CN103421729A

CN103421729A - 一种猪蓝耳病基因重组猪霍乱沙门氏菌疫苗及应用

Info

Publication number: CN103421729A
Application number: CN2012104088169A
Authority: CN
Inventors: 何启盖; 杨昆; 郭爱珍; 陈焕春; 刘晓莉
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2012-10-24
Filing date: 2012-10-24
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2032-10-24
Also published as: CN103421729B

Abstract

本发明涉及一种猪蓝耳病基因重组猪霍乱沙门氏菌疫苗及应用，属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪蓝耳病病毒（PRRSV）主要免疫原性膜蛋白的重组猪霍乱沙门氏菌的构建、活疫苗制备及应用。本发明得到一株表达猪PRRSV GP5m蛋白的重组猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012275。本发明还公开了利用该重组菌株制备猪霍乱沙门氏菌和PRRSV疫苗的方法及其应用。本发明制备的重组活疫苗可以刺激猪产生抵抗猪霍乱沙门氏菌和PRRSV主要免疫原性膜蛋白GP5m的免疫力，有效防制仔猪副伤寒和PRRSV的感染。

Description

一种猪蓝耳病基因重组猪霍乱沙门氏菌疫苗及应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（或称猪蓝耳病）修饰型ORF5m基因的重组猪霍乱沙门氏菌及疫苗的构建及应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种能够导致妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪呼吸道症状的病毒性传染病(Meulenberg et al,2000)，又称蓝耳病。该病以妊娠母猪早产、流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍，新生及断奶前仔猪高死亡率以及各年龄段尤其是仔猪的呼吸道疾病为特征。因其临床上常以感染猪只的可视黏膜例如耳部、吻突处发绀为特点，所以俗称“蓝耳病”(Blue-earDisease)。我国大陆于1996年首次报道此病并分离到病毒(郭宝清等，1996)，随后该病在我国呈蔓延趋势(蔡雪晖等，2000)。目前PRRS已遍及全球主要养猪国家和地区，成为影响养猪业的主要疾病因素之一，给养猪业造成了巨大的经济损失。2006年以来更是爆发了席卷全国的所谓“猪高热综合征”，又称“猪无名高热”，研究表明，肆虐我国养猪业的所谓“猪无名高热”与高致病性PRRSV感染有直接关系。

GP5由ORF5编码，长度为200个氨基酸左右，分子量为25～30kD，为糖基化的囊膜蛋白。GP5可诱导产生特异性中和抗体(neutralizing antibodies,NA)，病毒中和效应与抗GP5抗体滴度呈显著正相关性。用含编码GP5的DNA疫苗免疫，可使免疫猪产生抗PRRSV的NA。也有研究表明，该蛋白可引起细胞凋亡(Osorio et al.,2002)。Ostrowski等(2002)用具有PRRSV中和性的单抗和猪血清，从PRRSV cDNA噬菌体文库中筛选出了2个针对B细胞的抗原位点，即A表位和B表位，它们均位于GP5上。研究证实位点A为非NE，在各PRRSV分离株中高度变异，具有免疫优势；位点B为NE，在各PRRSV分离株中相对保守，不具免疫优势。位点A可能扮演了一个诱骗因子的角色，抑制了B表位产生NA的能力，使NA的产生至少推迟了3周，所以在设计基于GP5的PRRSV疫苗时，应考虑将B表位充分展现出来。江云波等（2006）研究证实将PADRE插入ORF5基因的诱骗表位和中和表位间，可以使ORF5基因的NE充分展示给B细胞，从而增强NA产生的水平。因此，如果用修饰型ORF5m基因代替天然的ORF5基因，从而诱发更高免疫反应的优化的GP5蛋白，有望成为新一代疫苗研制的候选靶蛋白。

同多数病毒性疾病的防制相同，对PRRS的防制仍以疫苗免疫预防为主。目前PRRS商品化疫苗主要是灭活苗和弱毒苗两种传统常规疫苗，使用后虽均可减轻临床症状，但不能阻止强毒感染和病猪的排毒及持续性感染的发生。

（1）PRRS灭活苗：目前，世界上许多养猪国家都已研制生产出PRRS灭活疫苗。例如灭活苗“Cyblue”(西班牙Cyanamid公司产品)，是基于欧洲型分离株的油乳剂疫苗，我国的PRRSV灭活疫苗则是由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的基于美洲型分离株CH1a株的油乳剂疫苗，用于预防母猪的繁殖障碍。灭活疫苗最大的优点是安全性好，最大的缺点是免疫次数多、免疫剂量大、免疫产生的保护效力有限。

（2）PRRS弱毒苗：同PRRSV灭活苗一样，目前许多国家(包括美国、西班牙、荷兰等)均已研制出针对PRRS的弱毒苗并商品化。PRRS弱毒苗效果要明显好于灭活苗(Mengeling et al.,1999)。但由于弱毒苗存在毒力返强的风险，所以安全问题仍是猪场长期免疫PRRS弱毒苗最大的忧虑(Storgaard et al.,1999)。

PRRSV不同分离株尤其是不同基因型（群）分离株在毒力、生物学特性、抗原性和遗传学特性上存在一定差异，因此利用单一PRRSV毒株制备的疫苗不能完全保护免疫猪免受异源毒株的感染，这给PRRS疫苗的研制带来很大困难，尤其是近年来免疫猪非典型性或急性PRRS的爆发更使人们质疑现有PRRS传统常规疫苗的免疫效果。因此近年国内外学者一致致力于PRRSV新型疫苗的研发，例如亚单位疫苗、核酸疫苗、感染性cDNA基因突变疫苗等，但是这些疫苗存在成本昂贵及技术要求高等缺陷，难以推广应用。

房晓文等将抗原性良好的猪霍乱沙门氏菌接种含有醋酸铊的普通肉汤培养基中传代培养，经数百代传代后，于1964年选出一株毒力弱、遗传稳定、免疫原性好的弱毒株，命名为C500，目前全国仔猪副伤寒弱毒活疫苗使用的都是C500株，年产量约1.5亿头份左右，其包括口服和注射两种剂型(康凯，2003)。随后，关于C500株为载体的疫苗陆续被报道，陆平等(1995)利用C500和大肠杆菌K88ac,LT(A-B+)表达质粒成功构建了基因工程二联疫苗，结果表明对免疫母猪所产仔猪可产生部分保护力。乔红伟等(2005)利用真核质粒pVAX 1表达猪瘟E2基因，然后电转化C500，随即免疫小鼠和家兔，免疫动物均产生了抗沙门氏菌和猪瘟的特异性抗体。以上两个研究有一个共同特点，即所用的都是抗性质粒，这种质粒在无抗性环境下极易丢失，而且抗性对机体也是有害的。因此，非常有必要对C500进行一定的遗传操作，使其更加安全和高效。

减毒沙门氏菌作为疫苗载体具有诸多优点：(1)可诱导产生细胞毒性杀伤反应(CTL反应)；(2)减毒沙门氏菌本身具有佐剂的效用；(3)由于减毒沙门氏菌是活菌，所以免疫具有持续性；(4)可同时携带不同的抗原，具有联合免疫作用；(5)所表达的靶抗原不需提纯，显著降低了疫苗的生产成本；(6)可直接将菌液接种猪体，简单方便，易于操作。

除此之外，重组沙门氏菌活疫苗自然感染或试验感染，诱导抗任何异源血清型沙门氏菌保护的同时，沙门氏菌因侵入淋巴系统，能够更有效地激发宿主产生针对异源抗原的体液和细胞免疫反应。这样，重组弱毒活疫苗也许是解决当前高致病性PRRSV商品化疫苗不足之处的一种可行方法。本申请人构建的asd质粒载体平衡致死系统具有表达量高、外源基因表达稳定、不需纯化以及无抗生素抗性标记等优点，同时鉴于猪霍乱沙门氏菌C500的良好免疫原性，将其开发为表达高致病PRRSV主要免疫原性膜蛋白的重组活疫苗具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明在于克服现有技术存在的缺陷，其第一个目的是获得表达高致病性PRRSV病毒修饰型ORF5m基因的重组猪霍乱沙门氏菌株。

本发明的第二个目的是利用上述重组菌株获得一种与PRRSV相关基因ORF5重组的猪霍乱沙门氏菌疫苗，该疫苗对仔猪副伤寒和高致病性PRRS两种病原具有明显的保护力。

本发明的第三个目的是涉及本发明重组菌株在制备猪霍乱沙门氏菌和高致病性PRRSV疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

申请人通过基因工程的方法，获得一株表达高致病性PRRSV修饰型ORF5m基因的重组的猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）C501-GP5m，于2012年07月08日送交中国.武汉.中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏编号为CCTCC NO:M 2012275。

申请人提供了一种重组猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m的制备方法，其包括下列步骤：

1）修饰型ORF5m基因的扩增：参照已报道的PRRSV WUH3全基因组序列（文献见后）设计2对引物，分别扩增带有EcoR Ⅰ+BamH Ⅰ酶切位点的A表位，在此下游引物中引入39bp的通用型辅助T淋巴细胞表位（PADRE）；BamH Ⅰ+HindⅢ酶切位点的B表位，以提取PRRSV WUH3株（文献见后）的基因组为模板，将PRRSV基因组反转录成cDNA，用上述2对引物进行PCR扩增，得到PCR产物。

2）重组质粒pYA-GP5m的构建与鉴定：回收带有EcoR Ⅰ+BamH Ⅰ酶切位点的A表位产物，用EcoRI和BamH Ⅰ分别对A表位回收产物和平衡表达质粒pYA3493进行双酶切、回收、连接构建重组质粒pYA-A；然后再用BamH Ⅰ和HindIII分别对带有BamH Ⅰ+HindIII酶切位点的B表位回收产物和pYA-A重组质粒进行酶切、回收、连接构建得到重组质粒pYA-GP5m。

3）重组猪霍乱沙门氏菌C501(GP5m)的构建与鉴定：从缺失了asd基因的大肠杆菌x6097中提取重组质粒pYA-GP5m，然后电转化△asdC500感受态细胞，在DAP阴性平板上筛选阳性克隆，挑取单菌落进行培养，用鉴定引物pYA-F/pYA-R进行PCR鉴定，并进行序列测定，得到表达高致病性PRRSV主要免疫原性膜蛋白GP5m蛋白的猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis）C501-GP5m，于2012年07月08日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M 2012275；

上述步骤1）中所述的2对引物的DNA序列如下所示：

A表位上游引物：GCCGAATTCATGTTGGGGAAGTGCTTGACC

A表位下游引物：TTTGAGCTCAGCGGCAGCCTTCAGGGTCCAGGCAGCCACGAACTTGGCGCTGGCGTTGACGAGC

B表位上游引物：CGCGAGCTCAACAACAACAGCTCTCATATTCAGT

B表位下游引物：ATTAAGCTTCGAGACGACCCCATTGTTCCGCTG

步骤3）所述的鉴定引物pYA-F/pYA-R的DNA序列如下所示：

pYA-GP5m的上游引物：TCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC

pYA-GP5m的下游引物：GCTGAAAATCTTCTCTCATCCG

申请人从一种原核表达的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒主要免疫原性膜蛋白GP5m蛋白的基因片段ORF5m，它是通过如下步骤制备得到的：将通用型辅助T淋巴细胞表位（PADRE）插入猪高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的诱骗表位和中和表位间，可以使ORF5基因的中和表位充分展示给B细胞，从而增强特异性中和抗体产生的水平。因此，用修饰型ORF5m基因代替天然的ORF5基因，能够诱发更高免疫反应的优化的GP5蛋白，ORF5m的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：3所示。

上述的修饰型高致病性PRRSV囊膜蛋白GP5m的重组猪霍乱沙门氏菌株缺失了沙门氏菌株基因组中必需的细胞壁形成的相关基因即asd基因（需要含asd基因的质粒存在于菌体内或外源添加DAP的培养基上才能够正常生长、繁殖），同时该重组菌株含有外源质粒pYA-GP5m（含有asd基因）。该重组菌株保留了亲本菌株猪霍乱沙门氏菌C500作为猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株的免疫特性。质粒pYA-GP5m能在该重组菌株中表达asd基因，并且含有能够表达高致病性PRRSV GP5m蛋白的基因（本发明将该蛋白命名为GP5m）。其中asd基因表达产物提供沙门氏菌株必需的细胞壁形成的相关成份，而GP5m蛋白的基因表达产物提供了良好的针对高致病性PRRSV的免疫原性。

本发明的修饰型高致病性PRRSV囊膜蛋白GP5m的重组猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500。本发明重组的猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m，缺失了C500菌株基因组中的asd基因，同时添加了含有能表达修饰型高致病性PRRSV囊膜蛋白GP5m质粒pYA-GP5m。这样GP5m蛋白的基因在重组菌株中能够稳定高效地表达，使本重组菌产生了针对高致病性PRRSV的免疫保护力。

本发明的主要优点是：

1.本发明的重组菌株所表达的高致病性PRRSV GP5m蛋白，具有良好的免保护性。由于高致病性PRRSV对养猪业危害较严重，而目前市场上各种商品化高致病性PRRSV疫苗（主要是灭活苗和弱毒苗）存在免疫效果不理想或毒力返强等不安全因素。因此，用本发明构建的基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。

2.本发明的重组菌株衍生于在中国已经使用了50年以上的商品化猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500，完全保留了C500针对猪霍乱沙门氏菌的免疫效力。而且，本发明的重组菌株毒力比C500弱，具有更好的生物安全性。

3.本发明的重组菌株可以同时提供针对仔猪副伤寒和高致病性PRRSV两种病原的保护力。

4.本发明的重组菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

更详细的技术方案见实施例所述。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是与猪蓝耳病相关的基因ORF5m的A表位pYA-A的核苷酸序列，长度为3237bp。

序列表SEQ ID NO：2是是与猪蓝耳病相关的基因ORF5m的pYA-GP5m的核苷酸序列，长度为3719bp。

序列表SEQ ID NO：3是ORF5m的核苷酸序列，长度为645bp。

图1：是本发明制备的重组质粒pYA-GP5m及猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m的构建流程图。

图2：是本发明中PRRSV的ORF5m基因中A表位和B表位的PCR扩增图。图中：M：DL2000DNA Marker；

1：含有EcoRI andBamH Ⅰ酶切位点的抗原A表位的PCR产物；3：含有酶切位点BamH Ⅰ和HindIII的抗原B表位的PCR产物；2,4：阴性对照。

图3：是本发明制备的重组质粒pYA-GP5m的PCR，酶切鉴定图。图中：M1：DL2000DNAMarker；M2：DL 15000DNAMarker；1：A表位的PCR产物；2：B表位的PCR产物；3：ORF5m的PCR产物；4：EcoRI和HindIII对重组质粒进行双酶切鉴定。

图4：pYA3493的质粒限制性图谱。

图5：猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m的PCR鉴定结果。图中：M：DL2000DNA Marker；1-9：C501-GP5m

菌株；-：阴性对照。

图6：是本发明制备的转移质粒pREasd12的示意图谱。

图7：是本发明制备的转移质粒pREasd12的酶切鉴定结果。泳道M为15000bp的DNA分子marker，泳道1为pREasd12经Xba I+KpnI酶切产物。

图8：是本发明制备的猪霍乱沙门氏菌asd-C500的PCR检测电泳图谱。泳道M1为2000bp的DNA分子marker，泳道M2为15000bp的DNA分子marker，泳道1-7为筛选的缺失株asd－C500，泳道8-12为亲本菌株C500对照，泳道13为pREasd12质粒对照，泳道14为H2O对照。

图9：是用Western-blot鉴定本发明的猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m的分泌表达图。图中显示猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m在24小时、36小时、48小时均可表达出目的片段，大小为29kD，亲本株C501(pYA)不能被检测出上述的特异性反应条带。图中所用生物材料分别为：亲本株C501(pYA)，即对照；表达GP5m蛋白的重组株C501(pYA-GP5m)，即：本发明的重组猪霍乱沙门氏菌C501(pYA-GP5m)。

图10：猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m诱发免疫小鼠抗PRRSV中和抗体检测。图中C500（pYA-GP5m）为试验编号（中国典型培养物保藏中心的保藏名称为C501-GP5m，保藏号为CCTCC NO：M2012275）。

图11：猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m诱发免疫小鼠淋巴细胞增殖检测。图中C500（pYA-GP5m）为试验编号（在中国典型培养物保藏中心的保藏名称为C501-GP5m，保藏号为CCTCC NO：M2012275）。

图12：β-actin荧光定量PCR引物的熔解曲线。

图13：IFN-γ荧光定量PCR引物的熔解曲线。

图14：荧光定量PCR检测猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA表达水平，图中C500（pYA-GP5m）为试验编号（中国典型培养物保藏中心的保藏名称为C501-GP5m，保藏号为CCTCC NO：M2012275）。

图15：利用本发明制备的猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m诱发猪只抗PRRSV中和抗体检测，图中C500（pYA-GP5m）为试验编号（中国典型培养物保藏中心的保藏名称为C501-GP5m，保藏号为CCTCC NO：M2012275）。

具体实施方式

以下结合说明书附图对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1制备实施例1（制备能够原核表达的高致病性PRRSV GP5m蛋白的基因片段）

1.引物的设计与合成

参照已报道的PRRSV WUH3(文献：Li B，2009；PRRSV WUH3基因组序列见Genebank登录号：NO.HM853673）全基因组序列设计2对引物（见表1），分别扩增带有EcoR Ⅰ+BamH Ⅰ酶切位点的A表位，在此下游引物（ORF5m-AR）中引入39bp的PADRE；BamH Ⅰ+HindⅢ酶切位点的B表位），本发明所需引物见表1所示。

2.RNA的提取、反转录及基因的扩增

（1）RNA的提取

使用购Bioflux公司的RNA提取试剂盒（按试剂盒说明书操作）提取PRRSVWUH3的RNA，具体方法如下：

1)取100μLPRRSV病毒贮存液加入到1.5mL离心管中，然后加入SolutionR2（溶解液）600μL，上下翻转5-6次，室温静置3-5min；

2)小心将上清液转移至吸附柱内，套上离心管，4℃，10000r/min，离心30s(注意不要吸到悬浮杂质)；

3)弃去管内液体，并向吸附柱内加入600μLWashbuffer（洗液），4℃，10000r/min，离心30s，弃去管内液体，如此重复洗涤一次；

4)将空柱于4℃，10000r/min，离心1min；

5)将吸附柱转移至一个新的1.5mL离心管内，在吸附柱的膜中央加入20～50μL Elution buffer（洗脱液），室温静置2-3min，4℃，10000r/min，离心1min，离心管底部的液体即为所需的总RNA。

注:以上物品均不含RNA酶。

表1本发明所用引物

注：表1中的引物序列的下划线为酶切位点。

（2）反转录合成cDNA

使用购自TOYOBO公司生产的ReverTra

试剂盒（按说明书介绍的方法）进行操作，具体步骤如下：

1）RNA的热变性，反应体系见表2：

表2RNA的热变性反应体系

置于PCR仪中，65℃5min，然后立即放在冰上。

2）反转录，反应体系见表3：

表3反转录反应体系

反转录条件为：30℃(10min)→42℃(20min)→99℃(5min)→4℃(5min)，反转录产物可直接用于常规PCR扩增，或于-20℃保存备用。

（3）PCR反应

PCR扩增反应体系见表4：

表4目的基因的扩增反应体系

反应条件为：94℃预变性5min后，开始进入PCR循环，94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸50s，36个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，取10μL PCR产物用0.8%-1%的琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果（见图2）。从图中可看出在153bp(含有114bp的A表位以及39bp的PADRE)和522bp左右有两条明显的DNA条带，与预期目的带大小相符，说明带有EcoR Ⅰ+BamH Ⅰ酶切位点的A表位和带有BamH Ⅰ+Hind III酶切位点的B表位扩增成功。

实施例2制备实施例2（重组质粒pYA-GP5m的构建与鉴定）

本实施例的第一步是将回收带有EcoR Ⅰ+BamH Ⅰ酶切位点的A表位产物，用EcoR I和BamH Ⅰ分别对A表位回收产物和平衡表达质粒pYA3493（见图4，将无抗性原核表达质粒pYA3493(asd⁺,p-lactamasesignal sequence,pBRori)转化宿主菌大肠杆菌x6097(该菌株的基本结构为araΔ(lac-pro)rpslΔasdA4Δ[zhf-2::Tn10]thiФ80d/lacZΔM15)），进行双酶切、回收、连接构建得到重组质粒，将该质粒命名为pYA-A，将连接产物转化大肠杆菌x6097，在DAP阴性平板上筛选阳性克隆，提取pYA-A质粒。第二步是用BamHⅠ和HindIII分别对带有BamH Ⅰ+HindIII酶切位点的B表位回收产物和pYA-A重组质粒进行酶切、回收、连接得到重组质粒，将其命名为pYA-GP5m。第三步是将连接产物转化缺失了asd基因的大肠杆菌x6097，在DAP阴性平板上筛选阳性克隆，提取pYA-GP5m质粒进行PCR、酶切和测序鉴定。pYA-GP5m重组质粒的构建流程如图1所示，重组质粒pYA-GP5m的图谱见图1所示。重组质粒pYA-GP5m的PCR、酶切和测序鉴定图见图3。其核苷酸序列见SEQ ID NO：3所述，序列长度为645bp。

上述生物材料的保藏信息如下所述：

包含所述表达质粒pYA3493的大肠杆菌（Escherichia coli）X6097/pYA3493于2012年9月13日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCCNO：M2012343。

大肠杆菌（Escherichia coli）x6097于2012年9月13日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2012344。

以上方案中关于目的片段的回收与纯化、酶切、连接和转化等实验方法为常规方法，具体步骤如下：

1.琼脂糖凝胶电泳目的片段的回收与纯化

使用购自BioFlux公司生产的DNA快速回收试剂盒（按试剂盒的说明书操作）进行回收纯化，具体步骤如下：

(1)将目的基因DNA片段（A表位和B表位）经0.8%～l%的琼脂糖凝胶电泳分离；

(2)电泳结束后，将琼脂糖凝胶经EB染色后，在长波紫外灯下用洁净、锋利的手术刀片切取含目的基因片段的琼脂凝胶块，放入一个洁净的2mL离心管中；

(3)按1:3的比例(凝胶质量:溶胶液体积(mg:mL))加入Extraction Buffer（萃取液）；

(4)于50℃恒温水浴或金属浴中温育10～15min，直到凝胶块融化，温育过程中每隔2～3min上下颠倒混匀一次；

(5)将混合液转移至回收柱内，6000r/min，离心1min，弃去管内液体；

(6)将500μL溶胶液加入回收柱内，12000r/min，离心1min，弃去管内液体；

(7)向回收柱内加入750μL洗液（Wash Buffer），室温静置2～5min，12000r/min，离心1min，弃去管内液体；

(8)再次于12000r/min，离心2min，然后将回收柱转移到无菌1.5mL离心管中，打开盖子，室温静置2～5min，待其自然风干；

(9)向离心柱内加30～50μL洗脱液、ddH₂O或TE溶液，于37℃温育5min；

(10)12000r/min，离心3min，如有需要可将离心管中的液体再次加入到离心柱内，再次洗脱，离心管底部的液体即为回收的目的基因片段，可直接用于连接反应，或于-20℃保存备用。

2.利用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞

参照《分子克隆实验指南(第三版)》（J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社出版，2008年），具体步骤如下：

(1)从大肠杆菌X6097（宿主菌X6097(araΔ(lac-pro)rpslΔasdA4Δ[zhf-2::Tn10]thiФ80d/lacZΔM15)由美国华盛顿大学Dr.Roy CurtissIII教授惠赠）平板中各挑取一个单菌落，接种于5mL LB液体培养基中(培养时要加入终浓度为25-50μg/mL的DAP)，37℃，200r/min过夜培养；

(2)按1:100（体积比）无菌转接到50mLLB液体培养基（1.0%蛋白胨(10g)、0.5%酵母提取物(5g)、1.0%NaCl(10g)，用10mol/L的NaOH调pH值至7.0～7.2，15磅高压灭菌20～30min）中(DAP同上)，200r/min，培养约2-3h，冰上静置30min，将菌液转移至无菌预冷的50mL聚丙烯离心管中；

(3)4℃，5000r/min，离心10min，弃上清，离心管倒置1min，流尽残留培养液；

(4)向离心管内加入10mL预冷的0.1mol/L CaCl₂液体，重悬沉淀，冰浴30min后，4℃，5000r/min，离心10min，弃上清；

(5)沉淀用2mL预冷的0.1mol/L CaCl₂重悬后，感受态细胞制备完成，分装0.1mL/管，悬浮的感受态细胞可马上用于转化，如需保存，则需加入无菌甘油至终浓度为15%，-80℃冰箱保存备用。

3.酶切、连接与转化

(1)目的DNA（A表位B表位）片段与pYA3493（见图4，无抗性原核表达质粒pYA3493(asd⁺,p-lactamasesignal sequence,pBRori)质粒双酶切反应体系见表5：

表5酶切反应体系

轻轻混匀上述组分，于37℃反应2h，反应结束后，进行凝胶回收。

(2)经酶切后回收纯化的PCR产物与质粒的连接反应体系见表6：

表6连接反应体系

Figure 2012104088169100002DEST_PATH_IMAGE001

Figure 2012104088169100002DEST_PATH_IMAGE002

轻弹管壁混匀并小转速离心，16℃水浴连接过夜;

(3)将10μL连接产物加入到100μLX6097感受态细胞中混匀，冰浴30min;

(4)42℃热激90s后，迅速置于冰上，静置5min;

(5)加入500μL LB液体培养基混匀，37℃,200r/min，培养45-60min;

(6)4℃，5000r/min，离心5min，弃掉500μL液体，用剩余的100μL液体重悬沉淀，然后涂布于准备好的LB固体培养基（LB培养液、1.2%～1.5%琼脂粉，15磅高压灭菌20～30min）上，37℃，倒置培养12～16h后，挑取单菌落培养鉴定。

4.质粒的小量制备

使用购自Transgene公司的小量质粒提取试剂盒（按试剂盒说明书操作）提取质粒，具体步骤如下：

(1)取1～4mL过夜培养的大肠杆菌，10,000r/min，离心1min，弃上清；

(2)加入250μL重悬液(RB，含RNaseA)，振荡，重悬沉淀，注意不应留有小的菌块；

(3)加入250μL裂解液（试剂盒自带)，温和地上下翻转5～6次，静置1～2min，使菌体充分裂解，待液体颜色由半透亮变为透亮蓝色时，指示菌体裂解完全，裂解时间不宜超过5min；

(4)加入350μL中和液（试剂盒自带)，上下轻轻翻转5-6次，室温下静置2min；

(5)12,000r/min，离心8min，小心将上清加入至吸附柱中；

(6)12,000r/min，离心1min，弃液体；

(7)向吸附柱内加入650μL洗涤液（试剂盒自带)，12,000r/min，离心1min，弃液体；

(8)将空的吸附柱于12,000r/min，离心1～2min，彻底去除残留的WB；

(9)将吸附柱置于一个干净的离心管内，打开盖子，室温静置2～5min，自然风干，在吸附柱的中央加入30～50μL EB，37℃温育5～7min；

(10)12,000r/min，离心2min，洗脱DNA，洗脱出的DNA于-20℃保存备用。

实施例3制备实施例3（表达GP5m蛋白的重组菌株C501-GP5m的构建与鉴定）

用质粒小提试剂盒（购自Trans gene公司）从缺失了asd基因的大肠杆菌x6097中提取重组质粒pYA-GP5m，然后电转化△asdC501感受态细胞，在DAP阴性平板上筛选阳性克隆，挑取单菌落进行培养，用鉴定引物pYA-F/pYA-R进行PCR鉴定，并进行序列测定，结果表明所获得的含有pYA-GP5m质粒的重组猪霍乱沙门氏菌是正确的，申请人将该重组菌株命名为猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m，其构建流程如图1所示。用基于质粒pYA设计的鉴定引物pYA-F/pYA-R分别对该猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m进行PCR鉴定，可以扩增出787bp大小的条带，与预期大小相符(图5)，同时将获得的重组菌株进行测序鉴定，显示碱基无突变。以上结果表明本发明的猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m构建正确，将其命名为猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m，Salmonella choleraesuis C501-GP5m于2012年7月8日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2012275。上述方案中沙门氏菌电转化感受态细胞的准备及沙门氏菌的电转化方法如下：

1.猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失菌株asd^-C500的构建

（1）引物设计

参照已报道的鼠伤寒沙门氏菌LT2株asd基因序列(GenBank No:AE008863)设计2对引物（pa1/pa2和pa3/pa4，见表7，从猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500（购自中国兽医药品监察所）基因组中分别扩增asd基因上下游片段asd1和asd2，扩增片段大小分别为2112bp和2069bp，上臂两端分别引入Xba I和BamH I酶切位点，下臂两端分别引入BamH I和Kpn I酶切位点。另设计1对引物（pa5/pa6见表

1）进行C500亲本菌株和asd缺失菌株的鉴定。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表7PCR引物

（2）asd基因上下游片段asd1（上臂）与asd2（下臂）的克隆

1）将冻干的猪霍乱沙门氏菌C500在LB固体平板上划线，37°C培养16h。挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37°C、200r/min振摇培养16h。按细菌基因组提取试剂盒（购自北京TIANGEN公司）说明书提取基因组为PCR模板。

2）asd1和asd2扩增反应均在25μL的体系中进行，反应体系（PCR相关试剂均购自宝生物工程大连有限公司）如下：模板DNA 1μL，10×PCR缓冲液2.5μL，25mmol/L MgCl₂2μL，10μmol/L上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs 1μL，2U/μLTaqase 0.5μL，双蒸水16μL。

3）asd1和asd2扩增条件为：95°C变性5min后进入循环，循环参数为94°C 1min，57°C 1min，72°C 2.5min。30个循环后，72°C延伸10min。扩增的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增2个片段大小与预期大小相当，分别为2112bp和2069bp。将得到的目的基因克隆到pMD18-T载体（购自大连宝生物工程有限公司公司）。

（3）pREasd12转移质粒的构建

用XbaI和BamHI双酶切asd1和pBluescriptSK(+)载体（购自美国Stratagene公司），回收纯化后用T4DNA ligase（购自宝生物工程大连有限公司）连接，16°C水浴12h，转化DH5α感受态细菌（购自宝生物工程大连有限公司），37°C在固体LB培养基（10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化钠，15g琼脂粉，加蒸馏水定容至1000mL，在121°C高压蒸汽灭菌25min）培养12h，挑菌到液体LB培养基（10g胰蛋白胨，5g酵母浸膏，5g氯化钠，加蒸馏水定容至1000mL，121°C高压蒸汽灭菌25min），于37°C、225r/min振摇培养12h，使用质粒提取试剂盒（购自北京TIANGEN公司）小量制备质粒从而获得质粒pSKasd1。再用BamHI和KpnI双酶切asd2与质粒pSKasd1。回收后用T4DNA ligase连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，37°C培养12h，挑菌到液体LB培养基，37°C、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得质粒pSKasd12。用XbaI和KpnI双酶切转移质粒pSKasd12与自杀性质粒pRE112(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Miller,V.L.,Mekalanos J.J.1988.A novel suicide vector and its use inconstruction on insertion mutations:osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants inVibrio cholerae requires toxR.J.Bacteriol.170:2575–2583)，回收asd1+asd2片段和质粒pRE112，用T4DNAligase连接，16°C水浴12h，电转化大肠杆菌χ7213(由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Edwards,R.A.，L.H.Keller,and D.M.Schifferli.1998.Improved allelic exchange vectors and their use to analyze 987Pfimbria gene expression.Gene 207:149-157)构建重组菌株χ7213/pREasd12，37°C培养12h挑菌到液体LB培养基，37°C、225r/min振摇培养12h，小量制备质粒从而获得pREasd12转移质粒，其物理图谱见图6。鉴定结果证实构建的转移质粒pREasd12是正确的（见图7）。

（4）asd基因缺失株的构建

以χ7213/pREasd12为供体菌，猪霍乱沙门氏菌C500为受体菌进行接合转移。供体菌和受体菌分别在LB培养基中培养过夜，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS，NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄.12H₂O 2.9g，KH₂PO₄0.2g，加蒸馏水至1000mL，经121°C高压蒸汽灭菌30min)洗两遍，调整菌浓度至OD595为0.8，各取100μL菌悬液混合。将无菌硝酸纤维滤膜贴于含二氨基庚二酸(diaminopimelic acid,DAP，购自美国Sigma公司)的固体LB平板上，将混合菌液滴于滤膜上，37°C培养12h，同时做供体和受体对照。洗下滤膜上菌液，用无菌PBS洗两遍，涂布含氯霉素(Cm，终浓度30μg/ml)的固体LB平板，37°C培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5%蔗糖的LB平板，筛选Cm抗性接合子，提取基因组，用引物pa5/pa6扩增鉴定。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB液体培养基中培养12h，连续10倍稀释，涂布含5%蔗糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5%蔗糖的固体平板，筛选Cm敏感菌落。提取基因组，再次用引物pa5/pa6扩增鉴定，鉴定结果见图8。C500的asd基因缺失株由于缺失asd基因而失去合成DAP的能力，所以不能在无外源DAP的培养基上生长。结果表明，所构建的asd基因缺失株asd^-C500是正确的。

2.沙门氏菌电转化感受态细胞的制备

(1)将减毒猪霍乱沙门氏菌C500 asd缺失株，即：猪霍乱沙门氏菌Δasd C500，Salmonella choleraesuis ΔasdC500于2012年9月13日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2012346，在DAP/TSA平板上划线，37℃，恒温倒置培养，挑取单菌落，37℃，200r/min，培养过夜；

(2)将过夜培养的菌液按体积比为1:100接种于50mL DAP/TSB液体培养基中，37℃，200r/min，培养至细菌分光光度值OD600为0.3～0.4，一般需2.5～3h；

(3)4℃，6000r/min，离心15min，收集菌体，用预冷的ddH₂O洗涤菌体；

(4)用ddH2O重复洗涤3次，体积分别为15mL,10mL,5mL，每次洗涤后，均需4℃，6000r/min，离心15min；

(5)离心后，弃上清，用预冷的20mL 10%的甘油洗涤菌体；

(6)分别用15mL，10mL和5mL 10%的甘油，洗涤3次，且最后一次，于4℃，7500r/min，离心15min收集细胞沉淀；

(7)细胞沉淀用500μL预冷的10%的甘油重悬，等量分装(100μL)，立即用于电转化或于-80℃保存备用。

（2）沙门氏菌的电转化

(1)将5μL小提质粒加至100μL电转化感受态细胞中，混匀，冰上静置30min；

(2)设置电转仪(Bio-Rad GenePulserⅡ)的参数：电压2.2Kv，电容25uF，脉冲电阻200Ω和时间4ms；

(3)将预冷的感受态细胞和质粒混合物加入到0.2cm的电转杯中，注意不要有气泡产生，将电转杯外面电极上的水擦拭干净后进行电击；

(4)电击过后，向电转杯中加入1mLTSB液体培养基（购自美国BD公司），轻轻吹打混匀，然后转移到无菌1.5mL离心管内，37℃,200r/min，复苏lh；

(5)将复苏过后的产物，5000r/min，离心5min，弃掉1mL上清，剩余上清重悬沉淀，均匀涂布于DAP阴性的TSA固体平板，37℃倒置，培养18～20h。

实施例4制备实施例4（表达GP5m蛋白的重组菌株C501（pYA-GP5m）的生物学特性）

1．猪霍乱沙门氏菌株C501-GP5m的表达特性分析

将猪霍乱沙门氏重组菌株C501-GP5m经SDS-PAGE后，Western-blotting分析表明，猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m在上清可检测到29kD的特异性反应条带，与预期大小相符。结果表明本发明的猪霍乱沙门氏菌株C501-GP5m的表达产物能够与猪源抗PRRSV血清发生特异性反应，成功地分泌表达了外源目的抗原(图9)。SDS-PAGE及Western-blotting的具体操作方法如下：

（1）SDS-PAGE

1)样品制备：将培养一定时间的菌液，4℃，12000r/min，离心1min收集菌体，沉淀用40μL灭菌去离子水重悬菌体，再加入10μL的5×SDS-PAGE loading Buffer(含β-琉基乙醇)，充分混匀后，煮沸10min，然后迅速置于冰上，5min后，12000r/min，离心3min；

2)聚丙烯酞胺凝胶的制备:

12%SDS-PAGE分离胶的制备：各成分见表8。

表8 12%聚丙烯酞胺凝胶的成分

加入后迅速吹打混匀，沿玻璃板灌制凝胶(约加入7mL)，注意不要有气泡产生，上层加约1.5mL去离子水，室温凝胶30min；

5%SDS-PAGE浓缩胶的制备：各成分见表9

表9 5%聚丙烯酞胺凝胶的成分

将上述各成分轻轻吹打混匀，弃去分离胶上面的去离子水，滤纸吸干，灌入凝胶，迅速插入制胶梳子，室温聚胶30min；

3)上样：按BIO-RAD使用说明组装垂直电泳槽，向电泳槽内注入电极缓冲液，每孔加20μL处理样品上清，同时设空白对照孔和蛋白Marker孔；

4)电泳：先以80V恒压进行电泳，待样品进入到分离胶层后，调整电压至120V继续进行电泳，直到溴酚蓝从底部跑出时停止电泳；

5)染色：加入考马斯亮蓝R250染色液至淹没过凝胶，置于水平摇床上室温染色4-5h；

6)脱色：将凝胶浸泡于脱色液中，置于水平摇床上脱色，其间要不断地更换脱色液，直至背景清晰为止。

（2）Western blotting

1)SDS-PAGE电泳结束后，取出凝胶，不染色；

2)电转：戴上一次性手套，切六张3mm的滤纸和1张硝酸纤维素膜(NC)，滤纸和硝酸纤维素膜的大小要与聚丙烯酰胺凝胶的相同。将滤纸和NC膜放于电转缓冲液（39mmol/L甘氨酸(2.9g)，48mmol/LTris-base(5.8g)，0.037%SDS(0.37g)，20%甲醇(200mL)，溶于800mL ddH₂O，用ddH₂O定容至1L）中浸泡5min。安装电转装置：平放底部电极(－)，然后依次按3张滤纸、聚丙烯酞胺凝胶、NC膜和另外3张滤纸的顺序，平铺在底部电极(－)，每一层都需精确对齐，并用玻璃棒赶出气泡；盖上阳极板，接通电源，电流大小按凝胶面积0.65mA-1.0mA/cm2，电转1.5-2h；

3)封闭：转膜结束后，断开电源，将NC膜放于TBST（10mmol/LTris-base 1.21g，150mmol/LNaCl 8.8g，溶于800mL ddH₂O中，用盐酸调至pH8.0后定容至1L，加入终浓度为0.05%(V/V)的Tween-20），室温平缓摇动1-2h，然后用TBST洗涤3次，5min/次；

4)一抗孵育：将NC膜放入经TBST稀释的一抗（猪源抗PRRSV血清）中(血清按体积比1:50～1:100稀释)，室温反应1.5h，然后将NC膜用TBST洗3次，5～10min/次；

5)二抗孵育：将NC膜放入用TBST稀释过的二抗（辣根过氧化物酶标记羊抗猪IgG抗体购自BIOTECH公司）中(一般按体积比为1:2500～1:5000稀释)，室温温育0.5-1h，然后将NC膜用TBST洗4-6遍，每次5-10min，再用TBS洗2次，以彻底除去Tween-20，每次5min；

6)显色：将NC膜放入10mL底物液（购自Ameresco公司）中避光显色5min，然后采集图片。

2．猪霍乱沙门氏菌C501-GP5m的表型鉴定试验

分别将本发明的猪霍乱沙门菌C501-GP5m、猪霍乱沙门氏亲本株C500（购自中国兽医药监察所）划线接种于TSA平板（购自美国BD公司），然后分别转接阿拉伯糖、半乳糖醇、甘露糖、麦芽糖、木糖、尿素、葡萄糖、乳糖、鼠李糖、蔗糖和硫化氢的生化鉴定管（购自杭州微生物试剂有限公司），进行生化反应。观察这些菌株能否利用这些碳源和硫化氢，从而判断本发明获得的猪霍乱沙门菌C501-GP5m的表型是否变化。结果表明猪霍乱沙门菌C501-GP5m的生化特性与亲本菌株C500相一致：都能够利用甘露糖、麦芽糖、葡萄糖、鼠李糖为碳源，不能利用阿拉伯糖、乳糖、蔗糖、尿素以及硫化氢，符合猪霍乱沙门氏菌的典型表型特征。

实施例5制备实施例5（利用猪霍乱沙门菌C501-GP5m制备二价基因工程疫苗）

将猪霍乱沙门菌C501-GP5m在TSA（购自美国BD公司）固体培养基上进行培养，挑取单菌落于TSB（购自美国BD公司）液体培养基中培养，直到活菌浓度达到2.5×10¹⁰CFU/mL。该菌液可直接用作疫苗使用，因为C500菌株具有佐剂的作用，这也是该沙门氏菌作为载体的优点之一。

实施例6应用实施例1（免疫小鼠特异性针对PRRSV的中和抗体）

将猪霍乱沙门菌C501-GP5m培养物按常规方法进行活菌计数。选30只小鼠（无特定病原体(specific-pathogen free,SPF)6周龄雌性BALB/c小鼠（以下简称小鼠）购自湖北省疾病预防控制中心）随机分为3组，每组10只，分别为猪霍乱沙门菌C501-GP5m组，C501(pYA)组，PBS（NaCl 8g，KCl 0.4g，Na₂HPO₄·12H₂O5.8g，KH₂PO40.4g，溶于800mL ddH₂O，用HCl或者NaOH调至pH值7.2，用ddH₂O定容至1L）组。免疫途径均采用肌肉注射的方式，免疫剂量均为1×10⁸CFU/只。2周后加强免疫一次，每2周尾部采一次血检测中和抗体；一免后4周每组小鼠随机挑选5只颈椎脱臼处死，无菌取脾细胞，进行淋巴细胞增殖试验(MTT)和细胞因子IFN-γ的检测；一免后8周处死剩余全部小鼠，进行淋巴细胞增殖试验(MTT)和细胞因子IFN-γ的检测。结果显示，猪霍乱沙门菌C501-GP5m免疫小鼠在首免后4周时均未产生特异性抗PRRSV的中和抗体。在首免后6周开始产生特异性中和抗体(≥1:4)，并于第8周达到最高，其平均中和抗体水平达到了1:13.33(见图10)。亲本菌株C501(pYA)和PBS阴性对照组在整个实验过程中均未出现特异性针对PRRSV的中和抗体。检测中和抗体的具体实验方法如下：

(1)免疫小鼠血清的灭活：将待检免疫小鼠的血清于56℃灭活30min，2倍倍比稀释后(1:2～1:256)加入96孔细胞培养板中，每孔添加量为50μL；

(2)待检血清与病毒的孵育：加入等体积的病毒液PRRSVWUH3(200TCID₅₀（细胞半数感染量）/100μL)与待检血清混合，于37℃孵育1h；

(3)接种细胞：将混合液接种已长满单层Marc-145细胞（猴肾细胞）的96孔培养板中，每个稀释度4孔，同时设细胞对照和病毒对照孔，37℃、5%CO2培养4～5d，逐日观察CPE（Cytopathogenic effect，细胞致病作用）情况；

(4)结果的判定：当病毒对照孔均出现CPE，以抑制50%CPE的最高血清稀释度作为NA滴度。

实施例7使用实施例2（免疫小鼠特异性针对PRRSV的淋巴细胞增殖反应）

为了探讨构建的重组菌株在机体内诱发特异性针对PRRSV的细胞免疫水平，申请人检测了免疫后小鼠的特异性淋巴细胞增殖。从图11中可以看出，利用经紫外线照射灭活的PRRSV作为刺激原，在首免后1个月本发明制备的猪霍乱沙门菌C501-GP5m免疫组诱发的增殖反应要高于对照组，但未达显著水平。首免后2个月各组的淋巴细胞增殖指数差异不显著(P＞0.05,t-test)。结果显示，在首免后2周本发明制备的猪霍乱沙门菌C501-GP5m一次免疫组和本发明制备的猪霍乱沙门菌C501-GP5m加强免疫组未检测到PRRSV特异性的中和抗体(≤1:2)，但在首免后4周这两组均检测到了PRRSV特异性的中和抗体(≥1:4)，其中本发明制备的猪霍乱沙门菌C501-GP5m一次免疫组平均中和抗体滴度达到了1:12.6，C501-GP5m加强免疫组平均中和抗体滴度达到了1:7.4。而首免之前各组和阴性对照组在整个试验过程中均未检测到特异性PRRSV中和抗体的产生。

淋巴细胞增殖实验的具体步骤如下：

(1)脾细胞的分离：无菌分离免疫小鼠脾脏并研磨，利用0.85%的Tris-NH₄Cl(pH7.4)裂解其中的红细胞，用PBS（pH7.4)洗涤2次后用含10%新生牛血清的RPMI-1640完全培养基（购自美国Gibcol公司）调整细胞浓度至(2×10⁶)/mL，分离出的小鼠脾淋巴细胞接种至96孔细胞培养板中，添加量100μL/孔；

(2)刺激物的加入：以经紫外线照射灭活的PRRSV WUH3作为刺激抗原，20μL/孔，各3复孔。而以ConA(ConA终浓度为5μg/mL)为阳性对照孔,同时设立阴性对照，用RPMI-1640完全培养基将每个孔补足到200μL,置37℃、5%CO₂培养箱中培养72h；

(3)MTT的加入：每孔加入化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。一种黄颜色的染料（简称MTT）(5mg/mL)10μL，充分混匀,继续培养4h后终止培养，小心吸去各孔上清，加入30%二甲基亚砜150μL，振荡10min，溶解甲臜，然后测定OD₅₇₀值；

(4)结果的判定：以刺激指数(Stimulation Index,SI)判断淋巴细胞增殖滴度。SI值的计算：实验孔OD₅₇₀均值/对照孔OD₅₇₀均值。

实施例8应用实施例3（荧光定量PCR方法分析免疫小鼠脾淋巴细胞IFN-γ的mRNA水平）

对扩增引物β-actin和引物IFN-γ的荧光定量PCR引物进行了熔解曲线分析(图12和图13)，结果显示两对引物均只出现单一的熔解峰，表明该引物具有良好的特异性，可用于荧光定量PCR反应。

将分离的小鼠脾淋巴细胞接种96孔板，用紫外线照射灭活的PRRSV WUH3株刺激，24h后收集细胞，利用SYBRGreen I实时荧光定量PCR的方法，检测免疫小鼠脾细胞中IFN-γmRNA相对于β-actin mRNA的表达量。由试验结果可以看出，首免后1个月猪霍乱沙门菌C501(pYA-GP5m)免疫组小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平最高，但首免后2个月其水平急剧下降，显著低于其他实验组(P<0.05)(图14)。荧光定量PCR实验方法具体如下：

(1)反应体系的配制，见表10：

表10实时定量PCR反应体系

(2)反应条件：95℃预变性1min；94℃变性15s，60℃退火与延伸1min，共40个循环。由ABI Prism7500实时荧光定量PCR仪检测反应过程中的荧光信号的变化，以β-actin-F和β-actin-R为内参引物，同时设定3个重复。

(3)结果的判定：利用2^-ΔΔCt方法进行结果判定，即样品中靶基因的相对mRNA表达水平用以下公式进行计算：相对mRNA表达=2^-ΔΔCt。其中△Ct值＝靶基因Ct值/β-actin Ct值，△△Ct=实验组△Ct值/对照组△Ct值。

实施例9应用实施例4（猪霍乱沙门菌C501-GP5m对猪的免疫试验）

分别于首免后2周，4周检测免疫仔猪（保育猪由华中农业大学实验猪场提供）的PRRSV特异性中和抗体产生情况。结果如图15显示，在首免后2周猪霍乱沙门菌C501-GP5m一次免疫组和猪霍乱沙门菌C501-GP5m加强免疫组未检测到PRRSV特异性的中和抗体(≤1:2)，但在首免后4周这两组均检测到了PRRSV特异性的中和抗体(≥1:4)，其中猪霍乱沙门菌C501-GP5m一次免疫组平均中和抗体滴度达到了1:12.6，猪霍乱沙门菌C501-GP5m加强免疫组平均中和抗体滴度达到了1:7.4。而首免之前各组和阴性对照组在整个试验过程中均未检测到特异性PRRSV中和抗体的产生。

名词术语解释：

A表位：为非NE，具有免疫优势，为诱骗因子，抑制了B表位产生NA的能力。

B表位：为GP5的NE，不具有免疫优势。

asd：天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶。

C501：原C500菌株重组后的菌株命名为C501菌株。

DAP：二氨基庚二酸

PRRSV：猪繁殖与呼吸综合征病毒，也称猪蓝耳病病毒。

PADRE：通用型辅助T淋巴细胞表位，插入到ORF5基因的诱骗表位和中和表位（NE）间，可以使ORF5基因的NE充分展示给B细胞，从而增强NA产生的水平。

NE：中和表位(neutralizing epitope,NE)，NE主要位于GP5上。

NA：特异性中和抗体(neutralizing antibodies,NA)。

主要参考文献：

1.江云波.猪繁殖与呼吸综合征病毒新型基因工程疫苗研究.[博士学位论文].武汉:华中农业大学，2006.http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?recid=&FileName=2007210097.nh&DbName=CDFD2008&DbCode=CDFD&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlNPdlJaQmc3NUdpb2pvZmUyd1lneFlQNXAvc2JVWGJLdWVBcE5BZ3Q2N2N6OVhXWA==

2.徐引弟等.猪霍乱沙门氏菌C501株△crp△asd缺失株平衡致死载体系统的构建及鉴定.生物工程学报,2006,5(3):366-371.

3.徐引弟.猪霍乱沙门氏菌C500株crp-、asd-缺失株平衡致死系统的构建及应用.[博士学位论文].武汉:华中农业大学，2006.

http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?recid=&FileName=2006190171.nh&DbName=CDFD2007&DbCode=CDFD&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlNPdlJaQmc3NUdpb2pvZmUyd1lneFlQNXAvc2JVWGJLdWVBcE5BZ3Q2N2N6OVhXWA==

4.赵战勤.支气管败血波氏杆菌的重组沙门氏菌基因工程疫苗研究.[博士学位论文].武汉:华中农业大学，2008.

http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?recid=&FileName=2008202986.nh&DbName=CDFD2009&DbCode=CDFD&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlNPdlJaQmc3NUdpb2pvZmUyd1lneFlQNXAvc2JVWGJLdWVBcE5BZ3Q2N2N6OVhXWA==

5.Li B,Xiao S,Wang Y，Xu S,Jiang Y，Chen H,et al.Immunogenicity of the highly pathogenic porcinereproductive and respiratory syndrome virus GP5protein encoded by a synthetic ORF5gene.Vaccine.2009;27(13):1957-63.

Claims

1.一株表达高致病性猪蓝耳病病毒主要免疫原性膜蛋白GP5m的重组猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choloraesuis）C501-GP5m，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2012275。

2.包含权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌的活疫苗。

3.权利要求1所述的重组猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌与高致病性猪蓝耳病病毒二价基因工程疫苗中的应用。