PT1960430E - Moléculas de anticorpo com especificidade para il-6 humana - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MOLÉCULAS DE ANTICORPO COM ESPECIFICIDADE PARA IL-6 HUMANA" A presente invenção diz respeito a moléculas de anticorpo que apresentam especificidade para determinantes antigénicos de IL-6. A presente invenção também se relaciona com o uso terapêutico de moléculas de anticorpo e métodos para produzir as moléculas de anticorpo. IL-6 é uma citocina multifuncional pleiotrópica produzida por uma variedade de tipos celulares. Foi originalmente identificada como um factor de diferenciação de células-B (BSF-2) que induzia a maturação final de células B a células produtoras de anticorpo (Hirano et ai., 1986 Nature 324, 73-76). Mostrou-se que IL-6 desempenha um papel central na regulação imunitária, inflamação, hematopoiese e oncogénese. No sistema imunitário, IL-6 induz a produção de anticorpos por células B, aumentando a quantidade de imunoglobulina policlonal. Também induz a expressão do receptor de interleucina-2 em células T (Nomo et ai., 1987, Immunol. Letters, 15, 3, 249-253) e promove a produção de IL-2 em células T activadas induzindo assim o crescimento e a diferenciação de células T citotóxicas (Okada et ai., 1988 J Immunol, 141, 5, 1543-1549) . Também se sabe que IL-6 determina a diferenciação de monócitos a macrófagos (Cho-marat P et ai., 2000 Nature Immunol., 6, 510-514) . A função de IL-6 não se restringe à resposta imunitária já que actua na hematopoiese, trombopoiese, formação de osteoclastos, elicitação de resposta de fase aguda hepática resultando na elevação da proteína C-reactiva (CRP) e proteína amilóide A do soro (SAA) . Sabe-se ser um factor de crescimento para queratinócitos epidérmicos, células mesangiais renais, células de mieloma e plasmocitoma (Grossman et ai., 1989 Prot Natl Acad Sei., 86, (16)6367-6371; Hori et ai., 1989, J Immunol, 143, 12, 3949-3955; Kawano et ai, 1988, Nature 332, 6159, 83-85) . IL-6 é produzida por uma grande variedade de tipos celulares incluindo monócitos/macrófagos, fibroblastos, queratinócitos epidérmicos, células endoteliais vasculares, células mesangiais renais, células gliais, condrócitos, células T e células B e algumas células tumorais (Akira et ai., 1990, FASEB J., 4, 11, 2860-2867). Com excepção das células tumorais que produzem constitutivamente IL-6, células normais não expressam IL-6 a não ser que sejam apropriadamente estimuladas. IL-6 é uma glicoproteína, uma molécula de 184 aminoácidos com um peso molecular de 21 a 28 kD dependendo das modificações pós-traducionais. Variantes de splice alternativo são encontradas nalguns tipos celulares (Kishi-moto et al. , 1995, Blood, 86, 4, 1243-1254) . O complexo do receptor IL-6 é compreendido por duas proteínas de membrana funcionalmente diferentes, uma cadeia de ligação especifica a IL-6 de 80 kD (gp80) e uma cadeia de transdução de sinal de 130 kD (gpl30). Embora IL-6 não se ligue directamente a gpl30, pode ligar-se a IL-6R para gerar um complexo ternário de elevada afinidade IL-6/IL-6R/gpl30. O IL-6R liga-se a IL-6 com baixa afinidade, no entanto IL-6R não tem um domínio de transdução de sinal intracelular por isso esta ligação sozinha não conduz a activação celular. De modo semelhante a expressão de superfície celular de IL-6R, não significa que a célula é susceptível de responder à estimulação por IL-6. A clivagem proteolítica conduz à libertação de IL-6R solúvel (sIL-6R; sgp80) que se pode ligar a IL-6 circulante e aumenta a meia vida de IL-6. Para activação celular, IL-6 liga-se primeiro a IL-6R ligado à célula ou sIL-6R; o complexo heterodimérico IL-6/IL6R asso-cia-se então com a glicoproteína de superfície celular gpl30. O heterocomplexo tripartido resultante liga-se a outro IL-6/IL6R/gpl30 e resulta a transdução de sinal (Bravo e Health 2000, EMBO J., 19, (11), 2399-2411; Boulanger et al. , 2003, Science, 300, 5628, 2101-2104),por isso ambos IL-6R ligado à célula e solúvel contribuem para activação celular. A sinalização IL-6 através de IL6R ligado à célula tem sido designada por sinalização cis enquanto a activação celular via IL-6R solúvel tem sido descrita como sinalização trans. As células que expressam gpl30 mas não IL-6R podem ser estimuladas por IL-6 através de sIL6R.

Sabe-se que anticorpos neutralizantes murinos para IL-6 humana são capazes de interferir com a ligação de IL-6 humana ao IL-6R (site 1) ou a gpl30 (sites 2 e 3) (Kalai et ai., 1997, Eur.J.Biochem. 249, 690-700; Bra-kenhoff et ai., 1990, Journal of Immunology, 145, 561-568; Wendling et ai., 1993, Journal of Rheumatology, 29, 259-262) . A patente US 5,856,135 revela anticorpos para IL-6 humana, transformados, que bloqueiam a ligação de IL6 a IL6R. Estes anticorpos foram derivados de um anticorpo monoclonal de ratinho SK2 no qual as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da região variável do anticorpo de ratinho SK2 foram transplantadas para as regiões variáveis de um anticorpo humano.

Também são conhecidos auto-anticorpos humanos neutralizantes para IL-6 (Hansen et ai, Eur. J. Immunol, 1995, 25, 348-354) .

Em W02004039826 foi descrito um anticorpo na-ti-IL-6 quimérico murino/humano, site I, para uso em terapia .

Um anticorpo monoclonal anti-receptor IL-6 humana, humanizado, está em ensaios clínicos de fase III para o tratamento de artrite reumatóide (Kishimoto, 2005, Annu Ver Immunol. 23: 1-21) . Também foi relatado que o mesmo anticorpo é eficaz num estudo de fase II de doença de Crohn. A eficácia também foi demonstrada com ambos anticorpos anti-IL-6 e anti-IL-6R em doença tipo lúpus em ratinhos NZB/W Fl (Fink et ai., 1994 J. Clin. Invest. 94, 585; Mihara et ai., 1998, Clin. Exp. Immunol. 112, 397). Um anticorpo neutra-lizante do receptor de IL-6 murino, suprimiu colite num modelo transfer adoptivo da doença (Yamamoto et ai., 2000 Journal of Immunology, 164, 4878; Atreya et ai, 2000 Nature Med 6, 583) . O último estudo também demontrou eficácia com um anticorpo anti-receptor no modelo knock-out IL-10 de colite e no modelo TNBS de inflamação do intestino.

Identificámos agora um anticorpo anti-IL-6 neu-tralizante de elevada afinidade que é particularmente eficaz in vivo, por exemplo no modelo in vivo aqui descrito, em particular um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana, contendo uma cadeia pesada que compreende a sequência gHl3 dada na SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve que compreende a sequência gLlO dada na SEQ ID NO:13.

Os resíduos nos domínios variáveis de anticorpo são convencionalmente numerados segundo um sistema inventado Rabat et ai. Este sistema é desenvolvido em Rabat et ai., 1987, em Sequences of Proteins of Immunological Interest, US, Department of Health and Human Services, NIH, USA (doravante "Rabat et al. (supra)") . Este Sistema de numeração é usado na presente especificação a não ser que seja indicado de outro modo.

As designações dos resíduos de Rabat nem sempre correspondem directamente à numeração linear dos resíduos de aminoácidos. A sequência de aminoácidos linear real pode conter menos ou aminoácidos adicionais do que a numeração de Rabat correspondente a um encurtamento ou inserção num componente estrutural, seja estrutura ou região determinante de complementaridade (CDR), da estrutura de domínio variável básica. A numeração de Rabat correcta dos resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento dos resíduos de homologia na sequência do anticorpo com uma sequência numerada de Rabat "standard".

Os CDRs do domínio variável da cadeia pesada estão localizados nos resíduos 31-35 (CDR-Hl), resíduos 50-65 (CDR-H2) e resíduos 95-102 (CDR-H3) de acordo com o sistema de numeração de Rabat. No entanto, de acordo com Clothia (Clothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)), o loop equivalente a CDR-Hl estende-se do resíduo 26 ao resíduo 32. Assim, 'CDR-Hl', como aqui usado, compreende resíduos 26 a 35, como descrito por uma combinação do sistema de numeração de Rabat e definição de loop topológica de Clothia.

Os CDRs do domínio variável da cadeia leve estão localizados nos resíduos 24-34 (CDR-Ll), resíduos 50-56 (CDR-L2) e resíduos 89-97 (CDR-L3) de acordo com o sistema de numeração de Rabat.

Como usado aqui, o termo "anticorpo neutra-lizante" descreve um anticorpo que é capaz de neutralizar a actividade biológica de sinalização de IL-6, por exemplo bloqueando o sitio 3 de ligação de IL-6 ao receptor gpl30.

Anticorpos para uso na presente invenção podem ser obtidos usando qualquer método conveniente conhecido na área. 0 polipéptido IL-6 ou células que expressam o poli-péptido pode ser usado para produzir anticorpos que reconhecem especificamente IL-6. 0 polipéptido IL-6 pode ser o polipéptido "maduro" ou um fragmento biologicamente activo ou derivados deste. Preferivelmente o polipéptido IL-6 é o polipéptido maduro. Polipéptidos IL-6 podem ser preparados por processos bem conhecidos na área a partir de células hospedeiro geneticamente modificadas que compreendem sistemas de expressão ou podem ser recuperados a partir de fontes biológicas naturais. Na presente aplicação, o termo "polipéptidos" inclui péptidos, polipéptidos e proteínas. Estes são usados alternadamente, a não ser que seja especificado de outro modo. 0 polipéptido IL-6 pode nalguns casos ser parte de uma proteína maior tal como uma proteína de fusão por exemplo ligada a um marcador de afinidade. Podem ser obtidos anticorpos gerados contra o polipéptido IL-6, em que é necessária imunização de um animal, administrando os polipéptidos a um animal, preferivelmente um animal não humano, usando protocolos bem conhecidos e de rotina, ver por exemplo Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986. Podem ser Imunizados vários animais de sangue quente, tais como coelhos, ratinhos, ratos, ovelhas, vacas ou porcos. No entanto são geralmente preferidos ratinhos, coelhos, porcos e ratos.

Anticorpos para uso na presente invenção incluem anticorpos completos e fragmentos funcionalmente activos ou derivados destes e podem ser, mas não estão limitados a anticorpos monoclonais, humanizados, totalmente humanos ou quiméricos.

Anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer método conhecido na área tais como a técnica de hibridoma (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), a técnica de trioma, a técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et ai., 1983, Immunology Today, 4: 72) e a técnica de hibridoma EBV (Cole et ai., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, p77-96, Alan R Liss, Inc., 1985) .

Anticorpos para uso na invenção também podem ser gerados usando métodos de anticorpos de linfócitos individuais, clonando e expressando os cDNAs da região variável da imunoglobulina gerados de linfócitos individuais seleccionadas para a produção de anticorpos específicos por exemplo pelos métodos descritos por Babcook, J. et ai., 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93 (15) : 7843-78481; WO92/02551; W02004/051268 e Número de Pedido de Patente Internacional W02004/106377.

Anticorpos humanizados (que incluem anticorpos enxertados CDR) são moléculas de anticorpo de espécies não-humanas contendo uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) das espécies não-humanas e uma região estrutura de uma molécula de imunoglobulina humana (ver, p.ex. US 5, 585, 089; WO91/09967). Será entendido que pode ser somente necessário transferir os resíduos determinantes de especificidade dos CDRs em vez da CDR completa (ver por exemplo, Kashmiri et ai., 2005, Methos, 36, 25-34). Anticorpos humanizados podem compreender opcionalmente um ou mais resíduos derivados da estrutura de espécies não humanas das quais os CDRs foram derivados.

Anticorpos quiméricos são os anticorpos codificados por genes de imunoglobulina que foram geneticamente modificados de modo que os genes de cadeia leve e pesada são compostos de segmentos de gene de imunoglobulina que pertencem a espécies diferentes.

Os anticorpos para uso na presente invenção também podem ser gerados usando vários métodos de "phage display" conhecidos na área e incluem os publicados por Brinkman et ai. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50), Ames et ai. (J. Immunol. Methods, 1995, 184: 177-186), Kettleborough et ai. (Eur. J. Immunol. 1994, 24: 952-958), Persic et ai. (Gene, 1997, 187, 9-18), Burton et ai. (Advavnces in Immunology, 1994, 57: 191-280) e WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 e 5,969,108.

Anticorpos completamente humanos são os anticorpos nos quais as regiões variáveis e as regiões constantes (quando presentes de ambas as cadeias pesada e leves são todas de origem humana, ou substancialmente idênticas a sequências de origem humana, não necessariamente do mesmo anticorpo. Exemplos de anticorpos completamente humanos incluem anticorpos produzidos por exemplo pelos métodos de "phage display" descritos acima e anticorpos produzidos por ratinhos nos quais os genes da parte constante e variável de imunoglobulina murina foram substituídos pelas suas correspondentes humanas por exemplo, como descrito em termos gerais em EP0546073 Bl, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US5,770,429, EP043 8 4 7 4 Bl e EP0463151 Bl.

Um anticorpo neutralizante, tendo especificidade para IL-6 humana, compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende pelo menos uma CDR com a sequência dada na SEQ ID NO: 5 para CDR-Hl, uma CDR com a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 e uma CDR com a sequência dada na SEQ ID NO:7 para CDR-H3.

Um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana pode compreender uma cadeia pesada em que pelo menos dois de CDR-Hl, CDR-H2 e CDR-H3 do domínio variável da cadeia pesada são seleccionados dos seguintes: a sequência dada na SEQ ID N0:5 para CDR-Hl, a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO:7 para CDR-H3. Por exemplo o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-Hl tem a sequência dada em SEQ ID NO: 5 e CDR-H2 tem a sequência dada em SEQ ID NO: 6. Alternativamente, o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-Hl tem a sequência dada em SEQ ID NO:5 e CDR-H3 tem a sequência dada em SEQ ID NO: 7 ou o anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que CDR-H2 tem a sequência dada em SEQ ID NO:6 e CDR-H3 tem a sequência dada em SEQ ID NO:7. Para evitar dúvidas, compreende-se que todas as permutações estão incluídas. É providenciado um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6, compreendendo uma cadeia pesada em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada em SEQ ID NO:5 para CDR-Hl, a sequência dada na SEQ ID NO: 6 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO:7 para CDR-H3.

Um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana pode compreender uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende pelo menos uma de uma CDR tendo a sequência dada em SEQ ID NO:8 para CDR-Ll, uma CDR com a sequência dada na SEQ ID NO:9 para CDR-L2 e uma CDR com a sequência dada na SEQ ID NO:10 para CDR-L3.

Um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana pode compreender uma cadeia leve em que pelo menos dois de CDR-Ll, CDR-L2 e CDR-L3 do dominio variável da cadeia leve são seleccionados dos seguintes: a sequência dada na SEQ ID NO:8 para CDR-Ll, a sequência dada na SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO:10 para CDR-L3. Por exemplo o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que CDR-Ll tem a sequência dada em SEQ ID NO: 8 e CDR-L2 tem a sequência dada em SEQ ID NO: 9. Alternativamente, o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que CDR-Ll tem a sequência dada em SEQ ID NO: 8 e CDR-L3 tem a sequência dada em SEQ ID NO:10 ou o anticorpo pode compreender uma cadeia leve em que CDR-L2 tem a sequência dada em SEQ ID NO:9 e CDR-H3 tem a sequência dada em SEQ ID NO:10. Para evitar dúvidas, compreende-se que todas as permutações estão incluídas. É providenciado um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana, compreendendo uma cadeia leve, em que o domínio variável compreende a sequência dada em SEQ ID NO:8 para CDR-Ll, a sequência dada em SEQ ID NO:9 para CDR-L2 e a sequência dada em SEQ ID NO:10 para CDR-L3. Será reconhecido que podem ser efectuadas uma ou mais substituições de aminoácidos, adições e/ou delecções às CDRs providenciadas pela presente invenção sem alterar significativamente a capacidade do anticorpo de se ligar a IL-6 e neutralizar a actividade de IL-6. O efeito de quaisquer substituições de aminoácidos, adições e/ou delecções podem ser facilmente testados por um perito na matéria, por exemplo usando métodos descritos nos exemplos para determinar a ligação a IL-6 e neutralização. Assim, num exemplo um anticorpo com especificidade para IL-6 humana compreende uma ou mais CDRs seleccionadas de CDRH-1 (SEQ ID NO:5), CDRH-2 (SEQ ID NO:6), CDRH-3 (SEQ ID NO:7), CDRL-1 (SEQ ID NO:8), CDRL-2 (SEQ ID NO:9), CDRL-3 (SEQ ID NO: 10), no qual um ou mais aminoácidos numa ou mais das CDRs foi substituído por outro aminoácido.

As moléculas de anticorpo podem compreender uma cadeia leve complementar ou uma cadeia pesada, respecti-vamente. O anticorpo de acordo com a presente invenção compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada em SEQ ID NO:5 para CDR-Hl, a sequência dada na SEQ ID NO:6 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 7 para CDR-H3 e uma cadeia leve em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO:8 para CDR-Ll, a sequência dada na SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO:10 para CDR-L3. O anticorpo tendo especificidade para IL-6 humana pode compreender uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada em SEQ ID NO:5 para CDR-Hl, a sequência dada na SEQ ID NO:6 para CDR-H2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 7 para CDR-H3 e uma cadeia leve em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 8 para CDR-Ll, a sequência dada na SEQ ID NO: 9 para CDR-L2 e a sequência dada na SEQ ID NO: 10 para CDR-L3 na qual um ou mais aminoácidos numa ou mais CDRs foi substituído por outro aminoácido. O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada em SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou semelhança com esta. "Identidade", como aqui usado, indica que em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é idêntico entre as sequências. "Semelhança", como aqui usado, indica que, em qualquer posição particular nas sequências alinhadas, o resíduo de aminoácido é de um tipo semelhante entre as sequências. Por exemplo, leucina pode ser substituído por isoleucina ou valina. Outros aminoácidos que podem ser frequentemente substituídos por um outro incluem mas não são limitados a: -fenilalanina, tirosina e triptofano (aminoácidos com cadeias laterais aromáticas); -lisina, arginina e histidina (aminoácidos com cadeias laterais básicas); -aspartato e glutamato (aminoácidos com cadeias laterais acídicas); e -asparagina e glutamina (aminoácidos com cadeias laterais amida); e -cisteína e metionina (aminoácidos com cadeias laterais contendo enxofre). Graus de identidade e semelnaça podem ser facilmente calculadas (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informáticas and Genome Projects Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds. , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991). 0 anticorpo pode compreender uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada em SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou semelhança com esta.

Um anticorpo pode compreender uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 2 e uma cadeia leve em que o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada em SEQ ID NO:4. O anticorpo pode compreender uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO: 2 e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO:4. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO: 2 e a cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO:4. É revelado um anticorpo de rato no qual o domínio variável da cadeia pesada compreende a sequência dada em SEQ ID NO:2 e o domínio variável da cadeia leve compreende a sequência dada em SEQ ID NO: 4. Este anticorpo de rato é aqui referido como 132E09 ou como o anticorpo "dador". A sequência completa de nucleótidos e aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada do anticorpo de rato 132E09 são providenciadas em SEQ ID NOS: 3 e 4 respectivamente. Os CDRs dados em SEQ ID NOS:5, 6, 7, 8, 9, e 10 são derivados do anticorpo de rato 132E09.

Além disso o anticorpo pode ser um anticorpo com enxerto CDR. Como usado aqui, o termo 'anticorpo com CDR enxertado' refere-se a um anticorpo em que a cadeia pesada e/ou leve contêm um ou mais CDRs (incluindo, se desejado, um ou mais CDRs modificados) de um anticorpo dador (por exemplo um anticorpo de rato) enxertado numa região estrutura variável de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo aceitador (por exemplo um anticorpo humano). Para uma revisão, ver Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998. Preferivelmente um ou mais dos CDRs foram obtidos do anticorpo de rato 132E09 (SEQ IS N0S:5, 6, 7, 8, 9 e 10) . Numa implementação, em vez de ser transferido o CDR inteiro, são transferidos apenas um ou mais dos resíduos determinantes de especificidade de qualquer um dos CDRs descritos aqui acima, para a estrutura do anticorpo humano (ver por exemplo, Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34) . Num modo de realização, apenas os resíduos determinantes de especificidade de um ou mais dos CDRs descritos aqui acima são transferidos para a estrutura de anticorpo humano. Num modo de realização, só os resíduos determinantes de especificidade de cada um dos CDRs descritos aqui acima são transferidos para a estrutura dos anticorpos humanos.

Quando os CDRs ou resíduos determinantes de especificidade são enxertados, pode ser usada qualquer sequência apropriada da estrutura da região variável aceitadora, tendo em conta a classe/tipo de anticorpo dador a partir do qual as CDRs são derivadas, incluindo regiões estrutura de rato, ratinho, primata e humano. Um anticorpo enxertado CDR deste tipo tem pelo menos um domínio variável que compreende regiões da estrutura aceitadora humana assim como uma ou mais das CDRs derivadas do anticorpo dador, tal como referido acima. Assim, é providenciado um anticorpo neutra-lizante enxertado em CDR, em que o domínio variável compreende regiões da estrutura aceitadora humana e CDRs dadoras não humanas, preferivelmente de rato.

Exemplos de estruturas humanas que podem ser usadas na presente invenção são KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (Rabat et al. , supra) . Por exemplo, KOL e NEWM pode ser usado para a cadeia pesada, REI pode ser usado para a cadeia leve e EU, LAY e POM podem ser usadas tanto para a cadeia pesada como para a cadeia leve. Alternativamente, podem ser usadas sequências germinais humanas; as sequências destas estão disponíveis em: http://vbase.mrc-cpe. cam.ac.uk/

Num anticorpo enxertado em CDR, as cadeias aceitadoras pesadas e leves não precisam de ser necessariamente do mesmo anticorpo e podem, se necessário, compreender cadeias compostas tendo regiões da estrutura derivadas de cadeias diferentes. A região da estrutura preferida para a cadeia pesada do anticorpo enxertado em CDR é derivada do subgrupo humano de sequência VH3 1-4 3-72, juntamente com JH4 (apresentado na Figura 2; SEQ ID NOS: 19 e 20) . Assim, é providenciado um anticorpo neutralizante enxertado em CDR que compreende pelo menos uma CDR dadora não humana em que a região da estrutura da cadeia pesada é derivada do subgrupo humano sequência 1-4 3-72 juntamente com JH4. A sequência de JH4 humano é a seguinte: (YFDY)WGQGTLVTVSS SEQ ID NO:20). O motivo YFDY é parte de CDR-H3 e não é parte da estrutura 4 (Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591). A sequência dadora é a sequência 132E09 VH (SEQ ID NO:2) apresentada na Figura 2 e as CDRs dadoras (SEQ ID Nos: 5, 6 e 7) estão sublinhadas. A região da estrutura preferida para a cadeia leve do anticorpo enxertado em CDR é derivado da sequência 2-1-(1)012 do subgrupo VKl da linha germinal humana juntamente com JK2 mostrado na Figura 2 (SEQ ID NO:21 e 22) . Assim é providenciado um anticorpo enxertado em CDR neutra-lizante, que compreende pelo menos um CDR dador não humano em que a região da estrutura da cadeia leve é derivada da sequência de subgrupo VKl 2-1-(1)012 juntamente com JK2. A sequência de JK2 é a seguinte: (YT)FGQGTKLEIKR(SEQ ID NO :22) . O motivo YT é parte de CDR-L3 e não é parte da estrutura 4 (Hieter, PA., et ai., 1982, J.Biol.Chem., 257, 1516-1522) . A sequência dadora é a sequência 132E09 VL (SEQ ID NO:4) apresentada na Figura 2 e as CDRs dadoras (SEQ ID Nos 8, 9 e 10) estão sublinhadas.

Além disso, num anticorpo enxertado em CDR, as regiões estrutura não precisam de ter exactamente a mesma sequência do que as do anticorpo aceitador. Por exemplo resíduos invulgares podem ser trocados por resíduos que ocorrem mais frequentemente para essa classe ou tipo de cadeia aceitadora. Alternativamente, resíduos seleccionados nas regiões da estrutura aceitadora podem ser trocados de modo a corresponderem ao resíduo encontrado na mesma posição no anticorpo dador (ver Reichmann et ai., 1998, Nature, 332, 323-324). Estas modificações deveriam ser mantidas ao mínimo necessário para recuperar a afinidade do anticorpo dador. Um protocolo para seleccionar resíduos nas regiões da estrutura aceitadora que podem necessitar ser modificadas é apresentada em WO91/09967.

Numa molécula de anticorpo enxertada em CDR da presente invenção, se a cadeia pesada aceitadora tem a sequência humana VH3 humana 1-4 3-72 juntamente com JH4, então as regiões da estrutura aceitadora da cadeia pesada compreendem, para além de uma ou mais CDRs dadoras, um resíduo dador pelo menos na posição 49 (de acordo com Rabat et ai. (supra)). Assim, é providenciado um anticorpo enxertado em CDR, em que pelo menos o resíduo na posição 49 do domínio variável da cadeia pesada é um resíduo dador.

Numa molécula de anticorpo enxertada em CDR, de acordo com a presente invenção tem a sequência de subgrupo humano VKl 2-1-(1)012 juntamente com JK2, então não são usados resíduos dadores nas regiões da estrutura aceitadora da cadeia leve e só são transferidas uma ou mais CDRs dadoras.

Os resíduos dadores são resíduos do anticorpo dador, i.e. o anticorpo do qual as CDRs foram originalmente derivadas, que, no caso da presente invenção é o anticorpo de rato 132E09.

Assim, a presente invenção providencia um anticorpo no qual a região variável da cadeia pesada compreende a sequência de gH!3 (Figura 2; SEQ ID NO:11).

Num modo de realização da presente invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência que apresenta pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada na SEQ ID NO: 11. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência que apresenta pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou semelhança com a sequência dada na SEQ ID NO:11.

Além disso, a presente invenção providencia um anticorpo no qual a região variável da cadeia leve compreende a sequência de gLlO (Figura 2; SEQ ID NO:13).

Num modo de realização da presente invenção, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência que apresenta pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada na SEQ ID NO: 13. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência que apresenta pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO :13.

Preferivelmente um anticorpo enxertado em CDR, de acordo com a presente invenção, compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência de gHl3 (SEQ ID NO:11) e uma cadeia leve que compreende a sequência de gLl0(SEQ ID NO:13).

Num modo de realização da presente invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que o domínio variável da cadeia pesada compreende uma sequência que apresenta pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO:11 e o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência que apresenta pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO :13. Preferivelmente o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve em que o domínio variável da cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou 98% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO :13.

As moléculas de anticorpo da presente invenção podem compreender uma molécula de anticorpo completa, tendo cadeias pesada e leve de comprimento total ou um fragmento destas e podem ser, mas não estão limitadas a Fab, Fab modificado, Fab', Fab(ab')2, Fv, anticorpos de domínio simples, scFv, anticorpos bi, tri ou tetra-valentes, Bis-scFv, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e fragmentos de ligação a epitopos de qualquer dos referidos acima (ver por exemplo Holliger e Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews-Online 2(3), 209-217). Os métodos para criar e produzir estes fragmentos de anticorpos são bem conhecidos na área (ver por exemplo Verma et al. , 1998, Journal of Immuno- logical Methods, 216, 165-181). Outros fragmentos de anticorpos para uso na presente invenção incluem os fragmentos Fab e Fab' descritos em Pedidos de patente internacionais W02005/003169, W02005/003170 e W02005/003171. Anticorpos multi-valentes podem compreender especificidades múltiplas ou ser monoespecíficos (Ver por exemplo WO 92/22853 e W005/113605).

Os domínios de região constante da molécula de anticorpo da presente invenção, se presentes, podem ser seleccionados tendo em conta a função proposta da molécula de anticorpo e, em particular as funções efectoras que podem ser requeridas. Por exemplo, os domínios de região constante podem ser domínios IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM. Em particular, podem ser usados domínios de região constante de IgG humanos, especialmente dos isótopos IgGl e IgG3 quando a molécula de anticorpo se destina a usos terapêuticos e são requeridas funções efectoras de anticorpo. Alternativamente, os isótopos IgG2 e IgG4 podem ser usados quando a molécula de anticorpo se destina a fins terá-pêuticos e não são requeridas as funções efectoras do anticorpo, por exemplo, simplesmente para bloquear a actividade de IL-6. Será reconhecido que também podem ser usadas variantes de sequência destes domínios de região constante. Por exemplo podem ser usadas moléculas IgG na qual a serina na posição 241 foi trocada por uma prolina, como descrito em Angal et ai., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. Particularmente preferido é o domínio constante de IgG4 que compreende esta modificação. Também será com preendido por um perito na matéria que anticorpos podem sofrer uma variedade de modificações pós-traducionais. 0 tipo e extensão destas modificações depende frequentemente da linha celular hospedeiro usada para exprimir o anticorpo assim como das condições de cultura. Estas modificações podem incluir variações em glicosilação, oxidação de metionina, formação de dicetopiperizina, isomerização de aspartato e desamidação de asparagina. Uma modificação frequente é a perda de um resíduo básico carboxi-terminal (tal como lisina ou arginina) devido à acção de carboxipep-tidases (como descrito em Harris, RJ. Journal of Chromatography 705: 129-134, 1995). Assim, a lisina C-terminal da cadeia pesada de anticorpo de SEQ ID NO: 16 pode estar ausente.

Num modo de realização preferido, o anticorpo fornecido pela presente invenção é um anticorpo neutra-lizante tendo especificidade para IL-6 humana no qual a região constante da cadeia pesada compreende a região constante IgG4 humana na qual a serina na posição 241 foi substituída por prolina, como descrito em Angal et ai., supra. Assim, a presente invenção fornece um anticorpo no qual a cadeia pesada compreende ou consiste na sequência dada em SEQ ID NO:16. Preferivelmente a região constante da cadeia leve é cKappa.

Num modo de realização, a presente invenção fornece um anticorpo no qual a cadeia pesada compreende ou consiste nas sequências dadas em SEQ ID NO:16 e a cadeia leve compreende ou consiste na sequência dada em SEQ ID NO:18.

Num modo de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO:16. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidade ou semelhança com a sequência dada na SEQ ID NO:16.

Num modo de realização da invenção o anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO:18. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia leve em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidade ou se melhança com a sequência dada na SEQ ID NO:18.

Num modo de realização da invenção, o anticorpo compreende uma cadeia pesada, em que a cadeia pesada compreende uma sequência que tem pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO: 16 e a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 60% de identidade ou semelhança com a sequência dada em SEQ ID NO:18. Preferivelmente, o anticorpo compreende uma cadeia pesada em que a cadeia pesada compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidade ou semelhança com a sequência dada na SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve em que a cadeia leve compreende uma sequência tendo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98% de identidade ou semelhança com a sequência dada na SEQ ID NO:18.

Também é providenciada uma região específica ou epitopo de IL-6 humana que está ligado por um anticorpo de acordo com a presente invenção, em particular um anticorpo que compreende qualquer uma de CDR-Hl (SEQ ID NO:5), CDR-H2 (SEQ ID NO:6), CDR-H3 (SEQ ID NO:7), CDR-Ll (SEQ ID NO:8), CDR-L2 (SEQ ID NO:9), CDR-L3 (SEQ ID NO:10), por exemplo o anticorpo 132E09 ou anticorpos que compreendem a sequência de região variável de cadeia pesada gHl3 (SEQ ID NO:11) e/ou a sequência de região variável de cadeia leve gLlO (SEQ ID NO:13).

Esta região específica ou epitopo do péptido IL-6 humano pode ser identificada por qualquer método de mapea-mento de epitopo conhecido na área em combinação com qualquer um dos anticorpos fornecidos pela presente invenção. Exemplos destes métodos incluem péptidos de screening (triagem) de comprimentos variáveis derivados de IL-6 para se ligar ao anticorpo da presente invenção com o fragmento mais pequeno que se pode ligar especificamente ao anticorpo contendo a sequência do epitopo reconhecido pelo anticorpo. Os péptidos IL-6 podem ser produzidos sinteticamente ou por digestão proteolítica do polipéptido IL-6. Os péptidos que se podem ligar ao anticorpo podem ser identificados, por exemplo, por análise por espectrometria de massa. Noutro exemplo, pode ser usada espectroscopia de NMR para identificar o epitopo ligado por um anticorpo da presente invenção, como descrito nos exemplos aqui. Uma vez identificado, pode ser usado o fragmento epitópico que se liga a um anticorpo da presente invenção, se for necessário, como imunogénio para obter anticorpos neutralizantes adicionais que se ligam ao mesmo anticorpo.

Num exemplo, o epitopo de IL-6 ligada por um anticorpo da presente invenção compreende pelo menos os resíduos de aminoácidos S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 e S169 de IL-6 humana (numeração dos resíduos de acordo com Boulanger et ai., Science, 300, 2101-2104) . Num exemplo, o epitopo de IL-6 humana ligado por um anticorpo da presente invenção compreende os resíduos de aminoácidos S47, C50, E93, R104, Fl 0 5, E106, T14 9, K150, A153, Q156, Q159 e S169 e um ou mais resíduos seleccionados de C44, S53, A58, V96, Q152, Q154, Nl55, W157, T163, L165 e E172.

Num exemplo, o epitopo do IL-6 humano ligado por um anticorpo da presente invenção compreende resíduos de aminoácidos C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, R104, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, Tl63, Ll65, SI 69 e E172.

Um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana pode ligar-se a um epitopo de IL-6 humana madura que compreende os resíduos de aminoácidos S47, C50, E93, Rl04, Fl05, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 e S169. Um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana pode ligar-se a um epitopo de IL-6 humana madura que compreende os resíduos de aminoácidos S47, C50, E93, R104, Fl 0 5, E106, T14 9, K150, A153, Q156, Q159 e S169 e um ou mais resíduos seleccionados de C44, S53, A58, V96, Q152, Q154, N155, W157, T163, L165 e E172.

Um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana pode ligar-se a um epitopo de IL-6 humana madura que compreende os resíduos de aminoácidos C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, R104, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 e E172.

Será compreendido que os resíduos acima mencionados podem também ser numerados baseado na numeração de aminoácidos do precursor não processado de IL-6 (Número de Acesso Swiss Prot P05231) . Usando esta numeração os resíduos numerados acima de acordo com Boulanger et al., supra como C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, R104, F105, E106, Tl4 9, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 e E172 transformam-se em C72, S75, C78, S81, A86, E121, V124, R132, F133, E134, T177, K178, Q180, A181, Q182, N183, Q184, W185, Q187, T191, L193, S197 e E200 respectivamente.

Preferivelmente um anticorpo da presente invenção bloqueia a ligação do receptor gpl30 ao site 3 da IL-6 humana.

Anticorpos que bloqueiam transversalmente a ligação dos anticorpos da presente invenção a IL-6 podem ser também úteis na neutralização da actividade de IL-6.

As moléculas de anticorpo da presente invenção preferivelmente têm uma afinidade de ligação elevada para IL-6 humana, preferivelmente picomolar. A afinidade pode ser medida usando qualquer método conveniente conhecido na área, incluindo BIAcore como descrito nos exemplos aqui. Preferivelmente a afinidade é medida usando IL-6 humana recombinante como descrito nos exemplos aqui. Preferivelmente uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-6 humana de menos de 500 pM. Preferivelmente uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-6 humana de menos de 50 pM. Assim, numa implementação uma molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de entre cerca de 1 e cerca de 500 pM. Numa implementação a molécula de anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação de entre cerca de 1 e cerca de 50 pM. Preferivelmente a molécula de anticorpo da presente invenção apresenta uma afinidade de ligação para IL-6 humana de entre cerca de 1 e cerca de 20 pM. Numa implementação o anticorpo da presente invenção tem uma afinidade de ligação para IL-6 entre 8 e 12 pM. Será compreendido que a afinidade de anticorpos fornecida pela presente invenção pode ser alterada usando um método conveniente conhecido na área. Assim, a presente invenção também se relaciona com variantes das moléculas de anticorpo da presente invenção, que têm uma afinidade melhorada para IL-6 humana. Estas variantes podem ser obtidas por diversos protocolos de maturação de afinidade incluindo mutação de CDRs (Yang et al., J.Mol.Biol., 254, 392-403, 1995) , "chain shuffling" (Mark set al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), Use of mutator strains of E.coli (Low et al., J.Mol.Biol., 250, 359-368, 1996), "DNA shuffling" (Patten et al. , Curr.Opin.Biotechnol. , 8, 724-733, 1997), "phage display" (Thompson et al. , J.Mol.Biol., 256, 77-88, 1996) e PCR sexual (carmeri et al., Nature, 391, 288-291, 1998) . Vaughan et al. (supra) discute estes métodos de maturação de afinidade.

As moléculas de anticorpo da presente invenção preferivelmente neutralizam a actividade de IL-6, por exemplo nos ensaios in vitro e in vivo descritos nos exemplos. Numa implementação estes anticorpos ligam-se ao site 3 de IL-6 humana.

Num modo de realização a presente invenção fornece um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana, que é capaz de inibir a actividade de 0,038 nM de IL-6 humana em 50% a uma concentração de menos do que 100 pM, sendo a referida actividade inibidora medida sobre a proliferação de células T1165, induzida por IL-6. Numa implementação a concentração de anticorpo que inibe IL-6 a 50% é menor do que 50 pM, mais preferivelmente menor que 20 pM. Preferivelmente a IL-6 humana usada no ensaio é IL-6 recombinante humana. Numa implementação o anticorpo neutra-lizante é um anticorpo humanizado ou totalmente humano.

Num outro modo de realização a presente invenção fornece um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana que é capaz de inibir a actividade de 3,84 nM de IL-6 humana em 50% a uma concentração de menos de 1 nM sendo a actividade inibidora medida sobre a produção de MCP-1 por HUVECS em resposta a IL-6 humana e sIL-6R. Preferivelmente o IL-6 humano usado no ensaio é IL-6 recombinante humano. Num modo de realização, o anticorpo neutralizante é um anticorpo humanizado ou totalmente humano.

Se desejado, um anticorpo de acordo com a presente invenção, pode ser conjugado com uma ou mais molécula (s) efectora(s). Será reconhecido que numa implementação a molécula efectora pode compreender uma só molécula efectora ou duas ou mais destas moléculas ligadas de modo a formar uma única parte que pode ser ligada aos anticorpos da presente invenção. Nos casos em que é desejado para obter um fragmento de anticorpo ligado a uma molécula efectora, isto pode ser preparado por procedimentos químicos standard ou procedimentos de DNA recombinante nos quais o fragmento de anticorpo é ligado directamente ou através de um agente acoplante à molécula efectora. Técnicas para conjugar estas moléculas efectoras a anticorpos são bem conhecidas na área (ver Hellstrom et ai., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp.623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). Procedimentos químicos particulares incluem, por exemplo, os descritos em WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 e WO03031581. Alternativamente, nos casos em que a molécula efectora é uma proteína ou polipéptido a ligação pode ser conseguida usando procedimentos de DNA recombi-nantes, por exemplo como descrito em WO 86/01533 e EP0392745. O termo molécula efectora como aqui usado, inclui, por exemplo agentes antineoplásicos, medicamentos, toxinas, proteínas biologicamente activas, por exemplo enzimas, outros anticorpos ou fragmentos de anticorpos, polímeros sintéticos ou que ocorrem naturalmente, ácidos nucleicos e fragmentos destes p.ex. DNA, RNA e fragmentos destes, radionuclidos, particularmente radioiodo, radioisó-topos, metais quelatados, nanoparticulas e grupos repórter, tais como compostos fluorescentes ou compostos que podem ser detectados por NMR ou espectroscopia de ESR.

Exemplos de moléculas efectoras podem incluir citotoxinas ou agentes citotóxicos incluindo qualquer agente prejudicial (por exemplo causador de morte) para as células. Exemplos incluem combrestatinas, dolastinas, epotilonas, estaurosporinas, maitansinóides, espongistatinas, rizoxina, halicondrinas, roridinas, hemiasterlinas, taxol, citocala- sina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomi-cina, etoposido, tenopósido, vincristina, vinblastina, col-chicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi-antracina-diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dihi-droxitestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propanol e puromicina e análogos e homólogos destes.

Moléculas efectoras também incluem, mas não estão limitadas a antimetabolitos (p.ex. metotrexato, 6-mercap-topurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluoracil decarba-zina), agentes alquilantes (meclororetamina, tioepacloram-bucil, melfalan, carmustina (BSNU) e Iomustina (CCNU), ci-clotosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C e cis-diclorodiamina platinum (II) (DDP) cis-platina), antraciclinas (por exemplo daunorubicina (ante-riormente daunomicina) e doxorubicina) , antibióticos (por exemplo dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomi-cina, mitramicina, antramicina (AMC), calicheamicinas ou duocarmicinas) e agentes antimicóticos (por exemplo vincristina e vinblastina),

Outras moléculas efectoras podem incluir radionu- 111 QD i η n g -i q clidos quelatados tais como In e Y, Lu , Bismuto ,

Californio , Indio e Tungsténio /Remo , ou drogas tais como, mas não limitadas a alquilfosfocolinas, inibi-dores da topoisomerase I, taxóides e suramina.

Outras moléculas efectoras incluem proteínas, péptidos e enzimas. Enzimas de interesse incluem, mas não são limitadas a enzimas proteolíticas, hidrólases, liases, isomerases, transferases. Proteínas, polipéptidos e péptidos de interesse incluem, mas não estão limitados a, imuno-globulinas, toxinas tais como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria, uma proteína tal como a insulina, factor de necrose de tumores, inter-feron-a, interferon-β, factor de crescimento do nervo, factor de crescimento das plaquetas ou activador do plasminogénio do tecido, um agente trombótico ou um agente anti-angiogénico, por exemplo angiostatina ou endostatina ou um modificador de resposta biológica tal como uma linfocina, interleucina-1(IL-1), interleucina 2(IL-2), in-terleucina-6(IL-6), factor de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), factor de crescimento do nervo (NGF) ou outros factores de crescimento e imuno-globulinas.

Outras moléculas efectoras podem incluir substâncias detectáveis úteis por exemplo em diagnóstico. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais fluorescentes, materiais bioluminescentes, nuclidos radioactivos, metais emissores de positrões (para uso em tomografia de emissão de positrões) e iões metálicos paramagnéticos não-radioactivos. Ver na generalidade a patente U.S. n° 4,741,900 para iões metálicos que podem ser conjugados a anticorpos para uso como diagnóstico. Enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano, fosfatase alcalina, beta-galactosidase ou acetilcolinesterase; grupos prostéticos adequados incluem estreptavidina, avidina e biotina; materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluo-resceína, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, dicloro-triazinilamina fluoresceina, cloreto de dansilo e ficoe-ritrina; materiais luminescentes adequados incluem luminol; materiais bioluminescentes adequados incluem luciferase, luciferina e equorina; e nuclidos radioactivos adequados incluem 125I, 131I, 1:LIn e 99Tc.

Noutro exemplo a(s) molécula(s) efectoras podem aumentar a meia-vida do anticorpo in vivo e/ou reduzir a imunogenicidade do segundo anticorpo e/ou aumentar a distribuição de um anticorpo através de uma barreira epitelial ao sistema imunitário. Exemplos de moléculas efectoras adequadas deste tipo incluem polímeros, albumina, proteínas de ligação à albumina ou compostos de ligação à albumina tais como os descritos em WO05/117984 (publicado a 15.12.05).

Nos casos em que a molécula efectora é um polímero, pode ser, em geral, um polímero sintético ou que ocorre naturalmente, por exemplo um polialquileno opcionalmente substituído de cadeia simples ou ramificada, polímero de polialquenileno ou polioxialquileno ou um polissacárido ramificado ou não ramificado, por exemplo um polissacárido homo ou hetero.

Substituintes opcionais particulares que podem estar presentes nos polímeros sintéticos acima mencionados incluem um ou mais grupos hidroxilo, metilo ou metoxi.

Exemplos particulares de polímeros sintéticos incluem opcionalmente polietilenoglicol, polipropileno-glicol, polivinilalcool, de cadeia simples ou ramificadaou derivados destes, especialmente polietilenoglicol opcionalmente substituído tal como metoxipolietilenoglicol ou derivados deste.

Polímeros que ocorrem naturalmente particulares incluem lactose, amilose, dextrano, glicogénio ou derivados destes. "Derivados" como aqui usado pretende incluir derivados reactivos, por exemplo grupos reactivos selec-tivos para tiol tais como maleimidas e afins. 0 grupo reactivo pode ser ligado directamente ou através de um segmento linker ao polímero. Será reconhecido que o resíduo de um grupo deste tipo fará nalguns casos parte do produto como o grupo linking entre o fragmento de anticorpo e o polímero. 0 tamanho do polímero pode ser variado como desejado, mas encontrar-se-á geralmente num intervalo de peso molecular médio de 500 Da a 50000 Da, preferivelmente de 5000 a 40000 Da e mais preferivelmente de 20000 a 40000 Da. O tamanho do polímero pode, em particular ser seleccionado na base do uso pretendido do produto por exemplo capacidade para localizar a certos tecidos tais como tumores ou meia-vida circulante aumentada (para revisão ver Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Assim, por exemplo, nos casos em que se pretende que o produto saia da circulação e penetre no tecido, por exemplo, para uso no tratamento de um tumor, pode ser vantajoso usar um polímero de pequeno peso molecular, por exemplo com um peso molecular de cerca de 5000 Da. Para aplicações em que o produto permanece em circulação, pode ser vantajoso usar um polímero de peso molecular mais elevado, por exemplo tendo um peso molecular no intervalo de 20000 Da a 40000 Da. Polímeros particularmente preferidos incluem um polímero polialquileno, tal como um politilenoglicol ou, especiae-mente um metoxipolietilenoglicol ou um derivado deste e, especialmente com um peso molecular no intervalo de cerca de 15000 Da a cerca de 40000 Da.

Num exemplo, anticorpos para uso na presente invenção estão ligados a grupos polietilenoglicol (PEG). Num exemplo particular o anticorpo é um fragmento de anticorpo e as moléculas PEG podem estar ligadas através de qualquer cadeia lateral de aminoácidos ou grupo funcional de aminoácidos terminal localizado no fragmento de anticorpo, por exemplo qualquer grupo amino, imino, tiol, hidroxi ou carboxilo livre. Estes aminoácidos podem ocorrer naturalmente no fragmento de anticorpo ou podem ser geneticamente introduzidos no fragmento usando métodos de DNA recombinante (ver por exemplo US 5,219,996; US 5,667,425; W098/25971). Num exemplo, a molécula de anticorpo da presente invenção é um fragmento Fab modificado em que a modificação é a adição ao terminal C da sua cadeia pesada de um ou mais aminoácidos para permitir a ligação de uma molécula efectora. Preferivelmente, os aminoácidos adicionais formam uma região "hinge" modificada contendo um ou mais resíduos de cisteína aos quais pode ser ligada a molécula efectora. Sites múltiplos podem ser usados para ligar duas ou mais moléculas PEG.

Preferivelmente as moléculas de PEG estão cova-lentemente ligadas através de um grupo tiol de pelo menos um resíduo de cisteína localizado no fragmento de anticorpo. Cada molécula de polímero ligada ao fragmento de anticorpo modificado pode estar covalentemente ligada ao átomo de enxofre de um resíduo de cisteína localizado no fragmento. A ligação covalente será geralmente uma ligação dissulfureto, em particular uma ligação enxofre-carbono. Nos casos em que é usado um grupo tiol como ponto de ligação, podem ser usadas moléculas efectoras apropriadas, por exemplo derivados selectivos de tiol tais como malei-midas e derivados de cisteína. Pode ser usado um polímero activado como material de partida na preparação de fragmentos de anticorpo modificados por polímero. 0 polímero activado pode ser qualquer polímero contendo um grupo tiol reactivo tal como um ácido α-halocarboxílico ou éster, por exemplo iodoacetamida, uma imida, por exemplo maleimida, uma vinil sulfona ou um dissulfureto. Estes materiais de partida podem ser obtidos comercialmente (por exemplo de

Nektar, anteriormente Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) ou podem ser preparados de matérias de partida comercialmente disponíveis usando procedimentos químicos convencionais. Moléculas PEG particulares incluem 20K meto-xi-PEG-amina (pode obter-se de Nektar, anteriormente Shearwater; Rapp Polymere; e SunBio) e M-PEG-SPA (pode obter-se de Nektar, anteriormente Shearwater).

Num modo de realização, o anticorpo é um fragmento Fab modificado ou diFab que é PEGilado, i.e. têm PEG (polietilenoglicol) ligado covalente a si., por exemplo de acordo com os métodos revelados em EP 0948544 ou EP1090037 [ver também "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, Poly (ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A.Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54: 531-545] . Num exemplo PEG está ligado a uma cisteína na região hinge. Num exemplo, um fragmento Fab modificado com PEG tem um grupo maleimida ligado covalentemente a um único grupo tiol numa região hinge modificada. Um resíduo de lisina pode ser covalentemente ligado ao grupo maleimida e a cada um dos grupos amina no resíduo de lisina pode ser ligado um polímero metoxipoli(etilenoglicol) tendo um peso molecular de apro- ximadamente 20,000 Da. 0 peso molecular total do PEG ligado ao fragmento Fab pode assim ser aproximadamente 40,000 Da.

Num modo de realização, a presente invenção fornece uma molécula de anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana, que é um fragmento Fab modificado tendo uma cadeia pesada que compreende a sequência dada em SEQ ID NO:11 e uma cadeia leve que compreende a sequência dada em SEQ ID NO: 13 e tendo, na extremidade C-terminal da sua cadeia pesada uma região hinge modificada que contem pelo menos um resíduo de cisteína ao qual está ligada uma molécula efectora. Preferivelmente a molécula efectora é PEG e é ligada usando os métodos descritos em (W098/25971 e W02004072116) em que um grupo lisil-maleimida é ligado ao resíduo de cisteína na extremidade C-terminal da cadeia pesada e cada grupo amino do resíduo lisil tem a si ligado covalentemente um resíduo de metoxipoli(etile-noglicol) com um peso molecular de cerca de 20,000 Da. P peso molecular total do PEG ligado ao anticorpo é assim de aproximadamente 40,000 Da.

Noutro exemplo moléculas efectoras podem ser ligadas a fragmentos de anticorpo usando os métodos descritos nos pedidos de patente internacionais W02005/003169, W02005/003170 e W02005/003171. A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica a(s) cadeia(s) pesada e/leve de uma molécula de anticorpo da presente invenção.

Preferivelmente, a sequência de DNA codifica a cadeia pesada ou a cadeia leve de uma molécula de anticorpo da presente invenção. A sequência de DNA da presente invenção pode compreender DNA sintético, por exemplo produzido por processamento químico, cDNA, DNA genómico ou qualquer combinação destes.

Sequências de DNA que codificam uma molécula de anticorpo da presente invenção, podem ser obtidas por métodos bem conhecidos dos peritos na matéria. Por exemplo, sequências de DNA que codificam parte ou todas as cadeias pesada e leve do anticorpo podem ser sintetizadas como desejado a partir das sequências determinadas ou na base das sequências de aminoácidos correspondentes. 0 DNA que codifica sequências da estrutura aceitadora está largamente disponível para os peritos na matéria e pode ser facilmente sintetizado, na base das suas sequências de aminoácidos conhecidas.

Podem ser usadas técnicas standard de biologia molecular para preparar sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas para preparar sequências de DNA que codificam o anticorpo da presente invenção. As sequências de DNA desejadas podem ser sintetizadas completamente ou em parte usando técnicas de síntese de oligonucleótidos. Quando apropriado também podem ser usadas mutagénese dirigida para sites e técnicas de reacção em cadeia por polimerase (PCR).

Exemplos de sequências de DNA adequadas são providenciadas na SEQ ID N0:1; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO:12; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 17. Os nucleótidos 1-57 em SEQ ID NO:15 e 1-60 em SEQ ID NO:17 codifica a sequência de péptido de sinal para o anticorpo B72.3 de ratinho (Whittle et ai., 1987, Protein Eng. 1(6)499-505) que é clivada para produzir uma molécula de anticorpo neutralizante da presente invenção. Assim a presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica a cadeia pesada de um anticorpo da presente invenção que compreende os nucleótidos 58-2008 da SEQ ID NO :15. A presente invenção também fornece uma sequência de DNA isolada que codifica a cadeia leve de um anticorpo da presente invenção que compreende os nucleótidos 61-705 da SEQ ID NO:17. A presente invenção também se relaciona com um vector de expressão ou clonagem que compreende uma ou mais sequências de DNA da presente invenção. Assim, é providenciado um vector de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências que codificam um anticorpo da presente invenção. Preferivelmente, o vector de clonagem ou expressão compreende duas sequências de DNA que codificam a cadeia leve e a cadeia pesada da molécula de anticorpo da presente invenção, respectivamente. Preferivelmente um vector de acordo com a presente invenção compreende a sequência dada em SEQ ID NOs: 15 e 17. Os nucleótidos 1-57 na SEQ ID NO:15 e 1-60 na SEQ ID NO:17 codificam a sequência de péptido de sinal do anticorpo de ratinho B72.3 que é mais preferivelmente clivado para produzir uma molécula de anticorpo neutralizante da presente invenção. Métodos gerais pelos quais os vectores podem ser construídos, métodos de transfecção e métodos de cultura são bem conhecidos dos peritos na matéria. A este respeito é feita referência a "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F.M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York e a Maniatis Manual produzido por Cold Spring Harbor Publishing.

Também é providenciada uma célula hospedeiro que compreende um ou mais vectores de clonagem ou expressão que compreendem uma ou mais sequências de DNA que codificam um anticorpo da presente invenção. Pode ser usado qualquer célula hospedeiro/ sistema de vector para expressão das sequências de DNA que codificam a molécula de anticorpo da presente invenção. Podem ser usados sistemas bacterianos, por exemplo E. coli e outros sistemas microbianos ou sistemas de expressão de células hospedeiro eucariotas, por exemplos células de mamíferos, ver Verma et ai., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181. Células hospedeiro de mamífero apropriadas incluem células CHO, NSO,células de mieloma ou hibridoma. Exemplos de sistemas de expressão adequados incluem o sistema de expressão de glutamina sintetase, descrito em WO87/04462. A presente invenção também fornece um processo para a produção de uma molécula de anticorpo de acordo com a invenção, que compreende cultivar uma célula hospedeiro contendo um vector da presente invenção sob condições adequadas para conduzir à expressão de proteína a partir de DNA que codifica a molécula de anticorpo da presente invenção e isolar a molécula de anticorpo. A molécula de anticorpo pode compreender somente um polipéptido de cadeia pesada ou leve e nesse caso só é necessário usar a sequência que codifica o polipéptido de cadeia pesada ou o polipéptido de cadeia leve para trans-fectar as células hospedeiro. Para a produção de produtos que compreendem ambas as cadeias pesada e leve, a linha celular pode ser transfectada com dois vectores, um primeiro vector que codifica o polipéptido da cadeia leve e um segundo vector que codifica um polipéptido de cadeia pesada. Alternativamente, pode ser usado um só vector, incluindo esse vector sequências que codificam os polipép-tidos da cadeia leve e da cadeia pesada.

Como os anticorpos da presente invenção são úteis no tratamento e/ou profilaxia de uma condição patológica, a presente invenção também fornece uma composição farmacêutica ou diagnóstica que compreende uma molécula de anticorpo da presente invenção em combinação com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. Assim, é providenciado o uso de um anticorpo da invenção para a produção de um medicamento. A composição será normalmente fornecida como parte de uma composição farmacêutica estéril que normalmente incluirá um veiculo aceitável do ponto de vista farmacêutico. Uma composição farmacêutica da presente invenção pode compreender adicionalmente um adjuvante aceitável do ponto de vista farmacêutico. A presente invenção também fornece um processo para preparação de uma composição farmacêutica ou diagnóstica que compreende adicionar e misturar a molécula de anticorpo da presente invenção juntamente com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico. A molécula de anticorpo pode ser o único ingrediente activo na composição farmacêutica ou diagnóstica ou pode ser acompanhada por outros ingredientes activos incluindo outros ingredientes de anticorpo, por exemplo anticorpos anti-TNF, anti-IL-Ιβ, anti-células T, anti-IFNy ou anti-LPS ou ingredientes não-anticorpos tais como xantinas.

As composições farmacêuticas compreendem preferivelmente uma quantidade terapeuticamente efectiva do anticorpo da invenção. 0 termo "quantidade terapeuticamente efectiva" como aqui usado refere-se a uma quantidade de um agente terapêutico necessária para tratar, melhorar ou evitar uma doença alvo ou condição, ou para exibir um efeito terapêutico ou preventivo detectável. Para qualquer anticorpo, a quantidade terapeuticamente efectiva pode ser estimada inicialmente ou em ensaios de cultura de células ou em modelos animais, normalmente em roedores, coelhos, cães, porcos ou primatas. 0 modelo animal também pode ser usado para determinar o intervalo de concentração apropriada e a via de administração. Esta informação pode depois ser usada para determinar doses úteis e vias de administração em humanos. A quantidade terapeuticamente efectiva exacta para um indivíduo humano dependerá da severidade do estado da doença, do estado de saúde geral do indivíduo, da idade, peso e do sexo do indivíduo, dieta, tempo e frequência de administração, combinações de drogas, sensibilidades de reacção e tolerância/resposta à terapia. Esta quantidade pode ser determinada por experimentação de rotina e é para ser decidida pelo médico. Geralmente, uma quantidade terá-peuticamente efectiva será de 0,01 mg/kg a 50 mg/kg, preferivelmente 0,1 mg/kg a 20 mg/kg. Composições farmacêuticas podem ser apresentadas convenientemente em formas de dose unitária contendo uma quantidade predeterminada de um agente activo da invenção por dose.

As composições podem ser administradas a um doente individualmente ou podem ser administradas em combinação (por exemplo simultaneamente, sequencialmente ou separadamente) com outros agentes, medicamentos ou hormonas. A dose, à qual a molécula de anticorpo da presente invenção é administrada, depende da natureza da condição a ser tratada, da extensão da inflamação presente e se a molécula de anticorpo está a ser usada profilacti-camente ou para tratar uma condição existente. A frequência de dose dependerá da meia-vida da molécula de anticorpo e da duração do seu efeito. Se a molécula de anticorpo tem uma meia-vida curta (por exemplo 2 a 10 horas) , pode ser necessário dar uma ou mais doses por dia. Alternativamente, se a molécula de anticorpo tem uma meia vida longa (por exemplo 2 a 15 ou 2 a 30 dias) , pode ser necessário administrar uma dose uma vez por dia, uma vez por semana ou mesmo uma vez por mês ou de dois em dois meses. O veículo aceitável do ponto de vista farmacêutico não deve induzir ele mesmo a produção de anticorpos nocivos para o indivíduo que recebe a composição e não deve ser tóxico. Veículos adequados podem ser moléculas grandes, que são metabolizadas lentamente tais como proteínas, polipéptidos, lipossomas, polissacáridos, ácidos polilác-ticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos e partículas de vírus inactivas. Podem ser usados sais aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, por exemplo sais de ácidos minerais, tais como hidrocloretos, hidrobrometos, fosfatos e sulfatos ou sais de ácidos orgânicos, tais como acetatos, propionatos, malonatos e benzoatos.

Veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico em composições terapêuticas podem conter adicionalmente líquidos, tais como água, solução salina, glicerol e etanol. Adicionalmente, podem estar presentes nestas composições substâncias auxiliares, tais como agentes humidi-ficantes ou emulsionantes ou substâncias de tamponagem de pH. Estes veículos permitem que as composições farmacêuticas sejam formuladas como comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas e suspensões para ingestão pelo doente.

Formas preferidas para administração incluem formas adequadas para administração parentérica, por exemplo por injecção ou infusão, por exemplo por injecção bolus ou infusão contínua. Nos casos em que o produto é para injecção ou infusão, pode tomar a forma de uma suspensão, solução ou emulsão num óleo ou veículo aquoso e pode conter agentes da fórmula, tais como agentes de suspensão, conservantes, estabilizadores e/ou dispersantes. Alternativamente, a molécula de anticorpo pode encontrar-se na forma seca, para reconstituição antes do uso com um líquido estéril apropriado.

Uma vez formuladas, as composições da invenção podem ser administradas directamente ao indivíduo. Os indivíduos a ser tratados podem ser animais. No entanto é preferível que as composições sejam adaptadas para administração a indivíduos humanos.

As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por várias vias incluindo, mas não sendo limitadas a via oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, intraventricular, transdermal, trancutânea (por exemplo ver WO 98/20734), subcutânea, intraperitoneal, intranasal, enteral, tópica, sublingual, intavaginal ou rectal. Também podem ser usados hiposprays para administrar as composições farmacêuticas da invenção. Tipicamente, as composições terapêuticas podem ser preparadas como injectáveis, como soluções liquidas ou suspensões. Também podem ser preparadas formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em veículos líquidos antes da injecção. A distribuição directa das composições será geralmente conseguida por injecção, por via subcutânea, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular ou distribuída no espaço intersticial de um tecido. As composições também podem ser administradas a uma lesão. O tratamento de dosagem pode ser um plano de dose única ou um plano de doses múltiplas.

Será compreendido que o ingrediente activo na composição será uma molécula de anticorpo. Como tal, será susceptível de degradação no tracto gastrointestinal. Assim, se a composição é para ser administrada por uma via usando o tracto gastrintestinal, a composição precisa de conter agentes que protejam o anticorpo de degradação mas que liberte o anticorpo uma vez que este tenha sido absorvido pelo tracto gastrointestinal.

Uma discussão completa de veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico está disponível em "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Company, N.J. 1991).

Também é considerado que o anticorpo da presente invenção pode ser administrado por uso de terapia genética. Para realizar isso, são introduzidos num doente sequências de DNA que codificam as cadeias pesada e leve da molécula de anticorpo sob controlo de componentes de DNA apropriados, de modo que as cadeias de anticorpo sejam expressas a partir das sequências de DNA e reunidas in situ. A presente invenção também fornece uma molécula de anticorpo para uso no controlo de doenças inflamatórias. Preferivelmente, a molécula de anticorpo pode ser usada para reduzir o processo inflamatório ou para evitar o processo inflamatório.

Também é providenciado uma molécula de anticorpo, de acordo com a presente invenção para uso no tratamento e/ou profilaxia de uma desordem patológica, que é mediada por IL-6 ou associada com um nível aumentado de IL-6. A presente invenção providencia ainda o uso de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção na produção de um medicamento, para o tratamento e/ou profilaxia de uma desordem patológica que é mediada por IL-6 ou associada com um nivel aumentado de IL-6. Preferivelmente, a condição patológica é seleccionada do grupo que consiste em infec-ções (virais, bacterianas, fúngicas e parasitárias), choque endotóxico associado com a infecção, artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil sistémica (JIA), lúpus eritematoso sistémico(SLE), asma, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença de Crohn, colite ulcerativa, sindrome do intestino irritável, doença de Castleman, espondilite anquilosante, dermatomio-site, uveite, doença de Peyronie, doença celíaca, doença de vesícula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, artrite lyme, meningoencefalite, desordens inflamatórias do sistema nervoso central e periférico, mediadas imunitáriamente, tais como esclerose múltipla e síndroma de Guillain-Barr, outras desordens auto-imunes, pancreatite, trauma (cirurgia), doença do enxerto contra o hospedeiro, rejeição de transplantes, cancro (tanto tumores sólidos tais como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de células escamosas, carcinoma de células tran-sicionais, cancros do ovário e malignidades hematológicas e em particular leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crónica, cancro do estômago e cancro do cólon), doenças de coração incluindo doenças isquémicas tais como enfarte do miocárdio assim como aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção do osso, doentes com queimaduras, osteo-porose, periodontite e hipocloridia.

Preferivelmente a desordem patológica é artrite reumatóide ou lúpus eritematoso sistémico (SLE). A presente invenção também providencia uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção para uso no tratamento e profilaxia da dor. A presente invenção providencia ainda o uso de uma molécula de anticorpo, de acordo com a presente invenção, na produção de um medicamento para o tratamento ou profilaxia da dor.

Uma molécula de anticorpo da presente invenção pode ser utilizada em qualquer terapia em que é desejado reduzir os efeitos de IL-6 no corpo humano ou animal. IL-6 pode estar circulante no corpo ou pode estar presente a um nivel indesejavelmente elevado num local particular do corpo, por exemplo no sitio de inflamação.

Uma molécula de anticorpo da presente invenção é preferivelmente usada para o controlo de doenças inflamatórias . A presente invenção também providencia um método para tratar indivíduos humanos ou animais sofrendo ou com risco de uma desordem mediada por IL-6, compreendendo o método administrar ao indivíduo uma quantidade efectiva da molécula de anticorpo da presente invenção. A molécula de anticorpo da presente invenção também pode ser usada no diagnóstico, por exemplo no diagnóstico in vivo e imagiologia de estados de doença que envolvem IL-6. A presente invenção é adicionalmente descrita por meio de ilustração somente nos exemplos seguintes, que se referem a figuras acompanhantes, nas quais: A Figura 1 apresenta o desenho enxerto para as sequências da cadeia pesada (Figura 2 a; SEQ ID NO:11) e cadeia leve (Figura 2 b; SEQ ID NO:13)de 240.gl. O símbolo (I) realça diferenças entre sequências da estrutura enxertadas: dadoras: aceitadoras. As CDR's apresentam sublinhado simples. Estas são como definidas por Rabat, exceptuando para CDR-Hl que abrange as definições de Rabat e Clothia. Sequências com sublinhado duplo são resíduos da estrutura do dador retidos nos enxertos.

Figura 2 a apresenta a sequência traduzida da cadeia pesada de 240.gl IgG4, mostrando os limites intrão/exão.

Figura 2 b apresenta a sequência traduzida da cadeia leve de 240.gl, mostrando os limites intrão/exão.

Figura 3 a mostra a inibição da proliferação de células ΊΊ165 induzida por IL-6 recombinante humana, derivada de mamifero humana, rhesus, cinomolgo e ratinho, pelo anticorpo 240.gl.

Figura 3 b mostra a inibição da produção de MCP-1 em HUVECs induzida por IL-6 recombinante humana e SIL-6R, pelo anticorpo 240.gl.

Figura 3c mostra a inibição da produção de MCP-1 em HUVECs induzida por IL-17, IL-6 endógena e SIL-6R, pelo anticorpo 240.gl.

Figura 4. Neutralização in vivo de SAA induzido por hIL-6 em ratinhos por administração de CA030_240.gl (site 3 anticorpo) n=7-8/ grupo, excepto PBS n=6. Análise estatística por ANOVA com pos teste Bonferroni, **P<0,01 comparada com IL-6 sozinha.

Manipulações de DNA e métodos gerais A estirpe de E.coli INVaF' (Invitrogen) foi usada para transformação e crescimento de cultura de rotina. Os enzimas para restrição e modificação de DNA foram obtidas de Roche Diagnostics Ltd. E New England Biolabs. As preparações de plasmideos foram realizadas usando kits de purificação Maxi Plasmid (QIAGEN, No. 12165 de catalogo). As reacções de sequenciação foram realizadas usando o kit de sequenciação ABI Prism Big Dye terminator (No. Catálogo 4304149) e corrida num sequenciador automático ABI 3100 (Applied Biosystems). Os dados foram analisados usando ο programa AutoAssembler (Applied Biosystems). Os oligonu-cleótidos foram obtidos de INVITROGEN. Os genes sintéticos foram produzidos em Entelechon. A concentração de Fab e IgG foi determinado usando ELISA.

Exemplo 1: Isolamento de 132E09

Os ratos foram imunizados por injecção subcutânea de IL-6 humana recombinante (Peprotech) em intervalos de três semanas, inicialmente com Adjuvante completo de Freund e subsequentemente com Adjuvante Incompleto de Freund. Os baços foram colhidos uma ou duas semanas após a última imunização e foram preparadas suspensões de célula única. Linfócitos de rato imunizado foram cultivados na presença de células EL4 timona de ratinho irradiadas e meio condicionado de células T de coelho durante uma semana em placas de microtitulo de 96 poços. Os sobrenadantes foram triados para a presença de anticorpos específicos para IL-6 humana em ELISAs. Os positivos foram triados para a capacidade de neutralizar os efeitos biológicos de IL-6 humana num ensaio de linha celular DS1 (Bock et al. , 1993, Cytokine, 5, 480-489) . Células B individuais que segregam anticorpo com características de ligação apropriadas foram isoladas a partir de poços positivos de microtitulo de acordo com o Método de anticorpos de linfócitos seleccionados (Babcook et al. , 1996, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 93, 7843-7848; WO92/02551) e genes de região variável de cadeia pesada e leve foram clonados via PCR de transcrição reversa a partir de células B de rato individuais. As regiões variáveis foram expressas em formato IgG recombinante para confirmar ligação e o anticorpo 132E09 foi seleccionado para humanização e estudo posterior. A sequência de região variável de rato foi registada como CA030_00240.

As sequências de região V estão apresentadas em SEQ ID NOS:1 a 4.

Exemplo 2: Enxerto CDR de 132E09

Foram designadas uma série de regiões VL e VH humanizadas nas quais as regiões hipervariáveis mais um número variável de resíduos da estrutura de 132E09 foram enxertados em estruturas aceitadoras da região V humanas. Foram designadas dez regiões VL enxertadas e foram construídos genes por montagem de oligonucleótidos e mutagénese por PCR. Também foram construídas um total de 13 regiões VH enxertadas (gHI-13) usando duas regiões da estrutura diferentes, VH3 1-4 3-72 e VH3 1-3 3-21. As sequências enxertadas de cadeia leve foram sub-clonadas no vector de expressão de cadeia leve humana pKHlO.l que contem o DNA que codifica a região constante C-kappa humana (alotipo Km3). As sequências enxertadas da cadeia pesada foram subclonadas no vector de expressão de gama-4 humana, pVhg4P FL, que contem o DNA que codifica a região constante gama 4 humana contendo a mutação estabilizante de hinge, S241P (Angal et ai., supra). Os plasmideos foram co-transfectados em células CHO e os anticorpos produzidos triados para a actividade em ligação a IL-6 e ensaios in vivo. As trans-fecções de células CHO foram realizadas usando o procedimento Lipofectamina™ 2000 de acordo com as instruções do fabricante (InVitrogen, No de catálogo 11668).

Dos 13 enxertos de cadeia pesada produzidos, dois continham somente um resíduo dador da estrutura (Ala) na posição 49 e estes foram produzidos usando ambas as duas estruturas de cadeia pesada diferentes. O enxerto VH3 1-3 3-21 expressou-se fracamente em células CHO e mostrou actividade reduzida para IL-6. Em contraste, o enxerto usando a estrutura VH3 1-4 3-72 expressou-se bem e reteve a afinidade do anticorpo dador. Este enxerto de cadeia pesada, compreendendo somente um resíduo dador, foi seleccionado em combinação com o enxerto de cadeia leve gLlO no qual somente os CDRs foram transferidos. A Figura 1 mostra o alinhamento entre a sequência de rato dadora 132E09 e as estruturas humanas aceitadoras. A estrutura de cadeia pesada aceitadora é a sequência de linha germinal humana VH3 1-3 3-72, com a estrutura 4 vinda desta porção da região JH humana de linha germinal JH4. A estrutura aceitadora de cadeia leve é a sequência de linha germinal humana VKl 2-1-(1)012, com a estrutura 4 vinda desta porção da região JK de linha germinal humana JK2. As sequências enxerto para gH!3 e gLlO mostram-se na Figura 1 (SEQ ID NOS :11, 12, 13 e 14) . Este anticorpo enxertado foi nomeado CA0130_00240.gl. Isto foi produzido como um IgG4 completo, compreendendo a substituição serina para prolina na posição 241 como descrito acima. As sequências de cadeia pesada e leve completamente traduzidas mostram-se nas Figuras 2a e 2b respectivamente. A sequência de aminoácidos completa da cadeia pesada é providenciada em SEQ ID NO 16 e da cadeia leve em SEQ ID NO 18. A sequência de DNA que codifica a cadeia pesada e leve são providenciados nas SEQ ID Nos 15 e 17 respectivamente. Os nucleótidos 1-57 e SEQ ID NO 15 e na Figura 2 a codificam as sequências peptidicas sinalizadoras do anticorpo de ratinho B72.3 VH e os nucleótidos 1-60 na SEQ ID NO 17 e na Figura 2b codificam as sequências peptidicas sinalizadoras do anticorpo de ratinho B72.3 VL. O anticorpo de ratinho B72.3 está descrito em Whittle et al. , 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505.

Exemplo 3: Afinidade de ligação

Medidas de afinidade de ligação de CA030 00240.gl A tecnologia BIAcore monitoriza a ligação entre biomoléculas em tempo real e sem necessidade de marcação. Uma das moléculas que interactuam, chamada ligando, está ou directamente imobilizada ou capturada na superfície imobilizada enquanto a outra, chamada analito, flui em solução sobre a superfície capturada. O sensor detecta a variação de massa à superfície do sensor quando o analito se liga ao ligando para formar um complexo à superfície. Isto corres ponde ao processo de associação. 0 processo de dissociação é monitorizado quando o analito é substituído por tampão. No ensaio de afinidade BIAcore, o ligando é CA030_00240.gl IgG4 total e o analito é IL-6 humana.

Instrumento

Biacore ©3000, Biacore AB, Uppsala, Suécia Chip Sensor CM5 (grau para investigação) Número de Catálogo: BR-1001- 14, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Os chips foram armazenados a 4 °C.

Solução BIAnormalising 70% (w/w) glicerol. Parte do kit BIA maintenance Número de catálogo: BR-1002-51, Biacore AB, Uppsala, Suécia. O kit BIA maintenance foi armazenado a 4°C.

Kit the Acoplamento de Aminas Número de Catálogo: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala,

Sweden .

Hidrocloreto de etilo-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC). Acertado a 75 mg/ml com água destilada e armazenado em alíquotas de 200 μΐ a -70°C. N-hidroxisuccinamida (NHS). Acertado a 11,5 mg/ml com água destilada e armazenado em alíquotas de 200μ1 a -70°C.

Cloridrato de etanolamina-NaOH 1M pH 8.5. Armazenado em alíquotas de 200μ1 a -70°C.

Tampões

Tampão de corrida: HBS-EP (HEPES 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15, EDTA 3 mM, agente tensioactivo P20 0,005%). Número de

Catálogo: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Suécia. O tampão foi armazenado a 4°C.

Tampão de imobilização: Acetato 5,0 (acetato de sódio 10 mM, pH 5,0) . Número de catálogo: BR-1003-51, Biacore AB,

Uppsala, Suécia. O tampão foi armazenado a 4°C.

Captura de Ligando

Affinipure fragmento F(ab')2 IgG anti-humana de cabra, específico para fragmento Fc. Jackson ImmunoResearch Inc (Pensilvania, USA) Número de Catálogo: 109-006-098.

Reagente armazenado a 4°C.

Analito IL-6 recombinante humana (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. Número de catálogo 206-IL-050, Número de lote A131402A, armazenada a -70°C e descongelado uma vez para cada ensaio. IL-6 de macaco cinomólogo recombinante e IL-6 de macaco Rhesus recombinante foram produzidos por transfecção transiente de células CHO. 0 material foi usado como sobrenadante de cultura de células não-purifiçado e não quantificado.

Solução de Regeneração

HC1, 40 mM preparada por diluição com água destilada de uma solução stock 11.6 M (BDH, Poole, Inglaterra, Número de ctálogo: 101254H

NaOH 5 mM preparada por diluição com água destilada a partir de uma solução stock 50 mM. Número de catálogo: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Suécia. Método de Ensaio BIA (Biamolecular Interaction Analysis- Análise de Interacção Biamolecular) foi realizada utilizando um BIAcore 3000 (BIAcore AB). Affinipure fragmento F(ab')2 IgG anti-humana de cabra, específico para fragmento Fc (Jackson ImmunoResearch) foi imobilizado num Chip Sensor CM5 através de química de acoplamento de aminas a um nível de captura de aprox.5000 unidades de resposta (RUs). Tampão HBS-EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, agente tensioactivo P20 0,005%, BIAcore AB) foi usado como tampão de corrida com uma velocidade de fluxo de 10 μΐ/min. Uma injecção de 10 μΐ de CA030_240.gl a 4pg/ml foi usada para captura pela IgG-Fc anti-humana. IL-6 humana foi titulada spela CA030_240.gl a várias concentrações a uma velocidade de fluxo de 30 μΐ/min. A superfície foi regenerada por uma injecção de 10 μΐ de HC1, 40 mM, seguido de uma injecção de 5μ1 de NaOH 5 mM a uma velocidade de fluxo de ΙΟμΙ/min. Curvas de ligação de subtracção de background foram analisadas usando o software de avaliação BIA (versão 3.2) seguindo procedimentos standard. Parâmetros cinéticos foram determinados a partir do algoritmo fitting.

Um lote de CA030_240.gl foi usado neste estudo. A afinidade foi medida a concentrações de IL-6 de 20 nM ou abaixo. O valor de afinidade determinado para CA030_240.gl encontrava-se no intervalo 9, 02-10,50 pM com uma média is.e.m. de 9,76 ± 0,74 pM (Tabela 1.1). Não foi possível medir a afinidade com a IL-6 humana imobilizada no chip BIAcore já que a imobilização resultava numa perda da conformação nativa.

Como não foi possível quantificar a IL-6 de macaco Cinomólogo ou macaco Rhesus, também não foi possível determinar os verdadeiros parâmetros cinéticos para a sua interacção com CA030_240.gl. No entanto, a inspecção visual de sensogramas de ligação indicam que CA030_240.gl se liga a estes IL-6 de primata não humano com uma afinidade semelhante à da para IL-6 humana.

Tabela 1.1: Afinidade CA030_240.gl para IL-6.

Exemplo 5: Ensaios de neutralização in vitro A potência do anticorpo CA030_240.gl, de aqui para a frente abreviado 240.gl, foi determinada usando dois ensaios diferentes. O primeiro ensaio empregou uma linha celular de ratinho, dependente de IL-6, chamada T1165, que prolifera em resposta a IL-6 de ratinho, Rhesus, cinomólogo e humana. Esta sinalização de directa de IL-6 para o receptor de IL-6 à superfície celular, em conjunção com uma sub-unidade receptora de sinalização chamada gpl30, é denominada sinalização cis. O segundo ensaio usou células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) estimuladas com IL-6 mais receptor IL-6 solúvel (IL-6R) sendo a leitura a produção de proteína quimiotáctica de monócitos-1 (MCP-1) . Nesse ensaio IL-6 foi adicionada exogenamente ou poderia ser produzida estimulando HUVECs com a citocina iter-leucina-17 (IL-17). Estas duas variantes de ensaio foram chamadas trans-sinalização já que HUVECs não expressam IL-6R e só podem responder i.e. produzir MCP-1, quando IL-6 e IL-6R são ambos adicionados exogenamente.

Usando estes vários ensaios foi possível gerar valores de ND50 (dose de neutralização 50%)para 240.gl contra IL-6 humana (recombinante e natural), rhesus, cinomolgo e ratinho.

Materiais

Meio de cultura

Meio de cultura T1165-RPMI 1640, suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (50yg/ml), glutamina (2mM) e IL-6 recombinante humana, 10 ng/ml, sistemas R&D, UK.

Meio de cultura HUVEC- meio basal de células de endotélio (LVECBM) TCS Cellworks, UK, suplemento de crescimento celular endotelilal, TCS Cellworks, UK e suplemento de antibiótico TCS Cellworks, UK. CA 030 00240.gl produzido no próprio laboratório a uma concentração de 6,83 mg/ml em PBS. IL-6 humana R&D systems, UK, IL-6 derivada mamífero humana (derivada no próprio laboratório através de transfecção de CHO com IL-6 de rhesus 10017108/67), IL-6 de cinomolgo (derivada no próprio laboratório através de transfecção de CHO com IL-6 de cinomolgo 10017108/67), IL-6 de ratinho R&D systems, UK. Anticorpo de captura MCP-1 anti-humano (555055) e anticorpo de detecção MCP-1 anti- humano (554664) e MCP-1 recombinante humana (890225), BD Biosciences, CA. Estreptavidina-HRP (AMDEX) Amersham bioscience, UK. Trombina Merck Biosciences, Darmstadt, Alemanha SIL-6R R&D systems, UK. IL-17 humana, R&D systems, UK.

Ensaio T1165- CellTiter 96®AQueous Promega, CA. TM Blue (erologicals, GA)

Medida da actividade de 240.gl usando a proliferação de células T1165 dependente de IL-6 Células T1165 foram descongeladas 4 dias antes do uso e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FCS, antibióticos, glutamina e IL-6 humana 10 ng/ml. A viabilidade celular foi monitorizada usando exclusão com azul de tripano, só foram usadas células consideradas pelo menos 90% viáveis. Antes do uso as células foram lavadas duas vezes em RPMI 1640 na ausência de IL-6 humana. As células foram então contadas e colocadas em placas de 96 poços de fundo plano a uma densidade de 5x104/?células por poço. Em placas separadas foi incubada uma diluição em série de 240.gl em presença de IL-6 recombinante humana, derivada de mamífero humana (também referida como IL-6 CHO humana), rhesus, cinomolgo ou ratinho a uma concentração fixa de 1 ng/ml (0,038 nM) . O complexo pré-misturado de

240.gl e IL-6 foi então transferido para poços contendo células T1165 que foram incubados durante 48 horas a 37°C numa atmosfera de 5% CO2 humidificada. Durante as últimas seis horas de incubação foram adicionados 20 ml de CellTiter 96®AQueous para determinar o número de células proliferantes. A inibição da proliferação dependente de IL-6 de células ΊΊ165 por 240.gl foi expressa como uma percentagem de inibição de poços tratados só com IL-6 menos poços controlo que continham células mas não IL-6. A actividade de 240.gl contra a proliferação da linha celular T1165 induzida por IL-6 recombinante humana, derivada de mamífero humana, rhesus, cinomolgo e ratinho pode ser vista na figura 3 a. 240.gl inibiu potencialmente a actividade de IL-6 recombinante humana, derivada de mamífero humana, rhesus, cinomolgo mas não de ratinho. A ND50 para IL-6 recombinante humana era 1,1 ± 0,5 ng/ml (7,26 ± 3,3 pM) .A ND50 para IL-6 derivada de mamífero humana era 3,6± 2,4 ng/ml (23,76 ± 15,84 pM). A ND50 para IL-6 de rhesus era 2,2 ± 1,1 ng/ml (14,52 ± 7,26 pM) . A ND50 para IL-6 de cinomolgo era 5,4 ± 1,1 ng/ml (35,64 ± 7,26 pM) .

Medida da actividade de 2401.gl usando IL-6 e receptor IL-6 solúvel induziu a produção de MCP-1 em HUVECs. HUVECs (TCS Cellworks, UK) foram crescidas em meio LVECBM e feitas passar em cultura não mais do que cinco vezes. As células foram deixadas crescer até 75% de confluência antes do uso. As células foram colhidas usando tripsina/EDTA, ressuspendidas e lavadas uma vez em LVECBM fresco. As células foram então contadas e distribuídas em placas de 96 poços de fundo plano a uma densidade de 2x104/células por poço. As células foram cultivadas de um dia para o outro a 37°C numa atmosfera de 5% CO2 humidificada. No dia seguinte as células foram lavadas em meio fresco suplementado com trombina biotinilada (3U/ml) e postas à parte. Em placas separadas uma diluição em série de 240.gl foi incubada na presença de IL-6 recombinante humana (50 ng/ml; 3,84 nM) e sIL-6R a uma concentração fixa de 500 ng/ml (10,15 nM). Além disso 240.gl também foi incubado com IL-17 recombinante humana (25 ng/ml; 1,18 nM), que estimula HUVECs para produzir IL-6 e sIL-6R a uma concentração fixa de 500 ng/ml (10,15 nM). O complexo pré-misturado de 240g.l e IL-6/sIL-6R ou IL-17/sIL-6R foi então transferido para poços contendo HUVECs que foram incubados durante 24 horas a 37°C, numa atmosfera de 5% CO2 humidificada. Após o período de incubação o sobrenadante livre de células, foi recolhido e os níveis de MCP-1 humana determinados por ELISA de sandwich (protocolo dado abaixo). A inibição de IL-6/sIL-6R ou a produção de MCP-1 IL-17/sIL-6R induzida por 240.gl foi expressa como uma percentagem de inibição de poços tratados com IL-6/sIL-6R ou IL-17/sIL-6R menos poços controlo que continham células mas sem estímulo. Além disso foram adicionados controlos para indicar a resposta de células à adição de IL-6 humana na ausência de sIL-6R. ELISA DE MCP-1

Placas Nunc Maxisorp foram revestidas com anticorpo de captura anti-MCP-1 a uma concentração de 2yg/ml. As placas foram incubadas a +4°C de um dia para o outro e depois lavadas duas vezes em PBS mais 0,1% tween20 (tampão de lavagem): As placas foram bloqueadas durante 1 hora em PBS mais 5% de albumina bovina sérica. As placas foram então lavadas quatro vezes com tampão de lavagem e standards e amostras adicionadas. As placas foram incubadas durante duas horas À temperatura ambiente. As placas foram então lavadas e foi adicionado anticorpo anti-MCP-1 bioti-nilado a uma concentração de 1 mg/ml. As placas foram incubadas durante duas horas adicionais e depois lavadas quatro vezes. Uma diluição 1:5000 de estreptavidina -HPR foi então adicionada e as placas incubadas durante 30 minutos. As placas foram lavadas de novo quatro vezes e foi adicionado substracto TMB. Leituras colorimétricas foram tomadas a 630 nm e leituras background a 492 nm. As concentrações MCP-1 foram derivadas a partir da curva padrão usando um ajustamento de curva logístico de quatro parâmetros, em software Genesis II. A actividade de 240.gl contra trans-sinalização induzida por IL-6 recombinante humana e SIL-6R em HUVECs pode ser vista na Figura 3b. 240.gl inibiu potencialmente a produção de MCP-1 induzida por IL-6 recombinante humana e SIL-6R em HUVECs. O ND50 era 64 ± 62 ng/ml (422 ± 409 pM). A actividade de 240.gl contra trans-sinalização induzida por IL-17 induzida por IL-6 endógena e sIL-6R em HUVECs pode ver-se na figura 3c. 240.gl inibiu potencial mente a produção de MCP-1 induzida por IL-17 induzida por IL-6 e sIL-6R por HUVECs. O ND50 era 93 ± 70 ng/ml (614 ± 4 62 pM) .

Conclusão 240.gl é capaz de neutralizar a bioactividade de IL-6 recombinante humana, derivada de mamífero humana, rhesus e cinomolgo mas não de IL-6 de ratinho num ensaio de trans-sinalização IL-6. Além disso 240.gl consegue neutralizar trans-sinalização de IL-6 induzida por IL-6 recombinante ou endógena.

Exemplo 6: Actividade in vivo

Sabe-se que IL-6 induz proteínas de fase aguda. Em ratinhos a proteína de fase aguda mais proeminente é a amilóide A de soro (SAA). IL-6 humana é capaz de actuar no receptor de ratinho de modo que é possível injectar IL-6 humana em ratinhos e medir a produção de SAA no soro.

Ratinhos Balb/c foram injectados subcutaneamente com o anticorpo anti-hIL6 específico de site 3, CA030_240.gl IgG4 total. 24 horas mais tarde, os ratinhos foram injectados intraperitonealmente com hIL-6 a 30yg/kg (Preprotech número de catálogo 200-06, número de lote 0203B16) . Após 20 horas o sangue foi retirado por punção cardíaca e o soro colhido para avaliação da proteína amilóide A do soro (SAA) por ELISA (Tridelta número de lote 22KT022) . Como notado na Figura 4, a indução de SAA por hIL-6 foi inibida por CA030_240.gl sendo notada redução estatisticamente significativa em SAA a doses de 0,3, 0,1 e 0,03 mg/kg. n=7-8/grupo, excepto PBS n=6. Análise estatística por ANOVA com pós-teste de Bonferroni, **P<0,01, comparada com IL-6 sozinha. 2 experiências adicionais confirmaram inibição significativa de SAA induzida por IL-6 (30ug/kg), por CA030_240.gl a doses de 0,3 e 0,1 mg/kg.

Exemplo 7:Mapa de epitopo de CA030 00240.gl O epitopo em IL-6 humano que CA030 00240.gl reconhece foi mapeado usando tecnologia de NMR usando 240.gl como fragmento Fab' . Isto necessitou que IL-6 humana fosse expressa em E.coli e uniformemente marcado com os isótopos estáveis 15N/13C/2H. Atribuições de ressonância específica de sequência foram obtidas para IL-6 livre e modificações na posição destes sinais induzida pela ligação do fragmento Fab' de CA030 00240.gl foram detectados usando um espectro 3D TROSY HNCO.

Expressão e purificação de IL-6 humana recombinante: IL-6 humana foi preparada a partir de um vector de expressão de E.coli (pET3d) que contem a sequência de codificação da da forma madura da proteína. A proteína foi expressa em células Tuner(DE3)pLysS, resultando em elevado rendimento de um produto insolúvel. Amostras de IL-6 marcadas com 15N, 15N/13C e 15N/13C/2H foram preparadas a partir de células cultivadas em meio rico adequadamente marcado (Celtone). A IL-6 foi purificada a partir de células de E.coli transformadas usando procedimentos bem estabelecidos. Inicialmente, as células foram recolhidas de 11 de meio de cultura foram ressuspendidas em 40 ml de tampão A [KC1 100 mM, DTT 2 mM, Tris-Hcl 10 mM pH 8,5, sucrose 25% (p/v), inibidor de protéase dissolvido (Boehringer)]. Foram adicionados 10 ml de tampãp B [Tris-HCl 300 mM pH 8,5, EDTA 100 mM, lisosima 4 mg/ml] e a suspensão incubada em gelo durante 10-30 minutos com agitação ocasional. Foram então adicionados 50 ml de tampão C[LiCl 1M, EDTA 20 mM, NP-40 0,5%(v/v)] e a suspensão foi passada pela prensa francesa duas vezes a 20000 psi. O homogenato foi então centrifugado a 16000g rpm durante 15 minutos a 4°C e o pellet retido. O pellet foi ressuspendido em 40 ml de tampão D [Tris-HCl 10 mM pH8,5, EDTA 0,1 mM, LiCl 0,5 M, NP-40 0,5% (v/v) , DTT lmM, pastilha de protéase dissolvida] e passada pela prensa francesa e centrifugada antes. Este estágio é repetido. O pellet é ressuspendido em 40 ml de tampão e Tris-HCl 10 mM pH8,5, EDTA 0,1 mM, NP-40 0,5% (v/v), DTT lmM, pastilha de protéase dissolvida] e passada pela prensa francesa e centrifugada, como antes. Repetir este passo. O pelete final é dissolvido em 6 ml GuHCl 6M, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 e clarificada por centrifugação a 48000g durante 30 minutos a 4°C. O sobrenadante é retido e a IL-6 solubilizada quantificada espectrofotometricamente. A IL-6 solubilizada é diluída a 2,5 mg/ml em GuHCl 5M, NaCl 50 mM, Tris-HCl 50 mM, GSH 2 mM, GSSG 0,2 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0 e incubada a 25°C durante 1 hora. As amostras foram então adicionalmente diluídas, gota a gota a 250 yg/ml em NaCl 50 mM, Tris-HCl 50 mM, GSH 2 mM, GSSG 0,2 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0 e incubadas a 25°C durante 3 horas. Qualquer precipitado formado nesta fase é removido por centrifugação a 30000 g durante 30 minutos a 4°C. O material clarificado é dialisado contra Tris-HCl 50 mM, glicerol 10% (v/v), pH9,0 durante um mínimo de 16 horas a 4°C com duas mudanças de tampão. Após a diálise a solução é clarificada por centrifugação a 30000 g durante 30 minutos a 4 °C. O sobrenadante é retido e carregado numa coluna de troca iónica monoQ (Amersham Biosciences)8 ml e eluida com um gradiente linear de cloreto de sódio (0-1,0 M) . As fracções contendo IL-6 redobrada foram identificadas por SDS-PAGE e depois misturadas e di-filtradas para fosfato de sódio 25 mM, NaCl 100 mM, NaN3 0,01% (p/v), pH 6,5. O fragmento Fab' de CA030_00240.gl foi gerado, purificado e formulado em fosfato de sódio 25 mM, NaCl 100 mM, NaN3 0,01%(w/v), pH 6,5. Os complexos 1:1 entre IL-6 e o fragmento Fab' de CA030_00240.gl foram preparados para análise NMR misturando quantidades equimolares de proteínas a uma concentração de cerca de 0,2-0,6 mM.

Espectroscopia de RMN:

As experiências de NMR foram realizadas em amostras de proteínas e complexos em fosfato de sódio 25 mM, cloreto de sódio 100 mM e tampão de azida de sódio 0,01% (w/v) a pH 6,5 (95% H20 e 5% D20) . O complexo 1:1 entre IL-6 marcado com 15N/13C/2H e o fragmento Fab' marcado de CA030_00240.gl foi preparado para análise por NMR misturando quantidades equimolares das proteínas para atingir uma concentração final de 0,1 mM. Os dados NMR foram adquiridos a 25°C para IL-6 livre e para o complexo IL-6: fragmento Fab' de CA030 00240.gl num espectrómetro Bruker Avance 800 MHz equipado com uma crio-amostra de ressonância tripla (15N/13C/1H) . Foram usados padrões HNCACB, CBCA(CO)NH e HNCO (Wittekind, M. e Mueller, L. (1993)J Magn Reson, Series B 101(2), 201; Grzesiek, S., and Bax, A. (1993) J

Biomol NMR 3(2), 185-204; Muhandiram, D.R., and Kay, L.E.(1994) J Magn Reson, Series B 103(3), 203; Grzesiek, S., and Bax, A. (1992) J Magn Reson 96(2), 432 foram usadas para indicações de ressonância de estrutura específicos de sequência (15N,13C e 3Η) para IL-6 livre usando uma amostra uniformamente marcada com 15N/13C 0,9 mM.

Modificações nas posições dos sinais da estrutura IL-6 induzidos pelo fragmento Fab' de ligação de

CA030_00240.gl foram detectados usando um espectro 3D TROSY-HNCO (Salzmann, M. et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(23), 13585-13590). Parâmetros de aquisição típicos para todas as experiências NMR 3D estão apresentados na tabela 1.

Todos os espectros foram processados usando NMRPipe (Delaglio, F. et al., (1995) J Biomol NMR 6(3), 277-293), com predição linear usada para estender o tempo de aquisição efectiva na dimensão 15N dos dados 3D a cerca de 30 ms. Aumento de resolução moderado foi aplicado a todas as dimensões usando uma função quadrática de seno deslocada. Análise dos espectros foi realizada usando Sparky (Goddard, T.D., e Kneller, D.G.SPARKY 3.In., Universidade da Califórnia, São Francisco).

Análise de dados de ligação de Fab: A abordagem de deslocamento mínimo (Farmer, B.T. et al., (1996) Nat Struct Mol Biol 3(12), 995; Muskett, F.W. et al. , (1998) J Biol Chem 273(34), 21736-21743) foi usado para determinar as alterações nas posições dos sinais de NMR de IL-6 resultantes de ligação do fragmento Fab' de CA030_00240.gl. Inicialmente todos os picos no espectro 3D de HNCO de IL-6 livre e espectro 3D TROSY-HNCO de IL-6 ligado a gl32E09 Fab foram colhidos nos seus centros. Os valores de deslocamento (deslocamento)químico de ressonâncias de cadeia principal de 15N e 1H foram corrigidos para a diferença em temperatura entre os espectros do complexo e da proteína (-0,8 ppm para 15N e -0,05 para 1H) (Baxter, N. J. and Williamson, M.P. (1997) J Biomol NMR 9(4), 359-369). A modificação minima na posição para picos entre IL-6 livre e ligado a IL-6 foi obtida usando Microsoft Excel para calcular a diferença de deslocamento química combinada em 15N, 13C e 1H para cada pico atribuído no espectro HNCO da proteína livre comparada com todos os picos observados no espectro TROSY-HNCO do complexo Fab. As diferenças de "deslocamento" (Δδ) químicas de protão amida, azoto e carbono foram definidas de acordo com a seguinte equação (Equação 1), em que ΔδΗΝ/ ΔδΝ e Δδ0 correspondem às diferenças nos deslocamentos de 1H, 15N e 13C entre pares de picos HNCO comparados e aN e aC são factores de escala de O, 2 e 0,33 requeridos para ter em conta diferenças no intervalo de "deslocamentos" químicos de protão amida, azoto amida e carbono. Para cada pico individual HNCO, o deslocamento mínimo induzido por ligação Fab foi tomado como o valor deslocamento combinado mais baixo possível.

Para identificar os sítios de ligação em Fab (epitopos) na IL-6, foi usado um histograma de deslocamento mínimo combinado versus sequência de proteína para revelar regiões de IL-6 contendo sinais perturbados significativamente. Se o tamanho da modificação do deslocamento químico combinado para aminoácidos individuais exceder um valor limiar da média da modificação do deslocamento químico combinado para todos os aminoácidos mais um desvio padrão dessa média, estes resíduos foram seleccionados para avaliação adicional como possíveis resíduos de contacto no sítio de ligação de Fab. As localizações dos candidatos a resíduos do sítio de ligação foram finalmente examinados na estrutura de alta resolução de IL-6 (Xu, G.Y. et al. , (1997) J Mol Biol 268(2), 468-481) e só os resíduos posicionados à superfície da proteína foram considerados disponíveis para a ligação Fab.

Foram aplicados dois limiares diferentes para identificar os resíduos ligados pelo Fab, o deslocamento mínimo médio + 1SD (0,143) e o deslocamento mínimo médio + 2SD (0,213) . Observou-se que o sítio de ligação do anticorpo abrangia o resíduo crítico de assinatura do site 3 de Trpl57 (Boulanger et al. , 2003, Science, 300, 2101-2104). Usando a numeração de aminoácidos uasad em Boulanger et al., supra, observou-se que o anticorpo 240g.l se liga pelo menos aos seguintes resíduos (média + 2SD(0,213)) S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 e S169. O anticorpo pode ligar-se a todos os seguintes resíduos (média + 1SD (0, 143) ) C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, Rl0 4, Fl05, El0 6, T149, K150, Q154, N155, Q156, W157, Q159, Tl63, Ll65, SI 69 e E172.

Será reconhecido que os mesmos resíduos também podem ser numerados baseado na numeração de aminoácidos do percursor não-processado de IL-6 (Swiss Prot Acession number P05231). Usando esta numeração o anticorpo 240g.l liga-se pelo menos aos seguintes resíduos S75, C78, E121,

Rl 32, F133, E134, T177, K178, A181, Q182, Q187 e S197. 0 anticorpo pode ligar-se a todos os resíduos seguintes C72, S7 5, C78, S81, A86, E121, V124, R123, F133, E134, T177, K178, Q180, Al81, Q182, N183, Q184, W185, Q187, T191, L193, SI97 e E200.

Tabela 1: Parâmetros básicos de experiências de RMN

A dimensão directa 1H (F3 ou F2) foi adquirida com um intervalo de varrimento de 14 ppm e tempo de aquisição de 85 ms.

Será certamente compreendido que a presente invenção foi descrita como exemplo não pretendendo de modo nenhum ser limitante e que modificações de pormenor podem ser feitas no âmbito das reivindicações que se seguem. Características preferidas de cada implementação da invenção são como no caso de cada implementação mutatis mutandis (mudando somente o necessário).

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> UCB, S.A. gelinas, richard popplewell, andrew adams, ralph singhal, mitra zhang,yi <120> Moléculas de anticorpo com especificidade para 11-6 humana <130> A0018 <160> 22

<170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Rattus rattus <4 0 0> 1 g&ggi&geaaa ttttggafac e«ÇKJv$gcfc(: ccfcg&gastg «è .· caaçfctca&fc SgeACfcsggfc <ycgtcag«5ct ISf g&ct&g&gfcg g«ttgete&,<s. *£$*<!*&&«;& sst<&tggc«e& λ 00 :£*&£««<3<sgg *§fcetstgse s gfstgp»K^efcgc «*«a»ee#§t£. £40 gsvxÃCvtge Mgfegagcog osxavgagefc gaggauaxgg cssatfc&afck» as.§fs:.a«aag& 300 gagicataet scQ-gctttac oicct&cfcgg ggc-caag^ag tcsttggteac agtcoog tS~ «21®» 2 12<: «212* Ρ8Τ <213* RsSlas fsi&s «40®» 2 elu vai el» Ile lati ôlu t&r «ly ©ly «ly 1.8¾ Vai. *ya Sr® sly «tly 1 5 10 15 g«r leu* Ang lasu Ser 1¾¾ Ala Tfer Ser ®ly Ρ&β Asa &he &*» Asp fyr ë SS 30

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Lisboa, 22 de Dezembro de 2014

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo neutralizante com especificidade para IL-6 humana, tendo uma cadeia pesada que compreende a sequência gHl3 dada em SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve que compreende a sequência gLlO dada em SEQ ID NO:13.
2. 2. Um anticorpo neutralizante tendo especificidade para IL-6 humana de acordo com a reivindicação 1, tendo uma cadeia pesada que compreende a sequência dada em SEQ ID NO: 16 e uma cadeia leve que compreende a sequência dada em SEQ ID NO:18.
3. 3. Uma sequência de DNA isolada que codifica a(s) cadeia (s) pesada e leve de um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2.
4. 4. Uma sequência de DNA isolada, de acordo com a reivindicação 3, na qual a sequência de DNA que codifica a cadeia pesada compreende a sequência dada na SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID N0:15 ou nucleótidos 58-2008 da SEQ ID NO:15.
5. 5. Uma cadeia de DNA isolada, de acordo com a reivindicação 4, na qual a sequência de DNA que codifica a cadeia leve compreende a sequência dada na SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:17 ou nucleótidos 61-705 da SEQ ID NO:17.
6. 6. Um vector de clonagem ou expressão que compreende uma ou mais sequências de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 3-5.
7. 7. Um vector de acordo com a reivindicação 6, em que o vector compreende a sequência dada em SEQ ID NO:15 e a sequência dada em SEQ ID NO :17.
8. 8. Uma célula hospedeiro para expressão de um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 que compreende: i) uma sequência de DNA que codifica a cadeia pesada do referido anticorpo e ii) uma sequência de DNA que codifica a cadeia leve do referido anticorpo. Em que as sequências de DNA são providenciadas num ou mais vectores de clonagem ou expressão.
9. 9. Célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 8 que compreende um ou mais vectores de clonagem ou expressão de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7 .
10. 10. Uma célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 8 em que a sequência de DNA que codifica a cadeia pesada compreende a sequência dada em SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO:15 ou os nucleótidos 58-2008 da SEQ ID NO:15.
11. 11. Uma célula hospedeiro de acordo com a reivindicação 10 em que a sequência de DNA que codifica a cadeia leve compreende a sequência dada em SEQ ID NO:14 ou SEQ ID NO:17 ou os nucleótidos 61-705 da SEQ ID NO:17.
12. 12. Um processo para a produção de um anticorpo tendo especificidade de ligação para IL-6 humana, que compreende cultivar a célula hospedeiro da reivindicação 8 a 11 e isolar o anticorpo.
13. 13. Uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em combinação com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos.
14. 14. Uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13, que compreende adicionalmente outros ingredientes activos.
15. 15. O anticorpo da reivindicação 1 ou reivindicação 2 ou a composição farmacêutica da reivindicação 13 ou reivindicação 14 para uso em terapia.
16. 16. Um anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2 ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 13 ou reivindicação 14, para uso no tratamento ou profilaxia de uma desordem patológica selec-cionada do grupo que consiste em infecções (virais, bacte- rianas, fúngicas e parasitárias), choque endotóxico associado com a infecção, artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil sistémica (JIA), lúpus eritematoso sistémico(SLE), asma, doença inflamatória pélvica, doença de Alzheimer, doença de Crohn, colite ulce-rativa, sindrome do intestino irritável, doença de Castle-man, espondilite anquilosante, dermatomiosite, uveite, doença de Peyronie, doença celiaca, doença de vesicula biliar, doença pilonidal, peritonite, psoríase, vasculite, adesões cirúrgicas, acidente vascular cerebral, diabetes tipo I, artrite de lyme, meningoencefalite, desordens inflamatórias do sistema nervoso central e periférico, mediadas imunitáriamente, tais como esclerose múltipla e síndroma de Guillain-Barr, outras desordens auto-imunes, pancreatite, trauma (cirurgia), doença do enxerto contra o hospedeiro, rejeição de transplantes, cancro (tanto tumores sólidos tais como melanomas, hepatoblastomas, sarcomas, carcinomas de células escamosas, carcinoma de células tran-sicionais, cancros do ovário e malignidades hematológicas e em particular leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crónica, cancro do estômago e cancro do cólon), doenças de coração incluindo doenças isquémicas tais como enfarte do miocárdio assim como aterosclerose, coagulação intravascular, reabsorção do osso, doentes com queimaduras, osteo-porose, periodontite e hipocloridia.
17. 17. 0 anticorpo ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16 para o referido uso, em que a desordem patológica é seleccionada do grupo que consiste em artrite, artrite reumatóide, artrite psoriática, artrite idiopática juvenil sistémica (JIA), lúpus eritematoso sistémico (SLE), asma, doença de Crohn, colite ulcerativa, doença de Castleman, espondilite anquilosante e cancro.
18. 18. 0 anticorpo ou composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 16 para o referido uso, em que a desordem patológica é artrite reumatóide. Lisboa, 22 de Dezembro de 2014