KR101046004B1

KR101046004B1 - 돼지 인플루엔자 혈청 진단 방법

Info

Publication number: KR101046004B1
Application number: KR1020090080689A
Authority: KR
Inventors: 박봉균; 안수경
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2008-11-12
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-07-01
Also published as: KR20100053433A

Abstract

본 발명의 일 구체예는 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005) 또는 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)를 이용한 인플루엔자 혈청 진단 방법 및 이를 위한 혈청 진단용 키트에 관한 것이다.

돼지 인플루엔자, ELISA

Description

돼지 인플루엔자 혈청 진단 방법{Serodiagnosis assay of swine influenza}

본 연구는 농림부 및 농촌진흥청의 Biogreen 21사업의 일환으로 수행되었음[20070401034009, 무균 돼지의 질병 모니터링 기술의 확립 개발].

본 발명의 일 실시예는 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005) 또는 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)를 이용한 인플루엔자 혈청 진단 방법 및 이를 위한 혈청 진단용 키트에 관한 것이다.

돼지 인플루엔자는 돼지의 급성 호흡기 전염병으로 전염성이 몹시 크고 기관지 폐렴이 나타나는 돼지 질병이다. 돼지 인플루엔자는 오르쏘믹소바이러스 종(Orthomyxoviridae family)(Lamb and Krug, 1996)에 속하는 인플루엔자 A 바이러스에 의해 발생된다. 돼지 인플루엔자 바이러스에는 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(neuraminidase, NA)의 두 개의 표면 당 단백질이 있으며, 이러한 당 단백질의 항원성 특성으로 인해 인플루엔자 바이러스를 수 개의 서브타입으로 나눈다. 현재까지 HA 16개 서브타입과 NA 9개 서브타입이 확인되었다.

돼지 인플루엔자 바이러스는 현재 H1N1, H1N2, 및 H3N2 세 개의 바이러스 서브타입이 유행하고 있는 것으로 알려져 있다(Jung and Song, 2007; Olsen, 2002). 한국에서 H1N1 돼지 인플루엔자 바이러스는 2004년과 2005년에 분리되었고, H3N2 바이러스 및 H1N2 바이러스는 1998년과 2003년에 분리되었다.

돼지 인플루엔자 바이러스 진단을 위해서 통상적으로는 혈구응집억제 반응(Hemagglutination inhibition, HI) 테스트를 사용하고 있다. 이 테스트는 비교적 저가인 혈청 진단 방법이지만, 시간이 많이 걸리는 분석 방법이고 대량으로 실시하기에는 어렵다(Skibbe et al., 2004).

최근에는 효소 연결된 면역흡수 분석 방법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)이 돼지 인플루엔자 바이러스 중 H1N1 바이러스와 H3N2 바이러스 서브 타입에 대한 특이적 항체를 검출하기 위해 사용되고 있다(IDEXX Laboratories). ELISA는 HI 분석 방법에 비해 다수의 시료를 처리할 수 있고 쉽게 실시할 수 있다는 장점이 있다. 그러나, IDEXX Laboratories의 ELISA는 비교적 통상의 바이러스의 검출을 위해 사용될 수 있지만 현재 지역적으로 유행하고 있는 돼지 인플루엔자 바이러스에 대한 항체를 검출하는 데 부적절할 수도 있다(Skibbe et al., 2004, J Vet Diagn Invest vol 16. pp 86-89). 또한, IDEXX Laboratories의 ELISA는 고가로서 그 이용에는 한계가 많았다.

본 발명의 일 실시예는 경제적이고 국내에 적용하기 적합한 돼지 인플루엔자 감염증 혈청 진단 방법 및 이를 위한 혈청 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시예는 동물의 혈청 시료를 인플루엔자 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005) 또는 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)와 접촉시키는 단계; 및

상기 혈청 시료 중 상기 인플루엔자 바이러스 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 인플루엔자 혈청 진단 방법을 제공한다.

상기 동물은 돼지일 수 있다.

상기 혈청 시료는 동물의 혈액으로부터 당업자들에게 알려져 있는 통상의 방법을 실시하여 채취할 수 있다.

상기 동물의 혈청 시료는 인플루엔자 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005) 또는 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)과 접촉될 수 있다. 접촉시키는 방법은 효소-연결된 면역흡수 분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 사용할 수 있다.

인플루엔자 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005)은 KCTC-11078BP로 기탁되어 있다.

인플루엔자 바이러스 항원 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)은 KCTC-11079BP 로 기탁되어 있다.

효소-연결된 면역흡수 분석법에 의할 때, 인플루엔자 바이러스 항원 H1N1은 0.25㎍/100㎕의 농도로 사용할 수 있고, 인플루엔자 바이러스 항원 H3N2는 0.5㎍/100㎕의 농도로 사용할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

효소-연결된 면역흡수 분석법에 의할 때, 혈청 시료 중 상기 인플루엔자 바이러스 항원과 결합된 항체의 존부는 OD(Optical Density) 값을 측정하여 검출할 수 있다. H1N1 바이러스 항원을 접촉시키는 경우 측정된 OD 값이 0.9 이상일 때에는 양성으로 판정할 수 있고, 0.9 미만일 때에는 음성으로 판정할 수 있다. H3N2 바이러스 항원을 접촉시키는 경우 측정된 OD 값이 1.0 이상일 때에는 양성으로 판정할 수 있고, 1.0 미만일 때에는 음성으로 판정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 혈청 진단 방법은 돼지 인플루엔자 혈청 진단을 위해 사용되는 통상의 HI 테스트 또는 ELISA(IDEXX Laboratories)의 결과와 비교하였을 때, 높은 민감도(sensitivity)와 특이도(specificity)를 나타내었다. 따라서, 비용상 고가였던 ELISA를 대체할 수 있고 OD 값만을 측정함으로써 돼지 인플루엔자의 감염증 여부를 간단한 방법으로 판정할 수 있다.

본 발명의 일 실시예는 인플루엔자 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005) 또는 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)를 포함하는 돼지 인플루엔자 혈청 진단용 키트를 제공한다.

인플루엔자 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005)은 KCTC-11078BP로 기탁되었다.

인플루엔자 바이러스 항원 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)은 KCTC-11079BP로 기탁되었다.

키트의 구성 요소는 본 분야에 잘 알려져 있으며, 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005) 또는 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)은 이러한 공지 또는 시판되고 있는 모든 키트에 용이하게 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005) 또는 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)가 포함된 키트는 종류에 관계없이 본 발명의 범위에 속한다.

본 발명의 일 구체예로 인해 경제적이고 진단이 용이한 돼지 인플루엔자 혈청 진단을 할 수 있다.

본 발명을 하기 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 : H1N1 또는 H3N2 항원을 이용한 ELISA

(1) H1N1 또는 H3N2 바이러스의 배양, 농축 및 정제

H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005)(KCTC-11078BP)를 계란에 접종하였다. 11일령된 계란을 요융모막(chorioallantoic) 주입 방법에 의해 접종하였고 37℃에서 배양하였다. 48시간 후에, H1N1으로 감염된 요막액을 멸균 조건에서 수확하였고, 사용할 때까지 -80℃에서 유지하였다.

H1N1 바이러스를 함유하는 요막액을 10,000 x g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리시켜, 세포 찌꺼기를 침전시켰다. 수득한 상층액에 있는 H1N1 바이러스를 4℃에서 폴리에틸렌 글리콜 6000(PEG-6000)(Heyward et al., 1977) 8%(wt/vol)로 침전시켰다. 침전된 H1N1 바이러스를 10,000 x g에서 20분 동안 4℃에서 원심분리시켜 H1N1 바이러스를 펠렛으로 만들었다. 얻은 펠렛을 포스페이트-완충된 식염수(phosphate-buffered saline, PBS)에서 현탁시켰다. 얻은 현탁액에 Triton X-100을 0.2% 최종 농도가 될 때까지 첨가하였고, 4℃에서 8시간 동안 그 다음에 37℃에서 1시간 동안 교반하였다. 15,000 x g에서 10분 동안 원심 분리하였고, 얻은 상층액을 H1N1 항원으로 사용하였다. 요막액 880 ml로 제조된 H1N1 항원의 함량은 38852.32 ㎍이었다. 제조된 항원을 PBS에 용해시켰고, 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)(KCTC-11079BP)를 개의 원위 세뇨관 세포(Madin-Darby Canine Kidney, MDCK) 세포에서 배양하였고, 18시간 후에 수확하였다. H1N1과 마찬가지로 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 바이러스가 접종되지 않은 MDCK 세포를 75 cm² 조직 배양 플라스크에서 길렀다. 형성된 단일층을 PBS로 3회 수세하였다. 각각의 조직 배양 플라스크에, 토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤(Tosyl-L-Phenylalanine Chloromethyl Ketone, TPCK)-처리된 트립신 1 ㎍/ml와 함께 H3N2 바이러스의 4 헤마글루티닌 유닛(Hemagglutinin Unit, HAU) 4 ml를 첨가하였다. 그런 다음 37℃에서 1시간 동안 배양하였고, 각각의 플라스크에서 배지를 교환하였다. 18시간 동안 세포들을 배양한 후에, 세포 변성 효과(cytopathic effect, CPE)가 막 유도되기 시작할 때, H3N2 바이러스로 감염된 세포들을 차가운 PBS로 3회 수세하였고, 세포 스크레이퍼(cell scraper)를 사용하여 긁어내었고, PBS에 현탁시켰다. Triton-X 100을 첨가하였고, H3N2 바이러스로 감염된 MDCK 세포들을 H1N1 항원 제조 방법과 동일한 방법에 따라 처리하였다. 제조된 항원의 단백질 농도는 Pierce BCA 키트(Pierce Chemical, Rockford, IL, USA)를 사용하여 결정하였다. 제조된 항원을 사용할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

(2) 돼지 혈청 시료의 제조

돼지로부터 얻은 혈액 시료를 2,500 x g에서 20분 동안 원심 분리하여 혈청을 분리하였다. 돼지로부터 얻은 모든 혈청 시료를 사용할 때까지 -20℃에서 보관하였다.

(3) ELISA 실시

코팅 버퍼(0.05 M 탄산수소나트륨 버퍼, pH 9.6)에서 H1N1 항원은 0.25 ㎍/100 ㎕의 농도로, H3N2 항원은 0.5 ㎍/100 ㎕의 농도로 희석하였다. 제조한 각각의 항원을 ELISA 용 96-웰 마이크로티터 플레이트(Nalge Nunc International, Naperiville, IL)에 코팅하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하였다. 결합되지 않은 H1N1 항원 또는 H3N2 항원을 제거하기 위해, 플레이트를 수세 용액(PBS, 0.05% Tween 20)으로 3회 수세하였다. 수세한 후에 플레이트를 블록킹 용액(PBS, 5% skim milk) 250 ㎕으로 블록킹시켰다. 돼지 혈청 시료를 혈청 희석제(2.5% skim milk, 0.1% 소 혈청 알부민(BSA). Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 0.05% Tween 20)에 1:10의 비율로 희석하였다. 희석시킨 돼지 혈청 시료를 플레이트에 첨가하였고, 1시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 플레이트를 수세 용액으로 5회 수세하였다. HRP-접합된 염소 항-돼지 IgG 항체(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)를 혈청 희석제로 1:50,000으로 희석하였고, 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 37℃에서 반응시켰고, 수세 용액으로 5회 수세하였다. 플레이트에 테트라메틸 벤지딘(tetramethyl benzidine, TMB) 페록시다제 기질 및 페록시다제 용액 B(Kirkegaard and Perry, Gaithersburg, MD)를 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 10분 동안 반응시켰고, 규칙적으로 흔들었다. 색깔이 나타나기 시작하면 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험예 : 본 발명의 일 실시예에 따른 ELISA 의 민감도와 특이도 결정

총 480개의 시료를 대상으로 하고 통상의 HI 테스트 결과를 기준으로 하여, 본 발명 ELISA와 IDEXX ELISA의 민감도와 특이도를 비교하였다.

(1) 통상의 HI 테스트 실시

H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005)(KCTC-11078BP)과 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)(KCTC-11079BP)을 대상으로 통상의 HI 테스트(World Organization for Animal Health, OIE)를 실시하여, 혈청 시료 480개를 음성과 양성으로 각각 분류하였다.

상기 실시예에서 기술된 방법과 동일한 방법으로 제조된 돼지 혈청 시료를 56℃에서 30분 동안 가열하였고, 25%(w/v) 카올린으로 처리하였다. 같은 부피의 50% 수탉(rooster) 적혈구 세포를 넣고 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그런 다 음, 1500 rpm에서 15분 동안 원심분리하였고, 상층액을 포집하였다. 통상의 HI 테스트(World Organization for Animal Health, OIE)에 따라 실시하였다. 간략하게는, 상기 처리된 혈청 시료를 연속적으로 2진 희석한 시료 25㎕와 8 HA 유닛(unit)을 같은 부피로 U-형태의 마이크로티터 플레이터(microtiter plater)에서 1시간 동안 실온에서 배양하였다. 그런 다음, 0.5% 수탉 적혈구 세포 50㎕를 마이크로티터 플레이터 각각의 웰에 첨가하였고, 실온에서 40분 동안 반응시켰다. 각각의 시료에서 HI 항체 역가는 바이러스의 8 HA 유닛의 혈구응집 활성을 완전히 억제하는 최고 희석 농도의 역수로 표시하였다.

아이오와(Iowa) 대학의 윤경진 박사님으로부터 받은 H1N1 SIV(A/Swine/IA/1979)와 H3N2 SIV(A/Swine/IA/41305/1998)에 대한 항혈청(양성 대조군)과 녹십자의 송대섭 박사님으로부터 받은 음성 혈청(음성 대조군)을 사용하여, HI 테스트 컷-오프(cut-off) 값을 결정하였다. 양성 대조군과 음성 대조군을 사용한 HI 테스트는 1:10 내지 1:20의 역가는 바이러스 서브타입 간의 비특이적인 반응 또는 상호-반응성(cross-reactivity) 때문일 수 있음을 보여주었다. 컷-오프 값을 1:40으로 정하고 1:40 또는 그 이상의 HI 역가는 양성이라고 간주하였다.

<표 5> HI 테스트 결과

HI 테스트 결과	시료의 개수
HI 테스트 결과	H1N1	H3N2
<10	59	57
10	47	86
20	74	67
40	64	60
80	65	58
160	93	48
320	60	46
640	18	21
1280	0	26
2560	0	11
전체	480	480

HI 테스트에서, H1N1 바이러스에 대해서는, 300개의 혈청 시료가 양성으로 나왔고, 180개의 혈청 시료가 음성으로 나왔다. H3N2 바이러스에 대해서는, 270개의 혈청 시료가 양성으로 나왔고, 210개의 시료가 음성으로 나왔다. HI 역가는 H1N1은 <10부터 640까지 나왔고 H3N2는 <10부터 2560까지 나왔다.

(2) 본 발명 ELISA 의 컷- 오프 값 결정

본 발명의 ELISA로부터 얻은 OD 값과 HI 테스트 결과를 비교하여 혈청을 양성과 음성으로 판정하기 위한 컷-오프 값을 결정하였다. HI 테스트 결과 양성 혈청을 양성으로 판정할 수 있고 음성 혈청을 음성으로 판정할 수 있는 값을 컷-오프 값으로 결정하였다. 즉, 상기 HI 테스트와 유사한 결과를 나타내는 OD 값을 컷-오프 값으로 결정하였다. 컷-오프 값은 H1N1의 경우 0.9, H3N2의 경우 1.0으로 결정하였다.

(3) 통상의 ELISA 실시

통상의 ELISA 키트(IDEXX Laboratories, Westbrook, ME)를 사용하여, 본 발명에 따른 ELISA 키트와 진단 결과를 비교하였다. 통상의 ELISA 키트의 제조자의 지시 사항에 따라 테스트를 수행하였다. 테스트할 돼지 혈청 시료를 희석제에서 1:40으로 희석하였다. 희석된 시료 100 ㎕를 ELISA 키트의 각각의 웰에 첨가하였고 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응시킨 후에, 각각의 웰을 수세 용액으로 3회 수세하였다. 과산화수소-접합된 항-IgG 2차 항체 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였고 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 각각의 웰을 수세 용액으로 3회 수세한 후에, 플레이트에 기질 용액 100 ㎕를 첨가하였고, 15분 동안 실온에서 반응시켰고, 정지 용액(stop solution) 100 ㎕를 첨가하였다. 각각의 웰에 대해 655nm에서 OD를 측정하였다. 측정된 OD 값을 S/P ratio(Sample-to-Positive ratio)으로 전환하였다.

돼지 인플루엔자 H1N1 항체 시료에 대해서는, S/P ratio가 0.4 이상이면 그 시료는 양성으로 판정하였다. 돼지 인플루엔자 H3N2 항체 시료에 대해서는, S/P ratio가 0.4 이상이면 양성으로, 0.3 이상 및 0.4 미만이면 의양성으로, 0.3 미만이면 음성으로 판정하였다.

(4) 본 발명의 일 실시예에 따른 ELISA 와 통상의 IDEXX ELSIA 의 민감도와 특이도

HI 테스트 결과를 기준으로 본 발명에 따른 ELISA와 통상의 IDEXX ELISA의 민감도와 특이도를 구하고 비교하였다.

HI 테스트의 컷-오프 값은 1:40으로 하였다. 본 발명 H1N1 ELSIA의 컷-오프 값은 0.9이었고, H3N2 ELISA의 컷-오프 값은 1.0이었다. S/P 값은 통상의 IDEXX ELISA의 제조자에 의해 제공된 식에 따라 계산하였다. H1N1 항체의 경우, S/P 값이 0.4 이상이면 양성으로 판정하였다. H3N2 항체의 경우, S/P 값이 0.4 이상이면 양성으로 판정하였고, 0.4 미만에서 0.3 이상이면 의양성으로 판정하였다. 본 발명 ELISA 또는 IDEXX ELISA의 민감도는 본 발명 ELISA 또는 IDEXX ELISA에서 양성이라고 판정된 혈청 시료와 HI 테스트에서 양성이라고 판정된 혈청 시료의 비율로 결정하였다. 본 발명 ELISA 또는 IDEXX ELISA의 특이도는 본 발명 ELISA 또는 IDEXX ELISA에서 음성이라고 판정된 혈청 시료와 HI 테스트에서 음성이라고 판정된 혈청 시료의 비율로 결정하였다. 그 결과는 표 6과 같다.

<표 6> 민감도와 특이도

HI 테스트	민감도				특이도
	IDEXX ELISA		본 발명 ELISA		IDEXX ELISA		본 발명 ELISA
480	H1N1	H3N2	H1N1	H3N2	H1N1	H3N2	H1N1	H3N2
	85.3%	82.6%	95.0%	95.1%	100%	98.1%	97.8%	96.2%

표 6에서 살핀 바와 같이, 사용한 바이러스 H1N1, H3N2 두 경우 모두에서 통상의 IDEXX ELISA에 비해 민감도가 더 높은 결과를 얻었다. 특이도의 경우 통상의 IDEXX ELISA가 약간 더 높지만 본 발명 ELISA 역시 95% 이상이었다. 그러므로, 돼지에서 국내에 유행하는 바이러스에 대한 항체를 측정할 때 본 발명의 ELISA가 더 적합함을 알 수 있다.

(5) 본 발명의 일 실시예에 따른 ELISA 와 통상의 IDEXX ELSIA 의 상관 관계 분석

(i) H1N1 에 대한 상관 관계 분석

상기 실험예에 따른 480개의 혈청 시료로부터 얻은 결과를 이용하여, 본 발명에 따른 ELISA 및 통상의 IDEXX ELISA와 HI 테스트의 상관 관계를 분석하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

<표 7> 본 발명 ELISA, 통상의 IDEXX ELISA와 HI 테스트의 일치 도(agreement)

HI 테스트	HI 테스트 결과	IDEXX ELISA			본 발명 ELISA
HI 테스트	HI 테스트 결과	양성	음성	일치도(%)	양성	음성	일치도(%)
양성	300	256(A)	44(B)	0.908	285(a)	15(b)	0.960
음성	180	0(C)	180(D)	0.908	4(c)	176(d)	0.960

일치도 계산 방법: HI 테스트의 역가는 1:40으로 하였고, S/P 값은 통상의 IDEXX ELISA의 제조자에 의해 제공된 식에 따라 계산하였다. S/P 값이 0.4 이상이면 양성으로 판정하였다. 본 발명 ELISA의 컷-오프 값은 0.9로 하였다. IDEXX ELISA의 일치도(agreement)는 (A + D/A + B + C + D) x 100으로 하였고, 본 발명 ELISA의 일치도는 (a + d/a + b + c + d) x 100으로 하였다.

상기 표 7에서 나타난 바와 같이, 본 발명 ELISA와 HI 테스트의 일치도는 0.960으로 나왔고, IDEXX ELISA와 HI 테스트의 일치도는 0.908로 나왔다. 따라서, 두 ELISA 모두 HI 테스트와 높은 일치도를 보였지만 본 발명 ELISA가 HI 테스트와 더 일치하는 것을 알 수 있다.

혈청 시료 421개를 대상으로 하여 본 발명의 ELISA의 OD와 HI 역가의 상관 관계를 도시하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 상관 계수는 0.8816으로 나왔다. 도 1은 HI 역가와 본 발명 ELISA의 OD 값이 상관 관계에 있음을 보여준다.

( ii ) H3N2 에 대한 상관 관계 분석

상기와 동일한 방법으로 H3N2에 대하여, 본 발명에 따른 ELISA 및 통상의 IDEXX ELISA와 HI 테스트의 상관 관계를 분석하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.

<표 8> 본 발명 ELISA, 통상의 IDEXX ELISA와 HI 테스트의 일치도

HI 테스트	HI 테스트 결과	IDEXX ELISA				본 발명 ELISA
HI 테스트	HI 테스트 결과	양성	의양성	음성	일치도(%)	양성	음성	일치도(%)
양성	270	180(A)	43(B)	47(C)	0.894	257(a)	13(b)	0.956
음성	210	0(D)	4(E)	206(F)	0.894	8(c)	202(d)	0.956

계산 방법: HI 테스트의 역가는 1:40으로 하였고, S/P 값은 통상의 IDEXX ELISA의 제조자에 의해 제공된 식에 따라 계산하였다. S/P 값이 0.4 이상이면 양성으로 판정하였고, 0.4 미만에서 0.3 이상이면 의양성으로 판정하였다. 본 발명 ELISA의 컷-오프 값은 0.9로 하였다. IDEXX ELISA의 일치도는 (A + B + D/A + C + D) x 100으로 하였고, 본 발명 ELISA의 일치도는 (a + d/a + b + c + d) x 100으로 하였다. 따라서, 본 발명의 ELISA는 통상의 ELISA보다 일치도가 더 높음을 알 수 있다.

혈청 시료 423개를 대상으로 하여 본 발명의 ELISA의 OD와 HI 역가의 상관 관계를 도시하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. 상관 계수는 0.8783으로 나왔다. 도 2는 HI 역가와 본 발명 ELISA의 OD 값이 상관 관계에 있음을 보여준다.

도 1은 H1N1 바이러스에 대하여 본 발명의 ELISA의 OD와 HI 역가의 상관 관계를 보여준다.

도 2는 H3N2 바이러스에 대하여 본 발명의 ELISA의 OD와 HI 역가의 상관 관계를 보여준다.

Claims

동물의 혈청 시료를 인플루엔자 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005)(KCTC-11078BP) 또는 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)(KCTC-11079BP)와 접촉시키는 단계; 및

상기 혈청 시료 중 상기 인플루엔자 바이러스 항원과 결합된 항체의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 인플루엔자 혈청 진단 방법.
제1항에 있어서, 효소-연결된 면역흡수 분석법(ELISA)에 의해 OD(Optical Density) 값을 측정하여 상기 인플루엔자 바이러스 항원에 결합된 항체의 존재를 검출하는 것인 혈청 진단 방법.
제1항에 있어서, 상기 동물은 돼지인 것인 혈청 진단 방법.
제1항의 인플루엔자 바이러스 항원 H1N1(A/Swine/Korea/GC0503/2005)(KCTC-11078BP) 또는 H3N2(A/Swine/Korea/GC0407/2005)(KCTC-11079BP)를 포함하는 돼지 인플루엔자 혈청 진단용 키트.