NO319371B1 - Filamentos fag - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse gjelder en filamentøs fag.

Bakgrunn

Filamentøse bakteriofager er en gruppe beslektede virus som infiserer bakterier. De kalles filamentøse siden de

er lange og tynne partikler som består av en avlang kapsel som omslutter deoksyribonukleinsyren (DNA) som danner bakteriofag-genomet. Den F-pili-filamentøse bakteriofag (Ff-fag) infiserer bare gramnegative bakterier ved spesifikt å adsorberes til enden av F-pili, og omfatter fd, fl og M13.

Den modne Ff-fagkapsel består av en kappe av fem fag-kodede genprodukter: cpVIII, hovedkappeproteinet som er et produkt av gen VIII som utgjør hovedmengden av kapselen; og fire mindre hyppig forekommende kappeproteiner, cpIII og cpIV ved én ende av kapselen og cpVll og cpIX ved den andre ende av kapselen. Langsiden av kapselen dannes av 2500 til 3000 kopier av cpVIII i et ordnet, heliksformet kompleks som utgjør den karakteristiske filamentstruktur. Tilnærmet fem kopier av hvert av de mindre hyppige kappeproteiner foreligger ved kap-selens ender. Det gen III-kodede protein (cpIII) foreligger typisk i 4 til 6 kopier ved én ende av kapselen og fungerer som reseptoren for binding av fagen til dens bakterievert i den innledende infeksjonsfase. For detaljerte oversikter over Ff-fagstruktur, se Rasched et al., Microbiol. Rev., 50:401-427

(1986); og Model et al., i "The Bacteriophages, Vol. 2",

R. Calendar, red., Plenum Press, s. 375-456 (1988).

Oppbyggingen av en Ff-fagpartikkel omfatter svært kompliserte mekanismer. Ingen fagpartikler bygges opp inne i vertscellen, derimot settes de sammen mens virusgenomet pres-ses ut gjennom vertscellens membran. Forut for utpressingen syntetiseres hovedkappeproteinet cpVIII og bikappeproteinet cpIII og transporteres til vertscellens membran. Både cpVIII og cpIII forankres i vertscellemembranen før de bygges inn i den modne partikkel. I tillegg fremstilles virusgenomet og dekkes med cpV-protein. Under utpressingsprosessen fjernes cpV-kappen fra det cpV-dekkede, genomiske DNA som samtidig overtrekkes med de modne kappeproteiner. Oppbyggingsmekanis-mene som kontrollerer overføring av disse proteiner fra membranen til partikkelen, er foreløpig ikke kjent.

Både cpIII- og cpVIII-proteiner omfatter to domener som tilveiebringer signaler for sammensetning av den modne fagpartikkel. Det første domene er et sekresjonssignal som styrer det nysyntetiserte protein til vertscellens membran. Sekresjonssignalet sitter i den aminoterminale ende av polypeptidet og styret polypeptidet i det minste til cellemembranen. Det andre domene er et membranforankringsdomene som inneholder signaler for assosiering med vertscellemembranen og for assosiering med fagpartikkelen under oppbygningen. For både cpVIII og cpIII omfatter dette andre signal i det minste et hydrofobt område som spenner over membranen.

cpVIII er omfattende undersøkt som en membranprotein-modell siden det kan integreres i lipiddobbeltlag på samme måte som i cellemembranen, i en asymmetrisk orientering med den sure, aminoterminale ende mot utsiden og den basiske, karboksyterminale ende mot innsiden av membranen. Det modne protein er tilnærmet 50 aminosyrerester langt, av hvilke 11

rester utgjør den karboksyterminale ende, 19 rester utgjør det hydrofobe transmembranområde, og de gjenværende rester utgjør den aminoterminale ende. Sekresjonssignalområdet i cpVIII har vært gjenstand for omfattende forskning for å fremme studiet

av membranproteinsyntese og styring til membraner. Imidlertid vites lite om hvilke endringer som kan tolereres i strukturen av membranforankringsområdet i cpVIII for fortsatt sammensetning av fagpartikler.

Manipulering av sekvensen til cpIII viser at det C-terminale 23 aminosyrerester lange område med hydrofobe aminosyrer som normalt er ansvarlige for en membranforankringsfunk-sjon, kan endres på en rekke forskjellige måter og fortsatt bibeholde evnen til å assosieres med membraner. Slike forank-ringsmodifiserte cpIII-proteiner mistet imidlertid sin evne til genetisk å komplementere gen III-mutanter, noe som viser at kravene til et membrananker for funksjonell sammensetning ikke er utredet.

Ff-fagbaserte ekspresjonsvektorer i hvilke hele aminosyrerestsekvensen til cpIII var modifisert ved innsetting av korte polypeptid-"epitoper" [Parmely et al., Gene, 73:305-318 (1988); og Cwirla et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6378-6382 (1990)] eller en aminosyrerestsekvens som definerer et enkeltkjedet antistoffdomene, McCafferty et al., Science, 348:552-554 (1990), er beskrevet. Disse hybridpro-teiner ble syntetisert og bygget inn i fagpartikler i mengder på tilnærmet 5 kopier pr. partikkel, den samme tetthet i hvilken normalt cpIII vanligvis finnes. Disse uttrykte fusjonsproteiner omfatter imidlertid hele aminosyrerestsekvensen til cpIII og antyder ikke fusjonsproteiner som kun benytter det karboksyterminale membranforankringsdomene i cpIII.

Videre er intet ekspresjonssystem blitt beskrevet i hvilket et fagkappeprotein er blitt endret slik at det tillater oppbygging av et heterodimert molekyl som er funksjonelt og i stand til å innbygges i kappen til en fagpartikkel.

Kort oppsummering av oppfinnelsen

En ny overflateintegreringsteknologi for ekspresjon av et heterodimert, rekombinant genprodukt på overflaten av en filamentøs fag som inneholder det rekombinante gen, er blitt oppdaget. Et membranforankringsdomene fra kappeprotein i en filamentøs fag benyttes som et middel til å sammenknytte genprodukt og gen under oppbyggingsstadiet av den filamentøse fags replikasjon.

Dette betyr at under replikasjonen av den filamentøse fag sammensettes kappeproteiner til et kompleks som omkapsler faggenomet. Det er nå blitt oppdaget at (1) fagoppbyggingen ikke forstyrres når rekombinante kappeproteiner fra filamen-tøse fag foreligger, (2) rekombinante kappeproteiner fra fila-mentøse fag kan integreres i den voksende form, og (3) inte-greringen i formen kan styres slik at den foregår i en over-flatet ilgjengelig orientering.

Foreliggende oppfinnelse kan med fordel benyttes til fremstilling av heterodimere reseptorer med forutbestemt spesifisitet, dvs. at den kan benyttes til fremstilling av antistoffer, T-cellereseptorer og lignende forbindelser som binder en utvalgt ligand.

Kort beskrivelse av figurene

For figurene som utgjør en del av denne beskrivelse, gjelder: Figur 1 viser et skjematisk diagram av immunoglobu-linmolekylet som viser de viktigste strukturelle egenskaper. Det omsirklede område på tungkjeden representerer det variable område (VH). Et polypeptid som inneholder en biologisk aktiv (ligandbindende) del av dette område og et gen som koder for dette polypeptid, fremstilles ved fremgangsmåtene i foreliggende oppfinnelse. Figur 2A er et diagram som viser en tung kjede (H) fra humant IgG (underklasse IgGl). Nummereringen går fra den N-terminale ende til venstre mot den C-terminale ende til høyre. Bemerk forekomsten av fire domener som hvert inneholder en intrakjede-disulfidbinding (S-S) som spenner over tilnærmet 60 aminosyrerester. Symbolet CHO står for karbohydrat. V-regi-onen i den tunge (H) kjede (VH) ligner på VLved at den har tre hypervariable CDR (ikke vist). Figur 2B er en diagramfremstilling av en human lettkjede (kappa) (felt 1). Nummereringen går fra den N-terminale ende til venstre mot den C-terminale ende til høyre. Bemerk at intrakjededisulfidbindingen (S-S) spenner over tilnærmet samme antall aminosyrerester i VL- og CL-domenene. Felt 2 viser plas-seringen av de komplementaritetsbestemmende områder (CDR) i VL-domenet. Segmentene utenfor CDR-områdene er struktursegmentene (FR). Figur 3 viser sekvensen av det dobbelttrådete, syntetiske DNA innsatt i "Lambda Zap" for å gi en Lambda Hc2-ekspresjonsvektor. Fremstillingen av det dobbelttrådete, syntetiske DNA-innskudd er beskrevet i eksempel la(ii). De forskjellige egenskaper som kreves av denne vektor for ekspresjon av de VH-kodende DNA-homologer, omfatter Shine-Dalgarno-ribosombindingssetet, en ledersekvens som styrer det uttrykte protein til periplasmaet som beskrevet av Mouva et al., J. Biol. Chem., 255:27, 1980, og forskjellige restriksjonsenzymseter som benyttes til operativ sammenknytting av VH-homologene til ekspresjonsvektoren. VH-ekspresjonsvektorsekvensen inneholder også en kort nukleinsyresekvens som koder for aminosyrer som vanligvis finnes i tungkjeden i variable områder (VH-ryggrad). Denne VH-ryggrad ligger like oppstrøms for og i samme leseramme som VH-DNA-homologene som er operativt innsatt i Xho I- og Spe I-kloningssetene. Sekvensene til topp- og bunntrådene i det dobbelttrådete, syntetiske DNA-innskudd er opplistet som henholdsvis SEKVENSID. NR. 1 og SEKVENSID. NR. 2. Det syntetiske DNA-innskudd ligeres retningsstyrt inn i "Lambda Zap" II kuttet med restriksjonsenzymene Not 1 og Xho I slik at ekspresjonsvektoren Lambda Hc2 dannes. Figur 4 viser de viktigste egenskaper ved den bakterielle ekspresjonsvektor Lambda Hc2 (VH-ekspresjonsvektor). Den syntetiske DNA-sekvens fra figur 3 er vist øverst sammen med T3-polymerasepromoteren fra "Lambda Zap" II. Orienteringen av innskuddet i "Lambda Zap" II er vist. VH-DNA-homologene er innskutt i Xho I- og Spe I-kloningssetene. Gjennomgående transkripsjon gir opphav til dekapeptidepitopen (merkelapp) som er plassert like 3' for kloningssetet. Figur 5 viser sekvensen av det dobbelttrådete, syntetiske DNA innskutt i "Lambda Zap" slik at en Lambda Lc2-ekspresjonsvektor dannes. De forskjellige egenskaper som kreves av denne vektor for ekspresjon av de VL-kodende DNA-homologer, er beskrevet i figur 3. De VL-kodende DNA-homologer er operativt koblet inn i Lc2-sekvensen ved Sac I- og Xho I-restrik-sjonssetene. Sekvensene til topp- og bunntrådene av det dobbelttrådete, syntetiske DNA-innskudd er opplistet som henholdsvis SEKVENSID. NR. 3 og SEKVENSID. NR. 4. Det syntetiske DNA-innskudd er retningsbestemt ligert inn i "Lambda Zap" II kuttet med restriksjonsenzymene Sac I og Not I slik at Lambda Lc2-ekspresjonsvektor dannes. Figur 6 viser de viktigste egenskaper ved den bakterielle ekspresjonsvektor Lc2 (VL-ekspresjonsvektor). Den syntetiske DNA-sekvens fra figur 5 er vist øverst sammen med T3-polymerasepromoteren fra "Lambda Zap" II. Orienteringen av innskuddet i "Lambda Zap" II er vist. VL-DNA-homologene er innskutt i Sac I- og Xho I-kloningssetene. Figur 7 viser den dicistroniske ekspresjonsvektor pComb i form av en fagmidekspresjonsvektor. For fremstilling av pComb ble fagmider først kuttet ut av ekspresjonsvektorene

Lambda Hc2 og Lambda Lc2 ved bruk av en in vivo- utkuttingsfremgangsmåte i henhold til produsentenes instruksjoner (Stratagene, La Jolla, California). pComb-ekspresjonsvektoren fremstilles fra Lambda Hc2 og Lambda Lc2 som ikke inneholder VH-kodende eller VL-kodende DNA-homologer. In vivo-utkuttings-fremgangsmåten flyttet det klonede innskudd fra Lambda Hc2- og Lc2-vektorene inn i en fagmidvektor. De dannede fagmider inneholdt de samme nukleotidsekvenser for antistoffragmentkloning og -ekspresjon som utgangsvektorene. Hc2- og Lc2-fagmideks-presjonsvektorer ble hver for seg kuttet med restriksjonsenzymene Sea I og EcoR I. De lineariserte fagmider ble ligert via de klebrige Sea I- og EcoR I-ender slik at den dicistroniske (kombinatoriske) vektor pComb ble dannet.

Figur 8 viser en skjematisk fremstilling av oppbyggingen av pCBAK8-2b-fagmidvektor og reaksjonsveien for sammensetning og innbygging av Fab i fagkappen. Vektoren bærer kloramfenikolacetyltransferase- (CAT) markørgenet i tillegg til nukleotidrestsekvensene som koder for Fd-cpVIII-fusjonspolypeptidet og kappakjeden. fl-fagens replikasjonsorigo forenkler dannelsen av enkelttrådet fagmid. Den isopropyltiogalaktopyranosid- (IPTG) induserte ekspresjon av et dicistronisk bud-skap som koder for Fd-cpVlll-fusjonen (VH, CHi, cpVIII) og lettkjeden (VL, CL) , fører til dannelse av tunge og lette kjeder. Hver kjede leveres til periplasmarommet av pelB-mål-sekvensen som deretter avkløyves. Tungkjeden forankres i membranen ved cpVIII-fusjonen, mens lettkjeden utskilles i periplasmaet. Tungkjede og lettkjede vil gå sammen og danne Fab-molekyler. Fab-ene inkorporeres i fagpartikler via cpVIII (sorte prikker). Figur 9 viser den elektronmikrografiske lokalisering av 5-7 nm kolloidale gullpartikler dekket med NPN-BSA-konjugat langs overflaten av filamentøs fag, og fra fag på vei ut av en bakteriecelle. Felt 9A viser filamentøs fag på vei ut av bak-teriecellens overflate spesifikt merket med de kolloidale gullpartikler dekket med BSA-NPN-antigen. Felt 9B viser en del av en moden, filamentøs fag langs hvilken merkingen av antigenbindende seter kan ses. Figur 10 viser resultatet av en to-seters ELISA for analyse av nærvær og funksjon av Fab-antistoff festet til overflaten av bakteriofagpartikler som beskrevet i eksempel 4b. For ekspresjon av Fab-antistoff på fagoverflater ble XL1-Blue-celler transformert med fagmidekspresjonsvektoren pCBAK8-2b. Induseren, isopropyltiogalaktopyranosid (IPTG) , ble blandet med bakteriesuspensjonen ved en sluttkonsentrasjon på 1 mM i l time. Hjelperfag ble så blandet med bakteriesuspensjonen for å igangsette dannelsen av kopier av fagmid-DNA-ets "sense"-tråd. Etter to timer ble bakteriesupernatanter som inneholdt bakteriofagpartikler, oppsamlet for analyse i ELISA.

Spesifikk, titrerbar binding av NPN-Fab-uttrykkende bakteriofagpartikler til NPN-dekkede skåler ble vist. Ingen binding ble påvist med hjelperfag alene. Figur 11 viser inhiberingen av NPN-Fab-uttrykkende bakteriofag til NPN-antigendekkede skåler ved tilsetning av økende mengder fritt hapten. Analysene ble utført som beskrevet i figur 10. Fullstendig bindingsinhibering ble observert med 5 ng tilsatt fritt NPN-hapten. Figur 12 viser skjematisk fremgangsmåten for mutagenisering av CDR3-regionen i et tungkjedefragment som fører til en endring av bindingsspesifisiteten. Oligonukleotidprimerne er vist med sorte streker. Prosessen er beskrevet i eksempel 6. Figur 13 viser aminosyresekvensene og de tilsvarende SEKVENSID. NR. av tungkjeden i CDR3-området i utgangsklonene og de utvalgte kloner, og klonenes affiniteter for fritt fluorescein og FI-BSA. Stjernen viser den tilnærmede Kd målt ved kompetitiv ELISA. Figur 14 viser aminosyresekvensene og de tilsvarende SEKVENSID. NR. for lettkjeden i CDR3-området i utgangsklonene og de utvalgte kloner, og affinitetene av klonene for fritt fluorescein og FI-BSA. Stjernen viser den tilnærmede Kd, bestemt ved kompetitiv ELISA.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

A. Definisj oner

Aminosyrerest: En aminosyre dannet ved kjemisk kløyving (hydrolyse) av et polypeptid ved dets peptidbind- inger. Aminosyrerestene som beskrives her, er fortrinnsvis i den "L"-isomere form. Rester i den "D"-isomere form kan imidlertid erstatte enhver L-aminosyrerest så lenge den ønskede, funksjonelle egenskap bibeholdes av polypeptidet. NH2viser til den frie aminogruppe som foreligger ved et polypeptids aminoterminale ende. COOH viser til den frie karboksygruppen som foreligger ved et polypeptids karboksyterminale ende. I samsvar med vanlig polypeptidnomenklatur (beskrevet i J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) og tatt i bruk ved 37 CF.R. 1.822(b)(2)), er forkortelser for aminosyrerester vist i føl-gende korrespondansetabell:

Det bør bemerkes at alle aminosyrerestsekvenser som her representeres ved formler, har en venstre-til-høyre-orientering i den sedvanlige retning fra aminoterminal til karboksyterminal ende. I tillegg er uttrykket "aminosyrerest" bredt definert til å omfatte aminosyrene opplistet i korrespondan-setabellen, og modifiserte og uvanlige aminosyrer som dem opplistet i 37 CFR 1.822(b)(4) som inkorporeres heri ved referanse. Videre bør det bemerkes at en strek ved begynnelsen eller slutten av en aminosyrerestsekvens viser en peptidbin-ding til en videre sekvens på én eller flere aminosyrerester eller en kovalent binding til en aminoterminal gruppe som NH2eller acetyl, eller til en karboksyterminal gruppe som COOH.

Nukleotid: En monomer DNA- eller RNA-enhet som består av en sukkerrest (pentose), et fosfat og en nitrogenholdig, heterosyklisk base. Basen er knyttet til sukkerresten via gly-kosidkarbonet {1' karbon i pentosen), og denne kombinasjon av base og sukker er et nukleosid. Når nukleosidet inneholder en fosfatgruppe bundet til 3'- eller 5'-posisjonen i pentosen, kalles det et nukleotid. En sekvens av operativt sammenbundne nukleotider vises her vanligvis til som en "basesekvens" eller "nukleotidsekvens" og deres grammatikalske ekvivalenter, og representeres her ved en formel hvis orientering fra venstre mot høyre er i den sedvanlige retning fra 5<1->ende til 3'-ende.

Basepar (bp): Et partnerskap mellom adenin (A) og thymin (T), eller mellom cytosin (C) og guanin (G) i et dobbelttrådet DNA-molekyl. I RNA inngår uracil (U) i stedet for thymin.

Nukleinsyre: En polymer av nukleotider, enten enkelt-eller dobbelttrådet.

Polynukleotid: En polymer av enkelt- eller dobbelttrådete nukleotider. Som benyttet her, vil "polynukleotid" og dets grammatikalske ekvivalenter omfatte alle typer nukleinsyrer. Et polynukleotid vil vanligvis vise til et nukleinsyremolekyl som består av en lineær tråd av to eller flere deoksy-ribonukleotider og/eller ribonukleotider. Den eksakte størrel-se vil avhenge av mange faktorer som igjen avhenger av de endelige bruksbetingelser, noe som er velkjent innen faget. Polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter primere, prober, RNA/DNA-segmenter, oligonukleotider eller "oligoer" (relativt korte polynukleotider), gener, vektorer, plasmider og lignende.

Gen: En nukleinsyre hvis nukleotidsekvens koder for et RNA eller polypeptid. Et gen kan være enten RNA eller DNA.

Dupleks- DNA: Et dobbelttrådet nukleinsyremolekyl som omfatter to tråder med i det vesentlige komplementære polynukleotider holdt sammen av én eller flere hydrogenbindinger

mellom hver av de komplementære baser som foreligger i et basepar i dupleksen. Da nukleotidene som danner et basepar kan være enten en ribonukleotidbase eller en deoksyribonukleotid-base, viser begrepet "dupleks-DNA" til enten en DNA-DNA-dupleks som består av to DNA-tråder (ds DNA), eller en RNADNA-dupleks som består av én DNA- og én RNA-tråd.

Komplementære baser: Nukleotider som vanligvis danner par når DNA eller RNA inntar en dobbelttrådet konfigurasjon.

Komplementær nukleotidsekvens: En sekvens av nukleotider i et enkelttrådet DNA- eller RNA-molekyl som er tilstrekkelig komplementær til den på en annen enkelttråd til spesifikt å hybridisere med denne med påfølgende hydrogenbin-ding.

Konservert: En nukleotidsekvens er konservert i forhold til en forut valgt (referanse-) sekvens hvis den hybridiserer ikke-tilfeldig til et eksakt komplement av den forut valgte sekvens.

Hybridisering: Pardannelse mellom i det vesentlige komplementære nukleotidsekvenser (nukleinsyretråder) slik at en dupleks eller heterodupleks dannes ved opprettelse av hydrogenbindinger mellom komplementære basepar. Dette er en spesifikk, dvs. ikke-tilfeldig, interaksjon mellom to komplementære polynukleotider som kan inhiberes kompetitivt.

Nukleotidanalog: Et purin- eller pyrimidinnukleotid som avviker strukturelt fra A, T, G, C eller U, men som er tilstrekkelig likt til å kunne erstatte det normale nukleotid i et nukleinsyremolekyl.

DNA- homolog: En nukleinsyre med en på forhånd valgt, konservert nukleotidsekvens og en sekvens som koder for en reseptor som kan binde en på forhånd valgt ligand.

Rekombinant DNA- ( rDNÅ-) molekyl: Et DNA-molekyl fremstilt ved operativ sammenkobling av to DNA-segmenter. Et rekombinant DNA-molekyl er således et hybrid-DNA-molekyl som består av minst to nukleotidsekvenser som normalt ikke finnes sammen i naturen. rDNA-er som ikke har et felles biologisk opphav, dvs. som er evolusjonsmessig forskjellige, sies å være "heterologe".

Vektor: Et rDNA-molekyl som er i stand til autonom replikasjon i en celle og til hvilket et DNA-segment, f.eks. et gen eller polynukleotid, kan tilknyttes operativt slik at replikasjon av det tilknyttede segment oppnås. Vektorer som er i stand til å styre ekspresjonen av gener som koder for ett eller flere polypeptider, kalles her for "ekspresjonsvektorer" . Særlig viktige vektorer tillater kloning av cDNA (komplementær-DNA) fra mRNA-er fremstilt ved bruk av revers transkriptase.

Reseptor: En reseptor er et molekyl, f.eks. et protein, glykoprotein og lignende, som spesifikt (ikke-tilfeldig) kan bindes til et annet molekyl.

Antistoff: Begrepet antistoff i dets forskjellige grammatikalske former benyttes her for å vise til immunoglobulinmolekyler og immunologisk aktive deler av immunoglobulinmolekyler, dvs. molekyler som inneholder et antistoffs bindingssete eller paratop. Eksempler på antistoffmolekyler er intakte immunoglobulinmolekyler, i det vesentlige intakte immunoglobulinmolekyler og deler av et immunoglobulinmolekyl, iberegnet de deler kjent innen faget som Fab, Fab', F(ab')2og F (v) .

Antistoffbindingssete: Et antistoffbindingssete er

den strukturelle del av et antistoffmolekyl som utgjøres av de variable og hypervariable områder fra en tung og en lett kjede som spesifikt binder (immunoreagerer med) et antigen. Begrepet immunoreagere i dets forskjellige former betyr spesifikk binding mellom et antigendeterminantholdig molekyl og et molekyl som inneholder et antistoffbindingssete som et helt antistoffmolekyl eller en del av dette.

Monoklonalt antistoff: Begrepet monoklonalt antistoff i dets forskjellige grammatikalske former viser til en popula sjon av antistoffmolekyler som inneholder bare én type antistof f bindingssete som kan immunoreagere med et gitt antigen. Et monoklonalt antistoff viser således typisk en enkelt bindingsaffinitet for ethvert antigen med hvilket det immunoreagerer. Et monoklonalt antistoff kan derfor inneholde et antistoffmolekyl med et stort antall antistoffbindingsseter, hvert immunospesifikt for et forskjellig antigen, f.eks. et bispesi-fikt, monoklonalt antistoff.

Fusjonspolypeptid: Et polypeptid som består av minst to polypeptider og en sammenbindingssekvens som operativt kobler de to polypeptider sammen til ett kontinuerlig polypeptid. De to polypeptider som er sammenkoblet i et fusjonspoly-pept id, er typisk avledet fra to uavhengige kilder, et fusjonspolypeptid omfatter derfor to sammenkoblede polypeptider som normalt ikke finnes sammenkoblet i naturen.

Oppstrøms: I retningen motsatt av retningen for DNA-transkripsjon, og følgelig i retningen fra 5' til 3' på den ikke-kodende tråd, eller 3<*>til 5<1>på mRNA-et.

Nedstrøms: Videre langs en DNA-sekvens i retningen for sekvenstranskripsjon eller avlesning, dvs. vandring i en 3' til 5' retning langs den ikke-kodende DNA-tråd eller 5' til 3' retning langs RNA-transkriptet.

Cistron: Nukleotidsekvens i et DNA-molekyl som koder for en aminosyrerestsekvens, innbefattet oppstrøms og ned-strøms kontrollelementer for DNA-ekspresjon.

Stoppkodon: Ethvert av tre kodoner som ikke koder for en aminosyre, men som i stedet forårsaker terminering av pro-teinsyntese. Disse er UAG, UAA og UGA og kalles også et "non-sense"- eller termineringskodon.

Lederpolypeptid: En aminosyresekvens av kort lengde ved aminoenden av et polypeptid som bærer eller styrer polypeptidet gjennom den indre membran og således sikrer dets endelige sekresjon inn i periplasmarommet og kanskje videre ut av dette. Ledersekvenspeptidet fjernes vanligvis før polypeptidet blir aktivt.

Leseramme: Spesiell sekvens av kontinuerlige nukleo-tidtripletter (kodoner) som benyttes i translasjonen. Leserammen avhenger av lokaliseringen av translasjonsinitierings-

kodonet.

B. Filamentøs fag

Foreliggende oppfinnelse omfatter en filamentøs fag, kjennetegnet ved at den omkapsler et genom som koder for en ligandbindende, heterodimer reseptor omfattende et første polypeptid og et andre polypeptid der det første polypeptidet er flankert av et prokaryot, aminoterminalt sekresjonssignaldomene og et karboksyterminalt membranankerdomene fra fila-mentøs fag, og det andre polypeptid er fusjonert til et prokaryot aminoterminalt sekresjonssignaldomene, hvori den heterodimere reseptor uttrykkes på overflaten av den filamentøse fag.

Den heterodimere reseptor i en foretrukket utførelse er et epitopbindende kompleks. Det vil si et kompleks av det første og det andre polypeptid som er i stand til å binde en epitop. Det første og det andre polypeptid er fortrinnsvis tungkjede- og lettkjedepolypeptid fra et antistoff.

Det første og det andre polypeptid er i stand til selvstendig oppbygging til et funksjonelt, epitopbindende kompleks (heterodimer reseptor) som så uttrykkes på den ytre overflate av fagen slik at de er tilgjengelige for ligand, dvs. at de er overflateintegrert i fagen. Et epitopbindende kompleks er således typisk til stede på overflaten av en fag ifølge foreliggende oppfinnelse. Det epitopbindende kompleks består typisk av et sammenbindende polypeptid som inneholder et membranforankringsdomene fra en filamentøs fag, f.eks. et polypeptid beskrevet i seksjon C, og et ikke-sammenbindende polypeptid(er). Fag med et cpIII- eller cpVIII-membranforankringsdomene koblet til et polypeptid fra det heterodimere kompleks som beskrevet i det følgende, foretrekkes.

Siden reseptoren er knyttet til fagen på en over-flatet ilgj engel ig måte, kan fagen med fordel benyttes som et fast-fase-affinitetsbindingsmiddel. I foretrukne utførelser er fagen koblet, fortrinnsvis slik at koblingen kan brytes, til et fast (uløselig i vann) støttemedium som agarose, cellulose, syntetiske harpikser, polysakkarider og lignende. Transformanter som avgir fagen, kan f.eks. påsettes og bibeholdes i en kolonne og opprettholdes under betingelser som fremmer utskilling av fagen. En vandig sammensetning som inneholder en ligand som bindes til reseptoren som uttrykkes av fagen, pas-seres så gjennom kolonnen med en forutbestemt hastighet og under reseptorbindende betingelser, slik at et fast-fase-reseptor-ligandkompleks dannes. Kolonnen vaskes så for å fjerne ubundet stoff slik at liganden bundet til fagen i fast fase, etterlates. Liganden kan så fjernes og gjenvinnes ved vasking av kolonnen med en buffer som fremmer dissosiasjon av reseptor-ligandkomplekset.

Alternativt kan renset fag blandes med en vandig løs-ning som inneholder liganden som skal affinitetsrenses. Reseptor/ligandbindingsreaksjonsblandingen som således dannes, bibeholdes over et tidsrom og under bindingsbetingelser som er tilstrekkelige til at et fagbundet reseptor-ligandkompleks dannes. Den fagbundne ligand (1igandbærende fag) skilles og gjenvinnes så fra de ubundne stoffer, f.eks. ved sentrifugering, elektroforese, utfelling og lignende.

Fag ifølge foreliggende oppfinnelse kan merkes når det benyttes i en diagnostisk fremgangsmåte. Foretrukne merkingsmidler omfatter radioaktivt merkede nukleinsyrer inkorporert i faggenomet, eller radioaktivt merkede aminosyrer inkorporert i proteinkomponentene i fagpartikkelen. Preparater av merket fag kan rutinemessig fremstilles ved å dyrke fag som beskrevet her, men med tilsatte radioaktivt merkede nukleotider eller radioaktivt merkede aminosyrer i dyrkningsmediet, slik at disse inkorporeres i fagens nukleinsyrer, henholdsvis polypeptider. Eksempler på merkingsmidler er<3>H-tymidin eller<35>S-metionin. Andre isotopiske merkingsmidler og andre nukleotid- eller aminosyreforløpere er enkelt tilgjengelige for fagfolk. Den merkede fag inneholder fortrinnsvis tilstrekkelig mye merkkingsmiddel til at den kan påvises i en ligandbin-dingsanalyse, dvs. at fagen er påvisbart merket.

C. DNA- ekspresjonsvektorer

En vektor er et rekombinant DNA- (rDNA-) molekyl tilpasset for å motta og uttrykke translaterbare DNA-sekvenser i form av et fusjonspolypeptid som inneholder et membranfor ankringsdomene fra en filamentøs fag og et prokaryotisk sekresjonssignaldomene. Vektoren består av en kassett som omfatter oppstrøms og nedstrøms translaterbare DNA-sekvenser operativt sammenknyttet via en nukleotidsekvens tilpasset retningsstyrt ligering til et innskudds-DNA. Den translaterbare oppstrømssekvens koder for sekresjonssignalet som definert her. Den translaterbare nedstrømssekvens koder for membranankeret fra den filamentøse fag som definert her. Kassetten omfatter fortrinnsvis kontrollsekvenser for DNA-ekspresjon for å gi ekspresjon av fusjonspolypeptidet som fremstilles når en translaterbar innskudds-DNA-sekvens (innskudds-DNA) retningsstyrt innsettes i kassetten via nukleotidsekvensen som er tilpasset retningsstyrt ligering. Membranankeret fra den filamentøse fag er fortrinnsvis et domene fra cpIII- eller cpVIII-kappeproteinet som er i stand til å bindes til komplekset i en filamentøs fagpartikkel slik at fusjonspolypeptidet inkorporeres i fagens overflate.

En ekspresjonsvektor karakteriseres ved at den er i stand til å uttrykke et strukturelt genprodukt, f.eks. et fusjonspolypeptid i en kompatibel vert.

Begrepet "vektor" benyttes her for å vise til et nukleinsyremolekyl som er i stand til å overføre mellom forskjellige genetiske omgivelser en annen nukleinsyre til hvilken det har blitt operativt sammenkoblet. Foretrukne vektorer er de som er i stand til autonom replikasjon og ekspresjon av strukturelle genprodukter som foreligger i DNA-segmentene til hvilke de er operativt sammenkoblet.

Begrepet "operativt sammenkoblet" slik det benyttes her i forbindelse med DNA-sekvenser eller -segmenter, betyr at sekvensene eller segmentene er blitt kovalent sammenkoblet, fortrinnsvis ved sedvanlige fosfodiesterbindinger, til én DNA-tråd, enten i enkelt- eller dobbelttrådet form.

Valget av vektor til hvilken en kassett er operativt sammenkoblet, avhenger, som velkjent innen faget, av de ønskede funksjonelle egenskaper, f.eks. vektorreplikasjon og proteinekspresjon, og av vertscellen som skal transformeres, da dette er begrensninger som er innebygget i læren om konstruksjon av rekombinante DNA-molekyler.

Den benyttede vektor omfatter et prokaryotisk replikon, dvs. en DNA-sekvens med evnen til å styre selvstendig replikasjon og bibeholdelse av det rekombinante DNA-molekyl ekstrakromosomalt i en prokaryotisk vertscelle, som f.eks. en bakteriell vertscelle, som er transformert med denne. Slike replikoner er velkjente innen faget. I tillegg omfatter de utførelser som omfatter et prokaryotisk replikon, også et gen hvis ekspresjon gir en selektiv fordel, f.eks. medikamentresistens, til en transformert bakterievert. Typiske bakterielle medikamentresistensgener er de som gir resistens mot ampicillin og tetrasyklin. Vektorer inneholder også typisk nyttige restriksjonsseter for innskudd av translaterbare DNA-sekvenser. Eksempler på vektorer er plasmidene pUC8, pUC9, pBR322 og pBR32 9 som er tilgjengelige fra BioRad Laboratories, (Richmond, CA) og pPL og pKK223 som er tilgjengelige fra Pharmacia, (Piscataway, NJ).

En nukleotidsekvens tilpasset retningsstyrt ligering, dvs. en polylinker, er et område i DNA-ekspresjonsvektoren som (1) operativt sammenkobler de translaterbare oppstrøms- og nedstrøms-DNA-sekvenser for replikasjon og transport, og

(2) tilveiebringer et sete eller middel for retningsstyrt ligering av en DNA-sekvens inn i vektoren. En retningsstyrende polylinker er typisk en nukleotidsekvens som definerer to eller flere gjenkjennelsessekvenser for restriksjonsendonuklease, eller restriksjonsseter. Ved restriksjonskutting gir de to seter klebrige ender via hvilke en translaterbar DNA-sekvens kan ligeres til DNA-ekspresjonsvektoren. De to restriksjonsseter gir fortrinnsvis ved restriksjonskutting klebrige ender som ikke er komplementære, og som således tillater retningsstyrt innskudd av en translaterbar DNA-sekvens inn i kassetten. I én utførelse tilveiebringes den retningsstyrte ligering ved nukleotider som foreligger i den translaterbare oppstrøms-DNA-sekvens, den translaterbare nedstrøms-DNA-sekvens, eller begge. I en annen utførelse omfatter nukleotidsekvensen tilpasset retningsstyrt ligering, en nukleotidsekvens som definerer flere midler for retningsstyrt kloning. Når nukleotidsekvens en tilpasset retningsstyrt ligering definerer flere restriksjonsseter, kalles den et multippelt klonings-

sete.

En translaterbar DNA-sekvens er en lineær rekke av nukleotider som gir en uavbrutt serie på minst 8 kodoner som koder for et polypeptid i én leseramme.

En translaterbar oppstrøms-DNA-sekvens koder for et prokaryotisk sekresjonssignal. Sekresjonssignalet er et leder-peptid-proteindomene som styret proteinet til periplasmamem-branen hos gramnegative bakterier.

Et foretrukket sekresjonssignal er et pelB-sekresjonssignal. De forutsagte aminosyrerestsekvenser til sekre-sj onssignaldomenet fra to pelB-genproduktvarianter fra Erwinia carotova er vist i tabell 1 som beskrevet av Lei et al., Nature, 331:543-546 (1988). Et spesielt foretrukket pelB-sekresjonssignal er også vist i tabell 1.

Ledersekvensen i pelB-proteinet er tidligere blitt benyttet som sekresjonssignal for fusjonsproteiner. Better et al., Science, 240:1041-1043 (1988); Sastry et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85:5728-5732 (1989); og Mullinax et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:8095-8099 (1990).

Aminosyrerestsekvenser for andre sekresjonssignal-polypeptiddomener fra E. coli som er anvendbare i foreliggende oppfinnelse, er også gitt i tabell 1. Oliver, i Neidhard, F.C.

(red.), Escherichia coli og Salmonella typhimurivm, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1:56-69 (1987).

En translaterbar DNA-sekvens som koder for pelB-sekresjonssignalet med aminosyrerestsekvensen vist i SEKVENSID. NR. 5, er en foretrukket DNA-sekvens for å inngå i en DNA-eks-pres j onsvektor.

En translaterbar nedstrøms-DNA-sekvens koder for et membrananker fra en filamentøs fag. Foretrukne membranankere kan erholdes fra de filamentøse fag M13, fl, fd og tilsvarende, ekvivalente, filamentøse fag. Foretrukne membranforankringsdomener er funnet i kappeproteinene som kodes av gen III og gen VIII. En translaterbar nedstrøms-DNA-sekvens koder således for en aminosyrerestsekvens som tilsvarer, og som fortrinnsvis er identisk med, membranforankringsdomenet i enten gen III- eller gen Vlll-kappepolypeptidet fra en filamentøs fag. fag er en del av det karboksyterminale område i kappeproteinet og omfatter et område med hydrofobe aminosyrerester som kan spenne over en lipid-dobbeltlagsmembran, og et område med ladede aminosyrerester som vanligvis finnes ved den cytoplasmatiske side av membranen og som strekker seg bort fra membranen.

I fagen fl omfatter gen Vlll-kappeproteinets membran-omspennende område sekvensen fra rest Trp-26 til Lys-40, og det cytoplasmatiske område omfatter de karboksyterminale 11 rester fra 41 til 52. Ohkawa et al., J. Biol. Chem., 256:9951-9958 (1981). Et eksempel på et membrananker kunne bestå av restene 26 til 40 i cpVIII.

Aminosyrerestsekvensen til et foretrukket membranforankringsdomene er således avledet fra gen III-kappeproteinet (også kalt cpIII) fra den filamentøse fag M13. Et foretrukket cpIII-avledet membrananker har sekvensen vist i SEKVENSID. NR. 16 fra rest 1 til rest 211. Gen III-kappeprotein foreligger på en moden, filamentøs fag ved én ende av fagpartikkelen, typisk med tilnærmet 4 til 6 kopier av kappeproteinet.

Aminosyrerestsekvensen til et annet foretrukket mem-branf orankr i ngsdomene er avledet fra gen VIII-kappeproteinet (også kalt cpVIII) fra den filamentøse fag M13. Et foretrukket cpVIII-avledet membrananker har sekvensen vist i SEKVENSID. NR. 17 fra rest 1 til rest 50. Gen Vlll-kappeprotein foreligger i en moden, filamentøs fag over størstedelen av fagpartikkelen, med typisk tilnærmet 2500 til 3000 kopier av kappeproteinet .

For detaljerte beskrivelser av strukturen av filamen-tøse fagpartikler, deres kappeproteiner og partikkelsammenset-ning, se oversiktene av Rached et al., Microbiol. Rev., 50:401-427 (1986); og Model et al., i "The Bacteriophages: Vol. 2", R. Calendar, red., Plenum Publishing Co., s. 375-456

(1988) .

En kassett i en DNA-ekspresjonsvektor er det området av vektoren som ved innsetting av en translaterbar DNA-sekvens (innskudds-DNA) danner en nukleotidsekvens som er i stand til å uttrykke et fusjonspolypeptid, i en passende vert. Den ekspresjonskompetente nukleotidsekvens kalles et cistron. Kassetten omfatter således DNA-ekspresjonskontrollelementer operativt koblet til de translaterbare oppstrøms- og ned-strøms -DNA-sekvenser. Et cistron dannes når en translaterbar DNA-sekvens blir retningsstyrt innsatt (retningsstyrt ligert) mellom oppstrøms- og nedstrømssekvensen via nukleotidsekvensen som er tilpasset dette formål. De resulterende tre translaterbare DNA-sekvenser, nemlig oppstrøms-, innskudds- og ned-strømssekvensen, er alle operativt sammenkoblet i samme leseramme.

DNA-ekspresjonskontrollsekvenser omfatter et sett av DNA-ekspresjonssignaler for ekspresjon av et strukturelt genprodukt og omfatter som kjent, både 5'- og 3<1->elementer operativt koblet til cistronet slik at cistronet er i stand til å uttrykke et strukturelt genprodukt. 5<1->kontrollsekvensene definerer en promoter for initiering av transkripsjon og et ribosombindingssete som er operativt koblet til den 5' ende av den translaterbare oppstrøms-DNA-sekvens.

For å oppnå høye genekspresjonsnivåer i E. coli, er det nødvendig å benytte ikke bare sterke promotere for å oppnå store mengder mRNA, men også ribosombindingsseter som sikrer at mRNA-et translateres effektivt. I E. coli omfatter ribosombindingssetet et initieringskodon (AUG) og en 3-9 nukleotider lang sekvens lokalisert 3-11 nukleotider oppstrøms fra initi-eringskodonet [Shine et al., Nature, 254:34 (1975)]. Sekvensen AGGAGGU, som kalles Shine-Dalgarno- (SD-) sekvensen, er komplementær til den 3' ende av E. coli 16S-mRNA. Binding av ribosomet til mRNA og sekvensen ved den 3 * ende av mRNA-et kan påvirkes av en rekke faktorer: (i) Graden av komplementaritet mellom SD-sekvensen og den 3' ende av 16S-tRNA-et. (ii) Avstanden, og muligens DNA-sekvensen, mellom SD-sekvensen og AUG [Roberts et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:760 (1979a); Roberts et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:5596 (1979b); Guarente et al., Science, 209:1428

(1980); og Guarente et al., Cell, 20:543 (1980)]. Optimaliser-ing oppnås ved å måle ekspresjonsnivået for gener i plasmider i hvilke denne avstand varieres systematisk. Sammenligning mellom forskjellige mRNA-er viser at det finnes statistisk foretrukne sekvenser fra posisjon -2 0 til +13 (hvor A i AUG er posisjon 0) [Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35:365

(1981)]. Ledersekvenser har vist seg å ha en dramatisk virk-ning på translasjonen (Roberts et al., 1979 a, b supra). (iii) Nukleotidsekvensen etter AUG som påvirker ribo-sombinding [Taniguchi et al., J. Mol. Biol., 128:533 (1978)]. Anvendbare ribosombindingsseter er vist i tabell 2 nedenfor.

3<1->kontrollsekvensene definerer minst ett termineringskodon (stoppkodon) i ramme med og operativt koblet til den translaterbare nedstrøms-DNA-sekvens.

En DNA-ekspresjonsvektor tilveiebringer således et system for kloning av translaterbare DNA-sekvenser inn i kassettdelen av vektoren slik at et cistron som er i stand til å uttrykke et fusjonspolypeptid dannes.

I foretrukne utførelser tilveiebringer en DNA-ekspresjonsvektor et system for uavhengig kloning (innskudd) av to translaterbare DNA-sekvenser inn i to atskilte kassetter som foreligger i vektoren, slik at to separate cistroner for ekspresjon av begge polypeptider i en heterodimer reseptor, eller de ligandbindende deler av polypeptidene som utgjør en heterodimer reseptor, dannes. DNA-ekspresjonsvektoren for ekspresjon av to cistroner kalles en dicistronisk ekspresjonsvektor.

En foretrukket DNA-ekspresjonsvektor omfatter således, i tillegg til kassetten som tidligere er beskrevet i detalj, en annen kassett for ekspresjon av et annet fusjonspolypeptid. Denne annen kassett omfatter en annen translaterbar DNA-sekvens som koder for et sekresjonssignal som beskrevet heri tidligere, operativt knyttet ved sin 3' ende via en nukleotidsekvens tilpasset retningsstyrt ligering til en nedstrøms DNA-sekvens i vektoren som typisk definerer minst ett stoppkodon i kassettens leseramme. Den annen translaterbare DNA-sekvens er operativt koblet ved sin 5<*>ende til DNA-ekspresjonskontrollsekvenser som danner de 5' elementer definert ovenfor. Den annen kassett er ved innsetting av en translaterbar DNA-sekvens (innskudds-DNA) i stand til å uttrykke det annet fusjonspolypeptid som består av en fusjon av sekresjonssignalet med et polypeptid som kodes av innskudds-DNA-et.

I en foretrukket utførelse er en DNA-ekspresjonsvektor utformet for enkel manipulering, i form av en filamentøs fagpartikkel som omkapsler et genom ifølge foreliggende opp-finnelses lære. I denne utførelse inneholder en DNA-ekspresjonsvektor videre en nukleotidsekvens som definerer et replikasjonsorigo fra en filamentøs fag slik at vektoren i nærvær av passende genetisk komplementering kan replikere som en filamentøs fag i enkelttrådet, replikativ form og pakkes i filamentøse fagpartikler. Denne egenskap tilveiebringer DNA-ekspresjonsvektorens evne til å pakkes i fagpartikler for på-følgende atskillelse av partikkelen, og vektor i denne, vekk fra andre partikler som utgjør en populasjon av fagpartikler.

Et replikasjonsorigo fra en filamentøs fag er som kjent et område i faggenomet som definerer seter for initiering av replikasjon, terminering av replikasjon og pakking av den replikative form som dannes ved replikasjon. Se f.eks. Rasched et al., Microbiol. Rev., 50:401-427 (1986); og

Horiuchi, J. Mol. Biol., 188:215-223 (1986).

Et foretrukket replikasjonsorigo fra en filamentøs fag for bruk i foreliggende oppfinnelse er et replikasjonsorigo fra en M13-, fl- eller fd-fag. Spesielt foretrukket er et replikasjonsorigo fra en filamentøs fag med sekvensen vist i SEKVENSID. NR. 117 og beskrevet av Short et al., Nucl. Acids Res., 16:7583-7600 (1988). Foretrukne DNA-ekspresjonsvektorer er de dicistroniske ekspresjonsvektorene pC0MB8, pCKAB8, pCOMB2-8, pCOMB3, pCKAB3, pCOMB2-3 og pCOMB2-3<1>beskrevet i eksempel 1.

I den grad en vektor kan manipuleres til å inneholde et innskudds-DNA og således ha evnen til å uttrykke et fusjonspolypeptid, omfatter én utførelse de tidligere beskrevne vektorer inneholdende et innskudds-DNA. Spesielt foretrukne vektorer som inneholder anti-stoffgener, er beskrevet i eksemplene.

D. Polypeptider

Et polypeptid som omfatter et innskuddsdomene flankert av et aminoterminalt sekresjonssignaldomene og et karboksyterminalt membranforankringsdomene fra kappeproteinet i en filamentøs fag er beskrevet.

Polypeptidet er et fusjonspolypeptid med et reseptordomene som består av en aminosyrerestsekvens som definerer det ligand- (epitop-) bindende domene fra et reseptorprotein plassert mellom et prokaryotisk sekresjonssignaldomene og et mem-branf orankringsdomene fra en filamentøs fag. Det vil si at innskuddsdomenet i fusjonspolypeptidet er det 1igandbindende domene fra en reseptor som også vises til som et ligandbindende reseptorpolypeptid.

I den grad polypeptidet har et reseptordomene, vises det her også til som en reseptor. I andre foretrukne utførel-ser er sekresjonssignaldomenet et pelB-sekresjonssignal som beskrevet heri. I tillegg foretrekkes det at membranforankringsdomenet er avledet fra cpIII- eller cpVIII-proteinene fra en filamentøs fag som beskrevet heri.

I foretrukne utførelser er reseptorproteinet en poly-peptidkjede fra en 1igandbindende, heterodimer reseptor. Mer foretrukket er den heterodimere reseptor et epitopbindende kompleks.

Foretrukne, heterodimere reseptorer omfatter immunoglobuliner, vevstypeantigener av klasse I eller II, lymfocyttreseptorer, integriner og lignende heterodimere reseptorer. Immunoglobuliner (antistoffmolekyler) kan være i form av Fab-eller Fv-fragmenter, eller andre deler av et antistoffmolekyl som inneholder områder fra det variable domene i tung- og lettkj edene.

I én utførelse har et polypeptid en aminosyrerestsekvens som kan representeres ved formelen, vist i retning fra amino- til karboksyende:

hvor 0 representerer en aminosyrerestsekvens som definerer et sekresjonssignal, U representerer et første avstandsgivende

polypeptid, V representerer en aminosyrerestsekvens som definerer et reseptordomene (et 1igandbindende reseptorpolypeptid), X representerer et annet avstandsgivende polypeptid, og Z representerer en aminosyrerestsekvens som definerer et membrananker fra kappeproteinet i en filamentøs fag, med de forbehold at m er det hele tall 0 eller 1, slik at når m er 0, er U ikke til stede, og når m er 1, er U til stede, og at n er 0 eller 1, slik at når n er 0, er X ikke til stede, og når n er 1, er X til stede.

I formelen (Fl) er sekresjonssignalet og membranankeret fra kappeproteinet i en filamentøs fag som definert heri ovenfor. Et foretrukket polypeptid omfatter således et polypeptid avledet fra et antistoffs variable kjededomene operativt koblet ved sin aminoende til sekresjonssignalet og operativt koblet ved sin karboksyende til membranankeret.

Et foretrukket polypeptid i denne utførelse består i det vesentlige av et antistoffs tungkjedepolypeptid som det variable domene. I denne sammenheng betyr "består i det vesentlige av" at polypeptidet ikke inneholder et antistoffs lettkjedepolypeptid, eller en del av dette. Spesielt foretrukket er et polypeptid i henhold til formel (Fl) hvor Z defin erer cpIII- eller cpVIII-membranankeret som beskrevet heri. I en annen foretrukket utførelse er sekresjonssignalet pelB-sekre-sj onssignalet.

Som benyttet heri ved henvisning til polypeptider, betyr begrepet "operativt koblet" at polypeptidfragmenter, eller proteindomener representert ved polypeptider, er blitt kovalent sammenkoblet til en enkelt polypeptidpolymer, fortrinnsvis ved konvensjonelle amidbindinger mellom naboamino-syrene som er sammenkoblet i polypeptidet.

I én utførelse er V en aminosyrerestsekvens som definerer det 1igandbindende domene fra en kjede i et heterodimert reseptormolekyl og er fortrinnsvis et polypeptid fra et immunoglobulins variable område. I et spesielt foretrukket polypeptid er V et VH- eller VL-polypeptid. Mest foretrukket er et polypeptid hvor V er et immunoglobulins VH-polypeptid (antistoffets tungkjedepolypeptid), og m og n er begge null.

I en annen utførelse kan U eller X definere et pro-teolytisk kløyvingssete, som f.eks. aminosyresekvensen funnet i et forløperprotein som protrombin, faktor X og lignende, som definerer kløyvingssetet i polypeptidet. Et fusjonspolypeptid med et kløyvingssete tilveiebringer et middel for rensing av polypeptidet fra fagpartikkelen til hvilken det er bundet.

De avstandsgivende polypeptider U og X kan hvert ha enhver aminosyrerestsekvens med lengde fra tilnærmet 1 til 6 aminosyrerester. De avstandsgivende rester foreligger typisk i et polypeptid for å gi den kontinuerlige leseramme som kreves når et polypeptid fremstilles ved fremgangsmåtene som beskrives heri, ved bruk av en DNA-ekspresjonsvektor.

En reseptor inntar en konformasjon som gir et bindingssete som, som vist ved dets evne til å inhiberes kompetitivt, er spesifikt for en på forhånd valgt eller forutbestemt ligand som et antigen, hapten, enzymatisk substrat og lignende. I én utførelse er en reseptor et 1igandbindende polypeptid som danner et antigenbindingssete som spesifikt bindes til et på forhånd valgt antigen slik at et kompleks dannes med tilstrekkelig sterk binding mellom antigenet og bindingssetet til at komplekset kan isoleres. Når reseptoren er et antigenbindende polypeptid, er dets affinitet eller aviditet generelt større enn IO<5>M"<1>, mer vanlig større enn IO<6>og fortrinnsvis større ennIO<8>M"<1>.

I en annen utførelse binder en reseptor et substrat og katalyserer dannelsen av et produkt fra substratet. Da topologien til det 1igandbindende sete i en katalytisk reseptor sannsynligvis er viktigere for dets på forhånd valgte aktivitet enn dets affinitet (assosiasjonskonstant eller pKa) for substratet, har de katalytiske reseptorer som her omtales, en assosiasjonskonstant for det på forhånd valgte substrat som generelt er større ennIO3M"<1>, mer vanlig større enn IO<5>M"<1>eller IO<6>M"<1>og fortrinnsvis større enn IO<7>M"<1>.

Reseptoren som fremstilles, er fortrinnsvis heterodimer og består derfor vanligvis av to forskjellige polypeptidkjeder som sammen inntar en konformasjon med en bindingsaffinitet, eller assosiasjonskonstant for den på forhånd valgte ligand, som er forskjellig fra, og fortrinnsvis større enn, affinitets- eller assosiasjonskonstanten for hvert av polypeptidene alene, dvs. som monomerer. Den heterodimere reseptor vises til som en 1igandbindende, heterodimer reseptor for å antyde dens evne til å binde ligand.

En foretrukket utførelse omfatter således en ligandbindende, heterodimer reseptor som består av et første og et annet polypeptid. Det første polypeptid er flankert av et aminoterminalt, prokaryotisk sekresjonssignaldomene og et karboksyterminalt membranforankringsdomene fra en filamentøs fag. Det annet polypeptid er koblet til et aminoterminalt, prokaryotisk sekresjonssignaldomene. En spesielt foretrukket 1igandbindende, heterodimer reseptor benytter et prokaryotisk sekresjonssignal som beskrevet heri. I tillegg inneholder en foretrukket 1igandbindende, heterodimer reseptor et membrananker avledet fra cpIII eller cpVIII som beskrevet heri.

En 1igandbindende, heterodimer reseptor vises til som et epitopbindende kompleks for å antyde av komplekset har evnen til å binde en epitop som foreligger på en ligand, og for å antyde at den heterodimere reseptor dannes ved assosia-sjon (kompleksdannelse) mellom to polypeptider som beskrevet heri.

Én eller begge av de forskjellige polypeptidkjeder er

fortrinnsvis avledet fra det variable område fra den tunge og lette kjede i et immunoglobulin. Typisk benyttes polypeptider som omfatter de lette (VL) og tunge (VH) variable regioner sammen for binding av den på forhånd valgte ligand.

Én utførelse omfatter således en 1igandbindende, heterodimer reseptor i hvilken det første polypeptid er et antistoffs tungkjedepolypeptid og det annet polypeptid er et lettkjedepolypeptid. En alternativ utførelse omfatter en 1igandbindende, heterodimer reseptor i hvilken det første polypeptid er et antistoffs lettkjedepolypeptid og det annet er et antistoffs tungkjedepolypeptid.

En reseptor fremstilt kan være aktiv i monomere så vel som multimere former, enten homomere eller heteromere, fortrinnsvis heterodimere. For eksempel kan VH- og VL-1igandbindende polypeptid med fordel kombineres med heterodimeren for å modulere aktiviteten av hver av dem, eller for å frembringe en aktivitet som er unik for heterodimeren.

Når de individuelle ligandpolypeptider vises til som VH og Vi,, kan heterodimeren vises til som et Fv. Det bør imidlertid forstås at et VH i tillegg til VH, kan inneholde i det vesentlige hele eller en del av tungkjedens konstante område. Tilsvarende kan et VLi tillegg til VL, inneholde i det vesentlige hele eller en del av lettkjedens konstante område. En heterodimer som består av et VH som inneholder en del av tungkj edens konstante område og et VLsom inneholder i det vesentlige hele lettkjedens konstantområde, kalles et Fab-fragment. Fremstilling av Fab kan være en fordel i visse situasjoner da de ekstra konstantområdesekvensene som inngår i et Fab sammenlignet med et Fv, kan stabilisere VH- og VL-interaksjonen. En slik stabilisering kan gjøre at Fab-et har høyere affinitet for antigen. I tillegg er Fab vanligere benyttet innen faget, og flere kommersielle antistoffer er således tilgjengelige for spesifikk gjenkjennelse av et Fab i fremgangsmåter for gjen-norns økning .

De enkelte VH- og VL-polypeptider kan fremstilles i' lengder som tilsvarer eller i det vesentlige tilsvarer deres naturlig forekommende lengder. I foretrukne utførelser vil imidlertid VH- og VL-polypeptidene ha færre enn 125 aminosyre rester, mer vanlig mindre enn tilnærmet 12 0 aminosyrerester, og på den annen side normalt mer enn 60 aminosyrerester, vanligvis mer enn tilnærmet 95 aminosyrerester, mer vanlig mer enn tilnærmet 100 aminosyrerester. Fortrinnsvis vil VH være fra tilnærmet 110 til 23 0 aminosyrerester langt, mens VLvil være fra tilnærmet 95 til tilnærmet 214 aminosyrerester langt. VH- og VL-kjeder som er tilstrekkelig lange til å danne Fab-er, er foretrukket.

Aminosyrerestsekvensene vil variere innen vide grenser, avhengig av den spesielle idiotype som er involvert. Vanligvis vil det være minst to cysteiner atskilt av fra tilnærmet 60 til 75 aminosyrerester, og forent med en disulfidbinding. Polypeptidene vil vanligvis være i det vesentlige kopier av idiotyper av de variable områder fra de tunge og/eller lette kjeder i immunoglobuliner, men i visse situasjoner kan et polypeptid inneholde tilfeldige mutasjoner i aminosyrerestsekvenser for å oppnå en fordelaktig forbedring i den ønskede aktivitet.

I noen situasjoner er det ønskelig å tillate kovalent kryssbinding av VH- og VL-polypept idene, noe som kan oppnås ved å tilveiebringe cysteinrester ved karboksylendene.Polypep-tidet vil vanligvis fremstilles fritt for immunoglobulinets konstante områder, en liten del av J-området kan imidlertid innbefattes som et resultat av den fordelaktige seleksjon av DNA-synteseprimere. D-området vil vanligvis inngå i transkriptet av VH.

Det C-terminale området i VH- og VL-polypeptidene vil typisk ha en større sekvensvariasjon enn den N-terminale ende, og kan, i henhold til den foreliggende strategi, videremodi-fiseres for å tillate en variasjon av de normalt forekommende VH- og VL-kjeder. Et syntetisk polypeptid kan benyttes for å variere én eller flere aminosyrer i et hypervariabelt område.

E. Fremgangsmåter for fremstilling av et bibliotek

1. Generelt grunnlag

I én utførelse tilveiebringes et system for samtidig kloning og gjennomsøkning av på forhånd valgte 1igandbindende spesifisiteter fra genrepertoarer ved bruk av et enkelt vektorsystem. Dette system tilveiebringer kobling mellom klonings- og gjennomsøkningsmetodologier og har to vilkår. For det første at ekspresjonen av polypeptidkjedene i en heterodimer reseptor i en in vitro-ekspresjonsvert som B. coli, krever samekspresjon av de to polypeptidkjeder for at en funksjonell heterodimer reseptor kan sammensettes og gi en reseptor som binder ligand. For det annet at gjennomsøkningen av isolerte medlemmer av biblioteket for en på forhånd valgt 1igandbindende evne krever et middel for å korrelere (en kobling mellom) bindingskapasiteten til et uttrykt reseptormolekyl og en fordelaktig fremgangsmåte for å isolere genet som koder for dette medlem fra biblioteket.

Kobling mellom ekspresjon og gjennomsøkning oppnås ved kombinasjonen av å målrette et fusjonspolypeptid til en bakteriecelles periplasma for å tillate oppbygging av en funksjonell reseptor, og målrettingen av et fusjonspolypeptid til kappen av en filamentøs fagpartikkel under fagsammensetning for å tillate en enkel gjennomsøkning av biblioteket. Målretting til periplasma oppnås ved nærvær av et sekresjonssignaldomene i et fusjonspolypeptid. Målretting til en fagpartikkel oppnås ved nærvær et membranforankringsdomene fra kappeprotein i en filamentøs fag (dvs. et cpIII- eller cpVIII-avledet membranforankringsdomene) i et fusjonspolypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse.

I én utførelse beskrives en fremgangsmåte for fremstilling av et bibliotek av DNA-molekyler hvor hvert DNA-molekyl omfatter et cistron for ekspresjon av et fusjonspolypeptid på overflaten av en filamentøs fagpartikkel. Fremgangsmåten omfatter følgende trinn: (a) dannelse av en ligeringsblanding ved å sammenblande i en ligeringsbuffer (i) et repertoar av polypeptidkodende gener og (ii) et stort antall DNA-ekspresjonsvektorer i lineær form tilpasset dannelse av et fusjonspolypeptiduttrykkende cistron, og (b) utsette blandingen for ligeringsbetingelser i et tidsrom som er tilstrekkelig til at genrepertoaret blir operativt koblet (ligert) til det store antall vektorer slik at biblioteket dannes.

I denne utførelse er repertoaret av polypeptidkodende gener i form av dobbelttrådet (ds) DNA, og hvert medlem av repertoaret har klebrige ender tilpasset retningsstyrt ligering. I tillegg er det store antall DNA-ekspresjonsvektorer lineære DNA-molekyler med oppstrøms og nedstrøms klebrige ender som er (a) tilpasset for retningsstyrt mottak av poly-peptidgenene i en felles leseramme, og (b) operativt koblet til translaterbare oppstrøms- henholdsvis nedstrøms-DNA-sekvenser. Den translaterbare oppstrøms-DNA-sekvens koder for et sekresjonssignal, fortrinnsvis et pelB-sekresjonssignal, og den translaterbare nedstrøms-DNA-sekvens koder for et membrananker fra et kappeprotein i en filamentøs fag som beskrevet heri for et polypeptid. De translaterbare DNA-sekvenser er også operativt koblet til oppstrøms- henholdsvis nedstrøms-DNA-ekspresjonskontrollsekvenser som definert for en DNA-ekspresjonsvektor beskrevet heri.

Biblioteket fremstilt på denne måte, kan benyttes for ekspresjon og gjennomsøkning av fusjonspolypeptidene som kodes av det resulterende bibliotek over cistroner representert i biblioteket ved ekspresjons- og gjennomsøkningsfremgangsmåtene beskrevet heri.

2. Fremstilling av genrepertoarer

Et genrepertoar er en samling av forskjellige gener, fortrinnsvis polypeptidkodende gener (polypeptidgener) og kan isoleres fra naturlige kilder eller dannes ad kunstig vei. Foretrukne genrepertoarer består av konserverte gener. Spesielt foretrukne genrepertoarer omfatter ett eller begge gener som koder for medlemmene i et dimert reseptormolekyl.

Et genrepertoar som er anvendbar inneholder minst IO<3>, fortrinnsvis minst 10<*>, mer foretrukket minst IO<5>, og mest foretrukket minst 10<7>forskjellige gener. Fremgangsmåter for å evaluere variabiliteten i et genrepertoar er velkjente for fagfolk.

Eksempler på konserverte genfamilier som koder for forskjellige polypeptidkjeder i en dimer reseptor, er de som koder for immunoglobuliner, vevstypeantigener av klasse I eller II, lymfocyttreseptorer, integriner og lignende.

Et gen kan identifiseres som tilhørende et repertoar av konserverte gener ved flere fremgangsmåter. Et isolert gen kan f.eks. benyttes som en hybridiseringsprobe under lite stringente betingelser for å påvise andre medlemmer av repertoaret av konserverte gener som foreligger i genomisk DNA, ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet av Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975). Dersom genet som benyttes som hybridiseringsprobe hybridiserer til flere restriksjonsendonukleasefrag-menter fra genomet, er genet et medlem av et repertoar av konserverte gener.

Immunoglobuliner

Immunoglobulinene, eller antistoffmolekyler, er en stor molekylfamilie som omfatter flere typer molekyler, f.eks.■ IgD, IgG, IgA, IgM og IgE. Antistoffmolekylet består typisk av to tunge (H) og lette (L) kjeder med både et variabelt (V) og et konstant (C) område til stede på hver kjede som vist i figur 1. Skjematiske diagrammer over human IgG tungkjede og human kappa lettkjede er vist i figurene 2A, henholdsvis 2B. Flere forskjellige områder i et immunoglobulin inneholder konserverte sekvenser som er nyttige for isolering av et immuno-globulinrepertoar. Omfattende aminosyre- og nukleinsyre-sekvensdata som viser eksempler på konserverte sekvenser, er satt sammen for immunoglobuliner av Kabat et al., i Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987. C-området i H-kjeden definerer den foreliggende immunoglobulintype. Følgelig vil valget av konserverte sekvenser som definert her fra C-området i H-kjeden, føre til fremstilling av et repertoar av immunoglobulingener med medlemmer av immunoglobulintypen til det valgte C-område. V-området i H- eller L-kjeden inneholder typisk fire strukturområder (FR) som hvert inneholder relativt lavere variasjonsgrad som omfatter strekk med konserverte sekvenser. Bruk av konserverte sekvenser fra FRI- og FR4- (J-region-) strukturområdene i VH-kjeden er et eksempel på en foretrukket utførelse og beskrives heri i eksemplene. Strukturområder er typisk konservert over flere eller alle immunoglobulintyper, og konserverte sekvenser i disse er således spesielt egnet for fremstilling av repertoarer med flere immunoglobulintyper.

Det store histokompatibilitetskompleks

Det store histokompatibilitetskompleks (MHC) er et stort genetisk lokus som koder for en omfattende protein-familie som omfatter flere molekylklasser vist til som klasse I-, klasse II- eller klasse III-MHC-molekyler. Paul et al., i Fundamental Immunology, Raven Press, NY, s. 303-378 (1984).

Klasse I-MHC-molekyler er en polymorf gruppe trans-plantasjonsantigener som representerer en konservert familie i hvilken antigenet består av en tungkjede og en ikke-MHC-kodet lettkjede. Den tunge kjede omfatter flere områder, kalt N-, Cl-, C2-, membran- og cytoplasmaområdene. Konserverte sekvenser som er anvendbare finnes hovedsakelig i N-, Cl- og C2-områdene og identifiseres som kontinuerlige sekvenser med "ikke-variable rester" i Kabat et al., supra.

Klasse II-MHC-molekyler omfatter en konservert familie med polymorfe antigener som deltar i immunsvar og består av en alfa- og en betakjede. Genene som koder for alfa- og betakjedene, omfatter hvert flere områder som inneholder konserverte sekvenser som er egnet for fremstilling av MHC-klasse II alfa- eller betakjederepertoarer. Eksempler på konserverte nukleotidsekvenser omfatter de som koder for aminosyrerestene 26-30 i Al-området, restene 161-170 i A2-området og restene 195-206 i membranområdet, alle i alfakjeden. Konserverte sekvenser foreligger også i Bl-, B2- og membranområdene i beta-kj eden ved nukleotidsekvensene som koder for henholdsvis aminosyrerestene 41-45, 150-162 og 200-209.

Lymfocyttreseptorer og celleoverflateantigener

Lymfocytter inneholder flere proteinfamilier på sine celleoverflater, heriblant T-cellereseptoren, Thy-1-antigen og et stort antall T-celleoverflateantigener, heriblant anti-genene som defineres av de monoklonale antistoffer OKT4 (leu3), OKT5/8 (leu2), OKT3, 0KT1 (leul), OKT 11 (leu5), OKT6 og OKT9. Paul, supra, s. 458-479.

T-cellereseptoren er et begrep som benyttes på en familie med antigenbindende molekyler funnet på overflaten av

T-celler. T-reseptoren som familie viser polymorf bindingsspesifisitet som minner om den til immunoglobulinene i sin diversitet. Den modne T-cellereseptor består av alfa- og beta-kj eder som hver har et variabelt (V) og et konstant (C) område. De likheter som T-cellereseptoren har med immunoglobuliner i genetisk organisering og funksjon, viser at T-cellereseptoren inneholder områder med konservert sekvens. Lai et al., Nature, 331:543-546 (1988).

Eksempler på konserverte sekvenser omfatter de som koder for aminosyrerestene 84-90 i alfa-kjeden, aminosyrerestene 107-115 i beta-kjeden, og aminosyrerestene 91-95 og 111-116 i gamma-kjeden. Kabat et al., supra, s. 279.

Integriner og adhesjoner

Adhesive proteiner som deltar i cellers festing til underlaget, er medlemmer av en stor familie beslektede proteiner kalt integriner. Integriner er heterodimerer som består av en beta- og en alfa-subenhet. Medlemmer av integrinfamilien omfatter celleoverflateglykoproteinene blodplatereseptor GpIIb-IIIa, vitronektinreseptoren (VnR), fibronektinreseptoren (FnR) og leukocyttadhesjonsreseptorene LFA-1, Mac-1, Mo-1 og 60.3. Rouslahti et al., Science, 238:491-497 (1987). Nukleinsyre- og proteinsekvensdata viser at områder med konserverte sekvenser forekommer i medlemmene av disse familier, særlig mellom beta-kjeden i GpIIb-IIIa, VnR og FnR, og mellom alfa-subenheten i VnR, Mac-1, LFA-1, FnR og GpIIb-IIIa. Suzuki et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:8614-8618, 1986; Ginsberg et al., J. Biol. Chem., 262:5437-5440, 1987.

Forskjellige velkjente fremgangsmåter kan benyttes for å fremstille et anvendelig genrepertoar. For eksempel kan VH- og VL-genrepertoarer fremstilles ved å isolere VH- og VL-kodende mRNA fra en heterogen populasjon av antistoffprodus-erende celler, dvs. B-lymfocytter (B-celler), fortrinnsvis omordnede B-celler som de har funnet i sirkulasjonen eller i milten hos hvirveldyr. Omordnede B-celler er de i hvilke immunoglobulingentranslokalisering, dvs. omordning, har fore-kommet, som vist ved forekomst i cellen av mRNA med transkrip-ter av immunoglobulingenområdene V, D og J liggende ved siden av hverandre. B-cellene oppsamles typisk i en 1-100 ml blod-prøve som vanligvis inneholder IO<6>B-celler/ml.

I noen tilfeller er det ønskelig å anrike repertoaret for en på forhånd valgt aktivitet, f.eks. ved å benytte som nukleinsyrekilde celler (kildeceller) fra vertebrater i en spesiell tilstand når det gjelder alder, helse og immunrespons. F.eks. vil gjentatt immunisering av et friskt dyr før omordnede B-celler oppsamles, føre til at man oppnår et repertoar som er anriket på genetisk materiale som gir en reseptor med høy affinitet. Mullinax et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:8095-8099 (1990). Tilsvarende vil oppsamling av omordnede B-celler fra et friskt dyr hvis immunsystem ikke nylig er blitt utfordret {dvs. et naivt immunsystem), føre til fremstilling av et repertoar som ikke forfordeler fremstilling av høyaffinitets-VH- eller VL-polypeptider.

Det bør bemerkes at jo større den genetiske heterogenitet i cellepopulasjonen fra hvilken nukleinsyrene erholdes er, jo større er diversiteten i det immunologiske repertoar (som omfatter VH- og VL-kodende gener) som vil være tilgjengelig for gjennomsøkning i henhold til fremgangsmåten. Således kan celler fra forskjellige individer, særlig slike som har en immunologisk signifikant forskjellig alder, og celler fra individer fra forskjellige stammer, raser og arter, med fordel kombineres for å øke heterogeniteten (diversiteten) til et repertoar.

I én foretrukket utførelse er således kildecellene erholdt fra et hvirveldyr, fortrinnsvis et pattedyr, som er blitt immunisert eller delvis immunisert med en antigenisk ligand (et antigen) mot hvilket aktivitet søkes, dvs. et på forhånd valgt antigen. Immuniseringen utføres på konvensjonell måte. Antistofftiteren i dyret kan måles for å bestemme det ønskede immuniseringstrinn som tilsvarer den anrikelsesmengde eller forfordeling av repertoaret som ønskes. Delvis immuniserte dyr mottar typisk bare én immunisering, og celler oppsamles fra disse dyr kort etter at en respons kan påvises. Fullt immuniserte dyr viser en topptiter som oppnås ved én eller flere gjentatte injeksjoner av antigenet inn i vertspatte-dyret, vanligvis hver 2. til 3. uke. Milten fjernes vanligvis tre til fem dager etter den siste immunisering, og det genetiske repertoar til splenocyttene, av hvilke tilnærmet 90% er omordnede B-celler, isoleres ved bruk av standard fremgangsmåter. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., red., John Wiley&Sons, NY. Nukleinsyrer som koder for VH- og VL-polypeptider, kan avledes fra celler som produserer IgA, IgD, IgE, IgG eller IgM, mest foretrukket fra IgM- og IgG-produserende celler.

Fremgangsmåter for fremstilling av fragmenter av genomisk DNA fra hvilke gener for immunoglobuliners variable område kan klones som en heterogen populasjon, er velkjente innen faget. Se f.eks. Herrmann et al., Methods In Enzymol., 152:180-183, (1987); Frischauf, Methods In Enzymol., 152:183:190 (1987); Frischauf, Methods In Enzymol., 152:190-199 (1987); og DiLella et al., Methods In Enzymol., 152:199-121 (1987). (Lærene til referansene som siteres heri, inkorporeres herved ved referanse.)

Det ønskede genrepertoar kan isoleres fra enten genomisk materiale som inneholder genet som uttrykker det variable område, eller fra messenger-RNA-et (mRNA-et) som

representerer et transkript av det variable område. Vanskelig-heten ved bruk av genomisk DNA fra annet enn ikke-omordnede B-lymfocytter ligger i å plassere ved siden av hverandre sekvensene som koder for det variable område, der hvor sekvensene er skilt fra hverandre ved introner. DNA-fragmentet eller -fragmentene som inneholder de riktige eksoner, må isoleres, intronene kuttes bort og eksonene så kobles sammen i riktig rekkefølge og riktig orientering. Dette vil som oftest være vanskelig slik at den alternative fremgangsmåten som benytter omordnede B-celler, vil være den foretrukne fremgangsmåte siden immunoglobulingenområdene V, D og J er blitt translokert slik at de ligger ved siden av hverandre, slik at sekvensen er kontinuerlig (fri for introner) over hele de variable områdene .

Når mRNA benyttes, vil cellene lyseres under RNase-inhiberende betingelser. I én utførelse er første trinn å isolere totalt cellulært mRNA. Poly A+-mRNA kan så utvelges ved hybridisering til en oligo-dT-cellulosekolonne. Nærvær av mRNA-er som koder for tung- og/eller lettkjedepolypeptidene, kan så analyseres ved hybridisering med enkelttrådet DNA fra de respektive gener. Sekvensene som koder for det konstante område i VH og VL, og som kan erholdes fra tilgjengelige kilder, kan med fordel benyttes som polypeptidnukleotidprober. Se f.eks. Early og Hood, Genetic Engineering, Setlow og Hollaender, red., bind 3, Plenum Publishing Corporation, NY,

(1981), s. 157-188; og Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD,

(1987).

I foretrukne utførelser anrikes preparater som inneholder det totale, cellulære mRNA, først for nærvær av VH-og/eller VL-kodende mRNA. Anrikning oppnås typisk ved å utsette det totale mRNA-preparat eller et delvis renset mRNA-produkt av dette, for en primerforlengelsesreaksjon ved bruk av en polypeptidsynteseprimer som beskrevet heri. Eksempler på fremgangsmåter for fremstilling av VH- og VL-genrepertoarer ved bruk av polypeptidsynteseprimere, er beskrevet i PCT-søknad nr. PCT/US90/02836 (internasjonalt publikasjonsskrift nr. WO 90/14430). Spesielt foretrukne fremgangsmåter for fremstilling av et genrepertoar bygger på bruk av på forhånd valgte oligonukleotider som primere, i en polymerasekjedereaksjon (PCR) slik at PCR-reaksjonsprodukter dannes, som beskrevet heri.

I foretrukne utførelser immuniseres isolerte B-celler in vitro mot et på forhånd valgt antigen. In vi tro immunisering defineres som den klonale ekspansjon av epitopspesifikke B-celler i kultur, som svar på antigenstimulering. Sluttresul-tatet er å øke frekvensen av antigenspesifikke B-celler i immunoglobulinrepertoaret og således redusere antall kloner i et ekspresjonsbibliotek som må gjennomsøkes for å identifisere en klon som uttrykker et antistoff med den ønskede spesifisitet. Fordelen med in vitro immunisering er at humane, monoklonale antistoffer kan dannes mot et ubegrenset antall tera-peutisk verdifulle antigener, heriblant toksiske eller svake immunogener. F.eks. kan antistoffer spesifikke for de polymorfe determinanter på tumorassosierte antigener, reumatoide faktorer og histokompatibilitetsantigener, fremstilles, noe som ikke kan frembringes i immuniserte dyr. I tillegg kan det lykkes å oppnå itntnunsvar som normalt er undertrykket in vivo.

In vi tro immunisering kan benyttes for å gi opphav til enten en primær eller sekundær immunrespons. En primær immunrespons som oppstår første gang en B-celle utsettes for et antigen, resulterer i klonal ekspansjon i epitopspesifikke celler og sekresjon av IgM-antistoffer med lav til middels tilsynelatende affinitetskonstanter (10<6->10B M"1) . Primær immunisering av humane milt- og tonsillymfocytter i kultur kan benyttes for fremstilling av monoklonale antistoffer mot et stort antall antigener, heriblant celler, peptider, makromolekyler, haptener og tumorassosierte antigener. Minne-B-celler fra immuniserte donorer kan også stimuleres i kultur til å gi opphav til en sekundær immunrespons,karakterisertved klonal ekspansjon og produksjon av høyaffinitetsanti-stoffer (>109 .M*1) av IgG-isotypen, særlig mot virale antigener, ved klonal ekspansjon av sensitiviserte lymfocytter avledet fra seropositive individer.

I én utførelse fjernes forskjellige cytolytiske celler som synes å nedregulere antigenspesifikk B-celleakti-vering fra lymfocytter fra perifert blod. Når lysosomrike subpopulasjoner (naturlige dreperceller, cytotoksiske og suppressor-T-celler, monocytter) først fjernes ved behandling med den lysosmotrope?metylester av leucin, responderer de gjenværende celler heriblant B-celler, T-hjelperceller, aksessorceller) antigenspesifikt under in vi tro immunisering. Lymfokinkravene for induksjon av antistoffproduksjon i kultur tilfredsstilles av en kultursupernatant fra aktiverte, be-strålte T-celler.

I tillegg til in vi tro immunisering kan celleanrik-ning (immunoaffinitetsabsorpsjon) benyttes for ytterligere å øke frekvensen av antigenspesifikke B-celler. Teknikker for seleksjon av B-cellesubpopulasjoner ved hjelp av fastfase-antigenbinding er veletablerte. Anrikningsbetingelsene kan optimaliseres for selektivt å anrike for B-celler som binder med høy affinitet til et stort antall antigener, heriblant celleoverflateproteiner. Anrikning kan benyttes alene eller sammen med in vi tro immunisering for å øke frekvensen av antigenspesifikke celler over de nivåer som kan oppnås med en av teknikkene alene. Immunoglobulinekspresjonsbiblioteker fremstilt fra anrikede populasjoner av B-celler, er anriket på antigenspesifikke antistoffkloner og tillater således identifisering av kloner med de ønskede spesifisiteter fra mindre, mindre komplekse biblioteker.

I én utførelse kan lymfocytter fra perifert blod (PBL) fra en donor føres inn i mus med alvorlig kombinert immunodefisiens (SCTD-mus) og så forøkes in vivo i SCID-musene for å øke immunresponsen forut for høsting av de tung- og lettkjedekodende nukleinsyrer fra SCID-musens B-celler. Se f.eks. Duchosal et al., Nature, 355:258t262 (1992). I denne rapporten ble humane PBL fra en donor med anti-tetanus toxoid-(TT-) titere forøkt i SCID-museverten. Det resulterende bibliotek på 370.000 kloner ga 2 fagpartikler som uttrykte et overflate-Fab som er i stand til å binde TT.

3. Fremstilling av polynukleotidprimere

Begrepet "polynukleotid" som benyttet her med hen-blikk på primere, prober og nukleinsyrefragmenter eller -segmenter som skal syntetiseres ved primerforlengelse, defineres som et molekyl som består av to eller flere deoksyribo-nukleotider eller ribonukleotider, fortrinnsvis flere enn 3. Dets eksakte størrelse vil avhenge av flere faktorer som i sin tur avhenger av de endelige bruksbetingelser.

Begrepet "primer" som benyttet her, viser til et polynukleotid, enten renset fra en restriksjonsenzymkuttet nukleinsyre eller fremstilt syntetisk, som er i stand til å fungere som et initieringspunkt for nukleinsyresyntese når det settes under betingelser ved hvilke syntese av et primerfor-lengelsesprodukt som er komplementært til en nukleinsyretråd induseres, dvs. i nærvær av nukleotider og et polymeriserings-middel som f.eks. DNA-polymerase, revers transkriptase og lignende, og ved en egnet temperatur og pH. Primeren er fortrinnsvis enkelttrådet for maksimal effektivitet, men kan alternativt være i dobbelttrådet form. Dersom den er dobbelttrådet, behandles primeren først for å skille den fra dens komplementære tråd før den benyttes til fremstilling av forlengelsesprodukter. Primeren er fortrinnsvis et polydeoksy- ribonukleotid. Primeren må være tilstrekkelig lang til å prime syntesen av forlengelsesprodukter i nærvær av polymeriserings-midlene. Den eksakte lengde av primerne vil avhenge av flere faktorer, heriblant temperatur og primerkilden. F.eks., avhengig av målsekvensens kompleksitet, inneholder en polynukleo-tidprimer typisk 15 til 25 eller flere nukleotider, selv om den kan inneholde færre nukleotider. Korte primermolekyler krever generelt lavere temperaturer for å danne tilstrekkelig stabile hybridkomplekser med templatet.

Primerne som benyttes her, velges for å være "i det vesentlige" komplementære til de forskjellige tråder i hver spesielle sekvens som skal syntetiseres eller amplifiseres. Dette betyr at primeren må være tilstrekkelig komplementær til ikke-tilfeldig å hybridisere med sin respektive templattråd. Således kan primersekvensen, men må nødvendigvis ikke, reflek-tere templatets eksakte sekvens. Et ikke-komplementært nukleo-tidfragment kan f.eks. påkobles primerens5'ende, med resten av primersekvensen i det vesentlige komplementær til tråden. Slike ikke-komplementære fragmenter koder typisk for et endo-nukleaserestriksjonssete. Alternativt kan ikke-komplementære baser eller lengre sekvenser spres inne i primeren, forutsatt at primersekvensen har tilstrekkelig komplementaritet med sekvensen av tråden som skal syntetiseres eller amplifiseres, til å hybridisere ikke-tilfeldig med denne og således danne et forlengelsesprodukt under betingelser som tillater polynukleotidsyntese.

Primeren kan også inneholde en DNA-avhengig RNA-polymerase-promotersekvens eller dens komplement. Se f.eks. Krieg et al., Nucl. Acids Res., 12:7057-70 (1984); Studier et al., J. Mol. Biol., 189:113-130 (1986); og Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Maniatis et al., red., Cold Spring Harbor, NY (1989).

Når en primer som inneholder en DNA-avhengig RNA-polymerasepromoter benyttes, hybridiseres primeren til poly-nukleotidtråden som skal amplifiseres, og den annen poly-nukleotidtråd til den DNA-avhengige RNA-polymerasepromoter fullføres ved bruk av et induksjonsmiddel som f.eks. E. coli DNA-polymerase I, eller Klenow-fragmentet av E. coli DNA- polymerase. Utgangspolynukleotidet amplifiseres ved alterner-ing mellom fremstilling av et RNA-polynukleotid og et DNA-polynukleotid.

Primere kan også inneholde en templatsekvens eller et replikasjonsinitieringssete for en RNA-styrt RNA-polymerase. Typiske RNA-styrte RNA-polymeraser omfatter QB-replikasen beskrevet av Lizardi et al., Biotechnology, 6:1197-1202

(1988). RNA-styrte polymeraser danner et stort antall RNA-tråder fra et lite antall templat-RNA-tråder som inneholder en templatsekvens eller et replikasjonsinitieringssete. Disse polymeraser gir typisk én million gangers amplifisering av tempiattråden, noe som er beskrevet av Kramer et al., J. Mol. Biol., 89:719-736 (1974).

Polynukleotidprimerne kan fremstilles ved bruk av enhver egnet fremgangsmåte, som f.eks. fosfotriester- eller fosfodiestermetodene, se Narang et al., Meth. Enzymol., 68:90,

(1979); US patentskrift nr. 4 356 270; og Brown et al., Meth. Enzymol., 68:109, (1979).

Valg av en primers nukleotidsekvens avhenger av faktorer som avstanden langs nukleinsyren fra området som koder for den ønskede reseptor, dens hybridiseringssete på nukleinsyren i forhold til en eventuelt annen primer som skal benyttes, antall gener i repertoaret den skal hybridisere til, og lignende.

a. Primere for fremstilling av immuno globulingenrepertoarer

VH- og VL-genrepertoarer kan fremstilles hver for seg forut for deres anvendelse. Repertoarfremstilling oppnås typisk ved primerforlengelse, fortrinnsvis ved primerforlengelse anvendt i en polymerasekjedereaksjon (PCR).

For fremstilling av et repertoar av VH-kodende DNA-homologer ved primerforlengelse velges nukleotidsekvensen til en primer slik at den hybridiserer med flertallet av immunoglobulin-tungkjedegener ved et sete som i det vesentlige ligger nær det VH-kodende område, slik at en nukleotidsekvens som koder for et funksjonelt (bindingskapabelt) polypeptid oppnås. For å hybridisere til flertallet av de forskjellige VH-kodende nukleinsyretråder må primeren i det vesentlige være komplementær til en nukleotidsekvens som er konservert blant de forskjellige tråder. Slike seter omfatter nukleotidsekvenser i det konstante område, i ethvert av det variable områdes strukturområder, fortrinnsvis det tredje strukturområde, lederområdet, promoterområder, J-området og lignende.

Dersom repertoarene av VH-kodende og VL-kodende DNA-homologer skal fremstilles ved (PCR) amplifisering, må to primere, dvs. et PCR-primerpar, benyttes for hver kodende nukleinsyretråd som skal amplifiseres. Den første primer blir en del av "nonsense"-tråden (minustråden eller den komplementære tråd) og hybridiserer til en nukleotidsekvens som er konservert blant VH-tråder (plusstråder eller kodende tråder) innen repertoaret. For fremstilling av VH-kodende DNA-homologer velges derfor førsteprimerne slik at de hybridiserer til (dvs. er komplementære til) konserverte områder innen J-området, CH1-området, hengselområdet, CH2-området eller CH3-området i immunoglobulingener og lignende. For fremstilling av en VL-kodende DNA-homolog velges de første primere slik at de hybridiserer med (dvs. er komplementære til) et konservert område innen J-området eller det konstante område i immunoglobulin-lettkjedegener og lignende. Annenprimerne blir del av den kodende tråd (plusstråden) og hybridiserer til en nukleotidsekvens som er konservert blant minustråder. For fremstilling av de VH-kodende DNA-homologer velges derfor annenprimerne slik at de hybridiserer til en konservert nukleotidsekvens ved den 5' ende av det VH-kodende immunoglobulingen, som f.eks. i det området som koder for lederområdet eller det første strukturområde. Det bør bemerkes at både ved amplifisering av VH- og VL-kodende DNA-homologer kan den konserverte 5<1>nukleotidsekvens i annenprimeren være komplementær til en sekvens påsatt eksogent ved bruk av terminal deoksynukleoti-dyltransferase som beskrevet av Loh et al., Science, 243:217-220 (1989). Én eller begge av første- og annenprimerne kan inneholde en nukleotidsekvens som definerer et endonukleasegjenkjenningssete. Dette sete kan være heterologt til immunoglobulingenet som amplifiseres og foreligger typisk ved eller nær primerens 5' ende.

Det restriksjonssetedefinerende område er, når det foreligger, typisk plassert i en 5' terminal, ikke-primende del av primeren. Restriksjonssetet som defineres av første-primeren, velges typisk slik at det gjenkjennes av et restrik-sjonsenzym som ikke gjenkjenner restriksjonssetet som defineres av annenprimeren slik at en kan fremstille et DNA-molekyl med klebrige ender som ikke er komplementære til hverandre, og som således tillater styrt innsetting i en vektor.

Ved én utførelse benyttes et polynukleotidsett som danner primere med et primende område plassert ved primerens 3' ende. Det primende område er typisk de 15 til 30 nukleotid-basene som ligger nærmest den 3' ende. Det 3' terminale, primende område i hver primer er i stand til å fungere som en primer for katalyse av nukleinsyresyntese, dvs. å initiere en primerforlengelsesreaksjon ut fra sin 3'ende. Én eller begge primere kan i tillegg inneholde et ikke-primende område i sin 5' ende, dvs. et område som ikke deltar i hybridisering til repertoartemplatet.

I PCR fungerer hver primer sammen med en annenprimer slik at en målnukleinsyresekvens amplifiseres. Valget av PCR-primerpar for bruk i PCR styres av betraktninger som diskutert heri for fremstilling av genrepertoarer. Det vil si at primerne har en nukleotidsekvens som er komplementær til en sekvens som er konservert i repertoaret. Anvendbare VH- og VL-primende sekvenser er vist i tabellene 5 og 6 heri, nedenfor.

4. Polymerasekjedereaksjon for fremstilling

av genrepertoarer

Strategien benyttet for kloning av VH- og VL-genene som inngår i et repertoar, vil, som velkjent innen faget, avhenge av typen, kompleksiteten og renheten av nukleinsyrene som utgjør repertoaret. Andre faktorer omfatter hvorvidt genene inngår i ett eller flere repertoarer, og hvorvidt de skal amplifiseres og/eller mutageniseres.

De VH- og VL-kodende genrepertoarer består av kodende polynukleotidtråder, som mRNA og/eller "sense"-tråden fra genomisk DNA. Dersom repertoaret er i form av dobbelttrådet genomisk DNA, denatureres det først til enkelttråder, typisk ved smelting. Et repertoar utsettes for en PCR-reaksjon ved å behandle repertoaret (sette det i kontakt) med et PCR-primerpar hvor hvert medlem av paret har en på forhånd valgt nukleotidsekvens. PCR-primerparet er i stand til å initiere primer-forlengelsesreaksjoner ved hybridisering til nukleotidsekvenser, fortrinnsvis minst tilnærmet 10 nukleotider lange, mer foretrukket minst tilnærmet 20 nukleotider lange, som er konservert i repertoaret. Førsteprimeren i et PCR-primerpar kalles noen ganger heri ""sense"-primeren" siden den hybridiserer til den kodende tråd eller "sense"-tråden i en nukleinsyre. I tillegg kalles noen ganger annenprimeren i et PCR-primerpar "anti-"sense"-primeren" siden den hybridiserer til en ikke-kodende eller anti-"sense"-tråd i en nukleinsyre, dvs. en tråd som er komplementær til en kodende tråd.

PCR-reaksjonen utføres ved å blande PCR-primerparet, fortrinnsvis en forutbestemt mengde av dette, med nukleinsyrene i repertoaret, fortrinnsvis en forutbestemt mengde av disse, i en PCR-buffer slik at en PCR-reaksjonsblanding dannes.Blandingen holdes under polynukleotidsyntetiserende betingelser i et tidsrom, typisk på forhånd bestemt, tilstrekkelig for dannelsen av et PCR-reaksjonsprodukt, hvorved et stort antall forskjellige VH-kodende og/eller VL-kodende DNA-homologer fremstilles.

Flere førsteprimere og/eller annenprimere kan benyttes i hver amplifisering, dvs. at én type førsteprimer kan pares med et antall forskjellige annenprimere slik at flere forskjellige primerpar dannes. Alternativt kan et individuelt par av første- og annenprimere benyttes. I alle fall kan amplifikasjonsproduktene fra amplifiseringer som benytter de samme eller forskjellige kombinasjoner av første- og annenprimere, kombineres for å øke genbibliotekets diversitet.

I en annen strategi er formålet å klone de VH-og/eller VL-kodende gener fra et repertoar ved å tilveiebringe et polynukleotidkomplement til repertoaret, f.eks. anti-"sense"-tråden i genomisk dsDNA eller polynukleotidet fremstilt ved å utsette mRNA for en revers transkriptasereak-sjon. Fremgangsmåter for fremstilling av slike komplementer er velkjente innen faget.

PCR-reaksjonen utføres ved å benytte enhver egnet fremgangsmåte. Generelt foregår den i en bufret, vandig løs-ning, dvs. en PCR-buffer, fortrinnsvis ved en pH på 7-9, mest foretrukket tilnærmet 8. Fortrinnsvis blandes et molart overskudd {for genomiske nukleinsyrer vanligvis tilnærmet 10<6>:1 primer:templat) av primeren til bufferen som inneholder templat tråden. Et stort molart overskudd foretrekkes for å bedre effektiviteten av prosessen.

PCR-bufferen inneholder også deoksyribonukleosidtri-fosfåtene dATP, dCTP, dGTP og dTTP og en polymerase, vanligvis termostabil, alle i tilstrekkelige mengder for en primerfor-lengelses- {polynukleotidsyntese-) reaksjon. Den resulterende løsning (PCR-blanding) oppvarmes til tilnærmet 90°C-100°C i tilnærmet 1 til 10 minutter, fortrinnsvis fra 1 til 4 minutter. Etter denne oppvarmingstid avkjøles løsningen til 54°C som fremmer primerhybridisering. Syntesereaksjonen kan foregå ved fra romtemperatur til en temperatur over hvilken polymer-asen (induksjonsmidlet) ikke lenger fungerer effektivt. Således er f.eks. temperaturen, dersom DNA-polymerase benyttes som induksjonsmiddel, vanligvis ikke høyere enn tilnærmet 4 0°C. Et eksempel på en PCR-buffer inneholder følgende: 50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl2, 0,001% (vekt/volum) gelatin, 200 uM dATP, 200 uM dTTP, 200 uM dCTP, 200 uM dGTP og 2,5 enheter DNA-polymerase I fra Thermus aquaticua (US patentskrift nr. 4 889 818) pr. 100 mikroliter buffer.

Induksjonsmidlet kan være enhver forbindelse eller ethvert system som vil gi syntese av primerforlengelsesproduk-ter, heriblant enzymer. Egnede enzymer for dette formål omfatter f.eks. DNA-polymerase I fra E. coli, Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I fra E. coli, T4-DNA-polymerase, andre tilgjengelige DNA-polymeraser, revers transkriptase og andre enzymer, heriblant varmestabile enzymer, som vil fremme kombinering av nukleotidene på riktig måte slik at primerforlengel-sesproduktene som er komplementære til hver nukleinsyretråd, dannes. Generelt vil syntesen initieres ved den 3' ende av hver primer og forløpe i 5<1->retning langs templattråden inntil syntesen terminerer, slik at molekyler av forskjellig lengde dannes. Imidlertid kan induksjonsmidler finnes som initierer syntesen ved den 5' ende og forløper i retningen gitt ovenfor, ved benyttelse av samme prosess som beskrevet ovenfor.

Induksjonsmidlet kan også være en forbindelse eller et system som vil gi syntese av RNA-primerforlengelsesproduk-ter, heriblant enzymer. I foretrukne utførelser kan induksjonsmidlet være en DNA-avhengig RNA-polymerase som f.eks. T7-RNA-polymerase, T3-RNA-polymerase eller SP6-RNA-polymerase. Disse polymeraser produserer et komplementært RNA-polynukleotid. RNA-polymerasens høye reaksjonshastighet amplifiserer utgangspolynukleotidet som beskrévet av Chamberlin et al., The Enzymes, red., P. Boyer, s. 87-108, Academic Press, New York

(1982). En annen fordel med T7-RNA-polymerase er at mutasjoner kan innføres i polynukleotidsyntesen ved å erstatte en del av cDNA-et med ett eller flere mutagene oligodeoksynukleotider (polynukleotider) og direkte transkripsjon av det delvis umake templat som tidligere beskrevet av Joyce et al., Nuc. Acid Res., 17:711-722 (1989). Amplifikasjonssystemer basert på transkripsjon, er blitt beskrevet av Gingeras et al., i PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, s. 245-252, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990).

Dersom induksjonsmidlet er en DNA-avhengig RNA-polymerase og således inkorporerer ribonukleosidtrifosfater, innblandes tilstrekkelige mengder ATP, CTP, GTP og UTP i primerforlengelsesreaksjonsblandingen, og den resulterende løsning behandles som beskrevet ovenfor.

Den nysyntetiserte tråd og dens komplementære nukleinsyretråd danner et dobbelttrådet molekyl som kan benyttes i påfølgende trinn i prosessen.

Den første og/eller annen PCR-reaksjon diskutert ovenfor, kan med fordel benyttes for inkorporering i reseptoren av en på forhånd valgt epitop som kan benyttes til immunologisk påvisning og/eller isolering av en reseptor. Dette oppnås ved å benytte en første og/eller annen polynuk-leotidsynteseprimer eller ekspresjonsvektor for inkorporering av en på forhånd valgt aminosyrerestsekvens inn i reseptorens aminosyrerestsekvens.

Etter fremstilling av VH- og VL-kodende DNA-homologer for flere forskjellige VH- og VL-kodende gener innen reper- toårene, amplifiseres DNA-molekylene vanligvis videre. Selv om DNA-molekylene kan amplifiseres ved klassiske teknikker, som inkorporering i en autonomt replikerende vektor, foretrekkes det først å amplifisere molekylene ved å utsette dem for en polymerasekjedereaksjon (PCR) før de innsettes i en vektor. PCR utføres typisk ved termosyklisering, dvs. gjentatt økning og reduksjon av temperaturen av en PCR-reaksjonsblanding innen et temperaturområde hvis nedre grense er tilnærmet 10°C til tilnærmet 4 0°C, og hvis øvre grense er tilnærmet 90°C til tilnærmet 100°C. Temperaturreduksjonen og -økningen kan være kontinuerlig, men er fortrinnsvis inndelt i faser, med tidsrom med relativ temperaturstabilitet ved hver av temperaturene som fremmer polynukleotidsyntese, denaturering og hybridisering.

Fremgangsmåter for PCR-amplifisering er beskrevet i detalj i US patentskrifter nr. 4 683 195, 4 683 202, 4 800 159 og 4 965 188, og i flere skrifter, heriblant "PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification", H. Erlich, red., Stockton Press, New York (1989), og "PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications", Innis et al., red., Academic Press, San Diego, California (1990).

I foretrukne utførelser benyttes bare ett par av første- og annenprimer i hver amplifikasjonsreaksjon. Amplifi-kasjonsreaksjonsproduktene erholdt fra flere forskjellige amplifikasjoner, hver utført med flere forskjellige primerpar, kombineres så.

I foretrukne utførelser benyttes PCR-prosessen ikke bare for å fremstille et DNA-molekylbibliotek, men også for å innføre mutasjoner i biblioteket eller å frembringe diversitet fra én enkelt utgangsklon og således tilveiebringe et bibliotek med større heterogenitet. Det bør her for det første bemerkes at PCR-prosessen i seg selv har iboende mutagenisitet grunnet en rekke faktorer velkjente innen faget. For det andre kan, i tillegg til de mutasjonsinduserende variasjoner som er beskrevet i US patentskrift nr. 4 683 195 vist til ovenfor, andre mutasjonsinduserende PCR-variasjoner benyttes. F.eks. kan PCR-reaksjonsblandingen utformes med forskjellige mengder av ett eller flere av nukleotidene som skal inkorporeres i forlengelsesproduktet. Under slike betingelser vil PCR-reak sjonen gi nukleotidsubstitusjoner i forlengelsesproduktet som en følge av knappheten av en gitt base. Tilsvarende kan tilnærmet like molare mengder av nukleotidene inkorporeres i ut-gangs -PCR- reaksjonsblandingen i en mengde som effektivt kan utføre X antall sykluser, hvoretter blandingen benyttes i et antall sykluser som er større enn X, f.eks. 2X.

Alternativt kan mutasjoner innføres under PCR-reaksjonen ved å inkorporere i reaksjonsblandingen nukleotid-derivater som inosin, som vanligvis ikke finnes i nukleinsyrene i repertoaret som amplifiseres. Under påfølgende in vivo DNA-syntese og replikasjon av nukleinsyrene i en vertscelle, vil nukleotidderivåtet erstattes med et substituerende nukleotid, noe som forårsaker en punktmutasjon.

5. Lineære DNA- ekspresjonsvektorer

En DNA-ekspresjonsvektor for benyttelse i en fremgangsmåte for fremstilling av et DNA-molekylbibliotek er et linearisert DNA-molekyl som beskrevet tidligere, med to (opp-strøms og nedstrøms) klebrige ender tilpasset retningsstyrt ligering til et polypeptidgen.

En lineær DNA-ekspresjonsvektor fremstilles typisk ved restriksjonsendonukleasekutting av en sirkulær DNA-ekspresjonsvektor slik at den kuttes ved to på forhånd valgte restriksjonsseter i vektorens nukleotidsekvens som er tilpasset retningsstyrt ligering, slik at et lineært DNA-molekyl med de påkrevde, klebrige ender som er tilpasset retningsstyrt ligering, dannes. Retningsstyrt ligering viser til forekomsten av to (en første og en annen) klebrige ender i en vektor, eller i innskudds-DNA-molekylet som skal ligeres inn i den valgte vektor, slik at endene på et enkelt molekyl ikke er komplementære. Vektorens første ende er komplementær til innskuddets første ende, og vektorens annen ende er komplementær til innskuddets annen ende.

6. Ligeringsreaksjoner for fremstilling av genbiblioteker

Ved fremstilling av et DNA-molekylbibliotek fremstilles en ligeringsblanding som beskrevet ovenfor, og blandingen utsettes for ligeringsbetingelser i et tidsrom som er tilstrekkelig for ligering (operativ sammenkobling) av det iblandede repertoar av polypeptidgener til overskuddet av DNA-ekspresjonsvektorer slik at biblioteket dannes.

Ligeringsbetingelser er betingelser valgt for å favorisere en ligeringsreaksjon hvorved en fosfodiesterbinding dannes mellom naboliggende 3<1->hydroksyl- og 5<1->fosforyl-DNA-ender. Ligeringsreaksjonen katalyseres fortrinnsvis av enzymet T4-DNA-ligase. Ligeringsbetingelser kan variere med hensyn til tid, temperatur, bufferkonsentrasjoner, mengder av DNA-molekyler som skal ligeres og ligasemengde, som velkjent innen faget. Foretrukne ligeringsbetingelser omfatter bibeholdelse av ligeringsblandingen ved fra 4°C til 12°C i 1 til 24 timer i nærvær av 1 til 10 enheter T4-DNA-ligase pr. ml, og med tilnærmet 1 til 2 mikrogram (ug) DNA. Ligeringsbuffer i en ligeringsblanding inneholder typisk 0,5 M Tris-HCl (pH 7,4), 0,01 M MgCl2, 0,01 M ditiotreitol, 1 mM spermidin, 1 mM ATP og

0,1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA). Andre ligeringsbuffere kan også benyttes.

Eksempler på ligeringsreaksjoner er beskrevet i eksempel 2.

7. Fremstilling av dicistroniske genbiblioteker

I en spesielt foretrukket utførelse beskrives fremgangsmåter for fremstilling av et bibliotek av dicistroniske DNA-molekyler. Et dicistronisk DNA-molekyl er et enkelt DNA-molekyl med evnen til å uttrykke to separate polypeptider fra to separate cistroner. I foretrukne utførelser er de to cistroner operativt sammenkoblet og plassert slik i forhold til hverandre i DNA-molekylet at begge cistroner er under transkripsjonskontroll av en enkelt promoter. Hvert dicistroniske molekyl kan uttrykke det første og det annet polypeptid fra det første, henholdsvis det annet, cistron, slik at disse i en egnet vert kan danne en heterodimer reseptor på overflaten av en filamentøs fagpartikkel.

Fremgangsmåten for fremstilling av et bibliotek av dicistroniske DNA-molekyler omfatter følgende trinn: (a) Dannelse av en første ligeringsblanding ved å

kombinere i en ligeringsbuffer:

(i) et repertoar av første polypeptidgener i form av dsDNA, hvert med klebrige ender tilpasset retningsstyrt ligering, og (ii) et overskudd av DNA-ekspresjonsvektorer i lineær form, hver med oppstrøms og nedstrøms første klebrige ender som er (a) tilpasset retningsstyrt mottak av de første polypeptidgener i en felles leseramme, og (b) operativt koblet til de respektive translaterbare oppstrøms- og nedstrøms-DNA-sekvenser. Den translaterbare oppstrøms-DNA-sekvens koder for et pelB-sekresjonssignal, den translaterbare nedstrøms-DNA-sekvens koder for et membrananker fra kappeprotein i en fila-mentøs fag, og translaterbare DNA-sekvenser er operativt koblet til de respektive oppstrøms- og nedstrøms-DNA-eks-presj onskontrollsekvenser. (b) Behandling av blandingen ved ligeringsbetingelser i et tidsrom som er tilstrekkelig til operativt å koble de første polypeptidgener til vektorene og frembringe et stort antall sirkulære DNA-molekyler som alle har et første cistron for uttrykk av det første polypeptid. (c) Behandling av det store antall sirkulære DNA-molekyler under DNA-kløyvingsbetingelser for fremstilling av et stort antall DNA-ekspresjonsvektorer i lineær form som alle har oppstrøms og nedstrøms andre klebrige ender som er (i) tilpasset retningsstyrt mottak av et repertoar av andre polypeptidgener i en felles leseramme, og (ii) operativt koblet til de respektive oppstrøms- og nedstrøms-DNA-sekvenser. Oppstrøms-DNA-sekvensen er en translaterbar sekvens som koder for et sekresjonssignal, nedstrøms-DNA-sekvensen har minst ett stoppkodon i leserammen, og den translaterbare DNA-sekvens er operativt koblet til en DNA-ekspresjonskontrollsekvens. (d) Dannelse av en annen ligeringsblanding ved å for-ene i en ligeringsbuffer: (i) det store antall DNA-ekspresjonsvektorer

dannet i trinn (c), og

(ii) repertoaret av annen-polypeptidgener i form av dsDNA, hvert med klebrige ender tilpasset retningsstyrt ligering til det store antall DNA-ekspresjonsvektorer,

og

(e) behandling av den annen blanding under ligeringsbetingelser i et tidsrom tilstrekkelig til operativt å koble de andre polypeptidgener til vektorene og frembringe et stort antall sirkulære DNA-molekyler som alle har det annet cistron for uttrykk av det annet polypeptid, som således utgjør biblioteket.

I foretrukne utførelser er sekresjonssignalet et pelB-sekresjonssignal. Også foretrukket er bruken av et membrananker fra en filamentøs fag som er avledet fra cpIII eller cpVIII som beskrevet heri.

DNA-ekspresjonsvektorer som er anvendbare for utfør-else av fremgangsmåten ovenfor, er de dicistroniske ekspresjonsvektorer beskrevet grundigere ovenfor.

Ved utførelse av fremgangsmåten for fremstilling av et bibliotek av dicistroniske DNA-molekyler foretrekkes det at de oppstrøms og nedstrøms første klebrige ender ikke har samme nukleotidsekvenser som de oppstrøms og nedstrøms andre klebrige ender. I denne utførelse omfatter behandlingstrinnet (c) for linearisering av de sirkulære DNA-molekyler typisk bruk av restriksjonsendonukleaser som er spesifikke for fremstilling av disse andre ender, men som ikke kløyver det sirkulære DNA-molekyl ved de seter som dannet de første ender. Eksempler på foretrukne første og andre ender er de ender som defineres ved kløyving av pCBAK8 med Xho I og Spe I for dannelse av de opp-strøms og nedstrøms første ender, og definert ved kløyving av pCBAK8 med Sac I og Xba I for dannelse av de oppstrøms og ned-strøms andre ender. I denne utførelse kan andre par av klebrige ender benyttes ved de respektive par av første og andre ender, så lenge de fire ender alle er distinkte, ikke-komplementære ender. Eksempler er endene funnet i vektorene pC0MB3, pCOMB2-3, pCOMB2-3', pC0MB8 og pCOMB2-8 beskrevet heri.

Fremgangsmåter for behandling av det store antall sirkulære DNA-molekyler under DNA-kløyvingsbetingelser slik at lineære DNA-molekyler dannes, er generelt velkjente og avhenger av nukleotidsekvensen som skal kløyves og kløyvingsmek-anismen. Foretrukne behandlinger omfatter sammenblanding av DNA-molekylene med en restriksjonsendonuklease som er spesi fikk for et endonukleasegjenkjenningssete ved det ønskede kløyvingssted i en mengde som er tilstrekkelig til at restriksjonsendonukleasen kløyver DNA-molekylet. Buffere, kløyvings-betingelser og substratkonsentrasjoner for restriksjonsendo-nukleasekløyving er velkjente og avhenger av det benyttede enzym. Eksempler på restriksjonsenzymkløyvingsbetingelser er beskrevet i eksempel 2.

I en beslektet utførelse tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av et bibliotek av DNA-molekyler med et enkelt cistron ved å følge fremgangsmåten beskrevet tidligere og stoppe etter at trinn (b) er fullført. Et slikt bibliotek inneholder DNA-molekyler som alle omfatter et cistron for ekspresjon av et polypeptid.

8. Fremgangsmåter for å endre et biblioteks

diversitet

Det beskrives fremgangsmåter for å endre diversiteten av et bibliotek av filamentøse fag ifølge oppfinnelsen. Disse fremgangsmåter øker generelt bibliotekets diversitet og øker således antallet mulige epitopbindende komplekser som kan gjennomsøkes for en ønsket bindingsaktivitet. Alternativt kan fremgangsmåtene rettes mot anrikning av en klasse epitopbindende komplekser. Klassen defineres typisk ved evnen til å binde en spesiell epitop eller epitopfamilie som foreligger på et på forhånd valgt antigen eller antigengruppe.

a. økning av bibliotekets diversitet ved mutasjon

En spesielt foretrukket fremgangsmåte for å øke diversiteten er å endre aminosyrerestsekvensen til ett eller flere polypeptider i det epitopbindende kompleks som kodes av genomet i en fag ifølge foreliggende oppfinnelse. Endringer kan enkelt innføres ved nukleinsyrenivået ved mutering av nukleinsyren. Fremgangsmåten kan utføres på en enkelt nuklein-syretype som koder for et polypeptid eller den kan utføres på et nukleinsyrebibliotek som foreligger i et fagbibliotek.

Mutering av nukleinsyre kan utføres på en rekke forskjellige måter, men utføres enklest i en PCR-reaksjon under en PCR-prosess. PCR-mutagenese kan som kjent være tilfeldig eller styrt til spesifikke nukleotidsekvenser. Utførelse av PCR under betingelser som fremmer tilfeldig mutagenese, er blitt beskrevet tidligere, og vises til som "feiltenderende PCR". Tilsvarende omfatter styrt mutagenese bruk av PCR-primere utformet for å målrette en spesifikk mutasjonstype til et spesifikt område i en nukleotidsekvens.

I én utførelse beskrives økt diversitet av ett eller flere epitopbindende komplekser ved PCR-styrt mutasjon av et komplementaritetsbestemmende område (CDR) i et antistoffs variable område som foreligger i et epitopbindende kompleks-polypeptid. CDR-mutagenese er tidligere beskrevet i generelle termer for "humanisering" av et antistoff ved innføring av humane sekvenser i CDR-området i et museantistoff. Se europe-isk patentsøknad nr. EP 23 9400.

Det beskrives således en mutagenesefremgangsmåte for endring av den immunologiske spesifisitet av et klonet immunoglobulingen som foreligger i en DNA-vektor. Fremgangsmåten omfatter styrt mutagenese i et forut valgt CDR i et immunoglobulingen som omfatter behandling av det mål-CDR-hoIdige, klonede immunoglobulingen ved PCR-betingelser som er egnet for amplifisering av et på forhånd valgt CDR-område. I denne fremgangsmåte behandles rDNA-molekylet ved PCR-betingelser som omfatter et PCR-primeroligonukleotid som beskrevet nedenfor, og som utgjør førsteprimeren i et PCR-primerpar som vites å frembringe et amplifisert PCR-produkt som er avledet fra det på forhånd valgte CDR-område, men som omfatter nukleotidsekvensen til PCR-primeren. Det annet oligonukleotid i PCR-amplifiseringsbetingelsene kan være enhver PCR-primer som er avledet fra immunoglobulingenet som skal mutageniseres, som beskrevet heri.

Foretrukket er fremgangsmåter som benytter et oligonukleotid som beskrevet nedenfor.

I en beslektet fremgangsmåte omfattes således et oligonukleotid som er anvendbart som en primer i en polymerasekjedereaksjon (PCR) for indusering av mutagenese i et komplementaritetsbestemmende område (CDR) i et immunoglobulingen. Oligonukleotidet har 3'- og 5'-ender og omfatter (1) en nukleotidsekvens ved sin 3<1>ende som kan hybridisere til et første strukturområde i et immunoglobulingen, (2) en nukleotidsekvens ved sin 5<1>ende som kan hybridisere til et annet strukturområde i et immunoglobulingen, og (3) en nukleotidsekvens mellom den 3' og den 5' ende som er tilpasset til under en PCR å innføre mutasjoner i CDR-området mellom det første og det annet strukturområde i immunoglobulingenet og således mutagenisere CDR-området.

Siden immunoglobulingener har tre CDR-områder både på immunoglobulinets tunge og lette kjede, alle atskilt av et distinkt strukturområde, må det forstås at eksemplet ovenfor lett kan anvendes for innføring av mutasjoner i en spesifikk CDR ved valg av de ovenfor nevnte 51 - og 3'-nukleotidsekvenser slik at de hybridiserer til strukturområdene som flankerer det valgte CDR. Således kan den første og den annen struktursek-vens nevnt ovenfor, være konserverte sekvens<4>er som flankerer CDR1, CDR2 eller CDR3 på enten den tunge eller lette kjede. Et foretrukket eksempel er CDR3 i den tunge kjede i humant immunoglobulin.

Lengden av nukleotidsekvensene i den 3' og den 5<1>ende i et gitt mutageniserende oligonukleotid kan som kjent variere i lengde så lenge lengden tilveiebringer et strekk av nukleotider som er tilstrekkelig komplementært til målstruk-tursekvensene til å hybridisere til disse. Når det gjelder nukleotidsekvensen i den 3' ende, må den være tilstrekkelig lang og komplementær til målstrukturområdet som ligger 3<1>for CDR-området som skal mutageniseres, til å hybridisere og tilveiebringe en 3' hydroksylende som kan initiere en primerforlengelsesreaksjon. Når det gjelder nukleotidsekvensen i den 5' ende, må den være tilstrekkelig lang og komplementær til målstrukturområdet som ligger 5' for CDR-området som skal mutageniseres, til å tilveiebringe et middel for hybridisering i en PCR-overlappingsforlengelsesreaksjon som beskrevet ovenfor, slik at den fullstendige tunge eller lette immunoglobulinkjede bygges opp.

Strukturområder som flankerer en CDR, er grundig beskrevet i immunologien og omfatter kjente nukleotidsekvenser eller konsensussekvenser som beskrevet heri annetsteds. Når et enkelt, på forhånd valgt immunoglobulingen skal mutageniseres, er de strukturdefinerende sekvenser som flankerer en gitt CDR, kjent, eller de kan lett bestemmes ved fremgangsmåter for nukleotidsekvensering. Når et repertoar av immunoglobulingener skal mutageniseres, er de strukturavledete sekvenser fortrinnsvis konservert, som beskrevet heri annetsteds.

Fortrinnsvis er nukleotidsekvensene i den 3<1>og den 5' ende hver minst 6 nukleotider lange og kan være opp til 50 eller flere nukleotider lange, selv om slike lengder er unød-vendige for å sikre nøyaktig og reproduserbar hybridisering. Foretrukne er lengder i området fra 12 til 30 nukleotider, og de vil typisk være tilnærmet 18 nukleotider.

En spesielt foretrukket, strukturdefinerende nukleotidsekvens for bruk som en nukleotidsekvens i en 3' ende, har nukleotidsekvensen 5<1->TGGGGCCAAGGGACCACG-3<1>(SEKVENS.ID. NR. 122) .

En spesielt foretrukket, strukturdefinerende nukleotidsekvens for bruk som en nukleotidsekvens i den 5' ende, har nukleotidsekvensen 5'-GTGTATTATTGTGCGAGA-3<1>(SEKVENS.ID. NR. 123) .

Nukleotidsekvensen som er plassert mellom den 3<1>og den 5' ende og som er tilpasset mutagenisering av en CDR, kan være enhver nukleotidsekvens så lenge den nye sekvens vil inkorporeres ved fremgangsmåtene gitt ovenfor. Den foreliggende tilnærming tilveiebringer imidlertid et middel for fremstilling av en stor populasjon mutageniserte CDR i en enkelt PCR-reaksjon ved bruk av en populasjon av overtallige sekvenser som definerer randomiserte eller nær randomiserte nukleotider i CDR-området som skal mutageniseres.

Et foretrukket oligonukleotid omfatter en nukleotidsekvens mellom de ovenfor nevnte 3' og 5<1>ender som representeres ved formelen [NNR]n, hvori N uavhengig kan være ethvert nukleotid, R kan være S, K eller analoger av disse, hvor S er G eller C, K er G eller T, og hvor n er fra 3 til tilnærmet 24. I foretrukne utførelser har oligonukleotidet formelen:

Et spesielt foretrukket eksempel er oligonukleotidet hvor R er S og n er 16, slik at oligonukleotidet representerer en stor populasjon overtallige oligonukleotidsekvenser.

Det beskrives således en fremgangsmåte for å øke diversiteten av et bibliotek av filamentøse fagpartikler som omfatter følgende trinn: a) tilveiebringelse av et bibliotek av filamentøse fagpartikler ifølge foreliggende oppfinnelse, og b) mutering av nukleotidsekvensen som koder for et immunoglobulins variable område og som foreligger i hver DNA-ekspresjonsvektor i biblioteket slik at et bibliotek av fagpartikler dannes hvor hver partikkel inneholder en mutert nukleotidsekvens for et immunoglobulins variable område.

Tilveiebringelsen kan omfatte manipulering av gen-omene til fagpartiklene i biblioteket for å isolere nukleinsyrene som en forberedelse til en mutageniserende PCR-reaksjon. Manipulering av et fagbibliotek for å isolere faggenomet for bruk i en PCR-reaksjon beskrives heri annetsteds.

I én utførelse omfatter muteringen behandling av nukleotidsekvensen som koder for immunoglobulinets variable område med en feiltenderende polymerasekjedereaksjon. I en annen utførelse omfatter muteringen behandling av nukleotidsekvensen som koder for immunoglobulinets-variable område med en fremgangsmåte for mutering av en CDR i nukleotidsekvensen som koder for immunoglobulinets variable område ved bruk av et CDR-rettet oligonukleotid som beskrevet heri.

Eksempler på fremgangsmåter for mutering av CDR-området i en nukleinsyre som koder for et gitt epitopbindende kompleks ved bruk av det ovenfor nevnte CDR-rettede oligonukleotid eller ved bruk av feiltenderendePCR for fremstilling av et stort bibliotek av forskjellige komplekser, er beskrevet i eksemplene.

b. Anrikning av et bibliotek

Det beskrives en fremgangsmåte for å endre bibliotekets diversitet ved å anrike biblioteket for en på forhånd valgt klasse av epitopbindende komplekser. Fremgangsmåten omfatter generelt affinitetsseleksjon av de fagpartikler i et bibliotek som er i stand til å binde et på forhånd valgt antigen. Affinitetsseleksjonsfremgangsmåten, eller anriknin-

gen, er beskrevet i detalj i eksemplene.

Det beskrives således en fremgangsmåte for endring av diversiteten til et bibliotek av filamentøse fagpartikler som omfatter trinnene a) tilveiebringelse av et bibliotek av filamentøse fagpartikler ifølge foreliggende oppfinnelse, b) behandling av biblioteket med en på forhånd valgt ligand under betingelser som tillater medlemmer av biblioteket å bindes til liganden og danne et ligand-fagpartikkelkompleks, og c) isolering av fagpartikler i komplekset fra ikke-bundne biblioteksmedlemmer slik at et ligandanriket bibliotek som omfatter fagpartikler med bindingsspesifisitet for den på forhånd valgte 1igand, danne s.

I foretrukne utførelser festes den på forhånd valgte ligand til et fast støttemiddel, og ligand-fagpartikkelkom-plekset dannes i den faste fase. Denne utførelse omfatter videre trinnene i) vask av det faste støttemiddel etter sammenblandingstrinnet for å fjerne ikke-bundne biblioteksmedlemmer fra det faste støttemiddel, og ii) eluering av fagpartikler bundet til den faste fase fra det faste støttemiddel. De eluerte fagpartikler oppsamles slik at isolerte fagpartikler som utgjør et anriket bibliotek, dannes.

Eluering kan utføres under en rekke betingelser som bryter interaksjonene mellom ligand og epitopbindende kompleks. Typiske betingelser omfatter buffere med høy saltkonsentrasjon eller lav pH. Spesielt foretrukket er buffere med tilnærmet pH 1 til 5, fortrinnsvis tilnærmet pH 2 til 3. Alternativt kan interaksjonen brytes ved konkurranse med et overskudd av den på forhånd valgte ligand i elueringsbufferen. Begge elueringsfremgangsmåter er beskrevet i eksemplene.

En beslektet utførelse kombinerer forøkning av bibliotekets diversitet ved mutering og anrikning av biblioteket for "modne" epitopbindende kompleksaffiniteter for en på forhånd valgt ligand. Således er det mulig å utvikle nye bin-dingsspesif isiteter og kraftigere bindingsspesifisiteter ved bruk av de her beskrevne fremgangsmåter for å endre bibliotekets diversitet.

Kombinasjonen av disse fremgangsmåter kan utføres på en rekke forskjellige måter, noe som vil være åpenbart for en erfaren utøver. En kan for eksempel isolere et bibliotek, mutagenisere (diversifisere), og så gjennomsøke (anrike) for en spesiell bindingsaktivitet. Alternativt kan en anrike for en spesiell aktivitet fra et bibliotek, mutagenisere det spesifikke epitopbindende kompleks og videre anrike det fremstilte bibliotek ved mutagenese.

I en annen permutasjon av dette tema kan en utnytte forskjellene mellom biblioteker basert på cpIII- og cpVIII-avledete membranankere grunnet deres iboende valensfor-skjeller. Siden et fagbibliotek med det cpIII-avledete membrananker typisk vil inneholde bare 1 til 4 kopier av det epitopbindende kompleks på overflaten av hver fagpartikkel, fremviser fagen et bindingskompleks med relativt "lav" valens, tilnærmet én. I motsetning til dette vil et fagbibliotek med et cpVIII-avledet membrananker typisk inneholde 2 0 til 1000 kopier av det epitopbindende kompleks på overflaten av hver fagpartikkel slik at fagpartikkelen fremviser en relativt "høy" valens. cpIII-baserte biblioteker henvises således til som monovalente, og cpVIII-baserte biblioteker henvises til som multivalente.

Ved bruk av de velkjente prinsipper for antistoff-affinitet og -valens vil det forstås at et cpIII-basert bibliotek kan anrikes ved gjennomsøkning for generelt høyere affinitetsbindingsinteraksjoner (bindingskonstanter på fra 10<6>tilIO<9>M"<1>) sammenlignet med det bredere affinitetsområde (bindingskonstanter på fra 10<*>til IO<9>M"<1>) som kan isoleres ved bruk av et multivalent reagens funnet i det cpvllI-baserte bibliotek. Følgelig er et cpVIII-basert bibliotek anvendbart for isolering av epitopbindende komplekser med et bredt affinitetsområde fra lavt til høyt, mens et cpIII-basert bibliotek er anvendbart for isolering av epitopbindende komplekser med et smalere område med høyere affinitet.

Det beskrives således fremstilling av et første anriket bibliotek ved anrikning av et cpVIII-basert bibliotek. Deretter overføres genene som koder for polypeptidene i det epitopbindende kompleks, til en cpIII-basert vektor, hvoretter de anrikes for bindingsinteraksjoner med høy affinitet. I én utførelse kan et muteringstrinn benyttes forut for overførsel

til den cpllI-baserte vektor.

I en annen utførelse vises evnen til modning av en ny affinitet ved et eksempel heri, i hvilket et klonet VH/VL-heterodimerkodende gen i stand til å uttrykke en heterodimer som binder liganden tetanus toxoid (TT), mutageniseres ved bruk av CDR-rettet PCR-mutagenese, og den mutageniserte nuk-leinsyrepopulasjon som herved oppnås, innsettes i et cpIII-basert bibliotek og gjennomsøkes for binding til en forskjellig ligand, fluorescein. Et epitopbindende kompleks som binder fluorescein med høy affinitet, ble identifisert.

I en beslektet utførelse ble et naivt (ikke-immunisert) bibliotek klonet inn i et cpVIII-basert bibliotek og gjennomsøkt for binding til antigenet progesteron. Lav-affinitetsbindere ble klonet inn i et cpIII-basert bibliotek, og tre kloner som binder progesteron med høy affinitet, ble identifisert. De tre kloner ble slått sammen og utsatt for feiltenderende PCR-mutagenese, og det resulterende bibliotek av muterte nukleinsyrer ble klonet inn i en cpIII-basert vektor og gjennomsøkt med progesteron slik at et epitopbindende kompleks som binder progesteron med høy affinitet, ble erholdt. Et høyaffinitetskompleks ble således "modnet" fra et naivt bibliotek.

Det beskrives således en fremgangsmåte for modning av affiniteten til et epitopbindende kompleks som kodes av en filamentøs fag ifølge foreliggende oppfinnelse, som omfatter trinnene a) tilveiebringelse av genomet til en filamentøs fag, b) mutering av nukleotidsekvensen i det erholdte genom som koder for et immunoglobulins variable område, slik at et bibliotek av fagpartikler dannes som inneholder en mutert nukleotidsekvens for et immunoglobulins variable område, c) behandling av biblioteket dannet i trinn (b) med en på forhånd valgt ligand under betingelser som tillater medlemmer av biblioteket å bindes til liganden og danne et ligandfagpar-tikkelkompleks, og d) isolering av fagpartikler i komplekset fra ikke-bundne biblioteksmedlemmer slik at et ligandanriket bibliotek som omfatter fagpartikler med bindingsspesifisitet overfor den på forhånd valgte ligand, dannes.

F. Fagbiblioteker

Det beskrives et bibliotek av DNA-molekyler som alle koder for et fusjonspolypeptid hvor biblioteket er i form av en populasjon av forskjellige filamentøse fagpartikler som alle inneholder et forskjellig rDNA-molekyl. Med forskjellig rDNA-molekyl menes et rDNA-molekyl som avviker i nukleotid-basesekvensen som koder for et polypeptid ved sammenligning med nukleotidsekvensen til et annet rDNA-molekyl i biblioteket .

Et fagbibliotek er således en populasjon av filamen-tøse fag, fortrinnsvis de filamentøse fag fl, fd eller M13, hvor hver fag har innpakket i partikkelen en rDNA-ekspresjonsvektor, og hvor rDNA-et er innkapslet i fagpartikkelen av fagens matriksproteiner. Uttrykt annerledes, inneholder et fagbibliotek et stort antall filamentøse fagpartikler hvor hver enkelt fagpartikkel inneholder minst ett epitopbindende kompleks på overflaten, som beskrevet heri. Et foretrukket bibliotek består av fagpartikler som inneholder DNA-molekyler som koder for minst IO<6>, fortrinnsvis IO<7>, og mer foretrukket IO<8>"<9>forskjellige fusjonspolypeptider. Med forskjellige fusjonspolypeptider menes fusjonspolypeptider med forskjellig aminosyrerestsekvens. Enda høyere biblioteksdiversiteter kan oppnås når fremgangsmåtene for tilfeldig kombinering eller mutagenese benyttes som beskrevet heri for å øke biblioteks-diversiteten.

Når den pakkede ekspresjonsvektor koder for det første og det annet polypeptid i en selvsammensettende reseptor, f .eks. VH- og VL-polypept i der som danner et Fab, kan biblioteket også karakteriseres som inneholdende eller uttrykkende et stort antall reseptorspesifisiteter. Biblioteker uttrykker således minst IO<5>, fortrinnsvis minst IO<6>og mer foretrukket minst IO<7>forskjellige reseptorer, for eksempel forskjellige antistoffer, T-cellereseptorer, integriner og lignende .

Bibliotekets størrelse kan variere avhengig av en rekke faktorer, spesielt fremgangsmåten ved hvilken biblioteket er fremstilt. Størrelse benyttes her for å vise til bibliotekets kompleksitet eller diversitet, dvs. antall for skjellige arter som utgjør biblioteket, snarere enn det abso-lutte partikkelantall i biblioteket.

Når et bibliotek fremstilles ved først separat å klone to genreseptorer som tilsvarer det første og det annet polypeptid, vil således den resulterende bibliotekstørrelse etter tilfeldig kombinering av de to reseptorer i form av en dicistronisk vektor forøkes kraftig. En kan for eksempel betrakte genreseptorer for variable tunge og lette antistoff-kjeder, hvert med IO<6>forskjellige medlemmer. Kombinering av de to reseptorer gir teoretisk et bibliotek med IO<12>mulige forskjellige dicistroniske vektorarter.

Et eksperimentelt system ble utformet for å evaluere muligheten for "sammenblanding" av to reseptorer som beskrevet ovenfor, for å oppnå høyere diversitet. Systemet benyttet et kombinatorisk Fab-bibliotek avledet fra en mus immunisert med haptenet paranitrofenylfosfonamidat (NPN). 22 forskjellige kloner ble isolert, og nukleinsyrene som koder for tunge og lette kjeder, ble isolert og sekvensert, hvorved det viste seg at 21 av de 22 par var forskjellige på nukleinsyresekvensnivå. De 22 NPN-1igandbindende kloner ble tilfeldig rekombinert (sammenblandet) og gjennomsøkt på nytt for NPN-binding.

Dersom det antas at tung- og lettkjeden bare kan danne 1igandbindende, heterodimere reseptormolekyler dersom de opprinnelige par gjenforenes, forutsier modellen at 4,6% av alle kombinasjoner ville gi 1igandbindende kombinasjoner. Enhver høyere prosent viser at pardannelse utover de opprinnelige par også er i stand til å binde NPN. Resultatene viste at 27 % av de isolerte kloner bandt NPN, noe som viser en 5,8-gangers økning i bibliotekets størrelse med hensyn til reseptorer i stand til å binde NPN etter sammenblanding. Denne på-viste økning er begrenset til de kloner som binder NPN. Andre medlemmer av det tilfeldig sammenblandede bibliotek har evnen til å binde forskjellige ikke-NPN-1igander. Sammenblanding ble således vist å øke diversiteten.

Bibliotekets kompleksitet kan også økes ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet her for mutering av nukleotidsekvenser i et på forhånd eksisterende sekvensbibliotek. Uttrykt som aminosyrerestforskjeller i et uttrykt fusjonspolypeptid, kan bibliotekstørrelsen potensielt øke 20 ganger for hver aminosyrerestposisjon som er et mål for tilfeldig mutasjon.

For eksempel ble, ved bruk av komplementaritetsbestemmende område- (CDR) rettet mutagenese av antistoffgener som beskrevet i eksemplene, et lineært område på 16 aminosyrerester utsatt for tilfeldig mutasjon. Med utgangspunkt i en enkelt art og mutering av alle 16 restposisjoner gjennom alle mulige kombinasjoner med et utvalg av 20 forskjellige aminosyrer, ville teoretisk et bibliotek av 20<16>forskjellige arter, eller 6 x 10<20>forskjellige arter, fremstilles.

Som beskrevet heri, er en spesiell fordel ved en filamentøs fag i foreliggende oppfinnelse at DNA-molekylet som foreligger i fagpartikkelen og koder for ett eller begge medlemmer av den heterodimere reseptor, kan skilles fra andre DNA-molekyler som foreligger i biblioteket basert på forekomst av det spesielle, uttrykte fusjonspolypeptid på fagpartikkel-ens overflate.

Isolering (segregering) av et DNA-molekyl som koder for ett eller begge medlemmer av en heterodimer reseptor, utføres ved segregering av den filamentøse fagpartikkel som inneholder det eller de interessante gen(er) vekk fra populasjonen av andre fagpartikler som utgjør biblioteket. Segregering av fagpartikler omfatter fysisk separering og oppformering av individuelle fagpartikler fjernet fra andre partikler i biblioteket. Fremgangsmåter for fysisk separering av filamen-tøse fagpartikler for fremstilling av individuelle partikler, og oppformering av de individuelle partikler for dannelse av populasjoner av fagavkom avledet fra den enkelte, segregerte partikkel, er velkjent innen fagområdet filamentøse fag.

En foretrukket separasjonsmetode omfatter identifisering av den uttrykte heterodimer på overflaten av fagpartikkelen ved hjelp av en ligandbindingsspesifisitet mellom fagpartikkelen og en på forhånd valgt ligand. Eksempelvis og foretrukket er bruk av anrikningsmetoder hvorved en fagpartik-kelsuspensjon tilsettes en fast-faseligand (et antigen) og tillates spesifikt å binde (eller immunoreagere dersom heterodimeren omfatter et immunoglobulins variable område). Etter binding vaskes ikke-bundne partikler vekk fra den faste fase, og de bundne fagpartikler er de som inneholder ligandspesifikk heterodimer reseptor (heterodimer) på sin overflate. De bundne partikler kan så gjenvinnes ved eluering av den bundne partikkel fra den faste fase, typisk ved bruk av vandige løsninger som forstyrrer ligand-reseptorinteraksjonen. Typiske løsninger omfatter buffere med høy ionestyrke, lav pH eller en mengde av løselig, konkurrerende ligand som er tilstrekkelig til å bryte reseptor-ligandbindingsinteraksj onen.

En alternativ fremgangsmåte for separering av en fagpartikkel basert på ligandspesifisiteten til den overflateut-trykte heterodimer fra en populasjon av partikler, er å felle fagpartiklene fra den oppløste fase ved kryssbinding med liganden. En eksemplarisk og foretrukket kryssbindings- og presipiteringsfremgangsmåte er beskrevet i detalj i eksempel 4c.

Bruk av de ovenfor beskrevne partikkelsegregerings-fremgangsmåter tilveiebringer er middel for gjennomsøkning av en populasjon av filamentøse fagpartikler som foreligger i et fagbibliotek. Anvendt på et fagbibliotek, kan gjennomsøkning benyttes til å anrike biblioteket med hensyn på én eller flere partikler som uttrykker en heterodimer med en på forhånd valgt ligandbindingsspesifisitet. Dersom biblioteket er utformet for å inneholde flere typer heterodimerer som alle har en viss målbar ligandbindingsaktivitet, men som skiller seg fra hverandre med hensyn til proteinstruktur, antigenisitet, ligandbindingsaffinitet eller -aviditet og lignende, kan gjennomsøkningsfremgangsmåtene benyttes etter hverandre for først å fremstille et bibliotek anriket for en på forhånd valgt bindingsspesifisitet, og deretter å fremstille et annet bibliotek ytterligere anriket ved fortsatt gjennomsøkning omfattende én eller flere isolerte fagpartikler. Fremgangsmåter for måling av ligandbindingsaktiviteter, antigenisitet og lignende interaksjoner mellom en ligand og en reseptor, er generelt velkjente og diskuteres ikke videre da de ikke er essensielle egenskaper ved foreliggende oppfinnelse.

I én utførelse er således et fagbibliotek en populasjon av partikler anriket for en på forhånd valgt ligandbindingsspesifisitet.

I en annen utførelse omfatter et fagbibliotek en populasjon av partikler hvor hver partikkel inneholder minst ett fusjonspolypeptid på overflaten av fagpartikkelen. Den faktiske mengde fusjonspolypeptid som foreligger på en fagpartikkels overflate, avhenger delvis av valget av kappeprotein-membrananker som foreligger i fusjonspolypeptidet.

Dersom ankeret er avledet 'fra cpIII, er det typisk 1 til 4 fusjonspolypeptider pr. fagpartikkel. Dersom ankeret er avledet fra det mer foretrukne cpVIII, er det mulighet for hundrevis av fusjonspolypeptider på partikkeloverflaten, avhengig av vekstbetingelser og andre faktorer som diskutert heri. Den faktiske mengde fusjonspolypeptider som foreligger på en fagpartikkel, kan justeres ved å kontrollere mengden som "fanges" av fagpartikkelen mens den syntetiseres i en vertscelle .

En fagpartikkel i et bibliotek inneholder typisk fra tilnærmet 10 til tilnærmet 500 cpVIII-avledete fusjonspolypeptider på overflaten av hver partikkel, og mer foretrukket tilnærmet 20 til 50 fusjonspolypeptider pr. partikkel. Eksempler på mengder av overflatefusjonspolypeptid er vist i de elektronmikroskopiske bilder som er beskrevet i eksempel 4a, som beskriver partikler med tilnærmet 20 til 24 cpVIII-avledete fusjonspolypeptider pr. partikkel.

I en annen utførelse omfattes en populasjon av fagpartikler som er avkom av én enkelt partikkel, og hvor følge-lig alle uttrykker den samme heterodimer på partikkeloverflaten. En slik fagpopulasjon er homogen og klonalt avledet og tilveiebringer derfor en kilde for ekspresjon av store mengder av et gitt fusjonspolypeptid. Et eksempel på en klonal, homogen fagpopulasjon er beskrevet i eksempel 4.

En filamentøs fagpartikkel i et bibliotek fremstilles ved vanlige fremgangsmåter for fremstilling av filamentøse fagpartikler og avhenger av nærværet i en DNA-ekspresjonsvektor av et replikasjonsorigo fra en filamentøs fag som beskrevet heri, for å tilveiebringe signalene som kreves for (1) produksjon av en enkelttrådet, replikativ form av filamentøs fag, og (2) pakking av den replikative form inn i en filamen-tøs fagpartikkel. Et slikt DNA-molekyl kan pakkes når det foreligger i en bakterievertscelle ved innføring av genetisk komplementering for å tilveiebringe filamentøs fag-proteinene som kreves for produksjon av infeksiøse fagpartikler. En typisk og foretrukket fremgangsmåte for genetisk komplementering er å infisere en bakterievertscelle som inneholder en DNA-ekspresjonsvektor med en filamentøs hjelperfag og således tilveiebringe de genetiske elementer som kreves for oppbygging av fagpartikler. Eksempler på hjelper-"rednings"-fremgangsmåter er beskrevet heri i eksempel 2 og beskrevet av Short et al., Nuc. Acids Res., 16:7583-7600 (1988).

Mengden av heterodimer reseptor som fanges på overflaten av en filamentøs fagpartikkel mens fagpartikkelen utskilles fra vertscellen, kan kontrolleres på en rekke måter. I én utførelse kontrolleres mengden av fusjonspolypeptidet ved bruk av sterke promotere i det første og det annet cistron for ekspresjon av polypeptidene slik at transkripsjonen av fusjonspolypeptidcistronene foregår med en hastighet som er større enn transkripsjonshastigheten av cpVIII-genet i hjelperfagen. I en annen utførelse kan hjelperfagen ha en "amber"-mutasjon i genet for ekspresjon av cpVIII slik at mindre vi11type-cpVIII transkriberes i vertscellen enn fusjonspolypeptider, noe som fører til forhøyede mengder fusjonspolypeptid i forhold til cpVIII under utskillelses-prosessen.

I en annen utførelse kan mengden heterodimer reseptor på fagpartikkeloverflaten kontrolleres ved å kontrollere tids-intervallet mellom ekspresjon av fusjonspolypeptider og super-infeksjon med hjelperfag. Etter innføring av ekspresjonsvektoren i vertscellen vil lengre ventetider før tilsetning av hjelperfag tillate økt akkumulering av fusjonspolypeptidene i vertscellen, noe som øker mengden fusjonspolypeptid som oppfanges av fagpartikkelen under utskilling.

G. Diagnostiske fremgangsmåter

Det beskrives også et diagnostisk system, fortrinnsvis utformet som et "kit", for analyse av nærvær av en på forhånd valgt ligand eller antigen i en prøve hvor det er ønskelig å påvise nærværet, og fortrinnsvis mengden, av liganden eller antigenet i en prøve, i henhold til de diagnostiske fremgangsmåter beskrevet heri.

Prøven kan være et vev, en vevsekstrakt, en væske-prøve eller en kroppsvæskeprøve som blod, plasma eller serum.

Det diagnostiske system omfatter, i en mengde som er tilstrekkelig til å utføre minst én analyse, en filamentøs fag eller 1igandbindende, heterodimer reseptor som et separat pakket reagens.

Eksempler på diagnostiske systemer for påvisning av en på forhånd valgt ligand i fast fase og som benytter en filamentøs fag ifølge foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i eksemplene.

Veiledning i bruk av de pakkede reagenser innbefattes typisk også.

Som benyttet her, viser begrepet "pakke" til et fast medium eller materiale som glass, plast {f.eks. polyetylen, polypropylen eller polykarbonat), papir, folie eller lignende, som er i stand til å holde innen faste grenser en heterodimer reseptor, en filamentøs fag eller et fagbibliotek. Således kan f.eks. en pakke være en glassampulle benyttet for å holde milligrammengder av et påtenkt, merket fagpreparat, eller den kan være en mikrotiterplatebrønn til hvilken mikrogrammengder av en påtenkt reseptor eller fagpartikkel er blitt operativt festet, dvs. tilkoblet slik at de er i stand til å binde en ligand.

"Brukerveiledning" omfatter typisk en håndgripelig tilkjennegivelse som beskriver reagenskonsentrasjonen eller i alle fall én parameter for analysefremgangsmåten, som for eksempel forholdet mellom reagensmengde og prøvemengde som skal sammenblandes, inkubasjonstidsrom for reagens/prøvebland-inger, bufferbetingelser og lignende.

Et diagnostisk system omfatter også fortrinnsvis en merking eller et påvisningsmiddel som er i stand til å signalisere dannelsen av et bindingsreaksjonskompleks som inneholder en 1igandbindende, heterodimer reseptor eller fag kompleksbundet med den på forhånd valgte ligand.

Ordet "kompleks" som benyttet her, viser til produktet av en spesifikk bindingsreaksjon som f.eks. en fag-ligand- eller reseptor-ligandreaksjon. Eksempelvise komplekser er immunoreaksj onsprodukter.

Som benyttet her, viser begrepene "merking" og "påvisningsmiddel" i sine forskjellige grammatikalske former til enkeltatomer eller molekyler som enten direkte eller indirekte er involvert i produksjonen av et påvisbart signal som viser nærvær av et kompleks. Enhver merking og ethvert påvisningsmiddel kan kobles til eller inkorporeres i et uttrykt polypeptid eller en fagpartikkel som benyttes i en diagnostisk fremgangsmåte. Slike merkinger er velkjente innen klinisk-diagnostisk kjemi.

Merkingsmidlet kan være et fluorescerende merkingsmiddel som kjemisk bindes til antistoff eller antigener uten å denaturere dem slik at et fluorokrom (et fargestoff) som er et anvendbart immunofluorescerende sporstoff, dannes. Egnede, fluorescerende merkingsmidler er fluorokromer som fluorescein-isocyanat (FIC), fluoresceinisotiocyanat (FITC), 5-dimetyl-amin-l-naftalensulfonylklorid (DANSC), tetrametylrhodaminiso-tiocyanat (TRITC), lissamin, rhodamin 8200 sulfonylklorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse av immunofluorescensana-lyseteknikker kan finnes i DeLuca, "Immunofluorescence Ana-lysis", i Antibody As a Tool, Marchalonis et al., red., John Wiley & Sons, Ltd., s. 189-231 (1982), som inkorporeres heri ved referanse.

I foretrukne utførelser er indikatorgruppen et enzym, f.eks. pepperrotperoksidase (HRP), glukoseoksidase eller lignende. I de tilfeller hvor hovedindikatorgruppen er et enzym som HRP eller glukoseoksidase, kreves ytterligere reagenser for å synliggjøre det faktum at et reseptor-ligandkompleks (en immunoreaktant) er blitt dannet. Slike tilleggsreagenser for HRP omfatter hydrogenperoksid og en oksidasjonsfargestoff-forløper som diaminobenzidin. Et tilleggsreagens som er anvendbart med glukoseoksidase, er 2,2<1->amino-di-(3-etyl-benz-tiazolin-G-sulfonsyre) (ABTS).

Radioaktive grunnstoffer er også anvendbare merkingsmidler og benyttes illustrerende heri. Et eksempel på et radioaktivt merkingsmiddel er et radioaktivt grunnstoff som produserer gammastråling. Grunnstoffer som selv utsender gam mastråler, f.eks.<1>24I, 12SI, 128I,<132>I og<51>Cr, representerer én klasse indikatorgrupper av gammastråleutsendende, radioaktive grunnstoffer. Spesielt foretrukket er<125>I. En annen gruppe av anvendbare merkingsmidler er de grunnstoffer som utsender positroner, f .eks.<11>C,<18>P,<15>0 og<13>N. De således utsendte positroner frembringer gammastråler når de treffer elektroner som foreligger i dyrekroppen. Også anvendbar er en p-utsender, f .eks.<113>"indium eller 3H.

Påkobling av merking, dvs. merking av, polypeptider og proteiner, er velkjent innen faget. For eksempel kan proteiner eller fag merkes ved metabolsk inkorporering av radio-isotopholdige aminosyrer tilsatt som en bestanddel av dyrkningsmediet. Se f.eks. Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46

(1981). Teknikker for proteinkonjugering eller kobling via aktiverte, funksjonelle grupper, er spesielt anvendbare. Se f.eks. Aurameas et al., Scand. J. Immunol., bind 8, Suppl. 7:7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984), og US patentskrift nr. 4 493 795.

De diagnostiske systemer kan også omfatte et spesifikt bindingsmiddel, fortrinnsvis som en separat pakke. Et "spesifikt bindingsmiddel" er en molekylær enhet i stand til selektivt å binde en reagenstype eller et kompleks som inneholder en slik type, men som ikke selv er et polypeptid eller en fag ifølge foreliggende oppfinnelse. Eksempler på spesifikke bindingsmidler er antistoffmolekyler, komplementpro-teiner eller fragmenter av disse, S. aureus protein A og lignende. Det spesifikke bindingsmiddel binder fortrinnsvis reagenstypen når denne type foreligger som del av et kompleks.

I foretrukne utførelser er det spesifikke bindingsmiddel merket. Dersom det diagnostiske system omfatter et spesifikt bindingsmiddel som ikke er merket, benyttes imidlertid midlet typisk som et forsterkingsmiddel eller -reagens. I disse utførelser er det merkede, spesifikt bindende stoff i stand til spesifikt å binde forsterkingsmidlet når forsterkingsmidlet er bundet til et kompleks som inneholder en reagenstype .

De diagnostiske sett kan benyttes i et "ELISA"-format for å bestemme mengden av en på forhånd valgt ligand i en væskeprøve. "ELISA" viser til en enzyrabundet immunosorbent-analyse som benytter et antistoff eller et antigen bundet til en fast fase og et enzym-antigen- eller enzym-antistoffkonju-gat for å påvise og kvantifisere mengden antigen som foreligger i en prøve, og som uten vanskeligheter anvendes i de foreliggende fremgangsmåter. En beskrivelse av ELISA-teknikken kan finnes i kapittel 22 i den 4. utgave av Basic and Clinical Immunology av D.P. Sites et al., utgitt av Lange Medical Publications, Los Altos, CA, i 1982, og i US patentskrifter nr. 3 654 090, 3 850 752 og 4 016 043, som alle inkorporeres heri ved referanse.

I noen utførelser kan således et polypeptid eller en fag ifølge foreliggende oppfinnelse festes til et fast materiale slik at et fast støttemiddel dannes som utgjør en pakke i de omtalte, diagnostiske systemer.

Et reagens festes typisk til et fast materiale ved adsorpsjon fra et vandig medium selv om andre festemåter som er anvendbare for proteiner og polypeptider, og som er velkjente blant fagfolk, kan anvendes. Eksempler på adsorpsjons-metoder er beskrevet heri.

Anvendbare, faste materialer er også velkjent innen faget. Slike materialer er vannuløselige og omfatter det kryssbundne dekstran som er tilgjengelig under varemerket "Sephadex" fra Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ), agarose, polystyrenkuler med fra tilnærmet 1 um til tilnærmet 5 mm i diameter, tilgjengelige fra Abbott Laboratories, Nord-Chicago, IL, polyvinylklorid, polystyren, kryssbundet poly-akrylamid, nitrocellulose- eller nylonbaserte nett utformet som ark, staver eller årer, eller rør, skåler eller brønnene i en mikrotiterplate slik som de fremstilt fra polystyren eller polyvinylklorid.

Reagenstypen, det merkede spesifikt bindende stoff eller forsterkingsmidlet i ethvert diagnostisk system beskrevet heri, kan tilveiebringes i løsning, som en flytende dispersjon eller som et i det vesentlige tørt pulver, f.eks. i frysetørket form. Dersom påvisningsmidlet er et enzym, kan enzymets substrat også tilveiebringes i en separat pakke i et system. Et fast støttemiddel som den ovenfor beskrevne mikro titerplate og én eller flere buffere, kan også inngå som separat pakkede deler av dette diagnostiske analysesystem.

Pakkematerialene som diskuteres her i forbindelse med diagnostiske systemer, er slike som vanligvis benyttes i diagnostiske systemer.

H. Analysefremgangsmåter

Det er beskrevet forskjellige analysefremgangsmåter for påvisning av nærvær, og fortrinnsvis mengde, av en på forhånd valgt ligand som typisk foreligger i et vandig preparat, f.eks. en biologisk væskeprøve, ved bruk av en heterodimer reseptor eller fag ifølge foreliggende oppfinnelse som et 1igandbindende reagens slik at et bindingsreaksjonsprodukt dannes hvis mengde enten direkte eller indirekte avhenger av mengden av den på forhånd valgte ligand i prøven.

Fagfolk vil forstå at det er en rekke velkjente fremgangsmåter innen klinisk-diagnostisk kjemi i hvilke et bindingsreagens kan benyttes for å danne et bindingsreaksjonsprodukt hvis mengde avhenger av mengden av liganden i en prøve.

Forskjellige heterogene og homogene fremgangsmåter, enten kompetitive eller ikke-kompetitive, kan benyttes ved utførelse av en analysefremgangsmåte.

I én utførelse beskrives en direkte bindingsanalyse som benytter en 1igandbindende, heterodimer reseptor som et bindingsreagens for å påvise nærvær av en på forhånd valgt ligand til hvilken reseptoren bindes. Fremgangsmåten omfatter trinnene a) sammenblanding av en prøve som kan tenkes å inneholde et på forhånd valgt antigen med en 1igandbindende, heterodimer reseptor, og som bindes til den på forhånd valgte ligand under bindingsbetingelser som er tilstrekkelige til at den 1igandbindende, heterodimere reseptor binder liganden og danner et ligand-reseptorkompleks, og b) påvisning av forekomst av ligand-reseptorkomplekset eller den 1igandbindende, heterodimere reseptor i komplekset.

Bindingsbetingelser er slike som opprettholder reseptorens 1igandbindende aktivitet. Slike betingelser omfatter et temperaturområde fra tilnærmet 4 til 50°C, et pH-verdiområde fra tilnærmet 5 til 9 og en ionestyrke som varierer fra tilnærmet den i destillert vann til den i tilnærmet 1 molar natriumklorid.

Påvisningstrinnet kan, som velkjent innen immunologien, rettes mot enten komplekset eller bindingsreagenset (reseptorbestanddelen av komplekset). Et sekundært bindingsreagens, f.eks. et antistoff spesifikt for reseptoren, kan således benyttes.

Alternativt kan komplekset påvises ved at et merket reseptormolekyl er benyttet, hvorved komplekset blir merket. Påvisning vil i dette tilfelle omfatte påvisning av den foreliggende merking i komplekset.

I en foretrukket utførelse tilveiebringes den ligandbindende, heterodimere reseptor festet til en filamentøs fagpartikkel, dvs. på overflaten av fagen. Et eksempel på en analyse som benytter en filamentøs fag ifølge foreliggende oppfinnelse, er beskrevet i ELISA-format i eksemplene.

I en annen utførelse merkes en filamentøs fagpartikkel på en måte som kan påvises, f.eks. ved innføring av en radioaktivt merket isotop i et fagprotein eller en fagnuklein-syre som beskrevet heri. I denne utførelse omfatter påvisningstrinnet påvisning av merkingen i komplekset og således påvisning av nærvær av liganden i komplekset.

Ytterligere en diagnostisk fremgangsmåte benytter den filamentøse fagpartikkels multivalens til kryssbinding av ligand, hvorved en samling av et stort antall ligander og fagpartikler dannes og gir et utfellbart aggregat. Denne utfør-else kan sammenlignes med de velkjente fremgangsmåter for im-munopresipitering. Denne utførelse omfatter et sammenbland-ingstrinn hvor prøven blandes med et overskudd av fagpartikler ifølge foreliggende oppfinnelse slik at en bindingsblanding dannes under bindingsbetingelser, fulgt av et separasjonstrinn for isolering av de dannede bindingskomplekser. Isoleringen oppnås typisk ved sentrifugering eller filtrering for å fjerne aggregatet fra blandingen. Nærvær av bindingskomplekser viser nærvær av en på forhånd valgte ligand som skal påvises.

Eksempler

1. Konstruksjon av en dicistronisk ekspresjonsvektor for fremstilling av en heterodimer reseptor på fagpartikler

For å oppnå et vektorsystem for dannelse av et stort antall Fab-antistoffragmenter som kan gjennomsøkes direkte, er ekspresjonsbiblioteket i bakteriofag Lambda tidligere blitt konstruert, som beskrevet i Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989). Disse systemer omfattet ikke utformingsegenskaper som gjorde at det uttrykte Fab ble styrt til overflaten av en filamentøs fagpartikkel.

Hovedkriteriet for valg av vektorsystem var behovet for å danne et størst mulig antall Fab-fragmenter som kunne gjennomsøkes direkte. Bakteriofag Lambda ble valgt som utgangspunkt for utvikling av en ekspresjonsvektor av tre grun-ner. For det første var in vi tro pakking av fag-DNA den mest effektive fremgangsmåte for gjeninnføring av DNA i vertsceller. For det andre var det mulig å påvise proteinekspresjon på enkeltfagplakk-nivå. Endelig omfattet gjennomsøkning av fagbiblioteker typisk mindre problemer med ikke-spesifikk binding. Alternativet, plasmidkloningsvektorer, er bare fordelaktige ved analyse av kloner etter at de er identifisert. Denne fordel gikk ikke tapt i det foreliggende system grunnet bruken av en dicistronisk ekspresjonsvektor som f.eks. pCombVIII, som tillater utkutting av et plasmid som inneholder de tungkjede-, lettkjede- eller Fag-uttrykkende innskudd.

a. Konstruksjon av dicistronisk ekspresjons-

vektor pCOMB

(i) Fremstilling av " Lambda Zap" II

"Lambda Zap" II er et derivat av den opprinnelige "Lambda Zap" (ATCC nr. 40 2 98) som har beholdt alle de karakteristiske egenskaper ved den opprinnelige "Lambda Zap", heriblant 6 unike kloningsseter, fusjonsproteinekspresjon og evnen til raskt å kutte ut innskuddet i form av et fagmid (Blue-script SK-), men som mangler SAM 100-mutasjonen, noe som tillater vekst i mange ikke-Sup F-stammer, heriblant XLl-Blue. "Lambda Zap" II ble konstruert som beskrevet i Short et al.,

Nuc. Acids Res., 16:7583-7600, 1988, ved å erstatte Lambda S-genet som forefinnes i et DNA-fragment på 4254 basepar (bp) fremstilt ved kutting av "Lambda Zap" med restriksjonsenzymet Nco I. Dette DNA-fragmentet på 4254 bp ble erstattet med DNA-fragmentet på 4254 bp som inneholder Lambda S-genet isolert fra Lambda gtlO (ATCC nr. 40 179), etter kutting av vektoren med restriksjonsenzymet Nco I. DNA-fragmentet på 4254 bp isolert fra lambda gtlO, ble ligert inn i den opprinnelige "Lambda Zap"-vektoren ved bruk av T4-DNA-ligase og standard-fremgangsmåter, som dem beskrevet i Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., red., John Wiley and Sons, NY, 1987, slik at "Lambda Zap" II ble dannet.

(ii) Fremstilling av Lambda Hc2

For ekspresjon av et stort antall VH-kodende DNA-homologer i en £. coli-vertscelle ble en vektor kalt Lambda Hc2, konstruert. Vektoren tilveiebrakte følgende: evnen til å plassere de VH-kodende DNA-homologer i den riktige leseramme, et ribosombindingssete som beskrevet av Shine et al., Nature, 254:34, 1975, en ledersekvens som styrer det uttrykte protein til periplasmarommet og som kalles pelB-sekresjonssignalet, en polynukleotidsekvens som kodet for en kjent epitop (epitop-merkelapp), og også et polynukleotid som kodet for et avstandsgivende protein mellom den VH-kodende DNA-homolog og polynukleotidet som koder for epitopmerkelappen. Lambda Hc2 er tidligere beskrevet av Huse et al., Science, 246:1275-1281

(1989).

For fremstilling av Lambda Hc2 ble en syntetisk DNA-sekvens som inneholdt alle de ovenfor nevnte egenskaper, konstruert ved å utforme enkelttrådete polynukleotidsegmenter på 20-40 baser som ville hybridisere til hverandre og danne den dobbelttrådete, syntetiske DNA-sekvens vist i figur 3. De forskjellige enkelttrådete polynukleotidsegmenter er vist i tabell 3.

Polynukleotidene N2, N3, N9-4, Nil, N10-5, N6, N7 og N8 (tabell 3) ble kinasebehandlet ved tilsetning av 1 ul av hvert polynukleotid (0,1 ug/ul) og 20 enheter T4-polynukleotidkinase til en løsning som inneholdt 70 mM Tris-

HC1, pH 7,6,

10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol (DTT) , 10 mM beta-merkaptoetanol og 500 mikrogram pr. milliliter (ug/ml) bovint serumalbumin (BSA). Løsningen ble bibeholdt ved 37°C i 30 minutter, og reaksjonen stoppet ved oppvarming av løsningen til 65°C i 10 minutter. De to ende-polynukleotidene, 20 ng av polynukleotidene Ni og N12, ble tilsatt kinasereaksjonsblan-dingen beskrevet ovenfor, sammen med 1/10 volum av en løsning som inneholdt 20,0 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2,0 mM MgCl2og 50,0 mM NaCl. Denne løsning ble oppvarmet til 70°C i 5 minutter og avkjølt til romtemperatur, tilnærmet 25°C, i løpet av 1,5 time i et 500 ml begerglass med vann. I løpet av dette tidsrom hybridiserte alle 10 polynukleotider slik at det dobbelttrådete, syntetiske DNA-innskudd vist i figur 3, ble dannet. De enkelte polynukleotider ble kovalent sammenkoblet for stabilisering av det syntetiske DNA-innskudd ved tilsetning av 40 ul av reaksjonsblandingen gitt ovenfor, til en løsning som inneholdt 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM adeno-sintrifosfat (ATP) og 10 enheter T4-DNA-ligase. Denne løsning ble inkubert ved 37°C i 30 minutter, hvoretter T4-DNA-ligase ble inaktivert ved inkubering av løsningen ved 65°C i 10 minutter. Ende-polynukleotidene ble kinasert ved å blande 52 ul av reaksjonsblandingen beskrevet ovenfor, 4 ul av en løsning som inneholdt 10 mM ATP og 5 enheter T4-polynukleotid-kinase. Denne løsning ble inkubert ved 37°C i 30 minutter, hvoretter T4-polynukleotidkinase ble inaktivert ved inkubering av løsningen ved 65°C i 10 minutter.

Det ferdigbehandlede, syntetiske DNA-innskudd ble ligert direkte inn i "Lambda Zap" II-vektoren beskrevet i eksempel la(i) som på forhånd var kuttet med restriksjonsenzymene Not I og Xho I. Ligeringsblandingen ble pakket ifølge produsentens instruksjoner ved bruk av "Gigapack II Gold" pakkeekstrakt som er tilgjengelig fra Stratagene, La Jolla, California. Den pakkede ligeringsblanding ble utstrøket på "XLl-Blue"-celler (Stratagene). Individuelle lambda-plakker ble plukket og innskuddene kuttet ut i henhold til in vivo-utkuttingsprotokollen for "Lambda Zap" II erholdt fra produsenten (Stratagene). Denne in vivo utkuttingsprotokoll over-førte det klonede innskudd fra Lambda Hc2-vektoren til en fagmidvektor for forenklet manipulering og sekvensering. Nøyaktigheten av kloningstrinnene beskrevet ovenfor, ble bekreftet ved sekvensering av innskuddet ved bruk av Sanger-dideoksymetoden beskrevet av Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74:5463-5467, (1977) og ved bruk av produsentens instruksjoner i et "AMV Reverse Transcriptase<35>S-ATP"-sekvenseringssett (Stratagene). Sekvensen av det resulterende dobbelttrådete, syntetiske DNA-innskudd i VH-ekspresjonsvek toren (Lambda Hc2) er vist i figur 3. Sekvensen av hver tråd (topptråd og bunntråd) av Lambda Hc2 er angitt i opplistingen av sekvenser som SEKVENSID. NR. 1, henholdsvis SEKVENSID. NR. 2. Den resulterende Lambda Hc2-ekspresjonsvektor er vist i figur 4.

(iii) Fremstilling av Lambda Lc2

For ekspresjon av et stort antall VL-kodende DNA-homologer i en E. coli vertscelle, ble en vektor kalt Lambda Lc2 konstruert med evnen til å plassere de VL-kodende DNA-homologer i riktig leseramme, og som tilveiebrakte et ribosombindingssete som beskrevet av Shine et al., Nature, 254:34 (1975), pelB-genets ledersekvens-sekresjonssignal som tidligere er benyttet til vellykket utskilling av Fab-fragmenter i E. coli av Lei et al., J. Bae, 169:4379 (1987) og Better et al., Science, 240:1041 (1988), og et polynukleotid som inneholder er restriksjonsendonukleasesete for kloning. Lambda Lc2 er tidligere beskrevet av Huse et al., Science, 246:1275-1281 (1989).

En syntetisk DNA-sekvens som inneholdt alle egen-skapene gitt ovenfor, ble konstruert ved å utforme enkelttrådete polynukleotidsegmenter på 20-60 baser som ville hybridisere til hverandre og danne den dobbelttrådete, syntetiske DNA-sekvens vist i figur 5. Sekvensen av de forskjellige enkelttrådete polynukleotidsegmenter (01-08) i den dobbelttrådete, syntetiske DNA-sekvens, er vist i tabell 4.

Polynukleotidene 02, 03, 04, 05, 06 og 07 (tabell 4) ble kinasebehandlet ved tilsetning av 1 ul (0,1 ug/ul) av hvert polynukleotid og 2 0 enheter T4-polynukleotidkinase til en løsning som inneholdt 70 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 mM beta-merkaptoetanol og 500 mg/ml BSA. Løsningen ble inkubert ved 37°C i 30 minutter, og reaksjonen stoppet ved inkubering av løsningen ved 65°C i 10 minutter. 2 0 ng av hvert av de to ende-polynukleotider, 01 og 08, ble tilsatt den ovenfor beskrevne kinasereaksjonsløsning sammen med 1/10 volum av en løsning som inneholdt 20,0 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2,0 mM MgCl2og 15,0 mM natriumklorid (NaCl) . Denne løsning ble oppvarmet til 70°C i 5 minutter og avkjølt til romtemperatur, tilnærmet 25°C, over et tidsrom på 1,5 time i et 500 ml begerglass med vann. I løpet av dette tidsrom hybridiserte alle 8 polynukleotider slik at det dobbelttrådete, syntetiske DNA-innskudd vist i figur 5, ble dannet. De enkelte polynukleotider ble kovalent sammenkoblet for stabilisering av det syntetiske DNA-innskudd ved tilsetning av 40 ul av reaksjonsblåndingen beskrevet ovenfor til en løsning som inneholdt 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 7 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM ATP og 10 enheter T4-DNA-ligase. Denne løsning ble inkubert ved 37°C i 30 minutter, hvoretter T4-DNA-ligase ble inaktivert ved inkubering av løsningen ved 65°C i 10 minutter. Ende-polynukleotidene ble kinasebehandlet ved sammenblanding av 52 ul av reaksjonsblandingen beskrevet ovenfor, 4 ul av en løsning med 10 mM ATP og 5 enheter T4-polynuk-leotidkinase. Denne løsning ble inkubert ved 37°C i 30 minutter, hvoretter T4-polynukleotidkinase ble inaktivert ved inkubering av løsningen ved 65°C i 10 minutter.

Det ferdigbehandlede, syntetiske DNA-innskudd ble ligert direkte inn i "Lambda Zap" II-vektoren beskrevet i eksempel l(a)(i) som på forhånd var kuttet med restriksjonsenzymene Sac I og Xho I. Ligeringsblandingen ble pakket i henhold til produsentens instruksjoner ved bruk av "Gigapack II Gold"-pakkeekstrakt (Stratagene). Den pakkede ligeringsblanding ble utsådd på "XLl-Blue"-celler (Stratagene). Individuelle lambda-plakker ble plukket, og innskuddene utkuttet i henhold til in vivo utkuttingsprotokollen for "Lambda Zap" II tilveiebrakt av produsenten (Stratagene). Denne in vivo utkuttingsprotokoll flyttet det klonede innskudd fra Lambda Lc2-vektoren over i en plasmid-fagmidvektor som tillater enkel manipulering og sekvensering. Nøyaktigheten av kloningstrinnene gitt ovenfor, ble bekreftet ved sekvensering av innskuddet ved bruk av produsentens instruksjoner i et "AMV Reverse Transcriptase<35>S-dATP"-sekvenseringssett (Stratagene). Sekvensen av den resulterende Lc2-ekspresjonsvektor (Lambda Lc2) er vist i figur 5. Hver tråd er angitt i opplistingen av sekvenser som SEKVENSID. NR. 3, henholdsvis SEKVENSID. NR. 4. Den resulterende Lc2-vektor er skjematisk vist i figur 6.

En foretrukket vektor kalt Lambda Lc3, er et derivat av Lambda Lc2 som ble fremstilt ovenfor. Lambda Lc2 inneholder et Spe I-restriksjonssete (ACTAGT) plassert 3' for EcoR I-restriksjonssetet og 5' for Shine-Dalgarno-ribosombindingssetet som vist i sekvensen i figur 5 og i SEKVENSID. NR. 3. Et Spe I-restriksjonssete foreligger også Lambda Hc2 som vist i figurene 3 og 4, og i SEKVENSID. NR. 1. En kombinasjonsvektor kalt pComb, ble konstruert ved å kombinere deler av Lambda Hc2 og Lc2 som beskrevet i eksempel la(iv) nedenfor. Den resulterende kombina-sjonsvektor pComb inneholdt to Spe I-restriksjonsseter, ett tilveiebrakt av Lambda Hc2 og ett av Lambda Lc2, med et EcoR I-sete mellom. Trass i forekomsten av to Spe I-restriksjonsseter ble DNA-homologer med Spe I- og EcoR I-klebrige ender med hell ligert retningsstyrt inn i en pComb-ekspresjonsvektor som på forhånd var kuttet med Spe I og EcoR I som beskrevet i eksempel lb nedenfor. Den korte avstand mellom EcoR I-restriksjonssetet og dets 3' Spe I-sete tilveiebrakt av Lc2-vektoren, hemmet den fullstendige kutting av det 3' Spe I-sete. Således førte kutting av pComb med Spe I og EcoR I ikke til at EcoR I-setet mellom de to Spe I-seter ble fjernet.

Nærvær av et annet Spe I-restriksjonssete kan være uønsket for ligeringer inn i en pComb-vektor kuttet bare med Spe I, da området mellom de to seter ville bli fjernet. Derfor fremstilles et Lambda Lc2-derivat som mangler det andre, eller 3' Spe I-sete og som kalles Lambda Lc3, ved først å kutte Lambda Lc2 med Spe I slik at en linearisert vektor dannes. Endene gjenfylles slik at butte ender dannes som så ligeres sammen for å gi Lambda Lc3 som mangler et Spe I-sete. Lambda Lc3 er en foretrukket vektor for bruk i konstruksjon av en kombinasjonsvektor som beskrevet nedenfor.

(iv) Fremstilling av pComb

Fagmider ble utkuttet fra ekspresjonsvektorene Lambda Hc2 eller Lambda Lc2 ved bruk av en in vivo utkuttingsprotokoll beskrevet ovenfor. Dobbelttrådet DNA ble fremstilt fra de fagmidholdige celler ifølge fremgangsmåtene beskrevet av Hol-mes et al., Anal. Biochem., 114:193 (1981). Fagmidene som ble dannet ved in vivo-utkuttingen, inneholdt de samme nukleotidsekvenser for antistoffragmentkloning og ekspresjon som utgangsvektorene og kalles fagmid Hc2 og Lc2,. som tilsvarer Lambda Hc2, henholdsvis Lc2.

For konstruksjon av kombinasjonsfagmidvektor pComb fremstilt ved å kombinere deler av fagmid Hc2 og fagmid Lc2, ble fagmid Hc2 først kuttet med Sac I for å fjerne restriksjonssetet plassert 5' for LacZ-promoteren. Det lineariserte fagmid ble så gjort buttendet med T4-polymerase og ligert, og dette førte til et Hc2-fagmid som mangler et Sac I-sete. Det modifiserte Hc2-fagmid og Lc2-fagmidet ble så restriksjonskuttet hver for seg med Sea I og EcoR I, noe som ga et Hc2-fragment med fra 5' til 3' Sea I-, Not I-, Xho I-, Spe I- og EcoR I-restriksjonsseter, og et Lc2-fragment med fra 5' til 3' EcoR I-, Sac I-, Xba I- og Sac I-restriksjonsseter. De lineariserte fagmider ble så sammenligert ved sine respektive klebrige ender slik at pComb, et sirkulært fagmid med et lineært arran-gement av restriksjonsseter for Not I, Xho I, Spe I, EcoR I, Sac I, Xba I, Not I, Apa I og Sea I, ble dannet. Den ligerte fagmidvektor ble så innsatt i en passende bakterievert, og transformanter ble utvalgt ved bruk av antibiotikumet ampicillin.

Utvalgte ampicillinresistente transformanter ble gjennomsøkt for nærvær av to Not I-seter. Den resulterende ampicillinresistente fagmidkombinasjonvektor ble kalt pComb, og dens skjematiske organisering er vist i figur 7. Den resulterende kombinasjonsvektor pComb besto av et DNA-molekyl med to kassetter for ekspresjon av to fusjonsproteiner og med nukleotidrestsekvenser for følgende operativt sammenkoblede elementer, oppgitt i en 5' til 3' retning: en første kassett som består av en induserbar LacZ-promoter oppstrøms for LacZ-genet, et Not I-restriksjonssete, et ribosombindingssete, en pelB-ledersekvens, en avstandsgivende sekvens, et kloningsområde avgrenset av et 5' Xho- og et 3' Spe I-restriksjonssete, en dekapeptidmerkelapp fulgt av ekspresjonskontrollstoppsekvenser, et EcoR I-restriksjonssete plassert 5' for en annen kassett som består av et ekspresjonskontrollerende ribosombindingssete, en pelB-ledersekvens, et avstandsgivende område, et kloningsområde flankert av et 5' Sac I- og et 3' Xba I-restriksjonssete fulgt av ekspresjonskontrollstoppsekvenser og et annet Not I-restriksjonssete.

En foretrukket kombinasjonsvektor kalt pComb2, er konstruert ved å kombinere deler av fagmid Hc2 og fagmid Lc3 som beskrevet ovenfor for fremstilling av pComb. Den resulterende kombinasjonsvektor, pComb2, består at et DNA-molekyl med to kassetter identisk med pComb som uttrykker to fusjonsproteiner identisk med pComb, bortsett fra at det andre Spe I-restriksjonssete i den andre kassett er fjernet.

b. Konstruksjon av vektorene pCombVIII og pComblll for ekspresjon av fusjonsproteiner med et membrananker fra et bakteriofag- kappeprotein Grunnet de mange restriksjonsendonukleaseklonings-seter er pComb-fagmidekspresjonsvektoren fremstilt ovenfor, et anvendbart kloningsmiddel for modifisering for fremstilling av en ekspresjonsvektor. For å oppnå dette kuttes pComb med EcoR

I og Spe I fulgt av fosfatasebehandling for å fremstille linearisert pComb.

(i) Fremstilling av pCombVIII

Et PCR-produkt fremstilt i eksempel 2g med en nukleotidsekvens som definerer et membranforankringsdomene fra kappeprotein VIII (cpVIII) fra en filamentøs fag og klebrige Spe I- og EcoR I-ender, ble blandet med linearisert pComb slik at en ligeringsblanding ble dannet. Det cpVIII-membrananker-kodende PCR-fragment ble retningsstyrt ligert inn i pComb-fagmidekspresjonsvektoren ved de tilsvarende klebrige ender slik at pCombVIII (også kalt pComb8) ble dannet. pCombVIII inneholder en kassett definert ved nukleotidsekvensen vist i SEKVENSID. NR. 116 fra nukleotidbase 1 til base 208, og inneholder et pelB-sekresjonssignal operativt koblet til cpVIII-membranankeret.

En foretrukket fagmidekspresjonsvektor kalt enten pComb2-VIII eller pComb2-8, ble fremstilt som beskrevet ovenfor ved retningsstyrt ligering av det cpVIII-membrananker-kodende PCR-fragment inn i en pComb2-fagmidekspresjonsvektor via de klebrige Spe I- og EcoR I-klebrige ender. pComb2-8 hadde bare ett Spe I-restriksjonssete.

(ii) Fremstilling av pComblll

En separat fagmidekspresjonsvektor ble konstruert ved bruk av sekvenser som koder for et cplII-membranforankringsdomene fra en bakteriofag. Et PCR-produkt som definerte cpIII-membranankeret og som inneholdt en LacZ-promoterregionsekvens 3' for membranankeret for ekspresjon av den lette kjede og Spe I- og EcoR I-klebrige ender, ble fremstilt som beskrevet for cpVIII, for hvilken detaljene er beskrevet i eksempel 2g. Det cplII-avledete PCR-produkt ble så ligert inn i linearisert pComb2-vektor med kun ett Spe I-sete slik at vektoren pComb2-3 (også kalt pComb2-III) ble dannet.

En mer foretrukket fagmidekspresjonsvektor med ytterligere restriksjonsenzymkloningsseter kalt pComb-III' eller pComb2-3', ble fremstilt som beskrevet ovenfor for pComb2-3, med tilføyelse av et 51 basepars fragment fra pBluescript som beskrevet av Short et al., Nuc. Acids Res., 16:7583-7600

(1988) og kommersielt tilgjengelig fra Stratagene. For fremstilling av pComb2-3' ble pComb2-3 først kuttet med restriksjonsenzymene Xho I og Spe I slik at linearisert pComb2-3 ble dannet. Vektoren pBluescript ble kuttet med de samme enzymer slik at et 51 basepars fragment som inneholdt restriksjonsenzymsetene Sal I, Acc I, Hine II, Cia I, Hind III, EcoR V, Pst I, Sma I og BamH I ble frigjort. 51-baseparfragmentet ble ligert inn i den lineariserte pComb2-3-vektor via de klebrige Xho I- og Spe I-ender slik at pComb2-3' ble dannet.

c. Konstruksjon av pCBAK- vektorer med en kloramfeni-kolresistensmarkør

For å kunne utbytte et annet gen for en selekterbar markør, som f.eks. kloramfenikolacetyltransferase (CAT), for seleksjon av bakterier transformert med en vektor ble ekspresjonsvektorer basert på pComb2, utviklet, med et gen som koder for CAT og kalt pCBAK-vektorer. pCBAK-vektorene fremstilles ved å kombinere deler av pCB og pComb2.

(i) Fremstilling av pCB

pBluescript-fagmidvektorene, pBC SK(-) og pBS SK{-), (Stratagene), ble modifisert og kombinert for å danne en tredje vektor kalt pCB som beskrevet nedenfor.

pBC SK(-), som inneholder et selekterbart markørgen for kloramfenikolresistens, ble kuttet med Bst BI og gjort buttendet med T4-polymerase. En annen kutting med Pvu I tillot fjerning av et 1 kilobases (kb) fragment og etterlot en 2,4 kb linearisert vektor som fortsatt inneholdt det selekterbare resistensmarkørgen CAT, en induserbar LacZ-promoter oppstrøms for LacZ-genet og et ColEl-origoområde. Fragmentet på 2,4 kb ble gjenvunnet. pBS SK(-)-vektoren ble kuttet med Aat II og gjort buttendet med T4-polymerase. En annen kutting med Pvu I tillot isolering av et 800 basepars (bp) fragment som inneholdt f1-replikasjonsorigoet. Ligering av det pBS-avledete 800 bp fl-fragment med det 2,4 kb pBC-fragment dannet en pCB-forløpervektor som inneholdt et Sac I-sete, et fl-replikasjonsorigo, et CAT selekterbart resistensmarkørgen, ColEl-

origo, et multippelt kloningssete (MCS) flankert av T3- og T7-promotere, og en induserbar LacZ-promoter oppstrøms for LacZ-genet.

pCB-forløpervektoren ble så kuttet med Sac I og gjort buttendet med T4-polymerase. Den T4-polymerasebehandlede pCB-vektor ble så religert slik at pCB-vektoren som mangler et Sac I-sete, ble dannet.

(ii) Fremstilling av pCBAKO

pCB-vektoren som inneholdt det selekterbare resis-tensmarkørgen CAT, ble kuttet med Sac II og Apa I og behandlet med fosfatase for å forhindre religering og danne linearisert pCB-vektor. pComb-vektoren fremstilt i eksempel l(a)(iv), ble restriksjonskuttet med Sac II og Apa I for å frigjøre et fragment som inneholdt nukleotidrestsekvenser som startet 5<1>for LacZ-promoteren og strakte seg forbi 3'-enden av det andre Not I-sete. Sac II/Apa I-pComb-DNA-fragmentet ble så retningsstyrt ligert inn i den tilsvarende kuttede pCB-vektor slik at fagmidekspresjonsvektoren pCBAKO ble dannet. Foretrukne pCBAK-ekspresjonsvektorer er konstruert med pComb2. Den resulterende pCBAK-ekspresjonsvektor inneholdt kun ett Spe I-restriksjonssete .

(iii) Fremstilling av pCBAK8

For fremstilling av en pCBAK-basert fagmidekspresjonsvektor som koder for et membranforankringsdomene fra et bakteriofag-kappeprotein i det uttrykte fusjonsprotein, ble pCB-fagmidkloningsvektor fremstilt i eksempel lc(ii), linearisert ved kutting med Sac II og Apa I. pCombVIII-fagmidekspresjonsvektoren fremstilt i eksempel lb(i), ble restriksjonskuttet med Sac II og Apa I slik at et fragment som inneholdt en nukleotidrestsekvens som startet 5' for LacZ-promoteren og strakte seg forbi 3<1->enden av det andre Not 1-sete, ble dannet. Fragmentet ble retningsstyrt ligert inn i den lineariserte pCB-kloningsvektor slik at fagmidekspresjonsvektoren pCBAK8 ble dannet.

(iv) Fremstilling av pCBAK3

Fagmidekspresjonsvektoren, pCBAK3, for ekspresjonen av fusjonsprotein med cplII-membranforankringsdomener ble konstruert på tilsvarende måte ved retningsstyrt ligering av det Sac II- og Apa I-restriksjonskuttede fragment fra pComblll til Sac II- og Apa I-linearisert pCB-kloningsvektor.

2 . Konstruksjon av dicistroniske ekspresjonsvektorer for ekspresjon av anti- NPN- heterodimer på fagoverflater

Det målrettes først de tunge (Fd bestående av VH og CH1) og lette (kappa) antistof f kj eder (VL, CL) til periplasmaet i E. coli for sammensetning av heterodimere Fab-molekyler. For å oppnå ekspresjon av antistoff-Fab-biblioteker på en fagoverflate må nukleotidrestsekvensene som koder for enten Fd eller de lette kjeder, være operativt koblet til nukleotidrestsekvensen som koder for et kappeprotein-membrananker fra en filamentøs bakteriofag. To foretrukne kappeproteiner for tilveiebringelse av et membrananker er VIII og III (cpVIII henholdsvis cpIII). I eksemplene beskrevet heri, beskrives fremgangsmåter for operativ kobling av en nukleotidrestsekvens som koder for en Fd-kjede til enten cpVIII- eller cpIII-membranankere i et fusjonsprotein.

I en fagmidvektor er et første og annet cistron som består av translaterbare DNA-sekvenser, operativt sammenkoblet slik at et dicistronisk DNA-molekyl dannes. Hvert cistron i det dicistroniske DNA-molekyl er koblet til DNA-ekspresjonskontrollsekvenser for koordinert ekspresjon av et fusjonsprotein, Fd-cpVIII eller Fd-cpIII, og en kappa-lettkjede.

Det første cistron koder for et periplasmasekresjons-signal (pelB-leder) operativt koblet til fusjonsproteinet, enten Fd-cpVIII eller Fd-cpIII. Det andre cistron koder for en annen pelB-leder operativt koblet til en kappa-lettkjede. Nærvær av pelB-lederen letter den koordinerte, men separate sekresjon av fusjonsproteinet og lettkjeden fra bakteriens cyto-plasma inn i periplasmarommet.

Prosessen beskrevet ovenfor, er vist skjematisk i figur 8. Kort beskrevet bærer fagmidekspresjonsvektoren et kloramfenikolacetyltransferase-(CAT) selekterbart resistens-markørgen i tillegg til Fd-cpVIII-fusjonen og kappakjeden. Replikasjonsorigoet fra fl-fag muliggjør dannelsen av enkelt trådet fagmid. Den isopropyltiogalaktopyranosid- (IPTG) induserte ekspresjon av et dicistronisk mRNA som koder for Fd-cpVIII -fusj onen (VH, Cm, cpVIII) og den lette kjede (VL, CL) , fører til dannelse av tunge og lette kjeder. Hver kjede føres til periplasmarommet av pelB-ledersekvensen som så kløyves av. Den tunge kjede forankres i membranen av cpVIII-membranforankringsdomenet, mens den lette kjede utskilles i periplasmaet. I nærvær av lettkjede vil den tunge kjede oppbygges til Fab-molekyler. Det samme resultat kan oppnås dersom, som en alternativ løsning, lettkjeden er forankret i membranen via et lettkjedefusjonsprotein med et membrananker, og tungkjede utskilles via en pelB-leder inn i periplasmaet.

Med påfølgende infeksjon av E. coli med en hjelperfag innbygges, etter hvert som oppbyggingen av den filamentøse bakteriofag fremskrider, kappeprotein VIII langs de filament-øse fagpartiklers hele lengde, som vist i figurene 8 og 9. Dersom cplII benyttes, foregår akkumuleringen på bakterio-fagens hale. Det er to fordeler med bruk av membranankeret fra cpVIII fremfor cpIII. For det første forefinnes et stort antall bindingsseter som består av tilnærmet 2700 cpVIII-monomerer sammensatt i et rørformet kompleks langs partikkeloverflaten. For det andre forstyrrer ikke konstruksjonen fagens infektivitet.

a. Polynukleotidseleksj on

Nukleotidsekvensene som koder for immunoglobulinpro-teiners CDR, er meget variable. Det er imidlertid flere områder med konserverte sekvenser som for eksempel flankerer V-områdedomenene i både den tunge og den lette kjede, og som inneholder i det vesentlige konserverte nukleotidsekvenser, dvs. sekvenser som vil hybridisere til samme primersekvens. Følgelig ble polynukleotidsyntese (amplifiserings-)-primere som hybridiserer til de konserverte sekvenser og som innfører i DNA-homologen som fremstilles, restriksjonsseter som er egnet for operativ kobling av de syntetiserte DNA-fragmenter til en vektor, konstruert. Mer spesifikt ble primerne utformet slik at de resulterende DNA-homologer som fremstilles, kan innsettes i en ekspresjonsvektor i samme leseramme som den oppstrøms translaterbare DNA-sekvens i det område av vektoren som inneholder midlene for retningsstyrt ligering.

(i) VH- primere

For amplifisering av VH-domenene utformes primere for innføring av klebrige ender som er kompatible med retningsstyrt ligering inn i de unike Xho I- og Spe I-seter i fagmid Hc2-ekspresjonsvektoren. For eksempel ble den 3' primer (primer 12A i tabell 5) utformet slik at den var komplementær til mRNA i JH-området. I alle tilfelle ble de 5' primere (primere 1-10, tabell 5) valgt slik at de var komplementære til førstetråden i cDNA-et i det konserverte N-terminale område (anti-"sense"-tråden). Opprinnelig ble amplifisering ut-ført med en blanding av 32 primere (primer 1, tabell 5) som var degenerert i fem posisjoner. Hybridom-mRNA kunne amplifiseres med blandede primere, men innledende forsøk på amplifisering av mRNA fra milt ga variable resultater. Derfor ble flere alternativer til amplifisering med blandede 5' primere sammenlignet.

Det første alternativ var å konstruere flere unike primere som tilsvarte enkeltmedlemmer i den blandede primer-populasjon, av hvilke åtte er vist i tabell 5. Enkeltprimerne 2-9 i tabell 5 ble konstruert ved inkorporering av ett av de to mulige nukleotider ved tre av de fem degenererte posisjoner.

Det andre alternativ var å konstruere en primer som inneholdt inosin (primer 10, tabell 5) i fire av de variable posisjoner basert på det publiserte arbeid til Takahashi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 82:1931-1935 (1985) og Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260:2605-2608 (1985). Fordelen med denne primeren er at den ikke er degenerert, og at den samtidig minimaliserer de negative virkninger av umake baser i de ikke konserverte posisjoner, som diskutert av Martin et al., Nuc. Acids Res., 13:8927 (1985). Det var imidlertid ikke kjent hvorvidt nærvær av inosinnukleotider ville føre til inkorporering av uønskede sekvenser i de klonede VH-områder. Inosin ble derfor ikke benyttet i den ene posisjon som blir igjen i de amplifiserte fragmenter etter kløyving av restrik- sjonssetene. Følgelig forekom ikke inosin i det klonede innskudd .

Ytterligere VH-amplifiseringsprimere, heriblant den unike 3' primer, ble utformet slik at de var komplementære til en del av det første konstante områdedomene i gamma 1-tungkj ede-mRNA (primere 16 og 17, tabell 5). Disse primere vil fremstille DNA-homologer som inneholder polynukleotider som koder for aminosyrer fra VH-domenet og det første konstante områdedomene i den tunge kjede. Disse DNA-homologer kan således benyttes til fremstilling av Fab-fragmenter, snarere enn Fv

Ytterligere unike 3' primere utformet for å hybridisere til lignende områder i en annen klasse av immunoglobulin-tungkjede som f.eks. IgM, IgE og IgA, omfattes. Andre 3' primere som hybridiserer til et spesifikt område av en spesifikk klasse av CHi-konstantområdet, og som er tilpasset over-føring av VH-domenene som amplifiseres ved bruk av denne primer til en ekspresjonsvektor som kan uttrykke disse VH-domener med en forskjellig klasse av tung- eller lettkjeders konstante område, omfattes også.

Som en kontroll for amplifisering fra milt- eller hybridom-mRNA ble et primersett som hybridiserer til et svært konservert område i det konstante område i IgG-tungkjedegenet, konstruert. Den 5' primer (primer 11, tabell 5) er komplementær til cDNA-et i CH2 - området, mens den 3' primer (primer 13, tabell 5) er komplementær til mRNA-et i CH3-området. Trolig forefinnes ingen umake basepar mellom disse primere og deres templater.

Primerne benyttet til amplifisering av tungkjede-Fd-fragmenter for konstruksjon av Fab-er, er vist i det minste i tabell 5. Amplifisering ble utført i åtte separate fraksjoner som hver inneholdt én av de 5' primere (primer 2-9) og én av de 3' primere (primer 16). De gjenværende 5' primere som er blitt benyttet til amplifisering i en enkelt reaksjon, er enten en degenerert primer (primer 1) eller en primer som inn-fører inosin i fire degenererte posisjoner (primer 10, tabell 5, og primer 17 og 18, tabell 6). Den gjenværende 3' primer (primer 14, tabell 6) er blitt benyttet til konstruksjon av Fv-fragmenter. Mange av de 5' primere innfører et Xho I-sete, og de 3' primere innfører et Spe I-restriksjonssete for innsetting av VH-DNA-homologen i fagmid Hc2-ekspresjonsvektoren (figur 4).

VH-amplifiseringsprimere utformet for amplifisering av variable områder i human tungkjede, er vist i tabell 6. Én av de 5' tungkjedeprimere inneholder inosinrester i degenererte nukleotidposisjoner, noe som tillater en enkelt primer å hybridisere til et stort antall variabelt områdesekvenser. Primere utformet for hybridisering til konstant områdesekven-sene i forskjellige IgG-mRNA-er, er også vist i tabell 6.

(ii) VL- primere

Nukleotidsekvensene som koder for VL-CDR-ene, er svært variable. Det er imidlertid flere områder med konserverte sekvenser som flankerer VL-CDR-domenene, heriblant JL-, VL-strukturområdene og VL-leder/promoteren. Derfor ble ampii-fiseringsprimere konstruert som hybridiserte til de konserverte sekvenser og innfører restriksjonsseter som tillater kloning av de amplifiserte fragmenter i fagmid Lc2-vektoren kuttet med Sac I og Xba I.

For amplifisering av VL-CDR-domenene ble de 5' primere (primer 1-8 i tabell 6) utformet slik at de var komplementære til førstetråds-cDNA i det konserverte, N-terminale område. Disse primere innførte også et Sac I-restriksjonsendonukleasesete for å tillate kloning av VL-DNA-homologen i fagmid Lc2-ekspresjonsvektoren. Den 3' VL-amplifiseringsprimer (primer 9 i tabell 6) ble utformet slik at den var komplementær til mRNA-et i Ji,-områdene, og for å innføre Xba I-restrik-sjonsendonukleasesetet som kreves for innsetting av VL-DNA-homologen i fagmid Lc2-ekspresjonsvektoren (figur 6).

Ytterligere 3' VL-amplifiseringsprimere ble utformet slik at de hybridiserte til det konstante område i enten kappa- eller lambda-mRNA (primere 10 og 11 i tabell 6). Disse primere tillater fremstilling av en DNA-homolog som inneholder polynukleotidsekvenser som koder for konstant område-aminosyrer fra enten kappa- eller lambda-kjeden. Disse primere gjør det mulig å fremstille et Fab-fragment, snarere enn en Fv.

Primerne benyttet til amplifisering av kappa-lett-kjedesekvenser for fremstilling av Fab-er, er vist i det minste i tabell 6. Amplifisering med disse primere ble utført i fem separate reaksjoner som hver inneholdt én av de 5' primere (primere 3-6 og 12) og én av de 3<1>primere (primer 13). Den gjenværende 3' primer (primer 9) er blitt benyttet til fremstilling av Fv-fragmenter. De 5' primere inneholder et Sac I-restriksjonssete, og de 3' primere inneholder et Xba I-restriksjonssete. VL-amplifiseringsprimere utformet for amplifisering av variable områder i humane lettkjeder av både lambda- og kappa-isotypene, er også vist i tabell 6.

Alle primere og syntetiske polynukleotider som beskrives heri, heriblant de vist i tabellene 3-7, ble enten erholdt fra Research Genetics i Huntsville, Alabama, eller syntetisert med en Applied Biosystems DNA-syntesemaskin, modell 381A, i henhold til produsentens instruksjoner.

De 19 primere som er oppført i tabell 5, er opplistet i sekvenslisten og er blitt gitt de følgende SEKVENSID. NR.:

(1) = SEKVENSID. NR. 4 0

(2) = SEKVENSID. NR. 41

(3) = SEKVENSID. NR. 42

(4) = SEKVENSID. NR. 43

(5) = SEKVENSID. NR. 44

(6) = SEKVENSID. NR. 45

(7) = SEKVENSID. NR. 46

(8) = SEKVENSID. NR. 47

(9) = SEKVENSID. NR. 48

(10) = SEKVENSID. NR. 49

(11) = SEKVENSID. NR. 50

(12) = SEKVENSID. NR. 51

(12A) = SEKVENSID. NR. 52

(13) = SEKVENSID. NR. 53

(14) = SEKVENSID. NR. 54

(15) = SEKVENSID. NR. 55

(16) = SEKVENSID. NR. 56

(17) = SEKVENSID. NR. 57

(18) = SEKVENSID. NR. 58

De 40 primere oppført som "(1)" til "(40)" i tabell 6, er også opplistet individuelt og i rekkefølge i sekvenslisten fra SEKVENSID. NR. 59 til SEKVENSID. NR. 98.

b. Fremstilling av et repertoar av gener som

koder for immunoglobuliners variable område Nitrofenylfosfonamidat (NPN) ble valgt som liganden for reseptorbinding ved fremstilling av en heterodimer reseptor ifølge fremgangsmåtene i foreliggende beskrivelse.

Albueskjell-hemocyanin (KLH) ble konjugert til NPN slik at et NPN-KLH-konjugat ble dannet, og benyttet til immunisering av en mus for frembringelse av en anti-NPN-immunrespons og således tilveiebringelse av en kilde for gener for ligandspesifikke, heterodimere reseptorer.

NPN-KLH-konjugatet ble fremstilt ved sammenblanding av 250 ul av en løsning som inneholdt 2,5 mg NPN i dimetylfor-mamid med 750 ul av en løsning som inneholdt 2 mg KLH i 0,01 molar (M) natriumfosfatbuffer (pH 7,2). De to løsninger ble sammenblandet ved langsom tilsetning av NPN-løsningen til KLH-løsningen mens KLH-løsningen ble omrørt med en roterende røremagnet. Deretter ble blandingen inkubert ved 4°C i 1 time under samme omrøring for å la konjugeringen foregå. Det kon-jugerte NPN-KLH ble isolert fra ikke-konjugert NPN og KLH ved gelfiltrering gjennom "Sephadex" G-25. Det isolerte NPN-KLH-konjugat ble injisert i mus som beskrevet nedenfor.

NPN-KLH-konjugatet ble forberedt for injisering i mus ved tilsetning av 100 ug av konjugatet til 250 ul fosfatbufret saltvann (PBS). Et likt volum komplett Freunds adjuvans ble tilsatt og emulgert i løsningen i 5 minutter. En 129 Gix+-mus ble injisert med 300 ul av emulsjonen. Injeksjoner ble gitt subkutant på flere steder ved bruk av en 21 "gauge" kanyle. Nok en immunisering med NPN-KLH ble gitt to uker senere. Denne injeksjon ble fremstilt som følger: 50 mikrogram (ug) NPN-KLH ble løst i 250 ul PBS, og et likt volum alun ble blandet med NPN-KLH-løsningen. Musen ble injisert intraperitonealt med 500 ul av løsningen ved bruk av en 23 "gauge" kanyle. Én måned senere ble musen gitt en endelig injeksjon med 50 ug av NPN-KLH-konjugatet fortynnet til 2 00 ul i PBS. Denne injeksjon ble gitt intravenøst i halesidevenen ved bruk av en 30 "gauge" kanyle. Fem dager etter denne siste injeksjon ble musene av-livet, og totalt cellulært RNA ble isolert fra miltene.

Totalt cellulært RNA ble fremstilt fra milten til en enkelt mus immunisert med KLH-NPN som beskrevet ovenfor, ved bruk av RNA-fremstillingsmetodene beskrevet av Chomczynski et al., Anal. Biochem., 162:156-159 (1987) og ved bruk av RNA-isoleringssettet (Stratagene) ifølge produsentens instruksjoner. Kort beskrevet ble vevet umiddelbart etter fjerning av milten fra den immuniserte mus homogenisert i 10 ml av en denatureringsløsning som inneholdt 4,0 M guaninisotiocyanat,

0,25 M natriumsitrat, pH 7,0, og 0,1 M beta-merkaptoetanol ved bruk av en glasshomogenisator. Én ml natriumacetat med en konsentrasjon på 2 M ved pH 4,0 ble blandet med den homogeniserte milt. Én ml fenol som på forhånd var mettet med H20, ble også

blandet med denatureringsløsningen som inneholdt den homogeniserte milt. To ml av en kloroform:isoamylalkohol- (24:1

volum/volum) blanding ble tilsatt homogenatet. Homogenatet ble blandet kraftig i 10 sekunder og inkubert på is i 15 minutter. Homogenatet ble så overført til et tykkvegget 50 ml polypro-pylensentrifugerør (Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA). Løsningen ble sentrifugert ved 10.000 x g i 20 minutter ved 4°C. Det øvre, RNA-holdige, vandige lag ble overført til et nytt 50 ml polypropylensentrifugerør og blandet med et likt volum isopropylalkohol. Denne løsning ble inkubert ved -20°C i minst én time for utfelling av RNA. Løsningen med det utfelte RNA ble sentrifugert ved 10.000 x g i 20 minutter ved 4°C. Det nedsentrifugerte, totale, cellulære RNA ble oppsamlet og løst i 3 ml av den ovenfor beskrevne denatureringsløsning. 3 ml isopropylalkohol ble tilsatt det resuspenderte, totale, cellulære RNA og grundig iblandet. Denne løsning ble inkubert ved -20°C i minst 1 time for utfelling av RNA. Løsningen med det utfelte RNA ble sentrifugert ved 10.000 x g i 10 minutter ved 4°C. Det nedsentrifugerte RNA ble vasket én gang med en løs-ning som inneholdt 75% etanol. Det nedsentrifugerte RNA ble tørket under vakuum i 15 minutter og så resuspendert i di-metylpyrokarbonat- (DEPC) behandlet H20 (DEPC-H20) .

Budbringer-RNA (mRNA) anriket på sekvenser med lange poly A-områder, ble fremstilt fra det totale, cellulære RNA ved bruk av fremgangsmåter beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis et al., red., Cold Spring Harbor, NY, (1982). Kort beskrevet ble halvparten av total-RNA-et isolert fra en enkelt immunisert musemilt fremstilt som beskrevet ovenfor, resuspendert i én ml DEPC-H20 og inkubert ved 65°C i fem minutter. Én ml 2x påsetningsbuffer med høy saltkonsentrasjon som består av 100 mM Tris-HCl (Tris-[hydroksy-metyl]-aminometan-hydroklorid), 1 M natriumklorid (NaCl),

2,0 mM dinatriumetylendiamintetraeddiksyre (EDTA) ved pH 7,5 og 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) ble tilsatt det resuspenderte RNA, og blandingen ble avkjølt til romtemperatur. Blandingen ble så satt på en oligo-dT-kolonne (Collaborative Research type 2 eller 3) som på forhånd var behandlet ved vask av oligo-dT med en løsning som inneholdt 0,1M natriumhydr-oksid og 5 mM EDTA og påfølgende ekvilibrering av kolonnen med DEPC-H20. Eluatet ble oppsamlet i et sterilt polypropylenrør

og påsatt samme kolonne etter oppvarming av eluatet i 5 minutter ved 65°C. 01 igo-dT-kolonnen ble så vasket med 2 ml påsetningsbuffer med høy saltkonsentrasjon som besto av 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM natriumklorid, 1 mM EDTA, pH 7,5, og 0,1% SDS. Oligo-dT-kolonnen ble så vasket med 2 ml 1 X buffer med

middels saltkonsentrasjon, som besto av 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM, 1 mM EDTA og 0,1% SDS. Budbringer-RNA-et ble eluert fra oligo-dT-kolonnen med 1 ml buffer som inneholdt 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, pH 7,5, og 0,05% SDS. Budbringer-RNA-et ble renset ved ekstraksjon av løsningen med fenol/- kloroform fulgt av en enkelt ekstraksjon med 100% kloroform. Budbringer-RNA-et ble konsentrert ved utfelling med etanol og resuspendert i DEPC-H20.

Budbringer-RNA-et (mRNA) isolert ved fremgangsmåten beskrevet ovenfor, inneholdt et stort antall forskjellige VH-kodende polynukleotider, dvs. mer enn tilnærmet IO<4>forskjellige VH-kodende gener, og inneholder et tilsvarende antall VL-kodende gener. mRNA-populasjonen representerer således et repertoar av gener som koder for variable områder.

c. Fremstilling av DNA- homologer

Som en forberedelse for PCR-amplifisering benyttes mRNA fremstilt ovenfor, som et templat for cDNA-syntese ved en primerforlengelsesreaksjon. I en typisk 50 ul transkripsjonsreaksjon hybridiseres først 5-10 ug milt-mRNA i vann med 500 ng (50,0 pmol) av den 3' VH-primer (primer 12A, tabell 5) ved 65°C i fem minutter. Deretter justeres blandingen til 1,5 mM dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 8 mM MgCl3, 50 mM NaCl og 2 mM spermidin. 26 enheter revers transkriptase fra Moloney-museleukemivirus (Stratagene) tilsettes, og løsningen inkuberes i 1 time ved 37°C.

PCR-amplifisering utføres i en 100 ul reaksjonsblanding som inneholder produktene fra revers transkriptasereak-sjonen (tilnærmet 5 ug cDNA/RNA-hybrid), 300 ng 3' VH-primer (primer 12A i tabell 5), 300 ng av hver av de 5' VH-primere (primer 2-10 i tabell 5), 200 mM av en blanding av dNTP-er,

50 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl2, 0,1% gelatin og 2 enheter Thermus aquaticus (Taq) DNA-polymerase (Perkin-

Elmer-Cetus, Emeryville, California). Reaksjonsblandingen overdekkes med mineralolje og utsettes for 40 sykluser med amplifisering. Hver amplifiseringssyklus omfatter denaturering ved 92°C i 1 minutt, hybridisering ved 52°C i 2 minutter og polynukleotidsyntese ved primerforlengelse ved 72°C i 1,5 minutter. Prøvene med amplifiserte, VH-kodende DNA-homologer ekstraheres så to ganger med fenol/kloroform, én gang med kloroform, felles med etanol og lagres ved -70°C i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, og 1 mM EDTA.

Ved bruk av unike 5' primere (2-9, tabell 5) oppnås effektiv syntese og amplifisering av VH-kodende DNA-homologer fra milt-mRNA-et, som vist ved agarosegelelektroforese. Det amplifiserte cDNA (VH-kodende DNA-homolog) kunne ses som et hovedbånd med den forventede størrelse (360 bp). Mengden amplifisert, VH-kodende polynukleotidfragment er tilnærmet lik i hver reaksjon, noe som tyder på at alle disse primere initi-erte amplifisering med tilnærmet lik effektivitet. Utbyttet og kvaliteten av amplifiseringen med disse primere er reproduser-bare .

Primeren med inosin ga også reproduserbar syntese av amplifiserte, VH-kodende DNA-homologer fra milt-mRNA og førte til fremstilling av fragment med forventet størrelse med en intensitet tilsvarende den til de andre amplifiserte cDNA-er. Nærvær av inosin tillater også effektiv syntese og amplifisering av DNA-homologer, noe som klart viser at slike primere er anvendbare for frembringelse av et stort antall VH-kodende DNA-homologer. Amplifiseringsprodukter oppnådd med konstant område-primerne (primer 11 og 13, tabell 5) er mer intense, noe som viser at amplifiseringen var mer effektiv, muligens grunnet en høyere homologigrad mellom templatet og primerne. Ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor, konstrueres et VH-kodende genbibliotek fra produktene av åtte amplifiseringer, hver utført med en forskjellig 5' primer. Like mengder av produktene fra hver primerforlengelsesreaksjon blandes, og det blandede produkt benyttes så til frembringelse av et bibliotek av VH-kodende, DNA-homologholdige vektorer.

DNA-homologer av VLfremstilles også fra det rensede mRNA fremstilt som beskrevet ovenfor. Som en forberedelse for

PCR-amplifisering benyttes mRNA fremstilt i henhold til eksemplene ovenfor som et templat for cDNA-syntese. I en typisk 50 pl transkripsjonsreaksjon hybridiseres først 5-10 ug milt-mRNA i vann med 300 ng (50,0 pmol) av den 3' VL-primer (primer 14, tabell 5) ved 65°C i fem minutter. Deretter justeres blandingen til 1,5 mM dATP, dCTP, dGTP og dTTP, 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 8 mM MgCla, 50 mM NaCl og 2 mM spermidin. 26 enheter revers transkriptase fra Moloney-museleukemivirus (Stratagene) tilsettes, og løsningen inkuberes i 1 time ved 37°C. PCR-amplifiseringen utføres i en 100 ul reaksjonsblanding som inneholder tilnærmet 5 ug av cDNA/RNA-hybridet fremstilt som beskrevet ovenfor, 300 ng av den 3' VL-primer (primer 14 i tabell 5), 300 ng av den 5' VL-primer (primer 16 i tabell 5), 200 mM av en blanding av dNTP-er, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 15 mM MgCl2, 0,1% gelatin og 2 enheter Taq-DNA-polymerase . Reaksjonsblandingen tildekkes med mineralolje og utsettes for 40 sykluser med amplifisering. Hver amplifiseringssyklus omfatter denaturering ved 92°C i 1 minutt, hybridisering ved 52°C i 2 minutter og forlengelse ved 72°C i 1,5 minutter. De amplifiserte prøver ekstraheres så to ganger med fenol/kloroform, én gang med kloroform, felles med etanol og lagres ved

-70°C i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, og 1 mM EDTA.

d. Innføring av DNA- homologer i en DNA-ekspresjonsvektor

For fremstilling av et ekspresjonsbibliotek anriket på VH-sekvenser, fremstilles DNA-homologer anriket på VH-sekvenser i henhold til eksempel 2c, med bruk av det samme sett med 5' primere, men med primer 12A (tabell 5) som 3'-primeren. De resulterende PCR-amplifiserte produkter (2,5 ug/30 pl av 150 mM NaCl, 8 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6 mM MgS04, 1 mM DTT,

200 pg/ml BSA) kuttes ved 37°C med restriksjonsenzymene Xho I (125 enheter) og Spe I (125 enheter). I kloningseksperimenter som krevde en blanding av amplifiseringsreaksjonsproduktene, blandes like volumer (50 pl, 1-10 pg konsentrasjon) av hver reaksjonsblanding etter amplifisering, men før restriksjonskutting. VH-homologene renses på en 1% agarosegel ved bruk av den gjengse elektroelueringsteknikken beskrevet i Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis et al., red., Cold Spring Harbor, NY, (1982). Etter gelelektroforese av det kuttede PCR-amplifiserte milt-mRNA utskjæres gelorarådet som inneholder DNA-fragmenter på tilnærmet 350 bp, elektroelueres i en dialysemembran, felles med etanol og resuspenderes i en TE-løsning som inneholder 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, og 1 mM EDTA til en sluttkonsentrasjon på 50 ng/ul. De resulterende VH-DNA-homologer representerer et repertoar av polynukleotidgener med klebrige ender tilpasset retningsstyrt ligering til vektoren Lambda Hc2. Disse fremstilte VH-DNA-homologer innføres så direkte ved retningsstyrt ligering i linearisert Lambda Hc2-ekspresjonsvektor fremstilt som beskrevet nedenfor.

Lambda Hc2-ekspresjons-DNA-vektoren forberedes for innføring av en DNA-homolog ved å sette 100 ug av dette DNA til en løsning som inneholder 250 enheter av hver av restriksjonsendonukleasene Xho I og Spe I (begge fra Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) og en buffer anbefalt av produsenten. Denne løsning inkuberes ved 37°C i 1,5 time. Løsningen oppvarmes til 65°C i 15 minutter for å inaktivere restriksjonsendonukleasene. Løsningen avkjøles til 30°C, og 25 enheter varme-labil (HK) fosfatase (Epicenter, Madison, WI) og CaCl2tilsettes i henhold til produsentens spesifikasjoner. Denne løsning inkuberes ved 3 0°C i 1 time. DNA renses ved ekstraksjon av løsningen med en blanding av fenol og kloroform fulgt av etanolfelling. Lambda Hc2-ekspresjonsvektoren er nå klar for ligering til VH-DNA-homologene fremstilt i eksemplene ovenfor. Disse fremstilte VH-DNA-homologer innføres så direkte i den Xho I- og Spe I-restriksjonskuttede Lambda Hc2-ekspresjonsvektor fremstilt ovenfor, ved ligering av 3 mol VH-DNA-homologinnskudd for hvert mol Hc2-ekspresjonsvektor over natten ved 5°C. Tilnærmet 3,0 x 10<5>plakkdannende enheter oppnås etter pakking av DNA-et med "Gigapack II Bold"

(Stratagene) av hvilke 50% er rekombinanter.

Ligeringsblandingen med VH-DNA-homologene pakkes ifølge produsentens spesifikasjoner ved bruk av "Gigapack Gold II Packing Extract" (Stratagene). De resulterende Lambda Hc2-ekspresjonsbiblioteker transformeres så inn i XLl-Blue-celler. For fremstilling av et bibliotek anriket på VL-sek venser, fremstilles PCR-amplifiserte produkter anriket på VL-sekvenser i henhold til eksempel 2c. Disse VL-DNA-homologer kuttes med restriksjonsenzymene Sac I og Xba I, og de kuttede VL-DNA-homologer renses på en 1% agarosegel som beskrevet ovenfor for VH-DNA-homologene slik at et repertoar av VL-polypeptidgener tilpasset retningsstyrt ligering, dannes. De fremstilte VL-DNA-homologer ligeres så retningsstyrt inn i Lambda Lc2-ekspresjonsvektoren som på forhånd er kuttet med restriksjonsenzymene Sac I og Xba I som beskrevet for Lambda Hc2. Ligeringsblåndingen med VL-DNA-homologene pakkes for dannelse av et Lambda Lc2-ekspresjonsbibliotek som beskrevet ovenfor, og er klart for utplating på XLl-Blue-celler.

e. Tilfeldig forening av VH- og VL- DNA-

homologer i samme ekspresjonsvektor Fremstilling av et bibliotek som inneholder vektorer for ekspresjon av to cistroner som uttrykker tunge og lette kjeder, oppnås i to trinn. I det første trinn konstrueres separate tung- og lettkjedebiblioteker i ekspresjonsvektorene Lambda Hc2, henholdsvis Lambda Lc2, som beskrevet ved bruk av genrepertoarer erholdt fra en mus immunisert med NPN-KLH. I det annet trinn kombineres disse to biblioteker ved de anti-symmetriske EcoR I-seter som foreligger i hver vektor. Dette førte til et bibliotek av kloner som hver potensielt kunne samtidig uttrykke en tung og en lett kjede. De forekommende kombinasjoner er tilfeldige og gjenspeiler ikke nødvendigvis kombinasjonene som foreligger i utgangsdyrets B-cellepopula-sjon.

Milt-mRNA-et fra immuniseringene beskrevet ovenfor (eksempel 2b), isoleres og benyttes for frembringelse av et primærbibliotek av VH-gensekvenser ved bruk av Lambda Hc2-ekspresjonsvektoren. Primærbiblioteket inneholder 1,3 x IO<6>plakkdannende enheter (pfu) og kan gjennomsøkes for ekspresjon av dekapeptidmerkelappen for å bestemme sekvensen av kloner som uttrykker VH- og CH1- (Fd-) sekvenser. Sekvensen for dette peptid er bare i leseramme for ekspresjon etter kloning av et Fd- (eller VH-) fragment inn i vektoren. Minst 80% av klonene i biblioteket uttrykker Fd-fragmenter basert på immunodeteksjon av dekapeptidmerkelappen.

Lettkjedebiblioteket fremstilles på samme måte som tungkjedebiblioteket og inneholder 2,5 x IO<6>medlemmer. Plakkgjennomsøkning ved bruk av et anti-kappakjede-antistoff antyder at 60% av biblioteket uttrykker lettkjedeinnskudd. En lav sekvens av innskudd er resultatet av ufullstendig defos-forylering av vektor etter kløyving med Sac I og Xba I.

Etter erholdelse av de to biblioteker benyttes de til fremstilling av et kombinasjonsbibliotek ved å krysse dem ved EcoR I-setet. For å oppnå krysningen renses først DNA fra hvert bibliotek.

Lambda Lc2-biblioteket fremstilt i eksempel 2d, amplifiseres, og 500 ug Lambda Lc2-ekspresjonsbibliotekfag-DNA fremstilles fra den amplifiserte fagbeholdning ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet i Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis et al., red., Cold Spring Harbor, NY (1982). 50 ug av dette amplifiserte ekspresjonsbibliotekfag-DNA inkuberes i en løsning som inneholder 100 enheter MLu I-restriksjonsendonuklease {Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) i 200 ul av en buffer levert av endonukleaseprodusenten i 1,5 time ved 37°C. Løsningen ekstraheres så med en blanding av fenol og kloroform. DNA-et felles så med etanol og resuspenderes i 100 ul vann. Denne løsning blandes med 100 enheter av restriksjonsendonukleasen EcoR I (Boehringer) i et sluttvolum på 200 ul buffer som inneholder bestanddelene angitt av produsenten. Denne løsning inkuberes ved 37°C i 1,5 time, og løs-ningen ekstraheres så med en blanding av fenol og kloroform. DNA-et felles med etanol og resuspenderes i TE.

Lambda Hc2-ekspresjonsbiblioteket fremstilt i eksempel 2d, amplifiseres, og 500 ug Lambda Hc2-ekspresjonsbibliotekfag-DNA fremstilles ved bruk av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor. 50 ug av dette amplifiserte bibliotekfag-DNA inkuberes i en løsning som inneholder 100 enheter Hind III-restriksjonsendonuklease (Boehringer) i 200 ul av en buffer levert av endonukleaseprodusenten i 1,5 time ved 37°C. Løsnin-gen ekstraheres så med en blanding av fenol og kloroform mettet med 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5. DNA-et felles så med etanol og resuspenderes i100 ul vann. Denne løsning blandes med 100 enheter av restriksjonsendonukleasen EcoR I (Boehringer) i et sluttvolum på 200 ul buffer som inneholder bestanddelene angitt av produsenten. Denne løsning inkuberes ved 3 9°C i 1,5 time, og løsningen ekstraheres så med en blanding av fenol og kloroform. DNA-et felles med etanol og resuspenderes i TE.

De restriksjonskuttede Hc2- og Lc2-ekspresjonsbiblio-teker ligeres sammen. For å oppnå dette fremstilles en DNA-blanding som består av 1 ug Hc2- og 1 ug Lc2-fagbibliotek-DNA i en 10 ul reaksjonsblanding ved bruk av reagensene levert i et ligeringssett (Stratagene). DNA-blandingen oppvarmes til 45°C i 5 minutter for å smelte klebrige ender som kan ha hybridisert. Blandingen avkjøles så til 0°C for å forhindre religering. Bakteriofag T4-DNA-ligase (0,1 Weiss-enheter som tilsvarer 0,02 enheter bestemt i en eksonukleaseresistens-analyse) tilsettes den avkjølte DNA-løsning sammen med 1 ul 5 mM ATP og 1 ul 10X bakteriofag T4-DNA-ligasebuffer (10X buffer fremstilles ved sammenblanding av 200 mM Tris-HCl, pH 7,6, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT og 500 ug/ml BSA) slik at en ligeringsblanding dannes. Etter ligering i 16 timer ved 4°C pakkes 1 ul av det ligerte fag-DNA med "Gigapack Gold II" pakkeekstrakt og utplates på XLl-Blue-celler behandlet i henhold til produsentens instruksjoner, slik at et Lambda fagbibliotek av dicistroniske ekspresjonsvektorer, som er i stand til å uttrykke tunge og lette kjeder avledet fra den NPN-immuniserte mus, dannes. En del av de erholdte kloner benyttes for å bestemme kombinasjonens effektivitet.

f. Seleksjon av anti- NPN- reaktive heterodimer-produserende, dicistroniske vektorer Kombinasjons-Fab-ekspresjonsbiblioteket fremstilt ovenfor i eksempel 2A, ble gjennomsøkt for identifisering av kloner med affinitet for NPN. For å fastsette frekvensen av fagkloner som samtidig uttrykte tung- og lettkjedefragmentene, ble duplikatavtrykk av lettkjede-, tungkjede- og kombinasjonsbiblioteket gjennomsøkt som beskrevet ovenfor, for ekspresjon av tunge og lette kjeder. I denne undersøkelse av tilnærmet 500 rekombinante fag, viste tilnærmet 60% koekspresjon av tung- og lettkjedeproteiner.

Både lettkjede-, tungkjede- og kombinasjonsbiblio teket ble gjennomsøkt for å fastslå om de inneholdt rekombinant fag som uttrykte antistoffragmenter som bandt NPN. I en typisk fremgangsmåte ble 30.000 fag utplatet på XLl-Blue-celler, og duplikatavtrykk på nitrocellulose ble gjennomsøkt for binding til NPN koblet til<125>I-merket BSA. BSA ble jodin-ert i henhold til kloramin-T-fremgangsmåten som beskrevet av Bolton et al., Biochem., 133:529-534 {1973). Gjennomsøkninger i duplikat av 80.000 rekombinante fag fra lettkjedebiblioteket og et tilsvarende antall fra tungkjedebiblioteket førte ikke til identifisering av noen kloner som bandt antigenet. I motsetning til dette førte gjennomsøkingen av et tilsvarende antall kloner fra Fab-ekspresjonsbiblioteket til identifisering av mange fagplakker som bandt NPN. Denne observasjon tyder på at under betingelser hvor mange tungkjeder i kombinasjon med lettkjeder bindes til antigen, vil de samme tunge eller lette kjeder alene ikke bindes. Når det gjelder NPN, antas det derfor at det finnes mange tunge og lette kjeder som bare binder antigen når de er kombinert med spesifikke lette, hhv. tunge kjeder.

For å vurdere evnen til å gjennomsøke et stort antall kloner og erholde et mer kvantitativt anslag over frekvensen av antigenbindende kloner i kombinasjonsbiblioteket, ble én million fagplakker gjennomsøkt, og tilnærmet 100 kloner som bandt antigen, ble identifisert. For 6 kloner som ble antatt å binde NPN, ble et område av skålen som inneholdt de 6 positive og tilnærmet 20 omliggende bakteriofagplakker utvalgt, og hver plakk ble plukket, utsådd på nytt og gjennomsøkt ved hjelp av duplikatavtrykk. Som ventet, ble tilnærmet 1 av 20 fag spesifikt bundet til antigen. Uttak av områder av de utsådde fag som ble antatt å være negative, ga ikke positive reaksjoner ved ny utsåing.

Klon 2b, én av de plakker som reagerte med NPN, ble utkuttet i henhold til en in vivo utkuttingsfremgangsmåte hvor 200 ul av fagbeholdningen og 200 ul av et F+-derivat at XL1-Blue (Asoo= 1/00) (Stratagene) ble blandet med 1 ul M13mp8-hjelperfag (1 x 10<10>pfu/milliliter (ml)) og inkubert ved 37°C i 15 minutter. Etter 4 timers inkubering i Luria-Bertani- (LB) medium og oppvarming til 70°C i 20 minutter for varmedreping av XLl-Blue-cellene ble fagmidene på ny innført i XLl-Blue-celler og utsådd på LB-skåler som inneholdt ampicillin. Denne fremgangsmåte overførte det klonede innskudd fra "Lambda Zap" II-vektoren til en plasmidvektor som tillater enkel manipulering og sekvensering (Stratagene). Fagmid-DNA-et som koder for VH og deler av VL, ble så bestemt ved DNA-sekvensering ved bruk av Sanger-dideoksyfremgangsmåten beskrevet i Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 74:5463-5467 (1977), ved bruk av et "Sequenase"-sett i henhold til produsentens instruksjoner (US Biochemical Corp., Cleveland, Ohio). Nukleotidrestsekvensen av klon 2b-Fd-kjede er oppført i sekvenslisten som SEKVENSID. NR. 99. Nukleotidrestsekvensene til kappa-lettkjedens variable og konstante områder er oppført i sekvenslisten som SEKVENSID. NR. 100, henholdsvis SEKVENSID. NR. 101.

g. Fremstilling av en DNA- sekvens som koder for

et membrananker fra kappeprotein i en fila-mentøs fag

cpVIII- membrananker: M13mpl8, en kommersielt tilgjengelig bakteriofagvektor (Pharmacia, Piscataway, New Jersey), ble benyttet som en kilde til isolering av genet som koder for cpVIII. Sekvensen av genet som koder for membranankerdomenet i cpVIII, oppført i sekvenslisten som SEKVENSID. NR. 102, ble modifisert ved PCR-amplifisering til å omfatte restriksjonsen-donukleasesetene, Spe I og EcoR I, og to stoppkodoner foran EcoR I-setet. Den tilsvarende aminosyrerestsekvens til membranankerdomenet i cpVIII er oppført som SEKVENSID. NR. 17.

For fremstilling av modifisert cpVIII ble først replikativ form-DNA fra M13mpl8 isolert. Kort beskrevet ble 50 ul av en kultur av en bakteriestamme som bærer et F'-episom (JM107, JM109 eller TG1) blandet med en tiendedels suspensjon av bakteriofagpartikler erholdt fra en enkelt plakk i 2 ml LB (Luria-Bertani-medium). Blandingen ble inkubert i 4 til

5 timer ved 37°C under konstant risting. Blandingen ble så

sentrifugert ved 12.000 x g i 5 minutter for nedsentrifugering av de infiserte bakterier. Etter fjerning av supernatanten ble de nedsentrifugerte bakterier resuspendert ved kraftig sammenblanding i 100 ul iskald løsning I. Løsning I ble fremstilt ved sammenblanding av 50 mM glukose, 10 mM EDTA og 25 mM Tris-

HC1, pH 8,0, og autoklavering i 15 minutter.

Til bakteriesuspensjonen ble 200 ul nylaget løsning II tilsatt, og røret ble hurtig snudd på hodet fem ganger. Løsning II ble fremstilt ved sammenblanding av 0,2 N NaOH og 1% SDS. Til bakteriesuspensjonen ble 150 ul iskald løsning III tilsatt, og røret ble ristet forsiktig med bunnen opp i 10 sekunder for fordeling av løsning III i det viskøse bakterielysat. Løsning III ble fremstilt ved sammenblanding av 60 ml 5 M kaliumacetat, 11,5 ml iseddik og 2 8,5 ml vann. Det resulterende bakterielysat ble så lagret på is i 5 minutter fulgt av sentrifugering ved 12.000 x g i 5 minutter ved 4°C i en mikrosentrifuge. Den resulterende supernatant ble overført til et nytt rør. Til supernatanten ble det tilsatt et likt volum fenol/kloroform, og blandingen ble sammenblandet. Blandingen ble så sentrifugert ved 12.000 x g i 2 minutter i en mikrosentrifuge. Den resulterende supernatant ble overført til et nytt rør, og det dobbelttrådete bakteriofag-DNA ble utfelt med 2 volumer etanol ved romtemperatur. Etter 2 minutters hen-stand ved romtemperatur ble blandingen sentrifugert for nedsentrifugering av DNA. Supernatanten ble fjernet, og det nedsentrifugerte replikativ form-DNA ble resuspendert i 25 pl Tris-HCl, pH 7,6, og 10 mM EDTA (TE).

Det dobbelttrådete M13mpl8-replikativ form-DNA ble så benyttet som templat for PCR. Primerne, AK 5 (SEKVENSID. NR. 103) og AK 6 (SEKVENSID. NR. 104), for hvilke sekvensene er oppført i tabell 7 nedenfor, ble benyttet i PCR-reaksjonen for amplifisering av det modne gen for cpVIII-membranankerdomenet og innføring av de to kloningssetene, Spe I og EcoR I. For PCR-reaksjonen ble 2 pl som inneholdt 1 ng Ml3mpl8-replikativ form-DNA blandet med 10 pl 10X PCR-buffer erholdt kommersielt (Promega Biotech, Madison, Wisconsin) i et 0,5 ml mikrosentri-fugerør. Til DNA-blandingen ble 8 pl av en 2,5 mM løsning av dNTP-er (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) tilsatt for å gi en sluttkonsentrasjon på 200 mikromolar (pM). 3 pl (tilsvarende 60 pico-mol (pM)) av den 5' foroverprimer AK 5 og 3 pl (60 pM) av den 3' reversprimer AK 6 ble tilsatt DNA-løsningen. Til blandingen ble 73 pl sterilt vann og 1 pl/5 enheter polymerase (Promega Biotech) tilsatt. To dråper mineralolje ble plassert på toppen av blandingen, og 40 runder med PCR-amplifisering i en pro-grammerbar varmeblokk ble utført. Amplifiseringssyklusen besto av 52°C i 2 minutter, 72°C i 1,5 minutter og 9l°C i 2 minutter. Det resulterende, PCR-modifiserte cpVIII-membranankerdomene-DNA-fragment fra Ml3mpl8-holdige prøver ble så renset med "Gene Clean" (BIO101, La Jolla, California), ekstrahert to ganger med fenol/kloroform og én gang med kloroform, fulgt av felling med etanol og lagring ved -70°C i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, og 1 mM EDTA.

For å bekrefte amplifiseringen av det modifiserte cpVIII-membranforankringsdomene ble de PCR-rensede DNA-produkter analysert ved elektroforese i en 1% agarosegel. Den forventede størrelse av cpVIII var tilnærmet 150 basepar. Området i agarosen som inneholdt det modifiserte cpVIII-DNA-fragment, ble isolert fra agarosen som beskrevet ovenfor. Sekvensen av det isolerte, modifiserte cpVIII-DNA-fragment er oppført som SEKVENSID. NR. 111. Det isolerte cpVIII-DNA-fragment ble så blandet med et tilsvarende fremstilt fragment av modifisert Fd, som beskrevet nedenfor i eksempel 2i, for å danne et DNA-segment som koder for fusjonsproteinet Fd-cpVIII.

cplII- membrananker: M13mpl8 ble også benyttet som en kilde til isolering av genet som koder for membranforankringsdomenet i cpIII, for hvilket sekvensen er oppført i sekvenslisten som SEKVENSID. NR. 112. Aminosyrerestsekvensen av mem-branf orankringsdomenet i cpIII er oppført som SEKVENSID. NR.

16. M13mpl8-replikativ form-DNA ble fremstilt som beskrevet ovenfor og benyttet som templat for to PCR-amplifiseringer for konstruksjon av et DNA-fragment som består av det modne gen for cpIII-membranforankringsdomenet plassert 5' for en sekvens som koder for promoteren, operatoren og det cap-bindende sete fra LacZ, for kontroll av lettkjedeekspresjon. Restriksjons-setene, Spe I og EcoR I, ble dannet under amplifiseringsreaksjonene og var plassert ved fragmentets 5' henholdsvis 3' ende. Fremgangsmåten for dannelse av dette fragment ved å kombinere produktene fra to separate PCR-amplifiseringer er beskrevet nedenfor.

Primerparet, G-3(F) (SEKVENSID. NR. 107) og G-3(B)

(SEKVENSID. NR. 108), begge oppført i tabell 7, ble benyttet i den første PCR-reaksjon utført som ovenfor, for amplifisering av cpIII-membranankergenet og inkorporering av Spe I- og Nhe I-restriksjonsseter i fragmentet. Det amplifiserte PCR-fragment inneholdt også nukleotidsekvenser som koder for et fem aminosyrer stort "tjor" bestående av fire glysinrester og én serin plassert mellom de tungkjede- og cplII-kodende domener. Etter ekspresjon førte den fem aminosyrer lange sekvens som mangler en ordnet sekundærstruktur, til minimalisering av interaksjonen mellom Fag- og cplII-domenene. Det resulterende PCR-modifiserte cpIII-DNA-fragment med Spe I- og Nhe I-seter i den 5', henholdsvis 3' ende, ble bekreftet og renset som beskrevet ovenfor. Sekvensen av det PCR-modifiserte cplII-mem-branf orankringsdomene -DNA- fragment er oppført i sekvenslisten som SEKVENSID. NR. 113. En annen PCR-amplifisering med primerparene Lac-F (SEKVENSID. NR. 109) og Lac-B (SEKVENSID. NR. 110) oppført i tabell 7, ble utført på et separat uttak av M13mpl8-replikativ form templat-DNA for amplifisering av promoter, operator og Cap-bindende sete fra LacZ, med et 5' Nhe I-sete og et 3' EcoR I-sete. Primerne benyttet i denne amplifisering, var utformet for innføring av et Nhe I-sete i den 5' ende av det amplifiserte fragment for overlapping med en del av den 3' ende av cpIII-genfragmentet og med Nhe I-setet 3<*>for det amplifiserte cpIII-fragment. Reaksjonen og rensing av PCR-produktet ble utført som beskrevet ovenfor. Sekvensen av det resulterende PCR-modifiserte cplII-DNA-fragment med et 5' Nhe I- og 3' EcoR I-restriksjonssete er oppført i sekvenslisten som SEKVENSID. NR. 114.

En alternativ Lac-B-primer for bruk ved konstruksjon av cplII-membranankeret og LacZ-promoterområdet var Lac-B<1>som vist i tabell 7. Amplifiseringsreaksjonene ble utført som beskrevet ovenfor, bortsett fra at Lac-B' ble benyttet sammen med Lac-F i den andre PCR-amplifiseringen, i stedet for Lac-B. Produktet fra amplifiseringsreaksjonen er oppført i sekvenslisten som SEKVENSID. NR. 114 fra nukleotidposisjon 1 til nukleotidposisjon 172. Bruk av Lac-B<1>førte til et LacZ-område som manglet 2 9 nukleotider i den 3' ende, men som funksjonelt var ekvivalent med det lengre fragment fremstilt med Lac-F og Lac-B-primerne.

Produktene fra den første og den andre PCR-amplifis-er ing ved bruk av primerparene 6-3(F) og 6-3(B), og Lac-F og

Lac-B ble så rekombinert ved nukleotidene som tilsvarer cpIII-membranankeroverlappingen og Nhe I-restriksjonssetet og utsatt for en ny runde med PCR ved bruk av G3-F- (SEKVENSID. NR. 107) og Lac-B- (SEKVENSID. NR. 110) primerparet for dannelse av et rekombinert PCR-DNA-fragmentprodukt som besto av følgende: et 5' Spe I-restriksjonssete, et cpIII-DNA-membranforankringsdomene som begynner ved nukleotidrestsekvensen som tilsvarer aminosyrerest 198 i det fullstendige, modne cplII-protein, et endogent stoppsete tilveiebrakt av membranankeret ved aminosyrerest nr. 112, et Nhe I-restriksjonssete, en LacZ-promoter, -operator og -Cap-bindingssetesekvens, og et 3' EcoR I-restriksjonssete. Det rekombinerte, PCR-modifiserte cpIII-membranforankringsdomene-DNA-fragment ble så restriksjonskuttet med Spe I og EcoR I for fremstilling av et DNA-fragment for retningsstyrt ligering inn i en pComb2-fagmidekspresjonsvektor med bare ett Spe I-sete fremstilt i eksempel la(iv), slik at en pComb2-lll- (også kalt pComb2-III) fagmidekspresjonsvektor ble dannet, som beskrevet i eksempel lb(ii).

h. Isolering av anti- NPN- kodende VH- DNA- segment

For fremstilling av modifiserte Fd-fragmenter for rekombinering med det PCR-modifiserte cpVIII-membranforank-ringsdomenefragment for dannelse av et Fd-cpVIII-DNA-fusjonsprodukt ble PCR-amplifisering utført som beskrevet ovenfor, med klon 2b, fremstilt i eksempel 2f, som et templat. Primerne, Hc3 (SEKVENSID. NR. 105) og AK 7 (SEKVENSID. NR. 106), for hvilke sekvensene er oppført i tabell 7, ble benyttet i PCR for amplifisering av Fd-delen av klon 2b og innføring av Xho I- og Spe I-kloningsseter sammen med en cpVIII-overlappende sekvens. Det amplifiserte, PCR-modifiserte Fd-produkt ble renset, analysert ved elektroforese og isolert fra 1% agarosegeler som beskrevet ovenfor. Størrelsen av Fd-fragmentet var 680 basepar.

i. Fremstilling av et DNA- segment som koder for

en del av fusjonsproteinet Fd- cpVIII

Det rensede, PCR-modifiserte Fd-DNA-fragment med cpVIII-overlappende nukleotidsekvenser fremstilt ovenfor, ble så blandet med det PCR-modifiserte cpVIII-membranforankrings-domenefragment. Fragmentene i blandingen fikk rekombinere ved sine komplementære områder. Blandingen med de rekombinerte PCR-fragmenter ble så utsatt for en ny runde med PCR-amplifis-er ing som beskrevet ovenfor, ved bruk av endeprimerparet AK 6 (SEKVENSID. NR. 104) og Hc3 (SEKVENSID. NR. 105) (tabell 7). Det tilsvarende produkt fra PCR-amplifiseringen ble renset og analysert på agarosegeler som beskrevet ovenfor. PCR-produktet ble vist å være tilnærmet 830 basepar (Fd = 680 + 150), noe som bekrefter fusjonen mellom Fd og cpVIII. Sekvensen av PCR-produktet som kobler Fd-sekvensen sammen med cpVIII-sekvensen i samme leseramme i en 5<1>til 3' retning, er oppført som SEKVENSID. NR. 115. Fd-cpVIII-fusjonsproduktet ble så benyttet i retningsstyrte ligeringer beskrevet i eksempel 2j for konstruksjon av en pCBAK8-2b-dicistronisk fagmidekspresjonsvektor .

j. Konstruksjon av den dicistroniske ekspresjonsvektor pCBAK8- 2b

For konstruksjon av en fagmidvektor for koordinert ekspresjon av et Fd-cpVIII-fusjonsprotein med kappa-lettkjede ble det PCR-amplifiserte Fd-cpVIII-fusjonsprodukt fremstilt ovenfor i eksempel 2i, først ligert inn i klon 2b-fagmideks-pres jonsvektor isolert fra NPN-kombinasjonsbiblioteket fremstilt i eksempel 2f. For ligeringen ble Fd-cpVIII-PCR-fusjonsproduktet først restriksjonskuttet med Xho I og EcoR I. Klon 2b-fagmidvektor ble kuttet på samme måte, noe som førte til fjerning av klonings- og dekapeptidområdet. Det kuttede Fd-cpVIII -f ragment ble blandet med og ligert inn i den kuttede klon 2b ved de klebrige ender dannet ved Xho I- og EcoR I-res-triksjonskuttingen. Ligeringen førte til operativ sammenkobling av nukleotidrestsekvensen som koder for Fd-cpVIII-polypeptidfusjonsproteinet til en annen kassett med nukleotidrestsekvensene som koder for ribosombindingssetet, en pelB-ledersekvens og kappa-lettkjeden som allerede forelå i klon 2b slik at et dicistronisk DNA-molekyl i den opprinnelige klon 2b-fagmidekspresjonsvektor ble dannet.

E. coli, stamme TG1, ble så transformert med fagmidet som inneholdt det dicistroniske DNA-molekyl, og transformanter ble utvalgt på ampicillin da den opprinnelige klon 2b inneholdt et ampicillinselekterbart resistensmarkørgen. For høy-effektiv elektrotransformering av E. coli ble et 1:100 volum av en over natts kultur av TG1-celler inokulert i én liter L-medium (1% Bactotrypton, 0,5% Bacto-gjærekstrakt, 0,5% NaCl). Cellesuspensjonen ble inkubert ved 37°C under kraftig risting til en absorbans ved 600 nm på 0,5 til 1,0. Cellesuspensjonen i logaritmisk vekst ble så høstet ved først å avkjøle kolben på is i 15 til 30 minutter fulgt av sentrifugering i en kald rotor ved 4000 x g i 15 minutter for å nedsentrifugere bak-teriene. Den resulterende supernatant ble fjernet, og bak-teriecellepelleten ble resuspendert i totalt 1 liter kaldt vann slik at en cellesuspensjon ble dannet. Sentrifugerings-og resuspenderingsfremgangsmåten ble gjentatt ytterligere to ganger, og etter den siste sentrifugering ble de nedsentrifugerte celler resuspendert i 20 ml kald 10% glyserol. Den resuspenderte cellesuspensjon ble så sentrifugert, og de nedsentrifugerte celler ble resuspendert i et sluttvolum på 2 til 3 ml i kald 10% glyserol, noe som ga en cellekonsentrasjon på 1 til 3 x 10<10>celler/ml. For elektrotransformeringsprosedyren ble 40 ul av den fremstilte cellesuspensjon blandet med 1 til 2 ul fagmid-DNA slik at en celle-fagmid-DNA-blanding ble dannet. Etter sammenblanding fikk blandingen stå på is i ett minutt. Et elektroporeringsapparat, f.eks. en "Gene Pulsar", ble justert til 25 uF og 2,5 kV. Pulskontrollen ble satt til 200 ohm. Celle-DNA-blandingen ble overført til en kald 0,2 cm elektro-poreringskyvette. Kyvetten ble så plassert i det isavkjølte sikkerhetskammer og gitt en puls ved betingelsene beskrevet ovenfor. Til den behandlede blanding ble så 1 ral SOC-medium tilsatt, og cellene ble resuspendert med en Pasteur-pipette (SOC-medium ble fremstilt ved sammenblanding av 2% Bactotrypton, 0,5% Bacto-gjærekstrakt, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCla, 10 mM MgS04og 20 mM glukose) . Cellesuspensjonen ble så overført til et 17 x 100 mm polypropylenrør og inkubert ved 37°C i 1 time. Etter inkubasjonen ble de transformerte TG1-celler så utsådd på ampicillin-LB-skåler for seleksjon av ampicillinresistente kolonier som inneholdt fagmidet som tilveiebrakte det selekterbare markørgen.

Ampicillinresistente kolonier ble utvalgt og analysert for korrekt innskuddsstørrelse og ekspresjon av Fab. Kort beskrevet ble DNA-minipreparater fra utvalgte kolonier fremstilt for isolering av fagmid-DNA. Det isolerte fagmid-DNA fra hvert minipreparat ble restriksjonskuttet med Xho I og EcoR I og analysert ved elektroforese i en 1% agarosegel. Klon AK16 ble valgt da et 83 0 bp fragment kunne ses på gelene, noe som bekreftet innskudd av Fd-cpVIII-PCR-fusjonsproduktet i kuttet klon 2b.

Klon AK16-fagmid ble så restriksjonskuttet med Xho I og Xba I, og nukleotidrestsekvensen for det dicistroniske DNA-molekyl som koder for Fd-cpVIII-fusjonsproteinet, ribosombindingssetet og pelB-ledersekvensen for ekspresjon av den lette kjede, et avstandsgivende område og 2b-kappa-lettkjeden ble isolert ved agarosegelelektroforese. Det isolerte, dicistroniske DNA-fragment ble så ligert inn i en Xho I- og Xba I-restriksjonskuttet pCBAKO-ekspresjonsvektor fremstilt i eksempel lc(ii) slik at en dicistronisk fagmidekspresjonsvektor kalt pCBAK8-2b, ble dannet.

Den resulterende pCBAK8-2b-ekspresjonsvektor besto av nukleotidrestsekvenser som koder for følgende elementer: replikasjonsorigo fra den filamentøse fag fl, et selekterbart resistensmarkørgen for kloramfenikolacetyltransferase, en induserbar LacZ-promoter oppstrøms for LacZ-genet, et multippelt kloningssete flankert av T3- og T7-polymerasepromotere, og det dicistroniske DNA-molekyl (en første kassett som består av et ribosombindingssete, en pelB-leder og et Fd-cpVIII-DNA-fusjonsprodukt operativt koblet til en annen kassett som be står av et nytt ribosombindingssete, en ny pelB-leder og en kappa-lettkjede.

k. Konstruksjon av den dicistroniske ekspresjonsvektor pCBAK3- 2b

For konstruksjon av en fagmidvektor for koordinert ekspresjon av et Fd-cpIII-fusjonsprotein med kappa-lettkjede ble det PCR-amplifiserte og rekombinerte cplII-membrananker-og LacZ-promoterregionområde fremstilt i eksempel 2g med et 5' Spe I- og et 3' EcoR I-restriksjonssete, først retningsstyrt ligert inn i en pComb2-fagmidekspresjonsvektor som på forhånd var kuttet med Spe I og EcoR I fremstilt i eksempel la(iv), slik at en pComb2-3- (også kalt pComb2-III) fagmidvektor ble dannet. Se eksempel lb(ii) for detaljer angående vektorkon-struksjon. Denne vektor ble benyttet når ampicillinresistente vektorer var foretrukket. Således inneholdt den resulterende pComb2-3-vektor med bare ett Spe I-restriksjonssete, uavhengige LacZ-promoter/operatorsekvenser for styring av den uavhengige ekspresjon av tungkjede-(Fd)-cpIII-fusjonsproduktet og lettkjedeproteinet. De uttrykte proteiner ble styrt til periplasmarommet av pelB-ledersekvenser for funksjonell sammensetning på membranen. Innføring av det intergeniske område fra fag Fl i vektoren tillot pakking av enkelttrådet fagmid ved hjelp av hjelperfag. Bruk av hjelperfag-superinfeksjon førte til ekspresjon av to cpIII-former. Således ble normal fagmorfogenese forstyrret ved konkurranse mellom Fab-cpIII-fusjonen og hjelperfagens native cpIII for inkorporering i viruspartikkelen, som skjematisk vist i figur 8 for Fab-cpVIII-fusjoner.

For fremstilling av kloramfenikolresistente vektorer ble den resulterende pComb2-3-fagmidvektor så restriksjonskuttet med Sac II og Apa I slik at et isolert fragment ble dannet. Det resulterende, isolerte fragment med ekspresjons-kontrollsekvensene og cplII-sekvensen ble så retningsstyrt ligert inn i en tilsvarende kuttet pCBAKO-fagmidvektor fremstilt i eksempel lc(ii) slik at en pCBAK3-fagmid-ekspres jonsvektor ble dannet. Denne vektor manglet Fd- og kappa-lettkj edesekvenser.

En kloramfenikolresistent fagmidekspresjonsvektor, pCBAK3-2b, for ekspresjon av et fusjonsprotein og kappa-lettkjede, ble så konstruert. Kort beskrevet ble pCBAK3-fag-midekspres jonsvektoren fremstilt ovenfor, først kuttet med Xho I og Spe I slik at en linearisert pCBAK3-fagmidekspresjonsvektor ble dannet. PCR-amplifisert og -modifisert Fd-fragment fremstilt i eksempel 2h, og med Xho I- og Spe I-seter, ble så restriksjonskuttet med Xho I og Spe I. Det resulterende Fd-fragment ble så retningsstyrt ligert via klebrige ender inn i den Xho I- og Spe I-restriksjonskuttede pCBAK3-fagmidekspresjonsvektor slik at en ny fagmidekspresjonsvektor i hvilken det PCR-modifiserte Fd-fragment var operativt sammenkoblet i leserammen til nukleotidrestsekvenser som kodet for cplII, ble dannet. E. coli, stamme XLl-Blue (Stratagene), ble så transformert med den ovenfor beskrevne fagmidvektor som inneholder Fd-cpIII. Transformanter med det Fd-cpIII-kodende fagmid ble utvalgt på kloramfenikol. Fagmid-DNA ble isolert fra kloramfenikolresistente kloner og ble restriksjonskuttet med Sac I og Xba I slik at en linearisert fagmidekspresjonsvektor i hvilken et Sac I- og Xba I-lettkjedefragment fremstilt nedenfor var retningsstyrt ligert, ble dannet.

Fagmid-klon 2b, isolert fra det opprinnelige kombinasjonsbibliotek som beskrevet i eksempel 2a, ble restriksjonskuttet med Sac I og Xba I for isolering av nukleotidrestsekvensen som koder for kappa-lettkjeden. Den isolerte kappa-lettkjedesekvens ble så retningsstyrt ligert inn i den Sac I-og Xba I-restriksjonskuttede fagmidekspresjonsvektor fremstilt ovenfor, og som inneholder Fd-cpIII, slik at fagmidekspresjonsvektoren pCBAK3-2b ble dannet. Den resulterende vektor inneholdt nukleotidrestsekvensen til et dicistronisk DNA-molekyl for koordinert ekspresjon av et Fd-cpIII-fusjonsprotein og kappa-lettkjede. Den resulterende fagmidekspresjonsvektor besto av nukleotidrestsekvenser som kodet for de følgende elementer: replikasjonsorigo fra den filamentøse fag fl, et selekterbart resistensmarkørgen for kloramfenikolacetyltransferase, en induserbar LacZ-promoter oppstrøms for LacZ-genet, et multippelt kloningssete flankert av T3- og T7-polymerasepromotere, og det dicistroniske molekyl (en første kassett bestående av et første ribosombindingssete og pelB- leder operativt koblet til Fd-cpIII, operativt koblet til nok en kassett som besto av nok et LacZ, nok et ribosombindingssete og nok en pelB-leder operativt koblet til en kappa-lettkjede).

XLl-Blue-celler ble så transformert med fagmidekspresjonsvektoren pCBAK3-2b. Transformerte kolonier som inneholdt de kloramfenikolresistente fagmider, ble utvalgt som beskrevet ovenfor og analysert for korrekt innskuddsstørreIse og Fab-ekspresjon som beskrevet i eksempel 2j. Etter bekreftelse av innskuddet og Fab-ekspresjon i pCBAK3-2b-fagmidvektoren ble XLl-Blue-celler så transformert og indusert for ekspresjon av Fab-antistoffer som beskrevet i eksemplene 3 og 4.

Resultatene av ekspresjonen, seleksjonen og gjennom-søkningen av Fab-cpIII-fusjonene avslørte en fordel med mono-valent fremvisning tilveiebrakt av Fab-cpIII-fusjoner fremfor multivalent fremvisning tilveiebrakt av Fab-cpVIII-fusjoner, da den tillot sortering av kloner basert på affinitet så vel som spesifisitet, på samme måte som immunsystemet gjør. En 253-gangers anrikning av den sterkt bindende klon 10C over den svakere bindende klon 7E ved bruk av pComb3-systemet som beskrevet i Barbas et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 88:7978-7982 (1991). Undersøkelser av peptidbiblioteker på fag som viste 4 til 5 peptidkopier på fagoverflaten, har vist at multivalens forhindret separasjon av fag som fremviser peptider med moderat affinitet (IO"<6>M) fra dem som fremviser peptider med høy affinitet (IO"<9>M). Cwirla et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 87:6378-6382 (1990). Multivalens fører til en chelateringseffekt som reduserer evnen til å skille mellom fag som bærer høyaffinitets-Fab-er fra de som bærer lavaffinitets-Fab-er.

Bruk av systemet ble videre demonstrert ved sortering av et tidligerekarakterisert(én binder pr. 5000 kloner) humant anti-tetanus toxoid-Fab-kombinasjonsbibliotek som beskrevet i eksempel 6 og av Persson et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 88:2432-2436 (1991). Biblioteket som opprinnelig var i et lambda-fagvektorsystem, ble rekonstruert i pComb2-3 med bevaring av de opprinnelse par mellom tung- og lettkjeder. Bibliotekstørrelsen, IO<7>kloner, var 10 ganger større enn det opprinnelige lambda-fagbibliotek. Etter en enkelt anrikningsrunde viste 13 av 57 plukkede kloner seg å være tetanus toxoid-bindere, noe som representerer en IO<3>gangers anrikning. Etter den tredje anrikningen hadde fagutbyttet økt 200 ganger, noe som antyder anrikning av spesifikk fag. Alle kloner var således antigenspesifikke hindere. Store kombinasjonsbiblioteker på IO<8>medlemmer er således tilgjengelige ved bruk av dette system. Enda større biblioteker oppnås ved mutagenese som beskrevet i eksemplene 6-8.

3 . Ekspresjon av anti- NPN- heterodimer på fagoverflater

For ekspresjon av antistoff-Fab rettet mot NPN på fagoverflater, ble XLl-Blue-celler separat transformert med fagmidvektorene pCBAK8-2b og pCBAK3-2b fremstilt i eksemplene 2j, henholdsvis 2k. Transformanter ble utvalgt på LB-skåler som inneholdt 30 ug/ml kloramfenikol. Antibiotikaresistente kolonier ble utvalgt for hver fagmidtransformasjon og dyrket i flytende kulturer ved 3 7°C i supermedium (supermedium ble fremstilt ved å blande følgende: 20 g 3-[N-morfolino]-propan-sulfonsyre (MOPS), 60 g trypton, 40 g gjærekstrakt og 2 liter vann, pH justert til 7,0 med 10 M NaOH) med 30 ug/ml kloramfenikol og 12,5 ug/ml tetracyklin for antibiotisk seleksjon av fagmidet, henholdsvis F'-episomet. De antibiotikaresistente, transformerte XLl-Blue-celler ble fortynnet til en optisk tetthet (ODsoonm) på 0,4 med supermedium. Induksj onsmidlet, isopropyltiogalaktopyranosid (IPTG), ble blandet i bakteriesuspensjonen til en sluttkonsentrasjon på 1 mM, og blandingen ble inkubert ved 3 7°C i 1 time for induksjon av ekspresjon av fusjonsproteinet og kappa-lettkjede fra LacZ-promoteren. Hjelperfag, enten R408 eller VCS M13 (Stratagene), ble så blandet med den induserte bakteriesuspensjon ved et forhold på 10-20 hjelperfag pr. transformert bakteriecelle for å initiere dannelsen av kopier av "sense"-tråden av fagmid-DNA-et. Blandingen med hjelperfag ble så inkubert i ytterligere 2 timer ved 37°C for å tillate sammensetning av filamentøs bakteriofag i hvilken de uttrykte anti-NPN-Fab-antistoffer koblet til bak-teriof agmembranforankringsdomener fra enten cpVIII eller cpIII, ble inkorporert i bakteriofagpartiklenes overflate. Bakteriesuspensjonen ble så sentrifugert, noe som førte til nedsentrifugerte bakterieceller og en supernatant som inneholdt fag. Supernatanten ble fjernet, oppsamlet og analysert som beskrevet nedenfor, for forekomst av funksjonelle anti-NPN-Fab-molekyler forankret til fagpartiklene via enten cpVIII eller cpIII.

4 . Analyser for å bekrefte forekomst og funksjon av anti- NPN- heterodimer på overflaten av filamentøs fag a. E1ekt ronmikroskop i

For lokalisering av funksjonelle Fab-molekyler ble binding til antigen merket med kolloidalt gull, undersøkt. Fagholdige supernatanter og bakterieceller fremstilt i eksempel 3, ble dryppet på formvar- {Polysciences, Inc., Warring-ton, Pennsylvania) kledde gittere festet til et fast støtte-medium. I noen eksperimenter var gitrene dekket med celler og infisert med fag in situ. Gitrene ble deretter blokkert med 1% bovint serumalbumin. (BSA) i PBS ved pH 7,2, vasket og inkubert med 2-7 nanometer (nm) kolloidale gullpartikler dekket med BSA-NPN-haptenkonjugat i et tidsrom tilstrekkelig for dannelse av et merket immunoreaksjonskompleks. Gitrene ble vasket for å fjerne overskudd av gullpartikler, negativt farget i uranyl-acetat og visualisert ved elektronmikroskopi.

Undersøkelse av filamentøse fag og permeabiliserte, fagproduserende celler viste spesifikk merking av fag eller eksponerte bakteriemembraner. Fag kunne ses å inneholde 1 til 24 kopier antigenbindende seter pr. partikkel. Hverken hjelperfag alene eller intakt E. coli ble merket med antigen. Ikke-spesifikk bakgrunnsbinding var svært lav. Filamentøse fagpartikler på vei gjennom E. coli-overflaten, ble merket med antigen som vist i figur 9.

Dannelsen av en beslektet fagoverflateekspresjonsvek-tor som benytter cpIII som fusjonspartner med klon 2b, pCBAK3-2b, viste spesifikk antigenmerking til faghodet, men ikke til fagens lengdesider. I tillegg bandt humant anti-tetanus-Fab uttrykt som en cplII-fusjon, ikke BSA-NPN-antigen.

b. Fag- ELISA

MiJcrotiterplater ble dekket med NPN-BSA-konjugat (0,1 ml, 1 ug/ml i 0,1 M Tris-HCl, pH 9,2) og blokkert med 1% BSA i PBS. To gangers seriefortynninger av pCBAK8-2b-avledet fag (0,1 ml) fremstilt i eksempel 3, ble tilsatt mikrotiter-platen og inkubert i 3 timer ved romtemperatur eller 16 timer ved 4°C. Platene ble vasket med PBS og geite-anti-kappa-alkalisk fosfatasekonjugat (Fisher Biotech, Pittsburgh, Pennsylvania) tilsatt (0,1 ml fortynnet 1/1000 i PBS med 0,1% BSA) og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Platene ble vasket med PBS og substrat tilsatt (0,1 ml, 1 mg/ml p-nitrofenylfosfat i 0,1 M Tris-HCl, pH 9,5, med 50 mM MgCl2) . Etter inkubering ved 37°C for utvikling av signal ble de optiske tettheter ved 400 nm bestemt. Konkurranseanalyser ble utført ved tilsetning av økende mengder fritt NPN-hapten i området fra 0 opp til 5 mg/brønn.

ELISA-analysene bekreftet forekomst av funksjonelt antistoff-Fab. Ved en to-seters ELISA på NPN-antigendekkede plater ved analyse med anti-muse-kappakjede-enzymkonjugat, viste fagsupernatant dannet ved hjelperfaginfeksjon av celler med pCBAK8-2b-konstruktet, de forventede titreringskurver med to gangers seriefortynninger av fag som inneholdt antistoff. Resultatene av den to-seters ELISA er vist i figur 10. For at et signal skal dannes i denne analyse må fagpartikkelen (i) ha funksjonelt forbundne Fd- og kappakjeder og (ii) være multivalent. Partikkelens spesifisitet ble undersøkt ved å hemme binding til platen i nærvær av økende konsentrasjoner av fritt hapten. De dannede fagpartikler viste binding til den faste fase i ELISA og kunne inhiberes ved tilsetning av hapten som vist i figur 11. Fullstendig hemming ble oppnådd når 5 ng fritt NPN-hapten ble benyttet i analysen. Hjelperfag ga ikke et signal i ELISA. Disse resultater viser funksjonell sammensetning av antistoff-tung- og lettkjedepolypeptider for dannelse av et epitopbindende kompleks som foreligger på fagpar-tikkelens overflate og som er i stand til å binde den forut valgt ligand som inneholder en epitop.

c. Antigenspesifikk utfelling av fag

Fagsupernatant fra XLl-Blue transformert med den dicistroniske ekspresjonsvektor pCBAK8-2b fremstilt i eksempel 3

(1 ml), ble inkubert med BSA-NPN-konjugat (10 ul, 2 mg/ml) i 18 timer ved 4°C. Blandingen ble sentrifugert ved 3 000 rpm i en bordsentrifuge og forekomst av et bunnfall notert. Hjelperfag ble benyttet som kontroll. Det nedsentrifugerte materiale ble vasket gjentatte ganger med kald PBS (5x3 ml/vask) og så resuspendert i LB (0,5 ml). De solubiliserte presipitater ble tilsatt friske XLl-Blue-celler (0,5 ml av en over natt-kultur) , inkubert i 1 time ved 37°C og uttak utsådd på LB-agar med kloramfenikol (30 ug/ml). Tilfeldige kolonier ble valgt. Koloniavtrykk på nitrocellulose ble behandlet med lysozym for å nedbryte celleveggen, behandlet en kort stund med kloroform for å bryte ned den ytre membran, blokkert med 1% BSA i PBS og inkubert med<12>SI-merket BSA-NPN-antigen. Etter flere gangers vask med PBS (med 0,05% "Tween-20") ble røntgenfilm pålagt det vaskede og tørkede filter over natten ved -70°C, hvoretter autoradiogrammene ble fremkalt.

Presipitater ble erholdt med antistoffholdig fag, men ikke hjelperfag, i nærvær av BSA-NPN. I tillegg bibeholdt par-tiklene infektivitet ved påfølgende inkubering med bakterieceller som bar F'-episomet og dannet 4 x IO<5>kolonier fra et enkelt solubilisert presipitat.

I tillegg ble DNA-restriksjonsanalyse utført for å påvise forekomst av tung- og lettkjedeinnskudd. DNA-restriksjonsanalyse av klonene viste nærvær av et Xho I- og Xba I-fragment på 1,4 kb som forventet for Fd-cpVIII-fusjonskonstrukt og kappakjedeinnskudd.

Disse resultater ga ytterligere bevis for antigen-spesifisitet og multivalens. I tillegg til å tilveiebringe immunologiske parametere gir denne utfelling muligheten for enkel anrikning av antigenspesifikke fagpartikler. I prinsippet kan fag som inneholder spesifikke antistoffer, anrikes kraftig ved felling med antigener (som kan være celleover-flatemarkører, virale, bakterielle og syntetiske molekyler). De vaskede antigen-antistoffpresipitater kan løses ved tilsetning av overskudd av antigen og levedyktige fag gjenvinnes. For gjenvinning av sjeldne typer kan et immobilisert antigen benyttes, noe som åpner veien for differensiell affinitetselu-ering.

For å vise anvendbarheten av immobilisert antigen for anrikning av kloner med definert bindingsspesifisitet ble et anrikningseksperiment utført. Et ampicillinresistent fagmid som uttrykte et anti-tetanus-Fab som en cpVIII-fusjon, ble konstruert. "Redning" av denne klon med hjelperfag førte til produksjon av fag som kodet for ampicillinresistent fagmid og som fremviste anti-tetanus-Fab på sine kappeoverflater. Disse fag som kodet for tetanus-spesifisitet, ble blandet med NPN-haptenkodende fag (1:100) og tillatt å bindes til en mikrotiterplate dekket med tetanus toxoid. Etter én times inkubering ble platene vasket grundig, og fag ble eluert med en buffer med lav pH. Infeksjon av XLl-Blue-celler i logaritmisk vekst og påfølgende utsåing av porsjoner på ampicillin og kloramfenikol, tillot direkte kvantitering av anriknings-graden. Undersøkelser av over 1000 kolonier viste at ampicillinresistente kolonier avledet fra den eluerte fag, forekom 2 7 ganger hyppigere enn kloramfenikolresistente kolonier. Fag som viste anti-tetanus-Fab, ble følgelig anriket 2700 ganger. Dette resultat antyder at en klon med definert spesifisitet som foreligger som én del pr. million, vil dominere over ikke-spesifikke kloner etter to anrikningsrunder.

5 . Fordeler ved sammensetning av antistoff- Fab-kombinasjonsbiblioteker langs fagoverflater

En kraftfull teknikk for dannelse av biblioteker medIO<8*9>medlemmer og seleksjon fra biblioteket av kombinasjons-Fab-er med forut valgte bindingsaktiviteter, presenteres her. I vektoren som beskrives heri, er restriksjonskloningssetene for innskudd av PCR-dannede antistoffragmenter blitt bibeholdt, som tidligere beskrevet for lambda-vektoren. "Redning" av genene som koder for antistoff-Fd og -kappakjedene, oppnås ved bruk av f1-replikasjonsorigoet som fører til syntese og pakking av den positive vektortråd ved koinfeksjon med hjelperfag. Da den "modne" viruspartikkel oppbygges ved inkorporering av hovedkappeproteinet rundt det enkelttrådete DNA mens det passerer gjennom den indre membran inn i periplasmarommet, oppfanges ikke bare den genetiske informasjon som bæres av fagmidvektoren, men det inkorporeres også flere kopier av funksjonelt Fab langs partikkelen. Ved påfølgende infeksjon av vertsceller som bærer F'-episomet, overfører fagmidet resistens, noe som tillater seleksjon av kolonier på det tilsvarende antibiotikum. Faktisk er antigengjenkjenningsenheten blitt sammenkoblet med instruksjoner for dens produksjon.

Den fulle kraft i det tidligere kombinasjonssystem kunne ikke fullt utnyttes, da gjennomsøkning bare tillot lett tilgang til tilnærmet 0,1-1% av medlemmene. I fagmid/M13-systemet dannes biblioteker av tilsvarende størrelse, og alle medlemmer er tilgjengelige via affinitetsseleksjon. Videre, i motsetning til lambdavektoren som dannet monovalente Fab-er, danner dette system multivalente partikler, noe som tillater oppfanging av et videre affinitetsområde.

De unike fagmidrestriksjonsseter tillater rekombinasjon av Fd- og kappakjedene, noe som muliggjør kjedeerstatning eller kjedeblanding. Frigjøring av filamentøst, enkelttrådet DNA tillater rask sekvensering og analyse av den undersøkte klons genetiske "make up". Det kan faktisk forventes at fag som koder for antistoffspesifisitet, kan anrikes ved antigen-seleksjon forut for DNA-sekvensering eller mutagenese. Muligheten for videre utvikling av en gjentatt mutasjonsprosess fulgt av seleksjon, kan tillate hurtig dannelse av høyaffini-tetsantistoff fra kimbanesekvenser. Prosessen kan automatis-eres. Bortsett fra systemets potensial for å etterligne naturen, vil fagmid/M13-systemet tillate en mer fullstendig disseksjon av antistoffresponsen hos mennesket, noe som kan gi anvendbare terapeutiske og diagnostiske reagenser.

Membranforankringen av tungkjeden og kompartmentalis-eringen av kappakjeden i periplasmaet er nøkkelen til ekspresjon av dette funksjonelle, dimere protein. Dette systems potensial er på ingen måte begrenset til antistoffer og kan ut-vides til ethvert proteingjenkjenningssystem eller kombina-s-jon av systemer som inneholder flere medlemmer. For eksempel er kobling av ligand- og effektorsystemer i et støttemedium med høy bindingsevne nå mulig. Tilsvarende kan et ligand-bibliotek sorteres mot et reseptorbibliotek.

6. Randomisert mutagenese av CDR3- området i en tungkjede som koder for anti- tetanus toxoid a. PCR- mutagenese med degenererte oligonukleotider

For å erholde en mutagenisert heterodimer med endret spesifisitet som ikke lenger gjenkjenner et tetanus toxoid-antigen (TT), men som ville gjenkjenne og spesifikt bindes til et nytt antigen, ble en metode utviklet for randomisering kun av CDR3-området i et tungkjedefragment kodet for av en kjent nukleotidsekvens. Denne tilnærming er skjematisk fremstilt i figur 12 hvor et representativt tungkjedefragment i en fagmidklon som består av alternerende strukturområder (1 til 4) vist med hvite blokker, og komplementaritetsbestemmende områder (CDR) (1 til 3) vist ved skraverte blokker, og det første konstante område (CH1), utsettes for to separate PCR-runder. I den første PCR-amplifiseringsreaksjonen amplifiseres den 5' ende av tungkjeden fra strukturområde 1 til den 3' ende av strukturområde 3. I den andre PCR-amplifiseringsreaksjon innføres tilfeldige mutasjoner i CDR3-området, vist med den sorte boks. Dette oppnås ved bruk av en samling av oligonukleotidprimere syntetisert med et degenerert område plassert mellom og kontinuerlig med det konserverte strukturområde 3- og 4-sekvenser. Amplifikasjonsproduktene fra den andre amplifiseringen, hvert med et randomisert CDR3-område, har sine 5' ender ved den 3<1>ende av strukturområde 3, mens den 3' ende av produktet strekker seg til den 3' ende av CH1-området.

Samlingen av degenererte oligonukleotidprimere er utformet for å gi amplifisering av produkter med en 5' ende som er komplementær til, og vil overlappe med, den 3' ende til produktene fra den første PCR-reaksjon. De to separate PCR-reaksjonsprodukter slås således sammen og utsettes for en tredje PCR-reaksjon, i hvilken det overlappende område mellom de to produkter forlenges for å gi en tungkjede med et randomisert CDR3-område.

Et tungkjede-DNA-templat var tilgjengelig i en klon (en fagmidvektor kalt 7E som inneholdt tung- og lettkjedefragmenter) fra et humant anti-tetanus toxoid- (TT) Fab-kombinasjonsbibliotek avledet fra lambda Hc2- og Lc2- biblioteker som beskrevet av Persson et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 88:2432-2436 (1991). For å frembringe et halv-syntetisk kombinasjonsbibliotek ble klon 7E konstruert i den dicistroniske ekspresjonsvektor pComb2-3' for ekspresjon av et tungkjede-cpIII-membranankerfusjonsprotein (Fd-cpIII) og en løselig lettkjede, som beskrevet for anti-NPN i eksempel 2k av Barbas et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 88:7978-7982

(1991) .

Fagmidvektoren pComb2-3' ble fremstilt som beskrevet i eksempel lb(ii). Den opprinnelige paring av tung- og lettkjedene fra 7E-lambdaklonen ble bibeholdt ved ligering av Xho I - Xba I-fragmentet inn i en Xho I - Xba I-kuttet pComb2-3'-vektor. For å erstatte cplII-membranankersekvensen, LacZ-pro-motersekvensen og pelB-lederen fjernet ved Xho I - Xba I-kut-tingen, ble et Spe I - Sac I-fragment fra pComb3 fremstilt i eksempel lb(ii), ligert inn i pComb2-3<1->vektoren med tung- og lettkjedesekvensene fra klon 7E. Den resulterende fagmidklon, her i det følgende kalt pC3-TT7E, ble først uttrykt som beskrevet for anti-NPN-heterodimerer på fagoverflater i eksempel 3, og deretter gjennomsøkt ved anrikning på TT-dekkede plater som beskrevet for anti-NPN i eksempel 4c. Klon pC3-TT7E viste en Kdoverfor TT av størrelsesordenen IO<7>M og var anriket IO<3>ganger over ikke-spesifikk fag, som beskrevet av Barbas et al., supra.

Klon pC3-TT7E som både har tung- og lettkjede-sekvenser, ble benyttet som templat-DNA for den randomiserte mutagenese av CDR3-området i tungkjeden, for å endre antigen-bindingsspesifisiteten som beskrevet heri. Sekvensen av tungkjeden ble bestemt som beskrevet i eksempella(ii). To separate PCR-reaksjoner ble utført som illustrert i figur 12.

Den første PCR-reaksjonen førte til amplifisering av det område i tungkjedefragmentet i pC3-TT7E-klonen som begynner med strukturområde 1 og strekker seg til enden av strukturområde 3 som er plassert 5<1>for CDR3 og som er tilnærmet 400 basepar langt. For å amplifisere dette område ble følgende primerpar benyttet. Den 5' anti-"sense" oligonukleotidprimer, FT3X, med nukleotidsekvensen 5'-G-CAA-TAA-ACC-CTC-ACT-AAA-GGG-3' (SEKVENSID. NR. 118) som hybridiserte til den ikke-kodende tråd av tungkjeden som tilsvarer området 5' for og innbefat-tende begynnelsen av strukturområde 1. Den 3' "sense"-oligonukleotidprimer, B7EFR3, med nukleotidsekvensen 5'-TCT-CGC-ACA-ATA-ATA-CAC-GGC-3<1>(SEKVENSID. NR. 119) hybridiserte til den kodende tråd av tungkjeden som svarer til den 3' ende av strukturområde 3. Oligonukleotidprimerne ble syntetisert av Research Genetics (Huntsville, AL). PCR-reaksjonen ble utført i en 100 pl reaksjon som inneholdt 1 pg av hver av oligonukleotidprimerne FTX3 og B7EFR3, 8 pl 2,5 mM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 1 pl Taq-polymerase, 10 ng templat pCE-TT7E og 10 pl 10X PCR-buffer, erholdt kommersielt (Promega Biotech). To dråper mineralolje ble plassert over blandingen, og 35 runder med PCR-amplifisering i en termosykler ble utført. Amplifikasjonssyklusen besto av denaturering ved 94°C i ett minutt, hybridisering ved 50°C i ett minutt og forlengelse ved 72°C i to minutter. De resulterende PCR-amplifiseringsprodukter ble så gelrenset som beskrevet i eksempel ld og benyttet i en overlappsforlengelse-PCR-reaksjon med produktene fra den andre PCR-reaksjon, begge som beskrevet nedenfor, for rekombinasjon av de to produkter til rekonstruerte tungkjeder med mutageniserte CDR3-områder, som illustrert i figur 12. Det totale DNA-utbytte fra denne amplifisering var tilnærmet 3 pg/100 pl.

Den andre PCR-reaksjon førte til amplifisering av tungkjeden fra den 3' ende av strukturområdet 3 til enden av CH1-området som gir tilnærmet 3 90 basepars lengde. For amplifisering av dette område ble følgende primere benyttet. Den 5' anti-"sense"-oligonukleotidprimersamling, kalt 7ECDR3, hadde nukleotidsekvensen representert ved formelen

5•-GTG-TAT-TAT-TGT-GCG-AGA-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-NNS-TGG-GGC-CAA-GGG-ACC-ACG-3'

hvor N kan være A, C, G eller T og S enten er C eller G (SEKVENSID. NR. 120), hvor den 5' ende av primersamlingen var komplementær til den 3<1>ende av strukturområde 3 representert av den komplementære nukleotidsekvens til oligonukleotid-primeren B73FR3, og den 3' ende av primersamlingen var komplementær til den 5' ende av strukturområde 4. Området mellom de to angitte ender av primersamlingen var representert av en 48-

mer NNS-degenerasjon som kodet for en variert populasjon av mutageniserte, 16 aminosyrerester lange CDR3-områder. Den 3' "sense"-oligonukleotidprimer CG1Z, beskrevet av Persson et al., supra, og med nukleotidsekvensen 5'-GCATGTACTAGTTTTGTCAC-AAGATTTGGG-3' (SEKVENSID. NR. 121), hybridiserte til den kodende tråd av tungkjeden som tilsvarer den 3' ende av CH1. Den andre PCR-reaksjon ble utført på pC3-TT7E i en 100 ul reaksjonsblanding som beskrevet ovenfor, med 1 ug av hver av oligonukleotidprimerne 7ECDR3 og CG1Z. De resulterende PCR-amplifiseringsprodukter ble så gelrenset som beskrevet ovenfor. Det totale DNA-utbytte fra denne andre PCR-mutageneseamplifisering var tilnærmet 3 ug/100 ul.

100 nanogram gelrensede produkter fra første og annen PCR-reaksjon ble så blandet med 1 ug av hver av oligonukleotidprimerne FTX3 og CG1Z som primerpar i en endelig PCR-reaksjon for dannelse av et fullstendig tungkjedefragment ved overlappsforlengelse som illustrert i figur 12. PCR-reaksjonsblandingen inneholdt også 10 ul 10X PCR-buffer, 1 ul Taq-polymerase og 8 ul 2,5 mM dNTP som beskrevet ovenfor. PCR-reaksjonen ble utført som beskrevet ovenfor. For å erholde tilstrekkelige mengder amplifiseringsprodukt ble 15 identiske

PCR-reaksjoner utført. De resulterende tungkjedefragmenter som starter ved strukturområde 1 og strekker seg til enden av CH1, og som har tilfeldig mutageniserte CDR3-områder, var tilnærmet 790 basepar lange. Tungkjedefragment-ampiifiseringsproduktene fra de 15 reaksjoner ble først slått sammen og så gelrenset som beskrevet ovenfor og deretter inkorporert i et fagmid-bibliotek. Det totale DNA-utbytte fra hver amplifisering var tilnærmet 3 ug/100ul, og det totale, sammenslåtte utbytte inneholdt følgelig tilnærmet 45 ug amplifisert, mutagenisert tungkj ede.

b. Fagmidbibliotekkonstruksjon

De gelrensede tungkjedefragmenter fremstilt i eksempel 6a, ble så kuttet med restriksjonsenzymene Xho I og Spe I, som beskrevet i eksempel 2d. De resulterende, kuttede tung-kjedef ragmenter ble deretter gelrenset før de ble innsatt i pC3-TT7E-fagmidvektorklonen som på forhånd var kuttet med de samme restriksjonsenzymer for å fjerne det ikke-mutageniserte tungkjedefragment og danne en lineær vektor. Ligering av 640 ng av tungkjede-Xho I-Spe I-fragmentene med mutageniserte CDR3-områder inn i 2 ug av den lineariserte pC3-TT7E-fagmidvektor for dannelse av sirkulariserte vektorer med mutageniserte CDR3-områder, ble utført over natten ved romtemperatur ved bruk av 10 enheter BRL-ligase (Gaithersburg, MD) i BRL-ligasebuffer i et reaksjonsvolum på 150 ul. Fem uavhengige ligeringsreaksjoner ble utført for å øke størrelsen av fagbiblioteket med mutageniserte CDR3-områder. Den totale mengde amplifisert, mutagenisert tungkjede for fem ligeringsreaksjoner var således 3,2 ug. Etter ligeringsreaksjonene ble det sirkulariserte DNA felt ved -20°C i to timer ved tilsetning av 2 ul glykogen (20 mg/ml), 15 ul 3 M natriumacetat, pH 5,2, og 300 ul etanol. DNA ble så nedsentrifugert ved mikrosentrifu-gering ved 4°C i 15 minutter. Det nedsentrifugerte DNA ble vasket med kald 70% etanol og tørket under vakuum. Bunnfallet ble resuspendert i 10 ul vann og transformert ved elektropor-ering inn i 300 ul E. coli XLl-Blue-celler som beskrevet i eksempel 2k, for dannelse av et fagbibliotek. Det totale utbytte fra mutagenesen og transformasjonsfremgangsmåten beskrevet her, var tilnærmet 5 x 10<7>transformanter. XLl-Blue-celler fra E. coli ble valgt som vert, da enkelttrinnskodonet TAG er suppressert.

Etter transformeringen ble, for å isolere fag på hvilke heterodimer ekspresjon er indusert, for påfølgende anrikning ved bruk av målantigener som for eksempel fluorescein, 3 ml SOC-medium (SOC ble fremstilt ved sammenblanding av 20 g bactotrypton, 5 g gjærekstrakt og 0,5 g NaCl i én liter vann, justering av pH til 7,5 og tilsetning av 20 ml glukose like før bruk, for induksjon av ekspresjon av Fd-cpIII- og lettkj ede-heterodimer) tilsatt, og kulturen ble ristet ved 220 rpm i 1 time ved 37°C hvorpå 10 ml SB (SB ble fremstilt ved sammenblanding av 30 g trypton, 20 g gjærekstrakt og 10 g Mops-buffer pr. liter, med pH justert til 7) med 20 ug/ml karbenicillin og 10 ug/ml tetrasyklin, og blandingen ble ristet ved 300 rpm i ytterligere en time. Den resulterende blanding ble tilsatt 100 ml SB med 50 ug/ml karbenicillin og 10 ug/ml tetrasyklin og ristet i 1 time, hvoretter hjelperfag VCSM13

(IO<12>pfu) ble tilsatt og blandingen ristet i ytterligere to timer. Så ble 70 ug/ml kanamycin tilsatt og blandingen inkubert ved 30°C over natten. Den lavere temperatur førte til bedre heterodimerinkorporering på fagoverflaten. Supernatanten ble klaret ved sentrifugering (4000 rpm i 15 minutter i en JA10-rotor ved 4°C) . Fag ble presipitert ved tilsetning av 4%

(vekt/volum) polyetylenglykol 8000 og 3% (vekt/volum) NaCl og inkubering på is i 30 minutter, fulgt av sentrifugering (9000 rpm i 20 minutter i en JAI0-rotor ved 4°C). Nedsentrifugert fag ble resuspendert i 2 ml PBS og mikrosentrifugert i 3 minutter for nedsentrifugering av cellerester, overført til nye rør og lagret ved -20°C for påfølgende gjennomsøkning som beskrevet nedenfor.

For å bestemme titeren av kolonidannende enheter (cfu) ble fag (pakket fagmid) fortynnet i SB, og 1 ul ble benyttet til infeksjon av 50 ul nydyrket (OD60o= D E. coli XLl-Blue-celler dyrket i SB med 10 ug/ml tetrasyklin. Fag og celler ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter og så direkte utsådd på LB/karbenicillin-skåler.

c. Seleksjon av anti- fluorescein- heterodimerer på fagoverflater

1) Gjentatte anrikninger av fagbiblioteket

med mutageniserte CDR3- områder Fagbiblioteket fremstilt i eksempel 6b med tungkjedefragmenter med mutageniserte CDR3-områder, ble anriket som beskrevet heri på en mikrotiterplate dekket med et 50 ug/ml fluorescein-BSA-konjugat for gjennomsøkning etter anti-fluorescein-heterodimerer . Fluorescein ble konjugert til BSA ifølge fremgangsmåtene beskrevet i "Antibodies: A Laboratory Manual", Harlow et al., red., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988.

Den benyttede anrikningsmetode var en modifisering av den opprinnelig beskrevet av Parmley og Smith (Parmley et al., Gene, 73:30-5-318). To til fire brønner på en mikrotiterplate (Costar 3690) ble dekket over natten ved 4°C med 25 ul TT-antigen (50 ug/ml) fremstilt ovenfor i 0,1 M bikarbonat, pH 8,6. Brønnene ble vasket to ganger med vann og blokkert ved fullstendig fylling av brønnen med 3% (vekt/volum) BSA i PBS og inkubering av platen ved 37°C i 1 time. Etter utristing av blokkeringsløsningen ble 50 ul av fagbiblioteket fremstilt ovenfor (typisk 10<11>cfu), tilsatt hver brønn, og platen ble inkubert i 2 timer ved 37°C.

Fag ble fjernet og platen vasket én gang med vann. Hver brønn ble så vasket ti ganger med TBS/Tween (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% "Tween 20") i 1 time ved romtemperatur hvor vaskingen besto av pipettering inn og ut for å vaske brønnen slik at brønnen hver gang ble fullstendig fylt med TBS/Tween mellom vaskingene. Platen ble vasket ytterligere én gang med destillert vann, og bundne fag ble eluert ved tilsetning av 50 ul elueringsbuffer (0,1 M HCl justert til pH 2,2 med fast glysin, og med 1 mg/ml BSA) til hver brønn fulgt av inkubering ved romtemperatur i 10 minutter. Elueringsbufferen ble pipettert inn og ut flere ganger, fjernet og nøytralisert med 3 ul 2 M Tris-base pr. 50 ul benyttet elueringsbuffer.

Eluert fag ble benyttet til infisering av 2 ml nydyrket (OD60o= D E. coli XLl-Blue-celler i 15 minutter ved romtemperatur, hvoretter 10 ml SB med 20 ug/ml karbenicillin og 10 ug/ml tetrasyklin ble tilsatt. Porsjoner på 20, 10 og 1/10 ul ble fjernet fra kulturen for utsåing for å bestemme antallet fag (pakkede fagmider) som ble eluert fra platen. Kulturen ble ristet i 1 time ved 37°C, hvoretter 100 ml SB med 50 ug/ml karbenicillin og 10 ug/ml tetrasyklin ble tilsatt, og blandingen ble ristet i 1 time. Hjelperfag VCSM13 (1012pfu)ble så tilsatt, og kulturen ble ristet i ytterligere 2 timer. Så ble 70-ug/ml kanamycin tilsatt, og kulturen ble inkubert ved 37°C over natten. Fagfremstilling og videre anrikning ble gjentatt som beskrevet ovenfor.

Etter hver anrikningsrunde ble prosentutbyttet av fag bestemt hvor prosentutbyttet - (antall fag eluert/antall fag påsatt) x 100. Den opprinnelige mengde fag tilsatt ble bestemt ved titrering på seleksjonsskåler som beskrevet i eksempel 6b, til å være tilnærmet 10<11>cfu for hver anrikningsrunde. Det endelige fagutbytte ble bestemt ved infisering av 2 ml XLl-Blue-celler i logaritmisk vekst som beskrevet ovenfor og utsåing av uttak på seleksjonsskåler.

Som et alternativ til eluering med syre ble fag bundet til mikrotiterplatens brønner, eluert ved tilsetning av 50 ul IO"<5>molar fluorescein i PBS fulgt av inkubering i 1 time ved 37°C. Løsningen ble så pipettert inn og ut for å vaske brønnene. Det resulterende eluat ble overført til 2 ml ny-dyrkede E. coli XLl-Blue-celler for infeksjon som beskrevet ovenfor for fremstilling av fag og videre anrikning. I påføl-gende anrikningsrunder ble fag eluert med 10'<6>M fluorescein.

Resultatene for mengden fag spesifikt bundet til fluorescein-dekkede brønner gjennom fire på hverandre følgende anrikningsrunder og eluering med syre eller med fluorescein alene, er vist nedenfor i tabell 8. Sammenlignbare utbytter av fag på hvilke heterodimerer som spesifikt bandt fluorescein ble uttrykt, ble oppnådd med hver elueringsmetode. Disse verdier bekrefter at mutagenese av CDR3-området som beskrevet førte til endring av en heterodimer som opprinnelig bandt spesifikt til TT, til én som spesifikt bandt fluorescein.

Ikke-spesifikk binding til denne overflate av kon-trollfag varierte mellom IO<4>og 10<5>fag pr. brønn. Produksjon av løselig Fab og bekreftelse av binding til fluorescein ved ELISA som beskrevet i 2) nedenfor, viste 8 reagerende kloner av 60 tilfeldig valgte fra de transformerte kolonier, og 38 reagerende kloner fra 40 tilfeldig valgte fra de transformerte kolonier, for de syreeluerte, henholdsvis de fluores-ceineluerte biblioteker.

2) Fremstilling av løselige heterodimerer for karakterisering av bindingsspesifisiteten til fluorescein

For videre å karakterisere spesifisiteten av de mutageniserte heterodimerer uttrykt på fagoverflaten som beskrevet ovenfor, ble løselige Fab-heterodimerer fra både syreeluert og fluoresceineluert fag fremstilt og analysert i ELISA-analyser på fluoresceindekkede plater, ved kompetitiv ELISA med økende konsentrasjoner av løselig fluorescein-BSA og også ved fluorescensreduksjonsanalyser. Disse analyser ble utført som beskrevet i "Fluorescein Hapten: An Immunological Probe", red.

E. W. Voss, CRC Press, Inc., s. 52-54, 1984.

For fremstilling av løselige heterodimerer ble fagmid-DNA fra positive kloner isolert og kuttet med Spe I og Nhe I. Kutting med disse enzymer ga kompatible, klebrige ender. DNA-fragmentet på 4,7 kb som manglet gen III-delen, ble gelrenset (0,6% agarose) og selv-ligert. Transformasjon av E. coli XLl-Blue tillot isolering av rekombinanter som manglet cplII-fragmentet. Kloner ble undersøkt for fjerning av cplII-fragmentet ved Xho I - Xba I-kutting, noe som skulle gi et fragment på 1,6 kb. Kloner ble dyrket i 100 ml SB med 50 ug/ml karbenicillin og 20 mM MgClaved 37°C inntil en OD60opå 0,2 ble oppnådd. IPTG (1 mM) ble tilsatt og kulturen dyrket over natten ved 30°C (vekst ved 37°C ga bare en svak reduksjon i utbyttet av heterodimer). Celler ble nedsentrifugert ved 4 00 rpm i 15 minutter i en JA10-rotor ved 4°C. Celler ble resuspendert i 4 ml PBS med 34 ug/ml fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) og lysert ved ultralydbehandling på is (2-4 minutter ved 50% effekt). Cellerester ble nedsentrifugert ved 14.000 rpm i en JA20-rotor ved 4°C i 15 minutter. Supernatanten ble benyttet direkte for ELISA-analyse som beskrevet nedenfor og ble lagret ved -20°C. For undersøkelser av et stort antall kloner ga 10 ml kulturer tilstrekkelig heterodimer for analyse. I dette tilfelle ble ultralydbehandlingen utført i 2 ml buffer.

De løselige heterodimerer fremstilt ovenfor, ble analysert ved ELISA. For denne analyse ble 1 ug/brønn fluorescein-BSA-løsning tilsatt enkeltbrønner på en mikrotiterplate og inkubert ved 4°C over natten for å tillate proteinløsningen å adherere til brennveggene. Etter inkubasjonen ble brønnene vasket én gang med PBS og så inkubert med en løsning av 3% BSA for å blokkere ikke-spesifikke seter på brønnene. Platene ble inkubert ved 37°C i 1 time, hvoretter de ble snudd og ristet for å fjerne BSA-løsningen. Løselige heterodimerer fremstilt ovenfor, ble så tilsatt hver brønn og inkubert ved 37°C i 1 time for dannelse av immunoreaksjonsprodukter. Etter inkubasjonen ble brønnene vasket 10 ganger med PBS for å fjerne ubundet, løselig antistoff, og så inkubert med et sekundært geite-anti-human-humant FAB konjugert til alkalisk fosfatase fortynnet med PBS med 1% BSA. Brønnene ble inkubert ved 37°C i 1 time, hvoretter de ble vasket 10 ganger med PBS fulgt av fremkalling med p-nitrofenylfosfat (PNPP).

Immunoreaktive heterodimerer bestemt ved ELISA-en ovenfor, ble så analysert ved kompetitiv ELISA for å bestemme affiniteten av de mutageniserte heterodimerer. ELISA-analysen ble utført som beskrevet ovenfor med økende konsentrasjoner av løselig fluorescein-BSA i et konsentrasjonsområde fra IO"9 M til IO"<5>M tilsatt i nærvær av de løselige heterodimerer. Maksimal bindingsinhibering ble oppnådd ved en konsentrasjon på10"s M fritt antigen med halvmaksimal inhibering oppnådd ved tilnærmet 10"<7>M fritt antigen. Antistoffer uttrykt fra alle kloner, hadde tilnærmede dissosiasjonskonstanter (Kd) i området fraIO"<7>til IO"<8>M for fluorescein-BSA-konjugater, både for eluering med fluorescein og med syre. Sanne Kd-verdier ble bestemt ved fluorescensreduksjonsanalyser. Antistoffer uttrykt på fag fra kloner erholdt ved fluoresceineluering, hadde høyere affiniteter for fluorescein, IO"<7>M mot 10"<6>M for de syreeluerte antistoffer. Utgangsklonen 7E viste ingen reduksjon innen målbare grenser for analyse, noe som tyder på en affinitet for fritt fluorescein på mindre enn IO"<5>M. Affinitetene for antistoffene som bandt sterkest til fluorescein (IO"<7>M), nærmet seg den gjennomsnittlige Kd for sekundærres-ponsen i immuniserte mus for fritt fluorescein (IO"<7>M) som vist av Kranz et al., Mol. Immunol., 20:1313-1322 (1983).

Således gjenkjente og bandt de mutageniserte heterodimerer spesifikt fluorescein. Ytterligere eksperimenter ble utført for å bekrefte at de mutageniserte heterodimerer ikke lenger gjenkjente TT som den ikke-mutageniserte heterodimer opprinnelig ble bundet til. Fluorescensreduksjonsanalyser ble også utført for å bekrefte bindingsspesifisiteten til de mutageniserte heterodimerer. Løselige heterodimerer fremstilt fra fag som enten var eluert med syre eller med fluorescein alene, bandt fluorescein like effektivt i alle de tidligere nevnte tilnærminger. Dette, som går ut på mutagenese av CDR3-området i tungkjeden i en heterodimer beskrevet heri, førte således til endring av bindingsspesifisiteten fra TT til fluorescein.

d. Sekvensanalyse av utvalgte anti- fluorescein-heterodimerer

Den fullstendige nukleotidsekvens av den muterte tungkjede i et representativt antall fluorescein-BSA-bindende kloner ble bestemt. Ingen PCR-induserte mutasjoner utenfor CDR3-området ble observert. De utledede aminosyresekvenser for tungkjede-CDR3-området er vist i figur 13 med det tilsvarende SEKVENSID. NR. vist i parentes. 7 kloner gjenvunnet fra syre-elueringsmetoden, viste ingen konsensussekvens. Mangelen på konsensusoppførsel i de syreeluerte kloner kan skyldes at de gjenkjenner en mer kompleks epitop som består av fluorescein og BSA, og vises også i deres mer uensartede affiniteter til fluorescein og fluorescein-BSA.

Klonene isolert ved fluoresceineluering, viste derimot en høy seleksjon av konsensussekvenser. I ti sekvenserte kloner ble bare tre forskjellige sekvenser funnet. Alle klonene hadde en glysinrest i aminosyrerestposisjon 95 og en asparaginsyrerest i posisjon 101. Aminosyrerestposisjonene er basert på Kabat-nummereringssystemet som beskrevet av Kabat et al. i "Sequences of Proteins of Immunological Interest", U.S. Department of Health and Human Services, (1987). Begge de mulige kodoner for koding av glysinresten tilveiebrakt ved syntesefremgangsmåten i hvilken alle de 32 mulige kodoner ble fremstilt, ble benyttet. I naturlige antistoffer spiller vanligvis asparaginsyreresten i posisjon 101 en strukturell rolle ved å danne en saltbro med en argininrest i posisjon 94 i strukturområde 3 (FR3). Den kunstige seleksjonsprosess hadde således rekapitulert en interaksjon av strukturell betydning

som gjenspeiler den en ser i dyret.

I tillegg inneholdt ni av de halvsyntetiske antistoffer uttrykt fra ti kloner, en serin-arginin-prolintri-plettsekvens nær midten av løkken like ved, eller én rest fjernet fra, den aminoterminale side av en argininrest selv om kodonbruken for to av disse rester var forskjellig. Klon F31 manglet dette sentrale motiv. Alle sekvenser var rike på ar-gininrester som kodes av tre av de 32 mulige kodoner. Sammenligning av forekomsten i de ti forskjellige CDR3-sekvenser av arginin med forekomsten av leucin og serin som også kodes av tre mulige kodoner i syntesen, viste et arginin-leucin-serin-forhold på 29:16:15. Denne tilbøyelighet til valg av arginin kan være et resultat av fluoresceins dianioniske egenskaper.

Det at forskjellige kodoner ble benyttet, støtter påstanden om at klonal seleksjon foregikk på antigen-anti-stofforeningsnivå, og ikke grunnet en uventet skjev inkorporering av nukleotider i DNA.

7. Randomisert mutagenese av CDR3- området i en lettkjede som koder for anti- tetanus toxoid a. PCR- mutagenese med degenererte oligonukleotider

Ved bruk av en fremgangsmåte som tilsvarer den for tilfeldig mutagenese av tungkjeden som beskrevet i eksempel 6, ble CDR3-området i et lettkjedefragment fra den anti-tetanus toxoid-spesifikke fagmidklon pC3-TT7E randomisert for fremstilling av antistoffer med fluoresceinspesifisitet. PCR-amplif iseringene ble utført som beskrevet i eksempel 6a, bortsett fra oligonukleotidprimerne som ble benyttet i reaksjonene .

Den første PCR-reaksjon førte til amplifisering av området i lettkjedefragmentet i pC3-TT7E-klonen fra det 5' EcoR V-sete i vektoren til den 5' ende av CDR3-området. For amplifisering av dette område ble følgende primere benyttet: Den 5' anti-"sense"-oligonukleotidprimer KEF med nukleotidsekvensen 5<1->GAATTCTAAACTAGCTAGTCG-3' (SEKVENSID. NR. 126), som hybridiserte til den ikke-kodende tråd i lettkjeden som tilsvarer EcoR V-setet i vektoren, og den 3' "sense"-oligonukleotidprimer KV12B med nukleotidsekvensen 5'-ATACTGCTGACAGTAATAC- AC-3' {SEKVENSID. NR. 127), som hybridiserte til den kodende tråd i tungkjeden som tilsvarer den 5' ende av CDR3. PCR-amplif iseringen ble utført som beskrevet i eksempel 6a. De resulterende PCR-produkter ble så gelrenset som beskrevet i eksempel ld og benyttet i en overlappsforlengelse-PCR-reaksjon

med produktene fra den andre PCR-reaksjonen, begge som beskrevet nedenfor, for rekombinasjon av de to produkter til rekonstruerte tungkjeder med mutageniserte CDR3-områder, som illustrert i figur 12.

Den andre PCR-reaksjonen førte til amplifisering av lettkjeden fra den 5' ende av CDR3-området til enden av CH1-området. For amplifisering av dette område ble følgende primere benyttet. Den 5' anti-"sense"-oligonukleotidprimer-blanding kalt KV5R, med nukleotidsekvensen representert ved formelen

51 -TATTACTGTCAGCAGTATNNKNNKNNKNNKNNKACTTTCGGCGGAGGGACC-3'

(SEKVENSID. NR. 128), hvor N kan være A, C, G eller T, og hvor K er enten G eller T, hvor den 5' ende av primersamlingen var komplementær til den 5' ende av CDR3 og den 3' ende av primersamlingen var komplementær til den 3' ende av CDR3 og den 5' ende av strukturområde 4. Området mellom de to angitte ender for primersamlingen var representert ved en 15-gangers degen-erering som endelig kodet for en variert populasjon av internt mutageniserte CDR3-områder på 5 aminosyrers lengde omgitt av ikke-mutageniserte 5' og 3' ender fra CDR3-områdene. Den 3' "sense"-oligonukleotidprimer T7B med nukleotidsekvensen

5'-AATACGACTCACTATAGGGCG-3" (SEKVENSID. NR. 129),

hybridiserte til den kodende tråd i lettkjeden som tilsvarer T7-området i vektoren. Den andre PCR-reaksjon ble utført på pC3-TT7E som beskrevet i eksempel 6a med KV5R- og T7B-primerne. De resulterende PCR-amplifiseringsprodukter ble så gelrenset som beskrevet ovenfor.

500 nanogram gelrensede produkter fra den første og den andre PCR-reaksjon ble så blandet med 1 ug av hver av oligonukleotidprimerne KEF og T7B som et primerpar i en endelig PCR-reaksjon for dannelse av et fullstendig lettkjedefragment ved overlappsforlengelse som illustrert i figur 12. PCR-amplif iseringen ble utført som beskrevet i eksempel 6a. For å

oppnå tilstrekkelige mengder amplifiseringsprodukt ble fem identiske PCR-reaksjoner utført. De resulterende lettkjedefragmenter som begynte ved det 5' EcoR V-sete og strakte seg til T7-området, hadde CDR3 med fem interne aminosyrer tilfeldig mutagenisert.

b. Fagmidbibliotekskonstruksj on

De resulterende, gelrensede lettkjedefragmenter fremstilt i eksempel 7a, ble så kuttet med restriksjonsenzymene Sac I og Xba I som beskrevet i eksempel 2d. De resulterende lettkjedefragmenter ble så gelrenset og deretter ligert inn i pC3-TT7E-fagmidvektorklonen som på forhånd var kuttet med de samme restriksjonsenzymer for å fjerne det ikke-mutageniserte lettkjedefragment og danne en lineær vektor. Ligering av 450 ng lettkjede-ampiifiseringsprodukter inn i 1,4 ug linearisert pC3-TT7E-fagmidvektor for dannelse av sirkulariserte vektorer med mutageniserte CDR3-områder ble utført som beskrevet i eksempel 6b. Fem uavhengige ligeringsreaksjoner ble utført for å øke størrelsen av fagbiblioteket med internt mutageniserte CDR3-områder. Etter ligeringsreaksjonene ble sirkularisert DNA felt og transformert inn i E. coli XLl-Blue som beskrevet i eksempel 6b for dannelse av et fagbibliotek. Totalutbyttet fra mutagenesen og transformasjonsfremgangsmåten beskrevet heri, var tilnærmet 2 x 10<7>transformanter. Fag ble isolert som beskrevet for transformantene fra tungkjedemuta-genesen.

c. Seleksjon av anti- fluorescein- heterodimerer på fagoverflater og sekvensanalyse av utvalgte antistoffer

Fagbiblioteket fremstilt i eksempel 7b med lettkjedefragmenter med fem internt mutageniserte aminosyrer i CDR3-området, ble anriket som beskrevet i eksempel 6c. Antall fag som bandt spesifikt til fluoresceindekkede brønner over tre på hverandre følgende runder med anrikning og hapteneluering med en fagtilførsel på 10<11>, var 0, 75 x 10<6>, 1 x 10<6>og 2,4 x 10<7>. De gjentatte sykluser med transformering, fagfremstilling, anrikning og eluering førte således til en signifikant anrikning på heterodimerer som spesifikt bandt fluorescein. Løse-lige Fab ble fremstilt som beskrevet i eksempel 6b2) for kar akterisering av bindingsspesifisiteten til fluorescein. Syv kloner ble valgt for sekvensanalyse som beskrevet i eksempel 6d. Resultatene fra sekvensanalysen er vist i figur 14. Det muterte område i lettkjede-CDR3 spenner over Kabat-aminosyre-posisjonene i immunoglobulinets lettkjede fra 92 til 96. Sekvensen av dette område i utgangsklonet, pC3-TT7E, var Gly-Ser-Ser-Leu-Trp (SEKVENSID. NR. 148). Av de syv antistoffer som var mutert og selektert på fluorescein, hadde fem fra klonene P2, P21, P23, P28 og P19, aminosyresekvensen Thr-Arg-Pro-Gly-Val (SEKVENSID. NR. 149), men hver var et resultat av transla-sjoner fra unike nukleotidsekvenser. De to gjenværende antistoffer fra klonene P15 og Pil, avledet fra unike nukleotidsekvenser, hadde også unike aminosyresekvenser. Siden de fleste av de mutageniserte lettkjeder hadde samme aminosyresekvens kodet av de mulige kodoner fra syntesen, har den guns-tige seleksjonsprosess således rekapitulert en interaksjon av strukturell betydning som i dyret var et resultat av naturlig seleksjon.

Mutagenese av CDR-områdene er ikke begrenset til CDR3-området da primere kan utformes for å gi tilfeldig mutagenese av CDR1 og CDR2, både i tung- og lettkjeden. Mutering av alle seks CDR-områder ville føre til et usedvanlig mangfol-dig bibliotek, mer så enn hva som kan oppnås i et dyr. For å oppnå randomisering i alle CDR-ene, kunne tungkjede-CDR-ene først randomiseres fra en utgangsklon fulgt av seleksjon av de beste antistoffbindere. Et nytt mutagenesetrinn på CDR-ene i den lette kjede kunne utføres, og det resulterende bibliotek kan blandes med de utvalgte tungkjedebindere. Alternativt kunne alle CDR-områder samtidig randomiseres, noe som vil føre til tung- og lettkjedebiblioteker som så kan kombineres og utsettes for seleksjon mot et forut valgt antigen.

Eksemplene 6 og 7 illustrerer således en fremgangsmåte for mutagenisering av de tunge og lette komplementaritetsbestemmende områder (CDR) i et immunoglobulingen og viser også oligonukleotider som er anvendbare for dette.

8. In vitro seleksjon og affinitetsmodning av antistoffer fra et naivt immunoglobulin- kombinasjonsbibliotek

En immunoglobulin-kombinasjonsbibliotektilnærming er blitt benyttet for å erholde monoklonale antistoffer fra ikke-immune, voksne mus og således fastsette prinsippene om (i) søking i naive antistoff-kombinasjonsbiblioteker etter forut valgte spesifisiteter og (ii) økning av affiniteten til de utvalgte antistoffers bindingsseter ved tilfeldig mutagenese. Et Fab-kombinasjonsbibliotek som uttrykte Igu- og kappa-lettkjedefragmenter på overflaten av filamentøs fag, ble fremstilt fra benmarg fra ikke-immuniserte, voksne Balb/c-mus ved bruk av den multivalente fremvisningsvektor pComb8 fremstilt i eksempel lb(i). Fag som fremviste lavaffinitets-Fab-er med bindingskonstanter på tilnærmet 10<*>til IO<5>M"<1>spesifikke for progesteron, ble isolert fra biblioteket ved å utnytte deres evne til å binde haptenet. Tilfeldig mutagenese av tung- og lettkjedens variable områder uttrykt i den monovalente frem-visnings f agvektor pComb3, ble utført ved feiltilbøyelig PCR. Kloner med forbedret progesteronaffinitet ble så utvalgt. Således ble, som beskrevet heri, antistoffer med ønskede egenskaper utvalgt fra en ikke-immun kilde og affinitetsmodning oppnådd ved bruk av tvillingvektorene pComb8 og pComb3, noe som åpner veien for erholdelse av spesifikke antistoffer fra et ikke-spesifikt bibliotek og omgåelse av immunisering.

Det beskrives tre essensielle egenskaper: (i) muligheten til først å søke etter lavaffinitets-Fab-er i et naivt bibliotek ved bruk av multivalente fagekspresjons-systemer, (ii) påfølgende affinitetsmodning ved feiltilbøyelig PCR og (iii) bruk av et enkeltkjedet konstrukt under modnings-prosessen for å unngå en høy bakgrunn av artefaktbinding grunnet tapet av lettkjeden. Samlet bruk av disse fremgangsmåter tillot seleksjon og affinitetsmodning av antistoffer fra et naivt bibliotek.

a. RNA- isolering og cDNA- syntese

Tre ikke-immuniserte, voksne (6 måneder) Balb/cByJ-hannmus (Scripps formeringskoloni) ble benyttet for fremstilling av 5 x IO<7>benmargsceller i 4% føtalt kalveserum i PBS. For å fjerne overflate-IgG-positive celler ble preparatet inkubert med rotte-anti-muse-IgG2b(0,1 ml), geite-anti-muse-IgG (0,1 ml) og kanin-anti-muse-IgG2b(0,1 ml) i 30 minutter ved romtemperatur. Cellene ble nedsentrifugert, vasket med PBS og resuspendert i 9 ml PBS. Kaninkomplement ble tilsatt (1 ml) og inkubert ved 37°C i 30 minutter. Cellene ble nedsentrifugert og total-RNA isolert som beskrevet i eksempel 2b. Total-RNA ble benyttet som templat for cDNA-syntesen for u- og kappakjeder med følgende primere: Igu, 5'-ATTGGG ACTAGTTTCTGC-GACAGCTGGAAT-3' (SEKVENSID. NR. 151) (Spe I-restriksjonssete-sekvensen er understreket) og kappa, 5'-GCGCC GTCTAGAATTAACACT-CATTCCTGTTGAA-3' (SEKVENSID. NR. 152) (Xba I-restriksjonssetet er understreket), ved bruk av "SuperScript"-sett (BRL).

Kort beskrevet ble 7 ug total-RNA blandet med

60 pmol primer, oppvarmet til 70°C i 10 minutter og øyeblik-kelig avkjølt på is. To ul RNase-inhibitor, 10 pl 5x syntese-buffer, 8 pl dNTP-blanding (som gir sluttkonsentrasjoner på 200 pM av hvert NTP), 5 pl 0,1 M DTT og 1 pl BRL "SuperScript" RT (200 U/pl) ble tilsatt, og reaksjonen ble justert til 50 pl med DEPC-behandlet vann. Reaksjonen fikk fremskride ved romtemperatur i 10 minutter og så ved 42°C i 50 minutter. Reaksjonen ble stoppet ved inkubering ved 90°C i 5 minutter og så plassering på is i 10 minutter fulgt av tilsetning av l pl RNase H og inkubering ved 37°C i 20 minutter. PCR-amplifisering ble utført i en 100 pl reaksjonsblanding som beskrevet i eksempel 2 ved bruk av VH 1-9 og p-kjedeprimeren for tungkj edene og VL3-7 og kappakjedeprimerne for lettkjedene, som vist i tabell 5.

b. Fremstilling av et naivt immunoglobulin p/ kappa-bibliotek

Det PCR-amplifiserte p-kjede- og kappakjede-DNA ble kløyvet med Xho I-Spe I, henholdsvis Sac I-Xba I. De resulterende p-kjede-Xho I-Spe I-fragmenter ble innsatt i pComb8-fagmidvektoren fremstilt i eksempel lb(i) for dannelse av et p-kjede-cp VIII-fusjonsbibliotek. Transformasjon inn i E. coli XLl-Blue og fagproduksjon ble utført i det vesentlige som beskrevet i eksempel 6. Deretter ble kappa-lettkjede-Sac I-Xba I-fragmentene klonet inn i tungkjede-Fdp-cpVIII-

fusjonsbiblioteket.

Et kombinasjonsbibliotek på 5 x IO<6>medlemmer ble etablert ved påfølgende kloning av Igu Fdog kappa-lettkjedefragmentene inn i pComb8-vektoren som tillot fusjon av tungkj ede- Fd- fragmentet til cpVIII. Siden Fab-antistoffragmentene ble fremvist ved et høyt kopitall på fagoverflaten, ble denne vektor valgt for tilgang til lavaffinitetsantistoffer som kan forventes å finnes i et ikke-selektert, upåvirket repertoar.

c. Seleksjon av lavaffinitetsantistoffer spesifikke

for progesteron

De rekombinante fagmider fremstilt ovenfor, ble pakket i M13-fagpartikler, og fem runder med anrikning på progesteron- 3- (O-karboksymetyl)-oksim-BSA-dekkede ELISA-brønner ble utført som beskrevet i eksempel 6. Kort beskrevet ble brønner på en mikrotiterplate dekket ved 4°C med 50 ul progesteron-3-{O-karboksymetyl)-oksim-BSA-konjugat (100 ug/ml) (Sigma nr. P4778) i PBS. Brønnene ble vasket to ganger med vann og blokkert ved fullstendig oppfylling med 1% vekt/volum BSA i PBS og inkubering av platene ved 37°C i 1 time. Blokkeringsløsningen ble ristet ut, og 50 ul av fagbiblioteket (typisk 1011cfu) i PBS-BSA (0,1% vekt/volum) ble tilsatt hver brønn og platene inkubert i 2 timer ved 3 7°C. Vasketrinnene, eluering og oppformering av fag ble utført i det vesentlige som beskrevet i eksempel 6al).

Fag eluert etter første og tredje runde, ble analysert for ekspresjon av anti-progesteron-Fab-er ved bakterie-koloniavtrykk som beskrevet i eksempel 2f. Koloniene ble undersøkt for progesteronbinding med et progesteron-3-(O-kar-boksymetyl) -oksim-HRP-konjugat. Filtrene ble fremkalt med 4-klornaftol. Forsiktighet ble vist for å unngå artefakter forårsaket av fagmider som uttrykker Igu Fd-cpVIII-fusjonen uten en tilsvarende lettkjede. Disse fag med bare tungkjede reagerte ikke-spesifikt overfor ubeslektede antigener som BSA, HRP og hønseegglysozym, antagelig grunnet det hydrofobe område som fremvises på en uparet tungkjede.

De kolonier som ga det sterkeste signal i Western-blottet, ble undersøkt videre, og tre kloner, PgAll, PgB6 og PgFl, ble isolert for påfølgende analyse. De to første fremkom etter første anrikningsrunde, og den siste ble isolert etter tredje seleksjonsrunde. Alle tre Fab-er fremstilt i løselig form som beskrevet i eksempel 6c2), bandt spesifikt til progesteron-3- (O-karboksymetyl) -oksim-BSA og progesteron-11a-hemisuccinyl-BSA. I tillegg viste alle tre Fab-er en vesentlig kryssreaktivitet mot en epitop på cytokrom C. Deres tilsynelatende bindingskonstanter for progesteron-3-(O-karboksy-metyl) -oksim-BSA ble målt til 10<*>M"<1>for PgAll, og 3 x IO<4>M"<1>og10sM<*1>forPgFl, henholdsvis PgB6. Disse bindingskonstanter var svært mye lavere enn de beskrevet for monoklonale anti-progesteron-antistoffer med affiniteter på fra 2 til 5 x10<8>M"<1>. KlonenePgB6 og PgFl benyttet samme kombinasjon av nært beslektede VH- og VL-gener. Begge VH-genene var identiske med to nært beslektede, men atskilte kimbanegener uten tegn til somatisk mutasjon som ventet for et naivt repertoar. Det (de) samme kimbanegen(er) for disse nært beslektede VL-gener er ennå ikke kjent. Da begge VH-genene er koblet til forskjellige D- og J-segmenter, kan ikke klonene PgB6 og PgFl ha samme opphav, men må være selektert fra to uavhengige kloningshendelser, noe som peker på en mulig betydning av denne spesielle kombinasjon for progesteronbinding. VL- og VH-genene som benyttes av PgAll, er ikke nært beslektet til de andre to klonene.

Dette viste således at Fab ved bruk av en multivalent fremvisningsvektor kan isoleres fra naive kombinasjonsbiblioteker med affiniteter som tilsvarer dem observert i den pri-mære immunrespons mot haptener, f.eks. fosforylcholin og nitrofenol. Videre kan kombinasjonsbibliotektilnærmingen gi V-gener eller V-genkombinasjoner som ikke ville ha blitt selektert in vivo.

d. Affinitetsmodning ved PCR- styrt mutagenese

For å etterligne den somatiske mutasjonsprosess som fører til seleksjon av antistoffer med høyere affinitet, ble tilfeldige mutasjoner dannet i både VL- og VH-området, og antistoffer med forhøyet affinitet til haptenet progesteron ble så selektert. For spesifikk og fullstendig retting av mutasjonene oppnådd ved feiltilbøyelig PCR til V-områdene, ble et enkeltkjedet fusjonsplasmid Fv-cpIII konstruert i en pComb2-3-fagmidvektor som inneholdt i leserammen fusjoner av følgende elementer: pelB-ledersekvensen for sekresjon, VH- og VL-leserammene sammenkoblet med et syntetisk oligonukleotid som koder for et fleksibelt peptid som diskutert i eksempel 6a, og cpIII-resten. Bruk av en enkeltkjedevektor vil videre overvinne de vanskeligheter som skyldes uønsket seleksjon for uspesifikk binding av fag som kun uttrykker lg-tungkjeder.

For fremstilling av en enkeltkjedet tung- og lettkjede- {kalt Fv) fusjon med membranankeret cplII ble plasmidet pComb2-3 fremstilt i eksempel lb(ii) med kun ett Spe I-restriksjonssete, kuttet med restriksjonsendonukleasene Xba I og Nhe I og religert slik at lettkjede-kloningskassetten ble fjernet. En syntetisk DNA-linker som koder for en 15 aminosyrer lang linkersekvens som består av to oligonukleotider, en 5' anti-"sense"-primer med nukleotidsekvensen 5<1->TCGAGAAAGTC-TCTAGAGGTAAATCTTCTGGTTCTGGTTCCGAATCTAAATCTACT- GAGCTCÅÅAGTCA-31

(SEKVENSID. NR. 153) og en 3' "sense"-primer med nukleotidsekvensen 51-CTAGTGACTTT GAGCTCAGTAGATTTAGATTCGGÅACCAGAACCAGÅA-GATTTACC TCTAGAGACTTTC-3 (SEKVENSID. NR. 154) ble innsatt i den Xho I-Spe I-kuttede, trunkerte pComb2-3-vektor slik at fagmidet ScpComb2-3 ble dannet. De indre gjenkjenningssekvenser for restriksjonsendonukleasene Xba I (TCTAGA) og Sac I (GAGCTC) er understreket. VH- og VL-segmentene i progesteronbinderne ble så amplifisert ved PCR som beskrevet i eksempel 2g i to enkeltreaksjoner.

I den første PCR-amplifiseringen ble primeren som tilsvarer SEKVENSID. NR. 153, oppført ovenfor og oligonukleotidet med nukleotidsekvensen 5'-ATTTGGGAAGGACT GTCTAGATGMRGA-GAC-3' (SEKVENSID. NR. 155), hvor M er enten A eller C og R er enten A eller G, benyttet til amplifisering av tungkjedefragmentet. Lettkjedefragmentet ble amplifisert for seg med primeren som tilsvarer SEKVENSID. NR. 154 oppført ovenfor og oligonukleotidet med nukleotidsekvensen 5'-GAG GACTAGTTACAGTTG-GTGCAGCATCAG-3' (SEKVENSID. NR. 156). De indre gjenkjenningssekvenser for Xba I (TCTAGA) og Spe I (ACTAGT) er understreket. VH- og VL-PCR-fragmentene ble kuttet med Xho I-Xba I, henholdsvis Sac I-Spe I og deretter innsatt i Scp-Comb2-3.

e. Ekspresjon og påvisning av løselige Fab- er og enkeltkjedete fusjonsantistoffer spesifikke for progesteron

For Fab-fremstilling ble gen VIII-resten i fagmidene som koder for progesteronbinderne PgAll, PgB6 og PgFl, utkuttet med restriksjonsendonukleasene Spe I og EcoR I og deretter erstattet med en syntetisk linker som koder for et TAA-stoppkodon (understreket). Linkeren ble dannet av oligonukleotidene 5'-CTAG TTAACTGAGTAAG-3' (SEKVENSID. NR. 157) og 5•-AATTCTTACT-CAG TTAA-3' (SEKVENSID. NR. 158). Fremstilling og påvisning av antistoff-Fab-fragment ble utført i det vesentlige som beskrevet i eksempel 6c2), bortsett fra at E. coli-cellene ble oppløst ved tre fryse-tinesykluser. For fremstilling av løse-lige antistof fragmenter ble VH-linker-VL-fusj onene utkuttet fra ScpComb2-3-fagmidet med Xho I og Spe I og subklonet i ekspresjonsvektoren pTACOl (Pharmacia) som er et pF1260-derivat. pTACOl-vektoren har den induserbare tac-promoter, pelB-ledersekvensen for sekresjon, og tillot fusjon i leserammen av det innskutte, enkeltkjedete fusjonskonstrukt med en dekapeptid-sekvens som beskrevet i eksempel la som merkelapp for immuno-kjemisk påvisning. Ekspresjon og påvisning av de enkeltkjedete fusjonsantistoffragmenter var som beskrevet ovenfor, bortsett fra at et anti-dekapeptidantistoff konjugert til alkalisk fosfatase, ble benyttet i ELISA-analysen.

Tre enkeltkjedete fusjonskloner ble utvalgt ved gjen-nomsøkningsfremgangsmåten og kalt ScpComb2-3-PgFl, -PgB6 og -PgAll. Disse plasmider ble utsatt for feiltilbøyelig PCR-mutagenese som beskrevet nedenfor.

f. Målrettet mutagenese av tung- og lettkjedene

ved feiltilbøyelig PCR

Like mengder ukuttet PgFl, PgB6 og PgAll-ScpComb2-3-plasmider fremstilt ovenfor, ble blandet og seriefortynnet. Uttak på 100 ng, 10 ng, 1 ng, 0,1 ng og 0,01 ng av blandingene ble hver for seg utsatt for 35 sykluser (1 minutt ved 94°C, 2 minutter ved 50°C, 1 minutt ved 72°C) amplifisering under følgende reaksjonsbetingelser: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0), 6,5 mM MgCl2, 0,5 mM MnCl2, 0,01% gelatin, 0,1% "Triton X-100", 1 mM av hver av dCTP, dGTP og dTTP, 0,2 mM dATP,

0,1 mM dITP, og ved bruk av M 13-revers-sekvenseringsprimeren, 5<1->AACAGCTATGACCATG-3' (SEKVENSID. NR. 159), og en returprimer komplementær til cpIII-resten, 5<1->GACAGGAGGTTGAGGCAGGT-3<1>(SEKVENSID. NR. 160) ved 100 uM. Den basale fremgangsmåte for feiltilbøyelig PCR var som opprinnelig beskrevet av Leung et al., J. Methods Cell. Mol. Biol., 1:11-15 (1989) som inkorporeres heri ved referanse. DNA-området som skulle mutageniseres, ble PCR-amplifisert under betingelser som reduserer Taq-DNA-polymerases nøyaktighet i DNA-syntese. Som vist av Leung et al., supra, førte de konsentrasjoner som ble benyttet i PCR-amplif iseringene av reagensene MnCl2og dATP, til mutasjons-frekvenser på 1,0%, henholdsvis 1,4%. Mutasjonsfrekvensen økte således når dATP-konsentrasjonen ble redusert.

PCR-reaksjonene for alle templatfortynninger ble slått sammen og behandlet med fenol før kutting med Xho I og Spe I. De gelrensede og kuttede PCR-fragmenter ble ligert til-bake inn i det Xho I-Spe I-kuttede ScpComb2-3-plasmid. Liger-ingsproduktene ble elektroporert inn i E. coli XLl-Blue og ga opphav til IO<6>transformanter. De påfølgende fagfremstillings-og anrikningstrinn ble utført som beskrevet i eksempel 6, bortsett fra at fag ble anriket i fravær av BSA.

Et bibliotek av muterte, enkeltkjedete anti-progesteron-fagmid-antistoffer ble således etablert og anriket ved bruk av progesteron-3-(O-karboksymetyl)-oksim-BSA, og antall eluerte cfu ble benyttet som et mål for de fremviste, enkeltkjedete antistoffers relative affinitet til haptenet. Etter tredje anrikningsrunde ble en 50- til 100-gangers økning i utbyttet av eluerte fagmider relativt til den ikke-muterte populasjon, påvist. Enkeltmutanter viste 10- til 300-gangers økt utbytte etter anrikning sammenlignet med utgangsklonene, noe som antyder at mutantene kodet for antistoffbindingsseter med forhøyet affinitet. De fire beste mutanter, kalt ScPgB6-l, -2, -3 og -4, ble utvalgt for bestemmelse av deres affinitet for haptenkonjugatet og sekvensanalyse.

g. Bestemmelse av mutageniserte, enkeltkjede-fusjons- anti- progesteron- antistoffers affinitet Bindingskonstantene for de løselige antistoffragmenter fremstilt fra de fire beste mutanter, ScPgB6-l, -2, -3

og -4 utvalgt ovenfor, ble bestemt ved kompetitiv ELISA som beskrevet i eksempel 6c2). Kort beskrevet ble brønner på en mikrotiterplate dekket ved 4°C med 50 ul progesteron-3-(O-kar-boksymetyl) -oksim-BSA-konjugat (100 ug/ml) i PBS. Brønnene ble vasket to ganger med vann og blokkert med 1% vekt/volum BSA i PBS ved 37°C i 1 time. Fab- eller enkeltkjedefusjonssuper-natanter ble blandet med progesteron-3-(O-karboksymetyl)-oksim-BSA i PBS-BSA (0,1 % vekt/volum) og inkubert i brønnene ved 37°C i to timer. Platene ble vasket med PBS-Tween (0,05 % volum/volum), og geite-anti-muse-kappakjede-alkalisk fosfatasekonjugat (Southern Biotech) eller monoklonale muse-anti-dekapeptid-antistoffer konjugert til alkalisk fosfatase, ble tilsatt og inkubert i 1 time ved 37°C. Platene ble vasket som før, og substrat ble tilsatt (0,1 ml, p-nitrofenylfosfat ved 1 mg/ml i 0,1 M Tris, pH 9,4, med 50 mM MgCl2) . Etter inkubering ved 25°C i 60-180 minutter ble absorbansen avlest ved 405 nm. De tilsynelatende affiniteter ble bestemt som den inverse verdi av haptenkonsentrasjonen som kreves for 50% inhibering av den maksimale binding i en kompetitiv ELISA. Dette er en nær tilnærmelse til affiniteten og tillot rangering av bind-ingsaktivitetene .

Affiniteten til de muterte Sc-antistoffer for progesteron-3- (O-karboksymetyl) -oksim-BSA bestemt ved kompetitiv ELISA, hadde, relativt til utgangsantistoffet ScPgB6, økt 3 0 ganger for ScPgB6-l og tilnærmet 13 ganger både for ScPgB6-3 og ScPgB6-4. Det er interessant at klonen med de færreste mutasjoner viste den høyeste affinitet. Kryssreaktivitets-mønsteret for de muterte Sc-antistoffer endret seg ikke, bortsett fra at ScPgB6-l hadde mistet det meste av sin reaktivitet overfor cytokrom C. I omfattende undersøkelser over immunres-ponser mot haptener kunne en affinitet forhøyet med én størr-elsesorden, tilskrives spesifikke utbyttinger av enkeltamino-syrer, noe som antyder at bare én eller to aminosyreutbyttinger i bindingssetet til Sc-anti-progesteron-antistoffene kan ha ført til deres forhøyede affinitet overfor hapten-konjugatet. Da en mutant med kun én enkelt aminosyreutbytting ikke ble gjenfunnet, kunne ikke den (de) kritiske rest(er) som forårsaket den forhøyede affinitet til hapten-konjugatet, identifiseres. Videre ble ingen aminosyresubstitusjoner felles for alle tre mutanter, observert, noe som antyder at endring av forskjellige rester kan føre til økt affinitet for 3-(0-karboksymetyl)-progesteron. En Ser64- til Pro64-substitusjon i VH-CDR2 er felles for mutantene ScPgB6-3 og ScPgB6-4. Selv om begge mutanter viste lignende affinitet til hapten-konjugatet, kan en entydig vurdering av denne rests betydning for antigen-binding ikke gjøres da flere aminosyreutbyttinger forekom i VL- og VH-områdene i de to mutanter.

h. Nukleinsyresekvensering

De fullstendige nukleotidsekvenser til de variable områder i tung- og lettkjedene ble bestemt fra dobbelttrådet DNA ved bruk av Sequenase 2.0 (United States Biochemical). DNA-sekvensering viste at alle fire mutantkloner, ScPgB6-l, -2, -3 og -4, hadde oppstått fra ScPgB6, og at ScPgB6-l og ScPgB6-2 var identiske. Den dominerende mutasjonstype erholdt ved denne PCR-fremgangsmåte, var en A-G/T-C-nukleotidutbytting (68%), mens T-G/A-C-, G-A/C-T-, T-A/A-T-, G-C/C-G- eller C-A/G-T-utbyttinger forekom med tilnærmet samme frekvens. DNA-sekvens er med en høyere mutasjonsfrekvens enn gjennomsnittet, dvs. mutasjons-"hot spots", ble observert. I tillegg var de tre mutantkloner forskjellige med hensyn til antall basepar-forandringer. Mutasjonsfrekvensene for både VH- og VL-området ble funnet å være 1,5% for ScPgB6-l, 2,1% for ScPgB6-3 og 4,1% for ScPgB6-4, noe som førte til flere aminosyresubstitusjoner i CDR- og strukturområdene i mutantene.

I sammenfatning beskrives prinsippet om seleksjon og affinitetsmodning av spesifikke antistoffer mot et hapten fra et naivt bibliotek. Selv om in vitro seleksjons- og mutagene-sesystemet er temmelig enkelt sammenlignet med immunsystemets kompleksitet, finnes noen felles egenskaper: (i) affiniteten til antistoffer utvalgt fra et naivt kombinasjonsbibliotek, kan nå samme størrelsesorden som antistoffer fra en primær immunrespons mot haptener, (ii) selv om mekanismene som gir mutasjoner in vivo og in vitro var forskjellige, ble mutasjons-"hot spots" observert, (iii) affinitetsøkningen etter én runde med mutasjon og seleksjon in vitro er av samme størrelsesorden som observert for overgangen fra primær- til sekundærimmunresponser mot haptener, og (iv) et mutert antistof f -bindingssete med endret kryssreaktivitet ble gjenvunnet, noe som av og til kan observeres in vivo.

Da kombinasjonsantistofftilnærmingen først ble beskrevet, var det et åpent spørsmål hvorvidt den kunne benyttes til effektivt å tappe det kolossale antistoffrepertoar in vivo. Det vises at antistoffkjedekombinasjoner som aldri kunne blitt valgt in vivo, kan benyttes og utvikles. Således synes det nå som om det er mulig å overgå diversiteten til antistof f responsen in vivo ved molekylære kloningsteknikker.

Claims (2)

1. Filamentøs fag, karakterisert vedat den omkapsler et genom som koder for en 1igandbindende, heterodimer reseptor omfattende et første polypeptid og et andre polypeptid der det første polypeptidet er flankert av et prokaryot, aminoterminal t sekresjonssignaldomene og et karboksyterminalt membranankerdomene fra filamentøs fag, og det andre polypeptid er fusjonert til et prokaryot aminoterminalt sekresjonssignaldomene, hvori den heterodimere reseptor uttrykkes på overflaten av den filamentøse fag.

2. Filamentøs fag ifølge krav 1,karakterisert vedat reseptoren er et epitopbindende kompleks.