CN102448485B - 免疫原性组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物。带电基团共价连接于树突细胞配体并与树突细胞靶向组分静电联系。

Description

免疫原性组合物及其用途
技术领域
本发明涉及免疫原性组合物，其中抗原通过静电相互作用与树突细胞配体联系。本发明进一步涉及所述组合物用于诱导受试者免疫应答的用途。
背景技术
人们对于可用于提高人类和其它动物免疫应答特别是预防疾病的组合物的开发有着日益增长的兴趣。在产生免疫应答的过程中，抗原与树突细胞相遇是必要的。树突细胞是免疫细胞并且构成哺乳动物免疫系统的一部分。其主要功能是处理抗原材料并将其呈递在免疫系统其它细胞的表面上，因此其作为抗原呈递细胞发挥功能。
之前已经认真思考过抗原对于树突细胞的靶向性并已证明树突细胞上的Toll样受体(Toll-like receptor)会对包括脂质的脂肽引起强烈的免疫应答(WO 2004/014956 & WO 2004/014957，将其公开并入本文以作参考)。
对于能够诱导有效的抗体应答的任何肽，其必须包含特殊的氨基酸序列(被称为可被免疫系统识别的表位)。特别地，对于抗体应答，表位需要被B淋巴细胞表面存在的特异性免疫球蛋白(Ig)受体识别。正是所述细胞最终分化为能够产生对于所述表位的抗体特异性的浆细胞。除了所述B细胞表位，免疫原还必须包含表位，所述表位通过抗原呈递细胞(APC)向辅助T淋巴细胞上存在的特异性受体呈递，对于提供信号必不可少的所述细胞需要所述B细胞以分化为抗体产生细胞。
在病毒感染的情况下以及在癌症的许多情况下，抗体包含在恢复中有限的益处以及对于能够杀死所述病毒感染细胞或癌症细胞的细胞毒性T细胞(CTL)产生应答的所述免疫系统。如同辅助T细胞，CTL首先通过与APC(携带其呈递于所述表面上的特异性肽表位)的相互作用被激活，此时与MHC I级分子而不是II分子联系。一旦激活所述CTL就可以吸引携带相同肽/I级复合体的靶细胞并导致其溶解。愈发明显的是，辅助T细胞在所述过程中发挥作用；在所述APC能够激活所述CTL之前，其必须首先接收来自所述辅助T细胞的信号以上调必需的共刺激分子的表达。
辅助T细胞表位通过存在于APC表面上的分子结合，所述APC通过所述主要组织相容性复合体(MHC)的II级基因编码。然后，所述II级分子复合体和肽表位通过T辅助淋巴细胞表面上的特异性T细胞受体(TCR)识别。通过这种方法，在MHC分子前体下的以抗原表位呈递的T细胞可以被激活并提供对于B淋巴细胞分化所必需的信号。
然后一般而言，免疫原必须包含能够被辅助T细胞识别的表位，除非所述表位会被B细胞或细胞毒性T细胞识别。显然所述类型的表位可能完全不同。对于B细胞表位，由于B细胞受体直接结合于天然免疫原，因此构象是重要的。相反地，被T细胞识别的表位不依赖于表位的构象完整性，并且由大约九个氨基酸的短序列构成CTL以及由稍微较长的序列(对于长度的限制较少)构成辅助T细胞。对于所述表位的唯一要求是其能够分别被安置在所述I级或II级分子的结合裂缝中，并且所述复合物然后能够吸引所述T细胞受体。II级分子的结合位点是两端开放的，其允许肽链长度的极大变化(Brown，J.H.，T.S.Jardetzky，J.C.Gorga，L.J.Stern，R.G.Urban，J.L.Strominger和D.C.Wiley.1993.Three-dimensional structure of the human class IIhistocompatibility antigen HLA-DR1.Nature 364：33)尽管已经报道了短如8个氨基酸残基的表位(Fahrer，A.M.，Geysen，H.M.，White，D.O.，Jackson，D.C.和Brown，L.E.Analysis of the requirements for classII-restricted T-cell recognition of a single determinant reveals considerablediversity in the T-cell response and degeneracy of peptide binding to I-ED J.Immunol.1995.155：2849-2857)。
发明内容
本发明人已经开发了包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原与所述树突细胞靶向组分静电联系。
第一方面，本发明提供包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原包含带负电区域，并且其中所述树突细胞靶向组分包含共价结合于树突细胞配体的带正电基团，并且其中所述抗原的带负电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。
第二方面，本发明提供包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原包含带正电区域，并且其中所述树突细胞靶向组分包含共价结合于树突细胞配体的带负电基团，并且其中所述抗原的带正电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。
第三方面，本发明提供提高受试者免疫应答的方法，所述方法包含为受试者施用本发明的第一或第二方面的免疫原性组合物。
附图说明
在下文中，OVA＝卵清蛋白；HEL＝鸡蛋清溶菌酶；R4(S2Pam2Cys)＝图5中1处显示的构造；E4(S2Pam2Cys)＝图5中2处显示的构造；CFA＝完全弗氏佐剂。
图1由接种R4(S2Pam2Cys-OVA)复合物引起的抗体和细胞介导的应答。(A)对成组的BALB/c小鼠接受皮下接种单独的25μg OVA、在CFA中乳化的OVA或者与等摩尔的或5倍摩尔过量的R4(S2Pam2Cys)混合的OVA。26天后，动物接受第二次相同剂量的抗原。在第一次接种抗原27天后(○)和第二次接种抗原13天后(●)从血液中获取血清。通过ELISA测定抗体水平，并且单独的抗体滴度与由横棒表示的平均值一同展示。(B)在第50天给小鼠第三次接种并在7天后获得脾脏。对脾细胞进行细胞内细胞因子染色以检测产生SIINFEKL-特异性IFN-γ的CD8+T细胞的存在。数据以三份样品的平均值和标准偏差表示。
图2由接种阳离子和阴离子脂肽-蛋白质复合物引起的OVA和HEL特异性抗体应答。BALB/c小鼠接受皮下接种单独的25μg HEL(A)或OVA(B)、在CFA中乳化的所述HEL或OVA或已与所述抗原混合的等量的R4(S2Pam2Cys)或E4(S2Pam2Cys。在最初(○)接种后28天对小鼠采血，在第32天强化免疫并在第46天(●)再次取血。然后通过ELISA测定抗体水平。单独的动物滴度与由横棒表示的平均值一同展示。
图3卵清蛋白-脂肽复合物的沉降。将递增量的支链R4(S2Pam2Cys)或直链Pam2Cys-SK4脂肽与1nmol的卵清蛋白(OVA)在平底96-孔平板中的总体积为100μl的PBS中混合。然后通过测定溶液于450nm处的光密度以测量所述溶液的浊度。
图4卵清蛋白-R4(S2Pam2Cys)脂肽溶液的HPLC分析。在含有(A)100nmol支链R4(S2Pam2Cys)脂肽、(B)1nmol卵清蛋白(OVA)或(C)离心(1.2×105G)后在总体积为100μl的PBS中的R4(S2Pam2Cys)脂肽和卵清蛋白混合物的溶液的上清液中进行HPLC分析。(D)将由含有所述脂肽和OVA二者的所述混合物得到的沉淀物材料溶解在50％丙酮的水溶液中，然后通过HPLC分析。在所有含有R4(S2Pam2Cys)的样品中，对应于所述脂肽的峰的确认通过质谱来验证。
图5在末端位置包含带正电的(精氨酸，R；赖氨酸，K)或带负电的(天冬氨酸，D；谷氨酸，E)氨基酸以使其各自的静电荷展示于环境中的支链的(构造1-5)和直链的(构造6-8)免疫原性组合物的一些实例的示意图。每个免疫原性组合物还含有二棕榈酰-S-甘油基半胱氨酸(Pam2Cys)，其是Toll样受体2的配体。两个丝氨酸残基(Ser)也包含在内。在构造2的情况下所述肽结构以N→C的方向组装，图中所示的所有其它结构均以C→N组装。正性和负性静电电荷以2-、2+、1-、1+等显示，其取决于电荷的大小。Ac＝在谷氨酸位于N-末端的情况下用于抑制α氨基正电荷的乙酰基。
发明详述
本发明发现共价结合于树突细胞靶向基团的带电部分与抗原静电联系以构成免疫原性复合物，所述免疫原性复合物可用于提高免疫应答。
因此，本发明提供了包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原包含带负电区域，并且其中所述树突细胞靶向组分包含与树突细胞配体共价结合的带正电基团，并且其中所述抗原的带负电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。
在本发明的这个方面，重要的是所述抗原包括能够与所述带电靶向组分发生静电相互作用的带负电区域或领域。然而，所述抗原具有整体的负电荷不是必不可少的，尽管是优选的。通过加入带负电基团还可能增加所述抗原的负电荷。例如，对于多肽抗原而言，天冬氨酸或谷氨酸残基链可以被加入到所述多肽中。
优选地，所述带正电基团包含至少一个带正电氨基酸。还优选地，所述带正电基团是支链的或直链的肽，优选为支链的。在多种实施方案中，所述肽包括至少一个精氨酸、组氨酸、鸟氨酸或赖氨酸残基或其组合。优选地，所述肽包含至少四个精氨酸残基和/或至少四个赖氨酸残基。特别优选地，所述带正电基团包含支链肽，所述支链肽包含至少4个精氨酸残基。
第二方面，在本发明提供了包含抗原和树突细胞靶向组分的免疫原性组合物，其中所述抗原包含带正电区域，并且其中所述树突细胞靶向组分包含共价结合于树突细胞配体的带负电基团，并且其中所述抗原的带正电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系。
在本发明的这个方面，重要的是所述抗原包括能够与所述带电靶向组分发生静电相互作用的带正电区域或领域。然而，所述抗原具有整体的正电荷不是必不可少的，尽管是优选的。通过加入带正电基团还可能增加所述抗原的正电荷。例如，对于多肽抗原而言，赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基链可以被加入到所述多肽中。
优选地，所述带负电基团包含至少一个带负电氨基酸。还优选地，所述带负电基团是支链的或直链的肽，优选为支链的。在多种实施方案中，所述肽包括至少一个天冬氨酸或谷氨酸残基或其组合。优选地，所述肽包含至少四个天冬氨酸残基和/或至少四个谷氨酸残基。特别优选地，所述带正电基团包含支链肽，所述支链肽包含至少4个谷氨酸残基。
在本发明的优选实施方案中，所述抗原不是核酸。还优选地，所述抗原与所述树突细胞靶向组分仅通过静电相互作用联系。
可在本发明中使用的一系列树突细胞配体列举在表1中。然而，优选地，所述树突细胞配体是TLR配体。所述TLR配体可包含脂质或肽聚糖或脂蛋白或脂多糖。特别地，所述TLR配体可包含棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基或癸酰基。优选地，所述TLR配体选自Pam2Cys、Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys和Oct2Cys。
在某个实施方案中，所述TLR配体结合TLR-2，所述TLR配体可与TLR-1或TLR-6联系。
第三方面，本发明提供了提高受试者免疫应答的方法，所述方法包含为受试者施用根据本发明的第一或第二方面的免疫原性组合物。
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本发明的示例性树突细胞靶向化合物是脂肽“Pam2Cys”。本领域技术人员将理解术语“脂肽”是指包含一个或多个脂质部分以及一个或多个偶联的氨基酸序列的物质的任何组合。“Pam2Cys”(亦称为二棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸或S-[2，3双(棕榈酰氧基)丙基]半胱氨酸已经被合成(Metzger，J.W.等人1995.J Pept Sci 1：184)并且相当于MALP-2的脂质部分，从发酵支原体(Mycoplasma fermentans)中分离巨噬细胞激活脂肽(Sacht，G.等人1998.Eur J Immunol 28：4207；Muhiradt，P.F.等人1998.Infect Immun 66：4804；Muhiradt，P.F.等人1997.J Exp Med185：1951)。已知Pam2Cys是TLR-2的配体。
Pam2Cys具有式(I)的结构：
可用于靶向作用细胞表面TLR的其它脂质部分包括棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、月桂酰基、辛酰基或癸酰基。优选的基团包括Pam2Cys、Pam3Cys、Ste2Cys、Lau2Cys和Oct2Cys。
关于此处使用的“免疫应答”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、巨噬细胞、粒细胞和通过上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补充物)的协同作用，其导致病原体侵入的人体、由病原体感染的细胞或组织、癌细胞或者在自身免疫或病理学炎症情况下的正常人类细胞或组织的选择性损害、解构或消除。
遍及本说明书的词语“包含(comprise)”，或者如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”的变体，应理解为意味着已作陈述的步骤或元素或整体或者步骤的或元素的或整体的组的包含物，但不排除任何其它的步骤或元素或整体或者元素的或整体的组。
本申请引用的所有参考文献已明确地并入本文以作参考。
关于本说明书中的任何现有技术不是，并且不应该被认为是，对所述现有技术构成澳大利亚公知常识的一部分的承认或任何形式的暗示。
可以理解的是，本领域技术人员可采用适合于所需申请的带正电基团和TLR配体的任何组合。
具体实施方式
现在将引用下列非限定性实施例进一步描述本发明。
材料和方法
脂肽的合成
在PEG-S RAM树脂(Rapp Polymere，Tübingen，德国；取代因子0.27mmol/g)上进行支链的和直链的脂肽的合成。对于支链脂肽R4(S2Pam2Cys)(构造1)和E4(S2Pam2Cys)(构造2；见示意图)的合成，首先用等摩尔量的O-苯并三唑-N，N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓-六氟磷酸盐(HBTU；Novabiochem，Darmstadt，Germany)、1-羟基苯并三唑(HOBt)和1.5倍摩尔过量的二异丙基乙基胺(DIPEA；Sigma，Castle Hill，Australia)将Fmoc-赖氨酸(Mtt)-OH(Novabiochem，Switzerland)以4倍过量的方式偶联在树脂上。酰化作用进行40分钟。然后脱除α-氨基上的Fmoc保护基，将Fmoc-赖氨酸(Fmoc)-OH偶联以便于所述Fmoc基团的后续脱除，将两个伯胺基团暴露以作为分支点。8倍过量的Fmoc-赖氨酸(Fmoc)-OH的另一轮连续偶联得到四个分支点，四个精氨酸(R)或谷氨酸(E)残基以16倍过量的方式偶联在所述四个分支点上。
对于支链构造的脂化，在存在DIPEA的情况下，使用10倍摩尔过量的二碳酸二叔丁酯(Fluka Chemika，Switzerland)保护N-末端精氨酸残基的氨基。通过成功的脂化和裂解脱除Boc保护基。用乙酸酐酰化谷氨酸残基以限制α-氨基并且也抑制终产物中α-氨基的正电荷。然后将存在于C-末端赖氨酸的ε-氨基上的Mtt保护基脱除，并将两个丝氨酸偶联。然后根据Zeng等人(Zeng 2003)将Pam2Cys脂质部分偶联以生成支链R4(S2Pam2Cys)或支链E4(S2Pam2Cys)。
在直链脂肽Pam2Cys-SK4的情况下，使用Fmoc-赖氨酸(Boc)-OH和Fmoc-丝氨酸(tBu)-OH以合成直链肽，然后是Pam2Cys脂质部分的偶联。
组装后，于室温用88％TFA、5％苯酚、2％TIPS、5％水将脂肽从固相载体上裂解3小时，并通过反相高压液相色谱法(RP-HPLC)使用安装在Waters HPLC系统中的Vydac C4柱(4.6x 300mm)分析。使用0.1％的H2O中的TFA和0.1％的乙腈中的TFA作为限制溶剂(limitsolvent)以1ml/min的流速产生色谱图。如需要，则将产物纯化并显示为分析型RP-HPLC上的单一主峰，并且当使用Agilent 1100系列离子阱质谱仪分析时，可以得到预期的质量。
免疫方案
除非另作说明，于第0天对五只雌性、8-12周龄BALB/c小鼠的组在尾根处进行皮下接种并于第28天再次接种在盐水中的、在CFA中乳化的或在盐水中与不同量的R4(S2Pam2Cys)或E4(S2Pam2Cys)混合的25μg卵清蛋白(OVA；Sigma Aldrich，USA)或鸡蛋溶解酶(HEL；Sigma Aldrich，USA)。除非另作说明，由大约在第一次接种后4周和第二次接种后2周采集的血液制备血清。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
在潮湿的气氛中，于室温条件下，用含有w/v 0.1％叠氮化钠(ChemSupply，Australia)的PBS中的OVA或HEL(5μg/ml)涂覆平底孔聚乙烯板(Thermo，USA)共18-20小时。将抗原移除并在用含有v/v 0.05％吐温-20(Sigma Aldrich，Milwaukee，USA)的PBS(PBST)洗涤之前加入含有10mg/ml牛血清白蛋白(BSA10PBS)的PBS共1小时。将获取自免疫小鼠的血清连续稀释物加入到孔中并于室温孵育过夜。在用PBST洗涤之后，使用与酶底物(含有0.004％过氧化氢[Ajax Chemicals，Australia]的50mM枸橼酸[M&B，England]中的0.2mM 2，2’-次偶氮基-双3-乙基苯并噻唑啉-磺酸[Sigma Aldrich，Milwaukee，USA])结合的辣根过氧化物酶偶联的兔抗-小鼠IgG抗体(Dako，Glostrup，Denmark)以检测结合的抗体。允许通过酶-底物反应诱导的显色进行15分钟并通过加入50mM氟化钠(BDH Chemicals，Australia)终止显色。使用Labsystems Multiscan Multisoft酶标仪(Pathtech Diagnostics，Australia)于405nm测定吸收度读数(于450nm校正波长)。抗体的滴度以需要达到0.2的光密度的血清的最高稀释度的倒数表示。
通过细胞内细胞因子染色的IFN-γ生成的检测
为了特异性CD8+T细胞介导的细胞因子生成的检测，为小鼠施用三次剂量的在盐水中的、在CFA中乳化的或与不同量的R4(S2Pam2Cys)混合的OVA(25μg)。七天后，脾脏从接种小鼠体内得到并将其挤压通过金属筛以得到单细胞悬浮液。然后在重组体IL-2(10U/ml；Roche，Manheim，Germany)存在的情况下，用同源照射(2200rad，60Co源)的原初脾细胞(5×105)与或非OVA258-265肽SIINFEKL(2μg/ml)培养脾细胞(1×106)。源自Cytofix/Cytoperm Plus Kit(Becton Dickinson，USA)的BD GolgiPlug形式的蓝菌素(Brefeldin)A(1μg/ml)也包括在所述培养物中。6小时后，将淋巴细胞用FAC洗液洗涤并于4℃用PerCP-偶联的大鼠抗-小鼠CD8抗体(Clone 53-6.7；Becton Dickinson，USA)染色共30分钟。然后根据生产商的说明于4℃使用Cytofix/Cytoperm溶液(Cytofix/Cytoperm Plus Kit，Becton Dickinson，USA)进行固定和渗透共20分钟。将细胞用提供试剂盒的Perm/Wash溶液洗涤一次并在通过流式细胞仪分析之前于4℃用FITC-偶联的大鼠抗-小鼠IFN-γ抗体(Clone XMG1.2；Becton Dickinson，USA)染色共30分钟。使用FlowJo软件(Treestar Inc，USA)进行数据分析。基于正向和侧向散射性质，使得有活力的活细胞通过并计算出总共1×105个CD8+细胞。
OVA-脂肽复合物的沉降
将OVA(1nmole)和递增量的支链R4(S2Pam2Cys)或直链Pam2Cys-SK4脂肽在平底96孔板中的总体积为100μl的PBS中混合。然后通过在Labsystems Multiscan Multisoft酶标仪上测量于450nm处的光密度以测定每孔中溶液的浊度。
另外将含有100nmole R4(S2Pam2Cys)、1nmole OVA或R4(S2Pam2Cys)和OVA的混合物的溶液离心(1.2×105G)并对上清液进行HPLC分析。另外将来自含有所述脂肽和OVA的混合物的沉淀材料溶解在50％的乙腈水溶液中，然后通过HPLC分析。在所有样品中，对应于所述脂肽的峰的确认通过质谱法证实，并且对应于OVA的峰的确认则基于在单独含有OVA的溶液中OVA的保留时间。
实施例1
说明
蛋白质抗原，特别是重组蛋白质，通常不是免疫原性的，并且有必要使用含有佐剂的制剂以增强其免疫原性，尽管在其能够获批用于人类之前需要解决关于佐剂毒性及其作用机制的担忧。因此，开发能够通过直接靶向和同时激活抗原呈递细胞(例如树突细胞)来促进蛋白质抗原递送的新型系统经证实是有益的。
在所述实施例中，我们描述能够静电结合蛋白质抗原并将其递送至树突细胞的带电的和支链的脂肽结构的用途。通过将整体的正电荷或负电荷分别传递至递送模块的四个N-末端精氨酸(R4)或谷氨酸残基(E4)的存在以调整所述脂肽的电荷。因此R4可用于结合带负电的蛋白质并且E4用于带正电者。TLR-2靶向脂质部分，Pam2Cys，与阳离子(R4(S2Pam2Cys))或阴离子版(E4(S2Pam2Cys))支链脂肽的合并保证了结合蛋白质向树突细胞的靶向递送。
结果
由于四个N-末端精氨酸残基的存在，所述脂肽R4(S2Pam2Cys)具有+8的整体电荷(每个精氨酸具有+2电荷)。为了测定R4(S2Pam2Cys)是否能够通过静电相互作用增强蛋白质免疫原性，使用卵清蛋白(OVA)(其具有11的整体负电荷)作为模型蛋白质抗原。
与单独接种OVA相比(图1A)，接种用等摩尔的或5倍摩尔过量的R4(S2Pam2Cys)预孵育的OVA可引起在一级和二级应答中抗-OVA抗体的明显较高的滴度，这表明阳离子脂肽和蛋白质的结合能够增强其免疫原性。引起的抗体水平似乎与使用的R4(S2Pam2Cys)的量成比例，因为与使用等量R4(S2Pam2Cys)所得到的相比，5倍过量的R4(S2Pam2Cys)导致较高的抗体水平。尽管这些组中小鼠一级应答的抗体水平低于用在完全弗氏佐剂(CFA)中乳化的OVA接种小鼠所得到的，在接种第二次剂量的R4(S2Pam2Cys)中的抗原以后得到的抗体水平几乎与通过FCA诱导者一样高。
用R4(S2Pam2Cys)+OVA接种之后还分析了细胞介导的应答。测量通过CD8+T细胞的前炎性细胞因子、干扰素-γ(IFN-γ)的分泌以作为T细胞活化的指标。与单独接种OVA相比，接种R4(S2Pam2Cys)+OVA可诱导接种小鼠脾脏中特异性更加明显的产生IFN-γ的CD8+T细胞，并且用R4(S2Pam2Cys)和CFA可引起相似水平的产生IFN-γ的CD8+T细胞(图1B)。与抗体结果相反(其中R4(S2Pam2Cys)的使用量的增加与较高的抗体应答相关)，相反的结果似乎是关于细胞介导的应答；与使用5倍过量者相比，使用等摩尔量的R4(S2Pam2Cys)检测到细胞因子分泌较高的T细胞。所述观察表明通过改变R4(S2Pam2Cys)和蛋白质抗原的比例能够选择用于清除特定病原体所需的适合类型(细胞的相对体液的)的免疫应答。
为了测定带负电的脂肽和带正电的抗原之间的静电相互作用是否还能够提供相同的免疫原性增强，用具有+8的整体电荷的鸡蛋溶解酶(HEL)孵育脂肽E4(S2Pam2Cys)(由于四个N-末端谷氨酸残基的存在，其具有+4的整体电荷)。与单独接种HEL所达到者相比，用所述复合物对小鼠的接种可导致较高的抗体滴度，这表明使用镶嵌有和与其一同施用的所述抗原相反的电荷的Pam2Cys的策略同样能够应用于容纳具有相反电荷的蛋白质抗原(图2A)。
我们还发现，用R4(S2Pam2Cys)和HEL(二者均具有正电荷)的小鼠接种没有导致抗体的产生，这表明增强是电荷特异性的。然而，使用E4(S2Pam2Cys)和带负电的OVA所看到的出乎意料的抗体结果是否归因于结合到OVA上存在的带正电片段的E4(S2Pam2Cys)仍需拭目以待。
讨论
本发现表明支链的带正电或带负电的脂肽可用于增强带相反电荷的蛋白质的免疫原性。其尤其突出地表现为R4(S2Pam2Cys)的使用(尽管其能够诱导OVA特异性应答)不能增强HEL特异性应答。考虑到所述脂肽的正电荷和检测蛋白质的负电荷，观察到的效果可能是由于在所述Pam2Cys部分和所述抗原之间的静电相互作用或其中所述静电相互作用的缺失。为了证实所述假设的进一步调查可通过分析色谱法以及使用带有相同或相反电荷的蛋白质抗原和具有中性电荷的支链脂肽的包含物的额外的体内研究来实现。
所述实验的结果也表明能够被诱导的免疫应答类型(即体液的或细胞的)可取决于使用的带电脂肽和蛋白质的比例。这可能是特别有意义的发现，因为特定病原体的成功清除可取决于被引起的免疫应答的类型。因此，我们在此处描述的脂肽可提供使所需的免疫应答适合根据疾病的特定抗原的手段。
实施例2
为了测量支链R4(S2Pam2Cys)与直链Pam2Cys-SK4脂肽与模型抗原卵清蛋白(OVA)构成复合物的能力，通过测量于450nm处的光密度以测定含有递增量的每一个脂肽和OVA的溶液的光吸收度(图3)。因此，允许与OVA构成复合物的每一个脂肽的能力将指示所述两个化合物之间的联系。
我们发现，向含有1nmol OVA的溶液中加入5nmol支链R4(S2Pam2Cys)可导致复合物的形成，其表现为浑浊的或乳白色溶液。增加支链脂肽的量可导致光密度读数的增加，当使用20至40nmol脂肽时得到最高值。反之，当加入直链Pam2Cys-SK4脂肽时，所有调查浓度均观察到光密度几无增加，这表明在结合所述抗原方面支链R4(S2Pam2Cys)优于所述直链脂肽。
为了确定R4(S2Pam2Cys)与OVA的结合，将单独含有所述化合物或含有其混合物的溶液离心以沉淀任何复合物。然后对上清液和沉淀材料进行HPLC分析。
在含有OVA或R4(S2Pam2Cys)的溶液的上清液中(图4A)，产生的色谱图显示了对应于溶液中每一个单独化合物的主峰。将两个化合物混合后，对应于溶液中OVA的峰的尺寸急剧下降是显而易见的，这说明由于所述蛋白质与所述R4(S2Pam2Cys)脂肽的结合，所述蛋白质已从溶液中沉淀出来。其在重建材料的HPLC分析中得到确证(图4B)，所述HPLC分析显示了对应于OVA和脂肽的两个主峰的存在，这证实所述沉淀材料是脂肽和蛋白质的复合物。

Claims (9)

1.一种免疫原性组合物，其包含: 
抗原、和 
树突细胞靶向组分， 
其中所述抗原包含带负电区域，并且 
其中所述树突细胞靶向组分包含与TLR配体共价连接的带正电的支链的肽，所述肽包含至少四个精氨酸残基和/或至少四个赖氨酸残基，并且 
其中所述抗原的带负电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系， 
所述TLR配体结合TLR-2， 
所述TLR配体是Pam2Cys或Pam3Cys。 
2.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述抗原具有整体负电荷。 
3.一种免疫原性组合物，其包含： 
抗原、和 
树突细胞靶向组分， 
其中所述抗原包含带正电区域，并且 
其中所述树突细胞靶向组分包含与TLR配体共价连接的带负电的支链的肽，所述肽包含至少四个天冬氨酸残基和/或至少四个谷氨酸残基，并且 
其中所述抗原的带正电区域与所述树突细胞靶向组分静电联系， 
所述TLR配体结合TLR-2， 
所述TLR配体是Pam2Cys或Pam3Cys。 
4.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述抗原具有整体正电荷。 
5.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述抗原不是核酸。 
6.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述抗原不是核酸。 
7.根据权利要求1所述的免疫原性组合物，其中所述抗原与树突细胞靶向组分仅通过静电相互作用联系。 
8.根据权利要求3所述的免疫原性组合物，其中所述抗原与树突细胞靶向组分仅通过静电相互作用联系。 
9.根据权利要求1至8任一项所述的免疫原性组合物在制备用于提高受试者免疫应答的药物中的用途。 
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