JP5653751B2 - 狂犬病糖タンパク質を発現するアライグマポックスウイルス - Google Patents
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Description
a)少なくとも1つの核酸分子がアライグマポックスウイルスノムの血球凝集素遺伝子座もしくはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入されているか、または
b)少なくとも2つの核酸分子がアライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子座またはもしくはチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入されているか、または
c)少なくとも1つの核酸分子が血球凝集素遺伝子座に挿入されており、かつ、少なくとも1つの核酸分子がアライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入されている、
組換え狂犬病ワクチンを提供する。
(a)第1の狂犬病株の糖タンパク質をコードする核酸配列を、アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入する工程と、
(b)第2の狂犬病株の糖タンパク質をコードする核酸配列を、アライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子座に挿入する工程と、
(c)組換えアライグマポックスウイルスベクターを回収する工程。
本方法および治療方法論が記載される前に、本発明は特定の方法および記載される実験条件に限定されず、方法および条件は変わり得るということが理解されなければならない。また、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるので、本明細書に用いられる専門用語は特定の実施形態のみを記載する目的のものであって、制限であるよう意図されるものではないということも理解されなくてはならない。
本明細書に使用される用語は、当業者に認識され、既知であることを意味するが、便宜上および完全性のために、特定の用語およびその意味を以下に説明する。
本発明に従って、安定な、安全な、高度に有効な、場合によってはアジュバントを含まない製品の製造においてアライグマポックスウイルス(RCNV)株を用いる独特の組換え狂犬病ワクチンが提供される。具体的には、本発明は、各々、少なくとも1つの狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする、1つ以上の外因性核酸分子を含み、血球凝集素(ha)遺伝子座もしくはチミジンキナーゼ(tk)遺伝子座に少なくとも2つの核酸分子が挿入されているか、または少なくとも1つの核酸分子が血球凝集素およびチミジンキナーゼ遺伝子座の各々に挿入されている組換えアライグマポックスウイルスベクター(rRCNV)を提供する。外因性核酸分子の供給源は、同一であっても異なっていてもよいが、少なくとも2つの異なる狂犬病株から外来遺伝子を得ることが望ましい。本発明の新規の、高度に好ましいウイルス構築物rRCNV−狂犬病G2は、2つの異なる狂犬病ウイルス株の狂犬病糖タンパク質(G)を独特に発現することが有利であり、ここで、Challenge Virus Standard(CVS)およびPasteur−Paris(PV)狂犬病株の抗原性糖タンパク質を、RCNVゲノムのチミジンキナーゼ(tk)および血球凝集素(ha)遺伝子座にそれぞれ挿入することが高度に望ましい。rRCNV−狂犬病G2感染ベロ細胞における狂犬病糖タンパク質のIn vitro 発現は、狂犬病糖タンパク質特異的モノクローナル抗体を用いる間接免疫蛍光アッセイ(IFA)によって確認される。本発明のrRCNV−狂犬病G2構築物は、極めて免役原性であり、高度に強力である。免疫継続期間(DOI)研究におけるネコおよびイヌの接種と、それに続く病原性狂犬病ウイルス誘発によって、新規組換え狂犬病ワクチンは、哺乳動物を狂犬病感染から保護することにおいて優れた効力および有用性を有ることが実証される。
手短には、狂犬病Pasteur− Paris糖タンパク質遺伝子(G)を、vKB3−JE13ゲノムの血球凝集(ha)遺伝子座に挿入することによってウイルスrRCNV−狂犬病G2を構築した。完全構築物は、RCNVチミジンキナーゼ(tk)および血球凝集(ha)遺伝子座にそれぞれ挿入されたCVSおよびPasteur−Paris株の狂犬病糖タンパク質遺伝子、さらなる弱毒野生型アライグマポックスウイルス、病原性Herman株を含む。
レシピエント特性決定に関しては、上記で記載および説明したように、親生物は、1961〜1962年にメリーランド州、アバディーン(Aberdeen)においてY.F.Hermanによって臨床症状のないアライグマの気道から最初に単離されたアライグマポックスウイルス(RCNV)のHerman株とした。RCNVは、直鎖の、ほぼ200kbの、各末端にヘアピンループを含む二本鎖DNAゲノムを含有するポックスウイルス科のメンバーである。その他のポックスウイルス(ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルスおよびカナリアポックスウイルス)と同様に、RCNVは細胞質中で複製し、その自身の転写系を使用し、ワクチン開発のための外来遺伝子を発現するために生存ベクターとして用いられてきた。しかし、RCNVのこれまでの、既知の使用は、アライグマポックスウイルスゲノムのtk遺伝子座での1つのみの狂犬病ウイルス株の糖タンパク質Gの挿入に制限されてきた。
RCNV野生型においてhaおよびtk遺伝子を、およびrRCNV−狂犬病−G2ゲノムのhaおよびtk遺伝子座療法に挿入された狂犬病糖タンパク質(G)遺伝子を同定するために、rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5中に存在する混合集団がないことを実証するために、以下の材料および方法を用いて包括的PCR試験を実施した。
1.ウイルス:
a)rRCNV−狂犬病G2 MSV
b)rRCNV−狂犬病G2 X+5
c)RCNV野生型エスポシト(Esposito)
2.QIAGEN DNeasy組織キット(Qiagen Inc、Valencia、CA、USAから市販されている)
3.遺伝子特異的プライマー:
a)同定試験のために、プライマーHA−08およびHA−Pstを用いてRCNV野生型の563bpのha遺伝子断片を増幅した。
ii)HA−Pst:5’−TCA TTG ACA TCT GGA GAT GCA GGT ACT−3’(配列番号3に対応する)
b) 同定試験のために、プライマーHA−Pstおよびgp−1Fを用いて、rRCNV−狂犬病G2 ゲノムのha遺伝子座で、1303bpの狂犬病Pasteur−ParisのG遺伝子断片を増幅した。
ii)gp−1F:5’−ACA CTA ACT TCG TTG GTT−5’(配列番号4に対応する)
c)同定試験のために、プライマーTK−LWおよびTK−RWを用いて、503bpのRCNV野生型のtk遺伝子断片を増幅した。
ii)TK−RW:5’−GAA AAC GAC GCC TCT TTA AAG−3’(配列番号6に対応する)
d)同定試験のために、プライマーTK−RRおよびgJE−F1を用いて、rRCNV−狂犬病G2ゲノムのtk遺伝子座で、1637bpの狂犬病CVSのG遺伝子断片を増幅した。
ii)gJE−F1:5’−TCT CCT ACA TGG AAC TCA−3’(配列番号8に対応する)
4.Applied Biosystems AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems、Foster City、CAから市販されている)
5.Amersham−Pharmacia−Biotech Inc.dNTP(Amersham Biosciences、Piscataway、NJから市販されている)
6.Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems、Foster City、CAから市販されている)
方法
A.DNA調製
rRCNVゲノムDNA調製は、QIAGEN DNeasy組織キット(Qiagen Inc、Valencia、CA、USAから市販されている)を用い、Qiagenによって提供される取扱説明書に記載のとおりに実施した。
この包括的PCR試験では、プライマーHA−08およびHA−Pstを用いて、RCNV野生型をスクリーニングし、プライマーHA−Pstおよびgp−1Fを用いて、ha遺伝子座でrRCNV−狂犬病G2をスクリーニングし、プライマーTK−LWおよびTK−RWを用いて、RCNV野生型をスクリーニングし、プライマーTK−RRおよびgJE−F1を用いて、tk遺伝子座でrRCNV−狂犬病G2をスクリーニングした。
5μL 10×PCRバッファー
3μL 25mM MgCl2
5μL 2mM dNTPs
5μL 各プライマー(10μM)
5μL DNA鋳型
0.5μL 5ユニット/μL ABI AmpliTaq Gold
21.5μL ddH20
2.95℃のサーマルサイクラー中で、10分間、サンプルをインキュベートして、DNA鋳型を完全に変性する。
変性 94℃ 1.0分
アニーリング 590C 1.0分
伸長 720C 2.0分
4.サンプルを72℃で、さらに5分間維持する。
1.10μLの各PCR産物を、2μLのローディングバッファーと合わせる。
遺伝子特異的プライマーを用いた、rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5のPCR同定試験の結果が図5に示されている。プライマーHA−08およびHA−Pstを用いて、RCNV ha遺伝子(図5A、ゲルA)を検出し、プライマーTK−LWおよびTK−RWを用いて、RCNV tk遺伝子(図5B、ゲルB)を検出し、MSVおよびX+5(レーン2〜6)ではバンドは観察されなかった。対照的に、RCNV野生型Esposito(レーン7)では、ha遺伝子座の563bpバンドおよびtk遺伝子座の503bpバンドの両方が観察された。これらの結果は、RCNV野生型は、rRCNV−狂犬病G2中に混合されているということを示した。プライマーHA−Pstおよびgp−1Fを用いて、狂犬病Pasteur−Paris G遺伝子がrRCNV−狂犬病G2 ゲノムのha遺伝子座に挿入されているかどうかを調べた場合、プライマーTK−RRおよびgJE−F1を用いて、狂犬病CVS G遺伝子がrRCNV−狂犬病G2 ゲノムのtk遺伝子座に挿入されているかどうかを調べた場合には、ha遺伝子座の1303bpバンドおよびtk遺伝子座の1637bpバンドの両方が、それぞれ、MSVおよびX+5(レーン8〜9)において観察された。対照的に、RCNV野生型Esposito(レーン13)ではバンドは観察されなかった。これらの結果は、狂犬病Pasteur−ParisおよびCVS G遺伝子は、rRCNV−狂犬病G2 ゲノムのhaおよびtk遺伝子座にそれぞれ挿入されているということを示した。これらの結果は以下の表1に要約されている:
このPCR同定試験の結果から、狂犬病Pasteur−ParisおよびCVS G遺伝子は、rRCNV−狂犬病G2ゲノムのhaおよびtk遺伝子座に物理的に存在していたこと、およびRCNV野生型は、rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5中には混合されていないことが結論付けられる。このPCR試験はまた、1)RCNV野生型の、rRCNV−狂犬病G2ゲノムのhaおよびtk遺伝子座中の狂犬病Pasteur−ParisおよびCVS G遺伝子の同定試験;および2)組換えウイルス構築のプラーク精製の際にrRCNV−狂犬病G2をRCNV野生型と区別するためのクローンスクリーニングのために使用できる。
rRCNV−狂犬病G2 MSVおよび継代5の感染ベロ細胞における狂犬病糖タンパク質の発現を調べるために、間接免疫蛍光アッセイ(IFA)を実施した。
ウイルス: rRCNV−狂犬病G2 MSV
rRCNV−狂犬病 G2 X+5
ベロ細胞: P18−ベロ−12
培地: w/0.05%のLAH & Gentを補給した1×MEM
一次抗体: 抗狂犬病IgG2mAb(Accurate Chemical&Scientific Corp.、Westbury、NYから市販されている)
二次抗体: 蛍光がコンジュゲートしているヤギ抗マウスIgG(H+L)0.5mg
希釈剤/洗浄バッファー: 0.01M PBS
増強溶液: 1mg/mL p−フェニレンジアミン
90% グリセロール
10% 0.01M PBS
0.5M 炭酸バッファー
pH9.0、−20℃、暗所で保管
蛍光顕微鏡: Olympus BX51
方法
1.2個の8ウェルチャンバースライドに、0.05%のラクトアルブミン加水分解物(LAH)、30μL/mLのゲンタマイシンおよび5%のウシ胎児血清(FBS)を補給した、500μLの1×最小必須培地(MEM)中、1.0×105個のベロ細胞を植え付ける。
4.100μLの各希釈物をチャンバースライドのウェルに2連で入れ、4番目のウェルは陰性対照として残しておく。
結果は図6A〜6Cに示されている。rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5感染ベロ細胞のすべての希釈物において、細胞変性効果および蛍光が観察された(図6Aおよび6b参照のこと)が、非感染ベロ細胞のみを含有する陰性対照では観察されなかった(図6C参照のこと)。この結果は、狂犬病Gタンパク質は、rRCNV−狂犬病G2 MSVおよび継代5において発現され、狂犬病Gタンパク質特異的モノクローナル抗体によって検出されるということを示した。
標準NIHマウス効力試験を用いて、rRCNV−狂犬病G2およびvKB3−JE13(RCNV Rab−G)構築物の最初の比較研究を実施した。結果は、以下の表2に要約されている:
ウイルスまたはワクチン:
rRCNV−狂犬病G2、生存ベクター(7.0Logs10TCID50/mL)
rRCNV−狂犬病G2、生存ベクター(6.5Logs10TCID50/mL)
vKB3−JE13(CDC旧構築物)(7.2Logs10TCID50/mL)
Merial PUREVAX(登録商標)ネコ狂犬病(生存カナリアポックスベクターを用いる一価の狂犬病糖タンパク質ワクチン、Merial、Harlow、Essex、UKから市販されている)
rRCNV−狂犬病G2(6.38Logs10TCID50/mL)
不活化rRCNV−狂犬病G2(不活化前力価:6.38Logs10TCID50/mL)
NIH狂犬病参照ワクチン:アジュバントを含む不活化狂犬病ワクチン、NIHマウス効力試験において参照として用いられる究極の判断基準ワクチン。
NIHマウス効力試験:
この試験は、元の方法では、1:5、1:25、1:125および1:625の、または改正法では未希釈、1:10、1:100および1:1000の試験ウイルス/ワクチンを用いて標準法「狂犬病ワクチンのNIHマウス効力試験」を実施した。手短には、16匹のマウスに、7日間隔(特記されない限り)で、2用量の0.5mLの試験ウイルス(希釈された、もしくは未希釈の)またはNIH狂犬病参照ワクチンを用いて、腹膜内に(IP)ワクチン接種した。最初のワクチン接種の14日後、すべてのワクチン接種したマウスに、0.03mLの、1:80,000希釈の病原性狂犬病(チャレンジウイルスは、ワクチン接種されていないマウス(各希釈10マウス)において5倍希釈で逆滴定して、適切な攻撃用量を確実にした。)を用いて脳内に攻撃した(IC)。すべてのマウスは、攻撃後14日間毎日観察した。
以下の表3では、rRCNV−狂犬病G2の相対効力(RP)は、それぞれ、6.5Logs10TCID50/mLで27.9および7.0Logs10TCID50/mL で101.9である。表4では、6.5Logs10TCID50/mLのrRCNV−狂犬病G2は、7.2Logs10TCID50/mLのMerial PUREVAX(登録商標)ネコ狂犬病ワクチン(Merial、Harlow、Essex、UKから市販されている生存カナリアポックスベクターを用いる一価の狂犬病糖タンパク質ワクチン、これは、市場からこの実験比較の目的で購入した)およびVKB3−JE13(CDC旧構築物)よりも強力であった。以下の表5では、結果は、生存rRCNV−狂犬病G2は、不活化ワクチン製品よりも強力であると示した。
NIHマウス効力試験は、本発明のrRCNV−狂犬病G2構築物はマウスモデルにおいて高度に強力であるということを示した。
実験研究の目的は、PCR試験によってrRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5の遺伝的安定性を調べることである。
1.ウイルス:
a)rRCNV−狂犬病G2 MSV
b)rRCNV−狂犬病G2 X+5
2.プライマー:
a)ha遺伝子座での1806bpのPasteur−Paris狂犬病G遺伝子およびその部分フランキング領域の増幅のために、
HA−Pst:5’−TCA TTG ACA TCT GGA GAT GCA GGT ACT−3’(配列番号3に対応する)
PW−04: 5’−AGA ACA TTA CCC ACA TGA−3’(配列番号9に対応する)
b) tk遺伝子座での1910bpのChallenge Virus Standard(CVS)狂犬病G遺伝子およびその部分フランキング領域の増幅のために
TK−RR:5’−GAA AAG GAA GCC TCC TTA AAG−3’(配列番号7に対応する)
PW−03:5’−TCT CAC AAT CAC CAC TTT CAT−3’(配列番号10に対応する)
3.DNA精製およびPCRクローニングのためのキット/試薬
a)QIAGEN DNeasy組織キット(Qiagen Inc.、Valencia、CA、USAから市販されている)
b)Applied Biosystems AmpliTaq Gold DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems、Foster City、CAから市販されている)
c)Amersham−Pharmacia−Biotech Inc.dNTP(Amersham Biosciences、Piscataway、NJから市販されている)
4.Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems、Foster City、CAから市販されている)
方法
A.DNA調製
QIAGEN DNeasy組織キット(Qiagen Inc、Valencia、CA、USAから市販されている)を用い、Qiagenによって提供される取扱説明書に記載のとおりに、rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5からのゲノムDNAの調製を実施した。
このPCR試験では、プライマーHA−PstおよびPW−04を用いて、ha遺伝子座で1806bpのPasteur−Paris狂犬病G遺伝子およびその挿入フランキング領域を増幅し、プライマーTK−RRおよびPW−03を用いて、tk遺伝子座で1910bpのCVS狂犬病G遺伝子およびその挿入フランキング領域を増幅した。
5μL 10×PCRバッファー
3μL 25mM MgCl2
5μL 2mM dNTP
5μL 各プライマー(10μM)
5μL DNA鋳型
0.5μL 5ユニット/μL ABI AmpliTaq Gold
21.5μL ddH20
2.95℃のサーマルサイクラー中で、10分間サンプルをインキュベートして、DNA鋳型を完全に変性する。
変性 94℃ 1.0分
アニーリング 590C 1.0分
伸長 720C 2.0分
4.サンプルを72℃で、さらに5分間維持する。
1.10μLの各PCR産物を、2μLのローディングバッファーと合わせる。
PCR結果は、rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5から、1806bp(ha遺伝子座)および1910bp(tk遺伝子座)の同一のバンドが増幅されることを示した(図7参照のこと)。この結果は、それぞれ、rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5から得た、挿入フランキング領域およびtk遺伝子座のCVS狂犬病株の、およびha 遺伝子座のPasteur−Paris狂犬病株の狂犬病G遺伝子内に、注目すべき挿入または欠失は生じていないことを示した。rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5間のバンド密度の相違は、継代5のウイルスの力価が、マスターシードよりお約10,000倍高かったからである。結果は表6に要約されている。
PCR試験から、rRCNV−狂犬病G2 MSVは、継代5への製造前スケールアップ手順下で遺伝的に安定であると結論付けられる。
この研究は、青色プラークアッセイによって、継代5(rRCNV−狂犬病G2 X+5)への製造前スケールアップ手順下でrRCNV−狂犬病G2 MSV(マスターシードウイルス)が表現型上安定であったかどうかを調べる。
A.ベロ細胞を播種する
1.細胞を、7×105個/mL(1×MEM/0.05% LAH/Gent培地+5%FBS中10mL)の濃度で100mmディッシュ上に植え付け、細胞が感染のために約80%のコンフルエンシーに達するよう一晩増殖させる。
2. Thaw out ウイルスを室温で解凍し、場合により、氷上で15秒間、3回、超音波処理する。
a)rRCNV−狂犬病G2 MSVを10−1に希釈した。
4.100mmディッシュから培地を除去し、6mlの0.01M PBSを用いて2回すすぐ。
8.2×MEM/0.05%LAH/Gent培地に10% FBSを加え、42℃に加温する。
5日間インキュベーションした後、以下のとおりに7mLの染色溶液でディッシュを覆う:
14.染色溶液(100mL):50mLの2.5%Noble寒天、50mLのPBSおよび1mLの50mg/mL X−Galを調製する。
18.37℃で4〜6時間インキュベートする。
各プレート上で総青色プラークを計数し、以下の表7に要約した。いずれのプレートにおいても白色プラークは観察されなかった。ベロ細胞におけるrRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5に由来する青色プラークのデジタル画像が図8Aおよび8Bにそれぞれ示されている。rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5の算出された力価を以下に示す。
rRCNV−狂犬病G2 MSVおよびX+5のいずれにおいても白色プラークは大きな力価喪失は観察されなかった。この結果は、rRCNV−狂犬病G2 MSVは、継代5への製造前スケールアップ手順下で表現型上安定であることを示した。
この研究は、rRCNV−狂犬病G2ワクチンの短期間(3ヶ月)の有効性を実証するために実施した。
この研究の目的は、rRCNV−狂犬病G2ワクチンの短期間(3ヶ月)の有効性を実証することであった。
ネコにおいてワクチン製剤を使用するための防御用量を調べるために、2つの、rRCNV−狂犬病G2ワクチンの1年の免役継続期間(DOI)研究を実施し、病原性狂犬病ウイルス攻撃によって有効性が実証された。これらの研究の目的は、2つの異なる用量、5.38Log10TCID50/mlの低用量および6.28Log10TCID50/mlの常用量の狂犬病ウイルスワクチンを用いた単回ワクチン接種後、1年の期間後、ネコにおいてアジュバント不含組換え狂犬病ワクチンの有効性および免疫原性を調べることであった。
手短には、この1年の免役継続期間(DOI)研究では、2群があった:ワクチン接種群のネコ(n=28)には、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター(VSコード1901.R5)の単回用量を、12週齢で投与し、対照群のネコ(n=13)には、ワクチン接種を行わなかった。ワクチン接種後28、91、183、272および365日に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種の1年より後に(421日目)、狂犬病攻撃のために35匹のネコ(25匹のワクチン接種されたものおよび10匹の対照)を無作為に選択した。攻撃材料は、NVSL−BVL、USDA(米国農業省の国立獣医学研究所(National Veterinary Services Laboratories of the United States Department of Agriculture)および全豪検査機関協会(National Association of Testing Authorities)(NATA)品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所(Berrimah Veterinary Laboratories)によって供給された、狂犬病street NYC株ロット92−5の1:40直接希釈によって調製した。すべての攻撃されたネコを、90日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡率を記録した。死亡した、または安楽死させたネコの脳を各々、蛍光抗体(FA)試験によって狂犬病について調べた。APHIS/CVB調査官は現場で、この研究におけるワクチン接種、攻撃材料調製および攻撃のすべての手順を観察した。
この研究のプロトコールを以下にさらに詳細に記載する:
ワクチン接種時には、28匹の試験動物および13匹の対照動物があった。攻撃のために35匹のこれらのネコ(25匹のワクチン接種されたものおよび10匹の対照)を無作為に選択した。ネコは、ワクチン接種時に12週齢であった。この研究のための凍結乾燥したrRCNV−狂犬病G2ワクチンは、2〜7℃で保存した。凍結乾燥ワクチンは、生存rRCNV−狂犬病G2およびSGGK安定化剤からなっていた。試験組換え狂犬病ワクチンは、アジュバント不含であった。試験ワクチンは、5つの複製アッセイで力価測定し、この研究においてネコに投与される用量を定めた。ワクチンの平均力価は、5.38Log10TCID50/mL(用量あたり)であった。
凍結乾燥ワクチンを、1.0mLの供給された滅菌水希釈剤によって再水和した。ワクチン接種経路は皮下とした。ワクチン接種群中の各動物には、1回用量(1mL/用量)のワクチンを襟首に投与した。対照動物には、ワクチン接種を行わなかった。APHIS/CVB調査官は現場で、ワクチン接種の全手順を観察した。長期の研究機関のために、Fel−O−Vax PCTを用い、ラベルの指示に従って、すべてのネコにワクチン接種した。
rRCNV−狂犬病G2ワクチンを用いたワクチン接種の1年より後に(421DPV)、攻撃のために10匹の対照および25匹のワクチン接種されたものを無作為に選択した。無作為化は、マイクロソフトエクセル中の乱数発生器を用いて実施した:ワクチン接種されたものに数を割り当て、分け、ワクチン接種されたものの数が25に等しくなるまで最大数をつけたネコを攻撃から除外し;類似の手順を用いて、対照の数を10に減らした。結果として、3匹の対照および2匹のワクチン接種されたものを、攻撃相から無作為に排除した。さらに、1匹の、種々の皮膚疾患を有していたワクチン接種されたものを、攻撃の前にこの研究から排除した。
血清サンプル
血清サンプルを採取した。各ネコから6mLの全血を、ワクチン接種後0日(DPV)、28DPV、91DPV、183DPV、272DPVおよび365DPVに血清のために採取した。
血清サンプルは、迅速蛍光フォーカス抑制試験(RFFIT)、NVSL(米国農業省の国立獣医学研究所(National Veterinary Services Laboratories of the United States Department of Agriculture))によって公開された組織培養蛍光抗体手順によって試験して、狂犬病ウイルスに対する血清中和(SN)力価を調べた。
攻撃後観察期間の間、安楽死させた、または死亡しているように見えたすべての動物を、狂犬病ウイルスについて試験した。より詳しくは、脳を採取し(アンモン角)、切片を作製し、加工し、蛍光抗体技術によって染色した。
ワクチン力価測定
この研究に用いたワクチンは、標準技術によってベロ細胞で5つの複製で力価測定した。試験ワクチンの平均力価は、5.38Log10TCID50/mL(用量あたり)であった。
ワクチン接種の28、91、183、272および365日後に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを、RFFITによって狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種を受けたネコの大部分において相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
攻撃後、ネコは90日間毎日観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡を記録した。8/10(80%)のワクチン接種を受けていない対照ネコが死亡するか、または狂犬病の徴候を示さず、これが妥当な攻撃試験であったことを示すことがわかった。対照的に、3/25(12%)のワクチン接種を受けたネコしか死亡または狂犬病の徴候を示さなかった。狂犬病感染による11匹のネコの死亡は、10DPCから20DPCの間に起こることがわかった。研究の最後に、22匹のワクチン接種されたものおよび2匹の対照が健康なままであった。ワクチン接種されたものと対照群の間の死亡率には有意差があった。予防できる確率は85%であった(95%CI55,97)。
上記の安楽死させたネコの脳(8匹の対照および3匹のワクチン接種されたもの)の試験結果は、狂犬病ウイルスについて陽性であり、それによって、これら11匹のネコの死亡は、狂犬病感染によるものであったことが確認された。
この1年DOI研究から、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターは、ネコの単回ワクチン接種後少なくとも1年間の狂犬病の予防において補助として、5.38Log10TCID50/mLほどの低い力価であっても有効であると結論付けられる。
1年の免役継続期間研究を反復した、ただし、組換えワクチンの平均力価は、「標準」用量と呼ばれる、6.28Log10TCID50/mL(用量あたり)であった。凍結乾燥ワクチンは、生存rRCNV−狂犬病G2およびSGGK安定化剤からなっていた。この組換え狂犬病ワクチンは、アジュバント不含であった。試験ワクチンは、5つの複製アッセイで力価測定し、この研究においてネコに投与される用量を定めた。
これは、無作為化完備ブロック計画であった。41匹のネコを、以下のように無作為に2群に分けた:
凍結乾燥ワクチンを、1.0mLの供給された滅菌水希釈剤によって再水和した。ワクチン接種経路は皮下とした。ワクチン接種群中の各動物には、1回用量(1mL/用量)のワクチンを襟首に投与した。対照動物には、ワクチン接種を行わなかった。APHIS/CVB調査官は現場で、ワクチン接種の全手順を観察した。長期の研究機関のために、Fel−O−Vax PCTを用い、ラベルの指示に従って、すべてのネコにワクチン接種した。
ワクチン接種の1年より後に(399日目)、攻撃のために10匹の対照および25匹のワクチン接種されたものを無作為に選択した。無作為化は、マイクロソフトエクセル中の乱数発生器を用いて実施した:ワクチン接種されたものに数を割り当て、分け、ワクチン接種されたものの数が25に等しくなるまで最大数をつけたネコを攻撃から除外し;類似の手順を用いて、対照の数を10に減らした。結果として、3匹の対照を、攻撃相から無作為に排除し、安全性試験のためにQCに移した。3匹のワクチン接種されたものも、攻撃相から無作為に排除し、安楽死させた。
ワクチン力価測定
この研究に使用したワクチンは、ベロ細胞で5つの複製で力価測定した。試験ワクチンの平均力価は、6.28Log10TCID50/mL(用量あたり)であった。
血清サンプル
6ミリリットルの全血を、ワクチン接種後0日およびワクチン接種後31、91、182、273および364日に採取した。
ワクチン接種後31、91、182、273および364日に、すべてのネコを出血させ、個々の血清サンプルを、RFFITによって狂犬病ウイルスに対する中和抗体について試験した。ワクチン接種を受けたネコの大部分において相当な狂犬病中和抗体力価が観察されたが、ワクチン接種を受けていないネコは、攻撃まで狂犬病血清陰性のままであった。
攻撃後、ネコは90日間観察し、狂犬病関連臨床徴候および死亡を記録した。9/10(90%)のワクチン接種を受けていない対照ネコが死亡するか、狂犬病の徴候を示し、これが妥当な攻撃試験であったことを示す。対照的に、ワクチン接種を受けたネコのうち死亡または狂犬病の徴候を示したものはなかった(0/25、0%)。狂犬病感染による9匹のネコの死亡は、10DPCから15DPCの間に起こることがわかった。研究の最後に、25匹のワクチン接種されたものすべておよび1匹の対照が健康なままであった。ワクチン接種されたものと対照群の間の死亡率には有意差があった。予防できる確率は100%であった(95%CI84,100)。
攻撃後観察期間の間に死亡した、および安楽死させたネコを、蛍光抗体試験のためにアイオワ州立大学獣医学部の獣医診断検査所(Veterinary Diagnostic Laboratory)に確実に運んだ。9匹の死亡したネコの脳(9匹の対照)は、狂犬病ウイルスについて試験の結果、陽性であった。これらの結果から、9匹のネコの死亡は狂犬病によるものであったことがさらに確認された。
この1年のDOI研究の結果から、新規狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター(rRCNV−狂犬病G2構築物)は、単回ワクチン接種後少なくとも1年間の狂犬病の予防において、ネコにおいて、6.28Log10TCID50/mLの力価で有効であると結論付けられる。
イヌにおける狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクターの防御用量を決定するために、rRCNV−狂犬病G2ワクチンの1年の免役継続期間(DOI)研究を実施し、イヌにおいて病原性狂犬病ウイルス攻撃によって有効性を実証した。この研究の目的は、単回ワクチン接種の1年後の、イヌにおけるアジュバント不含組換え狂犬病ワクチンの有効性を実証することであった。
凍結乾燥ワクチンを、1.0mLの供給された滅菌水希釈剤によって再水和した。ワクチン接種経路は皮下とした。ワクチン接種群中の各動物には、1用量(1mL/用量)のワクチンを襟首に投与した。対照動物には、ワクチン接種を行わなかった。APHIS/CVB調査官は現場で、ワクチン接種の全手順を観察した。
ワクチン接種の1年より後に(420日)、攻撃のために10匹の対照および25匹のワクチン接種されたものを選択した。4匹のイヌ(2匹のワクチン接種されたものおよび2匹の対照)を再発性耳感染のために排除した。2匹のイヌ(1匹のワクチン接種されたものおよび1匹の対照)を無作為に排除した。無作為化は、マイクロソフトエクセル中の乱数発生器を用いて実施した:ワクチン接種されたものに数を割り当て、分け、ワクチン接種されたものの数が25に等しくなるまで最大数をつけたイヌを攻撃から除外し;類似の手順を用いて、対照の数を10に減らした。結果として、1匹の対照および1匹のワクチン接種されたものを、攻撃相から無作為に排除した。
この1年のDOI研究の結果から、狂犬病ワクチン、生存アライグマポックスウイルスベクター(rRCNV−狂犬病G2構築物)は、イヌの単回ワクチン接種後少なくとも1年間の狂犬病の予防において、ネコにおいて補助として、6.28Log10TCID50/mLの力価で有効であると結論付けられる。
この研究の目的は、rRCNV−狂犬病G2が、ネコにおける戻し継代の際に病原性へ復帰できるかどうかを調べることおよびウイルス排出およびネコの間でのウイルスの蔓延の可能性を調べることであった。
10匹の接種したネコは、5匹の未処理(接触)対照ネコとまとめて飼育し、ワクチンウイルスの、動物対動物の接触によって蔓延する能力を評価した。口腔スワブおよび糞便サンプルを、接種後−2〜15日(DPI)まで毎日採取した。直腸温および全身の健康および臨床徴候の観察を、−2〜15DPIまで毎日モニターした。
最初の継代では、口腔スワブ、糞便サンプルまたは組織サンプルからウイルスが単離されなかったので、20匹のネコを用いて確認的戻し継代を実施した。10匹のネコに、プールした組織ホモジネートを接種し、10匹のネコに最初の接種におけるようなウイルスを接種した。これらのネコは、−2DPI〜21DPIまで観察した。21DPIに、これらのネコを安楽死させ、剖検した。
接触対照(接種なし)を除くすべてのネコに、最初および確認的戻し継代の両方において1.0mLの投与容量を用いて経口的に投与した。
直腸温、および咳、くしゃみ、鼻汁および眼漏、舌炎および口内炎などの臨床徴候を、最初の継代については、−2〜15DPIまで、確認的戻し継代については、−2〜21DPIまで毎日モニターした。剖検後、血清サンプル、口腔スワブ、糞便サンプルおよび組織サンプルを採取し、分析した。
a)rRCNV−狂犬病G2を接種されたネコは、臨床疾患の徴候を示さないはずである。咽門炎などの軽度の一時的な臨床異常が、開園生存ウイルスの経口投与のために予測され、接種の正常な反応と考えられるべきである。
この研究から得られた結果は、rRCNV−狂犬病G2は、ネコを通過した場合に病原性に復帰できないことを示した。また、rRCNV−狂犬病G2ウイルスは、排出しない、またはネコの間で播種しないことも実証した。
手短には、この用量設定研究では、4群があった:3つのワクチン接種群中のイヌ(n=3×10)には、単回用量の、それぞれ、6.7もしくは6.4Log10TCID50/mLの不活化前力価(希釈)を有するDURAMUNE(登録商標)DA2PPv(ケーキ)/不活化rRCNV−狂犬病G2、または6.7Log10TCID50/mLの不活化前力価(希釈)を有するCvK/LCIGP/不活化rRCNV−狂犬病G2を、12週齢で投与し、対照群中のイヌ(n=10)には、DURAMUNE(登録商標)DA2PPv(ケーキ)/水(希釈剤)を用いてワクチン接種した。ワクチン接種の時点で、すべての試験イヌは狂犬病血清陰性であった。
ワクチン1(V1)は、凍結乾燥DA2PPvケーキおよび希釈剤1からなるものであった。希釈剤1は、不活化rRCNV狂犬病G2画分(用量あたり約6.7Log10TCID50の不活化前力価)およびアジュバント(1% EMA(登録商標)3% NEOCRYL(登録商標))を含んでいた。
イヌを以下のように無作為に4群に分けた:
ワクチン接種経路は皮下(SQ)であった。各動物に1用量(1mL/用量)のワクチン/プラセボを襟首に投与した。
ワクチン接種の20週間(約5ヶ月)後、NVSL−BVL、USDA(米国農業省の国立獣医学研究所(National Veterinary Services Laboratories of the United States Department of Agriculture)および全豪検査機関協会(National Association of Testing Authorities)(NATA)品質認定研究所下のオーストラリアのノーザンテリトリーのベリマー獣医学研究所(Berrimah Veterinary Laboratories)によって供給された、狂犬病street challengeウイルス(キツネにおけるNYC株)の1:10−5直接希釈物を用いてすべてのイヌを攻撃した。手短には、動物を接種前に鎮静化し、次いで、0.5mLの各咀嚼筋への希釈した攻撃(合計1.0mL)を用いて筋肉内に接種した。動物を、33日の観察期間の間、狂犬病攻撃領域内の個々のケージに入れ、確保した。33日の攻撃後観察期間は、すべての狂犬病動物が攻撃後最初の4週間に死亡した、これまでの狂犬病攻撃結果によって正当であるとした。
攻撃前2日間、40匹の健康なイヌにおいて異常な徴候は観察されなかった。
この用量漸増研究の結果は、DURAMUNE(登録商標)DA2PPvまたはDURAMUNE(登録商標)DAP2Pv/LCIGPと組み合わせた本発明のrRCNV−狂犬病G2画分は、イヌにおける、単回ワクチン接種後少なくとも5ヶ月間の狂犬病の予防において補助として、6.4Log10TCID50/mL(用量あたり)の不活化前力価でさえ有効であると結論付けられる。
ネコにおけるワクチン製剤の使用のために防御用量を決定するために、rRCNV−狂犬病G2 ワクチンの3年の免役継続期間(DOI)研究を、実施例9において先に記載したものと同様の材料および方法を用いて実施し、有効性が病原性狂犬病ウイルス攻撃によって実証された。本発明の目的は、6.28Log10TCID50/mlの用量を用いて単回ワクチン接種した後の3年間後に、ネコにおけるアジュバント不含組換え狂犬病ワクチンの有効性および免疫原性を実証することであった。
ネコにおいてワクチン製剤を使用するための防御用量を調べるために、rRCNV−狂犬病G2画分の1年の免役継続期間(DOI)研究を実施し、病原性狂犬病ウイルス攻撃によって有効性が実証された。これらの研究の目的は、1年間後のネコにおけるFel−O−Vax−LvK IV+CaliVaxと組み合わせた、rRCNV−狂犬病G2画分の有効性および免疫原性を実証することであった。
Claims (31)
- 各々が少なくとも1つの狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする、2つ以上の外因性核酸分子を含む、組換えアライグマポックスウイルスベクター(rRCNV)であって、
血球凝集素(ha)およびチミジンキナーゼ(tk)遺伝子座の各々に少なくとも1つの前記核酸分子が挿入され、
狂犬病ウイルス糖タンパク質の供給源が、Challenge Virus Standard狂犬病株、およびPasteur−Paris狂犬病株から選択され、
アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入されている糖タンパク質をコードする核酸分子が、Challenge Virus Standard狂犬病株に由来し、
アライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子座に挿入されている糖タンパク質をコードする核酸分子が、Pasteur−Paris狂犬病株に由来する、
前記組換えアライグマポックスウイルスベクター(rRCNV)。 - アライグマポックスウイルスが生存しており、複製可能である、請求項1に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクター。
- アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼおよび血球凝集素遺伝子座に加え、アライグマポックスウイルスゲノムの第3の非必須部位に挿入されている狂犬病ウイルス糖タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、請求項2に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクター。
- アライグマポックスウイルスゲノムの第3の非必須部位が、セリンプロテアーゼ阻害剤部位である、請求項3に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクター。
- 免疫学的に有効な量の、請求項1に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクターと、所望により、好適な担体または希釈剤とを含む、組換え狂犬病ワクチン。
- 免疫学的に有効な量の、請求項1〜4のいずれか一項に記載の1つ以上の組換えアライグマポックスウイルスベクターと、所望により、好適な担体または希釈剤とを含む、組換え狂犬病ワクチン。
- ネコカリシウイルス、クラミドフィラ・フェリス(Chlamydophila felis)、ネコ白血病ウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコ鼻気管炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ネコ感染性腹膜炎ウイルスおよびバルトネラ菌からなる群から選択される1つ以上のネコ抗原との混合物をさらに含む、請求項6に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- エーリキア・カニス(Ehrlichia canis)、イヌパルボウイルス、イヌジステンパー、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌアデノウイルスII型、イヌアデノウイルス、イヌコロナウイルス、レプトスピラ・イクテロヘモラジア(Leptospira icterohemorrhagiae)、レプトスピラ・カニコーラ(Leptospira canicola)、レプトスピラ・グリポティフォーサ(Leptospira grippotyphosa)およびレプトスピラ・ポモナ(Leptospira pomona)からなる群から選択される1つ以上のイヌ抗原との混合物をさらに含む、請求項7に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- アジュバントをさらに含む、請求項5に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- 前記アジュバントが、エチレン/マレイン酸共重合体およびアクリル酸共重合体エマルジョンの混合物を含む、請求項9に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- アジュバントをさらに含む、請求項6に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- 前記アジュバントが、エチレン/マレイン酸共重合体およびアクリル酸共重合体エマルジョンの混合物を含む、請求項11に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- アジュバントをさらに含む、請求項7に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- 前記アジュバントが、エチレン/マレイン酸共重合体およびアクリル酸共重合体エマルジョンの混合物を含む、請求項13に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- アジュバントをさらに含む、請求項8に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- 前記アジュバントが、エチレン/マレイン酸共重合体およびアクリル酸共重合体エマルジョンの混合物を含む、請求項15に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- 哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項5に記載のワクチン。
- 哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項6に記載のワクチン。
- 哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項9に記載のワクチン。
- 哺乳動物において狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項11に記載のワクチン。
- ネコにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項7、13または14のいずれか一項に記載のワクチン。
- イヌにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項8、15または16のいずれか一項に記載のワクチン。
- ウシにおいて、またはウマにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項5または7〜10のいずれか一項に記載のワクチン。
- ウシにおいて、またはウマにおいて狂犬病に対する防御免疫応答を誘導するために使用される、請求項6に記載のワクチン。
- 請求項1に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクターを作製する方法であって、以下の工程:
(a)Challenge Virus Standard狂犬病株の糖タンパク質をコードする核酸配列を、アライグマポックスウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子座に挿入する工程と、
(b)Pasteur−Paris狂犬病株の糖タンパク質をコードする核酸配列を、アライグマポックスウイルスゲノムの血球凝集素遺伝子座に挿入する工程と、
(c)組換えアライグマポックスウイルスベクターを回収する工程と
を含む方法。 - 前記工程(a)および(b)の核酸配列が、組換えアライグマポックスウイルスベクターによる核酸の発現ならびに第1および第2の狂犬病株の糖タンパク質の産生を可能にするために、核酸配列に作動可能に連結したプロモーター配列をさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 前記ワクチンの有効免疫量が、4.5Log10TCID50/ml〜6.7Log10TCID50/mlの範囲である、請求項17〜24のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ワクチンの有効免疫量が、5.38Log10TCID50/ml〜6.28Log10TCID50/mlの範囲である、請求項17〜24のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ワクチンが、単回用量として、または反復用量として投与される、請求項17〜24のいずれか一項に記載のワクチン。
- 前記ワクチンがアジュバントを含まない、請求項5〜9のいずれか一項に記載の組換え狂犬病ワクチン。
- Challenge Virus Standard由来の核酸配列がvvP11後期プロモーターの制御下にあり、Pasteur−Paris狂犬病株由来の核酸配列が合成初期−後期プロモーターの制御下にある、請求項1に記載の組換えアライグマポックスウイルスベクター。
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