JP2004528833A - レポリポックスベースのベクターワクチン - Google Patents
レポリポックスベースのベクターワクチンInfo
- Publication number
- JP2004528833A JP2004528833A JP2002571903A JP2002571903A JP2004528833A JP 2004528833 A JP2004528833 A JP 2004528833A JP 2002571903 A JP2002571903 A JP 2002571903A JP 2002571903 A JP2002571903 A JP 2002571903A JP 2004528833 A JP2004528833 A JP 2004528833A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- exogenous dna
- recombinant
- rabbit
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 229940126580 vector vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 63
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims abstract description 52
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 27
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims abstract description 18
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims abstract description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 241000700562 Myxoma virus Species 0.000 claims description 35
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 21
- 241000714201 Feline calicivirus Species 0.000 claims description 18
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 claims description 13
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 13
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 claims description 11
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 claims description 10
- 241000701915 Feline panleukopenia virus Species 0.000 claims description 6
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 claims description 3
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 claims description 3
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims 1
- 102100021696 Syncytin-1 Human genes 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 14
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 8
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 abstract description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 18
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 7
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 6
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 6
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 description 5
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 5
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 5
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 206010016629 fibroma Diseases 0.000 description 5
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 101710197665 Capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 4
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 241000714203 Rabbit hemorrhagic disease virus Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 3
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 101900316143 Feline calicivirus Capsid protein Proteins 0.000 description 3
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 3
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 3
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 208000009091 myxoma Diseases 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710083734 CTP synthase Proteins 0.000 description 2
- 102100039866 CTP synthase 1 Human genes 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 2
- 208000004729 Feline Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000711475 Feline infectious peritonitis virus Species 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 2
- 101000947178 Homo sapiens Platelet basic protein Proteins 0.000 description 2
- -1 IP10 Proteins 0.000 description 2
- 241000712045 Morbillivirus Species 0.000 description 2
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100036154 Platelet basic protein Human genes 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 2
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108010071023 Bacterial Outer Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023702 C-C motif chemokine 13 Human genes 0.000 description 1
- 101710112613 C-C motif chemokine 13 Proteins 0.000 description 1
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710155857 C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100032366 C-C motif chemokine 7 Human genes 0.000 description 1
- 101710155834 C-C motif chemokine 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100034871 C-C motif chemokine 8 Human genes 0.000 description 1
- 101710155833 C-C motif chemokine 8 Proteins 0.000 description 1
- 102100039398 C-X-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 1
- 108700012434 CCL3 Proteins 0.000 description 1
- 101900009576 Canine coronavirus Spike glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101800001383 Capsid protein VP60 Proteins 0.000 description 1
- 241001466804 Carnivora Species 0.000 description 1
- 102000000013 Chemokine CCL3 Human genes 0.000 description 1
- 102000001326 Chemokine CCL4 Human genes 0.000 description 1
- 108010055165 Chemokine CCL4 Proteins 0.000 description 1
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 1
- 102000016950 Chemokine CXCL1 Human genes 0.000 description 1
- 108010014419 Chemokine CXCL1 Proteins 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 102400000498 Connective tissue-activating peptide III Human genes 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241001076388 Fimbria Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101000889128 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000973997 Homo sapiens Nucleosome assembly protein 1-like 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101710164702 Major outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 102100030304 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 1
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710150344 Protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 101710181917 Serine proteinase inhibitor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710181913 Serine proteinase inhibitor 2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036034 Thrombospondin-1 Human genes 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010065667 Viral Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101710201961 Virion infectivity factor Proteins 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 102220361483 c.31A>T Human genes 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 108010035886 connective tissue-activating peptide Proteins 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 1
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N mcp 2 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 AEUKDPKXTPNBNY-XEYRWQBLSA-N 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N oxo(oxoalumanyloxy)alumane Chemical compound O=[Al]O[Al]=O TWNQGVIAIRXVLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 108010089520 pol Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L sodium carbonate Substances [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/21—Retroviridae, e.g. equine infectious anemia virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/23—Parvoviridae, e.g. feline panleukopenia virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
- A61K2039/552—Veterinary vaccine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
- C12N2740/13034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/16011—Caliciviridae
- C12N2770/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Abstract
本発明は、非ウサギ種における感染症を治療及び／または予防するためのベクターワクチンの製造における、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスの使用に関する。本発明は更に、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれ、非ウサギ病原体の少なくとも１つの抗原をコードすることを特徴とする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスに関する。宿主範囲が限定されているために、前記した組換えレポリポックスウイルスは非ウサギ脊椎動物のような非感受性宿主では非病原性である。前記した組換えレポリポックスウイルスを用いてワクチン接種すると、ワクチン接種した非ウサギ宿主においてウイルスの生産的複製が認められなかったとしても前記宿主において抗原または免疫原性応答が生じた。
Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非感受性宿主種におけるレポリポックスウイルスベクターワクチンの使用及び生組換えレポリポックスウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
オルトポックス及びアビポックスウイルスをベースとするベクターワクチン及びこれらのワクチン接種時の組換えウイルスベクターとしての可能性は公知である。米国特許第５，７５９，８４１号明細書には、少なくとも１つの糖タンパク質をコードするモルビリウイルスＤＮＡ及び該ＤＮＡの発現のためのプロモーターをワクチンウイルスゲノムの非必須領域に含む組み換えワクシニアウイルスが記載されている。前記組換えワクシニアウイルスはイヌにおいてモルビリウイルスに対する免疫応答を誘発させるためのワクチン中に使用され得る。しかしながら、前記の組換えワクシニアベクターウイルスはヒトを含めた多数のいろいろの種において許容性であり、よってここに記載されているワクシニアベクターウイルスはワクチン接種宿主を無拘束に感染させたり、ワクチン接種宿主から非ワクチン接種宿主へ伝染させるという危険性を有している。
【０００３】
国際特許出願公開第９５２７７８０号パンフレットには、宿主範囲が制限されているために非トリ宿主において弱毒化病原性を有している組換えアビポックスウイルスが開示されている。この組換えアビポックスウイルスはウイルスゲノムの非必須領域に外来性ＤＮＡを含み、この外来性ＤＮＡはイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）抗原、ハシカウイルス（ＭＶ）ＭまたはＮ抗原の少なくとも１つをコードする。前記ウイルスはネコ及び他の肉食動物並びにヒトにおいて抗原または免疫学的応答を誘発させるために使用され得る。組換えアビポックスベクターウイルスは天然宿主に限定され、非トリ種に前記ベクターウイルスをワクチン接種すると、ウイルスを生産的に複製させることなく外来性抗原が発現する。しかしながら、アビポックスウイルスベクターをワクチン接種した後も外来性抗原の発現レベルは低いままである。よって、外来性抗原の発現レベルを向上させる必要がある。更に、アビポックスウイルスベクターでの免疫化により必ずしも外来性抗原に対して十分な中和抗体が生ずるわけではない。ネコにカナリア痘ベースのＦｅＬＶベクターワクチンを接種しても中和抗−ＦｅＬＶ抗体は生成しなかつた（Ｊ．Ｔａｒｔａｇｌｉａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：２３７０−２３７５（１９９３））。生まれたばかりの子猫は特にＦｅＬＶ感染を受けやすい。生まれたばかりの子猫は生後１週間の間成熟免疫系を持っていないので、ＦｅＬＶ感染に対する防御のために母親由来抗体に頼らざるを得ない。中和抗体を持つ母猫にワクチン接種しなかったら、子猫はＦｅＬＶから防御されず、ＦｅＬＶ感染されるであろう。
【０００４】
驚くことに、少なくとも１つの抗原をコードする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスがレポリポックスウイルスの生産的感染に対して通常感受性でない宿主において抗原または免疫原性応答を誘発するために使用され得ること、すなわちレポリポックスウイルスが複製後前記宿主において複製し得ないことが知見された。レポリポックスウイルスの生産的複製はウサギ種でしか生じない。従って、非ウサギ種にレポリポックスウイルスを感染させてもレポリポックスウイルスは複製されない。よって、他の接触動物へのウイルスベクターの発散が起こらない事実から明らかなように、生組換えレポリポックスウイルスは非感受性宿主を感染させ、前記宿主において組換えウイルスの生産的複製の非存在下で抗原を発現させ得るという驚くべき知見を得た。より驚くことに、非ウサギ種にレポリポックスウイルスを感染させると、前記宿主においてウイルスの生産的複製は見られなかったとしても外来性ＤＮＡによりコードされる抗原の発現レベルは高かった。数種の哺乳動物細胞株ではウイルスベクターはインビトロで増殖しない。更に、前記した非感受性宿主ではレポリポックスウイルスベクターの生産的複製が存在しないために、レポリポックスウイルスは非ウサギ種では非病原性であり、これらのウイルスベクターはワクチン接種のためにより好適となる。
【０００５】
外来性ＤＮＡを含む組換え粘液腫ウイルスを用いるワクチン接種はフランス国特許公開第２７３６３５８号明細書に記載されている。前記組換え粘液腫ウイルスは粘液腫症や他の家兎病原体により引き起こされる感染症に対して家兎をワクチン接種するために使用した。しかしながら、フランス国特許公開第２７３６３５８号明細書には、非感受性種、特に非ウサギ種において抗原または免疫原性応答を誘発させるためのウイルスベクターとして生組換え粘液腫ウイルスを使用することは示唆されていない。
【０００６】
本発明は、非ウサギ種における感染症の治療及び／または予防のためのベクターワクチンの製造における、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスの使用に関する。少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換え粘液腫ウイルスを非ウサギ種における感染症の治療及び／または予防のためのベクターワクチンの製造において使用することが好ましい。より具体的には、本発明は、トリ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ及びヒト種における感染症の治療及び／または予防のためのベクターワクチンの製造における前記した生組換えレポリポックスウイルスの使用に関する。好ましくは、本発明の生組換えレポリポックスウイルスはイヌまたはネコ種における感染症の治療のためのベクターワクチンを製造するために使用される。
【０００７】
本発明は更に、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し、非ウサギにおいて感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスを提供する。より具体的には、前記外来性ＤＮＡがヒト、ウシ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマまたはヒツジ種において感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードすることが好ましい。好ましくは、外来性ＤＮＡはネコまたはイヌ病原体の抗原をコードする。本発明によれば、病原体は患者にワクチン接種しなければならない病気に応じてウイルス、バクテリアまたは寄生虫起源であり得る。病原体がＲＮＡゲノムを有するならば、当該抗原は遺伝子に相当するｃＤＮＡによりコードされ得る。外来性ＤＮＡは同一の病原体または異なる病原体に由来し得る２つ以上の抗原をコードし得る。
【０００８】
組換えレポリポックスウイルス中に使用するための好適な外来性ＤＮＡは、好ましくはウイルス糖タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスマトリックスタンパク質、バクテリア外膜タンパク質、バクテリアエンテロトキシン、バクテリアフィンブリアまたは寄生虫タンパク質をコードする。外来性ＤＮＡは、具体的にはネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５８：８２５−８３４（１９８６））またはマトリックスタンパク質（Ｄｏｎａｈｕｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：７２２−７３１（１９８８））、ネコ−またはヒツジクラミジア主要外膜タンパク質（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰＦＰＮＭＯＭＰ及びＣＨＴＭＯＭＰＸ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）ＶＰ２タンパク質（Ｊ．Ｃａｒｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５５：５７４−５８２（１９８５））、ネコカリシウイルスキャプシドタンパク質（Ｍ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒら，Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１２２：２２３−２３５（１９９２））、ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）Ｇａｐ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、ＴａｔまたはＶｉｆタンパク質（Ｒ．Ｉ．Ｔａｌｂｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：５７４３−５７４７（１９８９）；Ｔ．Ｒ．Ｐｈｉｌｉｐｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：４６０５−４６１３（１９９０）；Ｋ．Ｍ．Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２６１：２５−３０（１９９９））、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）膜−、ヌクレオキャプシド−またはスパイクタンパク質（Ｒ．Ｊ．ｄｅＧｒｏｏｔら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：２６３９−２６４６（１９８７）；Ｈ．Ｖｅｎｎｅｍａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８１：３２７−３３５（１９９１））、イヌジステンパーウイルスＥｎｖ、ＨＡ、融合−またはヌクレオキャプシドタンパク質（Ｍ．Ｓｉｄｈｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９３：６６−７２（１９９３）；Ｕ．Ｇａｓｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１０７３７−１０７４４（２０００））、イヌパルボウイルスＶＰ２タンパク質（Ｐ．Ｒｅｅｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：２６６−２７６（１９８８））、家兎ウイルス糖タンパク質Ｇ（Ｔ．Ｊ．Ｗｉｋｔｏｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１９４−７１９８（１９８４））、イヌコロナウイルススパイクタンパク質（Ｂ．Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８４９−２８６４（２０００））をコードする。非ウサギ病原体由来の免疫原性タンパク質をコードする遺伝子に加えて、外来性ＤＮＡは、ＩＮＦγ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ３０６１９）、ＩＬ−１β（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ９２０６０）、ＩＬ−２／１５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５４６０１）、ＩＬ−４、ＩＬ−５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２５４３６）、ＩＬ−６、ＩＬ−１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８３１８４及びＵ８３１８５）、ＩＬ−１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００３７０１）またはＩＬ−１８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４６２１１）のようなサイトカイン、またはα−ケモカインＩＬ−８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ００３５０１）、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＮＡＰ−２、ＰＦ−４、ＩＰ１０、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、β−ＴＧ及びβ−ケモカインＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００２９８２）、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ０１２６５６）、ＭＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２５１１９０）、ＭＣＰ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００６２７３）、ＭＣＰ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２５１９１）のような化学走化性サイトカインをコードする遺伝子をも含み得る。本発明の好適なサイトカインをコードする遺伝子がワクチンを投与する同一種から誘導されることが好ましい。
【０００９】
外来性ＤＮＡは少なくとも１つの発現調節因子に作動的に結合しており、前記発現調節因子により該外来性ＤＮＡの発現が調節、制御される。好ましい実施態様において、外来性ＤＮＡ中に存在する各遺伝子は個別の発現調節因子により調節される。発現調節因子は当業界で公知であり、その中にはプロモーターが含まれる。本発明の外来性ＤＮＡの発現のために好適なプロモーターは、細胞質における発現を調節し得るウイルスまたは合成プロモーターである。本発明において有用なプロモーターはポックスウイルスプロモーター、好ましくはワクシニアプロモーター（ドイツ国特許公開第１９６２７１９３号明細書；Ｍａｃｋｅｔｔら，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，「ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)第３巻」，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．（１９８５年）発行参照）である。本発明の好ましいプロモーターは合成プロモーターであり、合成の初期−または初期／後期プロモーターがより好ましい。合成ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターはＣｈａｋｒａｂａｔｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，６：１０９４−１０９７（１９９７）に記載されている。前記プロモーターは当業界の一般的方法、例えば上掲のＣｈａｋｒａｂａｔｉら（１９９７）に記載されているような方法を用いて合成され得る。
【００１０】
本発明に従って使用され得る好適なレポリポックスウイルスの例には粘液腫ウイルス及びショープ線維腫ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。好適な粘液腫ウイルス株には、Ｌａｕｓａｎｎｅ株（ＡＴＣＣから入手可能）、ＳＧ３３（Ｍ．Ｄ．Ｍａｉｎｉｌら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２２：１１５−１２２（２０００））、Ｂｏｒｇｈｉ及びＢｏｅｒｌａｇｅ（Ｆｅｎｎｅｒ ＆ Ｆａｎｔｉｎｉ，「脊椎動物害虫の生物学的防除(Biological control of Vertebrate Pests)」，ＣＡＢＩ（１９９９年）発行，ＩＳＢＮ ０ ８５１９９ ３２３ ０及びここに引用されている文献）が含まれる。好適なショープ線維腫ウイルス株には、Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１１２）及びＫａｓｚａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−３６４）が含まれる。本発明の生組換えレポリポックスウイルスが粘液腫から誘導されることが好ましい。宿主がウサギ種に限定されているために、レポリポックスウイルスは非ウサギ宿主においては非病原性である。しかしながら、本発明の生組換えウイルスを生成するために弱毒化レポリポックスウイルスを産生することが好ましい。本発明では、弱毒化レポリポックスウイルスは病気を引き起こすことなく標的のウサギ宿主において生産的に複製し得るレポリポックスウイルスと定義される。レポリポックスウイルスの弱毒化は株を連続経代させるかまたはウイルス複製のために必須でない１つ以上の病原性遺伝子を欠失させることにより実施され得る。レポリポックスウイルスゲノムの完全ＤＮＡ配列、そのゲノムの構築及びすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置はＣａｍｅｒｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６４：２９８−３１８（１９９９）に記載されている。ショープ線維腫ウイルスゲノムの完全ＤＮＡ配列、そのゲノムの構築及びすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置はＷｉｌｌｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６４：３１９−３４３（１９９９）に記載されている。
【００１１】
好ましくは、本発明の外来性ＤＮＡはレポリポックスウイルスゲノムの非必須遺伝子領域に挿入される。より好ましくは、外来性ＤＮＡはレポリポックスウイルスの病原性に関与する非必須遺伝子領域に挿入される。粘液腫ウイルスゲノムまたはショープ線維腫ウイルスゲノムの好適な非必須遺伝子領域はチミジンキナーゼをコードするＴＫ遺伝子、Ｍ１１Ｌ ＯＲＦ、ＳＥＲＰ−１、−２及び−３ ＯＲＦ及びＭＧＦ ＯＲＦである（上掲のＣａｍｅｒｏｎら（１９９９）；上掲のＷｉｌｌｅｒら（１９９９））。本発明の好ましい実施態様では、１つ以上の非必須ウイルス遺伝子を欠失させた後外来性ＤＮＡ及びプロモーターを挿入させる。ＭＧＦ ＯＲＦは病原性因子をコードし、インビトロまたはインビボでの増殖に必須でないので、このＯＲＦの少なくとも一部を欠失させることが特に好ましい（Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９１：１１２−１２４（１９９２））。ＭＧＦ ＯＲＦを欠失させると、レポリポックスウイルスの病原性が低下する。
【００１２】
本発明の生組換えレポリポックスウイルスは、外来性ＤＮＡのレポリポックスウイルスゲノムへの部位特異的組換えによる挿入を含むインビボ組換え方法を用いて産生され得る。これは、組換えワクシニアウイルス及び組換え鶏頭ウイルスの産生について記載している方法（米国特許第４，６０３，１１２号明細書；米国特許第５，０９３，２５８号明細書参照；Ｐ．Ｘ．Ｇｕｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：４１８９−４１９８（１９９０）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)第３巻中のＭａｃｋｅｔｔら，「外来性遺伝子を発現するワクシニアウイル組換え体の構築及びキャラクタリゼーション(Construction And Characterization Of Vaccinia Virus Recombinants Expressing Exogenous Genes)」，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．（１９８５年）発行）と同様にして実施し得る。通常、本発明の生組換えレポリポックスウイルスは少なくとも１つの発現調節因子の制御下で外来性ＤＮＡを有するＤＮＡベクターと親レポリポックスゲノムの間での部位特異的組換えにより産生され得る。部位特異的組換えに使用するための適当なＤＮＡベクターは複数のクローニングサイトを含むプラスミドから誘導され得る。ＤＮＡベクターは、少なくとも１つの発現調節因子に結合し且つ外来性ＤＮＡが導入されるレポリポックスゲノムの領域に相同のウイルスＤＮＡ配列間にある外来性ＤＮＡを含む。外来性ＤＮＡに隣接するウイルスＤＮＡ配列はレポリポックスウイルスの複製に必須でない領域から選択されることが好ましい。レポリポックスウイルスとの組換えのためのＤＮＡベクターは更に、ポックスウイルスプロモーターの制御下で選択マーカーをコードする遺伝子を含み得る。追加の遺伝子及びプロモーターもレポリポックスゲノム由来のウイルスＤＮＡ配列間にある。親レポリポックスウイルスを感染させた宿主細胞にＤＮＡベクターをトランスフェクトさせる。好適な宿主細胞は、レポリポックスウイルスに対して許容的であり且つＤＮＡベクターによりトランスフェクトされ得る真核細胞である。宿主細胞の例は、家兎腎臓細胞ＬＬＣ−ＲＫ１及びＲＫ１３、家兎肺細胞Ｒ９ａｂ、家兎皮膚細胞ＳＦ １ Ｅｐ、ＤＲＳ及びＲＡＢ−９、家兎角膜細胞ＳＩＲＣ、家兎癌腫細胞Ｏｃ４Ｔ／ｃｃ、家兎皮膚／癌腫細胞ＣＴＰＳ、Ｖｅｒｏ細胞であり、これらの細胞はすべてＡＴＣＣから入手可能である。
【００１３】
本発明の生組換えレポリポックスウイルスを産生するのに適した親レポリポックスウイルスは粘液腫ウイルス株、例えばＬａｕｓａｎｎｅ株（ＡＴＣＣより入手可能）、ＳＧ３３（Ｍ．Ｄ．Ｍａｉｎｉｌ，ら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２２：１１５−１２２（２０００））、Ｂｏｒｇｈｉ及びＢｏｅｒｌａｇｅ（Ｆｅｎｎｅｒ ＆ Ｆａｎｔｉｎｉ，「脊椎動物害虫の生物学的防除(Biological control of Vertebrate Pests)」，ＣＡＢＩ（１９９９年）発行，ＩＳＢＮ ０ ８５１９９ ３２３ ０及びここに引用されている文献）、並びにショープ線維腫ウイルス株（Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１１２）及びＫａｓｚａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−３６４）を含む）である。本発明の生組換えレポリポックスウイルスを産生するために粘液腫ウイルス株を使用することが好ましい。好ましい親レポリポックスウイルスが弱毒化ウイルス、すなわち病気を生じさせることなく標的のウサギ宿主において生産的に複製し得るレポリポックスウイルスである。レポリポックスウイルス株の弱毒化は、株を連続経代させるかまたはウイルス複製に必須でない１つ以上の病原性遺伝子を欠失させることにより実施され得る（完全なゲノム配列及び遺伝子の局在化については、上掲のＣａｍｅｒｏｎら（１９９９）及び上掲のＷｉｌｌｅｒら（１９９９））。
【００１４】
ＤＮＡベクター上のレポリポックスＤＮＡ配列と親レポリポックスゲノム上の対応ＤＮＡの間で組換えが起こっている間にウイルスは宿主細胞において複製する。前記組換えにより、１つ以上の発現調節因子に結合した外来性ＤＮＡがレポリポックスゲノムに挿入される。組換えレポリポックスウイルスは当業界で公知の標準の選択またはスクリーニング方法を用いて選択、精製される。前記公知方法には、外来性ＤＮＡに相同のプローブを用いるハイブリダイゼーションによる外来性ＤＮＡの検出、外来性ＤＮＡを一緒に組み込んだ選択マーカーの発現の検出、外来性ＤＮＡを挿入した欠失レポリポックス遺伝子の発現産物の不在の検出が含まれる。組換えレポリポックスウイルスゲノムへの外来性ＤＮＡの挿入はポリメラーゼ連鎖反応分析により確認され得る。
【００１５】
本発明の組換えレポリポックスウイルスベクターは、インビボで宿主を免疫化するのに十分な抗原レベルに達し得るので非ウサギにおいて免疫化剤として使用するのに特に適している。宿主範囲が制限されているので、ウイルスは非ウサギ宿主において弱毒化され、よってレポリポックスウイルスにより病気が発症する危険性はない。宿主範囲が制限されていることから、本発明のレポリポックスウイルスがワクチン接種の標的でない宿主中に広がることが防止される。よって、更なる態様では、本発明は医薬組成物、より好ましくは少なくとも１つの発現調節因子に作動的に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれ、非ウサギにおいて感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスを医薬的に許容され得る担体と共に含むワクチンを提供する。本発明のワクチンが少なくとも非ウサギ病原体の免疫原タンパク質を発現する本発明の生組換え粘液腫ウイルスを医薬的に許容され得る担体と共に含むことが好ましい。２つ以上の免疫原性タンパク質を発現する本発明の組換えレポリポックスウイルスが多価ワクチンを製造するのに特に適している。
【００１６】
本発明のワクチン組成物は標準的手順に従って製造され得る。組換えレポリポックスウイルスは該ウイルスが許容性である細胞培養物、例えばいずれもＡＴＣＣから入手可能である家兎腎臓細胞ＬＬＣ−ＲＫ１及びＲＫ１３、家兎肺細胞Ｒ９ａｂ、家兎皮膚細胞ＳＦ １Ｅ ｐ、ＤＲＳ及びＲＡＢ−９、家兎角膜細胞ＳＩＲＣ、家兎癌腫細胞Ｏｃ４Ｔ／ｃｃ、家兎皮膚／癌腫細胞ＣＴＰＳ、Ｖｅｒｏ細胞において増殖され得る。こうして増殖させたウイルスを組織細胞培養液及び／または細胞を集めることにより収集され得る。場合により、収集中に増殖基質からの感染粒子の遊離を改善する技術、例えば超音波や凍結融解を適用することによりウイルスの収率を増加させ得る。生ワクチンは懸濁液の形態で製造されても凍結乾燥されてもよい。
【００１７】
本発明のワクチン中に使用するのに適した医薬的に許容され得る担体は滅菌水、食塩水、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）等である。加えて、本発明のワクチンは他の添加剤、例えばアジュバント、安定剤、酸化防止剤等を含み得る。
【００１８】
好適な安定剤の例は、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストラン及びグルコース）、タンパク質及びその分解生成物（非限定例には、アルブミン及びカゼインが含まれる）、タンパク質含有物質（例えば、ウシ血清または脱脂乳）、緩衝液（非限定例には、アルカリ金属ホスフェートが含まれる）である。凍結乾燥ワクチン組成物中には１つ以上の安定剤を添加することが好ましい。
【００１９】
好適なアジュバントの非限定例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、アンフィゲン、トコフェノール、モノホスフェニル脂質Ａ、ムラミルジペプチド、オイルエマルション、グルカン、カルボマー、ブロックコポリマー、サイトカイン及びサポニン（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ）が含まれる。アジュバントの添加量はアジュバントの種類に依存する。ＩＮＦγ、ＩＬ−１２やＩＬ−１８のようなサイトカインが本発明のワクチン中に使用するのに非常に適している。
【００２０】
好ましくは、本発明の組換えレポリポックスウイルスは非ウサギ種に対して非経口投与ルートにより投与される。前記投与ルートの非限定例には、筋肉内、皮内または皮下ルートが含まれる。また、ワクチンを経口、スプレー、眼内、鼻内または卵内投与のような経口投与により投与してもよい。
【００２１】
通常、本発明の組換えレポリポックスウイルスは、十分な発現レベルの外来性タンパク質を誘発させるのに有効な量で投与される。その用量は通常投与ルート、投与時期、ワンチン接種する動物の年令、健康状態及び食餌に依存する。組換えレポリポックスウイルスは１０２〜１０１１ｐｆｕ／用量／動物、好ましくは１０４〜１０９ｐｆｕ／用量／動物、より好ましくは１０６〜１０７ｐｆｕ／用量／動物の量で投与され得る。ここで、ｐｆｕはプラーク形成単位である。
【００２２】
本発明のワクチンを他の生または不活化ワクチンと同時にまたは付随的に投与してもよい。これらの追加ワクチンは非経口または経口投与ルートで投与され得る。好ましくは、追加ワクチンの非経口投与が推奨される。
【００２３】
下記実施例は本発明を説明するものであって、本発明は本明細書に記載の特定実施態様に限定されない。
【実施例１】
【００２４】
中間体ＤＮＡプラスミドｐＶ Ｌ 及びｐＶ ＥＬ の作成
この方法の出発プラスミドは、家兎出血性疾患ウイルスのｃＤＮＡ（Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８４：６６４−６７６（１９９１））を含有する市販のプラスミドｐＣＩＴＥ２−ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）をベクターのＳａｌＩ及びＨｉｎｃＩＩサイトに挿入したものであった。このプラスミドをｐＣＩＴＥ／ＲＨＤと称する。
【００２５】
第１ステップはＭＧＦフランキング配列の導入であった。５’フランキング配列を増幅させるためにＰＣＲプライマーｍｙｘ ａ及びｍｙｘ ｂを使用した。
【００２６】
【化１】
【００２７】
組織培養で増殖させたＭＲ２４（１０６ｐｆｕ／ｍｌ）の２μｌサンプルをＰＣＲ反応の鋳型として使用した。このＰＣＲ反応はＰＣＲビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、製造業者の指示に従って実施した。ＰＣＲ断片をＮｃｏＩ／平滑断片として一般的な実験方法に従ってｐＣＩＴＥ／ＲＨＤにクローン化した。まず、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した後ＮｃｏＩで消化することによりｐＣＩＴＥ／ＲＨＤを作成した。生じたプラスミドをｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂと称した。
【００２８】
第２ＰＣＲ反応を同一の鋳型調製物で下記プライマー
【００２９】
【化２】
を用いて実施して、３’フランキング配列を作成した。ＰＣＲ断片をＸｈｏＩ／Ｘｂａｌ断片としてＸｈｏＩ／Ｘｂａｌ切断ｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂにクローン化した。生じたプラスミドをｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂｃｄと称した。
【００３０】
次いで、以下のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより合成ポックスウイルスプロモーターを作成した。
【００３１】
【化３】
【００３２】
これらの２つの相補オリゴヌクレオチドを一緒にアニーリングすると、ＫｐｎＩ及びＮｃｏＩ制限サイトと相容性の付着末端が生ずる。同様に、以下の２つのオリゴヌクレオチドを一緒にアニーリングすると、ＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ相容性断片が生ずる。
【００３３】
【化４】
【００３４】
Ｖｐ５及びＶｐ６は一緒になって初期／後期プロモーターを構成し、Ｖｐ３及びＶｐ４は一緒になって後期プロモーターを構成する（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２３：１０９４−１０９４（１９９７））。次いで、アニーニングしたオリゴヌクレオチド対の１方または他方をＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ切断ｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂｃｄにクローン化すると、ｐＶＰ／ＲＨＤ（後期プロモーター）またはｐＥＬ／ＲＨＤ（初期／後期プロモーター）が生ずる。ＲＨＤキャプシド遺伝子は２つの構築物（ｐＶＰ／ＲＨＤ及びｐＥＬ／ＲＨＤ）のいずれかの第１メチオニンの枠に入っていないので、発現させるためにはＲＨＤキャプシド遺伝子（Ｖｐ６０）を再度クローン化し、介在配列を除去しなければならなかった。プラスミドｐＶＰ／ＲＨＤ及びｐＥＬ／ＲＨＤをＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断して、Ｖｐ６０コード配列及び初期ＡＴＧに対して５’の非コード配列を除去した。次いで、Ｖｐ６０遺伝子を以下のオリゴヌクレオチドを用いて作成したＰＣＲ生成断片で置換した。
【００３５】
【化５】
【００３６】
ＰＣＲ反応の鋳型はｐＣＩＴＥ／ＲＨＤであった。ＰＣＲ生成断片をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、作成したｐＶＰ／ＲＨＤ及びｐＥＬ／ＲＨＤにクローン化した。生じたプラスミドをｐＶＰ／Ｖｐ６０及びｐＥＬ／Ｖｐ６０と称した。他の制限サイトに隣接する遺伝子を導入するために、ｐＶＰ／Ｖｐ６０及びｐＥＬ／Ｖｐ６０中のユニークなＮｃｏＩサイトの下流に複数のクローニングサイトを導入した。以下のオリゴヌクレオチド
【００３７】
【化６】
をアニーリングすると、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼサイトと相容性の懸垂末端が生じる。ＲＨＤ関連配列をすべて有するＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ断片をアニーリングしたオリゴヌクレオチドで置換すると、２つのプラスミド、すなわちｐＶＬ及びｐＶＥＬ（図１参照）が生ずる。
【００３８】
プラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬを用いて、それぞれ家兎出血性疾患キャプシドタンパク質ＶＰ６０（上掲のＭｅｙｅｒｓら（１９９１））、緑色蛍光タンパク質（米国カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ネコ白血病エンベロープ糖タンパク質ｇｐ８５（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，５８：８２５−８３４（１９８６））、ネコ白血病マトリックス（ｇａｇ）タンパク質（Ｄｏｎａｈｕｅら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６２：７２２−７３１（１９８８））、ネコカリシウイルスキャプシドタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ１１５３６及びＮＣ ００１４８４１）、ネコ汎白血球減少症ウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ２（Ｃａｒｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，５５：５７４−５８２（１９８５））、ネコパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ２（Ｒｅｅｄ，Ｐ．ら，Ｊ，Ｖｉｏｌ．，６２：２６６−２７６（１９８８））の遺伝子を含む各種組換えＤＮＡプラスミドを構築した。表１には、本発明の組換え粘液腫ウイルスを生成するために構築した各種ＤＮＡプラスミドがリストされている。各組換えプラスミドは同一方法で構築したが、標的遺伝子は既存のプラスミドから切断したかまたは遺伝子末端の制限酵素サイトがｐＶＬ及びｐＶＥＬのｍｃｓ中のサイトと相容するようにＰＣＲで増幅させた。
【００３９】
ＤＮＡプラスミドｐＶ Ｌ ＧＦＰの作成
ＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドは米国カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化して、プラスミドからＧＦＰ遺伝子を切除した。この遺伝子をｐＶＬに挿入すると、ｐＶＬＧＦＰが生じた。
【００４０】
ＤＮＡプラスミドｐＶ ＥＬ ＦｅＬＶ ｅｎｖ の作成
エンペロープ遺伝子をｐＦＧＡ５（上掲のＳｔｅｗａｒｔ（１９８６））から以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅させた。
【００４１】
【化７】
【００４２】
ＰＣＲ断片をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＶＥＬに挿入すると、ｐＶＥＬＦｅＬＶｅｎｖが生じた。
【００４３】
ＤＮＡプラスミドｐＶ ＥＬ ＦＰＬの作成
以下のプライマーを用いるＰＣＲにより複製型（ｒｆ）ＤＮＡからＰＣＲ増幅することによりＦＰＬキャプシド遺伝子を得た。
【００４４】
【化８】
【００４５】
ｒｆ ＤＮＡは一般的方法（Ｐ．Ｒｅｅｄら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６２：２６６−２７６（１９８８））によりＦＰＬのワクチン株を感染させたネコ腎臓細胞（ＣＲＦＫ）から作成した。
【００４６】
ＤＮＡプラスミドｐＶ ＥＬ ＦＣＶの作成
ネコ腎臓細胞（ＣＲＦＫ）に０．１ｐｆｕ／細胞の多重度でＦＣＶ株Ｆ９を感染させた。３６時間後、細胞を収集し、全ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート（ＧｉｂＣｏ ＢＲＬのＴＲｌｚｏｌ試薬）を用いて作成した。ｏｌｉｇｏｄｔプライマー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ ＧｉｂＣｏ ＢＲＬ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。完全ヌクレオチド配列及びＦＣＶのＦ９株のゲノムの構築は報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８６３７９）。第２鎖ＤＮＡ合成を刺激し、その後キャプシド遺伝子をＰＣＲ増幅させるためにオリゴヌクレオチドを合成した。以下のオリゴヌクレオチドを用いてＦＣＶ（Ｆ９株）のＶｐ６０キャプシドタンパク質遺伝子を作成した。
【００４７】
【化９】
【００４８】
Ｖｐ６０キャプシド遺伝子をｐＶＬ及びｐＶＥＬのｍｃｓに挿入すると、それぞれｐＶＬＦＣＶ及びｐＶＥＬＦＣＶが生じた。
【００４９】
ＤＮＡプラスミドｐＶ ＥＬ ＣＰＶの作成
キャプシドタンパク質ＶＰ２をコードする遺伝子をＮｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ（登録商標）のＣＰＶワクチン株からＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＶＥＬに挿入した。
【実施例２】
【００５０】
組換え粘液腫ウイルスの生成
家兎腎臓細胞（ＲＫ１３）において長期間経代することにより弱毒化させた粘液腫ウイルスの非毒性株（ＭＲ２４と命名）を選択した。この弱毒化粘液腫ウイルス（ＭＲ２４）は、家兎に対して皮下、皮内または筋肉内投与したときに家兎では非毒性（死亡率０％）であることが分かった。ＭＲ２４は家兎において使用される粘液腫症ワクチン株の候補である。ウイルス滴定及び増幅はすべて家兎腎臓（ＲＫ−１３）細胞において実施した。
【００５１】
組換え粘液腫ウイルスは、組換えワクシニアウイルスの生成について記載している方法（上掲のＭａｃｋｅｔｔ（１９８５））に従って作成した。このためには、家兎腎臓細胞（ＲＫ１３）に０．１ｐｆｕ／細胞の多重度で粘液腫ウイルスＭＲ２４を感染させた。２時間後、細胞にリポフェクタミントランスフェクション試薬（ＧｉｂｏＣｏ ＢＲＬ）を用いてプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。組換えウイルスは、限界希釈及び免疫フルオレッセンスに基づいて選択した。
【００５２】
トランスフェクションから７２時間後、感染／トランスフェクトした細胞培養物を３回凍結融解してウイルスを遊離させた。この野生型及び組換え型ウイルスの一次ミックスを組織培養培地を用いて５０倍希釈した後、予めＲＫ１３細胞を接種した９６ウェル組織培養プレートの各ウェルを感染させるためにウイルスミックス１０μｌを使用した。次いで、９６ウェルプレートを７２時間インキュベートして、ウイルスの感染及び増殖を進行させた。この後、プレートの各ウェルの個々の状態を維持しながらプレートに対して凍結融解サイクルを３回実施した。こうすると、第１の丸いマスタープレートとなった。その後、各ウェルからのウイルス含有培地５μｌを１対のＲＫ１３細胞を接種した９６ウェルプレートにおいて平板培養した。４８時間後、１対のプレートを氷冷メタノールで固定し、プレートを免疫フルオレッセンスにより組換えタンパク質の発現についてスクリーニングした。
【００５３】
例えば、ｐＶＥＬＦｅＬＶｅｎｖを感染させ、トランスフェクトした細胞を、以下のようにしてＦｅＬＶエンベロープタンパク質の産生についてスクリーニングした。マウスモノクローナル抗体３−１７（オランダ国ウールデンに所在のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）腹水を１０００倍希釈した後、固定９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、次いでＦＩＴＣ標識家兎抗−マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）とインキュベートし、更に１時間インキュベートを続けた。最後に、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて検査した。感染の蛍光フォーカスを含むウェルを同定し、記録した。次いで、第１の丸いマスタープレートからの対応ウェルをより多くのＲＫ−１３接種９６ウェルプレート上に希釈した。こうすると、第２の丸いマスタープレートとなった。組換えウイルスが全ウイルスの２０〜５０％を占めるまで漸進濃縮プロセスを続けた。他の組換え粘液腫ウイルスの組換えタンパク質の発現を同様にスクリーニングした。
【００５４】
【表１】
【００５５】
最後に組換え体を、寒天重層培養物から感染の各フォーカスをピッキングすることにより精製した。
【実施例３】
【００５６】
ニワトリにおけるｍｙｘｏ／ＲＨＤ
組換え粘液腫瘍ウイルスを感染させた非ウサギ種が抗体応答を誘発するかを調べるために、ニワトリにｍｙｘｏ／ＲＨＤを皮下または筋肉内投与してニワトリを免疫化した。ニワトリには免疫化スケジュールの０日目及び１４日目に１０５ｐｆｕのウイルスを与えた。０日目、１４日目及び２８日目に血液サンプルを採取し、ＲＨＤＶに対する抗体について分析した。結果を表２に示す。すべてのニワトリが実験中臨床的には正常のままであった。
【００５７】
【表２】
【実施例４】
【００５８】
ネコにおけるｍｙｘｏ／ＦＣＶ
粘液腫／ネコカリシウイルスキャプシド組換えウイルス（ｍｙｘｏ／ＦＣＶ）が中和抗体応答を誘発させ、病原性のネコカリシウイルスの攻撃からネコを防御する効果を確立するために実験を実施した。１群４匹のネコ（第１群）には、５×１０６フォーカス形成単位（ｆｆｕ）のｍｙｘｏ／ＦＣＶを皮下投与して免疫化した。第１免疫化から３週間目に免疫化を繰り返した。４匹のワクチン接種していない対照動物（第２群）を試験動物と同じハウスに収容した。第２免疫化から４週間後、すべてのネコに対して１０５．３ＴＣＩＤ５０のネコカリシウイルスの病原性株を鼻内攻撃した。０．５ｍｌの攻撃ウイルスを各鼻孔に滴下した。
【００５９】
【表３】
【００６０】
実験開始時に、口腔咽頭にネコカリシウイルスが存在している動物はいないことを確かめるためにスワブを採取した。また、実験の開始前に抗−ＦＣＶ抗体を持っている動物はいないことを確かめるために血液サンプルを採取した。スワブはウイルスの排泄を調べるために攻撃後にも採取した。
【００６１】
実験中に採取した血液サンプルはウイルス中和アッセイで使用した。このアッセイにより、ネコにおける循環抗体レベルを測定する。血清抗体抗体が回復期の動物中に存在すること及びワクチン接種の結果生ずる既存の中和抗体が病気からの防御を与えるのに役立つことは公知である（Ｈｏｈｄａｔｓｕら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６１：２９９−３０１（１９９９））。
【００６２】
【表４】
【００６３】
ｍｙｘｏ−ＦＣＶをワクチン接種後の結果（表４）と従来のワクチンを用いた結果（表５）を比較すると、第１回ワクチン接種後第１群の動物は多くの市販ワクチンを２回投与した動物に匹敵する抗体応答を示すことが明らかであり、ネコは病気から保護されるであろうと示唆される。第２回ワクチン接種後、抗体価は市販のワクチン調製物で得られる値よりかなり高い（Ｈｏｈｄａｔｓｕら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６１：２９９−３０１（１９９９）；ＤｅＳｉｌｖｅｒら，第１回カリシウイルス国際シンポジウム議事録ＥＳＶＶ １３１−１４３）。
【００６４】
【表５】
【００６５】
Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９８８）が報告しているように、ＦＣＶ抗原を発現するネコヘルペスウイルスベクターも攻撃前非常に低い血清中和抗体価（２．５〜３．０）を誘発する。
【００６６】
【表６】
【実施例５】
【００６７】
ブタ及びウシにおけるｍｙｘｏ／ＦＣＶを用いる中和実験
非天然宿主、すなわちウシ及びブタにおいて防御免疫応答を誘発するための真核発現ベクターとしての粘液腫ウイルスの使用を皮内及び筋肉内注射により試験した。
【００６８】
成熟型のキャプシド抗原をコードするネコカリシウイルス遺伝子断片を含む粘液腫ウイルスベクターをウシ及びブタにおいて使用した。本研究には、１２週令のウシ４匹からなる群及び６週令のブタ４匹からなる群を含めた。
【００６９】
本研究の開始の１週間前に、動物がネコカリシウイルスに対して血清ネガティブであることを調べるために血液サンプル（１０ｍｌ／動物）を採取した。その後、動物に対して１×１０８ＦＦＵの組換え粘液腫ウイルス／投与ルート／動物を含有するＰＢＳ １ｍｌを皮内及び筋肉内注射した。動物は種毎に１群として収容した。４週間後、血液サンプル（１０ｍｌ／動物）を採取し、動物に対して同用量の粘液腫ウイルス、すなわち１×１０８ＦＦＵの組換え粘液腫ウイルス／投与ルート／動物を再び皮内及び筋肉内注射した。最後に注射してから２週間後、血液サンプル（１０ｍｌ／動物）を採取し、動物をインビボでのＧＭＯ試験に関するガイドラインに従って殺した。採取した血液サンプルについて、インビトロでのウイルス中和アッセイ方法に従ってカリシウイルスに対する抗体の存在を調べた。
【００７０】
【表７】
【００７１】
ＦＣＶ血清中和アッセイ方法
ＣｒＦＫ細胞に対するｃ．ｐ．ｅにより血清中和を調べた。２００ＴＣＩＤ５０のウイルスの５倍複製物を最終容量６００μｌで血清の連続希釈物（１：４〜）と混合した。次いで、ウイルス／血清混合物を無菌の５ｍｌ希釈管において３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、試験混合物１００μｌを、増殖培地１００μｌ中にＣｒＦＫ細胞を接種した９６ウェル組織培養皿に添加した。インキュベーションを５日間続けた。ＴＣＩＤ５０値をＲｅｅｄ及びＭｅｕｎｃｈ［１］：Ｌ．Ｊ．Ｒｅｅｄ及びＨ．Ｍｅｕｎｃｈ，「５０％終点を推定する簡単な方法(A simple method of estimating fifty percent end points)」，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，２７：４９３−４９７（１９８３）の方法に従って計算した。
【００７２】
【表８】
【実施例６】
【００７３】
インビトロで各種細胞タイプにおける粘液腫ウイルス株の増殖
２つの異なる粘液腫ウイルス菌株から構築した緑色蛍光タンパク質を発現する組換え粘液腫ウイルスで細胞を感染させた。蛍光細胞の数の増加により増殖を経時的にアッセイした。
【００７４】
表８に示すように、ｍｙｘｏ／ＧＦＰ組換えウイルスを各種細胞タイプで平板培養したときに蛍光が見られた。このことは、ウイルスは非ウサギ細胞においてＧＦＰ遺伝子をエントリーし、発現させることができたことを示している。表８から、インビトロでのウイルスの増殖が幾つかの細胞タイプにおいて見られ、試験した２つの構築物でパターンが異なっていたことが分かる。
【００７５】
【表９】
【実施例７】
【００７６】
イヌパルボウイルスワクチン接種に対する応答のＥＬＩＳＡ
イヌパルボウイルスキャプシドタンパク質Ｖｐ２を発現する組換え粘液腫ウイルスをイヌにワクチン接種することにより誘発される免疫応答を調べるために、ＥＬＩＳＡを実施した。ワクチン接種に対する応答を従来のワクチンを接種したイヌで見られた応答と比較した。
【００７７】
（材料及び方法）
材料
ＴＢＳ（５０ｍＭ トリス緩衝食塩水）：
５０ｍＭ トリス緩衝食塩水（ｐＨ７．５），トリス−ＨＣｌ（６．３５ｇ），トリス塩基（１．１８ｇ），ＮａＣｌ（８．７７ｇ），ｄＨ２Ｏ（８００ｍｌ）
ｐＨを７．５に調整し、ｄＨ２Ｏで容量を１Ｌとする。
ＴＢＳ−ツイーン：
ＴＢＳを上記したように調製した後ツイーン２０を添加する。十分に混合する。
【００７８】
方法
１．抗ＣＰＶモノクローナル抗体を０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）中に５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で懸濁させた。ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌ／ウェルの抗体懸濁液と共に４０℃で一晩インキュベートした。
２．過剰の抗原コーティング溶液を振盪除去した後、ＴＢＳ中１％ ＢＳＡ及び２％ 粉ミルク２００μｌと室温で１時間インキュベートすることにより各ウェルにおいて残りの結合サイトをブロックした。
３．ブロック溶液を振盪除去した後、約１０７ｐｆｕ／ｍｌの力価のイヌパルボウイルスを含有する組織培養懸濁液１００μｌと置換した。室温でインキュベーションを１〜２時間実施した。
４．プレートをＴＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。
５．被験血清をＴＢＳ中で連続希釈した。希釈物１００μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加し、室温でインキュベーションを１〜２時間続けた。
６．その後、プレートをＴＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。
７．抗−イヌアルカリホスファターゼ結合第２抗体（例えば、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓのカタログ番号６７５０７１）を製造業者が指示する希釈度で添加した。室温でインキュベーションを１〜２時間実施した。
８．プレートをＴＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。
９．基質ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート，例えばＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙのカタログ番号Ｎ２７７０）を添加することによりＥＬＩＳＡを展開した。
１０．分光光度計を用いて４２０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００７９】
結果を表９に示す。
【００８０】
【表１０】
【００８１】
ＥＬＩＳＡ結果は、従来のワクチンを接種したイヌの血清の１：４０希釈物は吸光度のバックグラウンドレベル、すなわちワクチン接種していないイヌ血清で見られるレベルを示すことを明らかに示している。一方、粘液腫−ＣＰＶ（Ｖｐ２）をワクチン接種したイヌの血清では、同じバックグラウンドレベルとするためには１：１２８０希釈物が必要である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１−１】中間体プラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬの構築の概略図。ＲＨＤは家兎出血性ウイルスのｃＤＮＡを表す。ａｂ（５’）及びｃｄ（３’）は粘液腫ウイルスＭＧＦフランキング領域を表す。プロモーターはそれぞれ合成の後期または初期／後期プロモーターを表す。“ｍｃｓ”は外来性ＤＮＡを導入するために複数のクローニングサイトを含むヌクレオチド配列を表す。
【図１−２】中間体プラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬの構築の概略図。ＲＨＤは家兎出血性ウイルスのｃＤＮＡを表す。ａｂ（５’）及びｃｄ（３’）は粘液腫ウイルスＭＧＦフランキング領域を表す。プロモーターはそれぞれ合成の後期または初期／後期プロモーターを表す。“ｍｃｓ”は外来性ＤＮＡを導入するために複数のクローニングサイトを含むヌクレオチド配列を表す。
【図２】構築したｐＶＬ及びｐＶＥＬをベースとする各種組換えＤＮＡプラスミド。Ｐは合成の後期（ｐＶＬ）または初期／後期（ｐＶＥＬ）プロモーター領域を表す。ａｂ（５’）及びｃｄ（３’）は粘液腫ウイルスＭＧＦフランキング領域を表す。ＲＨＤＶ Ｖｐ６０はＲＨＤＶ Ｖｐ６０タンパク質をコードする遺伝子を表す。ＦｅＬＶ ｇｐ８５はネコ白血病ウイルスｅｎｖ遺伝子を表す。ＦＣＶ Ｖｐ６０はネコカリシウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を表す。ＦＰＬ Ｖｐ２はネコ汎白血球減少症ウイルスｖｐ２遺伝子を表す。ＣＰＶ Ｖｐ２はイヌパルボウイルスｖｐ２遺伝子を表す。ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を表す。プラスミドはすべて選択マーカーとしてＡｍｐｒを含む（図示せず）。
【０００１】
本発明は、非感受性宿主種におけるレポリポックスウイルスベクターワクチンの使用及び生組換えレポリポックスウイルスに関する。
【背景技術】
【０００２】
オルトポックス及びアビポックスウイルスをベースとするベクターワクチン及びこれらのワクチン接種時の組換えウイルスベクターとしての可能性は公知である。米国特許第５，７５９，８４１号明細書には、少なくとも１つの糖タンパク質をコードするモルビリウイルスＤＮＡ及び該ＤＮＡの発現のためのプロモーターをワクチンウイルスゲノムの非必須領域に含む組み換えワクシニアウイルスが記載されている。前記組換えワクシニアウイルスはイヌにおいてモルビリウイルスに対する免疫応答を誘発させるためのワクチン中に使用され得る。しかしながら、前記の組換えワクシニアベクターウイルスはヒトを含めた多数のいろいろの種において許容性であり、よってここに記載されているワクシニアベクターウイルスはワクチン接種宿主を無拘束に感染させたり、ワクチン接種宿主から非ワクチン接種宿主へ伝染させるという危険性を有している。
【０００３】
国際特許出願公開第９５２７７８０号パンフレットには、宿主範囲が制限されているために非トリ宿主において弱毒化病原性を有している組換えアビポックスウイルスが開示されている。この組換えアビポックスウイルスはウイルスゲノムの非必須領域に外来性ＤＮＡを含み、この外来性ＤＮＡはイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）抗原、ハシカウイルス（ＭＶ）ＭまたはＮ抗原の少なくとも１つをコードする。前記ウイルスはネコ及び他の肉食動物並びにヒトにおいて抗原または免疫学的応答を誘発させるために使用され得る。組換えアビポックスベクターウイルスは天然宿主に限定され、非トリ種に前記ベクターウイルスをワクチン接種すると、ウイルスを生産的に複製させることなく外来性抗原が発現する。しかしながら、アビポックスウイルスベクターをワクチン接種した後も外来性抗原の発現レベルは低いままである。よって、外来性抗原の発現レベルを向上させる必要がある。更に、アビポックスウイルスベクターでの免疫化により必ずしも外来性抗原に対して十分な中和抗体が生ずるわけではない。ネコにカナリア痘ベースのＦｅＬＶベクターワクチンを接種しても中和抗−ＦｅＬＶ抗体は生成しなかつた（Ｊ．Ｔａｒｔａｇｌｉａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：２３７０−２３７５（１９９３））。生まれたばかりの子猫は特にＦｅＬＶ感染を受けやすい。生まれたばかりの子猫は生後１週間の間成熟免疫系を持っていないので、ＦｅＬＶ感染に対する防御のために母親由来抗体に頼らざるを得ない。中和抗体を持つ母猫にワクチン接種しなかったら、子猫はＦｅＬＶから防御されず、ＦｅＬＶ感染されるであろう。
【０００４】
驚くことに、少なくとも１つの抗原をコードする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスがレポリポックスウイルスの生産的感染に対して通常感受性でない宿主において抗原または免疫原性応答を誘発するために使用され得ること、すなわちレポリポックスウイルスが複製後前記宿主において複製し得ないことが知見された。レポリポックスウイルスの生産的複製はウサギ種でしか生じない。従って、非ウサギ種にレポリポックスウイルスを感染させてもレポリポックスウイルスは複製されない。よって、他の接触動物へのウイルスベクターの発散が起こらない事実から明らかなように、生組換えレポリポックスウイルスは非感受性宿主を感染させ、前記宿主において組換えウイルスの生産的複製の非存在下で抗原を発現させ得るという驚くべき知見を得た。より驚くことに、非ウサギ種にレポリポックスウイルスを感染させると、前記宿主においてウイルスの生産的複製は見られなかったとしても外来性ＤＮＡによりコードされる抗原の発現レベルは高かった。数種の哺乳動物細胞株ではウイルスベクターはインビトロで増殖しない。更に、前記した非感受性宿主ではレポリポックスウイルスベクターの生産的複製が存在しないために、レポリポックスウイルスは非ウサギ種では非病原性であり、これらのウイルスベクターはワクチン接種のためにより好適となる。
【０００５】
外来性ＤＮＡを含む組換え粘液腫ウイルスを用いるワクチン接種はフランス国特許公開第２７３６３５８号明細書に記載されている。前記組換え粘液腫ウイルスは粘液腫症や他の家兎病原体により引き起こされる感染症に対して家兎をワクチン接種するために使用した。しかしながら、フランス国特許公開第２７３６３５８号明細書には、非感受性種、特に非ウサギ種において抗原または免疫原性応答を誘発させるためのウイルスベクターとして生組換え粘液腫ウイルスを使用することは示唆されていない。
【０００６】
本発明は、非ウサギ種における感染症の治療及び／または予防のためのベクターワクチンの製造における、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスの使用に関する。少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換え粘液腫ウイルスを非ウサギ種における感染症の治療及び／または予防のためのベクターワクチンの製造において使用することが好ましい。より具体的には、本発明は、トリ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ及びヒト種における感染症の治療及び／または予防のためのベクターワクチンの製造における前記した生組換えレポリポックスウイルスの使用に関する。好ましくは、本発明の生組換えレポリポックスウイルスはイヌまたはネコ種における感染症の治療のためのベクターワクチンを製造するために使用される。
【０００７】
本発明は更に、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し、非ウサギにおいて感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスを提供する。より具体的には、前記外来性ＤＮＡがヒト、ウシ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ブタ、ウマまたはヒツジ種において感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードすることが好ましい。好ましくは、外来性ＤＮＡはネコまたはイヌ病原体の抗原をコードする。本発明によれば、病原体は患者にワクチン接種しなければならない病気に応じてウイルス、バクテリアまたは寄生虫起源であり得る。病原体がＲＮＡゲノムを有するならば、当該抗原は遺伝子に相当するｃＤＮＡによりコードされ得る。外来性ＤＮＡは同一の病原体または異なる病原体に由来し得る２つ以上の抗原をコードし得る。
【０００８】
組換えレポリポックスウイルス中に使用するための好適な外来性ＤＮＡは、好ましくはウイルス糖タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスマトリックスタンパク質、バクテリア外膜タンパク質、バクテリアエンテロトキシン、バクテリアフィンブリアまたは寄生虫タンパク質をコードする。外来性ＤＮＡは、具体的にはネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５８：８２５−８３４（１９８６））またはマトリックスタンパク質（Ｄｏｎａｈｕｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：７２２−７３１（１９８８））、ネコ−またはヒツジクラミジア主要外膜タンパク質（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＣＰＦＰＮＭＯＭＰ及びＣＨＴＭＯＭＰＸ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＶ）ＶＰ２タンパク質（Ｊ．Ｃａｒｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，５５：５７４−５８２（１９８５））、ネコカリシウイルスキャプシドタンパク質（Ｍ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒら，Ｊ．Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１２２：２２３−２３５（１９９２））、ネコ免疫不全症ウイルス（ＦＩＶ）Ｇａｐ、Ｐｏｌ、Ｒｅｖ、ＴａｔまたはＶｉｆタンパク質（Ｒ．Ｉ．Ｔａｌｂｏｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：５７４３−５７４７（１９８９）；Ｔ．Ｒ．Ｐｈｉｌｉｐｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６４：４６０５−４６１３（１９９０）；Ｋ．Ｍ．Ｌｏｃｋｒｉｄｇｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２６１：２５−３０（１９９９））、ネコ感染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）膜−、ヌクレオキャプシド−またはスパイクタンパク質（Ｒ．Ｊ．ｄｅＧｒｏｏｔら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，６８：２６３９−２６４６（１９８７）；Ｈ．Ｖｅｎｎｅｍａら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８１：３２７−３３５（１９９１））、イヌジステンパーウイルスＥｎｖ、ＨＡ、融合−またはヌクレオキャプシドタンパク質（Ｍ．Ｓｉｄｈｕら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９３：６６−７２（１９９３）；Ｕ．Ｇａｓｓｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１０７３７−１０７４４（２０００））、イヌパルボウイルスＶＰ２タンパク質（Ｐ．Ｒｅｅｄら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：２６６−２７６（１９８８））、家兎ウイルス糖タンパク質Ｇ（Ｔ．Ｊ．Ｗｉｋｔｏｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１９４−７１９８（１９８４））、イヌコロナウイルススパイクタンパク質（Ｂ．Ｈｏｒｓｂｕｒｇｈら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：２８４９−２８６４（２０００））をコードする。非ウサギ病原体由来の免疫原性タンパク質をコードする遺伝子に加えて、外来性ＤＮＡは、ＩＮＦγ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ３０６１９）、ＩＬ−１β（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ９２０６０）、ＩＬ−２／１５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５４６０１）、ＩＬ−４、ＩＬ−５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０２５４３６）、ＩＬ−６、ＩＬ−１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８３１８４及びＵ８３１８５）、ＩＬ−１６（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ００３７０１）またはＩＬ−１８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０４６２１１）のようなサイトカイン、またはα−ケモカインＩＬ−８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ００３５０１）、ＧＲＯα、ＧＲＯβ、ＮＡＰ−２、ＰＦ−４、ＩＰ１０、ＣＴＡＰ−ＩＩＩ、β−ＴＧ及びβ−ケモカインＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００２９８２）、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ０１２６５６）、ＭＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２５１１９０）、ＭＣＰ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００６２７３）、ＭＣＰ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＪ２５１９１）のような化学走化性サイトカインをコードする遺伝子をも含み得る。本発明の好適なサイトカインをコードする遺伝子がワクチンを投与する同一種から誘導されることが好ましい。
【０００９】
外来性ＤＮＡは少なくとも１つの発現調節因子に作動的に結合しており、前記発現調節因子により該外来性ＤＮＡの発現が調節、制御される。好ましい実施態様において、外来性ＤＮＡ中に存在する各遺伝子は個別の発現調節因子により調節される。発現調節因子は当業界で公知であり、その中にはプロモーターが含まれる。本発明の外来性ＤＮＡの発現のために好適なプロモーターは、細胞質における発現を調節し得るウイルスまたは合成プロモーターである。本発明において有用なプロモーターはポックスウイルスプロモーター、好ましくはワクシニアプロモーター（ドイツ国特許公開第１９６２７１９３号明細書；Ｍａｃｋｅｔｔら，Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，「ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)第３巻」，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．（１９８５年）発行参照）である。本発明の好ましいプロモーターは合成プロモーターであり、合成の初期−または初期／後期プロモーターがより好ましい。合成ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターはＣｈａｋｒａｂａｔｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３，６：１０９４−１０９７（１９９７）に記載されている。前記プロモーターは当業界の一般的方法、例えば上掲のＣｈａｋｒａｂａｔｉら（１９９７）に記載されているような方法を用いて合成され得る。
【００１０】
本発明に従って使用され得る好適なレポリポックスウイルスの例には粘液腫ウイルス及びショープ線維腫ウイルスが含まれるが、これらに限定されない。好適な粘液腫ウイルス株には、Ｌａｕｓａｎｎｅ株（ＡＴＣＣから入手可能）、ＳＧ３３（Ｍ．Ｄ．Ｍａｉｎｉｌら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２２：１１５−１２２（２０００））、Ｂｏｒｇｈｉ及びＢｏｅｒｌａｇｅ（Ｆｅｎｎｅｒ ＆ Ｆａｎｔｉｎｉ，「脊椎動物害虫の生物学的防除(Biological control of Vertebrate Pests)」，ＣＡＢＩ（１９９９年）発行，ＩＳＢＮ ０ ８５１９９ ３２３ ０及びここに引用されている文献）が含まれる。好適なショープ線維腫ウイルス株には、Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１１２）及びＫａｓｚａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−３６４）が含まれる。本発明の生組換えレポリポックスウイルスが粘液腫から誘導されることが好ましい。宿主がウサギ種に限定されているために、レポリポックスウイルスは非ウサギ宿主においては非病原性である。しかしながら、本発明の生組換えウイルスを生成するために弱毒化レポリポックスウイルスを産生することが好ましい。本発明では、弱毒化レポリポックスウイルスは病気を引き起こすことなく標的のウサギ宿主において生産的に複製し得るレポリポックスウイルスと定義される。レポリポックスウイルスの弱毒化は株を連続経代させるかまたはウイルス複製のために必須でない１つ以上の病原性遺伝子を欠失させることにより実施され得る。レポリポックスウイルスゲノムの完全ＤＮＡ配列、そのゲノムの構築及びすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置はＣａｍｅｒｏｎら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６４：２９８−３１８（１９９９）に記載されている。ショープ線維腫ウイルスゲノムの完全ＤＮＡ配列、そのゲノムの構築及びすべてのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配置はＷｉｌｌｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２６４：３１９−３４３（１９９９）に記載されている。
【００１１】
好ましくは、本発明の外来性ＤＮＡはレポリポックスウイルスゲノムの非必須遺伝子領域に挿入される。より好ましくは、外来性ＤＮＡはレポリポックスウイルスの病原性に関与する非必須遺伝子領域に挿入される。粘液腫ウイルスゲノムまたはショープ線維腫ウイルスゲノムの好適な非必須遺伝子領域はチミジンキナーゼをコードするＴＫ遺伝子、Ｍ１１Ｌ ＯＲＦ、ＳＥＲＰ−１、−２及び−３ ＯＲＦ及びＭＧＦ ＯＲＦである（上掲のＣａｍｅｒｏｎら（１９９９）；上掲のＷｉｌｌｅｒら（１９９９））。本発明の好ましい実施態様では、１つ以上の非必須ウイルス遺伝子を欠失させた後外来性ＤＮＡ及びプロモーターを挿入させる。ＭＧＦ ＯＲＦは病原性因子をコードし、インビトロまたはインビボでの増殖に必須でないので、このＯＲＦの少なくとも一部を欠失させることが特に好ましい（Ｇｒａｈａｍら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９１：１１２−１２４（１９９２））。ＭＧＦ ＯＲＦを欠失させると、レポリポックスウイルスの病原性が低下する。
【００１２】
本発明の生組換えレポリポックスウイルスは、外来性ＤＮＡのレポリポックスウイルスゲノムへの部位特異的組換えによる挿入を含むインビボ組換え方法を用いて産生され得る。これは、組換えワクシニアウイルス及び組換え鶏頭ウイルスの産生について記載している方法（米国特許第４，６０３，１１２号明細書；米国特許第５，０９３，２５８号明細書参照；Ｐ．Ｘ．Ｇｕｏ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：４１８９−４１９８（１９９０）；Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編，ＤＮＡクローニング(DNA Cloning)第３巻中のＭａｃｋｅｔｔら，「外来性遺伝子を発現するワクシニアウイル組換え体の構築及びキャラクタリゼーション(Construction And Characterization Of Vaccinia Virus Recombinants Expressing Exogenous Genes)」，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．（１９８５年）発行）と同様にして実施し得る。通常、本発明の生組換えレポリポックスウイルスは少なくとも１つの発現調節因子の制御下で外来性ＤＮＡを有するＤＮＡベクターと親レポリポックスゲノムの間での部位特異的組換えにより産生され得る。部位特異的組換えに使用するための適当なＤＮＡベクターは複数のクローニングサイトを含むプラスミドから誘導され得る。ＤＮＡベクターは、少なくとも１つの発現調節因子に結合し且つ外来性ＤＮＡが導入されるレポリポックスゲノムの領域に相同のウイルスＤＮＡ配列間にある外来性ＤＮＡを含む。外来性ＤＮＡに隣接するウイルスＤＮＡ配列はレポリポックスウイルスの複製に必須でない領域から選択されることが好ましい。レポリポックスウイルスとの組換えのためのＤＮＡベクターは更に、ポックスウイルスプロモーターの制御下で選択マーカーをコードする遺伝子を含み得る。追加の遺伝子及びプロモーターもレポリポックスゲノム由来のウイルスＤＮＡ配列間にある。親レポリポックスウイルスを感染させた宿主細胞にＤＮＡベクターをトランスフェクトさせる。好適な宿主細胞は、レポリポックスウイルスに対して許容的であり且つＤＮＡベクターによりトランスフェクトされ得る真核細胞である。宿主細胞の例は、家兎腎臓細胞ＬＬＣ−ＲＫ１及びＲＫ１３、家兎肺細胞Ｒ９ａｂ、家兎皮膚細胞ＳＦ １ Ｅｐ、ＤＲＳ及びＲＡＢ−９、家兎角膜細胞ＳＩＲＣ、家兎癌腫細胞Ｏｃ４Ｔ／ｃｃ、家兎皮膚／癌腫細胞ＣＴＰＳ、Ｖｅｒｏ細胞であり、これらの細胞はすべてＡＴＣＣから入手可能である。
【００１３】
本発明の生組換えレポリポックスウイルスを産生するのに適した親レポリポックスウイルスは粘液腫ウイルス株、例えばＬａｕｓａｎｎｅ株（ＡＴＣＣより入手可能）、ＳＧ３３（Ｍ．Ｄ．Ｍａｉｎｉｌ，ら，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐａｔｈｏｌ．，１２２：１１５−１２２（２０００））、Ｂｏｒｇｈｉ及びＢｏｅｒｌａｇｅ（Ｆｅｎｎｅｒ ＆ Ｆａｎｔｉｎｉ，「脊椎動物害虫の生物学的防除(Biological control of Vertebrate Pests)」，ＣＡＢＩ（１９９９年）発行，ＩＳＢＮ ０ ８５１９９ ３２３ ０及びここに引用されている文献）、並びにショープ線維腫ウイルス株（Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−１１２）及びＫａｓｚａ株（ＡＴＣＣカタログ番号ＶＲ−３６４）を含む）である。本発明の生組換えレポリポックスウイルスを産生するために粘液腫ウイルス株を使用することが好ましい。好ましい親レポリポックスウイルスが弱毒化ウイルス、すなわち病気を生じさせることなく標的のウサギ宿主において生産的に複製し得るレポリポックスウイルスである。レポリポックスウイルス株の弱毒化は、株を連続経代させるかまたはウイルス複製に必須でない１つ以上の病原性遺伝子を欠失させることにより実施され得る（完全なゲノム配列及び遺伝子の局在化については、上掲のＣａｍｅｒｏｎら（１９９９）及び上掲のＷｉｌｌｅｒら（１９９９））。
【００１４】
ＤＮＡベクター上のレポリポックスＤＮＡ配列と親レポリポックスゲノム上の対応ＤＮＡの間で組換えが起こっている間にウイルスは宿主細胞において複製する。前記組換えにより、１つ以上の発現調節因子に結合した外来性ＤＮＡがレポリポックスゲノムに挿入される。組換えレポリポックスウイルスは当業界で公知の標準の選択またはスクリーニング方法を用いて選択、精製される。前記公知方法には、外来性ＤＮＡに相同のプローブを用いるハイブリダイゼーションによる外来性ＤＮＡの検出、外来性ＤＮＡを一緒に組み込んだ選択マーカーの発現の検出、外来性ＤＮＡを挿入した欠失レポリポックス遺伝子の発現産物の不在の検出が含まれる。組換えレポリポックスウイルスゲノムへの外来性ＤＮＡの挿入はポリメラーゼ連鎖反応分析により確認され得る。
【００１５】
本発明の組換えレポリポックスウイルスベクターは、インビボで宿主を免疫化するのに十分な抗原レベルに達し得るので非ウサギにおいて免疫化剤として使用するのに特に適している。宿主範囲が制限されているので、ウイルスは非ウサギ宿主において弱毒化され、よってレポリポックスウイルスにより病気が発症する危険性はない。宿主範囲が制限されていることから、本発明のレポリポックスウイルスがワクチン接種の標的でない宿主中に広がることが防止される。よって、更なる態様では、本発明は医薬組成物、より好ましくは少なくとも１つの発現調節因子に作動的に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれ、非ウサギにおいて感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードする外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルスを医薬的に許容され得る担体と共に含むワクチンを提供する。本発明のワクチンが少なくとも非ウサギ病原体の免疫原タンパク質を発現する本発明の生組換え粘液腫ウイルスを医薬的に許容され得る担体と共に含むことが好ましい。２つ以上の免疫原性タンパク質を発現する本発明の組換えレポリポックスウイルスが多価ワクチンを製造するのに特に適している。
【００１６】
本発明のワクチン組成物は標準的手順に従って製造され得る。組換えレポリポックスウイルスは該ウイルスが許容性である細胞培養物、例えばいずれもＡＴＣＣから入手可能である家兎腎臓細胞ＬＬＣ−ＲＫ１及びＲＫ１３、家兎肺細胞Ｒ９ａｂ、家兎皮膚細胞ＳＦ １Ｅ ｐ、ＤＲＳ及びＲＡＢ−９、家兎角膜細胞ＳＩＲＣ、家兎癌腫細胞Ｏｃ４Ｔ／ｃｃ、家兎皮膚／癌腫細胞ＣＴＰＳ、Ｖｅｒｏ細胞において増殖され得る。こうして増殖させたウイルスを組織細胞培養液及び／または細胞を集めることにより収集され得る。場合により、収集中に増殖基質からの感染粒子の遊離を改善する技術、例えば超音波や凍結融解を適用することによりウイルスの収率を増加させ得る。生ワクチンは懸濁液の形態で製造されても凍結乾燥されてもよい。
【００１７】
本発明のワクチン中に使用するのに適した医薬的に許容され得る担体は滅菌水、食塩水、水性緩衝液（例えば、ＰＢＳ）等である。加えて、本発明のワクチンは他の添加剤、例えばアジュバント、安定剤、酸化防止剤等を含み得る。
【００１８】
好適な安定剤の例は、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、スターチ、スクロース、デキストラン及びグルコース）、タンパク質及びその分解生成物（非限定例には、アルブミン及びカゼインが含まれる）、タンパク質含有物質（例えば、ウシ血清または脱脂乳）、緩衝液（非限定例には、アルカリ金属ホスフェートが含まれる）である。凍結乾燥ワクチン組成物中には１つ以上の安定剤を添加することが好ましい。
【００１９】
好適なアジュバントの非限定例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウム、アンフィゲン、トコフェノール、モノホスフェニル脂質Ａ、ムラミルジペプチド、オイルエマルション、グルカン、カルボマー、ブロックコポリマー、サイトカイン及びサポニン（例えば、Ｑｕｉｌ Ａ）が含まれる。アジュバントの添加量はアジュバントの種類に依存する。ＩＮＦγ、ＩＬ−１２やＩＬ−１８のようなサイトカインが本発明のワクチン中に使用するのに非常に適している。
【００２０】
好ましくは、本発明の組換えレポリポックスウイルスは非ウサギ種に対して非経口投与ルートにより投与される。前記投与ルートの非限定例には、筋肉内、皮内または皮下ルートが含まれる。また、ワクチンを経口、スプレー、眼内、鼻内または卵内投与のような経口投与により投与してもよい。
【００２１】
通常、本発明の組換えレポリポックスウイルスは、十分な発現レベルの外来性タンパク質を誘発させるのに有効な量で投与される。その用量は通常投与ルート、投与時期、ワンチン接種する動物の年令、健康状態及び食餌に依存する。組換えレポリポックスウイルスは１０２〜１０１１ｐｆｕ／用量／動物、好ましくは１０４〜１０９ｐｆｕ／用量／動物、より好ましくは１０６〜１０７ｐｆｕ／用量／動物の量で投与され得る。ここで、ｐｆｕはプラーク形成単位である。
【００２２】
本発明のワクチンを他の生または不活化ワクチンと同時にまたは付随的に投与してもよい。これらの追加ワクチンは非経口または経口投与ルートで投与され得る。好ましくは、追加ワクチンの非経口投与が推奨される。
【００２３】
下記実施例は本発明を説明するものであって、本発明は本明細書に記載の特定実施態様に限定されない。
【実施例１】
【００２４】
中間体ＤＮＡプラスミドｐＶ Ｌ 及びｐＶ ＥＬ の作成
この方法の出発プラスミドは、家兎出血性疾患ウイルスのｃＤＮＡ（Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１８４：６６４−６７６（１９９１））を含有する市販のプラスミドｐＣＩＴＥ２−ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）をベクターのＳａｌＩ及びＨｉｎｃＩＩサイトに挿入したものであった。このプラスミドをｐＣＩＴＥ／ＲＨＤと称する。
【００２５】
第１ステップはＭＧＦフランキング配列の導入であった。５’フランキング配列を増幅させるためにＰＣＲプライマーｍｙｘ ａ及びｍｙｘ ｂを使用した。
【００２６】
【化１】
【００２７】
組織培養で増殖させたＭＲ２４（１０６ｐｆｕ／ｍｌ）の２μｌサンプルをＰＣＲ反応の鋳型として使用した。このＰＣＲ反応はＰＣＲビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、製造業者の指示に従って実施した。ＰＣＲ断片をＮｃｏＩ／平滑断片として一般的な実験方法に従ってｐＣＩＴＥ／ＲＨＤにクローン化した。まず、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑化した後ＮｃｏＩで消化することによりｐＣＩＴＥ／ＲＨＤを作成した。生じたプラスミドをｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂと称した。
【００２８】
第２ＰＣＲ反応を同一の鋳型調製物で下記プライマー
【００２９】
【化２】
を用いて実施して、３’フランキング配列を作成した。ＰＣＲ断片をＸｈｏＩ／Ｘｂａｌ断片としてＸｈｏＩ／Ｘｂａｌ切断ｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂにクローン化した。生じたプラスミドをｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂｃｄと称した。
【００３０】
次いで、以下のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズすることにより合成ポックスウイルスプロモーターを作成した。
【００３１】
【化３】
【００３２】
これらの２つの相補オリゴヌクレオチドを一緒にアニーリングすると、ＫｐｎＩ及びＮｃｏＩ制限サイトと相容性の付着末端が生ずる。同様に、以下の２つのオリゴヌクレオチドを一緒にアニーリングすると、ＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ相容性断片が生ずる。
【００３３】
【化４】
【００３４】
Ｖｐ５及びＶｐ６は一緒になって初期／後期プロモーターを構成し、Ｖｐ３及びＶｐ４は一緒になって後期プロモーターを構成する（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２３：１０９４−１０９４（１９９７））。次いで、アニーニングしたオリゴヌクレオチド対の１方または他方をＫｐｎＩ／ＮｃｏＩ切断ｐＣＩＴＥ／ＲＨＤａｂｃｄにクローン化すると、ｐＶＰ／ＲＨＤ（後期プロモーター）またはｐＥＬ／ＲＨＤ（初期／後期プロモーター）が生ずる。ＲＨＤキャプシド遺伝子は２つの構築物（ｐＶＰ／ＲＨＤ及びｐＥＬ／ＲＨＤ）のいずれかの第１メチオニンの枠に入っていないので、発現させるためにはＲＨＤキャプシド遺伝子（Ｖｐ６０）を再度クローン化し、介在配列を除去しなければならなかった。プラスミドｐＶＰ／ＲＨＤ及びｐＥＬ／ＲＨＤをＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断して、Ｖｐ６０コード配列及び初期ＡＴＧに対して５’の非コード配列を除去した。次いで、Ｖｐ６０遺伝子を以下のオリゴヌクレオチドを用いて作成したＰＣＲ生成断片で置換した。
【００３５】
【化５】
【００３６】
ＰＣＲ反応の鋳型はｐＣＩＴＥ／ＲＨＤであった。ＰＣＲ生成断片をＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、作成したｐＶＰ／ＲＨＤ及びｐＥＬ／ＲＨＤにクローン化した。生じたプラスミドをｐＶＰ／Ｖｐ６０及びｐＥＬ／Ｖｐ６０と称した。他の制限サイトに隣接する遺伝子を導入するために、ｐＶＰ／Ｖｐ６０及びｐＥＬ／Ｖｐ６０中のユニークなＮｃｏＩサイトの下流に複数のクローニングサイトを導入した。以下のオリゴヌクレオチド
【００３７】
【化６】
をアニーリングすると、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼサイトと相容性の懸垂末端が生じる。ＲＨＤ関連配列をすべて有するＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ断片をアニーリングしたオリゴヌクレオチドで置換すると、２つのプラスミド、すなわちｐＶＬ及びｐＶＥＬ（図１参照）が生ずる。
【００３８】
プラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬを用いて、それぞれ家兎出血性疾患キャプシドタンパク質ＶＰ６０（上掲のＭｅｙｅｒｓら（１９９１））、緑色蛍光タンパク質（米国カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．）、ネコ白血病エンベロープ糖タンパク質ｇｐ８５（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，５８：８２５−８３４（１９８６））、ネコ白血病マトリックス（ｇａｇ）タンパク質（Ｄｏｎａｈｕｅら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６２：７２２−７３１（１９８８））、ネコカリシウイルスキャプシドタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ１１５３６及びＮＣ ００１４８４１）、ネコ汎白血球減少症ウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ２（Ｃａｒｌｓｏｎら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，５５：５７４−５８２（１９８５））、ネコパルボウイルスキャプシドタンパク質ＶＰ２（Ｒｅｅｄ，Ｐ．ら，Ｊ，Ｖｉｏｌ．，６２：２６６−２７６（１９８８））の遺伝子を含む各種組換えＤＮＡプラスミドを構築した。表１には、本発明の組換え粘液腫ウイルスを生成するために構築した各種ＤＮＡプラスミドがリストされている。各組換えプラスミドは同一方法で構築したが、標的遺伝子は既存のプラスミドから切断したかまたは遺伝子末端の制限酵素サイトがｐＶＬ及びｐＶＥＬのｍｃｓ中のサイトと相容するようにＰＣＲで増幅させた。
【００３９】
ＤＮＡプラスミドｐＶ Ｌ ＧＦＰの作成
ＧＦＰ遺伝子を含むプラスミドは米国カリフォルニア州パロアルトに所在のＣｌｏｎｅｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から購入し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化して、プラスミドからＧＦＰ遺伝子を切除した。この遺伝子をｐＶＬに挿入すると、ｐＶＬＧＦＰが生じた。
【００４０】
ＤＮＡプラスミドｐＶ ＥＬ ＦｅＬＶ ｅｎｖ の作成
エンペロープ遺伝子をｐＦＧＡ５（上掲のＳｔｅｗａｒｔ（１９８６））から以下のオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲにより増幅させた。
【００４１】
【化７】
【００４２】
ＰＣＲ断片をＣｌａＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＶＥＬに挿入すると、ｐＶＥＬＦｅＬＶｅｎｖが生じた。
【００４３】
ＤＮＡプラスミドｐＶ ＥＬ ＦＰＬの作成
以下のプライマーを用いるＰＣＲにより複製型（ｒｆ）ＤＮＡからＰＣＲ増幅することによりＦＰＬキャプシド遺伝子を得た。
【００４４】
【化８】
【００４５】
ｒｆ ＤＮＡは一般的方法（Ｐ．Ｒｅｅｄら，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，６２：２６６−２７６（１９８８））によりＦＰＬのワクチン株を感染させたネコ腎臓細胞（ＣＲＦＫ）から作成した。
【００４６】
ＤＮＡプラスミドｐＶ ＥＬ ＦＣＶの作成
ネコ腎臓細胞（ＣＲＦＫ）に０．１ｐｆｕ／細胞の多重度でＦＣＶ株Ｆ９を感染させた。３６時間後、細胞を収集し、全ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート（ＧｉｂＣｏ ＢＲＬのＴＲｌｚｏｌ試薬）を用いて作成した。ｏｌｉｇｏｄｔプライマー（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｃｈｏｉｃｅ ＧｉｂＣｏ ＢＲＬ）を用いて第１鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。完全ヌクレオチド配列及びＦＣＶのＦ９株のゲノムの構築は報告されている（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８６３７９）。第２鎖ＤＮＡ合成を刺激し、その後キャプシド遺伝子をＰＣＲ増幅させるためにオリゴヌクレオチドを合成した。以下のオリゴヌクレオチドを用いてＦＣＶ（Ｆ９株）のＶｐ６０キャプシドタンパク質遺伝子を作成した。
【００４７】
【化９】
【００４８】
Ｖｐ６０キャプシド遺伝子をｐＶＬ及びｐＶＥＬのｍｃｓに挿入すると、それぞれｐＶＬＦＣＶ及びｐＶＥＬＦＣＶが生じた。
【００４９】
ＤＮＡプラスミドｐＶ ＥＬ ＣＰＶの作成
キャプシドタンパク質ＶＰ２をコードする遺伝子をＮｏｂｉｖａｃ Ｐａｒｖｏ（登録商標）のＣＰＶワクチン株からＰＣＲ増幅し、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、ｐＶＥＬに挿入した。
【実施例２】
【００５０】
組換え粘液腫ウイルスの生成
家兎腎臓細胞（ＲＫ１３）において長期間経代することにより弱毒化させた粘液腫ウイルスの非毒性株（ＭＲ２４と命名）を選択した。この弱毒化粘液腫ウイルス（ＭＲ２４）は、家兎に対して皮下、皮内または筋肉内投与したときに家兎では非毒性（死亡率０％）であることが分かった。ＭＲ２４は家兎において使用される粘液腫症ワクチン株の候補である。ウイルス滴定及び増幅はすべて家兎腎臓（ＲＫ−１３）細胞において実施した。
【００５１】
組換え粘液腫ウイルスは、組換えワクシニアウイルスの生成について記載している方法（上掲のＭａｃｋｅｔｔ（１９８５））に従って作成した。このためには、家兎腎臓細胞（ＲＫ１３）に０．１ｐｆｕ／細胞の多重度で粘液腫ウイルスＭＲ２４を感染させた。２時間後、細胞にリポフェクタミントランスフェクション試薬（ＧｉｂｏＣｏ ＢＲＬ）を用いてプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。組換えウイルスは、限界希釈及び免疫フルオレッセンスに基づいて選択した。
【００５２】
トランスフェクションから７２時間後、感染／トランスフェクトした細胞培養物を３回凍結融解してウイルスを遊離させた。この野生型及び組換え型ウイルスの一次ミックスを組織培養培地を用いて５０倍希釈した後、予めＲＫ１３細胞を接種した９６ウェル組織培養プレートの各ウェルを感染させるためにウイルスミックス１０μｌを使用した。次いで、９６ウェルプレートを７２時間インキュベートして、ウイルスの感染及び増殖を進行させた。この後、プレートの各ウェルの個々の状態を維持しながらプレートに対して凍結融解サイクルを３回実施した。こうすると、第１の丸いマスタープレートとなった。その後、各ウェルからのウイルス含有培地５μｌを１対のＲＫ１３細胞を接種した９６ウェルプレートにおいて平板培養した。４８時間後、１対のプレートを氷冷メタノールで固定し、プレートを免疫フルオレッセンスにより組換えタンパク質の発現についてスクリーニングした。
【００５３】
例えば、ｐＶＥＬＦｅＬＶｅｎｖを感染させ、トランスフェクトした細胞を、以下のようにしてＦｅＬＶエンベロープタンパク質の産生についてスクリーニングした。マウスモノクローナル抗体３−１７（オランダ国ウールデンに所在のＥｕｒｏｐｅａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）腹水を１０００倍希釈した後、固定９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、次いでＦＩＴＣ標識家兎抗−マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）とインキュベートし、更に１時間インキュベートを続けた。最後に、プレートをＰＢＳで５回洗浄し、蛍光顕微鏡を用いて検査した。感染の蛍光フォーカスを含むウェルを同定し、記録した。次いで、第１の丸いマスタープレートからの対応ウェルをより多くのＲＫ−１３接種９６ウェルプレート上に希釈した。こうすると、第２の丸いマスタープレートとなった。組換えウイルスが全ウイルスの２０〜５０％を占めるまで漸進濃縮プロセスを続けた。他の組換え粘液腫ウイルスの組換えタンパク質の発現を同様にスクリーニングした。
【００５４】
【表１】
【００５５】
最後に組換え体を、寒天重層培養物から感染の各フォーカスをピッキングすることにより精製した。
【実施例３】
【００５６】
ニワトリにおけるｍｙｘｏ／ＲＨＤ
組換え粘液腫瘍ウイルスを感染させた非ウサギ種が抗体応答を誘発するかを調べるために、ニワトリにｍｙｘｏ／ＲＨＤを皮下または筋肉内投与してニワトリを免疫化した。ニワトリには免疫化スケジュールの０日目及び１４日目に１０５ｐｆｕのウイルスを与えた。０日目、１４日目及び２８日目に血液サンプルを採取し、ＲＨＤＶに対する抗体について分析した。結果を表２に示す。すべてのニワトリが実験中臨床的には正常のままであった。
【００５７】
【表２】
【実施例４】
【００５８】
ネコにおけるｍｙｘｏ／ＦＣＶ
粘液腫／ネコカリシウイルスキャプシド組換えウイルス（ｍｙｘｏ／ＦＣＶ）が中和抗体応答を誘発させ、病原性のネコカリシウイルスの攻撃からネコを防御する効果を確立するために実験を実施した。１群４匹のネコ（第１群）には、５×１０６フォーカス形成単位（ｆｆｕ）のｍｙｘｏ／ＦＣＶを皮下投与して免疫化した。第１免疫化から３週間目に免疫化を繰り返した。４匹のワクチン接種していない対照動物（第２群）を試験動物と同じハウスに収容した。第２免疫化から４週間後、すべてのネコに対して１０５．３ＴＣＩＤ５０のネコカリシウイルスの病原性株を鼻内攻撃した。０．５ｍｌの攻撃ウイルスを各鼻孔に滴下した。
【００５９】
【表３】
【００６０】
実験開始時に、口腔咽頭にネコカリシウイルスが存在している動物はいないことを確かめるためにスワブを採取した。また、実験の開始前に抗−ＦＣＶ抗体を持っている動物はいないことを確かめるために血液サンプルを採取した。スワブはウイルスの排泄を調べるために攻撃後にも採取した。
【００６１】
実験中に採取した血液サンプルはウイルス中和アッセイで使用した。このアッセイにより、ネコにおける循環抗体レベルを測定する。血清抗体抗体が回復期の動物中に存在すること及びワクチン接種の結果生ずる既存の中和抗体が病気からの防御を与えるのに役立つことは公知である（Ｈｏｈｄａｔｓｕら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６１：２９９−３０１（１９９９））。
【００６２】
【表４】
【００６３】
ｍｙｘｏ−ＦＣＶをワクチン接種後の結果（表４）と従来のワクチンを用いた結果（表５）を比較すると、第１回ワクチン接種後第１群の動物は多くの市販ワクチンを２回投与した動物に匹敵する抗体応答を示すことが明らかであり、ネコは病気から保護されるであろうと示唆される。第２回ワクチン接種後、抗体価は市販のワクチン調製物で得られる値よりかなり高い（Ｈｏｈｄａｔｓｕら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，６１：２９９−３０１（１９９９）；ＤｅＳｉｌｖｅｒら，第１回カリシウイルス国際シンポジウム議事録ＥＳＶＶ １３１−１４３）。
【００６４】
【表５】
【００６５】
Ｙｏｋｏｙａｍａら（１９８８）が報告しているように、ＦＣＶ抗原を発現するネコヘルペスウイルスベクターも攻撃前非常に低い血清中和抗体価（２．５〜３．０）を誘発する。
【００６６】
【表６】
【実施例５】
【００６７】
ブタ及びウシにおけるｍｙｘｏ／ＦＣＶを用いる中和実験
非天然宿主、すなわちウシ及びブタにおいて防御免疫応答を誘発するための真核発現ベクターとしての粘液腫ウイルスの使用を皮内及び筋肉内注射により試験した。
【００６８】
成熟型のキャプシド抗原をコードするネコカリシウイルス遺伝子断片を含む粘液腫ウイルスベクターをウシ及びブタにおいて使用した。本研究には、１２週令のウシ４匹からなる群及び６週令のブタ４匹からなる群を含めた。
【００６９】
本研究の開始の１週間前に、動物がネコカリシウイルスに対して血清ネガティブであることを調べるために血液サンプル（１０ｍｌ／動物）を採取した。その後、動物に対して１×１０８ＦＦＵの組換え粘液腫ウイルス／投与ルート／動物を含有するＰＢＳ １ｍｌを皮内及び筋肉内注射した。動物は種毎に１群として収容した。４週間後、血液サンプル（１０ｍｌ／動物）を採取し、動物に対して同用量の粘液腫ウイルス、すなわち１×１０８ＦＦＵの組換え粘液腫ウイルス／投与ルート／動物を再び皮内及び筋肉内注射した。最後に注射してから２週間後、血液サンプル（１０ｍｌ／動物）を採取し、動物をインビボでのＧＭＯ試験に関するガイドラインに従って殺した。採取した血液サンプルについて、インビトロでのウイルス中和アッセイ方法に従ってカリシウイルスに対する抗体の存在を調べた。
【００７０】
【表７】
【００７１】
ＦＣＶ血清中和アッセイ方法
ＣｒＦＫ細胞に対するｃ．ｐ．ｅにより血清中和を調べた。２００ＴＣＩＤ５０のウイルスの５倍複製物を最終容量６００μｌで血清の連続希釈物（１：４〜）と混合した。次いで、ウイルス／血清混合物を無菌の５ｍｌ希釈管において３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、試験混合物１００μｌを、増殖培地１００μｌ中にＣｒＦＫ細胞を接種した９６ウェル組織培養皿に添加した。インキュベーションを５日間続けた。ＴＣＩＤ５０値をＲｅｅｄ及びＭｅｕｎｃｈ［１］：Ｌ．Ｊ．Ｒｅｅｄ及びＨ．Ｍｅｕｎｃｈ，「５０％終点を推定する簡単な方法(A simple method of estimating fifty percent end points)」，Ａｍ．Ｊ．Ｈｙｇ．，２７：４９３−４９７（１９８３）の方法に従って計算した。
【００７２】
【表８】
【実施例６】
【００７３】
インビトロで各種細胞タイプにおける粘液腫ウイルス株の増殖
２つの異なる粘液腫ウイルス菌株から構築した緑色蛍光タンパク質を発現する組換え粘液腫ウイルスで細胞を感染させた。蛍光細胞の数の増加により増殖を経時的にアッセイした。
【００７４】
表８に示すように、ｍｙｘｏ／ＧＦＰ組換えウイルスを各種細胞タイプで平板培養したときに蛍光が見られた。このことは、ウイルスは非ウサギ細胞においてＧＦＰ遺伝子をエントリーし、発現させることができたことを示している。表８から、インビトロでのウイルスの増殖が幾つかの細胞タイプにおいて見られ、試験した２つの構築物でパターンが異なっていたことが分かる。
【００７５】
【表９】
【実施例７】
【００７６】
イヌパルボウイルスワクチン接種に対する応答のＥＬＩＳＡ
イヌパルボウイルスキャプシドタンパク質Ｖｐ２を発現する組換え粘液腫ウイルスをイヌにワクチン接種することにより誘発される免疫応答を調べるために、ＥＬＩＳＡを実施した。ワクチン接種に対する応答を従来のワクチンを接種したイヌで見られた応答と比較した。
【００７７】
（材料及び方法）
材料
ＴＢＳ（５０ｍＭ トリス緩衝食塩水）：
５０ｍＭ トリス緩衝食塩水（ｐＨ７．５），トリス−ＨＣｌ（６．３５ｇ），トリス塩基（１．１８ｇ），ＮａＣｌ（８．７７ｇ），ｄＨ２Ｏ（８００ｍｌ）
ｐＨを７．５に調整し、ｄＨ２Ｏで容量を１Ｌとする。
ＴＢＳ−ツイーン：
ＴＢＳを上記したように調製した後ツイーン２０を添加する。十分に混合する。
【００７８】
方法
１．抗ＣＰＶモノクローナル抗体を０．１Ｍ Ｎａ２ＣＯ３緩衝液（ｐＨ９．６）中に５〜１０μｇ／ｍｌの濃度で懸濁させた。ＥＬＩＳＡプレートを１００μｌ／ウェルの抗体懸濁液と共に４０℃で一晩インキュベートした。
２．過剰の抗原コーティング溶液を振盪除去した後、ＴＢＳ中１％ ＢＳＡ及び２％ 粉ミルク２００μｌと室温で１時間インキュベートすることにより各ウェルにおいて残りの結合サイトをブロックした。
３．ブロック溶液を振盪除去した後、約１０７ｐｆｕ／ｍｌの力価のイヌパルボウイルスを含有する組織培養懸濁液１００μｌと置換した。室温でインキュベーションを１〜２時間実施した。
４．プレートをＴＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。
５．被験血清をＴＢＳ中で連続希釈した。希釈物１００μｌをＥＬＩＳＡプレートのウェルに添加し、室温でインキュベーションを１〜２時間続けた。
６．その後、プレートをＴＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。
７．抗−イヌアルカリホスファターゼ結合第２抗体（例えば、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓのカタログ番号６７５０７１）を製造業者が指示する希釈度で添加した。室温でインキュベーションを１〜２時間実施した。
８．プレートをＴＢＳ−ツイーンで４回洗浄した。
９．基質ＰＮＰＰ（ｐ−ニトロフェニルホスフェート，例えばＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙのカタログ番号Ｎ２７７０）を添加することによりＥＬＩＳＡを展開した。
１０．分光光度計を用いて４２０ｎｍでの吸光度を測定した。
【００７９】
結果を表９に示す。
【００８０】
【表１０】
【００８１】
ＥＬＩＳＡ結果は、従来のワクチンを接種したイヌの血清の１：４０希釈物は吸光度のバックグラウンドレベル、すなわちワクチン接種していないイヌ血清で見られるレベルを示すことを明らかに示している。一方、粘液腫−ＣＰＶ（Ｖｐ２）をワクチン接種したイヌの血清では、同じバックグラウンドレベルとするためには１：１２８０希釈物が必要である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１−１】中間体プラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬの構築の概略図。ＲＨＤは家兎出血性ウイルスのｃＤＮＡを表す。ａｂ（５’）及びｃｄ（３’）は粘液腫ウイルスＭＧＦフランキング領域を表す。プロモーターはそれぞれ合成の後期または初期／後期プロモーターを表す。“ｍｃｓ”は外来性ＤＮＡを導入するために複数のクローニングサイトを含むヌクレオチド配列を表す。
【図１−２】中間体プラスミドｐＶＬ及びｐＶＥＬの構築の概略図。ＲＨＤは家兎出血性ウイルスのｃＤＮＡを表す。ａｂ（５’）及びｃｄ（３’）は粘液腫ウイルスＭＧＦフランキング領域を表す。プロモーターはそれぞれ合成の後期または初期／後期プロモーターを表す。“ｍｃｓ”は外来性ＤＮＡを導入するために複数のクローニングサイトを含むヌクレオチド配列を表す。
【図２】構築したｐＶＬ及びｐＶＥＬをベースとする各種組換えＤＮＡプラスミド。Ｐは合成の後期（ｐＶＬ）または初期／後期（ｐＶＥＬ）プロモーター領域を表す。ａｂ（５’）及びｃｄ（３’）は粘液腫ウイルスＭＧＦフランキング領域を表す。ＲＨＤＶ Ｖｐ６０はＲＨＤＶ Ｖｐ６０タンパク質をコードする遺伝子を表す。ＦｅＬＶ ｇｐ８５はネコ白血病ウイルスｅｎｖ遺伝子を表す。ＦＣＶ Ｖｐ６０はネコカリシウイルスキャプシドタンパク質をコードする遺伝子を表す。ＦＰＬ Ｖｐ２はネコ汎白血球減少症ウイルスｖｐ２遺伝子を表す。ＣＰＶ Ｖｐ２はイヌパルボウイルスｖｐ２遺伝子を表す。ＧＦＰは緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を表す。プラスミドはすべて選択マーカーとしてＡｍｐｒを含む（図示せず）。
Claims (11)
- 非ウサギ種における感染症を治療及び／または予防するためのベクターワクチンの製造における、少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む、生組換えレポリポックスウイルスの使用。
- ネコまたはイヌにおける感染症を治療及び／または予防するためのベクターワクチンの製造における請求の範囲第１項に記載のウイルスの使用。
- 少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含む生組換えレポリポックスウイルス及び医薬的に許容され得る担体を含み、前記外来性ＤＮＡが非ウサギにおいて感染症を生じさせる病原体の少なくとも１つの抗原をコードするワクチン。
- 少なくとも１つの発現調節因子に作動可能に結合し且つウイルスゲノムの非必須領域に組み込まれた外来性ＤＮＡを含み、前記外来性ＤＮＡが非ウサギ病原体の少なくとも１つの抗原をコードする生組換えレポリポックスウイルス。
- レポリポックスウイルスが粘液腫ウイルスであることを特徴とする請求の範囲第４項に記載のウイルス。
- 外来性ＤＮＡがネコまたはイヌ病原体の少なくとも１つの抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲第４項または第５項に記載のウイルス。
- 外来性ＤＮＡがネコまたはイヌウイルスの少なくとも１つの抗原をコードすることを特徴とする請求の範囲第４項または第５項に記載のウイルス。
- 外来性ＤＮＡがネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）エンベロープタンパク質、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）キャプシドタンパク質、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬ）ＶＰ２タンパク質及び／またはイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２をコードすることを特徴とする請求の範囲第４項から第７項のいずれかに記載のウイルス。
- 外来性ＤＮＡ及び発現調節因子がウイルスゲノムのＭＧＦ ＯＲＦに挿入されていることを特徴とする請求の範囲第４項から第８項のいずれかに記載のウイルス。
- 外来性ＤＮＡに作動可能に結合する発現調節因子が合成ポックスウイルスプロモーターであることを特徴とする請求の範囲第４項から第９項のいずれかに記載のウイルス。
- プロモーターは初期／後期プロモーターであることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のウイルス。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP01200869 | 2001-03-08 | ||
| PCT/EP2002/002858 WO2002072852A2 (en) | 2001-03-08 | 2002-03-07 | Leporipox-based vector vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004528833A true JP2004528833A (ja) | 2004-09-24 |
| JP4037273B2 JP4037273B2 (ja) | 2008-01-23 |
Family
ID=8179978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002571903A Expired - Fee Related JP4037273B2 (ja) | 2001-03-08 | 2002-03-07 | レポリポックスベースのベクターワクチン |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6942864B2 (ja) |
| EP (1) | EP1370668B1 (ja) |
| JP (1) | JP4037273B2 (ja) |
| CN (1) | CN1258596C (ja) |
| AT (1) | ATE318321T1 (ja) |
| AU (1) | AU2002304856B2 (ja) |
| BR (1) | BR0207761A (ja) |
| CA (1) | CA2439872C (ja) |
| DE (1) | DE60209345T2 (ja) |
| DK (1) | DK1370668T3 (ja) |
| ES (1) | ES2258628T3 (ja) |
| MX (1) | MXPA03007862A (ja) |
| NO (1) | NO331305B1 (ja) |
| NZ (1) | NZ527940A (ja) |
| PT (1) | PT1370668E (ja) |
| WO (1) | WO2002072852A2 (ja) |
| ZA (1) | ZA200306607B (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100831537B1 (ko) * | 2007-01-19 | 2008-05-22 | 리엔 창 일렉트로닉 엔터프라이즈 컴퍼니 리미티드 | 하프 브릿지 드라이버 |
| KR100831536B1 (ko) * | 2007-01-19 | 2008-05-22 | 리엔 창 일렉트로닉 엔터프라이즈 컴퍼니 리미티드 | 풀 브릿지 드라이버 |
| JP2009538935A (ja) * | 2006-06-01 | 2009-11-12 | ロバーツ リサーチ インスティテュート | 癌の処置のための粘液腫ウイルス変異体 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2925067B1 (fr) * | 2007-12-18 | 2010-01-15 | Agronomique Inst Nat Rech | Vecteurs vaccinaux derives de leporipoxvirus |
| WO2021202971A1 (en) * | 2020-04-02 | 2021-10-07 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University | Covid-19 vaccine based on the myxoma virus platform |
| CN111904981A (zh) * | 2020-09-07 | 2020-11-10 | 威世药业（如皋）有限公司 | 一种痘苗病毒致炎兔皮生产方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5833975A (en) | 1989-03-08 | 1998-11-10 | Virogenetics Corporation | Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence |
| US5174993A (en) | 1981-12-24 | 1992-12-29 | Health Research Inc. | Recombinant avipox virus and immunological use thereof |
| US5505941A (en) | 1981-12-24 | 1996-04-09 | Health Research, Inc. | Recombinant avipox virus and method to induce an immune response |
| DE10399032I1 (de) * | 1987-08-28 | 2004-01-29 | Health Research Inc | Rekombinante Viren. |
| WO1993001284A1 (en) | 1991-07-09 | 1993-01-21 | Cornell Research Foundation, Inc. | Recombinant viral vaccine |
| TW377373B (en) | 1993-09-22 | 1999-12-21 | Wyeth Corp | Recombinant raccoon pox viruses and their use as an effective vaccine against feline infectious peritonitis virus disease |
| US6001349A (en) * | 1995-02-22 | 1999-12-14 | Therion Biologics Corporation | Generation of human cytotoxic T-cells specific for carcinoma self-associated antigens and uses thereof |
| FR2736358B1 (fr) * | 1995-07-05 | 1997-09-26 | Agronomique Inst Nat Rech | Virus myxomateux recombinant |
| AU4266597A (en) * | 1996-09-11 | 1998-04-14 | General Hospital Corporation, The | Use of a non-mammalian dna virus to express an exogenous gene in a mammalian cell |
| US6127172A (en) * | 1998-05-29 | 2000-10-03 | University Of Florida | Materials and methods for delivery and expression of heterologous DNA in vertebrate cells |
| ES2153284B1 (es) | 1998-06-10 | 2001-09-01 | Fundacion Para El Estudio Y De | Nuevo virus recombinante de mixoma atenuado y su uso en la preparacion de vacunas mixtas contra la mixomatosis y la enfermedad hemorragica de los conejos. |
| US6294176B1 (en) | 1998-07-10 | 2001-09-25 | Schering-Plough Veterinary Corp. | Recombinant raccoonpox virus and uses thereof as a vaccine in mammalian and avian species |
-
2002
- 2002-03-07 WO PCT/EP2002/002858 patent/WO2002072852A2/en active IP Right Grant
- 2002-03-07 CN CN02806102.0A patent/CN1258596C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-07 PT PT02732485T patent/PT1370668E/pt unknown
- 2002-03-07 NZ NZ527940A patent/NZ527940A/en not_active IP Right Cessation
- 2002-03-07 AU AU2002304856A patent/AU2002304856B2/en not_active Ceased
- 2002-03-07 JP JP2002571903A patent/JP4037273B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-07 MX MXPA03007862A patent/MXPA03007862A/es active IP Right Grant
- 2002-03-07 US US10/471,300 patent/US6942864B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-07 AT AT02732485T patent/ATE318321T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-03-07 CA CA002439872A patent/CA2439872C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-03-07 DE DE60209345T patent/DE60209345T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-07 EP EP02732485A patent/EP1370668B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-07 DK DK02732485T patent/DK1370668T3/da active
- 2002-03-07 ES ES02732485T patent/ES2258628T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-07 BR BR0207761-2A patent/BR0207761A/pt not_active IP Right Cessation
-
2003
- 2003-08-25 ZA ZA2003/06607A patent/ZA200306607B/en unknown
- 2003-09-04 NO NO20033912A patent/NO331305B1/no not_active IP Right Cessation
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009538935A (ja) * | 2006-06-01 | 2009-11-12 | ロバーツ リサーチ インスティテュート | 癌の処置のための粘液腫ウイルス変異体 |
| JP2015044878A (ja) * | 2006-06-01 | 2015-03-12 | ロバーツ リサーチ インスティテュート | 癌の処置のための粘液腫ウイルス変異体 |
| JP2017008105A (ja) * | 2006-06-01 | 2017-01-12 | ロバーツ リサーチ インスティテュート | 癌の処置のための粘液腫ウイルス変異体 |
| KR100831537B1 (ko) * | 2007-01-19 | 2008-05-22 | 리엔 창 일렉트로닉 엔터프라이즈 컴퍼니 리미티드 | 하프 브릿지 드라이버 |
| KR100831536B1 (ko) * | 2007-01-19 | 2008-05-22 | 리엔 창 일렉트로닉 엔터프라이즈 컴퍼니 리미티드 | 풀 브릿지 드라이버 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MXPA03007862A (es) | 2004-05-24 |
| EP1370668B1 (en) | 2006-02-22 |
| CA2439872C (en) | 2009-12-15 |
| NO331305B1 (no) | 2011-11-21 |
| DK1370668T3 (da) | 2006-06-06 |
| DE60209345D1 (de) | 2006-04-27 |
| AU2002304856B2 (en) | 2006-08-24 |
| ZA200306607B (en) | 2005-02-23 |
| CN1527883A (zh) | 2004-09-08 |
| CA2439872A1 (en) | 2002-09-19 |
| PT1370668E (pt) | 2006-06-30 |
| WO2002072852A3 (en) | 2002-12-27 |
| NO20033912D0 (no) | 2003-09-04 |
| NO20033912L (no) | 2003-10-22 |
| US20040137599A1 (en) | 2004-07-15 |
| JP4037273B2 (ja) | 2008-01-23 |
| NZ527940A (en) | 2005-01-28 |
| EP1370668A2 (en) | 2003-12-17 |
| ATE318321T1 (de) | 2006-03-15 |
| CN1258596C (zh) | 2006-06-07 |
| ES2258628T3 (es) | 2006-09-01 |
| US6942864B2 (en) | 2005-09-13 |
| BR0207761A (pt) | 2006-01-31 |
| DE60209345T2 (de) | 2006-08-03 |
| WO2002072852A2 (en) | 2002-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5106398B2 (ja) | Ｐｃｖ−２ワクチン | |
| RU2766003C2 (ru) | Мультивалентные рекомбинантные вирусы птичьего герпеса и вакцины для иммунизации птиц | |
| HUT55243A (en) | Process for producing recombinant subunite vaccine against pseudolyssa | |
| JP5653751B2 (ja) | 狂犬病糖タンパク質を発現するアライグマポックスウイルス | |
| US5651972A (en) | Use of recombinant swine poxvirus as a live vaccine vector | |
| US10905758B2 (en) | Intranasal vector vaccine against porcine epidemic diarrhea | |
| JP4037273B2 (ja) | レポリポックスベースのベクターワクチン | |
| US6241989B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| AU2002304856A1 (en) | Leporipox-based vector vaccines | |
| US20220202931A1 (en) | Attenuated ibv with extended cell culture and tissue tropism | |
| EP0485463B1 (en) | Attenuated canine parvovirus (cpv), vaccine comprising cpv and method of preventing infection by cpv in dogs | |
| US7087234B1 (en) | Recombinant multivalent viral vaccine | |
| JP2905483B2 (ja) | 弱毒化ヘルペスウイルス及び外来性ｄｎａを含むヘルペスウイルス | |
| JP2010528603A (ja) | ネコ抗原のアライグマポックスウイルス発現遺伝子 | |
| CN114107227B (zh) | 一种同时表达经典株和变异株传染性法氏囊病毒vp2蛋白的重组火鸡疱疹病毒活载体疫苗 | |
| US11033616B2 (en) | Recombinant viral vector systems expressing exogenous feline paramyxovirus genes and vaccines made therefrom | |
| AU633349B2 (en) | Attenuated canine parvovirus (cpv), vaccine comprising cpv and method of preventing infection by cpv in dogs | |
| TWI361695B (en) | Pcv-2 vaccine | |
| Sato et al. | Further development of a recombinant feline herpesvirus type 1 expressing the Gag protein of feline immunodeficiency virus | |
| JPH07255488A (ja) | 組換えマレック病ウイルスおよびその作出法 | |
| WO1999037327A1 (en) | A virus vaccine of enhanced immunogenicity against aujeszky's disease |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050216 |
|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A711 Effective date: 20061222 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071016 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071031 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101109 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111109 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121109 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121109 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131109 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |