ES2223040T3 - Bibliotecas de receptor heterodimerilo que usan fagemidos. - Google Patents

Abstract

FAGO FILAMENTOSO QUE COMPRENDE UNA MATRIZ DE PROTEINAS CPVIII ENCAPSULANDO UN GENOMA QUE CODIFICA PRIMER Y SEGUNDA POLIPEPTIDAS DE UN RECEPTOR QUE ENSAMBLA ANTIGENICAMENTE, TAL COMO UN ANTICUERPO, Y UN RECEPTOR COMPRENDIDO EN LA PRIMERA Y SEGUNDA SUPERFICIES INTEGRADAS DE LAS POLIPEPTIDAS DENTRO DE LA MATRIZ A TRAVES DE LA MEMBRANA DE PROTEINA DE LA CUBIERTA DE UN FAGO FILAMENTOSO FUSIONADO AL DOMINIO DE SUJECION DE AL MENOS UNA DE LAS POLIPEPTIDAS.

Description

Bibliotecas de receptor heterodimerilo que usan fagemidos.

Campo técnico

La presente invención se refiere a vectores de clonación y a procedimientos para producir una biblioteca de moléculas de ADN capaces de expresar un polipéptido de fusión en la superficie de una partícula de fago filamentoso.

Antecedentes

Los bacteriófagos filamentosos son un grupo de virus relacionados que infectan bacterias. Se denominan filamentosos porque son partículas largas y delgadas que comprenden una cápsula elongada que envuelve el ácido desoxirribonucleico (ADN) que forma el genoma bacteriófago. Los bacteriófagos filamentosos F. pili (fago Ff) infectan sólo bacterias gram-negativas adsorbiéndose específicamente sobre la punta de F. pili, e incluye fd, f1 y M13.

La cápsula madura del fago Ff comprende un recubrimiento de cinco productos génicos codificados por fago: cpVIII, el producto de proteína de recubrimiento principal del gen VIII que forma en grueso de la cápsula; y cuatro proteínas de recubrimiento minoritarias, cpIII y cpIV en un extremo de la cápsula y cpVII y cpIX en el otro extremo de la cápsula. La longitud de la cápsula está formada por 2500 a 3000 copias de cpVIII en una disposición de hélice ordenada que forma la estructura de filamento característica. Están presentes aproximadamente cinco copias de cada una de las proteínas de recubrimiento minoritarias en los extremos de la cápsula. La proteína codificada por el gen III (cpIII) está presente típicamente en 4 a 6 copias en un extremo de la cápsula y sirve como receptor para la unión del fago a su hospedador bacteriano en la fase inicial de infección. Para revisiones detalladas de la estructura del fago Ff, véanse Rasched et al., Microbiol. Rev., 50: 401-427 (1986); y Model et al. en "The Bacteriophages, Volume 2", R. Calendar, Ed., Plenum Press, pág. 375-456 (1988).

El ensamblaje de una partícula de fago Ff implica mecanismos altamente complejos. Las partículas de fago no se ensamblan en una célula hospedadora, en lugar de ello se ensamblan durante la extrusión del genoma viral a través de la membrana de la célula hospedadora. Antes de la extrusión, la proteína de recubrimiento principal cpVIII y la proteína de recubrimiento minoritaria cpIII se sintetizan y transportan a la membrana celular del hospedador. Tanto cpVIII como cpIII se anclan a la membrana de la célula hospedadora antes de su incorporación a la partícula madura. Además, se produce el genoma viral y se recubre con proteína cpV. Durante el proceso de extrusión, se priva al ADN genómico recubierto con cpV del recubrimiento de cpV y simultáneamente se recubre con las proteínas de recubrimiento maduras. Los mecanismos de ensamblaje que controlan la transferencia de estas proteínas de la membrana a la partícula no se conocen actualmente.

Ambas proteínas cpIII y cpVIII incluyen dos dominios que proporcionan señales para el ensamblaje de la partícula de fago madura. El primer dominio es una señal de secreción que dirige la proteína recién sintetizada a la membrana de la célula hospedadora. La señal de secreción se localiza en la terminación amino del polipéptido y orienta al polipéptido al menos a la membrana celular. El segundo dominio es un dominio de anclaje a membrana que proporciona señales para la asociación con la membrana de la célula hospedadora y para la asociación con la partícula de fago durante el ensamblaje. Esta segunda señal para ambas cpVIII y cpIII comprende al menos una región hidrófoba para atravesar la membrana.

La cpVIII se ha estudiado extensamente como proteína de membrana modelo debido a que puede integrarse en bicapas lipídicas tales como la membrana celular con una orientación asimétrica, con la terminación amino ácida hacia el exterior y la terminación carboxi básica hacia el interior de la membrana. La proteína madura es de aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, de los cuales 11 residuos proporcionan la terminación carboxi, 19 residuos proporcionan la región transmembrana hidrófoba, y los residuos restantes comprenden la terminación amino. Se ha realizado una considerable investigación sobre la región de señal de secreción de cpVIII para avanzar en el estudio de la síntesis de proteínas de membrana y la orientación a las membranas. Sin embargo, se sabe poco de los cambios que se toleran en la estructura de la región de anclaje a la membrana de cpVIII que permitirían el ensamblaje de las partículas de fago.

La manipulación de la secuencia de cpIII muestra que la extensión de 23 residuos aminoacídicos C-terminal de aminoácidos hidrófobos normalmente responsable de una función de anclaje a membrana puede alterarse de diversas maneras y retener la capacidad de asociarse a membranas. Sin embargo, estas proteínas cpIII de anclaje modificado pierden su capacidad de complementar genéticamente mutantes del gen III, indicando que los requisitos de un anclaje a membrana para ensamblaje funcional no se han elucidado.

Se han descrito vectores de expresión basados en fago Ff en los que la secuencia de residuos aminoacídicos completa de cpIII se modificaba mediante la inserción de "epítopos" polipeptídicos cortos [Parmely et al., Gene, 73: 305-318 (1988); y Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382 (1990)] o de una secuencia de residuos aminoacídicos que define un dominio de anticuerpo monocatenario. McCafferty et al., Science, 348: 552-554 (1990). Estas proteínas híbridas se sintetizaron y ensamblaron en partículas de fago en cantidades de aproximadamente 5 copias por partícula, una densidad a la que se encuentra habitualmente la cpIII normal. Sin embargo, estas proteínas de fusión expresadas incluyen la secuencia de residuos aminoacídicos completa de cpIII, y no se sugieren proteínas de fusión que utilizan sólo el dominio de anclaje a la membrana carboxi terminal de cpIII.

Además, no se ha descrito ningún sistema de expresión en el que la proteína de recubrimiento de fago se haya modificado por ingeniería genética para permitir el ensamblaje de una molécula heterodimérica que sea funcional y capaz de incorporación al recubrimiento de una partícula de fago.

Breve sumario de la invención

Se ha descubierto una nueva tecnología de integración en superficie para expresar un producto génico recombinante heterodimérico en la superficie de un fago filamentoso que contiene el gen recombinante. La invención utiliza un dominio de anclaje a la membrana de la proteína de recubrimiento de fago filamentoso como medio para unir el producto génico y el gen durante la etapa de ensamblaje de la replicación de fagos filamentosos.

Es decir, durante la replicación de fagos filamentosos, las proteínas de recubrimiento se ensamblan en una matriz que encapsula el genoma de fago. Se ha descubierto ahora que (1) el ensamblaje de fago no se desestabiliza cuando están presentes proteínas de recubrimiento de fago filamentoso recombinante, (2) las proteínas de recubrimiento de fago filamentoso pueden integrarse en la matriz de ensamblaje y (3) la integración en la matriz puede dirigirse para que ocurra con una orientación accesible a la superficie.

La presente invención puede aplicarse ventajosamente a la producción de receptores heterodiméricos de especificidad predeterminada, concretamente puede utilizarse para producir anticuerpos, receptores de células T y similares que se unen a un ligando preseleccionado.

Por tanto, la presente invención proporciona la unión de las funciones de reconocimiento de receptor heterodimérico y replicación de fago filamentoso en un procedimiento para el aislamiento de un receptor heterodimérico y el gen que codifica ese receptor. El procedimiento produce un fago filamentoso que comprende una matriz de proteínas codificadas por el gen VIII que encapsula un genoma recombinante. El genoma recombinante contiene genes que codifican los polipéptidos de receptor heterodimérico. El receptor heterodimérico se integra en la superficie en la matriz encapsulante mediante un dominio de anclaje a la membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso, que se condensa mediante un enlace peptídico durante la traducción con uno de los polipéptidos de receptor heterodimérico. Los polipéptidos de receptor heterodimérico y los genes que codifican los polipéptidos se unen físicamente durante la etapa de ensamblaje del ciclo de replicación de fagos. La unión específica del fago recubierto con receptor a un soporte sólido proporciona ventajosamente un medio para aislar un genoma recombinante que codifica un receptor heterodimérico deseado de una diversa biblioteca de genomas recombinantes.

En una realización, la presente invención contempla una molécula de anticuerpo que comprende polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera, comprendiendo dicho polipéptido de cadena pesada un dominio V_{H} flanqueado por un dominio de señal de secreción procariótica amino-terminal y un dominio de anclaje a membrana de fago filamentoso carboxi-terminal, comprendiendo dicho polipéptido de cadena ligera un dominio V_{L} condensado con un dominio de señal de secreción procariótica amino-terminal.

En otra realización, la presente invención contempla un vector para la expresión de un polipéptido de fusión, comprendiendo dicho vector secuencias de ADN traducible cadena arriba y cadena abajo unidas operativamente mediante una secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional de un inserto de ADN, codificando dicha secuencia cadena arriba una señal de secreción procariótica, y codificando dicha secuencia cadena abajo un anclaje a membrana de fago filamentoso, estando dichas secuencias de ADN traducible unidas operativamente a un conjunto de señales de expresión de ADN para la expresión de dichas secuencias de ADN traducibles en forma de partes de dicho polipéptido de fusión.

Breve descripción de las figuras

En las figuras que forman parte de esta descripción:

La Figura 1 ilustra un diagrama esquemático de la molécula de inmunoglobulina mostrando los rasgos estructurales principales. El área en un círculo de la cadena pesada que representa la región variable (V_{H}), un polipéptido que contiene una parte biológicamente activa (de unión a ligando) de esa región, y un gen que codifica ese polipéptido se producen mediante los procedimientos de la presente invención.

La Figura 2A es un diagrama esquemático de una cadena pesada (H) de IgG humana (subclase IgG1). La numeración es desde la terminación N a la izquierda a la terminación C a la derecha. Obsérvese la presencia de cuatro dominios, conteniendo cada uno un enlace disulfuro intracatenario (S-S) que abarca aproximadamente 60 residuos aminoacídicos. El símbolo CHO representa carbohidrato. La región V de la cadena pesada (H) (V_{H}) se parece a V_{L} en que tiene tres regiones hipervariables CDR (no mostradas).

La Figura 2B es un diagrama esquemático de una cadena ligera (kappa) humana (panel 1). La numeración es desde la terminación N a la izquierda a la terminación C a la derecha. Obsérvese el enlace disulfuro intracatenario (S-S) que abarca aproximadamente el mismo número de residuos aminoacídicos en los dominios V_{L} y C_{L}. El panel 2 muestra las localizaciones de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en el dominio V_{L}. Los segmentos fuera de las CDR son los segmentos estructurales (FR).

La Figura 3 ilustra la secuencia del ADN sintético bicatenario insertado en lambda Zap para producir el vector de expresión lambda Hc2. La preparación del inserto de ADN sintético bicatenario se describe en el ejemplo 1a(ii). Los diversos rasgos requeridos para que este vector exprese los homólogos de ADN que codifican V_{H} incluyen el sitio de unión a ribosoma Shine-Dalgarno, una secuencia líder para dirigir la proteína expresada al periplasma como se describe por Mouva et al., J. Biol. Chem., 255: 27, 1980, y diversos sitios de enzimas de restricción utilizados para unir operativamente los homólogos de V_{H} al vector de expresión. La secuencia del vector de expresión de V_{H} contiene también una corta secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos encontrados típicamente en las regiones variables de la cadena pesada (cadena principal de V_{H}). Esta cadena principal de V_{H} está justo cadena arriba y con la lectura apropiada como los homólogos de ADN de V_{H} que se unen operativamente en los sitios de clonación Xho I y Spe I. Las secuencias de las cadenas superior e inferior del inserto de ADN sintético bicatenario se enumeran respectivamente como SEC Nº ID 1 y SEC Nº ID 2. El inserto de ADN sintético se liga direccionalmente a lambda Zap II digerido con las enzimas de restricción Not l y Xho I para formar el vector de expresión lambda Hc2.

La Figura 4 ilustra los rasgos principales del vector de expresión bacteriana lambda Hc2 (vector de expresión de V_{H}). La secuencia de ADN sintético de la Figura 3 se muestra en la parte superior junto con el promotor de polimerasa T_{3} de lambda Zap II. Se muestra la orientación del inserto en lambda Zap II. Se insertan los homólogos de ADN de V_{H} en los sitios de clonación Xho I y Spe I. La lectura mediante la transcripción produce el epítopo decapeptídico (marcaje) que se localiza justo 3' del sitio de clonación.

La Figura 5 ilustra la secuencia del ADN sintético bicatenario insertado en lambda Zap para producir un vector de expresión lambda Lc2. Los diversos rasgos requeridos para que este vector exprese los homólogos de ADN que codifican V_{H} se describen en la Figura 3. Los homólogos de ADN que codifican V_{L} se unen operativamente a la secuencia Lc2 en los sitios de restricción Sac I y Xho I. Las secuencias de las cadenas superior e inferior del inserto de ADN sintético bicatenario se enumeran respectivamente como SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 4. El inserto de ADN sintético se liga direccionalmente en lambda Zap II digerido con las enzimas de restricción Sac I y Not I para formar el vector de expresión lambda Lc2.

La Figura 6 ilustra los rasgos principales del vector de expresión Lc2 (vector de expresión de V_{L}). La secuencia de ADN sintético de la Figura 5 se muestra en la parte superior junto con el promotor de polimerasa T_{3} de lambda Zap II. Se muestra la orientación del inserto en lambda Zap II. Se insertan los homólogos de ADN de V_{L} en los sitios de clonación Sac I y Xho I.

La Figura 7 ilustra el vector de expresión dicistrónica, pComb, en forma de un vector de expresión fagémido. Para producir pComb, los fagémidos se escindieron primero de los vectores de expresión, lambda Hc2 y lambda Lc2, utilizando un protocolo de escisión in vivo según las instrucciones de los fabricantes (Stratagene, La Jolla, California). El vector de expresión pComb se prepara a partir de lambda Hc2 y lambda Lc2 que no contienen homólogos de ADN que codifican V_{H} o que codifican V_{L}. El protocolo de escisión in vivo trasladó el inserto clonado de los vectores lambda Hc2 y Lc2 a un vector fagémido. Los fagémidos resultantes contenían las mismas secuencias nucleotídicas para la clonación y expresión de fragmentos de anticuerpo que los vectores originales. Los vectores de expresión fagémidos Hc2 y Lc2 se digirieron separadamente con las enzimas de restricción Sca I y EcoR I. Los fagémidos linealizados se ligaron mediante las terminaciones cohesivas Sca I y EcoR I para formar el vector dicistrónico (combinatorio) pComb.

La Figura 8 ilustra un diagrama esquemático de la composición del vector fagémido pCBAK, la ruta para el ensamblaje de Fab y la incorporación al recubrimiento de fago. El vector porta el gen marcador cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) además de las secuencias de residuos nucleotídicos que codifican el polipéptido de fusión Fd-cpVIII y la cadena kappa. El origen de replicación del fago f1 facilita la generación de un fagémido monocatenario. La expresión inducida por tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) de un mensaje dicistrónico que codifica la fusión Fd-cpVIII (V_{H}, C_{H}1, cpVIII) y la cadena ligera (V_{L}, C_{L}) conduce a la formación de las cadenas pesada y ligera. Cada cadena se suministra al espacio periplásmico mediante la secuencia diana pelB, que se escinde posteriormente. La cadena pesada se ancla a la membrana mediante la fusión cpVIII, mientras que la cadena ligera se secreta al periplasma. La cadena pesada se ensambla en presencia de cadena ligera formando moléculas Fab. Las Fab se incorporan a partículas de fago mediante cpVIII (puntos negros).

La Figura 9 ilustra la localización micrográfica electrónica de partículas de oro coloidal de 5-7 nm recubiertas con conjugado NPN-BSA a lo largo de la superficie del fago filamentoso, y del fago que emerge de una célula bacteriana. El panel 9A muestra al fago filamentoso que emerge de la superficie de la célula bacteriana marcado específicamente con las partículas de oro coloidal recubiertas con antígeno BSA-NPN. El panel 9B muestra una parte de un fago filamentoso maduro sobre cuya longitud se exhibe el marcaje de los sitios de unión a antígeno.

La Figura 10 ilustra los resultados de un ELISA de dos sitios para ensayar la presencia y función de un anticuerpo Fab unido a la superficie de partículas bacteriófagas como se describe en el ejemplo 4b. Para la expresión del anticuerpo Fab sobre las superficies del fago, se transformaron células XL1-Blue con el vector de expresión fagémido pCBAK8-2b. El inductor, tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG), se mezcló con la suspensión bacteriana a una concentración final de 1 mM durante 1 hora. Se mezcló después fago auxiliar con la suspensión bacteriana para iniciar la generación de copias de la cadena con sentido del ADN de fagémido. Después de un periodo de mantenimiento de dos horas, se recogieron los sobrenadantes bacterianos que contienen partículas bacteriófagas para ensayo en ELISA.

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Se exhibió la unión titulable específica de partículas bacteriófagas que expresan NPN-Fab a placas recubiertas con NPN. No se detectó unión con fago auxiliar solo.

La Figura 11 ilustra la inhibición de la unión del bacteriófago que expresa NPN-Fab con placas recubiertas con antígeno NPN mediante la adición de cantidades crecientes de hapteno libre. Los ensayos se realizaron como se describe en la Figura 10. Se observó la inhibición completa de la unión con 5 ng de hapteno NPN libre añadidos.

La Figura 12 ilustra esquemáticamente el proceso de mutagenizar la región CDR3 de un fragmento de cadena pesada dando como resultado la alteración de la especificidad de unión. Los cebadores oligonucleotídicos se indican por barras negras. El proceso se describe en el ejemplo 6.

La Figura 13 ilustra las secuencias aminoacídicas y las correspondientes SEC Nº ID de la cadena pesada de la región CDR3 de los clones de partida y seleccionados, y las afinidades de los clones por la fluoresceína libre y FI-BSA. El asterisco indica la Kd aproximada determinada mediante ELISA competitivo.

La Figura 14 ilustra las secuencias aminoacídicas y SEC Nº ID correspondientes de la cadena ligera de la región CDR3 de los clones de partida y seleccionados, y las afinidades de los clones por la fluoresceína libre y FI-BSA. El asterisco indica la Kd aproximada determinada mediante ELISA competitivo.

Descripción detallada de la invención A. Definiciones

Residuos aminoacídicos: Se formó un aminoácido tras digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptídicos. Los residuos aminoacídicos descritos en la presente memoria están preferiblemente en forma isomérica "L". Sin embargo, los residuos en forma isomérica "D" pueden sustituir a cualquier residuo L-aminoacídico a condición de que la propiedad funcional deseada sea retenida por el polipéptido. NH_{2} designa el grupo amino libre presente en la terminación amino de un polipéptido. COOH designa el grupo carboxi libre presente en la terminación carboxi de un polipéptido. Manteniendo la nomenclatura polipeptídica estándar (descrita en J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969) y adoptada en 37 C.F.R. 1.822(b)(2)), se muestran las abreviaturas para los residuos aminoacídicos en la siguiente tabla de correspondencia:

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA DE CORRESPONDENCIA

1

Debe observarse que todas las secuencias de residuos aminoacídicos representadas en la presente memoria mediante fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de terminación amino a terminación carboxi. Además, la expresión "residuo aminoacídico" se define ampliamente para incluir los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia y aminoácidos modificados e inusuales, tales como los enumerados en 37 CFR 1.622 (b) (4). Además, debe observarse que un guión al inicio o al final de una secuencia de residuo aminoacídico indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más residuos aminoacídicos o un enlace covalente con un grupo amino-terminal tal como NH_{2} o acetilo o a un grupo carboxi-terminal tal como COOH.

Nucleótido: Una unidad monomérica de ADN o ARN constituida por un resto azúcar (pentosa), un fosfato y una base heterocíclica nitrogenada. La base está unida al resto azúcar mediante el carbono glicosídico (carbono 1' de la pentosa), y esa combinación de base y azúcar es un nucleósido. Cuando el nucleósido contiene un grupo fosfato unido a la posición 3' o 5' de la pentosa se designa como un nucleótido. Una secuencia de nucleótidos unidos operativamente se designa típicamente en la presente memoria como una "secuencia de bases" o "secuencia nucleotídica", y sus equivalentes gramaticales, y se representa en la presente memoria por una fórmula cuya orientación de izquierda a derecha está en la dirección convencional de terminación 5' a terminación 3'.

Par de bases (pb): Una asociación de adenina (A) con timina (T) o de citosina (C) con guanina (G) en una molécula de ADN bicatenaria. En ARN, el uracilo (U) sustituyente a la timina.

Ácido nucleico: Un polímero mono- o bicatenario de nucleótidos.

Polinucleótido: Un polímero mono- o bicatenario de nucleótidos. Como se utiliza en la presente memoria, "polinucleótido" y sus equivalentes gramaticales incluirán el intervalo completo de ácidos nucleicos. Un polinucleótido designará típicamente una molécula de ácido nucleico que comprende una cadena lineal de dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de las condiciones últimas de uso, como es bien conocido en la técnica. Los polinucleótidos de la presente invención incluyen cebadores, sondas, segmentos de ADN/ARN, oligonucleótidos u "oligos" (polinucleótidos relativamente cortos), genes, vectores, plásmidos y similares.

Gen: Un ácido nucleico cuya secuencia nucleotídica codifica un ARN o polipéptido. Un gen puede ser de ARN o ADN.

ADN dúplex: Una molécula de ácido nucleico bicatenaria que comprende dos cadenas de polinucleótidos sustancialmente complementarias mantenidas juntas por uno o más puentes de hidrógeno entre cada una de las bases complementarias presentes en un par de bases del dúplex. Debido a que los nucleótidos que forman un par de bases pueden ser una base ribonucleotídica o una base desoxirribonucleotídica, la expresión "ADN dúplex" designa tanto un dúplex ADN-ADN que comprende dos cadenas de ADN (ADN bc), como un dúplex ARN-ADN que comprende una cadena de ADN y otra de ARN.

Bases complementarias: Nucleótidos que normalmente se aparean cuando el ADN o ARN adopta una configuración bicatenaria.

Secuencia nucleotídica complementaria: Una secuencia de nucleótidos en una molécula monocatenaria de ADN o ARN que es suficientemente complementaria con la de otra cadena monocatenaria para hibridar específicamente con ella con los consiguientes enlaces de hidrógeno.

Conservado: Una secuencia nucleotídica está conservada con respecto a una secuencia preseleccionada (referencia) si hibrida no aleatoriamente con un complemento exacto de la secuencia preseleccionada.

Hibridación: El apareamiento de secuencias nucleotídicas sustancialmente complementarias (cadenas de ácido nucleico) para formar un dúplex o heterodúplex mediante el establecimiento de enlaces de hidrógeno entre los pares de bases complementarias. Es una interacción específica, concretamente no aleatoria, entre dos polinucleótidos complementarios que puede inhibirse competitivamente.

Análogo nucleotídico: Una nucleótido de purina o pirimidina que difiere estructuralmente de A, T, G, C o U pero que es suficientemente similar para sustituir al nucleótido normal en una molécula de ácido nucleico.

Homólogo de ADN: Es un ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica conservada preseleccionada y una secuencia que codifica un receptor capaz de unirse a un ligando preseleccionado.

Molécula de ADN recombinante (ADNr): Una molécula de ADN producida mediante la unión operativa de dos segmentos de ADN. Por tanto, una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN híbrido que comprende al menos dos secuencias nucleotídicas no encontradas normalmente juntas en la naturaleza. Los ADNr que no tienen un origen biológico común, concretamente evolutivamente diferentes, se dice que son "heterólogos".

Vector: Una molécula de ADNr capaz de replicación autónoma en una célula y a la que puede unirse operativamente un segmento de ADN, por ejemplo un gen o polinucleótido, de modo que dé lugar a la replicación del segmento adjuntado. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes que codifican uno o más polipéptidos se designan en la presente memoria como "vectores de expresión". Los vectores particularmente importantes permiten la clonación de ADNc (ADN complementario) de ARNm producidos utilizando transcriptasa inversa.

Receptor: Un receptor es una molécula, tal como una proteína, glicoproteína y similares, que puede unirse específicamente (no aleatoriamente) a otra molécula.

Anticuerpo: El término anticuerpo en sus diversas formas gramaticales se utiliza en la presente memoria para designar moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, concretamente moléculas que contienen un sitio de combinación con anticuerpo o paratopo. Las moléculas de anticuerpo ejemplares son moléculas de inmunoglobulina intactas, moléculas de inmunoglobulina sustancialmente intactas y partes de una molécula de inmunoglobulina, incluyendo aquellas porciones conocidas en la técnica tales como Fab, Fab', F(ab')_{2} y F(v).

Sitios de combinación con anticuerpo: Un sitio de combinación con anticuerpo es aquella parte estructural de una molécula de anticuerpo que comprende regiones variables e hipervariables de una cadena pesada y otra ligera que se unen específicamente con (inmunoreaccionan con) un antígeno. El término inmunoreacccionar en sus diversas formas significa unión específica entre una molécula que contiene un determinante antigénico y una molécula que contiene un sitio de combinación con anticuerpo tal como una molécula de anticuerpo completa o una parte de la misma.

Anticuerpo monoclonal: La expresión anticuerpo monoclonal en sus diversas formas gramaticales designa una población de moléculas de anticuerpo que contienen sólo una especie de sitio de combinación con anticuerpo capaz de inmunoreaccionar con un antígeno particular. Un anticuerpo monoclonal presenta así típicamente una sola afinidad de unión por cualquier antígeno con el que inmunoreaccione. Un anticuerpo monoclonal puede contener por lo tanto una molécula de anticuerpo que tenga una pluralidad de sitios de combinación con anticuerpo, cada uno inmunoespecífico de un antígeno diferente, por ejemplo un anticuerpo monoclonal biespecífico.

Polipéptido de fusión: Un polipéptido que comprende al menos dos polipéptidos y una secuencia de engarce para unir operativamente los dos polipéptidos en un polipéptido continuo. Los dos polipéptidos unidos en un polipéptido de fusión derivan típicamente de dos fuentes independientes, y por lo tanto un polipéptido de fusión comprende dos polipéptidos unidos no encontrados normalmente unidos en la naturaleza.

Cadena arriba: En la dirección opuesta a la dirección de transcripción del ADN, y por lo tanto que va de 5' a 3' en la cadena de no codificación, o de 3' a 5' en el ARNm.

Cadena abajo: También a lo largo de la secuencia de ADN, en la dirección de transcripción o lectura de secuencia, es decir, que va en la dirección 3' a 5' a lo largo de la cadena de no codificación del ADN o de 5' a 3' en la dirección a lo largo del transcripto de ARN.

Cistrón: Secuencia de nucleótidos en una molécula de ADN que codifica una secuencia de residuos aminoacídicos e incluye los elementos de control de la expresión de ADN cadena arriba y cadena abajo.

Codon de paro: Cualquiera de los tres codones que no codifican un aminoácido, sino que en cambio causan la terminación de la síntesis de proteína. Son UAG, UAA y UGA, y se designan también como codon sin sentido o de terminación.

Polipéptido líder: Una corta longitud de secuencia aminoacídica en el extremo amino de un polipéptido que porta o dirige el polipéptido a través de la membrana interna y asegura así su eventual secreción en el espacio periplásmico y quizás más allá. El péptido de secuencia líder se retira habitualmente antes de que el péptido se vuelva activo.

Marco de lectura: Secuencia particular de tripletes nucleotídicos contiguos (codones) empleada en la traducción. El marco de lectura depende de la localización del codon de iniciación de la traducción.

B. Fago filamentoso

La presente invención contempla un fago filamentoso que comprende una matriz de proteínas que encapsula un genoma que codifica los primer y segundo polipéptidos capaces de formar un receptor heterodimérico. El fago contiene adicionalmente un receptor heterodimérico que comprende el primer y segundo polipéptidos integrados en la superficie de la matriz mediante un anclaje a membrana de fago filamentoso condensado con al menos uno del primer o segundo polipéptidos. El receptor heterodimérico tiene la capacidad de unirse al ligando, y por lo tanto se designa como receptor heterodimérico de unión a ligando. Por tanto, en un aspecto de la invención, se proporciona un fago filamentoso según la reivindicación 1. El receptor heterodimérico en una realización preferida es un complejo de unión a epítopo. Es decir, un complejo del primer y segundo polipéptidos capaz de unirse a un epítopo. Preferiblemente, el primer y segundo epítopos son polipéptidos de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo.

El primer y segundo polipéptidos son capaces de ensamblaje autógeno en un complejo de unión a epítopo funcional (receptor heterodimérico), que se expresa después en la superficie exterior del fago de manera accesible al ligando, concretamente están integrados en la superficie del fago. Por tanto, un complejo de unión a epítopo está típicamente presente en la superficie de un fago de esta invención. Típicamente, el complejo de unión a epítopo comprende un polipéptido de engarce que contiene un dominio de anclaje a membrana de fago filamentoso tal como un polipéptido descrito en la sección C, y un polipéptido o polipéptido no de engarce.

Debido a que el receptor está unido al fago de manera accesible a la superficie, el fago puede utilizarse ventajosamente como absorbente de afinidad en fase sólida. En procedimientos que hacen uso de la presente invención, el fago puede unirse, preferiblemente unirse lábilmente, a una matriz sólida (insoluble en agua) tal como agarosa, celulosa, resinas sintéticas, polisacáridos y similares. Por ejemplo, los transformantes que difunden el fago pueden aplicarse a y retenerse en una columna y mantenerse en condiciones que soporten la difusión del fago. Se pasa después a través de la columna una composición acuosa que contiene un ligando que se une al receptor expresado por el fago a una velocidad predeterminada y en condiciones de unión al receptor para formar un complejo receptor-ligando en fase sólida. Se lava después la columna para retirar el material no unido, dejando el ligando unido al fago en fase sólida. El ligando puede retirase después y recuperarse mediante lavado de la columna con tampón que promueva la disociación del complejo ligando-receptor.

Como alternativa, el fago purificado puede mezclarse con una solución acuosa que contiene el ligando a purificar por afinidad. La mezcla de reacción de unión receptor/ligando así formada se mantiene durante un periodo de tiempo y en condiciones de unión suficientes para que se forme un complejo receptor-ligando unido a fago. Se separa después el ligando unido a fago (fago que porta ligando) y se recupera de los materiales no unidos, tal como mediante centrifugación, electroforesis, precipitación y similares.

La presente invención proporciona también un fago filamentoso según la reivindicación 3. El fago de esta invención puede marcarse cuando se utiliza en un procedimiento de diagnóstico de esta invención. Los marcajes preferidos incluyen ácidos nucleicos marcados radiactivamente incorporados al genoma del fago o aminoácidos marcados radiactivamente incorporados a componentes de proteína de la partícula de fago. La preparación de fago marcado puede realizarse rutinariamente cultivando el fago como se describe anteriormente, pero incluyendo nucleótidos radiomarcados o aminoácidos radiomarcados en el medio de cultivo para incorporación a los ácidos nucleicos o polipéptidos del fago, respectivamente. Son marcajes ejemplares ^{3}H-timidina o ^{35}S-metionina. Otros marcajes isotópicos y otros precursores de nucleótidos o aminoácidos están fácilmente disponibles para un experto en la técnica. El fago marcado contiene preferiblemente suficiente marcaje para ser detectable en un ensayo de unión a ligando de esta invención, concretamente el fago se marca detectablemente.

C. Vectores de expresión de ADN

Es un vector de la presente invención una molécula de ADN recombinante (ADNr) adaptada para recibir y expresar secuencias de ADN traducible en forma de un polipéptido de fusión que contiene un dominio de anclaje a membrana de fago filamentoso y un dominio de señal de secreción procariótica. El vector comprende un módulo que incluye las secuencias de ADN traducible cadena arriba y cadena abajo unidas operativamente mediante una secuencia de nucleótidos adaptados para ligamiento direccional a un inserto de ADN. La secuencia traducible cadena arriba codifica la señal de secreción como se define en la presente memoria. La secuencia traducible cadena abajo codifica el anclaje a membrana de fago filamentoso como se define en la presente memoria. El módulo incluye preferiblemente secuencias de control de la expresión de ADN para expresar el polipéptido de fusión que se produce cuando se inserta direccionalmente un inserto de secuencia de ADN traducible (inserto de ADN) en el módulo mediante una secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional.

El vector de expresión de ADN proporciona un sistema para clonar independientemente (insertar) dos secuencias de ADN traducible en dos módulos separados presentes en el vector, para formar dos "cistrones" separados (véase a continuación), para expresar ambos polipéptidos de un receptor heterodimérico, o las partes de unión a ligando de los polipéptidos que comprenden un receptor heterodimérico. El vector de expresión de ADN para expresar dos cistrones se designa como un vector de expresión dicistrónico.

Por tanto, el vector de expresión de ADN de esta invención comprende, además del módulo anterior, un segundo módulo para expresar un segundo polipéptido de fusión. El segundo módulo incluye una segunda secuencia de ADN traducible que codifica una señal de secreción, como se define en la presente memoria, unida operativamente en su terminación 3' mediante una secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional con una secuencia de ADN cadena abajo del vector que define típicamente al menos un codon de paro en el marco de lectura del módulo. La segunda secuencia de ADN traducible se une operativamente en su terminación 5' con las secuencias de control de expresión de ADN que forman los elementos 5' definidos anteriormente. El segundo módulo es capaz, tras la inserción de una secuencia de ADN traducible (inserto de ADN) de expresar el segundo polipéptido de fusión que comprende una fusión de la señal de secreción con un polipéptido codificado por el inserto de ADN.

El anclaje a membrana de fago filamentoso es preferiblemente un dominio de la proteína de recubrimiento cpIII o cpVIII capaz de unirse a la matriz de una partícula de fago filamentoso, incorporando así el polipéptido de fusión a la superficie del fago.

Un vector de expresión se caracteriza por ser capaz de expresar, en un hospedador compatible, un producto génico estructural tal como un polipéptido de fusión de la presente invención.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "vector" designa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar entre diferentes ambientes genéticos otro ácido nucleico al que se ha unido operativamente. Los vectores preferidos son aquellos capaces de replicación autónoma y expresión de productos génicos estructurales presentes en los segmentos de ADN a los que están unidos operativamente.

Como se utiliza en la presente memoria con respecto a las secuencias o segmentos de ADN, la expresión "unido operativamente" significa que las secuencias o segmentos se han unido covalentemente, preferiblemente mediante enlaces fosfodiéster convencionales, en una cadena de ADN, en forma mono- o bicatenaria.

La elección del vector al que se unen operativamente los módulos de esta invención depende directamente, como es bien conocido en la técnica, de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, replicación de vector y expresión de proteína y de la célula hospedadora a transformar, siendo estas limitaciones inherentes a la técnica de construir moléculas de ADN recombinante.

En realizaciones preferidas, el vector utilizado incluye un replicón procariótico, concretamente una secuencia de ADN que tiene la capacidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extracromosómicamente en una célula hospedadora procariótica, tal como una célula hospedadora bacteriana, transformada con el mismo. Dichos replicones son bien conocidos en la técnica. Además, aquellas realizaciones que incluyen un replicón procariótico incluyen también un gen cuya expresión confiere una ventaja selectiva, tal como resistencia a fármacos, a un hospedador bacteriano transformado con el mismo. Los genes de resistencia a fármaco bacterianos típicos son aquellos que confieren resistencia a ampicilina o tetraciclina. Los vectores contienen también típicamente sitios de restricción convenientes para la inserción de secuencias de ADN traducibles. Son vectores ejemplares los plásmidos pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329, disponibles en BioRad Laboratories, (Richmond, CA) y pPL y pKK223 disponibles en Pharmacia (Piscataway, NJ).

Es una secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional, concretamente un poliengarce, una región del vector de expresión de ADN que (1) se une operativamente para replicación y transporte a las secuencias de ADN traducibles cadena arriba y cadena abajo y (2) proporciona un sitio o medio para el ligamento direccional de una secuencia de ADN al vector. Típicamente, un poliengarce direccional es una secuencia de nucleótidos que define dos o más secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción o sitios de restricción. Tras la escisión por restricción, los dos sitios proporcionan terminaciones cohesivas mediante las que puede ligarse una secuencia de ADN traducible al vector de expresión de ADN. Preferiblemente, los dos sitios de restricción proporcionan, tras escisión de restricción, terminaciones cohesivas que no son complementarias y permiten así la inserción direccional de una secuencia de ADN traducible en el módulo. En una realización, el medio de ligamiento direccional está proporcionado por nucleótidos presentes en la secuencia de ADN traducible cadena arriba, la secuencia de ADN traducible cadena abajo o ambas. En otra realización, la secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional comprende una secuencia de nucleótidos que define múltiples medios de clonación direccional. Cuando la secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional define numerosos sitios de restricción, se designa como un sitio de clonación múltiple.

Una secuencia de ADN traducible es una serie lineal de nucleótidos que proporciona una serie ininterrumpida de al menos 8 codones que codifican un polipéptido en un marco de lectura.

Una secuencia de ADN traducible cadena arriba codifica una señal de secreción procariótica. La señal de secreción es un dominio de péptido líder de proteína que orienta la proteína a la membrana periplásmica de bacterias gram-negativas.

Es una señal de secreción preferida una señal de secreción pelB. Se muestran las secuencias de residuos aminoacídicos predichas del dominio de señal de secreción de dos variantes del producto génico de pelB de Erwinia carotova en la Tabla 1, como se describe por Lei, et al., Nature, 331: 543-546 (1988).

Se muestra también una señal de secreción pelB particularmente preferida en la Tabla 1.

La secuencia líder de la proteína pelB se ha utilizado anteriormente como señal de secreción para proteínas de fusión. Better et al., Science, 240: 1041-1043, (1988); Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728-5732 (1989) y Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8095-8099, (1990).

Las secuencias de residuos aminoacídicos para otros dominios de polipéptido de señal de secreción de E. coli útiles en esta invención se enumeran también en la Tabla 1. Oliver, In Neidhard, F.C. (Ed.), "Escherichia coli and Salmonella typhimurium", American Society for Microbology, Washington D.C., 1: 56-69 (1987).

Por tanto, la presente invención proporciona un vector o vectores según la reivindicación 15 y la reivindicación 16.

Una secuencia de ADN traducible que codifica la señal de secreción de pelB que tiene la secuencia de residuos aminoacídicos mostrada en la SEC Nº ID 5 es una secuencia de ADN preferida para inclusión en un vector de expresión de ADN de esta invención.

Una secuencia de ADN traducible cadena abajo codifica un anclaje a membrana de fago filamentoso. Los anclajes a membrana preferidos son obtenibles a partir de los fagos filamentosos M13, f1, fd y equivalentes similares de fagos filamentosos. Los dominios de anclaje a membrana preferidos se encuentran en las proteínas de recubrimiento codificadas por el gen III y el gen VIII. Por tanto, una secuencia de ADN traducible cadena abajo codifica una secuencia de residuos aminoacídicos que corresponde, y preferiblemente es idéntica, al dominio de anclaje a membrana del polipéptido de recubrimiento del gen III o el gen VIII de fago filamentoso.

El dominio de anclaje a membrana de una proteína de recubrimiento de fago filamentoso es una parte de la región carboxi-terminal de la proteína de recubrimiento e incluye una región de residuos aminoacídicos hidrófobos para atravesar la membrana de bicapa lipídica y una región de residuos aminoacídicos cargados encontrados normalmente en la cara citoplasmática de la membrana y que se extiende más allá de la membrana.

TABLA 1 Secuencias líder

3

En el fago f1, la región que atraviesa la membrana de proteína de recubrimiento del gen VIII comprende del residuo Trp-26 a Lys-40, y la región citoplasmática comprende los 11 residuos carboxi-terminales de 41 a 52. Ohkawa et al., J. Biol. Chem., 256: 9951-9958 (1981). Un anclaje a membrana ejemplar consistiría en los residuos 26 a 40 de cpVIII.

Por tanto, la secuencia de residuos aminoacídicos de un dominio de anclaje a membrana preferido deriva de la proteína de recubrimiento del gen III del fago filamentoso M13 (también designada cpIII). Un anclaje a membrana derivado de cpIII preferido tiene una secuencia mostrada en la SEC Nº ID 16 del residuo 1 al residuo 211. La proteína de recubrimiento del gen III está presente en un fago filamentoso maduro en un extremo de la partícula de fago con típicamente aproximadamente 4 a 6 copias de la proteína de recubrimiento.

La secuencia de residuos aminoacídicos de otro dominio de anclaje a membrana preferido deriva de la proteína de recubrimiento del gen VIII del fago filamentoso M13 (también designada cpVIII). Un anclaje a membrana derivado de cpVIII preferido tiene una secuencia mostrada en la SEC Nº ID 17 del residuo 1 al residuo 50. La proteína de recubrimiento del gen VIII está presente en un fago filamentoso maduro en la mayoría de las partículas de fago, típicamente con aproximadamente 2500 a 3000 copias de proteína de recubrimiento.

En otra realización, el anclaje a membrana tiene la secuencia aminoacídica mostrada en la SEC Nº ID 113 de la base 28 a la base 663.

Para descripciones detalladas de la estructura de las partículas de fago filamentoso, sus proteínas de recubrimiento y el ensamblaje de partículas, véanse las revisiones de Rached et al., Microbiol. Rev., 50: 401-427 (1986); y Model et al., en "The Bacteriophages: Vol. 2", R. Calendar, ed. Plenum Publishing Co., pág. 375-456 (1988).

Un módulo en un vector de expresión de ADN de esta invención está en la región del vector que forma, tras inserción de una secuencia de ADN traducible (inserto de ADN), una secuencia de nucleótidos capaz de expresar, en un hospedador apropiado, un polipéptido de fusión de esta invención. La secuencia competente de expresión de los nucleótidos se designa como un cistrón. Por tanto, el módulo comprende los elementos de control de la expresión de ADN unidos operativamente a secuencias de ADN traducible cadena arriba y cadena abajo. Se forma un cistrón cuando se inserta direccionalmente (se liga direccionalmente) una secuencia de ADN traducible entre las secuencias cadena arriba y cadena abajo mediante la secuencia de nucleótidos adaptada para ese fin. Las tres secuencias de ADN traducible resultantes, a saber las secuencias cadena arriba, insertada y cadena abajo, están todas unidas operativamente en el mismo marco de lectura.

Las secuencias de control de la expresión de ADN comprenden un conjunto de señales de expresión de ADN para expresar un producto génico estructural, e incluyen ambos elementos 5' y 3', como es bien conocido, unidos operativamente al cistrón de modo que el cistrón sea capaz de expresar un producto génico estructural. Las secuencias de control 5' definen un promotor para iniciar la transcripción y un sitio de unión a ribosoma unido operativamente a la terminación 5' de la secuencia de ADN traducible cadena arriba.

Para conseguir altos niveles de expresión génica en E. coli., es necesario utilizar no sólo promotores fuertes para generar grandes cantidades de ARNm, sino también sitios de unión a ribosoma para asegurar que el ARNm se traduce eficazmente. En E. coli, el sitio de unión a ribosoma incluye un codon de iniciación (AUG) y una secuencia de 3-9 nucleótidos de longitud localizada 3-11 nucleótidos cadena arriba del codon de iniciación [Shine et al., Nature, 254: 34 (1975)]. La secuencia AGGAGGU, que se denomina la secuencia Shine-Dalgarno (SD), es complementaria del extremo 3' del ARNm 16S de E. coli.

La unión del ribosoma al ARNm y la secuencia en el extremo 3' del ARNm pueden verse afectadas por diversos factores.

(i) el grado de complementariedad entre la secuencia SD y el extremo 3' del ARNt de16S.

(ii) el espaciado y posiblemente la secuencia de ADN que se encuentra entre la secuencia SD y el AUG [Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 760 (1979a); Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5596 (1979b); Guarente et al., Science, 209: 1428 (1980), y Guarente et al., Cell, 20: 543 (1980)]. La optimización se consigue midiendo el nivel de expresión de los genes en plásmidos en los que este espaciado se altera sistemáticamente. La comparación de diferentes ARNm muestra que existen secuencias estadísticamente preferidas desde las posiciones -20 a +13 (en las que el A de AUG está en posición 0) [Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35: 365 (1981)]. Se ha mostrado que las secuencias líder influyen drásticamente en la traducción (Roberts et al., 1979a, b anteriormente).

(iii) la secuencia nucleotídica después del AUG, que afecta a la unión a ribosoma [Taniguchi et al., J. Mol. Biol., 118: 533 (1978)].

Los sitios de unión a ribosoma útiles se muestran en la Tabla 2 a continuación.

TABLA 2 Sitios de unión a ribosoma

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Las secuencias control 3' definen al menos un codon de terminación (paro) en fase con y unido operativamente a la secuencia de ADN traducible cadena abajo.

Por tanto, un vector de expresión de ADN de esta invención proporciona un sistema para clonar secuencias de ADN traducible en la parte del módulo del vector para producir cistrones capaces de expresar los polipéptidos de fusión de esta invención.

En una realización preferida, se diseña un vector de expresión de ADN para manipulación conveniente en forma de una partícula de fago filamentoso que encapsula un genoma según las enseñanzas de la presente invención. En esta realización, un vector de expresión de ADN contiene además una secuencia nucleotídica que define un origen de replicación de fago filamentoso tal que el vector, tras la presentación del complemento genético apropiado, puede replicarse como un fago filamentoso en forma replicativa monocatenaria y encapsularse en partículas de fago filamentoso. Este rasgo proporciona la capacidad al vector de expresión de ADN de encapsularse en partículas de fago para una posterior segregación de la partícula, y del vector contenido en la misma, separadas de otras partículas que comprenden una población de partículas de fago.

Un origen de replicación de fago filamentoso es una región del genoma del fago, como es bien conocido, que define sitios de iniciación de la replicación, terminación de la replicación y encapsulación de la forma replicativa producida mediante replicación. Véanse, por ejemplo, Rasched et al., Microbiol. Rev., 50: 401-427 (1986); y Horiuchi, J. Mol. Biol., 188: 215-223 (1986).

Un origen de replicación de fago filamentoso preferido para uso en la presente invención es un origen de replicación de fago M13, f1 o fd. Se prefiere particularmente un origen de replicación de fago filamentoso que tiene una secuencia mostrada en la SEC Nº ID 117 y descrita por Short et al., Nucl. Acids Res., 16: 7583-7600 (1988). Los vectores de expresión de ADN preferidos son los vectores de expresión dicistrónicos pCOMB8, pCKAB8, pCOMB2-8, pCOMB3, pCKAB3, pCOMB2-3 y pCOMB2-3', descritos en el ejemplo 1.

La presente invención proporciona también un vector según las reivindicaciones 20-22.

En la medida en que un vector de esta invención puede manipularse para contener un inserto de ADN, teniendo así la capacidad de expresar un polipéptido de fusión, una realización contempla los vectores descritos anteriormente que contienen el inserto de ADN. Se describen en los ejemplos vectores particularmente preferidos que contienen genes de anticuerpo.

D. Polipéptidos

En otra realización, la presente invención proporciona un polipéptido según la reivindicación 23.

El polipéptido es un polipéptido de fusión que tiene un dominio receptor que comprende una secuencia de residuos aminoacídicos que define el dominio de unión a ligando (epítopo) de una proteína receptor localizada en un dominio de anclaje a membrana de fago filamentoso. Es decir, el dominio de inserción en el polipéptido de fusión es el dominio de unión a ligando de un receptor, y se designa también como un polipéptido receptor de unión a ligando.

En la medida en que el polipéptido tiene un dominio receptor, se designa también en la presente memoria como un receptor. En otros polipéptidos relacionados, el polipéptido puede comprender adicionalmente un dominio señal de secreción, preferiblemente una señal de secreción pelB como se describe en la presente memoria.

En realizaciones preferidas, la proteína receptor es una cadena polipeptídica de un receptor heterodimérico de unión a ligando. Más preferiblemente, el receptor heterodimérico es un complejo de unión a epítopo.

Los receptores heterodiméricos preferidos incluyen inmunoglobulinas, antígenos de histocompatibilidad mayor de clase I o II, receptores de linfocitos, integrinas y receptores heterodiméricos similares. Las inmunoglobulinas (moléculas de anticuerpo) pueden estar en forma de fragmentos Fab o Fv u otras partes de una molécula de anticuerpo que contienen regiones del dominio variable de las cadenas pesada y ligera.

Un precursor de polipéptido de esta invención puede tener una secuencia de residuos aminoacídicos que puede estar representada por la fórmula, mostrada en la dirección de la terminación amino a carboxi:

(F1)NH_{2}-O-(U)_{m}-V-(X)_{n}-Z-COOH

en la que O representa una secuencia de residuos aminoacídicos que define una señal de secreción, U representa un primer polipéptido espaciador, V representa una secuencia de residuos aminoacídicos que define un dominio receptor (un polipéptido receptor de unión a ligando), X representa un segundo polipéptido espaciador, y Z representa una secuencia de residuos aminoacídicos que define un anclaje a membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso, con la condición de que m sea el número entero 0 ó 1, de tal modo que cuando m sea 0, U no esté presente, y cuando m sea 1, U esté presente; y n sea 0 ó 1 de tal modo que cuando n sea 0, X no esté presente y cuando n sea 1, X esté presente.

En la fórmula (F1), la señal de secreción y el anclaje a membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso son como se definen anteriormente en la presente memoria. Por tanto, algunos de dichos polipéptidos pueden comprender un polipéptido derivado de dominio de cadena variable de anticuerpo unido operativamente en su terminación amino a la señal de secreción y unido operativamente en su terminación carboxi al anclaje a membrana.

Un polipéptido preferido de esta realización consiste esencialmente en un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo como dominio variable. A este respecto, "consiste esencialmente en" significa que el polipéptido no contiene un polipéptido de cadena ligera de anticuerpo o parte del mismo. Por ejemplo, dicho polipéptido puede ser un polipéptido según la fórmula (F1) en la que Z define el anclaje a membrana cpIII como se describe en la presente memoria.

Como se utiliza en la presente memoria con respecto a los polipéptidos, la expresión "unido operativamente" significa que los fragmentos polipeptídicos o dominios proteicos representados por los polipéptidos, se han unido covalentemente a un polímero polipeptídico individual, preferiblemente mediante enlaces amida convencionales entre los aminoácidos adyacentes que se unen al polipéptido.

En una posible disposición, V es una secuencia de residuos aminoacídicos que define el dominio de unión a ligando de una cadena de una molécula de receptor heterodimérico, y preferiblemente es un polipéptido de región variable de inmunoglobulina. Por ejemplo, V puede ser un polipéptido de V_{H} o V_{L}. La presente invención proporciona un polipéptido según la reivindicación 26. En una posibilidad más preferida, V es un polipéptido de V_{H} de inmunoglobulina (polipéptido de cadena pesada de anticuerpo) y m y n son ambos cero.

U o X pueden definir un sitio de escisión proteolítica, tal como la secuencia de aminoácidos encontrada en una proteína precursora, tal como protrombina, factor X y similares, que define el sitio de escisión del polipéptido. Un polipéptido de fusión que tiene un sitio de escisión proporciona un medio para purificar el polipéptido separado de la partícula de fago a la que está unido.

Los espaciadores polipeptídicos U y X pueden tener cada uno cualquier secuencia de residuos aminoacídicos de aproximadamente 1 a 6 residuos aminoacídicos de longitud. Típicamente, los residuos espaciadores están presentes en un polipéptido para acomodar el marco de lectura continuo que se requiere cuando se produce un polipéptido mediante los procedimientos dados a conocer en la presente memoria utilizando un vector de expresión de ADN de esta invención.

Un receptor de la presente invención asume una conformación que tiene un sitio de unión específico, como se evidencia por su capacidad de inhibirse competitivamente, por un ligando preseleccionado o predeterminado tal como un antígeno, hapteno, sustrato enzimático y similar. En un posible uso de la presente invención, un receptor de esta invención puede ser un polipéptido de unión a ligando que forma un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno preseleccionado para formar un complejo que tiene una unión suficientemente fuerte entre el antígeno y el sitio de unión para que se aísle el complejo. Cuando el receptor es un polipéptido de unión a antígeno, su afinidad o avidez es generalmente mayor de 10^{5} M^{-1}, más habitualmente mayor de 10^{6} y preferiblemente mayor de 10^{8} M^{-1}.

En otro posible uso de la presente invención, un receptor de la invención en cuestión puede unirse a un sustrato y catalizar la formación de un producto a partir del sustrato. Aunque la topología del sitio de unión a ligando de un receptor catalítico es probablemente más importante para su actividad preseleccionada que su afinidad (constante de asociación o pKa) por el sustrato, los receptores catalíticos en cuestión tienen una constante de asociación por el sustrato preseleccionado generalmente mayor de 10^{3} M^{-1}, más habitualmente mayor de 10^{5} M^{-1} o 10^{6} M^{-1} y preferiblemente mayor de 10^{7} M^{-1}.

Preferiblemente, el receptor producido mediante la invención en cuestión es heterodimérico y comprende por lo tanto normalmente dos cadenas polipeptídicas diferentes que asumen conjuntamente una conformación que tiene una afinidad de unión, o constante de asociación, por el ligando preseleccionado que es diferente, preferiblemente mayor, que la afinidad o constante de asociación de cualquiera de los polipéptidos solos, concretamente en forma de monómeros. El receptor heterodimérico se designa como receptor heterodimérico de unión a ligando para indicar su capacidad de unirse a ligando.

Por tanto, una realización preferida proporciona un receptor heterodimérico de unión a ligando que comprende el primer y segundo polipéptidos según la reivindicación 5. El primer polipéptido puede estar flanqueado por un dominio de señal de secreción procariótica amino-terminal además del dominio de anclaje a membrana de fago filamentoso carboxi-terminal. El segundo polipéptido puede condensarse con un dominio de señal de secreción procariótica amino-terminal. Un receptor heterodimérico de unión a ligando particularmente preferido utiliza una señal de secreción procariótica como se describe en la presente memoria.

Un receptor heterodimérico de unión a receptor se designa como un complejo de unión a epítopo para indicar que el complejo tiene la capacidad de unirse a un epítopo presente en un ligando, y para indicar que el receptor heterodimérico está formado por la asociación (complejación) de dos polipéptidos como se describen en la presente memoria. Por tanto, la presente invención proporciona un receptor según la reivindicación 6.

Uno o ambas de las diferentes cadenas de polipéptidos deriva preferiblemente de la región variable de las cadenas ligera y pesada de una inmunoglobulina. Típicamente, los polipéptidos que comprenden las regiones variables ligera (V_{L}) y pesada (V_{H}) se emplean conjuntamente para unirse al ligando preseleccionado.

Por tanto, una realización contempla un receptor heterodimérico de unión a ligando en el que el primer polipéptido es un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo y el segundo polipéptido es un polipéptido de cadena ligera. Una realización alternativa contempla un receptor heterodimérico de unión a ligando en el que el primer polipéptido es un polipéptido de cadena ligera de anticuerpo y el segundo es un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo. Por tanto, la presente invención proporciona un receptor según las reivindicaciones 7 y 8.

Un receptor producido mediante la invención en cuestión puede ser activo en forma monomérica así como multimérica, tanto homomérica como heteromérica, preferiblemente heterodimérica. Por ejemplo, el polipéptido de unión a ligando V_{H}y V_{L} producido mediante la presente invención puede combinarse ventajosamente en el heterodímero para modular la actividad de cualquiera de ellos o para producir una actividad única en el heterodímero.

Cuando los polipéptidos de ligando individuales se designan como V_{H} y V_{L}, el heterodímero puede designarse como un Fv. Sin embargo, debe entenderse que un V_{H} puede contener además del V_{H} sustancialmente toda o una parte de la región constante de la cadena pesada. De forma similar, un V_{L} puede contener, además del V_{L}, sustancialmente toda o una parte de la región constante de la cadena ligera. Un heterodímero que comprende un V_{H} que contiene una parte de la región constante de la cadena pesada y un V_{L} que contiene sustancialmente toda la región constante de la cadena ligera se denomina un fragmento Fab. La producción de Fab puede ser ventajosa en algunas situaciones porque las secuencias de la región constante adicionales contenidas en un Fab en comparación con un Fv pueden estabilizar la interacción de V_{H} y V_{L}. Dicha estabilización puede causar que el Fab tenga una mayor afinidad por el antígeno. Además, el Fab se utiliza más habitualmente en la técnica, y por tanto existen más anticuerpos comerciales disponibles para reconocer específicamente un Fab en procedimientos de análisis.

Los polipéptidos V_{H} y V_{L} individuales pueden producirse en longitudes iguales o sustancialmente iguales a sus longitudes de aparición natural. Sin embargo, en realizaciones preferidas, los polipéptidos V_{H} y V_{L} tendrán generalmente menos de 125 residuos aminoacídicos, más habitualmente menos de aproximadamente 120 residuos aminoacídicos, mientras que normalmente tendrán más de 60 residuos aminoacídicos, habitualmente más de aproximadamente 95 residuos aminoacídicos, más habitualmente más de aproximadamente 100 residuos aminoacídicos. Preferiblemente, el V_{H} será de aproximadamente 110 a aproximadamente 230 residuos aminoacídicos de longitud, mientras que el V_{L} será de aproximadamente 95 a aproximadamente 214 residuos aminoacídicos de longitud. Se prefieren cadenas V_{H} y V_{L} suficientemente largas para formar Fab. Por tanto, la presente invención proporciona un receptor según las reivindicaciones 9-13.

Las secuencias de residuos aminoacídicos variarán ampliamente, dependiendo del idiotipo particular implicado. Habitualmente, habrá al menos dos cisteínas separadas por aproximadamente 60 a 75 residuos aminoacídicos y unidas por un enlace disulfuro. Los polipéptidos producidos mediante la invención en cuestión serán sustancialmente copias de idiotipos de las regiones variables de las cadenas pesada y/o ligera de inmunoglobulinas, pero en algunas situaciones un polipéptido puede contener mutaciones aleatorias de las secuencias de residuos aminoacídicos para mejorar ventajosamente la actividad deseada.

En algunas situaciones, es deseable proporcionar una unión covalente cruzada de los polipéptidos V_{H} y V_{L}, que puede conseguirse proporcionando residuos de cisteína a las terminaciones carboxilo. El polipéptido se preparará normalmente exento de las regiones constantes de inmunoglobulina, sin embargo una pequeña parte de la región J puede incluirse como resultado de la selección ventajosa de cebadores de síntesis de ADN. La región D se incluirá normalmente en el transcripto de V_{H}.

Típicamente, la región C-terminal de los polipéptidos V_{H}y V_{L} tendrá una mayor variedad de secuencias que la terminación N y, basándose en la presente estrategia, puede modificarse adicionalmente para permitir una variación de las cadenas V_{H} y V_{L} de aparición normal. Puede emplearse un polinucleótido sintético para variar uno o más aminoácidos en una región hipervariable.

E. Procedimientos para producir una biblioteca 1. Explicación general

La presente invención puede ser también útil en un sistema para la clonación y el examen simultáneo de especificidades de unión a ligando preseleccionadas de repertorios génicos utilizando un sistema de vector único. Este sistema puede proporcionar la unión de las metodologías de clonación y examen y tiene dos requisitos. El primero, que la expresión de las cadenas polipeptídicas de un receptor heterodimérico en un hospedador de expresión in vitro tal como E. coli requiere la coexpresión de las dos cadenas polipeptídicas para que pueda ensamblarse un receptor heterodimérico funcional para producir un receptor que se une a ligando. El segundo, que el examen en los miembros aislados de la biblioteca de una capacidad de unión a ligando preseleccionado requiere un medio para correlacionar (un nexo) la capacidad de unión de una molécula de receptor expresada con un medio conveniente para aislar el gen que codifica el miembro de la biblioteca.

La unión de la expresión y el examen se consigue mediante la combinación de la orientación de un polipéptido de fusión al periplasma de una célula bacteriana para permitir el ensamblaje de un receptor funcional, y la orientación de un polipéptido de fusión al recubrimiento de una partícula de fago filamentoso durante el ensamblaje de fago para permitir un examen conveniente del miembro de la biblioteca de interés. La orientación periplásmica se proporciona mediante la presencia de un dominio de señal de secreción en un polipéptido de fusión de esta invención. La orientación a una partícula de fago se proporciona mediante la presencia de un dominio de anclaje a membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso (concretamente un dominio de anclaje a membrana derivado de cpIII o cpVIII) en un polipéptido de fusión de esta invención.

La presente invención proporciona en una realización un procedimiento para producir una biblioteca de moléculas de ADN dicistrónico según la reivindicación 31.

En esta realización, el repertorio de genes que codifican polipéptidos está en forma de ADN bicatenario (bc), y cada miembro del repertorio tiene terminaciones cohesivas adaptadas para ligamiento direccional. Además, en la pluralidad de los vectores de expresión de ADN, cada molécula de ADN lineal tiene terminaciones cohesivas cadena arriba y cadena abajo que (a) están adaptadas para recibir direccionalmente los genes de polipéptido en un marco de lectura común, y (b) están unidas operativamente a las respectivas secuencias de ADN traducible cadena arriba y cadena abajo. La secuencia de ADN traducible cadena arriba codifica una señal de secreción, preferiblemente una señal de secreción pelB, y la secuencia de ADN traducible cadena abajo codifica un anclaje a membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso como se describe en la presente memoria para un polipéptido de esta invención. Las secuencias de ADN traducible están también unidas operativamente a las respectivas secuencias de control de la expresión de ADN cadena arriba y cadena abajo como se definen para un vector de expresión de ADN descrito en la presente memoria.

La biblioteca así producida puede utilizarse para la expresión y el examen de los polipéptidos de fusión codificados por la biblioteca resultante de cistrones representados en la biblioteca mediante los procedimientos de expresión y examen descritos en la presente memoria.

2. Producción de repertorios génicos

Un repertorio génico es una colección de diferentes genes, preferiblemente genes que codifican polipéptido (genes de polipéptido), y pueden aislarse de fuentes naturales o pueden generarse artificialmente. Los repertorios génicos preferidos comprenden genes conservados. Los repertorios génicos particularmente preferidos comprenden cualquiera o ambos genes que codifican los miembros de una molécula de receptor dimérico.

Un repertorio génico útil en la práctica de la presente invención contiene al menos 10^{3}, más preferiblemente al menos 10^{4}, más preferiblemente al menos 10^{5} y lo más preferiblemente al menos 10^{7} genes diferentes. Los procedimientos para evaluar la diversidad de un repertorio de genes son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Por tanto, en una realización, la presente invención contempla un procedimiento de aislamiento de un par de genes que codifican un receptor dimérico que tiene una actividad preseleccionada de un repertorio de genes conservados. Se describe también adicionalmente la expresión del par de genes clonados y el aislamiento de la proteína de receptor dimérico expresada resultante. Preferiblemente, el receptor será un polipéptido heterodimérico capaz de unirse a un ligando, tal como una molécula de anticuerpo o una parte inmunológicamente activa de la misma, un receptor celular o una proteína de adhesión celular codificada por uno de los miembros de una familia de genes conservados, concretamente de genes que contienen una secuencia nucleotídica conservada de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud.

Las familias de genes conservados ejemplares que codifican diferentes cadenas polipeptídicas de un receptor dimérico son aquellas que codifican inmunoglobulinas, antígenos de complejo de histocompatibilidad mayor de clase I o II, receptores de linfocitos, integrinas y similares.

Un gen puede identificarse como perteneciente a un repertorio de genes conservados utilizando diversos procedimientos. Por ejemplo, puede utilizarse un gen aislado como sonda de hibridación en condiciones de bajo rigor para detectar otros miembros del repertorio de genes conservados presentes en ADN genómico utilizando los procedimientos descritos por Southern, J. Mol. Biol., 98: 503 (1975). Si el gen utilizado como sonda de hibridación hibrida con fragmentos de endonucleasa de restricción múltiple del genoma, ese gen es un miembro de un repertorio de genes conservados.

Inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas, o moléculas de anticuerpo, son una gran familia de moléculas que incluye diversos tipos de moléculas tales como IgD, IgG, IgA, IgM e IgE. La molécula de anticuerpo comprende típicamente dos cadenas pesada (H) y ligera (L) con tanto una región variable (V) como constante (C) presentes en cada cadena, como se muestra en la Figura 1. Los diagramas esquemáticos de la cadena pesada de IgG humana y la cadena ligera kappa humana se muestran en las Figuras 2A y 2B, respectivamente. Diversas regiones diferentes de una inmunoglobulina contienen secuencias conservadas útiles para aislar un repertorio de inmunoglobulina. Se compilan extensos datos de secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos que exhiben secuencias conservadas ejemplares para moléculas de inmunoglobulina por Kabat et al. en Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD, 1987.

La región C de la cadena H define el tipo de inmunoglobulina particular. Por lo tanto, la selección de las secuencias conservadas como se definen en la presente memoria de la región C de la cadena H da como resultado la preparación de un repertorio de genes de inmunoglobulina que tienen miembros de tipo inmunoglobulina de la región C seleccionada.

La región V de la cadena H o L comprende típicamente cuatro regiones estructurales (FR) que contienen cada una grados relativamente bajos de variabilidad que incluyen longitudes de secuencias conservadas. El uso de secuencias conservadas de las regiones estructurales FR1 y FR4 (región J) de la cadena V_{H} es una realización ejemplar preferida, y se describe en la presente memoria en los ejemplos. Las regiones estructurales se conservan típicamente a lo largo de varios o todos los tipos de inmunoglobulina, y por tanto las secuencias conservadas contenidas en las mismas son particularmente adecuadas para preparar repertorios que tienen diversos tipos de inmunoglobulina.

Complejo mayor de histocompatibilidad

El complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) es un gran locus genético que codifica una extensa familia de proteínas que incluye diversas clases de moléculas designadas como moléculas MHC de clase I, clase II o clase III. Paul et al., en Fundamental Immunology, Raven Press, NY, pág. 303-378 (1984).

Las moléculas MHC de clase I son un grupo polimórfico de antígenos de transplante que representan una familia conservada en la que el antígeno comprende una cadena pesada y una cadena ligera no codificada por MHC. La cadena pesada incluye diversas regiones, denominadas las regiones N, C1, C2, de membrana y citoplasmáticas. Las secuencias conservadas útiles en la presente invención se encuentran principalmente en las regiones N, C1 y C2 y se identifican como secuencias continuas de "residuos invariables" en Kabat et al., anteriormente.

Las moléculas de MHC de clase II comprende una familia conservada de antígenos polimórficos que participan en la respuesta inmune y que comprenden una cadena alfa y una beta. Los genes que codifican la cadena alfa y beta incluyen cada uno diversas regiones que contienen secuencias conservadas adecuadas para producir repertorios de cadena alfa o beta de MHC de clase II. Las secuencias nucleotídicas conservadas ejemplares incluyen aquellas que codifican los residuos aminoacídicos 26-30 de la región A1, los residuos 161-170 de la región A2 y los residuos 195-206 de la región de membrana, todas de la cadena alfa. Las secuencias conservadas están también presentes en las regiones B1, B2 y de membrana de la cadena beta en las secuencias nucleotídicas que codifican los residuos aminoacídicos 41-45, 150-162 y 200-209, respectivamente.

Receptores de linfocitos y antígenos de superficie celular

Los linfocitos contienen diversas familias de proteínas en sus superficies celulares incluyendo receptores de células T, antígeno Thy-1 y numerosos antígenos de superficie celular de células T, incluyendo los antígenos definidos por los anticuerpos monoclonales OKT4 (leu3), OKT5/8 (leu2), OKT3, OKT1 (leu1), OKT11 (leu5), OKT6 y OKT9. Paul, anteriormente, en las pág. 458-479.

Receptor de célula T es un término utilizado para una familia de moléculas de unión a antígeno encontradas en la superficie de células T. El receptor de células T como familia exhibe una especificidad de unión polimórfica similar a las inmunoglobulinas en su diversidad. El receptor de célula T maduro comprende cadenas alfa y beta que tienen cada una región variable (V) y constante (C). Las similitudes que tiene el receptor de células T con las inmunoglobulinas en organización y función genética muestran que el receptor de células T contiene regiones de secuencia conservada. Lai et al., Nature, 331: 543-546 (1988).

Las secuencias conservadas ejemplares incluyen aquellas que codifican los residuos aminoacídicos 84-90 de la cadena alfa, los residuos aminoacídicos 107-115 de la cadena beta y los residuos aminoacídicos 91-95 y 111-116 de la cadena gamma. Kabat et al., anteriormente, pág. 279.

Integrinas y adhesiones

Las proteínas adhesivas implicadas en la unión celular son miembros de una gran familia de proteínas relacionadas denominadas integrinas. Las integrinas son heterodímeros que comprenden una subunidad beta y otra alfa. Los miembros de la familia de integrinas incluyen las glicoproteínas de superficie celular: receptor de plaquetas GpIIb-IIIa, receptor de vitronectina (VnR), receptor de fibronectina (FnR) y los receptores de adhesión a leucocitos LFA-1, Mac-1, Mo-1 y 60.3. Rouslahti et al., Science, 238: 491-497 (1987). Los datos de secuencias de ácidos nucleicos y proteínas demuestran que existen regiones de secuencias conservadas en los miembros de estas familias, particularmente entre la cadena beta de GpIIb-IIIa, VnR y FnR, y entre la subunidad alfa de VnR, Mac-1, LFA-1, FnR y GpIIb-IIIa. Suzuki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 8614-8618, 1986; Ginsberg et al., J. Biol. Chem., 262: 5437-5440, 1987.

Pueden emplearse diversos procedimientos bien conocidos para producir un repertorio génico útil. Por ejemplo, los repertorios de genes V_{H} y V_{L} pueden producirse aislando ARNm que codifica V_{H} y V_{L} de una población heterogénea de células productoras de anticuerpos, concretamente linfocitos B (células B), preferiblemente células B redispuestas de tal modo como las encontradas en la circulación o el bazo de un vertebrado. Las células B redispuestas son aquellas en las que ha ocurrido una translocación génica de la inmunoglobulina, concretamente una redisposición, como evidencia la presencia en la célula de ARNm con transcriptos de la región V, D y J del gen de inmunoglobulina localizados adyacentemente en la misma. Típicamente, las células B se recogen en una muestra de 1-100 ml de sangre que contiene habitualmente 10^{6} células B/ml.

En algunos casos, es deseable sesgar un repertorio por una actividad preseleccionada, tal como utilizando como fuente de ácidos nucleicos células (células fuente) de vertebrados en una cualquiera o varias etapas de crecimiento, salud y respuesta inmune. Por ejemplo, la inmunización repetida de un animal sano antes de recoger células B redispuestas da como resultado la obtención de un repertorio enriquecido en material genético productor de un receptor de alta afinidad. Mullinax et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8095-8099 (1990). A la inversa, la recogida de células B redispuestas de un animal sano cuyo sistema inmune no se haya expuesto recientemente (concretamente un sistema inmune no tratado), da como resultado la producción de un repertorio que no está sesgado hacia la producción de polipéptidos V_{H} y/o V_{L} de alta afinidad.

Debe observarse que cuanto mayor es la heterogeneidad genética de la población de células de la que se obtienen los ácidos nucleicos, mayor es la diversidad del repertorio inmunológico (que comprende los genes que codifican V_{H} y V_{L}) que se estará disponible para examen según el procedimiento de la presente invención. Por tanto, las células de diferentes individuos, particularmente de aquellos que tienen una diferencia de crecimiento inmunológicamente significativa, y células de individuos de diferentes cepas, razas o especies pueden combinarse ventajosamente para aumentar la heterogeneidad (diversidad) de un repertorio.

Por tanto, en una realización preferida, las células fuentes se obtienen de un vertebrado, preferiblemente un mamífero, que se ha inmunizado o inmunizado parcialmente con un ligando antigénico (antígeno) contra el que se busca actividad, concretamente un antígeno preseleccionado. La inmunización puede llevarse a cabo convencionalmente. La titulación de anticuerpos en el animal puede controlarse para determinar la etapa de inmunización deseada, correspondiendo dicha etapa a la cantidad de enriquecimiento o sesgo del repertorio deseado. Los animales inmunizados parcialmente reciben típicamente sólo una inmunización y las células se recogen de esos animales poco después de detectar una respuesta. Los animales totalmente inmunizados presentan un pico de titulación que se alcanza con una o más inyecciones repetidas del antígeno en el mamífero hospedador, normalmente a intervalos de 2 a 3 semanas. Habitualmente, 3 a 5 días después de la última exposición, se extirpa el bazo y se aísla el repertorio genético de los esplenocitos, aproximadamente el 90% de los cuales son células B redispuestas, utilizando procedimientos estándar. Véase Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., John Wiley & Sons, NY. Los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos V_{H} y V_{L} pueden derivar de células productoras de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM, lo más preferiblemente de células productoras de IgM e IgG.

Los procedimientos para preparar fragmentos de ADN genómico de los que pueden clonarse genes de región variable de inmunoglobulina como una población diferente son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Herrman et al., Methods in Enzymol., 152: 180-183 (1987); Frischauf, Methods in Enzymol., 152: 183-190 (1987); Frischauf, Methods in Enzymol., 152: 190-199 (1987) y DilLella et al., Methods in Enzymol., 152: 199-212 (1987).

El repertorio génico deseado puede aislarse de cualquier material genómico que contiene el gen que expresa la región variable o del ARN mensajero (ARNm) que representa un transcripto de la región variable. La dificultad para utilizar ADN genómico diferente de linfocitos B no redispuestos está en yuxtaponer las secuencias de codificación de la región variable cuando las secuencias están separadas por intrones. El fragmento o fragmentos de ADN que contienen los exones apropiados deben aislarse, escindirse los intrones y ayustarse después los exones en el orden apropiado y la orientación apropiada. Para la mayoría, esto será difícil, de modo que la técnica alternativa que emplea células B redispuestas será el procedimiento de elección porque las regiones génicas V, D y J de inmunoglobulina se han translocado para convertirse en adyacentes, de modo que la secuencia es continua (exenta de intrones) para las regiones variables enteras.

Cuando se utiliza ARNm, las células se lisarán en condiciones de inhibición de ARNasa. En una realización, la primera etapa es aislar el ARNm celular total. Después, puede seleccionarse el ARNm poliA+ mediante hibridación con una columna de oligo-DT celulosa. La presencia de ARNm que codifica los polipéptidos de cadena pesada y/o ligera puede ensayarse después mediante hibridación con ADN monocatenario de los genes apropiados. Convenientemente, las secuencias que codifican la parte constante de V_{H} y V_{L} pueden utilizarse como sondas polinucleotídicas, y dichas secuencias pueden obtenerse de fuentes disponibles. Véanse por ejemplo Early y Hood, Genetic Engineering, Setlow y Hollaender, ed., vol. 3, Plenum Publishing Corporation, NY, (1981), páginas 158-188; y Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1987).

En realizaciones preferidas, la preparación que contiene el ARNm celular total se enriquece primero con la presencia de ARNm que codifica V_{H} y/o V_{L}. El enriquecimiento se realiza típicamente sometiendo la preparación de ARNm total o ARNm parcialmente purificado del mismo a una reacción de extensión con cebador empleando un cebador de síntesis de polinucleótido como se describe en la presente memoria. Los procedimientos ejemplares para producir repertorios génicos de V_{H} y V_{L} utilizando cebadores de síntesis de polinucleótidos se describen en la solicitud PCT nº PCT/US 90/02836 (publicación internacional nº WO 90/14430). Los procedimientos particularmente preferidos para producir un repertorio génico se basan en el uso de oligonucleótidos preseleccionados como cebadores en una reacción en cadena con polimerasa (PCR) para formar productos de reacción PCR como se describen en la presente memoria.

En realizaciones preferidas, las células B aisladas se inmunizan in vitro frente a un antígeno preseleccionado. La inmunización in vitro se define como la expansión clonal de células B específicas de epítopo en cultivo, en respuesta a la estimulación con antígeno. El resultado final es aumentar la frecuencia de las células B específicas de antígeno en el repertorio de inmunoglobulina, y reducir así el número de clones que deben analizarse en una biblioteca de expresión para identificar un clon que expresa un anticuerpo de la especificidad deseada. La ventaja de la inmunización in vitro es que los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse frente a un número ilimitado de antígenos terapéuticamente valiosos, incluyendo inmunógenos tóxicos o débiles. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos específicos de los determinantes polimórficos de antígenos asociados a tumores, factores reumatoides y antígenos de histocompatibilidad, que no pueden desencadenarse en animales inmunizados. Además, puede ser posible generar respuestas inmunes que están normalmente suprimidas in vivo.

La inmunización in vitro puede utilizarse para dar lugar a una respuesta inmune primaria o secundaria. Una respuesta inmune primaria, resultante de una primera exposición de una célula B a un antígeno, da como resultado la expansión clonal de células específicas de epítopo y la secreción de anticuerpos de IgM con constantes de afinidad aparentes de bajas a moderadas (10^{6}-10^{8} M^{-1}). La inmunización primaria de linfocitos esplénicos y tonsilares humanos en cultivo puede utilizarse para producir anticuerpos monoclonales frente a una variedad de antígenos, incluyendo células, péptidos, macromoléculas, haptenos y antígenos asociados a tumores. Las células B con memoria de donantes inmunizados pueden estimularse también en cultivo para dar lugar a una respuesta inmune secundaria caracterizada por la expansión clonal y la producción de anticuerpos de alta afinidad (>10^{9} M^{-1}) del isotipo IgG, particularmente frente a antígenos virales mediante la expansión clonal de linfocitos sensibilizados derivados de individuos seropositivos.

En una realización, se privan linfocitos de sangre periférica de diversas células citolíticas que parecen regular el descenso de la activación de células B específicas de antígeno. Cuando se retiran en primer lugar las subpoblaciones ricas en lisosomas (células asesinas naturales, células T citotóxicas y supresoras, monocitos) mediante tratamiento con el éster metílico de leucina lisosmotrópico, las células restantes (incluyendo células B, células T auxiliares, células accesorias) responden de forma específica de antígeno durante la inmunización in vitro. Los requisitos de linfocinas para inducir la producción de anticuerpos en cultivo se satisfacen mediante un sobrenadante de cultivo de células T irradiadas activadas.

Además de la inmunización in vitro, puede utilizarse selección celular por afinidad (absorción por inmunoafinidad) para aumentar adicionalmente la frecuencia de las células B específicas de antígeno. Las técnicas para seleccionar subpoblaciones de células B mediante unión a antígeno de fase sólida están bien establecidas. Las condiciones de selección por afinidad pueden optimizarse para enriquecer selectivamente en células B que se unen con alta afinidad a una variedad de antígenos, incluyendo proteínas de superficie celular. La selección por afinidad puede utilizarse sola o en combinación con inmunización in vitro para aumentar la frecuencia de células específicas de antígeno por encima de los niveles que pueden obtenerse con cualquier técnica sola. Las bibliotecas de expresión de inmunoglobulina construidas a partir de poblaciones enriquecidas en células B están sesgadas a favor de clones de anticuerpo específico de antígeno, y por tanto posibilitan la identificación de clones con las especificidades deseadas de bibliotecas menores menos complejas.

En una realización, los linfocitos de sangre periférica (PBL) donantes pueden transferirse a ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) y potenciarse después in vivo en los ratones SCID para aumentar la respuesta inmune antes de recoger los ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y ligera de las células B de ratón SCID. Véase por ejemplo Duchosal et al., Nature, 335: 258-262 (1992). En ese informe, los PBL humanos de un donante que tenía titulaciones anti-toxoide del tétanos (TT) se potenciaron mientras estaban en el hospedador ratón SCID. La biblioteca resultante de 370.000 clones proporcionó 2 partículas de fago que expresaban un Fab de superficie capaz de unirse a TT.

3. Preparación de cebadores polinucleotídicos

El término "polinucleótido" como se utiliza en la presente memoria con referencia a cebadores, sondas y fragmentos o segmentos de ácidos nucleicos a sintetizar mediante extensión de cebador se define como una molécula que comprende dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de 3. Su tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de las condiciones últimas de uso.

El término "cebador" como se utiliza en la presente memoria designa un polinucleótido purificado a partir de una digestión de restricción de ácido nucleico o producido sintéticamente, que es capaz de actuar como punto de iniciación de la síntesis de ácido nucleico cuando se dispone en condiciones en las que se induce la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario de una cadena de ácido nucleico, concretamente en presencia de nucleótidos y un agente de polimerización tal como ADN polimerasa, transcriptasa inversa y similares, y una temperatura y pH adecuados. El cebador es preferiblemente monocatenario para eficacia máxima, pero puede estar como alternativa en forma bicatenaria. Si es bicatenario, el cebador se trata primero para separarlo de su cadena complementaria antes de utilizarlo para preparar productos de extensión. Preferiblemente, el cebador es un polidesoxirribonucleótido. El cebador debe ser suficientemente largo para cebar la síntesis de productos de extensión en presencia de agentes para la polimerización. Las longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores, incluyendo la temperatura y la fuente del cebador. Por ejemplo, dependiendo de la complejidad de la secuencia diana, un cebador polinucleotídico contiene típicamente 15 ó 25 o más nucleótidos, aunque puede contener menos nucleótidos. Las moléculas cebadoras cortas requieren generalmente temperaturas más frías para formar complejos híbridos suficientemente estables con el molde.

Los cebadores utilizados en la presente memoria se seleccionan por ser "sustancialmente" complementarios de las diferentes cadenas de cada secuencia específica a sintetizar o amplificar. Esto significa que el cebador debe ser suficientemente complementario para hibridar no aleatoriamente con su respectiva cadena molde. Por lo tanto, la secuencia cebadora puede reflejar o no la secuencia exacta del molde. Por ejemplo, puede unirse un fragmento nucleotídico no complementario al extremo 5' del cebador, siendo el resto de la secuencia cebadora sustancialmente complementaria de la cadena. Dichos fragmentos no complementarios codifican típicamente un sitio de restricción de endonucleasa. Como alternativa, pueden intercalarse bases no complementarias o secuencias más largas en el cebador, a condición de que la secuencia cebadora tenga suficiente complementariedad con la secuencia de la cadena a sintetizar o amplificar para hibridar no aleatoriamente con la misma y formar así un producto de extensión en condiciones de síntesis de polinucleótidos.

Los cebadores de la presente invención pueden contener también una secuencia promotora de ARN polimerasa dependiente de ADN o su complemento. Véanse por ejemplo Krieg et al., Nucl. Acids Res., 12: 7057-7070 (1984); Studier et al., J. Mol. Biol., 189: 113-130 (1986); y Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Maniatis et al., ed., Cold Spring Harbor, NY (1989).

Cuando se utiliza un cebador que contiene un promotor de ARN polimerasa dependiente de ADN, el cebador hibrida con la cadena polinucleotídica a amplificar y la segunda cadena polinucleotídica del promotor de ARN polimerasa dependiente de ADN se completa utilizando un agente inductor tal como ADN polimerasa I de E. coli o el fragmento Klenow de ADN polimerasa de E. coli. El polinucleótido de partida se amplifica alternando entre la producción de un polinucleótido de ARN y la producción de un polinucleótido de ADN.

Los cebadores pueden contener también una secuencia molde o sitio de iniciación de la replicación para una ARN polimerasa dirigida por ARN. Las ARN polimerasas dirigidas por ARN típicas incluyen la replicasa QB descrita por Lizardi et al., Biotechnology, 6: 1197-1202 (1988). Las polimerasas dirigidas por ARN producen un gran número de cadenas de ARN a partir de un pequeño número de cadenas de ARN molde que contienen una secuencia molde o sitio de iniciación de la replicación. Estas polimerasas proporcionan típicamente una amplificación de un millón de veces de la cadena molde como se ha descrito por Kramer et al., J. Mol. Biol., 89: 719-736 (1974).

Los cebadores de polinucleótidos pueden prepararse utilizando cualquier procedimiento adecuado, tal como por ejemplo los procedimientos de fosfotriéster o fosfodiéster, véanse Narang et al., Meth. Enzymol., 68: 90 (1979); la patente de EE.UU. nº 4.356.280; y Brown et al., Meth. Enzymol., 68: 109, (1979).

La elección de una secuencia nucleotídica de un cebador depende de factores tales como la distancia en el ácido nucleico desde la región de codificación del receptor deseado, su sitio de hibridación en el ácido nucleico respecto a cualquier segundo cebador a utilizar, el número de genes a hibridar en el repertorio y similares.

a. Cebadores para producir repertorios de gen de inmunoglobulina

Los repertorios de genes V_{H} y V_{L} pueden prepararse separadamente antes de su utilización en la presente invención. La preparación de repertorios se realiza típicamente mediante extensión de cebador, preferiblemente mediante extensión de cebador en un formato de reacción en cadena con polimerasa (PCR).

Para producir un repertorio de homólogos de ADN que codifican V_{H} mediante extensión de cebador, se selecciona la secuencia nucleotídica de un cebador para hibridar con una pluralidad de genes de cadena pesada de inmunoglobulina en un sitio sustancialmente adyacente a la región de codificación de V_{H}, de modo que se obtenga una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido funcional (capaz de unión). Para hibridar con una pluralidad de diferentes cadenas de ácido nucleico que codifica V_{H}, el cebador debe ser sustancialmente complementario de una secuencia nucleotídica conservada entre las diferentes cadenas. Dichos sitios incluyen secuencias nucleotídicas en la región constante, cualquiera de las regiones variables de las regiones estructurales, preferiblemente la tercera región estructural, la región líder, la región promotora, la región J y similares.

Si los repertorios de homólogos de ADN que codifican V_{H} y V_{L} van a producirse mediante amplificación (PCR), deben utilizarse dos cebadores, concretamente un par cebador PCR, para cada cadena de codificación de ácido nucleico a amplificar. El primer cebador entra a formar parte de la cadena sin sentido (menos o complementaria) e hibrida con una secuencia nucleotídica conservada entre las cadenas V_{H} (más o de codificación) en el repertorio. Para producir homólogos de ADN que codifican V_{H}, se eligen por lo tanto los primeros cebadores para hibridar con (concretamente ser complementarios de) regiones conservadas en la región J, la región CH1, la región bisagra, la región CH2 o la región CH3 de genes de inmunoglobulina y similares. Para producir un homólogo de ADN de codificación de V_{L}, se eligen los primeros cebadores para hibridar con (concretamente ser complementarios de) una región conservada en la región J o una región constante de los genes de cadena ligera de inmunoglobulina y similares. Los segundos cebadores entran a formar parte de la cadena de codificación (más) e hibridan con una secuencia nucleotídica conservada entre las cadenas menos. Para producir los homólogos de ADN de codificación de V_{H}, se eligen por lo tanto los segundos cebadores para hibridar con una secuencia nucleotídica conservada en el extremo 5' del gen de inmunoglobulina que codifica V_{H} tal como la que codifica en esa área la región líder o la primera región estructural. Debe observarse que en la amplificación de ambos homólogos de ADN que codifican V_{H} y V_{L}, la secuencia nucleotídica 5' conservada del segundo cebador puede ser complementaria de una secuencia añadida exógenamente utilizando transferasa de desoxinucleotidilo terminal como se describe por Loh et al., Science, 243: 217-220 (1989). Uno o ambos del primer y segundo cebadores pueden contener una secuencia nucleotídica que define un sitio de reconocimiento de endonucleasa. El sitio puede ser heterólogo del gen de inmunoglobulina, amplificándose y apareciendo típicamente en o cerca del extremo 5' del cebador.

Cuando está presente, la parte que define el sitio de restricción se localiza típicamente en una parte no cebadora 5'-terminal del cebador. El sitio de restricción definido por el primer cebador se elige típicamente para que sea uno reconocido por una enzima de restricción que no reconozca el sitio de restricción definido por el segundo cebador, siendo el objetivo ser capaz de producir una molécula de ADN que tenga terminaciones cohesivas que sean no complementarias entre sí y que permitan por tanto una inserción direccional en un vector.

En una realización, la presente invención utiliza un conjunto de polinucleótidos que forman cebadores que tienen una región cebadora localizada en la terminación 3' del cebador. La región cebadora es típicamente las 15 a 30 bases nucleotídicas más 3' (3'-terminal). La parte cebadora 3'-terminal de cada cebador es capaz de actuar como cebador para catalizar la síntesis de ácido nucleico, concretamente de iniciar una reacción de extensión de cebador desde su terminación 3'. Uno o ambos de los cebadores pueden contener adicionalmente una parte no cebadora 5'-terminal (la más 5'), concretamente una región que no participa en la hibridación con el molde del repertorio.

En PCR, cada cebador funciona en combinación con un segundo cebador para amplificar una secuencia de ácido nucleico diana. La elección de los pares cebadores de PCR para uso en PCR está regida por consideraciones como las discutidas en la presente memoria para producir repertorios génicos. Es decir, los cebadores tienen una secuencia nucleotídica que es complementaria de una secuencia conservada en el repertorio. Las secuencias cebadoras V_{H} y V_{L} útiles se muestran en las Tablas 5 y 6, a continuación en la presente memoria.

4. Reacción en cadena con polimerasa para producir repertorios génicos

La estrategia utilizada para clonar los genes V_{H} y V_{L} contenidos en un repertorio dependerá, como es bien conocido en la técnica, del tipo, complejidad y pureza de los ácidos nucleicos que componen el repertorio. Otros factores incluyen si los genes están contenidos o no en uno o una pluralidad de repertorios y si se amplifican y/o mutagenizan o no.

Los repertorios de genes que codifican V_{H} y/o V_{L} comprenden cadenas que codifican polinucleótidos, tales como ARNm y/o la cadena con sentido de ADN genómico. Si el repertorio está en forma de ADN genómico bicatenario, habitualmente se desnaturaliza primero, típicamente mediante fusión, en las cadenas individuales. Se somete un repertorio a una reacción PCR tratando el repertorio (poniéndolo en contacto) con un par cebador de PCR, teniendo cada miembro del par una secuencia nucleotídica preseleccionada. El par cebador de PCR es capaz de iniciar las reacciones de extensión de cebador mediante hibridación con secuencias nucleotídicas, preferiblemente al menos de aproximadamente 10 nucleótidos de longitud y más preferiblemente al menos de aproximadamente 20 nucleótidos de longitud, conservadas en el repertorio. El primer cebador de un par cebador de PCR se designa a veces en la presente memoria como el "cebador con sentido" porque hibrida con la cadena de codificación o con sentido de un ácido nucleico. Además, el segundo cebador de un par cebador de PCR se designa a veces en la presente memoria como el "cebador sin sentido" porque hibrida con una cadena de no codificación o sin sentido de un ácido nucleico, concretamente una cadena complementaria de una cadena de codificación.

La reacción PCR se realiza mezclando el par cebador de PCR, preferiblemente una cantidad predeterminada del mismo, con los ácidos nucleicos del repertorio, preferiblemente una cantidad predeterminada de los mismos, en un tampón PCR para formar una mezcla de reacción PCR. La mezcla se mantiene en condiciones de síntesis de polinucleótidos durante un periodo de tiempo, que está típicamente predeterminado, suficiente para la formación de un producto de reacción PCR, produciendo así una pluralidad de diferentes homólogos de ADN que codifican V_{H} y/o codifican V_{L}.

Puede utilizarse una pluralidad de primeros cebadores y/o una pluralidad de segundos cebadores en cada amplificación, por ejemplo, una especie de primer cebador puede aparearse con una serie de diferentes segundos cebadores para formar diversos pares cebadores diferentes. Como alternativa, puede utilizarse un par individual de primero y segundo cebadores. En cualquier caso, los productos de amplificación de las amplificaciones que utilizan la misma o diferentes combinaciones de primer y segundo cebadores pueden combinarse para aumentar la diversidad de la biblioteca génica.

En otra estrategia, el objeto es clonar los genes que codifican V_{H} y/o V_{L} de un repertorio proporcionando un complemento polinucleotídico del repertorio, tal como la cadena sin sentido de ADNbc genómico o el polinucleótido producido sometiendo ARNm a una reacción de transcripción inversa. Los procedimientos para producir dichos complementos son bien conocidos en la técnica.

La reacción PCR se realiza utilizando cualquier procedimiento adecuado. Generalmente, ocurre en una solución acuosa tamponada, concretamente un tampón PCR, preferiblemente a un pH de 7-9, lo más preferiblemente aproximadamente 8. Preferiblemente, se mezcla un exceso molar (para ácido nucleico genómico, habitualmente aproximadamente 10^{6}:1 cebador:molde) con el cebador en tampón que contiene la cadena molde. Se prefiere un gran exceso molar para mejorar la eficacia del proceso.

El tampón PCR contiene también los trifosfatos de desoxirribonucleótidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP y una polimerasa, típicamente termoestable, todos en cantidades adecuadas para la reacción de extensión de cebador (síntesis de polinucleótido). La solución resultante (mezcla de PCR) se calienta aproximadamente a 90ºC-100ºC durante aproximadamente 1 a 10 minutos, preferiblemente de 1 a 4 minutos. Después de este periodo de calentamiento, se permite enfriar la solución hasta 54ºC, que es preferible para la hibridación de cebadores. La reacción de síntesis puede ocurrir de temperatura ambiente hasta una temperatura superior a la que la polimerasa (agente inductor) no funciona ya eficazmente. Por tanto, por ejemplo, si se utiliza ADN polimerasa como agente inductor, la temperatura no es generalmente mayor de aproximadamente 40ºC. Un tampón PCR ejemplar comprende lo siguiente: KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,001% (p/v), dATP 200 \muM, dTTP 200 \muM, dCTP 200 \muM, dGTP 200 \muM y 2,5 unidades de ADN polimerasa I de Thermus aquaticus (patente de EE.UU. nº 4.889.818) por 100 \mul de tampón.

El agente inductor puede ser cualquier compuesto o sistema que funcionará realizando la síntesis de productos de extensión de cebador, incluyendo enzimas. Las enzimas adecuadas con este fin incluyen, por ejemplo, ADN polimerasa I de E. coli, fragmento Klenow de ADN polimerasa I de E. coli, ADN polimerasa T4, otras ADN polimerasas disponibles, transcriptasa inversa y otras enzimas, incluyendo enzimas termoestables, que facilitarán la combinación de los nucleótidos de manera apropiada para formar los productos de extensión de cebador que son complementarios de cada cadena de ácido nucleico. Generalmente, la síntesis se iniciará en el extremo 3' de cada cebador y proseguirá en la dirección 5' a lo largo de la cadena molde hasta que la síntesis termine, produciendo moléculas de diferentes longitudes. Puede haber agentes inductores, sin embargo, que inicien la síntesis en el extremo 5' y procedan en la dirección anterior utilizando el mismo proceso descrito anteriormente.

El agente inductor puede ser también un compuesto o sistema que funcionará realizando la síntesis de productos de extensión de cebador de ARN, incluyendo enzimas. En realizaciones preferidas, el agente inductor puede ser una ARN polimerasa dependiente de ADN tal como ARN polimerasa T7, ARN polimerasa T3 o ARN polimerasa SP6. Estas polimerasas producen un polinucleótido de ARN complementario. La alta tasa de recambio de la ARN polimerasa amplifica el polinucleótido de partida como se ha descrito por Chamberlin et al., The Enzymes, ed. P. Boyer, pág. 87-108, Academic Press, Nueva York, (1982). Otra ventaja de la ARN polimerasa T7 es que pueden introducirse mutaciones en la síntesis de polinucleótidos reemplazando una parte del ADNc por uno o más oligodesoxinucleótidos mutagénicos (polinucleótidos) y transcribiendo el molde parcialmente desapareado directamente, como se ha descrito anteriormente por Joyce et al., Nuc. Acid Res., 17: 711-722 (1989). Los sistemas de amplificación basados en la transcripción se han descrito por Gingeras et al. en PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, pág. 245-252, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990).

Si el agente inductor es una ARN polimerasa dependiente de ADN, y por lo tanto incorpora trifosfatos de ribonucleótido, se mezclan suficientes cantidades de ATP, CTP, GTP y UTP con la mezcla de reacción de extensión de cebador y se trata la solución resultante como se describe anteriormente.

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La cadena recién sintetizada y su cadena de ácido nucleico complementaria forman una molécula bicatenaria que puede utilizarse en las etapas sucesivas del proceso.

La primera y/o segunda reacciones PCR discutidas anteriormente pueden utilizarse ventajosamente para incorporar al receptor un epítopo preseleccionado útil en la detección y/o aislamiento inmunológico de un receptor. Esto se realiza utilizando un primer y/o segundo cebador o vector de expresión de la síntesis de polinucleótidos para incorporar una secuencia de residuos aminoacídicos predeterminada a la secuencia de residuos aminoacídicos del receptor.

Después de producir homólogos de ADN que codifican V_{H} y V_{L} para una pluralidad de diferentes genes que codifican V_{H} y V_{L} en los repertorios, típicamente se amplifican adicionalmente las moléculas de ADN. Aunque las moléculas de ADN pueden amplificarse mediante técnicas clásicas tales como la incorporación a un vector de replicación autónoma, se prefiere amplificar primero las moléculas sometiéndolas a una reacción en cadena con polimerasa (PCR) antes de insertarlas en un vector. La PCR se lleva a cabo típicamente mediante termociclación, concretamente aumentando y reduciendo repetidamente la temperatura de una mezcla de reacción PCR en un intervalo de temperatura cuyo límite inferior es de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 40ºC y cuyo límite superior es de aproximadamente 90ºC a aproximadamente 100ºC. El aumento y reducción pueden ser continuos, pero preferiblemente es una fase de periodos de tiempo de relativa estabilidad a la temperatura a cada temperatura que favorece la síntesis, desnaturalización e hibridación de polinucleótidos.

Los procedimientos de amplificación por PCR se describen con detalle en las patentes de EE.UU. nº 4.683.195, 4.683.202, 4.800.159 y 4.965.188, y al menos en diversos textos incluyendo "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", H. Ehrlich, ed., Stockton Press, Nueva York (1989); y "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis et al., ed., Academic Press, San Diego, California (1990).

En realizaciones preferidas, se utiliza sólo un par de primer y segundo cebadores por reacción de amplificación. Se combinan después los productos de la reacción de amplificación obtenidos de una pluralidad de diferentes amplificaciones, utilizando cada uno una pluralidad de diferentes pares cebadores.

Sin embargo, la presente invención contempla también la producción de homólogo de ADN mediante coamplificación (utilizando dos pares de cebadores) y amplificación múltiple (utilizando hasta 8, 9 ó 10 pares de cebadores).

En realizaciones preferidas, el proceso PCR se utiliza no sólo para producir una biblioteca de moléculas de ADN, sino también para inducir mutaciones en la biblioteca o para crear diversidad a partir de un solo clon original, proporcionando así una biblioteca que tiene una mayor heterogeneidad. En primer lugar, debe observarse que el proceso PCR mismo es inherentemente mutagénico debido a una variedad de factores bien conocidos en la técnica. En segundo lugar, además de las variantes inductoras de la mutación descritas anteriormente designadas en la patente de EE.UU. nº 4.683.195, pueden emplearse otras variaciones de PCR inductoras de mutación. Por ejemplo, la mezcla de reacción PCR puede formarse con diferentes cantidades de uno o más de los nucleótidos a incorporar al producto de extensión. En dichas condiciones, la reacción PCR procede produciendo sustituciones nucleotídicas en el producto de extensión como resultado de la escasez de una base particular. De forma similar, pueden incorporarse cantidades molares aproximadamente iguales de los nucleótidos a la mezcla de reacción PCR inicial en una cantidad para realizar eficazmente X número de ciclos, y ciclar después la mezcla mediante una serie de ciclos en exceso de X, tal como por ejemplo 2X. Como alternativa, pueden inducirse mutaciones durante la reacción PCR mediante la incorporación a la mezcla de reacción de derivados nucleotídicos tales como inosina, no encontrada normalmente en los ácidos nucleicos del repertorio que se está amplificando. Durante la posterior síntesis de ADN y replicación de los ácidos nucleicos in vivo en una célula hospedadora, el derivado nucleotídico se reemplazará por un nucleótido sustituto induciendo así una mutación puntual.

5. Vectores de expresión de ADN lineal

Es un vector de expresión de ADN para uso en un procedimiento de la invención para producir una biblioteca de moléculas de ADN una molécula de ADN linealizada como se describe anteriormente que tiene dos terminaciones cohesivas (cadena arriba y cadena abajo) adaptadas para ligamiento direccional a un gen de polipéptido.

Se prepara típicamente un vector de expresión de ADN lineal mediante digestión con endonucleasa de restricción de un vector de expresión de ADN circular de esta invención para cortar en dos sitios de restricción preseleccionados en la secuencia de nucleótidos del vector, adaptados para ligamiento direccional para producir una molécula de ADN lineal que tiene las terminaciones cohesivas requeridas que están adaptadas para ligamiento direccional. El ligamiento direccional designa la presencia de dos terminaciones cohesivas (una primera y una segunda) en un vector, o en la molécula de inserto de ADN a ligar en el vector seleccionado, de modo que las terminaciones en una molécula individual no son complementarias. La primera terminación del vector es complementaria de una primera terminación del inserto, y la segunda terminación del vector es complementaria de la segunda terminación del inserto.

6. Reacciones de ligamiento para producir bibliotecas génicas

Para preparar una biblioteca de moléculas de ADN de esta invención, se prepara una mezcla de ligamiento como se describe anteriormente, y la mezcla se somete a condiciones de ligamiento durante un periodo de tiempo suficiente para que el repertorio mezclado de genes de polipéptido se ligue (se una operativamente) a la pluralidad de vectores de expresión de ADN para formar la biblioteca.

Las condiciones de ligamiento son condiciones seleccionadas para favorecer una reacción de ligamiento en la que se forma un enlace fosfodiéster entre las terminaciones 3'-hidroxilo y 5'-fosforilo adyacentes del ADN. La reacción de ligamiento se cataliza preferiblemente mediante la enzima ADN ligasa T4. Las condiciones de ligamiento pueden variar en tiempo, temperatura, concentración de tampones, cantidades de moléculas de ADN a ligar y cantidades de ligasa, como es bien conocido. Las condiciones de ligamiento preferidas implican mantener la mezcla de ligamiento de 4 grados centígrados (ºC) a 12ºC durante 1 a 24 horas en presencia de 1 a 10 unidades de ADN ligasa T4 por mililitro (ml) y de aproximadamente 1 a 2 microgramos (\mug) de ADN. El tampón de ligamiento en una mezcla de ligamiento contiene típicamente Tris-HCl 0,5 M (pH 7,4), MgCl_{2} 0,01 M, ditiotreitol 0,01 M, espermidina 1 mM, ATP 1 mM y seroalbúmina bovina 0,1 mg/ml (BSA). Pueden utilizarse también otros tampones de ligamiento.

Se describen reacciones de ligamiento ejemplares en el ejemplo 2.

7. Preparación de bibliotecas génicas dicistrónicas

Como se describe anteriormente, la presente invención proporciona procedimientos para la preparación de una biblioteca de moléculas de ADN dicistrónico. Una molécula de ADN dicistrónico es una molécula individual de ADN que tiene la capacidad de expresar dos polipéptidos separados de dos cistrones separados. En realizaciones preferidas, los dos cistrones están unidos operativamente en localizaciones relativas en la molécula de ADN tales que ambos cistrones están bajo el control transcripcional de un solo promotor. Cada molécula dicistrónica es capaz de expresar un primer y segundo polinucleótidos del primer y segundo cistrones, respectivamente, que pueden formar, en un hospedador adecuado, un receptor heterodimérico en la superficie de una partícula de fago filamentoso.

El procedimiento para producir una biblioteca de moléculas de ADN dicistrónico comprende las etapas de:

(a) formar una primera mezcla de ligamiento mediante la combinación en un tampón de ligamiento de:

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(i) un repertorio de primeros genes de polipéptido en forma de ADNbc, teniendo cada uno terminación cohesivas adaptadas para ligamiento direccional, y

\hskip0,8cm

(ii) una pluralidad de vectores de expresión de ADN en forma lineal, teniendo cada uno unas primeras terminaciones cohesivas cadena arriba y cadena abajo que (a) están adaptadas para recibir direccionalmente los primeros genes de polipéptido en un marco de lectura común, y (b) están operativamente unidas a las respectivas secuencias de ADN traducible cadena arriba y cadena abajo. La secuencia de ADN traducible cadena arriba codifica una señal de secreción pelB, la secuencia de ADN traducible cadena abajo codifica un anclaje a membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso, y las secuencias de ADN traducible están unidas operativamente a las respectivas secuencias control de expresión de ADN cadena arriba y cadena abajo;

(b) someter a mezcla a condiciones de ligamiento durante un periodo de tiempo suficiente para unir operativamente los primeros genes de polipéptido a los vectores y producir una pluralidad de moléculas de ADN circular que tienen cada una un primer cistrón para expresar el primer polipéptido;

(c) tratar la pluralidad de moléculas de ADN circular en condiciones de escisión de ADN para producir una pluralidad de vectores de expresión de ADN en forma lineal que tienen cada uno unas segundas terminaciones cohesivas cadena arriba y cadena abajo que (i) están adaptadas para recibir direccionalmente un repertorio de segundos genes de polipéptido en un marco de lectura común, y (ii) están unidas operativamente a las respectivas secuencias de ADN cadena arriba y cadena abajo. La secuencia de ADN cadena arriba es una secuencia traducible que codifica una señal de secreción, la secuencia de ADN cadena abajo tiene al menos un codon de paro en el marco de lectura, y la secuencia de ADN traducible está unida operativamente a una secuencia de control de la expresión de ADN;

(d) formar una segunda mezcla de ligamiento mediante combinación en un tampón de ligamiento de:

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(i) la pluralidad de vectores de expresión de ADN formados en la etapa (c), y

\hskip0,8cm

(ii) el repertorio de segundos genes de polipéptido en forma de ADNbc, teniendo cada uno terminaciones cohesivas adaptadas para ligamiento direccional con la pluralidad de vectores de expresión de ADN; y

(e) someter la segunda mezcla a condiciones de ligamiento durante un periodo de tiempo suficiente para unir operativamente los segundos genes de polipéptido con dichos vectores y producir una pluralidad de moléculas de ADN circular, teniendo cada una el segundo cistrón para expresar el segundo polipéptido, formando así la biblioteca.

En realizaciones preferidas, es una señal de secreción la señal de secreción pelB. Se prefiere también el uso de un anclaje a membrana de fago filamentoso que deriva de cpIII o cpVIII como se describe en la presente memoria.

La presente invención proporciona también un procedimiento según la reivindicación 32 y una biblioteca o vector según la reivindicación 33.

Los vectores de expresión de ADN útiles para practicar el procedimiento anterior son los vectores de expresión dicistrónicos descritos con mayor detalle anteriormente.

En la práctica del procedimiento de producción de una biblioteca de moléculas de ADN dicistrónico, se prefiere que las primeras terminaciones cohesivas cadena arriba y cadena abajo no tengan las mismas secuencias nucleotídicas que las segundas terminaciones cohesivas cadena arriba y cadena abajo. En esta realización, la etapa de tratamiento (c) para linealizar las moléculas de ADN circular implica típicamente el uso de endonucleasas de restricción que son específicas para producir dichas segundas terminaciones, pero que no escinden la molécula de ADN circular en los sitios que formaron las primeras terminaciones. Son primeras terminaciones ejemplares y preferidas las terminaciones definidas mediante la escisión de pCBAK8 con Xho I y Spe I para formar las primeras terminaciones cadena arriba y cadena abajo, y las definidas mediante la escisión de pCBAK8 con Sac I y Xba I para formar las segundas terminaciones cadena arriba y cadena abajo. En esta realización, pueden utilizarse otros pares de terminaciones cohesivas en los pares respectivos de primeras y segundas terminaciones, siempre que las cuatro terminaciones sean cada una terminaciones distintas no complementarias. Son ejemplares las terminaciones encontradas en los vectores pCOMB3, pCOMB2-3, pCOMB2-3', pCOMB8 y pCOMB2-8 descritos en la presente memoria.

Los procedimientos de tratamiento de la pluralidad de moléculas de ADN circular en condiciones de escisión de ADN para formar moléculas de ADN lineal son generalmente bien conocidas y dependen de la secuencia nucleotídica a escindir y de los mecanismos para escisión. Los tratamientos preferidos implican la adición de las moléculas de ADN a una endonucleasa de restricción específica para un sitio de reconocimiento de endonucleasa en la localización de escisión deseada en una cantidad suficiente para que la endonucleasa de restricción escinda la molécula de ADN. Los tampones, condiciones de escisión y concentraciones de sustrato para la escisión por endonucleasa de restricción son bien conocidos y dependen de la enzima particular utilizada. Las condiciones de escisión por enzima de restricción ejemplares se describen en el ejemplo 2.

8. Procedimientos para cambiar la diversidad de una biblioteca

La presente invención puede utilizarse con procedimientos para cambiar la diversidad de una biblioteca de fago filamentoso de esta invención. Estos procedimientos aumentan generalmente la diversidad de la biblioteca, aumentando así el conjunto de posibles complejos de unión a epítopo en los que examinar una actividad de unión deseada. Como alternativa, los procedimientos pueden dirigirse a enriquecer en una clase de complejos de unión a epítopo. La clase se define típicamente por la capacidad de unirse a un epítopo o familia de epítopos particular presente en un antígeno o grupo de antígenos preseleccionados.

a. Aumento de la diversidad de la biblioteca mediante mutación

Un procedimiento adecuado para aumentar la diversidad es alterar la secuencia aminoacídica de uno o más polipéptidos del complejo de unión a epítopo codificado por el genoma de un fago de esta invención. Pueden introducirse convenientemente alteraciones al nivel de ácido nucleico mediante mutación del ácido nucleico. El procedimiento puede practicarse en una sola especie de ácido nucleico que codifica un polipéptido de esta invención, o puede practicarse en una biblioteca de ácidos nucleicos presentes en una biblioteca de fago de esta invención.

La mutación de ácidos nucleicos puede realizarse mediante una variedad de medios, pero se realiza lo más convenientemente en una reacción PCR durante un proceso de PCR de la presente invención. La mutagénesis por PCR puede ser aleatoria o dirigida a secuencias nucleotídicas específicas, como es generalmente bien sabido. Se ha descrito anteriormente la realización de PCR en condiciones favorables a la mutagénesis aleatoria, y se designa como "PCR con tendencia al error". De forma similar, la mutagénesis dirigida implica el uso de cebadores de PCR diseñados para orientar un tipo específico de mutación en una región específica de la secuencia nucleotídica.

La invención puede ser útil para aumentar la diversidad de uno o más complejos de unión a epítopo mediante mutación dirigida por PCR de una región determinante de la complementariedad (CDR) de un dominio variable de anticuerpo presente en un polipéptido complejo de unión a epítopo de esta invención. La mutagénesis de CDR se ha descrito anteriormente en términos generales para "humanizar" un anticuerpo mediante la introducción de secuencias humanas en la región CDR de un anticuerpo de murina. Véase la solicitud europea nº EP 239400.

Por ejemplo, la invención puede ser útil para un procedimiento de mutagénesis para alterar la especificidad inmunológica de un gen de inmunoglobulina clonado presente en un vector de ADN de esta invención. El procedimiento proporciona la mutagénesis dirigida en una CDR preseleccionada de un gen de inmunoglobulina, que comprende someter a una molécula de ADN recombinante (ADNr) que contiene el gen de inmunoglobulina clonado que tiene una CDR diana a condiciones de PCR adecuadas para amplificar una región preseleccionada de la CDR. En el procedimiento, la molécula de ADNr se somete a condiciones de PCR que incluyen un oligonucleótido cebador de PCR como se describe a continuación que constituye el primer cebador en un par cebador de PCR, como es bien conocido, para producir un producto de PCR amplificado que deriva de la región CDR preseleccionada pero que incluye las secuencias nucleotídicas del cebador de PCR. El segundo oligonucleótido en las condiciones de amplificación de PCR puede ser cualquier cebador de PCR derivado del gen de inmunoglobulina a mutagenizar, como se describe en la presente memoria.

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Los procedimientos preferidos serían aquellos que utilizan un oligonucleótido de esta invención como se describe a continuación.

En dichos procedimientos, por lo tanto, se contempla un oligonucleótido que es útil como cebador en una reacción en cadena con polimerasa (PCR) para inducir la mutagénesis en una región determinante de la complementariedad (CDR) de un gen de inmunoglobulina. El oligonucleótido tiene terminaciones 3' y 5' y comprende (1) una secuencia nucleotídica en su terminación 3' capaz de hibridar con una primera región estructural de un gen de inmunoglobulina, (2) una secuencia nucleotídica en su terminación 5' capaz de hibridar con una segunda región estructural de un gen de inmunoglobulina y (3) una secuencia nucleotídica entre las terminaciones 3' y 5' adaptada para introducir mutaciones durante una PCR en la región CDR entre las primera y segunda regiones estructurales del gen de inmunoglobulina, mutagenizando así la región CDR.

En la medida en que los genes de inmunoglobulina tienen tres regiones CDR tanto en la cadena pesada como en la cadena ligera de una inmunoglobulina, cada una separada por una región estructural distintiva, ha de entenderse que el ejemplo anterior es fácilmente aplicable a la introducción de mutaciones en una CDR específica mediante selección de las secuencias nucleotídicas 5' y 3' anteriores para hibridar con las regiones estructurales que flanquean la CDR diana. Por tanto, las primera y segunda secuencias estructurales anteriores pueden ser las secuencias conservadas que flanquean CDR, CDR2 o CDR3 en cualquiera de las cadenas pesada o ligera. Es ejemplar y preferida la CDR3 de la cadena pesada de inmunoglobulina humana.

La longitud de las secuencias nucleotídicas 3' y 5'-terminales de un oligonucleótido de mutagenización en cuestión pueden variar en longitud como es bien conocido, siempre que la longitud proporcione una extensión de nucleótidos complementarios de las secuencias estructurales diana para hibridar con ellas. En el caso de la secuencia nucleotídica 3'-terminal, debe ser de suficiente longitud y complementariedad con la región estructural diana localizada 3' de la región CDR a mutagenizar para hibridar y proporcionar una terminación 3'-hidroxilo para iniciar una reacción de extensión de cebador. En el caso de una secuencia nucleotídica 5'-terminal, debe ser de suficiente longitud y complementariedad con la región estructural diana localizada 5' de la región CDR a mutagenizar para proporcionar un medio para hibridar en una reacción de extensión por superposición de PCR como se describe anteriormente para ensamblar la cadena pesada o ligera completa de inmunoglobulina.

Las regiones estructurales que flanquean una CDR están bien caracterizadas en las técnicas inmunológicas, e incluyen secuencias nucleotídicas conocidas o secuencias consenso como se describen en otra parte de la presente memoria. Cuando ha de mutagenizarse un solo gen de inmunoglobulina preseleccionado, las secuencias estructurales definidas que flanquean una CDR particular son conocidas, o pueden determinarse fácilmente mediante protocolos de secuenciación de nucleótidos. Cuando ha de mutagenizarse un repertorio de genes de inmunoglobulina, las secuencias derivadas de regiones estructurales son preferiblemente conservadas, como se describe en otra parte de la presente memoria.

Preferiblemente, la longitud de las secuencias nucleotídicas 3' y 5'-terminales es cada una de al menos 6 nucleótidos de longitud, y puede ser de hasta 50 o más nucleótidos de longitud, aunque estas longitudes son innecesarias para asegurar una hibridación exacta y reproducible. Se prefieren longitudes en el intervalo de 12 a 30 nucleótidos, y típicamente son de aproximadamente 18 nucleótidos.

Una secuencia nucleotídica definida estructural particularmente preferida para uso como secuencia nucleotídica de terminación 3' tiene la secuencia nucleotídica 5'-TGGGGCCAAGGGACCACG-3' (SEC Nº ID 122).

Una secuencia nucleotídica definida estructural particularmente preferida para uso como secuencia nucleotídica de terminación 5' tiene la secuencia nucleotídica 5'-GTGTATTATTGTGCGAGA-3' (SEC Nº ID 123).

La secuencia nucleotídica localizada entre las terminaciones 3' y 5' adaptada para mutagenizar una CDR puede ser cualquier secuencia nucleotídica, a condición de que la nueva secuencia se incorpore mediante los procedimientos anteriores. Sin embargo, el presente enfoque proporciona un medio para producir una gran población de CDR mutagenizadas en una sola reacción PCR mediante el uso de una población de secuencias redundantes que definen nucleótidos aleatorios o casi aleatorios en la región CDR a mutagenizar.

Un oligonucleótido preferido comprende una secuencia nucleotídica entre las terminaciones 3' y 5' anteriormente descritas que se representa por la fórmula: [NNR]_{n}, en la que N puede ser independientemente cualquier nucleótido, R puede ser S, K o análogos de los mismos, en la que S es G o C, K es G o T y en la que n es de 3 a aproximadamente 24. En procedimientos preferidos, el oligonucleótido tiene la fórmula: 5'-GTGTATTATTGTGCGAGA[NNR]

\hbox{ _{n} }

TGGGGCCAAGGGACCACG-3' (SEC Nº ID 124).

Es ejemplar y particularmente preferido el oligonucleótido en el que R es S y n es 16, de tal modo que el oligonucleótido representa una gran población de secuencias oligonucleotídicas redundantes.

Por tanto, la invención puede ser útil en un procedimiento para aumentar la diversidad de una biblioteca de partículas de fago filamentoso que comprende las etapas de: a) proporcionar una biblioteca de partículas de fago filamentoso según la presente invención, y b) mutar la secuencia nucleotídica que codifica el dominio variable de inmunoglobulina presente en cada vector de expresión de ADN en la biblioteca para formar una biblioteca de partículas de fago que contienen cada una secuencia nucleotídica de dominio variable de inmunoglobulina.

La provisión puede incluir manipular los genomas de las partículas de fago en la biblioteca para aislar los ácidos nucleicos en preparación para una reacción PCR mutagenizante. Las manipulaciones de una biblioteca de fago para aislar el genoma de fago para uso en una reacción PCR se describen en otra parte de la presente memoria.

En un procedimiento, la mutación comprende someter la secuencia nucleotídica que codifica el dominio variable de inmunoglobulina a una reacción en cadena con polimerasa con tendencia al error. En otro procedimiento, la mutación comprende someter la secuencia nucleotídica que codifica un dominio variable de inmunoglobulina a un procedimiento para mutar una CDR de la secuencia nucleotídica que codifica un dominio variable de inmunoglobulina utilizando un oligonucleótido dirigido a CDR como se describe en la presente memoria.

Se describen en los ejemplos los procedimientos ejemplares de mutación de la región CDR de un ácido nucleico que codifica un complejo de unión a epítopo particular utilizando el oligonucleótido de orientación a CDR anterior, o utilizando PCR con tendencia al error para producir una gran biblioteca de diversos complejos.

b. Enriquecimiento de una biblioteca

La invención puede ser también útil junto con un procedimiento para cambiar la diversidad de la biblioteca mediante el enriquecimiento de la biblioteca en una clase preseleccionada de complejos de unión a epítopo. El proceso implica generalmente la selección por afinidad de aquellas partículas de fago en una biblioteca que son capaces de unirse a un antígeno preseleccionado. El proceso de selección por afinidad, o "panning", se describe con detalle en los ejemplos.

Por tanto, la invención puede ser útil en un procedimiento para cambiar la diversidad de una biblioteca de partículas de fago filamentoso que comprende las etapas de a) proporcionar una biblioteca de partículas de fago filamentoso según la presente invención, b) poner en contacto la biblioteca proporcionada con un ligando preseleccionado en condiciones suficientes para que los miembros de la biblioteca se unan al ligando y formen un complejo ligando-partícula de fago, y c) aislar las partículas de fago en el complejo separadas de los miembros no unidos de la biblioteca para formar una biblioteca enriquecida en ligando que comprende partículas de fago que tienen especificidad de unión por el ligando preseleccionado.

En procedimientos preferidos, el ligando preseleccionado se fija a un soporte sólido, y se forma el complejo ligando-partícula de fago en la fase sólida. Este procedimiento comprende además las etapas de i) lavar el soporte sólido después de la etapa de puesta en contacto para aclarar los miembros no unidos de la biblioteca del soporte sólido; y ii) eluir del soporte sólido cualquier partícula de fago unida a la fase sólida. Las partículas de fago eluidas se recogen, formando así partículas de fago aisladas que comprenden una biblioteca enriquecida.

La elución puede realizarse en una variedad de condiciones que desestabilicen la interacción ligando-complejo de unión a epítopo. Las condiciones típicas incluyen tampones muy salinos o de bajo pH. Se prefieren particularmente tampones de aproximadamente pH a 1 5, preferiblemente de pH aproximadamente 2 a 3. Como alternativa, la interacción puede desestabilizarse mediante competición con una cantidad en exceso del ligando preseleccionado en el tampón de elución. Se describen ambos procedimientos de elución en los ejemplos.

Un procedimiento relacionado combina ambos rasgos de aumentar la diversidad de una biblioteca mediante mutación y enriquecer la biblioteca mediante selección por las afinidades del complejo de unión a epítopo "maduro" por un ligando preseleccionado. Por tanto, es posible desarrollar nuevas especificidades de unión, y especificidades de unión más potentes, utilizando estos procedimientos para cambiar la diversidad de la biblioteca.

La combinación de estos procedimientos puede configurarse en una variedad de formas, como resultará evidente para un médico experto. Por ejemplo, puede aislarse una biblioteca, mutagenizarse (diversificarse) y después examinarse (enriquecerse en) una actividad de unión particular. Como alternativa, puede enriquecerse en una actividad particular una biblioteca, mutagenizarse el complejo de unión a epítopo específico y enriquecerse adicionalmente la biblioteca producida mediante mutagénesis.

En otra permutación sobre este tema, pueden utilizarse las diferencias entre bibliotecas basadas en anclajes a membrana derivados de cpIII y cpVIII debidas a sus diferencias inherentes de valencia. Debido a que una biblioteca de fago que tiene el anclaje a membrana derivado de cpIII contiene sólo de 1 a 4 copias del complejo de unión a epítopo sobre la superficie de cada partícula de fago, el fago presenta un complejo de unión de valencia relativamente "baja", aproximadamente uno. En contraste, una biblioteca de fago que tiene un anclaje a membrana derivado de cpVIII contendrá típicamente de 20 a 1000 copias del complejo de unión a epítopo sobre la superficie de cada partícula de fago, y la partícula presenta una valencia relativamente "alta". Por tanto, las bibliotecas basadas en cpIII se designan como monovalentes y las bibliotecas basadas en cpVIII se designan como multivalentes.

Aplicando los bien conocidos principios de afinidad y valencia de anticuerpos, se entiende que una biblioteca basada en cpIII puede enriquecerse tras examinar las interacciones de unión de afinidad generalmente mayores (constantes de unión de 10^{6} a 10^{9} M^{-1}) en comparación con el intervalo más amplio de afinidades (constantes de unión de 10^{4} a 10^{9} M^{-1}) aislables utilizando un reactivo multivalente encontradas en la biblioteca basada en cpVIII. Por lo tanto, una biblioteca basada en cpVIII es útil para aislar un amplio intervalo de afinidades de complejos de unión a epítopo de baja a alta, mientras que una biblioteca basada en cpIII es útil para aislar un intervalo más estrecho de complejos de unión a epítopo de mayor afinidad.

Por tanto, la invención puede ser útil para producir una primera biblioteca enriquecida mediante el enriquecimiento de una biblioteca basada en cpVIII. Después de ello, los genes para codificar los polipéptidos de complejo de unión a epítopo se transfieren a un vector basado en cpIII, y posteriormente se enriquecen en una interacción de unión de alta afinidad. En un procedimiento, puede utilizarse una etapa de mutación antes de la transferencia al vector basado en cpIII.

En otro procedimiento, se muestra la capacidad de madurar una nueva afinidad mediante un ejemplo en la presente memoria en el que se mutageniza un gen que codifica el heterodímero V_{H}/V_{L} clonado capaz de expresar un heterodímero que se une al ligando toxoide del tétanos (TT) utilizando mutagénesis por PCR dirigida a CDR, y la población de ácidos nucleicos mutagenizados resultante de la misma se inserta en una biblioteca basada en cpIII y se examina la unión a un ligando diferente, la fluoresceína. Se identificó un complejo de unión a epítopo de alta afinidad que se une a fluoresceína.

En un procedimiento relacionado, se clonó una biblioteca no tratada (no inmunizada) en una biblioteca basada en cpVIII y se examinó la unión al antígeno progesterona. Se clonaron ligantes de baja afinidad en una biblioteca basada en cpIII, y se identificaron tres clones de unión de alta afinidad que se unen a progesterona. Se combinaron los tres clones, se sometió la combinación a mutagénesis por PCR con tendencia al error, se clonó la biblioteca resultante de ácidos nucleicos mutados en un vector basado en cpIII y se examinó frente a la progesterona, proporcionando un complejo de unión a epítopo de alta afinidad que se une a progesterona. Por tanto, se "maduró" un complejo de alta afinidad a partir de una biblioteca no tratada.

Por tanto, la presente invención puede ser también útil en un procedimiento para madurar la afinidad de un complejo de unión a epítopo codificado por un fago filamentoso de esta invención que comprende las etapas de a) proporcionar el genoma de un fago filamentoso, b) mutar la secuencia nucleotídica que codifica el dominio variable de inmunoglobulina presente en el genoma proporcionado para formar una biblioteca de partículas de fago que contiene una secuencia nucleotídica de dominio variable de inmunoglobulina mutada, c) poner en contacto la biblioteca formada en la etapa b) con un ligando preseleccionado en condiciones suficientes para que los miembros de la biblioteca se unan al ligando y formen un complejo ligando-partícula de fago, y d) aislar partículas de fago en dicho complejo separadas de los miembros no unidos de la biblioteca para formar una biblioteca enriquecida en ligando que comprende partículas de fago que tienen especificidad de unión por el ligando preseleccionado.

F. Bibliotecas de fago

La presente invención contempla una biblioteca de moléculas de ADN que codifica cada una un polipéptido de fusión de esta invención, en la que la biblioteca está en forma de una población de diferentes partículas de fago filamentoso que contienen cada una molécula de ADNr diferente de esta invención. Por molécula de ADNr diferente se quiere indicar una molécula de ADNr que difiere en la secuencia de bases nucleotídicas que codifica un polipéptido de esta invención cuando se compara la secuencia nucleotídica con otra molécula de ADNr en la biblioteca.

Por tanto, una biblioteca de fago es una población de fagos filamentosos, preferiblemente fago filamentoso f1, fd o M13, teniendo cada fago encapsulado dentro de la partícula un vector de expresión de ADNr de esta invención, el ADNr está encapsulado en la partícula de fago mediante las proteínas de matriz del fago. Dicho de otra manera, una biblioteca de fago contiene una pluralidad de partículas de fago filamentoso, conteniendo cada partícula de fago diferente al menos un complejo de unión a epítopo en su superficie como se describe en la presente memoria. Por tanto, la presente invención proporciona una biblioteca de partículas de fago según la reivindicación 27. Una biblioteca preferida comprende partículas de fago que contienen moléculas de ADN que codifican al menos 10^{6}, preferiblemente 10^{7}, y más preferiblemente 10^{8-9} polipéptidos de fusión diferentes de esta invención. Por polipéptidos de fusión diferentes, se quiere indicar polipéptidos de fusión que difieren en las secuencias de residuos aminoacídicos. Están disponibles diversidades de biblioteca aún mayores cuando se utilizan procedimientos de combinación aleatoria o mutagénesis como se describen en la presente memoria para aumentar la diversidad de la biblioteca.

Cuando el vector de expresión encapsulado codifica los primero y segundo polipéptidos de un receptor de ensamblaje autógeno, por ejemplo los polipéptidos V_{H} y V_{L}que forman un Fab, la biblioteca puede caracterizarse también por contener o expresar una multiplicidad de especificidades de receptor. Por tanto, las bibliotecas expresan al menos 10^{5}, preferiblemente al menos 10^{6} y más preferiblemente al menos 10^{7} receptores diferentes, tales como anticuerpos, receptores de células T, integrinas y similares diferentes.

El tamaño de la biblioteca puede variar dependiendo de una serie de factores, particularmente del procedimiento mediante el que se produce la biblioteca. Como se utiliza en la presente memoria, el tamaño indica la complejidad o diversidad de la biblioteca, es decir, el número de especies diferentes que constituyen la biblioteca, en lugar del número absoluto de partículas en la biblioteca.

Por tanto, cuando una biblioteca se produce clonando primero separadamente dos repertorios de genes, correspondientes al primer y segundo polipéptidos, el tamaño de la biblioteca resultante después de combinar aleatoriamente los dos repertorios en forma de un vector dicistrónico aumenta en gran medida. Por ejemplo, considérense los repertorios génicos de anticuerpos variables de cadena ligera y de cadena pesada, que tienen cada uno 10^{6} miembros diferentes. Combinar los dos repertorios proporciona teóricamente una biblioteca de 10^{12} posibles especies de vector dicistrónico diferentes.

Se diseñó un sistema experimental para evaluar la capacidad de "redistribuir" dos repertorios como se describe anteriormente para generar una mayor diversidad. El sistema utilizó una biblioteca combinatoria de Fab derivada de un ratón inmunizado con el hapteno fosfonamidato de para-nitrofenilo (NPN). Se aislaron 22 clones diferentes, y se aislaron y secuenciaron los ácidos nucleicos que codifican la cadena pesada y ligera para determinar que 21 de los 22 pares eran diferentes al nivel de secuencia de ácido nucleico. Los 22 clones de unión a ligando NPN se recombinaron aleatoriamente (se redistribuyeron), y se volvió a examinar la unión a NPN.

Suponiendo que las cadenas pesada y ligera pueden formar sólo moléculas de receptor heterodimérico de unión a ligando si se reúnen los pares originales, el modelo predice que un 4,6% de las combinaciones totales proporcionarían combinaciones de unión a ligando. Cualquier porcentaje mayor demuestra que otros apareamientos distintos de los pares originales son también capaces de unirse a NPN. Los resultados mostraron que un 27% de los clones aislados se unieron a NPN, indicando un aumento de 5,8 veces del tamaño de la biblioteca de receptores capaces de unirse a NPN tras redistribución. Este aumento demostrado está limitado a aquellos clones que se unen a NPN. Otros miembros de la biblioteca redistribuida aleatoriamente tienen la capacidad de unirse a diversos ligandos no NPN. Por tanto, se mostró que la redistribución aumenta la diversidad.

La complejidad de la biblioteca puede aumentarse también utilizando los procedimientos descritos en la presente memoria para mutar secuencias nucleotídicas en una biblioteca preexistente de secuencias. Indicado en términos de diferencias de residuos aminoacídicos para un polipéptido de fusión expresado, puede haber un aumento de potencialmente 20 veces el tamaño de la biblioteca para cada posición de residuo aminoacídico que está orientada a mutación aleatoria.

Por ejemplo, utilizando la mutagénesis dirigida a la región determinante de la complementariedad (CDR) de genes de anticuerpo como se describe en los ejemplos, se orientó una región lineal de 16 residuos aminoacídicos a mutación aleatoria. Empezando con una sola especie y mutando las 16 posiciones de residuos mediante todas las combinaciones posibles con una elección de 20 aminoácidos diferentes, se produciría teóricamente una biblioteca de 20^{16} especies, o 6 x 10^{20} especies diferentes.

Como se describe en la presente memoria, es una ventaja particular de un fago filamentoso de la presente invención que la molécula de ADN presente en la partícula de fago y que codifica uno o ambos de los miembros del receptor heterodimérico puede separarse de otras moléculas de ADN presentes en la biblioteca basándose en la presencia del polipéptido de fusión expresado particular en la superficie de la partícula de fago.

El aislamiento (segregación) de una molécula de ADN que codifica los miembros de un receptor heterodimérico se realiza mediante la segregación de la partícula de fago filamentoso que contiene el gen o genes de interés de la población de las demás partículas de fago que comprende la biblioteca. La segregación de las partículas de fago implica la separación física y la propagación de partículas de fago individual apartadas de las demás partículas de la biblioteca. Los procedimientos para la separación física de las partículas de fago filamentoso para producir partículas individuales, y la propagación de las partículas individuales para formar poblaciones de fagos de progenie derivados de la partícula segregada individual, son bien conocidos en las técnicas de los fagos filamentosos.

Un procedimiento de separación preferido implica la identificación del heterodímero expresado en la superficie de la partícula de fago mediante la especificidad de unión a ligando entre la partícula de fago y un ligando preseleccionado. Es ejemplar y preferido el uso de procedimientos de "selección por afinidad" en los que se pone en contacto una suspensión de partículas de fago con un ligando en fase sólida (antígeno) y se permite unirse específicamente (o inmunoreaccionar cuando el heterodímero incluye un dominio variable de inmunoglobulina). Después de la unión, las partículas no unidas se separan por lavado de la fase sólida, y las partículas de fago unidas son aquellas que contienen receptor heterodimérico específico de ligando (heterodímero) en su superficie. Las partículas unidas pueden recuperarse después mediante elución de la fase sólida de la partícula unida, típicamente mediante el uso de disolventes acuosos que interfieren con la interacción ligando-receptor. Los disolventes típicos incluyen tampones que tienen alta fuerza iónica, bajo pH o una cantidad de ligando soluble competitivo suficiente para desestabilizar la interacción de unión receptor-ligando.

Un procedimiento alternativo para separar una partícula de fago basado en la especificidad de ligando del heterodímero expresado en la superficie de una población de partículas es precipitar las partículas de fago de la fase de solución mediante reticulación con el ligando. Se describe con detalle en el ejemplo 4c un procedimiento de reticulación y precipitación ejemplar y preferido.

El uso de los procedimientos de segregación de partículas anteriores proporciona un medio para examinar una población de partículas de fago filamentoso presente en una biblioteca de fago de esta invención. Como se aplica a una biblioteca de fago, el examen puede utilizarse para enriquecer la biblioteca en una o más partículas que expresan un heterodímero que tiene una especificidad de unión a ligando preseleccionado. Cuando la biblioteca se diseña para contener múltiples especies de heterodímeros que tienen todos cierta cantidad detectable de actividad de unión a ligando, pero que difieren en la estructura de proteína, antigenicidad, afinidad de unión a ligando o avidez, y similares, los procedimientos de examen pueden utilizarse secuencialmente para producir primero una biblioteca enriquecida en una especificidad de unión preseleccionada, y después para producir una segunda biblioteca enriquecida adicionalmente mediante examen adicional que comprende una o más partículas de fago aisladas. Los procedimientos para medir las actividades de unión a ligando, antigenicidad e interacciones similares entre un ligando y un receptor son generalmente bien conocidos y no se discuten adicionalmente, ya que no son rasgos esenciales de la presente invención.

Por tanto, una biblioteca de fago puede ser una población de partículas enriquecidas en una especificidad de unión a ligando preseleccionado.

Por tanto, una biblioteca de fago puede comprender también una población de partículas en la que cada partícula contiene al menos un polipéptido de fusión de esta invención en la superficie de la partícula de fago. La cantidad real de polipéptido de fusión presente en la superficie de una partícula de fago depende, en parte, de la elección del anclaje a membrana de proteína de recubrimiento presente en el polipéptido de fusión.

Cuando el anclaje deriva de cpIII, existen típicamente aproximadamente 1 a 4 polipéptidos de fusión por partícula de fago. Cuando el anclaje deriva de la más preferida cpVIII, existe el potencial de cientos de polipéptidos de fusión en la superficie de la partícula dependiendo de las condiciones de crecimiento y de otros factores discutidos en la presente memoria. La cantidad real de polipéptidos de fusión presentes en una partícula de fago puede ajustarse controlando la cantidad "capturada" por la partícula de fago a medida que se sintetiza en una célula hospedadora.

Típicamente, una partícula de fago en una biblioteca de esta invención contiene de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 polipéptidos de fusión derivados de cpVIII en la superficie de cada partícula, y más preferiblemente aproximadamente 20 a 50 polipéptidos de fusión por partícula. Se muestran cantidades ejemplares de polipéptidos de fusión de superficie mediante las micrografías electrónicas descritas en el ejemplo 4a, que describe partículas que tienen aproximadamente 20 a 24 polipéptidos de fusión derivados de cpVIII por partícula.

En algunos casos, la presente invención puede utilizarse para crear una población de partículas de fago que son la progenie de una sola partícula, y por lo tanto todas expresan el mismo heterodímero en la superficie de la partícula. Dicha población de fagos es homogénea y derivada por clonación, y por lo tanto proporciona una fuente para expresar grandes cantidades de un polipéptido de fusión particular. Se describe una población de fagos homogéneos por clonación ejemplares en el ejemplo 4.

Se produce una partícula de fago filamentoso en una biblioteca de esta invención mediante procedimientos de preparación de partículas de fagos filamentosos estándar, y depende de la presencia en un vector de expresión de ADN de esta invención de un origen de replicación de fago filamentoso como se describe en la presente memoria para proporcionar las señales necesarias para (1) la producción de una forma replicativa de fago filamentoso monocatenario y (2) el encapsulado de la forma replicativa en una partícula de fago filamentoso. Dicha molécula de ADN puede encapsularse cuando está presente en una célula bacteriana tras la introducción del complemento genético para proporcionar las proteínas de fago filamentoso requeridas para la producción de partículas de fago infecciosas. Es un procedimiento típico y preferido para complementación genética infectar una célula hospedadora bacteriana que contiene un vector de expresión de ADN de esta invención con un fago filamentoso auxiliar, proporcionando así los elementos genéticos requeridos para el ensamblaje de la partícula de fago. Se describen procedimientos de rescate auxiliares ejemplares en la presente memoria en el ejemplo 2, y se describen por Short et al., Nuc. Acids Res., 16: 7583-7600 (1988).

El nivel de receptor heterodimérico capturado en la superficie de una partícula de fago filamentoso durante el proceso de extrusión de la partícula de fago de la célula hospedadora puede controlarse mediante una variedad de medios. En un procedimiento, los niveles de polipéptidos de fusión se controlan mediante el uso de promotores fuertes en los primer y segundo cistrones para expresar los polipéptidos, de tal modo que la transcripción de los cistrones del polipéptido de fusión ocurre a una velocidad relativa mayor que la velocidad de transcripción del gen cpVIII en el fago auxiliar. En otro procedimiento, el fago auxiliar puede tener una mutación ámbar en el gen para expresar cpVIII, de tal modo que se transcribe menos cpVIII de tipo silvestre en la célula hospedadora que polipéptidos de fusión, conduciendo así a tasas aumentadas de polipéptido de fusión en comparación con la cpVIII durante el proceso de extrusión.

En otro procedimiento, la cantidad de receptor heterodimérico en la superficie de la partícula de fago puede controlarse controlando la sincronización entre la expresión de los polipéptidos de fusión y la superinfección por el fago auxiliar. Después de la introducción del vector de expresión en la célula hospedadora, tiempos de retardo mayores antes de la adición del fago auxiliar permitirán una acumulación aumentada de los polipéptidos de fusión en la célula hospedadora, aumentando así la cantidad de polipéptido de fusión capturado por la partícula de fago extrusionada.

La presente invención proporciona una biblioteca según las reivindicaciones 28-30.

G. Procedimientos de diagnóstico

La presente invención puede ser también útil en un sistema de diagnóstico, preferiblemente en forma de kit, para ensayar la presencia de un ligando preseleccionado, o antígeno, en una muestra en la que es deseable detectar la presencia, y preferiblemente la cantidad, de ligando o antígeno en una muestra según los procedimientos de diagnóstico descritos en la presente memoria.

La muestra puede ser un tejido, extracto de tejido, muestra de fluido o muestra de fluido corporal, tal como sangre, plasma o suero.

El sistema de diagnóstico puede incluir, en una cantidad suficiente para realizar al menos un ensayo, un fago filamentoso o receptor heterodimérico de unión a ligando según la presente invención, en forma de un reactivo empaquetado separadamente.

Se describen en los ejemplos sistemas de diagnóstico ejemplares para detectar un ligando preseleccionado en la fase sólida y utilizar un fago filamentoso de esta invención.

Las instrucciones para uso del reactivo o reactivos empaquetados se incluyen típicamente también.

Como se utiliza en la presente memoria, el término "paquete" designa una matriz sólida o material tal como vidrio, plástico (por ejemplo polietileno, polipropileno o policarbonato), papel, papel metalizado y similares capaz de mantener en límites fijos un receptor heterodimérico, fago filamentoso o biblioteca de fagos de la presente invención. Por tanto, por ejemplo, un paquete puede ser un vial de vidrio utilizado para contener cantidades de miligramos de una preparación de fagos marcados contemplada, o puede ser un pocillo de placa de microvaloración al que se han fijado operativamente cantidades de microgramos de un receptor de partícula(s) de fagos contemplado, concretamente unido de modo que sea capaz de unirse a un ligando.

"Instrucciones para uso" incluye típicamente una expresión tangible que describe la concentración de reactivo o al menos un parámetro del procedimiento de ensayo tal como las cantidades relativas de reactivo y muestra a mezclar, los periodos de tiempo de mantenimiento para las mezclas reactivo/muestra, la temperatura, las condiciones de tampón y similares.

Un sistema de diagnóstico para uso con la presente invención puede incluir preferiblemente también un marcaje o medio indicador capaz de señalar la formación de un complejo de reacción de unión que contiene un receptor heterodimérico de unión a ligando o fago complejado con el ligando preseleccionado.

La palabra "complejo" como se utiliza en la presente memoria designa el producto de una reacción de unión específica tal como una reacción fago-ligando o receptor-ligando. Los complejos ejemplares son productos de inmunoreacción.

Como se utiliza en la presente memoria, las expresiones "marcaje" y "medio indicador" en sus diversas formas gramaticales designan átomos y moléculas individuales que están directa o indirectamente implicados en la producción de una señal detectable para indicar la presencia de un complejo. Puede unirse o incorporarse cualquier marcaje o medio indicador a un polipéptido expresado o partícula de fago que se utiliza en un procedimiento de diagnóstico. Dichos marcajes son bien conocidos por sí mismos en la química de diagnóstico clínico, y constituyen una parte de esta invención sólo en la medida en que se utilizan con por lo demás nuevos procedimientos y/o sistemas de proteínas.

El medio de marcaje puede ser un agente de marcaje fluorescente que se une químicamente a anticuerpos o antígenos sin desnaturalizarlos, formando un fluorocromo (tinte) que es un trazador inmunofluorescente útil. Los agentes de marcaje fluorescente adecuados son fluorocromos tales como isocianato de fluoresceína (FIC), isotiocianato de fluoresceína (FITC), cloruro de 5-dimetilamino-1-naftalenosulfonilo (DANSC), isotiocianato de tetrametilrodamina (TRITC), lisamina, sulfonilcloruro de rodamina 8200 (RB 200 SC) y similares. Se encuentra una descripción de las técnicas de análisis por inmunofluorescencia en DeLuca, "Immunofluorescence Analysis" en Antibody As a Tool, Marchalonis et al., ed., John Wiley & Sons, Ltd., pág. 189-231 (1982).

En procedimientos preferidos, el grupo indicador es una enzima, tal como peroxidasa de rábano picante (HRP), glucosa oxidasa o similares. En dichos casos, cuando el grupo indicador principal es una enzima tal como HRP o glucosa oxidasa, se requieren reactivos adicionales para visualizar el hecho de que se ha formado un complejo receptor-ligando (inmunoreactivo). Dichos reactivos adicionales para HRP incluyen peróxido de hidrógeno y un precursor de tinte de oxidación tal como diaminobencidina. Un reactivo adicional útil con la glucosa oxidasa es el ácido 2,2'-amino-di-(3-etilbenzotiazolin-G-sulfónico) (ABTS).

Los elementos radiactivos son también agentes de marcaje útiles y se utilizan como se ilustra en la presente memoria. Es un agente de radiomarcaje ejemplar un elemento radiactivo que produzca emisiones de rayos gamma. Los elementos que emiten por sí mismos rayos gamma, tales como ^{124}I, ^{125}I, ^{128}I, ^{132}I, y ^{51}Cr representan una clase de grupos indicadores de elementos radiactivos productores de emisión de rayos gamma. Se prefiere particularmente ^{125}I. Otro grupo de medios de marcaje útil son aquellos elementos tales como ^{11}C, ^{18}F, ^{15}O y ^{13}N, que emiten por sí mismo positrones. Los positrones así emitidos producen rayos gamma tras encontrarse con los electrones presentes en el cuerpo animal. Es también útil un emisor beta tal como ^{111}indio o ^{3}H.

La unión de marcajes, concretamente el marcaje de polipéptidos y proteínas es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, las proteínas o fagos pueden marcarse mediante la incorporación metabólica de aminoácidos que contienen radioisótopos proporcionados como componente al medio de cultivo. Véase, por ejemplo, Galfre et al., Meth. Enzymol., 73: 3-46 (1981). Las técnicas de conjugación o acoplamiento de proteína mediante grupos funcionales activados son particularmente aplicables. Véanse, por ejemplo, Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., vol. 8 supl. 7: 7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3: 889-894 (1984) y la patente de EE.UU. nº 4.493.795.

Los sistemas de diagnóstico pueden incluir también, preferiblemente en forma de un paquete separado, un agente de unión específica. Un "agente de unión específica" es una entidad molecular capaz de unirse selectivamente a una especie reactiva de la presente invención o a un complejo que contiene dicha especie, pero no es por sí misma un polipéptido o fago de la presente invención. Los agentes de unión específica ejemplares son moléculas de anticuerpo, proteínas de complemento o fragmentos de las mismas, proteína A de S. aureus y similares. Preferiblemente, el agente de unión específica se une a la especie reactiva cuando esa especie está presente como parte de un complejo.

En sistemas preferidos, el agente de unión específica está marcado. Sin embargo, cuando el sistema de diagnóstico incluye un agente de unión específico que no está marcado, el agente se utiliza típicamente como medio o reactivo de amplificación. En estos sistemas, el agente de unión específica marcado es capaz de unirse específicamente al medio de amplificación cuando el medio de amplificación está unido a un complejo que contiene una especie reactiva.

Los kits de diagnóstico útiles con relación a la presente invención pueden utilizarse en un formato "ELISA" para detectar la cantidad de un ligando preseleccionado en una muestra de fluido. "ELISA" designa una ensayo de inmunosorción ligado a enzimas que emplea un anticuerpo o antígeno unido a una fase sólida y un conjugado enzima-antígeno o enzima-anticuerpo para detectar y cuantificar la cantidad de un antígeno presente en una muestra, y es fácilmente aplicable a los presentes procedimientos. Se encuentra una descripción de la técnica ELISA en el capítulo 22 de la 4ª edición de Basic and Clinical Immunology por D.P. Sites et al. publicado por Lange Medical Publications de Los Altos, CA, en 1982 y en las patentes de EE.UU. nº 3.654.090, nº 3.850.752 y nº 4.016.043.

Por tanto, en algunos kits de diagnóstico, puede fijarse un polipéptido o un fago de la presente invención a una matriz sólida para formar un soporte sólido que comprende un paquete en los sistemas de diagnóstico en cuestión.

Típicamente, se fija un reactivo a una matriz sólida mediante adsorción desde un medio acuoso, aunque pueden utilizarse otros modos de fijación aplicables a proteínas y polipéptidos que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Se describen procedimientos de adsorción ejemplares en la presente memoria.

Las matrices sólidas útiles son también bien conocidas en la técnica. Dichos materiales son insolubles en agua e incluyen el dextrano reticulado disponible con la marca comercial SEPHADEX de Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ), agarosa, perlas de poliestireno de aproximadamente 1 micrómetro a aproximadamente 5 micrómetros de diámetro disponibles en Abbott Laboratories de North Chicago, IL; poli(cloruro de vinilo), poliestireno, poliacrilamida reticulada, tejidos basados en nitrocelulosa o nailon tales como láminas, tiras o paletas, o tubos, placas o pocillos de una placa de microvaloración tales como las hechas de poliestireno o poli(cloruro de vinilo).

La especie reactiva, agente de unión específica marcado o reactivo de amplificación de cualquier sistema de diagnóstico descrito en la presente memoria puede proporcionarse en solución, en forma de una dispersión líquida o en forma de un polvo sustancialmente seco, por ejemplo en forma liofilizada. Cuando el medio indicador es una enzima, el sustrato de la enzima puede proporcionarse también en un paquete separado de un sistema. Pueden incluirse también un soporte sólido tal como la placa de microvaloración anteriormente descrita y uno o más tampones como elementos empaquetados separadamente en este sistema de ensayo diagnóstico.

Los materiales de empaquetado discutidos en la presente memoria con relación a los sistemas de diagnóstico son aquellos utilizados habitualmente en sistemas de diagnóstico.

H. Procedimientos de ensayo

La presente invención puede aplicarse también a diversos procedimientos de ensayo para determinar la presencia, y preferiblemente la cantidad, de un ligando preseleccionado, presente típicamente en una composición acuosa tal como una muestra de fluido biológico, utilizando un receptor heterodimérico o fago de esta invención como reactivo de unión a ligando para formar un producto de reacción de unión cuya cantidad se relaciona, directa o indirectamente, con la cantidad de ligando preseleccionado en la muestra.

Los expertos en la técnica comprenderán que existen numerosos procedimientos de química de diagnóstico clínico bien conocidos en los que puede utilizarse un reactivo de unión de esta invención para formar un producto de reacción de unión cuya cantidad se relaciona con la cantidad de ligando en una muestra. Por tanto, se describen procedimientos de ensayo ejemplares en la presente memoria.

Pueden emplearse diversos protocolos heterogéneos y homogéneos, competitivos o no competitivos, para realizar un procedimiento de ensayo de esta invención.

En un procedimiento, la invención puede aplicarse a un ensayo de unión directa utilizando un receptor heterodimérico de unión a ligando de esta invención como reactivo de unión para detectar la presencia de un ligando preseleccionado con el que se une el receptor. El procedimiento comprende las etapas de a) mezclar una muestra sospechosa de contener un antígeno preseleccionado con un receptor heterodimérico de unión a ligando de esta invención que se une al ligando preseleccionado en condiciones de unión suficientes para que el receptor heterodimérico de unión a ligando se una al ligando y forme un complejo ligando-receptor; y b) detectar la presencia del complejo ligando-receptor o del receptor heterodimérico de unión a ligando en el complejo.

Las condiciones de unión son aquellas que mantienen la actividad de unión al ligando del receptor. Esas condiciones incluyen un intervalo de temperatura de aproximadamente 4 a 50ºC, un intervalo de valor de pH de aproximadamente 5 a 9 y una fuerza iónica variable de aproximadamente la del agua destilada a la de aproximadamente cloruro de sodio 1 M.

La etapa de detección puede dirigirse, como es bien conocido en las técnicas inmunológicas, al complejo o al reactivo de unión (el componente receptor del complejo). Por tanto, puede utilizarse un reactivo de unión secundario tal como un anticuerpo específico del receptor.

Como alternativa, el complejo puede ser detectable en virtud de haber utilizado una molécula de receptor marcado, marcando así el complejo. La detección en este caso comprende detectar el marcaje presente en el complejo.

En un procedimiento preferido, el receptor heterodimérico de unión a ligando se proporciona en forma de una incorporación a una partícula de fago filamentoso, concretamente a la superficie del fago. Se describe un ensayo ejemplar que utiliza un fago filamentoso de esta invención en formato ELISA en los ejemplos.

En otro procedimiento, se marca detectablemente una partícula de fago filamentoso, tal como incorporando un radioisótopo a una proteína o ácido nucleico del fago como se describe en la presente memoria. En este procedimiento, la detección comprende detectar el marcaje en el complejo, y detectar así la presencia del ligando en el complejo.

Un posible procedimiento de diagnóstico adicional utiliza la multivalencia de una partícula de fago filamentoso para reticular el ligando, formando así un agregado de múltiples ligandos y partículas de fago, produciendo un agregado precipitable. Este procedimiento es comparable con los bien conocidos procedimientos de precipitación inmune. Este procedimiento comprende las etapas de mezclar una muestra con una pluralidad de partículas de fago de esta invención para formar una mezcla de unión en condiciones de unión, seguido de una etapa de separación para aislar los complejos de unión formados. Típicamente, el aislamiento se realiza mediante centrifugación o filtración para retirar el agregado de la mezcla. La presencia de complejos de unión indica la presencia del ligando preseleccionado a detectar.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se pretenden para ilustrar, pero no limitar, el alcance de la invención.

1. Construcción de un vector de expresión dicistrónico para producir un receptor heterodimérico en partículas de fago

Para obtener un sistema vector para generar un gran número de fragmentos de anticuerpo Fab que puedan examinarse directamente, se han construido previamente bibliotecas de expresión en bacteriófago lambda como se describe en Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989). Estos sistemas no contenían rasgos de diseño que proporcionen que el Fab expresado sea orientado a la superficie de una partícula de fago filamentoso.

El criterio principal utilizado al elegir un sistema vector fue la necesidad de generar el mayor número de fragmentos Fab que pudieran examinarse directamente. Se seleccionó el bacteriófago lambda como punto de partida para desarrollar un vector de expresión por tres razones. En primer lugar, el encapsulado in vitro de ADN de fago era el procedimiento más eficaz de reintroducir ADN en células hospedadoras. En segundo lugar, era posible detectar la expresión de proteína al nivel de placas de fagos individuales. Finalmente, el examen de las bibliotecas de fagos implicaba típicamente menos dificultad con la unión no específica. Los vectores de clonación de plásmidos alternativos son sólo ventajosos en el análisis de clones después de que se han identificado. Esta ventaja no se perdía en el presente sistema debido al uso de un vector de expresión dicistrónico tal como pCombVIII, permitiendo así que se escinda un plásmido que contiene insertos que expresan la cadena pesada, la cadena ligera o Fab.

a. Construcción del vector de expresión dicistrónica pCOMB (i) Preparación de lambda Zap™II

Lambda Zap™II es un derivado del lambda Zap original (ATCC nº 40.298) que mantiene todas las características del lambda Zap original incluyendo 6 sitios de clonación únicos, la expresión de proteína de fusión y la capacidad de escindir rápidamente el inserto en forma de un fagémido (Bluescript SK-), pero que carece de la mutación SAM 100, permitiendo el crecimiento de muchas cepas no Sup F, incluyendo XL1-Blue. El lambda Zap™II se construyó como se describe en Short et al., Nuc. Acids. Res., 16: 7583-7600, 1988, reemplazando el gen S lambda contenido en un fragmento de ADN de 4254 pares de bases (pb) producido mediante la digestión de lambda Zap con la enzima de restricción Nco I. Este fragmento de ADN de 4254 pb se reemplazó por el fragmento de ADN de 4254 pb que contiene el gen S lambda aislado de lambda gt10 (ATCC nº 40.179) después de digerir el vector con la enzima de restricción Nco I. El fragmento de ADN de 4254 pb aislado de gt10 lambda se ligó en el vector lambda Zap original utilizando ADN ligasa T4 y protocolos estándar tales como los descritos en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., ed., John Wiley & Sons, NY, 1987, para formar el lambda Zap™II.

(ii) Preparación de lambda Hc2

Para expresar una pluralidad de homólogos de ADN que codifican V_{H} en una célula hospedadora E. coli, se construyó un vector designado como lambda Hc2. El vector proporcionó lo siguiente: la capacidad de disponer los homólogos de ADN que codifica V_{H} en el marco de lectura apropiado; un sitio de unión a ribosoma como se describe por Shine et al., Nature, 254:34, 1975; una secuencia líder que dirige la proteína expresada al espacio periplásmico designada señal de secreción pelB; una secuencia polinucleotídica que codificaba un epítopo conocido (marcaje epitópico); y también un polinucleótido que codificaba una proteína espaciadora entre el homólogo de ADN que codifica V_{H} y el polinucleótido que codifica el marcaje de epítopo. El lambda Hc2 se ha descrito anteriormente por Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989).

Para preparar el lambda Hc2, se construyó una secuencia de ADN sintético que contenía todos los rasgos anteriores diseñando segmentos de polinucleótido monocatenario de 20-40 bases que hibridarían entre sí y formarían la secuencia de ADN sintético bicatenario mostrada en la Figura 3. Se muestran los segmentos polinucleotídicos monocatenarios individuales en la Tabla 3.

Los polinucleótidos N2, N3, N9-4, N11, N10-5, N6, N7 y N8 (Tabla 3) se sometieron a quinasa añadiendo 1 \mul de cada polinucleótido a 0,1 microgramos por mililitro (\mug/\mul) y 20 unidades de polinucleótido quinasa T4 a una solución que contenía Tris-HCl 70 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, ditiotreitol (DTT) 5 mM, beta-mercaptoetanol 10 mM y 500 microgramos por mililitro (\mug/ml) de seroalbúmina bovina (BSA). Se mantuvo la solución a 37 grados centígrados (ºC) durante 30 minutos y se detuvo la reacción manteniendo la solución a 65ºC durante 10 minutos. Se añadieron los dos polinucleótidos terminales, 20 ng de polinucleótidos N1 y polinucleótidos N12, a la solución de reacción de quinasa anterior junto con 1/10 de volumen de una solución que contenía Tris-HCl 20,0 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 2,0 mM y NaCl 50,0 mM. Se calentó esta solución a 70ºC durante 5 minutos y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, aproximadamente 25ºC, durante 1,5 horas en un vaso de precipitados con 500 ml de agua. Durante este periodo de tiempo, se asociaron los 10 polinucleótidos formando el inserto de ADN sintético bicatenario mostrado en la Figura 3. Los polinucleótidos individuales se unieron covalentemente entre sí para estabilizar el inserto de ADN sintético añadiendo 40 \mul de la reacción anterior a una solución que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 7 mM, DTT 1 mM, trifosfato de adenosina (ATP) 1 mM y 10 unidades de ADN ligasa T4. Se mantuvo esta solución a 37ºC durante 30 minutos y después se inactivó la ADN ligasa T4 manteniendo la solución a 65ºC durante 10 minutos. Se sometieron a quinasa los polinucleótidos terminales mezclando 52 \mul de la reacción anterior, 4 \mul de una solución que contenía ATP 10 mM y 5 unidades de polinucleótido quinasa T4. Esta solución se mantuvo a 37ºC durante 30 minutos, y después se inactivó la polinucleótido quinasa T4 manteniendo la solución a 65ºC durante 10 minutos.

TABLA 3

5

Se ligó directamente el inserto de ADN sintético completado en el vector lambda Zap™II descrito en el ejemplo 1a(i), que se había digerido previamente con las enzimas de restricción Not I y Xho I. La mezcla de ligamiento se encapsuló según las instrucciones del fabricante utilizando extracto de encapsulación Gigapack II Gold disponible en Stratagene, La Jolla, California. Se sembró la mezcla de ligamiento encapsulada en células XL1-Blue (Stratagene). Se tomaron muestras de placas lambda individuales y se escindieron los insertos según el protocolo de escisión in vivo para lambda Zap™II proporcionado por el fabricante (Stratagene). Este protocolo de escisión in vivo trasladó el inserto clonado del vector lambda Hc2 a un vector fagémido para permitir una fácil manipulación y secuenciación. Se confirmó la exactitud de las etapas de clonación anteriores secuenciando el inserto utilizando el procedimiento didesoxi de Sanger descrito por Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977) y utilizando las instrucciones del fabricante en el kit de secuenciación con ^{35}S-ATP por transcriptasa inversa AMV (Stratagene). La secuencia del inserto de ADN sintético bicatenario resultante en el vector de expresión V_{H} (lambda Hc2) se muestra en la Figura 3. La secuencia de cada cadena (superior e inferior) de lambda Hc2 se enumera en el listado de secuencias como SEC Nº ID 1 y SEC Nº ID 2, respectivamente. El vector de expresión lambda Hc2 resultante se muestra en la Figura 4.

(iii) Preparación de lambda Lc2

Para expresar una pluralidad de homólogos de ADN que codifican V_{L} en una célula hospedadora E.coli, se construyó un vector designado lambda Lc2 que tenía la capacidad de disponer los homólogos de ADN que codifican V_{L} en el marco de lectura apropiado, proporcionaba un sitio de unión a ribosoma como se describe por Shine et al., Nature, 254: 34 (1975), proporcionaba la señal de secreción de secuencia líder del gen pelB que se ha utilizado anteriormente para secretar exitosamente fragmentos de Fab en E. coli por Lei et al., J. Bac., 169: 4379 (1987) y Better et al., Science, 240: 1041 (1988), y proporcionó también un polinucleótido que contenía un sitio de endonucleasa de restricción para clonación. El lambda Lc2 se ha descrito anteriormente por Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989).

Se construyó una secuencia de ADN sintético que contenía todos los rasgos anteriores diseñando segmentos polinucleotídicos monocatenarios de 20-60 bases que hibridarían entre sí y formarían la secuencia de ADN sintético bicatenario mostrada en la Figura 5. La secuencia de cada segmento polinucleotídico monocatenario individual (01-08) en la secuencia de ADN sintético bicatenario se muestra en la Figura 4.

Los polinucleótidos 02, 03, 04, 05, 06 y 07 (Tabla 4) se sometieron a quinasa añadiendo 1 \mul (0,1 \mug/\mul) de cada polinucleótido y 20 unidades de polinucleótido quinasa T4 a una solución que contenía Tris-HCl 70 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, DTT 5 mM, beta-mercaptoetanol 10 mM, 500 mg/ml de BSA. Se mantuvo la solución a 37ºC durante 30 minutos y se detuvo la reacción manteniendo la solución a 65ºC durante 10 minutos. Se añadieron 20 ng de cada uno de los dos polinucleótidos terminales, 01 y 08, a la solución de reacción de quinasa anterior, junto con 1/10 de volumen de una solución que contenía Tris-HCl 20,0 mM, pH 7,4, MgCl_{2} 2,0 mM y cloruro de sodio (NaCl) 15,0 mM. Se calentó esta solución a 70ºC durante 5 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente, aproximadamente 25ºC, durante 1,5 horas en un vaso de precipitados con 500 ml de agua. Durante este periodo de tiempo, se asociaron los 8 polinucleótidos para formar el inserto de ADN sintético bicatenario mostrado en la Figura 5. Se unieron covalentemente los polinucleótidos individuales entre sí para estabilizar el inserto de ADN sintético añadiendo 40 \mul de la reacción anterior a una solución que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, MgCl_{2} 7 mM, DTT 1 mM, ATP 1 mM y 10 unidades de ADN ligasa T4. Se mantuvo esta solución a 37ºC durante 30 minutos y después se inactivó la ADN ligasa T4 manteniendo la solución a 65ºC durante 10 minutos. Se sometieron a quinasa los polinucleótidos terminales mezclando 52 \mul de la reacción anterior, 4 \mul de una solución que contenía ATP 10 mM y 5 unidades de polinucleótido quinasa T4. Se mantuvo esta solución a 37ºC durante 30 minutos y después se inactivó la polinucleótido quinasa T4 manteniendo la solución a 65ºC durante 10 minutos.

TABLA 4

6

Se ligó directamente el inserto de ADN sintético completado en el vector lambda Zap™II descrito en el ejemplo 1(a)(i), que se había digerido previamente con las enzimas de restricción Sac I y Xho I. Se encapsuló la mezcla de ligamiento según las instrucciones del fabricante utilizando extracto de encapsulación Gigapack II Gold (Stratagene). Se sembró la mezcla de ligamiento encapsulada en células XL1-Blue (Stratagene). Se tomaron muestras de placas lambda individuales y se escindieron los insertos según el protocolo de escisión in vivo de lambda Zap™II proporcionado por el fabricante (Stratagene). Este protocolo de escisión in vivo trasladó el inserto clonado del vector lambda Lc2 a un vector plasmídico fagémido para permitir una fácil manipulación y secuenciación. La exactitud de las etapas de clonación anteriores se confirmó secuenciando el inserto utilizando las instrucciones del fabricante en el kit de secuenciación con ^{35}S-dATP por transcriptasa inversa AMV (Stratagene). Se muestra la secuencia del vector de expresión Lc2 resultante (lambda Lc2) en la Figura 5. Se enumera separadamente cada cadena en el listado de secuencia como SEC Nº ID 3 y SEC Nº ID 4. El vector Lc2 resultante se representa en forma de diagrama esquemático en la Figura 6.

Es un vector preferido para uso en esta invención, designado como lambda Lc3, un derivado de lambda Lc2 preparado anteriormente. El lambda Lc2 contiene un sitio de restricción Spe I (ACTAGT) localizado 3' del sitio de restricción EcoR I y 5' del sitio de unión a ribosoma Shine-Dalgarno, como se muestra en la secuencia de la Figura 5 y en la SEC Nº ID 3. Está también presente un sitio de restricción Spe I en lambda Hc2 como se muestra en las Figuras 3 y 4 y en la SEC Nº ID 1. Se construyó un vector combinatorio, designado pComb, combinando conjuntamente partes de lambda Hc2 y Lc2 como se describe en el ejemplo 1a(iv) siguiente. El vector pComb combinatorio resultante contenía dos sitios de restricción Spe I, uno proporcionado por lambda Hc2 y otro proporcionado por lambda Lc2, con un sitio EcoR I entre ellos. A pesar de la presencia de dos sitios de restricción EcoR I, los homólogos de ADN que tienen terminaciones cohesivas Spe I y EcoR I se ligaron direccionalmente con éxito en un vector de expresión pComb previamente digerido con Spe I y EcoR I, como se describe en el ejemplo 1b siguiente. La proximidad del sitio de restricción EcoR I al sitio 3' Spe I, proporcionado por el vector Lc2, inhibió la digestión completa del sitio 3' Spe I. Por tanto, digerir pComb con Spe I y EcoR I no dio como resultado la eliminación del sitio EcoR I entre los dos sitios Spe I.

La presencia de un segundo sitio de restricción Spe I puede ser indeseable para ligamientos en un vector pComb digerido sólo con Spe I, ya que la región entre los dos sitios se eliminaría. Por lo tanto, se produce un derivado de lambda Lc2 que carece del segundo sitio 3' Spe I', designado lambda Lc3, digiriendo primero lambda Lc2 con Spe I para formar un vector linealizado. Los extremos se rellenan para formar extremos romos que se ligan conjuntamente para dar como resultado un lambda Lc3 que carece de un sitio Spe I. El lambda Lc3 es un vector preferido para uso en la construcción de un vector combinatorio como se describe a continuación.

(iv) Preparación de pComb

Se escindieron fagémidos de los vectores de expresión lambda Hc2 o lambda Lc2 utilizando un protocolo de escisión in vivo descrito anteriormente. Se preparó ADN bicatenario a partir de células que contenían fagémidos según los procedimientos descritos por Holmes et al., Anal. Biochem., 114: 193 (1981). Los fagémidos resultantes de la escisión in vivo contenían las mismas secuencias nucleotídicas para clonación y expresión de fragmentos de anticuerpos que los vectores originales, y se designan fagémido Hc2 y Lc2, correspondientes a lambda Hc2 y Lc2, respectivamente.

Para la construcción del vector fagémido combinatorio pComb, producido combinando partes del fagémido Hc2 y del fagémido Lc2, se digirió primero el fagémido Hc2 con Sac I para eliminar el sitio de restricción localizado 5' del promotor LacZ. Se hicieron romos después los extremos del fagémido linealizado con polimerasa T4 y se ligaron, dando como resultado un fagémido Hc2 que carece de un sitio Sac I. Se digirieron separadamente con las enzimas de restricción Sca I y EcoR I el fagémido Hc2 modificado y el fagémido Lc2, dando como resultado un fragmento Hc2 que tiene de 5' a 3' los sitios de restricción Sca I, Not I, Xho I, Spe I y EcoR I y un fragmento Lc2 que tiene de 5' a 3' los sitios de restricción EcoR I, Sac I, Xba I y Sac I. Los fagémidos linealizados se ligaron después conjuntamente en sus respectivos extremos cohesivos para formar pComb, un fagémido linealizado que tiene una disposición lineal de sitios de restricción de Not I, Xho I, Spe I, EcoR I, Sac I, Xba I, Not I, Apa I y Sca I. El vector fagémido ligado se insertó después en un hospedador bacteriano apropiado y se seleccionaron transformantes con el antibiótico ampicilina.

Se examinó en los transformantes resistentes a ampicilina seleccionados la presencia de dos sitios Not I. Se designó al vector fagémido combinatorio resistente a la ampicilina resultante pComb, cuya organización esquemática se muestra en la Figura 7. El vector combinatorio resultante, pComb, está constituido por una molécula de ADN que tiene dos módulos que expresan dos proteínas de fusión y que tiene secuencias de residuos nucleotídicos para los siguientes elementos unidos operativamente en la dirección 5' a 3': un primer módulo constituido por un promotor LacZ inducible cadena arriba del gen LacZ; un sitio de restricción Not I; un sitio de unión a ribosoma; una secuencia líder pelB; un espaciador; una región de clonación limitada por un sitio de restricción 5' Xho I y 3' Spe I'; un marcaje decapeptídico seguido por secuencias de detención de control de la expresión; un sitio de restricción EcoR I localizado 5' de un segundo módulo constituido por un sitio de unión a ribosoma de control de la expresión; una secuencia líder pelB; una región espaciadora; una región de clonación limitada por un sitio de restricción 5' Sac I y 3' Xba I seguida por secuencias de detención de control de la expresión y un segundo sitio de restricción Not I.

Se construye un vector combinatorio preferido para uso en esta invención, designado pComb2, combinando partes del fagémido Hc2 y del fagémido Lc3 como se describe anteriormente para preparar pComb. El vector combinatorio resultante, pComb2, consiste en una molécula de ADN que tiene dos módulos idénticos a pComb que expresan dos proteínas de fusión idénticas a pComb, excepto porque se elimina un segundo sitio de restricción Spe I en el segundo módulo.

b. Construcción de vectores pCombVIII y pCombIII para expresar proteínas de fusión que tienen un anclaje a membrana de proteína de recubrimiento de bacteriófago

Debido a los múltiples sitios de clonación de endonucleasas de restricción, el vector de expresión fagémido pComb preparado anteriormente es un vehículo de clonación útil para modificación en la preparación de un vector de expresión de esta invención. Con ese fin, se digiere pComb con EcoR I y Spe I seguido de tratamiento con fosfatasa para producir el pComb linealizado.

(i) Preparación de pCombVIII

Se mezcló un producto de PCR producido en el ejemplo 2g y que tiene una secuencia nucleotídica que define un dominio de anclaje a membrana de proteína de recubrimiento VIII de bacteriófago filamentoso (cpVIII) y terminaciones cohesivas Spe I y EcoR I con el pComb linealizado para formar una mezcla de ligamiento. Se ligó direccionalmente el fragmento de PCR que codifica el anclaje a membrana de cpVIII en el vector de expresión fagémido pComb en las correspondientes terminaciones cohesivas, lo que dio como resultado la formación de pCombVIII (también designado pComb8). El pCombVIII contiene un módulo definido por la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC Nº ID 116 desde la base nucleotídica 1 a la base 259, y contiene una señal de secreción pelB unida operativamente al anclaje a membrana de cpVIII.

Se preparó un vector de expresión fagémido preferido para uso en esta invención, designado como pComb2-VIII o pComb2-8, como se describe anteriormente ligando direccionalmente el fragmento PCR que codifica el anclaje a membrana de cpVIII en el vector de expresión fagémido pComb2 mediante las terminaciones cohesivas Spe I y EcoR I. El pComb2-8 tenía sólo un sitio de restricción Spe I.

(ii) Preparación de pCombIII

Se construyó un vector de expresión fagémido separado utilizando secuencias que codifican el dominio de anclaje a membrana de cpIII de bacteriófago. Se preparó un producto PCR que define el anclaje a membrana de cpIII que contiene una secuencia de región promotora LacZ 3' al anclaje de membrana para la expresión de la cadena ligera y las terminaciones cohesivas Spe I y EcoR I como se describe para cpVIII, cuyos detalles se describen en el ejemplo 2g. El producto PCR derivado de cpIII se ligó después en un vector pComb2 linealizado que tenía solo un sitio Spe I formando el vector pComb2-3 (también designado pComb2-III).

Se preparó un vector de expresión fagémido más preferido para uso en esta invención que tiene sitios de clonación de enzimas de restricción adicionales, designados pComb-III' o pComb2-3', como se describe anteriormente para pComb2-3 con la adición de un fragmento de 51 pares de bases de pBluescript como se describe por Short et al., Nuc. Acids Res., 16: 7583-7600 (1988) y comercialmente disponible en Stratagene. Para preparar pComb2-3', se digirió primero pComb2-3 con las enzimas de restricción Xho I y Spe I para formar un pComb2-3 linealizado. Se digirió el vector pBluescript con las mismas enzimas, liberando un fragmento de 51 pares de bases que contiene los sitios de enzimas de restricción Sal I, Acc I, Hinc II, Cla I, Hind III, EcoR V, Pst I, Sma I y BamH I. Se ligó el fragmento de 51 pares de bases en el vector pComb2-3 linealizado mediante las terminaciones cohesivas Xho I y Spe I, formando pComb2-3'.

c. Construcción de vectores pCBAK que tienen un marcador de resistencia a cloranfenicol

Para utilizar un gen marcador detectable diferente, tal como cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), para la selección de bacterias transformadas con un vector de esta invención, se desarrollaron vectores de expresión basados en pComb que tenían un gen que codifica CAT, y se designan vectores pCBAK. Los vectores pCBAK se preparan combinando partes de pCB y pComb.

(i) Preparación de pCB

Se modificaron los vectores fagémidos pBlueScript, pBC SK(-) y pBS SK(-) (Stratagene) y se combinaron, generando un tercer vector designado pCB como se describe a continuación.

El PBC SK(-), que contiene un gen marcador detectable de resistencia a cloranfenicol, se digirió con Bst BI y se hicieron los extremos romos con polimerasa T4. Una segunda digestión con Pvu I permitió la retirada de un fragmento de 1 kilobase (kb), dejando un vector linealizado de 2,4 kb que retenía el gen marcador detectable de resistencia a CAT, un promotor LacZ inducible cadena arriba del gen LacZ y una región de origen ColE1. Se recuperó el fragmento de 2,4 kb. Se digirió el vector pBS SK(-) con Aat II y se hicieron romos los extremos con polimerasa T4. Una segunda digestión con Pvu I permitió el aislamiento de un fragmento de 800 pares de bases (pb) que contenía el origen de replicación f1. El ligamiento del fragmento f1 de 800 pb derivado de pBS con el fragmento de 2,4 kb de pBC creó un vector precursor de pCB que contenía un sitio Sac I, un origen de replicación f1, un gen marcador detectable de resistencia a CAT, un origen ColE1, un sitio de clonación múltiple (MCS) flanqueado por promotores T_{3} y T_{7}, y un promotor LacZ inducible cadena arriba del gen LacZ.

Se digirió después el vector precursor pCB con Sac I y se hicieron los extremos romos con polimerasa T4. Se religó después el vector pCB tratado con polimerasa T4, formando el vector pCB que carece de un sitio Sac I.

(ii) Preparación de pCBAK0

Se digirió el vector pCB que contiene el gen marcador detectable de resistencia a CAT con Sac II y Apa I y se trató con fosfatasa para prevenir el religamiento y para formar un vector pCB linealizado. El vector pComb preparado en el ejemplo 1(a)(iv) se digirió con las enzimas de restricción Sac I y Apa I para liberar un fragmento que contenía secuencias de residuos nucleotídicos empezando 5' por el promotor LacZ y extendiéndose más allá del extremo 3' del segundo sitio Not I. El fragmento de ADN SacII y Apa I de pComb se ligó direccionalmente después en el vector pCB digerido de forma similar, formando el vector de expresión fagémido pCBAK0. Los vectores de expresión pCBAK preferidos se construyen con pComb2. El vector de expresión pCBAK resultante contenía sólo un sitio de restricción Spe I.

(iii) Preparación de pCBAK8

Para preparar un vector de expresión fagémido basado en pCBAK que codifica un dominio de anclaje a membrana de proteína de recubrimiento de bacteriófago en la proteína de fusión expresada, se linealizó el vector de clonación fagémido pCB preparado en el ejemplo 1c(ii) mediante digestión con Sac II y Apa I. Se digirió con las enzimas de restricción Sac II y Apa I el vector de expresión fagémido pCombVIII, preparado en el ejemplo 1b(i), formando un fragmento que contenía una secuencia de residuos nucleotídicos empezando 5' del promotor LacZ y extendiéndose más allá del extremo 3' del segundo sitio Not I. Se ligó direccionalmente el fragmento en el vector de clonación pCB linealizado formando el vector de expresión fagémido pCBAK8.

(iv) Preparación de pCBAK3

Se construyó el vector de expresión fagémido pCBAK3, para la expresión de la proteína de fusión que tiene dominios de anclaje a membrana cpIII, de forma similar ligando direccionalmente el fragmento digerido con las enzimas de restricción Sac II y Apa I de pComb II en el vector de clonación pCB linealizado con Sac II y Apa I.

2. Construcción de vectores de expresión dicistrónicos para expresar el heterodímero anti-NPN en superficies de fago

En la práctica de esta invención, se orientan primero la cadena pesada (Fd constituida por V_{H} y C_{K}1) y ligera (kappa) (V_{L}, C_{L}) de anticuerpos al periplasma de E. coli para el ensamblaje de moléculas Fab heterodiméricas. Para obtener la expresión de bibliotecas de Fab de anticuerpo en una superficie de fago, las secuencias de residuos nucleotídicos que codifican las cadenas Fd o ligera deben unirse operativamente a la secuencia de residuos nucleotídicos que codifica un anclaje a membrana de proteína de recubrimiento de bacteriófago filamentoso. Son dos proteínas de recubrimiento preferidas para uso en esta invención para proporcionar un anclaje a membrana VIII y III (cpVIII y cpIII, respectivamente). En los ejemplos descritos en la presente memoria, se describen procedimientos para unir operativamente una secuencia de residuos nucleotídicos que codifica una cadena Fd a anclajes a membrana cpVIII o cpIII en una proteína de fusión de esta invención.

En un vector fagémido, se unen operativamente un primer y un segundo cistrones constituidos por secuencias de ADN traducible formando una molécula de ADN dicistrónico. Cada cistrón en la molécula de ADN dicistrónico se une a secuencias de control de la expresión de ADN para la expresión coordinada de una proteína de fusión, Fd-cpVIII o Fd-cpIII, y una cadena ligera kappa.

El primer cistrón codifica una señal de secreción periplásmica (secuencia líder pelB) unida operativamente a la proteína de fusión Fd-cpVIII o Fd-cpIII. El segundo cistrón codifica una segunda secuencia líder pelB unida operativamente a una cadena ligera kappa. La presencia de la secuencia líder pelB facilita la secreción coordinada pero separada tanto de la proteína de fusión como de la cadena ligera del citoplasma bacteriano al espacio periplásmico.

El proceso descrito anteriormente se resume en un diagrama esquemático en la Figura 8. Brevemente, el vector de expresión fagémido porta un gen marcador detectable de resistencia a cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) además de la fusión Fd-cpVIII y la cadena kappa. El origen de replicación del fago f1 facilita la generación de fagémido monocatenario. La expresión inducida por tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG) de un mensaje dicistrónico que codifica la fusión Fd-cpVIII (V_{H}, C_{H1}, cpVIII) y la cadena ligera (V_{L}, C_{L}) conduce a la formación de cadenas pesada y ligera. Cada cadena se suministra al espacio periplásmico mediante la secuencia líder pelB, que se escinde posteriormente. La cadena pesada se ancla a la membrana mediante el dominio de anclaje a membrana cpVIII, mientras que la cadena ligera se secreta en el periplasma. La cadena pesada en presencia de cadena ligera se ensambla formando moléculas Fab. Puede conseguirse este mismo resultado si, como alternativa, se ancla la cadena ligera a la membrana mediante una proteína de fusión de cadena ligera que tiene un anclaje de membrana y se secreta una cadena pesada mediante una secuencia líder pelB al periplasma.

Con la posterior infección de E. coli con un fago auxiliar, a medida que progresa el ensamblaje del bacteriófago filamentoso, se incorpora la proteína de recubrimiento VIII a lo largo de toda la longitud de las partículas de fago filamentoso como se muestra en las Figuras 8 y 9. Si se utiliza cpIII, la acumulación ocurre en la cola del bacteriófago. La ventaja de la utilización de anclajes a membrana de cpVIII frente a cpIII es doble. En primer lugar, existe una multiplicidad de sitios de unión, constituidos por aproximadamente 2700 monómeros cpVIII ensamblados en una disposición tubular a lo largo de la superficie de la partícula. En segundo lugar, el constructo no interfiere con la infectividad del fago.

a. Selección de polinucleótido

Las secuencias nucleotídicas que codifican las CDR de proteína inmunoglobulina son altamente variables. Sin embargo, existen diversas regiones de secuencias conservadas que flanquean los dominios de la región V de cualquiera de la cadena ligera o pesada, por ejemplo, y que contienen secuencias nucleotídicas sustancialmente conservadas, concretamente secuencias que hibridarán con la misma secuencia cebadora. Por lo tanto, se utilizaron los cebadores de la síntesis de polinucleótidos (amplificación) que hibridan con las secuencias conservadas e incorporan sitios de restricción al homólogo de ADN producido que son adecuados para unir operativamente los fragmentos de ADN sintetizados a un vector. Más específicamente, los cebadores se diseñan de modo que los homólogos de ADN resultantes producidos puedan insertarse en un vector de expresión de esta invención en un marco de lectura con la secuencia de ADN traducible cadena arriba en la región del vector que contiene el medio de ligamiento direccional.

(i) Cebadores V_{H}

Para la amplificación de los dominios V_{H}, se diseñaron cebadores para introducir terminaciones cohesivas compatibles con el ligamiento direccional en los sitios Xho I y Spe I únicos del vector de expresión Hc2 fagémido. Por ejemplo, el cebador 3' (cebador 12A en la Tabla 5), se diseñó para ser complementario del ARNm de la región J_{H}. En todos los casos, se eligieron los cebadores 5' (cebadores 1-10, Tabla 5) para ser complementarios con la primera cadena de ADNc en la región N-terminal conservada (cadena sin sentido). Se realizó la amplificación inicialmente con una mezcla de 32 cebadores (cebador 1, Tabla 5) que estaban degenerados en cinco posiciones. El ARNm de hibridoma pudo amplificarse con cebadores mixtos, pero los intentos iniciales de amplificar el ARNm de bazo proporcionaron resultados variables. Por lo tanto, se compararon diversas alternativas de amplificación utilizando los cebadores 5' mixtos.

La primera alternativa fue construir cebadores únicos múltiples, ocho de los cuales se muestran en la Figura 5, correspondientes a miembros individuales de la combinación de cebadores mixtos. Los cebadores individuales 2-9 de la Tabla 5 se construyeron incorporando cualquiera de los dos posibles nucleótidos a tres de las cinco posiciones degeneradas.

La segunda alternativa fue construir un cebador que contiene inosina (cebador 10, Tabla 5) en cuatro de las posiciones variables basándose en el trabajo publicado por Takahashi, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82: 1931-1935, (1985) y Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260: 2605-2608 (1985). Este cebador tiene la ventaja de que no es degenerado y que, al mismo tiempo, minimiza los efectos negativos de los desapareamientos en las posiciones no conservadas como se discute por Martin et al., Nuc. Acids. Res., 13: 8927 (1985). Sin embargo, no se sabía si la presencia de nucleótidos de inosina daría como resultado la incorporación de secuencias indeseadas a las regiones V_{H} clonadas. Por lo tanto, la inosina no se incluyó en una posición que permanece en los fragmentos amplificados después de la escisión de los sitios de restricción. Como resultado, la inosina no estaba en el inserto clonado.

Los cebadores de amplificación V_{H} adicionales incluyendo el cebador 3' único se diseñaron para ser complementarios de una porción del primer dominio de región constante del ARNm de la cadena pesada gamma 1 (cebadores 16 y 17, Tabla 5). Estos cebadores producirán homólogos de ADN que contienen polinucleótidos que codifican aminoácidos de los dominios V_{H} y de la primera región constante de la cadena pesada. Estos homólogos de ADN pueden utilizarse por lo tanto para producir fragmentos Fab en lugar de Fv.

Se contemplan cebadores 3' únicos adicionales diseñados para hibridar con regiones similares de otra clase de cadena pesada de inmunoglobulina tal como IgM, IgE e IgA. Se contemplan también otros cebadores 3' que hibridan con una región específica de una clase específica de región constante CH_{1} y están adaptados para transferir los dominios V_{H} amplificados utilizando este cebador a un vector de expresión capaz de expresar esos dominios V_{H} con una clase diferente de región constante de cadena pesada o ligera.

Como control para amplificación de ARNm de bazo o hibridoma, se construyeron un conjunto de cebadores que hibridan con una región altamente conservada del gen de cadena pesada de IgG. El cebador 5' (cebador 11, Tabla 5) es complementario del ADNc en la región C_{H}2, mientras que el cebador 3' (cebador 13, Tabla 5) es complementario del ARNm en la región C_{H}3. Se cree que no estaban presentes desapareamientos entre estos cebadores y sus moldes.

Los cebadores utilizados para amplificación de fragmentos de Fd de cadena pesada para la construcción de Fab se muestran al menos en la Tabla 5. Se realizó la amplificación en ocho reacciones separadas, conteniendo cada una uno de los cebadores 5' (cebadores 2-9) y uno de los cebadores 3' (cebador 16). Los cebadores 5' restantes que se han utilizado para amplificación en una sola reacción son un cebador degenerado (cebador 1) o un cebador que incorpora inosina en cuatro posiciones degeneradas (cebador 10, Tabla 5, y cebadores 17 y 18, Tabla 6). El cebador 3' restante (cebador 14, Tabla 6) se ha utilizado para construir fragmentos F_{v}. Muchos de los cebadores 5' incorporan un sitio Xho I, y los cebadores 3' incorporan un sitio de restricción Spe I para la inserción de homólogo de ADN de V_{H} en el vector de expresión fagémido Hc2 (Figura 4).

Los cebadores de amplificación de V_{H} diseñados para amplificar las regiones variables de cadena pesada humana se muestran en la Tabla 6. Uno de los cebadores de cadena pesada 5' contiene residuos de inosina en posiciones nucleotídicas degeneradas que permiten que un solo cebador hibride con un gran número de secuencias de región variable. Los cebadores diseñados para hibridar con las secuencias de región constante de diversos ARNm de IgG se muestran también en la Tabla 6.

(ii) Cebadores V_{L}

Las secuencias nucleotídicas que codifican las CDR de V_{L} son altamente variables. Sin embargo, existen siete regiones de secuencias conservadas que flanquean los dominios de CDR de V_{L} incluyendo las regiones estructurales J_{L}, V_{L} y la secuencia líder/promotora de V_{L}. Por lo tanto, se construyeron cebadores de amplificación que hibridan con las secuencias conservadas y que incorporan sitios de restricción que permiten la clonación de los fragmentos amplificados en el vector fagémido Lc2 cortado con Sac I y Xba I.

Para la amplificación de los dominios CDR de V_{L}, se diseñaron los cebadores 5' (cebadores 1-8 en la Tabla 6) para ser complementarios de la primera cadena de ADNc en la región N-terminal conservada. Estos cebadores introdujeron también un sitio de endonucleasa de restricción Sac I para permitir clonar al homólogo de ADN de V_{L} en el vector de expresión fagémido Lc2. Se diseñó el cebador de amplificación 3' V_{L} (cebador 9 en la Tabla 6) para ser complementario con el ARNm en las regiones J_{L} y para introducir el sitio de endonucleasa de restricción Xba I requerido para insertar el homólogo de ADN de V_{L} en el vector de expresión fagémido Lc2 (Figura 6).

Se diseñaron cebadores de amplificación 3' V_{L} adicionales para hibridar con la región constante de ARNm kappa o lambda (cebadores 10 y 11 de la Tabla 6). Estos cebadores permiten producir un homólogo de ADN que contiene secuencias polinucleotídicas que codifican los aminoácidos de la región constante de cadena kappa o lambda. Estos cebadores hacen posible producir un fragmento Fab en lugar de un Fv.

Se muestran los cebadores utilizados para la amplificación de secuencias de cadena ligera kappa para la construcción de Fab al menos en la Tabla 6. La amplificación con estos cebadores se realizó en 5 reacciones separadas, conteniendo cada una los cebadores 5' (cebadores 3-6, y 12) y uno de los cebadores 3' (cebador 13). El cebador 3' restante (cebador 9) se ha utilizado para construir fragmentos Fv. Los cebadores 5' contienen un sitio de restricción Sac I y los cebadores 3' contienen un sitio de restricción Xba I.

Se muestran también en la Tabla 6 los cebadores de amplificación de V_{L} diseñados para amplificar las regiones variables de cadena ligera humana tanto de isotipo lambda como kappa.

Todos los cebadores y polinucleótidos sintéticos descritos en la presente memoria, incluyendo aquellos mostrados en las Tablas 3-7, se adquirieron en Research Genetics en Huntsville, Alabama, o se sintetizaron en un sintetizador de ADN Applied Biosystems, modelo 381A, utilizando las instrucciones del fabricante.

(Tabla pasa a página siguiente)

7

8

9

10

11

Los 19 cebadores emunerados en la Tabla 5 se han enumerado en el listado de secuencias y se les ha asignado las siguientes SEC Nº ID:

(1)

= SEC Nº ID 40

(2)

= SEC Nº ID 41

(3)

= SEC Nº ID 42

(4)

= SEC Nº ID 43

(5)

= SEC Nº ID 44

(6)

= SEC Nº ID 45

(7)

= SEC Nº ID 46

(8)

= SEC Nº ID 47

(9)

= SEC Nº ID 48

(10)

= SEC Nº ID 49

(11)

= SEC Nº ID 50

(12)

= SEC Nº ID 51

\hskip0,1cm

(12A) = SEC Nº ID 52

(13)

= SEC Nº ID 53

(14)

= SEC Nº ID 54

(15)

= SEC Nº ID 55

(16)

= SEC Nº ID 56

(17)

= SEC Nº ID 57

(18)

= SEC Nº ID 58

Los 40 cebadores enumerados como "(1)" a "(40)" en la Tabla 6 se han enumerado y secuenciado individualmente también en el listado de secuencias que empieza por SEC Nº ID 59 a SEC Nº ID 98, respectivamente.

b. Preparación de un repertorio de genes que codifican un dominio variable de inmunoglobulina

Se seleccionó fosfonoamidato de nitrofenilo (NPN) como ligando para unión a receptor en la preparación de un receptor heterodimérico según los procedimientos de la invención.

Se conjugó hemocianina de lapa bocallave (KLH) con NPN formando un conjugado NPN-KLH utilizado para inmunizar un ratón para producir una respuesta inmune anti-NPN, y proporcionar por tanto una fuente de genes de receptor heterodimérico específico de ligando.

Se preparó el conjugado NPN-KLH mezclando 250 \mul de una solución que contiene 2,5 mg de NPN en dimetilformamida con 750 \mul de una solución que contiene 2 mg de KLH en tampón fosfato de sodio 0,01 molar (M) (pH 7,2). Se mezclaron las dos soluciones mediante la lenta adición de la solución de NPN a la solución de KLH, agitando la solución de KLH mediante una barra agitadora giratoria. Después de ello, se mantuvo la mezcla a 4ºC durante 1 hora con la misma agitación permitiendo proceder la conjugación. Se aisló el conjugado NPN-KLH de los NPN y KLH no conjugados mediante filtración en gel a través de Sephadex G-25. Se inyectó el conjugado NPN-KLH aislado en ratones como se describe a continuación.

Se preparó el conjugado NPN-KLH para inyección en ratones añadiendo 100 \mug del conjugado a 250 \mul de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadió un volumen igual de coadyuvante completo de Freund y se emulsionó la solución completa durante 5 minutos. Se inyectaron 129 ratones G_{1x+} con 300 \mul de la emulsión. Se administraron por vía subcutánea las inyecciones en diversos sitios utilizando una aguja de calibre 21. Se administró una segunda inmunización con NPN-KLH dos semanas después. Se preparó esta inyección como sigue: se diluyeron 50 microgramos (\mug) de NPN-KLH en 250 \mul de PBS y se mezcló un volumen igual de alúmina con la solución de NPN-KLH. Se inyectaron por vía intraperitoneal a los ratones 500 \mul de la solución utilizando una aguja de calibre 23. Un mes después, se administraron a los ratones una inyección final de 50 \mug del conjugado NPN-KLH diluido a 200 \mul en PBS. Se administró por vía intravenosa esta inyección en la vena lateral de la cola utilizando una aguja de calibre 30. Cinco días después de esta inyección final, se sacrificaron los ratones y se aisló el ARN celular total de sus bazos.

Se preparó el ARN celular total a partir del bazo de un solo ratón inmunizado con KLH-NPN como se describe anteriormente utilizando los procedimientos de preparación de ARN descritos por Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162: 156-159 (1987) y utilizando el kit de aislamiento de ARN (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, inmediatamente después de la extracción del bazo del ratón inmunizado, se homogeneizó el tejido en 10 ml de una solución desnaturalizante que contenía isotiocianato de guanina 4,0 M, citrato de sodio 0,25 M a pH 7,0 y beta-mercaptoetanol 0,1 M utilizando un homogeneizador de vidrio. Se mezcló 1 ml de acetato de sodio a una concentración 2 M a pH 4,0 con el bazo homogeneizado. Se mezcló también 1 ml de fenol que se había saturado previamente con H_{2}O con la solución desnaturalizante que contenía el bazo homogeneizado. Se añadieron 2 ml de una mezcla de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1, v/v) a este homogeneizado. Se mezcló vigorosamente el homogeneizado durante 10 segundos y se mantuvo en hielo durante 15 minutos. Se transfirió después el homogeneizado a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml de paredes gruesas (Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA). Se centrifugó la solución a 10.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Se transfirió la fase acuosa que contiene ARN superior a un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml nuevo y se mezcló con un volumen igual de alcohol isopropílico. Se mantuvo esta solución a -20ºC durante al menos una hora para precipitar el ARN. Se centrifugó la solución que contenía el ARN precipitado a 10.000 x g durante 20 minutos a 4ºC. Se recogió el ARN celular total sedimentado y se disolvió en 3 ml de la solución desnaturalizante descrita anteriormente. Se añadieron 3 ml de alcohol isopropílico al ARN celular total resuspendido y se mezcló vigorosamente. Se mantuvo esta solución a -20ºC durante al menos 1 hora para precipitar el ARN. Se centrifugó la solución que contenía el ARN precipitado a 10.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. Se lavó el ARN sedimentado una vez con una solución que contenía 75% de etanol. Se secó el ARN sedimentado a vacío durante 15 minutos y después se resuspendió en H_{2}O tratada con pirocarbonato de dimetilo (DEPC) (DEPC-H_{2}O).

Se preparó ARN mensajero (ARNm) enriquecido en secuencias que contenían intervalos largos de poliA a partir del ARN celular total utilizando procedimientos descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis et al., ed., Cold Spring Harbor, NY (1982). Brevemente, se resuspendió la mitad del ARN total aislado de un solo bazo de ratón inmunizado preparado como se describe anteriormente en 1 ml de DEPC-H_{2}O, y se mantuvo a 65ºC durante 5 minutos. Se añadió 1 ml de tampón de carga salina alta 2 x constituido por Tris-HCl (clorhidrato de tris[hidroximetil]aminometano) 100 mM, cloruro de sodio (NaCl) 1 M, etilendiaminotetraacetato de disodio (EDTA-Na_{2}) 2,0 mM a pH 7,5 y dodecilsulfato de sodio al 0,2% (SDS) al ARN resuspendido, y la mezcla se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se aplicó después la mezcla a una columna de oligo-dT (Collaborative Research de tipo 2 o tipo 3) que se había preparado anteriormente lavando el oligo-dT con una solución que contenía hidróxido de sodio 0,1 M y EDTA 5 mM, y se había equilibrado después la columna con DEPC-H_{2}O. Se recogió el eluido en un tubo de polipropileno estéril y se volvió a aplicar a la misma columna después de calentar el eluido durante 5 minutos a 65ºC. Se lavó después la columna de oligo-dT con 2 ml de tampón de carga salina alta constituido por Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, cloruro de sodio 500 mM, EDTA 1 mM y pH 7,5 y SDS al 0,1%. Se lavó después la columna de oligo-dT con 2 ml de tampón salino medio 1 x constituido por Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM y SDS al 0,1%. Se eluyó el ARN mensajero de la columna de oligo-DT con 1 ml de tampón constituido por Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM a pH 7,5 y SDS al 0,05%. Se purificó el ARN mensajero extrayendo esta solución con fenol/cloroformo seguido de una sola extracción con 100% de cloroformo. Se concentró el ARN mensajero mediante precipitación con etanol y se resuspendió en DEPC-H_{2}O.

El ARN mensajero (ARNm) aislado mediante el proceso anterior contiene una pluralidad de diferentes polinucleótidos que codifican V_{H}, concretamente más de aproximadamente 10^{4} genes que codifican V_{H} diferentes, y contiene un número similar de genes que codifican V_{L}. Por tanto, la población de ARNm representa un repertorio de genes que codifican una región variable.

c. Preparación de homólogos de ADN

En la preparación para la amplificación por PCR, se utiliza el ARNm preparado anteriormente como molde para la síntesis de ADNc mediante una reacción de extensión de cebador. En una reacción de transcripción de 50 \mul típica, se hibridan (asocian) primero 5-10 \mug de ARNm de bazo en agua con 500 ng (50,0 pmol) del cebador 3' V_{H} (cebador 12A, tabla 5) a 65ºC durante 5 minutos. Posteriormente, se ajusta la mezcla a dATP, dCTP, dGTP y dTTP 1,5 mM, Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 8 mM, NaCl 50 mM y espermidina 2 mM. Se añade transcriptasa inversa del virus de leucemia de murina-Moloney (Stratagene), 26 unidades, y la solución se mantiene durante 1 hora a
37ºC.

Se realiza la amplificación por PCR en una reacción de 100 \mul que contiene los productos de la reacción de transcripción inversa (aproximadamente 5 \mug del híbrido ADNc/ARN), 300 ng del cebador 3' V_{H} (cebador 12A de la Tabla 5), 300 ng de cada uno de los cebadores 5' V_{H} (cebadores 2-10 de la Tabla 5), 200 mM de una mezcla de dNTP, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 15 mM, gelatina al 0,1% y 2 unidades de ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq)(Perkin-Elmer-Cetus, Emeryville, California). Se recubre la mezcla de reacción con aceite mineral y se somete a 40 ciclos de amplificación. Cada ciclo de amplificación incluye desnaturalización a 92ºC durante 1 minuto, asociación a 52ºC durante 2 minutos y síntesis de polinucleótido mediante extensión de cebador (elongación) a 72ºC durante 1,5 minutos. Se extraen después dos veces muestras que contienen homólogo de ADN que codifica V_{H} amplificado con fenol/cloroformo, una vez con cloroformo, se precipitan con etanol y se almacenan a -70ºC en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y EDTA 1 mM.

Utilizando cebadores 5' únicos (2-9, Tabla 5), se consigue una síntesis de homólogo de ADN que codifica V_{H} y amplificación de ARNm de bazo eficaces como muestra la electroforesis en gel de agarosa. Se observó el ADNc amplificado (homólogo de ADN que codifica V_{H}) como una banda mayoritaria del tamaño esperado (360 pb). La cantidad de fragmento de polinucleótido que codifica V_{H} amplificado en cada reacción es similar, indicando que todos estos cebadores eran aproximadamente igualmente eficaces en la iniciación de la amplificación. El rendimiento y la calidad de la amplificación con estos cebadores es reproducible.

El cebador que contiene inosina sintetiza también reproduciblemente homólogos de ADN que codifican V_{H} amplificados de ARNm de bazo, conduciendo a la producción del fragmento de tamaño esperado, de una intensidad similar a la de los demás ADNc amplificados. La presencia de inosina permite también una síntesis y amplificación eficaz del homólogo de ADN, indicando claramente que dichos cebadores son útiles para generar una pluralidad de homólogos de ADN que codifican V_{H}. Los productos de amplificación obtenidos de los cebadores de la región constante (cebadores 11 y 13, Tabla 5) son más intensos, indicando que la amplificación fue más eficaz, posiblemente debido a un mayor grado de homología entre el molde y los cebadores. Siguiendo los procedimientos anteriores, se construye una biblioteca génica que codifica V_{H} a partir de los productos de ocho amplificaciones, realizada cada una con un cebador 5' diferente. Se mezclan partes iguales de los productos de cada reacción de extensión de cebador y se utiliza después el producto mezclado para generar una biblioteca de vectores que contienen homólogos de ADN que codifican
V_{H}.

Los homólogos de ADN de V_{L} se preparan también a partir de ARNm purificado preparado como se describe anteriormente. En la preparación para la amplificación por PCR, el ARNm preparado según los ejemplos anteriores se utiliza como molde para la síntesis de ADNc. En una reacción de transcripción de 50 \mul típica, se asocian primero 5-10 \mug de ARNm de bazo en agua con 300 ng (50,0 pmol) del cebador 3' V_{L} (cebador 14, Tabla 5) a 65ºC durante 5 minutos. Posteriormente, se ajusta la mezcla a dATP, dCTP, dGTP y dTTP 1,5 mM, Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, MgCl_{2} 8 mM, NaCl 50 mM y espermidina 2 mM. Se añade transcriptasa inversa del virus de la leucemia de murina-Moloney (Stratagene), 26 unidades, y la solución se mantiene durante 1 hora a 37ºC. Se realiza la amplificación por PCR en una reacción de 100 \mul que contiene aproximadamente 5 \mug del híbrido ADNc/ARN producido como se describe anteriormente, 300 ng del cebador 3' V_{L} (cebador 14 de la Tabla 5), 300 ng del cebador 5' V_{L} (cebador 16 de la Tabla 5), 200 mM de una mezcla de dNTP, KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, MgCl_{2} 15 mM, gelatina al 0,1% y 2 unidades de ADN polimerasa Taq. Se recubre la mezcla de reacción con aceite mineral y se somete a 40 ciclos de amplificación. Cada ciclo de amplificación incluye desnaturalización a 92ºC durante 1 minuto, asociación a 52ºC durante 2 minutos y elongación a 72ºC durante 1,5 minutos. Las muestras amplificadas se extraen después dos veces con fenol/cloroformo, una vez con cloroformo, se precipitan con etanol y se almacenan a -70ºC en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y EDTA 1 mM.

d. Inserción de homólogos de ADN en un vector de expresión de ADN

Para preparar una biblioteca de expresión enriquecida en secuencias V_{H}, se preparan homólogos de ADN enriquecidos en secuencias V_{H} según el ejemplo 2c utilizando el mismo conjunto de cebadores 5', pero con el cebador 12A (Tabla 5) como cebador 3'. Se digieren los productos amplificados por PCR resultantes (2,5 \mug/30 \mul de NaCl 150 mM, Tris-HCl 8 mM, pH 7,5, MgSO_{4} 6 mM, DTT 1 mM, BSA 200 \mug/ml) a 37ºC con las enzimas de restricción Xho I (125 unidades) y Spe I (125 unidades). En los experimentos de clonación que requieren una mezcla de productos de las reacciones de amplificación, se combinan volúmenes iguales (50 \mul, concentración 1-10 \mug) de cada mezcla de reacción después de la amplificación pero antes de la digestión de restricción. Se purifican los homólogos de V_{H} en gel de agarosa al 1% utilizando la técnica de electroelución estándar descrita en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Maniatis et al., ed., Cold Spring Harbor, NY (1982). Después de la electroforesis en gel del ARNm de bazo amplificado por PCR, se escinde la región del gel que contiene fragmentos de ADN de aproximadamente 350 pb, se electroeluye en una membrana de diálisis, se precipita con etanol y se resuspende en una solución TE que contiene Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y EDTA 1 mM a una concentración final de 50 ng/\mul. Los homólogos de ADN de V_{H} resultantes representan un repertorio de genes de polipéptido que tienen terminaciones cohesivas adaptadas para ligamiento direccional al vector lambda Hc2. Estos homólogos de V_{H} preparados se inserta después directamente mediante ligamiento direccional en el vector de expresión lambda Hc2 linealizado preparado como se describe a
continuación.

El vector de ADN de expresión lambda Hc2 se prepara para inserción de un homólogo de ADN mezclando 100 \mug de este ADN con una solución que contiene 250 unidades de cada una de las endonucleasas de restricción Xho I y Spe I (ambas de Boheringer Mannheim, Indianápolis, IN) y un tampón recomendado por el fabricante. Esta solución se mantiene a 37ºC durante 1,5 horas. Se calienta la solución a 65ºC durante 15 minutos para inactivar las endonucleasas de restricción. Se enfría la solución a 30ºC y se mezclan 25 unidades de fosfatasa termolábil (HK) (Epicenter, Madison, WI) y CaCl_{2} con ella según las especificaciones del fabricante. Se mantiene esta solución a 30ºC durante 1 hora. Se purifica el ADN extrayendo la solución con una mezcla de fenol y cloroformo seguido de precipitación con etanol. El vector de expresión lambda Hc2 está ahora preparado para ligamiento a homólogos de ADN preparados en los ejemplos anteriores. Estos homólogos de ADN de V_{H} preparados se insertan después directamente en el vector de expresión lambda Hc2 digerido con enzimas de restricción Xho I y Spe I, que se preparó anteriormente, ligando 3 moles de insertos de homólogo de ADN de V_{H} con 1 mol de vector de expresión Hc2 durante una noche a 5ºC. Se obtienen aproximadamente 3,0 x 10^{5} unidades formadoras de placas después de encapsular el ADN con Gigapack II Bold (Stratagene) de las cuales un 50% son recombinantes. La mezcla de ligamiento que contiene los homólogos de ADN de V_{H} se encapsula según las especificaciones del fabricante utilizando extracto de encapsulación Gigapack Gold II (Stratagene). Las bibliotecas de expresión de lambda Hc2 resultantes se transforman después en células XL1-Blue.

Para preparar una biblioteca enriquecida en secuencias V_{L}, se preparan productos amplificados por PCR enriquecidos en secuencias V_{L} según el ejemplo 2c. Estos homólogos de ADN de V_{L} se digieren con las enzimas de restricción Sac I y Xba I, y los homólogos de ADN de V_{L}digerido se purifican en un gel de agarosa al 1% como se describe anteriormente para los homólogos de ADN de V_{H}, formando un repertorio de genes de polipéptido V_{L} adaptados para ligamiento direccional. Los homólogos de ADN de V_{L} preparados se ligan después direccionalmente en el vector de expresión lambda Lc2 previamente digerido con las enzimas de restricción Sac I y Xba I como se describe para lambda Hc2. La mezcla de ligamiento que contiene los homólogos de ADN de V_{L} se encapsula formando una biblioteca de expresión de lambda Lc2 como se describe anteriormente, y está preparada para sembrarse en células XL1-
Blue.

e. Combinación aleatoria de homólogos de V_{H} y V_{L} en el mismo vector de expresión

Se realiza la construcción de una biblioteca que contiene vectores para expresar dos cistrones que expresan las cadenas pesada y ligera en dos etapas. En la primera etapa, se construyen bibliotecas de cadena pesada y ligera separadas en los vectores de expresión lambda Hc2 y lambda Lc2, respectivamente, como se describe utilizado repertorios génicos obtenidos a partir de un ratón inmunizado con NPN-KLH. En la segunda etapa, se combinan estas dos bibliotecas en los sitios EcoR I antisimétricos presentes en cada vector. Esto dio como resultado una biblioteca de clones, cada uno de los cuales coexpresa potencialmente una cadena pesada y una ligera. Las combinaciones reales son aleatorias y no reflejan necesariamente las combinaciones presentes en la población de células B en el animal original.

Se aísla el ARNm de bazo resultante de las inmunizaciones anteriores (ejemplo 2b) y se utiliza para crear una biblioteca primaria de secuencias génicas de V_{H} utilizando el vector de expresión lambda Hc2. La biblioteca primaria contiene 1,3 x 10^{6} unidades formadoras de placas (ufp), y puede examinarse la expresión del marcaje decapeptídico para determinar el porcentaje de clones que expresan las secuencias V_{H} y C_{H}1 (Fd). La secuencia para este péptido está sólo en fase para expresión después de la clonación de un fragmento Fd (o V_{H}) en el vector. Al menos un 80% de los clones en la biblioteca expresan fragmentos Fd basándose en la inmunodetección del marcaje decapeptídico.

La biblioteca de cadena ligera se construye de la misma manera que la cadena pesada y contiene 2,5 x 10^{6} miembros. El examen de placas, utilizando un anticuerpo anti-cadena kappa, indica que un 60% de la biblioteca contenía insertos de cadena ligera expresados. Un pequeño porcentaje de insertos es el resultado de una desfosforilación incompleta del vector después de la escisión con Sac I y Xba I.

Una vez obtenidas, se utilizan las dos bibliotecas para construir una biblioteca combinatoria cruzándolas en el sitio EcoR I. Para conseguir el cruzamiento, se purifica primero el ADN de cada biblioteca.

Se amplifica la biblioteca de lambda Lc2 preparada en el ejemplo 2d y se preparan 500 \mug de ADN de fago de biblioteca de expresión lambda Lc2 a partir de la solución madre de fago amplificado utilizando los procedimientos descritos en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis et al., ed., Cold Spring Harbor, NY (1982). Se mantienen 50 \mug de este ADN de fago de biblioteca de expresión amplificado en una solución que contiene 100 unidades de endonucleasa de restricción MLu I (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN) en 200 \mul de un tampón suministrado por el fabricante de endonucleasa durante 1,5 horas a 37ºC. Se extrae después la solución con una mezcla de fenol y cloroformo. Se precipita después con etanol el ADN y se resuspende en 100 \mul de agua. Se mezcla esta solución con 100 unidades de la endonucleasa de restricción EcoR I (Boehringer) en un volumen final de 200 \mul de tampón que contiene los componentes especificados por el fabricante. Esta solución se mantiene a 37ºC durante 1,5 horas, y se extrae después la solución con una mezcla de fenol y cloroformo. Se precipitó el ADN con etanol y se resuspendió el ADN en TE.

Se amplifica la biblioteca de expresión de lambda Hc2 preparada en el Ejemplo 2d y se preparan 500 \mug de ADN de fago de biblioteca de expresión lambda Hc2 utilizando los procedimientos detallados anteriormente. Se mantienen 50 \mug de este ADN de fago de biblioteca amplificado en una solución que contiene 100 unidades de endonucleasa de restricción Hind III (Boehringer) en 200 \mul de un tampón suministrado por el fabricante de endonucleasa durante 1,5 horas a 37ºC. Se extrae después la solución con una mezcla de fenol y cloroformo saturada con Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5. Se precipita después con etanol el ADN y se resuspende en 100 \mul de agua. Se mezcla esta solución con 100 unidades de la endonucleasa de restricción EcoR I (Boehringer) en un volumen final de 200 \mul de tampón que contiene los componentes especificados por el fabricante. Esta solución se mantiene a 37ºC durante 1,5 horas y se extrae después la solución con una mezcla de fenol y cloroformo. Se precipita con etanol el ADN y se resuspende el ADN en TE.

Se ligan conjuntamente las bibliotecas de expresión de Hc2 y Lc2 digeridos. Con ese fin, se prepara una mezcla de ADN que consiste en 1 \mug de ADN de biblioteca de fago Hc2 y 1 \mug de Lc2 en una reacción de 10 \mul utilizando los reactivos suministrados en un kit de ligamiento (Stratagene). Se calienta la mezcla de ADN a 45ºC durante 5 minutos para fundir cualquier terminación cohesiva que pueda haberse reasociado. Se enfría después la mezcla a 0ºC para evitar el religamiento. Se mezcla ADN ligasa de bacteriófago T4 (0,1 unidades Weiss que es equivalente a 0,02 unidades determinadas en un ensayo de resistencia a exonucleasa) con la solución de ADN enfriada junto con 1 \mul de ATP 5 mM y 1 \mul de tampón de ADN ligasa de bacteriófago T4 10 x (el tampón 10 x se prepara mezclando Tris-HCl 200 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 50 mM, DTT 50 mM y BSA 500 \mug/ml) para formar una mezcla de ligamiento. Después de ligamiento durante 16 h a 4ºC, se encapsula 1 \mul del ADN de fago ligado con extracto de encapsulación Gigapack Gold II y se siembra en células XL1-Blue preparadas según las instrucciones del fabricante para formar una biblioteca de fago lambda de vectores de expresión dicistrónica capaces de expresar cadenas pesadas y ligeras derivadas de ratón inmunizado con NPN. Se utiliza una parte de los clones obtenidos para determinar la eficacia de la combinación.

f. Selección de vectores dicistrónicos productores de heterodímeros reactivos anti-NPN

Se examinó la biblioteca de expresión combinatoria de Fab preparada anteriormente en el ejemplo 2a para identificar clones que tienen afinidad por NPN. Para determinar la frecuencia de los clones de fago que coexpresaban los fragmentos de cadena ligera y pesada, se examinó en transferencias por duplicado de bibliotecas de cadena ligera, cadena pesada y combinatorias como anteriormente la expresión de cadena ligera y pesada. En este estudio de aproximadamente 500 fagos recombinantes, aproximadamente un 60% coexpresó proteínas de cadena ligera y
pesada.

Las tres bibliotecas, de cadena ligera, cadena pesada y combinatoria, se examinaron para determinaron si contenían fagos recombinantes que expresaran fragmentos de anticuerpos que se unen a NPN. En un procedimiento típico, se sembraron 30.000 fagos en células XL1-Blue y se examinó en transferencias por duplicado con nitrocelulosa la unión de NPN acoplado con BSA marcada con ^{125}I. Se yodó la BSA según el procedimiento de cloramina-T como se describe por Bolton et al., Biochem. 133: 529-534 (1973). Los exámenes por duplicado de 80.000 fagos recombinantes de la biblioteca de cadena ligera y un número similar de la biblioteca de cadena pesada no identificaron ningún clon que se uniera al antígeno. En contraste, la biblioteca de expresión de Fab identificó muchas placas de fago que se unían a NPN. Esta observación indica que en condiciones en las que muchas cadenas pesadas en combinación con cadenas ligeras se unen a antígeno, las mismas cadenas pesadas o ligeras no lo hacen. Por lo tanto, en el caso del NPN, se cree que hay muchas cadenas pesadas y ligeras que se unen sólo a antígeno cuando están combinadas con cadenas ligeras y pesadas específicas, respectivamente.

Para evaluar la capacidad de examinar grandes números de clones y obtener una estimación más cuantitativa de la frecuencia de clones de unión a antígeno en la biblioteca combinatoria, se examinaron un millón de placas de fago y se identificaron aproximadamente 100 clones que se unían a antígeno. Para seis clones que se creía que se unían a NPN, se seleccionó una región de la placa que contenía las seis placas de bacteriófago positivas y aproximadamente 20 circundantes, y de cada placa se tomó una muestra, se resembró y se examinó por transferencia por duplicado. Como se esperaba, aproximadamente uno de veinte de los fagos se unía específicamente al antígeno. Las muestras de las regiones del fago sembrado que se creía que eran negativas no proporcionaron positivos al resembrar.

El clon 2b, una de las placas que reaccionaron con NPN, se escindió según un protocolo de escisión in vivo en el que se mezclaron 200 \mul de solución madre de fago y 200 \mul de un derivado F+ de XL1-Blue (A_{600}= 1,00) (Stratagene) con 1 \mul de fago auxiliar M13mp8 (1 x 10^{10} ufp/mililitro (ml)) y se mantuvo a 37ºC durante 15 minutos. Después de un mantenimiento de 4 horas en medio Luria-Bertani (LB) y un calentamiento a 70ºC durante 20 minutos para matar por calentamiento las células XL1-Blue, se reinfectaron los fagémidos en las células XL1-Blue y se sembraron en placas LB que contenían ampicilina. Este procedimiento convirtió el inserto clonado del vector lambda Zap II en un vector plasmídico para permitir una fácil manipulación y secuenciación (Stratagene). Se determinó después el ADN de fagémido que codifica la V_{H}y parte de la V_{L} mediante secuenciación de ADN utilizando el procedimiento didesoxi de Sanger descrito por Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467 (1977), utilizando un kit Sequenase según las instrucciones del fabricante (US Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). La secuencia de residuos nucleotídicos de la cadena Fd del clon 2b se enumera en el listado de secuencias como SEC Nº ID 99. Las secuencias de residuos oligonucleotídicos de las regiones variable y constante de la cadena ligera kappa se enumeran en el listado de secuencias como SEC Nº ID 100 y SEC Nº ID 101, respectivamente.

g. Preparación de una secuencia de ADN que codifica un anclaje a membrana de proteína de recubrimiento de fago filamentoso

Anclaje a membrana de cpVIII: Se utilizó M13mp18, un vector bacteriófago comercialmente disponible (Pharmacia, Piscataway, New Jersey) como fuente para aislar el gen que codifica cpVIII. Se modificó la secuencia del gen que codifica el dominio de anclaje a membrana de cpVIII enumerada en el listado de secuencias como SEC Nº ID 102 mediante amplificación por PCR para incorporar los sitios de endonucleasa de restricción Spe I y EcoR I y dos codones de paro antes del sitio EcoR I. La secuencia de residuos aminoacídicos correspondientes del dominio de anclaje a membrana de cpVIII se enumera en la SEC Nº ID 17.

Para preparar una cpVIII modificada, se aisló en primer lugar un ADN de forma replicativa de M13mp18. Brevemente, se mezclaron en 2 ml de LB (medio Luria-Bertani) 50 \mul de un cultivo de una cepa bacteriana que porta un episoma F' (JM107, JM109 o TG1) con 1/10 de suspensión de partículas de bacteriófago derivadas de una sola placa. Se incubó la mezcla durante 4 a 5 horas a 37ºC con agitación constante. Se centrifugó después la mezcla a 12.000 x g durante 5 minutos para sedimentar las bacterias infectadas. Después de retirar el sobrenadante, se resuspendió el sedimento mediante agitación vigorosa con vórtex en 100 \mul de solución I enfriada con hielo. La solución I se preparó mezclando glucosa 50 mM, EDTA 10 mM y Tris-HCl 25 mM, pH 8,0, y sometiéndolo a autoclave durante 15
minutos.

Se mezclaron con la suspensión bacteriana 200 \mul de solución II recién preparada y el tubo se invirtió rápidamente cinco veces. La solución II se preparó mezclando NaOH 0,2 N y 1% de SDS. Se mezclaron con la suspensión bacteriana 150 \mul de solución III enfriada con hielo y se agitó con vórtex suavemente el tubo en posición invertida durante 10 segundos para dispersar la solución III por el lisado bacteriano viscoso. Se preparó la solución III mezclando 60 ml de acetato de potasio 5 M, 11,5 ml de ácido acético glacial y 28,5 ml de agua. Se almacenó después el lisado bacteriano resultante en hielo durante 5 minutos seguido de centrifugación a 12.000 x g durante 5 minutos a 4ºC en una microcentrífuga. Se recuperó el sobrenadante resultante y se transfirió a un nuevo tubo. Se añadió al sobrenadante un volumen igual de fenol-cloroformo y se agitó con vórtex la mezcla. Se centrifugó después la mezcla a 12.000 x g durante 2 minutos en una microcentrífuga. Se transfirió el sobrenadante resultante a un nuevo tubo y se precipitó el ADN de bacteriófago bicatenario con 2 volúmenes de etanol a temperatura ambiente. Después de dejar reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 2 minutos, se centrifugó la mezcla para sedimentar el ADN. Se retiró el sobrenadante y se resuspendió el ADN en forma replicativa sedimentado en 25 \mul de Tris-HCl, pH 7,6 y EDTA 10 mM (TE).

Se utilizó después ADN en forma replicativa de M13mp18 bicatenario como molde para PCR. Se utilizaron los cebadores AK 5 (SEC Nº ID 103) y AK 6 (SEC Nº ID 104), cuyas secuencias se enumeran en la Tabla 7 a continuación, en la reacción PCR para amplificar el gen maduro para el dominio de anclaje del miembro cpVIII e incorporar los dos sitios de clonación, Spe I y EcoR I. Para la reacción PCR, se mezclaron 2 \mul que contenían 1 ng de ADN en forma replicativa de M13mp18 con 10 \mul de tampón PCR 10x adquirido comercialmente (Promega Biotech, Madison, Wisconsin) en un tubo de microcentrífuga de 0,5 ml. Se mezclaron con la mezcla de ADN, 8 \mul de una solución 2,5 mM de dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), dando como resultado una concentración final 200 micromolar (\muM). Se mezclaron 3 \mul (equivalentes a 60 picomoles (pM)) del cebador 5' de codificación AK 5 y 3 \mul (60 pM) del cebador 3' inverso AK 6 con la solución de ADN. Se añadieron a la mezcla 73 \mul de agua estéril y 1 \mul/5 unidades de polimerasa (Promega Biotech). Se dispusieron dos gotas de aceite mineral en la parte superior de la mezcla y se realizaron 40 rondas de amplificación por PCR en un termociclador. El ciclo de amplificación consistió en 52ºC durante 2 minutos, 72ºC durante 1,5 minutos y 91ºC durante 2 minutos. Las muestras que contenían fragmento de ADN de dominio dee anclaje a membrana de cpVII modificado por PCR de M13mp18 resultante se purificaron después con Gene Clean (BIO101, La Jolla, California), se extrajeron dos veces con fenol-cloroformo, una vez con cloroformo seguido de precipitación con etanol, y se almacenaron a -70ºC en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y EDTA 1
mM.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7

12

F	Cebador de codificación
B	Cebador inverso
^{1}	\begin{minipage}[t]{145mm} De 5' a 3': la secuencia de superposición para el extremo 3' de C_{H}1 está doblemente subrayada; la secuencia del sitio de restricción Spe I está subrayada; la secuencia de superposición para cpVIII está doblemente subrayada.\end{minipage}
^{2}	La secuencia del sitio de restricción EcoR I está subrayada.
^{3}	La secuencia del sitio de restricción Xho I está subrayada.
^{4}	\begin{minipage}[t]{145mm} De 5' a 3': la secuencia de superposición para cpVIII está doblemente subrayada; la secuencia del sitio de restricción Spe I está subrayada; la secuencia de superposición para el extremo 5' de C_{H}1 está doblemente subrayada.\end{minipage}
^{5}	\begin{minipage}[t]{145mm} De 5' a 3': la secuencia del sitio de restricción Spe I está subrayada; la secuencia de superposición con el extremo 5' de cpIII está doblemente subrayada.\end{minipage}
^{6}	\begin{minipage}[t]{145mm} De 5' a 3': la secuencia del sitio de restricción Nhe I está subrayada; la secuencia de superposición con el extremo 3' de cpIII está doblemente subrayada.\end{minipage}
^{7}	\begin{minipage}[t]{145mm} De 5' a 3': la secuencia de superposición con el extremo 3' de cpIII está doblemente subrayada; la secuencia de restricción de Nhe I comienza con el residuo nucleotídico "G" en posición 4 y se extiende 5 residuos más = GCTAGC.\end{minipage}
^{8}	La secuencia del sitio de restricción EcoR I está subrayada
^{9}	\begin{minipage}[t]{145mm} Cebador inverso alternativo para amplificar LacZ; la secuencia del sitio de restricción EcoR I está subrayada.\end{minipage}

Para verificar la amplificación del dominio de anclaje a membrana de cpVIII modificado, se sometieron a electroforesis los productos de ADN purificados por PCR en gel de agarosa al 1%. El tamaño esperado de la cpVIII era de aproximadamente 150 pares de bases. El área en la agarosa que contenía el fragmento de ADN de cpVIII modificado se aisló de la agarosa como se describe anteriormente. Se enumera la secuencia del fragmento de ADN de cpVIII modificado aislado como SEC Nº ID 111. Se mezcló después el fragmento de ADN de cpVIII aislado con un fragmento preparado de forma similar de un Fd modificado como se describe a continuación en el ejemplo 2i para formar un segmento de ADN que codifica la proteína de fusión Fd-cpVIII.

Anclaje a membrana de cpIII: Se utilizó también M13mp18 como fuente para aislar el gen que codifica el dominio de anclaje a membrana de cpIII, cuya secuencia se enumera en el listado de secuencias como SEC Nº ID 112. Se enumera la secuencia de residuos aminoacídicos del dominio de anclaje a membrana de cpIII en la SEC Nº ID 16. Se preparó ADN en forma replicativa de M13mp18 como se describe anteriormente y se utilizó como molde para dos amplificaciones por PCR para la construcción de un fragmento de ADN constituido por el gen maduro del dominio de anclaje a membrana de cpIII localizado 5' a una secuencia que codifica el promotor, operador y sitio de unión a casquete de LacZ para controlar la expresión de cadena ligera. Los sitios de restricción Spe I y EcoR I se crearon en las reacciones de amplificación, y se localizaron en los extremos 5' y 3' de los fragmentos, respectivamente. El procedimiento para crear este fragmento combinando los productos de dos amplificaciones por PCR separadas se describe a continuación.

Se utilizó el primer par G-3 (F) (SEC Nº ID 107) y G-3 (B) (SEC Nº ID 108), enumerados en la Tabla 7, en la primera reacción PCR como se realiza anteriormente para amplificar el gen de anclaje a membrana cpIII e incorporar los sitios de restricción Spe I y Nhe I al fragmento. El fragmento amplificado por PCR contenía también secuencias nucleotídicas que codificaban un lazo de cinco aminoácidos compuesto por cuatro residuos de glicina y una serina yuxtapuesto entre los dominios que codifican la cadena pesada y cpIII. Una vez expresada, la secuencia de cinco aminoácidos que carece de estructura secundaria ordenada sirvió para minimizar la interacción entre los dominios Fab y cpIII. El fragmento de ADN de cpIII modificado por PCR resultante que tiene sitios Spe I y Nhe I en los extremos 5' y 3', respectivamente, del fragmento, se verificó y se purificó como se describe anteriormente. Se enumera la secuencia del fragmento de ADN de dominio de anclaje a membrana de cpIII modificado por PCR en el listado de secuencias como SEC Nº ID 113. Se realizó una segunda amplificación por PCR utilizando los pares cebadores Lac-F (SEC Nº ID 109) y Lac-B (SEC Nº ID 110) enumerados en la Tabla 7 en una alícuota separada de ADN molde en forma replicativa de M13mp18 para amplificar el promotor, operador y sitio de unión de casquete de LacZ que tiene un sitio 5' Nhe y 3' EcoR I. Los cebadores utilizados para esta amplificación se diseñaron para incorporar un sitio Nhe I al extremo 5' del fragmento amplificado para superponerse con una parte del extremo 3' del fragmento del gen cpIII y del sitio Nhe I 3' al fragmento de cpIII amplificado. La reacción y purificación del producto de PCR se realizaron como se describe anteriormente. Se enumera la secuencia del fragmento de ADN de cpIII modificado por PCR resultante que tiene un sitio de restricción 5' Nhe I y 3' EcoR I en el listado de secuencias como SEC Nº ID 114.

Era un cebador Lac-B alternativo para uso en la construcción del anclaje a membrana de cpIIII y la región promotora LacZ el Lac-B', como se muestra en la Tabla 7. Las reacciones de amplificación se realizaron como se describe anteriormente, con la excepción de que en la segunda amplificación por PCR se utilizó Lac-B' con Lac-F, en lugar de Lac-B. El producto de la reacción de amplificación se enumera en el listado de secuencias como SEC Nº ID 114 de la posición nucleotídica 1 a la posición nucleotídica 172. El uso de Lac-B' dio como resultado una región LacZ que carecía de 29 nucleótidos en el extremo 3', pero que era funcionalmente equivalente al fragmento más largo producido con los cebadores Lac-F y Lac-B.

Los productos de la primera y segunda amplificaciones por PCR que utilizan los pares cebadores 6-3(F) y 6-3(B) y Lac-F y Lac-B se recombinaron después en los nucleótidos correspondientes a la superposición del anclaje a membrana de cpIII y el sitio de restricción Nhe I y se sometieron a una segunda ronda de PCR utilizando el par cebador G3-F (SEC Nº ID 107) y Lac-B (SEC Nº ID 110) para formar un producto de fragmento de ADN recombinado por PCR constituido por lo siguiente: un sitio de restricción 5' Spe I; un dominio de anclaje a membrana de ADN de cpIII que comienza en la secuencia de residuos nucleotídicos que corresponde al residuo aminoacídico 198 de la proteína cpIII madura completa; un sitio de paro endógeno proporcionado por el anclaje a membrana en el residuo aminoacídico número 112; un sitio de restricción Nhe I, una secuencia promotora, operadora y de sitio de unión a casquete LacZ; y un sitio de restricción 3' EcoR I. Se digirió después con las enzimas de restricción Spe I y EcoR I el fragmento de ADN del dominio de anclaje a membrana de cpIII modificado por PCR recombinado para producir un fragmento de ADN para ligamiento direccional en un vector de expresión fagémido pComb2 que tiene sólo un sitio Spe I, preparado en el ejemplo 1a(iv), formando un vector de expresión fagémido pComb2-3 (también designado como pComb2-III) como se describe en el ejemplo 1b(ii).

h. Aislamiento del segmento de ADN que codifica V_{H} anti-NPN

Para preparar fragmentos Fd modificados para recombinación con el fragmento del dominio de anclaje a membrana de cpVIII modificado por PCR para formar un producto de fusión de ADN Fd-cpVIII, se realizó una amplificación por PCR como se describe anteriormente utilizando el clon 2b, preparado en el ejemplo 2f, como molde. Se utilizaron los cebadores Hc3 (SEC Nº ID 105) y AK 7 (SEC Nº ID 106), cuyas secuencias se enumeran en la Tabla 7, en una PCR para amplificar la parte Fd del clon 2b e incorporar los sitios de clonación Xho I y Spe I junto con una secuencia de superposición con cpVIII. El producto Fd modificado amplificado por PCR se purificó, se sometió a electroforesis y se aisló de geles de agarosa al 1% como se describe anteriormente. El tamaño del fragmento Fd fue de 680 pares de bases.

i. Preparación de un segmento de ADN que codifica una parte de la proteína de fusión Fd-cpVIII

Se mezcló después el fragmento de ADN de Fd modificado por PCR purificado que contiene secuencias nucleotídicas superpuestas con cpVIII, preparado anteriormente, con el fragmento de dominio de anclaje a membrana de cpVIII modificado por PCR para formar una mezcla. Se dejaron recombinaron los fragmentos en la mezcla con sus regiones complementarias. Se sometió después la mezcla que contenía los fragmentos de PCR recombinados a una segunda ronda de amplificación por PCR como se describe anteriormente utilizando el par cebador terminal AK 6 (SEC Nº ID 104) y Hc3 (SEC Nº ID 105) (Tabla 7). Se purificó el correspondiente producto de amplificación por PCR y se sometió a electroforesis en geles de agarosa como se describe anteriormente. Se determinó que el producto de PCR era de aproximadamente 830 pares de bases (Fd= 680 + 150), confirmando la fusión de Fd con cpVIII. La secuencia del producto de PCR que une la secuencia Fd con la secuencia cpVIII en fase en dirección 5' a 3' se enumera como SEC Nº ID 115. Se utilizó después el producto de fusión Fd-cpVIII en ligamientos direccionales descritos en el ejemplo 2j para la construcción de un vector de expresión fagémido dicistrónico pCBAK8-2b.

j. Construcción de un vector de expresión dicistrónico pCBAK8-2b

Para construir un vector fagémido para la expresión coordinada de una proteína de fusión Fd-cpVIII con una cadena ligera kappa, se ligó primero el producto de fusión Fd-cpVIII amplificado por PCR, preparado anteriormente en el ejemplo 2i, en el vector de expresión fagémido clon 2b aislado de la biblioteca combinatoria de NPN preparada en el ejemplo 2f. Para el ligamiento, se digirió primero con las enzimas de restricción Xho I y EcoR I el producto de fusión por PCR Fd-cpVIII. Se digirió de forma similar el vector fagémido clon 2b, dando como resultado la retirada de las regiones de clonación y decapeptídica. Se mezcló y ligó el fragmento Fd-cpVIII digerido con el clon 2b digerido en las terminaciones cohesivas generadas por la digestión de restricción con Xho I y EcoR I. El ligamiento dio como resultado la unión operativa de la secuencia de residuos nucleotídicos que codifican la proteína de fusión polipeptídica Fd-cpVIII a un segundo módulo que tiene las secuencias de residuos nucleotídicos que codifican el sitio de unión a ribosoma, una secuencia líder pelB y la cadena ligera kappa ya presentes en el clon 2b, formando una molécula de ADN dicistrónica en el vector de expresión fagémido clon 2b original.

Se transformó después E. coli, cepa TG1, con el fagémido que contiene la molécula de ADN dicistrónica, y se seleccionaron los transformantes en ampicilina, ya que el clon 2b original contenía un gen marcador detectable de resistencia a ampicilina. Para la electrotransformación de alta eficacia de E. coli, se inoculó un volumen 1:100 de un cultivo de una noche de células TG1 en 1 litro de caldo L (1% de triptona Bacto, 0,5% de extracto de levadura Bacto, 0,5% de NaCl). Se mantuvo la suspensión celular a 37ºC con agitación vigorosa a una absorbancia a 600 nm de 0,5 a 1,0. Se recogió después la suspensión celular en fase de crecimiento logarítmico enfriando en primer lugar el matraz en hielo durante 15 a 30 minutos, seguido de centrifugación en un rotor frío a 4000 x g durante 15 minutos para sedimentar las bacterias. Se retiró el sobrenadante resultante y se resuspendió el sedimento de células bacterianas en un total de 1 litro de agua fría para formar una suspensión celular. Se repitió el procedimiento de centrifugación y resuspensión dos veces más, y después de la centrifugación final se resuspendió el sedimento celular en 20 ml de glicerol frío al 20%. Se centrifugó después la suspensión celular resuspendida para formar un sedimento celular. Se resuspendió el sedimento celular resultante a un volumen final de 2 a 3 ml en glicerol frío al 10%, dando como resultado una concentración de células de 1 a 3 x 10^{10} células/ml. Para el procedimiento de electrotransformación, se mezclaron 40 \mul de la suspensión celular preparada con 1 a 2 \mul de ADN de fagémido formando una mezcla de ADN de célula-fagémido. Se mezcló la mezcla resultante y se dejó reposar en hielo durante un minuto. Se fijó un aparato de electroporación, por ejemplo un Gene Pulsar, a 25 \muF y 2,5 kV. Se fijó el controlador de pulsos a 200 ohmios. Se transfirió la mezcla de ADN celular a una cubeta de electroporación fría de 0,2 cm. Se dispuso después la cubeta en la cámara de seguridad enfriada y se realizó un pulso con los ajustes anteriores. Se añadió después 1 ml de medio SOC a la mezcla sometida a pulso y se resuspendieron las células con una pipeta Pasteur (el medio SOC se preparó mezclando 2% de peptona Bacto, 0,5% de extracto de levadura Bacto, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa 20 mM). Se transfirió después la suspensión celular a 17 tubos de polipropileno de 100 mm y se mantuvo a 37ºC durante 1 hora. Después del periodo de mantenimiento, se sembraron las células TG1 transformadas en placas LB con ampicilina para selección de las colonias resistentes a ampicilina que contienen el fagémido que proporcionaba el gen marcador detectable.

Se seleccionaron las colonias resistentes a lla ampicilina y se analizaron el tamaño de inserto correcto y la expresión de Fab. Brevemente, se prepararon minipreparaciones de ADN de colonias seleccionadas para el aislamiento de ADN de fagémido. Se digirió con las enzimas de restricción Xho I y EcoR I el ADN de fagémido aislado de cada minipreparación, y las digestiones se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1%. Se seleccionó el clon AK16 en forma de un fragmento de 830 pb y se visualizó en los geles, confirmando la inserción del producto de fusión PCR Fd-cpVIII en el clon 2b digerido.

Se sometió a digestión de restricción con Xho I y Xba I el fagémido clon AK16 y se aisló la secuencia de residuos nucleotídicos de la molécula de ADN dicistrónico que codificaba la proteína de fusión Fd-cpVIII, el sitio de unión a ribosoma y la secuencia líder pelB para la expresión de la cadena ligera, una región espaciadora y la cadena ligera kappa 2b mediante electroforesis en gel de agarosa. Se ligó después el fragmento de ADN dicistrónico aislado en un vector de expresión pCBAK0 digerido con las enzimas de restricción Xho I y Xba I preparado en el ejemplo 1c(ii), formando un vector de expresión fagémido dicistrónico designado pCBAK8-2b.

El vector de expresión pCBAK8-2b resultante consistía en secuencias de residuos nucleotídicos que codificaban los siguientes elementos: el origen de replicación del fago filamentoso f1; un gen marcador detectable de resistencia a cloranfenicol acetiltransferasa; un promotor LacZ inducible cadena arriba del gen LacZ; un sitio de clonación múltiple flanqueado por los promotores de polimerasa T3 y T7; y la molécula de ADN dicistrónico (un primer módulo que consiste en un sitio de unión a ribosoma, una secuencia líder pelB y un producto de fusión de ADN Fd-cpVIII ligado operativamente a un segundo módulo constituido por un segundo sitio de unión a ribosoma, una segunda secuencia líder pelB y una cadena ligera kappa).

k. Construcción del vector de expresión dicistrónico pCBAK3-2b

Para construir un vector fagémido para la expresión coordinada de una proteína de fusión Fd-cpIII con una cadena ligera kappa, se ligó primero direccionalmente el anclaje a membrana de cpIII amplificado por PCR y recombinado, preparado en el ejemplo 2g, que tiene un sitio de restricción 5' Spe I y 3' EcoR I en un vector de expresión fagémido pComb2 previamente digerido con Spe I y EcoR I, preparado en el ejemplo 1a(iv), formando un vector fagémido pComb2-3 (también denominado pComb2-III). Véase el ejemplo 1b(ii) para detalles de la construcción del vector. Se utilizó este vector en esta invención cuando se preferían vectores resistentes a la ampicilina. Por tanto, el vector pComb2-3 resultante, que tiene sólo un sitio de restricción Spe I, contenía secuencias promotoras/operadoras LacZ separadas para dirigir la expresión separada del producto de fusión (Fd)-cpIII de cadena pesada y la proteína de cadena ligera. Las proteínas expresadas se dirigieron al espacio periplásmico mediante las secuencias líder pelB para el ensamblaje funcional en la membrana. La inclusión de la región intergénica F1 en el vector permitió el encapsulado de un fagémido monocatenario con la ayuda de un fago auxiliar. El uso de superinfección con fago auxiliar conduce a la expresión de dos formas de cpIII. Por tanto, la morfogénesis normal del fago se perturbó por la competición entre la fusión Fab-cpIII y la cpIII nativa del fago auxiliar para la incorporación al virióm, como se muestra esquemáticamente en la Figura 8 para las fusiones Fab-cpVIII.

Para producir vectores resistentes a cloranfenicol para uso en esta invención, se digirió después con las enzimas de restricción Sac II y Apa I el vector fagémido pComb2-3 resultante formando un fragmento aislado. El fragmento aislado resultante que contiene las secuencias de control de la expresión y la secuencia cpIII se ligó después direccionalmente en un vector fagémido pCBAK0 digerido de forma similar, preparado en el ejemplo 1c(ii), formando un vector de expresión fagémido pCBAK3. Este vector carecía de las secuencias Fd y de cadena ligera kappa.

Se construyó después un vector de expresión fagémido resistente a cloranfenicol, pCBAK3-2b, para la expresión de una proteína de fusión y la cadena ligera kappa. Brevemente, se digirió primero el vector de expresión fagémido pCBAK3 preparado anteriormente con Xho I y Spe I, formando un vector de expresión fagémido pCBAK3 linealizado. El fragmento de Fd amplificado y modificado por PCR preparado en el ejemplo 2h, que contenía los sitios Xho I y Spe I, se digirió posteriormente con las enzimas de restricción Xho I y Spe I. El fragmento de Fd resultante se ligó después direccionalmente mediante terminaciones cohesivas al vector de expresión fagémido pCBAK3 digerido con las enzimas de restricción Xho I y Spe I formando un segundo vector de expresión fagémido en el que se unió operativamente el fragmento de Fd modificado por PCR en fase con las secuencias de residuos nucleotídicos que codifican cpIII. La cepa XL1-Blue de E. coli (Stratagene) se transformó después con el vector fagémido anterior que contenía Fd-cpIII. Los transformantes que contenían el fagémido que codifica Fd-cpIII se seleccionaron en cloranfenicol. Se aisló el ADN de fagémido de clones resistentes al cloranfenicol y se digirió con las enzimas de restricción Sac I y Xba I, formando un vector de expresión de fagémido linealizado en el que se ligó direccionalmente un fragmento de cadena ligera Sac I y Xba I preparado a continuación.

El fagémido clon 2b, aislado de la biblioteca combinatoria original como se describe en el ejemplo 2a, se digirió con las enzimas de restricción Sac I y Xba I para aislar la secuencia de residuos nucleotídicos que codifica la cadena ligera kappa. Se ligó después direccionalmente la secuencia de cadena ligera kappa aislada en el vector de expresión fagémido digerido con las enzimas de restricción Sac I y Xba I preparado anteriormente que contenía Fd-cpIII, formando el vector de expresión fagémido pCBAK3-2b. El vector resultante contenía la secuencia de residuos nucleotídicos de una molécula de ADN dicistrónico para la expresión coordinada de una proteína de fusión Fd-cpIII con la cadena ligera kappa. El vector de expresión fagémido resultante consistía en secuencias de residuos nucleotídicos que codifican los siguientes elementos: el origen de replicación de fago filamentoso f1; un gen marcador detectable de resistencia a cloranfenicol acetiltransferasa; un promotor LacZ inducible cadena arriba del gen LacZ; un sitio de clonación múltiple flanqueado por promotores de polimerasa T3 y T7; y la molécula dicistrónica (un primer módulo constituido por un primer sitio de unión a ribosoma y una secuencia líder pelB unida operativamente a Fd-cpIII unido operativamente a un segundo módulo constituido por un segundo LacZ, un segundo sitio de unión a ribosoma y una segunda secuencia líder pelB unida operativamente a una cadena ligera kappa).

Se transformaron después células XL1-Blue con el vector de expresión fagémido pCBAK3-2b. Se seleccionaron las colonias transformadas que contenían los fagémidos resistentes a cloranfenicol como se describe anteriormente, y se analizaron el correcto tamaño del inserto y la expresión de Fab como se describe en el ejemplo 2j. Después de la verificación del inserto y la expresión de Fab en el vector fagémido pCBAK3-2b, se transformaron células XL1-Blue y se indujeron a la expresión de anticuerpos Fab como se describe en los ejemplos 3 y 4.

Los resultados de la expresión, selección y examen de las fusiones Fab-cpIII reveló una ventaja de la presentación monovalente proporcionada por las fusiones Fab-cpIII frente a las presentaciones multivalentes proporcionadas por las fusiones Fab-cpVIII, ya que permitían la clasificación de clones basándose en la afinidad así como en la especificidad, como hace el sistema inmune. Se observó un enriquecimiento de 253 veces del clon 10c de unión fuerte frente al clon 7E de unión más débil utilizando el sistema pComb3 como se describe en Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991). Los estudios con bibliotecas de péptidos en fagos que presentaban cuatro a cinco copias del péptido en la superficie del fago han mostrado que la multivalencia evitaba la separación de fagos que presentaban péptidos de afinidad moderada (10^{-6} M) de los que presentaban péptidos de alta afinidad (10^{-9} M). Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382 (1990). La multivalencia conducía a un efecto de quelación que reduce la capacidad de discriminar entre fagos que portan Fab de alta afinidad de los que portan Fab de baja afinidad.

El uso del sistema se demostró adicionalmente clasificando una biblioteca Fab combinatoria humana de toxoide antitetánico previamente caracterizada (un ligante por 5000 clones) como se describe en el ejemplo 6 y por Persson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 (1991). La biblioteca, originalmente en un sistema vector de fago lambda, se reconstruyó en pComb2-3 que retenía los apareamientos originales de cadenas pesada y ligera. El tamaño de la biblioteca, 10^{7} clones, era 10 veces mayor que la biblioteca de fago lambda original. Después de una sola ronda de selección por afinidad, se determinó que 13 ó 57 clones recogidos eran ligantes de toxoide del tétanos, lo que representaba un enriquecimiento de 1000 veces. Después de la tercera selección por afinidad, el rendimiento de fago había aumentado 200 veces, indicando un enriquecimiento del fago específico. Todos los clones eran por tanto ligantes específicos de antígeno. Son por tanto accesibles grandes bibliotecas combinatorias de 10^{8} miembros utilizando este sistema. Se consiguen bibliotecas aún mayores mediante mutagénesis como se describe en los ejemplos 6-8.

3. Expresión de heterodímero anti-NPN en superficies de fago

Para la expresión de Fab de anticuerpo dirigido contra NPN en superficies de fago, se transformaron separadamente células XL1-Blue con los vectores fagémidos pCBAK8-2b y pCBAK3-2b preparados en los ejemplos 2j y 2k, respectivamente. Se seleccionaron los transformantes en placas LB que contenían cloranfenicol 30 \mug/ml. Se seleccionaron las colonias resistentes a antibióticos para cada transformación de fagémido y se hicieron crecer en cultivos líquidos a 37ºC en supercaldo (el supercaldo se preparó mezclando lo siguiente: 20 g de ácido 3-[N-morfolino]propanosulfónico (MOPS); 60 g de triptona; 40 g de extracto de levadura y 2 litros de agua; se ajusta el pH a 7,0 con NaOH 10 m) que contiene cloranfenicol 30 \mug/ml y tetracicina 12,5 \mug/ml para la selección de antibiótico respectiva del fagémido y del episoma F'. Se diluyeron las células XL1-Blue transformadas resistentes a antibióticos a una densidad óptica (DO_{600nm}) de 0,4 en supercaldo. Se mezcló el inductor, tiogalactopiranósido de isopropilo (IPTG), con la suspensión bacteriana para una concentración final 1 mM y se mantuvo la mezcla a 37ºC durante 1 h para inducir la expresión de la proteína de fusión y la cadena ligera kappa desde el promotor LacZ. Se mezcló después el fago auxiliar, R408 o VCS M13 (Stratagene) con la suspensión bacteriana inducida a una relación de 10-20 fagos auxiliares a 1 célula bacteriana transformada para iniciar la generación de copias de la cadena con sentido del ADN fagémido. La mezcla que contiene el fago auxiliar se mantuvo después durante 2 horas adicionales a 37ºC para permitir el ensamblaje de bacteriófago filamentoso, en el que los anticuerpos Fab anti-NPN expresados condensados al dominio de anclaje a membrana de cpVIII o cpIII se incorporaron a la superficie de partículas de bacteriófago. La suspensión bacteriana se centrifugó después, dando como resultado un sedimento celular bacteriano y un sobrenadante que contenía fago. Se retiró el sobrenadante, se recogió y se ensayó como se describe a continuación la presencia de moléculas Fab anti-NPN funcionales ancladas a las partículas de fago mediante cpVIII o cpIII.

4. Ensayos para verificar la presencia y función de heterodímero anti-NPN en la superficie de fago filamentoso a. Microscopía electrónica

Para localizar las moléculas de Fab funcionales, se estudió la unión a antígeno marcado con oro coloidal. Se situaron sobrenadantes que contenían fago y células bacterianas preparadas en el ejemplo 3 en rejillas recubiertas de formvar (Polysciences, Inc., Warrington, Pennsylvania) fijadas a una fase sólida. En algunos experimentos, las rejillas se recubrieron con células y se infectaron con fago in situ. Posteriormente, se bloquearon las rejillas con 1% de seroalbúmina bovina (BSA) en PBS a pH 7,2, se lavaron y se incubaron con partículas de oro coloidal de 2-7 nanómetros (nm) recubiertas con conjugado de hapteno BSA-NPN durante un periodo de tiempo suficiente para formar un complejo de inmunoreacción marcado. Se lavaron las rejillas para retirar las partículas de oro en exceso, se tiñeron negativamente con acetato de uranilo y se visualizaron mediante microscopía electrónica.

El examen de los fagos filamentosos y las células permeabilizadas productoras de fagos reveló un marcaje específico del fago o de las membranas bacterianas expuestas. Se observó que los fagos contenían 1 a 24 copias de sitios de unión a antígeno por partícula. Ni el fago auxiliar solo ni la E. coli intacta se marcaron con antígeno. La unión no específica de fondo fue muy baja. Las partículas de fago filamentoso emergentes de las superficies de E. coli se marcaron con antígeno como se muestra en la Figura 9.

La generación de un vector de expresión de superficie de fago relacionado utilizando cpIII como asociado de fusión con el clon 2b, pCBAK3-2b, reveló un marcaje de antígeno específico en la cabeza del fago, pero no en la columna. Adicionalmente, el Fab humano anti-tétanos expresado en forma de fusión con cpIII no se unió al antígeno BSA-NPN.

b. ELISA de fago

Se recubrieron placas de microvaloración con conjugado NPN-BSA (0,1 ml, 1 \mug/ml en Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2) y se bloquearon con 1% de BSA en PBS. Se añadieron diluciones dobles en serie del fago derivado pCBAK8-2b (0,1 ml), preparado en el ejemplo 3, a la placa de microvaloración prerecubierta y se incubaron durante 3 horas a temperatura ambiente o durante 16 horas a 4ºC. Se lavaron las placas con PBS y conjugado de fosfatasa alcalina de cabra anti-kappa (Fisher Biotech, Pittsburgh, Pennsylvania) (0,1 ml diluido 1/1000 en PBS que contiene 0,1% de BSA), y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Se lavaron las placas con PBS y se añadió sustrato (0,1 ml, fosfato de p-nitrofenilo 1 mg/ml en Tris-HCl 0,1 M, pH 9,5 que contiene MgCl_{2} 50 mM). Después de incubación a 37ºC para el desarrollo de la señal, se determinaron las densidades ópticas a 400 nm. Se realizaron ensayos competitivos con la adición de cantidades crecientes de hapteno NPN libre en el intervalo de 0 hasta 5 mg/pocillo.

Los ensayos ELISA confirmaron la presencia de Fab de anticuerpo funcional. En un ELISA de dos sitios en placas recubiertas con antígeno NPN, cuando se ensayó con conjugado enzimático de cadena kappa anti-ratón, el sobrenadante de fago generado por la infección con fago auxiliar de células que portan el constructo pCBAK8-2b exhibió las curvas de titulación esperadas con diluciones dobles en serie de fago que contiene anticuerpo. Los resultados del ELISA de dos sitios se muestran en la Figura 10. Para que se genere una señal en este ensayo, la partícula de fago debe (i) tener funcionalmente asociadas las cadenas Fd y kappa y (ii) ser multivalente. Se evaluó la especificidad de la partícula inhibiendo la unión a la placa en presencia de concentraciones crecientes de hapteno libre. Las partículas de fago generadas exhibieron unión a la fase sólida de ELISA y pudieron inhibirse mediante la adición de hapteno como se muestra en la Figura 11. Se consiguió una inhibición completa cuando se utilizaron 5 ng de hapteno NPN libre en el ensayo. El fago auxiliar no proporcionó señal en el ELISA. Estos resultados muestran el ensamblaje funcional de los polipéptidos de cadena pesada y ligera de anticuerpo para formar el complejo de unión a epítopo que está presente en la superficie de la partícula de fago y es capaz de unirse al segmento de ligando preseleccionado que contiene un epítopo.

c. Precipitación de fago específica de antígeno

Se transformó sobrenadante de fago de XL1-Blue con el vector de expresión dicistrónico pCBAK8-2b preparado en el ejemplo 3 (1 ml), y se incubó con conjugado BSA-NPN (10 \mul, 2 mg/ml) durante 18 horas a 4ºC. Se sedimentó después la mezcla mediante centrifugación a 3000 rpm en una centrífuga de sobremesa y se observó la aparición de precipitado. Se utilizó fago auxiliar como control. Se lavó repetidamente el sedimento con PBS frío (5 x 3 ml/lavado) y se resuspendió después en LB (0,5 ml). Se añadieron los precipitados solubilizados a células XL1-Blue recientes (0,5 ml de cultivo de una noche), se incubaron durante 1 hora a 37ºC y se sembraron alícuotas en agar LB que contenía cloranfenicol (30 \mug/ml). Se seleccionaron aleatoriamente las colonias. Se trataron las transferencias de colonias en nitrocelulosa con lisozima para digerir la pared celular, se trataron brevemente con cloroformo para degradar la membrana externa, se bloquearon en BSA al 1% en PBS y se incubaron con antígeno BSA-NPN marcado con ^{125}I. Después de varios lavados con PBS (que contenía 0,05% de Tween 20), se expuso la película a lavado y secado del filtro durante una noche a -70ºC, y se desarrollaron después las autorradiografías.

Se obtuvieron precipitados con fago que contiene anticuerpo, pero no con fago auxiliar en presencia de BSA-NPN. Además, las partículas retenían la infectividad en la incubación posterior con células bacterianas que portan el episoma F', y generaron 4 x 10^{5} colonias de un solo precipitado solubilizado.

Adicionalmente, se llevó a cabo un análisis de restricción para determinar la presencia de insertos de cadena pesada y ligera. El análisis de restricción de ADN de los clones reveló la presencia de un fragmento Xho I y Xba I de 1,4 kb como se esperaba para el constructo de fusión Fd-cpVIII y el inserto de cadena kappa.

Estos resultados proporcionan una evidencia adicional de la especificidad de antígeno y la multivalencia. Además de proporcionar parámetros inmunológicos, esta precipitación ofrece posibilidades para un fácil enriquecimiento en partículas de fago específicas de antígeno. En principio, los fagos que contienen anticuerpos específicos pueden enriquecerse en gran medida mediante precipitación con antígenos (que pueden ser marcadores de superficie celular, virales, bacterianos así como moléculas sintéticas). Los precipitados antígeno-anticuerpo lavados pueden solubilizarse mediante la adición de antígeno en exceso y recuperarse el fago viable. Para la recuperación de especies raras puede utilizarse un antígeno inmovilizado que abre la vía de la elución por afinidad diferencial.

Para demostrar la utilidad del antígeno inmovilizado para el enriquecimiento de clones de especificidad de unión definida, se realizó un experimento de selección por afinidad. Se construyó un fagémido resistente a ampicilina que expresa un Fab anti-tétanos en forma de una fusión con cpVIII. El rescate de este clon con fago auxiliar produjo un fago que codificaba el fagémido resistente a ampicilina que presentaba el Fab anti-tétanos en su recubrimiento. Estos fagos que codifican la especificidad del tétanos se mezclaron con fagos que codifican el hapteno NPN (1:100), y se dejaron unirse a una placa de microvaloración recubierta con toxoide del tétanos. Después de una hora de periodo de mantenimiento, se lavó extensamente la placa y se eluyeron después los fagos con un tampón de bajo pH. La infección de células XL1-Blue en fase de crecimiento logarítmico y la posterior siembra de alícuotas en ampicilina y cloranfenicol permitió una cuantificación directa del enriquecimiento. El examen de más de 1.000 colonias mostró que las colonias resistentes a ampicilina derivadas del fago eluido superaban a las colonias resistentes a cloranfenicol por 27 a 1. Por lo tanto, la selección por afinidad enriqueció al fago que presentaba el Fab anti-tétanos 2700 veces. Este resultado sugiere que un clon de especificidad definida presente en una parte por millón dominará frente a los clones no específicos después de dos rondas de selección por afinidad.

5. Ventajas de ensamblar bibliotecas combinatorias de Fab de anticuerpo en las superficies de fagos

Se presenta una poderosa técnica para generar bibliotecas con 10^{8-9} miembros y seleccionar de la biblioteca combinatoria Fab con actividades de unión preseleccionadas. En el vector descrito en la presente memoria, los sitios de clonación de restricción para insertar fragmentos de anticuerpo generados por PCR se han retenido como se reseñó anteriormente para el vector lambda. El rescate de los genes que codifican las cadenas Fd y kappa de anticuerpo está mediado por la utilización del origen de replicación f1 que conduce a la síntesis y encapsulación de la cadena positiva del vector en coinfección con fago auxiliar. Puesto que la partícula de virus "madura" se ensambla al incorporar la proteína de recubrimiento mayoritaria alrededor del ADN monocatenario a medida que pasa a través de la membrana interna al espacio periplásmico, no sólo captura la información genética portada en el vector fagémido, sino que incorpora también varias copias de Fab funcional a lo largo de la longitud de la partícula. En la infección posterior de células hospedadoras que portan el episoma F', el fagémido confiere resistencia que permite la selección de colonias en el antibiótico apropiado. En esencia, la unidad de reconocimiento de antígeno se ha unido a instrucciones para su producción.

No pudo utilizarse completamente toda la potencia del sistema combinatorio anterior puesto que el examen permitió un fácil acceso sólo a aproximadamente un 0,1-1% de los miembros. En el sistema fagémido/M13, se generan bibliotecas de tamaño similar y se accede a todos los miembros mediante selección por afinidad. Además, al contrario que el vector lambda que generaba Fab monovalentes, este sistema genera partículas multivalentes, permitiendo así la captura de un intervalo más amplio de afinidades.

Los sitios de restricción de fagémido únicos permiten la recombinación de las cadenas Fd y kappa, permitiendo el reemplazo o redistribución de cadena. El rescate del ADN monocatenario filamentoso permite una rápida secuenciación y análisis de la composición genética del clon de interés. Es más, puede concebirse que la especificidad del fago que codifica anticuerpo puede enriquecerse mediante selección de antígeno antes de la secuenciación o mutagénesis del ADN. La opción de desarrollar adicionalmente un proceso iterativo de mutación seguido de selección puede permitir la rápida generación de anticuerpos de alta afinidad a partir de secuencias de líneas germinales. El proceso puede automatizarse. Dejando de lado el potencial del sistema de imitar a la naturaleza, el sistema fagémido/M13 permitiría una disección más completa de la respuesta de anticuerpo en seres humanos que puede proporcionar útiles reactivos terapéuticos y de diagnóstico.

El anclaje a membrana de la cadena pesada y la compartimentalización de la cadena kappa en el periplasma es la clave para expresar esta proteína dimérica funcional. El potencial de este sistema no está limitado en modo alguno a los anticuerpos, y puede extenderse a cualquier sistema de reconocimiento de proteína o combinación de sistemas que contienen múltiples miembros. Por ejemplo, el acoplamiento de sistemas de ligando y efectos con una matriz de alta avidez es ahora posible. De modo similar, puede clasificarse una biblioteca de ligandos frente a una biblioteca de receptores.

6. Mutagénesis aleatoria de la región CDR3 de una cadena pesada que codifica anti-toxoide del tétanos a. Mutagénesis por PCR con oligonucleótidos degenerados

Para obtener un heterodímero mutagenizado de esta invención de especificidad alterada que no reconocería ya un antígeno de toxoide del tétanos (TT), pero que reconocería y se uniría específicamente a un nuevo antígeno, se desarrolló un procedimiento para aleatorizar sólo la región CDR3 de un fragmento de cadena pesada codificado por una secuencia nucleotídica conocida. Este enfoque se expone en un diagrama esquemático en la Figura 12, en la que se somete un fragmento de cadena pesada representativo en un clon fagémido, constituido por regiones estructurales alternadas (1 a 4) mostradas por bloques blancos y regiones determinantes de la complementariedad (CDR) (1 a 3) mostradas por bloques rayados y la primera región constante (CH1), a dos rondas separadas de PCR. En la primera reacción de amplificación por PCR, se amplifica el extremo 5' de la cadena pesada que empieza en la región estructural 1 y se extiende hasta el extremo 3' de la región estructural 3. En la segunda reacción de amplificación por PCR, la región CDR3 se mutageniza aleatoriamente, mostrado por la caja negra. Esto se realiza mediante el uso de una combinación de cebadores oligonucleotídicos sintetizados con una región degenerada situada entre y contigua a las secuencias de las regiones estructurales conservadas 3 y 4. Los productos de amplificación resultantes de la segunda amplificación, que tiene cada uno una región CDR3 aleatorizada, tienen su extremo 5' en el extremo 3' de la región estructural 3 y el extremo 3' del producto se extiende hasta el extremo 3' de la región CH1.

La combinación de cebadores oligonucleotídicos degenerados se ha diseñado para dar como resultado la amplificación de productos que tienen un extremo 5' que es complementario y se superpone con el extremo 3' de los productos de la primera reacción PCR. Por tanto, los dos productos de reacción PCR separados se combinan y se someten a una tercera reacción PCR en la que la región superpuesta entre los dos productos se extiende para dar como resultado la cadena pesada que tiene una región CDR3 aleatorizada.

Estaba disponible un molde de ADN de cadena pesada para uso en esta invención en un clon (un vector fagémido designado 7E que contiene fragmentos de cadena pesada y ligera) a partir de una biblioteca combinatoria humano de Fab anti-toxoide del tétanos (TT) derivada de bibliotecas de lambda Hc2 y Lc2 como se describe por Persson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 (1991). Para crear una biblioteca combinatoria semisintética, se construyó el clon 7E en el vector de expresión dicistrónico pComb2-3' para la expresión de una proteína de fusión de anclaje a membrana de cpIII de cadena pesada (Fd-cpIII) y una cadena ligera soluble como se describe para anti-NPN en el ejemplo 2k por Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991).

Se preparó el vector fagémido pComb2-3' como se describe en el ejemplo 1b(ii). Se mantuvo el apareamiento original de las cadenas pesada y ligera del clon lambda 7E mediante ligamiento del fragmento Xho I - Xba I en un vector pComb2-3' digerido con Xho I - Xba I. Para reemplazar la secuencia de anclaje a membrana de cpIII, se ligaron la secuencia promotora LacZ y la secuencia líder pelB eliminada por la digestión con Xho I - Xba I, un fragmento Spe I - Sac I de pComb3 como se prepara en el ejemplo 1b(u), al vector pComb2-3' que contiene las secuencias de cadena pesada y ligera del clon 7E. El clon fagémido resultante, en adelante deseando en la presente memoria como pC3-TT7E, se expresó primero como se describe para heterodímeros anti-NPN en superficies de fago en el ejemplo 3, y se examinó posteriormente mediante selección en placas recubiertas con TT como se describe para anti-NPN en el ejemplo 4c. El clon pC3-TT7E exhibía una K_{d} hacia TT del orden de 10^{-7} M y estaba enriquecido 1000 veces frente al fago no específico como se describe por Barbas et al., anteriormente.

El clon pC3-TT7E, que tiene ambas secuencias de cadena pesada y ligera, se utilizó como ADN molde para la mutagénesis aleatoria de la región CDR3 de la cadena pesada para alterar la especificidad de unión a antígeno como se describe en la presente memoria. Se determinó la secuencia de la cadena pesada como se describe en el ejemplo 1a(ii). Se realizaron dos reacciones PCR separadas como se ilustra en la Figura 12.

La primera reacción PCR dio como resultado la amplificación de la región del fragmento de cadena pesada en el clon pC3-TT7E que empieza por la región estructural 1 y se extiende hasta el extremo de la región estructural 3, que está localizada 5' a CDR3, que es de aproximadamente 400 pares de bases de longitud. Para amplificar esta región, se utilizaron los pares cebadores siguientes. El cebador oligonucleotídico sin sentido 5', FT3X, que tiene la secuencia nucleotídica 5'-G-CAA-TAA-ACC-CTC-ACT-AAA-GGG-3' (SEC Nº ID 118), hibridó con la cadena de no codificación de la cadena pesada correspondiente a la región 5' y que incluye el inicio de la región estructural 1. El cebador oligonucleotídico con sentido 3', B7EFR3, que tiene la secuencia nucleotídica 5'-TCT-CGC-ACA-ATA-ATA-CAC-GGC-3' (SEC Nº ID 119), hibridó con la cadena de codificación de la cadena pesada correspondiente al extremo 3' de la región estructural 3. Los cebadores oligonucleotídicos se sintetizaron por Research Genetics (Huntsvile, AL). La reacción PCR se realizó en una reacción de 100 \mul que contenía 1 \mug de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos FTX3 y B7EFR3, 8 \mul de dTNP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 2,5 mM, 1 \mul de polimerasa Taq, 10 ng de molde pCE-TT7E y 10 \mul de tampón PCR 10 x adquirido comercialmente (Promega Biotech). Se dispusieron dos gotas de aceite mineral en la parte superior de la mezcla y se realizaron 35 rondas de amplificación por PCR en un termociclador. El ciclo de amplificación consistió en desnaturalizar a 94ºC durante un minuto, asociar a 50ºC durante 1 minuto, seguido de extensión a 72ºC durante dos minutos. Los productos de amplificación por PCR resultantes se purificaron después en gel como se describe en el ejemplo 1d y se utilizaron en una reacción PCR de extensión por superposición con los productos de la segunda reacción PCR, ambos como se describen a continuación, para recombinar los dos productos en cadenas pesadas reconstruidas que contienen regiones CDR3 mutagenizadas como se ilustra en la Figura 12. El rendimiento total de ADN de esta amplificación fue de aproximadamente 3 \mug/100 \mul.

La segunda reacción PCR dio como resultado la amplificación de la cadena pesada desde el extremo 3' de la región estructural 3 extendiéndose hasta el extremo de la región CH1, que es de aproximadamente 390 pares de bases de longitud. Para amplificar esta región, se utilizaron los siguientes cebadores. La combinación de cebadores oligonucleotídicos sin sentido 5', designada 7ECDR3, tenía la secuencia nucleotídica representada por la fórmula 5'-GTG-TAT-TAT-TGT-GCG-AGA-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-TGG-GGC-CAA-GGG-ACC-ACG-3', en la que N puede ser A, C, G o T y S es C o G (SEC Nº ID 120), en la que el extremo 5' de la combinación de cebadores era complementario del extremo 3' de la región estructural 3 representada por la secuencia nucleotídica complementaria del cebador oligonucleotídico B73FR3, y el extremo 3' de la combinación de cebadores era complementario del extremo 5' de la región estructural 4. La región entre los dos extremos especificados de la combinación de cebadores se representó por una degeneración NNS de 48 unidades que codificaba en última instancia una diversa población de regiones CDR3 mutagenizadas de 16 residuos aminoacídicos de longitud. El cebador oligonucleotídico con sentido 3', CG1Z, como se describe por Persson et al., anteriormente, que tiene la secuencia nucleotídica 5'-GCATGTACTAGTTTTGTCACAAGATTTGGG-3' (SEC Nº ID 121), hibridó con la cadena de codificación de la cadena pesada correspondiente al extremo 3' de CH1. La segunda reacción PCR se realizó en pC3-TT7E en una reacción de 100 \mul como se describe anteriormente, que contiene 1 \mug de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos 7EECDR3 y CG1Z. Los productos de amplificación por PCR resultantes se purificaron después en gel como se describe anteriormente. El rendimiento total del ADN de esta segunda amplificación con mutagénesis por PCR fue de aproximadamente 3 \mug/100 \mul.

Se mezclaron después 100 nanogramos de productos purificados en gel de la primera y segunda reacciones PCR con 1 \mug de cada cebador oligonucleotídico FTX3 y CG1Z como par cebador en una reacción PCR final para formar un fragmento de cadena pesada completa mediante extensión de superposición como se ilustra en la Figura 12. La mezcla de reacción PCR contenía también 10 \mul de tampón PCR 10 x, 1 \mul de polimerasa Taq y 8 \mul de dNTP 2,5 mM como se describe anteriormente. Se realizó la reacción PCR como se describe anteriormente. Para obtener cantidades suficientes de producto de amplificación, se realizaron 15 reacciones PCR idénticas. Los fragmentos de cadena pesada resultantes que empiezan en la región estructural 1 y se extienden hasta el extremo de CH1 y tienen regiones CDR3 mutagenizadas aleatoriamente tenían aproximadamente 790 pares de bases de longitud. Los productos de amplificación del fragmento de cadena pesada de las 15 reacciones se combinaron primero y se purificaron después en gel como se describe anteriormente antes de su incorporación a una biblioteca de fagémido. El rendimiento total de ADN de cada amplificación fue de aproximadamente 3 \mug/100 \mul, por tanto el rendimiento combinado total contenía aproximadamente 45 \mug de cadena pesada mutagenizada amplificada.

b. Construcción de biblioteca de fagémido

Se digirieron después los fragmentos de cadena pesada purificada en gel resultantes preparados en el ejemplo 6a con las enzimas de restricción Xho I y Spe I, como se describe en el ejemplo 2d. Los fragmentos de cadena pesada digerida resultantes se purificaron en gel posteriormente antes de la inserción en el clon vector fagémido pC3-TT7E, que se digirió previamente con las mismas enzimas de restricción para retirar el fragmento de cadena pesada no mutagenizado y formar un vector lineal. El ligamiento de 640 ng de fragmentos Xho I - Spe I de cadena pesada que tienen regiones CDR3 mutagenizadas en 2 \mug de vector fagémido pC3-TT7E linealizado para formar vectores circularizados que tienen regiones CDR3 mutagenizadas se realizó durante una noche a temperatura ambiente utilizando 10 unidades de ligasa BRL (Gaithersburg, MD) en tampón ligasa BRL en un volumen de reacción de 150 \mul. Se realizaron cinco reacciones de ligamiento separadas para aumentar el tamaño de la biblioteca de fagos que tienen regiones CDR3 mutagenizadas. Por tanto, la cantidad total de cadena pesada mutagenizada amplificada para cinco reacciones de ligamiento fue de 3,2 \mug. Después de las reacciones de ligamiento, se precipitó el ADN circularizado a -20ºC durante 2 horas mediante la mezcla de 2 \mul de glicógeno 20 mg/ml, 15 \mul de acetato de sodio 3 M a pH 5,2 y 300 \mul de etanol. Se sedimentó después el ADN mediante centrifugación a 4ºC durante 15 minutos. Se lavó el sedimento de ADN con etanol frío al 70% y se secó a vacío. Se resuspendió el sedimento en 10 \mul de agua y se transformó mediante electroporación en 300 \mul de células XL1-Blue de E. coli como se describe en el ejemplo 2k, formando una biblioteca de fagos. El rendimiento total del procedimiento de mutagénesis y transformación descrito en la presente memoria fue de aproximadamente 5 x 10^{7} transformantes. Las células XL1-Blue de E. coli se seleccionaron como hospedadores, ya que se suprime el codon TAG de una etapa.

Después de la transformación, para aislar el fago en el que se ha inducido la expresión de heterodimero para selección por afinidad posterior en antígenos diana tales como fluoresceína, se mezclaron 3 ml de medio SOC (se preparó SOC mezclando 20 g de triptona Bacto, 5 g de extracto de levadura y 0,5 g de NaCl en 1 litro de agua, se ajustó el pH a 7,5 y se mezcló con 20 ml de glucosa justo antes del uso para inducir la expresión del heterodímero Fd-cpIII y cadena ligera), y se agitó el cultivo a 220 rpm durante 1 hora a 37ºC, después de dicho tiempo se añadieron 10 ml de SB (se preparó SB mezclando 30 g de triptona, 20 g de extracto de levadura y 10 g de tampón MOPS por litro, ajustando el pH a 7) que contenían carbenicilina 20 \mug/ml y tetraciclina 10 \mug/ml, y se agitó la mezcla a 300 rpm durante 1 hora adicional. Esta mezcla resultante se mezcló con 100 ml de SB que contenían carbenicilina 50 \mug/ml y tetraciclina 10 \mug/ml, y se agitó durante 1 hora, después de dicho tiempo se mezcló el fago auxiliar VCSM13 (10^{12} ufp) y se agitó la mezcla durante 2 horas adicionales. Desppués de este tiempo, se mezcló canamicina 70 \mug/ml y se mantuvo a 30ºC durante una noche. La menor temperatura dio como resultado una mejor incorporación de heterodímero a la superficie del fago. Se eliminó el sobrenadante mediante centrifugación (4000 rpm durante 15 minutos en un rotor JA10 a 4ºC). Se precipitó el fago mezclando polietilenglicol 8000 al 4% (p/v) y NaCl al 3% (p/v) y se mantuvo en hielo durante 30 minutos, seguido de centrifugación (9000 rpm durante 20 minutos en un rotor JA10 a 4ºC). Se resuspendieron los sedimentos de fago en 2 ml de PBS y se microcentrifugaron durante 3 minutos para sedimentar los residuos, se transfirieron a tubos nuevos y se almacenaron a -20ºC para examen posterior como se describe a continuación.

Para determinar la titulación de las unidades formadoras de colonia (ufc), se diluyeron los fagos (fagémidos encapsulados) en SB y se utilizó 1 \mul para infectar 50 \mul de células XL1-Blue de E. coli recientes (DO_{600} =1) crecidas en SB que contenía tetraciclina 10 \mug/ml. Se mantuvieron fagos y células a temperatura ambiente durante 15 minutos y después se sembraron directamente en placas de LB/carbenicilina.

c. Selección de heterodímeros anti-fluoresceína en superficies de fago 1) Selecciones por afinidad múltiples de biblioteca de fagos que tienen regiones CDR3 mutagenizadas

Se seleccionó por afinidad la biblioteca de fago producida en el ejemplo 6b que tiene fragmentos de cadena pesada con regiones CDR3 mutagenizadas como se describe en la presente memoria en una placa de microvaloración recubierta con un conjugado de fluoresceína-BSA 50 \mug/ml para examinar los heterodímeros anti-fluoresceína. Se conjugó la fluoresceína con BSA según los procedimientos descritos en "Antibodies: A Laboratory Manual", ed. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

El procedimiento de selección por afinidad utilizado fue una modificación del descrito originalmente por Parmley y Smith (Parmley et al., Gene, 73: 30-5-318). Se recubrieron dos de los cuatro pocillos de una placa de microvaloración (Costar 3690) durante una noche a 4ºC con 25 \mul de antígeno TT 50 \mug/ml preparado anteriormente en bicarbonato 0,1 M, pH 8,6. Se lavaron los pocillos dos veces con agua y se bloquearon rellenando completamente el pocillo con BSA al 3% (p/v) en PBS y manteniendo la placa a 37ºC durante 1 hora. Después de retirar con agitación la solución de bloqueo, se mezclaron 50 \mul de la biblioteca de fago preparada anteriormente (típicamente 10^{11} ufc) con cada pocillo, y se mantuvo la placa durante 2 horas a 37ºC.

Se retiraron los fagos y se lavó la placa una vez con agua. Se lavó después cada pocillo diez veces con TBS/Tween (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,5%) durante un periodo de una hora a temperatura ambiente, consistiendo el lavado en pipetear dentro y fuera para lavar el pocillo, permitiendo cada vez que el pocillo permanezca completamente lleno con TBS/Tween entre lavados. Se lavó la placa una vez más con agua destilada y se eluyó el fago adherente mediante la adición de 50 \mul de tampón de elución (HCl 0,1 M, ajustado a pH 2,2 con glicina sólida, que contiene BSA 1 mg/ml) a cada pocillo, seguido de mantenimiento a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se pipeteó dentro y fuera el tampón de elución varias veces, se retiró y se neutralizó con 3 \mul de base Tris 2 M por 50 \mul de tampón de elución utilizado.

Se utilizó el fago eluido para infectar 2 ml de células XL1-Blue de E. coli recientes (DO_{600}= 1) durante 15 minutos a temperatura ambiente, después de dicho tiempo se mezclaron 10 ml de SB que contiene carbenicilina 20 \mug/ml y tetraciclina 10 \mug/ml. Se retiraron alícuotas de 20, 10 y 1/10 \mul del cultivo para sembrado para determinar el número de fagos (fagémidos encapsulados) que eluyeron de la placa. Se agitó el cultivo durante 1 hora a 37ºC, después de dicho tiempo se añadió a 100 ml de SB que contenía carbenicilina 50 \mug/ml y tetraciclina 10 \mug/ml y se agitó durante 1 hora. Se añadió después fago auxiliar VCSM13 (10^{12} ufp) y se agitó el cultivo durante 2 horas adicionales. Después de este tiempo, se añadió canamicina 70 \mug/ml y se incubó el cultivo a 37ºC durante una noche. Se repitió la preparación y selección por afinidad posterior de fagos como se describe anteriormente.

Después de cada ronda de selección por afinidad, se determinó el rendimiento porcentual de fago, siendo el % de rendimiento = (número de fagos eluidos/número de fagos aplicados) x 100. La relación de entrada inicial de fagos mediante titulación en placas selectivas, como se describe en el ejemplo 6b, se determinó que era de aproximadamente 10^{11} ufc para cada ronda de selección. La relación de salida final de fagos se determinó mediante la infección de 2 ml de células XL1-Blue en fase logarítmica como se describe anteriormente y sembrando alícuotas en placas selectivas.

Como alternativa para la elución con ácido, los fagos unidos a los pocillos de la placa de microvaloración se eluyeron mezclando con 50 \mul de una solución de fluoresceína 10^{-5} M diluida en PBS, seguido de un periodo de mantenimiento de 1 hora a 37ºC. Se pipeteó después la solución dentro y fuera para lavar las células. Se transfirió el eluido resultante a 2 ml de células XL1-Blue de E. coli recientes para infección como se describe anteriormente, para preparar fagos y posterior selección por afinidad. En las rondas posteriores de selección por afinidad, se eluyeron los fagos con fluoresceína 10^{-6} M.

Los resultados de la cantidad de fago que se unía específicamente a pocillos recubiertos con fluoresceína durante cuatro rondas consecutivas de selección por afinidad y elución con ácido o con fluoresceína sola se muestran a continuación en la Tabla 8. Se consiguieron rendimientos comparables de fagos que expresaban heterodímeros que se unían específicamente a fluoresceína con cualquier protocolo de elución. Esto datos confirman que la mutagénesis de la región CDR3 como se describe en esta invención daba como resultado la alteración de un heterodímero que se une inicialmente específicamente a TT a uno de que se une específicamente a fluoresceína.

TABLA 8 Fago eluido

	Elución ácida	Elución con fluoresceína
Ronda 1	5,6 x 10^{5}/pocillo	4,7 x 10^{5}/pocillo
Ronda 2	4,6 x 10^{6}/pocillo	5,6 x 10^{5}/pocillo
Ronda 3	3,8 x 10^{5}/pocillo	1,4 x 10^{6}/pocillo
Ronda 4	1,3 x 10^{6}/pocillo	4,0 x 10^{6}/pocillo

La unión no específica a esta superficie con la fase de control variaba entre 10^{4} y 10^{5} fagos por pocillo. La producción de Fab soluble y la verificación de la unión a fluoresceína mediante ELISA como se describe en 2) a continuación reveló 8 clones reactivos de 60 seleccionados aleatoriamente de las colonias transformadas, y 38 clones reactivos de 40 seleccionados aleatoriamente de las colonias transformadas para las bibliotecas eluida con ácido y eluida con fluoresceína, respectivamente.

2) Preparación de heterodímeros solubles para caracterizar la especificidad de unión a fluoresceína

Para caracterizar adicionalmente la especificidad de los heterodímeros mutagenizados expresados en la superficie del fago como se describe anteriormente, se prepararon heterodímeros Fab solubles de ambos fagos eluido con ácido y eluido con fluoresceína y se analizaron en ensayos ELISA en placas recubiertas con fluoresceína, mediante ELISA competitiva con concentraciones crecientes de fluoresceína-BSA soluble y también mediante ensayos de apagamiento de la fluorescencia. Estos últimos ensayos se realizaron como se describe en "Fluorescein Hapten: An Immunological Probe", ed. E.W. Voss, CRC Press, Inc., pág. 52-54, 1984.

Para preparar heterodímeros solubles, se aisló ADN de fagémido de clones positivos y se digirió con Spe I y Nhe I. La digestión con estas enzimas produjo extremos cohesivos compatibles. Se purificó en gel el fragmento de ADN de 4,7 kb que carece de la parte del gen III (agarosa al 0,6%) y se autoligó. La transformación de XL1-Blue de E. coli proporcionó un aislamiento de recombinantes que carecen del fragmento cpIII. Se examinó en los clones la retirada del fragmento cpIII mediante digestión con Xho I - Xba I, que debería proporcionar un fragmento de 1,6 kb. Se hicieron crecer los clones en 100 ml de SB que contiene carbenicilina 50 \mug/ml y MgCl_{2} 20 mM a 37ºC hasta alcanzar una DO_{600} de 0,2. Se añadió IPTG (1 mM) y se hizo crecer el cultivo durante una noche a 30ºC (el crecimiento a 37ºC proporciona sólo una ligera reducción del rendimiento de heterodímero). Se sedimentaron las células mediante centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos en un rotor JA10 a 4ºC. Se resuspendieron las células en 4 ml de PBS que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 34 \mug/ml y se lisaron mediante sonicación en hielo (2-4 minutos a 50% de rendimiento). Se sedimentó el residuo mediante centrifugación a 14.000 rpm en un rotor JA20 a 4ºC durante 15 minutos. Se utilizó directamente el sobrenadante para análisis ELISA como se describe a continuación y se almacenó a -20ºC. Para el estudio de un gran número de clones, cultivos de 10 ml proporcionaron suficiente heterodímero para análisis. En este caso, se realizaron las sonicaciones en 2 ml de tampón.

Se ensayaron mediante ELISA los heterodímeros solubles preparados anteriormente. Para este ensayo, se añadió 1 \mug/pocillo de solución de fluoresceína-BSA en pocillos individuales de una placa de microvaloración y se mantuvo a 4ºC durante una noche, permitiendo que la solución de proteína se adhiriera a las paredes del pocillo. Después del periodo de mantenimiento, se lavaron los pocillos una vez con PBS y después de ello se mantuvieron con una solución de BSA al 3% para bloquear los sitios no específicos en los pocillos. Se mantuvieron las placas a 37ºC durante 1 hora, después de dicho tiempo se invirtieron las placas y se agitaron para retirar la solución de BSA. Se añadieron después los heterodímeros solubles preparados anteriormente a cada pocillo y se mantuvieron a 37ºC durante 1 hora para formar productos de inmunoreacción. Después del periodo de mantenimiento, se lavaron los pocillos diez veces con PBS para retirar el anticuerpo soluble no unido y después se mantuvieron con un FAB secundario de cabra anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina diluido en PBS que contenía 1% de BSA. Se mantuvieron los pocillos a 37ºC durante 1 hora, después de lo cual se lavaron los pocillos diez veces con PBS, seguido de desarrollo con fosfato de p-nitrofenilo (PNPP).

Se analizaron después los heterodímeros inmunoreactivos como se determina en el ELISA anterior mediante ELISA competitivo para determinar la afinidad de los heterodímeros mutagenizados. Se realizó el ELISA como se describe anteriormente con concentraciones crecientes de fluoresceína-BSA soluble en el intervalo de concentraciones de 10^{-9} M hasta 10^{-5} M añadida en presencia de los heterodímeros solubles. Se consiguió la inhibición máxima de la unión a una concentración de antígeno libre 10^{-6} M con una inhibición semimáxima obtenida con antígeno libre de aproximadamente 10^{-7} M. Los anticuerpos expresados de todos los clones tenían constantes de disociación aproximadas (Kd) del orden de 10^{-7}a 10^{-8} M para conjugados de fluoresceína-BSA para ambas eluciones con fluoresceína y ácido. Se determinaron las Kd reales en ensayos de apagamiento de fluorescencia. Los anticuerpos expresados en fagos de clones después de la elución con fluoresceína tenían mayores afinidades por la fluoresceína, 10^{-7} M frente a 10^{-6} M de los anticuerpos eluidos con ácido. El clon original, 7E, no mostró apagamiento en los límites detectables del ensayo, sugiriendo una afinidad con la fluoresceína libre menor de 10^{-5} M. Las afinidades de los ligantes más fuertes de anticuerpos a fluoresceína (10^{-7} M) se aproximaron a la Kd media de la respuesta secundaria de ratones inmunizados ante la fluoresceína libre (10^{-7} M) como muestran Kranz et al., Mol. Immunol., 20: 1313-1322 (1983).

Por tanto, los heterodímeros mutagenizados de esta invención reconocieron específicamente y se unieron a la fluoresceína. Se realizaron experimentos adicionales para confirmar que los heterodímeros mutagenizados no reconocían ya el TT el que se unía originalmente el heterodímero no mutagenizado. Se realizaron también ensayos de apagamiento de fluorescencia para confirmar la especificidad de la unión de los heterodímeros mutagenizados. Los heterodímeros solubles preparados a partir de fagos que eluyeron con ácido o con fluoresceína sola fueron igualmente eficaces para unirse a fluoresceína mediante cualquiera de los enfoques anteriormente citados. La invención de la mutagénesis de la región CFE3 de la cadena pesada de un heterodímero descrita en la presente memoria dio así como resultado la alteración de la especificidad de unión de TT a fluoresceína.

d. Análisis de secuencia de heterodímeros anti-fluoresceína seleccionados

Se determinó la secuencia nucleotídica completa de la cadena pesada mutada de un número representativo de clones de unión a fluoresceína-BSA. No se observaron mutaciones inducidas por PCR fuera de la región CDR3. Las secuencias aminoacídicas predichas de la región CDR3 de cadena pesada se muestran en la Figura 13 con la correspondiente SEC Nº ID mostrada entre paréntesis. Siete clones recuperados del régimen de elución ácido no mostraron secuencia consenso. La falta de comportamiento sw consenso en los clones eluidos con ácido puede ser debida a su reconocimiento de un epítopo más complejo constituido por fluoresceína y BSA, y se refleja en las afinidades más dispares por fluoresceína y fluoresceína-BSA.

A la inversa, los clones aislados mediante elución con fluoresceína mostraron una alta selección de secuencias consenso. De los diez clones secuenciados, sólo se observaron tres secuencias diferentes. Todos los clones tenían un residuo de glicina en la posición de residuo aminoacídico 95 y un residuo de ácido aspártico en la posición 101. Las posiciones de residuos aminoacídicos están basadas en el sistema de numeración de Kabat como se describe en Kabat et al., en "Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services, (1987). Se utilizaron ambos codones posibles para codificar el residuo de glicina proporcionados por el protocolo de síntesis, en el que se produjeron todos los 32 posibles codones. En anticuerpos naturales, el residuo de ácido aspártico en la posición 101 desempeña habitualmente un papel estructural al formar un puente salino con un residuo de arginina en la posición 94 en la región estructural 3 (FR3). Por tanto, el proceso de selección artificial había reproducido una interacción de significado estructural que refleja la observada en el animal.

Además, nueve de los anticuerpos semisintéticos expresados de los diez clones contenían una secuencia triplete de serina-arginina-prolina cerca del centro del bucle directamente adyacente a, o a un residuo de, el lado amino-terminal de un residuo de arginina, aunque el uso de codones para dos de esos residuos era diferente. El clon F31 carecía de este motivo central. Todas las secuencias eran ricas en residuos de arginina que se codificaban mediante tres de los 32 posibles codones. La comparación de la aparición en las diez secuencias de CDR3 diferentes de arginina con leucina y serina, que estaban también codificadas por los tres posibles codones en la síntesis, reveló una relación de arginina-leucina-serina de 29:16:15. Este sesgo hacia la selección de arginina puede ser el resultado del carácter dianiónico de la fluoresceína.

El descubrimiento de que se utilizaron diferentes codones apoya la propuesta de que la selección clonal ocurrió al nivel de la unión antígeno-anticuerpo, y no debido a algún sesgo inesperado de la incorporación de nucleótidos al ADN.

7. Mutagénesis aleatoria de la región CDR3 de una cadena ligera que codifica anti-toxoide del tétanos a. Mutagénesis por PCR con oligonucleótidos degenerados

Siguiendo un procedimiento similar a la mutagénesis aleatoria de la cadena pesada como se describe en el ejemplo 6, se aleatorizó la región CDR3 de un fragmento de cadena pesada del clon fagémido específico anti-toxoide del tétanos pC3-TT7E para producir anticuerpos que tienen especificidad por la fluoresceína. Las amplificaciones por PCR se realizaron como se describe en el ejemplo 6a, con la excepción de los cebadores oligonucleotídicos utilizados en las reacciones.

La primera reacción PCR dio como resultado la amplificación de la región del fragmento de cadena ligera del clon pC3-TT7E desde el sitio 5' EcoR V del vector que se extiende hasta el extremo 3' de la región CDR3. Para amplificar esta región, se utilizaron los siguientes cebadores: el cebador oligonucleotídico 5' sin sentido, KEF, que tiene la secuencia nucleotídica 5'-GAATTCTAAACTAGCTAGTCG-3' (SEC Nº ID 126), hibridaba con la cadena de no codificación de la cadena ligera correspondiente al sitio EcoR V en el vector; el cebador oligonucleotídico con sentido 3', KV12B, que tiene la secuencia nucleotídica 5'-ATACTGCTGACAGTAATACAC-3' (SEC Nº ID 127), hibridaba con la cadena de codificación de la cadena pesada correspondiente al extremo 5' de CDR3. Se realizó la amplificación por PCR como se describe en el ejemplo 6a. Los productos de PCR resultantes se purificaron después en gel como se describe en el ejemplo 1d y se utilizaron en una reacción PCR de extensión por superposición con los productos de la segunda reacción PCR, ambos como se describen a continuación, para recombinar los dos productos en cadenas pesadas reconstruidas que contienen regiones CDR3 mutagenizadas como se ilustra en la Figura 12.

La segunda reacción PCR dio como resultado la amplificación de la cadena ligera desde el extremo 5' de la región CDR3 extendiéndose hasta el extremo de la región CH1. Para amplificar esta región, se utilizaron los siguientes cebadores. La combinación de cebadores oligonucleotídicos 5' sin sentido, designada KV5R, tenía la secuencia nucleotídica representada por la fórmula 5'-TATTACTGTCAGCAGTATNNKNNKNNKNNKNNKACTTTCGGCGGAGGGACC-3' (SEC Nº ID 128) en la que N puede ser A, C, G o T y en la que K es G o T, en la que el extremo 5' de la combinación cebadora era complementario del extremo 5' de CDR3 y el extremo 3' de la combinación cebadora era complementario del extremo 3' de CDR3 y del extremo 5' de la región estructural 4. La región entre los dos extremos especificados de la combinación cebadora se representó por una degeneración de 15 unidades que codificaba en última instancia una población diversa de regiones CDR3 mutagenizadas internas de 5 aminoácidos de longitud rodeada por los extremos 5' y 3' no mutagenizados de las regiones CDR3. El cebador oligonucleotídico 3' con sentido, T7B, que tiene la secuencia nucleotídica 5'-AATACGACTCACTATAGGGCG-3' (SEC Nº ID 129), hibridó con la cadena de codificación de la cadena ligera correspondiente a la región T7 en el vector. Se realizó la segunda reacción PCR en pC3-TT7E como se describe en el ejemplo 6a con los cebadores KV5R y T7B. Los productos de amplificación por PCR resultantes se purificaron después en gel como se describe anteriormente.

Se mezclaron después 500 nanogramos de productos purificados en gel de la primera y segunda reacciones PCR con 1 \mug de cada uno de los cebadores oligonucleotídicos KEF y T7B como par cebador en una reacción PCR final para formar un fragmento de cadena ligera completa mediante extensión por superposición como se ilustra en la Figura 12. Se realizó la amplificación por PCR como se describe en el Ejemplo 6a. Para obtener suficiente cantidad de producto de amplificación, se realizaron 5 reacciones PCR idénticas. Los fragmentos de cadena ligera resultantes, que empezaban en el sitio 5' EcoR V y se extendían a la región T7, tenían CDR3 con cinco aminoácidos internos mutagenizados aleatoriamente.

b. Construcción de biblioteca de fagémidos

Se digirieron después los fragmentos de cadena ligera purificados en gel resultantes preparados en el ejemplo 7a con las enzimas de restricción Sac I y Xba I, como se describe en el ejemplo 2d. Los fragmentos de cadena ligera resultantes se purificaron posteriormente en gel antes del ligamiento en el clon de vector fagémido pC3-TT7E, que se había digerido previamente con las mismas enzimas de restricción para retirar el fragmento de cadena ligera no mutagenizado y formar un vector linealizado. El ligamiento de 450 ng de productos de amplificación de cadena ligera en 1,4 \mug de vector fagémido pC3-TT7E linealizado para formar vectores circularizados que tienen regiones CDR3 mutagenizadas se realizó como se describe en el ejemplo 6b. Se realizaron cinco reacciones de ligamiento separadas para aumentar el tamaño de la biblioteca de fagos que tienen regiones CDR3 mutagenizadas internamente. Después de las reacciones de ligamiento, se precipitó el ADN circularizado y se transformó en XL1-Blue de E. coli como se describe en el ejemplo 6b, formando una biblioteca de fagos. El rendimiento total del procedimiento de mutagénesis y transformación descrito en la presente memoria fue de aproximadamente 2 x 10^{7} transformantes. Se aislaron los fagos como se describe para los transformantes de mutagénesis de la cadena pesada.

c. Selección de heterodímeros anti-fluoresceína en superficies de fagos y análisis de secuencia de anticuerpos seleccionados

Se seleccionó por afinidad la biblioteca de fagos producida en el ejemplo 7b que tiene fragmentos de cadena ligera con cinco aminoácidos mutagenizados internamente en la región CDR3 como se describe en el ejemplo 6c. Los números de fagos que se unieron específicamente a pocillos recubiertos con fluoresceína durante tres rondas consecutivas de selección por afinidad y elución de hapteno con una entrada de fagos de 10^{11} fueron 0,75 x 10^{6}, 1 x 10^{6} y 2,4 x 10^{7}. Los ciclos repetidos de transformación, preparación de fagos, selección por afinidad y elución dieron por tanto como resultado un enriquecimiento significativo de heterodímeros que se unen específicamente a la fluoresceína. Se prepararon Fab solubles como se describe en el ejemplo 6b2 para caracterizar la especificidad de unión a fluoresceína. Se seleccionaron 7 clones para análisis de secuencia como se describe en el ejemplo 6d. Los resultados del análisis de secuencia se muestran en la Figura 14. La región mutada de CDR3 de la cadena ligera se extiende por las posiciones aminoacídicas de la cadena ligera de inmunoglobulina de Kabat de 92 a 96. La secuencia de esta región del clon de partida, pC3-TT7E, era Gly-Ser-Ser-Leu-Trp (SEC Nº ID 148). De los siete anticuerpos mutados y seleccionados con fluoresceína, cinco de ellos de los clones P2, P21, P23, P28 y P19 tenían la secuencia aminoacídica Thr-Arg-Pro-Gly-Val (SEC Nº ID 149), pero cada uno era el resultado de traducciones de secuencias nucleotídicas únicas. Los dos anticuerpos restantes de los clones P15 y P11, derivados de secuencias nucleotídicas únicas, tenían también secuencias aminoacídicas únicas. Por tanto, puesto que la mayoría de las cadenas ligeras mutagenizadas tenía la misma secuencia aminoacídica codificada por los posibles codones en la síntesis, el proceso de selección artificial ha reproducido una interacción de significado estructural que en el animal era el resultado de un proceso de selección natural.

La mutagénesis de las regiones CDR no está limitada a la región CDR3, ya que los cebadores pueden diseñarse para dar como resultado la mutagénesis aleatoria de CDR1 y CDR2 de ambas cadenas pesada y ligera. Mutar las seis regiones CDR daría como resultado una biblioteca excepcionalmente diversa más allá de la que puede obtenerse en el animal. Para obtener aleatorización en todas las CDR, las CDR de cadena pesada podrían aleatorizarse primero a partir de un clon de partida seguido de selección de los mejores ligantes a anticuerpos. Podría realizarse una segunda etapa de mutagénesis en las CDR de la cadena ligera y la biblioteca resultante puede mezclarse con los ligantes a cadena pesada seleccionados. Como alternativa, todas las CDR podrían aleatorizarse simultáneamente dando como resultado bibliotecas de cadena pesada y ligera que se combinan después y se someten a selección frente a un antígeno preseleccionado.

Por tanto, los ejemplos 6 y 7 ilustran un procedimiento de relevancia para la presente invención para mutagenizar las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera de un gen de inmunoglobulina, e ilustran también oligonucleótidos útiles para ello.

8. Selección in vitro y maduración de afinidad de anticuerpos a partir de una biblioteca combinatoria de inmunoglobulina no tratada

Se ha utilizado el enfoque de biblioteca combinatoria de inmunoglobulina para obtener anticuerpos monoclonales de ratones adultos no inmunes, estableciendo así los principios de (i) acceder a bibliotecas combinatorias de anticuerpos no tratados para especificidad predeterminadas y (ii) aumentar la afinidad de los sitios de unión a anticuerpos seleccionados mediante mutagénesis aleatoria. Se preparó una biblioteca combinatoria Fab que expresa fragmentos de Ig\mu y cadena ligera k en la superficie de fagos filamentosos a partir de médula ósea de ratones Balb/C adultos no inmunizados con el vector pComb8 de presentación multivalente preparado en el ejemplo 1b(i). Se aislaron fagos que presentan Fab de baja afinidad que tienen constantes de unión de aproximadamente 10^{4} a 10^{5} M^{-1} específicas para la progesterona a partir de la biblioteca por su capacidad de unirse al hapteno. Se realizó la mutagénesis aleatoria de regiones variables de cadena pesada y ligera expresadas en el vector pComb3 de presentación de fago monovalente mediante PCR con tendencia al error. Se seleccionaron posteriormente clones con afinidad mejorada por la progesterona. Por tanto, como se describe en la presente memoria, se seleccionaron anticuerpos con características deseables de una fuente no inmune y se consiguió la maduración de afinidad utilizando los vectores gemelos pComb8 y pComb3, abriendo así la ruta para la obtención de anticuerpos específicos de una biblioteca genérica y evitando la inmunización.

La invención descrita en la presente memoria tiene tres rasgos esenciales: (i) la capacidad de acceder inicialmente a Fab de baja afinidad a partir de una biblioteca no tratada mediante el uso de sistemas de expresión de fago multivalentes, (ii) la maduración de afinidad posterior mediante PCR con tendencia al error y (iii) el uso de un constructo monocatenario durante el proceso de maduración para evitar un alto fondo de unión de artefacto debido a la pérdida de la cadena ligera. Cuando se utilizaron concertadamente, estos procedimientos permitieron la selección y maduración de afinidad de anticuerpos a partir de una biblioteca no tratada.

a. Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc

Se utilizaron tres ratones adultos Balb/cByJ macho no inmunizados (6 meses) (colonia de cepa Scripps) para preparar 5 x 10^{7} células de médula ósea en suero de ternero fetal al 4% en PBS. Para agotar las células positivas de IgG de superficie, se mantuvo la preparación con IgG_{2b} de rata anti-ratón (0,1 ml), IgG de cabra anti-ratón (0,1 ml) e IgG_{2b} de conejo anti-ratón (0,1 ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se sedimentaron las células, se lavaron con PBS y se resuspendieron en 9 ml de PBS. Se añadió complemento de conejo (1 ml) y se mantuvo a 37ºC durante 30 minutos. Se sedimentaron las células y se aisló el ARN total como se describe en el ejemplo 2b. Se utilizó el ARN total como molde para la síntesis de ADNc de las cadenas \mu y k con los siguientes cebadores: Ig\mu, 5'-ATTGGGACTAGTTTCTGCGACAGCTGGAAT-3' (SEC Nº ID 151) (la secuencia del sitio de restricción Spe I está subrayada) y k, 5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3' (SEC Nº ID 152) (la secuencia del sitio de restricción Xba I está subrayada), respectivamente, utilizando el kit Superscript (BRL).

Brevemente, se mezclaron 7 \mug de ARN total con 60 pmol de cebador, se calentaron a 70ºC durante 10 minutos y se enfriaron inmediatamente en hielo. Se mezclaron 2 \mul de inhibidor de ARNasa, 10 \mul de tampón de síntesis 5 x, 8 \mul de mezcla de dNTP (para proporcionar una concentración final 200 \muM de cada NTP), 5 \mul de DTT 0,1 M y 1 \mul de BRL Superscript RT (200 U/\mul), y la reacción se completó hasta 50 \mul con agua tratada con DEPC. Se permitió proceder la reacción a temperatura ambiente durante 10 minutos y después a 42ºC durante 50 minutos. Se terminó la reacción manteniéndola a 90ºC durante 5 minutos y disponiéndola después en hielo durante 10 minutos, seguido de mezcla con 1 \mul de ARNasa H y mantenimiento a 37ºC durante 20 minutos. Se realizó la amplificación por PCR en una mezcla de reacción de 100 \mul como se describe en el ejemplo 2, utilizando V_{H}1-9 y el cebador de cadena \mu para las cadenas pesadas y V_{L} 3-7 y los cenadores de cadena k para las cadenas ligeras, como se muestra en la Tabla 5.

b. Construcción de biblioteca de inmunoglobulina \mu/k no tratada

Se escindió ADN de cadena \mu y cadena k amplificado por PCR con Xho I - Spe I y Sac I - Xba I, respectivamente. Se insertaron los fragmentos Xho I -Spe I de cadena \mu resultantes en el vector fagémido pComb8 preparado en el ejemplo 1b(i) para generar una biblioteca de fusión cadena \mu-cpVIII. Se llevaron a cabo la transformación en XL1-Blue de E. coli y la producción de fagos esencialmente como se describe en el ejemplo 6. Posteriormente, se clonaron fragmentos Sac I- Xba I de cadena ligera k en la biblioteca de fusión de cadena pesada F_{d}\mu-cpVIII.

Se estableció una biblioteca combinatoria de 5 x 10^{6} miembros clonando posteriormente los fragmentos F_{d} de Ig\mu y cadena ligera k en el vector pComb8, lo que permitió la fusión del fragmento F_{d} de cadena pesada con cpVIII. Puesto que los fragmentos de anticuerpo Fab se presentaron a un alto número de copias en la superficie del fago, se seleccionó este vector para acceder a anticuerpos de baja afinidad, que se espera encontrar en un repertorio no seleccionado y no cebado.

c. Selección de anticuerpos de baja afinidad específicos para progesterona

Se encapsularon los fagémidos recombinantes preparados anteriormente en partículas de fago M13 y se realizaron cinco rondas de selección por afinidad en pocillos ELISA recubiertos con progesterona-3-(O-carboximetil)oxima-BSA como se describe en el ejemplo 6. Brevemente, se recubrieron pocillos de una placa de microvaloración a 4ºC con 50 \mul de conjugado de progesteron-3-(O-carboximetil)oxima-BSA 100 \mug/ml (Sigma nº P4778 en PBS. Se lavaron dos veces los pocillos con agua y se bloquearon rellenando completamente con BSA al 1% p/v en PBS, y manteniendo las placas a 37ºC durante 1 hora. Se eliminó rápidamente la solución de bloqueo y se añadieron 50 \mul de la biblioteca de fagos (típicamente 10^{11} ufc) en PBS-BSA (0,1% p/v) a cada pocillo, y las placas se mantuvieron durante 2 horas a 37ºC. Se realizaron las etapas de lavado, elución y multiplicación de los fagos esencialmente como se describe en el ejemplo 6a1.

Se analizó en los fagos eluidos después de la primera y tercera rondas la expresión de Fab anti-progesterona mediante la transferencia de colonias bacterianas como se describe en el ejemplo 2f. Se ensayó en las colonias la unión a progesterona con un conjugado progesterona-3-(O-carboximetil)oxima-HRP. Se desarrollaron los filtros utilizando 4-cloronaftol. Se tuvo cuidado de excluir artefactos causados por fagémidos que expresan la fusión Fd de Ig\mu-cpVIII sin una correspondiente cadena ligera. Estos fagos de sólo cadena pesada reaccionaron no específicamente con antígenos no relacionados tales como BSA, HRP, lisozima de huevo de gallina, presumiblemente debido al parche hidrófobo presentado en una cadena pesada no apareada.

Aquellas colonias que producían la señal más fuerte en la transferenciaWestern se examinaron posteriormente, y se aislaron tres clones, PgA11, PgB6 y PgF1 para análisis posterior. Los dos primeros emergieron de la primera ronda de selección por afinidad, y el último se aisló después de la tercera ronda de selección por afinidad. Los tres Fab, producidos en su forma soluble como se describe en el ejemplo 6c2, se unieron específicamente a progesterona-3-(O-carboximetil)oxima-BSA y a progesterona-11\alpha-hemisuccinilo-BSA. Adicionalmente, los tres Fab presentaron una reactividad cruzada significativa frente a un epítopo del citocromo C. Se determinó que sus constantes de unión aparentes para la progesteron-3-(O-carboximetil)oxima-BSA eran 10^{4} M^{-1} para PgA11, y 3 x 10^{4} M^{-1} y 10^{5} M^{-1} para PgF1 y PgB6, respectivamente. Estas constantes de unión eran mucho menores que las reseñadas para anticuerpos monoclonales anti-progesterona con afinidades de 2 a 5 x 10^{8} M^{-1}. Los clones PgB6 y PgF1 utilizaron la misma combinación de genes V_{H} y V_{L} estrechamente relacionados. Ambos genes V_{H} eran idénticos a dos genes de línea germinal estrechamente relacionados pero distintos, sin evidencia de mutación somática como se esperaría para un repertorio no tratado. El gen o genes reales de la línea germinal para sus genes V_{L} estrechamente relacionados no se conocen todavía. Puesto que ambos genes V_{H} se han unido a diferentes segmentos D y J, los clones PgB6 y PgF1 no pueden ser del mismo origen, pero deben haberse seleccionado de dos eventos de clonación independientes, apuntando a una posible importancia de esta combinación particular para la unión a progesterona. Los genes V_{L} y V_{H} utilizados por PgA11 no están estrechamente relacionados con los otros dos clones.

Por tanto, esto demostró que utilizando un vector de presentación multivalente pueden aislarse Fab de bibliotecas combinatorias no tratadas con afinidades comparables a las observadas para la respuesta inmune primaria ante haptenos, tales como fosforilcolina y nitrofenol. Además, el enfoque de biblioteca combinatoria puede proporcionar genes V o combinaciones de genes V que no se habrían seleccionado in vivo.

d. Maduración de afinidad mediante mutagénesis dirigida por PCR

Para imitar el proceso de mutación somática que conduce a la selección de anticuerpos con una mayor afinidad, se crearon mutaciones aleatorias en ambas regiones V_{L} y V_{H} y se seleccionaron posteriormente anticuerpos con una afinidad aumentada por el hapteno progesterona. Para orientar las mutaciones mediante PCR con tendencia al error específicamente y sólo a las regiones V, se construyó un plásmido de fusión monocatenario Fv-cpIII en un vector fagémido pComb2-3 que contenía fusiones en fase de los siguientes elementos: la secuencia líder pelB para secreción, los marcos de lectura V_{H} y V_{L} unidos con un oligonucleótido sintético que codificaba un péptido soluble como se discute en el ejemplo 6a, y el resto cpIII. El uso de un vector monocatenario supera además las dificultades debidas a la selección indeseada de unión no específica mediante fagos que expresan sólo cadenas pesadas de Ig.

Para preparar una fusión de cadena pesada y ligera monocatenaria (designada Fv) con el anclaje a membrana de cpIII se digirió el plásmido pComb2-3, preparado en el ejemplo 1b(ii), que tiene sólo un sitio de restricción Spe I, con las endonucleasas de restricción Xba I y Nhe I y se religó, eliminando así el módulo de clonación de cadena ligera. Se insertó un engarce de ADN sintético que codifica una secuencia aminoacídica de engarce constituida por dos oligonucleótidos, un cebador 5' sin sentido que tiene la secuencia nucleotídica 5'-TCGAGAAAGTCTCTAGAGGTAAATCTTCTGGTTCTGGTTCCGAATCTAAATCTACTGAGCTCAAAGTCA-3' SEC Nº ID 153) y un cebador 3' con sentido que tiene la secuencia nucleotídica 5'-CTAGTGACTTTGAGCTCAGTAGATTTAGATTCGGA-
ACCAGAACCAGAAGATTTACCTCTAGAGACTTTC-3' (SEC Nº ID 154) en el vector pComb2-3 truncado digerido con Xho I - Spe I, formando el fagémido ScpComb2-3. Se subrayan las secuencias de reconocimiento internas para las endonucleasas de restricción Xba I (TCTAGA) y Sac I (GAGCTC). Los segmentos V_{H} y V_{L} de los ligantes de progesterona se amplificaron después mediante PCR como se describe en el Ejemplo 2g en dos reacciones separadas.

En la primera amplificación por PCR, se utilizaron el cebador correspondiente a la SEC Nº ID 153 enumerada anteriormente y el oligonucleótido que tiene la secuencia nucleotídica 5'-ATTTGGGAAGGACTGTCTAGATGMRGAG-
AC-3' (SEC Nº ID 155), en la que M es A o C y R es A o G, para amplificar el fragmento de cadena pesada. El fragmento de cadena ligera se amplificó separadamente con el correspondiente cebador de SEC Nº ID 154 enumerado anteriormente y el oligonucleótido que tiene la secuencia nucleotídica 5'-GAGGACTAGTTACAGTTGGTGCAGCATCAG-3' (SEC Nº ID 156). Se subrayan las secuencias de reconocimiento interno para Xba I (TCTAGA) y Spe I (ACTAGT). Se digirieron los fragmentos PCR V_{H} y V_{L} con Xho I - Xba I y Sac I - Spe I, respectivamente, y se insertaron posteriormente en Scp-Comb2-3.

e. Expresión y detección de Fab solubles y anticuerpos de fusión monocatenarios específicos de progesterona

Para la producción de Fab, se escindió el resto del gen VIII en el fagémido que codifica los ligantes a progesterona PgA11, PgB6 y PgF1 con las endonucleasas de restricción Spe I y EcoR I, y posteriormente se reemplazó por un engarce sintético que codifica un codon de paro TAA (subrayado). Se formó el engarce mediante los oligonucleótidos 5'-CTAGTTAACTGAGTAAG-3' (SEC Nº ID 157) y 5'-AATTCTTACTCAGTTAA-3' (SEC Nº ID 158). Se realizó la producción y detección del fragmento de anticuerpo Fab esencialmente como se describe en el Ejemplo 6c2, excepto porque las células E. coli se desestabilizaron mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Para producir fragmentos de anticuerpo soluble, se escindieron las fusiones V_{H}-engarce-V_{L} del fagémido ScpComb2-3 con Xho I y Spe I y se subclonaron en el vector de expresión pTAC01 (Pharmacia), que es un derivado de pF1260. El vector pTAC01 tiene el promotor tac inducible, la secuencia líder pelB para secreción y permitió la fusión en fase del constructo de fusión monocatenario insertado con una secuencia decapeptídica como se describe en el Ejemplo 1a como marcaje para detección inmunoquímica. La expresión y detección de los fragmentos de anticuerpo de fusión monocatenarios fueron como se describe anteriormente, excepto porque se utilizó un anticuerpo anti-decapéptido conjugado con fosfatasa alcalina para el ELISA.

Se seleccionaron tres clones de fusión monocatenarios mediante el protocolo de examen y se designaron ScpComb2-3-PgF1, -PgB6 y -PgA11. Estos plásmidos resultantes se sometieron a mutagénesis por PCR con tendencia al error como se describe a continuación.

f. Mutagénesis dirigida de las cadenas pesada y ligera mediante PCR con tendencia al error

Se mezclaron cantidades iguales de los plásmidos ScpComb2-3 PgF1, PgB6 y PgA11 no digeridos preparados anteriormente y se diluyeron en serie. Se sometieron separadamente alícuotas de 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng y 0,01 ng de las mezclas a 35 ciclos (1 minuto a 94ºC, 2 minutos a 50ºC, 1 minuto a 72ºC) de amplificación en las siguientes condiciones de reacción: KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0), MgCl_{2} 6,5 mM, MnCl_{2} 0,5 mM, gelatina al 0,01%, Triton X-100 al 0,1%, 1 mM de cada dCTP, dGTP, dTTP, 0,2 mM de dATP, 0,1 mM de dITP, utilizando el cebador de secuenciación inversa de M13, 5'-AACAGCTATGACCATG-3' (SEC Nº ID 159) y un cebador inverso complementario del resto cpIII, 5'-GACAGGAGGTTGAGGCAGGT-3' (SEC Nº ID 160) 100 \muM. El procedimiento básico de PCR con tendencia al error se describió originalmente por Leung et al., J. Methods Cell. Mol. Biol., 1: 11-15 (1989). La región de ADN a mutagenizar se amplificó mediante PCR en condiciones que reducían la fidelidad de la síntesis de ADN mediante ADN polimerasa Taq. Como se muestra por Leung et al., anteriormente, las concentraciones de los reactivos MuCl_{2} y dATP utilizadas en las amplificaciones por PCR dieron como resultado una frecuencia de mutación de 1,0% y 1,4%, respectivamente. Por tanto, la frecuencia de mutación aumentó a medida que se redujo la concentración de dATP.

Las reacciones PCR de todas las diluciones de molde se combinaron y se trataron con fenol antes de la digestión con Xho I y Spe I. Se ligaron de nuevo los fragmentos de PCR purificados en gel y digeridos al plásmido ScpComb2-3 digerido con Xho I - Spe I. Los productos de ligamiento se sometieron a electroporación en XL1-Blue de E. coli dando lugar a 10^{6} transformantes. Las etapas posteriores de producción y selección de fagos se llevaron a cabo como se describe en el ejemplo 6, excepto porque los fagos se seleccionaron en ausencia de BSA.

Por tanto, se estableció una biblioteca de anticuerpos fagémidos monocatenarios anti-progesterona mutados, se seleccionaron por afinidad en progesteron-3-(O-carboximetil)oxima-BSA, y se tomó el número de ufc eluidas como una medida de la afinidad relativa de los anticuerpos monocatenarios presentados ante el hapteno. Después de la tercera ronda de selección por afinidad, se observó un aumento de 50 a 100 veces del rendimiento de los fagémidos diluidos respecto a la población no mutada. Los mutantes individuales mostraron un aumento de 10 a 300 veces de rendimiento después de la selección por afinidad, en comparación con los clones originales, indicando que los mutantes codificaban sitios de unión a anticuerpo con afinidad aumentada. Los cuatro mejores mutantes, designados ScPgB6-1, -2, -3 y -4, se eligieron para la determinación de su afinidad por el conjugado de hapteno y el análisis de secuencia.

g. Determinación de la afinidad de anticuerpos anti-progesterona de fusión monocatenarios mutagenizados

Se determinaron las constantes de unión de los fragmentos de anticuerpo soluble preparados a partir de los cuatro mejores mutantes, ScPgB6-1, -2, -3 y -4 elegidos anteriormente mediante ELISA competitivo como se describe en el Ejemplo 6c2. Brevemente, se recubrieron pocillos de una placa de microvaloración a 4ºC con 50 \mul de conjugado progesteron-3-(O-carboximetil)oxima-BSA 100 \mug/ml en PBS. Se lavaron dos veces los pocillos con agua y se bloquearon con BSA al 1% p/v en PBS a 37ºC durante 1 hora. Se mezclaron los sobrenadantes de fusión Fab o monocatenarios con progesteron-3-(O-carboximetil)oxima-BSA en PBS-BSA (al 0,1% p/v), y se mantuvieron los pocillos a 37ºC durante 2 horas. Se lavaron las placas con PBS-Tween (al 0,05% v/v) y se añadieron conjugado de cadena k-fosfatasa alcalina de cabra anti-ratón (Southern Biotech) o anticuerpos monoclonales antidecapeptídicos de ratón conjugados con fosfatasa alcalina y se mantuvieron durante 1 hora a 37ºC. Se lavaron las placas como anteriormente y se incorporó sustrato (0,1 ml, fosfato de p-nitrofenilo a 1 mg/ml en Tris 0,1 M, pH 9,4 que contenía MgCl_{2} 50 mM). Después de mantener a 25ºC durante 60-180 minutos, se leyó la absorbancia a 405 nm. Se determinaron las afinidades aparentes como el recíproco de la concentración de hapteno requerida para inhibir un 50% de la unión máxima en un ELISA competitivo. Esto era una buena aproximación a la afinidad y permitía la clasificación de las actividades de unión.

La afinidad de los anticuerpos Sc mutados por el progesteron-3-(O-carboximetil)oxima-BSA, como se determina por ELISA competitivo, había aumentado frente al anticuerpo ScPgB6 original en 30 veces para ScPgB6-1 y en aproximadamente 13 veces tanto para ScPgB6-3 como ScPgB6-4. De forma interesante, el clon con menos mutaciones exhibió la mayor afinidad. El patrón de reactividad cruzada para los anticuerpos Sc mutados no cambió, excepto porque ScPgB6-1 había perdido la mayoría de su reactividad por el citocromo C. En estudios extensos de respuestas inmunes ante haptenos, pudo asignarse un aumento de afinidad de un orden de magnitud a sustituciones aminoacídicas específicas, lo que implica que sólo uno o dos de los cambios aminoacídicos en el sitio de combinación de los anticuerpos Sc anti-progesterona puede haber dado cuenta de su afinidad aumentada por el conjugado de hapteno. Puesto que no se recuperó ningún mutante con sólo un cambio aminoacídico, no pudieron identificarse el residuo o residuos críticos que causaban la afinidad potenciada por el conjugado de hapteno. Además, no se observaron sustituciones aminoacídicas comunes a los tres mutantes que sugirieran que el cambio de diferentes residuos puede dar cuenta de la afinidad aumentada por la 3-(O-carboximetil)progesterona. Es común una sustitución Ser_{64} a Pro_{64} en la CDR2 de V_{H} en los mutantes ScPgB6-3 y ScPgB6-4. Aunque ambos mutantes mostraron una afinidad similar por el conjugado de hapteno, no puede evaluarse inequívocamente la importancia de ese residuo para la unión a antígeno, puesto que ocurrieron múltiples cambios aminoacídicos en las regiones V_{L} y V_{H} de los dos mutantes.

h. Secuenciación de ácido nucleico

Se determinaron las secuencias nucleotídicas completas de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera a partir de ADN bicatenario utilizando Sequenase 2.0 (United States Biochemical). La secuenciación de ADN reveló que los cuatro clones mutantes, ScPgB6-1, -2, -3 y -4, habían surgido de ScPgB6, siendo idénticos ScPgB6-1 y ScPgB6-2. El tipo predominante de mutación obtenida mediante este protocolo de PCR fue un cambio nucleotídico A-G/T-C (68%), mientras que los cambios T-G/A-C, G-A/C-T, T-A/A-T, G-C/C-G o C-A/G-T ocurrieron aproximadamente con la misma frecuencia. Se observaron secuencias de ADN con una frecuencia de mutación mayor de la media, concretamente puntos calientes de mutación. Además, los tres clones mutantes diferían en el número de cambios de pares de bases. Se encontró que las frecuencias de mutación para ambas regiones V_{H} y V_{L} eran 1,5% para ScPgB6-1, 2,1% para ScPgB6-3 y 4,1% para ScPgB6-4, que condujeron a múltiples sustituciones aminoacídicas en las CDR y regiones estructurales de los mutantes.

En resumen, esta invención es útil para la selección y maduración de afinidad de anticuerpos específicos de un hapteno a partir de una biblioteca no tratada. Aunque el sistema de selección y mutagénesis in vitro es bastante simple comparado con la complejidad del sistema inmune, existen algunos rasgos comunes: (i) la afinidad de los anticuerpos seleccionados a partir de una biblioteca combinatoria no tratada puede alcanzar el mismo orden de magnitud que los anticuerpos de una respuesta inmune primaria ante haptenos; (ii) aunque los mecanismos que generan mutaciones in vivo o in vitro fueron diferentes, se observaron puntos calientes de mutación; (iii) el aumento de afinidad después de una ronda de mutación y selección in vitro es del mismo orden de magnitud que el observado para la transición de respuestas inmunes primarias a secundarias ante haptenos; (iv) se recuperó un sitio de combinación de anticuerpo mutado con una reactividad cruzada alterada como se observa ocasionalmente in vivo.

Cuando el enfoque de anticuerpos combinatorios se describió por primera vez, era cuestionable si podría utilizarse para sondear eficazmente el vasto repertorio de anticuerpos in vivo. La presente invención muestra que puede accederse a y hacerse evolucionar combinaciones de cadenas de anticuerpos que no pueden seleccionarse nunca in vivo. Por tanto, parece que ahora es posible superar la diversidad de la respuesta de anticuerpo in vivo mediante técnicas de clonación molecular.

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Claims (33)

1. Un fago filamentoso que encapsula un genoma que codifica un primer y un segundo polipéptidos capaces de formar un receptor heterodimérico de unión a ligando, estando flanqueado dicho primer polipéptido por un dominio de señal de secreción procariótica amino-terminal y un dominio de anclaje a membrana de cpIII de fago filamentoso carboxi-terminal, y el segundo polipéptido está condensado con un dominio de señal de secreción procariótica amino-terminal.

2. Un fago filamentoso de la reivindicación 1, en el que dicho receptor es un complejo de unión a epítopo.

3. Un fago filamentoso según la reivindicación 1, en el que dicho primer polipéptido es un polipéptido V_{H} que tiene más de 60 residuos aminoacídicos y menos de 125 residuos aminoacídicos, y dicho segundo polipéptido es un polipéptido V_{L} que tiene más de 60 residuos aminoacídicos y menos de 125 residuos aminoacídicos.

4. El fago filamentoso de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en el que dicho fago está marcado detectablemente.

5. Un receptor heterodimérico de unión a ligando que comprende un primer y segundo polipéptidos, estando condensado dicho primero polipéptido con un dominio de anclaje a membrana de cpIII de fago filamentoso carboxi-terminal.

6. El receptor de la reivindicación 5, en el que dicho receptor es un complejo de unión a epítopo.

7. El receptor de la reivindicación 6, en el que dicho primer polipéptido es un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo y dicho segundo polipéptido es un polipéptido de cadena ligera de anticuerpo.

8. El receptor de la reivindicación 6, en el que dicho primer polipéptido es un polipéptido de cadena ligera de anticuerpo y dicho segundo polipéptido es un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo.

9. Un receptor heterodimérico de unión a ligando que comprende un primer y segundo polipéptidos, en el que uno de dichos primer y segundo polipéptidos es un polipéptido V_{H} que tiene más de 60 residuos aminoacídicos y menos de 125 residuos aminoacídicos, y el otro de dichos primer y segundo polipéptidos es un polipéptido V_{L} que tiene más de 60 residuos aminoacídicos y menos de 125 residuos aminoacídicos, y en el que uno de dichos primer y segundo polipéptidos está condensado con un dominio de anclaje a membrana de fago filamentoso carboxi-terminal.

10. El receptor de la reivindicación 9, en el que dicho anclaje a membrana de fago filamentoso es el anclaje a membrana de cpVIII.

11. El receptor de la reivindicación 10, en el que dicho anclaje a membrana de fago filamentoso tiene una secuencia de residuos aminoacídicos representada por la fórmula en la SEC Nº ID 17 del residuo 1 al residuo 50.

12. El receptor de la reivindicación 9, en el que dicho anclaje a membrana de fago filamentoso es el anclaje a membrana de cpIII.

13. El receptor de la reivindicación 5 o la reivindicación 12, en el que dicho anclaje a membrana de fago filamentoso tiene una secuencia de residuos aminoacídicos codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC Nº ID 113 desde los residuos 28 a 663.

14. Un vector para expresar un polipéptido de fusión, comprendiendo dicho vector secuencias de ADN traducible cadena arriba y cadena abajo unidas operativamente mediante una secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional de un inserto de ADN, codificando dicha secuencia cadena arriba una señal de secreción procariótica y codificando dicha secuencia cadena abajo un anclaje a membrana de fago filamentoso, estando dichas secuencias de ADN traducible unidas operativamente a un conjunto de señales de expresión de ADN para la expresión de dichas secuencias de ADN traducible en forma de partes de dicho polipéptido de fusión, y comprendiendo adicionalmente dicho vector una segunda secuencia de ADN traducible cadena arriba que codifica una señal de secreción procariótica unida operativamente mediante una secuencia de nucleótidos adaptada para ligamiento direccional de un segundo inserto de ADN, estando unida operativamente dicha segunda secuencia de ADN traducible a un conjunto de señales de expresión de ADN para la expresión de dicha segunda secuencia de ADN traducible en forma de una parte del segundo polipéptido de fusión.

15. El vector de la reivindicación 14, en el que dicha señal de secreción procariótica es una señal de secreción pelB.

16. El vector de la reivindicación 15, en el que dicha señal de secreción pelB tiene una secuencia aminoacídica representada por una fórmula seleccionada del grupo constituido por:

(a) SEC Nº ID 5,

(b) SEC Nº ID 6, y

(c) SEC Nº ID 7.

17. El vector de la reivindicación 14, en el que dicho anclaje a membrana de fago filamentoso es como se indica en una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12.

18. El vector de la reivindicación 17, en el que el anclaje a membrana de fago filamentoso tiene la secuencia aminoacídica codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC Nº ID 113 desde la base 28 a la base 663.

19. El vector de la reivindicación 14, que comprende adicionalmente un origen de replicación de fago filamentoso.

20. El vector de la reivindicación 14, en el que dicho conjunto de señales de expresión incluye un promotor, un sitio de unión a ribosoma y al menos un codon de paro en fase con dicha secuencia de ADN traducible cadena abajo.

21. El vector de la reivindicación 14, en el que dicho vector tiene una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC Nº ID 116 desde la base 1 a la base 259.

22. El vector de la reivindicación 14, en el que dicho vector tiene una secuencia nucleotídica mostrada en la SEC Nº ID 3 desde la base 36 a la base 118.

23. Un polipéptido constituido por un polipéptido de receptor de unión a ligando unido operativamente a la terminación carboxi de un dominio de anclaje a membrana de cpIII de fago filamentoso.

24. El polipéptido de la reivindicación 23, en el que el polipéptido es un polipéptido de cadena variable de anticuerpo.

25. El polipéptido de la reivindicación 24, en el que la cadena variable es un polipéptido de cadena pesada de anticuerpo.

26. Un polipéptido V_{H} o V_{L} que tiene más de 60 residuos aminoacídicos y menos de 125 residuos aminoacídicos, unido operativamente a la terminación carboxi de un dominio de anclaje a membrana de fago filamentoso.

27. Una biblioteca de partículas de fago filamentoso en la que cada partícula de fago contiene un vector de expresión de ADN según la reivindicación 14.

28. La biblioteca de la reivindicación 27, en la que dicha biblioteca contiene al menos 10^{7} especies diferentes de dicho vector de expresión de ADN.

29. Una biblioteca de partículas de fago filamentoso en la que cada partícula de fago contiene al menos un receptor heterodimérico de unión a ligando según la reivindicación 5.

30. Una biblioteca de partículas de fago filamentoso en la que cada partícula de fago contiene al menos un receptor heterodimérico de unión a ligando que comprende un primer y segundo polipéptidos, estando condensado dicho primer polipéptido con un dominio de anclaje a membrana de fago filamentoso carboxi-terminal, expresando dicha biblioteca al menos 10^{5} receptores diferentes.

31. Un procedimiento de producción de una biblioteca de moléculas de ADN dicistrónicas, comprendiendo cada molécula de ADN dicistrónico un primer y segundo cistrones para expresar un primer y segundo polipéptidos de un receptor heterodimérico en la superficie de un fago filamentoso, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) formar una primera mezcla de ligamiento mediante la combinación en un tampón de ligamiento de:

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(i) un repertorio de primeros genes de polipéptido en forma de ADNbc, teniendo cada uno terminación cohesivas adaptadas para ligamiento direccional, y

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(ii) una pluralidad de vectores de expresión de ADN en forma lineal, teniendo cada vector unas primeras terminaciones cohesivas cadena arriba y cadena abajo que (a) están adaptadas para recibir direccionalmente uno de dichos primeros genes de polipéptido en un marco de lectura común, y (b) están unidas operativamente a las respectivas secuencias de ADN traducible cadena arriba y cadena abajo, codificando dicha secuencia de ADN traducible cadena arriba una señal de secreción procariótica, codificando dicha secuencia de ADN traducible cadena abajo un anclaje a membrana de fago filamentoso, y estando dichas secuencias de ADN traducible unidas operativamente a las respectivas secuencias de control de la expresión de ADN cadena arriba y cadena abajo; y

(b) someter dicha mezcla a condiciones de ligamiento durante un periodo de tiempo suficiente para unir operativamente dichos primeros genes de polipéptido a dichos vectores y producir una pluralidad de moléculas de ADN circular que tiene cada una dicho primer cistrón para expresar dicho primer polipéptido;

(c) producir una pluralidad de vectores de expresión de ADN en forma lineal, teniendo cada vector lineal segundas terminaciones cohesivas cadena arriba y cadena abajo (i) adaptadas para recibir direccionalmente uno de un repertorio de segundos genes de polipéptido en un marco de lectura común, y (ii) unidas operativamente a las respectivas secuencias de ADN cadena arriba y cadena abajo, siendo dicha secuencia de ADN cadena arriba una secuencia traducible que codifica una señal de secreción procariótica, teniendo dicha secuencia de ADN cadena abajo al menos un codon de paro en dicho marco de lectura, y estando dicha secuencia de ADN traducible unida operativamente a una secuencia de control de la expresión de ADN; tratando dicha pluralidad de moléculas de ADN circular en condiciones endonucleolíticas de restricción suficientes para escindir dichas moléculas de ADN circular y formar dichas segundas terminaciones cohesivas;

(d) formar una segunda mezcla de ligamiento mediante combinación en un tampón de ligamiento de:

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(i) dicha pluralidad de vectores de expresión de ADN formados en la etapa (c), y

\hskip0,8cm

(ii) dicho repertorio de segundos genes de polipéptido en forma de ADNbc, teniendo cada uno terminaciones cohesivas adaptadas para ligamiento direccional con dicha pluralidad de vectores de expresión de ADN; y

(e) someter dicha segunda mezcla a condiciones de ligamiento durante un periodo de tiempo suficiente para unir operativamente los segundos genes de polipéptido con dichos vectores y producir una pluralidad de moléculas de ADN circular, teniendo cada una dicho segundo cistrón para expresar dicho segundo polipéptido, formando así dicha biblioteca.

32. El procedimiento de la reivindicación 31, en el que dicho receptor heterodimérico es un complejo de unión a epítopo.

33. Una biblioteca de moléculas de ADN dicistrónico que comprende cada una un primer y segundo cistrones capaces de expresar un primer y segundo polipéptidos de un receptor heterodimérico en la superficie de un fago filamentoso, producida dicha biblioteca según el procedimiento de la reivindicación 31.