CN101928696B - 一种前列腺癌靶向腺病毒的制备及应用 - Google Patents

Abstract

一种前列腺癌靶向腺病毒的制备及应用，本发明涉及生物技术和基因治疗领域的一种前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能重组腺病毒载体系统的建立，及其在前列腺癌细胞中目的基因的表达、病毒特异性复制及溶瘤功能的验证。该腺病毒可以在前列腺癌细胞中大量复制，进而破坏肿瘤细胞；而不断复制的重组腺病毒，可高效表达PSA-IZ-CD40L和GM-CSF，进而激活机体的特异性抗肿瘤免疫反应。这种免疫反应不但能够有效配合肿瘤局部的溶瘤作用，而且可以通过全身免疫反应杀伤发生转移的前列腺癌细胞。

Description

一种前列腺癌靶向腺病毒的制备及应用

技术领域

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为一种前列腺癌靶向免疫溶瘤双功能腺病毒载体系统的建立及其在前列腺癌治疗中的应用。

背景技术

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一。2005年，前列腺癌高居美国男性癌症发病率的第一位和死亡率的第二位。在我国，随着人口老龄化的进程，前列腺癌发病率也呈逐年上升趋势，严重影响了老年男性的生活质量。手术、激素、放化疗和冷冻等传统治疗方法对于复发、转移及激素抗拒型的患者往往不敏感。因此，探索一种新的、更加有效针对前列腺癌的免疫基因治疗方案，对于前列腺癌的治疗具有重要的理论价值和现实意义。

近年，前列腺癌治疗的研究主要集中于免疫基因治疗和溶瘤病毒治疗。其中，犹以腺病毒介导的治疗方式发展迅速。两种治疗方式能通过不同的机制实现一定的抗肿瘤效应，但也存在着一些不足和缺陷。

(一)免疫基因治疗：

免疫基因治疗，主要通过病毒或非病毒载体携带具有免疫激活功能的目的基因，激活机体抗肿瘤免疫反应，通过免疫系统杀灭肿瘤细胞。目前，常见的免疫基因治疗主要通过载体携带一些免疫共刺激分子或免疫调节分子，激活机体的免疫反应。但是，这种反应是非特异性的，只有机体免疫耐受被打破后，才能激发特异性的免疫反应。因此，其杀伤效应和特异性往往不高。

细胞免疫在肿瘤免疫治疗中占据主要地位，但是肿瘤病人往往形成对肿瘤抗原的免疫耐受。因此，直接以肿瘤抗原作为免疫原，其效果往往不佳。2001年，Xiang等将人癌胚抗原(hCEA)胞外区和CD40L胞外区的融合表达框构建到质粒载体中，以减毒沙门氏菌为载体，口服给药，能通过CD8⁺T细胞依赖的方式抵抗hCEA阳性的鼠结肠癌细胞的生长。2003年，Lixin Zhang等将HPV E7抗原/hMUC-1和CD40L胞外区的融合表达框构建到腺病毒载体中，证明其对E7阳性或hMUC-1阳性的肿瘤细胞具有免疫抵抗作用。以上研究表明，CD40L与肿瘤抗原融合表达后，能通过其靶向作用将肿瘤抗原带到抗原递呈细胞(DC、巨噬细胞等)表面，进而更有效地发挥抗肿瘤免疫效应。

但是，这种治疗方式也存在这一定的缺陷。首先，肿瘤病人的免疫系统往往受到抑制，包括能够促进DC成熟和分化的细胞因子GM-CSF。CD40L只能将肿瘤抗原带到DC表面，而对抗原的处理、加工和递呈，需要GM-CSF等细胞因子的共同作用。其次，无论是复制缺陷型腺病毒载体还是质粒载体，目的基因的表达往往是瞬时的，而目的基因对机体免疫功能的激活作用不仅取决于局部的浓度，而且可能与刺激持续的时间有关。因此，掌握恰当的给药量、给药方式可能会关系到治疗的成败。

(二)溶瘤病毒治疗：

溶瘤腺病毒构建的策略之一是用组织特异性启动子替换天然的病毒启动子来控制病毒复制启动基因的表达，得到转录调控型的溶瘤腺病毒。目前，溶瘤腺病毒也是前列腺癌治疗研究的热点。

2004年，Sang-Jin Lee等制备了PSMAe控制E1A表达的CRAD；2005年，xiong li等制备了用PSES双向控制腺病毒E1A和E4基因表达的CRAD，但是，两种病毒均只在PSMA⁺细胞中有活力。2005年，W-S Cheng等制备了PSA-PSMA-TARP(PPT)嵌合启动子和小鼠H19绝缘子元件控制E1A表达的CRAD，并证实其具有较好的前列腺癌特异性，且是雄激素非依赖的。但是，该启动子中的H19绝缘子序列过长，对于Adeasy系统的穿梭质粒容纳是很大的负担。

同时，腺病毒感染细胞时，需要E1B-55KDa蛋白结合细胞内p53蛋白并使之失活，抑制p53基因依赖的细胞周期阻滞和细胞凋亡，从而使病毒大量繁殖。所以缺失了E1B-55KDa基因的腺病毒将不能在p53功能正常的细胞内有效复制。为保证腺病毒的有效复制，将E1B基因启动子及其调控的E1B-55KDa基因克隆到腺病毒载体中。

近年，随着溶瘤腺病毒的发展，其溶瘤作用不仅仅依靠病毒本身的复制能力，还通过病毒携带一些外源基因，如自杀基因、免疫调节因子基因等，增强对肿瘤细胞的杀伤能力。溶瘤腺病毒虽然在理论上能够在前列腺癌细胞中特异性复制并杀灭所有肿瘤细胞。但是，在启动子启动效率及机体多种因素的影响下，溶瘤腺病毒往往只能杀灭大部分的肿瘤细胞。特别是对于已经转移到其他器官的肿瘤细胞，由于转移灶附近腺病毒的浓度较低，病毒不能感染和杀伤肿瘤细胞。因此，对肿瘤复发和转移的治疗效果往往不佳。

(三)免疫溶瘤双功能腺病毒

胡泽斌等构建了溶瘤腺病毒Ad-CD80-TPE-GM，并证明其能够在端粒酶阳性的细胞中复制，并表达GM-CSF和共刺激分子B7-1(CD80)。动物研究表明，该重组腺病毒能在端粒酶阳性的人喉癌Hep2细胞移植瘤组织内大量复制并有效表达目的基因，具有明显抗肿瘤效应。但是，该溶瘤腺病毒携带的基因为免疫调节基因，其对机体免疫的激活是非特异性，因此，免疫反应的强度也较弱。

综上所述，制备一种能够在前列腺癌细胞中特异性复制，而且能够表达具有特异性免疫激活作用的目的基因的重组腺病毒，为前列腺癌的临床治疗提供一种特异、高效的方法，具有重大的理论和现实意义。

发明内容

本发明的目的是为了构建一种前列腺癌特异性的免疫溶瘤双功能腺病毒，为前列腺癌的治疗提供一种新的策略。

本发明采用Adeasy系统，将“前列腺癌特异性启动子调控E1A的表达框，E1B启动子调控E1B-55KDa及GM-CSF的表达框，及cmv启动子调控PSA-IZ-CD40L的表达框”构建到穿梭质粒。PmeI将其线性化，并于BJ5183菌株中与Adeasy-1同源重组。得到的重组腺病毒质粒，经PacI线性化后，转染HEK293细胞，包装得到重组腺病毒。并在前列腺癌细胞中鉴定其目的基因的表达和溶瘤效应。具体为：

1、前列腺癌特异性嵌合启动子(PSA-PSMA-TARP，PPTp)的构建：

我们参照W-S Cheng等采用的PPT和H19联合启动子的基础上，去处H19绝缘子，并将E1A表达筐置于目的基因表达筐加尾信号下游，使其不受包装信号中增强子的影响。有利于溶瘤腺病毒中插入一些具有免疫激活功能的目的基因，从而发挥溶瘤和免疫的双重功能。

此外，启动子的启动效率和特异性是一对矛盾，综合考虑后，删除了PSAe部分序列，保留全部AREc。该启动子具有较W-S Cheng等采用的联合启动子更强的启动效率，较xiong li等的PSES启动子更好的特异性。

2、pShuttle-cmv-PSA-IZ-CD40L-PPTp-E1A-GM-IRES-E1B55K的构建及鉴定：

本发明重组腺病毒融合蛋白能否发挥功能，关键在于其功能区域的结构是否稳定。我们选用了含有CD40结合位点的TNF结构域(113-261位氨基酸)，并将194位氨基酸由半胱氨酸(Cysteine，C)突变为色氨酸(Tryptophan，W)，防止二硫键形成。此外，“GGGGS+异亮氨酸拉链(isoleucine zipper，IZ)+LL”的连接方式，在保证蛋白结构稳定的同时，增强其抗原性，有助于机体免疫反应的激活。

3、制备重组腺病毒Ad-pShuttle-cmv-PSA-IZ-CD40L-PPTp-E1A-GM-IRES-E1B55K：

该重组腺病毒，同时携带能够靶向免疫激活的融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L和免疫刺激因子基因GM-CSF，有效提高DC递呈抗原的能力；同时，通过其在前列腺癌细胞中不断复制以及感染周围细胞的能力，使得目的基因的表达能够持续，且维持在一定的高度。这对于机体的免疫激活至关重要。

4、对照重组腺病毒的制备；

为了对免疫溶瘤双功能腺病毒的作用机制进行探讨，我们构建了三种对照腺病毒，分别为：(1)Ad-pSh-PPT-E1A：只具有溶瘤功能，而没有携带免疫基因；(2)Ad-pSh-PL-IR-GM：携带两个免疫激活基因PSA-IZ-CD40L和GM-CSF，但没有溶瘤作用；(3)Ad-psh-PL-PPT-E1A：具有溶瘤功能并携带一个免疫激活基因PSA-IZ-CD40L。

5、前列腺癌特异性启动子启动效率及特异性评价：

构建由前列腺癌特异性启动子调控EGFP表达的重组腺病毒，并以cmv启动子调控EGFP表达的重组腺病毒作为对照。将其感染不同的肿瘤细胞和正常细胞后，荧光显微镜和流式细胞检测目的基因EGFP的表达。直观评价前列腺癌特异性启动子的启动效率和特异性。

6、前列腺癌细胞中各种基因的表达；

将重组腺病毒感染前列腺癌细胞后48h，Western-blot和ELISA分别检测PSA-IZ-CD40L和GM-CSF的表达。目的基因的有效表达是免疫功能得意发挥的保障。

7、前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒体外溶瘤效果的评价：

本发明采用MTT法和结晶紫染色法分别检测病毒感染的前列腺癌细胞的存活情况，评价重组腺病毒体外溶瘤作用。

本发明的创新点在于将溶瘤腺病毒与肿瘤基因治疗最新成果的有效结合。其免疫和溶瘤功能能够相互作用，共同促进机体的抗肿瘤效应。肿瘤局部给药后，首先通过肿瘤细胞内的有效复制，杀灭肿瘤细胞；不断复制的病毒能够持续产生大量的目的蛋白：PSA-IZ-CD40L和GM-CSF。局部高浓度免疫分子的刺激，可以激活机体的免疫功能：PSA-IZ-CD40L通过CD40L的靶向作用，将前列腺癌抗原PSA带到DC表面；同时，GM-CSF促进DC的成熟、分化，DC将PSA抗原处理、加工，并递呈给T淋巴细胞。激活的T淋巴细胞能够杀伤残留或发生转移的前列腺癌细胞。

附图说明

附图1TE-PPT-SV-IR-55K的构建示意图：PCR扩增合成前列腺癌启动子PPTp，替换TE-terpt-SV-IR-55K地terpt启动子，得到含有前列腺癌特异性启动子(PPTp)的TE载体TE-PPT-SV-IR-55K，1表示采用PCR方法将三段基因连接成为全长PPTp，2表示NotI和EcoRI分别酶切TE-terpt-SV-IR-55K和PPTp，并进行连接。

附图2穿梭质粒pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A-GM的构建示意图：PCR扩增合成融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L，并将其克隆到pShuttle-cmv载体上，得到pshuttle-cmv-PL，pShuttle-cmv-PL和TE-terpt-SV-IR-55K经MfeI酶切、连接得到pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A-GM。1表示PCR方法将四段基因连接成全长的PL基因，2表示用KpnI和EcoRV分别酶切PSA-IZ-CD40L和pShuttle-cmv，并进行连接；3表示用MfeI分别酶切pshuttle-cmv-PL和TE-PPT-SV-IR-55K，并进行连接；

附图3穿梭质粒pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A-GM的酶切鉴定1为DL2000Marker；2为BglII酶切产物，3为HincII酶切产物，4为KpnI酶切产物，5为λ-HindIII Marker。

附图4Ad-psh-cmv-PL-PPT-E1A-GM构建的结构示意图：1表示pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A-GM经PmeI酶切，并电转BJ5183感受态细胞，与Adeasy-1同源重组，得到Ad-psh-cmv-PL-PPT-E1A-GM；2表示Ad-psh-cmv-PL-PPT-E1A-GM经PacI酶切后，转染HEK293细胞，包装产生重组腺病毒。

附图5PacI酶切鉴定重组腺病毒质粒：1为Ad-psh-cmv-PL；2为Ad-psh-cmv-PL经PacI酶切产物；3为Ad-psh-cmv-PL-PPT-E1A-GM经PacI酶切产物；4为Ad-psh-cmv-PL-PPT-E1A-GM；

附图6重组腺病毒Ad-psh-cmv-PL-PPT-E1A-GM和Ad-psh-cmv-PL的鉴定a，Western-blot(抗CD40L抗体)鉴定目的蛋白的表达1为HEK293细胞蛋白；2为感染Ad-psh-cmv-PL的HEK293细胞；3为感染Ad-psh-cmv-PL-PPT-E1A-GM的HEK293细胞；b，Western-blot(抗PSA抗体)鉴定目的蛋白的表达1为HEK293细胞蛋白；2为感染Ad-psh-cmv-PL的HEK293细胞；3为感染Ad-psh-cmv-PL-PPT-E1A-GM的HEK293细胞；附图7重组腺病毒感染前列腺癌细胞PC3M和DU145后，Western-blot检测融合蛋白表达的结果1、2分别为Ad-psh-cmv-PL感染PC3M和DU145细胞的结果；3、4为分别为Ad-psh-cmv-PL-ppt-E1A-GM感染PC3M和DU145细胞的结果。采用的抗体为PSA的抗体

附图8MTT法测定细胞存活率结果a为重组腺病毒感染DU145后5d检测的结果；b为重组腺病毒感染LNCaP后5d检测的结果；c为重组腺病毒感染PC3M后5d检测的结果。纵坐标为OD570nm检测值，1为未感染病毒的空白对照；2～5分别为5MOI，1MOI，0.5MOI，0.1MOIAd-psh-cmv-PL-ppt-E1A-GM感染的结果；6～8分别为5MOI，1MOI，0.5MOI Ad-psh-cmv-PL感染的结果。

具体实施方式

实施例1含有前列腺癌特异性启动子PPTp的TE载体的构建

其方法是以人基因组DNA为模板，设计引物分别扩增前列腺特异性抗原增强子AREc3区(PSAe)、前列腺膜特异性抗原增强子(PSMAe)和TARPp，然后采用PCR方法将其连接成嵌合启动子PPTp，取代TE-SV-tertp-E1A-GM-IRES-E1B55K(TE-Tertp-SV-IR-55K)中的Tertp，得到目的质粒TE-SV-PPT-E1A-GM-IRES-E1B55K(TE-PPT-SV-IR-55K)。(如附图1所示)

(1)前列腺特异性抗原增强子AREc3区(PSAe)的扩增

设计PSA增强子序列(AF243527：38200-38900)AREc3区引物：外侧引物上游见序列表1，下游见序列表2；内侧引物上游带有NotI酶切位点，见序列表3，下游带有部分PSMAe序列，见序列表4。以人基因组DNA为模板，巢氏PCR扩增。

(2)前列腺膜特异性抗原增强子(PSMAe)的扩增

设计PSMA增强子序列(AF007544：14600-15200)引物：外侧引物上游见序列表5，下游见序列表6；内侧引物上游带有部分PSAe序列，见序列表7，下游带有部分TARPp序列，见序列表8。以人基因组DNA为模板，巢氏PCR扩增。

(3)TARPp的PCR扩增

设计TARPp序列(NG_001336：100000-100500)引物：外侧引物上游见序列表9，下游见序列表10；内侧引物上游带有部分PSMAe序列，见序列表11，下游带有EcoRI酶切位点，见序列表12。以人基因组DNA为模板，巢氏PCR扩增。

(4)前列腺癌特异性嵌合启动子(PSAe-PSMAe-TARPp，PPTp)的合成

将以上得到PSAe、PSMAe、TARPp等三条序列，类似基因合成的方法，在不加引物的条件下先扩增10个循环。然后加入带有NotI的上游引物(序列3)和带有EcoRI的下游引物(序列12)进行PCR扩增。得到的产物序列如序列表序列13。

(5)前列腺癌特异性启动子克隆到TE载体并鉴定

TE-SV-tertp-E1A-GM-IRES-E1B55K(TE-Tertp-SV-IR-55K)质粒(保藏号：P2004-03-05)，含有端粒酶启动子调控腺病毒复制启动基因E1A的序列；同时含有E1B启动子调控GM-CSF和E1B55K的序列，是溶瘤腺病毒制备的一个中间载体。而且该载体调控E1A的启动子序列可以被方便地替换，用于制备不同要求的溶瘤腺病毒。

经酶切、连接，将该TE载体中的Tertp替换成PPTp。具体方法为：NotI.和EcoRI双酶切TE-Tertp-SV-IR-55K，将小片段的Tertp弃去，回收大片段，并与PPTp片段连接得到目的质粒TE-SV-PPT-E1A-GM-IRES-E1B55K(TE-PPT-SV-IR-55K)。经酶切、PCR和测序鉴定正确。

实施例2穿梭质粒pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A-E1Bp-GM-IR-E1B55K的构建

其方法是以人前列腺癌细胞LNCaP的cDNA为模板，扩增前列腺癌特异性抗原(PSA)；以人白血病细胞Juarket的cDNA为模板，扩增CD40L；基因合成的方法合成用于连接PSA和CD40L的接头。将以上三个片段PCR连接，获得PSA和CD40L的融合表达框，然后将其克隆到穿梭质粒pShuttle-cmv，得到pShuttle-cmv-PL。MfeI将pShuttle-cmv-PL和TE-PPT-SV-IR-55K酶切、连接，得到目的质粒pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A-E1Bp-GM-IR-E1B55K。(如附图2所示)

(1)前列腺癌特异性抗原(PSA)的PCR扩增

设计PSA序列(NM_001648.2，GI：22208990)引物：上游引物带有KpnI酶切位点，如序列表序列14，下游引物序列不包含终止子，如序列表序列15。

以人前列腺癌细胞LNCaP(保藏号：C9-4-34)的cDNA为模板，PCR扩增。为避免翻译时融合蛋白的提前终止，将PSA的终止子去除。

(2)CD40L的PCR扩增

由于CD40L的112Aa-113Aa之间存在一切点，在生理条件下能被切成可溶性的CD40L，为防止融合蛋白被切断，我们设计的CD40L是从113Aa开始的TNF结构域。此外，为防止二硫键的形成，需要将192位的C突变为W。我们将采用PCR方法进行定点突变，扩增产物将分为N端、C端两个片段。

设计CD40L序列(NM_000074.2)的引物：外侧上游引物见序列表16，外侧下游引物见序列表17；为引入定点突变，将CD40L分为N端和C端分别进行扩增，N端内侧引物上游见序列表18，下游见序列表19；C端内侧引物上游见序列表20，下游带有EcoRV酶切位点，见序列表21。以人白血病细胞Juarket(保藏号：C6-5-32)的cDNA为模板，巢氏PCR+定点突变的方法扩增目的基因。

(3)PSA与CD40L融合蛋白接头的合成(GGGGS+IZ+LL)

参考文献报道，我们在PSA和CD40L之间设计了异亮氨酸拉链(IZ)，以保持CD40L三聚体的形成和PSA结构的维持，同时，在PSA与IZ之间添加了GGGGS，在CD40L与IZ之间添加了LL。

我们采用基因合成的方法得到接头序列：我们设计了六条引物，如序列表序列22～序列27，将引物序列混合后，先PCR扩增15个循环，后加入两头的引物进行常规PCR扩增，得到目的产物。

(4)、融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L的PCR扩增

将以上得到的四个片段序列：PSA、linker，CD40L N端和CD40L C端，割胶纯化后混合，按照基因合成的方法，先PCR扩增15个循环，然后加入带有KpnI酶切位点的上游引物(序列14)和带有EcoRV酶切位点的下游引物(序列21)进行常规PCR扩增。所得产物条带与预期相一致，其序列如序列表序列28所示。

(5)、将PSA-IZ-CD40L克隆到穿梭质粒pShuttle-cmv上

穿梭质粒pShuttle-cmv载体(购自stratagene)和PSA-IZ-CD40L片段分别进行KpnI和EcoRI双酶切，然后进行连接，Kana⁺筛选获得目的质粒pShuttle-CMV-PL。

(6)pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A-E1Bp-GM-IR-E1B55K的构建

将中间载体TE-PPT-SV-IR-55K和pShuttle-cmv-PL进行MfeI酶切，连接，Kana⁺筛选得到目的质粒pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A-E1Bp-GM-IR-E1B55K(pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A-GM)，其序列如序列表序列29所示。分别进行BglII、HincII和KpnI酶切鉴定正确(如附图3所示)。

实施例3重组腺病毒Ad-pSh-cmv-PL-PPT-E1A-E1Bp-GM-IR-E1B55K的制备

其方法是PmeI酶切穿梭质粒pshuttle-cmv-PL-PPT-E1A和pShuttle-cmv-PL，电转BJ5183感受态细胞，与Adeasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒Ad-pSh-cmv-PL-PPT-E1A-E1Bp-GM-IR-E1B55K(Ad-pSh-PL-PPT-E1A-GM)和Ad-pSh-cmv-PL。PacI酶切重组腺病毒质粒，并将其转染HEK293细胞制备病毒。鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定。(如附图4所示)

(1)重组腺病毒质粒的产生：

将穿梭质粒pshuttle-cmv-PL-PPT-E1A和pShuttle-cmv-PL进行PmeI酶切，并去磷酸化，以“200Ω，2.5KV，25μ F”的条件电击转化BJ5183-Adeasy-1感受态细胞(购自Stratagene公司)，同源重组，Kana⁺筛选得到腺病毒质粒Ad-pSh-PL-PPT-E1A-GM和Ad-pSh-cmv-PL。PacI酶切鉴定正确，结果如附图5所示。

(2)重组腺病毒的制备：

鉴定正确的重组腺病毒质粒Ad-pSh-PL-PPT-E1A-GM和Ad-pSh-cmv-PL，经PacI酶切和酚氯仿抽提纯化，转染包装细胞HEK293(保藏号：C12-7-14)，8天噬斑形成，11d细胞完全病变。收集细胞及上清，反复冻溶3次后收集上清。制备得到的重组腺病毒能够表达PSA-IZ-CD40L和GM-CSF(其中PSA-IZ-CD40L蛋白序列如序列表序列30所示)。

(3)重组腺病毒的鉴定：

病毒上清感染HEK293细胞，48～72h出现细胞病变。收集细胞上清，ELISA检测GM-CSF的表达(如表1所示)，表明构建的病毒能够表达GM-CSF；收集细胞，提取病毒基因组DNA和蛋白，PCR及Western-Blot检测目的蛋白PSA-IZ-CD40L的表达，表明构建的病毒能够产生目的蛋白(如附图6所示)。以上结果，表明我们成功制备了免疫溶瘤双功能腺病毒。

表 1ELISA检测病毒感染的293细胞GM-CSF表达结果

(4)、重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定：

重组腺病毒感染HEK293细胞后进行病毒扩增，收集病变细胞。氯化铯密度梯度法纯化后于-80℃保存在含10％甘油的Hank’s液中备用。用紫外分光光度计法(波长260nm)和有限稀释法分别测定重组腺病毒Ad-pSh-PL-PPT-E1A-GM和Ad-pSh-cmv-PL的颗粒滴度(viralparticle units per milliliter，vp/ml)，纯度(OD260nm/280nm)和感染滴度(infection units per milliliter，IU/ml)，这些指标均符合实验需要，结果见表2。

表2 重组腺病毒Ad-pSh-PL-PPT-E1A-GM和Ad-pSh-cmv-PL滴度测定结果

实施例4对照重组腺病毒的构建

得到的腺病毒Ad-pSh-PL-PPT-E1A-GM含有：cmv启动子调控的免疫靶向基因PSA-IZ-CD40L；前列腺癌特异性启动子调控的腺病毒复制启动基因E1A；E1B启动子调控的免疫调节基因GM-CSF和E1B55K。本发明的腺病毒具有溶瘤和免疫激活的双重功能，为准确进行功能评价和机制探讨，我们需要构建一些对照病毒：

(1)Ad-psh-PL-PPT-E1A的构建

本发明中含有两个重要的免疫基因：PSA-IZ-CD40L和GM-CSF。其中，融合蛋白PSA-IZ-CD40L具有靶向免疫激活功能；而GM-CSF具有促进免疫细胞成熟、分化等功能。为准确评价两者的功能和相互作用机制，需要构建GM-CSF缺失的对照病毒。首先需要构建穿梭质粒pshuttle-cmv-PL-PPT-E1A-E1Bp-E1B55K(pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A)：MfeI酶切pShuttle-cmv-PL和TE-PPT-SV-55K后连接，Kana⁺筛选得到目的质粒pShuttle-cmv-PL-PPT-E1A，经酶切鉴定正确。PmeI线性化，转染BJ5183感受态细胞，同源重组获得Ad-psh-PL-PPT-E1A。PacI线性化，并转染HEK293细胞，获得重组腺病毒

TE-PPT-SV-55K构建的具体操作为：TE-SV-PPT-IR-55K进行SpeI和NsiI双酶切，切除GM-CSF，IRES和部分的E1B55K序列，获得7224bp的片段；PCR扩增被切除部分的E1B55K序列(E1B55Kplus)。E1B55Kp1us.上游引物带有SpeI酶切位点，如序列表序列31所示；下游引物带有NsiI酶切位点，如序列表序列32所示。将以上片段酶切后与载体相连得到目的质粒TE-SV-PPT-55K，酶切、PCR及测序鉴定正确。

(2)Ad-pSh-PL-IR-GM的构建

为体现本发明溶瘤性和免疫治疗的有效结合，需要设计非溶瘤腺病毒用于评价免疫治疗效果。融合蛋白基因PSA-IZ-CD40L和免疫调节基因GM-CSF以IRES连接的方式克隆到穿梭质粒pShuttle-cmv，cmv启动子能够调控融合蛋白和GM-CSF的共同表达。具体操作为

以TE-Tertp-SV-IR-55K为模板，扩增GM-CSF，并将其克隆到pShuttle-CMV上，Kana⁺筛选得到pShuttle-cmv-GM。

以pShuttle-cmv-PL为模板，扩增PSA-IZ-CD40L，并进行KpnI和EcoRI双酶切；EcoRI和NotI双酶切PUDK-HBV-IR-GM(保藏号：P2007-05-01)得到IRES。

KpnI和NotI双酶切pShuttle-cmv-GM，与PSA-IZ-CD40L和IRES连接，Kana⁺筛选得到目的质粒pShuttle-cmv-PL-IR-GM。酶切、PCR及测序鉴定正确。PmeI线性化，转染BJ5183感受态细胞，同源重组获得Ad-psh-PL-IR-GM。PacI线性化，并转染HEK293细胞，获得重组腺病毒。

GM-CSF上游引物带有HindIII酶切位点，见序列表序列33，下游引物带有EcoRV酶切位点，见序列表序列34。PSA-IZ-CD40L上游引物带有KpnI酶切位点，见序列表序列35，下游引物带有EcoRI酶切位点，见序列表序列36。

(3)Ad-pSh-PPT-E1A的构建

溶瘤特性是本发明的一个重要方面，为更好评价溶瘤效果，需要构建单独溶瘤的重组腺病毒，观察其效果。具体构建方法为穿梭质粒空载体pshuttle-cmv和TE-PPT-SV-55K分别进行MfeI酶切、连接，Kana⁺筛选得到目的质粒pShuttle-cmv-PPT-E1A-E1Bp-E1B55K(pshuttle-cmv-PPT-E1A)。酶切及PCR鉴定正确。PmeI线性化，转染BJ5183感受态细胞，同源重组获得Ad-pSh-PPT-E1A。PacI线性化，并转染HEK293细胞，获得重组腺病毒。

实施例5 前列腺癌特异性启动子PPTp启动效率及特异性评价

其方法是构建并制备PPT启动子调控EGFP表达的重组腺病毒，同时构建cmv启动子调控EGFP表达的对照腺病毒。将其以不同的MOI感染前列腺癌细胞系和其他细胞系，荧光显微镜和流式细胞术观察EGFP表达效率，评价启动子的启动效率和前列腺癌特异性。

(1)重组腺病毒Ad-pSh-PPT-EGFP和Ad-pSh-cmv-EGFP的构建及制备

以TE-SV-PPT-IR-55K为模板，PCR扩增目的基因PPTp；同时，以pLEGFP-C1为模板，扩增目的基因EGFP。PPTp启动子经KpnI和XhoI双酶切，EGFP经XhoI和HindIII双酶切，依次克隆到穿梭质粒pShuttle(购.自Stratagene公司)上，得到pShuttle-PPT-EGFP；将EGFP克隆到pShuttle-cmv上得到pShuttle-cmv-EGFP。经酶切、PCR和测序鉴定正确。

PPTp上游引物带有KpnI酶切位点，见序列表序列37，下游引物带有XhoI酶切位点，见序列表序列38。EGFP上游引物带有XhoI酶切位点，见序列表序列39，下游引物带有HindIII酶切位点，见序列表序列40。

质粒经PmeI线性化，电转BJ5183-Adeasy感受态细胞，同源重组，Kana⁺筛选得到Ad-pSh-PPT-EGFP和Ad-pSh-cmv-EGFP，PacI酶切鉴定正确。PacI线性化后转染HEK293细胞制备病毒，鉴定正确后，进行扩增、纯化和滴度测定。

(2)荧光显微镜和流式细胞测定EGFP在各细胞系中的表达效率：

将前列腺癌细胞系DU145(保藏号：C9-4-33)、PC3M(保藏号：C9-4-32)，乳腺癌细胞系MCF-7(保藏号：C9-3-31)，肺癌细胞系A549(保藏号：C9-3-32)，喉癌细胞系LO2(保藏号：C9-3-33)，肝癌细胞系7721(保藏号：C9-3-34)，正常肌肉细胞系C2C12(保藏号：C9-1-31)，血管内皮细胞系ECV304(保藏号：C9-1-32)分别以6×10⁵细胞/孔接种6孔板，第2天(约为1×10⁶细胞)分别以100MOI、50MOI、25MOI、5MOI、1MOI和0MOI重组腺病毒Ad-pSh-PPT-EGFP和Ad-pSh-cmv-EGFP感染细胞，感染后4h换液。于感染后48h，72h和96h荧光显微镜观察及流式检测EGFP的表达(如表3、4、5所示)。

以100MOI组为例，PC3M细胞感染后48h，对照组EGFP的表达效率90.86％，而实验组的表达效率为28.79％；72h对照组为97.15％，而实验组为49.01％。DU145细胞感染后48h，对照组EGFP的表达效率64.52％，而实验组的表达效率为47.76％；72h对照组为95.95％，而实验组为56.73％。而在7721细胞及其他细胞中，实验组EGFP的表达效率均低于10％。表明PPTp启动子具有前列腺癌特异性，且其启动效率较高。

表3 不同MOI重组腺病毒感染PC3M细胞后，EGFP表达检测结果

表4 不同MOI重组腺病毒感染DU145细胞后，EGFP表达检测结果

表5 100 MOI重组腺病毒感染7721和HepG2细胞后72h，EGFP表达检测结果

实施例6Ad-psh-cmv-PL-ppt-E1A-GM在前列腺癌细胞中蛋白的表达

其方法是将重组腺病毒Ad-psh-cmv-PL-ppt-E1A-GM和Ad-psh-cmv-PL以50MOI感染前列腺癌细胞PC3M和DU145，感染后4h换液。于感染后48h收集细胞上清，ELISA法测定细胞GM-CSF含量；同时，收集细胞，提取细胞蛋白，Western-blot测定PSA-IZ-CD40L的表达。

GM-CSF的检测结果如表6所示，在前列腺癌细胞系PC3M和DU145细胞中，Ad-psh-cmv-PL-ppt-E1A-GM能有效表达GM-CSF；而对照病毒Ad-psh-cmv-PL虽然也有GM-CSF的分泌，但含量很低。

融合蛋白PSA-IZ-CD40L的Western-blot检测结果如附图7所示，结果表明，病毒感染PC3M细胞和DU145蛋白均有融合蛋白的表达。

表6 重组腺病毒感染前列腺癌细胞后GM-CSF分泌表达的检测

实施例7 前列腺癌特异性免疫溶瘤双功能腺病毒体外溶瘤效果评价

其方法是以溶瘤腺病毒Ad-pSh-cmv-PL-ppt-E1A-GM感染各种前列腺癌细胞系和非前列腺癌细胞系，形态学观察细胞病变；MTT法检测细胞存活；RT-PCR检测复制相关基因E1A的表达。

(1)形态学观察前列腺癌细胞病变情况：

将PC3M细胞和DU145细胞分别以6×10⁵细胞/孔接种6孔板。第二天将腺病毒分别以100MOI、50MOI和10MOI感染细胞，感染后24h、48h、72h和96h分别观察细胞形态的改变。结果表明，100MOI感染后72h，部分细胞开始变圆，出现病变的迹象；感染后96h，细胞出现明显病变，而对照组则没有出现。收集细胞，以便进行E1A表达的检测。

(2)MTT法检测病毒感染细胞的存活情况：

将PC3M细胞、DU145细胞分别以1×10⁴细胞/孔接种96孔板、接种后第二天分别以0.1MOI、0.5MOI、1MOI和5MOI感染细胞，感染后5d分别采用MTT法检测细胞存活状况。结果结果如表7，图8所示。

表7 MTT法检测5MOI病毒感染6d后各细胞存活情况

(3)RT-PCR检测E1A表达

为了检测腺病毒复制启动基因E1A的表达情况，设计以下引物。提取(1)收集得到的细胞RNA，然后进行PCR检测，重组腺病毒感染前列腺癌细胞后，能够表达腺病毒复制启动基因E1A。

综上所述，我们成功构建了具有免疫和溶瘤双重功能的重组腺病毒，并证实免疫基因能够得到有效表达，其对前列腺癌细胞具有较强的溶瘤作用。

首先，通过构建PPTp调控EGFP表达的重组腺病毒，我们对该启动子的启动效率和特异性进行了评价，结果表明该启动子能够在前列腺癌细胞中有效启动报告基因的表达，且其表达效率较高；但在已经检测的多种非前列腺癌细胞中没有明显的表达。其次，分别通过Western-blot和ELISA检测了PSA-IZ-CD40L蛋白和GM-CSF的表达，结果表明，构建的重组腺病毒能够在293细胞和前列腺癌细胞中有效表达目的基因。再次，采用大体观察和MTT法分别对病毒的溶瘤效果进行了检测，结果表明，该病毒对前列腺癌细胞具有较强的杀伤作用；但对非前列腺癌细胞的杀伤作用不明显。

重组腺病毒对前列腺癌细胞的溶瘤作用是通过腺病毒不断复制实现的，在腺病毒不断复制的过程中，免疫基因能够得到有效表达，使得局部的免疫蛋白浓度增高，激活全身抗肿瘤免疫反应，进而杀灭肿瘤局部和已经发生转移的肿瘤细胞。因此，预计该重组腺病毒不但对原发前列腺癌细胞具有杀伤作用，对于复发或已发生转移的前列腺癌患者也具有良好效果。

序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所

<120>一种前列腺癌靶向免疫溶瘤双功能腺病毒的制备及其应用

<130>

<160>40

<170>PatentIn version3.2

<210>1

<211>25

<212>DNA

<213>

<400>1

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>

<400>2

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>

<400>3

<210>4

<211>38

<212>DNA

<213>

<400>4

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>

<400>5

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>

<400>6

<210>7

<211>43

<212>DNA

<213>

<400>7

<210>8

<211>40

<212>DNA

<213>

<400>8

<210>9

<211>25

<212>DNA

<213>

<400>9

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>

<400>10

<210>11

<211>39

<212>DNA

<213>

<400>11

<210>12

<211>37

<212>DNA

<213>

<400>12

<210>13

<211>720

<212>DNA

<213>

<400>13

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>14

<210>15

<211>22

<212>DNA

<213>

<400>15

<210>16

<211>25

<212>DNA

<213>

<400>16

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>

<400>17

<210>18

<211>31

<212>DNA

<213>

<400>18

<210>19

<211>31

<212>DNA

<213>

<400>19

<210>20

<211>31

<212>DNA

<213>

<400>20

<210>21

<211>31

<212>DNA

<213>

<400>21

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>22

<210>23

<211>50

<212>DNA

<213>

<400>23

<210>24

<211>50

<212>DNA

<213>

<400>24

<210>25

<211>50

<212>DNA

<213>

<400>25

<210>26

<211>50

<212>DNA

<213>

<400>26

<210>27

<211>41

<212>DNA

<213>

<400>27

<210>28

<211>1445

<212>DNA

<213>

<400>28

<210>29

<211>13599

<212>DNA

<213>

<400>29

<210>30

<211>450

<212>protein

<213>

<400>30

<210>31

<211>29

<212>DNA

<213>

<400>31

<210>32

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>32

<210>33

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>33

<210>34

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>34

<210>35

<211>30

<212>DNA

<213>

<400>35

<210>36

<211>31

<212>DNA

<213>

<400>36

<210>37

<211>36

<212>DNA

<213>

<400>37

<210>38

<211>37

<212>DNA

<213>

<400>38

<210>39

<211>28

<212>DNA

<213>

<400>39

<210>40

<211>28

<212>DNA

<213>

<400>40

Claims (2)

1.一种用于前列腺癌治疗的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒通过如下方法制备：

将携带目的基因的穿梭质粒和腺病毒骨架质粒AdEaSy-1在细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒；PacI酶切线性化后转染到293细胞制备得到重组腺病毒；并且

所述穿梭质粒的序列如序列表中的序列29所示。

2.权利要求1所述的重组腺病毒在制备治疗前列腺癌的药物中的应用。

Images