CN1527883A - 基于野兔痘的载体疫苗 - Google Patents

基于野兔痘的载体疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN1527883A
CN1527883A CNA028061020A CN02806102A CN1527883A CN 1527883 A CN1527883 A CN 1527883A CN A028061020 A CNA028061020 A CN A028061020A CN 02806102 A CN02806102 A CN 02806102A CN 1527883 A CN1527883 A CN 1527883A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
foreign dna
reorganization
hare
vaccine
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CNA028061020A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1258596C (zh
Inventor
N��˹Ƥ��
N·斯皮贝
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Intervet International BV
Original Assignee
Akzo Nobel NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Akzo Nobel NV filed Critical Akzo Nobel NV
Publication of CN1527883A publication Critical patent/CN1527883A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1258596C publication Critical patent/CN1258596C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/23—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及含有外源DNA的活的、重组野兔痘病毒在制备用于治疗或预防非兔种动物的感染性疾病的载体疫苗中的用途。此外源DNA操作性连接至少一个表达控制元件并且被整合到病毒基因组的非必须区域中。本发明进一步涉及含有外源DNA的活的、重组野兔痘病毒的用途，此外源DNA操作性连接至少一个表达控制元件并且被整合到病毒基因组的非必须区域中，其特征在于此外源DNA编码至少一个非兔种病原体的抗原。因其宿主范围有限，此重组野兔痘病毒在如非兔种脊椎动物等非易感宿主中不致病。用此重组野兔痘病毒接种可在接种疫苗的非兔种宿主中诱导产生抗原性或者免疫原性反应，即使在宿主中未观察到该病毒的生产性复制。

Description

基于野兔痘的载体疫苗
本发明涉及在非易感宿主中野兔痘病毒载体疫苗的用途和活的、重组野兔痘病毒。
已经介绍过基于正痘和禽痘病毒的载体疫苗及其在疫苗中作为重组病毒载体的潜力。美国专利5759841介绍的重组疫苗病毒在疫苗病毒基因组的非必须区域含有编码至少一个糖蛋白和一个DNA表达的启动子的麻疹病毒DNA。该重组疫苗可以在犬体内诱导产生针对麻疹病毒的免疫反应。然而包括人在内的大量不同物种能够许可这种重组疫苗载体，所以所述疫苗载体病毒在接种的宿主中有引起失控性感染或者从接种的宿主转移到未接种宿主的潜在危险。
专利WO9527780介绍了重组禽痘病毒，该病毒的优点是它的宿主范围有限，因此减少了对非鸟类宿主的毒性。该重组禽痘病毒在病毒基因组的非必须区域内含有外源DNA，该外源DNA编码至少一个犬瘟热病毒(CDV)抗原，或者麻疹病毒(MV)M或者N抗原。在犬类和其它食肉动物以及在人类中，这些病毒可以诱导产生抗原性反应或者免疫反应。该重组禽痘载体病毒限制在其天然宿主范围内，在非鸟类动物中接种该载体病毒后，只引起外源抗原表达，而不会产生病毒的生产性复制。不过，用禽痘病毒载体接种后，外源抗原表达水平始终较低。因此需要提高外源抗原的表达水平。此外，用禽痘病毒载体免疫后不是总会产生足够的针对外源抗原的中和性抗体。用基于金丝雀痘的FeLV载体疫苗对猫进行接种不会产生中和性的抗FeLV抗体(J.Tartaglia等，1993，J.Virol.67，p.2370-2375)。新生的小猫很容易发生FeLV感染。因为它们在出生后的第一周内不具有成熟的免疫系统，新生小猫必须依赖来自母亲的抗体防护FeLV感染。如果疫苗不能为母亲提供中和性抗体，小猫将无法得到抵抗FeLV的防护并且将会感染。
令人吃惊的是，在正常情况下不会被野兔痘病毒复制性感染的宿主中，即野兔痘病毒在所述宿主中复制后就不能进一步复制，可用活的含有编码至少一个抗原的外源基因的重组野兔痘病毒诱导产生抗原性或者免疫原性反应。野兔痘病毒的生产性感染仅限于兔类动物。因此，野兔痘病毒感染非兔类动物后不会发生野兔痘病毒的复制。因此，令人惊讶的是，活的重组野兔痘病毒能够感染这些非易感宿主并且在上述非易感宿主中不发生生产性复制而表达所述抗原，认如证据所表明的，病毒载体不会传播到其它接触的动物中。更令人惊讶的是，用所说的野兔痘病毒载体感染非兔种宿主后，即使在宿主中观察不到病毒的生产性复制，却导致外源DNA编码的抗原的高水平表达。在某些哺乳动物细胞系中，病毒载体确实可以在体外生长，并且，因为在这种非易感型宿主中野兔痘病毒载体不进行生产性复制，所以野兔痘病毒对非兔种动物没有致病性，这使得该病毒载体更适于用作疫苗。
在专利FR-A-2736358中介绍了包含外源DNA的重组粘液瘤病毒疫苗，这种重组粘液瘤病毒使兔子对粘液瘤病和其它兔子病原体引起的感染性疾病免疫。在专利FR-A-2736358中没有提到使用活的、重组粘液瘤病毒作为病毒载体来诱发非易感宿主产生抗原性反应或免疫原性反应，尤其是在非兔类宿主中。
因此，本发明关于含有外源DNA的活的、重组野兔痘病毒在制备用于治疗或预防非兔种动物的感染性疾病的载体疫苗中的用途，此外源DNA操作性连接至少一个表达控制元件并且被整合到病毒基因组的非必须区域中。优选将包含外源DNA的、活的、重组粘液瘤病毒用于制备治疗或预防非兔种动物的感染性疾病的载体疫苗，此外源DNA操作性连接至少一个表达控制元件并且被整合到病毒基因组的非必须区域中。更具体地，本发明涉及上述活的、重组的野兔痘病毒在制备用于治疗或预防禽、猫、犬、猪、羊、牛、马和人类感染性疾病的载体疫苗中的用途。优选根据本发明的活的重组野兔痘病毒用于制备治疗犬类和猫科动物的感染性疾病的载体疫苗。
本发明进一步提供包含外源DNA的、活的重组野兔痘病毒，此外源DNA操作性连接至少一个表达控制元件，此外源DNA至少编码一种导致非兔类宿主患感染性疾病的病原体抗原。更具体地，此外源DNA至少编码一种导致人、牛、禽、猫、犬、猪、马或羊类动物的感染性疾病的病原体抗原。优选此外源DNA编码一种猫或犬的病原体抗原。根据本发明，该病原体根据接种动物所针对的不同疾病种类，可以是病毒、细菌或寄生虫。如果病原体的基因组是RNA，那么目的抗原可由基因所对应的cDNA编码。外源DNA可以编码两种或更多的抗原，这些抗原可以来自相同的病原体或来自不同的病原体。
用于重组野兔痘病毒的适当的外源基因优选编码病毒糖蛋白、病毒包膜蛋白、病毒基质蛋白、细菌外膜蛋白、细菌肠毒素、细菌伞毛或者寄生蛋白。该外源DNA更具体地编码猫白血病病毒(FeLV)包膜蛋白(Stewart等(1986)J.Virol.58pp.825-834)或者基质蛋白(Donahue等.，1988，J.Virol.62，p.722-731)、猫或者羊衣原体主要外膜蛋白(GenBank Accession No.分别是CPFPNMOMP和CHTMOMPX)、猫传染性粒细胞缺乏症(panleukopenia)病毒(FPV)VP2蛋白(Carlson，J.等人，1985，J.Virol.55，p.574-582)、猫杯状病毒衣壳蛋白(M.J.Carter等人1992，J.Arch.Virol.122，P.223-235)，猫免疫缺陷病毒(FIV)Gag，Pol，Rev，Tat或Vif蛋白(R.I.Talbot等人1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86.p5743-5747；T.R.Philips等人1990，J.Virol.64，p.4605-4613；K.MLockridge，等人1999，J.Virol.261，p.25-30)，猫感染性腹膜炎病毒(FIPV)膜-、核衣壳-或刺突蛋白(R.J.de Groot等人1987，J.Gen.Virol.68，p.2639-2646；H.Vennema，等人1991，Virology，181，p.327-335)，犬瘟热病毒Env，HA，融合或核衣壳蛋白(M.Sidhu，等人1993，Virology 193，p 66-72；U.Gassen等人，2000，J.Virol.74，p.10737-10744)，犬细小病毒VP2蛋白(Reed，P.等人，1988，J.Virol.62，p.266-276)，狂犬病病毒糖蛋白G(T.J.Wiktor等.1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81，p.7194-7198)、犬冠状病毒刺突蛋白(B.Horsburgh等，2000，J.Gen，Virol.73，p.2849-2862)。除了编码非兔类病原体的免疫原性蛋白基因之外，外源DNA还包括编码细胞因子的基因，如：INFγ(GenBank Acc.No.D30619)、IL-1β(GenBankAcc.No.D92060)、IL-2/15(GenBank Acc.No.AF054601)、IL-4、IL-5(GenBank Acc.NoAF025436.)、IL-6、IL-12(GenBank Acc.No.U83184和U83185)、IL-16(GenBank Acc.No.AF003701)、或者IL-18(GenBank Acc.No.ABO46211)或者趋化性细胞因子如：α-趋化因子IL-8(GenBank Acc.No.XM003501)、GROα、GROβ、NAP-2、PF-4、IP10、CTAP-III、β-TG和β-趋化因子MCP-1(GenBankAcc.No.NM002982)、MIP-1α、MIP-1β、RANTES(GenBankAcc.No.XM012656)、MCP-2(GenBank Acc.No.AJ251190)、MCP-3(GenBank Acc.No.NM006273)、MCP-4(GenBankAcc.No.AJ251191)。优选根据本发明的编码适当的细胞因子的基因源自将接种该疫苗的同样种属的动物。
外源DNA操作性连接至少一个表达调控元件，此元件控制和调节此外源DNA的表达。在优选的实施方案中，外源DNA中的每个基因都受控于单独的不同的表达调控元件。表达调控元件为本领域内熟知并包括启动子。根据本发明中用于外源DNA表达的适合的启动子是病毒或者合成的启动子，此启动子能够调节蛋白在胞质中的表达。用于本发明中的启动子是痘病毒启动子，优选牛痘启动子(见DE-A-19627193；Mackett等人，“DNA Cloning Volume III”ed.D.M.Glover，1985，IRL公司出版)。根据本发明优选的启动子是合成的启动子，更优选合成的早期或者早/晚期启动子。在Chakrabati等人在Bio Techniques 23，vol.6，pp.1094-1097，1997.的文章中介绍了合成的牛痘病毒早/晚期启动子。可采用本领域内标准技术合成此启动子，例如见上1997，Chakrabate等人介绍的合成此启动子的实例。
本发明可以使用的适当的野兔痘病毒包括但是不局限于粘液瘤病毒或者兔纤维瘤病毒。适当的粘液瘤病毒株包括Lausanne株(来自ATCC)、SG33(Mainil，M.D.等人，2000，J.Comp.Pathol.122，p.115-122)、Borghi和Boerlage(Fenner & Fantini，“Biological control of Vertebrate pests”，CABI出版1999，ISBN0851993230和其中的参考文献)。适当的兔纤维瘤病毒株包括：Original A株(ATCC，编号：VR-112)和Kasza株(ATCC，编号VR-364)。根据本发明优选的活的重组野兔痘病毒来自于粘液瘤病毒。由于它的宿主限于兔类动物，在非兔类宿主中野兔痘没有病毒性。不过，优选用减毒的野兔痘病毒生成本发明的活的重组病毒。对于本发明的目的，减毒的野兔痘病毒被定义为在兔子宿主中能够进行生产性复制但不会引发疾病的野兔痘病毒。通过病毒株的系列传代或者删除一或者多个非病毒复制所必需的毒性基因而得到减毒的野兔痘病毒株。在Cameron等Virology 264，p.298-318(1999)中公布了野兔痘病毒的基因组完整DNA序列、它的基因组结构和所有开放阅读框架(ORF’s)的位置。Willer等人在Virology 264，p.319-343，(1999)中公布了兔纤维瘤病毒基因组的完整DNA序列、它基因组结构和所有开放阅读框架(ORF’s)的位置。
根据本发明的外源DNA优选插入到野兔痘基因组的非必需基因区域。更优选，外源DNA插入的野兔痘基因组的非必需基因区域涉及野兔痘病毒的毒性。粘液瘤病毒基因组或者兔纤维瘤病毒基因组的适当的非必需基因区域是编码胸腺嘧啶脱氧核苷激酶的TK基因、M11LORF、SERP-1、-2、和-3ORF和MGF ORF(Cameron等，1999，见上文；Willer等，1999，见上文)。在本发明优选的实施方案中，通过插入外源DNA和启动子删除一或者多个非必需病毒基因。特别优选至少删除MGF ORF的一部分，因为这个ORF编码毒性因子而且不是病毒在体内或者体外生长所必需的基因(Graham等，Virology191，pp.112-124，1992)。删除MGF ORF造成野兔痘病毒的毒性降低。
根据本发明的活的、重组野兔痘病毒可采用体内重组技术生产。该技术将外源DNA以位点特异性的重组插入到野兔痘病毒基因组中。可以采用与生产重组牛痘病毒以及重组禽痘病毒相似的办法来制备本发明涉及的重组病毒(见USP 4.603,112；USP 5,093,258；Guo，P.X；J.Virol.63：4189-4198(1990)；Mackett等“Construction AndCharacterization of Vaccinia Virus Recombinants ExpressingExogenous Genes”在“ DNA Cloning Volume III”。D.M.Glover，1985，IRL公司出版)。通常情况下，可以采用重组母体野兔痘基因组和携带受控于至少一个表达元件的外源DNA的DNA载体之间的位点特异性重组来制备根据本发明的活的重组野兔痘病毒。适当的进行位点特异性重组的DNA载体可源自任何含有多克隆位点的质粒。此DNA载体含有的外源DNA至少连接一个表达调控元件，而且其两边为病毒DNA序列，后者和野兔痘基因组中要插入外源DNA序列的区域同源。外源DNA侧翼的病毒DNA序列优选选自野兔痘病毒复制的非必须区域。用于和野兔痘基因组重组的DNA载体可以另外含有受控于痘病毒启动子的选择性标记基因。此附加的基因和启动子序列也都位于源于野兔痘基因组的病毒DNA序列间。将此DNA载体转染进入已经被母体野兔痘病毒感染的宿主细胞中。适当的宿主细胞是能够被野兔痘病毒感染并且可以被DNA载体转染的真核细胞。这样的宿主细胞实例有：兔肾细胞LLC-RK1和RK13、兔肺细胞R9ab、兔皮肤细胞SF1Ep、DRS和RAB-9、兔角膜细胞SIRC、兔癌细胞Oc4T/cc、兔皮肤/癌细胞CTPS、Vero细胞，所有细胞均来自ATCC。
适于产生本发明的活的重组野兔痘病毒的适当的母体野兔痘病毒是粘液瘤病毒株，如：Lausanne株(来自ATCC)、SG33(Mainil，M.D等，2000，J.Comp.Pathol.122，p.115-122)、Borghi和Boerlage(Fenner & Fantini，“Biological control of Vertebrate Pestes”，CABI出版，1999，ISBN 0851993230和其中的参考文献)和兔纤维瘤病毒株，包括：Original A株(ATCC编号VR-112)和Kasza株(ATCC变化VR-364)。优选粘液瘤病毒株用于生产根据本发明的活的、重组兔病毒。优选，母体野兔痘病毒是减毒的病毒，即在它靶向的兔宿主中能够进行生产性复制但是不会引发疾病。通过病毒株的系列传代或者删除一或者多个病毒复制所非必需的毒性基因可以得到减毒的野兔痘病毒株(完整的基因组序列和基因位置参见Cameron等1999，见上文，和Willer等，1999，见上文。)。
在DNA载体上的野兔痘DNA序列和母体野兔痘基因组的相应DNA间重组的过程中病毒可以在宿主中复制。此重组导致连接表达调控元件的外源DNA插入在野兔痘基因组中。用本领域内公知的标准选择和筛选方法选择和纯化此重组野兔痘病毒，包括用和该外源DNA同源的探针杂交检测整合的外源DNA、检测和外源DNA共整合的选择性标记的表达、和检测已经整合外源DNA后被删除的野兔痘基因的表达产物的缺失。可用聚合酶链反应分析证实重组野兔痘病毒基因组中的外源DNA的插入。
根据本发明的重组野兔痘病毒载体尤其适合用作非兔类动物的免疫试剂，因为抗原的表达水平在体内足以达到免疫宿主的效果。由于其受限制的宿主范围，此病毒在非兔宿主中是减毒的，因此不存在野兔痘病毒引发疾病的风险。这种宿主限制性更有助于防止本发明的野兔痘病毒在疫苗接种非靶向的宿主间的扩散。这样，在进一步的实施方案中本发明提供药物组合物，更优选含有可药用载体及活的含外源DNA的重组野兔痘病毒的疫苗，此外源DNA操作性连接至少一个表达控制元件并且被整合到病毒基因组的非必须区域中。此外源DNA至少编码了一种引起非兔类动物感染性疾病的病原体抗原。根据本发明的疫苗优选含有可药用载体和至少能够表达一种非兔病原体的免疫原性蛋白的活的重组粘液瘤病毒。根据本发明的表达一或者多种免疫原性蛋白的重组野兔痘病毒尤其适合生产多价疫苗。
可以按照下列标准方法制备根据本发明的疫苗组合物。重组野兔痘病毒可以在允许这种病毒的细胞培养物中生长，如：兔肾细胞LLC-RK1和RK13、兔肺细胞R9ab、兔皮肤细胞SF1Ep、DRS和RAB-9、兔角膜细胞SIRC、兔癌细胞Oc4T/cc、兔皮肤/癌细胞CTPS、Vero细胞，所有细胞都来自于ATCC。可以通过收集组织细胞培养液和/或细胞获得如此生长的病毒。或者，在收获病毒时可以采用促进感染性颗粒从生长底物中释放的技术来提高病毒的产量，例如：超声破碎和冻融。活疫苗可以制备成悬浮液或者冻干粉的形式。
适用于根据本发明的疫苗的可药用载体包括：无菌水、盐、水缓冲液，如PBS等。另外，根据本发明的疫苗中可以含有其它添加剂，如佐剂、稳定剂、抗氧化剂等。
适宜的稳定剂如：碳水化合物，包括：山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、右旋糖酐和葡萄糖、蛋白质及其降解物，包括但不限于白蛋白和酪蛋白、含蛋白制剂，如牛血清或者脱脂奶，和缓冲液，包括但不限于碱性金属磷酸盐。在冻干的疫苗组合物中优选加入一或者多种稳定剂。
适当的佐剂包括但不限于氢氧化铝、磷酸盐或氧化物、白榴石(amphigen)、维生素E、单磷酸脂A(monophosphenyl lipid A)、胞壁酰二肽、油类乳剂、葡聚糖、卡波姆、嵌段共聚物、细胞因子和皂角苷如Quil A。佐剂的添加量取决于佐剂本身的特性。细胞因子如INFγ、IL-12、IL18非常适合用于根据本发明的疫苗。
优选根据本发明的重组野兔痘病毒采用胃肠外给药途径对非兔类动物进行给药，包括但不限于肌内、皮内或皮下途径给药。或者，该疫苗可以经过肠道途径给药，例如：口服、喷雾、眼内、鼻内或者in ovo给药。
通常，根据本发明的重组野兔痘病毒以有效诱导外源蛋白足够的表达水平的量给药。该剂量通常取决于给药途径、给药时间，以及接种动物的年龄、健康状况和饮食情况。这种重组野兔痘病毒可以102-1011pfu/每个受试者的剂量给药，优选104-109pfu/每个受试者的剂量，更优选106-107pfu/每个受试者的剂量(pfu是嗜菌斑形成单位)。
根据本发明的疫苗可以同时或伴随其它活的或者灭活的疫苗给药。这些复合疫苗可以经肠道或胃肠外给药。优选推荐复合疫苗胃肠外给药。
下面用实施例对本发明进行阐述，并不限制本发明于所述的特定
实施方案。
附图说明
图1：中间质粒pVL和pVEL.的质粒结构的图示。RHD表示兔出血病毒的cDNA。ab(5’)和cd(3’)表示粘液瘤病毒MGF侧翼区域。启动子分别表示合成的晚期或者早期/晚期启动子。“mcs”表示含有用于导入外源DNA的多克隆位点的核酸序列。
图2：在pVL、pVEL基础上构建的多种重组DNA质粒。P表示合成晚期(pVL)或者早期/晚期(pVEL)启动子区域。ab(5’)和cd(3’)表示粘液瘤病毒MGF侧翼区域。RHDV Vp60表示RHDV Vp60蛋白的编码基因。FeLV gp85表示猫白血病病毒env基因。FCV Vp60表示猫杯状病毒衣壳蛋白的编码基因。FPL Vp2表示猫传染性粒细胞缺乏症病毒vp2基因，CPV VP2表示犬细小病毒vp2基因。GFP表示绿色荧光蛋白的编码基因。所有的质粒含有Ampr选择性标记(未显示)。
实施例
实施例1：中间DNA质粒pVL和pVEL的制备
该步骤中的起始质粒是商品质粒pCITE2-b(Novagen公司)，在载体的Sall和Hincll位点之间插入了兔出血病病毒的cDNA(MeyersG.等人，1991，Virology 184，p.664-676)。该质粒被命名为pCITE/RHD.
第一步是导入MGF侧翼序列。用myx a和myx b PCR引物扩增5’端侧翼序列。
myx a：5’TTCTCGGAAGTCATACGGTATT3’(第1号序列)
myx b：5’CATGCCAATGGCACATAAGAGAGTTGCGACTAGGTC3’(第2号序列)
用2μl MR24的组织培养物(106pfu ml-1)作为PCR反应的模板，按照生产商提供的说明用PCR珠(Pharmacia公司)进行PCR反应。用标准的试验室方法将PCR NcoI/平末端片段克隆到pCITE/RHD中。首先用KpnI消化，接着用T4DNA聚合酶进行末端补平，然后用NcoI进行消化，得到pCITE/RHD。最终质粒称为pCITE/RHDab。
用下述引物，对相同的模板制备物进行第二个PCR反应来制备3’侧翼序列。所用的引物的序列为：
myx c：5’CGG CTCGAGCTAATTACCATTAAGTAACCCGTTT TACA3’(第3号序列)
              XhoI
Myx d：5’GC TCTAGATATATCGTGTACGTAGTTCCCAAA AC3’    (第4号序列)
              XbaI
这个PCR片段作为XhoI/XbaI片段克隆到XhoI/XbaI酶切的pCITE/RHDab中。最终得到的质粒命名为pCITE/RHDabcd。
之后通过杂交下面的寡核苷酸合成痘病毒启动子。
Vp3：5’CTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTAGATCTTAAATGCC3’(第5号序列)
Vp4：5’CATGGGCATTTAAGATCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGTA 3’(第6号序列)
这2个互补的寡核苷酸一起退火形成与KpnI和NcoI限制性酶切位点兼容的粘性末端。同样，下面的2个寡核苷酸也可以一起退火形成KpnI/NcoI的兼容片段。
Vp5：5’CAAAAATTGAAATTTTATTTTTTTTTTTTGGAATATAAATAC 3’(第7号序列)
Vp6：5’CATGGTATTTATATTCCAAAAAAAAAAAATAAAATTTCAATTTTTGGTAC3’(第8号序列)
Vp5和Vp6一起组成一个早期/晚期启动子，同时Vp3和Vp4组成一个晚期启动子(Chakrabarti等人，Biotechniques 23，p.1094-1097，1997)。然后，将一个或者另外一个退火的寡核苷酸对克隆到KpnI/NcoI酶切的pCITE/RHDabcd中，产生pVP/RHD(晚期启动子)或者pEL/RHD(早晚期启动子)。因为在构建好的两个载体(pVP/RHD和pEL/RHD)中，RHD衣壳基因的阅读框与第一个甲硫氨酸不相符合，因此必须对RHD衣壳基因(Vp60)进行再克隆，并移去介于中间的序列以便获得表达。用NcoI和EcoRI酶切质粒pVP/RHD和pEL/RHD，移去Vp60编码序列和起始ATG 5’端的非编码序列。用下面的寡核苷酸扩增产生的PCR扩增片段置换Vp60基因。
5’GCTCCATGGAGGGCAAAGCCCGTG 3’(第9号序列)
5’TTGCTCAGGACACCGGCACCTGC3’(第10号序列)
PCR反应的模板是pCITE/RHD。用NcoI和EcoRI酶切PCR扩增片段，将其克隆到已经制备的pVP/RHD和pEL/RHD中。最终得到的质粒分别命名为pVP/Vp60和pEL/Vp60。为了引入在其侧翼有其它限制性酶切位点的基因，在pVP/Vp60和pEL/Vp60中单一的NcoI酶切位点的下游导入多克隆位点。下面的寡核苷酸序列：
mcsA：5’CATGGATCGATGTCGACGGATCCACTAGTGAATTCACGCGTC3’(第11号序列)
mcsB：5’TCGAGACGCGTGAATTCACTAGTGGATCCGTCGACATCGATC3’(第12号序列)
退火形成交叠末端，该与NcoI和XhoI限制性内切酶位点兼容。用退火形成的寡核苷酸置换含有全部RHD相关序列的NcoI/XhoI片段，最终形成2个质粒：pVL和pVEL(见图1)。
pVL和pVEL质粒用于构建含有下述基因的多种重组DNA：兔出血病衣壳蛋白VP60(Meyers等.1991，见上文)、绿色荧光蛋白(Clonetech Laboratories公司，美国加利福尼亚Palo Alto)猫白血病包膜糖蛋白gp85(Stewart等，1986，J.Virol 58，p.825-834)、猫白血病基质(gag)蛋白(Donahue等，1988，J.Virol 62，p.722-731)、猫杯状病毒衣壳蛋白(GenBank登录号Z11536和NC001481)、猫传染性粒细胞缺乏症病毒衣壳蛋白VP2(Carlson J.等1985，J.Virol.55，p.574-582)、犬细小病毒衣壳蛋白VP2(Reed P等，1988，J.Virol.62，p.266-276)。表1列出了已构建的用于产生根据本发明的重组粘液瘤病毒的多种DNA质粒。每一个重组质粒都采用的同样的构建方法。靶基因来自现有质粒的酶切产物或者为PCR扩增产物，这样在该基因的末端具有和pVL或者pVEL的mcs相兼容的限制性酶切位点。
pVL GFP DNA质粒的制备
含有GFP基因的质粒购自美国加利福尼亚Palo Alto的Clonetech laboratories公司，用NcoI和EcoRI从质粒中酶切得到GFP基因。将该基因插入到pVL中得到pVLGFP。
pVEL FeLVenv DNA质粒的制备
用下述寡核苷酸从pFGA5(Stewart等，1986见上文)中PCR扩增包膜基因。
5’CAC  ATC GAT TGA TGG AAA GTC CAA CGC 3’(第13号序列)
         ClaI
5’TG G AAT TCA TGG TCG GTC CGG ATC GTA 3’(第14号序列)
       EcoRI
用ClaI和EcoRI酶切PCR片段并将其插入到pVEL中得到pVELFeL Venv。
pVEL FPL DNA质粒的制备
用下述引物从复制型(rf)DNA中PCR扩增得到FPL衣壳基因。
5’CACATCGATTGATGAGTGATGGAGCAG3’(第15号序列)
5’CGGGAATTCTAGGTGCTAGTTGATATG 3’(第16号序列)
按照标准方法(Reed，P.等.1988，J.Virol.62，p.266-276)从FPL疫苗株感染的猫肾细胞(CRFK)中制备得到rfDNA。
pVEL FCV DNA质粒的制备
用FCV F9株按照每个细胞0.1pfu的数量感染猫肾细胞(CRFK)。36小时后收集细胞并用异硫氰酸胍(TRIzol试剂GibCoBRL)制备总RNA。用寡聚T引物合成cDNA的第一链(SuperScript ChoiceGibClBRL)。已经报道了FCV的F9株的完整核酸序列和基因组组织结构(GenBank登录号M86379)。合成寡核苷酸作为第二条DNA链合成的引物，随后PCR扩增衣壳基因。下述寡核苷酸用来产生FCV的Vp60衣壳蛋白基因(F9株)：
5’GG ATCGATGCGCGGATGACGGGTCAATC3’(第17号序列)
       ClaI
5’GGGG ACTAGTATTCATAACTTAGTCATGGG 3’(第18号序列)
         SpeI
将Vp60衣壳基因插入到pVL和pVEL的mcs中分别得到pVLFCV和pVELFCV。
pVEL CPV DNA质粒的制备
从Nobivac Parvo的CPV疫苗株中PCR扩增得到编码衣壳蛋白VP2的基因，用NcoI和EcoRI酶切并将其插入到pVEL中。
实施例2：重组粘液瘤病毒的制备
选用在兔肾细胞(RK13)中长期传代而减毒的非病原性粘液瘤病毒(命名为MR24)。当经皮下、皮内或者肌内途径对兔子进行给药时，该减毒粘液瘤病毒(MR24)表现无病原性(0％致死率)。MR24是用于兔子的粘液瘤疫苗候选株。所有病毒的滴度和扩增在兔肾细胞(RK-13)中进行测定。
用下面所述的构建重组疫苗病毒的方法生产重组粘液瘤病毒(Mackett等.1985，见上文)。按照每个细胞0.1pfu的数量用粘液瘤病毒MR24感染兔子肾细胞(RK13)。2小时后用脂转染胺试剂(GibCoBRL)对细胞进行质粒DNA的转染。采用有限稀释和鉴定免疫荧光的方法对重组病毒进行筛选。
转染72小时后，对感染/转染细胞培养物进行3次冻融以便释放病毒。用组织培养基对野生型和重组病毒的初级混合物进行50倍稀释，然后用10μl病毒混合物感染事先接种有RK13细胞的96孔板。孵育该96孔平板72小时，以便完成病毒感染和增殖过程。之后对平板进行3次冻融处理，同时保证平板的每个孔的单独状态。以此作为第一轮的主板(master plate)。之后，从每个孔中取出5μl含有培养基的病毒加到接种有RK13细胞的相同的96孔培养板中。48小时后，副本平板用冰冷的甲醇固定，并用免疫荧光筛选重组蛋白表达的平板。
例如：按照下述方法筛选pVELFeLVenv感染和转染的细胞中表达FeLV包膜蛋白的细胞：将小鼠单克隆抗体3-17的腹水(EuropeanVeterinary Laboratory，Woerden荷兰)稀释1000倍，然后添加到固定的96孔板每个孔中，在37℃孵育1小时。然后用PBS洗涤平板5次，并和FITC标记的兔抗小鼠IgG(Sigma Chemical Co)共同孵育1小时。最后用PBS洗涤平板5次并且用荧光显微镜进行检测。辨认并记录因感染而产生荧光点的孔。由第一轮主板相应的孔稀释到更多接种RK-13细胞的96孔板中，该板成为第二轮主板。连续进行该逐步富集步骤直到重组病毒占总病毒的20-50％为止。按照同样的方法对其它重组粘液瘤病毒的重组蛋白的表达进行筛选。
表1：DNA质粒和相应的重组粘液瘤病毒
    质粒     重组病毒     株号
    pVL/GFP     Myxo/GFP     未确定
    pVL/VP60     Myxo/RHD     未确定
    pVEL/FeL Venv     Myxo/FeL Venv     MS0011
    pVEL/FCV     Myxo/FCV     MS0013
    pVL/FCV     Myxo/FCV     MS0014
    pVEL/FPL     Myxo/FPL     MS0015
    pVEL/CPV     Myxo/CPV     MS0016
最后通过从琼脂覆盖培养基中挑选单个的感染点来纯化重组子。
实施例3：鸡中的myxo/RHD
检测非兔类动物感染重组粘液瘤病毒是否可以诱导产生抗体反应。以皮下或者肌内途径用myxo/RHD免疫小鸡。在接种日程第0天和第14天，鸡接种105pfu的病毒。在第0天、第14天以及第28天取得血样，分析其中针对RHDV的抗体。结果如表2所示。在整个试验中所有鸡的临床表现都正常。
表2：在鸡中孵育myxo/RHD的结果。用能够抑制4个单位的RHDV纯抗原引起的兔血红细胞凝集的免疫血清的稀释倍数的倒数表示抗体水平。
 接种途径  动物数量         血细胞凝集反应抑制滴度
    第0天     第14天     第28天
    肌内     166     0     80     40
    168     0     40     20
    170     0     640-1280     640-1280
    172     0     40     40
    174     0     320     320
    176     0     40     160
    178     0     320     640
    180     0     40     40
    皮下     182     0     320     320
    184     0     40     20
    186     0     10     10
    189     0     320-640     320
    191     0     40     40
    193     0     20     20
    195     0     640     640
    197     0     320     320
    对照     290     0     0     0
    292     0     0     0
    294     0     0     0
    296     0     0     0
    298     0     0     0
实施例4：在猫中的Myxo FCV
建立实验来检测粘液瘤/猫杯状病毒衣壳重组病毒(myxo/FCV)诱导中和性抗体并且预防毒性猫杯状病毒感染的有效性。用5×106点形成单位(ffu)的myxo/FCV对一组的4只猫进行皮下免疫(组1)，在第一次免疫后的第3周进行重复免疫。4只未接种疫苗的对照动物(组2)和检测动物一起圈养(Housed)。在2次免疫4周后，用105.3TCID50的毒性猫杯状病毒株对所有猫进行鼻腔内攻击。每个鼻孔滴入0.5ml攻击病毒。
表3：试验安排
    时间点     动物组     操作
    第-1天     1和2     鼻孔擦拭O/P，采血
    第0天     1     疫苗接种
    第21天     1     采血和第二次疫苗接种
    第49天     1和2     采血和免疫攻击
    第50-62天     1和2     临床监察，鼻孔擦拭O/P
    第63天     1和2     临床监察，采血，鼻孔擦拭O/P，
在试验开始时进行鼻拭取样检测是为了确保没有动物在口咽部位存在猫杯状病毒。与此相似，采血确保没有动物在开始试验前有抗FCV抗体。在免疫攻击后进行鼻拭取样来检测分泌的病毒。
试验中得到的血样用于病毒中和性分析。这些分析可以检测猫体内循环中的抗体水平。已知在恢复期动物体内出现含有血清中和性抗体，并且作为疫苗接种效果所提供的已经存在的中和性抗体有助于对疾病的防护(Hohdatsu等。1999 J.Vet.Med.Sci.61，299-301)。
表4：用myxo/FCV(MS0013)对猫接种的结果(血清中和效价)。该数据表明获得病毒中和效果的最大的血清稀释度。接种疫苗前的血样(前血)中没有针对FCV的抗体。在体外，稀释1-4倍的血清显示体外对病毒生长的非特异性抑制作用。
           血清   前血    第一次疫苗接种后    第二次疫苗接种后  免疫攻击后   临床分值*
  猫序号        组
  358-054 疫苗接种组(组1) ＜1∶4     1∶102     1∶2580   10321   1
  376-561 ＜1∶4     1∶50     1∶1024   ＞16384   13
  383-882 ＜1∶4     1∶215     1∶3444   13777   0
  073-609 ＜1∶4     1∶161     1∶1569   16384   4
  295-099   对照(组2) ＜1∶4     ＜1∶4     ＜1∶5   1337   49
  375-369 ＜1∶4     ＜1∶4     ＜1∶4   4096   18
  078-001 ＜1∶4     ＜1∶4     ＜1∶4   2435   47
  268-054 ＜1∶4     ＜1∶4     ＜1∶4   697   22
*所用临床评分标准是欧洲药典中对猫杯状病毒疫苗生产所限定的(1996年6月第3版，ISBN92-871-2991-6)。其要求临床分值显著低于对照的疫苗符合测试。在这项研究中，与对照组的34相比，疫苗接种组的临床平均分值是4.5。
比较myxo-FCV疫苗接种(表4)和常规疫苗接种(表5)的结果，可以清楚的看到第一次疫苗接种后组1动物的抗体反应与接种2倍剂量多种商品疫苗的动物相当。这表明这些猫被防护于这些疾病。二次疫苗接种后抗体的滴度明显超过了商品疫苗产生的效果(Hohdatsu等，1999 J.Vet.Med.Sci.61，299-301，DeSilver等，1997，1stInt.Symp.杯状病毒ESVV 131-143)。
表5：商品FCV疫苗免疫血清对FCV株*的中和性抗体滴度
                       免疫血清
FCV     疫苗A         疫苗B         疫苗C         疫苗D
分离物  #20a) #C3    #C1    #C4    #C2    #C5    #C6   #A7
F4      20b)  80     10     5      5      5      160   20
F9      160    160    640    40     10     10     160   320
255     10     20     20     5      ＜5    ＜5    640   ＞640
91-1    ＜5    ＜5    ＜5    ＜5    ＜5    ＜5    ＜5   ＜5
a)血清数量
b)中和滴度
*来自Hohdatsu等(1998)
据Yokoyama等(1998)报道，在免疫攻击前，表达FCV抗原的猫疱疹病毒载体也诱导产生很低滴度的血清中和性抗体(在2.5和3.0区域)。
参考文献
Hohdatsu T，Sato K，Tajima T和Koyama H。商品猫杯状病毒(FCV)疫苗免疫血清针对FCV视野分离物的中和性特性J Vet MedSci 1999；61：299-301。
Yokoyama N，Fujita K，Damiani等。表达猫杯状病毒免疫原性抗原的重组猫herepesvirus 1型载体的进一步开发。J of Vet Med Sci1998；60：717-723。
Reed LJ和Meunch H。估测50％终点的简单方法。Am J Hygiene1938；27：493-497。
实施例5：用Myxo/FCV在猪和牛中进行中和试验
通过皮内和肌内注射途径给药，在牛和猪中检测粘液瘤病毒作为真核表达载体在非天然宿主中诱导保护性免疫反应的适用性。
在小牛和猪中使用含有编码成熟型衣壳抗原的猫杯状病毒基因片段的粘液瘤病毒载体。这个试验的2个组中分别为12周龄的4头小牛和6周龄的4头猪。
在开始试验前1周采集血样(10ml/动物)，检测动物是否对猫杯状病毒呈血清阴性。之后，按照1ml PBS含有1×108FFU重组粘液瘤病毒/注射途径/动物对所有动物进行皮下或者肌内注射。每种动物作为一组进行圈养。4周后，采集血样(10ml/动物)，并且按照相同剂量，即1ml PBS含有1×108FFU重组粘液瘤病毒/注射途径/动物，对动物进行皮下或者肌内再次注射。上次注射后2周，采集血样(10ml/动物)，并且按照GMO体内试验的指导原则处死动物。采集的血样在体外通过病毒中和分析的方法检测是否出现了针对杯状病毒的抗体。
表6.试验设计和时间框架：每组含有4头猪或者4头牛
日期 活性
T＝-7天 采集前血清样本
T＝0天 按照1ml PBS含有1×108FFU重组粘液瘤病毒/每种注射途径/每只动物的剂量进行皮下或者肌内注射
T＝28天 p.i. 采集血液样本(10ml)
T＝28天 p.i. 按照1ml PBS含有1×108FFU重组粘液瘤病毒/每种注射途径/每只动物的剂量进行皮下或者肌内注射
T＝42天 p.i. 采集血液样本
T＝42天 p.i. 结束试验
FCV血清中和试验的方法
在CrFK细胞中利用c.p.e.进行血清中和性分析。二百TCID50的病毒的5倍复制产物和血清系列稀释物(开始1∶4)混合，终体积为600μl。在37℃条件下，于5ml无菌稀释管中孵育病毒/血清混合物60分钟。将100μl检测混合物添加到96孔组织培养板中，该培养板的孔中已经有100μl培养基，其中接种有CrFK细胞。继续孵育5天，根据Reed和Meunch[1]的方法计算TCID50的值。
Reed，L.J.，和Meuch.1938.估测50％终点的简单方法。Am JHygiene 1938；27：493-497。
表7：FMD004试验，免疫血清中针对FCV的Sns的结果
动物 前血 一次疫苗接种后 二次疫苗接种后
牛2403 ＜＝1∶4  1∶54 ＞＝1∶724
牛1948 ＜＝1∶4  1∶64 ＞＝1∶1024
牛1603 ＜＝1∶4  1∶13  1∶256
牛1190 ＜＝1∶4  1∶54 ＞＝1∶861
猪122 ＜＝1∶4 ＜＝1∶4  1∶304
猪119 ＜＝1∶4 ＜＝1∶4  1∶304
猪118 ＜＝1∶4  1∶10  1∶256
猪117 ＜＝1∶4 ＜＝1∶4 ＞＝1∶861
实施例6：粘液瘤病毒在多种类型细胞中的体外生长
用由2种不同的粘液瘤病毒株构建的表达绿色荧光蛋白的重组粘液瘤病毒感染细胞。根据随时间显示荧光的细胞数目的增多来分析细胞的生长情况。
当myxo/GFP重组病毒添加到培养的多种类型的细胞中时，可以观察到荧光，结果列在表8中。这表明这种病毒能够进入非兔细胞并且在其中表达GFP基因。表8表明在某些类型细胞中，病毒能在体外生长。并且，对于所检测的2个构建产物，表现出的模式不同。
表8：粘液瘤病毒在多种类型的细胞中的生长
  细胞类型                         生长
                              MS20-10    MR24
兔肾细胞(Rk-13)               ++++       ++++
非洲猴肾细胞(Vero)            ++++       ++++
牛胚肺细胞(BEL)               +          +
猫胚成纤维细胞(FeF)           +          -
鸡胚成纤维细胞(CEF)           +          -
犬肿瘤细胞系A72               -          -
实施例8：对犬细小病毒疫苗的反应的ELISA检测
为了检测用表达犬细小病毒衣壳蛋白Vp2的重组粘液瘤病毒接种狗诱导产生的免疫反应，进行了ELISA方法。对这种疫苗接种的反应和传统疫苗接种产生的反应做了比较。
材料和方法：
材料：
TBS(50mM Tris缓冲盐溶液)
50mM Tris-盐缓冲液，pH7.5
6.35g Tris-HCl
1.18g Tris碱
8.77g NaCl
800ml dH2O
调节pH到7.5并且用dH2O定容到1L。
TBS-Tween
按照上述方法制备TBS，然后添加0.5mL TWEEN 20，充分混和。
方法
1.抗CPV单克隆抗体重悬在0.1M Na2CO3缓冲液中，pH9.6，浓度为5-10μg/ml。在40℃孵育ELISA平板过夜，每孔中加入100μl抗体悬液。
2.甩去除过剩的抗原包被液，每孔加入200μl含有1％BSA和2％干奶粉的TBS溶液封闭残留的结合位点，室温放置1小时。
3.甩去除封闭液，每孔再加入100μl含有滴度为约107p.f.u.ml-1犬细小病毒的组织培养液上清。室温孵育1-2小时。
4.用TBS-Tween洗涤平板4次。
5.用TBS系列稀释血清。ELISA平板的孔中加入100μl这些稀释液，室温继续孵育1-2小时。
6.随后，用TBS-Tween洗涤平板4次。
7. 按照操作说明，加入偶联碱性磷酸酶的抗犬二抗(如：ICNbiomedical Research Products货号675071)稀释物，室温孵育1-2小时。
8.用TBS-Tween洗涤平板4次。
9.添加底物PNPP(p-硝基苯磷酸盐如：SIGMA化学公司序列号为N2770)进行ELISA显色。
10.用分光光度计读取420nm的光吸收值。
结果如表9所示。
表9：对CPV反应的ELISA检测结果
疫苗                              指示的稀释度的光吸收10           20          40          80          160           320           640           1280
Myxo-Vp2 ＞2.0  ＞2.0  1.8  1.56  1.198  0.685  0.45  0.297
传统疫苗 0.73  0.46  0.29  0.30  0.28  0.30  0.26  0.29
无 0.31  0.28  0.30  0.26  0.28  0.25  0.27  0.26
ELISA结果清楚的表明来自传统疫苗接种的犬的血清1∶40稀释度导致背景水平的光吸收，即和未接种疫苗的犬免疫血清一样。与此相对应，用myxoma-CPV(Vp2)接种的犬的免疫血清稀释度为1∶1280时吸光值和背景水平一致。

Claims (11)

1.含有外源DNA的活的重组野兔痘病毒在制备治疗或预防非兔类动物的感染性疾病的载体疫苗中的用途，此外源DNA操作性连接至少一个表达控制元件并且被整合到病毒基因组的非必须区域中。
2.根据权利要求的1的病毒的用途，其用于制备治疗或预防猫或者犬的感染性疾病的载体疫苗。
3.含药学可接受的载体和活的含有外源DNA的重组野兔痘病毒的疫苗，此外源DNA操作性连接至少一个表达控制元件并且被整合到病毒基因组的非必须区域中，并且此外源DNA至少编码一种在非兔类中产生感染性疾病的病原体抗原。
4.含有外源DNA的活的重组野兔痘病毒，此外源DNA操作性连接至少一个表达控制元件并且被整合到病毒基因组的非必须区域中，其特征在于此外源DNA编码至少一种非兔类病原体的抗原。
5.根据权利要求4的病毒，其特征在于此野兔痘病毒是粘液瘤病毒。
6.根据权利要求4或者5的病毒，其特征在于该外源DNA编码至少一种猫或者犬病原体的抗原。
7.根据权利要求4或者5的病毒，其特征在于该外源DNA编码至少一种猫或者犬病毒的抗原。
8.根据权利要求4到7的病毒，其特征在于该外源DNA编码猫白血病病毒(FeLV)的包膜蛋白、猫杯状病毒(FCV)衣壳蛋白、猫传染性粒细胞缺乏症病毒(FPL)VP2蛋白，和/或犬细小病毒(CPV)VP2。
9.权利要求4到8的病毒，其特征在于该外源DNA和表达调控元件插入到病毒基因组的MGF ORF中。
10.权利要求4到9的病毒，其特征在于操作性连接于外源DNA的表达调控元件是合成的痘病毒启动子。
11.权利要求10的病毒，其特征在于该启动子是早期/晚期启动子。
CN02806102.0A 2001-03-08 2002-03-07 基于野兔痘的载体疫苗 Expired - Fee Related CN1258596C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01200869.4 2001-03-08
EP01200869 2001-03-08

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1527883A true CN1527883A (zh) 2004-09-08
CN1258596C CN1258596C (zh) 2006-06-07

Family

ID=8179978

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN02806102.0A Expired - Fee Related CN1258596C (zh) 2001-03-08 2002-03-07 基于野兔痘的载体疫苗

Country Status (17)

Country Link
US (1) US6942864B2 (zh)
EP (1) EP1370668B1 (zh)
JP (1) JP4037273B2 (zh)
CN (1) CN1258596C (zh)
AT (1) ATE318321T1 (zh)
AU (1) AU2002304856B2 (zh)
BR (1) BR0207761A (zh)
CA (1) CA2439872C (zh)
DE (1) DE60209345T2 (zh)
DK (1) DK1370668T3 (zh)
ES (1) ES2258628T3 (zh)
MX (1) MXPA03007862A (zh)
NO (1) NO331305B1 (zh)
NZ (1) NZ527940A (zh)
PT (1) PT1370668E (zh)
WO (1) WO2002072852A2 (zh)
ZA (1) ZA200306607B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ572893A (en) * 2006-06-01 2011-06-30 Robarts Res Inst Myxoma virus mutants for cancer treatment
KR100831536B1 (ko) * 2007-01-19 2008-05-22 리엔 창 일렉트로닉 엔터프라이즈 컴퍼니 리미티드 풀 브릿지 드라이버
KR100831537B1 (ko) * 2007-01-19 2008-05-22 리엔 창 일렉트로닉 엔터프라이즈 컴퍼니 리미티드 하프 브릿지 드라이버
FR2925067B1 (fr) * 2007-12-18 2010-01-15 Agronomique Inst Nat Rech Vecteurs vaccinaux derives de leporipoxvirus
WO2021202971A1 (en) * 2020-04-02 2021-10-07 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Covid-19 vaccine based on the myxoma virus platform
CN111904981A (zh) * 2020-09-07 2020-11-10 威世药业（如皋）有限公司 一种痘苗病毒致炎兔皮生产方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5833975A (en) * 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US5505941A (en) * 1981-12-24 1996-04-09 Health Research, Inc. Recombinant avipox virus and method to induce an immune response
US5174993A (en) * 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
DE10399031I1 (de) * 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
AU2347692A (en) 1991-07-09 1993-02-11 Cornell Research Foundation Inc. Recombinant viral vaccine
TW377373B (en) 1993-09-22 1999-12-21 Wyeth Corp Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline infectious peritonitis virus disease
US6001349A (en) * 1995-02-22 1999-12-14 Therion Biologics Corporation Generation of human cytotoxic T-cells specific for carcinoma self-associated antigens and uses thereof
FR2736358B1 (fr) 1995-07-05 1997-09-26 Agronomique Inst Nat Rech Virus myxomateux recombinant
AU4266597A (en) * 1996-09-11 1998-04-14 General Hospital Corporation, The Use of a non-mammalian dna virus to express an exogenous gene in a mammalian cell
US6127172A (en) * 1998-05-29 2000-10-03 University Of Florida Materials and methods for delivery and expression of heterologous DNA in vertebrate cells
ES2153284B1 (es) * 1998-06-10 2001-09-01 Fundacion Para El Estudio Y De Nuevo virus recombinante de mixoma atenuado y su uso en la preparacion de vacunas mixtas contra la mixomatosis y la enfermedad hemorragica de los conejos.
US6294176B1 (en) * 1998-07-10 2001-09-25 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species

Also Published As

Publication number Publication date
CA2439872C (en) 2009-12-15
CN1258596C (zh) 2006-06-07
DE60209345T2 (de) 2006-08-03
CA2439872A1 (en) 2002-09-19
EP1370668A2 (en) 2003-12-17
BR0207761A (pt) 2006-01-31
MXPA03007862A (es) 2004-05-24
NO20033912D0 (no) 2003-09-04
EP1370668B1 (en) 2006-02-22
US6942864B2 (en) 2005-09-13
WO2002072852A3 (en) 2002-12-27
US20040137599A1 (en) 2004-07-15
AU2002304856B2 (en) 2006-08-24
JP2004528833A (ja) 2004-09-24
NO20033912L (no) 2003-10-22
JP4037273B2 (ja) 2008-01-23
NZ527940A (en) 2005-01-28
ES2258628T3 (es) 2006-09-01
WO2002072852A2 (en) 2002-09-19
DE60209345D1 (de) 2006-04-27
DK1370668T3 (da) 2006-06-06
NO331305B1 (no) 2011-11-21
ZA200306607B (en) 2005-02-23
ATE318321T1 (de) 2006-03-15
PT1370668E (pt) 2006-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1056878C (zh) 重组火鸡疱疹病毒及其衍生的活载体疫苗
JP5106398B2 (ja) Ｐｃｖ−２ワクチン
JP6096176B2 (ja) ブタウイルス感染の予防のための混合ワクチン
CN1912112A (zh) 重组的感染性不分节段的负链rna病毒
CN1940063A (zh) 一种伪狂犬病gEˉ/gIˉ基因缺失毒株、含有该毒株的灭活疫苗及应用
CN111876391A (zh) 猫泛白细胞减少症病毒fpv bj05株及其应用
CN1800374A (zh) 一种重组伪狂犬病－猪繁殖与呼吸综合征基因工程毒株及应用
JP7387623B2 (ja) 標的タンパク質を安定して発現できる組換えウイルス
CN1258596C (zh) 基于野兔痘的载体疫苗
CN1295339C (zh) 减毒痘苗病毒天坛株载体及制备方法和应用
JP2020537651A (ja) 昆虫細胞でのＰＣＶ２ｂ ＯＲＦ２タンパク質の組換え発現
CN1654666A (zh) 减毒痘苗病毒天坛株载体及制备方法和应用
CN114921422B (zh) 一种犬源猫细小病毒分离株及其应用
JPS637754B2 (zh)
CN1225553C (zh) 表达猪细小病毒vp2基因的重组伪狂犬病毒及疫苗与制备方法
Li et al. Immunogenicity assessment of rift valley fever virus virus-like particles in BALB/c mice
CN115161291A (zh) 一株猫细小病毒毒株及其应用
AU2002304856A1 (en) Leporipox-based vector vaccines
CN1283788C (zh) 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的重组伪狂犬病毒及应用
Frossard Retroviridae
CN117568288B (zh) 一种高效拯救禽冠状病毒的方法及其应用
US11033616B2 (en) Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom
CN114107227B (zh) 一种同时表达经典株和变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗
JP4856939B2 (ja) 感染症予防ワクチン
CN1264975C (zh) 轮状病毒基因重配株

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: INTERVET INTERNATIONAL CO., LTD.

Free format text: FORMER OWNER: AKZO NOVEL N.V. CORP.

Effective date: 20061208

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20061208

Address after: Holland Haier box

Patentee after: Intervet International Co., Ltd.

Address before: Holland Arnhem

Patentee before: Akzo Nobel N. V.

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20060607

Termination date: 20170307