CN100500855C - 生产用于预防婴幼儿腹泻的转基因植物材料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达人源轮状病毒外壳蛋白转基因植物的生产方法，并进而通过直接食用或肠道给药方式利用这些含有人源轮状病毒外壳蛋白的转基因植物及其衍生物从而引起人或哺乳动物对该抗原蛋白的免疫应答反应。

Description

生产用于预防婴幼儿腹泻的转基因植物材料的方法

技术领域

本发明涉及表达人源轮状病毒外壳蛋白转基因植物的生产方法，并进而通过直接食用或肠道给药方式利用这些含有人源轮状病毒外壳蛋白的转基因植物及其衍生物从而引起人或哺乳动物对该抗原蛋白的免疫应答反应。

背景技术

人源轮状病毒(human rotavirus，HRV)导致婴幼儿腹泻的主要病因，也是第三世界国家中儿童死亡率最高的疾病(1998年世界卫生统计报告)。HRV在世界各地传播，每年约有近百万儿童死于RV腹泻，在我国初步的资料表明每年也有约10万。卫生措施似乎对RV的传播影响甚小，营养状况对发病危险的重要性也远低于细菌性腹泻，因为无论发达国家或是发展中国家，3岁前的婴儿约有90％都要受RV感染，轻者表现为自限性的轻度水样便，重者可出现发热、呕吐及严重腹泻，进而导致脱水、电解质紊乱和酸中毒，甚至死亡。资料显示，由于轮状病毒所带来的社会负担和社会费用是惊人的。仅在美国，每年因此增加500,000门诊次数和50,000住院治疗次数，直接医疗费用为2.64亿美元，总社会费用超过10亿美元。另外，迄今尚无治疗RV的特效药物，因此预防显得极为重要。为此，世界卫生组织多次呼吁各国科学家研制开发有效的轮状病毒疫苗，指出只有疫苗预防接种才是遏制轮状病毒腹泻唯一有效的手段。

近年来轮状病毒疫苗的研究策略有两种途径：一种是研制减毒活疫苗，另一种是亚单位疫苗。前者是用G1～G4型病毒共同感染培养细胞，在一定选择压力下挑选出合适的疫苗候选株。目前仅有美国(1998年)和我国(2000年)获准用于临床。但其活疫苗的稳定性以及由于病毒毒力回复带来的安全性问题是减毒活疫苗面临的本质上的缺陷，如美国的恒河猴轮状病毒疫苗(RRV)就因健康儿童接种该疫苗后屡屡出现肠套叠问题而禁用，而且其价格偏高(如RRV疫苗需120美元)，因而大大地限制了该疫苗的推广、普及。如何保证其安全性并降低成本成为其问题的关键。亚单位疫苗的研制策略是运用基因工程方法进行轮状病毒重组多肽疫苗的研究，目前尚没有成功应用于临床的先例。况且，通过重组细胞培养系统生产的疫苗，因需要发酵、纯化技术，使其设备复杂、成本高，目前生产的疫苗也远不能满足全球免疫计划的需要。因此，如何使状病毒疫苗更为安全、经济、有效和更容易推广使用将是今后各国研究的主要方向。

轮状病毒属呼肠弧病毒家族成员，病毒具分段的双股RNA，含11个基因片断。除基因11可编码2种不同的蛋白外，每一基因片断可分别编码一种单一的蛋白。对轮状病毒病毒粒体结构组成的研究表明，其包膜蛋白主要有三种，依据编码基因的不同，分别称为VP4、VP7和VP6⁽¹⁾。

第一层外层为表面蛋白VP4形成的60个刺突状结构向外突出，VP4即病毒血凝素，是病毒毒力的重要决定簇，病毒借以能侵入肠壁细胞。第一层内层为VP7(由基因9表达的蛋白)形成平滑的波浪形，其成分占病毒表面蛋白的30％。在此层上裂开形成132个直接通达核心的孔，以供病毒与外界传递信息。VP7是一种高糖蛋白，为病毒确定亚型的依据。第二层是由VP6形成的三聚体，VP6约占病毒颗粒重量的一半，为病毒组和亚组确定的依据。

早在1985年，Hoshino等人发现VP7是主要中和性抗原，随后的重组轮状病毒活疫苗正是基于这一点，选择仅VP7被人源轮状病毒替换的重配株，均具有较好的保护力。Anderew等人分别在1990年和1992年证实经过改造的VP7基因在重组痘苗病毒中表达，具有与相同感染滴度的SA11活病毒相当。而且其保护性免疫力可遗传给下一代幼鼠。Wang等人1999年将猪源轮状病毒VP7基因改造后在大肠杆菌中表达，也具有很好的中和病毒能力，何金生等人2001年以腺病毒表达人源轮状病毒VP7免疫小鼠，产生较强的体液和粘膜免疫应答(已申请国内专利，申请号CN 02104125.3)，次年彭世勇等人用pCI分别进行VP7、VP4和VP6基因的DNA疫苗研究，结果仅VP7诱导最强的免疫应答；其次，VP7基因是高度保守的，在相同血清型其同源性可高达94-99％，不同血清型其同源性也可高达67-85％，因而具有较宽的疫苗保护性范围。上述研究表明：轮状病毒的外壳蛋白VP7是主要中和性抗原，在诱导机体产生体液和粘膜免疫应答、产生保护性免疫方面起决定性作用。从而为下一步制备高效轮状病毒疫苗提供了理论和实践依据。

绝大多数的人类病原体，是通过与粘膜表面相互作用而引起疾病的。通过这种机制起作用的细菌和病毒病原体，首先与粘膜表面接触，它们能够在粘膜表面粘附和克隆，或者由位于覆盖派氏集合淋巴结和其它淋巴滤泡的上皮中的专门吸收细胞(M细胞)所吸收。当抗原传输到滤泡内的免疫细胞时(例如轮状病毒)，在淋巴滤泡内可能很容易杀伤进入淋巴组织的病原体，从而激发一个潜在的保护性免疫应答。换句话说，能够幸免于局部防御机制的病原微生物，则可能自淋巴滤泡播散，随后引起局部的或全身性疾病(例如：在免疫受损宿主中的沙门氏菌属和脊髓灰质炎病毒。)。机体受到病原侵染后会产生免疫应答的过程至少涉及以下三种免疫机制之一：粘膜、体液或细胞。粘膜免疫应答产生分泌型抗体IgA(sIgA)，sIgA通过阻止粘附和/或克隆、中和表面活性毒素或防止入侵宿主细胞，可以防止病原体与粘膜表面的最初相互作用，从而保护呼吸道、消化道、生殖系统和腺体表面不受侵染。粘膜抗体可阻止病原在粘膜表面定居从而构成第一道防御屏障。粘膜抗体的产生可通过分泌性腺体和组织的局部免疫而获得，也可通过刺激肠道和呼吸道淋巴组织产生。

肠胃外注射灭活的整个细胞和整个病毒标本，在诱发抵抗病原体的保护性血清IgG和迟发性超敏反应中是有效的，在这些病原体的发病机理中有明显的血清阶段(例如伤寒沙门氏菌，乙型肝炎)。然而，肠胃外疫苗在诱发粘膜的sIgA应答时无效，并且对与粘膜表面相互作用但不入侵粘膜的细胞亦无效(例如，轮状病毒)。

一旦抗原被提呈到派氏集合淋结内的T-淋巴细胞、B-淋巴细胞以及辅助细胞，口服途径给药的疫苗就能有效地诱导特异的sIgA应答，在派氏集合淋巴结内，首先启动优先的IgAB-细胞发育。派氏集合淋巴结包含辅助T-(TH)细胞，它能介导B-细胞同型直接从IgM细胞转向IgA细胞。然后，B-细胞迁移至肠系膜淋巴结并且进行胸导管及全身循环，随后种植在体内所有的内分泌组织中，包括消化道和呼吸道的固有层。然后成熟的浆细胞产生IgA，与膜结合的分泌成分形成复合体，随后被运输到粘膜表面，在粘膜表面与入侵的病原体相互作用。这种粘膜免疫系统是应用活的口服疫苗和口服免疫制剂保护性抵御病原体的基础，这些病原体可通过首次与粘膜表面相互作用引起感染。鉴于IgA的保护力是短寿的，一个理想的粘膜疫苗应该是价廉、有效、安全和便于给药(如口服给药)，以便多次服用。

转基因植物技术的发展使上述假设成为可能。含有外源基因的植物细胞可再生出完整植株，并将外源基因稳定地遗传给后代。迄今有些单子叶和双子叶植物都已经进行了成功的转化。例如烟草、马铃薯、西红柿、大豆和玉米等。农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的双子叶植物转化已有众多报道。农杆菌介导的叶盘转化法可有效地进行基因转移、选择和再生。

植物是一种多样化、低成本和可再生的材料资源，而生物技术的迅速发展则使我们进一步拓宽了植物的使用范围，国外在植物中采用这种“分子农业”的方法，已经成功地生产了越来越多的有用物质，其中包括一些高价值药用蛋白多肽，如人的细胞生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等，一些研究机构和公司已经开始从这些药物蛋白的生产中获得巨大的经济效益。

特别值得指出的是，1998年4月，美国国家过敏症和传染病研究所(Natiomnal Instituteof Allergy and Infectious Diseases，NIAID)首次报道了人食用转基因马铃薯后体内能够产生对大肠杆菌热不稳定毒素B亚基的特异性抗体，在11个志愿者中有10人(91％)血清中抗体增加了4倍，有6人(55％)粘膜抗体也增加了4倍。这一研究结果清楚地表明：

(1)在植物中高效表达一些病原蛋白基因是可行的。

(2)病原蛋白在植物中可完成翻译后加工过程，如糖基化和高级结构的空间折叠，从而使这种重组蛋白多肽与天然蛋白具有相同免疫原性，这是原核生物表达系统无法比拟的，后者无法对源自真核生物的蛋白进行糖基化。

(3)植物中产生的抗原蛋白可安全地通过动物的消化道而不会被蛋白酶降解，原因是它们能够与肠粘膜细胞膜表面上的糖蛋白分子受体结合并刺激动物机体产生免疫应答。这类蛋白也被称谓粘膜性抗原(mucosal immumogen)，但并不是所有的蛋白都具有这种能力，现仅发现少数病毒和细菌含有这种抗原。

(4)研究也证实了粘膜性抗原只需要口服少量蛋白，就可以产生良好的免疫应答反应，并不比肌内注射所需要量大。

这些研究结果预示植物将成为继微生物发酵系统和动物细胞培养系统之后又一个新的蛋白表达系统。

利用植物表达系统生产轮状病毒包膜蛋白抗原具有以下优点：

(1)更安全：转基因植物中除只增加了轮状病毒重组抗原蛋白外，没有改变植物其它的遗传组成，因此，它绝不会含有对人体有害成份，也完全排除了污染其它病毒的可能性。

(2)价格更低廉：因为它不需要纯化和冷藏，抗原蛋白的生产可能只是简单地种植农作物，因此可大大降低生产成本。

(3)便用更方便：接种方式只是简单地食用含有该抗原蛋白的植物组织或由该植物组织加工而成的某种胶囊、冲剂或其它制剂，省去了较麻烦的注射过程，这种接种方式非常适用于中国或其它发展中国家。

(4)免疫力更持久：人或动物每隔一定时间服用含该抗原蛋白的胶囊或冲剂，可使体内抗体始终维持在一个较高的水平，增强了对轮状病毒感染的抵抗能力。

已有人尝试在植物中表达牛源轮状病毒结构蛋白VP6、鼠源非结构蛋白NSP4的B细胞表位，⁽³⁾。然而，在本发明之前，还没有人利用植物表达人源轮状病毒VP7蛋白抗原，而正如前文所述该蛋白具有比其它蛋白更强的免疫原性。而且，不同种属来源的轮状病毒抗原不能有效的保护其它种属的轮状病毒感染。

发明内容概述

本发明将含有轮状病毒VP7蛋白抗原的转基因植物加工成胶囊、冲剂或其它制剂的方法，对其中所含的抗原蛋白进行严格定量，从而对人或哺乳动物的食用间隔和食用量有了明确的规定，由此克服了直接食用转基因植物存在的上述缺点。

在没有成功的轮状病毒疫苗可供利用的情况下，非常有必要寻找新的更加安全和廉价的抗原蛋白生产途径。利用转基因植物生产病原体抗原重组蛋白是一种较好的选择，它可能为人类和哺乳动物抵御各种传染性疾病提供一条新途径。

本发明提供表达轮状病毒重组外壳蛋白抗原转基因植物以及如何应用含该重组抗原蛋白转基因植物的方法。本项发明适用于任何国家，特别适用于中国或其它发展中国家。

本发明利用可以食用的转基因植物生产病毒抗原蛋白，这些重组抗原蛋白在免疫原性方面与天然蛋白类似。按照一个优先的实施方案，就是本发明提供了转基因植物、与人或动物疾病相关的病毒重组抗原蛋白的生产方法以及如何具体应用这种含重组抗原蛋白转基因植物的方法。这里所指的疾病是指那些具有在自然状态下能够引起免疫应答、特别是粘膜免疫应答反应抗原的病毒病原。按照一个优先的实施方案，病毒病原指的是轮状病毒，植物指的是人们日常食用的植物。

本发明克服了以前一些病毒抗原蛋白生产方法如微生物发酵和动物细胞培养的缺点，它利用转基因植物生产病毒抗原蛋白，如果将其加工成口服胶囊、冲剂或其它制剂，则具有廉价、安全和使用方便的特点，会使更多人或动物得到保护。按照一个优先的实施方案，人或哺乳动物只需食用这些转基因植物的果实、汁液、根、茎、叶或植物的其它部分，或以肠道给药的方式利用这些转基因植物或转基因植物粗提取物制备的胶囊、冲剂或其它制剂便可获得对疾病的免疫能力。这里的植物是指人们日常所食用的，同时由于避免提纯过程，降低了生产成本和存在的其它一些不利因素。

按照一个实施方案，本发明涉及利用转基因植物生产含抗原蛋白胶囊、冲剂或其它制剂的方法。生产这种胶囊、冲剂或其它制剂的转基因植物材料可以有多种方式，可以是完整植物，或植物的一部分如果实、叶子、茎和块茎，或植物某一部分的粗提物、或经完全纯化以及部分纯化源自转基因植物的病毒抗原蛋白。总之，采用何种方式主要取决于抗原蛋白本身的免疫原性，产生粘膜免疫应答反应所需这种源自转基因动植物的抗原的剂量以及在这种成份中所含的干扰免疫应答反应的物质的多少，如糖类、热原和毒素等，并尽量降低免疫耐受性的产生。

本发明所指的抗原蛋白是指在转基因植物中生产的，首先是编码病原抗原蛋白的基因被分离出来。然后插入到一个含有选择标记的质粒上，启动子位于该基因的上游，它操纵该基因在植物中的表达。外源基因在植物各器官或可食用部分中表达后，人或动物可食用这部分植物组织。

本发明提供了在植物细胞中生产病毒重组蛋白的方法，而该蛋白已知在天然状态直可引起哺乳动物产生免疫应答反应。或者说，本发明所指的病毒重组蛋白可作为抗原，具有与源自哺乳动物和其它常规表达系统产生的该抗原蛋白如酵母和细菌一样的免疫原性，或者更确切说，本发明的抗原蛋白与源自哺乳动物和其它常规表达系统产生的该抗原蛋白一样，均能够通过口服和肠道给药的方式引起免疫应答反应。按照一个优先的实施方案，这种病毒重组蛋白是一种抗原蛋白，它可以在植物细胞中表达产生，且具有与源自哺乳动物或其它常规表达系统所产生的该抗原蛋白相似的免疫原性。

本发明的抗原源自一种哺乳动物的病毒，它可在植物中表达产生。按照一个优先的实施方案，抗原源自一种哺乳动物病毒病原。因此，可以说在植物中表达产生的最有用的病毒抗原是那些来源自哺乳动物如人的病毒病原的抗原。

本发明的抗原可在植物中表达产生，而表达产生该抗原的植物至少有一部分是可以直接食用或经过粗加工后可以食用。这种植物或植物的食用部分不应具有毒性，因此，许多常见的食用植物，例如西红柿、莴苣、胡萝卜、黄瓜等都包括在本发明所定义的植物范围之内。此外，在某些情况下，如马铃薯，在这里也被认为是可食用植物，尽管它的某些部分被认为是有毒的(马铃薯块茎部分是无毒的，因此属于本发明的权利要求范围之内，但它的果实是有毒的)，在这种情况下，这种植物也应包括在本发明的权利要求范围之内。植物可以是双子叶植物或是单子叶植物。

按照一个优先的实施方案，本发明的抗原应该是一个粘膜性抗原。它具有引起粘膜免疫系统产生特异性免疫应答的能力。按照一个更加优先的实施方案，这些粘膜抗在一定剂量范围之内能够引起粘膜和体液产生免疫应答反应，而不会导致产生免疫耐受性和过敏反应。免疫耐受性在这里被定义为：在人或哺乳动物多次食用该抗原之后，导致随后的特异性抗原-抗体反应能力消失。当然，本发明中的抗原也有可能产生粘膜系统免疫耐受性，但如果改为注射后，该抗原仍然能保持它的免疫原性。

本发明的重组抗原蛋白可以是病毒天然抗原蛋白的全部。然而，在某些具体实施方案中，抗原也可能只是该天然蛋白分子的一部分。有时，抗原可与另外一个多肽或蛋白分子如细菌病原蛋白多肽结合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工、共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译前就连接在一起。这两种技术是本领域专家早已熟知的技术。

在某些实施方案中，本发明的抗原将指的是来自一种肝炎病毒的抗原，在某些更优先的实施方案中，将选择使用轮状病毒外壳蛋白抗原。并且优选所说的抗原是具有Seq.ID.No.4所示的核苷酸序列或其简并序列的基因所编码的人源轮状病毒VP7抗原；其中术语“简并序列”是指基于密码子的冗余可以根据植物宿主细胞密码子的偏好性而在编码抗原的基因序列中引入适当的简并密码子加以替换，这样得到的抗原蛋白的氨基酸序列保持不变，但是表达效率大为提高。更进一步地，所说的抗原是具有Seq.ID.No.5所示的氨基酸序列的VP7抗原。因此，按照一个进一步的实施方案，轮状病毒外壳蛋白抗原基因在植物中表达，而该重组抗原可引起免疫应答反应、特别是粘膜免疫应答反应就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。

在本发明的其它实施方案中，一种表达哺乳动物病毒重组抗原蛋白的转基因植物被构建。就本发明而言，一种转基因植物至少应该在该植物的部分细胞中表达了某种病毒抗原。按照本发明的某些优先实施方案，本发明的转基因植物至少有一部分是可以食用的，其所表达的抗原是轮状病毒包膜中蛋白抗原，它能够引起免疫应答反应，特别是粘膜免疫应答反应，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。

本发明涉及到了一种食物的组成问题，该食物中至少含有转基因植物的某些食用部分，这里的转基因植物应能够表达轮状病毒包膜中蛋白抗原。就本发明而言，植物或植物的某一部分被认为应该具有某些营养价值，它能够为人或其它哺乳动物提供代谢所需的能量，维生素的其他辅助因子。尽管莴苣并不大量提供能量、蛋白质、碳水化合物和脂肪，但就因为它含有重组抗原蛋白而被人们特意食用的话，莴苣也应包括在本发明的权利要求范围内。莴苣的粗纤维对哺乳动物的健康是有利的，即使哺乳动物并不能够消化莴苣的粗纤维。

本发明涉及到了一种胶囊、冲剂或其它制剂的组成成份问题，胶囊、冲剂或其它制剂中可以含有适当的药学上可接受的载体或赋形剂等，但至少含有转基因植物的某些食用部分，这里的转基因植物应能够表达一种重组病毒抗原蛋白。就本发明而言，胶囊、冲剂或其它制剂中含有的抗原蛋白应该能够精确定量，以避免人或动物食用后产生免疫耐受性。按照本发明的一个优先实施方案，本发明的胶囊、冲剂或其它制剂所含有的抗原是轮状病毒包膜中蛋白抗原，它能够引起免疫应答反应，特别是粘膜免疫应答反应，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。

正如上述所述，按照本发明的某些实施方案，这里的食物将包括含有粘膜性抗原蛋白的食物，这种粘膜性抗原蛋白能够与粘膜细胞表面糖基化分子受体结合，它可以是一种融合蛋白或者是源自某种肝炎病毒的抗原。因此，按照一个更加具体的实施方案，本发明所指的食物将至少包括转基因植物的一部分，它具有某些营养价值，关含有轮状病毒外壳蛋白抗原，而该抗原能够与粘膜细胞表面的糖基化分子受体结合。在任何情况下，本发明的食物都包括植物的根、茎、叶、果实或所说的植物种子。

对本发明所使用方法和其它相关事项极为重要的是一些质粒载体的构建，它们在获得本发明所指的转基因植物以及转基因植物的加工应用中起重要作用。用于转化植物的质粒载体由编码哺乳动物病毒抗原的DNA序列和操纵该DNA序列在所说的植物中表达的一个植物启动子组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择或标记基因，主要用于转基因植物或细胞的检测。在某些具体实施方案中，本发明的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。正如上面所述，按照某些具体的实施方案，本发明的质粒载体用于转化可食用植物，它编码的抗原是一种粘膜抗原，更进一步说，质粒载体所编码的抗原能够诱导免疫应答反应，特别是粘膜性免疫应答反应，就象天然蛋白和源自其它表达系统所产生的该抗原蛋白一样。在一个优先的实施方案中，本发明用于转化植物的质粒载体含有编码轮状病毒包膜中蛋白抗原的基因以及一个植物启动子，该基因编码的蛋白抗原可引起免疫应答反应、特别是粘膜免疫应答反应就如同天然蛋白或源自其它表达系统的该抗原蛋白一样，而植物启动子主要是操纵该基因在植物中的表达。在一个类似的实施方案中，本发明提供的DNA片段可用于基因枪法转化植物。

本发明也提供了获得转基因植物细胞的方法，它包括以下步骤：1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码病毒抗原的基因，而且该基因被置于一个植物启动子的操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞。按照一个优先的实施方案，还包括从转化的植物细胞再生出完整的转基因植株的方法。

本发明提供了各种植物细胞或植物的转化方法。尽管在下面描述的某些优先实施方案中仅利用了特定的转化方法，但显而易见的是，本领域专家所早已熟知的其它植物转化方法也应包括在本发明的权利要求范围之内，这些方法包括微管注射、PEG融合、电融合。按照某些优先实施方案，使用的是农杆菌介导的转化方法，特别指Ti质粒参与的农杆菌转化系统。在其它一些优先实施方案中，还可以使用基因枪法转化植物细胞或植物。

本发明植物转化方法中所用的质粒载体是一个双元载体系统。按照一个实施方案，本发明使用的质粒是一个整合性载体。按照一个更加优先的实施方案，本发明所使用的质粒是pBI121。

本发明提供了一种转基因食物的生产方法。它包括以下步骤：1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码病毒抗原的基因，而且该基因被置于一个植物启动子操纵之下；2.用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3.从转化基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4.收获转基因植物的食用部分；5.食用一定量的这种转基因植物，尽量避免产生免疫耐受性，以达到预防疾病的效果。

本发明也提供了含确定数量抗原蛋白胶囊、冲剂或其它制剂的生产方法，它包括以下步骤：1.构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码病毒抗原蛋白的基因，而且该基因被置于一个植物启动子操纵之下；2.用质粒载体将上述DNA片段转化植物细胞；3.从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4.自转基因植物细胞或完整植物中提取出抗原蛋白加工成胶囊、冲剂或其它制剂。按照一个优先的实施方案，含有抗原蛋白的完整转基因植物或者其某些食用部分可直接进行冷冻、干燥的粉碎，然后加工成胶囊、冲剂或其它制剂，并确定其中含有的抗原蛋白数量。

本发明包括以下几个组成部分：1.利用DNA重组技木构建质粒表达载体，它含有轮状病毒外壳蛋白抗原基因或其衍生物，人或其它哺乳动物在食用该抗原蛋白后有可能产生针对轮状病毒的特异性中和抗体；2.选择适宜的受体植物进行转化，使编码抗原蛋白的基因稳定地整合入受体植物的染色体中并可遗传给后代；3.从转化的受体植物细胞中再生出完整的转基因植物，而且该植物能够稳定、高效地产生轮状病毒外壳蛋白抗原；4.人或哺乳动物直接食用这种转基因植物或以肠道给药的方式口服以该转基因为主要活性成份加工而成的胶囊、冲剂或其它制剂后，有可能预防轮状病毒的侵染。

本发明提供了表达轮状病毒外壳蛋白或其衍生物转基因植物的构建方法，这种转基因植物作为食物或加工成胶囊、冲剂或其它制剂后被人们食用有可能引起人或哺乳动物的免疫应答。这种免疫应答的结果使人或哺乳动物对轮状病毒的感染具有抵抗能力。这种免疫应答是由于在转基因植物中表达轮状病毒外壳蛋白抗原后而产生的结果，而轮状病毒外壳蛋白抗原的产生则是由于该抗原蛋白基因整合入植物的基因组中并在启动子调控下能够稳定地表达的结果。

附图的简单说明

为了详细描述本发明的某些优先实施方案，并以相应的绘图作参考：

图1轮状病毒VP7基因克隆示意图

图2轮状病毒VP7基因重组到植物表达载体构建示意图

图3质粒PBI121-VP7所含的结构基因及其调控表达序列

图4不同转基因马铃薯植株叶片中VP7蛋白的含量

图5转基因马铃薯叶片基因组总DNA Southern blot结果

图6转基因马铃薯块茎可溶性总蛋白Western blot结果

图7转基因西红柿果实可溶性总蛋白Western blot结果

在图3中，Nos-Pro＝胭脂碱合成酶；NPT-II＝新霉素磷酸转移酶；Nos-Ter＝胭脂碱合成酶终止子；35S Pro＝花椰菜花叶病毒35S启动子；RB＝T-DNA右边边界；LB＝T-DNA左边边界

在图4中，1.阴性对照株块茎抽提可溶性总蛋白；2-21.转基因马玲薯块茎抽提可溶性总蛋白；

在图5中，1.阳性对照，10ng重组PBI121-VP7质粒；2-9.转基因马玲薯植株；10.阴性对照株.

在图6中，1.阳性对照，市售重组VP7蛋白；2-5.转基因马玲薯块茎抽提可溶性总蛋白；6.阴性对照株块茎抽提可溶性总蛋白.

在图7中，1.阴性对照，未转基因西红柿叶片抽提总RNA；2-8.不同转基因西红柿植株叶片抽提总RNA.

本发明的详细描述

1.HRV疫苗的发展历史

人类轮状病毒(HRV)是引起婴幼儿急性腹泻和死亡的重要病原体，占所有肠道感染病因的50％以上。全球每年因RV感染致死的病例超过100万，卫生条件对RV的传播影响很小，营养状况与发病危险的关系也不如细菌性腹泻那样密切，无论卫生条件较好的发达国家，还是在卫生条件较差的发展中国家，3岁以下的婴幼儿约有90％都要受到RV的感染。美国每年由此的医疗和间接开支逾10亿美元。轮状病毒腹泻在全球已成为一项重要的公共卫生问题，世界卫生组织(WHO)对开发其疫苗给予了高度重视。发展轮状病毒疫苗，预防病毒性腹泻是刻不容缓的任务。近20年来RV疫苗的研制工作进展很快，取得的一些突破性成果简述如下。

第一代轮状病毒疫苗-轮状病毒口服减毒活疫苗人和动物轮状病毒的VP6具有相同的抗原性，动物毒株比人RV毒株易于在组织培养中生长且对人天然减毒，省去了体外减毒的步骤，因此动物RV株被用来研制减毒活疫苗。这种用动物病毒株预防人类疾病的方法称为“琴纳法”。口服减毒活疫苗可以有效地诱导局部粘膜免疫，产生抗体和细胞介导的免疫反应，且免疫持续的时间比灭活疫苗更长，因而成为首选疫苗。比较有代表性的有：(1)比利时SmithNine-RIT所发展的多次传代减毒的牛株(RIT-4237)疫苗，是把牛轮状病毒NCDV株在原代牛肾(或猴肾)细胞中经147次传代后获得的减毒株；(2)美国国立卫生研究院Kapikian等从3～5月龄腹泻的恒河猴粪便中分离到的病株，经猴肾细胞传9代之后得到的减毒株，恒河猴轮状病毒疫苗MMV—18006。该疫苗具有高度免疫原性，故接种剂量小，成本低，但引起发热、水样便和病毒排出率均高于RIT-4237，保护性不稳定(0～85％)；(3)美国费城Wistar研究所和法国erenx研究所联合研究的低传代牛RV疫苗Wister-eneux牛株疫苗(WC3)，是将牛RVWC3株在CV-1细胞中传12代，为G6型。主要不足仍为保护性不稳定。

第二代轮状病毒疫苗为多价重组疫苗由于早期的动物轮状病毒疫苗株型别单一，在婴幼儿服苗者中诱发的主要是同型免疫。为了提高疫苗效力，开始了多价重配疫苗的研制。首例自然发生的人RV基因重配株37于1985年在委内瑞拉新生儿感染粪样中分离获取。由于不同亚群重配株在自然状态下很难见到，人们利用轮状病毒RNA在自然或实验条件下易于发生基因重组的特性，运用基因重组技术构建了单基因替换重组体，使之既能诱生对人RV亲本株的免疫力又保留动物RV亲本株减毒特性及在体外高滴度生长的能力。由Kapikian等分别以编码人轮状病毒3个主要血清型的VP7基因作为亲本，其余10个基因都来自恒河猴轮状病毒(MMU18006G3型)，构建了4价恒河猴RV疫苗(RRV-TV)。申硕等组建了以羊RVLc40(G10)为背景，携带猴RVSA11(G3)第4，9基因片段的羊-猴RV基因重配株L-S4/9，该实验室还以羊RV为背景，组建了羊与人RV的杂交株L13 X DS-1(G2)，L-S4/9 X Hochi(G4)。羊RVLL-85的弱毒株是我国独有的相当理想的受体株，这对于人用RV疫苗的开发具有重要意义。这些重组株对人RV所有4个血清型有刺激同源免疫的可能性，同时又获得满意的减毒和遗传学稳定性。获得成功的是1998年8月31日在美国食品和药物管理局(FDA)批准的Wyeth-Lederle公司生产的4价口服RRV-TV疫苗，ACIP(美国疾病控制和预防中心免疫实施咨询委员会)批准此疫苗纳入儿童计划疫苗(VFC)中。但次年11月，该疫苗不得不撤离市场的原因是接到轮状病毒疫苗在15名婴儿中导致肠套叠的疫苗有害事件报告。因此，安全性是成了研制RV疫苗的首要考虑因素。

第三代RV疫苗—基因工程疫苗。随着基因工程的兴起，采用基因工程原理与技术研制的新型疫苗克服了以上传统疫苗的不足，取得了不少进展。有代表性的有以下几种：

(1)亚单位或多肽疫苗运用基因工程方法采用原核或真核表达载体表达病毒的抗原基因作为免疫原进行动物免疫。如1987年Meccrea等将VP7编码基因中的不同区段分别与pEX重组，结果只有pEX3/8/5一种重组方式较为理想，经转化，诱导后可高产量地合成β-Gal-VP融合蛋白，用之免疫动物产生特异的高滴度的免疫抗血清。试验证明此种疫苗安全、有效，与重组疫苗交替使用可成为其加强剂。但亚单位疫苗最大的缺点是高度纯化的疫苗免疫原性较弱，不能有效地刺激机体产生抗体和局部免疫应答，而预防轮状病毒感染恰恰需要肠道的局部免疫。

(2)DNA疫苗DNA疫苗是90年代初发展起来的一种疫苗形式。以其良好持久的免疫反应性、制备简单、易于保存等传统疫苗难以比拟的优点而受到普遍重视。DNA疫苗是利用基因重组技术直接将编码某种外源蛋白的目的基因，或将几种不同病原体的保护性抗原的DNA序列克隆到一个载体上制成的多价DNA疫苗，注入宿主体内，使之长期地在体内持续表达，从而激发免疫反应及保护性免疫应答。也可将抗原基因与某些细胞因子克隆到同一载体上，起到联合免疫和增强免疫效果的作用。Greenberg等将编码鼠RV VP4、VP6、VP7基因的cDNA插入表达质粒pCMV作为DNA疫苗，对同型RV有一定保护作用，表明DNA疫苗可能是控制RV腹泻一种新方法。其缺点是免疫原性较低，口服免疫不能有效激发局部免疫。

(3)转基因植物口服疫苗利用转基因植物生产重组蛋白，细胞易培养且保留重组蛋白天然免疫原性，转化植株的种子易于储存，具有安全、廉价、便于大量生产等优点，使转基因植物生产基因工程疫苗成为当前一大热点，并为“生物制药”提供了可能性。目前人们已建立了烟草、马铃薯、西红柿、香蕉等转植物基因表达系统，并成功地获得了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、链球菌属突变株表面蛋白(spaA)等十几种疫苗。在发展中国家生产并接种这种由植物制备的“可食用疫苗”为RV疫苗的研究和发展开拓了更广阔的前景。

2.农杆菌介导的核转化疫苗

目前，研究成功的转基因疫苗中约80％是由农杆菌介导形成的转基因植物表达系统产生。这种表达系统的成功构建源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是一种寄主非常广泛的土壤细菌，在自然状态下它能通过伤口侵染大多数双子叶植物，导致冠瘿瘤的发生[4]。其侵染机理是基于农杆菌体内的Ti质粒和vir基因即毒性区两部分的共同参与，Ti质粒中有一个DNA片断，称为转移DNA(Transfer DNA，T-DNA)。大多数双子叶植物组织受到创伤后，诱导植物细胞分泌某些酚类物质，如乙酰丁香酮(acetosyringone，简称AS)或羟基乙酰丁香酮(ahydroxyacetosyringone，简称OH-AS)，这些酚类物质即成为创伤信号分子或创伤诱导分子。vir基因受到创伤信号刺激后，转录活化其一系列基因VirA、B、C、D、E、F、G、H等，这些基因的表达产物最终形成膜通道以便于T-DNA复合物向植物细胞转移。T-DNA复合物通过其左右边界各为25bp的重复序列以单拷贝或多拷贝的形式将T-DNA复合物插入到宿主基因组中。将外源基因与T-DNA左右臂相连，同样可以将外源基因整合进植物基因组并得以表达，而且整合进植物基因组的外源DNA片断能够通过减数分裂以孟德尔遗传方式传递给后代^[5]。

利用农杆菌的这一特性，人们已构建了多种Ti质粒载体系统。Ti质粒载体系统包括两个基本要素：第一，含有T-DNA边界序列的一个重组质粒载体，这个质粒能够在大肠杆菌和农杆菌之间进行穿梭。这是因为Ti质粒是一个大质粒，很难对其进行常规的基因克隆操作，必须借助于一个中间的载体质粒，在大肠杆菌上进行常规的基因操作，连接上外源基因，然后转移到土壤农杆菌中，与相应的Disarmed Ti质粒共同组成一个完整的Ti质粒载体系统；第二，作为载体系统的质粒和农杆菌株必须含有完整的vir基因。

目前，广泛用于转基因植物的Ti质粒载体系统有共整合载体系统和双元载体系统。共整合载体是指Ti质粒上编码致瘤基因的序列被一段pBR322 DNA所替代，带外源基因的pBR322衍生中间载体由大肠杆菌转入农杆菌后，二者相同的pBR322序列发生同源重组，外源基因就此整合到disarmed Ti质粒上。双元载体系统是指一个农杆菌株系中含有两个彼此分离的质粒：一个是含有T-DNA和外源基因重组的多功能克隆载体质粒，它即能在大肠杆菌中进行复制，又能在农杆菌中进行复制，并能从大肠杆菌迁移到土壤农杆菌中；另一个是含有vir基因序列的Ti衍生质粒。

3.植物转化方法

有许多种方法可以将外源基因导入单子叶植物和双子叶植物。将外源基因稳定整合入植物染色体基因组DNA的主要方法包括：1)农杆菌介导法；2)DNA直接摄入法，包括PEG介导的原生质融合法、电激法、微管注射法以及使用基因枪将DNA直接送入植物细胞和组织等。

农杆菌介导法是利用质粒载体将特定的DNA片段整合入植物染色体基因组DNA。植物组织的转化方法因植物和农杆菌系统而异。最常用的方法是叶盘法，它适用于任何易于再生成完整植株的植物外植体。农杆菌转化方法特别适用于双子叶植物的转化。

正如上面已提到的各种DNA直接摄入转化方法，电激法是先将原生质体置于放在一个强电场中，在电流作用下将外源DNA送入原生质体内。微管注射法是用微管将DNA直接注射入细胞中。基因枪法是将DNA先吸附在硫酸镁或钨粒上，这些颗粒被加速射入植物细胞或组织中。

按照本发明的一个优先实施方案，农杆菌Ti质粒系统被选用。农杆菌的Ti质粒中含有一段叫做转移DNA(T-DNA)的，它可以进入植物细胞并整合入植物的染色体中。转移载体的构建分为两步，首先是构建一个可以在大肠杆菌中复制的质粒，这个质粒含有目的基因(在这里专指轮状病毒外壳蛋白抗原基因)；抗原基因的两端含有T-DNA边界序列，它负责目的基因在植物基因组中的插入位点。通常另外一个选择标志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右边界序列中，该基因在植物细胞中表达后可提供一个选择标记证实植物或植物细胞是否含有整合的T-DNA序列。载体构建的第二步是将质粒从大肠杆菌转移到农杆菌中。这可以通过电穿孔直接导入方式完成。为了T-DNA的转移，所用的农杆菌菌株中还要含有一套诱导基因，它们在T-DNA转移到植物细胞中起重要作用。

植物组织的转化方法因植物和农杆菌介导系统而异。最常用的是植物叶盘转化法，它适于多种易于再生的植物外植体。在某些情况下，还需要加入一些辅助细胞。其他的转化方法包括原生质体转化，继而由原生质体再生出植物细胞及完整植株。

4.基因表达启动子

在受体植物和转化方法确定之后，一个组成型的、发育调节型的或组织特异型的表达启动子被选择以便外源基因能够在植物中表达。

所有已知能操纵外源基因在植物细胞中转录的启动子都可以在应用在本发明中。这些启动子可从植物或病毒中获得，如花椰菜花叶病毒35S启动子(包括经过拼接、加倍和突变改造后的35S启动子)；光诱导基因启动子如核糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)；逆境诱导基因如乙醇脱氢酶(Adhl)或玉米肌动蛋白基因启动子生成，但不仅限于此。本发明也可利用已知在植物可食部分高效表达的启动子如马铃薯质体基因启动子。

用于植物转化的质粒通常含有一个选择标志基因。许多有此功能的基因已被开发出来。

本发明的具体实施方式

下面以转基因马铃薯和西红柿生产轮状蛋白抗原为例，描述一个优先的实施方案。

实施例1

轮状病毒外壳蛋白抗原植物表达载体PBI121/VP7构建

如图1所示，轮状病毒(血清型G1)总RNA被从腹泻患儿的粪便中分离出来作为模版，根据已知的轮状病毒RNA核酸序列合成特定的引物，具体碱基序列见序列表中Seq.ID.No.1-2，并通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得了轮状病毒外壳蛋白VP7基因。在3’端引物中引入了内质网滞留序列SEKDEL，具体碱基序列见序列表中Seq.ID.No.3，以上述扩增成功的PCR产物为模板，上游引物不变，再次扩增。将此PCR产物回收，纯化，直接克隆到PUC-T载体，经酶切鉴定选择反向插入的克隆，命名为PUC/VP7，通过进一步的序列分析，确定轮状病毒外壳蛋白基因VP7阅读框正确、完整，并已和内质网滞留序列SEKDEL融合。

用限制性内功酶XbaI和Sac I双酶切将轮状病毒蛋白基因VP7切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得该DNA片段，随后插入到质粒pBI121原GUS基因位点上(XbaI和SacI双酶切)便构建成双元表达载体PBI121/VP7。

质粒pBI121购自美国Clonetech公司，它的XbaI和Sac I限制性酶切位点分别位于花椰菜花叶病毒35S启动子和GUS基因起始密码之间以及GUS基因终止序列和NOS终止子之间。选用质粒pBI121是因为用XbaI和Sac I双酶切可将GUS基因删除，而随后可插入另一个蛋白基因。新基因将能够在植物细胞内表达。质粒pBI121还含有新霉素磷酸转移II基因(NPTII)，它编码的酶可为植物细胞提供卡那霉素抗性，从而可将含有T-DNA的细胞和组织筛选出来。NPT II基因有自己的启动子和多聚腺酸信号序列，它们源自胭脂碱(Nopaline)合成酶(NOS)基因。

质粒PBI121/VP7含有：1)新霉素合成酶基因II(NPT II)，它提供给植物细胞卡那霉素抗性；2)轮状病毒外壳蛋白抗原基因VP7及操纵基因的花椰菜花叶病毒35S启动子；3)T-DNA左右边界序列，它可将NPT II基因和轮状病毒外壳蛋白抗原基因VP7转移到植物体内并整合到植物染色体中。PBI121/VP7的结构如图4所示。

实施例2.将表达载体PBI121/VP7导入农杆菌(A.tumefaciens)

含有轮状病毒外壳蛋白抗原基因VP7的质粒PBI121/VP7被通过电穿孔的方式转移到农杆菌LBA4404菌株中，该菌株来自美国Clonetech公司。菌株LBA4404现已被广泛应用是因为它是一改造后的农杆菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已经被删除。Vir基因可反式调节T-DNA自质粒PBI121/VP7向植物细胞内的转移。

将OD值为0.6～0.8的农杆菌液20ml离心后，去离子水洗两次，重悬于1ml10％甘油；以40μl菌液加入2μl(约50ng)重组质粒PBI121/VP7，充分混匀；参数设置：电穿孔杯为0.1cm，电容25μF，电阻200Ω，电场强度18kv/cm。经电击后加入LB0.8ml和1M葡萄糖20μl混匀，转入1.5ml离心管，28℃225转/分振荡培养3hr；取100μl铺于含链霉素125mg/ml、卡那霉素50mg/ml的LB平板上，28℃培养36h，含有PBI121/VP7重组质粒的农杆菌菌落开始产生。

用碱裂解法从农杆菌中提取质粒DNA，并用限制性内切酶酶切可检测PBI121/VP7质粒DAN是否存在。

实施例3.农杆菌介导的植物遗传转化

植物的遗传转化首先是植物组织器官与农杆菌共培养，在培养约2天后，将植物外植体移置相应的选择培养基中。植物外植体可以是原生质体、愈伤组织或其它器官组织，因植物而异。我们选用子叶或茎段转化方法。

马铃薯无菌苗[品种为台湾红(Taiwanhong)，西南农业大学生物技术中心提供]。生长在23℃光照培养箱中，辅之以中等光照强度下，每隔3个星期剪取顶端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固体培养基中，生长2星期的马铃薯茎段最适于转化。西红柿(重庆市农作物研究所提供)则以7-10日龄的子叶或下胚轴无菌外植体进行转化。

含有表达载体PBI121/VP7的农杆菌LBA4404接种在50ml YEP培养基(含50mg/ml卡那霉素和125mg/ml链霉素)中28℃培养2天，5000g离心5分钟收集菌体，用25ml液体MS培养液(含抗生素)洗涤一次，再用MS重新悬浮至OD_600nm＝0.5-0.8。将有伤口的叶片浸入稀释后的农杆菌培养液中3-5分钟，用无菌滤纸吸干叶片上多余的菌液，然后将叶片移置不含任何抗生素的再生培养基上23-25℃共培养2天。将外置体移置新鲜的选择培养基上培养，该培养基中含有100-200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧苄青霉素，以后每两周更换一次培养基。当叶片伤口处愈伤有幼芽形成并长至足够大时，将幼芽切下(通常在转化后45天或更长)转移到生根培养基上生长。当根出现后，将再生植株移置无菌条件下生长或转移到土壤中，给予适宜的温度、光照和营养条件下生长。

实施例4.抽提阳性转化株植物的总DNA

按照CTAB法(McCouch，1988)，取100mg新鲜植物的叶片、茎、块茎或果实，液氮冷冻后研成粉末状，加入两倍体积60℃预热的匀浆缓冲液(CTAB 2％V/W，NaCl 1.4mol/L，EDTA0.02mol/L，Tris-HCl 0.1mol/L)轻轻颠倒混匀，60℃保温45分钟。加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀。5,000rpm，15-20℃离心5分钟。取上清，加等体积的氯仿/异戊醇，混匀。5,000rpm，15-20℃离心5分钟。取上清，加2/3体积预冷的异戊醇，混匀。-20℃放置2-3小时或过夜。11,000rpm离心10分钟。弃上清，沉淀干燥，加适量的TE溶解沉淀。加1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2-3倍体积预冷的无水乙醇，-20℃过夜。11,000rpm离心10min，弃上清。自然晾干沉淀，加适量TE溶解沉淀，紫外分光光度计上测定OD260nm、OD280nm及其比值，并进行DNA的定量。然后置-20℃保存备用。

上述抽提的总DNA稀释10倍后取1ul作为PCR模板，按前面扩增vp7的条件进行扩增，取5μlPCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳。待DNA条带迁移到合适位置，终止电泳并在紫外灯下照相纪录结果。

实施例5.转基因马铃薯的RNA分析

利用地高辛标记的包膜中蛋白基因探针，对PBI121/VP7表达载体转化后的卡那霉素抗性马铃薯植株RAN进行了杂交分析。

转基因马铃薯植株的叶片总RNA被提取，方法见参考文献(27)。取2g材料放入研钵中，倒入液氮，研成粉末。收进50ml离心管中，加入10ml(5ml/g)65℃预热的抽提buffer，振荡30s。65℃水浴，振荡2-3min。加入等体积氯仿，振荡10min。18℃，12000g离心5min。(重复一次)加入1/4体积的LiCl(10M)，4℃过夜。4℃，10000g离心20min。500μl0.5％SDS溶解沉淀。加入等体积氯仿，再次抽提一次。加入2倍体积无水乙醇，-20℃，2h。10000g，4℃，离心20min；吹干沉淀10min。DEPC处理水溶解沉淀(或用70％乙醇悬浮，-70℃保存)。沉淀溶于DEPC处理过的无RNA酶水中，RNA浓度可用紫外分光光度通过测定130nm的吸光值进行估算定量，置-20℃保存备用。假定1mg/ml的RNA吸光值是25单位。

取10μg RNA样品，约5μl，与2倍体积RNA样品缓冲(10ml去离子甲酰胺，3.5ml37％甲醛，2ml 5X MOPS)混合后，65℃加热5分钟，冷却后，加入3μl RNA加样缓冲液(50％甘油，1mM EDTA，0.4％溴酚蓝)，然后经过1％的RNA琼脂糖凝胶电泳。核酸通过毛吸管法转移到尼龙膜(Roche公司产品Cat.NO.1417240)上，所用的缓冲液为20×SSC，pH7.2(3M NaCl，300mM醋酸钠，pH7.0)，转移时间为16小时。核酸通过紫外线照射后被交连在尼龙膜上，将膜置于预杂交液中[50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt试剂，0.1％SDS]，68℃预杂交3小时，然后更新的杂交液[50％甲酰胺，5×SSPE，2×Denhardt试剂，0.1％SDS 0.02％SDS，1％的封闭剂(Roche公司试剂盒提供)，5ml杂交液中加入变性的地高辛标记的DNA探针60ng进行杂交，探针是来自质粒PBI121/VP7的XbaI和Sac I的酶切片段，包括了轮状病毒vp7基因的全部编码序列和内质网滞留序列SEKDEL。在杂交液中68℃杂交24小时后，取出杂交膜，于200ml 2×SSC，0.1％SDS缓冲液中室温下洗膜2次，然后于100ml 0.1×SSC，0.1％ SDS缓冲液中68℃洗膜2次。显色反应基本依据试剂盒中提供的方法(Roche公司试剂盒)，尼龙膜先于洗脱缓冲液[0.1M马来酸，pH7.5；0.15M NaCl；3％ Tween 20％(w/v)]中平衡5分钟，然后用50ml 1×封闭缓冲液封闭30分钟，加入碱性磷酸酶标记的地高辛的抗体至浓度为75mU/ml，室温下反应30分钟，用洗脱缓冲液2次，每次15分钟。将膜移置20ml显色缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH9.5；0.1M NaCl；50mM MgCl₂)中平衡5分钟，更换新的底物缓冲液(200ul NBT/BCIP底物加入10ml显色缓冲液)，遮光条件下显色16小时，待所期望的条带出现后，用水终止反应。

携带有质粒PBI121/VP7的转基因植株和阴性对照植物的RNA杂交。不同转基因植株的RNA杂交信号变异很大，这可能是由于基因的插入位点和基因的拷贝数不同引起的。和标准RNA分子量相比，转录的RNA约有1kb长，与预先估计的相一致。阴性对照植物的RNA没有观察到杂交信号。

实施例6.不同转基因马铃薯植株轮状病毒外壳蛋白含量的测定

取不同转基因马铃薯植株叶片0.1g，各加入1.5ml去离子水，在4℃下用玻璃匀浆器磨碎。匀浆液16000g 4℃离心5分钟，利用Bradford法(蛋白测定试剂盒购自Bio-Rad公司)，取部分上清液测定可溶性蛋白含量，以BSA作为标准蛋白质。以MA104细胞培养的人源轮状病毒总蛋白为阳性对照(VP7蛋白含量为总病毒蛋白含量的30％)。阳性对照被稀释成不同蛋白水平(即VP7蛋白含量为0.01-5.0ng)，在颜色反应后，读取492nm光吸收值，制备一条标准吸收曲线。如图4中所示，通过比较发现，阴性对照植物中(柱1)没有发现含有轮状病毒VP7蛋白，而在转基因马铃薯植株中则可以检测到不同含量的轮状病毒VP7蛋白，含量约为植物可溶性蛋白2-380ng/mg(柱2至柱21)。不同转基因马铃薯之间差异比较大这可能是由于基因插入的拷贝数和插入位点不同引起的。

实施例7.转基因马铃薯不同组织器官轮状病毒VP7蛋白含量的测定

取转基因马铃薯叶片、茎和块组织各0.2g，处理和测定方法同上。表2中列出了转基因马铃薯不同组织器官中轮状病毒VP7蛋白的含量。

马铃薯叶子中的轮状病毒VP7蛋白表达量最高约为可溶性蛋白的0.014％，为380ng/g鲜重。马铃薯块茎中的轮状病毒VP7蛋白含量略高，为可溶性蛋白的0.013％，约为420ng/g鲜重，这就为加工和利用马铃薯块提供了极大的方便。

表2 马铃薯叶子、茎和块茎中的包膜中蛋白含量

实施例8.Western blot检测转基因马铃薯块茎中轮状病毒VP7蛋白

选择阳性转化株，取其试管薯块茎进行可溶性蛋白提取。同时以具体操作为：取新鲜马铃薯块茎，用解剖刀切成小薄片放入研钵，加入液氮冷冻后，迅速用研钵磨成粉末。按200μl/100mg的比例加入提取缓冲液(200mmol/L Tris-HCl pH8.0，100mmol/L NaCl，14mmol/L巯基乙醇，400mmol/L蔗糖，1mmol/L PMSF，0.05％Tween-20)，待样品充分溶解后，于4℃、13000rpm离心20min取上清备用。用Bradford法测定蛋白质浓度。

取50μl转基因植物蛋白抽提液加入等体积的样品缓冲液(20％蔗糖，0.05％溴酚兰，0.125％mol/L Tris·HCl pH6.8，4％ SDS，14mmol/L巯基乙醇)，沸水煮5min，冰水浴2min使冷却。离心弃沉淀后样品用于电泳分析。取样品30-40μl上样12％ SDS-PAGE凝胶，同时上样蛋白标准分子量Marker，75V电泳30min后，150V电泳2-3h待溴酚兰带迁移到凝胶末端结束电泳。用Bio-Rad半干电泳转印仪将蛋白转移至甲醇预处理的PVDF膜上(蛋白质转移缓冲液为25mmol/L Tris·HCl pH8.3，192mmol/L甘氨酸，20％甲醇)，恒流30mA，电转2Hr或过夜。丽春红染色后标上标准蛋白分子量以便后面检测靶蛋白的大小。然后用水轻轻洗去染料。将膜置于4℃封闭过夜。次日按试剂盒说明书进行抗原抗体反应和发光实验，最后于暗盒中对X-片曝光10秒，并进行后续处理。

杂交反应结果如图6。它表明了来自转基因马铃薯组织的蛋白与轮状病毒特异性抗体发生了特异性抗原抗体反应，从而证实了轮状病毒VP7蛋白存在于转基因马铃薯组织中。其分子量大小约38KD，与预期的VP7蛋白的大小一致。而阴性对照植物块茎则未观察到任何杂交反应信号，说明杂交反应特异、结果可信。

实施例9西红柿的转化方案

西红柿种子(中蔬5号，重庆市农作物研究所提供)在20％的次氯酸钠溶液中浸泡消毒20分钟，然后用无菌的超纯水，仔细漂洗3次或更多次。大约50粒消毒过的种子，各自播种在含有1/2 MSO培养基的一个湿盒中。农杆菌侵染生长7-10天后子叶或下胚轴无菌外植体，该外植体不需预培养，而是在切下后立即浸入农杆菌菌液中5-10分钟，取出后用滤纸吸干多余的菌液，后移置共培养培养基MS1(MS基本培养基中加入1mg/L玉米素)，25℃遮光条件下共培养2天。然后将外植体转移到选择培养基MS2(MS基本培养基中加入1mg/L玉米素，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素)诱导愈伤组织形成和幼苗分化⁽²⁸⁾。在4到6周内，出现最初的发芽。当这些芽苗长到至少2厘米时，便从外植体上切下来，并确保至少包含有一个茎节，放入含有西红柿根选择性培养基中。新生根在约2星期内开始出现。然后转移到灭菌土壤中，给予适宜的条件培养生长。

实施例10.PCR检测轮状病毒VP7基因在西红柿中的整合情况

西红柿基因组DNA的提取方法基本同前实施例4马铃薯基因组DNA的提取⁽²⁹⁾。取100mg新鲜叶片或块茎，液氮冷冻后研成粉末状，加入两倍体积60℃预热的匀浆缓冲液(CTAB 2％V/W，NaCl 1.4mol/L，EDTA 0.02mol/L，Tris-HCl 0.1mol/L)轻轻颠倒混匀，60℃保温45分钟。加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，混匀。5,000rpm，15-20℃离心5分钟。取上清，加等体积的氯仿/异戊醇，混匀。5,000rpm，15-20℃离心5分钟。取上清，加2/3体积预冷的异丙醇，混匀。-20℃放置2-3小时或过夜。11,000rpm离心10分钟。弃上清，沉淀干燥，加适量的TE溶解沉淀。加1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.2)和2-3倍体积预冷的无水乙醇，-20℃过夜。11,000rpm离心10min，弃上清。自然晾干沉淀，加适量TE溶解沉淀，紫外分光光度计上测定OD₁₃₀、OD₂₈₀及其比值，并进行DNA的定量。然后置-20℃保存备用。

取上述西红柿基因组DNA 1μg约1μl作为模版，加入针对轮状病毒VP7基因序列的特异性引物各1μl，10×PCR缓冲液3μl，dNTP(各2.5mM)3μl，Taq酶0.5μl约2.5U，加水至总体积50ul。94℃ 5分钟热变性，然后94℃ 45秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟，共进行35个循环，然后72℃ 10分钟结束反应，取5ul扩增样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。阴性对照植物中没有发现特异性的条带，而在转基因西红柿植物中则可扩增出1个约1000bp的特异性条带，该结果表明轮状病毒VP7蛋白基因已整合进入西红柿基因组DNA中。

11.转基因西红柿的RNA分析

转基因西红柿叶片和未成熟果实中RNA的提取方法如同实施例5。RNA样品被倍比稀释后，通过点杂交转移到尼龙膜上(Roche公司产品Cat.NO.1209299)，紫外光照射3分钟进行交连，风干。杂交与显色反应如同实施例5。

轮状病毒VP7基因在转基因植物听表达量可以通过RNA印迹反应进行评估。分别从转基因西红柿叶子、绿色果实和非转基因西红柿植株叶片中提取的总RNA，通过点杂交装置被转移到尼龙膜上，用地高辛标记的轮状病毒VP7蛋白编码序列DNA探针进行杂交。图7是转基因西红柿叶子和果实中总RNA与探针杂交的结果，从杂交信号的强度比较来看。叶子中轮状病毒VP7蛋白mRNA含量是果实中的2-3倍。而非转基因西红柿的叶子总RNA在高浓度下有较弱的杂交信号产生，但与转基因西红柿叶子相比可以认为是非特异性的。由于在杂交中同时加入了已知含量的PBI121/VP7质粒DNA(含轮状病毒VP7蛋白编码序列)作为阳性对照，相互比较发现，VP7蛋白基因在转基因西红柿叶子和被忠实转录并积累到较高水平，约占植物mRNA的0.01％，属丰富mRNA。在成熟果实中RNA的含量很低，不能通过RNA印迹分析。

实施例12.叶子和果实中轮状病毒VP7蛋白含量的测定

VP7蛋白含量的测定方法同前实施例6，用研钵将植物组织磨碎，在磨碎过程中加入液氮，植物组织粉末中加入10倍体积灭菌无离子水进行稀释。植物匀浆液16000g 4℃离心5分钟，依据Bradford试剂盒(Bio-Rad)提供的方法，取部分上清液测定可溶性蛋白含量，以BSA作为标准蛋白质。以MA104细胞培养的人源轮状病毒总蛋白为阳性对照(VP7蛋白含量为总病毒蛋白含量的30％)。阳性对照被稀释成不同蛋白水平(即VP7蛋白含量为0.01-5.0ng)，在颜色反应后，读取492nm光吸收值，制备一条标准吸收曲线。

表3中列出了转基因西红柿叶子和果实中包膜中蛋白的含量。取在温室中生长的转基因西红柿的绿叶和红色果实进行可溶性蛋白和轮状病毒VP7蛋白含量的测定，就象上述所描述的那样。非转基因植物叶子和果实中检测不到轮状病毒VP7蛋白。

表3 西红柿叶子和果实中的包膜中蛋白含量

西红柿叶子的包膜中蛋白含量略高于马铃薯叶片，表达量为可溶性蛋白的0.0036％。在成熟果实中包膜中蛋白的含量约占可溶性蛋白的0.0048％，或为102ng/g鲜重。因为果实的密度比较高，西红柿果实中的包膜中蛋白表达量集中了西红柿植株包膜中蛋白的大部分，一个重100克的西红柿果实含有大约10ug包膜中蛋白重组抗原。

实施例13.转基因植物在小鼠中引发的免疫反应

实验小鼠直接口服以转轮状病毒VP7基因马铃薯块茎。对照组小鼠则直接口服未转基因的马铃薯块茎。给每一只实验小鼠所服用的抗原的剂量相当，例如所含VP7蛋白量为42或者84微克。在给药前一天，所有小鼠除水外停止一切进食并分笼饲养。在免疫的第0、7、14、42天，直接称取转基因马铃薯块茎(1g或2g/每份)，用解剖刀切成薄片，涂上免疫佐剂(CT或CTB)，用长约6-8cm的注射针头将马铃薯片串起来，置小鼠笼上。待小鼠吃完马铃薯片或24h后给饲料。在免疫前0、7、14、21、35、42、67天收集血液、尿液、唾液和粪便，作适当处理后-20℃冻存备用。

用ELISA方法检测结果表明，各试验组的动物免疫了马铃薯后，均检测到体液和粘膜免疫应答反应。其中，血清中只检测到IgG抗体，IgG抗体滴度从免疫后开始随着免疫时间的延长而逐渐增加，在免疫后第42天达到最高滴度，而在第67天略有下降，表明转VP7基因马铃薯疫苗可以诱导体液免疫应答。试验组小鼠的唾液、粪便和尿液中均检测到IgA，未检测到IgG抗体，而转空载体马铃薯免疫小鼠粘膜相关组织分泌液中(对照组)均未检测到任何HVP7特异性IgA和IgG抗体。抗体滴度从免疫后开始随着免疫时间的延长而逐渐增加，在免疫后第42天达到最高滴度，而在第67天基本维持。鉴于抗体在免疫后第42天达到最高峰，我们选取免疫前和免疫后第42天这两个时间点分别检测了唾液、尿液和粪便中的特异性抗体浓度。结果表明，在免疫后第42天可以检测到抗VP7特异性IgA抗体，而在免疫前检测不到抗VP7特异性IgA抗体。粪便中的抗VP7特异性IgA抗体滴度最高，唾液次之，尿液中最低，几乎检测不到，表明转VP7基因马铃薯疫苗可以诱导粘膜免疫应答。

为了检测抗体的中和病毒能力，我们进行了体外病毒中和试验。在进行RV接种MA104细胞的同时，加入不同稀释度的IgA或IgG抗体共同培养。以绿色荧光标记抗HRV抗体检测细胞。荧光显微镜下观察绿色荧光细胞，当样品孔发光细胞数比阳性对照发光细胞数减少了60％，表明该孔加入的抗体有中和病毒的效力。结果表明，当稀释倍数低于40-60倍时，加了IgA的样品孔发荧光细胞数均低于阳性对照孔细胞数60％以上，且随着IgA稀释倍数的增加，发光细胞数也相应增加，表明当IgA稀释倍数低于40-60时，IgA抗体起到了中和病毒的作用，从而抑制了RV感染细胞。同样，加入了IgG抗体的样品孔细胞进行荧光检测，但仅有稀释倍数低于2-4倍时，IgG才具有中和病毒的效力，当高于2-8倍时，荧光染色的细胞与阳性对照孔没有差别，因而判定为IgG基本无中和效力。

上述结果表明，VP7转基因植物疫苗可以在体诱导系统免疫应答和局部免疫应答，局部免疫应答所产生的特异性抗体主要为分泌型IgA，在中和病毒方面IgA发挥了关键性作用，这与以往的研究一致。因此，VP7转基因植物疫苗是HRV感染的预防性疫苗的候选形式。

本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请要求和为了解释和说明本专利的内容。很显然，在不背离本发明的精神和范围之内，可在此基础上，做进一步的改进和变化。

序列表

<110>中国人民解放军免疫学研究所

<120>生产用于预防婴幼儿腹泻的转基因植物材料的方法

<140>200410021929.9

<141>2004-02-26

<160>6

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222>

<223>用于扩增VP7基因的5’端特异性引物序列

<400>1

<210>2

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>

<222>

<223>用于RT-PCR扩增VP7基因的3’端特异性引物序列

<400>2

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>sig-peptide

<222>(4)……(21)

<223>编码内质网滞留序列SEKDEL

<220>

<221>

<222>

<223>含有内质网滞留序列的3’端特异性引物序列，用于VP7基因的再扩增

<400>3

<210>4

<211>1041

<212>DNA

<213>人源轮状病毒种(Human rotarvirus sp.)

<220>

<221>CDS

<222>(49)……(1020)

<223>编码人源轮状病毒VP7外壳蛋白的核苷酸序列

<220>

<221>sig-peptide

<222>(1021)……(1038)

<223>编码内质网滞留序列SEKDEL碱基

<400>4

<210>5

<211>346

<212>PRT

<213>人源轮状病毒种(Human rotarvirus sp.)

<220>

<221>INIT-MET

<222>(1)……(326)

<223>人源轮状病毒VP7外壳蛋白的氨基酸序列

<220>

<221>SINGAL

<222>(327)……(332)

<223>内质网滞留序列SEKDEL

<400>5

参考文献

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Claims (28)

1、一种用于转化植物的质粒载体，特征在于其包括：

一段编码人源A组轮状病毒蛋白抗原VP7与内质网滞留序列SEKDEL的融合蛋白的DNA序列，该序列编码的蛋白在天然状态下具有免疫原性；

一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，该启动子操纵所说的基因在所说的植物中表达。

2、如权利要求1所述的质粒载体，它含有一个选择或标记基因。

3、如权利要求1所述的质粒载体，其中所说的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。

4、如权利要求1所述的质粒载体，其中所说的植物至少有一部分是可食用的。

5、如权利要求1所述的质粒载体，其中所说的植物是西红柿、马铃薯、莴苣、胡萝卜、黄瓜或其它可食用的植物。

6、如权利要求1所述的质粒载体，其中编码VP7的核苷酸序列是Seq.ID.No.4所示的核苷酸序列或其简并序列。

7、如权利要求1所述的质粒载体，其中VP7是Seq.ID.No.5所示的氨基酸序列的VP7抗原。

8、一种用于基因枪法转化植物的DNA序列，包括：

唯一的编码序列，它是一段编码轮状病毒蛋白抗原VP7与内质网滞留序列SEKDEL的融合蛋白的DNA序列，该序列编码的蛋白在天然状态下具有免疫原性；

一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，该启动子操纵所说的基因在所说的植物中表达。

9、如权利要求8中所述的DNA序列，它还含有一个选择或标记基因。

10、如权利要求8中所述的DNA序列，其中VP7的氨基酸序列是Seq.ID.No.5所示的蛋白抗原。

11、如权利要求8中所述的DNA序列，其中编码VP7的核苷酸序列是Seq.ID.No.4所示的碱基序列。

12、如权利要求8中所述的DNA序列，其中所说的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。

13、如权利要求8中所述的DNA序列，其中所说的轮状病毒蛋白抗原是人源A组轮状病毒外壳蛋白VP7。

14、如权利要求8中所述的DNA序列，其中所说的植物至少有一部分是可食用性的。

15、如权利要求8中所述的DNA序列，其中所说的植物是西红柿、马铃薯、莴苣、胡萝卜、黄瓜或其它可食用的植物。

16、一种构建转基因植物细胞的方法，特征在于其包括：

构建一种如权利要求1-7任一项中所述的质粒载体或一种如权利要求8-15任一项中所述的DNA序列，其中都含有编码A组轮状病毒外壳蛋白的基因和可操纵该基因在所说的植物中表达的植物启动子，该蛋白在天然状态下具有免疫原性；并利用所说的质粒载体或DNA序列转化植物细胞。

17、一种制备转基因植物的方法，它包括由权利要求16所述的方法得到的转基因植物细胞中再生出完整的转基因植株。

18、一种利用转基因植物生产胶囊、冲剂或其它制剂的方法，特征在于其包括：

构建一种如权利要求1-7任一项中所述的质粒载体或一种如权利要求8-15任一项中所述的DNA序列，其中都含有编码A组轮状病毒外壳蛋白的基因和可操纵该基因在所说的植物中表达的植物启动子，该外壳蛋白在天然状态下具有免疫原性；

用该质粒载体或其DNA序列转化植物细胞；由植物细胞再生出完整的转基因植株；

将转基因植株的食用部分冷冻、干燥和磨碎后制作成胶囊、冲剂或其它制剂。

19、如权利要求18的方法，其中还包括从所说的植物细胞中部分纯化、完全纯化出所说的抗原蛋白作为胶囊、冲剂或其它制剂的活性组成部分。

20、如权利要求18的方法，其中包括至少收获所说的转基因植物的某一部分。

21、如权利要求18的方法，其中所说的植物细胞是双子叶植物的细胞，或是单子叶植物的细胞。

22、如权利要求18的方法，其中所说的植物是西红柿、马铃薯、莴苣、胡萝卜、黄瓜或其它可食用的植物。

23、如权利要求18的方法，其中所说的植物细胞是通过农杆菌系统转化的。

24、如权利要求18的方法，其中所说的农杆菌系统是农杆菌Ti质粒系统。

25、如权利要求18的方法，其中所说的质粒载体是一个双元载体系统。

26、如权利要求18的方法，其中所说的质粒载体是一个整合性载体。

27、如权利要求18的方法，其中所说的质粒载体是PBI121。

28、如权利要求18的方法，其中所说的植物细胞是通过基因枪法、微管注射法、PEG吸收法或电融合法转化的。

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