CN1308967A - 表达乙肝病毒包膜中蛋白转基因植物的生产方法及产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白转基因植物的生产方法,并进而通过直接食用或肠道给药的方式利用这些含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白的转基因植物或者自这些转基因植物中部分或完全纯化出乙型肝炎病毒包膜中蛋白作为胶囊、冲剂或其它制剂的主要活性成份从而引起人或哺乳动物对该抗原蛋白的免疫应答反应。

Description

表达乙肝病毒包膜中蛋白转基因植物的生产方法及产品

本发明涉及表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白转基因植物的生产方法，并进而通过直接食用或肠道给药的方式利用这些含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白的转基因植物及其衍生物从而引起人或哺乳动物对该抗原蛋白的免疫应答反应。

乙型肝炎(HBV)是一种广泛传播、世界性分布的传染性疾病，根据世界卫生组织1996年的报告，1995年全世界死于乙型肝炎的人数约有110万，居各种传染病死亡人数的第四位，而且近年来有逐渐增加的趋势。中国也是乙型肝炎的高发区，50-70％的人群受过HBV的感染，全国至少有1.2亿人为乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)携带者，其中显现临床症状的病人约有3千万人。

乙型肝炎病毒的感染，不仅可以引起急、慢性病毒性肝炎，而且还与肝硬化和肝细胞癌的发生、发展有密切关系。乙肝病毒的顽固性和多途径的易传性，使乙肝成为一个严重的公共卫生问题。迄今为止，由于仍缺乏根治乙型肝炎的特效药，因此，在日常生活中，如何保护健康人群，预防乙型肝炎的发生就成为人们要考虑的主要问题之一。

预防乙型肝炎的发生现在可以选择注射疫苗，目前广泛使用的乙肝疫苗依其来源可分为血源性的和基因重组多肽疫苗两类。

血源性的乙肝疫苗最初是从无症状的乙肝病毒携带者的血浆中提取22nm的病毒球形蛋白颗粒(HBsAg)，经福尔马林灭活或加热灭活制备而成的。1982年，美国和法国率先在高危人群和医务人员中推广使用血源性的乙肝疫苗，并取得了很好的预防效果。但是，应该指出，在使用血源性乙肝疫苗过程中还存在着一些问题有待解决：

(1)安全性：由于乙肝病毒不能在人工组织培养基中增殖，疫苗来源最初是从无症状的乙肝病毒携带者的血浆中提取22nm的球形蛋白颗粒(HBsAg)经福尔马林灭活或加热灭活制备而成，尽管大规模地接种已经证实其是安全的，但接种者还是担心疫苗可能没有被完全灭活或污染有其它的病毒和致病因子。

(2)血源来源有限：由于乙肝表面抗原携带者不是健康人群，不宜长期持续取血供生产乙肝疫苗使用，因此，生产疫苗的血源来源有限。

(3)价格昂贵：由于其制备过程、工艺要求严格，造成价格长期居高不下。尽管最近几年乙肝疫苗的成本和接种费用在逐渐减少，但儿童一剂接种费用在加拿大仍在12-28美元之间，在美国为7美元，中国约需40元人民币。

(4)接种也较麻烦，需经多次注射，且会引起局部疼痛和其它不适如发烧、恶心、呕吐、腹痛和腹泻等。

鉴于存在上述问题，中国卫生部在1997年10月已下文停止了血源性乙肝疫苗的生产和使用。

随着DNA重组技术的发展，在原核生物(大肠杆菌和芽胞杆菌)和真核生物(多种鼠LM细胞、Hala和酵母细胞)中表达HBsAg及HBcAg获得了成功。1986年，第一个基因工程疫苗-酵母菌表达的重组乙肝疫苗在美国被批准使用。中国也在九十年代初期研制成功了具有世界先进水平的基因工程重组乙肝疫苗。但这类疫苗仍需多次接种，价格较高，且一些人群在接种后不能够产生免疫应答反应。

对乙型肝炎病毒粒体结构组成的研究表明，其最外层的包膜含有三种蛋白，依据分子量的大小，分别称谓主要蛋白、中蛋白和大蛋白⁽¹⁾。

主要蛋白也称小蛋白，由226个氨基酸残基组成，由S基因编码，是病毒包膜及亚单位颗粒(HBsAg)的主要成分，因其分子量最小，因此称之为小蛋白。小蛋白是一种疏水性蛋白，包括糖基化的GP27和非糖基化的P24两种形式，分子量分别为27kD和24kD而得名。在GP27的N末端146位的天门冬酰胺上连接着一种复杂的糖基，在122位赖氨酸残基处有胰酶切割位点。S蛋白有三个疏水区段，分别位于7-23、80-98和169-226，被二个亲水区段分开。疏水区段的氨基酸比较保守，氨基酸的变异主要发生在亲水区段。HBsAg是一种构象性抗原，两个小蛋白分子由二硫键连在一起，构成二聚体，代表着结构单位，具有完整的HBsAg活性，其中第二个亲水区段，即122和155残基之间的主要蛋白片段含有大多数HBsAg组和亚型的决定簇。

中蛋白含有281个氨基酸残基，由前S₂和S基因共同编码，它实际上是在小蛋白的N端又增加了55个氨基酸残基的S₂蛋白区段，因分子量居中，因此称为中蛋白。中蛋白有一种非糖基化形式P31，两种糖基化形式GP33和GP36。GP33含有一个配糖体，GP36有两个配糖体，这两个糖基位于S蛋白的146位和前S₂区段。由前S₂基因编码的55个氨基酸通常是亲水性的，富含不依赖二硫键的连续抗原决定簇，具有比小蛋白更强的免疫原性，但易被胃蛋白酶消化而丧失其活性。前S₂蛋白还有一种多聚人血清白蛋白受体(PHSA-R)，能特异性地与人和黑猩猩血清的多聚白蛋白(PHSA)结合，肝细胞本身也有该受体，多聚人血清白蛋白介导HBV附着肝细胞，这就是HBV易感染肝细胞的一个重要原因，也是决定HBV嗜肝特点的重要结构基础。

大蛋白含有389-400个氨基酸残基，由前S₁、前S₂和S基因三部分共同编码，其分子量在三种包膜蛋白中分子量最大，因此称其为大蛋白。大蛋白也有两种不同的形式，糖基化的GP42和非糖基化的P39，分子量分别为42kD和39kD。根据亚型的不同在长度上有所变化，ay亚型和ad亚型的变化范围在389-400个氨基酸之间，在GP42有一个与N末端相连的糖基，由前S₁区编码的N末端位于包膜蛋白的表面。

一个完整的病毒粒体，含有300-400个S蛋白分子，40-80个中蛋白和大蛋白分子，管状颗粒的蛋白质组成与病毒粒体相同，而直径为22nm球形颗粒的蛋白质成份则完全不同：在有病毒复制的慢性携带者血清里，S蛋白和中蛋白的含量与在HBV颗粒中的含量大约有同样的比例(10∶1)，但大蛋白少于1/20；而在病毒的非复制期，则22nm的球形颗粒所含有的几乎全是S蛋白，中蛋白少于1％，无大蛋白。

对前S₂蛋白的免疫原性的研究，提供了一些制备高效乙肝疫苗的依据，目前世界上大多数血源疫苗的纯化都经胃蛋白酶处理，丧失了许多前S₂蛋白的免疫原性，因此，有必要在未来的、新的乙肝疫苗中，添加适量的中蛋白或前S₂蛋白的成份，以提高其免疫原性。特别是对S蛋白免疫应答差的机体，在接受前S₂蛋白以后，有希望获得中和抗体，这已在动物实验中得到了很好的证实。

现在人们已经认识到普遍接种乙肝疫苗是控制乙型肝炎发生的唯一方法，在一些发达国家，已对乙肝病毒感染高危人群进行接种。在加拿大和美国，普遍接种的对象是婴幼儿和青少年，采用这种免疫方式使乙肝病毒感染的新病例减少90％以上，因此，如何使乙肝疫苗更加安全、经济、有效和更容易推广使用将是今后各国研究的主要方向。

大量的实验研究表明人或其它哺乳动物在受到病原侵染后会产生免疫应答反应以抵御这种病原的入侵。这一过程至少涉及以下三种免疫机制之一：粘膜、体液或细胞。粘膜免疫应答产生分泌型抗体IgA，可保护呼吸道、消化道、生殖系统和腺体表面不受侵染。粘膜抗体可阻止病原在粘膜表面定居从而构成第一道防御屏障。粘膜抗体的产生可通过分泌性腺体和组织的局部免疫而获得，也可通过刺激肠道和呼吸道淋巴组织产生。另一方面，体液免疫主要涉及IgG和IgM，它们在血液中参与侵入病原的吞噬，病毒中和或有补体介导的细胞毒性。

研究人员已经注意到口服接种可诱导血液和粘膜抗体的产生，通常的情况是口服接种需要比较多的抗原，这是因为抗原被实际吸附和利用的数量比较低。因此，口服接种所需要的抗原数量远远超过注射接种⁽²⁾。然而，也有例外，业已发现，一些蛋白只需口服少量就能产生体液和粘膜免疫应答，这些蛋白常常能够与粘膜细胞膜表面的糖脂或糖蛋白特异性结合，因此，这些蛋白也被称为粘膜性抗原，例如病毒性血凝素。口服和肌肉注射剂量比较实验表明，粘膜类抗原也能够非常有效地引起体液免疫，与肌肉注射相比，二者之间只有轻微的差别。乙型肝炎病毒包膜蛋白可能也属于粘膜抗原。

基因工程研究领域的最新进展使植物表达外源基因成为可能。含有外源基因的植物细胞可再生出完整植株，并将外源基因稳定地遗传给后代。迄今有些单子叶和双子叶植物都已经进行了成功的转化。例如烟草、马铃薯、番茄、大豆和玉米等。

农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的双子叶植物转化已有众多报道。农杆菌介导的叶盘转化法可有效地进行基因转移、选择和再生。

单子叶植物经农杆菌介导转化比较困难，但也可以利用其它的转化方法如PEG和电融合法。有人成功地将外源基因导入玉米、水稻和小麦的原生质体中。然后从转化的原生质体再生出完整的植株。一些新的转化方法如微管注射法和基因枪法在单子叶植物转化和再生中可能更加有效。

植物是一种多样化、低成本和可再生的材料资源，而生物技术的迅速发展则使我们进一步拓宽了植物的使用范围，国外在植物中采用这种“分子农业”的方法，已经成功地生产了越来越多的有用物质，其中包括一些高价值药用蛋白多肽，如人的细胞生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等，一些研究机构和公司已经开始从这些药物蛋白的生产中获得巨大的经济效益。

特别值得指出的是，1998年4月，美国国家过敏症和传染病研究所(NationalInstitute of Allergy and Infectious Diseases,NIAID)首次报道了人食用转基因马铃薯后体内能够产生针对大肠杆菌热不稳定毒素B亚基的特异性抗体，在11个志愿者中有10人(91％)血清中抗体增加了4倍，有6人(55％)粘膜抗体也增加了4倍。这一研究结果清楚地表明：

(1)在植物中高效表达一些病原蛋白基因是可行的。

(2)病原蛋白在植物中可完成翻译后加工过程，如糖基化和高级结构的空间折叠，从而使这种重组蛋白多肽与天然蛋白具有相同的免疫原性，这是原核生物表达系统无法比拟的，后者无法对源自真核生物的蛋白进行糖基化。

(3)植物中产生的抗原蛋白可安全地通过动物的消化道而不会被胃蛋白酶降解，原因是它们能够与肠粘膜细胞膜表面上的糖蛋白分子受体结合并刺激动物机体产生免疫应答。这类蛋白也被称谓粘膜性抗原(mucosal immunogen)，但并不是所有的蛋白都具有这种能力，现仅发现少数病毒和细菌含有这种抗原。

(4)研究也证实了粘膜性抗原只需要口服少量蛋白，就可以产生良好的免疫应答反应，并不比肌内注射所需要量大。

这些研究结果预示植物将成为继微生物发酵系统和动物细胞培养系统之后又一个新的蛋白表达系统。

利用植物表达系统生产乙型肝炎病毒包膜蛋白抗原具有以下优点：

(1)更安全：转基因植物中除只增加了乙肝病毒重组抗原蛋白外，没有改变植物其它的遗传组成，因此，它绝不会含有对人体有害的成份，也完全排除了污染其它病毒的可能性。

(2)价格更低廉：因为它不需要纯化和冷藏，抗原蛋白的生产可能只是简单地种植农作物，因此可大大降低生产成本。

(3)使用更方便：接种方式只是简单地食用含有该抗原蛋白的植物组织或由该植物组织加工而成的某种胶囊、冲剂或其它制剂，省去了较麻烦的注射过程，这种接种方式非常适用于中国或其它发展中国家。

(4)免疫力更持久：人或动物每隔一定时间服用含该抗原蛋白的胶囊或冲剂，可使体内抗体始终维持在一个较高的水平，增强了对乙肝病毒感染的抵抗能力。

已有人尝试在植物中表达乙型肝炎病毒包膜小蛋白(S)，发现在植物中产生的HBsAg抗原与源自人血液或基因工程酵母中的HBsAg具有相似的抗原特性和物理特性，并进而提出了“食物疫苗”的概念，为此，还申请了相关专利⁽³⁾。然而，在本发明之前，还没有人利用植物表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原，而该蛋白具有比小蛋白更强的免疫原性，正如前文所述，因为中蛋白分子中除含有S蛋白多肽外，它还含有前S₂蛋白区段，它克服了此前血源性和基因工程酵母乙型肝炎疫苗不含有S₂蛋白的一些缺点，特别是对S蛋白免疫应答差的人群，在接受前S₂蛋白以后，有希望获得针对乙型肝炎病毒的中和抗体，从而获得更好的保护。

在本发明之前，尽管已有人提出“食物疫苗”的概念，但在具体操作中存在很大困难，因为植物中的表达的抗原蛋白含量不确定，且植物不同个体或同一植物个体的不同器官之间存在很大差异，人或动物直接食用这种转基因植物就会产生很大风险，长时间食用含少量抗原蛋白的植物材料会引起免疫耐受性，而短时间食用过多抗原又会引起超敏反应。本发明首次提出将含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原的转基因植物加工成胶囊、冲剂或其它制剂的方法，对其中所含的抗原蛋白进行严格定量，从而对人或哺乳动物的食用间隔和食用量有了明确的规定，由此克服了直接食用转基因植物存在的上述缺点。

在已经有血源性和基因工程酵母乙肝疫苗可供利用的情况下，仍有必要寻找其它新的更加安全和廉价的抗原蛋白生产途径。利用转基因植物生产疫苗用抗原重组蛋白是一种较好的选择，它可能为人类和哺乳动物抵御各种传染性疾病提供一条新途径。

本发明提供表达乙型肝炎病毒重组包膜中蛋白抗原转基因植物的构建方法以及如何应用含该重组抗原蛋白转基因植物的方法。本项发明特别适用于中国或其它发展中国家。

本发明利用可以食用的转基因植物生产病毒抗原蛋白，这些重组抗原蛋白在免疫原性方面与天然蛋白类似。按照一个优先的实施方案，就是本发明提供了转基因植物、与人或动物疾病相关的病毒重组抗原蛋白的生产方法以及如何具体应用这种含重组抗原蛋白转基因植物的方法。这里所指的疾病是指那些具有在自然状态下能够引起免疫应答、特别是粘膜免疫应答反应抗原的病毒病原。按照一个优先的实施方案，病毒病原指的是乙型肝炎病毒，植物指的是人们日常食用的植物。

本发明克服了以前一些病毒抗原蛋白生产方法如微生物发酵和动物细胞培养的缺点，它利用转基因植物生产病毒抗原蛋白，如果将其加工成口服胶囊、冲剂或其它制剂，则具有廉价、安全和使用方便的特点，会使更多的人或动物得到保护。按照一个优先的实施方案，人或哺乳动物只需食用这些转基因植物的果实、汁液、根、茎、叶或植物的其它部分，或以肠道给药的方式利用这些转基因植物或转基因植物粗提取物制备的胶囊、冲剂或其它制剂便可获得对疾病的免疫能力。这里的植物是指人们日常所食用的，同时由于避免了提纯过程，降低了生产成本和存在的其它一些不利因素。

按照一个实施方案，本发明涉及利用转基因植物生产含抗原蛋白胶囊、冲剂或其它制剂的方法。生产这种胶囊、冲剂或其它制剂的转基因植物材料可以有多种方式，可以是完整植物，或植物的一部分如果实、叶子、茎和块茎，或植物某一部分的粗提物、或经完全纯化以及部分纯化源自转基因植物的病毒抗原蛋白。总之，采用何种方式主要取决于抗原蛋白本身的免疫原性，产生粘膜免疫应答反应所需这种源自转基因植物的抗原的剂量以及在这种成份中所含的干扰免疫应答反应的物质的多少，如糖类、热原和毒素等，并尽量降低免疫耐受性的产生。

本发明所指的抗原蛋白是指在转基因植物中生产的，首先是编码病原抗原蛋白的基因被分离出来，然后插入到一个含有选择标记的质粒上，启动子位于该基因的上游，它操纵该基因在植物中的表达。外源基因在植物各器官或可食用部分中表达后，人或动物可食用这部分植物组织。

本发明提供了在植物细胞中生产病毒重组蛋白的方法，而该蛋白已知在天然状态下可引起哺乳动物产生免疫应答反应。或者说，本发明所指的病毒重组蛋白可作为抗原，具有与源自哺乳动物血液和其它常规表达系统产生的该抗原蛋白如酵母和细菌一样的免疫原性。或者更确切说，本发明的抗原蛋白与源自哺乳动物血液和其它常规表达系统产生的该抗原蛋白一样，均能够通过口服和肠道给药的方式引起免疫应答反应。按照一个优先的实施方案，这种病毒重组蛋白是一种抗原蛋白，它可以在植物细胞中表达产生，且具有与源自哺乳动物或其它常规表达系统所产生的该抗原蛋白相似的免疫原性。

本发明的抗原源自一种哺乳动物的病毒，它可在植物中表达产生。按照一个优先的实施方案，抗原源自一种哺乳动物病毒病原。因此，可以说在植物中表达产生的最有用的病毒抗原是那些来源自哺乳动物如人的病毒病原的抗原。

本发明的抗原可在植物中表达产生，而表达产生该抗原的植物至少有一部分是可以直接食用或经过粗加工后可以食用。这种植物或植物的食用部分不应具有毒性，因此，许多常见的食用植物都包括在本发明所定义的植物范围之内。此外，在某些情况下，如马铃薯，在这里也被认为是可食用植物，尽管它的某些部分被认为是有毒的(马铃薯块茎部分是无毒的，因此属于本发明的权利要求范围之内，但它的果实是有毒的)，在这种情况下，这种植物也应包括在本发明的权利要求范围之内。

按照一个优先的实施方案，本发明的抗原应该是一个粘膜性抗原。它具有引起粘膜免疫系统产生特异性免疫应答的能力。按照一个更加优先的实施方案，这些粘膜抗在一定的剂量范围之内能够引起粘膜和体液产生免疫应答反应，而不会导致产生免疫耐受性和过敏反应。免疫耐受性在这里被定义为：在人或哺乳动物多次食用该抗原之后，导致随后的特异性抗原-抗体反应能力消失。当然，本发明中的抗原也有可能产生粘膜系统免疫耐受性，但如果改为注射后，该抗原仍能保持它的免疫原性。

本发明的重组抗原蛋白可以是病毒天然抗原蛋白的全部。然而，在某些具体实施方案中，抗原也可能只是该天然蛋白分子的一部分。有时，抗原可与另外一个多肽或蛋白分子如细菌病原蛋白多肽结合在一起形成融合蛋白。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工、共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译前就连接在一起。这两种技术是本领域专家早已熟知的技术。

在某些实施方案中，本发明的抗原将指的是来自一种肝炎病毒的抗原，在某些更优先的实施方案中，将选择使用乙肝病毒包膜中蛋白抗原。因此，按照一个进一步的实施方案，乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因在植物中表达，而该重组抗原可引起免疫应答反应、特别是粘膜免疫应答反应就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。

在本发明的其它实施方案中，一种表达哺乳动物病毒重组抗原蛋白的转基因植物被构建。就本发明而言，一种转基因植物至少应该在该植物的部分细胞中表达了某种病毒抗原。按照本发明的某些优先实施方案，本发明的转基因植物至少有一部分是可以食用的，其所表达的抗原是乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原，它能够引起免疫应答反应，特别是粘膜免疫应答反应，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。

本发明涉及到了一种食物的组成问题，该食物中至少含有转基因植物的某些食用部分，这里的转基因植物应能够表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原。就本发明而言，植物或植物的某一部分被认为应该具有某些营养价值，它能够为人或其它哺乳动物提供代谢所需的能量，维生素和其他辅助因子。尽管莴苣并不大量提供能量、蛋白质、碳水化合物和脂肪，但就因为它含有重组抗原蛋白而被人们特意食用的话，莴苣也应包括在本发明的权利要求范围内。莴苣的粗纤维对哺乳动物的健康是有利的，即使哺乳动物并不能够消化莴苣的粗纤维。

本发明涉及到了一种胶囊、冲剂或其它制剂的组成成份问题，胶囊、冲剂或其它制剂中至少含有转基因植物的某些食用部分，这里的转基因植物应能够表达一种重组病毒抗原蛋白。就本发明而言，胶囊、冲剂或其它制剂中含有的抗原蛋白应该能够精确定量，以避免人或动物食用后产生免疫耐受性。按照本发明的一个优先实施方案，本发明的胶囊、冲剂或其它制剂所含有的抗原是乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原，它能够引起免疫应答反应，特别是粘膜免疫应答反应，就如同天然蛋白或其它表达系统产生的抗原蛋白一样。

正如上述所述，按照本发明的某些实施方案，这里的食物将包括含有粘膜性抗原蛋白的食物，这种粘膜性抗原蛋白能够与粘膜细胞表面糖基化分子受体结合，它可以是一种融合蛋白或者是源自某种肝炎病毒的抗原。因此，按照一个更加具体的实施方案，本发明所指的食物将至少包括转基因植物的一部分，它具有某些营养价值，并含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原，而该抗原能够与粘膜细胞表面的糖基化分子受体结合。在任何情况下，本发明的食物都包括植物的根、茎、叶、果实或所说的植物种子。

对本发明所使用的方法和其它相关事项极为重要的是一些质粒载体的构建，它们在获得本发明所指的转基因植物以及转基因植物的加工应用中起重要作用。用于转化植物的质粒载体由编码哺乳动物病毒抗原的DNA序列和操纵该DNA序列在所说的植物中表达的一个植物启动子组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择或标记基因，主要用于转基因植物或细胞的检测。在某些具体实施方案中，本发明的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。正如上面所述，按照某些具体的实施方案，本发明的质粒载体用于转化可食用植物，它编码的抗原是一种粘膜抗原，更进一步说，质粒载体所编码的抗原能够诱导免疫应答反应，特别是粘膜性免疫应答反应，就象天然蛋白和源自其它表达系统所产生的该抗原蛋白一样。在一个优先的实施方案中，本发明用于转化植物的质粒载体含有编码乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原的基因以及一个植物启动子，该基因编码的蛋白抗原可引起免疫应答反应、特别是粘膜免疫应答反应就如同天然蛋白或源自其它表达系统的该抗原蛋白一样，而植物启动子主要是操纵该基因在植物中的表达。在一个类似的实施方案中，本发明提供的DNA片段可用于基因枪法转化植物。

本发明也提供了获得转基因植物细胞的方法，它包括以下步骤：1．构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码病毒抗原的基因，而且该基因被置于一个植物启动子的操纵之下；2．用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞。按照一个优先的实施方案，还包括从转化的植物细胞再生出完整的转基因植株的方法。

本发明提供了各种植物细胞或植物的转化方法。尽管在下面描述的某些优先实施方案中仅利用了特定的转化方法，但显而易见的是，本领域专家所早已熟知的其它植物转化方法也应包括在本发明的权利要求范围之内，这些方法包括微管注射、PEG融合、电融合。按照某些优先实施方案，使用的是农杆菌介导的转化方法，特别指Ti质粒参与的农杆菌转化系统。在其它一些优先实施方案中，还可以使用基因枪法转化植物细胞或植物。

本发明在详细介绍转化方法时仅提到了马铃薯和番茄，然而，正如本领域专家所早已熟知的植物转化方法那样，许多种植物都可以利用本发明提供的方法进行转化。因此，所有这些植物都应包括在本发明的权利要求范围之内，这些植物可以是了单子叶植物或双子叶植物。

就象下面实例中所要详细描述的那样，本发明植物转化方法中所用的质粒载体是一个双元载体系统。按照一个实施方案，本发明使用的质粒是一个整合性载体。按照一个更加优先的实施方案，本发明所使用的质粒是pBI121。

本发明提供了一种转基因食物的生产方法。它包括以下步骤：1．构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码病毒抗原的基因，而且该基因被置于一个植物启动子操纵之下；2．用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3．从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4．收获转基因植物的食用部分；5．食用一定量的这种转基因植物，尽量避免产生免疫耐受性，以达到预防疾病的效果。

本发明也提供了含确定数量抗原蛋白胶囊、冲剂或其它制剂的生产方法，它包括以下步骤：1．构建一个质粒载体或者一段DNA序列，其中都含有编码病毒抗原蛋白的基因，而且该基因被置于一个植物启动子操纵之下；2．用质粒载体或上述DNA片段转化植物细胞；3．从转基因植物细胞中再生出完整的转基因植物；4．自转基因植物细胞或完整植物中提取出抗原蛋白加工成胶囊、冲剂或其它制剂。按照一个优先的实施方案，含有抗原蛋白的完整转基因植物或者其某些食用部分可直接进行冷冻、干燥和粉碎，然后加工成胶囊、冲剂或其它制剂，并确定其中含有的抗原蛋白数量。

为了详细描述本发明的某些优先实施方案，并以相应的绘图作参考：

图1A乙肝病毒包膜中蛋白基因的克隆。

图1B乙肝病毒包膜中蛋白的组成结构。

图2乙肝病毒包膜中蛋白基因的核苷酸及其编码蛋白的氨基酸序列。

图3质粒pSS2L的构建过程，它含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因。

图4质粒pSS2L所含的2个结构基因及其调控表达序列。

图5A不同转基因马铃薯植株叶片中乙肝病毒包膜中蛋白mRNA的含量。

图5B不同转基因马铃薯植株叶片中乙肝病毒包膜中蛋白的含量。

图6A转基因马铃薯叶片乙肝病毒包膜中蛋白原位杂交结果。

图6B转基因马铃薯块茎乙肝病毒包膜中蛋白原位杂交结果。

图7 PCR检测乙肝病毒包膜中蛋白基因在不同番茄中的整合情况。

图8转基因番茄叶片和果实中的RNA含量。

图9重组抗原蛋白(S₂&S)在植物汁液中的稳定性测定。

图10重组抗原蛋白在高温下的稳定性测定。

本发明包括以下几个组成部分：1．利用DNA重组技木构建质粒表达载体，它含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因或其衍生物，人或其它哺乳动物在食用该抗原蛋白后有可能产生针对乙型肝炎病毒的特异性中和抗体；2．选择适宜的受体植物进行转化，使编码抗原蛋白的基因稳定地整合入受体植物的染色体中并可遗传给后代；3．从转化的受体植物细胞中再生出完整的转基因植物，而且该植物能够稳定、高效地产生乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原；4．人或哺乳动物直接食用这种转基因植物或以肠道给药的方式口服以该转基因为主要活性成份加工而成的胶囊、冲剂或其它制剂后，有可能预防乙型肝炎病毒的侵染。

本发明提供了表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白或其衍生物转基因植物的构建方法，这种转基因植物作为食物或加工成胶囊、冲剂或其它制剂后被人们食用有可能引起人或哺乳动物的免疫应答。这种免疫应答的结果使人或哺乳动物对乙型肝炎病毒的感染具有抵抗能力。这种免疫应答是由于在转基因植物中表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原后而产生的结果，而乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原的产生则是由于该抗原蛋白基因整合入植物的基因组中并在启动子调控下能够稳定地表达的结果。1．利用植物生产外源蛋白

除了乙型肝炎病毒包膜中蛋白外，本发明还可用于生产其它一些病毒、细菌、真菌或寄生虫等人类或哺乳动物疾病病原的抗原蛋白。这些抗原蛋白在直接食用后或加工成胶囊、冲剂以及其它制剂并以肠道给药的方式能够为人和哺乳动物提供相应的免疫能力，则其基因都可以在本发明中应用。

编码病毒、细菌、真菌或寄生虫抗原蛋白的基因在经过缺失或变异之后也可以应用在本发明中。例如，表达载体含有经过修饰的抗原基因，结果造成抗原蛋白一个或多个氨基酸残基改变，从而也改变了该抗原蛋白的免疫能力。表达载体也可以只含有抗原蛋白的部分编码序列，结果只产生一小段多肽或作为融合蛋白的一小部分，在这种情况下，它们也属于本专利的权利要求范围之内。

实际上，早在现代医学产生之前，人们便已经自觉或不自觉地利用植物或植物中的某些天然成份来医治人类疾病。

随着生物技术的发展，过去只能从稀有植物乃至其它生物体才能够获得，或者收获量甚微的一些具有商业价值的物质，现在已有可能利用栽培作物来进行生产了。可以这样说，基因工程领域的研究进展，使得植物体正在成为具有重要经济价值的异源蛋白的生产体系。据不完全统计，迄今为止，国外已经有几十种药用蛋白质或多肽在植物中得到成功表达，其中包括了人的细胞生长因子、表皮生长因子、促红细胞生成素、干扰素、生长激素、单克隆抗体和可作为疫苗用的抗原蛋白等(见表1)。一些研究机构或公司已开始从这些药物蛋白的生产中获得巨大经济效益。

在植物中生产药用蛋白多肽最早的例子之一是利用植物贮藏蛋白天然的高水平表达特性，生产人的神经肽-亮氨酸脑啡肽。它是一个含有5个氨基酸残基的小分子多肽，在油菜中先以种子贮藏蛋白2S清蛋白的形式被生产出来，后经胰蛋白酶水解被从贮藏蛋白质上切割下来，再通过HPLC予以回收，在临床上可作为止痛剂或镇静剂使用。

继早期的研究之后，在植物中表达人和动物的抗体又成为人们关注的焦点。免疫球蛋白如IgG、IgM、IgG/IgA嵌合抗体、Fab片段、单链抗体和单域抗体等均已实现了表达，表达产物含量最高达植物可溶性蛋白的2％以上。这类抗体具有生物学活性，在纯化后可用作药物、诊断试剂和亲合剂等。此外，在植物中表达抗体还有可能增强作物的抗病毒能力、提高产量以及改良其它农艺性状等。

在植物中生产药用蛋白的另外一条途径是使用基因工程植物病毒作为表达载体，这类裁体可瞬时高效表达大量外源蛋白，是农杆菌转化系统等所不能做到的，已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体，包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、烟草花叶病毒(TMV)和豇豆花叶病毒(CpMV)等，其中超过150多种的蛋白多肽在TMV载体中成功表达⁽⁴⁾。利用融合抗原表达策略已生产出含有疟疾、动物口蹄疫病毒、鼻病毒及人免疫缺陷病毒(HIV)抗原决定簇的嵌合外壳蛋白，这类融合蛋白的生产方式将来可能是生产疫苗的一条重要和经济有效的途径。

本发明不仅允许在一种植物中生产一种抗原蛋白，而且可以在一种植物中同时生产多种抗原蛋白。将多种抗原蛋白的基因构建在同一个表达载体上，然后用其转化植物，从而在一个转基因植物中可同时表达多种抗原蛋白。此外，转基因植物也可以通过多次转化或者同时用多个含有不同抗原基因的表达载体同时转化的方法获得。例如，轮状病毒至少有4个不同的亚型，每一种亚型的抗原蛋白是不同的。如在一种转基因植物中同时表达这几种不同亚型的抗原蛋白，则食用这种转基因植物或以该转基因植物为主要成份加工而成的胶囊、冲剂及其它制剂后，可以同时抵御不同病毒亚型的感染。表1利用植物表达的外源蛋白外源蛋白                             商业应用        表达方式    参考文献

乙肝病毒表面抗原(HBsAg)            疫苗            转基因      [5]大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚基(LT-B)    口服疫苗        转基因        [6]诺沃克病毒外壳蛋白(Norwalk virus)    口服疫苗        转基因        [7]盖氏13单克隆抗体(Guys’13mAb)        预防龋齿        转基因        [8]

谷氨酸脱羧酶(GAD)                  预防糖尿病      转基因      [9]粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)   预防感染        转基因        [10]

Leu-脑啡肽(Leu-Enkephalin)         镇痛            转基因      [11]

水蛭素(Hirudin)                凝血酶抑制因子      转基因      [12]

表皮生长因子(EGF)              刺激上皮细胞分裂    转基因      [13]

促红细胞生成素(EPO)            调节红细胞水平      转基因      [14]红鳟生长激素(Growth hormone)        刺激生长       转基因        [15]人血清白蛋白(Human serum albumin)     血浆成分       转基因        [16]

人干扰素(HIFN-α-D)                抗病毒         CaMV(a)      [17]α-天花粉蛋白(α-trichosantin)    抑制艾滋病病毒     TMV(b)        [18]血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE1)        抗过敏反应       TMV           [19]流感病毒血凝索(Influenza virus HA)    疫苗           TMV           [20]

＆艾滋病毒抗原(HIV-1 gp120)

          疟疾抗原                疫苗           TMV           [21]

口蹄疫病毒抗原(FMDV-VP1)          疫苗           CpMV(c)       [22]

＆鼻病毒抗原(HRV-14)

水貂肠炎病毒抗原(MEV-VP2)         疫苗           CpMV          [23]

犬细小病毒抗原(CPV-CP-VP2)        疫苗           PPV(d)        [24]注：(a)CaMV为花椰菜花叶病毒表达裁体；(b)TMV为烟草花叶病毒表达载体；

(c)CpMV为豇豆叶病毒表达载体；    (d)PPV为李痘病毒表达载体。2．受体植物的选择

利用不同的外源DNA转移技术，现已转化了多种植物，包括许多双子叶植物和一些单子叶植物。考虑到遗传转化操作的难易程度，本发明更倾向于使用双子叶植物作为受体植物，尽管某些单子叶植物如小麦、玉米和水稻可能更适于作为人们的食物或加工成胶囊、冲剂或其它制剂。

选择受体植物进行遗传转化要考虑到抗原蛋白是否能够在它的食用部分中表达。因为，抗原蛋白在植物的某一部分如果实、叶子、茎、种子、或根中表达后，人或哺乳动物可直接食用该部分的植物组织或者在加工以后做成胶囊、冲剂或其它制剂供人们口服。按照一个并不优先的实施方案，抗原蛋白也可在不能食用的植物中表达，然后从中完全纯化出所需的抗原蛋白加工成胶囊、冲剂和其它制剂。

在选择受体植物时，还要考虑其它一些因素。受体植物的食用部分最好不需加热就可以食用，因为加热会引起抗原蛋白变性，从而降低它的免疫原性。此外，因为乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原在人或动物刚出生时最易诱导免疫应答反应的产生，因此，含有该抗原蛋白的植物部分最好能加工成液体的方式被饮用。

适于本发明转化的受体植物包括所有可作为人或动物食物的双子叶植物和单子叶植物，植物的一部分或全部可食用，这些植物包括马铃薯、番茄、胡萝卜、莴苣、黄瓜、小麦、大豆、水稻、玉米和香蕉等，但不仅限于此。3．植物转化方法

有许多种方法可以将外源基因导入单子叶植物和双子叶植物。将外源基因稳定整合入植物染色体基因组DNA的主要方法包括：1)农杆菌介导法；2)DNA直接摄入法，包括PEG介导的原生质融合法、电激法、微管注射法以及使用基因枪将DNA直接送入植物细胞和组织等。

农杆菌介导法是利用质粒载体将特定的DNA片段整合入植物染色体基因组DNA。植物组织的转化方法因植物和农杆菌系统而异。最常用的方法是叶盘法，它适用于任何易于再生成完整植株的植物外植体。农杆菌转化方法特别适用于双子叶植物的转化。

正如上面已提到的各种DNA直接摄入转化方法，电激法是先将原生质体置于放在一个强电场中，在电流作用下将外源DNA送入原生质体内。微管注射法是用微管将DNA直接注射入细胞中。基因枪法是将DNA先吸附在硫酸镁或钨粒上，这些颗粒被加速射入植物细胞或组织中。

按照本发明的一个优先实施方案，农杆菌Ti质粒系统被选用。农杆菌的Ti质粒中含有一段叫做转移DNA(T-DNA)的，它可以进入植物细胞中并整合入植物的染色体中。转移载体的构建分为两步，首先是构建一个可以在大肠杆菌中复制的质粒，这个质粒含有目的基因(在这里专指乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因)；抗原基因的两端含有T-DNA边界序列，它负责目的基因在植物基因组中的插入位点。通常另外一个选择标志基因(如抗卡那霉素抗性基因)也被包含在T-DNA的左右边界序列中，该基因在植物细胞中表达后可提供一个选择标记证实植物或植物细胞是否含有整合的T-DNA序列。载体构建的第二步是将质粒从大肠杆菌转移到农杆菌中。这可以通过三亲交配的方式或DNA直接导入方式完成。为了T-DNA的转移，所用的农杆菌菌株中还要含有一套诱导基因，它们在T-DNA转移到植物细胞中起重要作用。

熟悉植物遗传转化的人应该知道转化用的农杆菌菌株可以有多种选择，质粒构建也有多种方式，其目的都是为了更有利于植物的遗传转化。同样，人们也应该知道除了根癌农杆菌外，在有些情况下，还有其它农杆菌如发根型农杆菌更适于一些植物的转化。

植物组织的转化方法因植物和农杆菌介导系统而异。最常用的是植物叶盘转化法，它适于多种易于再生的植物外植体。在某些情况下，还需要加入一些辅助细胞。其他的转化方法包括原生质体转化，继而由原生质体再生出植物细胞及完整植株。

本发明不仅仅限于使用农杆菌Ti质粒转化系统，还应包括其它物理性的手段将外源基因直接导入植物细胞或原生质体的方法以及其它将外源基因导入植物细胞的方法。4．基因表达启动子

在受体植物和转化方法确定之后，一个组成型的、发育调节型的或组织特异型的表达启动子被选择以便外源基因能够在植物中表达。

所有已知能操纵外源基因在植物细胞中转录的启动子都可以在应用在本发明中。这些启动子可从植物或病毒中获得，如花椰菜花叶病毒35S启动子(包括经过拼接、加倍和突变改造后的35S启动子)；光诱导基因启动子如核糖二磷酸羧化酶小亚基(rbcS)；逆境诱导基因如乙醇脱氢酶(Adhl)或玉米肌动蛋白基因启动子等，但不仅限于此。本发明也可利用已知在植物可食部分高效表达的启动子如马铃薯质体基因启动子。

用于植物转化的质粒通常含有一个选择标志基因。许多有此功能的基因已被开发出来。

下面以转基因马铃薯和番茄生产乙肝病毒包膜中蛋白抗原为例，描述一个优先的实施方案，但本发明的应用不仅限于此。

选择乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原基因在转基因植物中表达是因为乙型肝炎是世界性分布的传染性病毒病，它可以引起人的急、慢性肝炎和肝硬化。选择马铃薯和番茄作为受体植物是为了举例说明在植物的不同部分可表达乙肝病毒表面抗原。

                           实施例11．乙肝病毒包膜中蛋白抗原植物表达载体pSS2L的构建

如图1所示，乙型肝炎病毒核酸(adr亚型)被从乙肝患者的血清中分离出来作为模版，根据已知的乙肝病毒DNA核酸序列⁽²⁵⁾合成特定的引物，并通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得了乙肝病毒包膜中蛋白基因。因为在5’端和3’端引物中分别引入了Bam HⅠ和Sac Ⅰ位点，所以扩增片段经Bam HⅠ和Sac Ⅰ双酶切后，被直接定向插入到质粒pUC19中的相应位点内。得到质粒pUCS2&S，然后，通过核苷酸序列分析，确定乙肝病毒包膜中蛋白基因是否正确和完整。

质粒pUCS2&S含有乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因，用限制性内切酶Bam HⅠ和Sac Ⅰ双酶切可将包膜中蛋白基因切下来，通过琼脂糖凝胶电泳分离获得该DNA片段，随后插入到质粒pBI121原GUS基因位点上(Bam HⅠ和Sac Ⅰ双酶切)便构建成双元表达载体pSS2L。

质粒pBI121购自美国Clonetech公司，它的Bam HⅠ和Sac Ⅰ限制性酶切位点分别位于花椰菜花叶病毒35S启动子和GUS基因起始密码之间以及GUS基因终止序列和NOS终止子之间。选用质粒pBIl21是因为用Bam HⅠ和Sac Ⅰ双酶切可将GUS基因删除，而随后可插入另外一个蛋白基因。新基因将能够在植物细胞内表达。质粒pBI121还含有新霉素磷酸转移酶Ⅱ基因(NPT Ⅱ)，它编码的酶可为植物细胞提供卡那霉素抗性，从而可将含有T-DNA的细胞和组织筛选出来。NPT Ⅱ基因有自己的启动子和多聚腺酸信号序列，它们源自胭脂碱(Nopaline)合成酶(NOS)基因。

质粒pSS2L含有：1)新霉素合成酶基因Ⅱ(NPT Ⅱ)，它提供给植物细胞卡那霉素抗性；2)乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因及操纵该基因的花椰菜花叶病毒35S启动子；3)T-DNA左右边界序列，它可将NPT Ⅱ基因和乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因转移到植物体内并整合到植物染色体中。pSS2L的结构如图2所示。2．将表达载体pSS2L导入农杆菌(A.tumefaciens)

含有乙肝病毒包膜中蛋白抗原基因的质粒pSS2L被通过三亲交配的方式转移到农杆菌LBA4404菌株中，该菌株购自美国Clonetech公司。菌株LBA4404现已被广泛应用是因为它是一改造后的农杆菌，它含有完整Vir基因，但T-DNA已经被删除。Vir基因可反式调节T-DNA自质粒pSS2L向植物细胞内的转移。

农杆菌在含有25mg/L链霉素50ml YEP培养基中振荡培养，在OD600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，将农杆菌细胞重新悬浮在1ml不含任何抗生素的YEP培养基中待用。含有表达载体pSS2L的DH5α和含有辅助质粒pRK2013的HB101分别接种在含有50mg/L卡那霉素50ml LB培养基中振荡培养，在OD_600nm值达到0.4-0.7时，4000g离心收集细菌细胞，然后将细胞分别悬浮在1ml不含任何抗生素的LB培养基中待用。取上述三种细胞悬浮液各200ul，置于同一1.5ml离心管中，28℃静置培养过夜，取该培养物5-10ul，均匀涂抹在YEP固体培养基平板上，该培养基中同时含有25mg/L链霉素和50mg/L卡那霉素，28℃培养2天后，含有pSS2L质粒的农杆菌菌落开始产生。

用碱裂解法从农杆菌中提取质粒DNA，并用限制性内切酶酶切可检测pSS2L质粒DNA是否存在。3．农杆菌介导的植物遗传转化

植物的遗传转化首先是植物组织器官或细胞与农杆菌共培养，在培养约2天后，将植物外植体移置相应的选择培养基中。植物外植体可以是原生质体、愈伤组织或其它器官组织，因植物而异。选用带叶子的器官是最常用的方法。

叶片转化主要依据Horsch等人的方法⁽²⁶⁾。马铃薯无菌苗[品种为费乌瑞它(Favorita)，中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供]保存在22℃光照培养箱中，辅之以中等光照强度下，每隔3个星期剪取顶端幼芽，重新扦插在不含任何抗生素的MS固体培养基中，生长2星期的叶片最适于转化。番茄(中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供)则以7-10日龄的子叶或下胚轴无菌外植体进行转化。

无论马铃薯还是番茄均以叶片进行转化为最好。含有表达载体pSS2L的农杆菌LBA4404接种在50ml YEP培养基(含50mg/ml卡那霉素和25mg/ml链霉素)中28℃培养2天，4000g离心5分钟收集菌体，用25ml液体MS培养液(不含抗生素)洗涤一次，再用MS重新悬浮至OD_600nm=0.2-0.4。将有伤口的叶片浸入稀释后的农杆菌培养液中数分钟，用无菌滤纸吸干叶片上多余的菌液，然后将叶片移置不含任何抗生素的再生培养基上23-25℃共培养2天。将叶片移置新鲜的选择培养基上培养，该培养基中含有100-200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧苄青霉素，以后每两周更换一次培养基。当叶片伤口处愈伤有幼芽形成并长至足够大时，将幼芽切下(通常在转化后6-10星期)转移到生根培养基上生长。当根出现后，将再生植株移置无菌条件下生长或转移到土壤中，给予适宜的温度、光照和营养条件下生长。4．表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白基因工程植株的筛选

在转化大约四个月后(番茄产生果实需10个月)。可检测转基因植株是否含有乙型肝炎病毒包膜中蛋白。

1)生物化学和免疫学检测

从转基因植物的叶片、茎、块茎或果实采集样品。并将样品在水或缓冲液(如PBS磷酸缓冲液，pH7.4含0.2g KH₂PO₄,2.9g Na₂HPO₄·12H₂O,8.0gNaCl,0.2gKCl)中磨碎后，匀浆液在10000g离心10分钟，取上清液，除留一小部分用于Lowry法定量可溶性蛋白外，其余用于乙肝病毒包膜中蛋白含量的测定。通过酶联免疫法测定乙肝病毒包膜中蛋白含量，Hepanostika HBsAg Uni-Form ⅡMicroelisa System试剂盒购自荷兰Organon Teknika公司。

2)乙型肝炎包膜中蛋白基因的检测

转基因植物中乙型肝炎包膜中蛋白基因的整合情况可通过PCR扩增目的片段基因或Southern杂交印迹反应进行检测，自转基因植物和对照植物中分别提取其基因组DNA，依此作为模版，用特异性的包膜中蛋白引物进行扩增，或用BamH Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切后，电泳分离DNA片段，在转移到尼龙膜上后，以地高辛(Digoxigenin)标记的包膜中蛋白核酸编码序列作为探针。此外，可收集转基因植株自交种子，通过卡那霉素抗性萌发实验或PCR分析其后代的外源基因纯合情况。5．表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白转基因植物的繁殖和培育

在筛选出高效和稳定表达乙型肝炎病毒包膜中蛋白的转基因马铃薯或番茄植株后，为生产该抗原蛋白必须大量繁殖该转基因植株。马铃薯是通过营养繁殖的，因此，可通过扦插的方法，在短时间内便可获得大量幼苗和微型薯，且不必担心由于有性生殖而引起后代的遗传重组问题。番茄或其它依靠种子繁殖的转基因植物要获得稳定表达的后代，则需要较长时间，因为种子繁殖有缺点，其后代缺乏均一性，外源基因按照孟德尔遗传规律传给后代。基本上，每个种子遗传上是不同的，具有它自己的遗传特性。因此，转基因植物最好要经过几代筛选，在得到纯系后，外源基因才能稳定地传给后代。6．含乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原转基因食品的制备

乙型肝炎病毒包膜中蛋白可通过大量繁殖转基因植物进行生产，植物在收获后可直接食用或加工成胶囊、冲剂以及其它制剂。马铃薯块茎虽然不能够生吃，但在冷冻干燥后，磨成细粉并加工成胶囊、冲剂或其它制剂。而番茄果实则可以加工成瓶装番茄汁方便饮用。在一定时间内，人们通过口服一定量的胶囊、冲剂或番茄汁或直接食用番茄(在一定时间内一次或多次)，其中含有的乙型肝炎病毒包膜中蛋白有可能激发人体产生免疫应答反应，人们也就具备了对乙型肝炎病毒的免疫能力。

                        实施例21．马铃薯的转化

在农杆菌介导下，利用叶盘法转化马铃薯，然后通过在选择培养基上连续培养和筛选，完整的卡那霉素抗性马铃薯植株被再生出来。

按照Horsch等人的方法，利用叶盘法转化马铃薯。马铃薯无菌苗在重新扦插于MS固体培养基中生长2周后，用剪刀自叶柄与茎相连部位处将叶片剪下。含有表达载体pSS2L的农杆菌菌株LBA4404接种在50ml YEP中，28℃培养2天，4000g离心5分钟，收集菌体，然后重新悬浮在液体的MS培养基中至OD_600nm=0.4，将剪下叶片浸入稀释后的农杆菌中5分钟，然后取出，用滤纸吸干，叶面朝上置于MS固体培养基上，28℃共培养2天。然后将叶片移置新鲜的选择培养基上，该培养基含有200ug/ml卡那霉素和500ug/ml羧卞青霉素，可抑制农杆菌细胞的生长并可使转化的植物细胞有选择的生长。以后每隔2个星期更换一次选择性培养基直到叶柄伤口处长出愈伤并分化出幼苗。当幼苗出现并长到足够大时，将幼苗切下来(通常在共培养后4-8个星期)，移到生根培养基上(含有100ug/ml卡那霉素)，当根长出后，幼苗被移到无菌的营养土中生长并辅之以适当的温度和光照条件。2．转基因马铃薯的RNA分析

利用地高辛标记的包膜中蛋白基因探针，对pSS2L表达载体转化后的卡那霉素抗性马铃薯植株RNA进行了杂交分析。

转基因马铃薯植株的叶片总RNA被提取，方法见参考文献(27)。大约1.0g叶片在液氮中用研钵磨成粉末，加入10ml RNA提取缓冲液(0.2MTris-HCl,pH6.8；0.2M NaCl；20mM EDTA；2％SDS)，随即加入10ml饱和酚缓冲液(10mMTris-HCl,pH8.0；1mM EDTA饱和)进行抽提，然后用10ml的氯仿抽提。3000g离心，收集上层水相，加入0.3M醋酸钾(pH5.2)缓冲液和2.5倍体积的无水乙醇，10000g离心收集沉淀，风干后，沉淀重新悬浮在2ml的水中，随后加入2ml6M的醋酸铵缓冲液和10ml无水乙醇，10000g离心收集沉淀。沉淀在干燥后，重新悬浮在0.4ml水中，RAN浓度可通过测定260nm的吸光值进行估算，假定1mg/ml的RNA吸光值是25单位。

取10ug RNA样品，约5ul，与2倍体积RNA样品缓冲液(10ml去离子甲酰胺，3.5ml 37％甲醛，2ml 5× MOPS)混合后，65℃加热5分钟，冷却后，加入3ulRNA加样缓冲液(50％甘油，1mM EDTA,0.4％溴酚蓝)，然后经过1％的RNA琼脂糖凝胶电泳。核酸通过毛吸管法转移到尼龙膜(Hybond N+)上，所用的缓冲液为20×SSC,pH7.2(3M氯化钠，0.3M柠檬酸钠)，转移时间为16小时。核酸通过紫外线照射后被交连在尼龙膜上，将膜置于预杂交液中[5×SSC,0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02％SDS,100ug/ml鲑鱼精DNA],68℃预杂交3小时，然后更换新的杂交液[5×SSC,0.1％(w/v)N-Lauroylsarcosine,0.02％SDS,1％的封闭剂(BM试剂盒中提供)，5ml杂交液中加入变性的地高辛标记的DNA探针60ng进行杂交，探针长933bp，它是来自质粒pUCS2&S的Bam HⅠ和Sac Ⅰ的酶切片段，包括了乙肝病毒包膜中蛋白基因的全部编码序列。在杂交液中68℃杂交24小时后，取出杂交膜，于200ml 2×SSC,0.1％SDS缓冲液中室温下洗膜2次，然后于100ml 0.1×SSC,0.1％SDS缓冲液中68℃洗膜2次。显色反应基本依据试剂盒中提供的方法(BM)，尼龙膜先于洗脱缓冲液[0.1M Maleicacid,pH7.5；0.15M NaCl；3％Tween 20(w/v)]中平衡5分钟，然后用50ml 1×封闭缓冲液封闭30分钟，加入碱性磷酸酶标记的地高辛抗体至浓度为75mU/ml，室温下反应30分钟，用洗脱缓冲液2次，每次15分钟。将膜移置20ml显色缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH9.5；0.1M NaCl；50mM MgCl₂)中平衡5分钟，更换新的底物缓冲液(200ul NBT/BCIP底物加入10ml显色缓冲液)，遮光条件下显色16小时，待所期望的条带出现后，用水终止反应。

携带有质粒pUCS2&S转基因植株和阴性对照植物的RNA杂交结果如图示5A。不同转基因植株的RNA杂交信号变异很大，这可能是由于基因的插入位点和基因的拷贝数不同引起的。和标准RNA分子量相比，转录的RNA约有1kb长，与预先估计的相一致。阴性对照植物的RNA没有观察到杂交信号。mRNA的稳定、大量表达并能够与编码乙肝病毒包膜中蛋白核酸探针特异性杂交的结果表明mRNA的稳定性在某些转基因植株中不会成为包膜中蛋白在马铃薯中表达的一个问题。3．不同转基因马铃薯植株乙肝病毒包膜中蛋白含量的测定

取不同转基因马铃薯植株叶片0.1g，各加入1.5ml去离子水，在4℃下用玻璃匀浆器磨碎。匀浆液10000g 4℃离心5分钟，利用Lowry法(蛋白测定试剂盒购自Sigma公司，货号为P5656)，取部分上清液测定可溶性蛋白含量。依据Hepanostika HBsAg Uni-Form Ⅱ Microelisa System试剂盒(购自荷兰Organon Teknika公司)中提供的方法，测定上清液中乙肝病毒包膜中蛋白的含量。以CHO细胞提取的标准含量的重组HBsAg蛋白(中国卫生部生物制品鉴定所提供，因为无法获得标准含量的乙肝病毒包膜中蛋白，以下所测定的植物包膜中蛋白表达量为近似值)为阳性对照。阳性对照被稀释成不同蛋白水平(0.02-3.2ng)，在颜色反应后，读取450nm光吸收值，制备一条标准吸收曲线。如图5B中所示，通过比较发现，阴性对照植物中(柱1)没有发现含有乙肝病毒包膜中蛋白，而在转基因马铃薯植株中则可以检测到不同含量的乙肝病毒包膜中蛋白，含量约为植物可溶性蛋白4-15ng/mg(柱2至柱7)。不同转基因马铃薯之间差异比较大这可能是由于基因插入的拷贝数和插入位点不同引起的。4．转基因马铃薯不同组织器官乙肝病毒包膜中蛋白含量的测定

取转基因马铃薯叶片、茎和块茎组织各0.1g，处理和测定方法同上。表2中列出了转基因马铃薯不同组织器官中乙肝病毒包膜中蛋白的含量。

马铃薯叶子中的乙肝病毒包膜中蛋白表达量最高约为可溶性蛋白的0.0015％，为80ng/g鲜重。茎中的乙肝病毒包膜中蛋白尽管表达量占植物可溶性蛋白的0.003％，但因茎中含有的可溶性蛋白量比较低，故每g鲜重只含有40ng包膜中蛋白，约为叶片的一半。马铃薯块茎中的包膜中蛋白含量最高，约为380ng/g鲜重，这就为加工和利用马铃薯块茎提供了极大的方便。表2。马铃薯叶子、茎和块茎中的包膜中蛋白含量器官    ng/mg可溶性蛋白(％)    ng/g鲜重叶子    15(0.0015％)           80茎      33(0.0033％)           40块茎    111(0.011％)           3805．原位杂交法检测转基因马铃薯叶片和块茎中乙肝病毒包膜中蛋白

摘取转基因和非转基因马铃薯植株叶片，在细沙纸上按一下，然后朝向沙纸的一面在硝酸纤维素膜上按下。马铃薯块茎则用干净的手术刀片切开，然后按在硝酸纤维素膜上30秒种。用3％的BSA(溶解在1×PBST缓冲液中)在37℃包被该膜2小时，然后加入HBsAg小鼠抗体(1∶1000倍稀释在PBST中，含2％BSA)，37℃反应5小时。洗膜后，依次加入碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG 37℃反应1小时，最后加入底物缓冲液液进行颜色反应。

原位杂交反应结果如图6A和6B。它直接证实了乙肝病毒包膜中蛋白存在于转基因马铃薯组织中。因为抗体并不能够与SDS变性的乙肝病毒包膜中蛋白反应，所以不可能通过SDS-PAGE电泳进行蛋白印迹检测包膜中蛋白的大小。图6A是转基因马铃薯和阴性对照植物叶子的原位杂交反应结果。右边的阴性对照植物叶片也有一些颜色，但主要是来自叶绿素。左边的叶子都显示了紫色，表明有特异的抗原抗体反应。图6B是转基因马铃薯和阴性对照植物块茎的原位杂交反应结果，与叶片杂交获得的结果相类似。6．乙肝病毒包膜中蛋白转基因马铃薯的繁殖

转基因马铃薯的繁殖已在实施例1中描述。

                           实施例31．番茄的转化

番茄(Lycopersicom esculentum)品种中蔬5号(购自中国农业科学院蔬菜花卉研究所)的转化方法如同实施例2的1中所描述的那样，也是在农杆菌LBA4404介导下利用叶盘法进行遗传转化。农杆菌侵染生长7-10天后子叶或下胚轴无菌外植体，该外植体不需预培养，而是在切下后立即浸入农杆菌菌液中5-10分钟，取出后用滤纸吸干多余的菌液，后移置Z1培养基(MS基本培养基中加入1mg/L玉米素)，25℃遮光条件下共培养2天。然后将外植体转移到SM培养基(MS基本培养基中加入1mg/L玉米素，100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素)诱导愈伤组织形成和幼苗分化⁽²⁸⁾。切下的幼苗在RM培养基(1/2MS基本培养基中加入0.2mg/L NAA,100mg/L卡那霉素和500mg/L羧苄青霉素)诱导生根，待长至一定高度，然后转移到灭菌土壤中，给予适宜的条件培养生长。2．PCR检测乙肝病毒包膜中蛋白基因在番茄中的整合情况

番茄基因组DNA的提取方法基本依据Chee的方法⁽²⁹⁾。取3g番茄鲜叶片，放入研钵中用液氮研磨，磨碎后的粉末移置20ml离心管中，然后加入9ml CTAB提取液(100mM Tris-HCl,pH7.5含5M NaCl,10mM EDTA,10ml/L β-巯基乙醇，10g/L CTAB)，剧烈振荡1分钟，使之充分混匀。在60℃水浴中温浴90分钟，期间每30分钟振荡一次。从水浴中取出离心管，室温下放置4-5分钟，使之冷却，然后加入4.5ml氯仿，轻轻摇动，使之充分混匀。室温下5000g离心10分钟。收集上清液于另一20ml离心管中，加入4.5ml氯仿，重复上述步骤。收集上清液，加入10ml冰冷的异丙醇，轻摇10-15分钟，5000g离心5分钟，收集沉淀，用3ml 76％乙醇含0.2M NaOAc和2ml 76％乙醇含10mM NH₄OAc各洗沉淀一次，最后加入TE(pH8.0)缓冲液溶解DNA，将DNA浓度调至1ug/ul。

取上述番茄基因组DNA 1ug约1ul作为模版，加入乙肝病毒包膜中蛋白基因核酸编码序列特异性引物各1ul,10×PCR缓冲液3ul,dNTP(各2.5mM)3ul,Taq酶0.5ul约1.5U，加水至总体积30ul。94℃30秒，50℃45秒，72℃1.5分钟，共进行35个循环。反应结束后，取5ul扩增样品进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。如图7所示，阴性对照植物中(泳道2-3)没有发现特异性的条带，而在转基因番茄植株中则可扩增出1个约900bp的特异性条带(泳道4-10)，该结果表明乙肝病毒包膜中蛋白基因已整合进入番茄基因组DNA中。3．转基因番茄的RNA分析

转基因番茄叶片和未成熟果实中RNA的提取方法如同实施例2中的2。RNA样品被倍比稀释后，通过点杂交装置(Schleicher&Schuell Manifold SpotBlotting)转移到尼龙膜上(NYTRAN SuperCharge Nylon)，紫外光照射3分钟进行交连，风干。杂交与显色反应如同实施例2中的2。

乙肝病毒膜中蛋白基因在转基因植物中的表达量可以通过RNA印迹反应进行评估。分别从转基因番茄叶子、绿色果实和非转基因番茄植株叶片中提取的总RNA，通过点杂交装置被转移到尼龙膜上，用地高辛标记的乙肝病毒膜中蛋白编码序列DNA探针进行杂交。图8是转基因番茄叶子和果实中总RNA与探针杂交的结果，从杂交信号的强度比较来看，叶子中乙肝病毒包膜中蛋白mRNA含量是果实中的2-3倍。而非转基因番茄的叶子总RNA在高浓度下有较弱的杂交信号产生，但与转基因番茄叶子相比可以认为是非特异性的。由于在杂交中同时加入了已知含量的pUCS2&S质粒DNA(含乙肝病毒包膜中蛋白编码序列)作为阳性对照，相互比较发现，包膜中蛋白基因在转基因番茄叶子和被忠实转录并积累到较高水平，约占植物mRNA的0.01％，属丰富mRNA。在成熟果实中RNA的含量很低，不能通过RNA印迹分析。3．叶子和果实中乙肝病毒包膜中蛋白含量的测定

用研钵将植物组织磨碎，在磨碎过程中加入液氮，植物组织粉末中加入10倍体积灭菌无离子水进行稀释。植物匀浆液10000g 4℃离心5分钟，依据试剂盒(Sigam,p5656)提供的方法，取部分上清液测定可溶性蛋白含量。依据Hepanostika HBsAg Uni-Form Ⅱ Microelisa System试剂盒(购自荷兰OrganonTeknika公司)中提供的方法，测定上清液中乙肝病毒包膜中蛋白的含量。以CHO细胞提取的标准含量的重组HBsAg蛋白(中国卫生部生物制品鉴定所提供)为阳性对照。阳性对照被稀释成不同蛋白水平(0.02-3.2ng)，在颜色反应后，读取450nm光吸收值，制备一条标准吸收曲线。

表3中列出了转基因番茄叶子和果实中包膜中蛋白的含量。取在温室中生长的转基因番茄的绿叶和红色果实进行可溶性蛋白和乙肝病毒包膜中蛋白含量的测定，就象上述所描述的那样。非转基因植物叶子和果实中检测不到乙肝病毒包膜中蛋白。

             表3番茄叶子和果实中的包膜中蛋白含量器官        ng/mg可溶性蛋白(％)    ng/g鲜重叶子        21(0.0021％)           95果实(红)    35(0.0035％)           71

番茄叶子中的包膜中蛋白含量略高于马铃薯叶片，表达量为可溶性蛋白的0.0021％。在成熟果实中包膜中蛋白的含量约占可溶性蛋白的0.0035％，或为71ng/g鲜重。因为果实的密度比较高，番茄果实中的包膜中蛋白表达量集中了番茄植株包膜中蛋白的大部分，一个重100克的番茄果实含有大约7ug包膜中蛋白重组抗原。

                         实施例41．重组乙肝病毒包膜中蛋白在植物组织中的稳定性测定

重组乙肝病毒包膜中蛋白抗原(S₂&S)在完整的植物细胞中，可长时间保存。如以马铃薯块茎方式4℃下低温保存，保存期长达一年，抗原也不会有任何损失。但当植物细胞结构破坏后，细胞器中的各种蛋白酶就会被释放出来，它们能降解植物汁液中所含的重组抗原蛋白。因此，检测重组抗原蛋白在植物汁液中的稳定性，对于今后在加工过程中尽可能保证抗原蛋白不受损失至关重要。从图9中可以看出，重组的乙肝病毒包膜中蛋白抗原在植物汁液中放置的时间越长，蛋白的损失就会越大。在室温下放置1天后与新研磨的汁液中抗原蛋白含量差别不大，但从第2天起，抗原蛋白的量会急剧减少，到第七天后，基本上检测不到抗原蛋白了。该结果表明，在转基因马铃薯块茎加工过程中，应尽快使其脱水干燥，才可以有效防止重组抗原蛋白不会被细胞中释放出的蛋白酶降解破坏。

尽管高温可加速转基因马铃薯块茎脱水干燥，但重组乙肝病毒包膜中蛋白抗原对高温的忍受能力是有限的。从图10可以看出，当温度超过50℃时，处理时间达5小时，植物汁液中能够检测到的抗原蛋白的数量急剧下降，这表明该抗原蛋白可忍受的极限高温是50℃。超过此温度，蛋白会变性，从而失去与特异性抗体的反应能力。

综合上述，可以得出如下结论，干燥马铃薯块茎以低温、快速最为适宜，在此条件下可有效保护重组抗原蛋白不受损失。2．含乙肝病毒包膜中蛋白抗原胶囊的制备

马铃薯块茎不便于食用，可考虑加工成胶囊。1000g鲜重马铃薯块茎在冷冻干燥后可获得干物质约140g，该干物质进而在低温下被磨成150-200目的干粉，经测定，每100mg这种转基因马铃薯块茎制成的干粉中约含有280ng乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原。该干粉可直接灌入肠溶性或胃溶性的胶囊外壳内。根据具体情况，每个胶囊可灌入100-500mg转基因马铃薯块茎制成的干粉，例如，一个300mg的胶囊约含有840ng抗原蛋白。成人一次需服用至少10粒，才有可能获得足够的免疫剂量。

为了提高每个胶囊内乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原的含量，新鲜马铃薯块茎也可在加入等重量水后，在4℃低温情况下进行彻底粉碎，低速离心收集上清液，经迅速冷冻干燥后，每100mg这种提取物中约含有30-45ug乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原。成年人每次只需服用1粒100mg的胶囊，就有可能达到足够的免疫剂量。3．含乙肝病毒包膜中蛋白抗原冲剂的制备

胶囊的容积比较小，如果直接灌入转基因马铃薯块茎制成的干粉，则每粒胶囊所含有的重组抗原蛋白较少，成人每次需服用多粒胶囊才能够达到足够的免疫剂量，因此，增加一次性食用量在某些情况下可能是必需的。此时，可采用冲剂包装形式，每袋内装入5-20g由转基因马铃薯块茎制成的干粉。以10g包装为例，含有乙型肝炎病毒包膜重组中蛋白抗原28ug。成人每次只需服用1袋，便可获得足够的免疫剂量。在服用时，为避免高温导致蛋白变性，可伴以温开水稀释后服下。4．含重组乙肝病毒包膜中蛋白抗原的其它制剂

含重组乙型肝炎病毒包膜中蛋白的转基因番茄果实在直接食用时存在一些问题，因为不可能对每个番茄中的抗原蛋白含量进行测定，因而也就无法确定人每次食用几个番茄果实较为适宜。在这种情况下，可考虑将番茄果实加工成果茶或其它饮料方式，只需对每批产品进行抽样检测，便可作为人服用剂量的指导依据。当然，马铃薯块茎或其它转基因植物也可以加工成饮料的方式便于服用，其前提是必须保证在液体情况下重组乙型肝炎病毒包膜中蛋白抗原不会被蛋白酶所降解，在室温条件下能够长期储存。

植物来源的重组乙肝病毒包膜中蛋白抗原还可以有其它应用方式，例如，抗原蛋白在经过完全纯化或部分纯化后，可作为食品添加剂，掺入奶粉、豆粉果汁和酸奶等食物和饮料中制备成各种特殊功能性食品。

                         参考文献1．成军和杨守纯主编，现代肝炎病毒分子生物学，人民军医出版社，1997年2．de Aizpurua and Russell-Jones,J.Exp.Med.,1988,167:440-4513．Man-kit,L.D.,Arntzen,C.J.and Mason,H.S.,WO 94/20135,19944．Mason,H.S.,Man-kit,L.D.and Arntzen,C.J.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:11745-117495．Grill,L.K.,PBI Bulletin,1998,1:13-146．Haq,K.I.,et al.,Science,1995,268:714-7167．Mason,H.S.,et al.,Proc.Nati.Acad.Sci.USA,1996,93:5335-53408．Ma,J.K.,et al.,Science,1995,268:716-7199．Ma,S.W.and Jevnnikar,A.M.,PBI Bulletin,1998,1:6-810．Gans,P.R.,et al.,In Transgenic Plant:A Production System forIndustrial and Pharmaceutical Proteins,edited by M.R.L.Owen andJ.Pan.,John Wiley and Sons Ltd.,New York,NY.1996,pp281-29711．Krebbers,E.and van de Kerckhove,L.,Trends in Bioechnology,1990,

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Manual,1991,C3:1-28

本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请要求和为了解释和说明本专利的内容。很显然，在不背离本发明的精神和范围之内，可在此基础上，做进一步的改进和变化。

Claims (36)

1．一种引起哺乳动物对病毒抗原蛋白产生免疫应答的方法，该方法包括使用有效和确定免疫剂量的、来源于能产生该抗原蛋白或其衍生物的转基因植物的植物材料或其加工提取物对该哺乳动物进行口服或肠道给药。

2．如权利要求1中的方法，其中所说的植物至少有一部分是可以食用的。

3．如权利要求1中的方法，其中所说的病毒抗原蛋白是乙型肝炎病毒包膜中蛋白。

4．一种抗原来自一种肝炎病毒，其中所说的抗原可以在植物中表达生产，且该抗原为蛋白质，在自然状态下具有免疫原性。

5．如权利要求4中的抗原，其中所说的植物至少有一部分是可以食用的。

6．如权利要求4中的抗原，其中所说的肝炎病毒是乙型肝炎病毒。

7．一种转基因植物是能够表达一种肝炎病毒蛋白的植物，该蛋白在自然状态下具有免疫原性。

8．如权利要求7中的转基因植物，其中所说的植物至少有一部分是可食用的。

9．如权利要求7中的转基因植物，其中所说的肝炎病毒是乙型肝炎病毒。

10．一种乙型肝炎病毒包膜抗原在植物中表达，其中所说的抗原为蛋白质，它在天然状态下具有免疫原性，且可以作为一种药物的有效组成部分。

11．一种食物至少是由转基因植物的某一部分所组成，它被食用是因为它具有一定的营养价值，其中所说的植物是一种能够表达乙型肝炎病毒包膜重组中蛋白抗原的植物，该抗原在天然状态下具有免疫原性。

12．如权利要求11中的任何食物，其中所说的植物食用部分包括果实、叶子、茎、根或所说的植物种子。

13．一个用于转化植物的质粒载体包括：

一段编码肝炎病毒蛋白抗原的DNA序列，该蛋白在天然状态下具有免疫原性。

一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，该启动子操纵所说的基因在所说的植物中表达。

14．如权利要求13中的质粒载体，它含有一个选择或标记基因。

15．如权利要求13中的质粒载体，其中所说的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。

16．如权利要求13中的质粒载体，其中所说的植物至少有一部分是可食用性的。

17．如权利要求13中的质粒载体，其中所说的肝炎病毒蛋白抗原是乙型肝炎病毒包膜中蛋白。

18．一段用于基因枪法转化植物的DNA序列包括：

一段编码肝炎病毒蛋白抗原的DNA序列，该蛋白在天然状态下具有免疫原性。

一个与所说的DNA序列连接的植物启动子，该启动子操纵所说的基因在所说的植物中表达。

19．如权利要求18中的DNA序列，它含有一个选择或标记基因。

20．如权利要求18中的DNA序列，其中所说的植物启动子是花椰菜花叶病毒35S启动子。

21．如权利要求18中的DNA序列，其中所说的植物至少有一部分是可食性的。

22．如权利要求18中的DNA序列，其中所说的肝炎病毒蛋白抗原是乙型肝炎包膜中蛋白。

23．一种构建转基因植物细胞的方法包括：

构建一个质粒载体或一段DNA序列，其中都含有编码乙型肝炎病毒包膜中蛋白的基因和可操纵该基因在所说的植物中表达的植物启动子，该蛋白在天然状态下具有免疫原性。

用该质粒载体或该DNA序列转化植物细胞。

24．如权利要求23中的方法，它包括从所说的转基因植物细胞中再生出完整的转基因植株。

25．生产一种胶囊、冲剂或其它制剂的方法包括：

构建一个质粒载体或一段DNA序列，其中都含有编码乙型肝炎病毒包膜中蛋白的基因和可操纵该基因在所说的植物中表达的植物启动子，该包膜蛋白在天然状态下具有免疫原性。

用该质粒载体或该DNA序列转化植物细胞。

将转基因植物的食用部分冷冻、干燥和磨碎后制作成胶囊、冲剂或其它制剂。

26．如权利要求25的方法，其中还包括在利用转基因植物作为食物以及加工成胶囊、冲剂或其它制剂之前，应从所说的转基因植物细胞中再生出完整的转基因植株。

27．如权利要求25中的方法，其中还包括从所说的植物细胞中部分纯化或完全纯化出所说的抗原蛋白作为胶囊、冲剂或其它制剂的活性组成部分。

28．如权利要求26中的方法，其中包括至少收获所说的转基因植物的某一部分。

29．如权利要求25中的方法，其中所说的植物细胞是通过农杆菌系统转化的。

30．如权利要求29中的方法，其中所说的农杆菌系统是农杆菌Ti质粒系统。

31．如权利要求25中的方法，其中所说的植物是番茄、马铃薯、莴苣、胡萝卜、黄瓜或其它可食用的植物。

32．如权利要求25中的方法，其中所说的质粒载体是一个双元载体系统。

33．如权利要求25中的方法，其中所说的质粒载体是一个整合性载体。

34．如权利要求25中的方法，其中所说的质粒载体是pBI121。

35．如权利要求25中的方法，其中所说的植物细胞是通过除农杆菌转化系统以外的其它转化方法如基因枪法、微管注射法、PEG吸收法以及电融合法等方法转化的。

36．如权利要求25中的方法，其中所说的植物细胞是一个双子叶植物的细胞，或是一个单子叶植物的细胞。

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