CN101680036B - 表达狂犬病糖蛋白的浣熊痘病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组浣熊痘病毒载体，其表达在所述痘病毒基因组的血球凝集素(hemagglutinin)(ha)基因座处的狂犬病病毒糖蛋白基因，或表达在所述痘病毒基因组的胸苷激酶(thymidine kinase)(tk)和血球凝集素(ha)基因座处的相同或不同狂犬病病毒株的糖蛋白基因，及该等载体作为无佐剂疫苗的用途。所述浣熊痘病毒载体包含编码攻击病毒标准(Challenge Virus Standard)狂犬病病毒株的糖蛋白的核酸分子，其插入并表达于所述痘病毒基因组的tk基因座；和编码巴斯德-巴黎(Pasteur-Paris)狂犬病病毒株的糖蛋白的核酸分子，其插入并表达于所述痘病毒基因组的ha基因座。所述疫苗可任选地含有用于免疫动物的其它猫和犬抗原的混合物。还揭示通过向哺乳动物投与有效免疫量的本发明疫苗而诱发所述哺乳动物针对狂犬病的免疫反应的方法。

Description

表达狂犬病糖蛋白的浣熊痘病毒
技术领域
本发明涉及重组浣熊痘病毒载体，其独特表达至少两种插入浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶(tk)和血球凝集素(ha)基因座中的不同狂犬病病毒株的狂犬病糖蛋白基因。本发明适用作预防由狂犬病病毒引起的神经疾病和死亡中的疫苗。
背景技术
狂犬病病毒是弹状病毒科(family Rhabdoviridae)具有负链极性的不分段、单链、线性RNA弹状病毒(rhabdovirus)或狂犬病毒(lyssavirus)，其形同子弹，一端为圆形或锥形，而另一端平坦或为凹形。病毒粒子(virion)的圆形或锥形末端具有脂蛋白包膜，包膜上有糖蛋白G构成的球形突起状刺突(knob-like spike)。除糖蛋白G外，环绕核心结构的脂质膜或病毒包膜还具有由基质蛋白(M)组成的第二内层。外表面糖蛋白G负责细胞粘附并且已鉴别为负责狂犬病病毒的毒力或致病性以及宿主免疫反应的抗原性物质。
极少例外，狂犬病总是在人类和动物中导致致命神经疾病，并且仍为严重的全球公共卫生问题。大多数源于狂犬病的人类死亡都发生非洲、亚洲和南美洲，而在美国，由于快速增长的受感染浣熊群体，狂犬病流行病也已在最近成为问题。受关注的其它初级病毒携带者是主要存在于中西部州的臭鼬，和为美国大多数人类病例主要来源的蝙蝠。除诸如浣熊、臭鼬、狐狸、狼等受感染野生动物外，人类通常经受感染犬和猫咬伤而感染上狂犬病。在犬科狂犬病是地方性流行病的非洲和亚洲，犬仍是狂犬病病毒的主要宿主，并且犬仍是造成全世界因狂犬病而发生的大多数人类死亡的原因。因此，对人类而言，预防诸如犬、猫和雪貂等家养宠物中的狂犬病病毒感染尤其重要。
巴斯德·路易斯(Louis Pasteur)和埃米尔·鲁(Emile Roux)在1885年研发出第一次狂犬病疫苗接种。早期神经组织来源的疫苗由取自受感染兔并经干燥以减弱其致病性的病毒样本组成。一些发展中国家仍使用类似的神经组织狂犬病疫苗，并且尽管比现代细胞培养疫苗便宜很多，但是其并不同样有效并具有神经副作用的显著风险。
在1967年，使用病毒的减毒皮特曼-穆尔L503(Pitman-Moore L503)病毒株，开发出人类二倍体细胞狂犬病疫苗(HDCV)用于人类疫苗接种。现在市场上可购得价格低廉、高度纯化的鸡胚培养疫苗(PCEC)和纯化的维洛(Vero)细胞狂犬病疫苗。后一种Vero细胞培养疫苗使用狂犬病病毒的减毒维斯塔尔(Wistar)病毒株而Vero细胞系为其宿主。尽管经过减毒，但Vero细胞培养疫苗具有回复毒力的可能。因此，狂犬病疫苗的制备要求工作人员极其小心以避免由于幸免于灭活过程的狂犬病病毒而导致意外传播所述病毒株的病毒感染。PCEC疫苗具有额外缺点，即其不可被给予对蛋或鸡过敏的任何人。在疫苗中操作、制造或使用活狂犬病病毒的其它困难是药物和兽医学领域的技术人员所熟知的。
鉴于常规狂犬病病毒疫苗的缺点，研究已针对使用重组浣熊痘病毒和将诸如狂犬病病毒糖蛋白基因等外来基因插入浣熊痘病毒的胸苷激酶(tk)基因座中。据发现，重组浣熊痘病毒的某些早期构建体可表达外来病毒抗原性物质或外来DNA，并且在诸如犬和猫等其它动物中引发宿主保护性免疫反应。然而，适用作疫苗的安全有效的重组浣熊痘病毒的构建是复杂的并且涉及许多必须考虑的因素。具体来说，产生使插入至已知tk基因座以外的不同区域中的外源或外来基因的位置改变的重组浣熊痘病毒的能力，以及对功能性外来抗原DNA片段的特定选择要求大量实验研究以确定所得重组痘病毒的稳定性、安全性和功效(efficacy)。因此，在兽医学疫苗领域中，许多研究工作着重于获得商业可行重组浣熊痘病毒疫苗的数种尝试。
因而，存在大量关于重组浣熊痘病毒作为疫苗的主题的公开信息。例如最近，已在美国专利申请案第2005/0282210号中描述用于浣熊狂犬病的口服遗传重组病毒疫苗。使用重组DNA技术将产生狂犬病病毒外壳中的蛋白质的基因插入活牛痘病毒中。当经修饰牛痘病毒感染正常动物时，其产生通常由狂犬病病毒制得的抗原蛋白质。受感染者的生物系统将这一蛋白质识别为外来蛋白质；并且动物产生主动免疫性。具体而言，专利申请案第2005/0282210号是针对在臭鼬或猫鼬中引发免疫反应的方法，其包括投与由包含已插入至牛痘的病毒载体基因组中的狂犬病表面糖蛋白基因的病毒载体组成的组合物。所述揭示案提出在以下位置用于欲表达的聚核苷酸的潜在插入位点：胸苷激酶(tk)基因或插入位点、血球凝集素(ha)基因或插入位点，或编码牛痘病毒的A型包涵体(ATI)的区域；在金丝雀痘(canarypox)病毒的状况下，为ORF C3、C5和/或C6；在禽痘(fowlpox)病毒的状况下，为ORF F7和/或F8，但文献仅例证狂犬病糖蛋白G是来源于ERA病毒株并且仅插入牛痘的tk位点中的牛痘病毒载体的用途。
美国专利第7,074,413号揭示通过以街或神经侵袭性狂犬病病毒的糖蛋白替代非神经侵袭性狂犬病病毒株的糖蛋白来设计重组狂犬病病毒疫苗，以产生用于疫苗接种或构建表达促凋亡蛋白(pro-apoptotic protein)的重组狂犬病病毒的减毒重组狂犬病病毒。
美国专利第6,719,981 号显示减毒狂犬病病毒突变体和包含所述突变体的活减毒抗狂犬病疫苗，其中街-亚拉巴马-达弗林(Street Alabama Dufferin)病毒株(SAD D29)的重组狂犬病病毒突变体包含病毒基因组的G蛋白中的突变，其中所述突变包含编码Arg333的AGA密码子经GAC密码子特定取代。
美国专利第6,294,176号涉及由浣熊痘病毒病毒基因组组成的重组浣熊痘病毒疫苗，所述基因组含有插入浣熊痘病毒基因组的HindIII“U”基因组区域、HindIII“M”基因组区域或HindIII“N”基因组区域内的非必需区域中的外来DNA序列。浣熊痘病毒病毒基因组在所述专利中描述为，在病毒基因组的浣熊痘病毒宿主范围基因中含有缺失。所述专利提供用于通过将外来DNA序列插入至浣熊痘病毒基因组中来产生重组浣熊痘病毒的同源载体(homology vector)。虽然广泛提出重组浣熊痘病毒可能含有编码来自狂犬病病毒的抗原多肽的外来DNA，但是没有与其相关的例证。另外，DNA序列分析表明，由专利权所有人揭示的HindIII“U”基因组区域不是重组浣熊痘病毒基因组的血球凝集素(ha)插入和/或胸苷激酶(tk)区域。
美国专利第6,241,989号及其接续美国专利第7,087,234号研究多价重组浣熊痘病毒，其含有不止一个插入胸苷激酶基因或血球凝集素基因中的外源基因。在这些专利中揭示多价重组浣熊痘病毒作为疫苗以使猫免疫抵抗猫病原体的用途。还揭示通过重组过程制造多价重组浣熊痘病毒的方法，其包括构建外源基因插入于其中的插入载体；并使所插入基因侧接有可重组至浣熊痘病毒胸苷激酶基因或血球凝集素基因中的序列；将含有外源基因的插入载体和浣熊痘病毒引入敏感宿主细胞中；并从所得斑块选择重组浣熊痘病毒。所述专利的多价重组浣熊痘病毒可在猫细胞中感染和复制，并含有不止一个插入由浣熊痘病毒基因组的血球凝集素基因或胸苷激酶基因组成的区域中的外源基因，所述区域对病毒复制而言是非必需的，并且各外源基因编码一种猫病原体抗原。所述专利描述编码诸如猫白血病病毒(FeLV Env)、猫免疫缺陷病毒(FIV Gag)、猫免疫缺陷病毒(FIV Env)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV M)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV N)、猫杯状病毒(FCV衣壳蛋白)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV VP2)和狂犬病-G等猫病原体抗原的外源基因。
尽管美国专利第6,241,989和7,087,234号提出浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶(tk)基因和血球凝集素(ha)基因都可用于通过重组插入外源基因，但是具体实例仅显示，如何通过所侧接牛痘病毒tk基因序列和含有插入ha基因中的FCV衣壳蛋白基因的单独同源重组浣熊痘病毒的同源重组来产生多价的基于RCNV的重组FPV VP2和狂犬病病毒(RCNV/FPV/RAB-G)。没有权利要求或例证教授如何构建和/或使用在胸苷激酶和血球凝集素基因上都含有多种外来抗原性物质的重组浣熊痘病毒。此外，所述专利未教授或揭示具有插入浣熊痘病毒基因组ha位点中的狂犬病病毒糖蛋白基因的任何重组构建体。
美国专利第6,106,841号涉及使动物免疫抵抗异源抗原的方法。所述方法描述经由结膜途径向动物投与一种组合物，这一组合物包含具有编码所述异源抗原的核酸分子的重组浣熊痘病毒。抗原描述为杯状病毒、冠状病毒、疱疹病毒、免疫缺陷病毒、传染性腹膜炎病毒、白血病病毒、细小病毒抗原、狂犬病病毒、巴尔通体(Bartonella)、耶尔森菌(Yersinia)、恶丝虫属(Dirofilaria)、弓形虫属(Toxoplasma)、蚤抗原或蚤过敏原、蠓抗原或过敏原、螨抗原或过敏原以及肿瘤抗原。所述专利进一步揭示重组浣熊痘病毒，其包含编码诸如以下等免疫调节剂的核酸分子：粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、集落刺激因子(CSF)、白细胞介素、干扰素γ等。其中还描述使用在选自胸苷激酶、血球凝集素、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)、细胞因子受体和干扰素受体基因的浣熊痘病毒基因中具有异源核酸分子的重组浣熊痘病毒基因组的方法，其中异源核酸分子操作性连接由p11痘病毒启动子、p7.5痘病毒启动子或合成痘病毒启动子组成的转录控制序列。
美国专利第6,024,953号描述一种牛痘病毒，其含有编码狂犬病的抗原糖蛋白的全部或部分DNA序列。具体来说，所述专利揭示：含有编码狂犬病糖蛋白G氨基酸序列的DNA序列的杂合牛痘病毒，所述氨基酸序列已插入处于7.5K牛痘病毒启动子控制下的牛痘胸苷激酶(tk)基因中；和由杂合牛痘病毒和医药学上可接受的载剂组成的用于预防和治疗狂犬病的疫苗。
美国专利第5,348,741号研究已用包含操作性连接至牛痘P11晚期启动子的狂犬病病毒糖蛋白G基因的重组DNA构建的质粒载体。狂犬病病毒糖蛋白G基因来源于攻击病毒标准病毒株。将基因和启动子插入牛痘(vaccinia/cowpox)病毒载体的胸苷激酶(tk)基因座中。所述专利陈述，重组牛痘病毒在细胞中表达狂犬病病毒糖蛋白的基因并诱导产生用于免疫以抵抗狂犬病的糖蛋白。所述专利表明，重组病毒可应用于抗狂犬病疫苗和G抗原抗体以及用于研究或诊断目的的相关免疫学试剂的制造。值得注意地，所述专利并未描述将狂犬病病毒糖蛋白G基因插入除tk基因座以外的任何其它位点中，并且未给出使用浣熊痘病毒作为载体的任何提议。
早期DNA狂犬病疫苗描述于美国专利第5,830,477号中，其涉及含有编码狂犬病的抗原糖蛋白的全部或部分DNA序列的牛痘病毒。所述专利涉及用于在哺乳动物中预防或治疗狂犬病的口服疫苗，其由含有并表达编码狂犬病糖蛋白G氨基酸序列的DNA序列的杂合牛痘病毒和医药学上可接受的载剂组成，其中所述DNA序列存在于牛痘病毒的非必需区段中。具体而言，所述专利仅例证狂犬病糖蛋白G处于7.5K牛痘启动子控制下并存在于牛痘胸苷激酶(tk)基因中的杂合牛痘病毒疫苗。
美国专利第5,266,313号涉及浣熊痘病毒作为底物用于插入和表达异源生物体的核苷酸编码序列的用途。所述专利描述通过浣熊痘病毒DNA与用于通过胸苷激酶(tk)插入灭活来产生牛痘病毒重组体的嵌合质粒之间的同源重组，产生两种用于表达狂犬病病毒表面刺突糖蛋白(G)的传染性浣熊痘病毒重组体。
作为本发明的背景材料，还关注与启动子的普通用途相关的先前专利，所述启动子即积极调控基因转录的那些序列，诸如供外来基因蛋白编码序列使用的启动子，所述序列包含由重组载体插入和表达的外来基因或外源基因物质。举例来说，美国专利第6,998,252号涉及诸如牛痘的重组痘病毒，其包含编码对痘病毒而言为外来的多肽的第一DNA序列和痘病毒转录调控序列，其中转录调控序列邻近于DNA序列并对DNA序列发挥转录控制作用，并且所述区段位于重组痘病毒的非必需基因组区域内。显示含有来自牛痘病毒的7.5K多肽基因(7.5K基因)的启动子、用于插入外来蛋白编码序列的限制性内切酶位点和作为侧接DNA的中断牛痘病毒胸苷激酶(tk)基因的质粒的构建。
美国专利第7,045,313号类似地涉及使用牛痘病毒或其它痘病毒作为表达外来基因的载体的方法和组合物，其中所述表达是通过将牛痘病毒转录调控序列与未中断外来蛋白编码序列活体外组合以形成嵌合基因而获得。所述专利显示如何使嵌合基因由来自牛痘病毒基因组的非必需区域的DNA侧接，以提供用于活体内同源重组的位点。这些步骤在专利揭示案中通过构建含有紧接于牛痘转录调控序列的用于插入外来蛋白编码序列的多个限制性内切酶位点的质粒得以促进。所述专利进一步显示质粒，包含包括编码对牛痘病毒而言为外来的多肽的第一DNA序列和牛痘病毒启动子序列的区段，其中所述启动子序列邻近于所述第一DNA序列并对所述第一DNA序列发挥转录控制作用；和侧接所述区段的来自牛痘基因组非必需区域的DNA。具体而言，启动子序列为在牛痘病毒中调控胸苷激酶(tk)基因或编码7.5K多肽的牛痘基因的序列。专利中说明将DNA引入细胞中的转染程序，其中同源重组使得嵌合基因插入牛痘病毒基因组的非必需区域中。
还与所属领域中已知的标准启动子相关，美国专利第7,208,313号涉及用阴性胸苷激酶(tk)表型和阴性牛痘病毒生长因子表型产生的牛痘病毒表达载体。将外来基因置于牛痘病毒启动子控制下并整合至突变牛痘病毒的基因组中。或者，表达可通过将含有受牛痘启动子控制的基因的穿梭载体或质粒转染至已用牛痘病毒感染的细胞中并通过同源重组引入外源序列来实现。
合成早期-晚期牛痘病毒启动子说明于美国专利第6,183,750、7,067,248号和其它专利中。美国专利第6,183,750号描述含有来自疱疹病毒的外来DNA和操作性连接至所述DNA以供表达所述DNA的启动子的重组痘病毒，诸如牛痘病毒、禽痘病毒或金丝雀痘病毒，其中将启动子迭置于DNA的起始密码子上或与DNA的起始密码子连接。将启动子-基因连锁在质粒构建体中定位，以便所述连锁在两端由与侧接含有非必需基因座的痘DNA区域的DNA序列同源的DNA侧接。所插入DNA的表达条件是存在与所插入DNA呈适当关系的启动子，即，启动子应经放置以便其位于欲表达的DNA序列的上游。美国专利第7,067,248号另外显示使用合成早期-晚期启动子以从牛痘病毒表达底物蛋白的方式。还参见，钱克拉巴蒂(S.Chakrabarti)等人，“用于蛋白质表达的紧密、合成疫苗病毒早期/晚期启动子(Compact，Synthetic，vaccinia virus early/late promoter for proteinexpression)，”生物技术(BioTechniques)23：1094-1097(1997)。
与本发明背景有关的其它材料可见于以下文献引用中：亚历山大(A.D.Alexander)等人，“切萨皮克湾野生动物中所选人畜共患病的调查(Survey of wild mammals in aChesapeake Bay area for selected zoonoses)，”野生生物疾病杂志(J.Wildlife Dis.)8：119-126(1972)；巴哈洛尔(C.Bahloul)等人，“用于针对狂犬病毒的免疫交叉反应性扩大研究的基于DNA的免疫(DNA-based immunization for exploring the enlargement ofimmunological cross reactivity against the lyssaviruses)，”疫苗(Vaccine)16：417-425(1998)；钱克拉巴蒂等人，“用于蛋白质表达的紧密、合成疫苗病毒早期/晚期启动子，”生物技术23：1094-1097(1997)；德马蒂尼(J.C.DeMartini)等人，“绵羊中的浣熊痘病毒狂犬病病毒糖蛋白重组疫苗(Raccoon poxvirus rabies virus glycoprotein recombinantvaccine in sheep)，”病毒学文献(Arch.Virol.)133：211-222(1993)；迪奇奥德(B.Dietzschold)等人，“弹状病毒(Rhabdoviruses)，”于费氏病毒学(Fields Viology)，菲尔兹(B.N.Fields)等人编，第3版，纽约：雷文出版社(New York：Raven Press)，第1137-1159页(1996)中；艾斯波西多(J.J.Esposito)等人，“表达狂犬病病毒糖蛋白的牛痘病毒重组体防治狂犬病(Vaccinia virus recombinants expressing rabiesvirusglycoprotein protect against rabies)，”病毒基因(Virus Genes)1：7-21(1987)；艾斯波西多等人，“表达狂犬病病毒糖蛋白的浣熊痘病毒重组体的成功口服狂犬病疫苗接种(Successful oral rabies vaccination of raccoon poxvirus recombinants expressing rabies virusglycoprotein)”病毒学(Virology)165：313-316(1988)；艾斯波西多，“野生生物免疫规划中的痘病毒活载体疫苗：狂犬病范例(Live poxvirus-vectored vaccines in wildlifeimmunization programmes：the rabies paradigm)”病毒学研究(Res.Virol.)140：480-482(1989)；艾斯波西多等人，“利用表达狂犬病病毒糖蛋白的浣熊痘病毒的动物口服免疫(Oral Immunization of Animals with Raccoon Poxvirus Expressing Rabies VirusGlycoprotein)，”于疫苗89，勒纳(R.Lerner)，金斯伯格(H.Ginsberg)，查诺克(R.M.Chanock)和布朗( F.Brown)编，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，纽约冷泉港(Cold Spring Harbor，NY)，第403-408页(1989)中；艾斯波西多等人，“用于野生生物的浣熊痘病毒狂犬病-糖蛋白重组口服疫苗：浣熊痘病毒的功效与安全性进一步研究和血清学调查(Raccoon Poxvirus Rabies-Glycoprotein RecombinantOral Vaccine for Wildlife：Further Efficacy and Safety Studies and Serosurvey for RaccoonPoxvirus)，”于疫苗92，布朗，查诺克，金斯伯格和勒纳编，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，第321-329页(1992)中；赫尔曼(Y.F.Herman)，“天然浣熊痘病毒的分离与特性研究(Isolation and characterization of a naturally occurring pox virus of raccoons)，”于细菌学会议论文集，美国微生物协会第64届年会(Bacteriol.Proc.，64th Annual Meetingof the American Society for Microbiology)第117页(1964)中；鲁(L.Hu)等人，“浣熊痘病毒活重组猫泛白细胞减少症病毒VP2和狂犬病病毒糖蛋白二价疫苗(Raccoonpoxvirus live recombinant feline panleukopenia virus VP2 and rabies virus glycoproteinbivalent vaccine)，”疫苗15：1466-1472(1996)；鲁等人，“浣熊痘病毒猫泛白细胞减少症病毒VP2重组体保护猫抵抗FPV攻击(Raccoon poxvirus feline panleukopenia virus VP2recombinant protects cats against FPV challenge)，”病毒学218：248-252(1997)；麦克法兰(R.I.Macfarlan)等人，“狂犬病病毒糖蛋白对细胞毒性T淋巴细胞反应的刺激和免疫优势区的鉴别(Stimulation of cytotoxic T-lymphocyte responses by rabies virusglycoprotein and identification of an immunodominant domain)，”分子免疫学(Mol.Immunol.)23：733-741(1986)；奥苏利奥(J.E.Osorio)等人，“重组浣熊痘疫苗保护小鼠抵抗致死蚀斑(Recombinant raccoon pox vaccine protests mice against lethalplaque)，”疫苗21：1232-1238(2003)；佩林(P.Perrin)等人，“狂犬病免疫体(亚单位疫苗)结构和免疫原性.暴露前后保护研究(Rabies immunosome(subunit vaccine)structure and immunogenicity.Pre-and post-exposure protection studies)，”疫苗3：325-332(1985)；斯帕兹(S.J.Spatz)等人，“猫疱疹病毒1型糖蛋白B的免疫特性研究和其推导氨基酸序列的分析(Immunological characterization of the feline herpesvirus-1glycoprotein B and analysis of its deduced amino acid sequence)，”病毒学197：125-136(1993)；斯帕兹等人，“表达糖蛋白G、D、I和E的猫疱疹病毒1型(FHV-1)基因的鉴别：FHV-1糖蛋白D在牛痘和浣熊痘病毒中的表达(Identification of the felineherpesvirus type 1(FHV-1)genes encoding glycoproteins G，D，I and E：expression of FHV-1glycoprotein D in vaccinia and raccoon poxviruses)，”普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)75：1235-1244(1994)；泰勒(J.Taylor)等人，“对金丝雀痘-狂犬病重组病毒的功效研究(Efficacy studies on a canarypox-rabies recombinant virus)，”疫苗9：190-192(1991)；托马斯(E.K.Thomas)等人，“浣熊痘病毒的进一步特性研究(Further characterization ofraccoonpox virus)，”病毒学文献49：217-227(1975)；耶尔弗顿(E.Yelverton)等人，“狂犬病病毒糖蛋白类似物：大肠杆菌中的生物合成(Rabies virus glycoprotein analogs：Biosynthesis in Escherichia coli)，”科学(Science)219：614-620(1983)。
与常规灭活狂犬病疫苗相比，安全有效的无佐剂浣熊痘病毒载体狂犬病疫苗的成功开发将在以下方面产生重要优点：避免猫中佐剂相关的肉瘤副作用，确保疫苗制备期间的雇员安全性并且完全消除狂犬病病毒幸免于商业生产中所用灭活与消毒程序的任何机会。仍存在对用于家庭宠物的安全有效的狂犬病病毒疫苗的业内公认的需要，所述疫苗充分保护宠物免受狂犬病病毒感染并进而保护其所有人免受致命感染。还需要预防哺乳动物狂犬病并改善有害神经作用的可行方法。
前述目标通过提供安全有效的重组狂犬病疫苗来完成，所述重组狂犬病疫苗以如本文中所述的狂犬病疫苗的新型浣熊痘病毒载体构建体形式在犬和猫中产生持久免疫性。
本说明书中引用的所有专利和公开案在此以全文引用的方式并入本文中。
发明内容
在最广泛方面，本发明提供包含两种或两种以上各编码至少一种狂犬病病毒糖蛋白的外源核酸分子的新型、高度免疫原性重组浣熊痘病毒载体(rRCNV)，其中所述核酸分子中的至少两种插入血球凝集素(ha)基因座或胸苷激酶(tk)基因座中，或所述核酸分子中的至少一种插入血球凝集素和胸苷激酶基因座的每一个中，所述抗原可能来自至少两种不同的狂犬病病毒株。当将两种外源核酸插入同一基因座中时，其可邻接或由介入序列隔开。所述新颖重组浣熊痘病毒载体疫苗可在痘病毒基因组的血球凝集素(ha)基因座或胸苷激酶(tk)基因座处或在痘病毒基因组的胸苷激酶(tk)和血球凝集素(ha)基因座二者处，表达外源或外来狂犬病病毒糖蛋白基因。有利地，本发明的新型且高度优选的重组病毒构建体表达分别在tk和ha基因座处的攻击病毒标准(CVS)和巴斯德-巴黎(PV)病毒株的狂犬病糖蛋白(G2)。虽然编码狂犬病病毒糖蛋白的核酸分子的来源可能来自狂犬病病毒的同一病毒株，但优选地，将至少两种不同狂犬病病毒株的基因插入痘病毒基因组的胸苷激酶(tk)和血球凝集素(ha)基因座中。本发明的广谱重组浣熊痘病毒载体适用作无佐剂疫苗。所述重组疫苗可能合意地含有用于有效免疫动物的其它猫和犬抗原的混合物。还揭示在哺乳动物中诱发针对狂犬病的免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与有效免疫量的本发明的疫苗。
因此，本发明的第一方面提供包含两种或两种以上各编码至少一种狂犬病病毒糖蛋白的外源核酸分子的重组浣熊痘病毒载体(rRCNV)，其中所述核酸分子中的至少两种插入血球凝集素(ha)基因座或胸苷激酶(tk)基因座中，或所述核酸分子中的至少一种插入血球凝集素和胸苷激酶基因座的每一个中。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体构建体进一步包含编码狂犬病糖蛋白的核酸分子，所述核酸分子是插入除浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶和血球凝集素基因座外的浣熊痘病毒基因组的第三个非必需位点中。
在一实施例中，浣熊痘病毒基因组的第三个非必需位点是丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。
在一实施例中，两种编码狂犬病病毒糖蛋白的核酸分子是从狂犬病病毒的同一病毒株分离的。
在一实施例中，两种编码狂犬病病毒糖蛋白的核酸分子是从狂犬病病毒的不同病毒株分离的。
在一实施例中，狂犬病病毒糖蛋白的来源选自由以下组成的群组：攻击病毒标准狂犬病病毒株、巴斯德-巴黎狂犬病病毒株、犬狂犬病街病毒(canine rabies street virus)、北极狐狂犬病病毒(Arctic Fox rabies virus)、浣熊狂犬病病毒(raccoon rabies virus)和蝙蝠狂犬病病毒(bat rabies virus)。
在一实施例中，编码糖蛋白的插入浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座中的核酸分子是来自攻击病毒标准狂犬病病毒株。
在一实施例中，编码糖蛋白的插入浣熊痘病毒基因组的血球凝集素基因座中的核酸分子是来自巴斯德-巴黎狂犬病病毒株。
在一实施例中，浣熊痘病毒是活的并且可复制。
在一实施例中，重组浣熊痘病毒载体进一步包含编码狂犬病病毒糖蛋白的核酸分子，所述核酸分子是插入除浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶和血球凝集素基因座外的浣熊痘病毒基因组的第三个非必需位点中。
在一实施例中，浣熊痘病毒基因组的第三个非必需位点是丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。
本发明的第二方面提供一种重组狂犬病疫苗，其包含免疫有效量的如本文中所述重组浣熊痘病毒载体中的任一种和任选的适合载剂或稀释剂。
在一实施例中，重组狂犬病疫苗包含免疫有效量的如本文中所述重组浣熊痘病毒载体中的两种或两种以上和任选的适合载剂或稀释剂。
在一实施例中，多价疫苗仅含有一种载体构建体。
在一实施例中，本发明提供包含一种或多种核酸分子的重组狂犬病疫苗，其中各核酸分子编码一种狂犬病抗原，其中：
a)至少一种核酸分子插入浣熊痘病毒基因组的血球凝集素基因座或胸苷激酶基因座中；或
b)至少两种核酸分子插入浣熊痘病毒基因组的血球凝集素基因座或胸苷激酶基因座中；或
c)至少一种核酸分子插入浣熊痘病毒基因组的血球凝集素基因座中并且至少一种核酸分子插入胸苷激酶基因座中。
在一实施例中，重组狂犬病疫苗进一步包含具有一种或多种选自由以下组成的群组的猫抗原的混合物：猫杯状病毒(feline calicivirus)、猫披衣菌(Chlamydophila felis)、猫白血病病毒(feline leukemia virus)、猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopeniavirus)、猫鼻气管炎病毒(feline rhinotracheitis virus)、猫免疫缺陷病毒(felineimmunodeficiency virus)、猫传染性腹膜炎病毒(infectious peritonitis)和巴尔通体细菌(Bartonella bacteria)。
在一实施例中，重组狂犬病疫苗进一步包含具有一种或多种选自由以下组成的群组的犬抗原的混合物：犬埃立克体(Ehrlichia canis)、犬细小病毒(canine parvovirus)、犬瘟热(canine distemper)、犬副流感病毒(canine parainfluenza virus)、II型犬腺病毒(canine adenovirus type II)、犬腺病毒(canine adenovirus)、犬冠状病毒(caninecoronavirus)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohemorrhagiae)、犬钩端螺旋体(Leptospira canicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa)和波蒙纳钩端螺旋体(Leptospira Pomona)。
在一实施例中，重组狂犬病疫苗为无佐剂疫苗。
在一实施例中，重组狂犬病疫苗进一步包含佐剂。
在一实施例中，佐剂包含乙烯/马来酸共聚物和丙烯酸共聚物乳液的混合物。
本发明的第三方面提供在哺乳动物中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应的方法，其包含向哺乳动物投与有效免疫量的如本文中所述的任何疫苗。
在一实施例中，本发明提供在猫中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应，是通过向猫投与有效免疫量的如本文中所述但合意地不含任何佐剂的疫苗。
在一实施例中，本发明提供在犬中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应，是通过向犬投与有效免疫量的如本文中所述的任何疫苗。
在一实施例中，本发明提供在牛或马中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应，是通过向牛或马投与有效免疫量的如本文中所述的任何疫苗。
在一实施例中，保护性免疫反应是体液或抗体介导的反应。
在一实施例中，保护性免疫反应是细胞介导或T细胞介导的免疫反应。
在一实施例中，保护性免疫反应通过投与在约4.5Log10TCID50/ml至约6.7Log10TCID50/ml范围内的疫苗剂量来诱发。
在一实施例中，保护性免疫反应通过投与在约5.38Log10TCID50/ml至约6.28Log10TCID50/ml范围内的疫苗剂量来诱发。
在一实施例中，保护性反应通过投与呈单次剂量或重复剂量形式的疫苗来诱发。
本发明的第四方面提供制造重组浣熊痘病毒载体的方法，其包含以下步骤：
(a)将编码第一狂犬病病毒株的糖蛋白的核酸序列插入浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座中；
(b)将编码第二狂犬病病毒株的糖蛋白的核酸序列插入浣熊痘病毒基因组的血球凝集素基因座中；和
(c)回收重组浣熊痘病毒载体。
在一实施例中，步骤(a)和(b)的核酸序列进一步包含操作性连接至核酸序列以允许通过重组浣熊痘病毒载体来表达核酸并产生第一和第二狂犬病病毒株的糖蛋白的启动子序列。
在一实施例中，第一狂犬病病毒株为攻击病毒标准狂犬病病毒株。
在一实施例中，第二狂犬病病毒株为巴斯德-巴黎狂犬病病毒株。
本发明的第五方面提供具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的质粒pFD2003-GPV-PV。
第六方面提供本发明的任何载体或疫苗用于制备在哺乳动物中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应的药物的用途。
附图说明
图1A-1K(其对应于SEQ ID NO：1)显示质粒pFD2003SEL-GPV-PV(8373个核苷酸)的完整序列，其中RCNV HA-L片段包含碱基对位置1-557，PSEL(合成早期-晚期)启动子区域经过碱基对位置2153-2195C，狂犬病巴斯德-巴黎G基因涵盖碱基对位置570-2150C，vv P7.5早期启动子区域跨越碱基对位置2202-2468，lacZ ORF报告基因覆盖碱基对位置2469-5525，RCNV HA-R片段涵盖碱基对位置5532-6123，并且氨苄西林(ampicillin)ORF包括碱基对位置6566-7426。
图2说明质粒pFD2003SEL-GPV-PV的限制酶图，其显示将质粒切割1次与3次之间的主要限制酶，即BamHI(碱基对位置2471、5526)，EcoRI(位置558、5469)，EcoRV(位置265、324、3578)，HindIII(位置2055)，HpaI(位置2891、3515、5895)，KpnI(位置2147)，MluI(位置3767、4547、4972)，NcoI(位置80、2147)，NsiI(位置1812)，PciI(位置24、5224、8241)，SacI(位置4405、8372)，SalI(位置564)，SpeI(位置5583)，SphI(位置1423、6128)，XbaI(位置2196)和XhoI(位置1633)；和不切割质粒pFD2003-GPV-PV的主要限制酶，即，BglII、KasI、NheI、NotI、NruI、PmeI、PstI、SacII、SmaI和XmaI。
图3显示在构建rRCNV-狂犬病G2中的关键步骤的图。将KpnI-SalI狂犬病GPV-PV片段从狂犬病DNA疫苗pVAX1-GPV-PV(如WO 00/63242中所制备)亚克隆至质粒pFD2003SEL中以产生质粒pFD2003SEL-GPV-PV。使用vKB3-JE13、pFD2003SEL-GPV-PV和COS-7细胞的三路共感染/转染产生rRCNV-狂犬病G2的池克隆。下一步涉及Vero细胞中的蚀斑纯化和纯克隆的选择。候选克隆物通过PCR一致性测试和rRCNV-狂犬病G2所来源的IFA对狂犬病G蛋白的活体外表达来确认。
图4说明rRCNV-狂犬病G2基因组(约200kb线性dsDNA)的图，其中巴斯德-巴黎狂犬病G2 lacZ构建在ha基因座处并且CVS狂犬病G构建在重组浣熊痘病毒基因型的tk基因座处。
图5A-5B显示ha基因座(图5A)和tk基因座(图5B)的rRCNV-狂犬病-G2 MSV和X+5的PCR一致性测试的琼脂糖凝胶电泳。包括对照的样品的DNA模板使用泳道2中的rRCNV-狂犬病G2、MSV；泳道3中的rRCNV-狂犬病G2、X+5；泳道4中的DNA纯化阴性对照-01；泳道5中的DNA纯化阴性对照-02；泳道6中的PCR阴性对照(水)；泳道7中的PCR阳性对照(RCNV Esposito-3稀释液)；泳道8中的rRCNV-狂犬病G2、MSV；泳道9中的rRCNV-狂犬病G2、X+5；泳道10中的DNA纯化阴性对照-01；泳道11中的DNA纯化阴性对照-02；泳道12中的PCR阴性对照(水)；和泳道13中的PCR阳性对照(RCNV Esposito-3稀释液)。λ/Hind III标记在泳道1中并且1kb DNA梯形标记在泳道14中。对于泳道2-7，凝胶A(图5A)的引物为HA-08、HA-Pst；凝胶B(图5B)的引物为TK-LW、TK-RW；并且靶基因为wt ha/tk。对于泳道8-13，凝胶A(图5A)的引物为HA-Pst、gp-1F；凝胶B(图5B)的引物为TK-RR、gJE-F1；并且靶基因为狂犬病G。如图5中所示，PCR在泳道2-6和10-13中呈阴性，而PCR在泳道7-9中呈阳性。
图6A-6C揭示狂犬病糖蛋白在rRCNV-狂犬病G2感染的Vero细胞中的活体外表达。在rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5感染的Vero细胞的所有稀释液中观察到细胞病变效应和荧光(图6A和6B)，但在仅由未感染Vero细胞组成的阴性对照中并未观察到(图6C)。此结果表明，在rRCNV-狂犬病G2 MSV和第5代中，狂犬病G蛋白得到表达并由狂犬病G蛋白特异性单克隆抗体检测到。
图7显示含有全长狂犬病G基因的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳。包括对照的所测试样品包含泳道2中的rRCNV-狂犬病G2 MSV；泳道3中的rRCNV-狂犬病G2 X+5；泳道4中的阴性对照(水)；泳道5中的rRCNV-狂犬病G2 MSV；泳道6中的rRCNV-狂犬病G2 X+5；和泳道7中的阴性对照(水)；以及泳道1中的λ/HindIII标记和泳道8中的1kb DNA梯形标记。对于泳道2-4，引物为HA-Pst、PW4；并且基因靶为1806-bp巴斯德-巴黎狂犬病G和其侧接区域。对于泳道5-7， 引物为TK-RR、PW-03；并且基因靶为1910-bp CVS狂犬病G和其侧接区域。如图7中所示，PCR在对照泳道4和7中呈阴性，而PCR产物在泳道2、3、5和6中呈阳性。
图8A-8B说明通过rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5于Vero细胞中的蓝色蚀斑(Lac+)纯化进行的筛选，其中图8A表示rRCNV-狂犬病G2 MSV(未稀释，100)而图8B表示rRCNV-狂犬病G2 X+5(10-4稀释度)。结果表明，通过蓝色蚀斑试验，rRCNV-狂犬病G2 MSV在达到第5代的生产前放大程序以下在表型上是稳定的。
具体实施方式
本发明的背景和其与所属领域的不同将在下文参考附图进一步描述。
在描述当前方法和治疗方法之前，应了解本发明不限于所述特定方法和实验条件，因而方法和条件可变化。还应了解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并且不欲具有限制性，因为本发明的范围将仅在随附权利要求书中限制。
如本说明书和随附权利要求书中所使用，单数形式“一”和“所述”除非上下文另外明确规定，否则包括复数个参考物。因此，举例来说，提及“所述方法”包括一种或多种方法，和/或具有本文中所述和/或在阅读本揭示案后所属领域的技术人员将清楚了解的类型的步骤，等等。
因此，在本申请案中，可使用所属领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。所述技术在文献中已充分说明。参见(例如)伯德(Byrd，CM)和赫鲁比(Hruby，DE)，分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)，第269卷：牛痘病毒和痘病毒学(Vaccinia Virus and Poxvirology)，第3章，第31-40页；萨姆布鲁克(Sambrook)，弗里奇(Fritsch)和玛尼蒂斯(Maniatis)，分子克隆：实验手册(MolecularCloning：A Laboratory Manual)，第二版(1989)冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(在本文中“萨姆布鲁克等人，1989”)；DNA克隆：实用方法(DNA Cloning：A PracticalApproach)，第I和II卷(格洛弗(D.N.Glover)编1985)；寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)(盖特(M.J.Gait)编1984)；核酸分子杂交(Nucleic Acid Hybridization)[黑姆斯(B.D.Hames)和希金斯(S.J.Higgins)编(1985)]；转录与翻译(Transcription AndTranslation)[黑姆斯和希金斯编(1984)]；动物细胞培养(Animal Cell Culture)[弗雷什尼(R.I.Freshney)编(1986)]；固定化细胞与酶(Immobilized Cells And Enzymes)[IRL出版社(IRL Press)，(1986)]；泊贝尔(B.Perbal)，分子克隆的实用指南(A PracticalGuide To Molecular Cloning)(1984)；奥苏伯尔(F.M.Ausubel)等人(编)，分子生物学实验室指南(Current Protocols in Molecular Biology)，约翰威立出版公司(John Wiley& Sons，Inc.)(1994)。
尽管在实施或测试本发明时可使用与本文中所述的方法和材料类似或等效的方法和材料，但现描述优选方法和材料。本文中提及的所有公开案以全文引用的方式并入本文。
定义
本文中所用的术语具有所属领域的技术人员公认和已知的含义，然而，为方便和完整性起见，下文陈述特定术语和其含义。
术语“约”意指20％以内，更优选10％以内并且更优选5％以内。
术语“佐剂”是指增强针对抗原的免疫反应的化合物或混合物。佐剂可用作缓慢释放抗原的组织储库并且还可用作非特异增强免疫反应的淋巴系统活化剂(胡德(Hood)等人，免疫学(Immunology)，第二版，1984，(本杰明/康明思：加利福尼亚州门罗帕克(Benjamin/Cummings：Menlo Park，California))，第384页)。视情况而定，在不存在佐剂的情况下仅以抗原进行的初次攻击可能无法引发体液或细胞免疫反应。佐剂包括(但不限于)弗氏完全佐剂(complete Freund′s adjuvant)、弗氏不完全佐剂、皂素、矿物凝胶(诸如氢氧化铝)、表面活性物质(诸如溶血卵磷脂)、复合多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子(polyanion)、肽、油或烃乳液、钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)、二硝基酚和潜在适用的人类佐剂(诸如BCG(卡介苗(bacille Calmette-Guerin))和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum))。优选地，佐剂为医药学上可接受的。术语“无佐剂”是指如上所述在不存在佐剂的情况下，制备本发明的任一种疫苗。
“由......编码”或“编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中多肽序列含有具有至少3至5个氨基酸，更优选至少8至10个氨基酸，并且甚至更优选至少15至20个氨基酸的氨基酸序列，由所述核酸序列编码的多肽。还涵盖可用由所述序列编码的多肽以免疫学方法鉴别的多肽序列。因此，抗原“多肽”、“蛋白质”或“氨基酸”序列可与抗原的多肽或氨基酸序列具有至少70％的相似性，优选至少约80％的相似性，更优选约90-95％的相似性，并且最优选约99％的相似性。
术语“外源”是指在浣熊痘病毒基因组以外产生、起源、获得或发展的外来基因或由所述外来基因编码的蛋白质。
针对抗原或疫苗组合物的“免疫反应”为受试者中针对所关注抗原或疫苗组合物中所存在分子的体液和/或细胞介导免疫反应的发展。出于本发明的目的，“体液免疫反应”是抗体介导的免疫反应并且涉及对本发明的抗原/疫苗具有亲和力的抗体的产生，而“细胞介导的免疫反应”是由T淋巴细胞和/或其它白细胞介导的反应。“细胞介导的免疫反应”通过提呈与主要组织相容性复合体(MHC)的I类或II类分子缔合的抗原表位而引发。这将活化抗原特异CD4+T辅助细胞或CD8+细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)。CTL对以与由主要组织相容性复合体(MHC)编码的蛋白质缔合的形式提呈并表达在细胞表面上的肽抗原具有特异性。CTL帮助诱发并促进细胞内微生物的细胞内破坏，或受所述微生物感染的细胞的溶解。细胞免疫性的另一方面涉及辅助T细胞的抗原特异性反应。辅助T细胞帮助刺激非特异效应细胞针对在表面上以与MHC分子缔合形式呈现肽抗原的细胞的功能并集中非特异效应细胞针对在表面上以与MHC分子缔合形式展示肽抗原的细胞的活性。“细胞介导的免疫反应”还指产生细胞因子、趋化因子和由已活化T细胞和/或其它白细胞产生的其它此类分子，包括来源于CD4+和CD8+T细胞的那些分子。特定抗原或组合物刺激细胞介导的免疫反应的能力可通过许多试验来测定，诸如淋巴增殖(淋巴细胞活化)试验、CTL细胞毒性细胞试验、在敏化受试者中测试对抗原特异的T淋巴细胞、或测量T细胞回应抗原再刺激的细胞因子产生。所述试验在所属领域中是熟知的。参见(例如)埃里克森(Erickson)等人，免疫学杂志(J.Immunol.)(1993)151：4189-4199；多伊(Doe)等人，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)(1994)24：2369-2376。
“免疫有效量”或“有效免疫量”在本文中可互换使用，是指如由所属领域技术人员已知的标准试验所测量，足以引发免疫反应，即细胞(T细胞)或体液(B细胞或抗体)反应的抗原或疫苗的量。在本发明中，“免疫有效量”或“有效免疫量”是最小保护剂量(效价)：4.5至6.7Log10TCID50/mL。抗原作为免疫原的有效性(effectiveness)可通过增殖试验，通过细胞溶解试验，诸如测量T细胞溶解其特异靶细胞的能力的铬释放试验，或通过测量B细胞活性水平，通过测量对抗原特异的循环抗体在血清中的含量来测量。此外，免疫反应的保护水平可通过用已注射的抗原攻击经免疫宿主来测量。举例来说，若需要针对其的免疫反应的抗原是病毒或肿瘤细胞，则由“免疫有效量”抗原诱发的保护水平通过检测在以病毒或肿瘤细胞攻击动物后的存活百分比或死亡百分比来测量。
如本文中所定义，浣熊痘病毒基因组中的“非必需位点”意指病毒基因组中不是病毒感染或复制所必需的区域。浣熊痘病毒基因组中非必需位点的实例包括(但不限于)胸苷激酶(TK)位点、血球凝集素(HA)位点和丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。浣熊痘病毒的TK位点描述于卢策-华莱士(C.Lutze-Wallace)，西杜(M.Sidhu)和卡普勒(A.Kappeler)，病毒基因(Virus Genes)10(1995)，第81-84页中。浣熊痘病毒的TK基因的序列还可见于PubMed寄存编号DQ066544和U08228。浣熊痘病毒的HA位点描述于卡瓦拉罗(Cavallaro KF)和艾斯波西多(Esposito，JJ)，病毒学(Virology)(1992)，190(1)：434-9中。浣熊痘病毒的HA基因的序列还可见于PubMed寄存编号AF375116。
术语“核酸分子”或“核酸序列”具有其普通含义，是指具有诸如嘌呤和嘧啶碱基等重复单元的重复核苷酸的长链，其指导蛋白质合成的过程，即，其编码并表达蛋白质物质。当在权利要求书中使用本术语时，核酸是指编码狂犬病病毒糖蛋白的已知外源或外来基因。
当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，编码序列“操作性连接至”细胞中的转录和翻译控制序列，所述mRNA随后经反式-RNA剪接并翻译成由所述编码序列编码的蛋白质。
“保护性”免疫反应是指疫苗引发体液或细胞介导的免疫反应的能力，所述免疫反应用以保护哺乳动物免受感染。所提供的保护不必绝对，即，若与哺乳动物的对照群体比较存在统计学上显著的改善，则不必完全防止或根除感染。保护可能限于减轻感染症状发作的严重程度或发展速度。
如本文中所使用的术语“重组体”仅指通过标准遗传工程方法产生的浣熊痘病毒构建体。
术语“可复制”是指微生物，尤其诸如浣熊痘病毒等病毒，其能够在适合宿主细胞中复制(replicating/duplicating/reproducing)。
术语“疫苗”或“疫苗组合物”在本文中可互换使用并且是指医药组合物，其包含至少一种在动物中诱发免疫反应和/或保护动物免受感染所致的疾病或可能的死亡的免疫活性组分，并且可包括或可不包括一种或多种增强所述活性组分的免疫活性的其它组分。疫苗可另外包含对医药组合物而言典型的其它组分。
“载体”为能够在宿主生物体中复制的DNA分子，在所述DNA分子中插入基因以构建重组DNA分子。
概述
根据本发明，提供在制造稳定、安全、高度有效并且任选地不含佐剂的产品中使用浣熊痘病毒(RCNV)病毒株的独特重组狂犬病疫苗。具体而言，本发明提供包含两种或两种以上各编码至少一种狂犬病病毒糖蛋白的外源核酸分子的重组浣熊痘病毒载体(rRCNV)，其中所述核酸分子中的至少两种插入血球凝集素(ha)基因座或胸苷激酶(tk)基因座中，或所述核酸分子中的至少一种插入血球凝集素和胸苷激酶基因座的每一个中。尽管希望从至少两种不同狂犬病病毒株获得外来基因，但外源核酸分子的来源可相同或不同。有利地，本发明的新型并且高度优选的病毒构建体rRCNV-狂犬病G2独特地表达两种不同狂犬病病毒株的狂犬病糖蛋白(G)，其中将攻击病毒标准(CVS)和巴斯德-巴黎(PV)狂犬病病毒株的抗原糖蛋白分别插入RCNV基因组的胸苷激酶(tk)和血球凝集素(ha)基因座中非常合意。狂犬病糖蛋白在rRCNV-狂犬病G2感染的Vero细胞中的活体外表达通过使用狂犬病糖蛋白特异性单克隆抗体的间接免疫荧光试验(IFA)来确认。本发明的rRCNV-狂犬病G2构建体具有高免疫原性并且非常有效。在免疫期(DOI)研究中将猫和犬接种，接着以有毒力(virulent)狂犬病病毒攻击证明，新型重组狂犬病疫苗具有优良效能(potency)并且适用于保护哺乳动物抵抗狂犬病感染。
浣熊痘病毒(Herman病毒株)首先由赫尔曼(Y.F.Herman)于1961-1962年在马里兰州阿伯丁(Aberdeen，Maryland)从没有临床症状的浣熊的呼吸道分离得到(赫尔曼，”天然浣熊痘病毒的分离与特性研究(Isolation and characterization of a naturallyoccurring pox virus of raccoons)，”于细菌学会议论文集，美国微生物协会第64届年会(Bacteriol.Proc.，64th Annual Meeting of the American Society for Microbiology)，第117页(1964)中)。若干早期研究报导，当向野生动物和包括猫的家养动物投与时，表达在tk基因座处的CVS狂犬病G基因的RCNV载体是安全的(参见(例如)亚历山大(A.D.Alexander)等人，“切萨皮克湾野生动物中所选人畜共患病的调查(Survey of wildmammals in a Chesapeake Bay area for selected zoonoses)，”野生生物疾病杂志(J.WildlifeDis.)8：119-126(1972)；巴哈洛尔(C.Bahloul)等人，“用于针对狂犬病毒的免疫交叉反应性扩大研究的基于DNA的免疫(DNA-based immunization for exploring theenlargement of immunological cross reactivity against the lyssaviruses)，”疫苗(Vaccine)16：417-425(1998)；钱克拉巴蒂(S.Chakrabarti)等人，“用于蛋白质表达的紧密、合成疫苗病毒早期/晚期启动子(Compact，Synthetic，vaccinia virus early/late promoter forprotein expression)，”生物技术(BioTechniques)23：1094-1097(1997)；和德马蒂尼(J.C.DeMartini)等人，“绵羊中的浣熊痘病毒狂犬病病毒糖蛋白重组疫苗(Raccoon poxvirusrabies virus glycoprotein recombinant vaccine in sheep)，”病毒学文献(Arch.Virol.)133：211-222(1993))。
然而，早期构建体无一提供本发明的独特设计，其中将一种狂犬病G基因插入浣熊痘病毒基因组的ha位点中或其中将至少两种狂犬病G基因插入tk和ha基因座二者中。没有构建体或动物研究展示本发明的新颖构建体。
称为vKB3-JE13的先前重组狂犬病构建体(RCNV Rab-G，从英国埃塞克斯郡哈洛市的梅里亚公司(Merial，Harlow，Essex，UK)以RABORAL
Figure G2008800176957D00181
形式购得)使用RCNV载体的Herman病毒株，但构建体仅具有狂犬病CVS病毒株的G基因在RCNV基因组的tk基因座处的单一插入。尽管本发明的rRCNV-狂犬病G2构建体也利用RCNV载体的Herman病毒株，但是此新颖构建体具有插入两个基因座中的来自两种不同狂犬病病毒株的外来基因，即，将包含狂犬病CVS和PV病毒株的G基因的外来基因物质插入RCNV基因组中并且插入位点是特异性的，以在RCNV基因组的tk基因座处提供来自CVS基因的DNA和在ha基因座处提供来自PV基因的DNA。在本发明的新型rRCNV-狂犬病G2构建体中，将狂犬病G基因插入RCNV基因组的tk和ha基因座二者的组合中使得无毒力(avirulent)Herman病毒株进一步减毒，但同时提供有效广谱疫苗。
与vKB3-JE13类似，本发明的rRCNV-狂犬病G2最初使用vv P 11晚期启动子来制备，以将CVS基因插入tk基因座中，而随后进一步使用合成早期-晚期启动子以驱动并将另一PV基因插入ha基因座中。rRCNV-狂犬病G2在能够从tk和ha基因座表达外来狂犬病抗原方面的稳定性和适用性是迄今未知的新型多价构建体的重要性质。
就作为更佳构建体来说，本发明的显著改进rRCNV-狂犬病G2构建体也提供超过先前构建体vKB3-JE13的未预见到的并且显著的优点。惊人地，rRCNV-狂犬病G2具有更佳的载体操作安全性、大体更佳的最小保护剂量(即，显著更有效)和涵盖攻击病毒标准(CVS)和巴斯德-巴黎(PV)狂犬病病毒株的更宽保护范围。
举例来说，rRCNV-狂犬病G2和vKB3-JE13(RCNV Rab-G)在美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)标准小鼠效能测试中在相当效价下的性能揭示，与vKB3-JE13(6.4Logs10TCID50/mL)低得多的相对效能(RP)值0.3相比，rRCNV-狂犬病G2(6.3Logs10TCID50/mL)具有6.8的优越RP值。本发明rRCNV-狂犬病G2构建体的效能意外地是vKB3-JE13构建体的23倍。
虽然仅带有来自CVS的狂犬病糖蛋白基因的已知重组RCNV(vKB3-JE13)的确在经单次剂量皮下疫苗接种的猫中证明功效，但vKB3-JE13要求8.3Log10TCID50/mL高效价的RCNV Rab-G以在一年免疫期研究(DOI)中达成抵抗狂犬病的充分保护，所述一年免疫期研究显示96.2％(25/26)的给予高浓度Rab-G的猫得到保护，而93.8％(15/16)的对照由于狂犬病攻击而死亡。然而，下游加工研究表明，生产这种高效价病毒对于工业化而言是不可行的。由于安全性和载体问题，vKB3-JE13达不到在猫中的实际使用。
另外，功效数据证明，这种先前vKB3-JE13构建体在对犬的一年DOI研究中未能满足法定要求(标题9，美国联邦法规(Code of Federal Regulations))。仅79.2％(19/24)的经单次剂量的8.3Log10TCID50/mL的RCNV Rab-G皮下疫苗接种的犬在一年免疫期研究(DOI)中得到保护抵抗狂犬病，而100％(13/13)的对照由于狂犬病攻击而死亡。
比较而言，本发明的新型rRCNV-狂犬病G2构建体的一年DOI在比vKB3-JE13所需低得多的浓度下，在猫中提供极佳结果。在6.28Log10TCID50/mL(每剂)的效价下，攻击结果显示，虽然9/10(90％)的对照由于狂犬病而死亡，但有利地，25/25(100％)的疫苗接种者保持健康持续90天，这是令人满意的测试，满足狂犬病疫苗功效的法定要求。一年DOI研究的结果证明，本发明的重组狂犬病疫苗在猫中在单次疫苗接种后，在预防狂犬病中高度有效持续至少一年。
关于在犬中的一年DOI研究，本发明的新型rRCNV-狂犬病G2构建体在犬中提供极佳并且成功的结果，而所属领域中的RCNV Rab-G未能给予充分保护。在6.28Log10TCID50/mL(每剂)的效价下，攻击结果显示，虽然9/10(90％)的对照由于狂犬病而死亡，但22/25(88％)的疫苗接种者保持健康持续90天，这满足狂犬病疫苗功效的法定要求。此一年DOI研究的结果证明，本发明的重组狂犬病疫苗在犬中在单次疫苗接种后，作为辅助有效预防狂犬病至少一年。
除所属领域中已知的先前重组vKB3-JE13构建体的缺点外，其它常规灭活狂犬病疫苗还在兽医学领域中具有其技术问题，这些问题在本发明中得到解决。灭活狂犬病疫苗常常需要佐剂补充物来获得有效免疫反应，但不幸地，佐剂常常造成在猫中形成肉瘤并且在猫和犬中具有其它安全性问题。本发明独特地解决业内公认的问题并且提供重组浣熊痘病毒(rRCNV)载体狂犬病疫苗作为更安全的产品，其在不存在佐剂的情况下在单次疫苗接种后维持极佳的免疫反应。
有利地，本发明的无佐剂rRCNV载体狂犬病疫苗还改善疫苗生产期间的雇员安全性并且完全消除狂犬病病毒幸免于商业生产期间使用的灭活与消毒程序的任何机会。rRCNV-狂犬病G2通过将巴斯德-巴黎狂犬病G基因插入在RCNV基因组tk基因座中含有所插入CVS G基因的RCNV载体的ha基因座中而进一步减毒。换句话说，虽然减毒狂犬病病毒被视为具有中度潜在健康危害的2级生物安全病原体，但认为rRCNV-狂犬病G2作为低风险1级生物安全病原体将是十分安全的。
新颖狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(即本发明的rRCNV-狂犬病G2构建体)通常作为预防狂犬病感染的辅助，用于年龄为3个月或更大的健康猫和犬的疫苗接种。诸如雪貂等其它家养宠物也将在足以获得充分免疫反应的成熟年龄受益于针对狂犬病的接种。若需要疫苗作为感染后治疗，则可在暴露于狂犬病病毒的较幼小的猫、犬和其它哺乳动物中使用所述疫苗。
在用高水平的活RCNV接种猫后，未证明病毒排毒(shedding)，从而确认RCNV在猫中不具有复制性和致病性。将猫选作测试动物是因为猫比犬对RCNV易感。RCNV的自然感染途径主要经由口腔粘膜、皮肤擦伤和呼吸道。扁桃体是这些病毒进行复制的优选位置。因此对于下文中用来说明本发明的实例而言，在一些研究中选择最普通的感染途径-经口途径来投与重组病毒。然而，预期本发明的疫苗可通过多种常规途径投与。
NIH(美国国立卫生研究院)小鼠效能测试证明，rRCNV-狂犬病G2构建体具有高免疫原性并且非常有效。当猫和犬经免疫有效剂量的rRCNV-狂犬病G2皮下疫苗接种时，剂量滴定研究显示抵抗狂犬病攻击的完全保护(疫苗接种后3个月)。本发明的狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体在猫和犬中的3个月免疫期(DOI)研究、一年DOI研究和在猫中的毒力回复研究，均显示极佳结果。十分有利地，经口投与浣熊痘病毒载体疫苗不回复毒力或传播至体液或粪便中，并且在猫和犬中皮下投与rRCNV-狂犬病G2 X+3的浓储备液后，未观察到不利反应。
为证明短期功效并确定用于较长免疫期研究的适当剂量，用三种不同效价的rRCNV-狂犬病G2疫苗对猫和犬进行疫苗接种，接着在单次疫苗接种后3个月以有毒力狂犬病病毒攻击。在猫中，100％(10/10)经单次剂量的6.5、5.5和4.5Log10TCID50/mL的rRCNV-狂犬病G2皮下疫苗接种的猫得到有利保护，而80％(8/10)的对照由于狂犬病攻击而死亡。在犬中，100％(10/10)、90％(9/10)和70％(7/10)分别经单次剂量的6.5、5.5和4.5Log10TCID50/mL的rRCNV-狂犬病G2皮下疫苗接种的犬得到保护，而100％(10/10)的对照由于狂犬病攻击而死亡。后一在犬中的结果说明用于在兽医学疫苗领域中获得新型疫苗产品适当剂量的标准滴定研究，其证明4.5Log10TCID50/mL的效价是不足以保护犬免受狂犬病的浓度，但疫苗在6.5Log10TCID50/mL和5.5Log10TCID50/mL的可行效价下，在犬中显示功效。
如上文所述和下文实例中所例证，向猫和犬单次投与本发明的重组rRCNV-狂犬病G2疫苗后，一年免疫期(DOI)研究的结果也显示疫苗的极佳效能和有用性。重组狂犬病疫苗在单次接种后惊人并且有利地产生显著长久的免疫性。
一般而言，病毒rRCNV-狂犬病G2可通过将狂犬病糖蛋白基因(例如狂犬病巴斯德-巴黎糖蛋白基因(G))插入vKB3-JE13基因组的血球凝集作用(ha)基因座中来构建。已知病毒vKB3-JE13表达在野生型浣熊痘病毒的胸苷激酶(tk)基因座处的攻击病毒标准(CVS)病毒株的狂犬病糖蛋白。在一个实施例中，rRCNV-狂犬病G2的构建过程经由两个主要步骤提供。首先，将PCR扩增的1,575bp狂犬病巴斯德-巴黎G基因(GPV-PV)克隆至所构建的本发明pFD2003SEL载体中，以产生质粒pFD2003SEL-GPV-PV。此步骤包括将FDAH狂犬病DNA疫苗构建体pVAX1-GPV-PV(如WO 00/63242中所制备)的KpnI-SalI狂犬病GPV-PV片段亚克隆至质粒pFD2003SEL中，从而产生pFD2003SEL-GPV-PV。其次，在COS-7细胞中进行vKB3-JE13和质粒pFD2003SEL-GPV-PV的三路共感染/转染，通过在ha基因座处的等位交换(allelicexchange)产生rRCNV-狂犬病G2。通过在Vero细胞中4轮连续蚀斑纯化克隆蓝色蚀斑(Lac+)。候选克隆物(clone candidate)在Vero细胞中使用补充有0.05％乳白蛋白水解物(LAH)、30μg/mL硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)和5％胎牛血清的最小必需培养基(Minimum Essential Medium，MEM)进一步扩增三次，并通过基因特异性PCR和间接免疫荧光试验(IFA)来确认。使用第7代制备预备主种子(pre-master seed)。主种子(Master Seed)可通过1∶10,000稀释预备主种子来建立，并命名rRCNV-狂犬病G2，其中浣熊痘病毒作为活载体表达分别在ha和tk基因座处的巴斯德-巴黎和CVS病毒株的狂犬病糖蛋白。此主种子可用于进一步制造狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体。rRCNV-狂犬病G2构建体在预防动物狂犬病中作为疫苗高度有效并且安全。
预期本发明中所述的新颖方法可由所属领域的一般技术人员用于从其它狂犬病病毒株获得的抗原糖蛋白，其中使用除所说明的CVS和PV病毒株外的病毒株的狂犬病糖蛋白，并将其插入浣熊痘病毒载体的tk和/或ha基因座中，或在tk和ha基因座二者的状况下，可将另一糖蛋白基因插入另外第三个非必需区域中，诸如插入丝氨酸蛋白酶抑制剂基因等中，以提供用于保护抵抗狂犬病感染的免疫原性疫苗。举例来说，编码诸如犬狂犬病街病毒、北极狐病毒、浣熊狂犬病病毒或蝙蝠狂犬病病毒株等其它狂犬病病毒株的抗原糖蛋白的核苷酸或核酸分子可轻易取代CVS和/或PV病毒株，或除CVS和/或PV病毒株外进一步使用。或者，可分离新型野外分离株(field isolate)或狂犬病突变体的糖蛋白基因并将其用于本发明的重组疫苗中替代CVS和/或PV基因。还预期可将编码第三狂犬病病毒株的另一抗原糖蛋白的基因插入浣熊痘病毒基因组的第三个非必需位点中。例如，tk和ha基因座以外的其它非必需基因包括不是痘病毒的生长和繁殖所必需的那些区域。
虽然实例说明CVS病毒株的糖蛋白基因插入tk基因座中和PV病毒株的糖蛋白基因插入ha基因座中，但另外涵盖反过来的基因插入，即将CVS的G基因插入ha基因座中并将PV的G基因插入tk基因座中，或涵盖将相同狂犬病病毒株的相同糖蛋白基因插入tk和ha位点二者中来构建强有效的重组疫苗，以获得针对致病性狂犬病病毒的增强免疫反应。似乎也可能需要构建编码狂犬病病毒糖蛋白的核酸仅插入浣熊痘病毒基因组的ha位点中的重组疫苗。
可使用所属领域的技术人员已知的任何方法来制备本发明的基因构建体。举例来说，可使用标准方法，利用特定限制位点来将任何所要核酸序列插入浣熊痘病毒载体中。或者，如本文中所述，当需要插入大的序列或需要插入多种基因时，可利用同源重组技术。在此方法中，侧接欲插入多种基因的插入位点的质粒序列含有与浣熊痘病毒基因组中所存在的序列具有足够同源性的序列以介导重组。侧接序列须与对浣熊痘病毒的生长和繁殖而言并非必需的浣熊痘病毒区域同源，所述区域诸如血球凝集素基因座或胸苷激酶基因座或丝氨酸蛋白酶抑制剂基因座。尽管可使用一个启动子来驱动欲重组的两种外源基因的表达，但在插入载体中使用两个启动子(各启动子操作性连接至个别基因)也将提供有效表达。
本发明还提供通过向需要保护的哺乳动物投与有效的新型重组疫苗来保护哺乳动物抵抗狂犬病或在受狂犬病病毒感染后治疗动物的新方法。
在本发明的方法中，将免疫有效量的本发明疫苗投与需要保护抵抗狂犬病感染或治疗狂犬病感染的哺乳动物，尤其猫和犬，以诱发针对狂犬病的保护性免疫反应。还涵盖疫苗用于使牛和马免疫以抵抗狂犬病的用途。给予哺乳动物的有效免疫量是获得针对疫苗的足够免疫反应以保护哺乳动物免受狂犬病病毒的致命神经作用的量。当疫苗满足或超过USDA批准的狂犬病疫苗的法定准则时，视为获得针对狂犬病的保护性免疫反应。通过常规测试，诸如通过标准剂量滴定研究，可容易地测定或易于滴定得到接种动物并引发满意疫苗接种效应的免疫有效剂量或有效免疫量。
疫苗可以单次剂量或以重复剂量来投与，尤其作为感染后治疗。合意地，疫苗以单次接种投与至健康动物以提供抵抗狂犬病的长期保护，从而保护动物免受狂犬病持续至少一年至三年或更长。当投与至猫和犬时，剂量可在(例如)约5.4至约6.7Log10TCID50/mL(最小保护性剂量)的范围内，但一些较小猫可受益于约4.5Log10TCID50/mL和更高的剂量。雪貂可接受与猫和犬中所用相似的剂量。
因为在一些国家，在马和牛中存在狂犬病问题，所以将对大型动物给予适合疫苗接种剂量，其表示为每剂(1-2mL)的效价而非通常以体重计。效价可经由兽医学领域的一般技术人员所已知的常规滴定研究来确定。预期本发明的rRCNV-狂犬病G2还可在诸如狐狸、臭鼬、猫鼬、浣熊、蝙蝠等野生动物中用作控制狂犬病传播的手段。
疫苗可含有免疫有效量的本文中所述的任一种重组浣熊痘病毒载体构建体。在另一实施例中，疫苗可含有免疫有效量的本文中所述的任两种或两种以上重组浣熊痘病毒载体构建体。在一实施例中，多价疫苗仅含有一种载体构建体。
疫苗可易于通过任何投药途径，经口、鼻内、经皮(即涂覆在皮肤表面上或皮肤表面处以供全身性吸收)、非经肠等给予，尽管一些途径根据动物和操纵者而在后勤方面更加困难。非经肠投药途径包括(但不限于)皮下、肌肉内、静脉内、腹膜内、皮内(即注射或以其它方式置于皮肤底下)等途径。优选地，将疫苗皮下投与至健康猫、犬和其它家养宠物。
尽管对本发明的疫苗而言，为获得最佳和有效免疫功效，使用活浣熊痘病毒非常合意，但痘病毒载体可能是活的或者通过制备灭活病毒疫苗的常规程序进行灭活，例如使用二乙烯亚胺(binary ethyleneimine，BEI)、福尔马林(formalin)等，其中BEI为优选灭活剂。活浣熊痘病毒也是可复制病毒，意指其可在适合培养物中复制以制造其自身的复制体而用于从主种子病毒进行疫苗开发。有利地，表达狂犬病攻击病毒标准(CVS)和巴斯德-巴黎病毒株的狂犬病糖蛋白(G2)的活重组RCNV适用作疫苗，单独使用或与适合载剂、稀释剂和佐剂组合使用。适合载剂为无毒和医药学上可接受的以投与至所有哺乳动物。不过，预期用于接种猫的产品不含佐剂。疫苗产品可呈液体形式，或呈冻干(lyophilized)粉末形式以在使用前不久用标准、无毒稀释剂来复水。冻干粉末具有的优点为，当在2-7℃下冻干和储存时，其在长期储存下维持其效能而无效价损失。
当作为液体投与时，本发明疫苗可制备为水溶液、糖浆、酏剂、酊剂等常规形式。这类调配物在所属领域中是已知的并且通常通过将抗原和其它添加剂溶解或分散于用于投药的适当载剂或溶剂系统中来制备。适合的无毒、生理学上可接受的载剂或溶剂包括(但不限于)水、盐水、乙二醇、甘油等。疫苗还可经冻干或以其它方式冷冻干燥(freeze-dried)并随后在使用前不久使用适合稀释剂无菌复水或再水合。适合稀释剂包括(但不限于)盐水、伊格尔氏最小必需培养基(Eagle′s minimum essential media)等。典型添加剂或辅助调配剂(co-formulant)为(例如)合格染料、香料、甜味剂和一种或多种抗微生物防腐剂，诸如硫柳汞(乙基汞硫代水杨酸钠)、新霉素(neomycin)、多粘菌素B(polymyxin B)、两性霉素B(amphotericin B)等。所述溶液可(例如)通过添加部分水解明胶、山梨糖醇或细胞培养基来加以稳定，并且可通过常规方法，使用所属领域中已知的试剂，诸如磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、其混合物等来进行缓冲。
液体调配物还可包括悬浮液和乳液，其含有与其它标准辅助调配剂组合的悬浮或乳化剂。这些类型的液体调配物可通过常规方法制备。例如，悬浮液可使用胶体磨来制备。例如，乳液可使用均质机来制备。
为注射至体液系统中所设计的非经肠调配物要求适当等渗和pH缓冲达到猫体液的相应水平。必要时可用氯化钠和其它盐来适当调整等渗性。在疫苗接种时，将病毒解冻(若经冷冻)或用诸如去离子水、盐水、磷酸盐缓冲盐水等生理学上可接受的载剂来复水(若经冻干)。可使用诸如丙二醇等适合溶剂来增加各成分于调配物中的溶解度和液体制剂的稳定性。
对不具有来自免疫增强佐剂系统的不良效应的犬和其它动物的接种而言，疫苗产品可任选地含有多种典型、无毒、医药学上可接受的添加剂、稀释剂和佐剂，其包括(但不限于)防腐剂；稳定剂；乳化剂；氢氧化铝；磷酸铝；pH值调节剂，诸如氢氧化钠、盐酸等；表面活性剂，诸如吐温
Figure G2008800176957D00241
(聚山梨醇酯80，购自西格玛化学公司(Sigma Chemical Co.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis，MO)；脂质体；免疫刺激复合物(iscom)佐剂；合成糖肽，诸如胞壁酰二肽(muramyl dipeptide)；增量剂，诸如葡聚糖或葡聚糖与(例如)磷酸铝的组合、硫酸葡聚糖、DEAE-葡聚糖等；羧聚乙烯(carboxypolymethylene)，诸如卡波姆
Figure G2008800176957D00242
(聚丙烯酸聚合物，购自古德里奇公司(B.F.Goodrich Company)，俄亥俄州克利夫兰(Cleveland，Ohio))；乙烯马来酸酐或乙烯/马来酸酐共聚物(
Figure G2008800176957D00243
具有大致相等量的乙烯和马来酸酐的线性乙烯/马来酸酐共聚物，估算平均分子量约75,000至100,000，购自密苏里州圣路易斯的孟山都公司(Monsanto Co.))；丙烯酸共聚物乳液，诸如苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸的混合物的共聚物，如
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(例如，美国专利第5,047,238号，与苯乙烯混合的丙烯酸和甲基丙烯酸的未聚结水性丙烯酸共聚物，购自聚乙烯化学品公司(PolyvinylChemicals，Inc.)，马萨诸塞州威尔明顿(Wilmington，MA))；细菌细胞壁，诸如分枝杆菌(mycobacterial)细胞壁提取物；棒状杆菌来源的佐剂，诸如短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)；丙酸杆菌来源的佐剂(Propionibacterium-derived adjuvant)，诸如痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne)；牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(卡介苗或BCG)；亚病毒颗粒佐剂，诸如环状病毒(orbivirus)；霍乱毒素；N，N-二(十八烷基)-N′，N′-双(2-羟基乙基)-丙二胺(阿夫立定(avridine))；单磷酰脂质A；二甲基二(十八烷基)溴化铵(DDA，购自柯达公司(Kodak)，纽约州罗彻斯特(Rochester，NY))；其合成物和混合物。可用于本发明疫苗中的其它添加剂包括(但不限于)葡萄糖、常规抗氧化剂和常规螯合剂，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)。可任选地补充疫苗调配物的其它医药学上可接受的佐剂包括(但不限于)聚阴离子、聚阳离子、肽、矿物油乳液、免疫调节剂、多种组合等。适合佐剂的其它非限制性实例包括角鲨烷和角鲨烯(或动物来源的其它油)；聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物，诸如普流尼克(L121，例如购自巴斯夫公司(BASF Aktiengesellschaft)，德国路德维希港(Ludwigshafen，Germany))；皂素；Quil A(皂草苷(Quillaja saponaria)纯化形式的商业名称，购自瑞典的Iscotec AB，和丹麦维比克(Vedbaek)的Superfos Biosector a/s)；矿物油，诸如
Figure G2008800176957D00252
(液体饱和烃类的纯化混合物，购自埃克森美孚公司(Exxon-Mobil)，弗吉尼亚州费尔法克斯(Fairfax，VA))；植物油，诸如花生油；白细胞介素，诸如白细胞介素-2和白细胞介素-12；干扰素，诸如γ干扰素；动物痘病毒蛋白质或其混合物。适合稳定剂的实例包括(但不限于)蔗糖、明胶、蛋白胨、消化蛋白提取物，诸如NZ-胺或NZ-胺AS。乳化剂的实例包括(但不限于)矿物油、植物油、花生油和适用于可注射疫苗或鼻内疫苗的其它标准、可代谢、无毒油。合意地，将氢氧化铝与诸如皂素或Quil A等其它佐剂混合形成诸如皂素-氢氧化铝或Quil A-氢氧化铝等组合。优选佐剂包含乙烯/马来酸酐共聚物、苯乙烯与丙烯酸和甲基丙烯酸的混合物的共聚物、矿物油乳液或其组合。
显著增强本发明的rRCNV-狂犬病G2构建体用于犬的效能的尤其优选佐剂系统包含乙烯/马来酸共聚物(诸如
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(具有大致相等量的乙烯和马来酸酐的直链乙烯/马来酸酐共聚物，其估算平均分子量约75,000至100,000，购自密苏里州圣路易斯的孟山都公司))与丙烯酸共聚物乳液(诸如(与苯乙烯混合的丙烯酸和甲基丙烯酸的未聚结水性丙烯酸共聚物(丙烯酸-苯乙烯乳液)，购自马萨诸塞州威尔明顿的聚乙烯化学品公司))的组合。研究证明，效价为6.4Log10TCID50/mL(每剂)的rRCNV-狂犬病G2构建体在包含
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和
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的组合佐剂系统存在下高度有效。攻击结果显示，10/10(100％)对照犬死亡或显现狂犬病征象，表明研究为有效攻击测试(validchallenge test)。相反，在3个接种组中，9/10(90％)、10/10(100％)和10/10(100％)的疫苗接种者在研究期间保持健康。
在犬的状况下，本发明的重组狂犬病疫苗还可任选地含有具有一种或多种其它犬抗原的混合物，所述犬抗原诸如犬埃立克体、犬细小病毒(CPV)、犬瘟热、犬副流感病毒(CPI)、II型犬腺病毒(CAV-2)、犬腺病毒(CDV)、犬冠状病毒(CCV)、出血性黄疸钩端螺旋体(LI)、犬钩端螺旋体(LC)、感冒伤寒型钩端螺旋体(LG)、波蒙纳钩端螺旋体(LP)等。抗原的尤其优选组合涵盖犬细小病毒、犬瘟热、犬腺病毒和犬副流感的分离株，具有或不具有冠状病毒和钩端螺旋体(包括新出现的血清型(serovar)，感冒伤寒型钩端螺旋体和波蒙纳钩端螺旋体)。
在猫的状况下，本发明的重组狂犬病疫苗还可任选地含有具有一种或多种其它猫抗原的混合物，所述猫抗原诸如猫杯状病毒(FCV)、猫披衣菌(C.felis，先前通常又称为鹦鹉披衣菌(Chlamydia psittaci)(FCP))、猫白血病病毒(FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫鼻气管炎病毒(FVR)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、巴尔通体细菌(例如典型猫抓病)等。
当在本文中使用术语时，采用所属领域一般技术人员所已知的常规含义。举例来说，术语“核酸分子”或“核酸序列”具有其普通含义，是指具有诸如嘌呤和嘧啶碱基等重复单元的重复核苷酸的长链，其指导蛋白质合成的过程，即，其编码并表达蛋白质物质。当在权利要求书中使用术语时，核酸是指编码狂犬病病毒糖蛋白的已知外源或外来基因。如本文中所使用的术语“重组体”仅指通过标准遗传工程方法产生的浣熊痘病毒构建体。
实例
以下实例证明本发明的某些方面。然而，应了解这些实例仅用于说明并且不欲完全界定本发明的条件和范围。应了解，当已给出典型反应条件(例如温度、反应时间等)时，还可使用高于和低于指定范围的条件，尽管通常其不太适宜。实例在室温下(约23℃至约28℃)和大气压力下进行。除非另外规定，否则本文中提及的所有份数和百分比均以重量计，并且所有温度以摄氏度表示。
对本发明的进一步理解可从下文的实例获得。这些工作实例欲说明本发明而不限制其范围。
实例1：rRCNV-狂犬病G2的构建
简单地说，病毒rRCNV-狂犬病G2可通过将狂犬病巴斯德-巴黎糖蛋白基因(G)插入vKB3-JE13基因组的血球凝集作用(ha)基因座中来构建。完整构建体包含分别插入RCNV胸苷激酶(tk)和血球凝集作用(ha)基因座中的CVS和巴斯德-巴黎病毒株的狂犬病糖蛋白基因，使野生型浣熊痘病毒无毒力Herman病毒株进一步减毒。
从艾斯波西多(Joseph J.Esposito)博士(疾病控制与预防中心(Centers for DiseaseControl and Prevention，CDC)，佐治亚州亚特兰大(Atlanta，GA))获得的病毒vKB3-JE13表达在浣熊痘病毒的胸苷激酶(tk)基因座处的攻击病毒标准(CVS)病毒株的狂犬病糖蛋白(另参见美国专利第7,087,234；6,241,989；5,348,741和5,266,313号以获得其它信息)。巴斯德-巴黎G基因从可根据WO 00/63242的方法产生的狂犬病DNA疫苗获得。rRCNV-狂犬病G2的构建过程经由两个主要步骤来提供。首先，将经PCR扩增的来自FDAH狂犬病DNA疫苗构建体pVAX1-GPV-PV的1,575bp狂犬病巴斯德-巴黎G基因(GPV-PV)克隆至质粒pFD2003SEL载体中，以产生质粒pFD2003SEL-GPV-PV。其次，在COS-7细胞中进行vKB3-JE13和质粒pFD2003SEL-GPV-PV的三路共感染/转染，以通过在ha基因座处的等位交换产生rRCNV-狂犬病G2。通过在Vero细胞中进行4轮连续蚀斑纯化来克隆蓝色蚀斑(Lac+)。在Vero细胞中使用补充有0.05％乳白蛋白水解物(LAH)、30μg/mL硫酸庆大霉素和5％胎牛血清的最小必需培养基(MEM)进一步将候选克隆物再扩增三次，并且其后通过基因特异性PCR和间接免疫荧光试验(IFA)来确认。使用第7代制备预备主种子。主种子可通过以1∶10,000稀释预备主种子来建立，并命名为rRCNV-狂犬病G2，其中浣熊痘病毒作为活载体能够独特地表达分别在ha和tk基因座处的巴斯德-巴黎和CVS病毒株的狂犬病糖蛋白。狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体的主种子病毒(rRCNV-狂犬病G2)通过RCNV ha、tk和狂犬病G基因特异性PCR测试加以鉴别。狂犬病糖蛋白的表达通过IFA使用来自纽约州西布雷的精细化工科技公司(Accurate Chemical & Scientific Corporation，Westbury，NY)的狂犬病G蛋白特异性单克隆抗体来确认。用于检测细菌、真菌和支原体污染的纯度测试加上猫和犬中的安全性测试根据APHIS标准方案来进行。所有纯度和安全性测试报告结果均令人满意。
更详细地，按照以下方案制备重组生物体rRCNV-狂犬病G2：
关于受体特性研究，如上文所指出和描述，亲本生物体为浣熊痘病毒(RCNV)的Herman病毒株，其首先由赫尔曼(Y.F.Herman)于1961-1962年在马里兰州阿伯丁(Aberdeen，Maryland)从没有临床症状的浣熊的呼吸道分离得到。RCNV是痘病毒科的成员，其含有在各末端具有发夹环的线性且接近200kb的双链DNA基因组。如同其它痘病毒(牛痘病毒、禽痘病毒和金丝雀痘病毒)一般，RCNV也在细胞质中复制，使用其自身的转录系统，并且已用作活载体来表达用于疫苗开发的外来基因。然而，RCNV的先前已知的使用限于仅在浣熊痘病毒基因组的tk基因座处插入仅一种狂犬病病毒株的糖蛋白G。
就遗传标记而言，RCNV野生型含有tk基因，命名为TK+表型。将狂犬病CVS G基因插入先前病毒vKB3-JE13构建体中会破坏tk基因的开放阅读框并提供RCNV TK-。类似地，RCNV野生型含有ha基因，命名HA+表型。狂犬病巴斯德-巴黎G基因通过本发明方法的插入破坏ha基因的开放阅读框并提供RCNV HA-。
关于供体特性研究，供体生物体描述如下：狂犬病病毒，一种负链RNA病毒，是弹状病毒科狂犬病毒属的成员。狂犬病病毒可感染所有温血动物。此病毒的感染可导致致命神经疾病。5种结构蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(M1)、基质蛋白(M2)、跨膜糖蛋白(G)和RNA依赖性RNA聚合酶(L)，由12-kb病毒基因组编码。已知病毒抗原G蛋白可诱发病毒中和抗体和针对致死狂犬病病毒攻击的保护。
为获得供体基因，使用逆转录酶(RT)-PCR从狂犬病CVS和巴斯德-巴黎病毒株扩增狂犬病G-cDNA。CVS和巴斯德-巴黎狂犬病G基因的大小为1575-bp。质粒pFD2003-GPV-PV的完整核苷酸序列和限制酶图显示于图1和图2中。进一步的DNA序列分析表明，狂犬病CVS G基因与狂犬病巴斯德-巴黎G基因享有89％一致性，并且这两种狂犬病G基因分别以相反定向插入rRCNV-狂犬病G2基因组的tk和ha基因座中。
为构建重组生物体，通过将狂犬病巴斯德-巴黎糖蛋白基因(G)插入vKB3-JE13基因组的血球凝集作用(ha)基因座中构建病毒rRCNV-狂犬病G2。rRCNV-狂犬病G2的构建过程涉及两个主要步骤。首先，将使用从质粒pGPV-PV(参见WO 00/63242中制备的狂犬病DNA疫苗和pGPV-PV)构建的质粒pVAX1-GPV-PV作为模板通过PCR所扩增的含有1,575bp狂犬病巴斯德-巴黎G cDNA(GPV-PV)的KpnI-SalI片段插入pFD2003SEL载体中，以产生质粒pFD2003SEL-GPV-PV。在此构建体中，GPV-PV的表达受到合成早期-晚期启动子(PSEL)调控，并且大肠杆菌(E.coli)β-半乳糖苷酶作为报告基因的表达处于呈相反定向的牛痘病毒7.5kDa启动子(P7.5)的转录控制下。整个表达盒由RCNV ha序列侧接。其次，在COS-7细胞中进行vKB3-JE13和质粒pFD2003SEL-GPV-PV的三路共感染/转染，以通过在ha基因座处的等位交换产生rRCNV-狂犬病G2。通过在Vero细胞中5轮连续蚀斑纯化克隆蓝色蚀斑(Lac+)。使用基因(ha或tk)特异性PCR来确认不存在混合群体，并使用间接免疫荧光试验(IFA)来测定狂犬病糖蛋白的表达。关于对构建rRCNV-狂犬病G2中关键步骤的说明，参见图3，并且关于rRCNV-狂犬病G2基因组的图，参见图4。
作为中间克隆载体，质粒pFD2003SEL-GPV-PV如本文中所述来构建。质粒pFD2003SEL-GPV-PV的完整序列和限制酶图分别显示于图1和2中。
为将遗传修饰引入至受体中，通过同源重组将狂犬病CVS和巴斯德-巴黎的G基因分别插入RCNV基因组的tk和ha基因座中。使用利用牛痘病毒的前述程序(参见艾斯波西多(J.J.Esposito)等人，“表达狂犬病病毒糖蛋白的牛痘病毒重组体防治狂犬病(Vaccinia virus recombinants expressing rabiesvirus glycoprotein protect against rabies)，”病毒基因(Virus Genes)1：7-21(1987))来完成将本发明的新型遗传修饰引入至浣熊痘病毒中的所述过程。
用于鉴别和纯化重组生物体的筛选方法和方案如下执行：通过标准病毒蚀斑纯化技术来纯化重组病毒。通过在CV-1细胞内同源重组产生vKB3-JE13。在诱变化合物5-溴脱氧尿苷(BUdR)存在下选择TK-病毒，并通过包括DNA杂交、PCR和狂犬病糖蛋白蛋白质表达的免疫筛选在内的多种方法进一步筛选重组体。通过蓝色蚀斑(Lac+)纯化、基因(ha或tk)特异性PCR和IFA来筛选rRCNV-狂犬病G2。
实例2：rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的PCR一致性测试
为鉴别RCNV野生型中的ha和tk基因以及插入在rRCNV-狂犬病G2基因组的ha和tk基因座二者中的狂犬病糖蛋白(G)基因，并且为证明无混合群体存在于rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5中，使用以下材料和方法执行全面PCR测试。
材料
1.病毒：
a)rRCNV-狂犬病G2 MSV
b)rRCNV-狂犬病G2 X+5
c)RCNV野生型Esposito
2.QIAGEN DNeasy组织试剂盒(购自Qiagen公司，美国加利福尼亚州瓦伦西亚(Valencia，CA，USA))
3.基因特异性引物：
a)使用引物HA-08和HA-Pst扩增用于一致性测试的RCNV野生型的563-bp ha基因片段。
i)HA-08：5′-GAA ACA ATG CCA AAT ATC TCT-3′(其对应于SEQ ID NO：2)
ii)HA-Pst：5′-TCA TTG ACA TCT GGA GAT GCA GGT ACT-3′(其对应于SEQ IDNO：3)
b)使用引物HA-Pst和gp-1F扩增用于一致性测试的rRCNV-狂犬病G2基因组的ha基因座处的狂犬病巴斯德-巴黎的1303-bp G基因片段。
i)HA-Pst：参见上述序列
ii)gp-1F：5′-ACA CTA ACT TCG TTG GTT-5′(其对应于SEQ ID NO：4)
c)使用引物TK-LW和TK-RW扩增用于一致性测试的RCNV野生型的503-bp tk基因片段。
i)TK-LW：5′-AAC GTA ATG GAT ATA TTA AAG TCT-3′(其对应于SEQ ID NO：5)
ii)TK-RW：5′-GAA AAC GAC GCC TCT TTA AAG-3′(其对应于SEQ ID NO：6)
d)使用引物TK-RR和gJE-F1扩增用于一致性测试的rRCNV-狂犬病G2基因组的tk基因座处的狂犬病CVS的1637-bp G基因片段。
i)TK-RR：5′-GAA AAG GAA GCC TCC TTA AAG-3′(其对应于SEQ ID NO：7)
ii)gJE-F1：5′-TCT CCT ACA TGG AAC TCA-3′(其对应于SEQ ID NO：8)
4.应用生物系统阿普泰克金DNA聚合酶(Applied Biosystems AmpliTaq Gold DNAPolymerase)(购自应用生物系统公司(Applied Biosystems)，加利福尼亚州福斯特市(Foster City，CA))
5.安玛西亚制药生物科技公司dNTP(Amersham-Pharmacia-Biotech Inc.dNTP)(购自安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences)，新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))
6.应用生物系统基因扩增PCR系统9700(Applied Biosystems GeneAmp PCRSystem 9700)(购自加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司)
方法
A.DNA制备
使用QIAGEN DNeasy组织试剂盒(购自美国加利福尼亚州瓦伦西亚的Qiagen公司)，如由Qiagen提供的说明手册中所述来执行rRCNV基因组DNA制备。
B.PCR测试
在此全面PCR测试中，使用引物HA-08和HA-Pst筛选RCNV野生型；使用引物HA-Pst和gp-1F筛选ha基因座处的rRCNV-狂犬病G2；使用引物TK-LW和TK-RW筛选RCNV野生型；并且使用引物TK-RR和gJE-F1筛选tk基因座处的rRCNV-狂犬病G2。
1.对于各PCR反应，制备以下反应混合物：
5μL    10×PCR缓冲液
3μL    25mM MgCl2
5μL    2mM dNTP
5μL    各引物(10μM)
5μL    DNA模板
0.5μL  5单位/微升ABI AmpliTaq金
21.5μL ddH2O
2.在95℃下，在热循环仪中将样品培育10min以使DNA模板完全变性。
3.将靶模板扩增35个循环：
步骤             温度              时间
变性             94℃              1.0min
退火             59℃              1.0min
延伸             72℃              2.0min
4.将样品在72℃下再保持5min。
5.将样品在4℃下无限保持。
C.琼脂糖凝胶电泳
1.将10μL的各PCR产物与2μL的加样缓冲液组合。
2.使样品在1％琼脂糖凝胶上跑胶，使用普洛麦格(Promega)λDNA/Hind III和普洛麦格1kb DNA梯形作为标记(两种产品购自普洛麦格公司(Promega Corporation)，威斯康辛州麦迪森(Madison，WI))。
结果
使用基因特异性引物的关于rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的PCR一致性测试的结果显示于图5中。当使用引物HA-08和HA-Pst来检测RCNV ha基因(图5A，凝胶A)，并使用引物TK-LW和TK-RW来检测RCNV tk基因(图5B，凝胶B)时，在MSV和X+5中未观察到色带(泳道2-6)。相反，在RCNV野生型Esposito中观察到ha基因座的563-bp色带和tk基因座的503-bp色带(泳道7)。这些结果表明，RCNV野生型未混合于rRCNV-狂犬病G2中。当使用引物HA-Pst和gp-1F来检测狂犬病巴斯德-巴黎G基因是否插入rRCNV-狂犬病G2基因组的ha基因座中，并使用引物TK-RR和gJE-F1来检测狂犬病CVS G基因是否插入rRCNV-狂犬病G2基因组的tk基因座中时，分别在MSV和X+5中观察到ha基因座的1303-bp色带和tk基因座的1637-bp色带(泳道8-9)。相反，在RCNV野生型Esposito中未观察到色带(泳道13)。结果表明，狂犬病巴斯德-巴黎和CVS G基因分别插入rRCNV-狂犬病G2基因组的ha和tk基因座中。这些结果概括于下表1中：
表1.PCR一致性测试的结果
Figure G2008800176957D00311
Figure G2008800176957D00321
注释：NA，不适用；*-，PCR阴性；**+，PCR阳性；RCNV Esposito-3稀释液用作阳性对照。
结论
从此PCR一致性测试的结果推断，狂犬病巴斯德-巴黎和CVS G基因实际上存在于rRCNV-狂犬病G2基因组的ha和tk基因座中，并且RCNV野生型未混合于rRCNV-狂犬病G2MSV和X+5中。此PCR测试还可用于：1)RCNV野生型和rRCNV-狂犬病G2基因组的ha和tk基因座中的狂犬病巴斯德-巴黎和CVS G基因的一致性测试；和2)克隆筛选以在重组病毒构建的蚀斑纯化期间区分rRCNV-狂犬病G2与RCNV野生型。
实例3：狂犬病糖蛋白于rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5中的活体外表达
为测定狂犬病糖蛋白于rRCNV-狂犬病G2 MSV和第5代感染的Vero细胞中的表达，执行间接免疫荧光试验(IFA)。
材料
病毒：                rRCNV-狂犬病G2 MSV
                      rRCNV-狂犬病G2 X+5
Vero细胞：            P18-Vero-12
培养基：              补充有0.05％LAH & Gent的1×MEM
初级抗体：            抗狂犬病IgG2 mAb(购自纽约州西布雷的精细化工科技公司)
次级抗体：            荧光素接合山羊抗小鼠IgG(H+L)0.5mg
稀释剂/洗涤缓冲液：   0.01M PBS
增强溶液：               1mg/mL对苯二胺
                         90％甘油
                         10％0.01M PBS
                         0.5M碳酸盐缓冲液
                         pH 9.0，在-20℃下储存于黑暗中
荧光显微镜：             奥林巴斯(Olympus)BX51
方法
1.培植两个具有于500μL补充有0.05％乳白蛋白水解物(LAH)、30μL/mL庆大霉素和5％胎牛血清(FBS)的1×最小必需培养基(MEM)中的1.0×105个Vero细胞的8孔腔室玻片。
2.在37℃下，在5％CO2腔室中培育过夜。
3.使用具有0.05％LAH & Gent的1×MEM培养基，对样品执行连续10倍稀释，对rRCNV-狂犬病G2 MSV而言从未稀释稀释至10-1，而对rRCNV-狂犬病G2 X+5而言，从10-2稀释至10-4。
4.以双重复将100μL的各稀释液置于腔室玻片的孔中，并保留第四孔作为阴性对照。
5.在37℃下，在5％CO2腔室中培育48小时过夜。
6.观察细胞病变效应，并进一步通过IFA(间接免疫荧光试验)，使用狂犬病G蛋白特异性单克隆抗体(G蛋白特异性MAb)检测狂犬病G蛋白表达的蚀斑。
结果
结果显示于图6A-6C中。在rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5感染的Vero细胞的所有稀释液中观察到细胞病变效应和荧光(参见图6A和6B)，但在仅由未感染的Vero细胞组成的阴性对照中并未观察到(参见图6C)。此结果表明，在rRCNV-狂犬病G2 MSV和第5代中，狂犬病G蛋白得到表达并由狂犬病G蛋白特异性单克隆抗体检测到。
实例4：NIH小鼠效能测试
使用标准NIH小鼠效能测试进行rRCNV-狂犬病G2和vKB3-JE13(RCNV Rab-G)构建体的初始比较研究。结果概括于下表2中：
表2.rRCNV-狂犬病G2和vKB3-JE13的NIH小鼠效能比较结果
  构建体   效价(Logs10TCID50/mL)   RP值
  rRCNV-狂犬病G2   6.3   6.8
  vKB3-JE13   6.4   0.3
vKB3-JE13   8.3   9.1
上述结果表明，本发明的rRCNV-狂犬病G2构建体的效能惊人地是vKB3-JE13构建体的23倍。
下文更详细描述，其后使用相同业内公认技术执行另一研究，以测定与所属领域中已知的先前狂犬病疫苗相比，于不同调配物中的本发明狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体的NIH小鼠效能。
材料
病毒或疫苗：
rRCNV-狂犬病G2、活载体(7.0 Logs10TCID50/mL)
rRCNV-狂犬病G2、活载体(6.5 Logs10TCID50/mL)
vKB3-JE13(CDC旧构建体)(7.2 Logs10TCID50/mL)
梅里亚(Merial)
Figure G2008800176957D00341
猫狂犬病(使用活金丝雀痘载体的单价狂犬病糖蛋白疫苗，购自梅里亚公司(Merial)，英国埃塞克斯郡哈洛市(Harlow，Essex，UK))
rRCNV-狂犬病G2(6.38Logs10TCID50/mL)
灭活rRCNV-狂犬病G2(灭活前效价：6.38Logs10TCID50/mL)
NIH狂犬病参考疫苗：具有佐剂的灭活狂犬病疫苗，金色标准疫苗用作NIH小鼠效能测试中的参考。
方法
NIH小鼠效能测试：
按照标准方法“狂犬病疫苗的NIH小鼠效能测试(NIH Mouse Potency Test of RabiesVaccine)”，用在原始方法中以1∶5、1∶25、1∶125和1∶625稀释或在修正方法中以未稀释、1∶10、1∶100和1∶1000稀释的测试病毒/疫苗执行此测试。简单地说，用两次剂量的0.5mL测试病毒(稀释或未稀释)或NIH狂犬病参考疫苗，以7天间隔(另外指示)对16只小鼠进行腹膜内(IP)疫苗接种。第一次疫苗接种后14天，用以1∶80,000稀释的0.03mL有毒力狂犬病对所有疫苗接种的小鼠进行脑内(IC)攻击(在未经疫苗接种的小鼠中，以5倍稀释度对攻击病毒进行反滴定(各稀释液10只小鼠)，以确保适当攻击剂量)。攻击后每天观察所有小鼠持续14天。
结果
在下表3中，rRCNV-狂犬病G2的相对效能(RP)分别为，在6.5Logs10TCID50/mL下为27.9和在7.0Logs10TCID50/mL下为101.9。在下表4中，6.5Logs10TCID50/mL下的rRCNV-狂犬病G2比梅里亚
Figure G2008800176957D00351
猫狂犬病疫苗(使用活金丝雀痘载体的单价狂犬病疫苗糖蛋白疫苗，购自英国埃塞克斯郡哈洛的梅里亚公司，为实验比较目的而从市场购买)和7.2Logs10TCID50/mL下的vKB3-JE13(CDC旧构建体)有效。在下表5中，结果表明，活rRCNV-狂犬病G2比灭活疫苗产品有效。
结论
NIH小鼠效能测试表明，本发明的rRCNV-狂犬病G2构建体在小鼠模型中高度有效。
表3.rRCNV-狂犬病G2的NIH小鼠效能测试*
*14DPC下存活小鼠的数量    **狂犬病参考：NIH狂犬病参考疫苗
表4.rRCNV-狂犬病G2、vKB3-JE13和梅里亚
Figure G2008800176957D00353
猫狂犬病疫苗的NIH小鼠效能比较*
*14DPC下存活小鼠的数量。
表5.活/灭活rRCNV-狂犬病G2的NIH小鼠效能测试*
Figure G2008800176957D00355
Figure G2008800176957D00361
*14 DPC下存活小鼠的数量。
**6.38Log10TCID50/mL下的活rRCNV-狂犬病G2。
***6.38Log10TCID50/mL的灭活前效价下的灭活rRCNV-狂犬病G2(无佐剂)。
实例5：通过PCR测试进行rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的遗传稳定性测试
本实验研究的目标为通过PCR测试测定rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的遗传稳定性。
材料
1.病毒：
a)rRCNV-狂犬病G2 MSV
b)rRCNV-狂犬病G2 X+5
2.引物：
a)对扩增ha基因座处的1806-bp巴斯德-巴黎狂犬病G基因和其部分侧接区域而言
HA-Pst：5′-TCA TTG ACA TCT GGA GAT GCA GGT ACT-3′(其对应于SEQ IDNO：3)
PW-04：5′-AGA ACA TTA CCC ACA TGA-3′(其对应于SEQ ID NO：9)
b)对扩增tk基因座处的1910-bp攻击病毒标准(CVS)狂犬病G基因和其部分侧接区域而言
TK-RR：5′-GAA AAG GAA GCC TCC TTA AAG-3′(其对应于SEQ ID NO：7)
PW-03：5′-TCT CAC AAT CAC CAC TTT CAT-3′(其对应于SEQ ID NO：10)
3.用于DNA纯化和PCR克隆的试剂盒/试剂
a)QIAGEN DNeasy组织试剂盒(购自Qiagen公司，美国加利福尼亚州瓦伦西亚(Valencia，CA，USA))
b)应用生物系统阿普泰克金DNA聚合酶(Applied Biosystems AmpliTaq Gold DNAPolymerase)(购自应用生物系统公司(Applied Biosystems)，加利福尼亚州福斯特市(Foster City，CA))
c)安玛西亚制药生物科技公司dNTP(Amersham-Pharmacia-Biotech Inc.dNTP)(购自安玛西亚生物科技公司(Amersham Biosciences)，新泽西州皮斯卡塔韦(Piscataway，NJ))
4.应用生物系统基因扩增PCR系统9700(Applied Biosystems GeneAmp PCRSystem 9700)(购自加利福尼亚州福斯特市的应用生物系统公司)
方法
A.DNA制备
使用QIAGEN DNeasy组织试剂盒(购自Qiagen公司，美国加利福尼亚州瓦伦西亚)，如由Qiagen提供的说明手册中所述，执行从rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的基因组DNA制备。
B.PCR测试
在此PCR测试中，使用引物HA-Pst和PW-04扩增ha基因座处的1806-bp巴斯德-巴黎狂犬病G基因和其插入侧接区域，并且使用引物TK-RR和PW-03扩增tk基因座处的1910-bp CVS狂犬病G基因和其插入侧接区域。
1.对于各PCR反应，制备以下反应混合物：
5μL            10×PCR缓冲液
3μL            25mM MgCl2
5μL            2mM dNTPs
5μL            各引物(10μM)
5μL            DNA模板
0.5μL          5单位/微升ABI AmpliTaq金
21.5μL         ddH2O
2.在95℃下，在热循环仪中将样品培育10min以使DNA模板完全变性。
3.将靶模板扩增35个循环：
步骤           温度            时间
变性           94℃            1.0min
退火           59℃            1.0min
延伸           72℃            2.0min
4.将样品在72℃下再保持5min。
5.将样品在4℃下无限保持。
C.琼脂糖凝胶电泳
1.将10μL的各PCR产物与2μL的加样缓冲液组合。
2.使样品在1％琼脂糖凝胶上跑胶，使用普洛麦格(Promega)λDNA/Hind III和1kb DNA梯形作为标记(两种产品购自普洛麦格公司(Promega Corporation)，威斯康辛州麦迪森(Madison，WI))(参见图7)。
结果
PCR结果显示，从rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5扩增1806-bp(ha基因座)和1910-bp(tk基因座)一致色带(参见图7)。结果表明，在分别来自rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的tk基因座处的CVS狂犬病病毒株的插入侧接区域和狂犬病G基因，以及ha基因座处的巴斯德-巴黎狂犬病病毒株的插入侧接区域和狂犬病G基因内，未发生显著插入或缺失。rRCNV-狂犬病G2 MSV与X+5之间的色带密度差异是因为第5代的病毒效价是主种子的约10,000倍。结果概括于下表6中：
表6.rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的遗传稳定性测试的结果
结论
从PCR测试推断，rRCNV-狂犬病G2 MSV在达到第5代的生产前放大程序以下在遗传上是稳定的。
实例6：通过蓝色蚀斑试验进行rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的表型稳定性测试
本研究通过蓝色蚀斑试验来检测rRCNV-狂犬病G2 MSV(主种子病毒)在达到第5代(rRCNV-狂犬病G2 X+5)的生产前放大程序以下在表型上是否稳定。
方法
A.种子Vero细胞
1.以7×105/mL的浓度(10mL于1×MEM/0.05％LAH/Gent培养基+5％FBS中)，将细胞培植于100mm培养皿上，并生长过夜，如此细胞达到约80％汇合以供感染。
B.病毒稀释
2.在室温下将病毒解冻并任选地在冰上超声波处理15秒3次。
3.在1×MEM/0.05％LAH/Gent培养基中制备连续10倍稀释液：
a)将rRCNV-狂犬病G2 MSV稀释至10-1。
b)将rRCNV-狂犬病G2 X+5稀释至10-5。
C.感染
4.从100mm培养皿去除培养基并用6mL的0.01M PBS冲洗两次。
5.从培养板去除所有流体并将经稀释的病毒添加至各培养皿中。
a)对MSV而言：三重复添加1mL的100和10-1稀释病毒。
b)对X+5而言：三重复添加1mL的10-3、10-4和10-5稀释病毒。
6.将4mL的1×MEM/0.05％LAH/Gent培养基添加至各培养皿中以便各培养皿中的总体积为5mL。
7.在37℃和5％CO2下培育2小时，并使病毒感染Vero细胞。
D.琼脂覆层
8.将10％FBS添加至2×MEM/0.05％LAH/Gent培养基中并升温至42℃。
9.熔融后，将诺布尔(Noble)琼脂冷却至56℃。
10.将等体积的2.5％Noble琼脂与2×MEM/0.05％LAH/Gent培养基+10％FBS混合，并在室温下使其在含有56℃水的烧杯中静置10min。
11.2小时感染后，从步骤7的培养板去除整个培养基，并用15mL来自步骤10的生长培养基/Noble琼脂混合物将细胞单层覆盖。
12.使琼脂固化10-15min。
13.在37℃和5％CO2下培育培养皿。
E.染色
5天培育后，如下用7mL染色溶液覆盖培养皿：
14.制备染色溶液(100mL)：50mL的2.5％Noble琼脂、50mL的PBS和1mL的50mg/mL X-Gal。
15.混合之前，将Noble琼脂冷却至56℃并将PBS升温至42℃。先将PBS和X-Gal混合，并随后将X-Gal/PBS添加至Noble琼脂中。在室温下使混合物于含有56℃水的烧杯中静置10min。
16.10min后，将7mL的染色溶液添加至各培养板上。
17.使琼脂固化10-15min。
18.在37℃下培育4-6小时
19.计数蓝色蚀斑并记录数字图像。
结果
计数各培养板上的总蓝色蚀斑并概括于下表7中。未在任何培养板中观察到白色蚀斑。来自Vero细胞中rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的蓝色蚀斑的数字图像分别显示于图8A和8B中。rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的计算效价显示于下文。
结论
在rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5中既未观察到白色蚀斑，也未观察到显著效价损失。此结果表明，rRCNV-狂犬病G2 MSV在达到第5代的生产前放大程序以下在表型上是稳定的。
表7.Vero细胞中rRCNV-狂犬病G2 MSV和X+5的蓝色蚀斑计数
Figure G2008800176957D00401
实例7：猫中rRCNV-狂犬病G2的剂量滴定研究
执行本研究以证明rRCNV-狂犬病G2疫苗的短期(3个月)功效。
在40只猫中进行rRCNV-狂犬病G2的剂量滴定研究。无佐剂的测试疫苗由活rRCNV-狂犬病G2和1×MEM(最小必需培养基)组成。疫苗储存在2-7℃下。在本研究中，有4个组(各组有10只12周龄的猫)：第1-3组的猫分别皮下(SQ)投与单次剂量(1毫升/剂量)的6.5、5.5和4.5Log10TCID50/mL的rRCNV-狂犬病G2，而第4组(对照)的猫不进行疫苗接种。猫在疫苗接种时为12周龄。疫苗接种后3个月，用狂犬病NYC街病毒株对猫进行攻击。在攻击后42天，经疫苗接种的猫都没有死亡，而80％(8/10)的对照猫由于狂犬病感染而死亡。显示100％以三种不同剂量进行疫苗接种的猫得到保护，本研究的极佳结果表明，本发明的rRCNV-狂犬病G2构建体能够在猫中诱发完全保护抵抗狂犬病攻击。
在本剂量滴定研究中有4个组：3个疫苗接种组的猫(n＝3×10)在12周龄时分别投与单次剂量的三种不同效价(6.50、5.39和4.42Log10TCID50/mL/剂量)的狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(rRCNV-狂犬病G2)，而对照组的猫(n＝10)不进行疫苗接种。在疫苗接种后28、63和98天，将所有猫放血并测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。在大多数疫苗接种猫中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种猫直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
疫苗接种后超过3个月(98DPV)，用狂犬病街NYC病毒株批号92-5的1∶150直接稀释液对所有猫(30只疫苗接种猫和10只对照)进行攻击，所述狂犬病街NYC病毒株是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室(National VeterinaryServices Laboratories of the United States Department of Agriculture)和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室(Berrimah VeterinaryLaboratories of the Northern Territory of Australia under the National Association of TestingAuthorities(NATA)quality accredited laboratories))供应。每天观察所有经攻击的猫，持续42天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡率。攻击结果显示，8/10(80％)对照由于狂犬病死亡，而各疫苗接种组的10/10(100％)疫苗接种者仍保持健康持续42天。疫苗接种组与对照组之间的死亡率有显著差异。对所有3个疫苗接种组而言，疫苗功效为100％。
总之，本剂量滴定研究的结果证明，在猫中，使用浣熊痘病毒活载体的本发明重组狂犬病疫苗即使在低达4.42Log10TCID50/mL(每剂)的效价下也可在单次疫苗接种后有效预防狂犬病至少3个月。
疫苗接种后超过3个月(98DPV)，用狂犬病街攻击病毒(批号92-5、3-1-92，狐狸中的NYC病毒株)的1∶150直接稀释液对所有猫进行攻击，所述狂犬病街攻击病毒是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。简单地说，在接种之前使动物镇静(tranquilized)并随后用0.5mL的经稀释攻击物肌肉内接种至各咬肌中(总共1.0mL)。将动物放置并固定在狂犬病攻击区域内的个别笼中持续42天观察期。所有狂犬病动物在攻击后前4周死亡的先前狂犬病攻击结果证明42天的攻击后观察期是合理的。
由本研究中对照猫的死亡率确定所述致死攻击剂量是可接受的。攻击结果表明，8/10(80％)对照由于狂犬病而死亡。因此，这是有效攻击测试。
在疫苗接种后第0天(day post vaccination，DPV)、28DPV、63和98DPV，收集来自各猫的6mL全血的血清。
通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)测试血清样品以测定针对狂犬病病毒的血清中和(SN)效价，RFFIT是一种由NVSL(美国农业部的国家兽医学实验室(NationalVeterinary Services Laboratories of the United States Department of Agriculture))公开的组织培养荧光抗体程序。
在Vero细胞上，将用于本研究的rRCNV-狂犬病G2疫苗重复滴定5次。测试疫苗的平均效价分别为6.50(V1)、5.39(V2)和4.42(V3)Log10TCID50/mL(每剂)。
在疫苗接种后28、63和98天，将所有猫放血并通过RFFIT测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。在大多数疫苗接种猫中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种猫直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击后，每天观察猫，持续42天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡。8/10(80％)非疫苗接种对照猫死亡或显示狂犬病征象，表明这是有效攻击测试。相反，3个组的所有疫苗接种猫(10/10，100％)保持健康。发现8只猫由于狂犬病感染导致的死亡发生在12DPC与25DPC之间。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。对所有3个疫苗接种组而言，疫苗功效为100％。
从本剂量滴定研究推断，在猫中，使用浣熊痘病毒活载体的新型狂犬病疫苗(rRCNV-狂犬病G2)，甚至在低达每剂4.42Log10TCID50/mL的效价下，在单次疫苗接种后有效预防狂犬病至少3个月。
实例8：犬中rRCNV-狂犬病G2的剂量滴定研究
本研究的目标为证明rRCNV-狂犬病G2疫苗的短期(3个月)功效。
在40只犬中进行rRCNV-狂犬病G2的剂量滴定研究。测试疫苗由不具有佐剂的活rRCNV-狂犬病G2和1×MEM组成。在本研究中有4个组(各组具有10只12周龄的犬)：第1-3组的犬分别皮下(SQ)投与单次剂量(1毫升/剂量)的6.5、5.5和4.5Logs10TCID50/mL的rRCNV-狂犬病G2，而第4组(对照)的犬不进行疫苗接种。犬在疫苗接种时为12周龄。疫苗接种后3个月，用狂犬病NYC街病毒株对犬进行攻击。在攻击后42天，第1组中0％(0/10)、第2组中10％(1/10)和第3组中30％(3/10)的犬死亡，而100％(10/10)的对照犬由于狂犬病感染而死亡。第1组中100％(10/10)的犬得到保护抵抗感染的极佳结果表明，当用6.5Logs10TCID50/mL的有效免疫剂量对犬进行疫苗接种时，本发明的rRCNV-狂犬病G2引发并成功达到完全保护抵抗狂犬病攻击。显示经5.5Log10TCID50/mL的有效量进行疫苗接种的90％(9/10)犬得到保护抵抗感染的第2组也具有满意结果。本研究显示，标准剂量滴定技术可建立具有满意结果的本发明rRCNV-狂犬病G2构建体的有效免疫量或剂量，所述满意结果将满足活狂犬病疫苗验收的美国政府要求(9C.F.R.§113.312)。
在本剂量滴定研究中有4个组：3个疫苗接种组的犬(n＝3×10)在12周龄时，分别投与单次剂量的具有三种不同效价(每剂6.50、5.39和4.42Log10TCID50/mL)的狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(rRCNV-狂犬病G2)，而对照组的犬(n＝10)不进行疫苗接种。在疫苗接种后28、64和91天，将所有犬放血并测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。在大多数疫苗接种犬中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种犬直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
疫苗接种后超过3个月(98DPV)，用狂犬病街NYC病毒株(狐狸中的NYC病毒株)的1∶10-5直接稀释液对所有犬(30只疫苗接种犬和10只对照)进行攻击，所述狂犬病街NYC病毒株是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。简单地说，在接种之前使动物镇静并随后用0.5mL的经稀释攻击物肌肉内接种至各咬肌中(总共1.0mL)。每天观察所有经攻击的犬，持续42天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡率。攻击结果显示，10/10(100％)对照由于狂犬病而死亡，而分别以每剂6.50、5.39和4.42Log10TCID50/mL的剂量进行疫苗接种的犬以10/10(100％)、9/10(90％)和7/10(70％)保持健康持续42天。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。疫苗功效分别为100％(V1)、90％(V2)和70％(V3)。
总之，本剂量滴定研究的结果证明，在犬中，使用活RCNV的新颖狂犬病疫苗即使在低达5.39Log10TCID50/mL(每剂)的效价下也可在单次疫苗接种后作为辅助手段有效预防狂犬病至少3个月。
由本研究中对照犬的死亡率确定所述致死攻击剂量是可接受的。攻击结果显示，10/10(100％)对照由于狂犬病而死亡。这显然是有效攻击测试。
取血清样品。在疫苗接种后第0天(DPV)、28DPV、63和91DPV，收集来自各犬的8mL全血的血清。通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)测试血清样品以测定针对狂犬病病毒的血清中和(SN)效价，RFFIT是一种由NVSL(美国农业部的国家兽医学实验室)公开的组织培养荧光抗体程序。
在Vero细胞上，将用于本研究的rRCNV-狂犬病G2重复滴定5次。测试疫苗的平均效价分别为6.50(V1)、5.39(V2)和4.42(V3)Log10TCID50/mL(每剂)。
在疫苗接种后28、63和91天，将所有犬放血并通过RFFIT测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。在大多数疫苗接种犬中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种犬直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击后观察：攻击后，每天观察犬，持续42天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡。10/10(100％)非疫苗接种对照犬死亡或显示狂犬病征象，表明这是有效攻击测试。相反，分别以每剂6.50、5.39和4.42Log10TCID50/mL的剂量进行疫苗接种的10/10(100％)、9/10(90％)和7/10(70％)犬仍保持健康持续42天。有趣地发现，14只犬由于狂犬病感染导致的死亡发生在13DPC与25DPC之间。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。疫苗功效分别为100％(V1)、90％(V2)和70％(V3)。
从本剂量滴定研究推断，在犬中，狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体产品(rRCNV-狂犬病G2)甚至在低达5.39Log10TCID50/mL的效价下，在单次疫苗接种后作为辅助有效预防狂犬病至少3个月。
实例9：猫中狂犬病疫苗(低剂量和常规剂量)、浣熊痘病毒活载体的一年免疫期研究
为确定疫苗产品在猫中使用的保护性剂量，进行两个对rRCNV-狂犬病G2疫苗的一年免疫期(DOI)研究，并通过有毒力狂犬病病毒攻击来证明功效。这些研究的目标为证明，使用两种不同狂犬病病毒疫苗剂量，即5.38Log10TCID50/ml的低剂量和6.28Log10TCID50/ml的常规剂量，在单次疫苗接种后的一年持续时间后，无佐剂重组狂犬病疫苗在猫中的功效和免疫原性。
A.低剂量研究概述
简单地说，在本一年免疫期(DOI)研究中有两个组：疫苗接种组的猫(n＝28)在12周龄时投与单次剂量的狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(VS编码1901.R5)，而对照组的猫(n＝13)不进行疫苗接种。在疫苗接种后28、91、183、272和365天，将所有猫放血并测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。疫苗接种后超过一年(421天)，随机选择35只猫(25只疫苗接种者和10只对照)用于狂犬病攻击。攻击物质通过以1∶40直接稀释狂犬病街NYC病毒株批号92-5来制备，所述狂犬病街NYC病毒株是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。每天观察所有经攻击的猫，持续90天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡率。通过荧光抗体(FA)试验就狂犬病检查各只死亡猫或安乐死猫的脑部。APHIS/CVB检查员现场观察本研究中疫苗接种、攻击物质制备和攻击的所有程序。
以称为“低”剂量的5.38Log10TCID50/mL(每剂)的平均效价将狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体重复滴定5次。在疫苗接种猫中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种猫直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击结果显示，8/10(80％)的非疫苗接种对照由于狂犬病而死亡，而仅3/25或12％的疫苗接种猫由于狂犬病死亡并且22/25(88％)疫苗接种者仍保持健康持续90天。通过FA测试确认9只死亡对照猫的脑部关于狂犬病病毒呈阳性。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。疫苗预防狂犬病的功效为85％(95％CI 55，97)。这是令人满意的测试，满足狂犬病疫苗功效的法定要求(标题9，美国联邦法规和EP)。
低剂量研究方案
本研究的方案进一步详细描述于下文：
在疫苗接种时，有28只测试动物和13只对照动物。随机选择这些猫中的35只(25只疫苗接种者和10只对照)用于攻击。猫在疫苗接种时为12周龄。用于本研究的冻干rRCNV-狂犬病G2疫苗储存在2-7℃下。冻干疫苗由活rRCNV-狂犬病G2和SGGK稳定剂组成。此测试重组狂犬病疫苗不含佐剂。在5个重复试验中滴定测试疫苗以建立本研究中投与至猫的剂量。疫苗的平均效价为5.38Log10TCID50/mL(每剂)。
在疫苗接种时有41个实验单位(28只疫苗接种者和13只对照)。随机选择这些猫中的35只(25只疫苗接种者和10只对照)用于攻击。根据同窝仔(litter)，将动物随机分成疫苗接种者和对照。随机化过程通过使用微软Excel表格(Microsoft Excel)对各同窝仔的动物进行随机数分配来完成。各同窝仔中的随机数按升序分类以用于将那一同窝仔的动物置于各组中。重复所述过程直至所有同窝仔的动物已随机化。
这是随机化完全区组设计。如下将41只猫随机分为两组：
  组   疫苗  动物数*
  疫苗接种者   rRCNV-狂犬病G2(每剂5.38Log10TCID50/mL)  28
  对照   无  13
*随机选择25只疫苗接种者和10只对照用于狂犬病攻击。
疫苗接种方案
将冻干疫苗由所供应的1.0mL无菌水稀释剂再水合。采用皮下疫苗接种途径。疫苗接种组的各只动物在颈背部给予一次剂量(1毫升/剂量)的疫苗。对照动物不进行疫苗接种。APHIS/CVB检查员现场观察疫苗接种的完整程序。鉴于较长的研究持续时间，根据标签指导，用Fel-O-Vax PCT对所有猫进行疫苗接种。
攻击方案
用rRCNV-狂犬病G2疫苗进行疫苗接种后超过一年(421DPV)，随机选择10只对照和25只疫苗接种者用于攻击。使用微软Excel表格中的随机数生成器执行随机化：将疫苗接种者指定编号、分类并将最高编号的猫从攻击中排除直至疫苗接种者数量等于25；使用类似程序将对照的数量降低至10。因此，从攻击阶段随机排除3只对照和2只疫苗接种者。另外，具有各种皮肤病的另一疫苗接种者在攻击之前从本研究中排除。
用狂犬病街攻击病毒(狐狸中的NYC病毒株)的1∶40直接稀释液对所有35只猫进行攻击，所述狂犬病街攻击病毒是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。简单地说，在接种之前使动物镇静并随后用0.5mL的经稀释攻击物肌肉内接种至各咬肌中(总共1.0mL)。将动物放置并固定在狂犬病攻击区域内的个别笼中持续90天观察期。APHIS/CVB检查员现场观察攻击病毒稀释和狂犬病攻击的完整程序。
由本研究中对照猫的死亡率，确定所述致死攻击剂量可接受。攻击结果显示，8/10(80％)对照由于狂犬病而死亡。因此，这是有效攻击测试。
样品收集和测试
血清样品
取血清样品。在疫苗接种后第0天(DPV)、28DPV、91DPV、183DPV、272DPV和365DPV，收集来自各猫的6mL全血的血清。
血清学测试
通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)测试血清样品以测定针对狂犬病病毒的血清中和(SN)效价，RFFIT是一种由NVSL(美国农业部的国家兽医学实验室)公开的组织培养荧光抗体程序。
动物测试
在攻击后观察期期间，测试安乐死或发现死亡的所有动物的狂犬病病毒情况。具体来说，收集脑(阿蒙氏角(ammons horn))、切片、处理并通过荧光抗体技术染色。
结果
疫苗滴定
在Vero细胞上，通过标准技术将用于本研究的疫苗重复滴定5次。测试疫苗的平均效价为5.38Log10TCID50/mL(每剂)。
针对狂犬病的中和抗体
在疫苗接种后28、91、183、272和365天，将所有猫放血并通过RFFIT测试个别血清样品中针对狂猫病病毒的中和抗体。在大多数疫苗接种猫中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种猫直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击后观察：
攻击后，每天观察猫，持续90天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡。发现8/10(80％)非疫苗接种对照猫死亡或显示狂犬病征象，表明这是有效攻击测试。相反，仅3/25(12％)疫苗接种猫死亡或显示狂犬病征象。发现11只猫由于狂犬病感染导致的死亡发生在10DPC与20DPC之间。研究结束时，22只疫苗接种者和2只对照仍保持健康。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。可预防分数(preventable fraction)为85％(95％CI 55，97)。
荧光抗体试验
上述安乐死猫(8只对照和3只疫苗接种者)的脑部经测试关于狂犬病病毒呈阳性，从而确认这11只猫的死亡是由狂犬病感染所致。
结论
从所述一年DOI研究推断，狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体甚至在低达5.38Log10TCID50/mL的效价下，在对猫进行单次疫苗接种后作为辅助有效预防狂犬病至少一年。
B.常规剂量研究概述
重复一年免疫期研究，但使用称为“常规”剂量的6.28Log10TCID50/mL(每剂)的重组疫苗平均效价。冻干疫苗由活rRCNV-狂犬病G2和SGGK稳定剂组成。此重组狂犬病疫苗不含佐剂。在5个重复试验中滴定测试疫苗以建立本研究中投与至猫中的剂量。
在本一年免疫期(DOI)研究中有两个组：疫苗接种组的猫(n＝28)在12周龄时投与单次剂量的狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(VS编码1901.R5)，而对照组的猫(n＝13)不进行疫苗接种。在疫苗接种后31、91、182、273和364天，将所有猫放血并测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。疫苗接种后超过一年(399天)，随机选择35只猫(25只疫苗接种者和10只对照)用于狂犬病攻击。攻击物质通过以1∶40直接稀释狂犬病街NYC病毒株批号92-5来制备，所述狂犬病街NYC病毒株是由USDA的NVSL-BVL供应。每天观察所有经攻击的猫，持续90天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡率。通过荧光抗体(FA)试验就狂犬病检查各只死亡猫或安乐死猫的脑部。APHIS/CVB检查员现场观察本研究中疫苗接种、攻击物质制备和攻击的所有程序。
以6.28Log10TCID50/mL(每剂)的平均效价将狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体重复滴定5次。在所有疫苗接种猫中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种对照猫直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击结果显示，9/10(90％)对照由于狂犬病而死亡，而25/25(100％)疫苗接种者仍保持健康持续90天。通过FA测试确认9只死亡对照猫的脑部关于狂犬病病毒呈阳性。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。疫苗预防狂犬病的功效为100％(95％CI 84，100)。这是令人满意的测试，满足狂犬病疫苗功效的9CFR和EP要求。
总之，此一年DOI研究的结果证明，富道动物保健公司(Fort Dodge Animal Health)的狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体在6.28Log10TCID50/mL(每剂)的效价下，在单次疫苗接种后有效预防狂犬病至少一年。
常规剂量研究方案
这是随机化完全区组设计。如下将41只猫随机分成两组：
  组   疫苗  动物数*
  疫苗接种者   rRCNV-狂犬病G2(每剂6.28Log10TCID50/mL)  28
  对照   无  13
*随机选择25只疫苗接种者和10只对照用于狂犬病攻击。
疫苗接种方案
将冻干疫苗通过所供应的1.0mL无菌水稀释剂再水合。采用皮下疫苗接种途径。疫苗接种组的各只动物在颈背部给予1次剂量(1毫升/剂量)的疫苗。对照动物不进行疫苗接种。APHIS/CVB检查员现场观察疫苗接种的完整程序。鉴于较长的研究持续时间，根据标签指导，用Fel-O-Vax PCT对所有猫进行疫苗接种。
攻击方案
疫苗接种后超过一年(399天)，随机选择10只对照和25只疫苗接种者用于攻击。使用微软Excel表格中的随机数生成器执行随机化：将疫苗接种者指定编号、分类并将最高编号的猫从攻击中排除直至疫苗接种者数量等于25；使用类似程序来将对照的数量降低至10。因此，从攻击阶段随机排除3只对照并将其转移至QC用于安全性测试。还从攻击阶段随机排除3只疫苗接种者并对其实施安乐死。
用狂犬病街攻击病毒(狐狸中的NYC病毒株)的1∶40直接稀释液对所有35只猫进行攻击，所述狂犬病街攻击病毒是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。简单地说，在接种之前使动物镇静并随后用0.5mL的经稀释攻击物肌肉内接种至各咬肌中(总共1.0mL)。将动物放置并固定在狂犬病攻击区域内的个别笼中持续90天观察期。APHIS/CVB检查员现场观察攻击病毒稀释和狂犬病攻击的完整程序。
由本研究中对照猫的死亡率，确定所述致死攻击剂量可接受。攻击结果显示，9/10(90％)对照由于狂犬病而死亡。因此，这是有效攻击测试。
结果
疫苗滴定
在Vero细胞上，将用于本研究的疫苗重复滴定5次。测试疫苗的平均效价为6.28Log10TCID50/mL(每剂)。
样品收集和测试
血清样品
在疫苗接种后第0天和在疫苗接种后31、91、182、273和364天收集6毫升全血。
血清学测试
在疫苗接种后31、91、182、273和364天，将所有猫放血并通过RFFIT测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。在大多数疫苗接种猫中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种猫直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击后观察
攻击后，每天观察猫，持续90天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡。可见9/10(90％)非疫苗接种对照猫死亡或显示狂犬病征象，表明这是有效攻击测试。相反，无(0/25，0％)疫苗接种猫死亡或显示狂犬病征象。发现9只猫由于狂犬病感染导致的死亡发生在10DPC与15DPC之间。研究结束时，所有25只疫苗接种者和1只对照仍保持健康。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。可预防分数为100％(95％CI84，100)。
荧光抗体试验
将在攻击后观察时期期间的死亡猫和安乐死猫安全运送至爱荷华州立大学兽医学院(Iowa State University College of Veterinary Medicine)的兽医诊断实验室(VeterinaryDiagnostic Laboratory)以供荧光抗体试验。9只死亡猫(9只对照)的脑部经测试关于狂犬病病毒呈阳性。这些结果进一步确认，9只猫的死亡是由狂犬病所致。
结论
从所述一年DOI研究的结果推断，在猫中，新型狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(rRCNV-狂犬病G2构建体)在6.28Log10TCID50/mL的效价下，在单次疫苗接种后有效预防狂犬病至少一年。
实例10：犬中狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体的一年免疫期研究
为确定新型疫苗在犬中的保护性剂量，进行rRCNV-狂犬病G疫苗的一年免疫期(DOI)研究，并通过在犬中的有毒力狂犬病病毒攻击来证明功效。本研究的目标为证明在单次疫苗接种后的一年持续时间后，无佐剂重组狂犬病疫苗在犬中的功效。
简单地说，在本一年免疫期(DOI)研究中有两个组：疫苗接种组的犬(n＝28)在12周龄时投与单次剂量的狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(VS编码1901.R5)，而对照组的犬(n＝13)不进行疫苗接种。在疫苗接种后28、91、182、273和365天，将所有犬放血并测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。疫苗接种后超过一年(420天)，随机选择35只犬(25只疫苗接种者和10只对照)用于狂犬病攻击。攻击物质通过以10-4直接稀释狂犬病街NYC病毒株批号92-5来制备，所述狂犬病街NYC病毒株是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。每天观察所有经攻击的犬，持续90天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡率。通过荧光抗体(FA)试验就狂犬病检查各只死亡犬或安乐死犬的脑部。APHIS/CVB检查员现场观察本研究中疫苗接种、攻击物质制备和攻击的所有程序。
以6.28Log10TCID50/mL(每剂)的平均效价将狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体重复滴定5次。在大多数疫苗接种犬中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种犬直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击结果显示，9/10(90％)对照由于狂犬病而死亡，而22/25(88％)疫苗接种者仍保持健康持续90天。通过FA测试确认9只死亡对照和3只疫苗接种犬的脑部关于狂犬病病毒呈阳性。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。疫苗预防狂犬病的功效为87％(95％CI 62，97)。这是令人满意的测试，满足狂犬病疫苗功效的法定要求(标题9，美国联邦法规)。
具体而言，在疫苗接种时有28只测试动物和13只对照动物。随机选择这些犬中的35只(25只疫苗接种者和10只对照)用于攻击。犬在疫苗接种时为12周龄。用于本研究的冻干rRCNV-狂犬病G2疫苗储存在2-7℃下，并且由活rRCNV-狂犬病G2和SGGK稳定剂组成。此重组狂犬病疫苗不含佐剂。在5个重复试验中滴定测试疫苗以建立本研究中投与至犬中的剂量。疫苗的平均效价为6.28Log10TCID50/mL(每剂)。
在对照组中不使用安慰剂。安慰剂的缺乏不引入任何特殊观察偏倚，因为结果为活或死亡。在疫苗接种日期之后超过一整年，由不知情观察者判断结果，此时缺乏安慰剂的任何可能临时效应将早已过去。
在疫苗接种时有41个实验单位(28只疫苗接种者和13只对照)。随机选择这些犬中的35只(25只疫苗接种者和10只对照)用于攻击。根据同窝仔(litter)，将动物随机分成疫苗接种者和对照。随机化过程通过使用微软Excel表格对各同窝仔的动物进行随机数分配来完成。各同窝仔中的随机数按升序分类以用于将那一同窝仔的动物置于各组中。重复所述过程直至所有同窝仔的动物已随机化。
在前3周期间，不盲化本研究，因为将疫苗接种者和对照单独圈养以防止各组之间任何可能的排毒。动物护理人员须了解各组以确保没有疫苗在组之间转移。疫苗接种后3周，将动物再随机化并将剩余研究盲化。
这是随机化完全区组设计。如下将41只犬随机分成两组：
  组   疫苗  动物数*
  疫苗接种者   rRCNV-狂犬病G2(每剂6.28Log10TCID50/mL)  28
  对照   无  13
*随机选择25只疫苗接种者和10只对照用于狂犬病攻击。
疫苗接种
将冻干疫苗通过所供应的1.0mL无菌水稀释剂再水合。采用皮下疫苗接种途径。疫苗接种组的各只动物在颈背部给予1次剂量(1毫升/剂量)的疫苗。对照动物不进行疫苗接种。APHIS/CVB检查员现场观察疫苗接种的完整程序。
攻击
疫苗接种后超过一年(420天)，随机选择10只对照和25只疫苗接种者用于攻击。4只犬(2只疫苗接种者和2只对照)由于反复耳朵感染而被排除。随机排除2只犬(1只疫苗接种者和1只对照)。使用微软Excel表格中的随机数生成器执行随机化：将疫苗接种者指定编号、分类并将最高编号的犬从攻击中排除直至疫苗接种者数量等于25；使用类似程序来将对照的数量降低至10。因此，从攻击阶段随机排除1只对照和1只疫苗接种者。
用狂犬病街攻击病毒(狐狸中的NYC病毒株)的10-4直接稀释液对所有35只犬进行攻击，所述狂犬病街攻击病毒是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。简单地说，在接种之前使动物镇静并随后用0.5mL的经稀释攻击物肌肉内接种至各咬肌中(总共1.0mL)。将动物放置并固定在狂犬病攻击区域内的个别笼中持续90天观察期。APHIS/CVB检查员现场观察攻击病毒稀释和狂犬病攻击的完整程序。
由本研究中对照犬的死亡率，确定所述致死攻击剂量可接受。攻击结果显示，9/10(90％)对照由于狂犬病而死亡。因此，这是有效攻击测试。
在攻击前的2天，在35只健康犬中未观察到异常征象。取血清样品。在疫苗接种后(DPV)第0天、28DPV、91DPV、182DPV、273DPV和365DPV，收集来自各犬的6mL全血的血清。通过快速荧光灶抑制试验(RFFIT)测试血清样品以测定针对狂犬病病毒的血清中和(SN)效价，RFFIT是一种由NVSL(美国农业部的国家兽医学实验室)公开的组织培养荧光抗体程序。
每次标准程序，在Vero细胞上将用于本研究的疫苗重复滴定5次。测试疫苗的平均效价为6.28Log10TCID50/mL(每剂)。
在疫苗接种后28、91、182、273和365天，将所有犬放血并通过RFFIT测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。在大多数疫苗接种犬中观察到狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种犬直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击后，每天观察犬，持续90天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡。9/10(90％)非疫苗接种对照犬死亡或显示狂犬病征象，表明这是有效攻击测试。相反，3/25(12％)疫苗接种犬死亡或显示狂犬病征象。发现犬由于狂犬病感染导致的死亡发生在11DPC与17DPC之间。研究结束时，22只疫苗接种者和1只对照仍保持健康。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。可预防分数为87％(95％CI 62，97)。
将在攻击后观察时期期间的死亡犬和安乐死犬安全运送至爱荷华州立大学兽医学院的兽医诊断实验室以供荧光抗体试验。12只死亡犬(9只对照和3只疫苗接种者)的脑部经测试关于狂犬病病毒呈阳性。这些结果进一步确认，13只犬的死亡是由狂犬病所致。
结论
从所述一年DOI研究的结果证明，狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(rRCNV-狂犬病G2)在6.28Log10TCID50/mL(每剂)的效价下，在对犬进行单次疫苗接种后作为辅助有效预防狂犬病至少一年。
实例11：猫中狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体的毒力回复研究
本研究的目标为确定在猫中反传代(back-passage)后，rRCNV-狂犬病G2是否可回复毒力，并检测猫之间病毒排毒和病毒传播的可能性。
在本研究中评估活重组浣熊痘病毒(rRCNV-狂犬病G2)的毒力回复，所述活重组浣熊痘病毒表达分别在胸苷激酶和血球凝集作用基因座处的攻击病毒标准和巴斯德-巴黎病毒株的狂犬病糖蛋白。在总共35只8周龄的健康猫中进行初始传代和确认性反传代。在接种时，所有35只猫对浣熊痘病毒为血清阴性。
在总共15只猫中进行初始传代：将10只猫用1.0mL剂量的7.41Log10TCID50rRCNV-狂犬病G2经口接种，并将5只不接种的猫作为接触对照。从接种后(DPI)-2至15天，每天收集口腔拭子和5个随机粪便样品。在15DPI，对所有猫进行尸检以供组织样品收集。未观察到肉眼损害(gross lesion)，并且未从口腔拭子、粪便和组织样品的任一种分离出病毒。
为确保准确度，在20只猫中执行确认性反传代：将10只猫用1.0mL剂量的与初始传代相同的病毒(7.57Log10TCID50)经口接种，并且10只猫用1.0mL剂量的从初始传代收集的汇集组织匀浆经口接种。从-2至21DPI，每天取口腔拭子和5个随机粪便样品。在21DPI，对所有猫进行尸检以供组织样品收集。如同初始传代，未观察到肉眼损害，并且未从任何所收集样品分离出病毒。
在两次传代中，在研究时期期间每天监测所有猫的直肠温度、与浣熊痘病毒感染相关的临床征象和任何其它局部或全身性反应。所测试的猫无一显示任何与浣熊痘病毒感染相关的临床征象或显著直肠温度升高。
总之，本研究的结果证明，当在猫中传代时，rRCNV-狂犬病G2不可回复毒力和/或传播至体液或粪便中。另外，所测试的猫无一发展出临床征象。这些结果进一步表明，rRCNV-狂犬病G2在猫中不具有复制性和致病性。
在用高水平的活RCNV接种后未证明病毒排毒，确认RCNV在猫中不具有复制性和致病性。
具体而言，将总共35只健康猫用于本研究。初始传代使用10只接种猫和5只未处理(接触)对照猫。确认性传代使用20只猫，其中10只猫用来自初始传代的汇集组织匀浆接种，而10只猫用与初始传代相同的病毒接种。
在两次传代中，在接种时猫为约8周龄。靶群体为健康猫。关于其免疫功能，选用于本研究的动物视为猫的代表。所有猫经测试对RCNV呈阴性(SN效价＜2)。
初始传代由15只猫组成，10只用rRCNV-狂犬病G2×+3接种而5只为未处理接触对照。确认性反传代包括20只猫。10只猫用来自初始传代的汇集组织匀浆接种，而10只猫用与初始传代相同的病毒(rRCNV-狂犬病G2×+3)接种。
根据同窝仔，将用于初始接种和确认性反传代的猫随机分至适当组中。随机化通过使用微软Excel表格对各同窝仔的动物进行随机数分配来完成。随机数按升序分类以将各同窝仔的动物置于其各自组中。使执行本研究初始传代和确认性反传代的观察、样品收集和测试的科学工作者对研究不知情。
初始传代
将10只接种猫与5只未处理(接触)对照猫一起成组圈养，以评估疫苗病毒通过动物与动物接触来传播的能力。从接种后(DPI)-2至15天，每天收集口腔拭子和粪便样品。从-2至15DPI，每天监测直肠温度和对全身健康和临床征象的观察。
在15DPI，将10只接种猫和5只接触对照猫安乐死并进行尸检。无菌收集组织样品(颈部淋巴结、肝、脾和扁桃体)以供病毒分离。
确认性反传代
因为未从初始传代中的口腔拭子、粪便样品或组织样品中分离出病毒，所以使用20只猫进行确认性反传代。将10只猫用汇集组织匀浆接种而10只猫用与初始接种相同的病毒接种。从-2DPI至21DPI观察这些猫。在21DPI将猫安乐死并进行尸检。
接种
在初始传代和确认性反传代二者中，用1.0mL剂量体积对除接触对照(无接种)外的所有猫进行经口投与。
观察和程序
从初始传代的-2至15DPI和确认性反传代的-2至21DPI，每天监测直肠温度和临床征象，诸如咳嗽、喷嚏、鼻和眼分泌物、舌炎和口炎。在尸检后，收集并分析血清样品、口腔拭子、粪便样品和组织样品。
通过血清中和，使用恒定病毒(50-300TCID50)变化血清方法测量针对RCNV的抗体。通过显微镜检测Vero细胞上RCNV感染所特有的细胞病变效应(CPE)来读取终点。效价根据里德(Reed)和明奇(Muench)的方法计算为引起病毒复制50％抑制的血清稀释度。
在24孔培养板中，在Vero细胞上滴定用于初始传代和确认性反传代中的rRCNV-狂犬病G2接种物。
简单地说，使用含有0.05％LAH和庆大霉素(30μg/mL)的1×MEM制备rRCNV-狂犬病G2的连续10倍稀释液。在超过90％汇合的单层上，每孔接种100μL的经稀释病毒。在36±2℃和4-6％CO2下，将培养板培育2小时。培育之后，将含有0.05％LAH、庆大霉素(30μg/mL)和5％FBS的1.0-1.5mL 1×MEM添加至各孔中，并且在36±2℃和4-6％CO2下，将培养板再培育5天。培育后，将培养板染色以便观察典型CPE或蚀斑。使用里德(Reed)和明奇(Muench)的方法计算TCID50效价。
为确定病毒分离方法的灵敏性，稀释(掺入(spiked))汇集口腔拭子、组织匀浆和粪便样品中的rRCNV-狂犬病G2，并通过上述方法对其滴定。
为证明当在猫中传代时缺乏rRCNV-狂犬病G2的毒力回复，应满足以下标准：
a)经rRCNV-狂犬病G2接种的猫应不显示临床疾病的征象。对经修饰活病毒的经口投药而言，预期诸如咽喉炎等轻度和瞬间临床异常，并且其应视为接种的正常反应。
b)与初始传代中接种的病毒相比，在从确认性反传代分离的rRCNV-狂犬病G2中，未观察到表型和/或基因型改变。
c)若未从粪便、口腔和组织样品分离出病毒，则不存在病毒排毒和传播。
重复进行5次接种物rRCNV狂犬病G2×+3的滴定。用于初始传代的平均效价为7.41Log10TCID50/mL，而用于确认性反传代的平均效价为7.57Log10TCID50/mL。这些效价大约是一年免疫期研究中投与至猫和犬的常规剂量(6.28Log10TCID50/mL)的约13-20倍。
通过血清中和测量针对RCNV的抗体以确认猫关于RCNV抗体呈阴性。血清中和试验显示，在两次传代中在接种时，所有猫关于RCNV抗体呈阴性(SN＜2)。
在初始传代和确认性反传代中，所有猫的直肠温度和临床征象记录为正常。对照组和接种组二者中的一些猫偶而具有高温(103.0°F至103.9°F)，这最有可能是因为在观察时间期间猫变得兴奋并且同时受到约束。在研究时期期间未观察到异常征象。在15DPI(初始传代)和21DPI(确认性反传代)时，对所有猫进行尸检并且未观察到肉眼损害。这些结果表明，rRCNV-狂犬病G2对猫不具有致病性。
对于初始传代和确认性反传代，从所有口腔拭子、粪便和组织样品进行的病毒分离呈阴性。未计算病毒效价，因为未从任何传代分离出病毒。这些结果表明，rRCNV-狂犬病G2在猫中不具有复制性。
为检测口腔拭子、粪便和组织样品是否对病毒滴定具有任何负面影响，使用上述样品作为稀释剂以双重复滴定rRCNV-狂犬病G2×+3，并与作为对照的MEM培养基相比较。rRCNV-狂犬病G2×+3的平均效价分别为7.6(口腔拭子)、7.0(粪便)、7.0(组织)和7.6Log10TCID50/mL(MEM)。这些结果表明，口腔拭子、粪便和组织样品对滴定试验无显著影响。用于灵敏性的进一步掺入试验表明，若测试样品中存在病毒颗粒，则分离将呈阳性。
因为未从任何测试样品分离出病毒，所以未进行初始传代与确认性反传代之间rRCNV-狂犬病G2表型和/或基因型改变的比较。
结论
从本研究的结果表明，当在猫中传代时，rRCNV-狂犬病G2不能回复毒力。还证明rRCNV-狂犬病G2病毒在猫之间不排毒或传播。
实例12：犬中与
Figure G2008800176957D00551
DA2PPv或
Figure G2008800176957D00552
DA2PPv/CvK/LCIGP组合的灭活rRCNV-狂犬病G2部分的剂量滴定
简单地说，在本剂量滴定研究中有4个组：3个疫苗接种组的犬(n＝3×10)分别在12周龄时，投与单次剂量的
Figure G2008800176957D00553
DA2PPv(饼)/灭活前效价为6.7或6.4Log10TCID50/mL的灭活rRCNV-狂犬病G2(稀释剂)，或CvK/LCIGP/灭活前效价为6.7Log10TCID50/mL的灭活rRCNV-狂犬病G2(稀释剂)，而对照组的犬(n＝10)用
Figure G2008800176957D00554
DA2PPv(饼)/水(稀释剂)进行疫苗接种。在疫苗接种时，所有测试犬是狂犬病血清阴性。
疫苗接种后20周(140DPV)，用狂犬病街NYC病毒株的1∶10-5直接稀释液对所有犬(30只疫苗接种者和10只对照)进行攻击，所述狂犬病街NYC病毒株是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。每天观察所有经攻击的犬，持续33天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡率。攻击结果显示，10/10(100％)对照由于狂犬病而死亡，而第1组中9/10(90％)疫苗接种者、第2组中10/10(100％)疫苗接种者和第3组中10/10(100％)疫苗接种者分别保持健康持续33天。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。疫苗功效分别为90％(V1)、100％(V2)和100％(V3)。
Figure G2008800176957D00561
10组合产品(购自富道动物保健公司，新泽西州麦迪逊的惠氏公司(Wyeth，Madison，NJ)的分公司)，犬瘟热-2型腺病毒-冠状病毒-副流感-细小病毒疫苗、经修饰活病毒和杀死病毒、钩端螺旋体菌苗(DA2PPv/CvK/LCIGP)为USDA批准疫苗。冻干DAPPv经修饰活部分(live fraction)含有犬瘟热病毒(CDV)、2型犬腺病毒(CAV2)、犬副流感病毒(CPI)和犬细小病毒(CPV)。稀释剂CvK/LCIGP部分(fraction)含有灭活犬冠状病毒(CCV)和钩端螺旋体菌苗(L)，钩端螺旋体菌苗由出血性黄疸钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体和波蒙纳钩端螺旋体的外膜蛋白(OMC)组成。将DA2PPv饼用CvK/LCIGP稀释剂复水并通过皮下(SQ)途径投与至6周龄或更大的小狗中作为辅助来保护抵抗由以下引起的疾病：CDV、传染性犬肝炎病毒(ICHV)、CAV2、CPV、CPI、CCV、犬钩端螺旋体、出血性黄疸钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体和波蒙纳钩端螺旋体。
在本剂量滴定研究中，用单次剂量的DA2PPv/灭活rRCNV-狂犬病G2或
Figure G2008800176957D00563
DA2PPi/CvK/LCIGP/灭活rRCNV-狂犬病G2对犬进行疫苗接种，并且在疫苗接种后约5个月用有毒力狂犬病病毒进行攻击。本研究的目标为：(1)确定重组病毒(rRCNV-狂犬病G2)作为灭活疫苗是否具有免疫原性；(2)评估与DA2PPv或
Figure G2008800176957D00564
DA2PPi组合的灭活rRCNV-狂犬病G2的5个月DOI，和(3)优化获得免疫原性的剂量。
有30只测试动物和10只对照动物。犬在疫苗接种时为12周龄。
测试疫苗的组成
疫苗1(V1)由冻干DA2PPv饼和稀释剂1组成。稀释剂1含有灭活rRCNV狂犬病G2部分(每剂约6.7Log10TCID50灭活前效价)和佐剂(1％和3％
Figure G2008800176957D00566
)。
疫苗2(V2)由冻干DA2PPv饼和稀释剂2组成。稀释剂2含有灭活rRCNV狂犬病G2部分(每剂约6.4Log10TCID50灭活前效价)和佐剂(1％和3％)。
疫苗3(V3)由冻干DAPPv饼和稀释剂3组成。稀释剂3含有灭活rRCNV狂犬病G2部分(每剂约6.7Log10TCID50灭活前效价)、灭活犬冠状病毒(CvK)、钩端螺旋体菌苗(LCIGP-出血性黄疸钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体和波蒙纳钩端螺旋体的OMC)和佐剂(1％和3％
Figure G2008800176957D00572
)。
冻干DA2PPv部分和CvK/LCIGP稀释剂根据常规制造方法制备。灭活rRCNV-狂犬病G2部分由BEI(二乙烯亚胺)，通过用于将制备疫苗用的病毒培养物灭活的标准技术来灭活。冻干DA2PPv部分在疫苗接种时通过各自稀释剂再水合。在本研究中，用1mL的无菌Super Q水将
Figure G2008800176957D00573
DA2PPv饼复水，并将再水合DA2PPv用作安慰剂。
方法
如下将犬随机分成4组：
Figure G2008800176957D00574
*CvK/LCIGP部分：灭活犬冠状病毒(CvK)和钩端螺旋体菌苗(L)，钩端螺旋体菌苗由处于释放水平的出血性黄疸钩端螺旋体、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体和波蒙纳钩端螺旋体的OMC组成。
疫苗接种
采用皮下疫苗接种途径(SQ)。对各只动物在颈背部给予1次剂量(1毫升/剂量)的疫苗/安慰剂。
攻击
疫苗接种后20周(约5个月)，用狂犬病街攻击病毒(狐狸中的NYC病毒株)的1∶10-5直接稀释液对所有犬进行攻击，所述狂犬病街攻击病毒是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。简单地说，在接种之前使动物镇静并随后用0.5mL的经稀释攻击物肌肉内接种至各咬肌中(总共1.0mL)。将动物放置并固定在狂犬病攻击区域内的个别笼中持续33天观察期。所有狂犬病动物在攻击后前4周死亡的先前狂犬病攻击结果证明33天的攻击后观察期是合理的。
由本研究中对照犬的死亡率，确定所述致死攻击剂量可接受。攻击结果显示，10/10(100％)对照由于狂犬病而死亡。这显然是有效攻击测试。
观察
在攻击的前2天，在40只健康犬中未观察到异常征象。
攻击后，由临床兽医所培训的人员每天监测动物以识别狂犬病征象直至攻击后(DPC)33天。记录观察结果并按狂犬病疫苗的法定要求加以分级。
攻击后，每天观察犬，持续33天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡。10/10(100％)对照犬死亡或显示狂犬病征象，表明这是有效攻击测试。相反，在第1、2或3组中，分别有9/10(90％)、10/10(100％)和10/10(100％)的疫苗接种者仍保持健康持续33天。有趣地发现，11只犬由于狂犬病感染导致的死亡发生在11DPC与22DPC之间。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。疫苗功效分别为90％(V1)、100％(V2)和100％(V3)。
结论
从本剂量滴定研究的结果证明，与DA2PPv或
Figure G2008800176957D00582
DAP2Pv/CvK/LCIGP组合的本发明的灭活rRCNV-狂犬病G2部分在犬中，甚至在6.4Log10TCID50/mL(每剂)的灭活前效价下，在单次疫苗接种后作为辅助有效预防狂犬病至少5个月。
实例13：猫中狂犬病疫苗(常规剂量)、浣熊痘病毒活载体的三年免疫期研究
为确定疫苗产品在猫中使用的保护性剂量，使用与先前实例9中所述类似的材料和方法，进行rRCNV-狂犬病G2疫苗的三年免疫期(DOI)研究，并通过有毒力狂犬病病毒攻击来证明功效。本研究的目标为证明使用6.28Log10TCID50/ml的剂量，在单次疫苗接种后的三年持续时间后，无佐剂重组狂犬病疫苗在猫中的功效和免疫原性。
简单地说，在本一年免疫期(DOI)研究中有两个组：疫苗接种组的猫(n＝28)在12周龄时投与单次剂量的狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(VS编码1901.R5)，而对照组的猫(n＝13)不进行疫苗接种。在疫苗接种后0、28、91、181、273、365、549、730、912和1095天，将所有猫放血并且如前述，测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。疫苗接种后超过三年(1128天)，随机选择35只猫(25只疫苗接种者和10只对照)用于狂犬病攻击。攻击物质通过以1∶25直接稀释狂犬病街NYC病毒株批号92-5来制备，所述狂犬病街NYC病毒株是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。每天观察所有经攻击的猫，持续90天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡率。通过荧光抗体(FA)试验就狂犬病检查各只死亡猫或安乐死猫的脑部。APHIS/CVB检查员现场观察本研究中疫苗接种、攻击物质制备和攻击的所有程序。
以6.28Log10TCID50/mL(每剂)的平均效价将狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体重复滴定5次。在疫苗接种猫中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种猫直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击结果显示，10/10(100％)对照由于狂犬病而死亡，而21/25(84％)疫苗接种者仍保持健康持续90天。通过FA测试确认10只死亡对照和4只死亡疫苗接种猫的脑部关于狂犬病病毒呈阳性。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。疫苗预防狂犬病的功效为84％(95％CI 64，96)。
实例14：猫中与Fel-O-Vax-LvK IV+CaliciVax组合的狂犬病疫苗(常规剂量)、浣熊痘病毒活载体的一年免疫期研究
为确定疫苗产品在猫中使用的保护性剂量，进行rRCNV-狂犬病G2部分的一年免疫期(DOI)研究，并通过有毒力狂犬病病毒攻击来证明功效。本研究的目标为证明在一年持续时间后，与Fel-O-Vax-LvK IV+Calici Vax组合的rRCNV-狂犬病G2部分在猫中的功效和免疫原性。
简单地说，在本一年免疫期(DOI)研究中有两个组：疫苗接种组的猫(n＝28)在12周龄时皮下投与与Fel-O-Vax LvK IV+Calici Vax(稀释剂)组合的1mL狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体(饼)，而对照组的猫(n＝13)皮下投与1mL的Fel-O-Vax LvK IV+CaliciVax(稀释剂)。在8周龄时，给予所有猫1mL的Fel-O-Vax LvK IV+Calici Vax。在疫苗接种后0、28、91、182、274和398天，将所有猫放血并测试个别血清样品中针对狂犬病病毒的中和抗体。疫苗接种后超过一年(400天)，随机选择35只猫(25只疫苗接种者和10只对照)用于狂犬病攻击。攻击物质通过以1∶25直接稀释狂犬病街NYC病毒株批号92-5来制备，所述狂犬病街NYC病毒株是由USDA的NVSL-BVL(美国农业部的国家兽医学实验室和澳大利亚国家检测机构协会(NATA)品质认可实验室的北领地贝里马兽医学实验室)供应。每天观察所有经攻击的猫，持续90天，并记录狂犬病相关临床征象和死亡率。通过荧光抗体(FA)试验就狂犬病检查各只死亡猫或安乐死猫的脑部。APHIS/CVB检查员现场观察本研究中疫苗接种、攻击物质制备和攻击的所有程序。
以6.28Log10TCID50/mL(每剂)的平均效价将狂犬病疫苗、浣熊痘病毒活载体重复滴定5次。在疫苗接种猫中观察到显著狂犬病中和抗体效价，而非疫苗接种猫直至攻击时仍为狂犬病血清阴性。
攻击结果显示，7/10(70％)对照由于狂犬病而死亡，而25/25(100％)疫苗接种者仍保持健康持续90天。通过FA测试确认7只死亡对照猫的脑部关于狂犬病病毒呈阳性。疫苗接种组与对照组之间的死亡率存在显著差异。疫苗预防狂犬病的功效为100％(95％CI 82，100)。
在上文中，为说明而非限制的目的提供对本发明的特定实施例的详细描述。应了解，基于本揭示案的对所属领域的技术人员而言明显的所有其它修改、衍生和等效形式均欲包括在如所主张的本发明范围内。
序列描述和识别符
  序列识别符  描述
  1  质粒pFD2003SEL-GPV-PV的完整序列
  2  HA-08引物
  3  HA-Pst：引物
  4  gp-1F引物
  5  TK-LW引物
  6  TK-RW引物
  7  TK-RR引物
  8  gJE-F1引物
  9  PW-04引物
  10  PW-03引物
  11  狂犬病病毒G蛋白
  12  LacZ ORF
  13  氨苄西林ORF
Figure IYZ000006830769500011
Figure IYZ000006830769500021
Figure IYZ000006830769500031
Figure IYZ000006830769500041
Figure IYZ000006830769500061
Figure IYZ000006830769500071
Figure IYZ000006830769500091
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Figure IYZ000006830769500111
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Figure IYZ000006830769500181
Figure IYZ000006830769500191
Figure IYZ000006830769500201
Figure IYZ000006830769500211

Claims (30)

1.一种重组浣熊痘病毒载体(rRCNV)，其包含两种或两种以上各编码至少一种狂犬病病毒糖蛋白的外源核酸分子，其中所述核酸分子中的至少一种插入血球凝集素基因座和胸苷激酶基因座的每一个中； 
其中狂犬病病毒糖蛋白的来源选自:攻击病毒标准(Challenge Virus Standard)狂犬病病毒株和巴斯德-巴黎(Pasteur-Paris)狂犬病病毒株； 
其中插入所述浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座的编码所述糖蛋白的所述核酸分子来自所述攻击病毒标准狂犬病病毒株;且 
其中插入所述浣熊痘病毒基因组的血球凝集素基因座的编码所述糖蛋白的所述核酸分子来自所述巴斯德-巴黎狂犬病病毒株。 
2.根据权利要求1所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述浣熊痘病毒是活病毒并且可复制。 
3.根据权利要求2所述的重组浣熊痘病毒载体，其进一步包含一种编码狂犬病病毒糖蛋白的核酸分子，其还插入除所述浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座和血球凝集素基因座以外的所述浣熊痘病毒基因组的第三个非必需位点中。 
4.根据权利要求3所述的重组浣熊痘病毒载体，其中所述浣熊痘病毒基因组的所述第三个非必需位点为丝氨酸蛋白酶抑制剂位点。 
5.一种重组狂犬病疫苗，其包含免疫有效量的根据权利要求1所述的重组浣熊痘病毒载体和任选的适合载剂或稀释剂。 
6.一种重组狂犬病疫苗，其包含免疫有效量的一种或多种根据权利要求1至4中任一权利要求所述的重组浣熊痘病毒载体和任选的适合载剂或稀释剂。 
7.根据权利要求6所述的重组狂犬病疫苗，其进一步包含具有一种或多种选自由以下组成的群组的猫抗原的混合物:猫杯状病毒(feline calicivirus)、猫披衣菌(Chlamydophila felis)、猫白血病病毒(feline leukemia virus)、猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus)、猫鼻气管炎病毒(feline rhinotracheitis virus)、猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus)、猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus)和巴尔通体(Bartonella)细菌。 
8.根据权利要求7所述的重组狂犬病疫苗，其进一步包含具有一种或多种选自由以下组成的群组的犬抗原的混合物:犬埃立克体(Ehrlichia canis)、犬细小病毒(canine  parvovirus)、犬瘟热(canine distemper)、犬副流感病毒(canine parainfluenza virus)、II型犬腺病毒(canine adenovirus typeII)、犬腺病毒、犬冠状病毒(canine coronavirus)、出血性黄疸钩端螺旋体(Leptospira icterohemorrhagiae)、犬钩端螺旋体(Leprospira canicola)、感冒伤寒型钩端螺旋体(Leprospira grippotyphosa)和波蒙纳钩端螺旋体(Leptospira pomona)。 
9.根据权利要求5所述的重组狂犬病疫苗，其进一步包含佐剂。 
10.根据权利要求9所述的重组狂犬病疫苗，其中所述佐剂包含乙烯/马来酸共聚物和丙烯酸共聚物乳液的混合物。 
11.根据权利要求6所述的重组狂犬病疫苗，其进一步包含佐剂。 
12.根据权利要求11所述的重组狂犬病疫苗，其中所述佐剂包含乙烯/马来酸共聚物和丙烯酸共聚物乳液的混合物。 
13.根据权利要求7所述的重组狂犬病疫苗，其进一步包含佐剂。 
14.根据权利要求13所述的重组狂犬病疫苗，其中所述佐剂包含乙烯/马来酸共聚物和丙烯酸共聚物乳液的混合物。 
15.根据权利要求8所述的重组狂犬病疫苗，其进一步包含佐剂。 
16.根据权利要求15所述的重组狂犬病疫苗，其中所述佐剂包含乙烯/马来酸共聚物和丙烯酸共聚物乳液的混合物。 
17.一种根据权利要求5所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应。 
18.一种根据权利要求6所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应。 
19.一种根据权利要求9所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应。 
20.一种根据权利要求11所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于在哺乳动物中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应。 
21.一种根据权利要求7、13或14中任一权利要求所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于在猫中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应。 
22.一种根据权利要求8、15或16中任一权利要求所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于在犬中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应。 
23.一种根据权利要求5或7-10中任一权利要求所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于在牛或马中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应。 
24.一种根据权利要求6所述的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于在牛或马中诱发针对狂犬病的保护性免疫反应。 
25.一种制造根据权利要求1所述的重组浣熊痘病毒载体的方法，其包含以下步骤: 
(a)将编码攻击病毒标准狂犬病病毒株的糖蛋白的核酸序列插入所述浣熊痘病毒基因组的胸苷激酶基因座中； 
(b)将编码巴斯德-巴黎狂犬病病毒株的糖蛋白的核酸序列插入所述浣熊痘病毒基因组的血球凝集素基因座中；和 
(c)回收所述重组浣熊痘病毒载体。 
26.根据权利要求25所述的方法，其中步骤(a)和(b)的所述核酸序列进一步包含一个启动子序列，其操作性连接至所述核酸序列以允许通过所述重组浣熊痘病毒载体来表达所述核酸并产生所述攻击病毒标准狂犬病病毒株和所述巴斯德-巴黎狂犬病病毒株的糖蛋白。 
27.一种质粒pFD2003-GPV-PV，其由SEQIDNO:1的核苷酸序列组成。 
28.根据权利要求17至24中任一权利要求所述的用途，其中所述疫苗的有效免疫量在4.5Logl0TCID50/ml至6.7Logl0TCID50/ml的范围内。 
29.根据权利要求17至24中任一权利要求所述的用途，其中所述疫苗的有效免疫量在5.38Logl0TCID50/ml至6.28Logl0TCID50/ml的范围内。 
30.根据权利要求5至8中任一权利要求所述的重组狂犬病疫苗，其中所述疫苗为无佐剂疫苗。 
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