BRPI0707779B1

BRPI0707779B1 - antígeno isolado, composição de vacina e método para produção de uma proteína antígeno

Info

Publication number: BRPI0707779B1
Application number: BRPI0707779-3A
Authority: BR
Inventors: Mett Vadim; Yusibov Vidadi
Original assignee: Fraunhofer Usa Inc; Ibio Inc
Priority date: 2006-02-13
Filing date: 2007-02-13
Publication date: 2019-11-05
Also published as: KR20080106434A; BRPI0707779B8; CN101395174A; WO2007095320A2; WO2007095320A3; IL193397A0; US20080279877A1; EP1984388A2; CA2642056A1; WO2007095320A4; JP2009526780A; CN101395174B; AU2007215082B2; EP1984388B1; EP1984388A4; BRPI0707779A2; AU2007215082A1

Abstract

antigenos de hpv, composições de vacina, e métodos relacionados. a presente invenção refere-se a intersecção dos campos de imunologia e produção de proteína, e, particularmente, a antígenos e vacinas úteis na prevenção de infecção por vírus papiloma humano. são providos antígenos de proteína recombinantes, composições e métodos para a produção e uso de tais antígenos e composições de vacina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTÍGENO ISOLADO, COMPOSIÇÃO DE VACINA E MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA ANTÍGENO.

Pedidos Relacionados [001] O presente pedido é relacionado a e reivindica prioridade sob 35 USC 119(e) a U.S.S.N. 60/773.374, depositado em 13 de fevereiro de 2006 (o pedido ‘374’); os conteúdos totais do pedido ‘374’ sendo incorporados aqui por referência.

Antecedentes da Invenção [002] O câncer cervical é o segundo câncer mais comum entre mulheres pelo mundo inteiro. Embora a triagem tenha reduzido dramaticamente a incidência desta doença no mundo desenvolvido, em áreas do mundo onde muitas mulheres não têm acesso a triagem e cuidado ginecológico regulares, câncer cervical é a segunda somente em relação ao câncer de seio como uma causa de morte relacionada a câncer. Investigações clínicas, moleculares e epidemiológicos têm papilomavírus humano (HPV) identificados como a maior causa de câncer cervical e displasia cervical. Virtualmente todos os cânceres cervicais (cerca de 99%) contêm os genes do HPVs de alto risco, tipos mais comumente 16, 18, 31 e 45 (Fearly et al., 1999). Cerca de doze por cento (12%) de cânceres femininos pelo mundo são devido a infecção por HPV do colo do útero. Todo ano, cerca de 470.000 casos de câncer cervical são diagnosticados pelo mundo, e quase metade das mulheres afligidas morrerão. É estimado que HPV 16 é responsável por aproximadamente 60% de cânceres cervicais, com HPV-18 acrescentando outros 10%-20%. Outros tipos de alto risco incluem tipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 e 73.

[003] Contudo, o HPV pode desempenhar um papel em certos carcinomas da região da cabeça e pescoço, bem como os melanomas

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2/83 mais letais, e talvez outros cânceres (ver, por exemplo, Mellin et al., 2000, Internat. J. Cancer, 89-300; Zumbach et al., 2000, Internat. J. Cancer, 85:815; Dreau et al., 2000, Annals Surgery, 231:664; e Soini et al., 1996, Thorax, 51:887).

[004] O tratamento atual de displasia cervical é limitado a procedimentos de excisão e ablativos que removem ou destroem o tecido cervical. Estes procedimentos têm taxas de eficiência de aproximadamente 90%, mas estão associados com morbidez e perda. Adicionalmente, os tratamentos cirúrgicos removem somente o tecido displástico, deixando o tecido infectado por HPV que parece normal não-tratado (Bell et al., 2005). É, portanto, desejável erradicar esta infecção usando uma vacina. A vacinação preventiva de adolescentes antes que eles primeiro entre em contato com o HPV é um objetivo. Algumas vacinas profiláticas estão atualmente em ensaios clínicos de fase final, com resultados encorajadores. Devido ao período de latência longo entre a infecção e o câncer, os benefícios de uma vacinação profilática, em termos de incidência de câncer, seriam visíveis após décadas. Contudo, indivíduos já infectados, bem como pacientes que sofrem de câncer avançado, também podem se beneficiar de vacinações terapêuticas. A vacinação contra HPV para prevenir infecção e/ou tratar doença maligna pode diminuir substancialmente a morbidez e mortalidade de cânceres associados a HPV. Desse modo, existe uma necessidade remanescente de se desenvolver vacinas aperfeiçoadas adicionais contra HPV que sejam pouco custosas e possam ser prontamente disponíveis a grandes populações. Além disso, o desenvolvimento de vacinas terapêuticas contra HPV capaz de evitar a progressão de lesões pré-existentes e tumores malignos, e, ainda para eliminá-los, será de benefício extraordinário para aqueles afligidos com infecção.

Sumário da Invenção

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3/83 [005] A presente invenção proporciona vacinas de papilomavírus humano (HPV) e componentes de vacina produzidos em plantas. Em algumas concretizações, um ou mais antígenos de papilomavírus humano são gerados como uma proteína de fusão com uma proteína termoestável. A presente invenção compreende adicionalmente composições de vacina contendo antígenos de HPV. Em algumas concretizações, as vacinas de HPV da invenção compreendem pelo menos dois antígenos de HPV diferentes. Além disso, a invenção proporciona vacinas de papilomavírus humano (HPV) compreendendo pelo menos dois antígenos de papilomavírus humanos (HPV) diferentes. Alternativamente ou adicionalmente, as vacinas de HPV da invenção podem compreender um ou mais componentes de planta. Ainda adicionalmente providos são métodos para a produção e uso dos antígenos e composições de vacina da invenção.

Breve Descrição dos Desenhos [006] Figura 1: Map do plasmídeo pET32. A esquerda superior indica a região entre o promotor T7 o e terminador T7 necessitando de plasmídeo modificado usado para antígeno-alvo de clonagem.

[007] Figura 2: Produção das construções de pET-PRACS-LicKDEL e pET-PRACS-Lic-VAC de um vetor pET32 modificado.

[008] Figura 3: Esquemático da organização de vetor pBI121.

[009] Figura 4: Organização esquemática da derivação de plasmídeo pBID4 de um vetor pBI após excisão do gene βglucuronidase (GUS) e a adição de um plasmídeo derivado de TMV. [0010] Figura 5: Esquemático da fusão de E7 e E7GGG em sequência de lichenase entre locais BgIII e HindIII e clonagem subsequente no vetor pBID4.

[0011] Figuras 6A-D: Análise de Western de plantas infiltradas de Agrobacterium que expressam construções E7 usando um anticorpo anti-lichenase (6A, C) ou anticorpo anti-6HIS-E7 (6B, D).

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4/83 [0012] Figuras 7A-D1: Análise de Western de plantas infiltradas de Agrobacterium que expressam construções E7 usando um anticorpo anti-lichenase (7A, C) ou anticorpo anti-6HIS-E7 (7B, D).

[0013] Figura 8: Análise de atividade de lichenase de plantas infiltradas de Agrobacterium que expressam construções E7 (8A, 8B) ou E7GGG (8C, 8D) usando um anticorpo anti-lichenase.

[0014] Figuras 9A-D: (9A) Análise de Western de plantas infiltradas de Agrobacterium que expressam construções E7GGG usando um anticorpo anti-lichenase. (9B-D) Análise de coloração por Coomassie de frações de proteína do isolamento através de procedimentos de purificação.

[0015] Figura 10: Análise de Zimograma realizada em extratos de raízes transgênicas de Nicotiana benthamiana com Agrobacterium rhizogenes contendo pBID4-Lic-E7-KDEL (raias 1-9) e construções pBID4-Lic-E7GGG-KDEL (raias 10,11); via 12 = 150 ng de lichenase (controle positivo); via 13 = extrato bruto de folhas de Nicotiana benthamiana agro-infiltradas com Agrobacterium rhizogenes contendo a construção pBID4-Lic-E7-KDEL.

[0016] Figuras 11A-D: Caracterização e eficiência de candidatos de vacina produzidos por planta. (11A) Respostas IgG de soro específico E7. Os dados são apresentados como valores de densidade ótica em 405 nm de soro diluído 1:500. Os dados de animais individuais são mostrados junto com valores médios. (11B) Análise de ELISPOT de esplenócitos de camundongos vacinados. Os dados são apresentados como número médio de pontos ± SD por 2 x 10⁵ esplenócitos. As colunas cinza e negra se referem a células estimuladas com ou sem peptídeo CTL E7 específicos, respectivamente. (11C) Vacinação profilática contra tumores induzidos por TC-1. Os dados são representados como percentagem de camundongos livres de tumor. (11D) Vacinação terapêutica contra tumores induzidos por TC-1. Os

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5/83 dados são representados como percentagem de camundongos livres de tumor.

Descrição Detalhada da Invenção [0017] A invenção refere-se a antígenos de papilomavírus humano (HPV) útil na preparação de vacinas contra infecção por HPV, e proteínas de fusão compreendendo tais antígenos de HPV operavelmente ligados a proteína termoestável. A invenção se refere a métodos de produção de antígenos providos, incluindo, mas não limitados a produção em sistemas de planta. Adicionalmente, a invenção refere-se a vetores, proteínas de fusão, células de planta, plantas e composições de vacina compreendendo os antígenos e proteínas de fusão da invenção. Ainda adicionalmente providos são métodos de indução de resposta imune contra infecção por HPV em um indivíduo compreendendo administrar composições de vacina da invenção a um indivíduo.

Antígenos de HPV [0018] Proteínas de antígeno de papilomavírus humano (HPV) da presente invenção incluem qualquer proteína ou peptídeo antígeno imunogênico capaz de induzir uma resposta imune contra vírus HPV. Geralmente, proteínas imunogênicas de interesse incluem antígenos de HPV (por exemplo, proteína E6, proteína E7, etc), uma porção imunogênica destas, e/ou uma variante imunogênica destas.

[0019] Antígenos de HPV para uso de acordo com a presente invenção podem incluir proteínas de HPV de comprimento total (por exemplo, E6, E7, etc), ou fragmentos de tais proteínas, onde tais fragmentos retêm atividade imunológica, e/ou proteínas de fusão compreendendo tais proteínas de HPV de comprimento total ou fragmentos.

[0020] Os genes de HPV envolvidos na transformação de células in vitro são aqueles que codificam E6 e/ou E7 (Bedell et al., 1987, J.

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Virol., 61:3635). (Os mecanismos pelos quais proteínas E6 e E7 podem causar transformação celular foram propostos (Park et al., 1995, Cancer, 76:1902), e referências citadas neste). Baseado na sua capacidade de induzir resposta imunoprotetora contra infecção viral, E7 e E6 são os antígenos primários de interesse na geração de vacinas. Adicionalmente, os antígenos de HPV podem ser úteis na produção de combinação de vacinas de modo a aperfeiçoar eficiência de imunoproteção.

[0021] E6 é um polipeptídeo pequeno (aproximadamente 15.000 MW) compreendendo domínios de ligação de Zn. Um indício a sua função de transformação foi provido pela observação que a proteína se liga a p53. A proteína p53 é uma proteína supressora de tumor bem-conhecida que regula negativamente a profissão de ciclo de célula e, consequentemente, crescimento e divisão celular. A ligação de E8 a p53 resulta em ubiquitinação e eventual degradação da proteína ulterior, cujo processo envolve outra proteína celular denominada proteína associada E6. Consequentemente, células que expressam E6 terão um nível basal reduzido de p53. Os níveis de p53 são elevados em resposta a dano de DNA. Tais níveis aumentados resultam na expressão aumentada de p21, um inibidor de quinases dependentes de ciclina, cuja proteína media a limitação do ciclo de célula. Este mecanismo proporciona células com uma janela de tempo dentro da qual elas podem reparar o DNA danificado antes de sua replicação, que resultaria no restabelecimento do dano/mutação. A reciclagem aumentada de p53 mediada por E6 pode impedir o mecanismo de operação. Recentemente, foi verificado que E6 não afeta somente a regulação de ciclo de célula em virtude de acelerar a degradação de p53, mas também, mais diretamente, pelo bloqueio de p53 de interagir com DNA (Thomas et al., 1995, Oncogene, 10:261).

[0022] A oncoproteína E7 de HPV é um antígeno específico de

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7/83 tumor, e é envolvida na progressão maligna. E7 é uma proteína de vida curta, que é degradada ambas in vitro e in vivo pela via ubitiquinaprotessoma (Reinstein et al., 2000). A proteína E7 é uma fosfoproteína de ligação ao Zn pequena (aproximadamente 10.000 Mw) capaz de se ligar ao produto de gene retinoblastoma Rb. Rb é um supressor de tumor que se liga a e inativa o fator de transcrição E2F. O fator ulterior controla a transcrição de um número de genes relacionados ao crescimento incluindo aqueles que codificam timidina quinase, c-myc, dihidrofolato redutase e DNA alfa polimerase. A formação de complexo Rb-E2F impede a expressão dos genes ulteriores nas fases G0 e G1 do ciclo de célula, restringindo sua expressão à fase S onde os complexos Rb-E2F são programados para dissociarem, liberando fato r de transcrição ativo E2F. A formação de complexos de Rb-E7 impede a formação dos complexos de Rb-E2F com o resultado de encurtar as fases pré-S, isto é, acelerando a progressão através do ciclo de célula. Tentativas para produzir grandes quantidades de proteína E7 recombinante não-fusionada de sequência autêntica em sistemas de expressão eucarióticos têm praticamente falhado, principalmente devido a sua rápida degradação (Fernando et al., 1999). Não obstante, algumas vacinas terapêuticas específicas de HPV baseadas em E7 são atualmente exploradas em ensaios clínicos de fase II e III. Resultados preliminares são promissores, mas ainda necessitam de aperfeiçoamento adicional pela associação com adjuvantes mais apropriados capazes de estimular a eficiência de imunidade mediada por célula (Frazer, 2004).

[0023] Evidência correlativa para a importância destes mecanismos é provida pelas observações que proteínas E6 de tipos HPV altamente oncogênicas (por exemplo, HPV 16 e 18) têm afinidades mais altas para p53 do que proteínas correspondentes de tipos não-oncogênicas, e que proteínas E7 de tipos altamente oncogênicas têm afinidades

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8/83 mais altas para Rb do que proteínas correspondentes de tipos nãooncogênicas. Desse modo, E6 e E7 representam alvos principais para o desenvolvimento de vacina seletiva e terapia anticâncer.

[0024] Desse modo, a invenção proporciona células de planta e/ou plantas que expressam uma proteína heteróloga (por exemplo, antígeno de HPV). Uma proteína heteróloga da invenção pode ser qualquer antígeno de HPV de interesse, incluindo, mas não limitado a E6, E7, uma porção de E6, e/ou uma porção de E7. Ácido nucléico de comprimento total e sequências de proteína para E7 e uma E7 modificada de qualquer subtipo são providos em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, e SEQ ID NO: 4.

[0025] Enquanto sequências de antígenos de HPV exemplares são aqui providas, sequências adicionais de E6 e E7 para várias cepas e subtipos de HPV são conhecidas na técnica, e podem ser identificadas, por exemplo, nas bases de dados tais como o Banco de Gene (GenBank). Ainda adicionalmente, as atividades e domínios para cada uma de E6 e E7 são conhecidos na técnica. Desse modo, será apreciado que qualquer sequência tendo as características imunogênicas de um domínio de E6 e/ou E7 pode alternativamente ser empregada. Um versado na técnica será prontamente capaz de gerar sequências tendo pelo menos 75%, 80% ou 90% ou mais de identidade para os antígenos providos. Em certas concretizações, sequências de antígeno de HPV compreendendo proteínas incluem aquelas tendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou mais de identidade para sequências, ou uma porção destas, em que a proteína antígeno retém atividade imunogênica. Por exemplo, sequências tendo identidade suficiente para antígeno(s) de HPV que retém características imunogênicas são capazes de se ligarem com anticorpos que reagem com antígeno(s) de domínio provido(s) nas mesmas. As características imunogênicas frequentemente incluem

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9/83 três apresentações dimensionais de aminoácidos ou grupos laterais relevantes. Um versado na técnica pode identificar prontamente sequências com diferenças modestas na sequência (por exemplo, com diferença nos limites e/ou algumas alternativas de sequências que, não obstante, preservam as características imunogênicas). Por exemplo, sequências cujos limites são pertos de (por exemplo, dentro de cerca de 15 aminoácidos, 14 aminoácidos, 13 aminoácidos, 12 aminoácidos, 11 aminoácidos, 10 aminoácidos, 9 aminoácidos, 8 aminoácidos, 7 aminoácidos, 6 aminoácidos, 4 aminoácidos, 3 aminoácidos, 2 aminoácidos, ou 1 aminoácido) dos limites de domínio designados aqui em qualquer extremidade da sequência de aminoácido designada podem ser consideradas por compreenderem o domínio relevante de acordo com a presente invenção. Desse modo, a invenção contempla o uso de uma sequência de antígeno de HPV para compreender resíduos que se aproximam da designação de domínio. Por exemplo, um domínio de E7 foi projetado e expresso como uma proteína de fusão de estrutura interna como um antígeno da invenção (ver Exemplos aqui). Adicionalmente, será apreciado que quaisquer domínios, domínios parciais, ou regiões de sequências de aminoácido do antígeno de HPV (por exemplo, E6, E7) que são imunogênicos podem ser gerados usando-se as construções e métodos aqui providos. Ainda adicionalmente, domínios ou subdomínios podem ser combinados, separadamente e/ou consecutivamente para produção de antígenos de HPV.

Fusões de Antígeno com Proteínas Termoestáveis [0026] Em certos aspectos da invenção, são providos polipeptídeos que compreendem um antígeno de HPV (ou um fragmento ou variante deste) operavelmente ligado a proteína termoestável. Os polipeptídeos de fusão da invenção podem ser produzidos em qualquer sistema de expressão conhecido na técnica. Em certas concretizações, as

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10/83 proteínas de fusão da invenção são produzidas em uma planta ou porção desta (por exemplo, planta, célula de planta, raiz, broto, etc). [0027] Enzimas ou outras proteínas que não são encontradas naturalmente em células humanas ou animais são particularmente apropriadas para uso em polipeptídeos de fusão da presente invenção. As proteínas termoestáveis que, quando fusionadas, conferem termoestabilidade ao produto de fusão, são úteis. A termoestabilidade permite que a proteína produzida mantenha conformação, e mantenha proteína produzida à temperatura ambiente. Esta característica facilita recuperação fácil, de tempo eficiente e custo efetivo do polipeptídeo de fusão. Uma família representativa de enzimas termoestáveis úteis de acordo com a invenção é a família de glicanohidrolase. Estas enzimas clivam especialmente ligações 1,4-β glicosídicas que são adjacentes às ligações 1,3-β em polissacarídeos ligado misturados (Hahn et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:10417). As enzimas são encontradas em cereais, tais como aveia e cevada, e são também encontradas em um número de fungos e espécies bacterianas, incluindo C. thermocellum (Goldenkova et al., 2002, Mol. Biol., 36:698). Desse modo, proteínas termoestáveis exemplares para uso em polipeptídeos de fusão da presente invenção incluem enzimas glicosidase; proteínas glicosidase termoestáveis exemplares incluem aquelas representadas pelos números de acesso no Banco de Gene (GeneBank) selecionados de: P29716, P37073, P45798, P40942,

P14002, O33830, O43097, P54583, P14288, O52629, P29094,

P49067, JC7532, Q60037, P33558, P05117, P04954, Q4J929,

O33833, P49425, P06279, P45703, P45702, P40943, P09961,

Q60042, AAN05438, AAN05437, AAN05440, AAN05439 e AAD43138, cada um do qual sendo aqui incorporado por referência. Enzimas lichenase de uso em proteínas de fusão da invenção incluem Clostridium thermocellum P29716, Brevibacillus brevis P37073, e

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Rhodthermus marinus P45798, cada uma das quais sendo incorporadas aqui por referência em seus números de acesso no banco de Genes (GenBank). As proteínas de fusão representativas ilustradas nos Exemplos utilizam lichenase modificada isolada de Clostridium thermocellus; contudo, qualquer proteína termoestável pode ser similarmente utilizada de acordo com a presente invenção. [0028] Quando se designam proteínas de fusão e polipeptídeos de acordo com a invenção, é desejável, naturalmente, preservar a imunogenicidade do antígeno. Ainda adicionalmente, é desejável em certos aspectos da invenção proporcionar construções que proporcionam termoestabilidade da proteína de fusão. Esta característica facilita a recuperação fácil, de tempo eficiente e de custo efetivo do antígeno-alvo. Em certos aspectos, modelos de fusão de antígeno podem ser selecionados que proporcionam vantagens adicionais, incluindo aumento de imunogenicidade potencial para incorporar determinantes de vacina múltiplos, ainda carente antes desejável. Dois destes sistemas incluem produção de sistemas de raízes clonais e plantas clonais, e derivados destes, bem como produção de sistemas de brotos germinados.

Planta Clonal [0029] As raízes clonais mantêm vetores de expressão viral de RNA, e produzem estavelmente proteína alvo uniformemente na raiz total sobre períodos estendidos de tempo e subculturas múltiplas. Em contraste às plantas, onde o gene alvo é eliminado via recombinação durante movimento de célula a célula ou de longa distância, em culturas de raiz, a integridade do vetor viral é mantida e níveis de proteína alvo produzida sobre o tempo são similares àqueles observados durante varredura inicial. As raízes clonais permitem facilidade de produção de material para formulação oral de antígeno e composições de vacina. Métodos e reagentes para geração de uma

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12/83 variedade de entidades clonais derivadas de plantas que são úteis para a produção de antígeno (por exemplo, proteínas de antígeno da invenção) foram descritos anteriormente, e são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Publicação PCT WO 05/81905, que é incorporada aqui por referência). As entidades clonais incluem linhagens de raiz clonal, linhagens de célula de raiz clonal, linhagens de célula de planta clonal, e plantas clonais capazes de produção de antígeno (por exemplo, proteínas de antígeno da invenção). A invenção proporciona adicionalmente métodos e reagentes para expressão de polinucleotídeo de antígeno e produtos de polipeptídeo em linhagens de célula clonal derivadas de vários tecidos de planta (por exemplo, raízes, folhas), e em plantas totais derivadas de células simples (plantas clonais). Tais métodos são tipicamente baseados no uso de vetores virais de planta de vários tipos.

[0030] Por exemplo, em um aspecto, a invenção proporciona métodos de obtenção de uma linhagem de raiz clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção compreendendo as etapas de: (i) introdução de um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifica o antígeno da invenção em uma planta ou porção desta; e (ii) geração de uma ou mais linhagens de raiz clonal a partir da planta. As linhagens de raiz clonal podem ser geradas, por exemplo, pela infecção de uma planta ou porção de planta (por exemplo, uma peça colhida de planta) com um Agrobacterium (por exemplo, A. Rhizogenes) que causa formação de raízes com pelos. As linhagens de raiz clonal podem ser rastreadas em vários modos para identificar linhagens que mantêm vírus, linhagens que expressam polinucleotídeos que codificam antígeno da invenção em altos níveis, etc. A invenção proporciona adicionalmente linhagens de raiz clonal, por exemplo, linhagens de raiz clonal produzidas de acordo com os métodos da invenção, e envolve adicionalmente métodos de

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13/83 expressão de polinucleotídeos e produção de polipeptídeos que codificam antígeno da invenção usando as linhagens de raiz clonal.

[0031] A invenção proporciona métodos de geração de uma linhagem de célula clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de uma linhagem de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção; (ii) liberação de células individuais a partir da linhagem de raiz clonal; e (iii) manutenção das células sob condições adequadas para proliferação de célula de raiz. A invenção proporciona linhagens de célula de raiz e métodos de expressão de polinucleotídeos e produção de polipeptídeos usando linhagens de célula de raiz clonal.

[0032] Em algumas concretizações, a invenção proporciona métodos de geração de uma linhagem de célula clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de uma linhagem de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção; (ii) liberação de células individuais a partir da linhagem de raiz clonal; e (iii) manutenção das células em cultura sob condições apropriadas para proliferação de célula de raiz. A invenção proporciona métodos de geração de uma linhagem de célula de planta clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção compreendendo etapas de: (i) introdução de um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção em células de uma linhagem de célula de planta mantida na cultura; e (ii) enriquecimento das células que contêm o vetor viral. O enriquecimento pode ser realizado, por exemplo, por (i) remoção de uma porção das células a partir da cultura; (ii) diluição das células removidas de modo a reduzir a concentração de célula; (iii) permitindo que as células diluídas proliferem; e (iv) varredura das células que

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14/83 contêm o vetor viral. As linhagens clonais de célula de planta podem ser usadas para produção de um antígeno de HPV de acordo com a presente invenção.

[0033] A invenção inclui um número de métodos de geração de plantas clonais, células das quais contêm um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção. Por exemplo, a invenção proporciona métodos de geração de uma planta clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção compreendendo as etapas de: (i) geração de uma linhagem de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção; (ii) liberação de células individuais a partir da linhagem de raiz clonal; e (iii) manutenção das células liberadas sob condições apropriadas para formação de uma planta. A invenção proporciona adicionalmente métodos de geração de uma planta clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de uma linhagem clonal de célula de planta, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção; e (ii) manutenção das células sob condições apropriadas para formação de uma planta. Em geral, as plantas clonais de acordo com a invenção podem expressar qualquer polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção. Tais plantas clonais podem ser usadas para produção de um antígeno-polipeptídeo.

[0034] Conforme notado acima, a presente invenção proporciona sistemas para expressão de um polinucleotídeo ou polinucleotídeos que codificam antígeno da invenção em linhagens de raiz clonal, linhagens de planta clonal (por exemplo, as linhagens de célula derivadas de folha, caule, etc), e/ou em plantas clonais. O polinucleotídeo de codificação de antígeno da invenção é introduzido

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15/83 em uma célula de planta ancestral usando um vetor viral de planta cujo genoma inclui o polinucleotídeo de codificação de antígeno da invenção operavelmente ligado a (isto é, sob controle de) um promotor. Uma linhagem de célula clonal ou linhagem de célula de planta clonal é estabelecida de uma célula contendo o vírus de acordo com qualquer de várias técnicas adicionalmente descritas abaixo. O vetor de vírus de planta ou porções deste pode ser introduzido em uma célula de planta por infecção, pela inoculação com uma transcrição viral ou clone de cDNA infeccioso, por eletroporação, por transferência de gene mediada por T-DNA, etc.

[0035] As seções que se seguem descrevem métodos para geração de linhagens de raiz de clonal, linhagens de célula de raiz clonal, linhagens de célula de planta clonal, e plantas clonais que expressam um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção são, em seguida, descritas. Uma linhagem de raiz é distinguida de uma linhagem de célula de raiz em que uma linhagem de raiz produz estruturas atuais similares a raiz ou raízes, enquanto uma linhagem de célula de raiz consiste em células de raiz que não formam estruturas similares a raiz. O uso do termo linha é pretendido para indicar que células da linhagem podem proliferar e passar informação genética para as células de progenia. As células de uma linhagem de célula tipicamente proliferam na cultura sem ser parte de uma estrutura organizada, tal como aquela encontrada em uma planta intacta. O uso do termo linhagem de raiz é pretendido para indicar que as células na estrutura de raiz podem proliferar sem ser parte de uma planta completa. É notado que o termo célula de planta envolve raízes de célula. Contudo, para distinguir os métodos da invenção para gerar linhagens de raiz e linhagens de célula de raiz daqueles usados para gerar diretamente linhagens de célula de planta de tecido sem raiz (conforme oposto para gerar linhagens de célula de planta clonal de

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16/83 linhagens de raiz clonal ou plantas clonais derivadas de linhagens de raiz clonal), os termos célula de planta e linhagem de célula de planta conforme usados aqui, geralmente se referem a células e linhagens de célula que consistem em tecido de planta sem raiz. As células de planta podem ser, por exemplo, folha, caule, broto, parte de flor, etc. É notado que sementes podem ser derivadas das plantas clonais geradas como derivadas aqui. Tais sementes também conterão um vetor viral como plantas obtidas de tais sementes. Métodos para obtenção de estoques de semente são bem-conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados Unidos 2004/0093643).

Linhagens de Raiz Clonal [0036] A presente invenção proporciona sistemas para geração de uma linhagem de raiz clonal em que um vetor de planta viral é usado para direcionar expressão de um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção. Um ou mais vetores de expressão incluindo um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção operavelmente ligado a um promotor são introduzidos em uma planta ou uma porção desta de acordo com qualquer de uma variedade de métodos conhecidos. Por exemplo, folhas de planta podem ser inoculadas com transcrições virais. Os próprios vetores podem ser diretamente aplicados a plantas (por exemplo, via inoculações abrasivas, inoculações de spray mecanizadas, infiltração a vácuo, bombardeio de partícula, ou eletroporação). Alternativamente ou adicionalmente, vírions podem ser preparados (por exemplo, de plantas já infectadas), e aplicados a outras plantas de acordo com técnicas conhecidas.

[0037] Onde infecção é para ser acompanhada por aplicação direta de um genoma viral a uma planta, qualquer técnica disponível pode ser usada para preparar o genoma. Por exemplo, muitos vírus que são utilmente empregados de acordo com a presente invenção têm

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17/83 genomas de ssRNA. ssRNA podem ser preparados por transcrição de uma cópia de DNA do genoma, ou por replicação de uma cópia de RNA, ou in vivo ou in vitro. Dada a pronta disponibilidade de facilidade de uso de sistemas de transcrição in vitro (por exemplo, SP6, T7, lisado de reticulócito, etc), e também a conveniência de manutenção de uma cópia de DNA de um vetor de RNA, é esperado que os vetores de ssRNA da invenção serão frequentemente preparados por transcrição in vitro, particularmente com T7 ou SP6 polimerase. Clones de cDNA infecciosos podem ser usados. Transferência de gene mediada agrobacterialmente pode ser usada para transferir ácidos nucléicos virais, tais como vetores virais (ou genomas virais totais ou porções destes) em células de planta usando-se, por exemplo, agro infiltração, de acordo com métodos conhecidos na técnica.

[0038] A planta ou porção de planta podem, em seguida, serem mantidas (por exemplo, cultivadas ou crescidas) sob condições adequadas para replicação de uma transcrição viral. Em certas concretizações da invenção, o vírus se espalha além de uma célula inicialmente inoculada, por exemplo, localmente de célula a célula e/ou sistemicamente de uma folha inicialmente inoculada em folhas adicionais. Contudo, em algumas concretizações da invenção, o vírus não se espalha. Desse modo, um vetor viral pode conter genes que codificam MP e/ou CP funcionais, mas podem estar carecendo de um ou ambos de tais genes. Em geral, um vetor viral é introduzido em células múltiplas (infectadas) em uma planta ou porção desta.

[0039] Em seguida a introdução de um vetor viral na planta, folhas são colhidas. Em geral, as folhas podem ser colhidas a qualquer tempo em seguida a introdução de um vetor viral. Contudo, pode ser desejável manter a planta por um período de tempo em seguida a introdução de um vetor viral na planta, por exemplo, um período de tempo suficiente para replicação e, opcionalmente, difusão do vírus a

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18/83 partir das células nas quais foi inicialmente introduzido. Uma cultura de raiz clonal (ou culturas múltiplas) é preparada, por exemplo, por métodos conhecidos adicionalmente descritos abaixo.

[0040] Em geral, qualquer método disponível pode ser usado para preparar uma cultura de raiz clonal de uma planta ou tecido de planta em que um vetor viral foi introduzido. Tal método emprega genes que existem em certos plasmídeos bacterianos. Estes plasmídeos são encontrados em várias espécies de Agrobacterium que infectam e transferem DNA a uma ampla variedade de organismos. Como um gênero, Agrobacterium pode transferir DNA a um conjunto grande e diverso de tipos de planta, incluindo numerosas espécies de angiosperma de dicotiledônea e monocotiledônea e gimnosperma (ver Gelvin, 2003, Microbial. Mol. Biol. Rev., 67:16, e referências neste, todos dos quais sendo incorporados aqui por referência). A base molecular de transformação genética de células de planta é transferência de uma bactéria e integração em um genoma nuclear de planta de uma região de um grande plasmídeo (Ri) rizogênico ou (Ti) de indução de um tumor que reside dentro de várias espécies de

Agrobacterium. Esta região é referida como a região T, quando presente no plasmídeo, e como T-DNA quando excisado a partir do plasmídeo. Geralmente, uma molécula de T-DNA de trançado simples é transferida para uma célula de planta na infecção Agrobacteriana que ocorre naturalmente, e é por último, incorporada (na forma de fita dupla) no genoma. Sistemas baseados nos plasmídeos Ti são amplamente usados para introdução de material genético exógeno em plantas, e para produção de plantas transgênicas.

[0041] A infecção de plantas com várias espécies de Agrobacterium e transferência do T-DNA tem um número de efeitos. Por exemplo, A. tumefaciens causa doença de bile de coroa, enquanto A. rhizogenes causa desenvolvimento de raízes com pelos no local de

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19/83 infecção, uma condição conhecida como doença de raiz com pelo. Cada raiz ocorre de uma célula geneticamente transformada simples. Desse modo, as células de raiz nas raízes são clonais, e cada raiz representa uma população clonal de células. Raízes produzidas por infecção de A. rhizogenes são caracterizadas por uma alta taxa de crescimento e estabilidade genética (Giri et al., 2000., Biotech. Adv., 18:1, e referências neste, todas das quais sendo aqui incorporadas por referência). Em adição, tais raízes são capazes de regenerar plantas geneticamente estáveis (Giri et al., 2000, supra).

[0042] Em geral, a presente invenção envolve o uso de qualquer cepa de Agrobacteria (por exemplo, qualquer cepa de A. rhizogene) que é capaz de induzir formação de raízes de células de planta. Conforme mencionado acima, uma porção do plasmídeo Ri (Ri-TDNA) é responsável por causar doença de raiz com pelo. Enquanto transferência desta porção do plasmídeo Ri para células de planta pode convenientemente ser acompanhada por infecção com Agrobacteria que abriga o plasmídeo Ri, a invenção envolve o uso de vários outros métodos de introdução da região relevante em uma célula de planta. Tais métodos incluem qualquer método disponível de introdução de células de planta em material genético incluindo, mas não limitada a biolísticos, eletroporação, incorporação de DNA mediado por PEG, vetores baseados em Ti, etc. Porções relevantes do Ri T-DNA podem ser introduzidas em células de planta pelo uso de um vetor viral. Os genes de Ri podem ser incluídos no mesmo vetor que contém um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção, ou em um vetor viral diferente, que pode ser o mesmo, ou um tipo diferente daquele vetor que compreende o polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção. É notado que o Ri-T-DNA total não pode ser requerido para produção de raízes com pelos, e a invenção envolve o uso de porções do Ri-T-DNA, provido que tais porções contêm material

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20/83 genético suficiente para induzir formação de raiz, conforme conhecido na técnica. Material genético adicional, por exemplo, genes presentes dentro do plasmídeo Ri, mas não dentro do T-DNA, pode ser transferido para uma célula de planta de acordo com a invenção, particularmente genes onde os produtos de expressão facilitam integração do T-DNA no DNA de célula de planta.

[0043] De modo a preparar uma linhagem de raiz clonal de acordo com certas concretizações da invenção, porções de folha colhidas são contatadas com A. rhizogenes sob condições adequadas para infecção e transformação. Porções de folha são mantidas na cultura para permitir desenvolvimento de raízes com pelos. Cada raiz é clonal, isto é, células na raiz são derivadas de uma célula ancestral simples na qual o Ri T-DNA foi transferido. De acordo com a invenção, uma porção de tais células ancestrais conterá um vetor viral. Desse modo, as células em uma raiz derivada de tais células ancestral conterão um vetor viral, visto que elas serão replicadas e serão transmitidas durante divisão da célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) das células conterão o vetor viral. É notado que desde que um vetor viral é herdado de células-filhas dentro de uma raiz clonal, o movimento de um vetor viral dentro da raiz não é necessário para manter o vetor viral através de toda a raiz. As raízes com pelos clonais individuais podem ser removidas de uma porção de folha e adicionalmente cultivadas. Tais raízes também são referidas aqui como linhagens de raiz. Raízes clonais isoladas continuam a crescer em seguida ao isolamento.

[0044] Uma variedade de linhagens de raiz clonal diferentes foi gerada usando os métodos da invenção. As linhagens de raiz foram geradas usando vetores virais contendo polinucleotídeos que

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21/83 codificam antígeno da invenção (por exemplo, codificando peptídeo imunogênico). As linhagens de raiz foram testadas por western blot. As linhagens de raiz revelam uma variedade de níveis de expressão diferentes de vários polipeptídeos. As linhagens de raiz que revelam alta expressão foram selecionadas e adicionalmente cultivadas. As linhagens de raiz foram subsequentemente testadas novamente e mostradas para manter altos níveis de expressão sobre períodos estendidos de tempo, incluindo estabilidade. Níveis de expressão foram comparáveis a ou maiores do que expressão em plantas intactas infectadas com o mesmo vetor viral usado para gerar linhagens de raiz clonal. Em adição, a estabilidade de expressão das linhagens de raiz foi obtida em plantas infectadas com o mesmo vetor viral. Até 80% de tais plantas infectadas com vírus revertidas em tipo selvagem após 2-3 passagens. (Tais passagens envolvem inoculação de plantas com transcrições, permitindo que a infecção (local ou sistêmica) se torne estabelecida, tomando uma amostra de folha, e inoculando plantas recentes que são subsequentemente testadas para expressão).

[0045] As linhagens de raiz podem ser cultivadas em uma grande escala para produção de antígeno dos polipeptídeos da invenção conforme discutido adicionalmente abaixo. É notado que linhagens de raiz clonal (e linhagens de célula derivadas de linhagens de raiz clonal) podem geralmente serem mantidas no meio que não inclui vários compostos, por exemplo, hormônios de crescimento de planta, tais como auxinas, citocinas, etc, que são tipicamente empregadas na cultura de raiz e células de planta. Esta característica reduz o dispêndio associado com cultura de tecido, e os inventores esperam que contribuirá significantemente à praticabilidade econômica de produção de proteína usando plantas.

[0046] Qualquer de uma variedade de métodos podem ser usada

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22/83 para selecionar raízes clonais que expressam um polinucleotídeo que codifica antígeno(s) de HPV da invenção. Western blot, ensaios ELISA, etc, podem ser usados para detectar um polipeptídeo codificado. No caso de marcadores detectáveis, tais como GFP, métodos alternativos, tais como varreduras visuais, podem ser realizados. Se um vetor viral compreendendo um polinucleotídeo que codifica um marcador selecionável é usado, uma seleção apropriada pode ser imposta (por exemplo, o material de folha e/ou raízes derivadas deste podem ser cultivados na presença de uma condição antibiótica ou nutricional apropriadas e raízes sobreviventes identificadas e isoladas). Certos vetores virais contêm dois ou mais polinucleotídeos que codificam antígeno da invenção, por exemplo, dois ou mais polinucleotídeos que codificam polipeptídeos diferentes. Se um destes é um marcador selecionável ou detectável, as raízes clonais que são selecionadas ou detectadas por seleção ou detecção de expressão do marcador terão uma alta probabilidade de também expressar o segundo polinucleotídeo. A varredura (screening) de linhagens de raiz que contêm polinucleotídeos particulares pode ser realizada usando PCR e outros métodos de detecção de ácido nucléico.

[0047] Alternativamente ou adicionalmente, linhagens de raiz clonal podem ser classificadas pela presença do vírus pela inoculação de plantas hospedeiras que formarão lesões locais como um resultado de infecção de vírus (por exemplo, plantas hospedeiras hipersensíveis). Por exemplo, 5 mg de tecido de raiz pode ser homogeneizado em 50 μl de tampão de fosfato, e usado para inocular uma folha simples de uma planta de tabaco. Se o vírus está presente em culturas de raiz, dentro de dois ou três dias lesões características aparecerão nas folhas infectadas. Isto significa que a linhagem de raiz contém vírus recombinante que transporta o polinucleotídeo que codifica antígeno

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23/83 da invenção (gene alvo). Se nenhuma lesão local é formada, não existe vírus, e a linhagem de raiz é rejeitada como negativa. Este método é altamente eficiente em tempo e custo. Após classificar inicialmente a presença de vírus, as raízes que contêm o vírus podem ser submetidas a varredura secundária, por exemplo, por Western blot ou ELISA para selecionar altos expressores. Varreduras adicionais, por exemplo, varreduras para crescimento rápido, crescimento em meio particular, ou sob condições ambientais particulares, etc, podem ser aplicados. Estes métodos de varredura podem, em geral, serem aplicados no desenvolvimento de qualquer das linhagens de raiz clonal, linhagens de célula clonal, linhagens de célula de planta clonal, e/ou plantas clonais aqui descritas.

[0048] Conforme será evidente a um versado na técnica, uma variedade de modificações pode ser feita à descrição dos métodos da invenção para gerar linhagens de raiz clonal que contêm um vetor viral. Tais modificações estão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, enquanto é geralmente desejável introduzir o vetor viral em uma planta intacta ou proteína desta antes da introdução dos genes de Ri-T-DNA, em certas concretizações da invenção o Ri-DNA é introduzido antes da introdução do vetor viral. Em adição, é possível contatar plantas intactas com A. rhizogenes preferivelmente do que colheita de porções de folha e, em seguida, expondo-as a bactéria.

[0049] Outros métodos de gerar linhagens de raiz clonais de células simples da planta ou porção desta que abriga um vetor viral podem ser usados (isto é, métodos não usando A. rhizogenes ou material genético a partir de plasmídeo Ri). Por exemplo, tratamento com certos hormônios de planta ou combinações de hormônios de planta é conhecido para resultar na geração de raízes de tecido de planta.

Linhagens de Célula Clonal Derivadas de Linhagens de Raiz Clonal

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24/83 [0050] Conforme descrito acima, a invenção proporciona métodos para gerar linhagens de raiz clonais, no qual as células nas linhagens de raiz contêm um vetor viral. Conforme é bem-conhecido na técnica, uma variedade de linhagens de célula diferentes pode ser gerada de raízes. Por exemplo, linhagens de raiz de célula podem ser geradas de células de raiz individuais obtidas a partir da raiz usando uma variedade de métodos conhecidos. Tais linhagens de célula de raiz podem ser obtidas de vários tipos de célula de raiz diferentes dentro da raiz. Em geral, o material de raiz é colhido e dissociado (por exemplo, fisicamente e/ou enzimaticamente digerido) para liberar células de raiz individuais, que são, em seguida, adicionalmente cultivadas. A formação completa de protoplasto não é geralmente necessária. Se desejado, células de raiz podem ser revestidas em concentrações de célula muito diluídas, de modo a obter linhagens de célula de raiz de células de raiz simples. Linhagens de célula de raiz derivadas dessa maneira são linhagens de célula clonais contendo o vetor viral. Tais linhagens de célula de raiz, portanto, exibem expressão estável do polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção. As linhagens de célula de planta clonais podem ser obtidas em uma maneira similar a partir de raízes clonais, por exemplo, por cultura de células de raiz dissociadas na presença dos hormônios de planta apropriados. Varreduras e etapas sucessivas de enriquecimento podem ser usadas para identificar linhagens de célula que expressam o polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção em níveis altos. Contudo, se a linhagem de raiz clonal da qual a linhagem de célula é derivada já expressa em altos níveis, tais varreduras adicionais podem ser desnecessárias.

[0051] Como no caso das linhagens de célula clonais, as células de uma linhagem de célula de raiz clonal são derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral e, conterá, portanto,

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25/83 também o vetor viral, visto que ele será replicado, e será transmitido durante divisão da célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde que o vetor viral foi herdado pelas células-filhas dentro da linhagem de célula de raiz clonal, o movimento do vetor viral entre as células não é necessário para manter o vetor viral. As linhagens de célula de raiz clonais podem ser usadas de um polinucleotídeo que codifica antígeno da invenção conforme descrito abaixo.

Linhagens de Célula de Planta Clonal [0052] A presente invenção proporciona métodos para gerar uma linhagem de célula de planta clonal na qual um vetor viral de planta é usado para direcionar expressão de um polipeptídeo que codifica antígeno da invenção. De acordo com o método da invenção, um ou mais vetor(es) de expressão viral incluindo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de HPV da invenção ligado operavelmente a um promotor é introduzido em células de uma linhagem de célula de planta que é mantida na cultura de célula. Um número de linhagens de célula de plantas de vários tipos de planta é conhecido na técnica, qualquer dos quais podendo ser usado. Linhagens de célula recentemente derivadas podem ser geradas de acordo com métodos conhecidos para uso na prática da invenção. Um vetor viral é introduzido nas células da linhagem de célula de planta de acordo com qualquer de um número de métodos. Por exemplo, protoplastos podem ser produzidos e transcrições virais em seguida eletroporadas nas células. Outros métodos de introdução de um vetor viral de planta nas células de uma linhagem de célula de planta podem ser usados.

[0053] Um método de gerar linhagens de célula de planta clonais, de acordo com a invenção, e um vetor viral para introdução em células

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26/83 de planta (por exemplo, protoplastos), podem ser usados conforme segue: em seguida a introdução do vetor viral, a linhagem de célula de planta pode ser mantida na cultura de tecido. Durante este tempo, o vetor viral pode replicar, e os polipeptídeos que codificam antígeno da invenção podem ser expressos. As linhagens de célula de planta clonais são derivadas a partir da cultura, por exemplo, por um processo de enriquecimento sucessivo. Por exemplo, amostras podem ser removidas da cultura, opcionalmente com diluição de modo que a concentração de células é baixa, e revestidas em placas de Petri em gotículas individuais. As gotículas são, em seguida, mantidas para permitir divisão de célula.

[0054] Será apreciado que as gotículas podem conter um número variável de células, dependendo da densidade inicial da cultura e da quantidade de diluição. As células podem ser diluídas tal que muitas gotículas contêm ou 0 ou 1 célula se é desejado obter-se linhagens de célula clonais expressando o polipeptídeo que codifica antígeno da invenção após somente uma etapa simples de enriquecimento. Contudo, pode ser mais eficiente selecionar uma concentração tal que células múltiplas estejam presentes em cada gotícula e, em seguida, classificar as gotículas para identificar aquelas que contêm expressão de células. Em geral, qualquer procedimento de varredura apropriado pode ser empregado. Por exemplo, seleção ou detecção de um marcador detectável, tal como GFP, pode ser usado. Western blot ou ensaios ELISA podem ser usados. Gotículas individuais (100 pl) contêm mais do que células o bastante para realização destes ensaios. Etapas múltiplas de enriquecimento são realizadas para isolar linhagens de célula de expressão mais altas. Linhagens de célula de planta clonais simples (isto é, populações derivadas de uma célula ancestral simples) podem ser geradas por limitação adicional de diluição usando-se métodos-padrão para clonagem de célula simples.

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Contudo, é necessário isolar linhagens clonais individuais. Uma população contendo linhagens de célula clonais múltiplas pode ser usada de um polipeptídeo que codifica antígeno da invenção.

[0055] Em geral, certas concretizações acima descritas para geração de linhagens de raiz clonais se aplicam a geração de linhagens de célula de planta clonais. Por exemplo, uma diversidade de vetores virais contendo um ou mais polipeptídeos que codificam antígeno da invenção pode ser usada como podem combinações de vetores diferentes múltiplos. Métodos de varredura similares podem ser usados. Como no caso das linhagens de raiz clonais e linhagens de célula de raiz clonais, células de uma linhagem de célula de planta clonal são derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral e conterão, portanto, também o vetor viral, visto que será replicado e será transmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde que o vetor viral é herdado por células-filhas dentro da linhagem de célula de planta clonal, o movimento do vetor viral entre as células não é necessário para manter o vetor viral. A linhagem de célula de planta clonal pode ser usada para produção de um polipeptídeo que codifica antígeno da invenção conforme descrito abaixo.

Plantas Clonais [0056] Plantas clonais podem ser geradas a partir de raízes clonais, linhagens de célula de raiz clonais, e/ou linhagens de célula de planta clonais produzidas de acordo com os vários métodos acima descritos. Métodos para geração de plantas a partir de raízes, linhagens de célula de raízes, e linhagens de célula de plantas, tais como as linhagens de raiz clonais, linhagens de célula de raiz clonais,

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28/83 e linhagens de célula de planta clonais aqui descritas são bemconhecidas na técnica (ver, por exemplo, Peres et al, 2001, Plant Cell Tissue and Organ Culture, 65:37; e referência modelo operam na biologia molecular de planta e biotecnologia citadas aqui). A invenção proporciona, portanto, um método de gerar uma planta clonal compreendendo etapas de (i) gerar uma linhagem de raiz clonal, linhagem de célula de raiz clonal, ou linhagem de célula de planta clonal de acordo com qualquer dos métodos da invenção descritos acima; e (ii) gerar uma planta total a partir da linhagem de raiz clonal, linhagem de célula de raiz clonal, ou planta clonal. As plantas clonais podem ser propagadas e descridas de acordo com métodos padrões.

[0057] Como no caso das linhagens de raiz clonais, linhagens de célula de raiz clonais e linhagens de célula de planta clonais, as células de uma planta clonal são derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral e conterão, portanto, também o vetor viral, visto que será replicado e será transmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde que o vetor viral é herdado por células-filhas dentro da planta clonal, o movimento do vetor viral não é necessário para manter o vetor viral.

Sistemas de Expressão de Planta de Brotos e Brotos Germinados [0058] Sistemas e reagentes para gerar uma variedade de brotos e brotos germinados que são úteis para a produção de antígeno(s) de HPV de acordo com a presente invenção foram descritos anteriormente e são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Publicação PCT WO 04/43886, que é aqui incorporada por referência). A presente invenção proporciona adicionalmente brotos germinados, que podem ser comíveis, como uma biomassa contendo um peptídeo

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29/83 ou proteína [0059] antígeno de HPV. Em certos aspectos, a biomassa é provida diretamente para consumo de composições de antígeno. Em alguns aspectos, a biomassa é processada antes do consumo, por exemplo, por homogeneização, trituração, secagem ou extração. Em certos aspectos, o antígeno de HPV é purificado a partir da biomassa e formulado em uma composição farmacêutica.

[0060] Adicionalmente providos são métodos para produção de antígeno de HPV em brotos germinados que podem ser consumidos ou colhidos vivos (por exemplo, brotos germinados do gênero Brassica). Em certos aspectos, a presente invenção envolve crescimento de uma semente a um broto germinado comestível em um ambiente regulável contido (por exemplo, internos, em um recipiente, etc). A semente pode ser uma semente geneticamente projetada que contém um cassete de expressão que codifica um antígeno de HPV, cuja expressão é acionada por um promotor exogenamente induzível. Uma variedade de promotores exogenamente induzíveis pode ser usada que sejam induzíveis, por exemplo, por luz, calor, fitohormônios, nutrientes, etc.

[0061] Em concretizações relacionadas, a presente invenção proporciona métodos de produção de antígeno(s) de HPV em brotos germinados primeiro pela geração de um estoque de semente para o broto germinado pela transformação de plantas com um cassete de expressão que codifica antígeno de HPV usando sistema de transformação de Agrobacterium, no qual a expressão do antígeno de HPV é acionada por um promotor induzível. Sementes transgênicas podem ser obtidas a partir da planta transformada, crescida em um ambiente regulável contido, e induzida para expressar o antígeno de HPV.

[0062] Em algumas concretizações, métodos são providos que

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30/83 envolvem infecção de brotos germinados com um cassete de expressão viral que codifica um antígeno de HPV, expressão da qual pode ser acionada por qualquer de um promotor viral ou um promotor induzível. Os brotos germinados são crescidos por dois a quatorze dias em um ambiente regulável contido, ou pelo menos até que níveis do antígeno de HPV tenham sido obtidos para consumo ou colheita. [0063] A presente invenção proporciona adicionalmente sistemas para produção de antígeno(s) de HPV em brotos germinados que incluem uma unidade de alojamento com controle de clima e em broto germinado contendo um cassete de expressão que codifica um ou mais antígenos de HPV, no qual expressão é acionada por um promotor constitutivo ou induzível. Os sistemas da invenção podem proporcionar vantagens únicas sobre o ambiente externo ou estufa, que não podem ser controlados. Desse modo, a presente invenção capacita ao cultivador precisar o tempo de indução de expressão do antígeno de HPV. Ele pode também reduzir grandemente o custo de produção de antígeno(s) de HPV.

[0064] Em certos aspectos, brotos transientemente transfectados contêm sequências de vetor viral que codificam um antígeno de HPV da invenção. Os brotos são crescidos por um período de tempo de modo a permitir produção de um ácido nucléico viral no broto, seguido por um período de crescimento no qual cópias múltiplas de vírus são produzidas, resultando, desse modo, na produção de antígeno.

[0065] Em certos aspectos, sementes geneticamente projetadas ou embriões que contêm um transgene que codifica um antígeno de HPV são crescidos ao estágio de broto de semente em um ambiente regulável contido. O ambiente regulável contido pode ser uma unidade de alojamento ou ambiente no qual as sementes podem ser crescidas interiormente. Todos os fatores ambientais do ambiente regulável contido podem ser controlados. Desde que os brotos não requerem luz

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31/83 e iluminação para crescerem, o que pode ser custoso, as sementes geneticamente projetadas ou embriões podem ser crescidas ao estágio de semente germinada em interiores na ausência de luz.

[0066] Outros fatores ambientais que podem ser regulados em um ambiente regulável contido da presente invenção incluem temperatura, umidade, água, nutrientes, gás (por exemplo, teor de O2 ou CO2, ou circulação de ar), químicos (moléculas pequenas, tais como açúcares e derivados de açúcar, ou hormônios, tais como os fitohormônios giberélico ou ácido absísico, etc), e similares.

[0067] De acordo com certos métodos da presente invenção, expressão do transgene que codifica um antígeno de HPV pode ser controlada por um promotor exogenamente induzível. Pro motores exogenamente induzíveis são propensos a aumentar ou diminuir a expressão de um transgene em resposta a um estímulo externo, preferivelmente do que interno. Um número destes fatores ambientais pode agir como indutores para expressão dos transgenes transportados pelos cassetes de expressão dos brotos geneticamente projetados. Os promotores podem ser um promotor induzível de calor, tal como um promotor de choque de calor. Por exemplo, usando-se como um promotor de choque de calor, a temperatura do ambiente contido pode simplesmente ser elevada para induzir expressão do transgene. Outros promotores incluem promotores induzíveis de luz. Os promotores induzíveis de luz podem ser mantidos como promotores constitutivos se a luz no ambiente regulável contido está sempre ligada. Alternativamente ou adicionalmente, a expressão do transgene pode ser ligada em um tempo particular durante desenvolvimento ligando-se simplesmente a luz. O promotor pode ser um promotor quimicamente induzível que é usado para induzir expressão da transgene. De acordo com estas concretizações, o químico pode simplesmente ser enevoado ou pulverizado em uma

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32/83 semente, embrião, ou broto para induzir expressão do transgene. A pulverização e nebulização podem ser precisamente controladas e direcionadas em uma semente particular, embrião, ou broto ao qual é pretendido. O ambiente contido é destituído de vento ou correntes de ar, que podem dispersar o químico para fora a partir do alvo pretendido, de modo que o químico fica no alvo para qual ele foi pretendido.

[0068] De acordo com a presente invenção, o tempo de expressão que é induzido pode ser selecionado para maximizar a expressão de um antígeno de HPV no broto de semente pelo tempo de colheita. A indução de expressão em um embrião em um estágio particular de crescimento (por exemplo, indução de expressão em um embrião em um número particular de dias após germinação, pode resultar em síntese máxima do antígeno de HPV no tempo de colheita). Por exemplo, a indução de expressão a partir do promotor 4 dias após germinação pode resultar em mais síntese de proteína do que indução de expressão a partir do promotor após 3 dias ou após 5 dias. Aqueles versados na técnica apreciarão que a maximização da expressão pode ser alcançada por experimentação de rotina. Em algumas concretizações, os brotos germinados são colhidos em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11 ou 12 dias após germinação.

[0069] Em casos onde o vetor de expressão tem um promotor constitutivo ao invés de um promotor induzível, o broto germinado pode ser colhido em um certo tempo após transformação do broto de semente. Por exemplo, se um broto germinado fosse viralmente transformado em um estágio anterior de desenvolvimento, por exemplo, no estágio de embrião, os brotos germinados podem ser colhidos em um tempo quando expressão está em sua póstransformação máxima, por exemplo, em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias pós-transformação. Pode também ser que

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33/83 brotos se desenvolvam um, dois, três ou mais meses póstransformação, dependendo da germinação da semente.

[0070] Geralmente, uma vez que a expressão do antígeno de HPV se inicia, as sementes, embriões ou brotos germinados são permitidos crescerem até que níveis suficientes de antígeno de HPV sejam expressos. Em certos aspectos, níveis suficientes são níveis que proporcionariam um benefício terapêutico a um paciente se a biomassa colhida fosse material em bruto ingerido. Alternativamente ou adicionalmente, níveis suficientes são níveis dos quais o antígeno de HPV pode ser concentrado ou purificado a partir da biomassa e formulado em uma composição farmacêutica que proporciona um benefício terapêutico a um indivíduo após administração. Tipicamente, o antígeno não é uma proteína expressa no broto germinado na natureza. Em qualquer taxa, o antígeno de HPV é tipicamente expresso em concentrações acima daquela que estaria presente no broto germinado na natureza.

[0071] Uma vez que a expressão do antígeno de HPV é induzida, crescimento é permitido continuar até o estágio de broto germinado, em cujo tempo os brotos germinados são colhidos. Os brotos germinados podem ser colhidos vivos. A colheita de brotos germinados vivos tem várias vantagens, incluindo esforço e quebra mínimos. Os brotos germinados da presente invenção podem ser crescidos hidroponicamente, tornando a colheita uma ação simples de se elevar o broto germinado de sua solução hidropônica. Nenhum solo é requerido para o crescimento dos brotos germinados da invenção, mas pode ser provido se considerado necessário ou desejável pelo versado na técnica. Devido aos brotos serem crescidos sem solo, nenhuma limpeza de material de broto germinado é requerida na hora da colheita. Sendo capaz de colher o broto germinado diretamente de seu ambiente hidropônico sem lavagem ou esfregamento,

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34/83 minimizando-se a quebra do material colhido. A quebra e definhamento de plantas induzem apoptose. Durante apoptose, certas enzimas proteolíticas tornam-se ativas, que podem degradar a proteína farmacêutica expressa no broto germinado, resultando na atividade terapêutica diminuída da proteína. A proteólise induzida por apoptose pode diminuir significantemente a produção de proteína de plantas maduras. Usando-se os métodos da presente invenção, apoptose pode ser evitada quando nenhuma colheita ocorre até o momento das proteínas serem extraídas da planta.

[0072] Por exemplo, brotos vivos podem ser moídos, triturados ou misturados para produzir uma pasta fluida de biomassa de broto germinado, em inibidores de protease contendo tampão. O tampão pode ser mantido a cerca de 4°C. Em alguns aspectos, a biomassa de broto germinado é seca a ar, pulverizada seca, congelada, ou congelada seca. Como em plantas maduras, alguns destes métodos, tais como secagem a ar, podem resultar em uma perda de atividade da proteína farmacêutica. Contudo, devido aos brotos germinados serem muito pequenos e terem uma grande área superficial em razão de volume, isto é muito menos provável de ocorrer. Aqueles versados na técnica apreciarão que muitas técnicas para colheita da biomassa que minimizam a proteólise da proteína expressa são disponíveis, e podem ser aplicadas a presente invenção.

[0073] Em algumas concretizações, os brotos germinados são comestíveis. Em certas concretizações, os brotos germinados que expressam níveis suficientes de antígenos de HPV são consumidos após colheita (por exemplo, após colheita, dentro de um período mínimo em seguida a colheita), de modo que absolutamente nenhum processamento ocorre antes dos brotos de semente serem consumidos. Desse modo, qualquer quebra proteolítica induzida pela colheita do antígeno de HPV antes da administração do antígeno de

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HPV a um paciente em necessidade de tratamento é minimizada. Por exemplo, brotos germinados que estão prontos para serem consumidos podem ser distribuídos diretamente a um paciente. Alternativamente ou adicionalmente, sementes geneticamente projetadas ou embriões são distribuídos a um paciente em necessidade de tratamento e desenvolvidos ao estágio de broto germinado pelo paciente. Em um aspecto, um suprimento de brotos germinados geneticamente projetados é provido a um paciente, ou a um médico que estará tratando os pacientes, de modo que um estoque contínuo de brotos germinados que expressam certos antígenos de HPV pode ser cultivado. Isto pode ser particularmente valioso para populações em países em desenvolvimento, onde farmacêuticos custosos não são oferecidos ou distribuídos. A facilidade com qual os brotos germinados da invenção podem ser crescidos torna os brotos germinados da presente invenção particularmente desejáveis para tal população em desenvolvimento.

[0074] A natureza regulável do ambiente contido concede vantagens para a presente invenção sobre crescimento de plantas no ambiente externo. Em geral, o crescimento de brotos germinados geneticamente projetados que expressa proteínas farmacêuticos em plantas proporciona um produto farmacêutico mais rápido (porque as plantas são colhidas mais jovens) e com menos esforço, risco, e considerações regulatórias do que o desenvolvimento de plantas geneticamente projetadas. O ambiente regulável contido usado na presente invenção reduz ou elimina o risco de plantas de polinização cruzada na natureza.

[0075] Por exemplo, um promotor induzível de calor do mesmo modo não seria usado nos exteriores porque a temperatura no exterior não pode ser controlada. O promotor seria ligado a qualquer hora que a temperatura exterior se elevasse acima de um certo nível.

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Similarmente, o promotor seria desligado toda hora que a temperatura externa caísse. Tais alterações de temperatura podem ocorrer em um único dia, por exemplo, ligando a expressão no dia e desligando a noite. Um promotor induzível de calor, tal como aquele aqui descrito, não seria mesmo prático para uso em uma estufa, que é susceptível a alterações climáticas para quase o mesmo grau conforme os exteriores. O crescimento de plantas geneticamente projetadas em uma estufa é muito custoso. Em contraste, no presente sistema, muita variável pode ser controlada de modo que a quantidade máxima de expressão pode ser alcançada com toda colheita.

[0076] Em certas concretizações, os brotos germinados da presente invenção são crescidos em bandejas que podem ser irrigadas, pulverizadas, ou enevoadas em qualquer tempo durante desenvolvimento do broto germinado. Por exemplo, a bandeja pode ser assentada com um ou mais aparelhos de irrigação, pulverização, nebulização e drenagem que podem distribuir e/ou remover água, nutrientes, químicos, etc., no tempo específico, e em quantidades precisas durante desenvolvimento do broto germinado. Por exemplo, as sementes requerem umidade suficiente para mantê-las úmidas. A umidade em excesso drena através de furos nas bandejas nos drenos no solo do ambiente. Tipicamente, a água de drenagem é tratada conforme apropriado para remoção de químicos nocivos antes da descarga de volta no ambiente.

[0077] Outra vantagem de bandejas é que elas podem estar contidas dentro de um espaço muito pequeno. Desde que nenhuma luz seja requerida para os brotos germinados crescerem, as bandejas contendo sementes, embriões ou brotos germinados podem ser apertadamente empilhadas verticalmente uma sobre a outra, proporcionando uma grande quantidade de biomassa por unidade de espaço de solo em uma facilidade de alojamento construída

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37/83 especificamente para esta proposta. Em adição, as pilhas de bandejas podem ser dispostas em séries horizontais dentro de uma unidade de alojamento. Uma vez que os brotos tenham crescido a um estágio apropriado para colheita (cerca de dois a quatorze dias), as bandejas de broto individuais são movidas em uma facilidade de processamento, ou manualmente, ou por meios automáticos, tal como uma correia transportadora.

[0078] O sistema da presente invenção é único em que ele proporciona uma biomassa de broto germinado que é uma fonte de um antígeno de HPV. Se diretamente consumida ou processada na forma de uma composição farmacêutica, porque os brotos germinados são crescidos em um ambiente regulável contido, a biomassa de broto germinado e/ou composição farmacêutica derivada a partir da biomassa podem ser providas a um consumidor em baixo custo. Em adição, o fato que as condições para crescimento dos brotos germinados podem ser controladas torna a qualidade e pureza do produto consistentes. O ambiente regulável contido da invenção também torna óbvio muitas regulações seguras da EPA que pode impedir cientistas de desenvolverem produtos agriculturais geneticamente projetados ao ar livre.

Brotos Transformados [0079] Uma variedade de métodos pode ser usada para transformar células de planta e produzir brotos germinados geneticamente projetados. Dois métodos disponíveis para a transformação de plantas que requerem que linhagens de células transgênicas sejam geradas in vitro, seguido por regeneração das linhagens de célula nas plantas totais, incluem transferência de gene mediada por Agrobacterium tumefaciens e bombardeio de microprojétil, ou eletroporação. A transformação viral é um método mais rápido e menos custoso de transformação de embriões e brotos

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38/83 germinados que podem ser colhidos sem um retardo experimental ou geracional antes da obtenção do produto desejado. Para qualquer destas técnicas, o versado na técnica apreciaria como ajustar e otimizar os protocolos de transformação que foram usados tradicionalmente para plantas, sementes, embriões, ou brotos germinados.

Cassetes de Expressão de Transformação de Agrobacterium [0080] Agrobacterium é um gênero representativo da família gramnegativa Rhizobiaceae. Esta espécie é responsável por tumores de planta, tais como doença de bile de coroa e raiz com pelo. Em tecido de planta dediferenciado, que é característico de tumores, derivados de aminoácido conhecidos como opines são produzidos pelo Agrobacterium e catabolizados pela planta. Os genes bacterianos responsáveis pela expressão de opines são uma fonte conveniente de elementos de controle para cassetes de expressão quiméricos. De acordo com a presente invenção, o sistema de transformação de Agrobacterium pode ser usado para gerar brotos germinados comestíveis, que são meramente colhidos antes das plantas amadurecerem. Os métodos de transformação de Agrobacterium podem facilmente ser aplicados para regenerar brotos germinados que expressam antígenos de HPV.

[0081] Em geral, a transformação das plantas envolve a transformação de células de planta crescidas em cultura de tecido por co-cultivo com um Agrobacterium tumefaciens conduzindo uma planta/vetor bacteriano. O vetor contém um gene que codifica um antígeno de HPV. O Agrobacterium transfere o vetor para a célula hospedeira da planta e é, em seguida, eliminado usando tratamento antibiótico. As células de planta transformadas que expressam o antígeno de HPV são selecionadas, diferenciadas, e, finalmente, regeneradas em plântulas completas (Hellen et al., 2000, Plant Mol).

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Biol., 42:819; Pilon-Smits et al., Plant Physiolog. 119(1):123; Barfield et al., 1991, Plant Cell Reports, 10:308; e Riva et al., J. Biotechnology 1(3); cada um do qual é incorporado aqui por referência.

[0082] Vetores de expressão para uso na presente invenção incluem um gene (ou cassete de expressão) que codifica um antígeno de HPV designado para operação em plantas, com sequências companheiras a montante e a jusante do cassete de expressão. As sequências companheiras são geralmente de plasmídeo ou de origem viral, e proporcionam características necessárias ao vetor para transferir DNA da bactéria ao hospedeiro de planta desejado.

[0083] A construção básica bacteriana/vetor de planta pode desejavelmente proporcionar uma faixa ampla de hospedeiro com origem de replicação de procarioto, um marcador selecionável de procarioto. Marcadores selecionáveis procarióticos adequados incluem resistência a antibióticos, tais como ampicilina ou tetraciclina. Outras sequências de DNA que codificam funções adicionais que são bemconhecidas podem também estar presentes no vetor.

[0084] Sequências de Agrobacterium T-DNA são requeridas para transferência mediada por Agrobacterium de DNA para o cromossomo da planta. Os genes de indução de tumor do T-DNA são tipicamente removidos e substituídos com sequências que codificam o antígeno de HPV. As sequências de limite de T-DNA são retidas porque elas iniciam a integração da região de T-DNA no genoma da planta. Se expressão do antígeno de HPV não é prontamente acessível para detecção, a construção bacteriana/de vetor de planta pode também incluir um gene marcador selecionável para determinação se uma célula de planta foi transformada, por exemplo, o gene de resistência nptII para karamicina. No mesmo ou diferente vetor bacteriana/de planta (plasmídeo Ti) são sequências Ti. Sequências Ti incluem os genes de virulência, que codificam um conjunto de proteínas

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40/83 responsáveis pela excisão, transferência e integração do T-DNA no genoma da planta (Caiu, 1987, Caiense, 237:1176). Outras sequências adequadas para permissão de integração da sequência heteróloga no genoma da planta podem incluir sequências de transposon, e similares, para recombinação homóloga.

[0085] Certas construções incluirão o cassete de expressão que codifica uma proteína antígeno. Um, dois ou mais cassetes de expressão podem ser usados em uma dada transformação. O cassete de expressão recombinante contém, em adição à sequência que codifica antígeno de HPV, pelo menos os seguintes elementos: uma região de promotor, sequências não-traduzidas 5' de planta, códon de iniciação (dependendo se ou não o gene expresso tem seu reconhecimento), e sequências de terminação de transcrição e terminação. Em adição, terminadores de transcrição e translação podem ser incluídos nos cassetes de expressão ou genes quiméricos da presente invenção. Sequências de secreção de sinal que permitem processamento e translocação da proteína, conforme apropriado, podem também ser incluídas no cassete de expressão. Uma variedade de promotores, sequências de sinal, e terminadores de transcrição e translação são descritos (ver, por exemplo, Lawton et al., 1987, Plant Mol). Biol 9:315; e Patente dos Estados Unidos N° 5.888.789, incorporados aqui por referência. Em adição, genes estruturais para resistência a antibiótico são comumente utilizados como um fator de seleção (Fraley et al., 1983, Proc). Natl. Acad. Sci., USA 80:4803, aqui incorporado por referência. Locais de enzima de restrição únicos nas extremidades 5' e 3' do cassete permitem fácil inserção em um vetor pré-existente. Outros sistemas de vetor binário para transformação mediada por Agrobacterium, conduzindo pelo menos uma sequência limite de T-DNA, são descritos em PCT/EP99/07414, incorporado aqui por referência.

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Regeneração [0086] Sementes de plantas transformadas podem ser colhidas, secas, limpas e testadas para viabilidade e para a presença e expressão de um produto de gene desejado. Uma vez que este tenha sido determinado, estoque de semente é tipicamente armazenado sob condições apropriadas de temperatura, umidade, saneamento e segurança a serem usadas quando necessário. As plantas totais podem então ser regeneradas de protoplastos cultivados (ver, por exemplo, Evans et al., Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMillan Publishing Co). New York, 1983; e Vasil I. R. (ed.), Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol. I, 1984, e Vol. III, 1986, incorporados aqui por referência. Em certos aspectos, as plantas são regeneradas somente ao estágio de broto germinado. Em alguns aspectos, as plantas totais são regeneradas para produzir estoques de semente, e brotos germinados são geradas a partir das sementes do estoque de semente.

[0087] T odas as plantas das quais protoplastos podem ser isolados e cultivados para dar plantas totais regeneradas podem ser transformadas pela presente invenção de modo que as plantas totais são recuperadas, que contêm o gene transferido. É sabido que praticamente todas as plantas podem ser regeneradas a partir das células de cultura ou tecidos, incluindo, mas não limitadas a todas as espécies maiores de plantas que produzem brotos comestíveis. Algumas plantas adequadas incluem alfafa, feijão mungo, rabanete, trigo, mostarda, espinafre, cenoura, beterraba, cebola, alho, aipo, ruibarbo, uma planta folhosa, tais como repolho ou alface, agrião, ervas, tais como salsa, hortelã, ou trevos, couve-flor, brócolis, soja, lentilhas, flores comestíveis, tal como girassol, etc.

[0088] Os meios para regeneração variam de uma espécie de plantas para a próxima. Contudo, aqueles versados na técnica

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42/83 apreciarão que geralmente uma suspensão de protoplantas transformadas contendo cópias do gene heterólogo é primeiro provida. Tecido de calo é formado, e brotos podem ser induzidos de calo e, subsequentemente, arraigados. Alternativamente ou adicionalmente, formação de embrião pode ser induzida a partir da suspensão de protoplastos. Estes embriões germinam como embriões naturais para formar plantas. O afundamento da semente na água, ou a pulverização da semente com água para aumentar o teor de umidade da semente para entre 35-45%, inicia a germinação. Para a germinação proceder, as sementes são tipicamente mantidas em ar saturado com água sob condições de temperatura controlada e fluxo de ar. O meio de cultura geralmente conterá vários aminoácidos e hormônios, tais como auxina e citocininas. É também vantajoso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmente para espécies, tal como alfafa. Brotos e raízes normalmente se desenvolvem simultaneamente. A regeneração eficiente dependerá do meio, do genótipo, e da história da cultura. Se estas três variáveis são controladas, então a regeneração é totalmente reproduzível e repetível.

[0089] As plantas maduras, crescidas a partir de células de planta transformadas, são plantas transgênicas homozigóticas de auto e nãosegregação, são identificadas. Uma planta Uma planta congênita produz sementes contendo as sequências que codificam o antígeno da invenção. Tais sementes podem ser germinadas e crescidas ao estágio de broto germinado para produzir o(s) antígeno(s) de HPV de acordo com a presente invenção.

[0090] Em concretizações relacionadas, sementes da presente invenção podem ser formadas em produtos de semente, e vendidas com instruções de como desenvolver brotos para o estágio de broto germinado apropriado para administração ou colheita em uma

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43/83 composição farmacêutica. Em algumas concretizações relacionadas, híbridos ou novas variedades concretizando os traços desejados podem ser desenvolvidos de plantas congênitas da invenção. Integração Direta [0091] Integração direta de fragmentos de DNA no genoma de células de planta por bombardeio de microprojétil ou eletroporação pode também ser usada na presente invenção (ver, por exemplo, Kikkert et al., 1999, Plant: J. Tissue Cult. Assoc., 35:43; e Bates, 1994, Mol. Biotech., 2:135). Mais particularmente, vetores que expressam antígenos de HPV da presente invenção podem ser introduzidos nas células de planta por uma variedade de técnicas. Conforme descrito acima, os vetores podem incluir marcadores selecionáveis para uso em células de planta. Os vetores podem incluir sequências que permitem sua seleção e propagação em um hospedeiro secundário, tais como sequências contendo uma origem de replicação e marcador selecionável. Tipicamente, hospedeiros secundários incluem bactéria e levedura. Em uma concretização, o hospedeiro secundário é bactéria (por exemplo, Escherichia coli, a origem de replicação é uma origem tipo ColE1 de replicação), e o marcador selecionável é um gene que codifica resistência a ampicilina. Tais sequências são bem-conhecidas na técnica, e são comercialmente disponíveis (por exemplo, Clontech, Palo Alto, CA ou Stratagene, La Jolla, CA).

[0092] Os vetores da presente invenção podem também ser modificados em plasmídeos de transformação de planta intermediários que contêm uma região de homologia a um vetor de Agrobacterium tumefaciens, uma região limite de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, e ácidos nucléicos que codificam antígeno ou cassetes de expressão descritos acima. Vetores adicionais podem incluir um tumor de planta desarmado incluindo plasmídeo de Agrobacterium tumefaciens.

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44/83 [0093] De acordo com esta concretização, transformação direta dos vetores da invenção envolve microinjeção dos vetores diretamente nas células da planta pelo uso de micropipetas para transferir mecanicamente o DNA recombinante (ver, por exemplo, 1985, Mol. Gen. Genet., 202:179, incorporado aqui por referência). O material genético pode também ser transferido na célula da planta pelo uso de polietileno glicóis (ver, por exemplo, Krens et al., 1982, Nature 296:72). Outro método de introdução de ácidos nucléicos em plantas via penetração balística de alta velocidade por partículas pequenas com um ácido nucléico, ou dentro da matriz de gotas pequenas, ou partículas, ou na superfície (ver, por exemplo, Klein et al., 1987,

Nature 327:70; Knudsen et al, 1991, Planta 185:330). Ainda outro método de introdução é fusão de protoplastos com outras entidades, ou minicélulas, células, lisossomos, ou outros corpos de superfície de lipídeo fusíveis (ver, por exemplo, Fraley et al., 1982, Proc). Natl.

Acad. Sci. USA (1859). Vetores da invenção podem também serem introduzidos nas células da planta por eletroporação (ver, por exemplo, Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5824). De acordo com esta técnica, protoplastos de planta são eletroporados na presença de plasmídeos contendo uma construção de gene. Impulsos elétricos de reversibilidade de resistência de campo alta permeabilizam biomembranas permitindo a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos de planta eletroporados reformam a célula, dividem a parede, e formam calo da planta, que podem ser regenerados para formar brotos germinados da invenção. Aqueles versados na técnica apreciarão como utilizar estes métodos para transformar células de planta que podem ser usadas para gerar brotos germinados comestíveis.

Transformação Viral [0094] Similares a sistemas de expressão convencionais, vetores

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45/83 de vírus de planta podem ser usados para produzir proteína de comprimento total, incluindo antígeno de comprimento total. De acordo com a presente invenção, os vetores de vírus de planta podem ser usados para infectar e produzir antígeno(s) em sementes, embriões, brotos germinados, etc, sistemas virais que podem ser usados para expressar tudo de peptídeos curtos a proteínas complexas grandes. Especificamente, o uso de vetores de tobamovírus é descrito (ver, por exemplo, McCormick et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:703; Kumagai et al., 2000, Gene , 245:169; e Verch et al., 1998, J. Immunol. Methods 220:69; cada um do qual incorporado aqui por referência). Desse modo, vetores virais de planta têm uma capacidade demonstrada de expressar peptídeos curtos, bem como proteínas complexas grandes.

[0095] Em certas concretizações, brotos germinados que expressam antígeno de HPV são gerados utilizando um sistema de hospedeiro/vírus. Os brotos transgênicos produzidos por infecção viral proporcionam uma fonte de proteína transgênica que já foi demonstrado ser segura. Por exemplo, os brotos são livres de contaminação com patogenias animais. Diferentemente, por exemplo, tabaco, proteínas de um broto comestível podiam pelo menos na teoria ser usadas em aplicações orais sem purificação, reduzindo, desse modo, significantemente, os custos. Em adição, um sistema de vírus/broto oferece uma via muito mais simples, menos custosa para escala e fabricação, visto que transgenes são introduzidos no vírus, que pode ser desenvolvido a uma escala comercial dentro de uns poucos dias. Em contraste, plantas transgênicas podem requerer até 5-7 anos antes que sementes ou material de planta suficientes estejam disponíveis para ensaios de grande escala ou comercialização.

[0096] De acordo com a presente invenção, os vírus de RNA de planta têm certas vantagens, enquanto os tornam atrativos como

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46/83 vetores para expressão de proteína estranha. A biologia e patologia molecular de um número de vírus de RNA de planta são bem caracterizadas, e existe conhecimento considerável de biologia, genéticas e sequência regulatória de vírus. Muitos vírus de RNA de planta têm genomas pequenos, e clones de cDNA infecciosos são disponíveis para facilitar manipulação genética. Uma vez que o material de vírus infeccioso entra na célula hospedeira susceptível, ele replica a altos níveis e se espalha rapidamente através de um broto germinado total (um a dez dias pós-inoculação). As partículas de vírus são facilmente e economicamente recuperadas de tecido de broto germinado infectado. Os vírus têm uma faixa ampla de hospedeiro, capacitando o uso de uma construção simples para infecção de várias espécies susceptíveis. Estas características são prontamente transferíveis para os brotos.

[0097] Sequências exógenas podem ser expressas de vírus de RNA de planta, tipicamente pela substituição de um dos genes virais com sequência desejada, pela inserção de sequências exógenas no genoma do vírus em uma posição apropriada, ou pela fusão de peptídeos estranhos às proteínas estruturais de um vírus. Além disso, quaisquer destas aproximações podem ser combinadas para expressarem sequências exógenas por transcomplementação de funções vitais de um vírus. Um número de estratégias diferentes existe como ferramentas para expressar sequências exógenas nas plantas infectadas por vírus usando vírus de mosaico de tabaco (TMV), vírus de mosaico de alfafa (AlMV), e quimeras destes.

[0098] O genoma de AlMV é um representante da família Bromoviridae de vírus, e consiste em três RNAs genômicos (RNAs1-3) e RNA sub-genômico (RNA4). Os RNAs genômicos 1 e 2 codificam proteínas replicases de vírus P1 e P2, respectivamente. O RNA3 genômico codifica a proteína de movimento de célula a célula P3 e a

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47/83 proteína de revestimento (CP). A CP é tranduzida a partir do RNA4 subgenômico, que é sintetizado de RNA3 genômico, e é requerido para iniciar a infecção. Estudos têm demonstrado o envolvimento da CP em funções múltiplas, incluindo ativação de genoma, replicação, estabilidade de RNA, formação de sintoma, e encapsidação de RNA (ver, por exemplo, Bol et al., 1971, Virology (1971) 46:73; Van Der Vossen et al., 1994, Virology 202:891; Yusibov et al., Virology 208:405; Yusibov et al., 1998, Virology 242:1; Bol et al., (Review, 100 refs.), 1999, J. Gen. Virol., 80:1089; De Graaff, 1995, Virology 208:583;

Jaspars et al., Adv. Vírus Res 19:37; Loesch-Fries, 1985, Virology 146: 177; Neeleman et al., 1991, Virology 181:687; Neeleman et al., 1993, Virology, 196:883; Van Der Kuyl et al., 1991, Virology 183:731; Van Der Kuyl et al., 1991, Virology, 185:496).

[0099] A encapsidação de partículas virais é tipicamente requerida para movimento de longa distância de vírus de partes inoculadas a não-inoculadas da semente, embrião, ou broto germinado, e para infecção sistêmica. De acordo com a presente invenção, inoculação pode ocorrer em qualquer estágio de desenvolvimento de planta. Em embriões e brotos, a difusão do vírus inoculado deve ser muito rápida. Vírions de AlMV são encapsidados por uma CP única (24 kD), formando mais do que um tipo de partícula. O tamanho (30 a 60 mm de comprimento e 18 nm de diâmetro) e forma (esférica, elipsoidal, ou baciliforme) de uma partícula dependem do tamanho do RNA encapsidado. Após montagem, o N-terminal da CP de AlMV é para estar localizada na superfície das partículas de vírus, e não parece interferir com a montagem do vírus (Bol et al., 1971, Virology 6:73). Adicionalmente, a CP de AlMV com um adicional de 38 peptídeo aminoácidos em seu N-terminal forma partículas in vitro e retém atividade biológica (Yusibov et al., 1995, J. Gen. Virol., 77:567).

[00100] O AlMV tem uma faixa de hospedeiro ampla, que inclui um

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48/83 número de plantas de colheita agriculturalmente valiosas, incluindo sementes de planta, embriões, e brotos. Juntas, estas características tornam a CP de AlMV um excelente candidato como uma molécula transportadora e AlMV um vetor candidato atrativo para a expressão de sequências exógenas para a expressão de sequências exógenas na planta no estágio de broto de desenvolvimento. Além disso, após expressão de um vetor heterólogo, tal como TMV, a CP de AlMV encapsida o genoma de TMV sem interferir com a infectividade do vírus (Yusibov et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:5784, incorporado aqui por referência). Isto permite o uso de TMV como um vírus veículo para CP de AlMV fusionada às sequências exógenas.

[00101] TMV, o protótipo do tobamovírus, tem um genoma consistindo em um RNA de fita simples senso positivo encapsidado com uma CP de 17,0 kD, que resulta em partículas em forma de bastão (300 nm de comprimento). A CP é a única proteína estrutural do TMV, e é requerida para encapsidação e movimento de longa distância do vírus em um hospedeiro infectado (Saito et al., 1990, Virology 176:329). As 183 e 128 kD de proteínas são traduzidas de RNA genômico, e são requeridas para replicação de vírus (Ishikawa et al., 1986, Nucleic Acids Res., 14:8291). A proteína de 30 kD é a proteína de movimento de célula a célula de vírus (Meshi et al., 1987, EMBO J. 6:2557). As proteínas de movimento e de revestimento são traduzidas de RNAs sub-genômicos (Hunter et al., 1976, Nature 260:759; Bruening et al., 1976, Virology 71:498; e Beachy et al., 1976, Virology 73:498; cada um do qual sendo incorporado aqui por referência).

[00102] Outros métodos de transformação de tecidos de planta incluem transformação da flor de uma planta. A transformação de Arabidopsis thaliana pode ser alcançada pela imersão das flores da planta em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (Curtis et al.,

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2001, Transgenic Res., 10:363; e Qing et al., Molecular Breeding: New Strategies in Plant Improvement, 1:67). Plantas transformadas são formadas na população de sementes geradas pelas plantas imersas. Em um ponto específico durante desenvolvimento da flor, um poro existe na parede do ovário através da qual Agrobacterium tumefaciens ganha acesso ao interior do ovário. Uma vez no interior do ovário, o Agrobacterium tumefaciens prolifera e transforma os óvulos individuais (Desfeux et al., 2000, Plant Physiology, 123:895). Os óvulos transformados seguem a trajetória típica de formação de semente no interior do ovário.

Produção e Isolamento de Antígeno [00103] Em geral, métodos padrão conhecidos na técnica podem ser usados para cultura ou crescimento de plantas, células de planta, e/ou tecidos de planta da invenção (por exemplo, plantas clonais, células de planta clonais, raízes clonais, linhagens de raiz clonais, brotos, brotos germinados, plantas, etc.), para produção de antígeno(s). Uma ampla variedade de meio de cultura e biorreatores foram empregados para cultura de células de raiz com pelos, linhagens de célula de raiz e células de planta (ver, por exemplo, Giri et al., 2000, Biotecnolol. Adv., 18:1; Rao et al., 2002, Biotechnol. Adv., 20:101; e referências em ambos dos precedentes, todos dos quais sendo aqui incorporados por referência). Plantas clonais podem ser crescidas em qualquer maneira adequada.

[00104] Em certas concretizações, os antígenos de HPV da invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido. Em algumas concretizações, um antígeno de HPV é expresso em uma planta ou porção desta. As proteínas são isoladas e purificadas de acordo com condições e técnicas convencionais conhecidas na técnica. Estas incluem métodos, tais como extração, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, eletroforese e similares. A

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50/83 presente invenção envolve a purificação e escala alcançável de produção de antígeno(s) de HPV usando qualquer de uma variedade de sistemas de expressão de planta conhecido na técnica e providos aqui, incluindo sistemas de expressão de planta virais aqui descritos. [00105] Em muitas concretizações da presente invenção, será desejável isolar produtos de antígeno de vacina. Onde uma proteína da invenção é produzida de tecido(s) de planta ou uma porção deste(s), por exemplo, raízes, células de raiz, plantas, células de planta que as expressam, métodos descritos em detalhes adicionais aqui, ou quaisquer métodos aplicáveis conhecidos na técnica, podem ser usados para qualquer de um isolamento parcial ou completo de material de planta. Onde é desejável isolar um produto de expressão de alguma ou toda de células de planta ou tecidos que a expressam, quaisquer técnicas de purificação disponíveis podem ser empregadas. Aqueles versados na técnica são familiares com uma faixa ampla de procedimentos de fracionamento e separação (ver), por exemplo, Scopes et al., Protein Purification: Principle and Practice, 3^a Edição, Janson et al., 1993; Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Wiley-VCH, 1998; Springer-Verlag, NY, 1993; e Roe, Protein Purification Techniques, Oxford University Press, 2001, cada um do qual sendo aqui incorporado por referência. Frequentemente, será desejável produzir um produto mais do que 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% puro. Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos 6.740.740 e 6.841.659 para discussão de certos métodos úteis para purificação de substâncias de tecidos ou fluidos de planta.

[00106] Aqueles versados na técnica também apreciarão que um método de obtenção de produtos de vacina desejado é por extração. O material de planta (por exemplo, raízes, folhas, etc) pode ser extraído para remover produtos desejados de biomassa residual, aumentando,

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51/83 desse modo, a concentração e pureza de um produto. As plantas podem ser extraídas em uma solução tampão. Por exemplo, o material de planta pode ser transferido em uma quantidade de água gelada a uma razão de um para um por peso, que foi tamponada com, por exemplo, tampão de fosfato. Inibidores de protease podem ser adicionados conforme requerido. O material de planta pode ser rompido por mistura ou moagem vigorosas enquanto suspenso na solução tampão, e a biomassa extraída removida por filtração ou centrifugação. O produto transportado na solução pode adicionalmente ser purificado por etapas adicionais, ou convertido a um pó seco por congelamento-secagem ou precipitação. A extração pode ser efetuada por prensagem. As plantas ou raízes podem ser extraídas por prensagem em uma prensa, ou moídas a medida que elas passam através de rolos proximamente espaçados. Os fluidos expressos a partir das plantas ou raízes moídas são coletados e processados de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica. A extração por prensagem permite a liberação de produtos em uma forma mais concentrada. Contudo, o rendimento total do produto pode ser mais baixo do que se um produto fosse extraído em solução.

Vacina [00107] A presente invenção proporciona proteínas de antígeno farmacêuticas para uso terapêutico, tal como proteína(s) de antígeno, ou porção(ões) imunogênica(s) desta(s) ativa(s) como uma vacina para tratamento terapêutico e/ou profilático de infecção por HPV. Adicionalmente, a invenção proporciona uso veterinário, visto que proteína antígeno ou porção imunogênica desta é ativa em aplicações veterinárias. Em certas concretizações, antígeno(s) pode(m) ser produzido(s) por planta(s) ou porção desta(s) (por exemplo, raiz, célula, broto, linhagem de célula, planta, etc.) da invenção. Em certas concretizações, os antígenos de HPV são expressos em plantas,

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52/83 células de planta, e/ou tecidos de planta (por exemplo, brotos, brotos germinados, raízes, cultura de célula, células clonais, linhagens de célula clonais, plantas clonais, etc.), e podem ser usados diretamente de uma planta, ou parcialmente purificados ou purificados na preparação para administração farmacêutica a um indivíduo.

[00108] A presente invenção proporciona plantas, células de planta, e tecidos de planta que expressam antígeno(s) que mantêm atividade farmacêutica quando administrados a um indivíduo em necessidade deste. Em certas concretizações, os indivíduos incluem vertebrados, (por exemplo, mamíferos, tais como humanos). De acordo com a presente invenção, os indivíduos incluem indivíduos veterinários, tais como bovinos, ovinos, caninos, felinos, etc. Em certos aspectos, uma planta comestível ou porção desta (por exemplo, broto, raiz) é administrada oralmente a um indivíduo em uma quantidade terapeuticamente eficaz. Em alguns aspectos, um ou mais antígeno(s) de HPV é (são) provido(s) em uma preparação farmacêutica, conforme descrito aqui.

[00109] As composições de vacina da invenção compreendem um ou mais antígenos de HPV. Em certas concretizações, pelo menos dois antígenos de HPV da invenção são incluídos em uma composição de vacina administrada.

[00110] De acordo com a presente invenção, o tratamento de um indivíduo com um antígeno de vacina é pretendido para induzir um efeito fisiológico. Uma proteína de vacina pode ter propriedades curativas ou paliativas contra uma enfermidade ou doença, e pode ser administrada para aliviar melhora, aliviar, retardar começo de reverso, ou diminuir sintomas ou severidade de uma doença ou enfermidade. Um antígeno de vacina pode ter propriedades profiláticas, e pode ser usado para impedir ou retardar começo de uma doença, ou diminuir a severidade de tal doença, enfermidade, ou condição patológica

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53/83 quando ela aparece. Um efeito fisiológico induzido pelo tratamento de um indivíduo com antígeno de acordo com a presente invenção pode incluir uma resposta imune eficaz tal que infecção por um organismo é impedida.

[00111] Em algumas concretizações, as vacinas da invenção são distribuídas por vias orais e/ou pelas mucosas. A administração oral e/ou pela mucosa tem o potencial de impedir a infecção de tecidos de mucosas, a abertura principal de infecção para muitas patogenias. A distribuição oral e/ou pela mucosa pode iniciar resposta imune sistêmica. Tem sido progresso considerável no desenvolvimento de sistemas de expressão heterólogos para a administração oral de antígenos que estimulam o sistema imune de mucosa, e pode iniciar imunidade sistêmica. Esforços prévios na distribuição de vacina oral, contudo, têm demonstrado um requerimento de quantidades consideráveis de antígeno em alcançar eficiência. Desse modo, a produção econômica de grandes quantidades de antígenos-alvos é um pré-requisito para a criação de vacinas orais eficazes. O desenvolvimento de plantas que expressam antígenos, incluindo antígenos termoestáveis, representa uma aproximação mais realísticas a tais dificuldades.

[00112] As preparações farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas em uma ampla variedade de modos ao indivíduo, tais como, por exemplo, oralmente, enteralmente, nasalmente, parenteralmente, intramuscularmente ou intravenosamente, retalmente, vaginalmente, topicamente, ocularmente, pulmonarmente, ou por aplicação de contato. Em certas concretizações, um antígeno de HPV expresso em uma planta ou porção desta é administrado a um indivíduo oralmente por administração direta da planta ao indivíduo. Em alguns aspectos, uma proteína de vacina expressa em uma planta ou porção desta é extraída e/ou purificada, e usada para a preparação

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54/83 de uma composição farmacêutica. Pode ser desejável formular tais produtos isolados para seu uso pretendido (por exemplo, como um agente farmacêutico, composição de vacina, etc.). Em algumas concretizações, será desejável formular os produtos junto com alguns ou todos dos tecidos de planta que os expressam.

[00113] Onde é desejável formular o produto junto com o material de planta, será frequentemente desejável ter uma planta que seja não tóxica ao recipiente relevante (por exemplo, um humano ou outro animal). Tecido de planta relevante (por exemplo, células, raízes, folhas) pode simplesmente ser colhido e processado de acordo com técnicas conhecidas na técnica, com devida consideração para manter atividade do produto expresso. Em certas concretizações da invenção, é desejável ter expressado o antígeno de vacina em uma planta comestível (e, especificamente, em porções comestíveis da planta), de modo que o material pode ser subsequentemente comido. Por exemplo, onde o antígeno de vacina é ativo após distribuição oral (quando corretamente formulado), pode ser desejável produzir a proteína antígeno em uma porção de planta comestível, e para formular o antígeno de vacina expresso para distribuição oral junto com o algum ou todo do material de planta com o qual a proteína foi expressa.

[00114] Os antígenos de vacina providos podem ser formulados de acordo com técnicas conhecidas. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um produto de vacina pode ser formulada junto com um ou mais materiais transportadores farmaceuticamente adequados, orgânicos ou inorgânicos, líquido ou sólido. Um antígeno de vacina produzido de acordo com a presente invenção pode ser empregado em formas de dosagem tais como comprimidos, cápsulas, pastilhas, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas, cremes, unguentos, aerosóis, pacotes de pó, soluções líquidas, solventes, diluentes, agentes ativos

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55/83 de superfície, agentes isotônicos, agentes de espessamento ou emulsificante, preservativos, e ligações sólidas, considerando-se que a atividade biológica da proteína não seja destruída por tal forma de dosagem.

[00115] Em geral, as composições podem compreender qualquer de uma variedade de transportador(es) farmaceuticamente aceitável(eis) diferente(s), adjuvante(s), ou veículo(s), ou uma combinação de um ou mais tal(is) transportador(es), adjuvante(s), ou veículo(s). Conforme aqui usado, a linguagem veículo farmaceuticamente aceitável, adjuvante ou veículo inclui solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos ou antifúngicos, agentes de absorção e retardamento, e similares, compatíveis com administração farmacêutica. Os materiais que podem servir como transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, amidos, tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como carboximetil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte, gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de supositório; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleo de girassol; óleo de gergelim; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de soja; glicóis, tal como propileno glicol; ésteres, tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico, e soluções tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes não-tóxicos, tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes colorantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes de adoçamento, agentes aromatizantes, e agentes perfumantes, conservantes, e antioxidantes, podem estar presentes na composição,

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56/83 de acordo com o julgamento do formulador (ver também Remington’s Pharmaceutical Sciences, Décima Quinta Edição, E. W. martin (Mack Publishing Co., Easton PA, 1975)). Por exemplo, o produto de antígeno de vacina pode ser provido como uma composição farmacêutica por meio de processos convencionais de produção de granulação por mistura, dissolução, liofilização, ou processos similares.

Componentes adicionais de vacina [00116] As vacinas da invenção podem incluir adicionalmente qualquer adjuvante adequado para aumentar a imunogenicidade da vacina quando administrada a um indivíduo. Por exemplo, tal(is) adjuvante(s) pode(m) incluir, sem limitação, extratos de Quillaja saponaria (QS), incluindo sub-frações purificadas de grau de alimentação QS, tais como Quil A e QS-21, alume, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, MF59, Malp2, adjuvante de Freund incompleto; adjuvante de Freund completo; lipídeo A 3 De-Omonofosforil acilatado (3D-MPL). Adjuvantes adicionais podem incluir oligonucleotídeos imunomodulatórios, por exemplo, sequência CpG não-metilatada conforme descrita em WO 96/02555. Combinações de adjuvantes diferentes, tais como aquelas mencionadas aqui acima, são contempladas como proporcionando um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta de célula TH1. Por exemplo, QS21 pode ser formulado junto com 3D-MPL. A razão de QS21:3DMPL será tipicamente na ordem de 1:10 a 10:1; 1:5 a 5:1; e frequentemente substancialmente 1:1. Em algumas concretizações, a faixa de energia ótima é 2,5:1 a 1:1 3D-MPL:QS21. Doses de extratos de QS purificados para uso em uma formulação de vacina humana são de 0,01 mg a 10 mg por quilograma de peso corpóreo.

[00117] Deve ser notado que certas proteínas termoestáveis (por exemplo, lichenase) podem demonstrar atividade de potencialização

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57/83 da resposta imune, tal que o uso de tal proteína se em uma fusão com um antígeno de HPV ou separadamente pode ser uso considerado de um adjuvante. Desse modo, as composições de vacina da invenção podem adicionalmente compreender um ou mais adjuvantes. Certas composições de vacina podem compreender dois ou mais adjuvantes. Além disso, dependendo da formulação e vias de administração, certos adjuvantes podem ser desejados em formulações e/ou combinações particulares.

[00118] Em certas situações, pode ser desejável prolongar o efeito de uma vacina da invenção pelo abaixamento da absorção de um ou mais componentes do produto de vacina (por exemplo, proteína) que é subcutaneamente ou intramuscularmente injetada. Isto pode ser efetuado pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com solubilidade pobre em água. A taxa de absorção do produto então depende de sua taxa de dissolução, que, por sua vez, pode depender do tamanho e forma. Alternativamente ou adicionalmente, absorção retardada de um produto parenteralmente administrado por dissolução ou suspensão do produto em um veículo de óleo. Formas de depósito injetáveis são produzidas pela formação de matrizes de microcápsulas da proteína em polímeros biodegradáveis, tais como polilactide-poliglicolide. Dependendo da razão de produto para polímero e da natureza do polímero particular empregada, a taxa de liberação pode ser controlada. Exemplos de polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações injetáveis de depósito podem ser preparadas por encerramento do produto em lipossomas ou microemulsões, que são compatíveis com os tecidos do corpo. Veículos de distribuição poliméricos alternativos podem ser usados para formulações orais. Por exemplo, polímeros biocompatíveis biodegradáveis, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres

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58/83 e ácido poliláctico, etc., podem ser formulados como micropartículas, por exemplo, em combinação com um veículo de distribuição polimérico.

[00119] Preparações enteralmente administradas de antígenos de vacina podem ser introduzidas na forma sólida, semi-sólida, de suspensão e de emulsão, e podem ser compostas com quaisquer transportadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como água, agentes de suspensão, e agentes emulsificantes. Os antígenos podem ser administrados por meio de bombas ou formas de liberação sustentada, especialmente quando administrados como uma medida preventiva, de modo a prevenir o desenvolvimento de doença em um indivíduo, ou para melhorar ou retardar doença estabelecida. Compostos ativos suplementares, por exemplo, compostos independentemente ativos contra a doença ou condição clínica a ser tratada, ou compostos que aumentam a atividade de um composto da invenção, podem ser incorporados em ou administrados com as composições. Agentes aromatizantes e colorantes podem ser usados.

[00120] Os produtos de vacina da invenção, opcionalmente juntos com tecido de planta, são particularmente bem adequados para administração oral como composições farmacêuticas. Formulações líquidas orais podem ser usadas e podem ser de utilidade particular para populações pediátricas. O material de planta colhido pode ser processado em qualquer de uma variedade de modos (por exemplo, secagem a ar, secagem por congelamento, extração, etc.), dependendo das propriedades do produto terapêutico desejado e sua forma desejada. Tais composições conforme descritas acima podem ser ingeridas oralmente somente, ou ingeridas com alimento ou alimentação, ou com uma bebida. As composições para administração oral incluem plantas; extração das plantas, e proteínas purificadas de plantas infectadas providas como pós secos, produtos alimentícios,

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59/83 solventes aquosos ou não-aquosos, suspensões ou emulsões. Exemplos de solventes não-aquosos são propileno glicol, polietileno glicol, óleo vegetal, óleo de peixe, e ésteres orgânicos injetáveis. Transportadores aquosos incluem água, soluções de água-álcool, emulsões ou suspensões, incluindo salina e veículos parenterais mediais tamponados, incluindo solução de cloreto de sódio, solução de dextrose de Ringer, solução de dextrose mais cloreto de sódio, solução de Ringer contendo lactose, ou óleos fixados. Exemplos de pós secos incluem qualquer biomassa de planta que foi secada, por exemplo, secada por congelamento, secada em ar, ou secada por pulverização. Por exemplo, as plantas podem ser secadas a ar por colocação das mesmas em um secador de ar comercial a cerca de 120 graus Fahrenheit até que a biomassa contenha menos do que 5% de umidade por peso. As plantas secas são armazenadas para processamento adicional como sólidos de massa, ou adicionalmente processadas por moagem a um pó de tamanho de malha desejado. Alternativamente ou adicionalmente, secagem por congelamento pode ser usada para produtos que são sensíveis a secagem por ar. Os produtos podem ser secados por congelamento pela colocação dos mesmos em um secador a vácuo, e secados congelados sob um vácuo até que a biomassa contenha menos do que 5% de umidade por peso. O material seco pode ser adicionalmente processado conforme descrito aqui.

[00121] O material derivado de planta pode ser administrado como ou junto com uma ou mais preparações herbáceas. Alguns exemplos de preparações herbáceas incluem tinturas, extratos (por exemplo, extratos aquosos, extratos de álcool), decocções, preparações secas (por exemplo, secadas a ar, secadas por pulverização, ou secadas por congelamento), pós, (por exemplo, pó liofilizado), e líquido. Preparações herbáceas podem ser providas em qualquer veículo de

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60/83 distribuição padrão, tais como uma cápsula, comprimido, supositório, dosagem líquida, etc. Aqueles versados na técnica apreciarão as várias formulações e modalidades de distribuição de preparações herbáceas que podem ser aplicadas a presente invenção.

[00122] As linhagens de raiz, linhagens de células, plantas, extrações, pós, preparações secas e proteína purificada ou produtos de ácido nucléico, etc. da invenção podem estar na forma encapsulada com ou sem um ou mais excipientes conforme notado acima. Formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos, revestimentos de liberação controlada, e outros revestimentos bem-conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Em tais formas de dosagem sólida o agente ativo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte, tal como sacarose, lactose ou amido. Tais formas de dosagem podem compreender, conforme é prática normal, substâncias adicionais outras do que diluentes inertes, por exemplo, lubrificantes de comprimido e outros auxiliares de co mprimido, tais como um estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podem compreender agentes de tamponamento. Elas podem opcionalmente conter agentes de opacidade, e podem ser de uma co mposição que elas liberam o(s) ingrediente(s) ativo(s) somente, em uma certa parte do trato intestinal, e/ou em uma maneira retardada. Exemplos de composições de encrustação que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.

[00123] Em alguns métodos, uma planta ou porção desta expressando um antígeno de HPV de acordo com a presente invenção, ou biomassa destas, é administrada oralmente como alimento medicinal. Tais composições comestíveis são tipicamente

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61/83 consumidas como produto em bruto de comer, se em uma forma sólida, ou por bebida, se na forma líquida. O material de planta pode ser diretamente ingerido sem uma etapa de processamento anterior, ou após preparação culinária mínima. Por exemplo, a proteína de vacina pode ser expressa em um broto que pode ser comido diretamente. Por exemplo, antígenos de vacina podem ser expressos em um broto de alfafa, broto de feijão mungo, ou broto de espinafre, ou broto de folha de alface, etc. Em uma concretização, a biomassa planta pode ser processada, e o material recuperado após a etapa de processamento é ingerido.

[00124] Métodos de processamento úteis de acordo com a presente invenção são métodos comumente usados na indústria de alimento e de alimentação. Os produtos finais de tais métodos incluem tipicamente uma quantidade substancial de um antígeno expresso, e podem ser convenientemente comidos ou bebidos. O produto final pode ser misturado com outro alimento ou formas de alimentação, tais como sais, transportadores, intensificadores de sabor, antibióticos, e similares, e consumidos na forma sólida, semi-sólida, de suspensão, de emulsão, ou líquida. Tais métodos podem incluir uma etapa de conservação, tal como, por exemplo, pasteurização, cozimento, ou adição de agentes de conservação e de preservação. Qualquer planta pode ser usada e processada na presente invenção para produzir matéria de planta comestível ou bebível. A quantidade de antígeno de HPV em uma preparação derivada de planta pode ser testada por métodos padrões na técnica, por exemplo, eletroforese de gel, ELISA, ou análise de western blot, usando-se uma sonda ou anticorpo específico para o produto. Esta determinação pode ser usada para padronizar a quantidade de proteína antígeno de vacina ingerida. Por exemplo, a quantidade de antígeno de vacina pode ser determinada e regulada, por exemplo, por mistura de bateladas de produto tendo

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62/83 níveis eficientes de produto de modo que a quantidade de material a ser bebida ou comida para ingerir uma dose simples pode ser padronizada. O ambiente regulável contido da presente invenção, contudo, deve minimizar a necessidade de efetuar tais procedimentos de padronização.

[00125] Uma proteína de vacina produzida em uma célula ou tecido de planta e comida por um indivíduo pode ser preferivelmente absorvida pelo sistema digestivo. Uma vantagem da ingestão de tecido de planta que tenha sido apenas minimamente processado é proporcionar encapsulamento ou sequestro da proteína em células da planta. Desse modo, o produto pode receber pelo menos alguma proteção de digestão no trato digestivo superior antes de alcançar o intestino, e uma proporção mais alta de produto ativo seria disponível para percepção.

[00126] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas terapeuticamente ou profilaticamente. As composições podem ser usadas para tratar ou prevenir uma doença. Por exemplo, qualquer indivíduo que sofre de uma doença, ou que está em risco de desenvolver infecção por HPV, pode ser tratado. Será apreciado que um indivíduo pode ser considerado em risco de desenvolver uma doença sem ter sido diagnosticado com quaisquer sintomas da doença. Por exemplo, se o indivíduo é conhecido como tendo sido, ou para ser pretendido para estar em situações com risco relativamente alto de exposição a infecção por HPV, este indivíduo será considerado em risco de desenvolver a doença. Similarmente, se membros de uma família de indivíduos, amigos ou parentes foram diagnosticados com infecção por HPV, o indivíduo pode ser considerado estar em risco de desenvolver a doença.

[00127] As formas de dosagem líquida para administração oral incluem, mas não estão limitadas a emulsões farmaceuticamente

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63/83 aceitáveis, micro emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Em adição aos agentes ativos, as formas de dosagem líquida podem conter diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes de solubilização e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool de benzílico, benzoato de benzílico, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos (em particular, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de milho, óleo de germe, óleo de oliva, óleo de rícino, e óleo de gergelim), glicerol, álcool tetrahidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitan, e misturas destes. Além dos diluentes inertes, as composições orais podem incluir adjuvantes, tais como agentes de umedecimento, agentes emulsificantes e agentes de suspensão, agentes adoçantes, flavorizantes e de perfume.

[00128] As composições para administração retal ou vaginal podem ser supositórios ou enemas de retenção, que podem ser preparados pela mistura das composições desta invenção com excipientes ou transportadores não-irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietileno glicol, ou uma cera de supositório que são sólidos à temperatura ambiente, mas líquidos na temperatura do corpo e, portanto, derretem no reto ou cavidade vaginal, e liberam a proteína ativa.

[00129] As formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de uma composição de vacina desta invenção incluem unguentos, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou emplastros. O agente ativo, ou preparação deste, é misturado sob condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantes ou tampões necessários conforme podem ser requeridos. Para administração transmucosa ou transdérmica, penetrantes apropriados à barreira a ser permeada

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64/83 podem ser usados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica, por exemplo, para administração transdérmica, detergentes, sais de bile, e derivados ácidos fusídicos. A administração transmucosa pode ser acompanhada através do uso de pulverizações nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, antígeno, ou uma porção imunogênica deste, podem ser formulados em unguentos, pomadas, géis ou cremes, conforme geralmente conhecidos na técnica. Formulação oftálmica, gotas no ouvido e gotas no olho são também contempladas como estando dentro do escopo desta invenção. Adicionalmente, a presente invenção contempla o uso de emplastros transdérmicos, que têm a vantagem adicional de proporcionar distribuição controlada de uma proteína de vacina ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser produzidas por suspensão ou dispensa do produto de vacina no meio correto. Intensificadores de absorção podem ser usados para aumentar o fluxo da proteína de vacina através da pele. A taxa pode ser controlada, ou pela provisão de uma membrana de controle de taxa, ou pela dispersão da proteína de vacina em uma matriz de polímero ou gel.

[00130] As composições da invenção são administradas em tais quantidades e por tal tempo conforme é necessário para alcançar o resultado desejado. Em certas concretizações da presente invenção, uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica é aquela quantidade eficaz para tratamento, atenuação, ou prevenção de uma doença em um indivíduo. Desse modo, a quantidade eficaz para tratar, atenuar ou prevenir doença, conforme usado aqui, se refere a uma quantidade não-tóxica, mas suficiente, da composição farmacêutica para tratar, atenuar ou prevenir doença em qualquer indivíduo. Por exemplo, a quantidade terapeuticamente eficaz pode ser uma quantidade para tratar, atenuar ou prevenir

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65/83 infecção (por exemplo, infecção viral, infecção por HPV).

[00131] A quantidade exata requerida variará de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, idade e condições gerais do indivíduo, do estágio da doença, a mistura farmacêutica particular, seu modo de administração, e similares. Antígenos de antrax da invenção, incluindo antígeno(s) que expressa(m) plantas e/ou preparações destes, podem ser formulados em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A expressão forma de unidade de dosagem, conforme aqui usada, se refere a uma unidade fisicamente distinta de composição de vacina apropriada para o paciente a ser tratado. Será compreendido, contudo, que o uso diário total das composições da presente invenção é tipicamente decidido por um médico atendente dentro do escopo do julgamento médico. O nível de dose terapeuticamente efetivo específico para qualquer paciente particular ou organismo pode depender de uma variedade de fatores, incluindo a severidade ou risco de infecção; a atividade do composto específico empregado; a composição específica empregada; a idade, peso corpóreo, saúde geral, sexo do paciente, dieta do paciente, condições farmacocinéticas do paciente, o tempo de administração, via de administração, e taxa de excreção do composto específico empregado; a duração do tratamento; fármacos usados em combinação ou por coincidência com a composição de vacina empregada; e fatores similares bem-conhecidos nas técnicas médicas.

[00132] Será também apreciado que as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser empregadas em terapias de combinação (por exemplo, combinação de terapias de combinação), isto é, as composições farmacêuticas podem ser administradas concorrentemente com, antes de, ou subsequente a, um ou mais outros procedimentos de vacinação desejados. A combinação

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66/83 particular de terapias (por exemplo, vacinas, tratamento terapêutico de infecção por HPV) para empregar em um regime de combinação levará em conta compatibilidade dos terapêuticos e/ou procedimentos desejados, e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Será apreciado que as terapias e/ou vacinas empregadas podem alcançar um efeito desejado para a mesma enfermidade (por exemplo, um composto da invenção pode ser administrado concorrentemente com outra vacina de HPV), ou eles podem alcançar efeitos diferentes. Em certas concretizações, as composições de vacina compreendem pelo menos dois antígenos de HPV. Por exemplo, certas composições de vacina podem compreender pelo menos dois antígenos da invenção (por exemplo, uma E7 de domínio de HPV 16 e uma E7 de domínio de HPV 18 contendo antígeno da invenção). Em alguns aspectos, tal combinação de vacinas pode incluir uma proteína de fusão termoestável compreendendo antígeno de HPV; em alguns aspectos, duas ou mais proteínas de fusão termoestáveis compreendendo antígeno de HPV são providas. Em certas concretizações, antígenos múltiplos serão derivados de HPV da mesma cepa, e podem incluir antígenos derivados de proteínas diferentes. Em algumas concretizações, antígenos múltiplos serão derivados de HPV da mesma cepa, e podem incluir antígenos derivados da mesma proteína (por exemplo, domínios diferentes da mesma proteína). Em certas concretizações, antígenos múltiplos serão derivados de HPV de cepas verdadeiras, e incluem antígenos derivados de proteínas diferentes. Ainda outras combinações contemplam uso de antígenos múltiplos derivados de cepas diferentes e da mesma proteína. Variações e/ou combinações das combinações exemplares precedentes são contempladas. Por exemplo, em algumas concretizações, um domínio de E7, dois domínios de E7 ou três domínios de E7 de cepas diferentes são combinados para compreenderem uma composição de

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67/83 vacina da invenção. Onde combinação de vacinas é utilizada, será compreendido que qualquer combinação de antígenos de HPV pode ser usada para tais combinações.

Kits [00133] Em um aspecto, a presente invenção proporciona um envoltório ou kit farmacêutico incluindo brotos germinados vivos, entidade clonal ou planta que produz um antígeno de HPV de acordo com a presente invenção, ou preparações, extratos, ou composições farmacêuticas contendo a vacina em um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Em certas concretizações, o envoltório ou kit farmacêutico inclui um agente terapêutico aprovado adicional (por exemplo, antígeno de HPV, vacina de HPV) para uso como uma terapia de combinação. Opcionalmente associado com tal(is) recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, com avisos que refletem aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para administração humana.

[00134] Os kits são providos que incluem reagentes terapêuticos. Como um exemplo, mas não limitativo, vacina de HPV pode ser provida como formulações orais e administradas como terapia. Alternativamente ou adicionalmente, a vacina de HPV pode ser provida em uma formulação injetável para administração. Doses farmacêuticas ou instruções, portanto, podem ser providas no kit para administração a um indivíduo que sofre de, ou está em risco de infecção por HPV.

[00135] Os exemplos representativos que se seguem são pretendidos para ajudar a ilustrar a invenção, e não são pretendidos para, nem devem ser construídos para limitar o escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção e muitas concretizações

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68/83 adicionais destas, em adição àquelas mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão aparentes àqueles versados na técnica a partir dos conteúdos totais deste documento, incluindo os exemplos que se seguem e as referências à literatura científica e de patente aqui citada. Os exemplos seguintes contêm informação, exemplificação e guia, que podem ser adaptadas à prática desta invenção em suas várias concretizações, e os equivalentes destas.

Exemplificação

Exemplo 1. Geração de Construções Candidatas de Vacina

Geração de sequências de antígeno de papilomavírus humano [00136] Devido a interesses de segurança, o oncogene de HPV16 E7 (KO278, Seedorf et al., 1985, Virology, 145:181) já clonado em pQE30 (pQE30-E7) entre locais de restrição BamHI/PstI, sofreu mutação usando-se Kit de Mutagênese de Local Dirigido Quikchange (Stratagene) para gerar o plasmídeo pQE30-E7GGG. Três mutações de ponto foram introduzidas no local de ligação pRB do gene E7 conforme indicado pelos oligonucleotídeos em negrito dos iniciadores direto e reverso purificados de cromatografia líquida de polinucleotídeo rápida designados para introduzir mutações, respectivamente:

E7GGG dir:

5’-CAACAAgAgACAACT gg*iT CTCTAC g6sgT TAT gg₇₆g CAATTAAATgACAgC 3’

I_____J I_____J

Asp21>Gly Cys24>Gly Glu26 >Gly

E7GGG rev:

5’-gCTgTCATTTAATTg CCC ATA ACC gTAgAg ACC AgTTgTCTCTggTTg C-3’

Glu26 >Gly Cys24 > Gly Asp21>Gly [00137] As mutações introduzidas, resultadas na substituição dos três aminoácidos na sequência de proteína E7: D21G (Asp21 > Gly),

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C24G (Cys24 > Gly), E26G (Glu26 > Gly) aboliram o potencial de transformação de proteína E7. A autenticidade do gene resultante, denotado E7GGG, foi confirmada pelo sequenciamento

HPV16 E7 (KO2718, Seedorf et al., supra) (SEQ ID NO: 1)

ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGA GACAACTGATCTCTACTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAG GATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACA ATATTGTAACCTTTTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAA AGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAG GAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACGATAA

E7 (SEQ ID NO: 2):

MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYN1 VTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCP1CSQKP '

HPV16 E7GGG (SEQ ID NO:3):

ATGCATGGAGATACACCTACATTGCATGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGA GACAACTGGTCTCTACGGTTATGGGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAG GATGAAATAGATGGTCCAGCTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACA ATATTGTAACCrnTGTTGCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAA AGCACACACGTAGACATTCGTACTTTGGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAG GAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAACCATAA

E7GG (SEQ ID NO: 4):

MHGDTPTLHEYMLDLQPETTGLYGYGQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNI VTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGrVCPICSQKP

Geração de construção de veículo termoestável [00138] C. thermocellum lichenase, LicB, nativa de comprimento total, consiste sequencialmente em um peptídeo guia (Lp), uma porção N-terminal (A), um laço superficial (I), uma porção C-terminal (C), uma caixa Pro-Thr, e um domínio de ligação de celulossomo (C-BD). Nós removemos as sequências de codificação Lp, caixa Pro-Thr e C-BD a partir do gene que codifica LicB, circularmente permutou-se a molécula para inverter os N e C-terminais (Musiychuk, et al., 2007, Influenza and Other Respiratory Viruses, 1:1), e incorporamos locais de endonuclease de restrição únicos para clonagem de sequências alvos

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70/83 nos novos N e C-terminais, bem como no laço superficiais (I). A sequência de molécula transportadora projetada resultante foi verificada, e é designada LicKM.

SEQ ID NO: 5:

GGATCCTTAATTAAAATGGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAG AACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAA IAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACA ACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTT CAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCT TGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGITTTGAGTGGAGACCAG ATTATATTGATTTTTATGlTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAAC ATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGT TGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTAT GAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAA TACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGC TGAITGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCÀAGTTA CTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCAT CATCATCATCATCATTGACTCGAGCTC

SEQ ID NO: 6:

MGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEI DIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFY VDGKKVYRGTRNLPVTPGKIMMNLWPG1GVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVXYY PNGRSEFKLWNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGK MILTLDREYVDHHHHHH [00139] Para certas construções, foi projetado um peptídeo sinal PR1a e sequência KDEL nos N e C-terminais de LicKM. O ácido nucléico e sequência de aminoácidos destas construções são mostradas em SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8.

SEQ ID NO: 7:

GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTT CTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCCAA AATGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTT TGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATT GTTTCTTCTITCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAG ATTGATATTGAGTTTCTTGG.AAAGGAIACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTA

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TAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCITCATAACCTTGGATTTGATGCTT CTCAAGATTTTCATACTTATGGTTrTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTI ATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCT GGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTG GTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTA TTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGC TGTnTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACG GTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAA AGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCAT AAGGATGAACTTTGACTCGAGCTC

SEQ ID NO: 8: MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEV RMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNE YLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGrRNIPVTPGKIMMNLW PGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQ WEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHHKDEL

Geração de construções de antígeno recombinante [00140] Foram usados vetores de expressão pET, derivados de plasmídeo pBR322, projetados para levar vantagem das características do gene bacteriófago T7 10 que promove transcrição e translação em alto nível. O bacteriófago que codifica polimerase de RNA é altamente específico para as sequências de promotor T7, que são raramente encontradas em genomas outros do que genoma de fagos T7 (Figura 1). pET-32 foi usado para fusão das construções E7 e E7GGG na região de laço de uma sequência de lichenase modificada que tinha sido clonada neste vetor. O domínio catalítico do gene de lichenase com sequência PR-1A a montante (Proteína 1A Relacionada a Patogenia), com um retículo endoplasmático (KDEL), ou uma sequência de retenção vacuolar (VAC) e uma etiqueta His6 a jusante, foram clonados entre os locais PacI e XholI em um vetor pET-32 modificado (em que a região entre o promotor E7 e o terminador T7 foi excisada). Desse modo, o pET-PRACS-LicKM-KDEL e pET-PRACSLicKM-VAC foram obtidos (Figura 2). O fragmento de DNA E7 e

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E7GGG foi subclonado na porção de laço (I) de LicKM para dar uma fusão na estrutura de leitura correta para translação.

Exemplo 2. Geração de Vetores de Antígeno Candidato de Vacina [00141] Construções de antígeno-alvos LicKM-E7 ou LicKM-E7GGG foram individualmente subclonadas no vetor viral escolhido (pBI-D4). pBI-D4 é um vetor binário derivado de pBI121 no qual o gene relator que codifica para E. coli β-D-glucoronidase (GUS) foi substituído por um poliligante onde, entre os locais Xbal e SacI, um vetor derivado de RMV foi clonado (Figura 3). pBI-D4 é uma construção baseada em TMV na qual um gene estranho a ser expresso (por exemplo, antígeno-alvo (por exemplo, LicKM-E7, LicKM-E7GGG) substitui o gene de proteína de revestimento (CP) de TMV). O vírus retém o gene TMV 126/183kDa, o gene de proteína de movimento (MP), e o promotor de mRNA subgenômico de CP (sgp), que se estende na estrutura de leitura aberta de CP (ORF). O códon de partida para CP sofreu mutação. O vírus carece de CP e, portanto, não pode se mover através de toda planta hospedeira via floema. Contudo, o movimento de célula a célula de infecção viral permanece funcional, e o vírus pode se mover vagarosamente para as folhas superiores dessa maneira. Um local de clonagem múltiplo (PacI-PmeI-Agel-Xhol) foi projetado na extremidade de sgp para expressão de genes estranhos, e é seguido pela região não-transladada TMV 3' (NTR). O promotor 35S é fusionado na extremidade 5' da sequência viral. A sequência de vetor é posicionada entre os locais BamHI e SacI de pBI121. A ribozima de cabeça de martelo é colocada 3' da sequência viral (Chen et al., 2003, Mol. Breed., 11:287). Estas construções incluem fusões de sequências que codificam LicKM-E7 ou E7GGG, em sequências que codificam o peptídeo sinal de proteína PR-1a de tabaco, uma etiqueta 6x His e a sequência âncora de retenção de ER KDEL, ou sequência de varredura vacuolar (Figura 4). Para construções que

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73/83 contêm sequência codificando PRACS-LicKM-E7-KDEL, PRACSLicKM-E7VAC, PRACS-LicKM-E7GGG-KDEL e PRACS-LicKME7GGG-VAC, o DNA de codificação foi introduzido como fragmentos PacI-Xhol em pBI-D4. A sequência de nucleotídeo foi subsequentemente verificada estendendo-se sobre as junções de subclonagem das construções de expressão final (Figura 5).

Exemplo 3: Geração de Plantas e Produção de Antígeno

Infiltração de Agrobacterium de plantas [00142] Sistema de expressão transiente mediado por Agrobacterium alcançado por infiltração de Agrobacterium pode ser utilizado (Turpen et al., 1993, J. Virol. Methods, 42:227). Folhas saudáveis de N. benthamiana foram infiltradas com A. rhizogenes contendo vetores virais projetados para expressar LicKM-E7 ou LicKM0E7GGG.

[00143] A cepa A. rhizogenes A4 (ATCC 43057) ou A. tumefaciens (GV3103) foi transformada com as construções pBI-D4-PRACS-LiKME7-KDEL, pBI-D4-PRACS-LicKM-E7VAC, pBI-D4-PRACS-LicKME7GGG-KDEL e pBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-VAC. Culturas de Agrobacterium foram crescidas e induzidas conforme descrito (Kapila et al., 1997, Plant Sci., 122:101). Uma cultura iniciadora de 2 ml (escolhida de uma colônia fresca) foi crescida durante a noite em YEB (5 g/l de extrato de carne bovina, 1 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de peptona, 5 g/l de sacarose, 2 mM de MgSO4 com 25 μg/ml de kanamicina a 28°C. A cultura iniciadora foi diluída 1:500 em 500 ml de YEB com 25 μg/ml de kanamicina, 10 mM de 2-4(-morfolino)ácido etanossulfônico (MES) pH 5,6, 2 mM de MgSO4 adicional e 20 μg/ml de acetosiringone. A cultura diluída foi, em seguida, crescida durante a noite a um O.Dgqq de ~1,7 a 28°C. As células foram centrifugadas a 3.000 x g por 15 minutos e ressuspensas em meio de MMA (sais de MS, 10 mM de MES pH 5,6, 20 g/l de sacarose, 200 μM de

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74/83 acetosiringone) a um O.Dgqq 2,4, mantidas por 1 hora à temperatura ambiente, e usadas para infiltração de Agrobacterium. Folhas de N. benthamiana foram injetadas com a suspensão de Agrobacterium usando-se uma seringa disponível sem uma agulha. As folhas infiltradas foram colhidas 6 dias pós-infiltração.

Geração de raiz clonal e linhagem de raiz clonal [QQ144] Explantes de Petunia hibrida de cm x 1 cm de largura foram obtidos de folhas após esterilização em 0,1% de NH4Cl e seis lavagens em dH2O estéril. Os explantes foram levemente danificados com uma faca no lado abacsial e co-cultivados com Agrobacterium rhizogenes, cepa A4, contendo ou o pBID4-LiKM-E7-KDEL ou o pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL. Os explantes foram incubados por 2 minutos com uma cultura de Agrobacterium durante a noite (O.D. 6QQ nm=Q,8-1), centrifugados por 1Q minutos a 3QQQ rpm a 4°C, e ressuspensos em meio MMA para um OD 6QQ final = 0,5 na presença de 20 mM de acetossiringone. No final da incubação, os explantes foram secados em papel estéril e transferidos em 0,8% de placas de MS ágar na presença de 1% de glicose, e 20 mM de acetossiringone. As placas foram paralaminadas à temperatura ambiente por dois dias. Os explantes foram então transferidos nas placas de MS na presença de 500 mg/l de Cefotaxin (Cif), 100 mg/l de Timentin (Tim) e 25 mg/l de karamicina. Após 5 semanas, a geração de raízes transgênicas foi obtida de explantes de folha de Petunia hibrida transformados com Agrobacterium rhizogenes contendo as construções pBID4-LiKM-E7KDEL e pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL. Muitas raízes foram obtidas da transformação com pBID4-LicKM-E7-KDEL do que com a construção pBID4-LicKM-E7GGG-KDEL. A análise de zimograma revelou a expressão de ambas proteínas quiméricas E7 e E7GGG nas raízes transgênicas de Petunia hibrida testadas. A expressão é associada com atividade de lichenase. A faixa de atividade relacionada às

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75/83 proteínas de fusão mostra um peso molecular mais alto do que o controle de lichenase, e o mesmo peso molecular do produto expresso por plantas após agro-infecção, confirmando a presença de todo produto de fusão.

[00145] Após transformação, raízes com pelos foram cortadas e colocadas em uma linhagem no meio K3 livre de hormônio sólido. Quatro a seis dias mais tarde as raízes que cresceram mais ativamente são isoladas e transferidas para meio K3 semi-sólido (0,4% de ágar). As raízes selecionadas são cultivadas a 22°C no escuro, e linhagens clonais são isoladas e sub-cultivadas de seis em seis semanas. As raízes e/ou linhagens clonais podem ser classificadas para a presença de expressão de antígeno-alvo pela avaliação de ensaio de atividade de lichenase e análise de imunomarcação.

Exemplo 4: Produção de Candidato de vacina [00146] Amostras de 100 mg de material de folha infiltrado de N. benthamiana foram colhidas em 4, 5, 6 e 7 dias pós-infecção. O tecido fresco foi analisado para expressão de proteína após ser colhido ou coletado a -80°C para a preparação subsequente de extratos de planta bruta, ou para purificação de proteína de fusão.

[00147] As amostras frescas foram ressuspensas em PBS frio 1x + Inibidores de protease (Roche) em uma razão p/v 1/3 (1 ml/0,3 g de tecido), e moídas com um pilão. Os homogenatos foram fervidos por 5 minutos em tampão de carregamento de gel SDS, e então clareados por centrifugação por 5 minutos a 12.000 rpm a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos em um tubo fresco e 20 pl, 1 pl ou suas diluições foram separadas em 12% de SDS-PAGE e analisadas por análise de western blot usando-se anticorpos policlonais de camundongo anti-His6-E7 ou anti-lichenase de coelho e/ou por análise de zimograma para avaliar atividade hidrolítica indicando atividade funcional de lichenase. A zimografia é um método eletroforético para

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76/83 medição de atividade de enzima. O método é baseado em um gel de sódio dodecil sulfato impregnado com um substrato que é degradado pela enzima dissolvida durante o período de incubação. A coloração do gel revela atividade enzimática como faixas brancas em um pano de fundo vermelho escuro. Dentro de uma certa faixa, a intensidade de faixa pode estar relacionada a quantidade de enzima carregada.

[00148] A expressão de E7 em plantas Nicotiana benthamiana infiltradas ou com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes contendo o plasmídeo pBID4-LicKM-E7-KDEL conduz a uma faixa específica correspondente ao peso molecular da proteína quimérica LicKM-E7-KDEL (cerca de 39 kD) se a mobilidade eletroforética de proteína E7 na proteína de fusão corresponde ao PM teórico de 11 kD (o PM da enzima de lichenase é cerca de 28 kD) (Figuras 6A-D). Plantas Nicotiana benthamiana infiltradas com ou Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes contendo os plasmídeos pBID4-LicKM-E7-VAC expressam a proteína quimérica LicKM-E7-VAC. Não obstante, a faixa revelada é um par. A faixa dupla é provavelmente representativa da presença de ambas a sequência de sinal vacuolar corretamente processado ou não-processado dentro de proteínas quiméricas (Figuras 6A-D). Em ambas cepas de Agrobacterium, a melhor construção de expressão vira para fora para ser a construção provida com a sequência KDEL, que foi escolhida para a grande produção de tecido de planta expressando a fusão de E7 (ou a E7GGG) com a enzima lichenase. Os mesmos resultados de expressão foram obtidos para as proteínas quiméricas E7GGG (Figura 7A).

[00149] A análise de zimograma revelou que a expressão de ambas proteínas quiméricas E7 e E7GGG está associada com atividade de lichenase, indicando que a fusão da proteína acima mencionada no laço do domínio catalítico da enzima lichenase não prejudica a

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77/83 atividade da enzima. A faixa de atividade relacionada a proteína de fusão mostra um peso molecular mais alto do que o controle da lichenase, confirmando a presença do produto de fusão total. O extrato obtido de plantas Nicotiana benthamiana infiltradas com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes contendo pBID4-LicKM-E7-KDEL, pBID4-Lic-KM-E7GGG-KDEL mostra uma faixa de atividade, enquanto construções-VAC resultam em uma extensão menor de atividade (Figuras 8A-D).

[00150] Ambas a expressão das fusões E7-LicKM-KDEL e E7LicKM-VAC são constantemente altas e estáveis a partir do 4° ao 7° dia pós-infecção (embora pareça ser levemente mais alta no 5° dia), com a exceção da expressão de Agrobacterium rhizogenes que cai dramaticamente do 6° ao 7° dia. Foi decidido colher no 5° dia pósinfecção de modo a evitar degradação de proteína. A qualificação das proteínas quiméricas LicKM-E7-KDEL e Lic-KM-E7GGG-KDEL expressas no extrato bruto foi produzida por imunoblotting ambos do tecido infiltrado manualmente e nos tecidos infiltrados à vácuo (Figuras 7B, C). O rendimento estimado de expressão no extrato bruto é pelo menos 400 pg de proteína quimérica LicKM-E7-KDEL e Lic-KME7GGG-KDEL/g de tecido (correspondendo a 100 pg de proteínas E7 ou E7GGG/g de tecido).

Purificação de antígenos [00151] Folhas de plantas infiltradas com Agrobacterium tumefaciens contendo as construções pBID4-LicKM-E7-KDEL e pBID4-Lic-KM-E7GGG-KDEL foram homogeneizadas. Tampão de extração com inibidores de protease livres de EDTA (Roche) e TritonX-100 1% foi usado a uma razão de 3 volumes p/v, e oscilado por 30 minutos a 4°C. Os extratos foram clareados por centrifugação a 9000 x g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi sequencialmente filtrado através de tecido Mira, centrifugado a 20.000 x g por 30 minutos a

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4°C, e filtrado através de um filtro de 0,45 μm, antes de purificação cromatográfica.

[00152] Proteínas quiméricas LicKM-E7-KDEL e Lic-KM-E7GGGKDEL His-etiquetadas foram purificadas pelo uso de IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography, GE Health) à temperatura ambiente sob gravidade. A purificação foi realizada sob condições de não-desnaturação. As proteínas foram coletadas como frações de 0,5 ml, que foram unificadas, adicionadas com 20 mM de EDTA, dialisadas contra PBS 1X durante a noite a 4°C, e analisadas por SDS-PAGE.

[00153] Alternativamente, frações foram coletadas juntas adicionadas com 20 mM de EDTA, dialisada contra NaH2PH4 10 mM, durante a noite, a 4°C, e purificada por Cromatografia de Troca de Ânion. Para purificação de LICKM-E7-KDEL E LIC-KM-E7GGG-KDEL, coluna de troca de ânion Q Sepharose de Fluxo Rápido (Amersham Pharmacia Biosciences) foi usada. Amostras de afinidade de LICKME7-KDEL E LICKM-E7GGG-KDEL, ou proteínas quiméricas purificadas de troca de íon foram separadas em 12% de géis de poliacrilamida, seguido por coloração por Coomassie. As proteínas separadas foram também eletroforeticamente transferidas nas membranas de PVDF, e analisadas por análise de western blot usando-se anticorpo de anti-lichenase e sucessivamente com anticorpo IgG anti-coelho conjugado com peroxidase.

[00154] As frações coletadas após diálise foram analisadas por imunoblotting usando-se ambos pAb α-lichenase (Figuras 9A) e o pAb a-anti-His6 (dados não mostrados). A His-etiqueta foi mantida pelas proteínas quiméricas expressas, e a concentração final da proteína purificada foi avaliada por software (Figuras 9A, B). De 40 g de tecido infiltrado, 6,5 mg de cada proteína quimérica de pBID4-LicKM-E7KDEL e pBID4-Lic-KM-E7GGG-KDEL foram purificados com um

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79/83 rendimento final de 163 pg de proteínas quiméricas/g de tecido (cerca de 50 pg de proteína E7 ou E7GGG/ g de tecido, no qual o peso molecular de proteína E7 e E7GGG é cerca de 1/4 da fusão total). Os resultados do protocolo de purificação são representados nas Figuras 9C, D.

Exemplo 5: Estudos de Imunogenicidade

Produção e caracterização de antígenos-alvos [00155] Um estudo de imunogenicidade inicial foi conduzido para determinar se LicKM-E7-KDEL e Lic-KM-E7GGG-KDEL produzida de planta pode induzir soro específico IgG em camundongos intraperitonealmente imunizados, e se os anticorpos induzidos podem se ligar a células que expressam E7. O estudo usou LicKM-E7-KDEL e Lic-KM-E7GGG-KDEL enriquecidos de folhas de N. benthamiana infiltradas com Agrobacterium para pureza, conforme descrito acima.

[00156] Brevemente, o oncogene de HPV16 E7 (número de acesso ao Banco de Gene KP2718) sofreu mutação usando Kit de Mutagênese de Local Dirigido de Mudança Rápida (Stratagene; La Jolla, CA) para dar E7GGG com as seguintes substituições de aminoácido no local de ligação pRB de E7:D21G, C24G e E26G (Smahel et al., 2001, Virology, 281:231). Sequências que codificam HPV16 E7 e E7GGG foram clonadas como fusões internas de estrutura interna de LicKM para obter LicKM-E7 e Lic-KM-E7GGG. Estas fusões incluíam a sequência sinal da proteína PR1a de Nicotiana tabacum, e a etiqueta 6xHis, seguido pelo sinal de retenção de retículo endoplasmático KDEL em seu C-terminal. As fusões foram clonadas no vetor de expressão de planta pBID4 (Musiychuk et al., 2007, Influenza and Other Respiratory Viruses, 1:1, em prensa) para dar pBID4-LicKM-E7 e pBID4-Lic-KM-E7GGG. Cada construção foi introduzida na cepa de Agrobacterium rhizogenes A4, e as bactérias resultantes foram inoculadas em Nicotiana benthamiana. Cinco a sete

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80/83 dias pós-infiltração, antígenos-alvos foram purificados por cromatografia de afinidade.

[00157] Os rendimentos estimados para LicKM-E7 e Lic-KM-E7 foram aproximadamente 400 mg por kg de tecido de folha fresca, e o rendimento estimado para LicKM foi aproximadamente 1 g por kg. Antígeno-alvos purificados foram caracterizados por análise de SDSPAGE para revelar as proteínas dimensionadas prognosticadas de 28 kD (LicKM), 39 kD (LicKM-E7), e 39 kD (LicKM-E7GGG) (Figura 9B). Para proporcionar material de controle, LicKM foi similarmente produzida em N. benthamiana. A antigenicidade das proteínas expressas por planta foi verificada por imunomarcação usando-se anticorpos específicos a LicKM e E7. As amostras foram quantificadas por densitometria usando-se o software GeneTools (Syngene; canbridge, UK).

Estudos de Imunogenicidade [00158] Para avaliar a eficiência de antígenos-alvos produzidos por planta, camundongos fêmeas de quatro a oito semanas de idade C57BL/6 (Charles River; Como, Itália) foram imunizados com antígenos-alvos.

[00159] Para estudos profiláticos, 10 camundongos por grupo receberam 40 pg de LicKM-R7 ou LicKM-E7GGG (equivalente a aproximadamente 10 pg de E7 ou E7GGG, respectivamente) subcutaneamente, com ou sem adjuvante Quil A (10 (pg/camundongo), nos dias 0, 14, 28, 42 e 76. Amostras de soro de animais foram coletadas no dia de cada administração, e avaliadas para a presença de anticorpo específicos de E7 por ELISA. No dia 49, dois animais em cada grupo foram sacrificados para avaliar respostas imunes mediadas por célula. Todos os animais remanescentes foram então provocados por injeção subcutânea com 5 x 10⁴ E7, expressando células de tumor TC-1 (Lin et al., 1996, Cancer

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Research, 56:21). Para caracterização de respostas imunes, ELISA, ELISPOT, e ensaios de hipersensibilidade de tipo retardada espontânea (DHT) foram realizados conforme anteriormente descrito (Franconi et al., 2002, Cancer Research, 62:3654).

[00160] Para estudos profiláticos, 8 a 10 camundongos por grupo foram inoculados subcutaneamente com 5 x 104 E7 expressando células de tumor TC-1 3 dias antes de imunização subcutânea com 40 μg de LicKM-E7 ou LicKM-E7GGG, com ou sem Quil A (10 μg/camundongo), nos dias 0, 15, 30, 45 e 60.

[00161] Para ambos estudos profiláticos e terapêuticos, animais de controle foram administrados com 10 μg de E7 ou E7GGG produzido de E. coli ou LicKM produzida de planta, com ou sem Quil A. O crescimento do tumor foi monitorado por palpação duas vezes por semana. Através de todos estes estudos, os animais foram observados para sinais potenciais de estresse, diarreia, morte ou outros sinais clínicos que podem resultar da administração do antígeno-alvo.

[00162] Para testar a imunogenicidade e potencial profilático de LicKM-E7 e LicKM-D7GGG produzidos por planta, os animais foram imunizados com antígenos-alvos. Na presença de adjuvante, todos os animais imunizados com LicKM-E7 e LicKM-D7GGG, ou com E7 ou E7GGG produzidos de E. coli montaram uma resposta IgG específica (Figura 11A), embora na ausência de um adjuvante, fusões de LicKM não induziram respostas humorais significantes (Figura 11A). Desde que células T citotóxicas CD8⁺ têm um papel reconhecido como influenciadores em respostas anticâncer, a indução de células T CD8+ específicas de E7 foi investigada por ELISPOT. Na ausência de adjuvante, números altos de células de secreção de IFNy foram detectados em camundongos vacinados com LicKM-E7 e LicKMD7GGG, onde números inferiores de células CD8⁺ específicas de E7

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82/83 foram encontrados em camundongos vacinados com R7 ou E7GGG produzidos de E. coli, e nenhuma célula de secreção IFNy foi detectada em camundongos vacinados de LicKM (Figura 11B). Ambas fusões de LicKM e antígenos produzidos em E. coli induzem números baixos, mas significantes, de pontos na ausência de adjuvante, com as fusões de LicKM dando o número mais alto de contagens de ELISPOT (Figura 11B).

[00163] Foi estabelecido que células T CD8+ específicas de HPV são protetoras contra provocação com um tumor de expressão de E7 (Frazer, 2004, Nature Reviews, 4:46). Portanto, a atividade anti-tumor das respostas imunes induzidas por vacinas candidatas de E7 produzidas por planta por provocação de camundongos vacinados com células TC-1. Na presença de adjuvante, LicKM-E7 e LicKMD7GGG induziram proteção de tumor em 100% de animais, enquanto E7 ou E7GGG produzidas por E. coli induziram proteção em 80% e 60% de camundongos, respectivamente (Figura 11C). 80% de animais imunizados com LicKM-E7 na ausência de adjuvante foram protegidos (Figura 11C). 20% de animais imunizados com LicKM-E7GGG ou qualquer antígeno produzido po r E. coli na ausência de adjuvante foram protegidos (Figura 11C). Nenhuma proteção foi observada em animais imunizados com LicKM (Figura 11C).

[00164] Para testar atividade terapêutica de LicKM-E7 e LicKMD7GGG contra tumores de expressão de HPV16 D7, os animais que foram inoculados com células TC-1 de expressão de E7 foram subsequentemente imunizadas com LicKM, LicKM-E7, ou LicKME7GGG, ou com E7 ou E7GGG produzidas de E. coli. Todos os animais imunizados com LicKM desenvolveram tumores dentro de 4 semanas, enquanto aqueles tratados com LicKM-E7 ou LicKM-E7GGG mais adjuvante permaneceram livres de tumor para a duração do estudo (10 semanas). Imunização com E7 ou E7GGG produzidas de

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E. coli mais adjuvarrte inibiu crescimento de tumor em 40% e 60% de animais, respectivamente (Figura 11D). Na ausência do adjuvante, fusões de LicKM inibiram crescimento de tumor, com proteção maior observada em animais que receberam LicKM-E7 (80%) versus LicKME7GGG (60%), e 20% de animais tratados com E7 e E7GGG produzidos de E. coli permaneceram livres de tumor (Figura 11D).

[00165] A proteção contra o desenvolvimento de doença associada a HPV é, na maior parte, atribuída às respostas imunes mediadas por célula. A resposta de DTH é pensada representar inflamação mediada por citocina específica de antígeno, particularmente envolvendo citocinas tipo Th1. Desde que LicKM-E7 mostrou maior atividade terapêutica do que Lic-KM-E7GGG contra tumores de expressão de E7, foi avaliada a resposta de DTH a E7 em camundongos vacinados com LicKM-E7 ou E7 produzida por E. coli. Uma resposta de DHT específica de antígeno foi observada em camundongos com a proteína LicKM-E7, mesmo na ausência de adjuvante (Tabela 1). Esta resposta excede aquela observada em camundongos vacinados com E7 produzida por E. coli. Os camundongos imunizados com LicKM não mostraram nenhuma inchação significante da orelha, demonstrando que a molécula transportadora de LicKM não induz uma resposta inflamatória.

Tabela 1. Hipersensibilidade Tipo Retardada

	Δ espessura da orelha* ± desvios padrões
	48 horas	72 horas
LicKM	2,5 ± 0,7	1,0 ± 0,7
E coli E7	2,3 ± 1,5	4,6 ± 2,5
LicKM-E7	5,0 ± 2,7	10 ± 2,3
LicKM-E7 + Quil-A-	6,5 ± 0,7	7,0 ± 0,1

*inchação da orelha foi reportada com a média das diferenças (Δ) na espessura entre orelhas de controle provocadas ou não-provocadas de 5 camundongos por grupo (espessura de orelha em mm x 10^-2).

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Antígeno isolado, caracterizado pelo fato de que compreende um componente do papilomavírus humano (HPV) fusionado a uma proteína LicKM;

em que o componente de HPV compreende pelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV 16, E7 de HPV 18, E6 de HPV 16, e E6 de HPV 18, um fragmento de E7 de HPV 16, um fragmento de E7 de HPV 18, um fragmento de E6 de HPV 16, e um fragmento de E6 de HPV 18, e em que a proteína LicKM compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8.
2. Antígeno isolado de acordo com a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o componente de HPV consiste emE7 de HPV 16 ou HPV 18.
3. Antígeno isolado de acordo com a reivindicação1, caracterizado pelo fato de que o componente de HPV consiste na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
4. Antígeno isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de HPV é fusionado à proteína LicKM como uma proteína de fusão N-terminal, uma proteína de fusão C-terminal, ou uma fusão de inserção de laço na superfície.
5. Antígeno isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de HPV compreende pelo menos dois domínios independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em E7 de HPV 16, E7 de HPV 18, E6 de HPV 16, e E6 de HPV 18, um fragmento de E7 de HPV 16, um fragmento de E7 de HPV 18, um fragmento de E6 de HPV 16, e um fragmento de E6 de HPV 18.
6. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende o antígeno como definido em qualquer uma das

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2/6 reivindicações 1 a 5 e um veículo farmaceuticamente aceitável, em que a composição é capaz de elicitar uma reposta imune contra infecção por HPV após administração a um indivíduo.
7. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um segundo antígeno, em que o segundo antígeno compreende um componente de HPV fusionado a uma proteína LicKM, em que o componente de HPV do primeiro antígeno compreende pelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV 16, E7 de HPV 18, E6 de HPV 16, e E6 de HPV 18, um fragmento de E7 de HPV 16, um fragmento de E7 de HPV 18, um fragmento de E6 de HPV 16, e um fragmento de E6 de HPV 18; e o componente de HPV do segundo antígeno compreende pelo menos um domínio distinto do primeiro antígeno selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV 16, E7 de HPV 18, E6 de HPV 16, e E6 de HPV 18, um fragmento de E7 de HPV 16, um fragmento de E7 de HPV 18, um fragmento de E6 de HPV 16, e um fragmento de E6 de HPV 18.
8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o antígeno é produzido em uma planta selecionada de uma planta transgênica e uma planta transientemente expressando o antígeno.
9. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a composição compreende antígeno que é purificado, parcialmente purificado, ou não-purificado de células de planta, de uma planta, sementes, fruto, ou um extrato destes.
10. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante de vacina, por exemplo, alume, MF59, MALP2, ou saponina.
11. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos dois antígenos, cada um dos quais

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3/6 compreendendo um componente de papilomavírus humano (HPV), em que pelo menos um dos antígenos compreende ainda uma proteína LicKM fusionada ao componente de HPV, em que a composição é capaz de elicitar uma reposta imune contra infecção por HPV após administração a um indivíduo, e em que a proteína LicKM compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8.
12. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que pelo menos dois antígenos compreendem um componente de HPV, cada um dos quais compreende independentemente pelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV 16, E7 de HPV 18, E6 de HPV 16, e E6 de HPV 18, um fragmento de E7 de HPV 16, um fragmento de E7 de HPV 18, um fragmento de E6 de HPV 16, e um fragmento de E6 de HPV 18 e combinações destes; e em que a composição é capaz de elicitar uma resposta imune contra infecção por HPV após administração a um indivíduo.
13. Composição de vacina anti-HPV, caracterizada pelo fato de que é para uso na indução de uma resposta de célula T citotóxica contra infecção por papilomavírus humano (HPV) em um indivíduo;

a. em que a composição de vacina compreende antígeno compreendendo um componente do papilomavírus humano (HPV) fusionado a uma proteína LicKM, em que a proteína LicKM compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8;

b. em que o componente de HPV compreende pelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV 16, E7 de HPV 18, E6 de HPV 16, e E6 de HPV 18, um fragmento de E7 de HPV 16, um fragmento de E7 de HPV 18, um fragmento de E6 de HPV 16, e um fragmento de E6 de HPV 1814. Composição de

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4/6 acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é para administração oralmente, por exemplo, através da alimentação com células de planta ao indivíduo, intranasalmente, subcutaneamente, intravenosamente, intraperitonealmente, ou intramuscularmente.
15. Composição de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
16. Método para produção de uma proteína antígeno compreendendo um componente do papilomavírus humano (HPV) fusionado a uma proteína LicKM, caracterizado pelo fato de que compreende:

a. preparação de uma construção de ácido nucléico que codifica um componente de antígeno do papilomavírus humano (HPV) fusionado a uma proteína LicKM, em que a proteína LicKM compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8;

b. transformação de uma célula de planta com a construção de ácido nucléico da etapa a; e

c. incubação da célula de planta sob condições favoráveis para expressão da proteína antígeno;

d. produzindo, desse modo, a proteína antígeno;

e. em que o componente de HPV do antígeno compreende pelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindo em E7 de HPV 16, E7 de HPV 18, E6 de HPV 16, e E6 de HPV 18, um fragmento de E7 de HPV 16, um fragmento de E7 de HPV 18, um fragmento de E6 de HPV 16, e um fragmento de E6 de HPV 18.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o componente de HPV consiste em E7 de HPV 16 ou HPV 18.
18. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o componente de HPV é codificado por

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5/6 uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 3.
19. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o componente de HPV consiste em SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.
20. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o componente de HPV é fusionado à proteína LicKM como uma proteína de fusão N-terminal, uma proteína de fusão C-terminal, ou uma fusão de inserção de laço na superfície.
21. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o componente de HPV compreende pelo menos dois domínios independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em E7 de HPV 16, E7 de HPV 18, E6 de HPV 16, e E6 de HPV 18, um fragmento de E7 de HPV 16, um fragmento de E7 de HPV 18, um fragmento de E6 de HPV 16, e um fragmento de E6 de HPV 18, e combinações destes.
22. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a expressão da proteína antígeno está sob controle de um promotor viral.
23. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a construção de ácido nucléico compreende ainda sequência de ácido nucléico de vetor e/ou a construção de ácido nucléico compreende ainda sequências que codificam proteínas virais.
24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor binário.
25. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a célula de planta é selecionada a partir do grupo consistindo em célula de alfafa, rabanete, mostarda, feijão mungo, brócolis, agrião, soja, girassol, trigo, repolho, trevo, petúnia,

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6/6 tomate, batata, nicotina, espinafre e lentilha.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a proteína antígeno é produzida em uma célula de raiz clonal e/ou em mudas germinadas.
27. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda recuperar a proteína antígeno parcialmente purificada ou purificada que é produzida.

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