BRPI0707733A2 - antÍgenos de gripe, composiÇÕes de vacina, e mÉtodos relacionados - Google Patents

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Abstract

ANTÍGENOS DE GRIPE, COMPOSIÇÕES DE VACINA, E MÉTODOS RELACIONADOS. A presente invenção refere-se à intersecção dos campos de munologia e produção de proteína, e, particularmente, a antígenos e vacinas úteis na prevenção de infecção por vírus de gripe. São providos antígenos de proteína recombinantes, composições e métodos para a produção e uso de tais antígenos e composições de vacina.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTÍGENOSDE GRIPE, COMPOSIÇÕES DE VACINA, E MÉTODOS RELACIONADOS".
Pedidos de Patente Relacionados
O presente pedido de patente é relacionado a e reivindica priori-dade sob 35 USC 119(e) a U.S.S.N. 60/773.378, depositado em 13 de feve-reiro de 2006 (o pedido de patente '378'), e a U.S.S.N. 60/813.955, deposi-tado em 15 de junho de 2006 (o pedido de patente '955'); os conteúdos to-tais dos pedidos '378' e '955' sendo incorporados aqui por referência.
Antecedentes da Invenção
A gripe tem uma longa história caracterizada por ondas de do-enças pandêmicas, doenças epidêmicas, ressurgências e deflagrações. Agripe é uma doença altamente contagiosa que pode estar devastando igual-mente ambos os países em desenvolvimento e desenvolvidos. O vírus dagripe apresenta uma das maiores ameaças à população humana. Apesardos esforços da vacinação anual, as infecções de vírus resultam em morbi-dez e mortalidade substanciais. Embora doenças epidêmicas de gripe ocor-ram quase todo ano, felizmente as doenças pandêmicas não ocorrem muitofreqüentemente. Contudo, cepas recentes de gripe têm aparecido, visto quese está novamente diante do potencial de uma doença pandêmica de gripe.O vírus de gripe aviária do tipo H5N1, atualmente causando uma doençapandêmica em aves domésticas na Ásia, bem como regiões do leste da Eu-ropa, tem persistentemente se difundido por todo o globo. A difusão rápidode infecção, bem como transmissão de espécies cruzadas de pássaros paraindivíduos humanos, aumenta o potencial de deflagrações em populaçõeshumanas e o risco de uma doença pandêmica. O vírus é altamente patogê-nico, resultando em uma taxa de mortalidade de mais de cinqüenta por centoem pássaros, bem como poucos casos humanos que foram identificados. Seo vírus fosse alcançar transmissão de humano a humano, ele não teria opotencial para resultar em doença rápida, muito difundida, e mortalidade.
A maior defesa contra a gripe é a vacinação. Os vírus da gripesão vírus de RNA de filamento negativo, segmentados, pertencentes à famí-lia Orthomyxoviridae. Os antígenos virais são imunogenes altamente efica-zes, capazes de induzir ambas as respostas sistêmicas e de anticorpo mu-cosal. A glicoproteína hemaglutinina de vírus da gripe (HA) é geralmenteconsiderada o antígeno viral mais importante com relação ao estímulo deneutralização de anticorpos e desenho de vacina. A presença de neuramini-dase viral (NA) foi mostrada ser importante para geração de respostas imu-nes protetoras de braço múltiplo contra o vírus. Antivirais que inibem ativida-de de neuraminidase têm sido desenvolvidos, e podem ser um tratamentoantiviral adicional sob infecção. Um terceiro componente considerado útil nodesenvolvimento de antivirais e vacinas de gripe é proteína de canal de íonM2.
Subtipos do vírus da gripe são designados por HA e NA diferen-tes, resultantes da alteração antigênica. Além disso, novas cepas do mesmosubtipo resultam de alteração de antígeno, ou mutações nas moléculas deHA ou NA que geram epitopos novos e diferentes. Embora 15 subtipos anti-gênicos de HA tenham sido documentados, somente três destes tipos H1,H2 e H3 circularam extensivamente em seres humanos. A vacinação tornou-se suprema na questão de qualidade de vida aperfeiçoada em nações am-bas industrializadas e subdesenvolvidas. A maioria de vacinas disponíveisainda segue os princípios básicos de aspectos que imitam infecção de modoa induzir uma resposta imune que pode proteger contra a infecção relevante.Contudo, a geração de vírus atenuados de vários subtipos e combinaçõespode consumir tempo e ser custosa. Novas tecnologias emergentes emcompreensão profunda de uma biologia molecular de patogenia, patogêne-se, e suas interações com um sistema imune individual, têm resultado emnovas aproximações para desenvolvimento de vacina e distribuição de vaci-na. Desse modo, enquanto os avanços tecnológicos têm aperfeiçoado a ca-pacidade de produzir composições de vacina de antígenos de gripe aperfei-çoadas, permanece uma necessidade de proporcionar fontes adicionais devacinas e novos antígenos para produção de vacinas para tratar subtipos ecepas emergentes. O desenho e desenvolvimento aperfeiçoados de vacinapara subtipos de vírus da gripe, bem como métodos de produção e uso detais composições de matéria, são necessários, que proporcionam fontespouco custosas e altamente acessíveis de tais composições terapêuticas.
Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a antígenos de gripe e compo-nente de vacina produzido em plantas. A presente invenção proporciona umou mais antígenos de gripe como uma fusão com uma proteína termoestá-vel. A invenção proporciona adicionalmente composições de vacina conten-do antígenos de gripe. Além disso, a invenção proporciona vacinas de gripecompreendendo pelo menos dois antígenos de gripe diferentes. Em algumasconcretizações, as composições da invenção incluem um ou mais compo-nentes de planta. Ainda adicionalmente providos são métodos para produ-ção e uso do antígeno e composições de vacina da invenção.
Breve Descrição dos Desenhos
figura 1. Esquemático de proteína hemaglutinina (HA) e domí-nios de proteína. Os números 1, 2 e 3 na esquerda superior correspondemaos domínios 1, 2 e 3 aqui descritos. Os domínios 1, 2, e 2, 1 se dobram jun-tos para formar um domínio de haste (SD). O domínio 3 é um domínio globu-lar (GD). As faixas apresentadas nos itens 1-6 correspondem às posições deaminoácido de HA.
figura 2. Mapa do plasmídeo pET32. A esquerda superior indicaa região entre o promotor T7 e o terminador T7 necessitando de plasmídeomodificado usado para clonagem de antígeno-alvo.
figura 3\ Esquemático dos contruto de pET-PR-LicKM-KDEL epET-PR-LicKM-VAC inseridos em um vetor pET32a modificado.
figura 4: Esquemático da organização de vetor pBM 21.
figura 5: Organização esquemática da derivação do plasmídeopBID4 de um vetor pBI após excisão do gene GUS e a adição de um plas-mídeo derivado de TMV.
figura 6: Esquemático da fusão de HA, domínios de HA, e NAem seqüência de lichenase, com ou sem seqüências-alvo que foram postasem um vetor.
figuras 7A,B: Ensaios de lichenase de extratos de plantas queexpressam LicKM e proteínas de fusão. (7A) Expressão transiente de Iiche-nase em Nicotiana benthamiana. (7B) Zimograma de proteínas de fusão deHA de Iichenase em plantas (seta).
figura 8. Análise de Western de extratos de plantas que expres-sam proteínas de fusão Lic-HA usando anticorpos anti-HA e anti-LicB.
figura 9. Ensaios de Iiehenase de extratos de plantas expres-sando proteínas de fusão Lic-NA.
figura 10. Análise de Western de extratos de plantas que ex-pressam proteínas de fusão Lic-HA.
figura 11. Ensaio de hemaglutinação de célula vermelha de san-gue com proteínas de fusão de Iiehenase de HA expressas em planta.
figura 12. Resposta de anticorpo de camundongos imunizadoscom a vacina de gripe H5N1 teste, com e sem adjuvante.
figura 13. Inibição de atividade de hemaglutinação por diluiçõesde soro obtidas de camundongos imunizados com vacina teste H5N1, com esem adjuvante.
figuras 14A-D. Sintomas em seguida a provocação de vírusH3N2 em vacina teste de gripe H3N2 e grupos de tratamento de controle.(14A) Resultados máximos médios totais de contagens de sintoma clínico.(14B) Resultados máximos médios totais de contagens de célula em lava-gens nasais após provocação de vírus. (14C) Resultados máximos médiostotais de perda de peso em animais. (14D) Máxima média total de mudançade temperatura em animais.
figura 15. Liberação de vírus em seguida a provocação de vírusH3N2 em vacina teste de gripe H3N2 e grupos de tratamento de controle. Ogrupo 1 representa os resultados do grupo de tratamento de controle negati-vo; O grupo 2 representa os resultados de animais tratados com artigo Teste1 (CMB F1); O grupo 3 representa os resultados de animais tratados com oartigo teste 2 (CMB F2); O grupo 4 representa os resultados de animais tra-tados com artigo Teste 3 (CMB F3); e o grupo D representa os resultados deanimais tratados de controle positivo. N se refere ao número de animais ava-liados em cada grupo (8 em cada grupo).figura 16. Caracterização de antígenos de vírus A/Wyoming3/03de gripe produzidos em plantas. (16A) Análise de ELISA de LicKM-(SD) eLicKM-(GD) usando soro de ovelha elevado contra HA purificada de vírusA/Wyoming/3/03. Vírus homólogo (A/W/3/03) e NA produzidos por plantaforam usados como controles positivo e negativo, respectivamente. (16B)Análise de imunomanchamento de LicKM-HA (SD) (rota 3) e LicKM-HA (GD)(rota 3) usando soro de coelho elevado contra MicKM (anti-LicKM) e soro deovelha elevado contra HA purificada de vírus A/Wyoming/3/03 de gripe (anti-HA). MicKM (rota 2) e vírus homólogo (rota 1) foram usados como controles.(16C) Análise de ELISA de NA usando soro de ovelha elevado contra vírusreagrupados NIBRG-18 (anti-H7N2) e vírus reagrupados NIBRG-17 (anti-H7N1). Vírus homólogo (A/W/3/03) avaliados usando soro de ovelha paraNIBRG-18 (anti-H7N2) foi usado como um controle positivo. (16D) Inibiçãoespecífica de cepa de atividade de neuraminidase em seguida a pré-incubação com soro de ovelha contra NIBRG-18 (anti-H7N2) ou NIBRG-17(anti-H7N1). A atividade enzimática média de três réplicas é mostrada comdesvios padrão.
figura 17. Titulações de inibição de hemaglutinação de soro defurões imunizados com VCI mais adjuvantes, VC2 sem adjuvante, ou VC2mais adjuvante. As amostras de soro foram coletadas antes da primeira do-se (Pré-imm), 14 dias após a primeira dose (D1), 14 dias após a segundadose (D2), 10 dias após a terceira dose (D3), e 4 dias pós-provocação (Pós-Ch). Titulações médias geométricas com desvios padrão são mostradas.
figura 18. Monitoramento de pós-provocação de furões imuniza-dos com VC1 mais adjuvante, VC2 sem adjuvante, ou VC2 mais adjuvante.Valores médios com desvios padrão são mostrados, e análise estatística dedados foi conduzida usando ANOVA com a correção de Bonferroni para tes-te múltiplo. A significância estatística foi definida como ρ < 0,05. (18A) Picode pós-infecção de abrigo de vírus. (18B) Perda de peso máxima pós-infecção. (18C) Temperatura de pico que ocorre pós-infecção. (18D) Pico declassificações de sintoma pós-infecção. (18E) Peco de contagens de leucóci-to total por ml de amostras de lavagem nasal pós-infecção.Descrição Detalhada da Invenção
A invenção se refere a antígenos de gripe úteis na preparaçãode vacinas contra infecção de gripe, e proteínas de fusão compreendendotais antígenos de gripe operavelmente ligados à proteína termoestável. Ainvenção se refere a métodos de produção de antígenos providos, incluindo,mas não limitados a, produção em sistemas de planta. Adicionalmente, ainvenção se refere a vetores, proteínas de fusão, células de planta, plantas ecomposições de vacina compreendendo os antígenos e proteínas de fusãoda invenção. Ainda adicionalmente providos são métodos de indução deresposta imune contra infecção de gripe em um indivíduo compreendendoadministrar composições de vacina da invenção a um indivíduo.
Antígenos de gripe
Proteínas de antígeno de gripe da presente invenção incluemqualquer proteína imunogênica ou peptídeo capaz de induzir uma respostaimune contra vírus da gripe. Geralmente, proteínas imunogênicas de interes-se incluem antígenos de gripe (por exemplo, proteína de gripe, proteínas defusão, etc.), porções imunogênicas destas, ou variantes imunogênicas des-tas, e combinações de quaisquer das precedentes.
Antígenos de gripe para uso de acordo com a presente invençãopodem incluir proteínas de gripe de comprimento total, ou fragmentos deproteínas de gripe, e/ou proteínas de fusão compreendendo proteínas degripe de comprimento total, ou fragmentos de proteínas de gripe. Ondefragmentos de proteínas de gripe são utilizados, se sozinhos ou em proteí-nas de fusão, tais fragmentos retêm atividade imunológica (por exemplo,reatividade cruzada com anticorpos antigripe). Baseado em sua capacidadede induzir resposta imunoprotetora contra infecção viral, hemaglutinina eneuraminidase são antígenos primários de interesse na geração de vacinas.Antígenos adicionais, tal como canal de íon de membrana M2, podem serúteis na produção de vacinas (por exemplo, combinação de vacinas) de mo-do a aperfeiçoar a eficiência de imunoproteção.
Desse modo, a invenção proporciona células de planta e plantasque expressam uma proteína heteróloga (por exemplo, proteína de gripe, ouum fragmento desta, uma proteína de fusão compreendendo uma proteínade gripe, ou fragmento desta). Uma proteína heteróloga da invenção podecompreender qualquer antígeno de gripe de interesse, incluindo, mas nãolimitado a, hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), canal de íon de mem-brana M2 (M2), uma porção de hemaglutinina (HA), uma porção de neura-minidase (NA), e uma porção de canal de íon de membrana (M2), ou proteí-nas de fusão, fragmentos, ou combinações de hemaglutinina (HA), neurami-nidase (NA), canal de íon de membrana M2 (M2), ou porção de hamaglutinin(HA), uma porção de neuraminidase (NA), e/ou uma porção de canal de íonde membrana (M2).
Seqüências de aminoácido de uma variedade de proteínas degripe de HA, NA e M2 diferentes (por exemplo, de subtipos diferentes, oucepas ou isolados) são conhecidos na técnica, e são disponíveis em basesde dados públicas, tal como o Banco de Gene (GenBank). Seqüências deproteína de comprimento total exemplares para HA e NA de dois subtipos degripe de interesse particular hoje, bem como seqüência para M2, são provi-das abaixo:
V: Vietnam H5N1
HA (HAV) SEQ ID NO.: 1AKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSLALALMVAGLSLWMCSNGSLQCRICINA(NAV) SEQ ID NO.: 2:
/WA/PA/0K//T/GS/C/WWG/1/SLMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNL
LTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHL
ECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESV
AWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQES
ECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEEC
SCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPN
DGTGSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPN
GWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRG
RPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
W: Wvomina H3N2HA (HAW) SEQ ID NO.: 3:
MKTIIALSYILCLVFSQKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTN
ATELVQSSSTGGICDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVE
RSKAYSNCYPVWPDWSLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSAC
KRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDS
DQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIVKPGDILL
INSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNV
NRITYGACPfíVl/raA/7L/<M7GMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVD
GWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEF
SEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERT
KKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQI
KGVELKSGYKDWILWISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
NA (NAW) SEQ ID NO.: 4:
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
Proteína de gripe Hong Kong SEQ ID N0.:5:
LTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP
Proteínas de gripe
Hemaqlutinina
Em certas concretizações, a hemaglutinina de comprimento total(HA) é utilizada em composições de vacina da invenção. Em algumas con-cretizações, um ou mais domínios de HA são usados. Em certas concretiza-ções, dois ou três ou mais domínios são utilizados, como um ou mais poli-peptídeos separados ou ligados juntos em um ou mais polipeptídeos de fu-são. Certas concretizações exemplares proporcionam antígeno de gripecompreendendo domínio 1-2 e domínio 2-1 (referidos como HA1_2) ou do-mínio 3 de HA, de comprimento total.
HA Vietnam [H5N1]:
Peptídeo de sinal H5N1 HA SEQ ID NO: 6: AKAGVQSVKMEKI-VLLFAIVSLVKS
Domínio 1-2 de H5N1 HA SEQ ID NO.: 7: DQJCIGYHANNS-TEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKL
Domínio 3 de H5N1 HA SEQ ID NO.: 33:
CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC
Domínio 2-1 de H5N1 HA SEQ ID NO.: 8:NTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI
Domínio de transmembrana de H5N1 HA SEQ ID NO.: 9:LSIYSTVASSLALAMVAGLSLWMCSNGSLQCRICIHA AANyoming (H3N2)
Peptídeo de sinal de H3N2 SEQ ID NO.: 10: MKTIIALSYIL-
CLVFS
Domínio 1-2 de H3N2 HA SEQ ID NO.: 11:
QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVINATELVQ
SSSTGGI
Domínio 3 de H3N2 HA SEQ ID NO.: 12:CDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNC YPYD\ZPDW\SLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDSDQISLY AQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKC
Domínio 2-1 de H3N2 HA SEQ ID NO.: 13:
NSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPflm<QA/TLKM7GMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL
Domínio de transmembrana de H3N2 HA SEQ ID NO.: 14:
WISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICIEm certas concretizações, antígeno de neuraminidase de com-primento total (NA) é utilizado em antígenos de vacina da invenção. Em al-gumas concretizações, um domínio de NA é usado. Em certas concretiza-ções, dois ou três ou mais domínios são providos em antígenos da invenção.Certas concretizações exemplares proporcionam antígeno de gripe compre-endendo NA de comprimento total, carecendo de seqüência de peptídeo deâncora.
Neuraminidase
NA Vietnam
Peptídeo de âncora H5N1 NA SEQ ID NO.: 15: MNPNQTIITIG-SICMVTGIVSΗ5Ν1 NASEQ ID NO.: 16:LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
Peptídeo de âncora de H3N2 NA SEQ ID NO.: 17:MNPNKQIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHF
H3N2 NA SEQ ID NO.: 18:KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
Conquanto seqüências de antígenos de gripe exemplares sejamprovidas aqui, e domínios representados para cada um de HA e NA e M2foram providos para cepas exemplares, será apreciado que qualquer se-qüência tendo características imunogênicas de um domínio de HA e/ou NAe/ou M2 podem alternativa ser empregada. Um versado na técnica seráprontamente capaz de gerar seqüências tendo pelo menos 75%, 80%, 85%ou 90% ou mais de identidade para antígenos providos. Em certas concreti-zações, os antígenos de gripe compreendem proteínas incluindo aquelastendo pelo menos 95%, 96%, 97%, 98% ou mais identidades para um domí-nio de HA e/ou NA e/ou M2, ou uma porção de um domínio de HA e/ou NAe/ou M2, no qual no qual a proteína de antígeno retém atividade imunogêni-ca. Por exemplo, seqüências tendo identidade suficiente para antígeno(s) degripe que retém características imunogênicas são capazes de se ligaremcom anticorpos que reagem com antígeno(s) de domínio provido(s) nasmesmas. As características imunogênicas freqüentemente incluem três a-presentações dimensionais de aminoácidos ou grupos laterais relevantes.Um versado na técnica pode identificar prontamente seqüências de identida-de com diferenças modestas na seqüência (por exemplo, com diferença noslimites e/ou algumas alternativas de seqüências que, não obstante, preser-vam as características imunogênicas). Por exemplo, seqüências cujos limitessão pertos de (por exemplo, dentro de cerca de 15 aminoácidos, 14 aminoá-cidos, 13 aminoácidos, 12 aminoácidos, 11 aminoácidos, 10 aminoácidos, 9aminoácidos, 8 aminoácidos, 7 aminoácidos, 6 aminoácidos, 4 aminoácidos,3 aminoácidos, 2 aminoácidos, ou 1 aminoácido) dos limites de domínio de-signados aqui em qualquer extremidade da seqüência de aminoácido desig-nada podem ser consideradas por compreenderem o domínio relevante deacordo com a presente invenção. Desse modo, a invenção contempla o usode uma seqüência de antígeno de gripe para compreender resíduos que seaproximam da designação de domínio. Por exemplo, domínio(s) de HAfoi(foram) projetado(s) e expresso(s) como uma proteína de fusão de estru-tura interna como um antígeno da invenção (vide Exemplificação aqui). Adi-cionalmente, será apreciado que quaisquer domínios, domínios parciais, ouregiões de seqüências de aminoácido de antígeno de gripe (por exemplo,HA, NA, M2) que são imunogênicos podem ser gerados usando-se aosconstructo e métodos aqui providos. Ainda adicionalmente, domínios ousubdomínios podem ser combinados, separada e/ou consecutivamente paraprodução de antígenos de gripe.
Como antígenos exemplares, usou-se seqüências de hemagluti-nina, neuraminidase e M2 de subtipos particulares conforme descrito emdetalhe aqui. Vários subtipos de vírus de gripe existem e continuam a seremidentificados à medida que novos subtipos aparecem. Será compreendidopor um versado na técnica que os métodos e composições aqui proporcio-nados podem ser adaptados para utilizar seqüências de subtipos adicionais.Tal variação é contemplada e envolvida dentro dos métodos e composiçõesaqui providos.
Fusões de Polipeptídeo de Gripe com Proteínas TermoestáveisEm certos aspectos da invenção, são providos antígeno(s) de
gripe compreendendo polipeptídeos de fusão que compreendem uma prote-ína de gripe (ou um fragmento ou variante desta) operavelmente ligada auma proteína termoestável. Os polipeptídeos de fusão da invenção podemser produzidos em qualquer sistema de expressão disponível conhecido na técnica. Em certas concretizações, as proteínas de fusão da invenção sãoproduzidas em uma planta ou porção desta (por exemplo, planta, célula deplanta, raiz, broto, etc).
Enzimas ou outras proteínas que não são encontradas natural-mente em células de humanos ou animais são particularmente apropriadaspara uso em polipeptídeos de fusão da presente invenção. As proteínas ter-moestáveis que, quando fundidas, conferem termoestabilidade a um produtode fusão, são úteis. A termoestabilidade permite que a proteína produzidamantenha conformação, e mantenha proteína produzida à temperatura am-biente. Esta característica facilita recuperação fácil, de tempo eficiente e cus-to eficaz de um polipeptídeo de fusão. Uma família representativa de enzi-mas termoestáveis úteis de acordo com a invenção é a família de glucanohi-drolase. Estas enzimas clivam especialmente ligações 1,4-β glucosídicasque são adjacentes às ligações 1,3-β em polissacarídeos ligado misturados(Hahn et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:10417). Tais enzimas sãoencontradas em cereais, tais como aveia e cevada, e são também encontra-das em um número de fungos e espécies bacteriais, incluindo C. thermocel-Ium (Goldenkova et al., 2002, Mol. Biol., 36:698). Desse modo, proteínastermoestáveis exemplares para uso em polipeptídeos de fusão da presenteinvenção incluem enzimas glicosidase. Proteínas glicosidase termoestáveisexemplares incluem aquelas representadas pelos números de acesso noBanco de Gene (GeneBank) selecionados a partir daqueles colocados naTabela A, os conteúdos de cada um dos quais são incorporados aqui porreferência pela incorporação total da informação de acesso no Banco deGene (GenBank) para cada número referenciado. Enzimas termoestáveisexemplares de uso em proteínas de fusão da invenção incluem Clostridiumthermocellum P29716, Brevibacillus brevis P37073, e Rhodthermus marinusP45798, cada uma das quais sendo incorporadas aqui por referência emseus números de acesso no banco de Genes (GenBank). As proteínas defusão representativas ilustradas nos Exemplos utilizam enzima termoestávelmodificada isolada de Clostridium thermocellus; contudo, qualquer proteínatermoestável pode ser similarmente utilizada de acordo com a presente invenção.
Tabela A: Proteínas glicosidase termoestáveis
<table>table see original document page 15</column></row><table><table>table see original document page 16</column></row><table>
Quando se designam proteínas de fusão e polipeptídeos de a-cordo com a invenção, é desejável, naturalmente, preservar a imunogenici-dade do antígeno. Ainda adicionalmente, é desejável em certos aspectos dainvenção proporcionar constructo que proporcionam termoestabilidade deuma proteína de fusão. Esta característica facilita a recuperação fácil, detempo eficiente e de custo eficaz do antígeno-alvo. Em certos aspectos, mo-delos de fusão de antígeno podem ser selecionados, que proporcionam van-tagens adicionais, incluindo aumento de imunogenicidade potencial para in-corporar determinantes de vacina múltiplos, ainda carente antes da exposi-ção imunogênica a vacinação dos indivíduos. Qualidades benéficas adicio-nais de peptídeos de fusão de interesse incluem proteínas que proporcionamfacilidade de manipulação para incorporação de um ou mais antígenos, bemcomo proteínas que têm potencial para conferir facilidade de produção, puri-ficação e/ou formulação de preparações de vacina. Um versado na técnicaapreciará que apresentação tridimensional pode afetar cada uma destas ca-racterísticas benéficas. A preservação de imunidade ou qualidades preferen-ciais, portanto, podem afetar, por exemplo, a escolha de co-participantes defusão, e/ou escolha de localização de fusão (por exemplo, terminal-N, termi-nal-C, combinações destes). Alternativa ou adicionalmente, preferências po-dem afetar o comprimento de segmento selecionado para fusão, se ele forcomprimento de antígeno, ou comprimento de co-participante de fusão sele-cionado.A presente invenção demonstrou fusão bem-sucedida de umavariedade de antígenos com uma proteína termoestável. Por exemplo, tem-se usado a molécula veículo termo-estável LicB1 também referida como Ii-chenase, para produção de proteínas de fusão. LicB é 1,3-1,4-β glucanase(LicB) de Clostridium termocellum (Acesso no Banco de Genes: X63355[gi:40697]). A MicB pertence a uma família de proteínas globulares. Baseadona estrutura tridimensional de LicB, seus terminais NeC estão situados pró-ximos um ao outro na superfície, em proximidade ao domínio ativo. A LicBtambém tem uma estrutura de laço exposta à superfície que está localizadadistante do domínio ativo. Tem-se gerado constructo, tal que a estrutura delaço e os terminais N e C de proteína podem ser usados como locais de in-serção para polipeptídeos de antígeno de gripe. Os polipeptídeos de antíge-no de gripe podem ser expressos como fusões de terminal N ou C1 ou comoinsertos no laço da superfície. Importantemente, a LicB mantém sua ativida-de enzimática em pH baixo e a alta temperatura (até 75°C). Desse modo, ouso de LicB como uma molécula veículo contribui para vantagens, incluindosimilarmente intensificação de imunogenicidade específica de alvo, potencialpara incorporar determinantes de vacina múltiplos, e formulação direta devacinas que podem ser distribuídas nasal, oral ou parenteralmente. Alémdisso, a produção de fusões de LicB em plantas deve reduzir o risco de con-taminação com patogenias animais ou humanas. Vide exemplos providosaqui;
Proteínas de fusão da invenção compreendendo antígeno degripe podem ser produzidas em qualquer de uma variedade de sistemas deexpressão, incluindo ambos sistemas in vitro e in vivo. Um versado na técni-ca apreciará prontamente que otimização de seqüências de ácido nucléicopara um sistema de expressão particular é freqüentemente desejável. Porexemplo, na exemplificação aqui provida, seqüência otimizada para expres-são de antígeno de gripe-fusões de LicB em plantas providas. Vide Exemplo1. Desse modo, um antígeno(s) de gripe que codifica ácido nucléico relevan-te, proteína(s) de fusão, e fragmentos destes, de acordo com a invenção, épretendido para ser envolvido com constructo de ácido nucléico da invenção.Para produção em sistemas de planta, plantas transgênicas ex-pressando antígeno(s) de gripe (por exemplo, proteína(s) de gripe, ou frag-mentos ou fusões destes), podem ser usadas. Alternativa ou adicionalmente,plantas trangênicas podem ser produzidas usando-se métodos bem-conhecidos na técnica para gerar colheitas de produção estáveis. Adicional-mente, plantas utilizando sistemas de expressão transientes podem ser utili-zadas para produção de antígeno(s) de gripe. Quando se utiliza sistemas deexpressão de planta, se expressão transgênica ou transiente em plantas éutilizada, qualquer de expressão nuclear, expressão de cloroplasto, expres-são mitocondrial, ou expressão viral, podem levar vantagem de acordo coma aplicabilidade do sistema para antígeno desejado. Além disso, sistemas deexpressão adicionais para produção de antígenos e proteínas de fusão deacordo com a presente invenção podem ser utilizados. Por exemplo, siste-mas de expressão de mamífero (por exemplo, linhas de célula de mamíferos(por exemplo, CHO, etc)), sistemas de expressão bacteriais (por exemplo, E.coli), sistemas de expressão de inseto (por exemplo, baculovírus), sistemasde expressão de levedura, e sistemas de expressão in vitro (por exemplo,lisatos reticulados) podem ser usados para expressão de antígenos e proteí-nas de fusão da invenção.
Produção de Antígenos da Gripe
De acordo com a presente invenção, antígenos da gripe (inclu-indo proteína(s) de gripe, fragmentos, variantes, e/ou fusões destes) podemser produzidos em qualquer sistema desejável; a produção não é limitada asistemas de planta. Constructo de vetor e sistemas de expressão são bem-conhecidos na técnica, e podem ser adaptados para incorporar uso de antí-genos da gripe aqui providos. Por exemplo, antígenos da gripe (incluindofragmentos, variantes, e/ou fusões) podem ser produzidos em sistemas deexpressão conhecidos, incluindo sistema de célula de mamíferos, animaistransgênicos, sistemas de expressão microbiais, sistemas de célula de inse-to, e sistemas de planta, incluindo sistemas de planta transgênicos e deplanta. Particularmente onde antígenos da gripe são produzidos como prote-ínas de fusão, pode ser desejável produzir tais proteínas de fusão em siste-mas sem planta.
Em algumas concretizações da invenção, os antígenos da gripesão desejavelmente produzidos em sistemas de planta. As plantas são rela-tivamente fáceis de manipular geneticamente, e têm várias vantagens sobrefontes alternativas, tais como fluidos humanos, linhas de célula de animal,microorganismos recombinantes e animais transgênicos. As plantas têmmaquinaria de modificação pós-translacional sofisticada para proteínas queé similar àquela de mamíferos (embora deva ser notado que existem algu-mas diferenças nos modelos de glicosilação entre plantas e mamíferos). Istocapacita à produção de reagentes bioativos em tecidos de planta. Também,as plantas podem ser economicamente produzir quantidades muito grandesde biomassa sem requerer facilidades sofisticadas. Além disso, as plantasnão são submetidas à contaminação com patogenias animais. Similar aoslipossomos e microcápsulas, as células de planta são esperadas proporcio-nar proteção para a passagem de antígeno ao trato gastrointestinal.
As plantas podem ser utilizadas para produção de proteínas he-terólogas, via uso de vários sistemas de produção. Tal sistema inclui uso deplantas transgênicas/geneticamente modificadas onde um gene que codificaproduto alvo é permanentemente incorporado no genoma da planta. Siste-mas transgênicos podem gerar sistemas de produção de colheita. Uma vari-edade de proteínas estranhas, incluindo muitas de origem de mamífero, emuitos antígenos candidatos de vacina, tem sido expressa em plantas trans-gênicas, e mostram ter atividade funcional. (Tacker et ai, 2000, J. Infect.Dis., 182:302; e Thanavala et ai, 2005, Proc. Nati Acad. Sci., USA,102:3378). Adicionalmente, a administração de plantas transgênicas não-processadas que expressam antígeno de superfície maior de hepatite B emvoluntários humanos não-imunizados resulta em produção de resposta imu-ne (Kapusta et ai, 1999, FASEBJ., 13:1796).
Um sistema para expressão de polipeptídeos em plantas utilizavetores virais projetados para expressar seqüências estranhas (por exemplo,expressão transiente). Esta aproximação permite o uso de plantas saudáveisnão-transgênicas como sistemas de produção rápidos. Desse modo, plantasgeneticamente projetadas e plantas infectadas com vírus de planta recombi-nantes que servem como "fábricas verdes" para gerar rapidamente e produ-zir proteínas específicas de interesse. Vírus de planta têm certas vantagensque os tornam atrativos como vetores de expressão para produção de prote-ína estranha. Vários membros de vírus de RNA de planta têm sido bem-caracterizados, e clones de cDNA infecciosos são disponíveis para facilitarmanipulação genética. Uma vez que o material genético viral infeccioso en-tre em uma célula hospedeira susceptível, ele replica a altos níveis e se es-palha rapidamente através de toda a planta. Existem várias aproximaçõespara produção de polipeptídeos alvos usando vetores de expressão viral deplanta, incluindo incorporação de polipeptídeos alvos nos genomas virais.Uma aproximação envolve projeto de proteínas de revestimento de vírus queinfectam bactéria, animais ou plantas, para funcionarem como moléculasveículos para peptídeos antigênicos. Referidas proteínas veículos têm o po-tencial de agregar e formar partículas similares a vírus recombinante querevelam epitopos antigênicos desejados. Esta aproximação permite produ-ção eficiente de tempo de vacinas candidatas, visto que a natureza da partí-cula de uma vacina candidata facilita recuperação fácil e de custo eficaz dotecido de planta. Vantagens adicionais incluem imunogenicidade específicade alvo aumentada, o potencial para incorporar determinantes múltiplos devacina, e facilidade de formulação em vacinas que pode ser distribuída na-sal, oral ou parenteralmente. Como um exemplo, folhas de espinafre conten-do partículas virais de planta recombinantes transportando epitopos de vírusfundidos para proteína de revestimento têm resposta imune gerada apósadministração (Modelska et ai, 1998, Proc. NatL Acad. Sci., USA, 95:2481; eYusibov et ai, 2002, Vaccine, 19/20:3155).
Sistemas de Expressão de Planta
Qualquer planta susceptível a incorporação e/ou manutenção deácido nucléico heterólogo, e capaz de produzir proteína heteróloga, pode serutilizada de acordo com a presente invenção. Em geral, será freqüentementedesejável utilizar plantas que são responsáveis pelo crescimento sob condi-ções definidas, por exemplo, em uma estufa e/ou em sistemas aquosos. Po-de ser desejável selecionar plantas que não são tipicamente consumidaspelos seres humanos ou animais domesticado, e/ou não são tipicamenteparte da cadeia de alimentação humana, de modo que elas podem ser cres-cidas do lado de fora sem interesse que polinucleotídeo expresso possa serindesejavelmente ingerido. Em algumas concretizações, contudo, será dese-jável empregar plantas comestíveis. Será desejável utilizar plantas que acu-mulam polipeptídeos expressos em porções comestíveis de uma planta.
Freqüentemente, certas características de planta desejáveis se-rão determinadas pelo polinucleotídeo particular a ser expresso. Para dar,mas uns poucos exemplos, quando um polinucleotídeo codifica uma proteínaa ser produzida em alto rendimento (conforme será freqüentemente o caso,por exemplo, quando proteínas de antígeno são para serem expressas), se-rá freqüentemente desejável selecionar plantas com biomassa relativamentealta (por exemplo, tabaco, que tem vantagens adicionais que são altamentesusceptíveis a infecção viral, tem um período de crescimento curto, e nãoestá na cadeia de alimentação humana). Onde um polinucleotídeo codificaproteína de antígeno cuja atividade total requer (ou é inibida por) uma modi-ficação pós-translacional particular, a capacidade (ou inabilidade) de certasespécies de planta em efetuar modificação relevante (por exemplo, uma gli-cosilação particular) pode direcionar seleção. Por exemplo, as plantas sãocapazes de efetuar certas modificações pós-translacionais (por exemplo,glicosilação); contudo, as plantas não gerarão modelos de sialação que éencontrado em modificações pós-translacionais de mamífero. Desse modo,a produção de planta de antígeno pode resultar na produção de uma entida-de diferente do que a seqüência de proteína idêntica em sistemas alternativos.
Em certas concretizações da invenção, plantas de colheita, ouplantas relacionadas à colheita, são utilizadas. Em certas concretizaçõesespecíficas, plantas comestíveis são utilizadas.
Plantas para uso de acordo com a presente invenção incluemAngiospermas, Briófitos (por exemplo, Hepaticae, Musci, etc), Pterofitos (porexemplo, samambaias, rabo-de-cavalo, licopódio), Gimnospermas (por e-xemplo, coníferas, cicase, Ginko, Gnetales), e Algas (por exemplo, Clorofí-ceas, Faeofíceas, Rodofíceas, Mixofíceas, Xantofícea, e Euglenofícea).Plantas exemplares são membros da família Leguminosas (Febaceae; porexemplo, ervilha, alfafa, feijão-soja); Gramíneas (Poaceae; por exemplo, mi-lho, trigo, arroz); Solanaceae, particularmente do gênero Lycopersicon (porexemplo, tomate), Solanum (por exemplo, tomate, berinjela), Capsium (porexemplo, pimenta), ou Nicotiana (por exemplo, tabaco); Umbeliiferae, parti-cularmente do gênero Daucus (por exemplo, cenoura), Apium (por exemplo,aipo, ou Rutueeae (por exemplo, laranjas); Compositae, particularmente dogênero Laetuea (por exemplo, alface), Brassicaceae (Cruciferae), particular-mente do gênero Brassiea ou Sinapis). Em certas espécies, as plantas dainvenção podem ser plantas do gênero Brassiea ou Arabidopsis. Algunsmembros da família Brassicaceae exemplares incluem Brassiea eampestris,B earinata, B. juneea, B. napus, B. nigra, B. oieraeae, B. tournifortii, Sinapisaiba, e Rapharnus sativus. Algumas plantas adequadas que são melhoráveisa transformação e são comestíveis como brotos germinados incluem alfafa,munguba, rabanete, trigo, mostarda, espinafre, cenoura, beterraba, cebola,alho, aipo, ruibarbo, uma folha de planta folhosa tal como repolho ou alface,agrião, ervas tais como salsa, trevo, couve-flor, brócolis, feijão-soja, Ienti-lhas, flores comestíveis, tal como girassol, etc.
Introdução de Vetores e Plantas
Em geral, vetores podem ser distribuídos para plantas de acordocom técnicas conhecidas. Por exemplo, os vetores podem ser diretamenteaplicados a plantas (por exemplo, inoculações abrasivas virais, inoculaçõesde pulverização mecanizadas, infiltração a vácuo, bombardeio de partícula,ou eletroporação). Alternativa ou adicionalmente, virions podem ser prepara-dos (por exemplo, de plantas já infectadas), e podem ser aplicados a outrasplantas de acordo com técnicas conhecidas.
Uma ampla variedade de vírus é conhecida que infecta váriasespécies de planta, e pode ser empregada para expressão de polinucleotí-deo de acordo com a presente invenção (vide, por exemplo, em The Classi-fieation and Nomenelature of Viruses, "Sixth Report of the International Com-mittee on Taxonomy of Viruses" (Ed. Murphy et al), Springer Verlag; NewYork, 1995, os conteúdos totais dos quais sendo aqui incorporados por refe-rência; Grierson et al., Plant Molecular Biology, Blackie, London, pp. 126-146, 1984; Gluzman et al., Communictions in Molecular Biology; Viral Vec-tors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 172-189; eMathew, Plant Viruses Online (http://imaqe.fs.uidaho.edu/vide/). Em certasconcretizações da invenção preferivelmente do que distribuição de um vetorviral simples a uma célula de planta, vetores diferentes múltiplos são distri-buídos que, juntos, permitem replicação (e, opcionalmente, movimento decélula a célula e/ou de longa distância) de vetor(es) viral(is). Algumas ou to-das das proteínas podem ser codificadas pelo genoma de plantas transgêni-cas. Em certos aspectos, descritos em maiores detalhes aqui, estes siste-mas incluem um ou mais componentes de vetor viral.
Sistemas de vetores que incluem componentes de dois vírus deplanta heteróloga de modo a alcançar um sistema que infecta prontamenteuma faixa ampla de tipos de planta ainda impõem pouco ou nenhum risco dedifusão de infecção. Um sistema exemplar foi descrito anteriormente (vide,por exemplo, publicação PCT WO 00/25574 e Publicação de Patente dosEstados Unidos 2005/0026291, ambas das quais sendo incorporadas aquipor referência. Conforme notado aqui, em aspectos particulares da presenteinvenção, vetores virais são aplicados a plantas (por exemplo, planta, porçãode planta, broto, etc), por exemplo, através da infiltração ou inoculação me-cânica, pulverização, etc. Onde infecção é para ser acompanhada por apli-cação direta de um genoma viral a uma planta, qualquer técnica disponívelpode ser usada para preparar o genoma. Por exemplo, muitos vírus que sãoutilmente empregados de acordo com a presente invenção têm genomas dessRNA. ssRNA pode ser preparado por transcrição de uma cópia de DNA dogenoma, ou por replicação de uma cópia de RNA, ou in vitro ou in vivo. Dadaà pronta disponibilidade de sistemas de transcrição in vitro de facilidade deuso (por exemplo, SP6, T7, Iisato reticulócito, etc), e também a conveniênciade manutenção de uma cópia de DNA de um vetor de RNA, é esperado queos vetores de ssRNA da invenção freqüentemente serão preparados portranscrição in vitro, particularmente com T7 ou SP6 polimerase.
Em certas concretizações da invenção preferivelmente do queintrodução de um tipo de vetor viral simples em uma planta, vetores viraisdiferentes múltiplos são introduzidos. Tais vetores podem, por exemplo,trans-complementar um outro com relação às funções de tal replicação, mo-vimento de célula a célula, e/ou movimento de longa distância. Os vetorespodem conter polinucleotídeos diferentes que codificam antígeno de gripe dainvenção. A seleção para planta(s) ou porções desta(s) que expressam poli-peptídeos múltiplos que codificam um ou mais antígeno(s) de gripe pode serrealizada conforme descrito acima para polinucleotídeos ou polipeptídeossimples.
Sistemas de Expressão de Tecido de Planta
Conforme discutido acima, de acordo com a presente invenção,antígenos da gripe podem ser produzidos em qualquer sistema desejável.Constructo de vetores e sistemas de expressão são bem-conhecidos na téc-nica, e podem ser adaptados para incorporar uso de antígenos de gripe aquiprovidos. Por exemplo, produção de planta transgênica é conhecida, e gera-ção de constructo e produção de planta podem ser adaptadas de acordocom técnicas conhecidas na técnica. Em algumas concretizações, sistemasde expressão transiente em plantas são desejáveis. Dois destes sistemasincluem produção de raízes clonais e sistemas de planta clonal, e derivadosdestes, bem como produção de sistemas de brotos germinados.
Plantas Clonais
As raízes clonais mantêm vetores de expressão viral de RNA, eproduzem estavelmente proteína-alvo uniformemente na raiz total sobre pe-ríodos estendidos de tempo e subculturas múltiplas. Em contraste às plan-tas, onde o gene-alvo é eliminado via recombinação durante movimento decélula a célula ou de longa distância, em culturas de raiz, a integridade desão similares àqueles observados durante classificação inicial. As raízesclonais permitem facilidade de produção de material de proteína heterólogapara formulação oral de antígeno e composições de vacina. Métodos e rea-gentes para geração de uma variedade de entidades clonais derivadas deplantas que são úteis para a produção de antígeno (por exemplo, proteínasde antígeno da invenção) foram descritos anteriormente, e são conhecidosna técnica (vide, por exemplo, Publicação PCT WO 05/81905, que é incorpo-rada aqui por referência). As entidades clonais incluem linhas de raiz clonal,linhas de célula de raiz clonal, linhas de célula de planta clonal, e plantasclonais capazes de produção de antígeno (por exemplo, proteínas de antí-geno da invenção). A invenção proporciona adicionalmente métodos e rea-gentes para expressão de polinucleotídeo de antígeno e produtos de poli-peptídeo em linhas de célula clonal derivadas de vários tecidos de planta(por exemplo, raízes, folhas), e em plantas totais derivadas de células sim-ples (plantas clonais). Tais métodos são tipicamente baseados no uso devetores de planta viral de vários tipos.
Por exemplo, em um aspecto, a invenção proporciona métodosde obtenção de uma linha de raiz clonal que expressa um polinucleotídeoque codifica antígeno da gripe compreendendo as etapas de: (i) introduçãode um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifica um antí-geno da gripe da invenção em uma planta ou porção desta; e (ii) geração deuma ou mais linhas de raiz clonal a partir de uma planta. As linhas de raizclonal podem ser geradas, por exemplo, pela infecção de uma planta ou por-ção de planta (por exemplo, uma peça colhida de planta) com um Agrobacte-rium (por exemplo, A. Rhizogenes) que causa formação de raízes com pê-los. As linhas de raiz clonal podem ser classificadas em vários modos paraidentificar linhas que mantêm vírus, linhas que expressam um polinucleotí-deos que codificam um antígeno da gripe da invenção em altos níveis, etc. Ainvenção proporciona adicionalmente linhas de raiz clonal, por exemplo, li-nhas de raiz clonal produzidas de acordo com os métodos da invenção, eenvolve adicionalmente métodos de expressão de polinucleotídeos e produ-ção de polipeptídeo(s) que codifica(m) antígeno(s) da gripe da invenção u-sando as linhas de raiz clonal.
A invenção proporciona adicionalmente métodos de geração deuma linha de célula clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica an-tígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de umalinha de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma com-preende um polinucleotídeo que codifica um antígeno da gripe da invenção;(ii) liberação de células individuais a partir da linha de raiz clonal; e (iii) ma-nutenção das células sob condições adequadas para proliferação de célulade raiz. A invenção proporciona linhas de célula de raiz e métodos de ex-pressão de polinucleotídeos e produção de polipeptídeos usando linhas decélula de raiz clonal.
Em um aspecto, a invenção proporciona métodos de geração deuma linha de célula clonal que expressa um polinucleotídeo que codifica an-tígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i) geração de umalinha de raiz clonal, células da qual contêm um vetor viral cujo genoma com-preende um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção; (ii)liberação de células individuais a partir da linha de raiz clonal; e (iii) manu-tenção das células em cultura sob condições apropriadas para proliferaçãode célula de raiz. A invenção proporciona adicionalmente métodos de gera-ção de uma linha de célula de planta clonal que expressa um polinucleotídeoque codifica antígeno da gripe da invenção compreendendo etapas de: (i)introdução de um vetor viral que compreende um polinucleotídeo que codifi-ca antígeno da gripe da invenção em células de uma linha de célula de plan-ta mantida na cultura; e (ii) enriquecimento das células que contêm o vetorviral. O enriquecimento pode ser realizado, por exemplo, por (i) remoção deuma porção das células a partir da cultura; (ii) diluição das células removidasde modo a reduzir a concentração de célula; (iii) permitindo que as célulasdiluídas proliferem; e (iv) classificação das células que contêm o vetor viral.
As linhas de célula de planta clonal podem ser usadas para produção de umantígeno da gripe de acordo com a presente invenção.
A invenção inclui um número de métodos de geração de plantasclonais, células das quais contêm um vetor viral que compreende um polinu-cleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção. Por exemplo, a inven-ção proporciona métodos de geração de uma planta clonal que expressa umpolinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção compreendendoas etapas de: (i) geração de uma linha de raiz clonal, células da qual contêmum vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codifica an-tígeno da gripe da invenção; (ii) liberação de células individuais a partir dalinha de raiz clonal; e (iii) manutenção das células liberadas sob condiçõesapropriadas para formação de uma planta. A invenção proporciona adicio-nalmente métodos de geração de uma planta clonal que expressa um poli-nucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção compreendendo eta-pas de: (i) geração de uma linha célula de planta clonal, células da qual con-têm um vetor viral cujo genoma compreende um polinucleotídeo que codificaantígeno da gripe da invenção; e (ii) manutenção das células sob condiçõesapropriadas para formação de uma planta. Em geral, as plantas clonais deacordo com a invenção podem expressar qualquer polinucleotídeo que codi-fica antígeno da gripe da invenção. Tais plantas clonais podem ser usadaspara produção de um polipeptídeo de antígeno.
Conforme notado acima, a presente invenção proporciona sis-temas para expressão de um polinucleotídeo ou polinucleotídeo(s) que codi-ficam antígeno(s) da gripe da invenção em linhas de raiz clonal, linhas deraiz clonal, linhas de planta clonal (por exemplo, as linhas de célula deriva-das de folha, caule, etc), e em plantas clonais. Um polinucleotídeo de codifi-cação de antígeno da gripe da invenção é introduzido em uma célula deplanta ancestral usando um vetor viral de planta cujo genoma inclui o polinu-cleotídeo de codificação de um antígeno da gripe da invenção operavelmen-te ligado a (isto é, sob controle de) um promotor. Uma linha de célula clonalou linha de célula de planta clonal é estabelecida de uma célula contendo ovírus de acordo com qualquer de várias técnicas adicionalmente descritasabaixo. O vetor de vírus de planta ou porções deste pode ser introduzido emuma célula de planta por infecção, pela inoculação com uma transcrição viralou clone de cDNA infeccioso, por eletroporação, por transferência de genemediada por T-DNA, etc.
As seções que se seguem descrevem métodos para geração delinhas de raiz de clonal, linhas de célula de raiz clonal, linhas de célula deplanta clonal, e plantas clonais que expressam um polinucleotídeo que codi-fica antígeno da gripe da invenção são, em seguida, descritas. Uma "linhade raiz é distinguida de uma "linha de célula de raiz" em que uma linha deraiz produz estruturas atuais similares à raiz ou raízes, enquanto uma linhade célula de raiz consiste em células de raiz que não formam estruturas simi-lares à raiz". O uso do termo "linha" é pretendido para indicar que células dalinha podem proliferar e passar informação genética para as células de pro-genia. As células de uma linha de célula tipicamente proliferam na culturasem ser parte de uma estrutura organizada, tal como aquela encontrada emuma planta intacta. O uso do termo "linha de raiz" é pretendido para indicarque as células na estrutura de raiz podem proliferar sem ser parte de umaplanta completa. É notado que o termo "célula de planta" envolve raízes decélula. Contudo, para distinguir os métodos da invenção para gerar linhas deraiz e linhas de célula de raiz daqueles usados para gerar diretamente linhasde célula de planta de tecido sem raiz (conforme oposto para gerar linhas decélula de planta clonal de linhas de raiz clonal ou plantas clonais derivadasde linhas de raiz clonal), os termos "célula de planta" e "linha de célula deplanta" conforme usados aqui, geralmente se referem a células e linhas decélula que consistem de tecido de planta sem raiz. As células de planta po-dem ser, por exemplo, folha, caule, broto, parte de flor, etc. É notado quesementes podem ser derivadas das plantas clonais geradas como derivadasaqui. Tais sementes também conterão um vetor viral como plantas obtidasde tais sementes. Métodos para obtenção de estoques de semente sãobem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Publicação de Patente dosEstados Unidos 2004/0093643).
Linhas de Raiz Clonal
A presente invenção proporciona sistemas para geração de umalinha de raiz clonal em que um vetor de planta viral é usado para direcionarexpressão de um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da inven-ção. Um ou mais vetores de expressão incluindo um polinucleotídeo que co-difica antígeno da gripe da invenção operavelmente ligado a um promotorsão introduzidos em uma planta ou uma porção desta de acordo com qual-quer de uma variedade de métodos conhecidos. Por exemplo, folhas deplanta podem ser inoculadas com transcrições virais. Os próprios vetorespodem ser diretamente aplicados a plantas (por exemplo, via inoculaçõesabrasivas, inoculações de spray mecanizadas, infiltração a vácuo, bombar-deio de partícula, ou eletroporação). Alternativa ou adicionalmente, virionspodem ser preparados (por exemplo, de plantas já infectadas), e aplicados aoutras plantas de acordo com técnicas conhecidas.
Onde infecção é para ser acompanhada por aplicação direta deum genoma viral a uma planta, qualquer técnica disponível pode ser usadapara preparar o genoma. Por exemplo, muitos vírus que são utilmente em-pregados de acordo com a presente invenção têm genomas de ssRNA. ss-RNA podem ser preparados por transcrição de uma cópia de DNA do geno-ma, ou por replicação de uma cópia de RNA, ou in vivo ou in vitro. Dada apronta disponibilidade de facilidade de uso de sistemas de transcrição in vi-tro (por exemplo, SP6, T7, Iisato reticulócito, etc), e também a conveniênciade manutenção de uma cópia de DNA de um vetor de RNA, é esperado queos vetores de ssRNA da invenção serão freqüentemente preparados portranscrição in vitro, particularmente com T7 ou SP6 polimerase. Clones decDNA infecciosos podem ser usados. Transferência de gene mediada agro-bacterialmente pode ser usada para transferir ácidos nucléicos virais, taiscomo vetores virais (ou genomas virais totais ou porções destes) em célulasde planta usando-se, por exemplo, agro-infiltração, de acordo com métodosconhecidos na técnica.
A planta ou porção de planta pode, em seguida, ser mantida(por exemplo, cultivada ou crescida) sob condições adequadas para replica-ção de uma transcrição viral. Em certas concretizações da invenção, o vírusse espalha além de uma célula inicialmente inoculada, por exemplo, local-mente de célula a célula e/ou sistemicamente de uma folha inicialmente ino-culada em folhas adicionais. Contudo, em algumas concretizações da inven-ção, o vírus não se espalha. Desse modo, um vetor viral pode conter genesque codificam MP e/ou CP funcionais, mas podem estar carecendo de umou ambos de tais genes. Em geral, um vetor viral é introduzido em célulasmúltiplas (infectadas) em uma planta ou porção desta.Em seguida a introdução de um vetor viral na planta, folhas sãocolhidas. Em geral, as folhas podem ser colhidas a qualquer tempo em se-guida a introdução de um vetor viral. Contudo, pode ser desejável manter aplanta por um período de tempo em seguida à introdução de um vetor viralna planta, por exemplo, um período de tempo suficiente para replicação e,opcionalmente, difusão do vírus a partir das células nas quais foi inicialmenteintroduzido. Uma cultura de raiz clonal (ou culturas múltiplas) é preparada,por exemplo, por métodos conhecidos adicionalmente descritos abaixo.
Em geral, qualquer método disponível pode ser usado para pre-parar uma cultura de raiz clonal de uma planta ou tecido de planta em queum vetor viral foi introduzido. Tal método emprega genes que existem emcertos plasmídeos bacteriais. Estes plasmídeos são encontrados em váriasespécies de Agrobacterium que infectam e transferem DNA a uma amplavariedade de organismos. Como um gênero, Agrobacterium pode transferirDNA a um conjunto grande e diverso de tipos de planta, incluindo numero-sas espécies de angiosperma dicot e monocot e gimnosperma (vide Gelvin,2003, Microbiai. Mol. Biol Rev., 67:16, e referências neste, todos dos quaissendo incorporados aqui por referência). A base molecular de transformaçãogenética de células de planta é transferência de uma bactéria e integraçãoem um genoma nuclear de planta de uma região de um grande plasmídeo(Ri) rizogênico ou (Ti) de indução de um tumor que reside dentro de váriasespécies de Agrobacterium. Esta região é referida como a "região T", quan-do presente no plasmídeo, e como "T-DNA" quando excizado a partir doplasmídeo. Geralmente, uma molécula de T-DNA de filamento simples étransferida para uma célula de planta na infecção Agrobacteriai que ocorrenaturalmente, e é, por último, incorporada (na forma de filamento duplo) nogenoma. Sistemas baseados nos plasmídeos Ti são amplamente usadospara introdução de material genético estranho em plantas, e para produçãode plantas transgênicas.
A infecção de plantas com várias espécies de Agrobacterium etransferência do T-DNA tem um número de efeitos. Por exemplo, A. tumefa-ciens causa doença de bile de coroa, enquanto A. rhizogenes causa desen-volvimento de raízes com pelos no local de infecção, uma condição conheci-da como "doença de raiz com pêlo". Cada raiz ocorre de uma célula geneti-camente transformada simples. Desse modo, as células de raiz nas raízessão clonais, e cada raiz representa uma população clonal de células. Raízesproduzidas por infecção de A. rhizogenes são caracterizadas por uma altataxa de crescimento e estabilidade genética (Giri et ai, 2000., Biotech. Adv.,18:1, e referências neste, todas das quais sendo aqui incorporadas por refe-rência). Em adição, tais raízes são capazes de regenerar plantas genetica-mente estáveis (Giri et ai, 2000, supra).
Em geral, a presente invenção envolve o uso de qualquer cepade Agrobacteria (por exemplo, qualquer cepa de A. rhizogené) que é capazde induzir formação de raízes de células de planta. Conforme mencionadoacima, uma porção do plasmídeo Ri (Ri-T-DNA) é responsável por causardoença de raiz com pelo. Enquanto transferência desta porção do plasmídeoR1 para células de planta pode convenientemente ser acompanhada por in-fecção com Agrobacteria que abriga o plasmídeo Ri, a invenção envolve ouso de vários outros métodos de introdução da região relevante em uma cé-lula de planta. Tais métodos incluem qualquer método disponível de introdu-ção de células de planta em material genético incluindo, mas não limitada a,biolísticos, eletroporação, entendimento de DNA mediado por PEG, vetoresbaseados em Ti, etc. Porções relevantes do Ri T-DNA podem ser introduzi-das em células de planta pelo uso de um vetor viral. Os genes de Ri podemser incluídos no mesmo vetor que contém um polinucleotídeo que codificaantígeno da invenção, ou em um vetor viral diferente, que pode ser o mes-mo, ou um tipo diferente daquele vetor que compreende o polinucleotídeoque codifica antígeno da invenção. É notado que o Ri-T-DNA total não podeser requerido para produção de raízes com pêlos, e a invenção envolve ouso de porções do R1-T-DNA, provido que tais porções contêm material ge-nético suficiente para induzir formação de raiz, conforme conhecido na técni-ca. Material genético adicional, por exemplo, genes presentes dentro doplasmídeo Ri, mas não dentro do T-DNA, pode ser transferido para uma cé-lula de planta de acordo com a invenção, particularmente genes onde osprodutos de expressão facilitam integração do T-DNA no DNA de célula deplanta.
De modo a preparar uma linha de raiz clonal de acordo com cer-tas concretizações da invenção, porções de folha colhidas são contactadascom A. rhizogenes sob condições adequadas para infecção e transformação.
Porções de folha são mantidas na cultura para permitir desenvolvimento deraízes com pelos. Cada raiz é clonal, isto é, células na raiz são derivadas deuma célula ancestral simples na qual o Ri T-DNA foi transferido. De acordocom a invenção, uma porção de tais células ancestrais conterá um vetor vi-ral. Desse modo, as células em uma raiz derivada de tais células ancestralconterão um vetor viral, visto que elas serão replicadas e serão transmitidasdurante divisão da célula. Desse modo, uma alta proporção (por exemplo,pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelomenos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos 98%) dascélulas conterão o vetor viral. É notado que desde que um vetor viral é her-dado de células filhas dentro de uma raiz clonal, o movimento de um vetorviral dentro da raiz não é necessário para manter o vetor viral através de to-da a raiz. As raízes com pelos clonais individuais podem ser removidas deuma porção de folha e adicionalmente cultivadas. Tais raízes também sãoreferidas aqui como linhas de raiz. Raízes clonais isoladas continuam acrescer em seguida ao isolamento.
Uma variedade de linhas de raiz clonal diferentes foi gerada u-sando os métodos da invenção. As linhas de raiz foram geradas usando ve-tores virais contendo polinucleotídeos que codificam antígeno da invenção(por exemplo, codificando peptídeo imunogênico). As linhas de raiz foramtestadas por Western blot. As linhas de raiz revelam uma variedade de ní-veis de expressão diferentes de vários polipeptídeos. As linhas de raiz querevelam alta expressão foram selecionadas e adicionalmente cultivadas. Aslinhas de raiz foram subseqüentemente testadas novamente e mostradaspara manter altos níveis de expressão sobre períodos estendidos de tempo,incluindo estabilidade. Níveis de expressão foram comparáveis a ou maioresdo que expressão em plantas intactas infectadas com o mesmo vetor viralusado para gerar linhas de raiz clonal. Em adição, a estabilidade de expres-são das linhas de raiz foi obtida em plantas infectadas com o mesmo vetorviral. Até 80% de tais plantas infectadas com vírus revertidas em tipo selva-gem após 2-3 passagens. (Tais passagens envolvem inoculação de plantascom transcrições, permitindo que a infecção (local ou sistêmica) se torneestabelecida, tomando uma amostra de folha, e inoculando plantas recentesque são subseqüentemente testadas para expressão).
As linhas de raiz podem ser cultivadas em uma grande escalapara produção de antígeno dos polipeptídeos da invenção conforme discuti-do adicionalmente abaixo. É notado que linhas de raiz clonal (e linhas decélula derivadas de linhas de raiz clonal) podem geralmente ser mantidas nomeio que não inclui vários compostos, por exemplo, hormônios de cresci-mento de planta, tais como auxinas, citoquinas, etc, que são tipicamenteempregadas na cultura de raiz e células de planta. Esta característica reduzo dispêndio associado com cultura de tecido, e os inventores esperam quecontribuirá significantemente à praticabilidade econômica de produção deproteína usando plantas.
Qualquer de uma variedade de métodos pode ser usada paraselecionar raízes clonais que expressam um polinucleotídeo que codificaantígeno(s) da gripe da invenção. Western blots, ensaios ELISA, etc, podemser usados para detectar um polipeptídeo codificado. No caso de marcado-res detectáveis, tais como GFP, métodos alternativos, tais como classifica-ções visuais, podem ser realizados. Se um vetor viral compreendendo umpolinucleotídeo que codifica um marcador selecionável é usado, uma sele-ção apropriada pode ser imposta (por exemplo, o material de folha e/ou raí-zes derivadas deste podem ser cultivados na presença de uma condiçãoantibiótica ou nutricional apropriadas e raízes sobreviventes identificadas eisoladas). Certos vetores virais contêm dois ou mais polinucleotídeos quecodificam antígeno da gripe da invenção, por exemplo, dois ou mais polinu-cleotídeos que codificam polipeptídeos diferentes. Se um destes é um mar-cador selecionável ou detectável, as raízes clonais que são selecionadas oudetectadas por seleção ou detecção de expressão do marcador terão umaalta probabilidade de também expressar o segundo polinucleotídeo. A classi-ficação de linhas de raiz que contêm polinucleotídeos particulares pode serrealizada usando PCR e outros métodos de detecção de ácido nucléico.
Alternativa ou adicionalmente, linhas de raiz clonal podem serclassificadas pela presença do vírus pela inoculação de plantas hospedeirasque formarão lesões locais como um resultado de infecção de vírus (por e-xemplo, plantas hospedeiras hipersensíveis). Por exemplo, 5 mg de tecidode raiz pode ser homogeneizado em 50 μΙ de tampão de fosfato, e usadopara inocular uma folha simples de uma planta de tabaco. Se o vírus estápresente em culturas de raiz, dentro de dois ou três dias lesões característi-cas aparecerão nas folhas infectadas. Isto significa que a linha de raiz con-tém vírus recombinante que transporta o polinucleotídeo que codifica antíge-no da gripe da invenção (gene-alvo). Se nenhuma lesão local é formada, nãoexiste vírus, e a linha de raiz é rejeitada como negativa. Este método é alta-mente eficiente em tempo e custo. Após classificar inicialmente a presençade vírus, as raízes que contêm o vírus podem ser submetidas à classificaçãosecundária, por exemplo, por Western blot ou ELISA para selecionar altosexpressores. Classificações adicionais, por exemplo, classificações paracrescimento rápido, crescimento em meio particular, ou sob condições ambi-entais particulares, etc, podem ser aplicados. Estes métodos de classifica-ção podem, em geral, serem aplicados no desenvolvimento de qualquer daslinhas de raiz clonal, linhas de célula clonal, linhas de célula de planta clonal,e/ou plantas clonais aqui descritas.
Conforme será evidente a um versado na técnica, uma varieda-de de modificações pode ser feita à descrição dos métodos da invenção pa-ra gerar linhas de raiz clonal que contêm um vetor viral. Tais modificaçõesestão dentro do escopo da invenção. Por exemplo, enquanto é geralmentedesejável introduzir o vetor viral em uma planta intacta ou proteína destaantes da introdução dos genes de Ri-T-DNA, em certas concretizações dainvenção o Ri-DNA é introduzido antes da introdução do vetor viral. Em adi-ção, é possível contactar plantas intactas com A. rhizogenes preferivelmentedo que colheita de porções de folha e, em seguida, expondo-as ao bacteri-um.
Outros métodos de gerar linhas de raiz clonais de células sim-ples da planta ou porção desta que abriga um vetor viral podem ser usados(isto é, métodos não usando A. rhizogenes ou material genético a partir deplasmídeo Ri). Por exemplo, tratamento com certos hormônios de planta oucombinações de hormônios de planta é conhecido para resultar na geraçãode raízes de tecido de planta.
Linhas de Célula Clonal Derivadas de Linhas de Raiz Clonal
Conforme descrito acima, a invenção proporciona métodos paragerar linhas de raiz clonais, no qual as células nas linhas de raiz contêm umvetor viral. Conforme é bem-conhecido na técnica, uma variedade de linhasde célula diferentes pode ser gerada de raízes. Por exemplo, linhas de raizde célula podem ser geradas de células de raiz individuais obtidas a partir daraiz usando uma variedade de métodos conhecidos. Tais linhas de célula deraiz podem ser obtidas de vários tipos de célula de raiz diferentes dentro daraiz. Em geral, o material de raiz é colhido e dissociado (por exemplo, fisi-camente e/ou enzimaticamente digerido) para liberar células de raiz indivi-duais, que são, em seguida, adicionalmente cultivadas. A formação completade protoplasto não é geralmente necessária. Se desejado, células de raizpodem ser revestidas em concentrações de célula muito diluídas, de modo aobter linhas de célula de raiz de células de raiz simples. Linhas de célula deraiz derivadas dessa maneira são linhas de célula clonais contendo o vetorviral. Tais linhas de célula de raiz, portanto, exibem expressão estável dopolinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da invenção. As linhas de cé-lula de planta clonais podem ser obtidas em uma maneira similar a partir deraízes clonais, por exemplo, por cultura de células de raiz dissociadas napresença dos hormônios de planta apropriados. Classificações e etapas su-cessivas de enriquecimento podem ser usadas para identificar linhas de cé-lula que expressam o polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe da in-venção em níveis altos. Contudo, se a linha de raiz clonal da qual a linha decélula é derivada já expressa em altos níveis, tais classificações adicionaispodem ser desnecessárias.Como no caso das linhas de célula clonais, as células de uma li-nha de célula de raiz clonal são derivadas de uma célula ancestral simplesque contém o vetor viral e, conterá, portanto, também o vetor viral, visto queele será replicado, e será transmitido durante divisão da célula. Desse modo,uma alta proporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelomenos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substan-cialmente total (pelo menos 98%) das células conterão o vetor viral. É nota-do que desde que o vetor viral é herdado pelas células filhas dentro da linhade célula de raiz clonal, o movimento do vetor viral entre as células não énecessário para manter o vetor viral. As linhas de célula de raiz clonais po-dem ser usadas de um polinucleotídeo que codifica antígeno da gripe dainvenção conforme descrito abaixo.
Linhas de Célula de Planta Clonal
A presente invenção proporciona métodos para gerar uma linhade célula de planta clonal na qual um vetor viral de planta é usado para dire-cionar expressão de um polipeptídeo que codifica antígeno da gripe da in-venção. De acordo com o método da invenção, um ou mais vetor(es) de ex-pressão viral incluindo um polinucleotídeo que codifica um antígeno de gripeda invenção ligado operavelmente a um promotor é introduzido em célulasde uma linha de célula de planta que é mantida na cultura de célula. Umnúmero de linhas de célula de plantas de vários tipos de planta é conhecidona técnica, qualquer dos quais podendo ser usado. Linhas de célula recen-temente derivadas podem ser geradas de acordo com métodos conhecidospara uso na prática da invenção. Um vetor viral é introduzido nas células dalinha de célula de planta de acordo com qualquer de um número de méto-dos. Por exemplo, protoplastos podem ser produzidos e transcrições viraisem seguida eletroporadas nas células. Outros métodos de introdução de umvetor viral de planta nas células de uma linha de célula de planta podem serusados.
Um método de gerar linhas de célula de planta clonais, de acor-do com a invenção, e um vetor viral para introdução em células de planta(por exemplo, protoplastos), podem ser usados conforme segue: em seguidaa introdução do vetor viral, a linha de célula de planta pode ser mantida nacultura de tecido. Durante este tempo, o vetor viral pode replicar, e os poli-peptídeos que codificam antígeno da gripe da invenção podem ser expres-sos. As linhas de célula de planta clonais são derivadas a partir da cultura,por exemplo, por um processo de enriquecimento sucessivo. Por exemplo,amostras podem ser removidas da cultura, opcionalmente com diluição demodo que a concentração de células é baixa, e revestidas em placas de Pe-tri em gotículas individuais. As gotículas são, em seguida, mantidas parapermitir divisão de célula.
Será apreciado que as gotículas podem conter um número vari-ável de células, dependendo da densidade inicial da cultura e da quantidadede diluição. As células podem ser diluídas tal que muitas gotículas contêmou 0 ou 1 célula se é desejado obter-se linhas de célula clonais expressandoo polipeptídeo que codifica antígeno da gripe da invenção após somenteuma etapa simples de enriquecimento. Contudo, pode ser mais eficiente se-lecionar uma concentração tal que células múltiplas estejam presentes emcada gotícula e, em seguida, classificar as gotículas para identificar aquelasque contêm expressão de células. Em geral, qualquer procedimento de clas-sificação apropriado pode ser empregado. Por exemplo, seleção ou detec-ção de um marcador detectável, tal como GFP, pode ser usado. Westernblots ou ensaios ELISA podem ser usados. Gotículas individuais (100 μΙ)contêm mais do que células o bastante para realização destes ensaios. Eta-pas múltiplas de enriquecimento são realizadas para isolar linhas de célulade expressão mais altas. Linhas de célula de planta clonais simples (isto é,populações derivadas de uma célula ancestral simples) podem ser geradaspor limitação adicional de diluição usando-se métodos padrão para clona-gem de célula simples. Contudo, é necessário isolar linhas clonais individu-ais. Uma população contendo linhas de célula clonais múltiplas pode ser u-sada de um polipeptídeo que codifica antígeno(s) da gripe da invenção.
Em geral, certas concretizações acima descritas para geraçãode linhas de raiz clonais se aplicam a geração de linhas de célula de plantaclonais. Por exemplo, uma diversidade de vetores virais contendo um oumais polipeptídeos que codificam antígeno(s) da gripe da invenção pode serusada como podem combinações de vetores diferentes múltiplos. Métodosde classificação similares podem ser usados. Como no caso das linhas deraiz clonais e linhas de célula de raiz clonais, células de uma linha de célulade planta clonal são derivadas de uma célula ancestral simples que contémo vetor viral e conterão, portanto, também o vetor viral, visto que será repli-cado e será transmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma altaproporção (por exemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmentetotal (pelo menos 98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desdeque o vetor viral é herdado por células filhas dentro da linha de célula deplanta clonal, o movimento do vetor viral entre as células não é necessáriopara manter o vetor viral. A linha de célula de planta clonal pode ser usadapara produção de um polipeptídeo que codifica antígeno da gripe da inven-ção conforme descrito abaixo.
Plantas Clonais
Plantas clonais podem ser geradas a partir de raízes clonais, li-nhas de célula de raiz clonais, e/ou linhas de célula de planta clonais produ-zidas de acordo com os vários métodos acima descritos. Métodos para ge-ração de plantas a partir de raízes, linhas de célula de raízes, e linhas decélula de plantas, tais como as linhas de raiz clonais, linhas de célula de raizclonais, e linhas de célula de planta clonais aqui descritas são bem-conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Peres et al, 2001, Plant Cell Tis-sue and Organ Culture, 65:37; e referência modelo operam na biologia mo-Iecular de planta e biotecnologia citadas aqui). A invenção proporciona, por-tanto, um método de gerar uma planta clonal compreendendo etapas de (i)gerar uma linha de raiz clonal, linha de célula de raiz clonal, ou linha de célu-la de planta clonal de acordo com qualquer dos métodos da invenção descri-tos acima; e (ii) gerar uma planta total a partir da linha de raiz clonal, linha decélula de raiz clonal, ou planta clonal. As plantas clonais podem ser propa-gadas e descridas de acordo com métodos padrão.
Como no caso das linhas de raiz clonais, linhas de célula de raizclonais e linhas de célula de planta clonais, as células de uma planta clonalsão derivadas de uma célula ancestral simples que contém o vetor viral econterão, portanto, também o vetor viral, visto que será replicado e serátransmitido durante divisão de célula. Desse modo, uma alta proporção (porexemplo, pelo menos 50%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos90%, pelo menos 95%), total (100%), ou substancialmente total (pelo menos98%) das células conterá o vetor viral. É notado que desde que o vetor viralé herdado por células filhas dentro da planta clonal, o movimento do vetorviral não é necessário para manter o vetor viral.
Sistemas de Expressão de Planta de Brotos e Brotos Germinados
Sistemas e reagentes para gerar uma variedade de brotos e bro-tos germinados que são úteis para a produção de antígeno(s) de gripe deacordo com a presente invenção foram descritos anteriormente e são co-nhecidos na técnica (vide, por exemplo, Publicação PCT WO 04/43886, queé aqui incorporada por referência). A presente invenção proporciona adicio-nalmente brotos germinados, que podem ser comíveis, como uma biomassacontendo um peptídeo ou proteína de antígeno de gripe. Em certos aspec-tos, a biomassa é provida diretamente para consumo de composições deantígeno. Em alguns aspectos, a biomassa é processada antes do consumo,por exemplo, por homogeneização, trituração, secagem ou extração. Emcertos aspectos, o antígeno de gripe é purificado a partir da biomassa e for-mulado em uma composição farmacêutica.
Adicionalmente providos são métodos para produção de antíge-no(s) de gripe em brotos germinados que podem ser consumidos ou colhi-dos vivos (por exemplo, brotos germinados do gênero Brassica). Em certosaspectos, a presente invenção envolve crescimento de uma semente a umbroto germinado comestível em um ambiente regulável contido (por exem-plo, internos, em um recipiente, etc). A semente pode ser uma semente ge-neticamente projetada que contém um cassete de expressão que codificaum antígeno de gripe, cuja expressão é acionada por um promotor exoge-namente induzível. Uma variedade de promotores exogenamente induzíveispode ser usada que sejam induzíveis, por exemplo, por luz, calor, fitohormô-nios, nutrientes, etc.
Em concretizações relacionadas, a presente invenção propor-ciona métodos de produção de antígeno(s) de gripe em brotos germinadosprimeiro pela geração de um estoque de semente para o broto germinadopela transformação de plantas com um cassete de expressão que codificaantígeno de gripe usando sistema de transformação de Agrobacterium, noqual a expressão do antígeno de gripe é acionada por um promotor induzí-vel. Sementes transgênicas podem ser obtidas a partir da planta transforma-da, crescida em um ambiente regulável contido, e induzida para expressar oantígeno de gripe.
Em algumas concretizações, métodos são providos que envol-vem infecção de brotos germinados com um cassete de expressão viral quecodifica um antígeno de gripe, expressão da qual pode ser acionada porqualquer de um promotor viral ou um promotor induzível. Os brotos germina-dos são crescidos por dois a quatorze dias em um ambiente regulável conti-do, ou pelo menos até que níveis do antígeno de gripe tenham sido obtidospara consumo ou colheita.
A presente invenção proporciona adicionalmente sistemas paraprodução de antígeno(s) de gripe em brotos germinados que incluem umaunidade de alojamento com controle de clima e em broto germinado conten-do um cassete de expressão que codifica um ou mais antígenos de gripe, noqual expressão é acionada por um promotor constitutivo ou induzível. Ossistemas da invenção podem proporcionar vantagens únicas sobre o ambi-ente externo ou estufa, que não podem ser controlados. Desse modo, a pre-sente invenção capacita ao cultivador precisar o tempo de indução de ex-pressão do antígeno de gripe. Ele pode também reduzir grandemente o cus-to de produção de antígeno(s) de gripe.
Em certos aspectos, brotos transientemente transfectados con-têm seqüências de vetor viral que codificam um antígeno de gripe da inven-ção. Os brotos são crescidos por um período de tempo de modo a permitirprodução de um ácido nucléico viral no broto, seguido por um período decrescimento no qual cópias múltiplas de vírus são produzidas, resultando,desse modo, na produção de antígeno.
Em certos aspectos, sementes geneticamente projetadas ouembriões que contêm um transgene que codifica um antígeno de gripe sãocrescidos ao estágio de broto de semente em um ambiente regulável conti-do. O ambiente regulável contido pode ser uma unidade de alojamento ouambiente no qual as sementes podem ser crescidas interiormente. Todos osfatores ambientais do ambiente regulável contido podem ser controlados.Desde que os brotos não requerem luz e iluminação para crescerem, o quepode ser custoso, as sementes geneticamente projetadas ou embriões po-dem ser crescidas ao estágio de semente germinada em interiores na au-sência de luz.
Outros fatores ambientais que podem ser regulados em um am-biente regulável contido da presente invenção incluem temperatura, umida-de, água, nutrientes, gás (por exemplo, teor de O2 ou CO2, ou circulação dear), químicos (moléculas pequenas, tais como açúcares e derivados de açú-car, ou hormônios, tais como os fitohormônios giberélico ou ácido absísico,etc), e similares.
De acordo com certos métodos da presente invenção, expres-são do transgene que codifica um antígeno de gripe pode ser controlada porum promotor exogenamente induzível. Promotores exogenamente induzíveissão propensos a aumentar ou diminuir a expressão de um transgene emresposta a um estímulo externo, preferivelmente do que interno. Um númerodestes fatores ambientais pode agir como indutores para expressão dostransgenes transportados pelos cassetes de expressão dos brotos geneti-camente projetados. Os promotores podem ser um promotor induzível decalor, tal como um promotor de choque de calor. Por exemplo, usando-secomo um promotor de choque de calor, a temperatura do ambiente contidopode simplesmente ser elevada para induzir expressão do transgene. Outrospromotores incluem promotores induzíveis de luz. Os promotores induzíveisde luz podem ser mantidos como promotores constitutivos se a luz no ambi-ente regulável contido está sempre ligada. Alternativa ou adicionalmente, aexpressão do transgene pode ser ligada em um tempo particular durantedesenvolvimento ligando-se simplesmente a luz. O promotor pode ser umpromotor quimicamente induzível que é usado para induzir expressão datransgene. De acordo com estas concretizações, o químico pode simples-mente ser enevoado ou pulverizado em uma semente, embrião, ou brotopara induzir expressão do transgene. A pulverização e enevoamento podemser precisamente controladas e direcionadas em uma semente particular,embrião, ou broto ao qual é pretendido. O ambiente contido é destituído devento ou correntes de ar, que podem dispersar o químico para fora a partirdo alvo pretendido, de modo que o químico fica no alvo para qual ele foi pre-tendido.
De acordo com a presente invenção, o tempo de expressão queé induzido pode ser selecionado para maximizar a expressão de um antíge-no de gripe no broto de semente pelo tempo de colheita. A indução de ex-pressão em um embrião em um estágio particular de crescimento (por e-xemplo, indução de expressão em um embrião em um número particular dedias após germinação, pode resultar em síntese máxima do antígeno de gri-pe no tempo de colheita). Por exemplo, a indução de expressão a partir dopromotor 4 dias após germinação pode resultar em mais síntese de proteínado que indução de expressão a partir do promotor após 3 dias ou após 5dias. Aqueles técnicos no assunto apreciarão que a maximização da expres-são pode ser alcançada por experimentação de rotina. Em algumas concre-tizações, os brotos germinados são colhidos em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 10, 11 ou 12 dias após germinação.
Em casos onde o vetor de expressão tem um promotor constitu-tivo ao invés de um promotor induzível, o broto germinado pode ser colhidoem um certo tempo após transformação do broto de semente. Por exemplo,se um broto germinado fosse viralmente transformado em um estágio anteri-or de desenvolvimento, por exemplo, no estágio de embrião, os brotos ger-minados podem ser colhidos em um tempo quando expressão está em suapós-transformação máxima, por exemplo, em cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13 ou 14 dias pós-transformação. Pode também ser que brotosse desenvolvam um, dois, três ou mais meses pós-transformação, depen-dendo da germinação da semente.
Geralmente, uma vez que a expressão do antígeno(s) de gripese inicia, as sementes, embriões ou brotos germinados são permitidos cres-cerem até que níveis suficientes de antígeno(s) de gripe sejam expressos.Em certos aspectos, níveis suficientes são níveis que proporcionariam umbenefício terapêutico a um paciente se a biomassa colhida fosse material embruto ingerido. Alternativa ou adicionalmente, níveis suficientes são níveisdos quais o antígeno de gripe pode ser concentrado ou purificado a partir dabiomassa e formulado em uma composição farmacêutica que proporcionaum benefício terapêutico a um indivíduo após administração. Tipicamente, oantígeno não é uma proteína expressa no broto germinado na natureza. Emqualquer taxa, o antígeno de gripe é tipicamente expresso em concentraçõesacima daquela que estaria presente no broto germinado na natureza.
Uma vez que a expressão do antígeno de gripe é induzida,crescimento é permitido continuar até o estágio de broto germinado, em cujotempo os brotos germinados são colhidos. Os brotos germinados podem sercolhidos vivos. A colheita de brotos germinados vivos tem várias vantagens,incluindo esforço e quebra mínimos. Os brotos germinados da presente in-venção podem ser crescidos hidroponicamente, tornando a colheita umaação simples de se elevar o broto germinado de sua solução hidropônica.Nenhum solo é requerido para o crescimento dos brotos germinados da in-venção, mas pode ser provido se considerado necessário ou desejável peloversado na técnica. Devido aos brotos serem crescidos sem solo, nenhumalimpeza de material de broto germinado é requerida na hora da colheita.Sendo capaz de colher o broto germinado diretamente de seu ambiente hi-dropônico sem lavagem ou esfregamento, minimizando-se a quebra do ma-terial colhido. A quebra e definhamento de plantas induzem apoptose. Du-rante apoptose, certas enzimas proteolíticas tornam-se ativas, que podemdegradar a proteína farmacêutica expressa no broto germinado, resultandona atividade terapêutica diminuída da proteína. A proteólise induzida por a-poptose pode diminuir significantemente a produção de proteína de plantasmaduras. Usando-se os métodos da presente invenção, apoptose pode serevitada quando nenhuma colheita ocorre até o momento das proteínas se-rem extraídas da planta.
Por exemplo, brotos vivos podem ser moídos, triturados ou mis-turados para produzir uma pasta fluida de biomassa de broto germinado, eminibidores de protease contendo tampão. O tampão pode ser mantido a cer-ca de 4°C. Em alguns aspectos, a biomassa de broto germinado é seca a ar,pulverizada seca, congelada, ou congelada seca. Como em plantas madu-ras, alguns destes métodos, tais como secagem a ar, podem resultar emuma perda de atividade da proteína farmacêutica. Contudo, devido aos bro-tos germinados serem muito pequenos e terem uma grande área superficialem razão de volume, isto é muito menos provável de ocorrer. Aqueles técni-cos no assunto apreciarão que muitas técnicas para colheita da biomassaque minimizam a proteólise da proteína expressa são disponíveis, e podemser aplicadas a presente invenção.
Em algumas concretizações, os brotos germinados são comes-tíveis. Em certas concretizações, os brotos germinados que expressam ní-veis suficientes de antígenos de gripe são consumidos após colheita (porexemplo, após colheita, dentro de um período mínimo em seguida a colhei-ta), de modo que absolutamente nenhum processamento ocorre antes dosbrotos de semente serem consumidos. Desse modo, qualquer quebra prote-olítica induzida pela colheita do antígeno de HPV antes da administração doantígeno de gripe a um paciente em necessidade de tratamento é minimiza-da. Por exemplo, brotos germinados que estão prontos para serem consu-midos podem ser distribuídos diretamente a um paciente. Alternativa ou adi-cionalmente, sementes geneticamente projetadas ou embriões são distribuí-dos a um paciente em necessidade de tratamento e desenvolvidos ao está-gio de broto germinado pelo paciente. Em um aspecto, um suprimento debrotos germinados geneticamente projetados é provido a um paciente, ou aum médico que estará tratando os pacientes, de modo que um estoque con-tínuo de brotos germinados que expressam certos antígenos de gripe podeser cultivado. Isto pode ser particularmente valioso para populações em pai-ses em desenvolvimento, onde farmacêuticos custosos não são oferecidosou distribuídos. A facilidade com qual os brotos germinados da invenção po-dem ser crescidos torna os brotos germinados da presente invenção particu-larmente desejáveis para tal população em desenvolvimento.
A natureza regulável do ambiente contido concede vantagenspara a presente invenção sobre crescimento de plantas no ambiente exter-no. Em geral, o crescimento de brotos germinados geneticamente projetadosque expressa proteínas farmacêuticos em plantas proporciona um produtofarmacêutico mais rápido (porque as plantas são colhidas mais jovens) ecom menos esforço, risco, e considerações regulatórias do que o desenvol-vimento de plantas geneticamente projetadas. O ambiente regulável contidousado na presente invenção reduz ou elimina o risco de plantas de poliniza-ção cruzada na natureza.
Por exemplo, um promotor induzível de calor do mesmo modonão seria usado nos exteriores porque a temperatura no exterior não podeser controlada. O promotor seria ligado a qualquer hora que a temperaturaexterior se elevasse acima de um certo nível. Similarmente, o promotor seriadesligado toda hora que a temperatura externa caísse. Tais alterações detemperatura podem ocorrer em um único dia, por exemplo, ligando a expres-são no dia e desligando a noite. Um promotor induzível de calor, tal comoaquele aqui descrito, não seria mesmo prático para uso em uma estufa, queé susceptível a alterações climáticas para quase o mesmo grau conforme osexteriores. O crescimento de plantas geneticamente projetadas em uma es-tufa é muito custoso. Em contraste, no presente sistema, muita variável podeser controlada de modo que a quantidade máxima de expressão pode seralcançada com toda colheita.
Em certas concretizações, os brotos germinados da presente in-venção são crescidos em bandejas que podem ser irrigadas, pulverizadas,ou enevoadas em qualquer tempo durante desenvolvimento do broto germi-nado. Por exemplo, a bandeja pode ser assentada com um ou mais apare-lhos de irrigação, pulverização, enevoamento e drenagem que podem distri-buir e/ou remover água, nutrientes, químicos, etc., no tempo específico, eem quantidades precisas durante desenvolvimento do broto germinado. Porexemplo, as sementes requerem umidade suficiente para mantê-las úmidas.A umidade em excesso drena através de furos nas bandejas nos drenos nosolo do ambiente. Tipicamente, a água de drenagem é tratada conforme a-propriado para remoção de químicos nocivos antes da descarga de volta noambiente.
Outra vantagem de bandejas é que elas podem estar contidasdentro de um espaço muito pequeno. Desde que nenhuma luz é requeridapara os brotos germinados crescerem, as bandejas contendo sementes,embriões ou brotos germinados podem ser apertadamente empilhadas verti-calmente uma sobre a outra, proporcionando uma grande quantidade de bi-omassa por unidade de espaço de solo em uma facilidade de alojamentoconstruída especificamente para esta proposta. Em adição, as pilhas debandejas podem ser dispostas em séries horizontais dentro de uma unidadede alojamento. Uma vez que os brotos tenham crescido a um estágio apro-priado para colheita (cerca de dois a quatorze dias), as bandejas de brotoindividuais são movidas em uma facilidade de processamento, ou manual-mente, ou por meios automáticos, tal como uma correia veículo.
O sistema da presente invenção é único em que ele proporcionauma biomassa de broto germinado que é uma fonte de um antígeno(s) degripe. Se diretamente consumida ou processada na forma de uma composi-ção farmacêutica, porque os brotos germinados são crescidos em um ambi-ente regulável contido, a biomassa de broto germinado e/ou composiçãofarmacêutica derivada a partir da biomassa podem ser providas a um con-sumidor em baixo custo. Em adição, o fato que as condições para cresci-mento dos brotos germinados podem ser controladas torna a qualidade epureza do produto consistentes. O ambiente regulável contido da invençãotambém torna óbvio muitas regulações seguras da EPA que pode impedircientistas de desenvolverem produtos agriculturais geneticamente projetadosao ar livre.
Brotos Transformados
Uma variedade de métodos pode ser usada para transformar cé-lulas de planta e produzir brotos germinados geneticamente projetados. Doismétodos disponíveis para a transformação de plantas que requerem quelinhas de células transgênicas sejam geradas in vitro, seguido por regenera-ção das linhas de célula nas plantas totais, incluem transferência de genemediada por Agrobacterium tumefaciens e bombardeio de microprojétil, oueletroporação. A transformação viral é um método mais rápido e menos cus-toso de transformação de embriões e brotos germinados que podem ser co-lhidos sem um retardo experimental ou geracional antes da obtenção doproduto desejado. Para qualquer destas técnicas, o versado na técnica a-preciaria como ajustar e otimizar os protocolos de transformação que foramusados tradicionalmente para plantas, sementes, embriões, ou brotos germi-nados.
Cassetes de Expressão de Transformação de Aarobacterium
Agrobacterium é um gênero representativo da família gram-negativa Rhizobiaceae. Esta espécie é responsável por tumores de planta,tais como doença de bile de coroa e raiz com pelo. Em tecido de planta de-diferenciado, que é característico de tumores, derivados de aminoácido co-nhecidos como opines são produzidos pelo Agrobacterium e catabolizadospela planta. Os genes bacteriais responsáveis pela expressão de opines sãouma fonte conveniente de elementos de controle para cassetes de expres-são quiméricos. De acordo com a presente invenção, o sistema de transfor-mação de Agrobacterium pode ser usado para gerar brotos germinados co-mestíveis, que são meramente colhidos antes das plantas amadurecerem.Os métodos de transformação de Agrobacterium podem facilmente seremaplicados para regenerar brotos germinados que expressam antígenos degripe.
Em geral, a transformação das plantas envolve a transformaçãode células de planta crescidas em cultura de tecido por co-cultivo com umAgrobacterium tumefaciens conduzindo uma planta/vetor bacterial. O vetorcontém um gene que codifica um antígeno de gripe. O Agrobaeterium trans-fere o vetor para a célula hospedeira da planta e é, em seguida, eliminadousando tratamento antibiótico. As células de planta transformadas que ex-pressam o antígeno de gripe são selecionadas, diferenciadas, e, finalmente,regeneradas em plantinhas completas (Hellen et al., 2000, Plant Mol). Biol.,42:819; Pilon-Smits et al., Plant Physiolog. 119(1):123; Barfield et al., 1991,Plant Cell Reports, 10:308; e Riva et al., J. Biotechnology 1 (3); cada um doqual é incorporado aqui por referência.
Vetores de expressão para uso na presente invenção incluemum gene (ou cassete de expressão) que codifica um antígeno de gripe de-signado para operação em plantas, com seqüências companheiras a mon-tante e a jusante do cassete de expressão. As seqüências companheirassão geralmente de plasmídeo ou de origem viral, e proporcionam caracterís-ticas necessárias ao vetor para transferir DNA da bactéria ao hospedeiro deplanta desejado.
O construto básico bacterial/vetor de planta pode desejavelmen-te proporcionar uma origem de replicação de procariote de hospedeiro defaixa ampla, um marcador selecionável de procariote. Marcadores selecio-náveis procarióticos adequados incluem resistência a antibióticos, tais comoampicilina ou tetraciclina. Outras seqüências de DNA que codificam funçõesadicionais que são bem-conhecidas podem também estarem presentes novetor.
Seqüências de Agrobacterium T-DNA são requeridas para trans-ferência mediada por Agrobacterium de DNA para o cromossomo da planta.Os genes de indução de tumor do T-DNA são tipicamente removidos e subs-tituídos com seqüências que codificam o antígeno de gripe. As seqüênciasde limite de T-DNA são retidas porque elas iniciam a integração da região deT-DNA no genoma da planta. Se expressão do antígeno de HPV não é pron-tamente acessível para detecção, o construto bacterial/de vetor de plantapode também incluir um gene marcador selecionável para determinação seuma célula de planta foi transformada, por exemplo, o gene de resistêncianptll karamicin. No mesmo ou diferente vetor bacterial/de planta (plasmídeoTi) são seqüências Ti. Seqüências Ti incluem os genes de virulência, quecodificam um conjunto de proteínas responsáveis pela excisão, transferênciae integração do T-DNA no genoma da planta (Caiu, 1987, Caiense,237:1176). Outras seqüências adequadas para permissão de integração daseqüência heteróloga no genoma da planta podem incluir seqüências detransposon, e similares, para recombinação homóloga.
Certos constructo incluirão o cassete de expressão que codificauma proteína de antígeno. Um, dois ou mais cassetes de expressão podemser usados em uma dada transformação. O cassete de expressão recombi-nante contém, em adição á seqüência que codifica antígeno de gripe, pelomenos os seguintes elementos: uma região de promotor, seqüências não-transladadas 5' de planta, códon de iniciação (dependendo se ou não o geneexpresso tem seu reconhecimento), e seqüências de terminação de transcri-ção e terminação. Em adição, terminadores de transcrição e translação po-dem ser incluídos nos cassetes de expressão ou genes quiméricos da pre-sente invenção. Seqüências de secreção de sinal que permitem processa-mento e translocação da proteína, conforme apropriado, podem também se-rem incluídas no cassete de expressão. Uma variedade de promotores, se-qüências de sinal, e terminadores de transcrição e translação são descritos(vide, por exemplo, Lawton et al., 1987, Plant Mol). Biol 9:315; e Patente dosEstados Unidos N0 5.888.789, incorporados aqui por referência. Em adição,genes estruturais para resistência a antibiótico são comumente utilizadoscomo um fator de seleção (Fraley et al., 1983, Proc). Nati Acad. Sci., USA80:4803, aqui incorporado por referência. Locais de enzima de restrição úni-cos nas extremidades 5' e 3' do cassete permitem fácil inserção em um vetorpré-existente. Outros sistemas de vetor binário para transformação mediadapor Agrobacterium, conduzindo pelo menos uma seqüência limite de T-DNA,são descritos em PCT/EP99/07414, incorporado aqui por referência.
Regeneração
Sementes de plantas transformadas podem ser colhidas, secas,limpas e testadas para viabilidade e para a presença e expressão de umproduto de gene desejado. Uma vez que este tenha sido determinado, esto-que de semente é tipicamente armazenado sob condições apropriadas detemperatura, umidade, saneamento e segurança a serem usadas quandonecessário. As plantas totais podem então serem regeneradas de protoplas-tos cultivados (vide, por exemplo, Evans etal., Handbook of Plant Cell Culto-res, Vol. 1, MacMiIIan Publishing Co). New York, 1983; e Vasil I. R. (ed.),Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, Vol.I, 1984, e Vol. III, 1986, incorporados aqui por referência. Em certos aspec-tos, as plantas são regeneradas somente ao estágio de broto germinado. Emalguns aspectos, as plantas totais são regeneradas para produzir estoquesde semente, e brotos germinados são geradas a partir das sementes do es-toque de semente.
Todas as plantas das quais protoplastos podem ser isolados ecultivados para dar plantas totais regeneradas podem ser transformadas pe-la presente invenção de modo que as plantas totais são recuperadas, quecontêm o gene transferido. É sabido que praticamente todas as plantas po-dem ser regeneradas a partir das células de cultura ou tecidos, incluindo,mas não limitadas a, todas as espécies maiores de plantas que produzembrotos comestíveis. Algumas plantas adequadas incluem alfafa, munguba,rabanete, trigo, mostarda, espinafre, cenoura, beterraba, cebola, alho, aipo,ruibarbo, uma planta folhosa, tais como repolho ou alface, agrião, ervas, taiscomo salsa, hortelã, ou trevos, couve-flor, brócolis, feijão-soja, lentilhas, flo-res comestíveis, tal como girassol, etc.
Os meios para regeneração variam de uma espécie de plantaspara a próxima. Contudo, aqueles técnicos no assunto apreciarão que ge-ralmente uma suspensão de protoplantas transformadas contendo cópias dogene heterólogo é primeiro provida. Tecido de calo é formado, e brotos po-dem ser induzidos de calo e, subseqüentemente, arraigados. Alternativa ouadicionalmente, formação de embrião pode ser induzida a partir da suspen-são de protoplastos. Estes embriões germinam como embriões naturais paraformar plantas. O afundamento da semente na água, ou a pulverização dasemente com água para aumentar o teor de umidade da semente para entre35-45%, inicia a germinação. Para a germinação proceder, as sementes sãotipicamente mantidas em ar saturado com água sob condições de tempera-tura controlada e fluxo de ar. O meio de cultura geralmente conterá váriosaminoácidos e hormônios, tais como auxina e citoquinins. É também vanta-joso adicionar ácido glutâmico e prolina ao meio, especialmente para espé-cies, tal como alfafa. Brotos e raízes normalmente se desenvolvem simulta-neamente. A regeneração eficiente dependerá do meio, do genótipo, e dahistória da cultura. Se estas três variáveis são controladas, então a regene-ração é totalmente reproduzível e repetível.
As plantas maduras, crescidas a partir de células de plantatransformadas, são plantas transgênicas homozigóticas de auto e não-segregação, são identificadas. Uma planta congênita produz sementes con-tendo as seqüências que codificam o antígeno da invenção. Tais sementespodem ser germinadas e crescidas ao estágio de broto germinado para pro-duzir o(s) antígeno(s) de gripe de acordo com a presente invenção.
Em concretizações relacionadas, sementes da presente inven-ção podem ser formadas em produtos de semente, e vendidas com instru-ções de como desenvolver brotos para o estágio de broto germinado apro-priado para administração ou colheita em uma composição farmacêutica. Emalgumas concretizações relacionadas, híbridos ou novas variedades concre-tizando os traços desejados podem ser desenvolvidos de plantas congênitasda invenção.
Integração Direta
Integração direta de fragmentos de DNA no genoma de célulasde planta por bombardeio de microprojétil ou eletroporação pode tambémser usada na presente invenção (vide, por exemplo, Kikkert et ai, 1999,Plant: J. Tissue Cult. Assoc., 35:43; e Bates, 1994, MoL Biotech., 2:135).Mais particularmente, vetores que expressam antígenos de HPV da presenteinvenção podem ser introduzidos nas células de planta por uma variedadede técnicas. Conforme descrito acima, os vetores podem incluir marcadoresselecionáveis para uso em células de planta. Os vetores podem incluir se-qüências que permitem sua seleção e propagação em um hospedeiro se-cundário, tais como seqüências contendo uma origem de replicação e mar-cador selecionável. Tipicamente, hospedeiros secundários incluem bactériae levedura. Em uma concretização, o hospedeiro secundário é bactéria (porexemplo, Escherichia coli, a origem de replicação é um origem tipo CoIEI dereplicação), e o marcador selecionável é um gene que codifica resistência aampicilina. Tais seqüências são bem-conhecidas na técnica, e são comerci-almente disponíveis (por exemplo, Clontech, Palo Alto, CA ou Stratagene, LaJollal CA).
Os vetores da presente invenção podem também serem modifi-cados em plasmídeos de transformação de planta intermediários que contêmuma região de homologia a um vetor de Agrobacterium tumefaciens, umaregião limite de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, e ácidos nucléicosque codificam antígeno ou cassetes de expressão descritos acima. Vetoresadicionais podem incluir um tumor de planta desarmado incluindo plasmídeode Agrobacterium tumefaciens.
De acordo com esta concretização, transformação direta dos ve-tores da invenção envolve micro injeção dos vetores diretamente nas célulasda planta pelo uso de micropipetas para transferir mecanicamente o DNArecombinante (vide, por exemplo, 1985, Mol. Gen. Genet., 202:179, incorpo-rado aqui por referência). O material genético pode também ser transferidona célula da planta pelo uso de polietileno glicóis (vide, por exemplo, Krenset ai., 1982, Nature 296:72). Outro método de introdução de ácidos nucléicosem plantas via penetração balística de alta velocidade por partículas peque-nas com um ácido nucléico, ou dentro da matriz de gotas pequenas, ou par-tículas, ou na superfície (vide, por exemplo, Klein et ai., 1987, Nature 327:70;Knudsen et ai, 1991, Planta 185:330). Ainda outro método de introdução éfusão de protoplastos com outras entidades, ou minicélulas, células, Iisos-somos, ou outros corpos de superfície de lipídeo fusíveis (vide, por exemplo,Fraley et ai., 1982, Proc). Nati. Acad. Sei. USA (1859). Vetores da invençãopodem também serem introduzidos nas células da planta por eletroporação(vide, por exemplo, Fromm et ai., 1985, Proc. Nati. Acad. Sei. USA,82:5824). De acordo com esta técnica, protoplastos de planta são eletropo-rados na presença de plasmídeos contendo umo construto de gene. Impul-sos elétricos de reversibilidade de resistência de campo alta permeabilizambiomembranas permitindo a introdução dos plasmídeos. Os protoplastos deplanta eletroporados reformam a célula, dividem a parede, e formam calo daplanta, que podem ser regenerados para formar brotos germinados da in-venção. Aqueles técnicos no assunto apreciarão como utilizar estes métodospara transformar células de planta que podem ser usadas para gerar brotosgerminados comestíveis.
Transformação Viral
Similares a sistemas de expressão convencionais, vetores de ví-rus de planta podem ser usados para produzir proteína de comprimento to-tal, incluindo antígeno de comprimento total. De acordo com a presente in-venção, os vetores de vírus de planta podem ser usados para infectar e pro-duzir antígeno(s) em sementes, embriões, brotos germinados, etc, sistemasvirais que podem ser usados para expressar tudo de peptídeos curtos a pro-teínas complexas grandes. Especificamente, o uso de vetores tobamoviral édescrito (vide, por exemplo, McCormick et ai, 1999, Proc. Nati Acad. Sei.USA 96:703; Kumagai et ai, 2000, Gene , 245:169; e Verch et ai, 1998, J.Immunol. Methods 220:69; cada um do qual incorporado aqui por referên-cia). Desse modo, vetores virais de planta têm uma capacidade demonstra-da de expressar peptídeos curtos, bem como proteínas complexas grandes.
Em certas concretizações, brotos germinados que expressamantígeno de gripe são gerados utilizando um sistema de hospedeiro/vírus.Os brotos transgênicos produzidos por infecção viral proporcionam uma fon-te de proteína transgênica que já foi demonstrado ser segura. Por exemplo,os brotos são livres de contaminação com patogenias animais. Diferente-mente, por exemplo, tabaco, proteínas de um broto comestível podiam pelomenos na teoria serem usadas em aplicações orais sem purificação, redu-zindo, desse modo, significantemente, os custos. Em adição, um sistema devírus/broto oferece uma rota muito mais simples, menos custosa para escalae fabricação, visto que transgenes são introduzidos no vírus, que pode serdesenvolvido a uma escala comercial dentro de uns poucos dias. Em con-traste, plantas transgênicas podem requerer até 5-7 anos antes que semen-tes suficiente ou material de planta estejam disponíveis para ensaios degrande escala ou comercialização.
De acordo com a presente invenção, os vírus de RNA de plantatêm certas vantagens, enquanto os tornam atrativos como vetores para ex-pressão de proteína estranha. A biologia e patologia molecular de um núme-ro de vírus de RNA de planta são bem caracterizadas, e existe conhecimen-to considerável de biologia, genéticas e seqüência regulatória de vírus. Mui-tos vírus de RNA de planta têm genomas pequenos, e clones de cDNA in-fecciosos são disponíveis para facilitar manipulação genética. Uma vez queo material de vírus infeccioso entra na célula hospedeira susceptível, ele re-plica a altos níveis e se espalha rapidamente através de um broto germinadototal (um a dez dias pós-inoculação). As partículas de vírus são facilmente eeconomicamente recuperadas de tecido de broto germinado infectado. Osvírus têm uma faixa ampla de hospedeiro, capacitando o uso de umo cons-truto simples para infecção de várias espécies susceptíveis. Estas caracte-rísticas são prontamente transferíveis para os brotos.
Seqüências estranhas podem ser expressas de vírus de RNA deplanta, tipicamente pela substituição de um dos genes virais com seqüênciadesejada, pela inserção de seqüências estranhas no genoma do vírus emuma posição apropriada, ou pela fusão de peptídeos estranhos às proteínasestruturais de um vírus. Além disso, quaisquer destas aproximações podemser combinadas para expressarem seqüências estranhas por transcomple-mentação de funções vitais de um vírus. Um número de estratégias diferen-tes existe como ferramentas para expressar seqüências estranhas nas plan-tas infectadas por vírus usando vírus de mosaico de tabaco (TMV), vírus demosaico de alfafa (AIMV), e quimeras destes.
O genoma de AIMV é um representante da família Bromoviridaede vírus, e consiste em três RNAs genômicos (RNAs1-3) e RNA subgenômi-co (RNA4) Os RNAs genômicos 1 e 2 codificam proteínas replicases de ví-rus P1 e P2, respectivamente. O RNA3 genômico codifica a proteína de mo-vimento de célula a célula P3 e a proteína de revestimento (CP). A CP étransladada de RNA4 subgenômico, que é sintetizado de RNA3 genômico, eé requerido para iniciar a infecção. Estudos têm demonstrado o envolvimen-to da CP em funções múltiplas, incluindo ativação de genoma, replicação,estabilidade de RNA, formação de sintoma, e encapsidação de RNA (vide,por exemplo, Bol et ai, 1971, Virology (1971) 46:73; Van Der Vossen et ai,1994, Virology 202:891; Yusibov et ai, Virology 208:405; Yusibov et ai,1998, Virology 242:1; Bol et ai, (Review, 100 refs.), 1999, J. Gen. Virol.,80:1089; De Graaff, 1995, Virology 208:583; Jaspars et ai, Adv. Vírus Res19:37; Loesch-Fries, 1985, Virology 146: 177; Neeleman et ai, 1991, Viro-logy 181:687; Neeleman et ai, 1993, Virology, 196:883; Van Der Kuyl et ai,1991, Virology 183:731; Van DerKuyI et ai, 1991, Virology, 185:496).
A encapsidação de partículas virais é tipicamente requerida paramovimento de longa distância de vírus de partes inoculadas a não-inoculadas da semente, embrião, ou broto germinado, e para infecção sistê-mica. De acordo com a presente invenção, inoculação pode ocorrer emqualquer estágio de desenvolvimento de planta. Em embriões e brotos, adifusão do vírus inoculado deve ser muito rápida. Virions de AIMV são en-capsidatados por uma CP única (24 kD), formando mais do que um tipo departícula. O tamanho (30 a 60 mm de comprimento e 18 nm de diâmetro) eforma (esférica, elipsoidal, ou baciliforme) de uma partícula dependem dotamanho do RNA encapsidatado. Após montagem, o terminal N do AIMV CPé para estar localizado na superfície das partículas de vírus, e não pareceinterferir com a montagem do vírus (Boi et ai, 1971, Virology 6:73). Adicio-nalmente, o AIMV CP com um adicional de 38 peptídeo aminoácidos em seuterminal N forma partículas in vitro e retém atividade biológica (Yusibov etai, 1995, J. Gen. Viroi, 77:567).
O AIMV tem uma faixa de hospedeiro ampla, que inclui um nú-mero de plantas de colheita agriculturalmente valiosas, incluindo sementesde planta, embriões, e brotos. Juntas, estas características tornam o AIMVCP um excelente candidato como uma molécula veículo e AIMV um vetorcandidato atrativo para a expressão de seqüências estranhas para a expres-são de seqüências estranhas na planta no estágio de broto de desenvolvi-mento. Além disso, após expressão de um vetor heterólogo, tal como TMV, oAIMV CP encapsidata o genoma de TMV sem interferir com a infectividadedo vírus (Yusibov et ai, 1997, Proc. Nati Acad. Sei. USA 94:5784, incorpo-rado aqui por referência). Isto permite o uso de TMV como um vírus veículopara AIMV CP fundido às seqüências estranhas.
TMV, o protótipo do tobamovírus, tem um genoma consistindoem um RNA simples mais de sentido encapsidatado com uma CP de 17,0kD, que resulta em partículas em forma de haste (300 nm de comprimento).
A CP é a única proteína estrutural de TMV, e é requerida para encapsidaçãoe movimento de longa distância do vírus em um hospedeiro infectado (Saitoet al., 1990, Virology 176:329). As 183 e 128 kD de proteínas são translada-das de RNA genômico, e são requeridas para replicação de vírus (Ishikawaet ai, 1986, NucIeicAcids Res., 14:8291). A proteína de 30 kD é a proteínade movimento de célula a célula de vírus (Meshi et al., 1987, EMBO J.6:2557). As proteínas de movimento e de revestimento são transladadas deRNAs subgenômicos (Hunter et al., 1976, Nature 260:759; Bruening et al.,1976, Virology 71:498; e Beachy et al., 1976, Virology 73:498; cada um doqual sendo incorporado aqui por referência).
Outros métodos de transformação de tecidos de planta incluemtransformação da flor de uma planta. A transformação de Arabidopsis thalia-na pode ser alcançada pela imersão das flores da planta em uma solução deAgrobacterium tumefaciens (Curtis et al., 2001, Transgenic Res., 10:363; eQing et ai, Molecular Breeding: New Strategiesin Plant Improvement, 1:67).Plantas transformadas são formadas na população de sementes geradaspelas "plantas imersas". Em um ponto específico durante desenvolvimentoda flor, um poro existe na parede do ovário através da qual Agrobacteriumtumefaciens ganha acesso ao interior do ovário. Uma vez no interior do ová-rio, o Agrobacterium tumefaciens prolifera e transforma os óvulos individuais(Desfeux et al., 2000, Plant Physiology, 123:895). Os óvulos transformadosseguem a trajetória típica de formação de semente no interior do ovário.
Produção e Isolamento de Antígeno
Em geral, métodos conhecidos padrão na técnica podem serusados para cultura ou crescimento de plantas, células de planta, e/ou teci-dos de planta da invenção (por exemplo, plantas clonais, células de plantaclonais, raízes clonais, linhas de raiz clonais, brotos, brotos germinados,plantas, etc.), para produção de antígeno(s). Uma ampla variedade de meiode cultura e biorreatores foram empregados para cultura de células de raizcom pelos, linhas de célula de raiz e células de planta (vide, por exemplo,Giri et ai, 2000, Biotecnolol. Adv., 18:1; Rao et ai, 2002, Biotechnol. Adv.,20:101; e referências em ambos dos precedentes, todos dos quais sendoaqui incorporados por referência). Plantas clonais podem ser crescidas emqualquer maneira adequada.
Em certas concretizações, os antígenos de gripe da invençãopodem ser produzidos por qualquer método conhecido. Em algumas concre-tizações, um antígeno de gripe é expresso em uma planta ou porção desta.As proteínas são isoladas e purificadas de acordo com condições e técnicasconvencionais conhecidas na técnica. Estas incluem métodos, tais comoextração, precipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, eletrofore-se, e similares. A presente invenção envolve a purificação e escala alcançá-vel de produção de antígeno(s) de gripe usando qualquer de uma variedadede sistemas de expressão de planta conhecido na técnica e providos aqui,incluindo sistemas de expressão de planta virais aqui descritos.
Em muitas concretizações da presente invenção, será desejávelisolar produtos de antígeno de vacina. Onde uma proteína da invenção éproduzida de tecido(s) de planta ou uma porção deste(s), por exemplo, raí-zes, células de raiz, plantas, células de planta que as expressam, métodosdescritos em detalhes adicionais aqui, ou quaisquer métodos aplicáveis co-nhecidos na técnica, podem ser usados para qualquer de um isolamentoparcial ou completo de material de planta. Onde é desejável isolar um produ-to de expressão de alguma ou toda de células de planta ou tecidos que aexpressam, quaisquer técnicas de purificação disponíveis podem ser empre-gadas. Aqueles técnicos no assunto são familiares com uma faixa ampla deprocedimentos de fracionamento e separação (vide), por exemplo, Scopes etal., Protein Purification: Principie and Practice, 33 Edição, Janson et al.,1993; Protein Purification: Principies, High Resolution Methods, and Applica-tions, WiIey-VCH, 1998; Springer-Verlag, NY, 1993; e Roe, Protein Purificati-on Techniques, Oxford University Press, 2001, cada um do qual sendo aquiincorporado por referência. Freqüentemente, será desejável produzir umproduto mais do que 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% puro. Vide, por exemplo, Patentes dosEstados Unidos 6.740.740 e 6.841.659 para discussão de certos métodosúteis para purificação de substâncias de tecidos ou fluidos de planta.
- Aqueles técnicos no assunto também apreciarão que um méto-
do de obtenção de produtos de vacina desejado é por extração. O materialde planta (por exemplo, raízes, folhas, etc) pode ser extraído para removerprodutos desejados de biomassa residual, aumentando, desse modo, a con-centração e pureza de um produto. As plantas podem ser extraídas em umasolução tampão. Por exemplo, o material de planta pode ser transferido emuma quantidade de água gelada a uma razão de um para um por peso, quefoi tamponada com, por exemplo, tampão de fosfato. Inibidores de proteasepodem ser adicionados conforme requerido. O material de planta pode serrompido por mistura ou moagem vigorosas enquanto suspenso na soluçãotampão, e a biomassa extraída removida por filtração ou centrifugação. Oproduto transportado na solução pode adicionalmente ser purificado por eta-pas adicionais, ou convertido a um pó seco por congelamento-secagem ouprecipitação. A extração pode ser efetuada por prensagem. As plantas ouraízes podem ser extraídas por prensagem em uma prensa, ou moídas àmedida que elas passam através de rolos proximamente espaçados. Os flui-dos expressos a partir das plantas ou raízes moídas são coletados e proces-sados de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica. A extração porprensagem permite a liberação de produtos em uma forma mais concentra-da. Contudo, o rendimento total do produto pode ser mais baixo do que seum produto fosse extraído em solução.
Vacinas
A presente invenção proporciona proteínas de antígeno farma-cêuticas para uso terapêutico, tal como proteína(s) de antígeno, ou por-ção(ões) imunogênica(s) desta(s) ativa(s) como uma vacina para tratamentoterapêutico e/ou profilático de infecção de gripe. Adicionalmente, a invençãoproporciona uso veterinário, visto que proteína de antígeno ou porção imu-nogênica desta é ativa em aplicações veterinárias. Em certas concretiza-ções, antígeno(s) pode(m) ser produzido(s) por planta(s) ou porção desta(s)(por exemplo, raiz, célula, broto, linha de célula, planta, etc.) da invenção.Em certas concretizações, os antígenos de HPV são expressos em plantas,células de planta, e/ou tecidos de planta (por exemplo, brotos, brotos germi-nados, raízes, cultura de célula, células clonais, linhas de célula clonais,plantas clonais, etc.), e podem ser usados diretamente de uma planta, ouparcialmente purificados ou purificados na preparação para administraçãofarmacêutica a um indivíduo.
A presente invenção proporciona plantas, células de planta, etecidos de planta que expressam antígeno(s) de gripe que mantêm atividadefarmacêutica quando administrados a um indivíduo em necessidade deste.Em certas concretizações, os indivíduos incluem vertebrados, (por exemplo,mamíferos, tais como seres humanos). De acordo com a presente invenção,os indivíduos incluem indivíduos veterinários, tais como bovinos, ovinos, ca-ninos, felinos, etc. Em certos aspectos, uma planta comestível ou porçãodesta (por exemplo, broto, raiz) é administrada oralmente a um indivíduo emuma quantidade terapeuticamente eficaz. Em alguns aspectos, um ou maisantígeno(s) de gripe é (são) provido(s) em uma preparação farmacêutica,conforme descrito aqui.
As composições de vacina da invenção compreendem um oumais antígenos de gripe. Em certas concretizações, pelo menos dois antíge-nos de gripe da invenção são incluídos em uma composição de vacina ad-ministrada.
De acordo com a presente invenção, o tratamento de um indiví-duo com um antígeno de vacina é pretendido para induzir um efeito fisiológi-co. Uma proteína de vacina pode ter propriedades curativas ou paliativascontra uma enfermidade ou doença, e pode ser administrada para aliviarmelhora, aliviar, retardar começo de reverso, ou diminuir sintomas ou severi-dade de uma doença ou enfermidade. Um antígeno de vacina pode ter pro-priedades profiláticas, e pode ser usado para impedir ou retardar começo deuma doença, ou diminuir a severidade de tal doença, enfermidade, ou condi-ção patológica quando ela aparece. Um efeito fisiológico induzido pelo tra-tamento de um indivíduo com antígeno de acordo com a presente invençãopode incluir uma resposta imune eficaz tal que infecção por um organismo éimpedida.
Em algumas concretizações, as vacinas da invenção são distri-buídas por rotas orais e/ou mucosais. A administração oral e/ou mucosal temo potencial de impedir a infecção de tecidos mucosais, a abertura principalde infecção para muitas patogenias. A distribuição oral e/ou mucosal podeiniciar resposta imune sistêmica. Tem sido progresso considerável no de-senvolvimento de sistemas de expressão heterólogos para a administraçãooral de antígenos que estimulam o sistema imune mucosal, e pode iniciarimunidade sistêmica. Esforços prévios na distribuição de vacina oral, contu-do, têm demonstrado um requerimento de quantidades consideráveis de an-tígeno em alcançar eficiência. Desse modo, a produção econômica de gran-des quantidades de antígenos alvos é um pré-requisito para a criação devacinas orais eficazes. O desenvolvimento de plantas que expressam antí-genos, incluindo antígenos termoestáveis, representa uma aproximaçãomais realísticas a tais dificuldades.
As preparações farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas em uma ampla variedade de modos ao indivíduo, tais como,por exemplo, oral, enteral, nasal, parenteral, intramuscular ou intravenosa,retal, vaginal, tópica, ocular, pulmonarmente, ou por aplicação de contato.Em certas concretizações, um antígeno de gripe expresso em uma planta ouporção desta é administrado a um indivíduo oralmente por administraçãodireta da planta ao indivíduo. Em alguns aspectos, uma proteína de vacinaexpressa em uma planta ou porção desta é extraída e/ou purificada, e usadapara a preparação de uma composição farmacêutica. Pode ser desejávelformular tais produtos isolados para seu uso pretendido (por exemplo, comoum agente farmacêutico, composição de vacina, etc.). Em algumas concreti-zações, será desejável formular os produtos junto com alguns ou todos dostecidos de planta que os expressam.
Onde é desejável formular o produto junto com o material deplanta, será freqüentemente desejável ter uma planta que seja não tóxica aorecipiente relevante (por exemplo, um humano ou outro animal). Tecido deplanta relevante (por exemplo, células, raízes, folhas) pode simplesmenteser colhido e processado de acordo com técnicas conhecidas na técnica,com devida consideração para manter atividade do produto expresso. Emcertas concretizações da invenção, é desejável ter expressado o antígeno devacina em uma planta comestível (e, especificamente, em porções comestí-veis da planta), de modo que o material pode ser subseqüentemente comi-do. Por exemplo, onde o antígeno de vacina é ativo após distribuição oral(quando corretamente formulado), pode ser desejável produzir a proteína deantígeno em uma porção de planta comestível, e para formular o antígenode vacina expresso para distribuição oral junto com o algum ou todo do ma-terial de planta com o qual a proteína foi expressa.
Os antígenos de vacina providos podem ser formulados de a-cordo com técnicas conhecidas. Por exemplo, uma quantidade eficaz de umproduto de vacina pode ser formulada junto com um ou mais materiais veícu-los farmaceuticamente adequados, orgânicos ou inorgânicos, líquido ou sóli-do. Um antígeno de vacina produzido de acordo com a presente invençãopode ser empregado em formas de dosagem tais como comprimidos, cápsu-las, pastilhas, dispersões, suspensões, soluções, cápsulas, cremes, ungüen-tos, aerossóis, pacotes de pó, soluções líquidas, solventes, diluentes, agen-tes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes de espessamento ouemulsificante, conservantes, e ligações sólidas, considerando-se que a ativi-dade biológica da proteína não seja destruída por tal forma de dosagem.
Em geral, as composições podem compreender qualquer deuma variedade de veículo(es) farmaceuticamente aceitável(eis) diferente(s),adjuvante(s), ou uma combinação de um ou mais tal(is) adjuvante(s). Con-forme aqui usado, a linguagem "veículo farmaceuticamente aceitável, adju-vante" inclui solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacte-rial ou antifungal, agentes de absorção e retardamento, e similares, compatí-veis com administração farmacêutica. Os materiais que podem servir comoveículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a,açúcares, tais como lactose, glicose e sacarose, amidos, tais como amido demilho e amido de batata; celulose e seus derivados, tais como sódio carbo-ximetil celulose, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte,gelatina; talco; excipientes, tais como manteiga de cacau e ceras de suposi-tório; óleos, tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleode girassol; óleo de gergelim; óleo de oliva; óleo de milho e óleo de soja;glicóis, tal como propileno glicol; ésteres, tais como etil oleato e etil laurato;agar; agentes de tamponamento, tais como hidróxido de magnésio e hidróxi-do de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; solução salina isotô-nica; solução de Ringer; álcool etílico, e soluções tampão de fosfato, bemcomo outros lubrificantes não-tóxicos, tais como Iauril sulfato de sódio e es-tearato de magnésio, bem como agentes colorantes, agentes de liberação,agentes de revestimento, agentes de adoçamento, agentes aromatizantes, eagentes perfumantes, conservantes, e antioxidantes, podem estar presentesna composição, de acordo com o julgamento do formulador (vide tambémRemington1S Pharmaceutical Sciences, Décima Quinta Edição, E. W. martin(Mack Publishing Co., Easton PA, 1975)). Por exemplo, o produto de antíge-no de vacina pode ser provido como uma composição farmacêutica por meiode processos convencionais de produção de granulação por mistura, disso-lução, liofilização, ou processos similares.
Componentes adicionais de vacina
As vacinas da invenção podem incluir adicionalmente qualqueradjuvante adequado para aumentar a imugenicidade da vacina quando ad-ministrada a um indivíduo. Por exemplo, tal(is) adjuvante(s) pode(m) incluir,sem limitação, extratos de Quillaja saponaria (QS), incluindo subtrações puri-ficadas de grau de alimentação QS, tais como Quil A e QS-21, alum, hidróxi-do de alumínio, fosfato de alumínio, MF59, Malp2, adjuvante de Freund in-completo; adjuvante de Freund completo; lipídeo A 3 De-O-monofosforil aci-latado (3D-MPL). Adjuvantes adicionais podem incluir oligonucleotídeos i-munomodulatórios, por exemplo, seqüência CpG não-metilatada conformedescrito em WO 96/02555. Combinações de adjuvantes diferentes, tais co-mo aquelas mencionadas aqui acima, são contempladas como proporcio-nando um adjuvante que é um estimulador preferencial de resposta de célulaTH1. Por exemplo, QS21 pode ser formulado junto com 3D-MPL. A razão deQS21:3D-MPL será tipicamente na ordem de 1:10 a 10:1; 1:5 a 5:1; e fre-qüentemente substancialmente 1:1. Em algumas concretizações, a faixa deenergia ótima é 2,5:1 a 1:1 3D-MPLQS21. Doses de extratos de QS purifi-cados para uso em uma formulação de vacina humana são de 0,01 mg a 10mg por quilograma de peso corpóreo.
Deve ser notado que certas proteínas termoestáveis (por exem-plo, lichenase) podem demonstrar atividade de potencialização de imunor-resposta, tal que o uso de tal proteína se em uma fusão com um antígeno deHPV ou separadamente pode ser uso considerado de um adjuvante. Dessemodo, as composições de vacina da invenção podem adicionalmente com-preender um ou mais adjuvantes. Certas composições de vacina podemcompreender dois ou mais adjuvantes. Além disso, dependendo da formula-ção e rotas de administração, certos adjuvantes podem ser desejados emformulações e/ou combinações particulares.
Em certas situações, pode ser desejável prolongar o efeito deuma vacina da invenção pelo abaixamento da absorção de um ou maiscomponentes do produto de vacina (por exemplo, proteína) que é subcutâ-nea ou intramuscularmente injetada. Isto pode ser efetuado pelo uso de umasuspensão líquida de material cristalino ou amorfo com solubilidade pobreem água. A taxa de absorção do produto então depende de sua taxa de dis-solução, que, por sua vez, pode depender do tamanho e forma. Alternativaou adicionalmente, absorção retardada de um produto parenteralmente ad-ministrado por dissolução ou suspensão do produto em um veículo de óleo.Formas de depósito injetáveis são produzidas pela formação de matrizes demicrocápsulas da proteína em polímeros biodegradáveis, tais como polilacti-de-poliglicolide. Dependendo da razão de produto para polímero e da natu-reza do polímero particular empregada, a taxa de liberação pode ser contro-lada. Exemplos de polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e po-li(anidridos). Formulações injetáveis de depósito podem ser preparadas porencerramento do produto em Iipossomos ou microemulsões, que são com-patíveis com os tecidos do corpo. Veículos de distribuição poliméricos alter-nativos podem ser usados para formulações orais. Por exemplo, polímerosbiocompatíveis biodegradáveis, tais como etileno vinil acetato, polianidridos,ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico, etc., podemser formulados como micropartículas, por exemplo, em combinação com umveículo de distribuição polimérico.
Preparações enteralmente administradas de antígenos de vaci-na podem ser introduzidas na forma sólida, semi-sólida, de suspensão e deemulsão, e podem ser compostas com quaisquer veículos farmaceuticamen-te aceitáveis, tais como água, agentes de suspensão, e agentes emulsifican-tes. Os antígenos podem ser administrados por meio de bombas ou formasde liberação sustentada, especialmente quando administrados como umamedida preventiva, de modo a prevenir o desenvolvimento de doença em umindivíduo, ou para melhorar ou retardar doença estabelecida. Compostosativos suplementares, por exemplo, compostos independentemente ativoscontra a doença ou condição clínica a ser tratada, ou compostos que aumen-tam a atividade de um composto da invenção, podem ser incorporados emou administrados com as composições. Agentes aromatizantes e colorantespodem ser usados.
Os produtos de vacina da invenção, opcionalmente juntos comtecido de planta, são particularmente bem adequados para administraçãooral como composições farmacêuticas. Formulações líquidas orais podemser usadas e podem ser de utilidade particular para populações pediátricas.O material de planta colhido pode ser processado em qualquer de uma vari-edade de modos (por exemplo, secagem a ar, secagem por congelamento,extração, etc.), dependendo das propriedades do produto terapêutico dese-jado e sua forma desejada. Tais composições conforme descritas acima po-dem ser ingeridas oralmente somente, ou ingeridas com alimento ou alimen-tação, ou com uma bebida. As composições para administração oral incluemplantas; extração das plantas, e proteínas purificadas de plantas infectadasprovidas como pós secos, produtos alimentícios, solventes aquosos ou não-aquosos, suspensões ou emulsões. Exemplos de solventes não-aquosossão propileno glicol, polietileno glicol, óleo vegetal, óleo de peixe, e ésteresorgânicos injetáveis. Veículos aquosos incluem água, soluções de água-álcool, emulsões ou suspensões, incluindo solução salina e veículos paren-terais mediais tamponados, incluindo solução de cloreto de sódio, soluçãode dextrose de Ringer, solução de dextrose mais cloreto de sódio, soluçãode Ringer contendo lactose, ou óleos fixados,..Exemplos de pós secos inclu-em qualquer biomassa de planta que foi sécadá, por exemplo, secada porcongelamento, secada em ar, ou secada por pulverização. Por exemplo, asplantas podem ser secadas a ar por colocação das mesmas em um secadorde ar comercial a cerca de 48 0C (120 graus Fahrenheit) até que a biomassacontenha menos do que 5% de umidade em peso. As plantas secas são ar-mazenadas para processamento adicional como sólidos de massa, ou adi-cionalmente processadas por moagem a um pó de tamanho de malha dese-jado. Alternativa ou adicionalmente, secagem por congelamento pode serusada para produtos que são sensíveis a secagem por ar. Os produtos po-dem ser secados por congelamento pela colocação dos mesmos em um se-cador a vácuo, e secados congelados sob um vácuo até que a biomassacontenha menos do que 5% de umidade por peso. O material seco pode seradicionalmente processado conforme descrito aqui.
O material derivado de planta pode ser administrado como, umjunto com uma ou mais preparações herbáceas. Alguns exemplos de prepa-rações herbáceas incluem tinturas, extratos (por exemplo, extratos aquosos,extratos de álcool), decocções, preparações secas (por exemplo, secadas aar, secadas por pulverização, ou secadas por congelamento), pós, (por e-xemplo, pó liofilizado), e líquido. Preparações herbáceas podem ser providasem qualquer veículo de distribuição padrão, tais como uma cápsula, com-primido, supositório, dosagem líquida, etc. Aqueles técnicos no assunto a-preciarão as várias formulações e modalidades de distribuição de prepara-ções herbáceas que podem ser aplicadas a presente invenção.
As linhas de raiz, linhas de células, plantas, extrações, pós, pre-parações secas e proteína purificada ou produtos de ácido nucléico, etc. dainvenção podem estar na forma encapsulada com ou sem um ou mais exci-pientes conforme notado acima. Formas de dosagem sólidas, tais comocomprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadascom revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos, revesti-mentos de liberação controlada, e outros revestimentos bem-conhecidos natécnica de formulação farmacêutica. Em tais formas de dosagem sólida oagente ativo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte, tal co-mo sacarose, Iactose ou amido. Tais formas de dosagem podem compreen-der, conforme é prática normal, substâncias adicionais outras do que diluen-tes inertes, por exemplo, lubrificantes de comprimido e outros auxiliares decomprimido, tais como um estearato de magnésio e celulose microcristalina.No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podemcompreender agentes de tamponamento. Elas podem opcionalmente conteragentes de opacidade, e podem ser de uma composição que elas liberamo(s) ingrediente(s) ativo(s) somente, em uma certa parte do trato intestinal,e/ou em uma maneira retardada. Exemplos de composições de encrustaçãoque podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.
Em alguns métodos, uma planta ou porção desta expressandoum antígeno de gripe de acordo com a presente invenção, ou biomassa des-tas, é administrada oralmente como alimento medicinal. Tais composiçõescomestíveis são tipicamente consumidas como produto em bruto de comer,se em uma forma sólida, ou por bebida, se na forma líquida. O material deplanta pode ser diretamente ingerido sem uma etapa de processamento an-terior, ou após preparação culinária mínima. Por exemplo, a proteína de va-cina pode ser expressa em um broto que pode ser comido diretamente. Porexemplo, antígenos de vacina podem ser expressos em um broto de alfafa,broto de munguba, ou broto de espinafre, ou broto de folha de alface, etc.Em uma concretização, a biomassa planta pode ser processada, e o materialrecuperado após a etapa de processamento é ingerido.
Métodos de processamento úteis de acordo com a presente in-venção são métodos comumente usados na indústria de alimento e de ali-mentação. Os produtos finais de tais métodos incluem tipicamente umaquantidade substancial de um antígeno expresso, e podem ser convenien-temente comidos ou bebidos. O produto final pode ser misturado com outroalimento ou formas de alimentação, tais como sais, veículos, intensificadoresde sabor, antibióticos, e similares, e consumidos na forma sólida, semi-sólida, de suspensão, de emulsão, ou líquida. Tais métodos podem incluiruma etapa de conservação, tal como, por exemplo, pasteurização, cozimen-to, ou adição de agentes de conservação e de preservação. Qualquer plantapode ser usada e processada na presente invenção para produzir matéria deplanta comível ou bebível. A quantidade de antígeno de HPV em uma prepa-ração derivada de planta pode ser testada por métodos padrão na técnica,por exemplo, eletroforese de gel, ELISA, ou análise de mancha de Western,usando-se uma sonda ou anticorpo específico para o produto. Esta determi-nação pode ser usada para padronizar a quantidade de proteína de antígenode vacina ingerida. Por exemplo, a quantidade de antígeno de vacina podeser determinada e regulada, por exemplo, por mistura de bateladas de pro-duto tendo níveis eficientes de produto de modo que a quantidade de mate-rial a ser bebida ou comida para ingerir uma dose simples pode ser padroni-zada. O ambiente regulável contido da presente invenção, contudo, deveminimizar a necessidade de efetuar tais procedimentos de padronização.
Uma proteína de vacina produzida em uma planta e comida porum indivíduo pode ser preferivelmente absorvida pelo sistema digestivo.Uma vantagem da ingestão de tecido de planta que tenha sido apenas mi-nimamente processado é proporcionar encapsulamento ou seqüestro da pro-teína em células da planta. Desse modo, o produto pode receber pelo menosalguma proteção de digestão no trato digestivo superior antes de alcançar ointestino, e uma proporção mais alta de produto ativo seria disponível parapercepção.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem seradministradas terapeuticamente ou profilaticamente. As composições podemser usadas para tratar ou prevenir uma doença. Por exemplo, qualquer indi-víduo que sofre de uma doença, ou que está em risco de desenvolver infec-ção de gripe, pode ser tratado. Será apreciado que um indivíduo pode serconsiderado em risco de desenvolver uma doença sem ter sido diagnostica-do com quaisquer sintomas da doença. Por exemplo, se o indivíduo é co-nhecido como tendo sido, ou para ser pretendido para estar em situaçõescom risco relativamente alto de exposição à infecção de gripe, este indivíduoserá considerado em risco de desenvolver a doença. Similarmente, se mem-bros de uma família de indivíduos, amigos ou parentes foram diagnosticadoscom infecção de gripe, o indivíduo pode ser considerado estar em risco dedesenvolver a doença.
As formas de dosagem líquida para administração oral incluem,mas não estão limitadas a, emulsões farmaceuticamente aceitáveis, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires. Em adição aos agentesativos, as formas de dosagem líquida podem conter diluentes inertes comu-mente usados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros solventes,agentes de solubilização e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool i-sopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool de benzílico, benzoatode benzílico, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos (emparticular, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de milho,óleo de germe, óleo de oliva, óleo de rícino, e óleo de gergelim), glicerol,tetrahidrofurfurílico álcool, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sor-bitan, e misturas destes. Além dos diluentes inertes, as composições oraispodem incluir adjuvantes, tais como agentes de umedecimento, agentesemulsificantes e agentes de suspensão, agentes adoçantes, aromatizantes ede perfume.
As composições para administração retal ou vaginal podem sersupositórios ou enemas de retenção, que podem ser preparados pela mistu-ra das composições desta invenção com excipientes ou veículos não-irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietileno glicol, ou umacera de supositório que são sólidos à temperatura ambiente, mas líquidos natemperatura do corpo e, portanto, derretem no reto ou cavidade vaginal, eliberam a proteína ativa.
As formas de dosagem para administração tópica ou transder-mal de uma composição de vacina desta invenção incluem ungüentos, pas-tas, cremes, loções, géis, pós, soluções, pulverizações, inalantes ou emplas-tros. O agente ativo, ou preparação deste, é misturado sob condições esté-reis com um veículo farmaceuticamente aceitável e quaisquer conservantesou tampões necessários conforme podem ser requeridos. Para administra-ção transmucosal ou transdermal, penetrantes apropriados à barreira a serpermeada podem ser usados na formulação. Tais penetrantes são geral-mente conhecidos na técnica, por exemplo, para administração transdermal,detergentes, sais de bile, e derivados ácidos fusídicos. A administraçãotransmucosal pode ser acompanhada através do uso de pulverizações na-sais ou supositórios. Para administração transdermal, antígeno, ou uma por-ção imunogênica deste, podem ser formulados em ungüentos, pomadas,géis ou cremes, conforme geralmente conhecidos na técnica. Formulaçãooftálmica, gotas no ouvido e gotas no olho são também contempladas comoestando dentro do escopo desta invenção. Adicionalmente, a presente in-venção contempla o uso de emplastros transdermais, que têm a vantagemadicional de proporcionar distribuição controlada de uma proteína de vacinaao corpo. Tais formas de dosagem podem ser produzidas por suspensão oudispensa do produto de vacina no meio correto. Intensificadores de absorçãopodem serem usados para aumentar o fluxo da proteína de vacina atravésda pele. A taxa pode ser controlada, ou pela provisão de uma membrana decontrole de taxa, ou pela dispersão da proteína de vacina em uma matriz depolímero ou gel.
As composições da invenção são administradas em tais quanti-dades e por tal tempo conforme é necessário para alcançar o resultado de-sejado. Em certas concretizações da presente invenção, uma "quantidadeterapeuticamente eficaz" de uma composição farmacêutica é aquela quanti-dade eficaz para tratamento, atenuação, ou prevenção de uma doença emum indivíduo. Desse modo, a "quantidade eficaz para tratar, atenuar ou pre-venir doença", conforme usado aqui, se refere a uma quantidade não-tóxica,mas suficiente, da composição farmacêutica para tratar, atenuar ou prevenirdoença em qualquer indivíduo. Por exemplo, a "quantidade terapeuticamen-te eficaz" pode ser uma quantidade para tratar, atenuar ou prevenir infecção(por exemplo, infecção viral, infecção de gripe), etc.
A quantidade exata requerida variará de indivíduo para indiví-duo, dependendo da espécie, idade e condições gerais do indivíduo, do es-tágio da doença, a mistura farmacêutica particular, seu modo de administra-ção, e similares. Antígenos de anthrax da invenção, incluindo antígeno(s)que expressa(m) plantas e/ou preparações destes, podem ser formuladosem forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uni-formidade de dosagem. A expressão "forma de unidade de dosagem", con-forme aqui usada, se refere a uma unidade fisicamente distinta de composi-ção de vacina apropriada para o paciente a ser tratado. Será compreendido,contudo, que o uso diário total das composições da presente invenção é tipi-camente decidido por um médico atendente dentro do escopo do julgamentomédico. O nível de dose terapeuticamente eficaz específico para qualquerpaciente particular ou organismo pode depender de uma variedade de fato-res, incluindo a severidade ou risco de infecção; a atividade do compostoespecífico empregado; a composição específica empregada; a idade, pesocorpóreo, saúde geral, sexo do paciente, dieta do paciente, condições far-macocinéticas do paciente, o tempo de administração, rota de administra-ção, e taxa de excreção do composto específico empregado; a duração dotratamento; drogas usadas em combinação ou coincidental com a composi-ção de vacina empregada; e fatores similares bem-conhecidos nas técnicasmédicas.
Será apreciado que as composições farmacêuticas da presenteinvenção podem ser empregadas em terapias de combinação (por exemplo,combinação de terapias de combinação), isto é, as composições farmacêuti-cas podem ser administradas concorrentemente com, antes de, ou subse-qüente a, um ou mais outros procedimentos de vacinação desejados. Acombinação particular de terapias (por exemplo, vacinas, tratamento tera-pêutico de infecção de gripe) para empregar em um regime de combinaçãolevará em conta compatibilidade dos terapêuticos e/ou procedimentos dese-jados, e o efeito terapêutico desejado a ser alcançado. Será apreciado queas terapias e/ou vacinas empregadas podem alcançar um efeito desejadopara a mesma enfermidade (por exemplo, um composto da invenção podeser administrado concorrentemente com outra vacina de gripe), ou eles po-dem alcançar efeitos diferentes.
Em certas concretizações, as composições de vacina compre-endem pelo menos dois antígenos de gripe. Por exemplo, certas composi-ções de vacina podem compreender pelo menos dois antígenos da invenção(por exemplo, um domínio de HA e um domínio NA contendo antígeno dainvenção). Em alguns aspectos, tal combinação de vacinas pode incluir umaproteína de fusão termoestável compreendendo antígeno de gripe; em al-guns aspectos, duas ou mais proteínas de fusão termoestáveis compreen-dendo antígeno de gripe são providas.
Onde combinações de vacina são utilizadas, será compreendidoque qualquer combinação de antígenos de gripe pode ser usada para taiscombinações. Composições podem incluir antígenos de gripe múltiplos, in-cluindo antígenos múltiplos aqui providos. Além disso, composições podemincluir um ou mais antígenos aqui providos com um ou mais antígenos adi-cionais. Combinações de antígenos de gripe incluem antígenos de gripe de-rivados de um ou mais vários subtipos ou cepas, tal que imunização confereresposta imune contra mais do que um tipo de infecção. Combinações deantígeno de gripe podem incluir pelo menos um, pelo menos dois, pelo me-nos três, pelo menos quatro ou mais antígenos derivados de subtipos oucepas diferentes. Em algumas combinações, pelo menos dois ou pelo me-nos três antígenos de subtipos diferentes são combinados em uma composi-ção de vacina. Além disso, combinações de vacina podem utilizar antígenode gripe e antígeno de um ou mais agentes infecciosos únicos.
Kits
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um envoltórioou kit farmacêutico incluindo antígenos de gripe de acordo com a presenteinvenção. Em certas concretizações, os envoltórios ou kits farmacêutico in-cluem brotos germinados vivos, entidade clonal ou plantas que produzemum antígeno de gripe de acordo com a invenção, ou preparações, extratos,ou composições farmacêuticas contendo vacina em um ou mais recipientespreenchidos com opcionalmente um ou mais ingredientes adicionais decomposições farmacêuticas da invenção. Em algumas concretizações, en-voltórios farmacêuticos ou kits incluem composições farmacêuticas compre-endendo antígeno de gripe purificado de acordo com a presente invenção,em um ou mais recipientes opcionalmente preenchidos com um ou mais in-gredientes adicionais de composições farmacêuticas da invenção. Em certasconcretizações, o envoltório farmacêutico ou kit inclui um agente terapêuticoaprovado adicional (por exemplo, antígeno de gripe, vacina de gripe) parauso como uma terapia de combinação. Opcionalmente associado com tal(is)recipiente(s) pode estar um aviso na forma prescrita por uma agência gover-namental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos,com avisos que refletem aprovação pela agência de fabricação, uso ou ven-da para administração humana.
Os kits são providos que incluem reagentes terapêuticos. Comoum exemplo, mas não limitativo, vacina de gripe pode ser provida como for-mulações orais e administradas como terapia. Alternativa ou adicionalmente,a vacina de gripe pode ser provida em uma formulação injetável para admi-nistração. Em algumas concretizações, a vacina da gripe pode ser providaem uma formulação inalável para administração. Doses farmacêuticas ouinstruções, portanto, podem ser providas no kit para administração a um in-divíduo que sofre de, ou está em risco de infecção de gripe.
Os exemplos representativos que se seguem são pretendidospara ajudar a ilustrar a invenção, e não são pretendidos para, nem devemser construídos para limitar o escopo da invenção. De fato, várias modifica-ções da invenção e muitas concretizações adicionais destas, em adição à-quelas mostradas e descritas aqui, tornar-se-ão aparentes àqueles técnicosno assunto a partir dos conteúdos totais deste documento, incluindo os e-xemplos que se seguem e as referências à literatura científica e de patenteaqui citada. Os exemplos seguintes contêm informação, exemplificação eguia, que podem ser adaptadas à prática desta invenção em suas váriasconcretizações, e os equivalentes destas.
Exemplificação
Exemplo 1. Geração de Constructo Candidatas de Vacina
Geração de seqüências de antígeno de vírus hemaalutininaSeqüências de nucleotídeo que codificam domínio de haste deHA (SD) 1-2 e domínio globular de HA (GD) 3 de cada de vírus de gripe tipoVietnam H5N1 e Wyoming H3N2 foram sintetizadas e confirmadas comosendo corretas. O ácido nucléico produzido foi digerido com endonucleasesde restrição Bglll/Hindlll, locais para quais foram projetados em qualquerextremidade de domínios de codificação de seqüência. Os fragmentos deDNA resultantes foram fundidos em seqüência que codifica uma moléculaveículo termoestável projetada.
HA Vietnam ΓΗ5ΝΠ
(Domínio SD 1-2): HA1_2V: (SEQ ID N0.:19)
AGATCTGATCAAATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTG G ATAC A ATTATG G AG AAG AACGTG ACTGTTACTCACG CTCAG G ATATTCTTG A AAAG ACTCACAACG G A AAGTTG GG AG G AG G AAACACTAAGTG CC AG ACTCC AATG G G AGCTATTAACTCTTCTATGCC ATTCCAC AAC ATTCACCCACTTACTATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCACAAAGAGAGAGGAGAAGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATG G C AAG G AATG GTTG ATG G ATGGTACG G ATACC ATCACTCTAATG AGCAGGGATCTGGATATGCTGCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTAACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAGTTCAACAATCTTGAGAGGAGGATTGAGAACCTT AACAAGAAAATGGAGGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACAACGCTGAGCTTCTTGTGCTTATGGAGAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAGGAGCTTGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGAT AATGAGTGCATGGAGTCTGTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGACTTAAGAGGGAGGAGATTTCTGGAGTG AAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATT AAGCTT(Domínio SD 1-2): HA1_2V: (SEQ ID N0.:20)DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLNTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERT
LDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTY
DYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI
(Domínio GD 3): HA3V: (SEQ ID NO.:21)AGATCTTGCGATCTTGATGGAGTGAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGCTTCTTGGAAACCCAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAACCCAGTGAACGATCTTTGTTACCCAGGAGATTTCAACGATTACGAGGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAAGTCATCTTG GTC ATCTC ACG AG G CTTCTCTTG G AGTTTCTTCTGCTTG CCC ATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAGGATCTTCTTGTGCTTTGGGGAATTCACCATCCAAATGATGCTGCTGAGCAG ACTAAGTTGTACC AG AACCC AACTACTTAC ATTTCTGTG G G AACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAATCTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGAGATTCTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAAGCTT(Domínio GD 3): HAV3: (SEQ ID NO.:8)
CDLDG VKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC
(comprimento total): HAS_V: (SEQ ID NO.:22)GG ATCC ATTA ATTAAAATG G G ATTCGTGCTTTTCTCTC AG CTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGTCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTGATCAAATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAGAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTGCGATCTTGATGGAGTGAAG CC ACTTATTCTTAG G G ATTGCTCTGTTGCTG G ATG G CTTCTTG G A AACCCAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAACCCAGTTAATGATCTTTGCTACCCAGGAGATTTCAACGATTACGAGGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAAGTCATCTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATT AAGAGGTCTTAC AACAAC ACTAACC AG GAG G ATCTTCTTGTG CTTTG G G G AATTC ACCATCCAAATGATGCTGCTGAGCAGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAATCTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGAGATTCTACT ATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGTGCCAAACTCCAATGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTG CTTG CTACTG G ACTTAG G A ATTCTCC AC A AAG AG AG AG G AG AAGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGC AAG G AATG GTTG ATGG ATG GTACG G ATACCATCACTCTAATG AGCAGGGATCTGGATATGCTGCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTAACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAGTTCAACAATCTTGAGAGGAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTACAACGCTGAGCTTCTTGTGTTGATGGAGAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAGGAGCTTGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAATGAGTGCATGGAGTCTGTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGACTTAAGAGGGAGGAGATTTCTGGAGTGAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTCACCATCACCATCACCACAAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTCHA A/Wyoming (H3N2)(Domínio SD 1-2): HA1_2V: (SEQ ID NO.:23)AGATCTCAAAAGTTGCCAGGAAACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCT
TGGACATCACGCTGTTCCAAACGGAACTATTGTGAAAACTATTACTAACG
ATCAGATTGAGGTGACAAACGCTACTGAGCTTGTTCAGTCATCTTCTACT
GGAGGAATTGGAGGAGGAAACTCTGAGTGCATTACACCTAATGGATCTA
TTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGATTACTTATGGAGC
TTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAATG
AGGAATGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCT
GGATTCATTGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGA
TTCAGGCATCAGAATTCTGAGGGAACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGT
CTACTC AG GCTG CTATTAACC AG ATTAACG G AAAGTTG AAC AGG CTTATT
GGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCTGAG
GTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAG
ATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCA
GCACACT ATTGATCTTACTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGG
ACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCTGAGGATATGGGAAATGGATGC
TTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTGAGTCTATTAGGAA
CGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTAACAACAGG
TTCC AG ATTAAG G G AGTG G AGCTTAAGTCTG G ATAC AAG G ATTG G ATTC
TTAAGCTT
(Domínio SD 1-2): HA1_2: (SEQ ID NO.:24)QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGINSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGAC PRYVKQNTLKLATGMRmPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL
(Domínio GD 3): HA3W: (SEQ ID NO.:25)QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGINSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACP/?yW<O/\/TLKM7GMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL
(Domínio GD 3): HA3W: (SEQ ID NO.:12)
CDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNC VPVD1/PDV4SLRSLVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEKFDKLYIWGVHHPVTDSDQISLY AQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKC
(comprimento total): HASW: (SEQ ID NO.:26)GGATCCATTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGTCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAAGTTGCCAGGAAACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTTGGACATCACGCTGTTCCAAACGGAACTATTGTGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAAACGCTACTGAGCTTGTTCAGTCATCTTCTACTGGAGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATGGAGAGAACTGCACTCTTATTGATGCTCTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTGGAAAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAGGAGTCTTGTGGCTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTTCAACTGGGCTGGAGTTACTC AG AACG G AACTTCTTCTG CTTGTAAG AG G AG GTCTAAC AAGTCTTTCTTCTCTAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTTAACGTGACTATGCCAAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCACCCAGTTACTGATTCTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAG GCTTCTG G AAG G ATTACTGTGTCTACTAAG AG GTCTC AGC AG ACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGAGGGATATTTCTTCTAGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTCTT ATTAA
CTCT ACTG G A A ACCTT ATTG CTCC A AG G G G ATACTTC A AG ATTAG GAGT
GGAAAGTCATCTATTATGAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAACT
CTGAGTGCATTACTCCAAACGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCA
GAACGTGAACAGGATTACTTATGGAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAG
AACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAATGAGGAATGTGCCAGAGAAGCAGA
CTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCACCAGAATTCAGAGGGAACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAACGGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATTTGACTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGCTGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTGAGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTAACAACAGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTG G ATACAAG G ATTG G ATTCTTC ATGATCACC ACC ACCAC AAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTC
Geração de seqüências de antígeno de neuraminidase de vírusde gripe
Seqüências de nucleotídeo que codificam neuraminidase de ca-da de vírus de gripe tipo Vietnam H5N1 (NAV) e Wyoming H3N2 (NAW) fo-ram sintetizadas e confirmadas como sendo corretas. O ácido nucléico pro-duzido foi digerido com endonucleases de restrição Sall, locais para quaisforam projetados em qualquer extremidade de domínios de codificação deseqüência. Os fragmentos de DNA resultantes foram fundidos na estruturano terminal C em seqüência que codifica uma molécula veículo termo-estável projetada.
NAV(N1): (SEQ ID NO.:27)GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGTCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAATGTCGACCTTATGCTTCAGATTGGAAACATGATTTCTATTTGGGTGTCACACTCTATTCACACTGGAAACCAGCATCAGTCTGAGCCAATTTCTAACACTAACCTTTTGACTGAGAAGGCTGTGGCTTCTGTT AAGTTGGCTGGAAACTCTTCTCTTTGCCCTATTAACGGATGGGCTGTGTACTCTAAGGATAACTCTATTAGGATTGGATCTAAGGGAGATGTGTTCGTGATTAGGGAGCCATTCATTTCTTGCTCTCACCTTGAGTGCCGTACTTTCTTCCTTACTCAGGGTGCTCTTCTTAACGATAAGCACTCTAACGGAACTGTGAAGGATAGGTCTCCACACAGGACTCTTATGTCTTGTCCAGTTGGAGAAGCTCCAT
CTCCATACAACTCTAGATTCGAGTCTGTTGCTTGGAGTGCTTCTGCTTG
CCATGATGGAACTTCATGGCTTACTATTGGAATTTCTGGACCAGATAAC
GGAGCTGTTGCTGTGCTTAAGTACAACGGAATTATTACTGATACCATCAA
GTCTTGGAGGAACAACATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGCTTGC
GTTAACGGATCTTGCTTCACTGTGATGACTGATGGACCATCTAATGGAC
AGGCTTCTCACAAGATTTTCAAGATGGAGAAGGGAAAGGTTGTGAAGTC
TGTGGAACTTGATGCTCCAAACTACCATTACGAGGAGTGTTCTTGCTAT
CCAGATGCTGGAGAGATTACTTGTGTGTGCCGTGATAATTGGCATGGAT
CTAAC AG GCC ATG G GTGTC ATTC AATC AG AACCTTG AGTACC AG ATTG G
TTACATTTGCTCTGGAGTGTTCGGAGATAATCCAAGGCCAAACGATGGA
ACTGGATCTTGTGGACCAGTGTCATCTAATGGAGCTGGAGGAGTGAAG
G G ATTCTCTTTCA AGTACG G AAACG G AGTTTG G ATTG G AAG G ACTAAGT
CTACTAACTCTAGGAGTGGATTCGAGATGATTTGGGACCCAAACGGATG
GACTGAGACTGATTCTTCTTTCTCTGTGAAGCAGGATATTGTGGCTATTA
CTGATTGGAGTGGATACTCTGGATCTTTCGTTCAGCACCCAGAGCTTAC
TG G ACTTG ATTGC ATTAGG CC ATGCTTCTG G GTTG AACTTATTAG GGGA
AG G CC AAAG G AGTCTACTATTTGG ACTTCTGG ATCTTCTATTTCTTTCTG
CGGAGTGAATTCTGATACTGTGGGATGGTCTTGGCCAGATGGAGCTGA
GCTTCCATTCACTATTGATAAGGTCGACCATCATCATCATCACCACAAGG
ATGAGCTTTGACTCGAG
NAV: (SEQ ID Ν0.:16)LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
NAW(N2): (SEQ ID NO.:28)GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTT
CCTTCTTGTGTCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCG
TGCTCAAAATGTCGACAAGCAGTACGAGTTCAACTCTCCACCAAACAAC
CAGGTTATGCTTTGCGAGCCAACTATTATTGAGAGGAACATTACTGAGA
TTGTGTACCTTACTAACACTACTATTGAGAAGGAGATTTGCCCAAAGTTG
GCTGAGTACCGTAATTGGTCTAAGCCACAGTGCAACATTACTGGATTCG
CTCC ATTCTCTAAGG ATAACTC AATTAG G CTTTCTGCTG G AG G AG ATATT
TGGGTTACAAGGGAGCCATACGTTTCTTGCGATCCAGATAAGTGCTACC
AGTTCGCTCTTGGACAAGGAACTACTCTTAACAACGTGCACTCT AACGA
TACTGTGCACGATAGGACTCCATACCGTACTCTTTTGATGAACGAGCTT
GGAGTTCCATTCCACCTTGGAACTAAGCAAGTGTGCATTGCTTGGTCAT
CTTCATCTTGCCACGATGGAAAGGCTTGGCTTCATGTTTGCGTGACTGG
AGATGATGAGAACGCTACTGCTTCTTTCATCTACAACGGAAGGCTTGTG
GATTCT ATTGTTTCTTGGTCTAAGAAGATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGA
GTGTGTGTGCATTAACGGAACTTGCACTGTGGTTATGACTGATGGATCT
GCTTCTGGAAAGGCTGATACAAAGATTCTTTTCATTGAGGAGGGAAAGA
TTGTGCACACTTCTACTCTTTCTGGATCTGCTCAGCATGTTGAGGAGTGT
TCTTGCTACCCAAGGTATCCAGGAGTTAGATGTGTGTGCCGTGATAACT
GGAAGGGATCTAACAGGCCAATTGTGGATATT AACATT AAGGATTACTC
TATTGTGTC ATCTTATGTGTG CTCTG G ACTTGTTG G AG ATACTCCAAG G A
AGAACGATTCTTCTTCATCTTCACACTGCCTTGATCCAAATAACGAGGAG
GGAGGACATGGAGTTAAGGGATGGGCTTTCGATGATGGAAACGATGTT
TGGATGGGAAGGACTATTTCTGAGAAGTTGAGGAGCGGATACGAGACT
TTCAAAGTGATTGAGGGATGGTCTAACCCAAATTCTAAGCTGCAGATTAA
CAGGCAAGTGATTGTGGATAGGGGAAACAGGAGTGGATACTCTGGAAT
TTTCTCTGTGGAGGGAAAGTCTTGCATTAACAGATGCTTCTACGTGGAG
CTTATTAGGGGAAGGAAGCAGGAGACTGAGGTTTTGTGGACTTCTAACT
CTATTGTG GTGTTCTGCG G A ACTTCTG G AACTTACG G A ACTG G ATCTTG
GCCAGATGGAGCTGATATTAACCTTATGCCAATTGTCGACCATCATCAC
CATCACCACAAGGATGAGCTTTGACTCGAG
NAW: (SEQ ID NO.: 18):
KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
Geração de construto de veículo termoestável
C. thermocellum lichenase, LicB1 nativa de comprimento total,consiste seqüencialmente de um peptídeo guia (Lp)1 uma porção N-terminal(A), um laço superficial (I), uma porção terminal-C (C), uma caixa Pro-Thr, eum domínio de ligação de celulossomo (C-BD). Removeu-se as seqüênciasde codificação Lp, caixa Pro-Thr e C-BD a partir do gene que codifica LicB,circularmente permutou-se a molécula para inverter os terminais NeC (Mu-siychuk, et al., 2007, Influenza and Other Respiratory Viruses, 1:1), e incor-porou-se locais de endonuclease de restrição únicos para clonagem de se-qüências-alvo nos novos terminais N e C, bem como no laço superficiais (I).A seqüência de molécula veículo projetada resultante foi verificada, e é de-signada LicKM.
SEQ ID NO.: 29:
GGATCCTTAATTAAAATGGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGG ATACTACTAAG GTTC AATTC AACTGGTATA AG AATG GTGTTG GTG G AAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTT I IATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATG A ATCTTTG G CC AG G A ATTG GTGTTG ATG AATG G CTTG GTAG ATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATT ATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTAC Illll CTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCAT TGACTCG AGCTC
SEQ ID Ν0.:30:
MGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHH
Para certos constructo, projetou-se um peptídeo de sinal PR1a eseqüência KDEL nos terminais N e C de LicKM. O ácido nucléico e seqüên-cia de aminoácidos destes constructos são mostrados em SEQ ID NO:31 e
SEQ ID NO:32.
SEQ ID NO.:31:
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTTCTTGTCTCTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCCAAAATGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATAAGGATGAACTTTGACTCGAGCTCSEQ ID NO.: 32:
MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLWNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHHKDEL
Geração de constructo de antíqeno recombinante
Usou-se vetores de expressão pET, derivados de plasmídeopBR322, projetados para levar vantagem das características do gene bacte-riófago 17 10 que promove transcrição e translação em alto nível. O bacteri-ófago que codifica polimerase de RNA é altamente específico para as se-qüências de promotor 17, que são raramente encontradas em genomas ou-tros do que genoma de fagos 17 (figura 2). pET-32 foi usado para fusão dosconstructo HA e NA na região de laço de uma seqüência de Iichenase modi-ficada que tinha sido clonada neste vetor. O domínio catalítico do gene deIichenase com seqüência PR-1A a montante ("Proteína 1A Relacionada àPatogenia"), com um retículo endoplasmático (KDEL), ou uma seqüência deretenção vacuolar (VAC) e uma etiqueta His6 a jusante, foram clonados en-tre os locais Pacl e Xholl em um vetor pET-32 modificado (em que a regiãoentre o promotor E7 e o terminador 17 foi excizada). Desse modo, o pET-PRACS-LicKM-KDEL e pET-PRACS-LicKM-VAC foram obtidos (figura 3).
O domínio de HA de fragmento de DNA ou NA foi subclonado naporção de laço (I) de LicKM para dar uma fusão na estrutura de leitura corre-ta para translação. Fusões de LicKM-NA foram construídas. O fragmento deDNA de NAW ou NAV foi subclonado no terminal C de LicKM usando umlocal Sall para dar uma fusão na estrutura de leitura correta para translação.
Exemplo 2. Geração de Vetores de Antígeno Candidato de Vacina
Constructo de antígeno-alvo LicKM-HA(SD), LicKM-HA(GD), ouLicKM-NA foram individualmente subclonadas no vetor viral escolhido (pBI-D4). pBI-D4 é um vetor binário derivado de pBI121 no qual o gene relatorque codifica para E. coli β-D-glucoronidase (GUS) foi substituído por um "po-liligador" onde, entre os locais Xbal e Sacl1 um vetor derivado de TMV foiclonado (figura 4). pBI-D4 é um construto baseado em TMV na qual um geneestranho a ser expresso (por exemplo, antígeno-alvo, tal como LicKM-HA(GD), LicKM-HA(GD), LicKM-NA) substitui o gene de proteína de revesti-mento (CP) de TMV). O vírus retém o gene TMV 126/183kDa, o gene deproteína de movimento (MP), e o promotor de mRNA subgenômico de CP(sgp), que se estende na estrutura de leitura aberta de CP (ORF). O códonde partida para CP sofreu mutação. O vírus carece de CP e, portanto, nãopode se mover através de toda planta hospedeira via floema. Contudo, omovimento de célula a célula de infecção viral permanece funcional, e o ví-rus pode se mover vagarosamente para as folhas superiores dessa maneira.
Um local de clonagem múltiplo (PacI-PmeI-AgeI-XhoI) foi projetado na ex-tremidade de sgp para expressão de genes estranhos, e é seguido pela re-gião não-transladada TMV 3' (NTR). O promotor 35S é fundido na extremi-dade 5' da seqüência viral. A seqüência de vetor é posicionada entre os lo-cais BamHI e Sacl de pBI121. A ribozima de cabeça de martelo é colocada3' da seqüência viral (Chen et aí., 2003, Mol. Breed., 11:287). Estos contrutoincluem fusões de seqüências que codificam LicKM-HA-SD, LicKM-HA(GD)ou NA, em seqüências que codificam o peptídeo de sinal de proteína PR-Iade tabaco, uma etiqueta 6x His e a seqüência âncora de retenção de ERKDEL, ou seqüência de classificação vacuolar (figura 5). Para constructoque contêm seqüência codificando PR-LicKM-HA(SD)-KDEL, PR-LicKM-HA(GD)-KDEL e PR-LicKM-NA-KDEL, o DNA de codificação foi introduzidocomo fragmentos Pacl-Xhol em pBI-D4. Além disso, HAW (HA Wyoming),HAV (HA Vietnam), NAW (NA Wyoming), e NAV (NA Vietnam) foram intro-duzidos diretamente como fragmentos Pacl-Xhol em pBI-D4. A seqüência denucleotídeo foi subseqüentemente verificada estendendo-se sobre as jun-ções de subclonagem dos contruto de expressão final (figura 6).
Exemplo 3: Geração de Plantas e Produção de Antígeno
Infiltração de Agrobacterium de plantas
Sistema de expressão transiente mediado por Agrobacterium al-cangado por infiltração de Agrobacterium pode ser utilizado (Turpen et al.,1993, J. Virol. Methods, 42:227). Folhas saudáveis de N. benthamiana foraminfiltradas com A. rhizogenes contendo vetores virais projetados para ex-pressar LicKM-HA ou LicKM-NA.
A cepa A. rhizogenes A4 (ATCC 43057) foi transformada com oscontruto de pBI-D4-PR-LiKM-HA-(SD)-KDEL, PR-LicKM-HA(GD)-KDEL1 epBI-D4-PR-LicKM-NA-KDEL. Culturas de Agrobacterium foram crescidas einduzidas conforme descrito (Kapila et al., 1997, Plant Sci., 122:101). Umacultura iniciadora de 2 ml (escolhida de uma colônia fresca) foi crescida du-rante a noite em YEB (5 g/l de extrato de carne bovina, 1 g/l de extrato delevedura, 5 g/l de peptona, 5 g/l de sacarose, 2 mM de MgSO4 com 25 pg/mlde kanamicin a 28°C. A cultura iniciadora foi diluída 1:500 em 500 ml de YEBcom 25 pg/ml de kanamicin, 10 mM de 2-4(-morfolino)ácido etanosulfônico(MES) pH 5,6, 2 mM de MgSO4 adicional e 20 pg/ml de acetosiringone. Acultura diluída foi, em seguida, crescida durante a noite a um O.Deoo de ~1,7a 28°C. As células foram centrifugadas a 3.000 χ g por 15 minutos e ressus-pensas em meio de MMA (sais de MS, 10 mM de MES pH 5,6, 20 g/l de sa-carose, 200 μΜ de acetosiringona) a um O.D60o 2,4, mantidas por 1 hora àtemperatura ambiente, e usadas para infiltração de Agrobacterium. Folhasde N. benthamiana foram injetadas com a suspensão de Agrobacterium u-sando-se uma seringa disponível sem uma agulha. As folhas infiltradas fo-ram colhidas 4-7 dias (por exemplo, 6 dias) pós-infiltração.
As plantas foram classificadas para a presença de expressão deantígeno-alvo por avaliação de ensaio de atividade de Iichenase e análise deimunomanchamento (figuras 7, 8, 9 e 10). A análise de zimograma revelouque expressão de ambas proteínas quiméricas de HA e NA nas folhas infil-tradas de Nicotiana benthamiana testadas. A expressão está associada comatividade de Iichenase (figuras 7 e 9). A faixa de atividade relacionada àsproteínas de fusão mostra um peso molecular mais alto do que o controle delichenase, e o mesmo peso molecular do produto expresso após agro-infiltração, confirmando a presença de todo produto de fusão.Geração de raiz clonal e linha de raiz clonal
Explantes de folha de Nicotiana benthamiana de cm χ 1 cm delargura são obtidos de folhas após esterilização em 0,1% de NH4CI e seislavagens em dH20 estéril. Os explantes são levemente danificados comuma faca no lado abacsial e co-cultivados com Agrobacterium rhizogenes,cepa A4, contendo ou a pBID4-Lic-HA-KDEL ou o pBID4-Lic-NA-KDEL. Osexplantes são incubados por 2 minutos com uma cultura de Agrobacteriumdurante a noite (O.D. 6oonm=0,8-1), centrifugados por 10 minutos a 3000 rpma 4°C, e ressuspensos em meio de MMA para um OD 600 final = 0,5 na pre-sença de 20 mM de acetosiringona. No final da incubação, os explantes fo-ram secados em papel estéril e transferidos em 0,8% de placas de MS agarna presença de 1% de glicose, e 20 mM de acetosiringona. As placas foramparalaminadas e mantidas à temperatura ambiente por dois dias. Os explan-tes são então transferidos nas placas de MS na presença de 500 mg/l deCefotaxin (Cif), 100 mg/l de Timentin (Tim) e 25 mg/l de karamicin. Após a-proximadamente 5 semanas, a geração de raízes transgênicas é obtida deexplantes de folha de Nicotiana benthamiana transformados com Agrobaete-rium rhizogenes contendo os constructo de pBID4-Lic-HA-KDEL e pBID4-LicKM-NA-
Após transformação, raízes com pêlos podem ser cortadas e co-locadas em uma linha no meio K3 livre de hormônio sólido. Quatro a seisdias mais tarde as raízes que cresceram mais ativamente são isoladas etransferidas para meio K3 semi-sólido. As raízes selecionadas são cultivadasem um oscilador rotativo a 24°C no escuro, e linhas clonais são isoladas esubcultivadas semanalmente. As raízes e/ou linhas clonais podem ser classi-ficadas para a presença de expressão de antígeno-alvo pela avaliação deensaio de atividade de Iichenase e análise de imunomanchamento.
Exemplo 4: Produção de Candidato de vacina
Amostras de 100 mg de material de folha infiltrado de N. ben-thamiana foram colhidas em 4, 5, 5 e 7 dias pós-infecção. O tecido fresco foianalisado para expressão de proteína após ser colhido ou coletado a -80°Cpara a preparação de extratos de planta bruta subseqüentes, ou para purifi-cação de proteína de fusão.
As amostras frescas foram ressuspensas em PBS frio 1x inibido-res de protease (Roche) em uma razão p/v 1/3 (1 ml/0,3 g de tecido), e moí-das com um pilão. Os homogenados foram fervidos por 5 minutos em tam-pão de carregamento de gel SDS, e então clareados por centrifugação por 5minutos a 12.000 rpm a 4°C. Os sobrenadantes foram transferidos em umtubo fresco e 20 μl, 1 μl ou suas diluições foram separadas em 12% de SDS-PAGE e analisadas por análise de Western blot usando-se anticorpos poli-clonais de camundongo anti-His6-HA ou antilichenase de coelho e/ou poranálise de zimograma para avaliar atividade hidrolítica indicando atividadefuncional de lichenase. A zimografia é um método eletroforéticò para medi-ção de atividade de enzima. O método é baseado em um gel de sódio dode-cil sulfato impregnado com um substrato que é degradado pela enzima dis-solvida durante o período de incubação. O manchamento do gel revela ativi-dade enzimática como faixas brancas em um pano de fundo vermelho escu-ro. Dentro de uma certa faixa, a intensidade de faixa pode estar relacionadaà quantidade de enzima carregada.
A expressão de HA em plantas Nicotiana benthamiana infiltra-das ou com Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes con-tendo o plasmídeo pBID4-LicKM-HA(SD) ou pBID4-LicKM-HA(GD)-KDELconduz a uma faixa específica correspondente ao peso molecular da proteí-na quimérica LicKM-HA(SD)-KDEL ou LicKM-HA(GD)-KDEL se a mobilidadeeletroforética de proteína HA na proteína de fusão corresponde ao PM teóri-co (o PM da enzima de lichenase é cerca de 28 kD).
A quantificação das proteínas quiméricas Lic-HA-KDEL e Lic-NA-KDEL expressas no extrato bruto pode ser feita por imunomanchamentoambos nos tecidos manualmente infiltrados e nos tecidos infiltrados a vácuo.
Purificação de antígenos
Folhas de plantas infiltradas com Agrobacterium tumefacienscontendo os contruto de pBID4-LicKM-HA(SD)-KDEL, pBID4-MicKM-HA(GD)-KDEL, e pBID4-comprimento total-NA-KDEL foram moídas por ho-mogeneização. Tampão de extração com inibidores de protease "livres deEDTA" (Roche) e Triton-X-100 1% foi usado a uma razão de 3 volumes p/v,e oscilado por 30 minutos a 4°C. Os extratos foram clareados por centrifuga-ção a 9000 χ g por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi seqüencialmentefiltrado através de tecido Mira, centrifugado a 20.000 χ g por 30 minutos a4°C, e filtrado através de um filtro de 0,45 pm, antes de purificação cromato-gráfica.
O extrato resultante foi cortado usando-se precipitação de sulfa-to de amônia. Brevemente, (NH4)2SO4 foi adicionado ao extrato a 20% desaturação, incubado em gelo, e centrifugado a 18.000 χ g por 15 minutos. Opélete foi descartado e (NH4)2SO4 adicionado vagarosamente a 60% de sa-turação, incubado em gelo por 1 hora, e centrifugado a 18.000 χ g por 15minutos. O sobrenadante foi descartado, e o pélete resultante ressuspensaem tampão, em seguida mantido em gelo por 20 minutos, seguido por centrí-fuga a 18.000 χ g por 30 minutos, e o sobrenadante dializado durante todanoite 10000 volumes de tampão de lavagem:
Proteínas quiméricas LicKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL e NA-KDEL de comprimento total His-etiquetadas foram purificadaspelo uso de IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography", GE Health)à temperatura ambiente sob gravidade. A purificação foi realizada sob condi-ções de não-desnaturação. As proteínas foram coletadas como frações de0,5 ml, que foram unificadas, adicionadas com 20 mM de EDTA, dializadascontra PBS 1X durante a noite a 4°C, e analisadas por SDS-PAGE.
Alternativa, frações foram coletadas juntas adicionadas com 20mM de EDTA, dializada contra NaH2PH4 10 mM, durante a noite, a 4°C, epurificada por Cromatografia de Troca de Ânion. Para purificação de LICKM-HA(SD)-KDEL, LIC-KM-HA(GD)-KDEL, e NA-KDEL de comprimento total,coluna de troca de ânion Q Sepharose de Fluxo Rápido (Amersham Phar-macia Biosciences) foi usada. Amostras de afinidade de LICKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL e NA-KDEL de comprimento total, ou proteínasquiméricas purificadas de troca de íon foram separadas em 12% de géis depoliacrilamida, seguido por manchamento de Coomassie. As proteínas sepa-radas foram também eletroforeticamente transferidas nas membranas dePVDF para análise de Western blot usando-se anticorpo de antilichenase esucessivamente com peroxidase de IgG anti-coelho-anticorpo conjugado.
As frações coletadas após diálise foram analisadas por imuno-manchamento usando-se ambos pAb α-lichenase e o pAb a-anti-His6. A His-etiqueta foi mantida pelas proteínas quiméricas expressas, e a concentraçãofinal da proteína purificada foi avaliada por software.
Ensaio de Hemaglutinação
Três espécies de células de sangue vermelhas (RBCs) de duasfontes diferentes foram usadas para demonstrar atividade hemaglutinanteem preparações produzidas de planta de vacinas de gripe. O material devacina ensaiado foi referido como "domínio 3" (domínio globular) de ou GripeA/Wyoming/03/03 (um vírus H3N2) ou Gripe A/Vietnam/1194/2004 (um vírusH5N1).
RBCs de galinha, peru e cavalo foram lavados individualmenteem salina tamponada de fosfato (PBS) três vezes e ajustados para 0,5% v/vcom PBS. Placas de microtitulação de 96 cavidades de fundo redondo foramtestadas com PBS apenas para garantia de qualidade demonstrando quesomente placas Falcon consistentemente proporcionavam delineação claraentre resultados positivo e negativo. O material de vacina foi avaliado emduplicata partindo-se de 0,5 mg/ml, e diluído 2 vezes na plana por pipetaçãode 25 μΙ de material em 25 μΙ de PBS etapa a etapa. 25 μΙ de uma suspen-são 0,5% de uma espécie de RBC/placa foi então dispensado em todas ascavidades daquela placa. As placas foram sacudidas para distribuir RBCs eincubadas a 4°C por 4 horas antes de determinar resultados positivos denegativos.
O domínio 3 de Gripe A/Vietnam/1194/2004 (um vírus H5N1)deu consistente e reproducivelmente um resultado positivo no RBC de ave,mas não no RBC de cavalo. A diluição de ponto final foi consistentemente 8em réplicas e repetições experimentais, indicando que o domínio 3 H5 podehemaglutinar RBC de ave a uma concentração de 62,5 25 μg (figura 11).
Exemplo 5: Estudos de Imunogenicidade
Estudo de imunogenicidade inicialUm estudo de imunogenicidade inicial foi conduzido para deter-minar se fusões de LicKM-antígeno produzida de planta pode induzir soroespecífico IgG em camundongos intraperitonealmente imunizados, e se osanticorpos induzidos podem neutralizar vírus de gripe in vitro. O estudo usouLicKM, LicKM-HA(SD)1 LicKM-HA(SD)1 e NA recombinante enriquecida defolhas infiltradas de Agrobacterium de N. benthamiana para pureza de 75%,conforme descrito acima.
Camundongos BALB/c fêmeas de oito semanas de idade foramimunizados com 100 pg por dose de LicKM-HA(SD)1 LicKMHA(GD) recom-binantes, e 50 pg por dose de NA recombinante. Três imunizações de imu-nogênio foram administradas intraperitonealmente no dia 1, o primeiro im-pulso 14 dias mais tarde, seguido por um segundo impulso 10 dias mais tar-de. A primeira dose incluía adjuvante de Freund completo a uma razão devolume de 1:1, a segunda dose não incluía qualquer adjuvante. Um grupo decontrole negativo recebeu 250 pg por dose de LicKM recombinante. Trêscamundongos estavam em cada grupo. Soros pré-imunes foram coletadosum dia antes da primeira dosagem, e soros foram subseqüentemente cole-tados no dia 28, após o segundo impulso. As titulações de anticorpo IgG es-pecífico de gripe foram determinadas usando-se um ensaio ELISA (figura 12).
Inibição de atividade de hemagiutinação de vírus por soros imu-nes elevados contra vacina de gripe
Os soros pré-imunes e soros pós-segundo impulso de camun-dongos imunizados, conforme descrito acima, foram avaliados para a capa-cidade de titulações de anticorpo para inibir atividade de hemagiutinação devírus de gripe inativado. 4 unidades de HA de gripe A inativa-da/Vietnam/vírus 1194/2004 (um vírus H5N1) foram combinadas com 25 μΙde diluições de soros pré-imunes ou soros coletados após o segundo impul-so de vacina. A inibição de atividade de hemagiutinação em RBC de ave foiavaliada conforme descrito no Exemplo 4. As titulações de anticorpo resul-tantes foram eficazes na inibição de hemagiutinação de vírus. Os resultadosexemplares representados na figura 13, e resumidos na Tabela 1, demons-tram que anticorpos elevados podem proteger contra atividade de hemaglu-tinação de vírus.
Tabela 1: Inibição de hemaglutinação por soros imunes eleva-dos contra vacina de gripe experimental
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Exemplo 6: Sistema Modelo de Vacinações de Gripe
A. Vacinação Intramuscular
O furão, um modelo de animal estabelecido para o estudo de in-fecção de gripe, foi usado para determinar a eficiência de vacinas de gripe(por exemplo, Boyd et ai, 1975; Chen et ai, 1995; Scheiblauer et ai, 1995;Sweet et ai, 1980, Microbiol. Rev., 44:303; Maassab et ai, 1982, J. Infact.Dis., 146:780; Toms et ai, 1977; Webster et ai, 1994; Fenton et ai, 1981; eWebster et ai, 1994). Estudos de transmissão utilizando um modelo de ani-mal furão não somente demonstrou doador para difusão de recipiente devírus de gripe, mas também os efeitos de mutações na virulência de vírus(Herlocher et ai, 2001; e Herlocher et ai, 2002). O modelo de provocaçãode vacina primitivo usado nos estudos aqui descritos foi bem-sucedidamentetestado com vacinas de gripe sem adjuvante inativadas.
Produção de Artigos Testes
Avaliou-se a imunogenicidade e eficiência protetora de antíge-nos produzidos de planta em furões. O artigo teste consistia em antígeno-alvo purificado em plantas. Domínios de HA de uma cepa de gripe tipo A(A/Wyoming/3/03 [H3N2] foram projetados como fusões com molécula veícu-lo termo-estáveis e produzidos em um sistema de expressão baseado emplanta, conforme descrito acima. NA de uma mesma cepa foi produzida emum sistema de expressão baseado em planta, conforme descrito acima. Osartigos testes não contêm quaisquer ácidos nucléicos, substância tóxica, ouagente infeccioso.Especificamente, seqüências de nucleotídeo codificando amino-ácidos 17 a 67 mais 294 a 532 de HA1 que juntas compreendem o domíniode haste (Wilson et ai., 1981, nature 289:366), foram inseridas em LicKM(número de acesso no banco de gene DQ776900) para dar LicKM-HA(SD).
Seqüências de nucleotídeo que codificam aminoácidos 68 a 293 de HA,compreendendo o domínio globular (Wilson et ai, supra), foram similarmenteinseridas para dar LicKM-HA(GD). Seqüência que codifica o peptídeo desinal da proteína PR1a relacionada à patogenia de Nicotiana tabacum (Pfitz-ner et ai, 1987, Nucieic Acids Res., 15:4449) foi incluída no terminal N dasfusões. As seqüências que codificam a etiqueta de purificação de afinidadede poli-histidina (6xHis), e o sinal de retenção de retículo endoplasmático(KDEL), foram incluídos no terminal C. As fusões de LicKM foram introduzi-das no vetor híbrido pBDI4 (Wilson et ai., supra), que permite transcrição degenoma viral a partir do promotor 35S de vírus de mosaico de couve-flor,seguido por replicação viral e expressão de seqüência alvo de mRNA sub-genômico de proteína de revestimento (TMV) de vírus de mosaico de tabaco(Shivprasad et ai., 1999, Virology, 255:312), e que é derivada de plasmídeobinário pBI121 Agrobaeteriai (Chen et ai., 2003, Moi, Breed, 11:287), para aexpressão transiente de alvos em folhas. Em adição, seqüência codificandoaminoácidos 38 e 469 de NA da mesma cepa de gripe foi introduzida empBID4 e 6xHis mais KDEL foram incluídas no terminal C.
Os vetores projetados contendo antígenos de gripe foram intro-duzidos em cepa Agrobaeterium tumefaeiens GV3101 por eletroporação. Assuspensões de A. tumefaeiens recombinante foram introduzidas em plantasNieotiana benthamiana por inoculação de folhas aproximadamente seis se-manas após semeadura de modo a introduzir seqüência-alvo nos tecidos defolha. As plantas foram crescidas em pote com solo sob condições de 12horas de luz/12 hora no escuro a 21 °C. As folhas foram colhidas quatro asete dias após inoculação, dependendo do construto de expressão. Extratosde proteína foram preparados por moagem de folhas em um tampão com-preendendo 50 mM de fosfato de sódio, pH 7,0; 100 mM de cloreto de sódio;10 mM de sódio dietilditiocarbamato; e 10 mM de β-mercaptoetanol. Os an-tígenos recombinantes foram enriquecidos por precipitação de sulfato deamônia, seguido por cromatografia de afinidade de metal imobilizado (porexemplo, pelo uso de etiqueta 6xHis), e cromatografia de troca de ânion,com diálise após cada etapa, a pelo menos 80% de pureza.
As reações de antígenos produzidos por planta com anti-sorosde referência foram avaliadas por análise de ELISA (figura 16A), e sob con-dições de desnaturação por imunomanchamento (figura 16B). Para ELISA,placas de 96 cavidades foram revestidas com LicKM-HA(SD)1 LicKM-HA(GD) e NA purificadas de plantas ou revestidas com vírus de gripe inati-vada A/Wyoming/3/03. As placas revestidas foram incubadas com anti-sorosde ovelha elevados contra HA purificada de vírus A/Wyoming/3/03, anti-soros de ovelha elevados contra vírus reagrupados NIBRG-18 (H7N2), ouanti-soros de ovelha de vírus reagrupados elevados contra NIBRG-17(H7N1). Para análise de imunomancha, 100 ng de LicKM-HA(SD)1 100 ng deLicKM-HA(GD), e uma quantidade de gripe A/Wyoming/3/03 correspondendoa 100 ng de HA, foram separados por SDS-PAGE, transferidos para mem-brana de fluoreto de polivinilideno, e incubados com anti-soros de coelhocontra LicKM, ou anti-soros de ovelha elevados contra HA purificada de vírusA/Wyoming/3/03. A atividade de NA foi avaliada de acordo com o protocolopadrão WHO WHO/CDS/CSR/NCS 2002.5 Rev. 1. A inibição de atividade deNA foi avaliada por pré-incubação de NA produzida por planta com anti-soros de ovelha elevados contra vírus reagrupados homólogos (N1BRG-18[H7N2] ou heterólogos (NIBRG-17 [H7N1] antes da condução do ensaio deneuraminidase.
Em ambos ensaios ELISA e de imunomancha, LicKM-HA(SD)foi mais fortemente reconhecido pelos soros de referência do que LicKM-HA(GD), embora soros de coelho elevados contra LicKM reconheceram ca-da fusão a uma extensão similar (figura 16B). Em adição, NA produzida porplanta foi reconhecida por soros de ovelha policlonais de referência elevadoscontra vírus H7N2 reagrupados (figura 16C), e mostrou atividade enzimáticaque foi inibida por soros de referência em uma maneira específica de cepa(figura 16C).Vacinação
Estudos de furões efetuados sob UK Home Office license, con-forme requerido pelo UK Animal (Scientific Procedures) Act1 1986. "Fitch"macho ou furões albinos (Highgate Farm, Highgate, England), de 4,5 mesesde idade, pesando de 441 a 629 gramas no início do estudo, e mantidos emLab-Diet de furão de alta densidade (IPS Product Supplies, Lindres, reinoUnido), foram transferidos para tratamento conforme mostrado na Tabela 2.
Tabela 2. Grupos de Tratamento
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TCID50 ("Dose de Infecção de Cultura de Tecido") = o nível dediluição de um vírus no qual metade de uma série de cavidades de laborató-rio contém vírus de crescimento ativos.
Estes grupos de oito furões foram imunizados subcutaneamentepor imprimadura e impulsão duas vezes (nos dias 0, 14 e 28) com formula-ções de vacina candidata (VC1 mais adjuvante, VC2, VC2 mais adjuvante)contendo combinações de antígenos de gripe produzidos por plantas (Tabe-la 1). Animais de VC1 receberam 100 pg de LicKM-HA(SD) e 100 pg deLicKM-GD mais 1,3 mg de alum. Animais de VC2 receberam 100 pg deLicKM-(SD) e 100 pg de LicKM-(GD), e 50 pg de NA, mais 1,3 mg de alum"mais adjuvante"), ou mais nenhum alum ("NENHUM adjuvante). 100 pg deLicKM-(SD) e 100 μg de LicKM-(GD) distribuídos juntos correspondem a a-proximadamente 100 pg de HA. Os animais de controle negativo receberamadjuvante alum sozinho, e aos animais de grupo de controle positivo foramdados uma dose intranasal simples de vírus da gripe A/Wyoming/3/03 (0,5ml a uma concentração de 105'5 TCID50 por ml no dia 0). Em seguida a imu-nização, o animais foram monitorados diariamente para lesões ou irritação,mobilidade, eritema e atividade geral.
Os animais foram provocados intranasalmente enquanto sobanestésico com 0,5 ml de vírus de gripe A/Wyoming a uma concentração de105,5 TCID50 por ml dez dias após a dose final. Amostras de sangue foramcoletadas de veias terminais superficiais nos dias de vacinação, provocadas,e quatro dias pós-provocação, e lavagens nasais foram coletadas por quatrodias pós-provocação. Titulações Hl de soros foram determinadas para vírusde gripe homólogos A/Wyoming/3/03 e vírus de gripe heterólogosA/Sydney/5/97 (H3N2), A/Califórnia/7/04 (H3N2) e A/New Caledonia/20/99.
As vacinações, procedimentos e provocações de vírus da gripeforam efetuados de acordo com a tabela colocada na Tabela 3. Nenhum e-feito adverso foi notado em quaisquer animais que receberam candidatos devacina produzida por planta. Os animais foram implantados com transpon-ders para identificação individual e monitoramento da temperatura do corpo.A dosagem foi efetuada em três ocasiões separadas em pontos de tempodetalhados na tabela de estudo (Tabela 3). O material de teste preparadoem avanço foi aliquotado para cada dose. O material de teste foi misturadocom adjuvante imediatamente antes da administração.
Tabela 3. Tabela de Estudo
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Análise
Sinais clínicos (registros de saúde), peso corpóreo e mudançasde temperatura foram registrados. Uma vez diariamente, pós-infecção, cadaanimal examinado para lesões ou irritação, mobilidade, eritema e atividadegeral, e observações foram registradas para determinação de registros desaúde. Cada animal foi classificado como segue: espirro ou ruído nasal (pon-to 1); descarga purulenta a partir das narinas externas (ponto 1); atividadeespontânea ou movimento diminuídos (ponto 1); nenhuma atividade espon-tânea ou agilidade diminuídas (pontos 2). "Atividade espontânea ou movi-mento diminuídos" e "nenhuma atividade espontânea ou agilidade diminuí-das" foram pontos de classificação mutuamente exclusivos. A perda máximano peso do dia de infecção foi calculada para cada animal. O aumento má-ximo na temperatura do corpo do dia de infecção foi calculado para cadaanimal. O desvio médio e padrão de registro de saúde máximo, perda depeso, e mudança de temperatura para cada animal em qualquer dia foi cal-culado pelo grupo de tratamento, e comparado por ANOVA. Uma mediçãosimilar a AUC compreendendo a soma de saúde, perda de peso, e registrosde mudanças de temperatura em cada dia pós-infecção foi calculada paracada animal; desvios médio, mediano e padrão de grupo de tratamento fo-ram calculados e comparados por ANOVA ou teste de Krustal-Wallis, con-forme apropriado. Em seguida a provocação com vírus, cada um dos gruposde tratamento demonstrou recuperação da provocação conforme indicadopor sinais clínicos, e mudanças na temperatura e peso corpóreo. Os gruposde animais que receberam a vacina de teste foram protegidos e mostrarampouco ou nenhum sintoma de doença em seguida a provocação com vírusde gripe homólogo. Ambos os candidatos de vacina teste proporcionaramproteção total aos animais (figura 14).
As lavagens nasais foram coletadas após provocação de vírus.O volume de recuperação de lavagem nasal foi medido, e o peso da lava-gem nasal foi monitorado. A resposta celular inflamatória foi avaliada emlavagens nasais pós-provocação por manchamento com azul de Trypan (u-sado para determinar contagens de célula totais), e contagem de leucócito.As contagens de célula na lavagem nasal foram resumidas por desvio mé-dio, mediano e padrão de dados transformados de Iog em cada dia de amos-tragem pós-infecção; grupos de tratamento foram comparados por ANOVAou teste de Kruskal-Wallis, conforme apropriado. Similar aos sinais clínicosdiscutidos acima, o monitoramento de lavagens nasais indicou grupos detratamento recebendo cada uma das vacinas de tratamento de teste de-monstrou proteção de infecção igual a, maior do que grupos de controle po-sitivo (figura 14).
Abrigo viral foi determinado usando-se titulação de célula de rimcanino Madin-Darby (MDCK) nas amostras de lavagem nasal. O ponto finaldo ensaio de titulação de MDCK foi determinado pela realização de um en-saio de hemaglutinação com células de sangue vermelha de peru. O cálculode Karber foi usado para determinar Iogi0 TCID5o/ml para cada amostra. Oabrigo nasal a partir das amostras de lavagem nasal foi determinado nasamostras de lavagem nasal pós-infecção. O abrigo de titulação máxima paracada animal foi log-transformado; desvios médio, mediano e padrão de gru-pos de controle foram calculados e comparados por teste de Kruskal-Wallis.A proporção de animais em cada grupo de tratamento com qualquer abrigode vírus em qualquer tempo foi tabulada, e os grupos foram contrastadosusando-se um teste X2 para independência. Os resultados do abrigo de vírussão representados na figura 15. Somente o grupo de tratamento de controlenegativo resultou em abrigo significante de vírus (figura 15).
Ensaios de inibição de hemaglutinina (HAI) foram realizadosconforme descrito no Exemplo 5 usando-se amostras de soros pré e pós-vacinação contra vírus homólogos (vírus de Gripe A/Wyoming/3/2003(H3N2)) para confirmar soro-negatividade dos animais como guia e se ounão animais soro-convertem em seguida à imunização e infecção. As titula-ções de HAI foram tabuladas e animais com a > 4 vezes que ocorre entre odia 0 e o dia terminal foram identificados.
A atividade de inibição de hemaglutinina (HI) de soros de ani-mais imunizados está relacionada como um correlato de proteção (Brown etal., 2004, Dev. BioL (Basel), 115:1; e Hobson et ai, 1972, J. Hyg., 70:767).
Os resultados de tal experimento são apresentados na Tabela 4. Todos osanimais em grupos imunizados com vacinas testes contra H3N2 ou respos-tas imunes específicas de alvo fortes montadas de controle positivo com altaatividade de inibição de hemaglutinação de soros. Em seguida a uma primei-ra dose de vacina, VC2 mais adjuvante geram altas titulações de HAI. VC2sem adjuvante geram uma resposta protetora, embora titulações não tãoaltas com adjuvantes após uma primeira dose. Contudo, em seguida a umasegunda dose, as titulações alcançaram níveis similares a CMBI com adju-vante. VC1 mais adjuvante também resultou em geração de níveis proteto-res de anticorpo que foram significantemente mais altos em seguida a umasegunda dose de vacina.
Tabela 4: Resumo dos dados de HAI de Furão
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Os resultados de um segundo experimento de ensaio de HA sãoapresentados ma figura 17. Nenhuma atividade de Hl foi observada em so-ros pré-imunes de qualquer animal, ou em soros de animais NC (figura 17).Contudo, os soros de todos os furões vacinados com VC2 mais adjuvanteexibiram titulações de Hl altas na faixa de 1:320 a 1:2560 (titulação média1273) em seguida a primeira dose (figura 17). Respostas inferiores e titula-ções de Hl mais baixas em seguida à primeira dose foram observadas entreanimais que receberam VC1 mais adjuvante (figura 17), sugerindo que NApode ter modulado a resposta imune. Cinco dos oito animais que receberamVC2 dão titulações de Hl na faixa de 1:160 a 1:1280, onde vacinas de gripeinativadas comerciais na ausência de adjuvante tipicamente induzem titula-ções de Hl muito baixas, se houver (Potter et ai, 1972, Br. J. Exp. Pathol.,53:168; Potter et ai, 1973, J. Hyg. (Lond), 71:97; e Potter et ai, 1973, Arch.Gesamte Virusforsch., 42:285). Em seguida a segunda dose de VC1 maisadjuvante, VC2, ou VC2 mais adjuvante, soros de todos os furões tinhamtitulações de Hl na faixa de 1:640 a 1:2560, e estas permaneceram similar-mente altos após a terceira dose (figura 17). Os soros de todos destes ani-mais tinham titulações em excesso de 1:40, relacionados por alguns como atitulação de Hl mínima consistente com proteção em seres humanos (Brownet ai, 2004, Dev. Biol. (Basel), 115:1; e Hobson et ai, 1972, J. Hyg., 70:767).
As titulações de Hl nos soros de furões que receberam duasdestas três doses de qualquer dos candidatos de vacina produzidos de plan-ta foram equivalentes a ou maior do que aquelas nos soros de animais decontrole positivo intranasalmente infectados (figura 17), e estavam em ex-cesso daquelas observadas em outros estudos de furão. Por exemplo, fu-rões intramuscularmente imunizados com uma vacina de gripe H3N2 inati-vada comercial foram reportados para desenvolver titulações de Hl de 1:20após receberem duas doses (Lambkin et ai, 2004, vaccine, 22:4390). Ossoros de furões imunizados com VC1 mais adjuvante, VC2, ou VC2 maisadjuvante tinham titulações de Hl quatro a vinte vezes mais baixas contra ascepas de vírus H3N2 heterólogo A/Sydney/5/97 e A/California/7/04 do quecontra A/Wyomimg/3/03, mas estas titulações estavam todas em excesso dolimite 1:40 consistente com proteção, sugerindo o potencial para estes can-didatos de vacina para proteger contra cepas H3N2 heterólogas. Titulaçõesde Hl abaixo de 1:10 foram observadas contra gripe A/New Caledonia/20/99(H1N1), indicando a especificidade de subtipo H3 da resposta de anticorpode Hl.
Em seguida a imunogenicidade e eficiência protetora, estudo foiconduzido para avaliar a eficiência protetora de antígenos de HA e NA pro-duzidos por planta em furões imunizados por provocações intranasais comvírus de gripe de crescimento vivo A/Wyoming/3/03.
A extensão de infecção viral em seguida a provocação foi de-terminada para cada animal por monitoramento da titulação de abrigo devírus em lavagens nasais por quatro dias pós-provocação. Somente um a-nimal que recebeu qualquer das três formulações de vacina candidata mos-trou abrigo de viris detectável, e ainda em menos do que 102 TCID50, ondeanimais nos grupos NC mostraram abrigo de vírus na faixa de 106 a 107TCID50 (figura 18A). O nível de abrigo de vírus no grupo PC estava na faixade 102 a 103 TCID50, maior do que para qualquer animal nos grupos de vaci-na candidata (figura 18A).
A evidência de proteção foi observada para animais recebendoquaisquer das formulações de vacina candidata. A perda de peso pós-infecção foi grandemente reduzida em furões que receberam VC1 mais ad-juvante, VC2 mais adjuvante, ou o vírus homólogo, comparada àqueles dogrupo NC (figura 18B). A redução na perda de peso para animais que rece-beram VC2 foi menos surpreendente (figura 18B). Em adição, a elevação natemperatura do corpo em furões imunizados com qualquer das formulaçõesde vacina candidata foi reduzida comparada àquela observada para animaisem quaisquer grupos NC ou PC (figura 18C). Além disso, o pico médio deregistro de sintoma, um índice indicando a freqüência de vários sintomasrelacionado à gripe em seguida a provocação, foi reduzido em animais quereceberam as formulações de vacina candidata comparado àqueles no gru-po NC (figura 18D). Similarmente, contagens de leucócito nas lavagens na-sais de furões, tomadas como um indicador de infecção de trato respiratóriosuperior, foram reduzidas em recipientes de vacina candidata comparadas aanimais no grupo NC (figura 18E).
O estudo de provocação indica que os antígenos de HA e NAproduzidos de planta conferem um alto grau de imunidade protetora em fu-rões, mostrando promessa de desenvolvimento de vacina. Nos estudos futu-ros, nós elucidaremos o papel protetor de LicKM-SD e LicKM-GD quandoadministrados individualmente, e o papel de NA em respostas imunes defacilitação adicional.
Β. Vacinação Intranasal
A imunogenicidade de vacinas candidatas é avaliada em segui-da a imunização intranasal em camundongos Balb/c ou animais modelosfurão. O desenho do estudo é similar àquele de imunização intramusculardiscutida nos Exemplos acima. Em breve, grupos de camundongos ou fu-rões (aproximadamente 8-10 animais/grupos) são imunizados intranasal-mente com três doses (100 pg/dose) de antígeno-alvo em cerca dos dias 0,14 e 28, na presença ou ausência de adjuvantes (por exemplo, hidróxido dealumínio, MALP-2, etc). Amostras de soros e lavagens nasais são coletadasem cada dia de vacinação antes da administração do antígeno, e dez diasapós a terceira dose. Os animais imunizados são provocados após a últimadose pela rota nasal com a cepa homóloga de vírus da gripe conhecida parainfectar os animais, e para produzir sintomas de infecção respiratória comfebre. A natureza da resposta imune é examinada pela determinação do ní-vel de abrigo de vírus, perda de peso pós-infecção, elevação na temperaturado corpo, pico médio de registros de sintoma, e contagens de leucócitos emlavagens nasais, conforme medidos após provocação do vírus. A presençade anticorpos em NA e/ou HA, bem como atividade de neutralização de Hl evírus, é examinada.
C. Estudos de Escalação de Dose
Composições e doses ótimas de antígenos e adjuvantes, rota deadministração, bem como regimes de imunização, podem ser adicionalmen-te avaliados usando estudos de escalação de dose. Antecipou-se o teste detrês a seis composições de vacina de teste neste estudo. O estudo é reali-zado usando-se ambas a rota intramuscular (Tabela 3) e rota intranasal. Si-milar àquela imunização intramuscular e intranasal discutida nos Exemplosacima, grupos de animais (aproximadamente 8-10 animais/grupos) são imu-nizados intranasalmente com várias doses de vacina de teste, na presençaou ausência de adjuvante (por exemplo, hidróxido de alumínio, MALP-2, etc).Vide Tabela 5 para uma tabela de dosagem exemplar.
Como em outros estudos, amostras de soros e lavagens nasaissão coletadas em cada dia de vacinação antes da administração do antíge-no, e dez dias após a terceira dose. Os animais imunizados são provocadosapós a última dose por rota nasal com a cepa homóloga de vírus de gripeconhecida para infectar animais e para produzir sintomas de infecção respi-ratória com febre. A natureza da resposta imune pode ser determinada peloexame do nível de abrigo de vírus; perda de peso pós-infecção; elevação natemperatura do corpo; pico médio de registros de sintoma; contagens deleucócitos em lavagens nasais; presença de anticorpos em NA, HA e/ou M2;inibição de hemaglutinação; e/ou atividade de neutralização de vírus.
Tabela 5: Desenho Exemplar para Estudo de Escalação de Dose em A-nimais
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*i.m. = injeção intramuscular

Claims (94)

1. Antígeno isolado compreendendo um componente de umaproteína de membrana integral de gripe A fundida a uma proteína termoes-tável;no qual o componente de proteína de membrana integral com-preende pelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindoem hemaglutinina (HA), um domínio de neuraminidase (NA) e um domíniode M2.
2. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, no qual ocomponente de proteína de membrana integral consiste em pelo menos umahemaglutinina de domínio (HA), no qual o domínio é selecionado a partir dogrupo consistindo em SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 7, SEQID NO.: 8, SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 20 e SEQ ID NO.: 24.
3. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, no qual ocomponente de proteína de membrana integral consiste em pelo menos umdomínio de neuraminidase (NA) selecionado a partir do grupo consistindoem SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 16 e SEQ ID NO.: 18.
4. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, no qual ocomponente de proteína de membrana integral consiste em hemaglutinina(HA) de comprimento total selecionada de SEQ ID NO.: 1, ou SEQ ID NO.: 3
5. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, no qual ocomponente de proteína de membrana integral consiste em neuraminidase(NA) de comprimento total selecionada de SEQ ID NO.: 2, ou SEQ ID NO.: 4.
6. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, no qual aproteína termoestável compreende uma seqüência de proteína Iichenasemodificada.
7. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 6, no qual aseqüência de codificação para Iichenase foi otimizada para expressão deproteína em plantas.
8. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 6, no qual aseqüência de proteína Iichenase compreende o domínio N-terminal, o domí-nio C-terminal, e o domínio de laço de superfície de Iichenase LicB.
9. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, no qual ocomponente de proteína de membrana integral fundido à Iichenase é qual-quer de uma fusão N-terminal, uma fusão C-terminal, ou uma proteína defusão de inserção de laço de superfície.
10. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 1, no qual ocomponente de proteína de membrana integral compreende pelo menos doisdomínios selecionados a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO.: 1, SEQID NO.: 3, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 11,SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 20, SEQ ID NO.: 24, SEQ IDNO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 16, e SEQ ID NO.: 18.
11. Antígeno isolado, de acordo com a reivindicação 10, no qualo componente de proteína de membrana integral compreende um domíniode hemaglutinina (HA) e um domínio de neuraminidase (NA).
12. Composição de vacina compreendendo um antígeno com-preendendo um componente de uma proteína de membrana integral de gripeA fundida a uma proteína termoestável, e um veículo farmaceuticamenteaceitável;no qual o componente de proteína de membrana integral com-preende pelo menos um domínio selecionado a partir de um domínio de he-maglutinina (HA), um domínio de neuraminidase (NA), e um domínio de M2;eno qual a composição é capaz de induzir uma resposta imuneapós administração a um indivíduo.
13. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,no qual o componente de proteína de membrana integral consiste em pelomenos uma hemaglutinina de domínio (HA), no qual o domínio é selecionadoa partir do grupo consistindo em SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 3, SEQ IDNO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12,SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 20 e SEQ ID NO.: 24.
14. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,no qual o componente de proteína de membrana integral consiste em pelomenos um domínio de neuraminidase (NA) selecionado a partir do grupoconsistindo em SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 16 e SEQ IDNO.: 18.
15. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,no qual o componente de proteína de membrana integral consiste em hema-glutinina (HA) de comprimento total selecionada de SEQ ID NO.: 1, ou SEQID NO.: 3.
16. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,no qual o componente de proteína de membrana integral consiste em neu-raminidase (NA) de comprimento total selecionada de SEQ ID NO.: 2, ouSEQ ID NO.: 4.
17. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,no qual a proteína termoestável compreende uma seqüência de proteínalichenase modificada.
18. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,no qual a proteína termoestável compreende uma seqüência de proteínalichenase modificada de Clostridium thermocellum.
19. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 17,no qual a seqüência de codificação para lichenase foi otimizada para ex-pressão de proteína em plantas.
20. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 17,no qual a seqüência de proteína Iichenase compreende o domínio N-terminal, o domínio C-terminal, e o domínio de laço de superfície de lichena-se.
21. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 20,no qual o componente de proteína de membrana integral fundido à Iichenaseé qualquer de uma fusão N-terminal, uma fusão C-terminal, ou uma proteínade fusão de inserção de laço de superfície.
22. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,no qual o componente de proteína de membrana integral compreende pelomenos dois domínios selecionados a partir do grupo consistindo em SEQ IDNO.: 1, SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 33,SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 20, SEQ IDNO.: 24, SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 16, e SEQ ID NO.: 18,e no qual a composição é capaz de induzir uma resposta imune após admi-nistração a um indivíduo.
23. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 22,no qual o componente de proteína de membrana integral compreende umdomínio de hemaglutinina (HA) e um domínio de neuraminidase (NA).
24. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 22,no qual o componente de proteína de membrana integral compreende he-maglutinina (HA) de comprimento total e neuraminidase (NA) de comprimen-to total.
25. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,compreendendo adicionalmente um segundo antígeno, no qual a composi-ção é capaz de induzir uma resposta imune após administração a um animal.
26. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 25,no qual o segundo antígeno compreende um componente de proteína demembrana integral de gripe A fundido a uma proteína termoestável, e umveículo farmaceuticamente aceitável;no qual o componente de proteína de membrana integral doprimeiro antígeno compreende pelo menos um domínio selecionado a partirdo grupo consistindo em um domínio de hemaglutinina (HA), um domínio deneuraminidase (NA) e um domínio de M2, e o componente de proteína demembrana integral do segundo antígeno compreende pelo menos um domí-nio distinto do primeiro antígeno selecionado a partir do grupo consistindoem um domínio de hemaglutinina (HA), um domínio de neuraminidase (NA),e um domínio de M2; eno qual a composição é capaz de induzir uma resposta imuneapós administração a um indivíduo.
27. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 26,no qual o componente de proteína de membrana integral do primeiro antíge-no compreende um domínio de hemaglutinina (HA) e componente de proteí-na de membrana integral do segundo antígeno compreende um domínio deneuraminidase (NA).
28. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,no qual o antígeno é produzido em uma planta selecionada de uma plantatransgênica e uma planta que expressa transientemente o antígeno.
29. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,no qual a composição compreende antígeno que é purificado, parcialmentepurificado, ou não-purificado de células de planta, uma planta, sementes,fruta, ou um extrato destes.
30. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 12,compreendendo adicionalmente pelo menos um adjuvante de vacina.
31. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 30,no qual o adjuvante é selecionado a partir do grupo consistindo em alum,MF59, saponina e MALP2.
32. Composição de vacina compreendendo pelo menos dois an-tígenos, cada um do qual compreendendo um componente de proteína demembrana integral de gripe A, no qual o componente de proteína de mem-brana integral compreende pelo menos um domínio selecionado a partir dogrupo consistindo em um domínio de hemaglutinina (HA), um domínio deneuraminidase (NA), e um domínio de M2; no qual pelo menos um antígenoé fundido a uma proteína termoestável, e um veículo farmaceuticamente a-ceitável; no qual a composição é capaz de induzir uma resposta imune apósadministração a um indivíduo.
33. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,no qual pelo menos um componente de proteína de membrana integral depelo menos uma hemaglutinina (HA) de domínio, no qual o domínio é sele-cionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 3,SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 11, SEQ IDNO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 20 e SEQ ID NO.: 24.
34. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,no qual pelo menos um componente de proteína de membrana integral com-preende pelo menos um domínio de neuraminidase (NA) selecionado a partirdo grupo consistindo em SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 16 eSEQ ID NO.: 18.
35. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,no qual pelo menos um componente de proteína de membrana integral con-siste em hemaglutinina (HA) de comprimento total selecionada de SEQ IDNO.: 1, ou SEQ ID NO.: 3.
36. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,no qual pelo menos um componente de proteína de membrana integral con-siste em neuraminidase (NA) de comprimento total selecionada de SEQ IDNO.: 2, ou SEQ ID NO.: 4.
37. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,no qual a proteína termoestável compreende uma seqüência de proteínaIichenase modificada.
38. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,no qual a proteína termoestável compreende uma seqüência de proteínaItchenase modificada de Clostridium thermocellum.
39. Composição de vacina.de acordo com a reivindicação 37, noqual a seqüência de codificação para Iichenase foi otimizada para expressãode proteína em plantas.
40. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 37,no qual a seqüência de proteína Iichenase compreende o domínio N-terminal, o domínio C-terminal, e o domínio de laço de superfície de Iichenase.
41. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 40,no qual o componente de proteína de membrana integral fundido à Iichenaseé qualquer de uma fusão N-terminal, uma fusão C-terminal, ou uma proteínade fusão de inserção de laço de superfície.
42. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,no qual o componente de proteína de membrana integral compreende pelomenos dois domínios selecionados a partir do grupo consistindo em SEQ IDNO.: 1, SEQ ID NO.: 3, SEO ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 33,SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 20, SEQ IDNO.: 24, SEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 16, e SEQ ID NO.: 18,e no qual a composição é capaz de induzir uma resposta imune após admi-nistração a um indivíduo.
43. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 42,no qual o componente de proteína de membrana integral compreende umdomínio de hemaglutinina (HA) e um domínio de neuraminidase (NA).
44. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 42,no qual o componente de proteína de membrana integral compreende he-maglutinina (HA) de comprimento total e neuraminidase (NA) de comprimen-to total.
45. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,compreendendo adicionalmente um terceiro antígeno, no qual a composiçãoé capaz de induzir uma resposta imune após administração a um animal.
46. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 45,no qual o terceiro antígeno compreende um componente de proteína demembrana integral de gripe A fundido a uma proteína termoestável, e umveículo farmaceuticamente aceitável;no qual o componente de proteína de membrana integral doprimeiro antígeno compreende pelo menos um domínio selecionado a partirdo grupo consistindo em um domínio de hemaglutinina (HA), um domínio deneuraminidase (NA) e um domínio de M2, e o componente de proteína demembrana integral do segundo antígeno compreende pelo menos um domí-nio distinto do primeiro antígeno selecionado a partir do grupo consistindoem um domínio de hemaglutinina (HA), um domínio de neuraminidase (NA),e um domínio de M2; eno qual a composição é capaz de induzir uma resposta imuneapós administração a um indivíduo.
47. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,no qual o antígeno é produzido em uma planta selecionada de uma plantatransgênica e uma planta que expressa transientemente o antígeno.
48. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,no qual a composição compreende antígeno que é purificado, parcialmentepurificado, ou não-purificado de células de planta, uma planta, sementes,fruta, ou um extrato destes.
49. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 32,compreendendo adicionalmente pelo menos um adjuvante de vacina.
50. Composição de vacina, de acordo com a reivindicação 49,no qual o adjuvante é selecionado a partir do grupo consistindo em alum,MF59, saponina e MALP2.
51. Método para induzir uma resposta imune protetora contra in-fecção de gripe A em um indivíduo compreendendo administrar a um indiví-duo uma quantidade eficaz de uma composição de vacina antigripe A, noqual a administração é suficiente para estimular produção de anticorpos es-pecíficos de antígeno, ou estimular uma resposta imune celular pelo indiví-duo; induzindo, desse modo, uma resposta imune protetora;no qual a composição de vacina compreende um antígeno com-preendendo um componente de uma proteína de membrana integral de gripeA fundida a uma proteína termoestável; eno qual o componente de proteína de membrana integral com-preende pelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindoem hemaglutinina (HA), um domínio de neuraminidase (NA), e um domíniode M2.
52. Método, de acordo com a reivindicação 51, no qual a com-posição é administrada oral, intranasal, subcutanea, intravenosa, intraperito-neal, ou intramuscular.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, no qual a com-posição é administrada oralmente, via alimentação de células de planta aoindivíduo.
54. Método, de acordo com a reivindicação 51, no qual o indiví-duo é ser humano.
55. Método, de acordo com a reivindicação 51, no qual o indiví-duo é selecionado a partir do grupo consistindo em um pássaro, um porco eum cavalo.
56. Método para produção de uma proteína de antígeno com-preendendo um componente de uma proteína de membrana integral de gripeA fundida a uma proteína termoestável, compreendendo:a. preparar umo construto de ácido nucléico que codifica um an-tígeno compreendendo um componente de uma proteína de membrana inte-gral de gripe A fundida a uma proteína termoestável;b. introduzir o ácido nucléico da etapa a em uma célula; ec. incubar a célula sob condições favoráveis para expressão daproteína de antígeno; produzindo, dessa modo, a proteína de antígeno;no qual o componente de proteína de membrana integral com-preende pelo menos um domínio selecionado a partir do grupo consistindoem um domínio de hemaglutinina (HA), e um domínio de neuraminidase.
57. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o com-ponente de proteína de membrana integral consiste em pelo menos umahemaglutinina (HA) de domínio, no qual o domínio é selecionado a partir dogrupo consistindo em SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 3, SEQ ID NO.: 7, SEQID NO.: 8, SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 11, SEQ ID NO.: 12, SEQ ID NO.:-13, SEQ ID NO.: 20 e SEQ ID NO.: 24.
58. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o com-ponente de proteína de membrana integral consiste em pelo menos um do-mínio de neuraminidase (NA) selecionado a partir do grupo consistindo emSEQ ID NO.: 2, SEQ ID NO.: 4, SEQ ID NO.: 16 e SEQ ID NO.: 18.
59. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o com-ponente de proteína de membrana integral consiste em hemaglutinina (HA)de comprimento total selecionada de SEQ ID NO.: 1, ou SEQ ID NO.: 3.
60. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o com-ponente de proteína de membrana integral consiste em neuraminidase (NA)de comprimento total selecionada de SEQ ID NO.: 2, ou SEQ ID NO.: 4.
61. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual a proteí-na termoestável compreende uma seqüência de proteína Iichenase modifi-cada.
62. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual a se-qüência de codificação para Iichenase foi otimizada para expressão de pro-teína em plantas.
63. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual a se-qüência de proteína Iichenase compreende o domínio N-terminal, o domínioC-terminal, e o domínio de laço de superfície de lichenase.
64. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o com-ponente de proteína de membrana integral fundido à lichenase é qualquer deuma fusão N-terminal, uma fusão C-terminal, ou uma proteína de fusão deinserção de laço de superfície.
65. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o com-ponente de proteína de membrana integral compreende pelo menos doisdomínios selecionados a partir do grupo consistindo em um domínio de he-maglutinina (HA) e um domínio de neuraminidase (NA).
66. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o com-ponente de proteína de membrana integral compreende um domínio de he-maglutinina (HA) e um domínio de neuraminidase (NA).
67. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual a ex-pressão da proteína de antígeno está sob controle de um promotor viral.
68. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o cons-truto de ácido nucléico compreende adicionalmente seqüência de ácido nu-cléico de vetor.
69. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o vetor éum vetor binário.
70. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual o cons-truto de ácido nucléico compreende adicionalmente seqüências que codifi-cam proteínas virais.
71. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual a célulaé uma célula de planta.
72. Método, de acordo com a reivindicação 71, no qual a célulade planta é selecionada a partir do grupo consistindo em alfafa, rabanete,mustarda, munguba, brócolis, agrião, feijão-soja, girassol de trigo, repolho,trevo, petúnia, tomate, batata, nicotina, espinafre e célula de lentilha.
73. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual a proteí-na de antígeno é produzida em uma célula de raiz clonal.
74. Método, de acordo com a reivindicação 56, no qual a proteí-na de antígeno é produzida em mudas germinadas.
75. Método, de acordo com a reivindicação 56, compreendendoadicionalmente recuperar proteína de antígeno parcialmente purificada oupurificada que é produzida.
76. Construto de ácido nucléico isolado compreendendo se-qüência de ácido nucléico que codifica um componente de uma proteína demembrana integral de gripe A fundida a uma proteína termoestável; e noqual o componente de proteína de membrana integral compreende pelo me-nos um domínio selecionado a partir do grupo consistindo em um domínio dehemaglutinina (HA) e um domínio de neuraminidase (NA).
77. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, no qual o componente de proteína de membrana integral com-preende pelo menos um domínio de hemaglutinina (HA), no qual o domínio éselecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO.: 1, SEQ ID NO.: 3,SEQ ID NO.: 7, SEQ ID NO.: 8, SEQ ID NO.: 33, SEQ ID NO.: 11, SEQ IDNO.: 12, SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 20 e SEQ ID NO.: 24.
78. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, no qual os componentes de membrana integral compreendempelo menos um domínio de hemaglutinina no qual o componente de proteínade membrana integral consiste em pelo menos um domínio de neuraminida-se (NA) selecionado a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO.: 2, SEQID NO.: 4, SEQ ID NO.: 16 e SEQ ID NO.: 18.
79. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, no qual os componentes de membrana integral compreendempelo menos um domínio de hemaglutinina no qual o componente de proteínade membrana integral consiste em hemaglutinina (HA) de comprimento totalselecionada de SEQ ID NO.: 1, ou SEQ ID NO.: 3.
80. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, no qual os componentes de membrana integral compreendempelo menos um domínio de hemaglutinina no qual o componente de proteínade membrana integral consiste em neuraminidase (NA) de comprimento totalselecionada de SEQ ID NO.: 2, ou SEQ ID NO.: 4.
81. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, no qual os componentes de membrana integral compreendempelo menos um domínio de hemaglutinina no qual a proteína termoestávelcompreende uma seqüência de proteína Iichenase modificada.
82. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, no qual os componentes de membrana integral compreendempelo menos um domínio de hemaglutinina no qual a seqüência de codifica-ção para Iichenase foi otimizada para expressão de proteína em plantas.
83. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, no qual os componentes de membrana integral compreendempelo menos um domínio de hemaglutinina no qual a seqüência de proteínaIichenase compreende o domínio N-terminal, o domínio C-terminal, e o do-mínio de laço de superfície de lichenase.
84. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, no qual os componentes de membrana integral compreendempelo menos um domínio de hemaglutinina no qual o componente de proteínade membrana integral fundido à lichenase é qualquer de uma fusão N-terminal, uma fusão C-terminal, ou uma proteína de fusão de inserção delaço de superfície.
85. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, no qual os componentes de membrana integral compreendempelo menos um domínio de hemaglutinina no qual o componente de proteínade membrana integral compreende pelo menos dois domínios selecionadosa partir do grupo consistindo em um domínio de hemaglutinina (HÁ) e umdomínio de neuraminidase (NA).
86. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 85, no qual o componente de proteína de membrana integral com-preende pelo menos um domínio de hemaglutinina (HA) e pelo menos umdomínio de neuraminidase (NA).
87. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 76, compreendendo adicionalmente seqüências de ácido nucléicode vetor.
88. Construto de ácido nucléico isolado, de acordo com a reivin-dicação 85, compreendendo adicionalmente seqüência de ácido nucléico devetor.
89. Método, de acordo com a reivindicação 76, no qual o vetor éum vetor binário.
90. Método, de acordo com a reivindicação 76, compreendendoadicionalmente seqüências de ácido nucléico que codificam proteínas virais.
91. Célula hospedeira compreendendo o construto de ácido nu-cléico como definido na reivindicação 76.
92. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 91, que éuma célula de planta.
93. Planta, de acordo com a reivindicação 92, que é selecionadaa partir do grupo consistindo em alfafa, rabanete, mustarda, munguba, bró-colis, agrião, feijão-soja, girassol de trigo, repolho, trevo, petúnia, tomate,batata, nicotina, espinafre e lentilha.
94. Planta, de acordo com a reivindicação 92, que é um gêneroselecionado de gênero Brassica, o gênero Nicotana, e o gênero Petúnia.
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