KR20080077271A - 사람 ｉｌ­6에 특이성을 지니는 항체 분자 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-6의 항원성 결정인자에 특이성을 지니는 항체 분자, 항체 분자의 치료적 용도 및 항체 분자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

사람 ＩＬ­6에 특이성을 지니는 항체 분자{ANTIBODY MOLECULES HAVING SPECIFICITY FOR HUMAN IL-6}

본 발명은 IL-6의 항원성 결정인자에 특이성을 지니는 항체 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체 분자의 치료적 용도 및 항체 분자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

IL-6은 다양한 세포 유형에 의해 생성되는 다면발현성(pleiotropic) 다중-기능 시토킨이다. 이것은 원래 항체 생성 세포로의 B-세포의 최종 성숙을 유도하는 B-세포 분화 인자(BSF-2)로서 동정되었다(Hirano et al., 1986 Nature 324, 73-76). IL-6은 면역 조절, 염증, 조혈 및 종양발생에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 면역계내에서, IL-6은 폴리클로날 면역글로불린의 양을 증가시키는 B-세포 항체 생성을 유도한다. 이것은 또한 T-세포 상에서 인터루킨-2(IL-2) 수용체 발현을 유도하고(Nomo et al., 1987, Immunol, letters, 15, 3, 249-253) 활성화된 T-세포에서 IL-2 생성을 촉진함으로써 세포독성 T-세포의 성장 및 분화 둘 모두를 유도한다(Okada et al., 1988 J Immunol, 141, 5, 1543-1549). IL-6은 단핵세포가 대식세포로 분화되는 것을 결정하는 것으로도 공지되어 있다(Chomarat P et al., 2000 Nature Immunol., 6, 510-514).

IL-6의 기능은, 이것이 조혈, 혈소판형성, 파골세포 형성, 간 급성기 반응의 유발에서 작용하여 C-반응성 단백질(CRP) 및 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 상승을 초래하므로 면역 반응에 제한되지 않는다. 이것은 표피 각질세포, 신장 혈관사이 세포, 골수종 및 형질세포종 세포에 대한 성장 인자로 공지되어 있다(Grossman et al., 1989 Prot Natl Acad Sci., 86, (16) 6367-6371; Horii et al., 1989, J Immunol, 143, 12, 3949-3955; Kawano et al., 1988, Nature 332, 6159, 83-85). IL-6은 단핵세포/대식세포, 섬유모세포, 표피 각질세포, 혈관 내피 세포, 신장 혈관사이 세포, 아교 세포, 연골세포, T 및 B-세포 및 일부 종양 세포를 포함하는 광범한 세포 유형에 의해 생성된다(Akira et al., 1990, FASEB J., 4, 11, 2860-2867). IL-6을 항시적으로(constitutively) 생성하는 종양 세포를 제외하고, 정상 세포들은 적절하게 자극되지 않는 한 IL-6을 발현시키지 않는다.

IL-6은 번역후 개질에 의존하여 21 내지 28 kD의 분자량을 지니는 184개 아미노산 분자의 당단백질이다. 대안적인 스플라이스(splice) 변이체가 일부 세포 유형에서 발견된다(Kishimoto et al., 1995, Blood, 86, 4, 1243-1254). IL-6 수용체(IL-6R) 복합체는 두 개의 기능적으로 상이한 막 단백질인 8OkD의 IL-6 특이적인 결합 사슬(gp80) 및 13OkD의 신호 변환 사슬(gpl30)로 이루어진다. IL-6이 gpl30에 직접 결합될 수 없으나, IL-6R에 결합하여 IL-6/IL-6R/gpl30의 고-친화력 3원 복합체를 생성한다. IL-6R은 낮은 친화력으로 IL-6에 결합되나, IL-6R은 세포내 신호 변환 도메인을 지니지 않으므로 이러한 라이게이션(ligation)만으로는 세포의 활성화를 초래할 수 없다. 유사하게, IL-6R의 세포 표면 발현이, 세포가 IL- 6 자극에 반응성임을 의미하는 것은 아니다. 단백질분해 절단은 순환하는 IL-6에 결합하여 IL-6의 반감기를 증가시킬 수 있는 가용성 IL-6R (sIL-6R; sgp80)의 방출을 초래한다. 세포의 활성화를 위하여, IL-6은 먼저 세포 결합된 IL-6R 또는 sIL-6R에 결합된 다음; 이종이량체 IL-6/IL-6R 복합체가 세포 표면 당단백질 gpl30과 결합된다. 생성된 3성분(tripartite) 이종복합체는 또 다른 IL-6/IL-6R/gpl30에 결합하여 신호 변환을 일으키므로(Bravo and Heath 2000, EMBO J., 19, (11), 2399-2411; Boulanger et al., 2003, Science, 300, 5628, 2101-2104), 세포-결합된 IL-6R 및 가용성 IL-6R 둘 모두는 세포의 활성화에 기여한다. 세포 결합된 IL-6R을 통한 IL-6 시그널링(signaling)은 시스(cis) 시그널링이라 명명되는 한편, 가용성 IL-6R을 통한 세포의 활성화는 트랜스(trans) 시그널링으로서 개시되었다. gpl30을 발현시키나 IL-6R을 발현시키지 않는 세포는 sIL-6R을 통해 IL-6에 의해 자극될 수 있다.

사람 IL-6에 대한 뮤린 항체를 중화시키는 것이 IL-6R(부위 1) 또는 gp130(부위 2 및 3)에 대한 사람 IL-6의 결합을 방해할 수 있는 것으로 공지되어 있다(Kalai et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249, 690-700; Brakenhoff et al., 1990, Journal of Immunology, 145, 561-568; Wendling et al., 1993, Journal of Rheumatology, 29, 259-262).

미국특허 5,856,135호는 IL-6R에 대한 IL-6의 결합을 차단하는 사람 IL-6에 대해 재형상화된 사람 항체를 기술한다. 상기 항체는 마우스 모노클로날 항체 SK2로부터 유래되었고 여기서 마우스 항체 SK2의 가변 영역으로부터의 상보성 결정 영 역(CDR)은 사람 항체의 가변 영역으로 이식된다.

IL-6의 사람 자가-항체를 중화시키는 것도 공지되어 있다(Hansen et al., Eur. J. Immunol, 1995, 25, 348-354).

부위 I 키메라 뮤린/사람 항-IL-6 항체가 치료용으로 WO2004039826호에 개시되었다.

사람화된 항-사람 IL-6 수용체 모노클로날 항체는 류마티스 관절염의 치료를 위해 III기 임상 시험 중에 있다(Kishimoto, 2005, Annu Rev Immunol. 23:1-21). 동일한 항체가 크론병의 II기 연구에서 유효한 것으로도 보고된 바 있다. 효능은 NZB/W F₁ 마우스의 루푸스-유사 질병에서 항-IL-6 및 항-IL-6R 항체 둘 모두로 입증되었다(Fink et al., 1994 J. Clin. Invest. 94, 585; Mihara et al., 1998, Clin. Exp. Immunol. 112, 397). 뮤린 IL-6 수용체에 대한 중화 항체는 양자 이동(adoptive transfer) 질병 모델에서 결장염을 억제하였다(Yamamoto et al., 2000 Journal of Immunology, 164, 4878; Atreya et al., 2000 Nature Med 6, 583). 후자의 연구는 결장염의 IL-10 녹-아웃(knock-out) 마우스 모델 및 장관 염증의 TNBS 모델에서 항-수용체 항체의 효능도 입증하였다.

본 발명자들은 생체내, 예를 들어 본원에 개시된 생체내 모델에서 특히 유효한 항-IL-6 항체를 고 친화력으로 중화시키는 것을 규명하였다.

항체 가변 도메인의 잔기는 카바트(Kabat) 등에 의해 고안된 시스템에 따라 관례적으로 넘버링한다. 상기 시스템은 문헌[Kabat et al., 1987, in Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (hereafter "Kabat et al. (supra)"]에 개시되어 있다. 상기 넘버링 시스템이 달리 지시되지 않는 한 본 명세서에 이용된다.

카바트 잔기 지명이 아미노산 잔기의 선형 넘버링에 직접적으로 항상 일치하는 것은 아니다. 실제의 선형 아미노산 서열은 엄격한 카바트 넘버링 보다 아미노산을 덜 함유하거나 더 함유할 수 있으며, 이것은 프레임워크이든지 상보성 결정 영역(CDR)이든지 기본적인 가변 도메인 구조의 단축 또는 구조적 성분으로의 삽입에 해당된다. 잔기의 정확한 카바트 넘버링은 항체의 서열에서 "표준" 카바트 넘버링된 서열과 상동인 잔기의 정렬에 의해 제공된 항체에 대해 결정될 수 있다.

중쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 31-35 (CDR-H1), 잔기 50-65 (CDR-H2) 및 잔기 95-102 (CDR-H3)에 위치한다. 그러나, 코티아(Chothia)(Chothia, C. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987))에 따르면, CDR-H1에 상당하는 루프(loop)가 잔기 26으로부터 잔기 32까지 연장된다. 따라서 본원에 사용된 'CDR-H1'은 카바트 넘버링 시스템 및 코티아의 위상적 루프 정의의 조합에 의해 개시된 대로 잔기 26 내지 35를 포함한다.

경쇄 가변 도메인의 CDR은 카바트 넘버링 시스템에 따라 잔기 24-34 (CDR-L1), 잔기 50-56 (CDR-L2) 및 잔기 89-97 (CDR-L3)에 위치한다.

본원에서 사용된 "중화 항체"라는 용어는, 예를 들어 gp130 수용체에 대한 IL-6의 부위 3 결합을 차단함에 의해 IL-6의 생물학적 시그널링 활성을 중화시킬 수 있는 항체를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 항체는 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 수득될 수 있다. IL-6 폴리펩티드 또는 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 이용하여 IL-6을 특이적으로 인식하는 항체를 생성할 수 있다. IL-6 폴리펩티드는 "성숙" 폴리펩티드 또는 이의 생물학적으로 활성인 단편 또는 유도체일 수 있다. 바람직하게는 IL-6 폴리펩티드가 성숙 폴리펩티드이다. IL-6 폴리펩티드는 발현 시스템을 포함하는 유전자 공학에 의해 생성된 숙주 세포로부터 당 분야에 공지된 프로세스에 의해 제조될 수 있거나 자연 발생적인 생물학적 공급원으로부터 회수될 수 있다. 본 출원에서, "폴리펩티드"라는 용어는 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질을 포함한다. 이들은 달리 명시되지 않는 한 상호교환적으로 이용된다. IL-6 폴리펩티드는 일부 경우에, 예를 들어 친화성 태그(tag)에 융합된 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부일 수 있다. IL-6 폴리펩티드에 대해 생성된 항체를 수득할 수 있으며, 이 때 폴리펩티드를 동물, 바람직하게는 사람이 아닌 동물에게 널리 공지된 통상적인 프로토콜을 이용하여 투여함에 의해 동물을 면역시키는 것이 필요하다[참조, 예를 들어 Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986]. 토끼, 마우스, 래트, 양, 젖소 또는 돼지와 같은 다수의 온혈 동물을 면역시킬 수 있다. 그러나, 마우스, 토끼, 돼지 및 래트가 일반적으로 바람직하다.

본 발명에 이용되는 항체는 전체 항체 및 이의 기능적으로 활성인 단편 또는 유도체를 포함하며, 모노클로날 항체, 사람화된 항체, 완전한 사람 항체 또는 키메라 항체일 수 있으나 이로 제한되지 않는다,

모노클로날 항체는 하이브리도마 기술(Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor et al,, 1983, Immunology Today, 4:72) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985)과 같은 당 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 이용되는 항체는, 예를 들어 문헌[Babcook, J. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(15):7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 and International Patent Application number WO2004/106377]에 개시된 방법에 의해 특정 항체를 생성하기 위해 선택된 단일 림프구로부터 생성된 면역글로불린 가변 영역 cDNA를 클로닝 및 발현시킴에 의해 단일 림프구 항체 방법을 이용하여 생성될 수도 있다.

사람화된 항체(CDR-이식된(grafted) 항체 포함)는 사람이 아닌 종으로부터의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자로부터의 프레임워크 영역을 지니는 사람이 아닌 종으로부터의 항체 분자이다(참조, 미국특허 5,585,089; WO91/09967). 전체 CDR이 아닌 CDR의 특이성 결정 잔기를 이동하는 것만이 필요할 수 있음을 이해할 것이다(참조, 예를 들어 Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). 사람화된 항체는 CDR이 유래된 사람이 아닌 종으로부터 유래된 하나 이상의 프레임워크 잔기를 추가로 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

키메라 항체는 유전자 공학에 의해 생성된 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩되어 경쇄 및 중쇄 유전자가 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 세그먼트로 이루어진 항체이다.

본 발명에 이용되는 항체는 당 분야에 공지된 다양한 파지 디스플레이 방법을 이용하여 생성될 수도 있으며 문헌[Brinkman et al. (in J. Immunol. Methods, 1995, 182:41-50), Ames et al. (J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186), Kettleborough et al. (Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958), Persic et al. (Gene, 1997 187 9-18), Burton et al. (Advances in Immunology, 1994, 57:191-280) and WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; and US 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 and 5,969,108]에 개시된 것들을 포함한다.

완전한 사람 항체는 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 가변 영역 및 불변 영역(존재하는 경우)이 모두 사람 기원이거나, 사람 기원의 서열과 실질적으로 동일한 항체이며, 이들이 동일한 항체로부터 온 것일 필요는 없다. 완전한 사람 항체의 예로는 예를 들어 상기 개시된 파지 디스플레이 방법에 의해 생성된 항체 및 뮤린 면역글로불린 가변 및 불변 부분 유전자가 문헌[EP0546073 B1, US 5,545,806, US 5,569,825, US 5,625,126, US 5,633,425, US 5,661,016, US5,770,429, EP 0438474 Bl and EP0463151 Bl]에 포괄적인 용어로 개시된 이들의 사람 대응부(counterpart)에 의해 교체된 마우스에 의해 생성된 항체를 들 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니며 중쇄를 포함하는 중화 항체로서, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1의 경우 서열번호 5로 제공된 서열을 지니는 CDR, CDR-H2의 경우 서열번호 6으로 제공된 서열을 지니는 CDR 및 CDR-H3의 경우 서열번호 7로 제공된 서열을 지니는 CDR 중 하나 이상을 포함하는 중화 항체를 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니며 중쇄를 포함하는 중화 항체로서, 중쇄의 가변 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 중 둘 이상이 CDR-H1의 경우 서열번호 5로 제공된 서열, CDR-H2의 경우 서열번호 6으로 제공된 서열 및 CDR-H3의 경우 서열번호 7로 제공된 서열로부터 선택되는 중화 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-H1은 서열번호 5로 제공된 서열을 지니고 CDR-H2는 서열번호 6으로 제공된 서열을 지닌다. 대안적으로, 항체는 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-H1은 서열번호 5로 제공된 서열을 지니고 CDR-H3은 서열번호 7로 제공된 서열을 지니거나, 항체는 중쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-H2는 서열번호 6으로 제공된 서열을 지니고 CDR-H3은 서열번호 7로 제공된 서열을 지닌다. 불확실성을 배제하기 위해, 모든 변경이 포함됨을 이해하여야 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니며 중쇄를 포함하는 중화 항체로서, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1의 경우 서열번호 5로 제공된 서열, CDR-H2의 경우 서열번호 6으로 제공된 서열 및 CDR-H3의 경우 서열번호 7로 제공된 서열을 포함하는 중화 항체를 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니며 경쇄를 포함하는 중화 항체로서, 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1의 경우 서열번호 8로 제공된 서열을 지니는 CDR, CDR-L2의 경우 서열번호 9로 제공된 서열을 지니는 CDR 및 CDR-L3의 경우 서열번호 10으로 제공된 서열을 지니는 CDR 중 하나 이상을 포함하는 중화 항체를 제공한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니며 경쇄를 포함하는 중화 항체로서, 경쇄의 가변 도메인의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 중 둘 이상이 CDR-L1의 경우 서열번호 8로 제공된 서열, CDR-L2의 경우 서열번호 9로 제공된 서열 및 CDR-L3의 경우 서열번호 10으로 제공된 서열로부터 선택되는 중화 항체를 제공한다. 예를 들어, 항체는 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-L1은 서열번호 8로 제공된 서열을 지니고 CDR-L2는 서열번호 9로 제공된 서열을 지닌다. 대안적으로, 항체는 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-L1은 서열번호 8로 제공된 서열을 지니고 CDR-L3은 서열번호 10으로 제공된 서열을 지니거나, 항체는 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 CDR-L2는 서열번호 9로 제공된 서열을 지니고 CDR-L3은 서열번호 10으로 제공된 서열을 지닌다. 불확실성을 배제하기 위해, 모든 변경이 포함됨을 이해하여야 한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니며 경쇄를 포함하는 중화 항체로서, 가변 도메인이 CDR-L1의 경우 서열번호 8로 제공된 서열, CDR-L2의 경우 서열번호 9로 제공된 서열 및 CDR-L3의 경우 서열번호 10으로 제공된 서열을 포함하는 중화 항체를 제공한다.

IL-6에 결합하여 IL-6 활성을 중화시키는 항체의 능력을 현저하게 변경시키지 않으면서 본 발명에 의해 제공된 CDR에 대해 하나 이상의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 임의의 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실의 효과는 당업자에 의해, 예를 들어 실시예에 개시된 방법을 이용하여 IL-6 결합 및 중화를 결정함에 의해 용이하게 시험될 수 있다. 따라서, 일 실시예에서, 본 발명은 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니며 CDRH-1 (서열번호 5), CDRH-2 (서열번호 6), CDRH-3 (서열번호 7), CDRL-1 (서열번호 8), CDRL-2 (서열번호 9) 및 CDRL-3 (서열번호 10)로부터 선택된 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체를 제공하며, CDR 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.

본 발명의 항체 분자는 상보성 경쇄 또는 상보성 중쇄를 각각 포함하는 것이 바람직하다.

따라서, 일 구체예에서, 본 발명에 따른 항체는 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1의 경우 서열번호 5로 제공되는 서열, CDR-H2의 경우 서열번호 6으로 제공되는 서열 및 CDR-H3의 경우 서열번호 7로 제공되는 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1의 경우 서열번호 8로 제공되는 서열, CDR-L2의 경우 서열번호 9로 제공되는 서열 및 CDR-L3의 경우 서열번호 10으로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명은 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니며, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1의 경우 서열번호 5로 제공되는 서열, CDR-H2의 경우 서열번호 6으로 제공되는 서열 및 CDR-H3의 경우 서열번호 7로 제공되는 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1의 경우 서열번호 8로 제공되는 서열, CDR-L2의 경우 서열번호 9로 제공되는 서열 및 CDR-L3의 경우 서열번호 10으로 제공되는 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공하고, 이 때 CDR 중 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산은 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열번호 2로 제공된 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄를 포함하는데, 중쇄의 가변 도메인은 서열번호 2로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 종쇄의 가변 도메인이 서열번호 2로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

본원에서 사용된 "동일성"은 정렬된 서열 중의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열간에 동일함을 나타낸다. 본원에서 사용된 "유사성"은 정렬된 서열 중의 임의의 특정 위치에서, 아미노산 잔기가 서열간에 유사한 유형임을 나타낸다. 예를 들어, 류신은 이소류신 또는 발린으로 치환될 수 있다. 종종 또 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 아미노산은 하기와 같으며 이로 제한되지 않는다:

- 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 (방향족 측쇄를 지니는 아미노산);

- 리신, 아르기닌 및 히스티딘 (염기성 측쇄를 지니는 아미노산);

- 아스파르테이트 및 글루타메이트 (산성 측쇄를 지니는 아미노산);

- 아스파라긴 및 글루타민 (아미드 측쇄를 지니는 아미노산); 및

- 시스테인 및 메티오닌 (황-함유 측쇄를 지니는 아미노산). 동일성 및 유사성 정도는 용이하게 산출될 수 있다(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991).

일 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 4로 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄를 포함하는데, 경쇄의 가변 도메인은 서열번호 4로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 4로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열번호 2로 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 4로 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 중쇄의 가변 도메인은 서열번호 2로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하고 경쇄의 가변 도메인은 서열번호 4로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함한다. 바람직하게는, 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열번호 2로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 4로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 항체는 래트 항체이고, 여기서 중쇄의 가변 도메인은 서열번호 2로 제공된 서열을 포함하고 경쇄의 가변 도메인은 서열번호 4로 제공된 서열을 포함한다. 래트 항체는 본원에서 '132E09' 또는 "공여체" 항체로서 언급된다. 래트 항체 132E09의 중쇄의 가변 도메인의 완전한 누클레오티드 및 아미노산 서열은 서열번호 1 및 2로서 각각 제공된다. 래트 항체 132E09의 경쇄의 가변 도메인의 완전한 누클레오티드 및 아미노산 서열은 서열번호 3 및 4로서 각각 제공된다. 서열번호 5, 6, 7, 8, 9 및 10으로 제공되는 CDR은 래트 항체 132E09로부터 유래된다.

일 구체예에서, 본 발명의 항체는 CDR-이식된 항체이다. 본원에서 사용된 용어 'CDR-이식된 항체'는 중쇄 및/또는 경쇄가 수용체(acceptor) 항체(예컨대, 사람 항체)의 중쇄 및/경쇄 가변 영역 프레임워크로 이식된 공여체 항체(예컨대, 래트 항체)로부터의 하나 이상의 CDR(요망되는 경우, 하나 이상의 개질된 CDR을 포함함)을 함유하는 항체를 언급한다. 검토를 위해 문헌[Vaughan et al., Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998]을 참조한다. 바람직하게는 CDR 중 하나 이상이 래트 항체 132E09로부터 수득되었다(서열번호 5, 6, 7, 8, 9 및 10). 일 실시예에서, 전체 CDR이 이동한다기 보다, 상기 본원에 개시된 CDR 중 임의의 하나로부터의 특이성 결정 잔기의 1종 이상만이 사람 항체 프레임워크로 이동한다(참조, 예를 들어 Kashmiri et al., 2005, Methods, 36, 25-34). 일 실시예에서, 상기 본원에 개시된 CDR 중 1종 이상으로부터의 특이성 결정 잔기만이 사람 항체 프레임워크로 이동한다. 또 다른 구체예에서, 상기 본원에 개시된 CDR 각각으로부터의 특이성 결정 잔기만이 사람 항체 프레임워크로 이동한다.

CDR 또는 특이성 결정 잔기가 이식될 때, 임의의 적합한 수용체 가변 영역 프레임워크 서열이 CDR이 유래되는 공여체 항체의 부류/유형을 고려하여 이용될 수 있고, 래트, 마우스, 영장류 및 사람 프레임워크 영역을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 CDR-이식된 항체가 사람 수용체 프레임워크 영역 뿐만 아니라 상기 언급된 공여체 항체로부터 유래된 CDR 중 1종 이상을 포함하는 하나 이상의 가변 도메인을 지닌다. 따라서, 가변 도메인이 사람 수용체 프레임워크 영역 및 사람이 아닌, 바람직하게는 래트인 공여체 CDR을 포함하는 중화 CDR-이식된 항체가 제공된다.

본 발명에 이용될 수 있는 사람 프레임워크의 예는 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY 및 POM이다(Kabat et al., 상술함). 예를 들어, KOL 및 NEWM은 중쇄에 이용될 수 있고, REI는 경쇄에 이용될 수 있으며, EU, LAY 및 POM은 중쇄 및 경쇄 둘 모두에 이용될 수 있다. 대안적으로, 사람 생식계통(germline) 서열을 이용할 수 있으며; 이러한 서열은 http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/에서 이용가능하다.

본 발명의 CDR-이식된 항체에서, 수용체 중쇄 및 경쇄가 반드시 동일한 항체로부터 유래될 필요는 없으며 요망되는 경우 상이한 사슬로부터 유래된 프레임워크 영역을 지니는 혼성(composite) 사슬을 포함할 수 있다.

본 발명의 CDR-이식된 항체의 중쇄에 대해 바람직한 프레임워크 영역은 JH4와 함께 사람 서브-그룹 VH3 서열 1-4 3-72로부터 유래된다(도 2에 도시됨; 서열번호 19 및 20). 따라서, 하나 이상의 사람이 아닌 공여체 CDR을 포함하는 중화 CDR-이식된 항체가 제공되며, 여기서 중쇄 프레임워크 영역은 JH4와 함께 사람 서브그룹 서열 1-4 3-72로부터 유래된다. 사람 JH4의 서열은 다음과 같다: (YFDY)WGQGTLVTVSS (서열번호 20). YFDY 모티프는 CDR-H3의 일부이며 프레임워크 4의 일부는 아니다(Ravetch, JV. et al., 1981, Cell, 27, 583-591). 공여체 서열은 도 2에 도시된 132E09 VH 서열(서열번호 2)이고 공여체 CDR(서열번호 5, 6 및 7)은 밑줄로 표시한다.

본 발명의 CDR-이식된 항체의 경쇄에 대해 바람직한 프레임워크 영역은 도 2에 도시된 JK2와 함께 사람 생식계통 서브-그룹 VK1 서열 2-1-(1) O12로부터 유래된다(서열번호 21 및 22). 따라서, 하나 이상의 사람이 아닌 공여체 CDR을 포함하는 중화 CDR-이식된 항체가 제공되며, 여기서 경쇄 프레임워크 영역은 JK2와 함께 사람 서브그룹 서열 VK1 2-1-(1) O12로부터 유래된다. JK2의 서열은 다음과 같다: (YT)FGQGTKLEIKR (서열번호 22). YT 모티프는 CDR-L3의 일부이며 프레임워크 4의 일부는 아니다(Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522). 공여체 서열은 도 2에 도시된 132E09 VL 서열(서열번호 4)이고 공여체 CDR(서열번호 8, 9 및 10)은 밑줄로 표시한다.

또한, 본 발명의 CDR-이식된 항체에서, 프레임워크 영역이 수용체 항체와 정확히 동일한 서열일 필요는 없다. 예를 들어, 다른 잔기는 그 수용체 사슬 부류 또는 유형에 대해 보다 빈번하게-발생하는 잔기로 교체될 수 있다. 대안적으로, 수용체 프레임워크 영역에서 선택된 잔기를 교체하여 이것이 공여체 항체의 동일한 위치에 있는 잔기와 같아지도록 할 수 있다(참조, Reichmann et al., 1998, Nature, 332, 323-324). 이러한 교체는 공여체 항체의 친화력을 회복하는데 필요한 최소 한도를 유지하여야 한다. 교체될 필요가 있는 수용체 프레임워크 영역의 잔기를 선택하는 프로토콜은 WO 91/09967호에 개시되어 있다.

바람직하게는, 본 발명의 CDR-이식된 항체 분자에서, 수용체 중쇄가 JH4와 함께 사람 VH3 서열 1-3 3-72를 지니는 경우, 중쇄의 수용체 프레임워크 영역은 하나 이상의 공여체 CDR 이외에 적어도 49번 위치(카바트 등에 준함(상술함))에 공여체 잔기를 포함한다. 따라서, 중쇄의 가변 도메인의 49번 위치에 있는 잔기가 적어도 공여체 잔기인 CDR-이식된 항체가 제공된다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 CDR-이식된 항체 분자에서, 수용체 경쇄가 JK2와 함께 사람 서브-그룹 VK1 서열 2-1-(1) O12를 지니는 경우, 공여체 잔기는 경쇄의 수용체 프레임워크 영역에 이용되지 않고 하나 이상의 공여체 CDR만이 이동한다.

공여체 잔기는 공여체 항체, 즉 CDR이 최초로 유래된 항체로부터 온 잔기이며, 본 발명의 경우, 이것은 래트 항체 132E09이다.

따라서, 본 발명은 중쇄 가변 영역이 gH13의 서열(도 2; 서열번호 11)을 포함하는 항체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열번호 11로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열번호 11로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

또한, 본 발명은 가변 영역의 경쇄가 gL10의 서열(도 2; 서열번호 13)을 포함하는 항체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 항체는 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 13으로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 13으로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 CDR-이식된 항체는 gH13의 서열(서열번호 11)을 포함하는 중쇄 및 gL10의 서열(서열번호 13)을 포함하는 경쇄를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 항체는 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서 중쇄의 가변 도메인은 서열번호 11로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하고 경쇄의 가변 도메인은 서열번호 13으로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함한다. 바람직하게, 항체는 중쇄의 가변 도메인이 서열번호 11로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인이 서열번호 13으로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

본 발명의 항체 분자는 전장 중쇄 및 경쇄를 지니는 완전한 항체 분자 또는 이의 단편을 포함할 수 있고 Fab, 개질된 Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 단일 도메인 항체, scFv, 2가, 3가 또는 4가 항체, Bis-scFv, 디아보디(diabodies), 트리아보디(triabodies), 테트라보디(tetrabodies) 및 상기 임의의 에피토프-결합 단편일 수 있으나 이로 제한되지 않는다(참조, 예를 들어 Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217). 항체 단편을 생성하고 제조하는 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다(참조, 예를 들어 Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). 본 발명에 이용되는 다른 항체 단편으로는 국제 특허 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 개시된 Fab 및 Fab' 단편이 있다. 다가 항체는 다중 특이성을 포함할 수 있거나 단일특이적일 수 있다(참조, 예를 들어 WO 92/22853 및 WO05/113605).

본 발명의 항체 분자의 불변 영역 도메인은, 존재하는 경우, 항체 분자의 제안된 기능, 및 구체적으로 필요할 수 있는 이펙터(effector) 기능을 고려하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역 도메인은 사람 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 도메인일 수 있다. 특히, 항체 분자가 치료용이고 항체 이펙터 기능이 요구될 때, 특히 IgG1 및 IgG3 이소형(isotype)의 사람 IgG 불변 영역 도메인을 이용할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자가 치료용이고 항체 이펙터 기능이 요구되지 않을 때, 예컨대 단순히 IL-6 활성을 차단하고자 할 때 IgG2 및 IgG4 이소형을 이용할 수 있다. 이러한 불변 영역 도메인의 서열 변이체도 이용할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들어, 문헌[Angal et al., Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108]에 개시된 대로 241번 위치의 세린이 프롤린으로 교체된 IgG 분자를 이용할 수 있다. 이러한 교체를 포함하는 IgG4 불변 도메인이 특이 바람직하다. 항체가 다양한 번역후 개질을 겪을 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 이러한 개질의 유형 및 한도는 종종 항체를 발현시키는데 이용된 숙주 세포주 및 배양 조건에 의존적이다. 이러한 개질은 글리코실화, 메티오닌 산화, 디케토피페리진 형성, 아스파르테이트 이성질화 및 아스파라긴 탈아미드화에서의 변이를 포함할 수 있다. 빈번한 개질은 카르복시펩티다제의 작용에 의한 카르복시-말단 염기성 잔기(예컨대, 리신 또는 아르기닌)의 손실이다(Harris, RJ. Journal of Chromatography 705:129-134, 1995에 개시됨). 따라서, 서열번호 16의 항체 중쇄의 C-말단 리신이 부재할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 항체는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체이고, 여기서 중쇄 불변 영역은 문헌[Angal et al., 상술함]에 개시된 대로 241번 위치의 세린이 프롤린으로 치환된 사람 IgG4 불변 영역을 포함한다. 따라서, 본 발명은 중쇄가 서열번호 16으로 제공된 서열을 포함하거나 이로 구성된 항체를 제공한다. 바람직하게는 경쇄 불변 영역이 cKappa이다.

일 실시예에서, 본 발명은 중쇄가 서열번호 16으로 제공된 서열을 포함하거나 이로 구성되고 경쇄가 서열번호 18로 제공된 서열을 포함하거나 이로 구성된 항체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 항체는 서열번호 16으로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 바람직하게는, 항체가 서열번호 16으로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 항체는 서열번호 18로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 바람직하게는, 항체가 서열번호 18로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 항체는 서열번호 16으로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 18로 제공된 서열과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 바람직하게는, 항체는 서열번호 16으로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 18로 제공된 서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.

본 발명에 따른 항체, 특히 CDR-Hl (서열번호 5), CDR-H2 (서열번호 6), CDR-H3 (서열번호 7), CDR-Ll (서열번호 8), CDR-L2 (서열번호 9) 또는 CDR-L3 (서열번호 10) 중 임의의 하나를 포함하는 항체, 예를 들어 항체 132E09 또는 중쇄 가변 영역 서열 gH13 (서열번호 11) 및/또는 경쇄 가변 영역 서열 (서열번호 13)을 포함하는 항체에 의해 결합된 사람 IL-6의 특정 영역 또는 에피토프가 본 발명에 의해 제공된다.

이러한 사람 IL-6 폴리펩티드의 특정 영역 또는 에피토프가 본 발명에 의해 제공된 항체 중 임의의 하나와 조합하여 당 분야에 공지된 임의의 적합한 에피토프 맵핑(mapping) 방법에 의해 동정될 수 있다. 상기 방법의 예로는 항체에 의해 인식된 에피토프의 서열을 함유하는 항체에 특이적으로 결합될 수 있는 최소 단편을 지니는 본 발명의 항체와의 결합을 위해 IL-6으로부터 유래된 길이를 변화시킨 펩티드를 스크리닝하는 것이 있다. IL-6 펩티드는 합성에 의해서나 IL-6 폴리펩티드의 단백질분해 소화에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합되는 펩티드는, 예를 들어 질량 분광 분석에 의해 동정될 수 있다. 또 다른 실시예에서, NMR 분광기를 이용하여 본원 실시예에 개시된 대로, 본 발명의 항체에 의해 결합된 에피토프를 동정할 수 있다. 일단 동정되면, 본 발명의 항체에 결합되는 에피토프 단편을, 요망되는 경우, 동일한 에피토프에 결합되는 추가의 중화 항체를 수득하기 위한 면역원으로서 이용할 수 있다.

일 실시예에서, 본 발명의 항체에 의해 결합된 사람 IL-6의 에피토프는 적어도 사람 IL-6의 아미노산 잔기 S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 및 S169을 포함한다(Boulanger et al., Science, 300, 2101-2104에 따른 잔기 넘버링). 일 실시예에서, 본 발명의 항체에 의해 결합된 사람 IL-6의 에피토프는 아미노산 잔기 S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 및 S169, 및 C44, S53, A58, V96, Q152, Q154, N155, W157, T163, L165, 및 E172로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명의 항체에 의해 결합된 사람 IL-6의 에피토프는 아미노산 잔기 C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, Rl04, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 및 E172를 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명은 아미노산 잔기 S47, C50, E93, Rl04, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 및 S169를 포함하는 성숙 사람 IL-6의 에피토프에 결합하는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체를 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 아미노산 잔기 S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 및 S169, 및 C44, S53, A58, V96, Ql52, Ql54, Nl55, W157, T163, L165, 및 E172로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하는 성숙 사람 IL-6의 에피토프에 결합하는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체를 제공한다.

일 구체예에서, 본 발명은 아미노산 잔기 C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, R104, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 및 E172를 포함하는 성숙 사람 IL-6의 에피토프에 결합하는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체를 제공한다.

상기 지명된 잔기가 IL-6의 비가공된 전구체의 아미노산 넘버링에 기초하여 넘버링될 수도 있음을 이해할 것이다(Swiss Prot Accession number P05231). 이러한 넘버링을 이용하여 보랑거(Boulanger) 등(상술함)에 따라 C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, Rl04, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 및 E172로서 상기 넘버링된 잔기는 각각 C72, S75, C78, S81, A86, E121, V124, R132, F133, E134, T177, K178, Q180, A181, Q182, N183, Q184, W185, Q187, T191, L193, S197 및 E200이 된다.

바람직하게는, 본 발명의 항체가 사람 IL-6의 부위 3에 대한 gp130 수용체의 결합을 차단한다.

IL-6에 대한 본 발명의 항체의 결합을 교차-차단(cross-block)하는 항체는 IL-6 활성을 중화시키는데 있어서 유사하게 유용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 사람 IL-6에 대한 상기 개시된 항체 중 임의의 하나의 결합을 교차-차단하고/거나 상기 항체 중 임의의 하나에 의해 IL-6과의 결합이 교차-차단되는, 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체를 제공한다. 일 구체예에서, 이러한 항체는 상기 본원에 개시된 항체로서 동일한 에피토프에 결합된다. 또 다른 구체예에서, 교차-차단용 중화 항체는 상기 본원에 개시된 항체에 의해 결합된 에피토프와 근사하고(border)/거나 중복되는 에피토프에 결합된다. 또 다른 구체예에서, 본 발명의 상기 측면의 교차-차단용 중화 항체는 본 발명의 항체와 동일한 에피토프 또는 상기 에피토프와 근사하고/거나 중복되는 에피토프에 결합되지 않는다.

교차-차단용 항체는, 예를 들어 사람 IL-6에 대한 교차 차단용 항체의 결합이 본 발명의 항체의 결합을 억제하거나 역으로 억제하는 경쟁 ELISA 또는 BIAcore를 이용함에 의해 당 분야의 임의의 적합한 방법을 이용하여 동정될 수 있다.

일 구체예에서, 사람 IL-6에 특이성을 지니는 중화 항체가 제공되며, 이것은 사람 IL-6에 대한 항체 132E09 또는 중쇄가 서열 gH13 (서열번호 11)를 포함하는 항체 또는 경쇄가 서열 gL10 (서열번호 13)을 포함하는 항체 또는 CDR-H1 (서열번호 5), CDR-H2 (서열번호 6), CDR-H3 (서열번호 7), CDR-L1 (서열번호 8), CDR-L2 (서열번호 9) 또는 CDR-L3 (서열번호 10) 중 임의의 하나를 포함하는 항체의 결합을 교차-차단시킨다. 일 구체예에서, 본 발명에 의해 제공된 교차-차단용 항체는 사람 IL-6에 대한 132E09 또는 중쇄가 서열 gH13 (서열번호 11)를 포함하는 항체 또는 경쇄가 서열 gL10 (서열번호 13)을 포함하는 항체 또는 CDR-H1 (서열번호 5), CDR-H2 (서열번호 6), CDR-H3 (서열번호 7), CDR-L1 (서열번호 8), CDR-L2 (서열번호 9) 또는 CDR-L3 (서열번호 10) 중 임의의 하나를 포함하는 항체의 결합을 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상까지 억제한다.

대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 상기 측면에 따른 중화 항체는 본 발명의 항체 중 임의의 하나에 의해 사람 IL-6과의 결합을 교차-차단할 수 있다. 따라서 항체 132E09 또는 중쇄가 서열 gH13 (서열번호 11)를 포함하는 항체 또는 경쇄가 서열 gL10 (서열번호 13)을 포함하는 항체 또는 CDR-H1 (서열번호 5), CDR-H2 (서열번호 6), CDR-H3 (서열번호 7), CDR-L1 (서열번호 8), CDR-L2 (서열번호 9) 또는 CDR-L3 (서열번호 10) 중 임의의 하나를 포함하는 항체에 의해 사람 IL-6과의 결합을 교차-차단시키는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체 분자가 제공된다. 일 구체예에서, 본 발명의 상기 측면에 의해 제공된 중화 항체는 132E09 또는 중쇄가 서열 gH13 (서열번호 11)를 포함하는 항체 또는 경쇄가 서열 gL10 (서열번호 13)을 포함하는 항체 또는 CDR-H1 (서열번호 5), CDR-H2 (서열번호 6), CDR-H3 (서열번호 7), CDR-L1 (서열번호 8), CDR-L2 (서열번호 9) 또는 CDR-L3 (서열번호 10) 중 임의의 하나를 포함하는 항체에 의해 사람 IL-6과의 결합을 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상까지 억제한다.

본 발명의 항체 분자는 사람 IL-6에 대해 바람직하게는 피코몰의 높은 결합 친화력을 지니는 것이 바람직하다. 친화력은 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 측정될 수 있고, 본원 실시예에 개시된 BIAcore를 포함한다. 바람직하게는 친화력이 본원 실시예에 개시된 대로 재조합 사람 IL-6을 이용하여 측정된다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 분자가 사람 IL-6에 대해 500 pM 미만의 결합 친화력을 지닌다. 본 발명에 따른 항체 분자는 사람 IL-6에 대해 50 pM 미만의 결합 친화력을 지니는 것이 바람직하다. 따라서, 일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 약 1 내지 약 500 pM의 결합 친화력을 지닌다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체 분자는 약 1 내지 약 50 pM의 결합 친화력을 지닌다. 바람직하게는 본 발명의 항체 분자가 사람 IL-6에 대해 약 1 내지 약 20 pM의 결합 친화력을 지닌다. 일 구체예에서, 본 발명의 항체는 사람 IL-6에 대해 8 내지 12 pM의 결합 친화력을 지닌다. 본 발명에 의해 제공된 항체의 친화력이 당 분야에 공지된 임의의 적합한 방법을 이용하여 변경될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 분자의 변이체에 관한 것이고, 이것은 사람 IL-6에 대해 개선된 친화력을 지닌다. 이러한 변이체는 CDR를 돌연변이시키는 것(Yang et al., J. Mol. Biol, 254, 392-403, 1995), 사슬 셔플링(shuffling)(Marks et al., Bio/Technology,. 10, 779-783, 1992), 대장균(E. coli)의 돌연변이유발 균주의 이용(Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996), DNA 셔플링 (Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997), 파지 디스플레이 (Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996) 및 유성 PCR (Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998)을 포함하는 다수의 친화력 성숙 프로토콜에 의해 수득될 수 있다. 바우간(Vaughan) 등(상술함)이 이러한 친화력 성숙 방법을 논의한다.

본 발명의 항체 분자는, 예를 들어 실시예에 개시된 시험관내 및 생체내 검정에서 IL-6 활성을 중화시키는 것이 바람직하다. 일 실시예에서, 이러한 항체는 사람 IL-6의 부위 3에 결합된다.

일 구체예에서, 본 발명은 0.038 nM의 사람 IL-6의 활성을 100 pM 미만의 농도에서 50%까지 억제할 수 있는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체를 제공하며, 억제 활성은 T1165 세포의 IL-6 유도된 증식에 대해 측정된다. 일 구체예에서, IL-6을 50%까지 억제하는 항체의 농도는 50 pM 미만, 보다 바람직하게는 20 pM 미만이다. 바람직하게는, 검정에 사용된 사람 IL-6이 사람 재조합 IL-6이다. 일 구체예에서, 중화 항체는 사람화된 항체 또는 완전한 사람 항체이다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 3.84 nM의 사람 IL-6의 활성을 1 nM 미만의 농도에서 50%까지 억제할 수 있는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체를 제공하며, 억제 활성은 사람 IL-6 및 sIL-6R에 반응하는 HUVEC에 의한 MCP-1의 생성에 대해 측정된다. 바람직하게는, 검정에 사용된 사람 IL-6이 사람 재조합 IL-6이다. 일 구체예에서, 중화 항체는 사람화된 항체 또는 완전한 사람 항체이다.

요망되는 경우 본 발명에 따른 항체는 하나 이상의 이펙터 분자(들)에 컨주게이션될 수 있다. 일 구체예에서, 이펙터 분자가 단일 이펙터 분자를 포함하거나 결합되어 본 발명의 항체에 부착될 수 있는 단일 부분을 형성하는 둘 이상의 상기 분자를 포함할 수 있음이 이해될 것이다. 이펙터 분자에 결합된 항체 단편을 수득하는 것이 요망되는 경우, 이것은 항체 단편을 직접 또는 커플링제에 의해 이펙터 분자에 결합시키는 표준 화학적 또는 재조합 DNA 공정에 의해 제조될 수 있다. 상기 이펙터 분자를 항체에 컨주게이션하는 기술은 당 분야에 널리 공지되어 있다(참조, Hellstrom et al., Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al., eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev., 62:119-58 and Dubowchik et al., 1999, Pharmacology and Therapeutics, 83, 67-123). 상세한 화학적 공정으로는 예를 들어 WO 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 및 WO03031581에 개시된 것들이 있다. 대안적으로, 이펙터 분자가 단백질 또는 폴리펩티드일 때, 결합은, 예를 들어 WO 86/01533 및 EP0392745에 개시된 재조합 DNA 공정을 이용하여 달성될 수 있다.

본원에 사용된 이펙터 분자라는 용어는, 예를 들어 항신생물제, 약물, 독소, 생물학적으로 활성인 단백질, 예를 들어 효소, 다른 항체 또는 항체 단편, 합성 또는 천연 발생 중합체, 핵산 및 이의 단편, 예컨대 DNA, RNA 및 이의 단편, 방사성핵종, 특히 방사성 요오다이드, 방사성 동위원소, 킬레이트 금속, 나노입자 및 리포터 그룹, 예컨대 형광 화합물 또는 NMR 또는 ESR 분광학에 의해 검출될 수 있는 화합물을 포함한다.

이펙터 분자의 예로는 세포에 유해한(예컨대, 치사시키는) 임의의 작용제를 포함하는 세포독소 또는 세포독성제가 있을 수 있다. 예로는 콤브레스타틴, 돌라스타틴, 에포틸론, 스타우로스포린, 메이탠시노이드, 스폰기스타틴, 리족신, 할리콘드린, 로리딘, 헤미아스텔린, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤, 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 있다.

이펙터 분자는 항대사물질(예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제(예컨대, 메클로르에타민, 티오에파 클로르암부실, 멜팔란, 카르무스틴(BSNU) 및 로무스틴(CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및시스-디클로로디아민 백금(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린(예컨대, 다우노루비신(이전에는 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제(예컨대, 닥티노마이신(이전에는 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 안트라마이신(AMC), 칼리케아미신 ㄸ또똔또는 두오카르마이신), 및 항-유사분열제(예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)도 포함하나 이로 제한되지 않는다.

다른 이펙터 분자는 ¹¹¹In 및 ⁹⁰Y, Lu¹⁷⁷, 비스무트²¹³, 칼리포르늄²⁵², 이리듐¹⁹² 및 텅스텐¹⁸⁸/레늄¹⁸⁸과 같은 킬레이트 방사성핵종; 또는 이로 제한되지 않으나 알킬포스포콜린, 토포이소머라제 I 억제제, 탁소이드 및 수라민과 같은 약물을 포함할 수 있다.

다른 이펙터 분자는 단백질, 펩티드 및 효소를 포함한다. 관심있는 효소로는 단백질분해 효소, 하이드롤라제, 라이아제, 이소머라제, 트랜스퍼라제가 있으나 이로 제한되지 않는다. 관심있는 단백질, 폴리펩티드 및 펩티드로는 면역글로불린, 아브린, 리신 A, 슈도모나스 엑소톡신 또는 디프테리아 독소와 같은 독소, 인슐린, 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자 또는 조직 플라스미노겐 활성화제와 같은 단백질, 혈전제 또는 항-혈관형성제, 예컨대 안지오스타틴 또는 엔도스타틴, 또는 생물학적 반응 개질제, 예컨대 림포카인, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-6(IL-6), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 신경 성장 인자(NGF) 또는 다른 성장 인자 및 면역글로불린이 있으나 이로 제한되지 않는다.

다른 이펙터 분자는 예를 들어 진단에서 유용한 검출가능한 물질을 포함할 수 있다. 검출가능한 물질의 예로는 다양한 효소, 배합군(prosthetic groups), 형광 재료, 발광 재료, 생체발광 재료, 방사성 핵종, 양전자 방출 금속(양전자 방출 단층촬영법에 이용됨), 및 비방사성 상자성 금속 이온이 있다. 진단용 항체에 컨주게이션될 수 있는 금속 이온에 대해서는 미국특허 4,741,900호를 참조한다. 적합한 효소로는 홍당무 과산화효소, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제가 있고; 적합한 배합군에는 스트렙타비딘, 아비딘 및 비오틴이 있으며; 적합한 형광 재료에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 및 피코에리트린이 있고; 적합한 발광 재료로는 루미놀이 있으며; 적합한 생체발광재료에는 루시퍼라제, 루시페린 및 아에쿠오린이 있고; 적합한 방사성 핵종으로는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹¹¹In 및 ⁹⁹Tc가 있다.

또 다른 실시예에서, 이펙터 분자(들)는 생체내에서 항체의 반감기를 증가시키고/거나 항체의 면역원성을 감소시키고/거나 상피 장벽을 지나 면역계로의 항체의 전달을 향상시킬 수 있다. 이러한 유형의 적합한 이펙터 분자의 예로는 WO05/117984 (published 15.12.05)에 개시된 것들과 같은 중합체, 알부민, 알부민 결합 단백질 또는 알부민 결합 화합물이 있다.

이펙터 분자가 중합체일 때, 이것은 일반적으로 합성 또는 천연 발생 중합체일 수 있으며, 예를 들어 치환되거나 치환되지 않은 직쇄 또는 분지쇄 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌 또는 폴리옥시알킬렌 중합체 또는 분지되거나 분지되지 않은 다당류, 예컨대 호모- 또는 헤테로-다당류이다.

상기 언급된 합성 중합체에 제공될 수 있는 임의의 특정 치환기에는 하나 이상의 히드록시, 메틸 또는 메톡시기가 있다.

합성 중합체의 구체적인 예로는 치환되거나 치환되지 않은 직쇄 또는 분지쇄 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌글리콜) 폴리(비닐알코올) 또는 이들의 유도체가 있고, 특히 메톡시폴리(에틸렌글리콜)과 같은 치환되거나 치환되지 않은 폴리(에틸렌글리콜) 또는 이의 유도체이다.

상세한 천연 발생 중합체로는 락토오스, 아밀로오스, 덱스트란, 글리코겐 또는 이들의 유도체가 있다.

본원에서 사용된 "유도체"는 반응성 유도체, 예를 들어 말레이미드 등과 같은 티올-선택적 반응성기를 포함하도록 의도된다. 반응성기는 중합체에 직접 결합되거나 링커 세그먼트를 통해 결합될 수 있다. 일부 경우에 상기 기의 잔기가 항체 단편과 중합체의 결합기(linking group)로서 생성물의 일부를 형성할 것임이 이해될 것이다.

중합체의 크기는 요망에 따라 다양할 수 있으나, 일반적으로 평균 분자량이 500Da 내지 50000Da의 범위일 것이고, 바람직하게는 5000 내지 40000Da 및 보다 바람직하게는 20000 내지 40000Da일 것이다. 중합체 크기는 특히 종양과 같은 특정 조직에 국소화시키는 능력 또는 순환되는 반감기를 연장시키는 능력과 같은 생성물의 의도된 용도에 기초하여 선택될 수 있다(검토를 위해, Chapman, 2002, Advanced Drag Delivery Reviews, 54, 531-545 참조). 따라서, 예를 들어, 생성물이 종양의 치료에 사용되기 위해 순환을 중지하고 조직으로 침투할 때, 예를 들어 약 5000Da의 분자량을 지니는 저분자량의 중합체를 이용하는 것이 유리할 수 있다. 생성물이 여전히 순환중인 적용의 경우에, 예를 들어 20000Da 내지 40000Da 범위의 분자량을 지니는 고분자량의 중합체를 이용하는 것이 유리할 수 있다.

특히 바람직한 중합체는 폴리알킬렌 중합체, 예컨대 폴리(에틸렌글리콜) 또는, 특히, 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 또는 이들의 유도체 및 특히 분자량의 범위가 약 15000Da 내지 약 40000Da인 것이다.

일 실시예에서, 본 발명에 사용되는 항체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 부분에 부착된다. 구체적인 일 실시예에서, 항체는 항체 단편이고 PEG 분자는 임의의 이용가능한 아미노산 측쇄 또는 항체 단편에 위치한 말단 아미노산 작용기, 예를 들어 임의의 유리 아미노기, 이미노기, 티올기, 히드록실기 또는 카르복실기를 통해 부착될 수 있다. 이러한 아미노산은 항체 단편에서 본래 발생할 수 있거나 재조합 DNA 방법을 이용하여 단편으로 공학처리될 수 있다(참조, 예를 들어 US 5,219,996; US 5,667,425; WO98/25971). 일 실시예에서, 본 발명의 항체 분자는 개질된 Fab 단편이고 여기서 개질은 이의 중쇄의 C-말단부에 이펙터 분자의 부착을 가능하게 하는 하나 이상의 아미노산의 첨가이다. 바람직하게는, 추가된 아미노산이 이펙터 분자가 부착될 수 있는 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 개질된 힌지(hinge) 영역을 형성한다. 둘 이상의 PEG 분자를 부착시키기 위해 다수의 부위가 이용될 수 있다.

바람직하게는 PEG 분자가 항체 단편에 위치한 하나 이상의 시스테인 잔기의 티올기를 통해 공유적으로 결합된다. 개질된 항체 단편에 부착된 각 중합체 분자는 단편에 위치한 시스테인 잔기의 황 원자에 공유적으로 결합될 수 있다. 공유 결합은 일반적으로 이황화 결합, 또는 특히 황-탄소 결합일 것이다. 티올기가 부착점(point of attachment)으로서 이용되는 경우 적합하게 활성화된 이펙터 분자, 예를 들어 말레이미드 및 시스테인 유도체와 같은 티올 선택적인 유도체가 이용될 수 있다. 활성화된 중합체는 상기 개시된 중합체-개질된 항체 단편의 제조에서 출발 재료로서 이용될 수 있다. 활성화된 중합체는 α-할로카르복실산 또는 에스테르와 같은 티올 반응성기를 함유하는 임의의 중합체, 예컨대 요오도아세트아미드, 이미드, 예컨대 말레이미드, 비닐 설폰 또는 디설파이드일 수 있다. 이러한 출발 재료는 상업적으로 입수할 수 있거나(예를 들어, Nektar, 이전에는 Shearwater Polymers Inc., Huntsville, AL, USA) 시판되는 출발 물질로부터 통상의 화학적 공정을 이용하여 제조될 수 있다. 특정 PEG 분자는 2OK 메톡시-PEG-아민 (Nektar, 이전에는 Shearwater; Rapp Polymere; and SunBio로부터 수득할 수 있음) 및 M-PEG-SPA (Nektar, 이전에는 Shearwater로부터 수득할 수 있음)를 포함한다.

일 구체예에서, 항체는, 예컨대 EP 0948544 또는 EP 1090037에 개시된 방법에 따라 PEG화된, 즉 공유적으로 결합된 PEG (폴리(에틸렌글리콜))을 지니는 개질된 Fab 단편 또는 디Fab이다[참조 "Poly(ethyleneglycol) Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J. Milton Harris (ed), Plenum Press, New York, "Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications", 1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A. Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. 일 실시예에서, PEG는 힌지 영역의 시스테인에 부착된다. 일 실시예에서, PEG 개질된 Fab 단편은 개질된 힌지 영역에서 단일 티올기에 공유적으로 결합된 말레이미드기를 지닌다. 리신 잔기는 말레이미드기에 공유적으로 결합될 수 있고 리신 잔기 상에서 아민기의 각각에 분자량이 약 20,000Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 중합체가 부착될 수 있다. Fab 단편에 부착된 PEG의 총 분자량은 따라서 대략 40,000Da일 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명은 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체 분자를 제공하고, 이것은 서열번호 11로 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 13으로 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 지니고 이펙터 분자가 부착된 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 개질된 힌지 영역을 이의 중쇄의 C-말단부에 지니는 개질된 Fab 단편이다. 바람직하게는 이펙터 분자가 PEG이고 (WO98/25971 및 WO2004072116)에 개시된 방법을 이용하여 리실-말레이미드기를 중쇄의 C-말단부에서 시스테인 잔기에 부착시킴에 의해 부착되며, 리실 잔기의 각 아미노기는 이것을 분자량이 약 20,000Da인 메톡시폴리(에틸렌글리콜) 잔기에 공유적으로 결합시켰다. 항체에 부착된 PEG의 총 분자량은 따라서 대략 40,000Da이다.

또 다른 실시예에서, 이펙터 분자는 국제 특허 출원 WO2005/003169, WO2005/003170 및 WO2005/003171에 개시된 방법을 이용하여 항체 단편에 부착될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 항체 분자의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 단리된 DNA 서열을 제공한다. 바람직하게는, DNA 서열이 본 발명의 항체 분자의 중쇄 또는 경쇄를 엔코딩한다. 본 발명의 DNA 서열은 예를 들어 화학적 프로세싱, cDNA, 게놈 DNA 또는 이들의 임의의 조합에 의해 생성된 합성 DNA를 포함할 수 있다.

본 발명의 항체 분자를 엔코딩하는 DNA 서열은 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄의 일부 또는 전부를 코딩하는 DNA 서열은 요망에 따라 결정된 DNA 서열로부터 합성될 수 있거나 상응하는 아미노산 서열에 기초하여 합성될 수 있다.

수용체 프레임워크 서열을 코딩하는 DNA는 당업자에게 널리 이용될 수 있고 이들의 공지된 아미노산 서열에 기초하여 용이하게 합성될 수 있다.

분자생물학의 표준 기술을 이용하여 본 발명의 항체 분자를 코딩하는 DNA 서열을 제조할 수 있다. 요망되는 DNA 서열은 올리고누클레오티드 합성 기술을 이용하여 완전히 또는 부분적으로 합성될 수 있다. 부위-유도된 돌연변이유발 및 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기술을 적합하게 이용할 수 있다.

적합한 DNA 서열의 예가 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 12, 서열번호 14, 서열번호 15 및 서열번호 17에 제공된다. 서열번호 15의 누클레오티드 1-57 및 서열번호 17의 누클레오티드 1-60은 마우스 항체 B72.3으로부터의 신호 펩티드 서열을 엔코딩하며(Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1(6) 499-505.), 절단되어 본 발명의 중화 항체 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명은 서열번호 15의 누클레오티드 58-2008을 포함하는 본 발명의 항체의 중쇄를 엔코딩하는 단리된 DNA 서열도 제공한다. 본 발명은 서열번호 17의 누클레오티드 61-705를 포함하는 본 발명의 항체의 경쇄를 엔코딩하는 단리된 DNA 서열도 제공한다.

본 발명은 본 발명의 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 항체를 엔코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 클로닝 또는 발현 벡터가 제공된다. 바람직하게는, 클로닝 또는 발현 벡터가 본 발명의 항체 분자의 경쇄 및 중쇄를 각각 엔코딩하는 두 개의 DNA 서열을 포함한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 벡터가 서열번호 15 및 17로 제공된 서열을 포함한다. 서열번호 15의 누클레오티드 1-57 및 서열번호 17의 누클레오티드 1-60은 마우스 항체 B72.3으로부터의 신호 펩티드 서열을 엔코딩하며, 이것은 가장 바람직하게 절단되어 본 발명의 중화 항체 분자를 제공한다.

벡터를 구성할 수 있는 일반적인 방법으로 트랜스펙션(transfection) 방법 및 배양 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York and the Maniatis Manual produced by Cold Spring Harbor Publishing]을 참조한다.

또한, 본 발명의 항체를 엔코딩하는 하나 이상의 DNA 서열을 포함하는 하나 이상의 클로닝 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 임의의 적합한 숙주 세포/벡터 시스템을 본 발명의 항체 분자를 엔코딩하는 DNA 서열의 발현에 시용할 수 있다. 세균, 예를 들어 대장균(E. coli) 및 다른 미생물 시스템을 이용할 수 있거나, 진핵, 예를 들어 포유동물, 숙주 세포 발현 시스템을 이용할 수도 있다. 참조, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181. 적합한 포유동물 숙주 세포로는 CHO, NSO, 골수종 또는 하이브리도마 세포가 있다. 적합한 발현 시스템의 예로는 WO87/04462에 개시된 글루타민 합성효소 발현 시스템이 있다.

본 발명은 본 발명의 벡터를 함유하는 숙주 세포를 본 발명의 항체 분자를 엔코딩하는 DNA로부터 단백질을 발현시키기에 적합한 조건하에 배양하고, 항체 분자를 단리시키는 것을 포함하여, 본 발명에 따른 항체 분자를 제조하는 방법을 제공한다.

항체 분자는 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드만을 포함할 수 있고; 이 경우 중쇄 또는 경쇄 폴리펩티드 코딩 서열만을 숙주 세포를 트랜스펙션하는데 이용할 필요가 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 모두를 포함하는 생성물을 제조하기 위해, 세포주를 두 개의 벡터로 트랜스펙션시킬 수 있는데, 첫 번째 벡터는 경쇄 폴리펩티드를 엔코딩하고 두 번째 벡터는 중쇄 폴리펩티드를 엔코딩한다. 대안적으로, 경쇄 및 중쇄 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 단일 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명의 항체가 병리 상태의 치료 및/또는 예방에 유용하기 때문에, 본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체 분자를 포함하는 약제학적 조성물 또는 진단용 조성물을 제공한다. 따라서, 약제를 제조하기 위한 본 발명의 항체의 용도가 제공된다. 조성물은 보통은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 살균된 약제학적 조성물의 일부로서 일반적으로 제공될 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 애주번트를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 본 발명의 항체 분자를 첨가하고 혼합시키는 것을 포함하여, 약제학적 또는 진단용 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

항체 분자는 약제학적 또는 진단용 조성물에서 유일한 활성 성분일 수 있거나 다른 항체 성분, 예를 들어 항-TNF, 항-IL-1β, 항-T 세포, 항-IFNγ 또는 항-LPS 항체, 또는 비-항체 성분, 예컨대 크산틴을 포함하는 다른 활성 성분을 동반할 수 있다.

약제학적 조성물은 치료적 유효량의 본 발명의항체를 포함하는 것이 바람직하다. 본원에서 사용된 "치료적 유효량"이라는 용어는 표적 질병 또는 질환을 치료, 경감 또는 예방하는데 필요한 치료제의 양, 또는 검출할 수 있는 치료 또는 예방 효과를 나타내는 양을 언급한다. 임의의 항체에 대하여, 치료적 유효량은 일반적으로 설치류, 토끼, 개, 돼지 또는 영장류에서, 세포 배양 검정 또는 동물 모델에서 초기에 산정될 수 있다. 동물 모델은 적합한 농도 범위 및 투여 경로를 결정하는데에도 이용될 수 있다. 이러한 정보는 이후 사람에게 투여하기 위한 유용한 용량 및 경로를 결정하는데 이용될 수 있다.

사람 피검체에 대한 정확한 치료적 유효량은 질병 상태의 중증도, 피검체의 일반적인 건강 상태, 피검체의 연령, 체중 및 성별, 식이, 투여 시간 및 빈도, 약물 조합물(들), 반응 민감성 및 치료에 대한 내성/반응에 의존적일 것이다. 이러한 양은 관례적인 실험에 의해 결정될 수 있고 임상의의 판단하에 있다. 일반적으로, 치료적 유효량은 0.01 mg/kg 내지 50 mg/kg일 것이고, 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg이다. 약제학적 조성물은 용량 당 소정량의 본 발명의 활성제를 함유하는 단위 용량 형태로 편리하게 제공될 수 있다.

조성물은 환자에게 개별적으로 투여될 수 있거나 다른 작용제, 약물 또는 호르몬과 함께 (예컨대, 동시에, 차례로 또는 별도로) 투여될 수 있다.

투여되는 본 발명의 항체 분자의 양은 치료하려는 질병의 특성, 존재하는 염증의 정도 및 항체 분자가 예방용인지 현재의 질병을 치료하기 위해 이용되는 것인지에 의존적이다.

복용 빈도는 항체 분자의 반감기 및 이의 효과의 지속기간에 의존적일 것이다. 항체 분자가 짧은 반감기를 지닐 때(예컨대 2 내지 10시간), 이것은 매일 1회 이상 복용될 필요가 있다. 대안적으로, 항체 분자가 긴 반감기를 지닐 때(예컨대, 2 내지 15일 또는 2 내지 30일), 이것은 매일 1회, 1주에 1회, 또는 매 1개월 또는 2개월에 1회의 복용량을 제공하는 것만이 필요할 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 조성물을 수용하는 개체에게 해로운 항체의 생성을 자체적으로 유도하지 않고 유독하지 않아야 한다. 적합한 담체로는 단백질, 폴리펩티드, 리포솜, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 고분자 아미노산, 아미노산 공중합체 및 불활성 바이러스 입자와 같은 천천히 대사되는 큰 거대분자일 수 있다.

약제학적으로 허용되는 염을 사용할 수 있고, 예를 들어 광산염, 예컨대 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트 및 설페이트, 또는 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트 및 벤조에이트이다.

치료용 조성물 중의 약제학적으로 허용되는 담체는 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올과 같은 액체를 추가로 함유할 수 있다. 추가로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 에멀젼화제 또는 pH 완충 물질이 이러한 조성물에 존재할 수 있다. 이러한 담체들은 약제 조성물이 환자에 의해 섭취되는 정제, 알약, 드라제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리 및 현탁액으로 제형화될 수 있게 한다.

바람직한 투여 형태는 주사 또는 주입, 예를 들어 볼루스(bolus) 주사 또는 연속 주입과 같이 비경구 투여에 적합한 형태를 포함한다. 생성물이 주사 또는 주입을 위한 것일 때, 이것은 지성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 방부제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체 분자는 사용 전에 적합한 살균 액체와 재구성되는 건조 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물이 일단 제형화되면, 본 발명의 조성물은 피검체에게 직접 투여될 수 있다. 치료하려는 피검체는 동물일 수 있다. 그러나, 조성물이 사람 피검체에게 투여되기 위해 개질되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 정맥내, 근내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심실내, 경피(transdermal), 경피(transcutaneous)(예를 들어, WO98/20734 참조), 피하, 복막내, 비내, 창자, 국소, 설하, 질내 또는 직장 경로를 포함하나 이로 제한되지 않는 다수의 경로에 의해 투여될 수 있다. 하이포스프레이(hypospray)도 본 발명의 약제학적 조성물을 투여하는데 사용될 수 있다. 통상적으로, 치료용 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능하게 제조될 수 있다. 주사 전에 액체 비히클 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다.

조성물의 직접 전달은 일반적으로 주사, 피하, 복막내, 정맥내 또는 근내에 의해 확립될 수 있거나, 조직의 사이질 공간으로 전달될 수 있다. 조성물은 병변으로 투여될 수도 있다. 복용 치료는 단일 용량 스케줄 또는 다중 용량 스케줄일 수 있다.

조성물 중의 활성 성분이 항체 분자임이 이해될 것이다. 이와 같이, 이것은 위장관에서의 분해에 민감할 것이다. 따라서, 조성물이 위장관을 이용한 경로에 의해 투여되어야 하는 경우, 조성물은 분해로부터 항체를 보호하나 일단 이것이 위장관으로부터 흡수되면 항체를 방출시키는 작용제를 함유할 필요가 있다.

약체학적으로 허용되는 담체의 완전한 논의는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, NJ. 1991)]을 이용할 수 있다.

본 발명의 항체는 유전자 치료요법을 이용하여 투여될 수 있음이 구상된다. 이를 달성하기 위하여, 항체 분자의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 DNA 서열을 적합한 DNA 성분의 조절하에 환자에게 도입시켜 항체 사슬을 DNA 서열로부터 발현시키고 동일반응계내에서(in situ) 어셈블링시킨다.

본 발명은 염증 질병의 조절에 사용되는 항체 분자도 제공한다. 바람직하게는, 항체 분자가 염증 프로세스를 감소시키거나 염증 프로세스를 예방하는데 이용될 수 있다.

IL-6에 의해 매개되거나 IL-6의 증가된 수준과 관련된 병리적 질환의 치료 및/또는 예방에 사용되는 본 발명에 따른 항체 분자가 제공된다. 본 발명은 IL-6에 의해 매개되거나 IL-6의 증가된 수준과 관련된 병리적 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체 분자의 용도를 추가로 제공한다. 바람직하게는, 병리적 상태가 감염(바이러스, 세균, 진균 및 기생충), 감염과 관련된 내독소 쇼크, 관절염, 류마티스 관절염, 건선 관절염, 전신 개시 소아 특발 관절염(JIA), 전신 홍반 루푸스(SLE), 천식, 골반 염증 질병, 알츠하이머병, 크론병, 궤양 결장염, 과민 대장 증후군, 캐슬맨(Castleman)병, 강직 척추염, 피부근육염, 포도막염, 페이로니(Peyronie)병, 복부질병, 담낭 질병, 털둥지 질병, 복막염, 건선, 혈관염, 수술 유착, 뇌졸중, 타입 I 당뇨병, 라임 관절염, 수막뇌염, 중추 및 말초 신경계의 면역 매개된 염증 질병, 예컨대 다발성 경화증 및 질레인-바(Guillain-Barr) 증후군, 다른 자가면역 질병, 췌장염, 외상(수술), 이식편대 숙주 질병, 이식 거부, 암(고형암, 예컨대 흑색종, 간모세포종, 육종, 편평세포 암종, 이행 세포 암, 난소암 및 혈액암 및 특히 급성 골수백혈병, 만성 골수백혈병, 위암 및 결장암 모두), 심근경색과 같은 허혈 질병 뿐만 아니라 죽상경화증을 포함하는 심장병, 혈관내 응고, 뼈 재흡수, 화상 환자, 골다공증, 치주염 및 저염산증으로 구성된 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 병리적 질병이 류마티스 관절염 또는 전신 홍반 루푸스(SLE)이다.

본 발명은 동통을 치료 또는 예방하기 위한 본 발명에 따른 항체 분자를 제공한다.

본 발명은 동통을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 본 발명에 따른 항체 분자의 용도를 추가로 제공한다.

본 발명의 항체 분자는 사람 또는 동물체에서 IL-6의 영향을 감소시키는 것이 요망되는 임의의 치료에서 이용될 수 있다. IL-6은 체내에서 순환할 수 있거나 체내의 특정 부위, 예를 들어 염증 부위에 국한되어 바람직하지 않게 높은 수준으로 제공될 수 있다.

본 발명의 항체 분자는 염증 질병의 조절을 위해 이용되는 것이 바람직하다.

본 발명은 IL-6에 의해 매개된 질병에 걸렸거나 걸릴 위험이 있는 사람 또는 동물 피검체를 치료하는 방법, 본 발명의 유효량의 항체 분자를 피검체에게 투여하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항체 분자는 진단, 예를 들어 생체내 진단 및 IL-6을 수반하는 질병 상태의 영상화(imaging)에도 이용될 수 있다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조한 하기 실시예에서 설명만을 목적으로 하여 추가로 기술된다.

도 1은 240.g1 중쇄 (도 2a; 서열번호 11) 및 경쇄 (도 2b; 서열번호 13) 서열에 대한 이식 설계를 도시한다. 기호(｜)는 공여체:수용체:이식된 프레임워크 서열간의 차이를 강조한다. CDR은 한 줄로 표시한다. CDR-H1이 카바트 및 코티아 정의 둘 모두를 포함하는 것을 제외하고, 이들은 카바트에 의해 정의된다. 두 줄로 표시된 서열은 이식편에 보유된 공여체 프레임워크 잔기이다.

도 2a는 인트론/엑손 경계를 도시하는 240.g1 IgG4 중쇄의 번역된 서열이다.

도 2b는 인트론/엑손 경계를 도시하는 24O.g1 경쇄의 번역된 서열이다.

도 3a는 항체 24O.g1에 의한 사람 재조합, 사람 포유동물 유래, 리서스(rhesus), 시노몰거스 및 마우스 IL-6 유도된 T1165 세포의 증식의 억제를 도시한다.

도 3b는 항체 24O.g1에 의한 사람 재조합 IL-6 및 sIL-6R 유도된 MCP-1 생성의 억제를 도시한다.

도 3c는 항체 24O.g1에 의한 HUVEC에서의 IL-17 유도된 내인성 IL-6 및 sIL-6R 유도된 MCP-1 생성의 억제를 도시한다.

도 4는 CA030_240.g1 (부위 3 항체)의 투여에 의한 마우스에서의 hIL-6 유도된 SAA의 생체내 중화, n=7-8/그룹, 예외로 PBS의 경우 n=6. 본페로니 포스트 테스트(Bonferroni post test)로 ANOVA에 의한 통계적 분석, **IL-6 단독에 비해 P<0.01.

DNA 조작 및 일반적인 방법

대장균(E. coli) 균주 INVαF' (Invitrogen)를 형질전환 및 통상적인 배양 성장에 이용하였다. DNA 제한 및 개질 효소를 로슈 다이어그노틱스 엘티디(Roche Diagnostics Ltd.) 및 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터 수득하였다. 플라스미드 제조를 맥스 플라스미드 정제 키트(QIAGEN, catalogue No. 12165)를 이용하여 수행하였다. DNA 서열화 반응을 ABI 프리즘 빅 다이 터미네이터 시퀀싱 키트(catalogue No. 4304149)를 이용하여 수행하고 ABI 3100 자동화 서열화기(Applied Biosystems) 상에서 가동시켰다. 데이터를 프로그램 오토어셈블러(Applied Biosystems)를 이용하여 분석하였다. 올리고누클레오티드를 인비트로겐(INVITROGEN)으로부터 수득하였다. 합성 유전자를 엔텔레콘(Entelechon)에서 수립하였다. Fab 및 IgG의 농도를 어셈블리 ELISA를 이용하여 측정하였다.

실시예 1: 132 E09 의 단리

초기에 프로인트의 완전 애주번트를 이용하고 후속하여 프로인트의 불완전 애주번트를 이용하여 3주 간격으로 래트를 재조합 사람 IL-6 (Peprotech)의 피하 주입에 의해 면역시켰다. 최후 면역 후 1-2주에 비장을 회수하고, 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 면역 래트 림프구를 조사된 마우스 가슴샘종 EL4 세포 및 토끼 T 세포 조건(conditioned) 배지의 존재하에 1주일 동안 96 웰 미세역가 플레이트에서 배양하였다. 상청액을 ELISA에서 사람 IL-6에 특이적인 항체의 존재에 대해 스크리닝하였다. DSI 세포주 검정에서 사람 IL-6의 생물학적 효과를 중화시키는 능력에 대해 포지티브를 추가로 스크리닝하였다(Bock et al., 1993, Cytokine, 5, 480-489).

적합한 결합 특성을 지니는 개개의 B 세포 분비 항체를 선택된 림프구 항체 방법(Selected Lymphocyte Antibody Method)에 따라 포지티브 미세역가 웰로부터 단리시키고(Babcook et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 7843-7848; WO92/02551), 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자를 단일 래트 B 세포로부터 역전사 PCR을 통해 클로닝시켰다. 가변 영역을 재조합 IgG 포맷에서 발현시켜 결합을 확인하고, 항체 132E09를 사람화 및 추가 연구를 위해 선택하였다. 래트 가변 영역 서열을 CA030_00240으로서 기입하였다.

V-영역 서열은 서열번호 1 내지 4로 나타내었다.

실시예 2: 132 E09 의 CDR -이식

일련의 사람화된 VL 및 VH 영역을 고안하였으며, 여기서 132E09로부터의 CDR 과가변 영역 및 다수의 프레임워크 잔기가 사람 V-영역 수용체 프레임워크 상으로 이식되었다.

10개의 이식된 VL 영역(gL1-10)을 설계하고, 유전자를 올리고누클레오티드 어셈블리 및 PCR 돌연변이유발에 의해 구성하였다. 총 13개의 이식된 VH 영역을 두 상이한 프레임워크 영역인 VH3 1-4 3-72 및 VH3 1-3 3-21을 이용하여 구성하였다(gH1-13). 경쇄 이식된 서열을 사람 C-카파 불변 영역을 엔코딩하는 DNA(Km3 동종이형)를 함유하는 사람 경쇄 발현 벡터 pKHlO.1로 서브클로닝시켰다. 중쇄 이식된 서열을 사람 감마-4 발현 벡터 pVhg4P FL로 서브클로닝하였고, 이것은 힌지 안정화 돌연변이 S241P를 함유하는 사람 감마-4 불변 영역을 엔코딩하는 DNA를 함유한다(Angal et al., 상술함). 플라스미드를 CHO 세포로 공(co)-트랜스펙션시키고, 생성된 항체를 IL-6 결합에서의 활성 및 생체내 검정으로 스크리닝하였다. CHO 세포의 트랜스펙션은 리포펙타민^TM 2000 공정을 이용하여 제조자의 지시에 따라 수행되었다(InVitrogen, catalogue No. 11668).

생성된 13개의 중쇄 이식편 중에서, 둘은 49번 위치에 단일 프레임워크 공여체 잔기(Ala)만을 함유하였고 이들은 두 상이한 중쇄 프레임워크 둘 모두를 이용하 여 생성되었다. VH3 1-3 3-21 이식편은 CHO 세포에서 불충분하게 발현되었고 IL-6에 대해 감소된 친화력을 나타내었다. 대조적으로, VH3 1-4 3-72 프레임워크를 이용한 이식편은 잘 발현되었고 공여체 항체의 친화력을 유지하였다. 단일 공여체 프레임워크 잔기만을 포함하는 이러한 중쇄 이식편을 CDR만이 이동된 경쇄 이식편 gL10과 함께 선택하였다.

도 1은 공여체 래트 서열 132E09 및 수용체 사람 프레임워크간의 정렬을 도시한다. 중쇄 수용체 프레임워크는 사람 생식계통 서열 VH3 1-3 3-72이며, 사람 JH-영역 생식계통 JH4의 이러한 부분으로부터 온 프레임워크 4를 지닌다. 경쇄 수용체 프레임워크는 사람 생식계통 VK1 2-1-(1) 012이며, 사람 JK-영역 생식계통 JK2의 이러한 부분으로부터 온 프레임워크 4를 지닌다. gH13 및 gL10에 대한 이식편 서열이 도 1에 도시되어 있다(서열번호 11, 12, 13 및 14).

이렇게 이식된 항체를 CA030_00240.g1로서 명명한다. 이것은 상기 기술된 241번 위치에서 프롤린 치환되는 세린을 포함하는 전체 IgG4로서 생성되었다. 번역된 완전한 중쇄 및 경쇄 서열이 각각 도 2a 및 2b에 도시되어 있다. 중쇄의 완전한 아미노산 서열이 서열번호 16으로 제공되고 경쇄가 서열번호 18로 제공된다. 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 DNA 서열이 각각 서열번호 15 및 17로 제공된다. 서열번호 15 및 도 2a의 누클레오티드 1-57이 마우스 항체 B72.3 VH로부터 신호 펩티드 서열을 엔코딩하고 서열번호 17 및 도 2b의 누클레오티드 1-60이 마우스 항체 B72.3 VL로부터 신호 펩티드 서열을 엔코딩한다.

마우스 항체 B72.3이 문헌[Whittle et al., 1987, Protein Eng. 1(6) 499- 505]에 개시되어 있다.

실시예 3: 결합 친화력

CA030 _00240. g1 결합 친화력 측정

BlAcore 기술로 표지화에 대한 요구 없이 실시간으로 생체분자간의 결합을 모니터링한다. 리간드로서 명명된 상호작용 물질 중 하나를 직접 고정시키거나 고정된 표면 상에 포획하는 한편, 분석물(analyte)로서 명명된 다른 하나를 포획된 표면 상에서 용액으로 유동시킨다. 센서가, 분석물이 리간드와 결합하여 표면 상에 복합체를 형성함에 따라 센서 표면 상에 질량의 변화를 검출한다. 이것은 회합(association) 공정에 상응한다. 분석물이 완충액으로 교체될 때 분리 공정이 모니터링된다. 친화력 BIAcore 검정에서, 리간드는 CA030_00240.g1 전체 IgG4이고 분석물은 사람 IL-6이다.

장치

Biacore ® 3000, Biacore AB, Uppsala, Sweden

센서 칩

CM5 (리서치 등급) 카달로그 번호: BR-1001-14, Biacore AB, Uppsala, Sweden. 칩을 4℃에 저장하였다.

BIA 표준화 용액

70% (w/w) 글리세롤. BIAmaintenance 키트 카달로그 번호: BR-1002-51의 일부, Biacore AB, Uppsala, Sweden. BIAmaintenance 키트를 4℃에 저장하였다.

아민 커플링 키트

카달로그 번호: BR-1000-50, Biacore AB, Uppsala, Sweden.

에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드(EDC). 증류수에서 75 mg/mL로 구성되며 200 μL의 분취량으로 -70℃에서 저장됨.

N-히드록시숙신이미드(NHS). 증류수에서 11.5 mg/mL로 구성되며 200 μL의 분취량으로 -70℃에서 저장됨.

1 M 에탄올아민 히드로클로라이드-NaOH pH 8.5. 200 μL의 분취량으로 -70℃에서 저장됨.

완충액

흐름 완충액: HBS-EP (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 계면활성제 P20). 카달로그 번호: BR-1001-88, Biacore AB, Uppsala, Sweden. 완충액을 4℃에서 저장하였다.

고정화 완충액: 아세테이트 5.0 (10 mM 나트륨 아세테이트 pH 5.0). 카달로그 번호: BR-1003-51, Biacore AB, Uppsala, Sweden. 완충액을 4℃에서 저장하였다.

리간드 포획

어피니퓨어(affnipure) F(ab')₂ 단편 염소 항-사람 IgG, Fc 단편 특이적임, Jackson ImmunoResearch Inc (Pennsylvania, USA) 카달로그 번호: 109-006-098. 시약을 4℃에서 저장하였다.

분석물

재조합 사람 IL-6 (R&D Systems Europe Ltd, Abingdon, Oxon. 카달로그 번호 206-IL-050, 로트 번호 A131402A)을 -70℃에서 저장하고 각 검정에 대해 1회 해동시켰다.

재조합 시노몰거스 원숭이 IL-6 및 재조합 리서스 원숭이 IL-6을 CHO 세포의 일시적인 트랜스펙션에 의해 생성하였다. 재료를 비정제되고 비정량된 세포 배양 상청액으로서 이용하였다.

재생 용액

11.6M 스톡 용액(BDH, Poole, England. 카달로그 번호: 101254H)으로부터 증류수로 희석시켜 40 mM HCl을 제조하였다.

50 mM 스톡 용액으로부터 증류수로 희석시켜 5 mM NaOH를 제조하였다.

카달로그 번호: BR-1003-58, Biacore AB, Uppsala, Sweden.

검정 방법

BIAcore 3000 (BIAcore AB)을 이용하여 BIA (Biamolecular Interaction Analysis)을 수행하였다. Fc 단편 특이적인 어피니퓨어 F(ab')₂ 단편 염소 항-사람 IgG를 CM5 센서 칩 상에서 아민 커플링 화학을 통해

5000 반응 유닛(RU)의 포획 수준으로 고정되었다. HBS-EP 완충액 (1OmM HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % 계면활성제 P20, BIAcore AB)를 10 ㎕/분의 유속으로 흐름 완충액으로서 이용하였다. 10 ㎕의 CA030_240.g1 주사액을 4 ㎍/mL로 고정된 항-사람 IgG-Fc에 의한 포획을 위해 이용하였다. 사람 IL-6을 포획된 CA030_240.g1 상에서 다 양한 농도에서 30 μL/분의 유속으로 적정하였다. 10 μL/분의 유속으로 40 mM HCl을 10 μL 주사한 후 5 mM NaOH를 5 μL 주사하여 표면을 재생시켰다.

배경 제거(background subtraction) 결합 곡선을 BIAevaluation 소프트웨어(버젼 3.2)에 이어서 표준 공정을 이용하여 분석하였다. 동력학 파라미터를 피팅(fitting) 알고리듬으로부터 결정하였다.

CA030_240.g1의 일 회분을 상기 연구에 이용하였다. 20 nM 또는 그 미만의 사람 IL-6 농도에서 친화력을 결정하였다. CA030_240.g1에 대해 결정된 친화력 값은 9.76±0.74 pM의 평균±s.e.m.을 지니며 9.02-10.50 pM의 범위였다(표 1.1). IL-6을 고정시키는 것이 원래 구조의 손실을 야기하므로 BIAcore 칩 상에 고정된 사람 IL-6을 이용하여 친화력을 결정할 수 없었다.

시노몰거스 원숭이 또는 리서스 원숭이 IL-6을 정량할 수 없었기 때문에, 이들의 030_00240.g1과의 상호작용에 대한 진정한 동력한 파라미터도 결정할 수 없었다. 그러나, 결합 센소그램의 시각적 조사는, CA030_00240.g1이 이러한 비-사람 영장류 IL-6에 사람 IL-6에 대한 것과 유사한 친화력으로 결합됨을 나타낸다.

표 1.1: 사람 IL-6에 대한 CA030_240.g1의 친화력

참조번호	k a (M -1 s -1 )	k d (s -1 )	K d (M)	K d pM
10017474/39-51	7.31E+05	7.68E-06	1.05E-11	10.5
10017474/39-51	8.52E+05	7.68E-06	9.02E-12	9.02

실시예 5: 시험관내 중화 검정

항체 CA030 00240.g1 (이후, 240.g1)의 효능을 상이한 두 검정을 이용하여 결정하였다. 첫 번째 검정에서는 마우스, 리서스, 시노몰거스 및 사람 IL-6에 반응하여 증식하는 T1165로 명명된 마우스 IL-6 의존적인 세포주를 적용하였다. 세포 표면 IL-6 수용체에 대한 IL-6의 이러한 직접적인 시그널링(signalling)은 gp130이라 불리는 시그널링 수용체 서브유닛과 관련하여 시스(cis)-시그널링이라 명명된다. 두 번째 검정은 IL-6 및 가용성 IL-6 수용체(IL-6R)로 자극된 사람 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)를 이용하였고 그 정보는 단핵세포 화학유인 단백질-1(MCP-1)의 생성이다. 상기 검정에서, IL-6은 외인성으로 첨가되었거나 HUVEC를 시토킨 인터루킨-17 (IL-17)로 자극함에 의해 생성될 수 있었다. HUVEC가 IL-6R을 발현시키지 않고 IL-6 및 가용성 IL-6R 둘 모두가 외인성으로 첨가되는 경우에만 반응, 즉 MCP-1을 생성할 수 있기 때문에 이러한 두 검정 변형을 트랜스(trans)-시그널링이라 명명하였다.

상기 다양한 검정을 이용하여 사람(재조합 및 천연), 리서스, 시노몰거스 및 마우스 IL-6에 대하여 24O.g1에 대한 ND50(중화 용량 50%) 값을 생성할 수 있었다.

재료

배양 배지

T1165 배양 배지 - RPMIl640, 10% 송아지 태아 혈청, 페니실린 (100 유닛/ml), 스트렙토마이신 (50 ㎍/ml), 글루타민 (2mM) 및 10 ng/ml의 사람 재조합 IL-6이 보충됨, R&D systems, UK.

HUVEC 배양 배지 - 대혈관 내피 세포 기저 배지(LVECBM) TCS Cellworks, UK, 대혈관 내피 세포 성장 보충물 TCS Cellworks, UK 및 항생제 보충물 TCS Cellworks, UK.

PBS 중 6.83 mg/ml의 농도에서 인 하우스(in house) 제조된 CA 030 00240.g1.

사람 IL-6 R&D systems, UK, 사람 포유동물-유래 IL-6 (사람 IL-6 10017108/67로 트랜스펙션된 CHO로부터 인 하우스 유래됨), 리서스 IL-6 (리서스 IL-6 10017108/67로 트랜스펙션된 CHO로부터 인 하우스 유래됨), 시노몰거스 IL-6 (시노몰거스 IL-6 10017108/67로 트랜스펙션된 CHO로부터 인 하우스 유래됨), 마우스 IL-6 R&D systems, UK. 항-사람 MCP-1 포획 항체 (555055) 및 항-사람 MCP-1 검출 항체(554664) 및 사람 재조합 MCP-1(890225), BD Biosciences, CA. 스트렙타비딘-HRP (AMDEX) Amersham bioscience, UK. Thrombin Merck Biosciences, Darmstadt, Germany. sIL-6R R&D systems, UK. 사람 IL-17 R&D systems, UK.

T1165 검정 - 세포역가(CellTiter) 96® AQueous Promega, CA.

TM 블루 (Serologicals, GA).

IL-6 의존적인 T1165 세포의 증식을 이용한 240. g1 활성의 측정

T1165 세포를 사용 4일 전에 해동시키고 10% FCS, 항생제, 글루타민 및 10 ng/ml의 사람 IL-6이 보충된 RPMI1640에서 배양하였다. 세포 생육력을 트리판 블루 배제를 이용하여 모니터링하였고, 생육력이 90% 이상인 세포만을 이용한 것으로 간주하였다. 세포를 사용하기 전에 세포를 RPMI1640에서 사람 IL-6의 부재하에 2회 세척하였다. 이후 세포를 계수하고 96 웰 편평 바닥 플레이트에 웰 당 5xlO⁴개 세포 밀도로 분배하였다. 별개의 플레이트에서, 24O.g1의 연속 희석물을 사람 재조합, 사람 포유동물-유래(사람 CHO IL-6으로서도 언급됨), 리서스, 시노몰거스 또는 마우스 IL-6을 1 ng/ml (0.038nM)의 고정된 농도로 존재시켜 인큐베이션하였다. 240.g1 및 IL-6의 미리-혼합된 복합물을 습윤된 5%CO₂ 대기에서 48시간 동안 37℃에서 인큐베이션된 T1165 세포를 함유하는 웰로 옮겼다. 인큐베이션의 마지막 6시간 동안, 20 ml의 세포역가(CellTiter) 96® AQueous를 첨가하여 증식 세포의 수를 측정하였다. 240.g1에 의한 IL-6-의존적인 T1165 세포 증식의 억제를 세포를 함유하나 IL-6은 함유하지 않는 대조군 웰만을 뺀 IL-6으로 처리된 웰의 억제 백분율로서 표시하였다.

사람 재조합, 사람 포유동물-유래, 리서스, 시노몰거스 및 마우스 IL-6 유도된 세포주 T1165의 증식에 대한 24O.g1의 활성을 도 3a에서 볼 수 있다. 240.g1은 유력하게 사람 재조합, 사람 포유동물-유래, 리서스, 시노몰거스 IL-6 활성을 억제하였으나 마우스 IL-6 활성을 억제하지 않았다.

사람 재조합 IL-6에 대한 ND50은 1.1 ± 0.5 ng/ml (7.26 ± 3.3 pM)이었다. 사람 포유동물 유래 IL-6에 대한 ND50은 3.6 ± 2.4 ng/ml (23.76 ± 15.84 pM)이었다. 리서스 IL-6에 대한 ND50은 2.2 ± 1.1 ng/ml (14.52 ± 7.26 pM)이었다. 시노몰거스 IL-6에 대한 ND50은 5.4 ± 1.1 ng/ml (35.64 ± 7.26 pM)이었다.

HUVEC 에서 IL-6 및 가용성 IL-6 유도된 MCP -1 생성을 이용한 2401. g1 활성의 측정

HUVEC (TCS Cellworks, UK)를 대혈관 내피 세포 기저 배지(LVECBM)에서 성장시키고 배양액에서 5회 이하로 계대(passage)시켰다. 세포를 사용 전에 75% 컨플루언스(confluence)까지 성장시켰다. 세포를 트립신/EDTA를 이용하여 분리시키고, 재현탁하고 새로운 LVECBM에서 1회 세척하였다. 이후 세포를 계수하고 96웰 편평 바닥 플레이트에 웰 당 2xlO⁴개 세포 밀도로 분배시켰다. 이후 세포를 37℃에서 습윤된 5%CO₂ 대기에서 밤새 배양하였다. 다음날 세포를 비오티닐화된 트롬빈(3U/ml)이 보충된 새로운 배지로 세척하고 따로 두었다. 별개의 플레이트에서, 240.g1의 연속 희석물을 사람 재조합 IL-6(50 mg/ml; 3.84 nM) 및 sIL-6R을 500 ng/ml (10.15 nM)의 고정된 농도로 존재시켜 인큐베이션하였다. 추가로, 240.g1을 HUVEC를 자극하여 IL-6을 생성시키는 사람 재조합 IL-17 (25 ng/ml; 1.18 nM) 및 sIL-6R과 함께 500ng/ml (10.15nM)의 고정된 농도에서 인큐베이션하였다. 24O.g1 및 IL-6/sIL-6R 또는 IL-17/sIL-6R의 미리-혼합된 복합물을 24시간 동안 37℃에서 습윤된 5%CO₂ 대기에서 인큐베이션된 HUVEC를 함유하는 웰로 옮겼다. 인큐베이션 기간 이후에, 무세포 상청액을 수집하고, 사람 MCP-1 수준을 샌드위치 ELISA (하기 제시된 프로토콜)에 의해 결정하였다. 240.g1에 의한 IL-6/sIL-6R 또는 IL-17/sIL-6R 유도된 MCP-1 생성의 억제를 IL-6/sIL-6R 또는 IL-17/sIL-6R로 처리된 웰에서 세포를 함유하며 자극되지 않은 대조군 웰을 빼서 억제 백분율로서 표시하였다. 또한, 대조군을 첨가하여 sIL-6R의 부재하에 사람 IL-6 첨가에 대한 세포의 반응을 나타내었다.

MCP -1 ELISA

누크 맥시소프 플레이트(Nunc Maxisorp plate)를 2 ㎍/ml 농도의 항-MCP-1 포획 항체로 코팅하였다. 플레이트를 +4℃에서 밤새 인큐베이션 한 다음 PBS 및 0.1% 트윈20(세척 완충액)으로 2회 세척하였다. 플레이트를 PBS 및 5% 소혈청 알부민에서 1시간 동안 차단시켰다. 이후 플레이트를 세척 완충액으로 4회 세척하고 기준물 및 샘플을 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 비오티닐화된 항-MCP-1 항체를 1 mg/ml의 농도로 첨가하였다. 플레이트를 추가로 2시간 동안 인큐베이션하고 4회 세척하였다. 스트렙타비딘-HRP의 1:5000 희석액을 첨가하고 플레이트를 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 최종 4회 세척하고 TMB 기질을 첨가하였다. 630 nm에서 비색 판독하고 492 nm에서 배경 판독하였다. MCP-1 농축물이, 제네시스(Genesis) II 소프트웨어 상에서 4-파라미터 로지스틱 곡선 피트(fit)를 이용하여 기준 곡선으로부터 유래되었다.

HUVEC에서 사람 재조합 IL-6 및 sIL-6R 유도된 트랜스-시그널링에 대한 240.g1의 활성을 도 3b에서 볼 수 있다. 24O.g1은 유력하게 HUVEC에 의한 사람 재조합 IL-6 및 sIL-6R 유도된 MCP-1 생성을 억제하였다. ND50은 64 ± 62 ng/ml (422 ± 409 pM)이었다.

HUVEC에서 IL-17 유도된 내인성 IL-6 및 sIL-6R 유도된 트랜스-시그널링에 대한 240.g1의 활성을 도 3c에서 볼 수 있다. 240.g1은 HUVEC에 의한 IL-17 유도된 내인성 IL-6 및 sIL-6R 유도된 MCP-1 생성을 유력하게 억제하였다. ND50은 93 ± 70 ng/ml (614 ± 462 pM)이었다.

결론

24O.g1은 IL-6 시스-시그널링 검정에서 사람 재조합, 사람 포유동물-유래, 리서스 및 시노몰거스 IL-6의 생체활성을 중화시킬 수 있으나 마우스 IL-6에 대해서는 그렇지 않다. 또한 24O.g1은 재조합 또는 내인성 IL-6에 의해 유도된 IL-6 트랜스-시그널링을 중화시킬 수 있다.

실시예 6: 생체내 활성

IL-6은 급성기(acute phase) 단백질을 유도하는 것으로 공지되어 있다. 마우스에서, 가장 많은 현저한 급성기 단백질은 혈청 아밀로이드 A(SAA)이다. 사람 IL-6은 마우스 수용체 상에서 작용할 수 있어서 사람 IL-6을 마우스에게 주입하고 혈청 중의 SAA 생성을 측정할 수 있다.

Balb/c 마우스에게 부위 3 특이적인 항-hIL-6 항체, CA030_00240.g1 전체 IgG4를 s.c. 주입하였다. 24시간 후, 마우스에게 hIL-6을 30 ㎍/kg (Peprotech 카달로그 번호 200-06, 로트 번호 0203B16)으로 i.p. 주입하였다. 20시간 후, 혈액을 심장 천자에 의해 취하고 ELISA (Tridelta 로트 번호 22KT022)에 의한 혈청 아밀로이드 A(SAA)의 측정을 위해 혈청을 수집하였다. 도 4에 기입한 대로, hIL-6에 의한 SAA 유도는 0.3, 0.1 및 0.03mg/kg의 용량에 기입된 SAA에서의 통계적으로 유의한 감소를 지니며 CA030_00240.g1에 의해 억제되었다.

n=7-8/그룹, 예외로 PBS n=6. 본페로니 포스트 테스트(Bonferroni post test)로 ANOVA에 의한 통계적 분석, **IL-6 단독에 비해 P<0.01.

2회의 추가 실험으로, IL-6 (30ug/kg)-유도된 SAA의 0.3 및 0.1 mg/kg의 용량에서 CA030_240.g1에 의한 현저한 억제를 확인하였다.

실시예 7: CA030 00240. g1 에피토프 맵핑 (Mapping)

CA030_00240.g1이 인식하는 사람 IL-6 상에서의 에피토프를 240.g1을 Fab' 단편으로서 이용한 NMR 기술을 이용하여 맵핑하였다. 이는, 사람 IL-6이 대장균(E. coli)에서 발현되고 ¹⁵N/¹³C/²H 안정한 에피토프로 균일하게 표지될 것을 필요로 한다. 완전한 서열-특이적 백본 공명 어사인먼트(assignement)를 유리 IL-6에 대해 수득하였고 CA030_00240.g1의 Fab' 단편의 결합에 의해 유도된 이러한 신호 위치에서의 변화를 3D TROSY HNCO 스펙트럼을 이용하여 검출하였다.

재조합 사람 IL-6의 발현 및 정제:

사람 IL-6을 단백질의 성숙 형태의 코딩 서열을 함유하는 대장균(E. coli) 발현 벡터(pET3d)로부터 제조하였다. 단백질을 터너(Tuner)(DE3) pLysS 세포에서 발현시켜 고수율의 불용성 생성물을 생성하였다. ¹⁵N, ¹⁵N/¹³C 및 ¹⁵N/¹³C/²H 표지된 IL-6의 샘플을 적합하게 표지된 부화(rich) 배지(Celtone) 상에서 성장시킨 세포로부터 제조하였다.

IL-6을 널리 확립된 공정을 이용하여 형질변환된 대장균(E. coli) 세포로부터 정제하였다. 초기에, 1ℓ의 배양 배지로부터 회수된 세포를 40 mL의 완충액 A[100 mM KCl, 2 mM DTT, 1OmM Tris-HCl pH 8.5, 25 % (w/v) 수크로스, 용해된 프로테아제 억제제 정제(Boehringer)]에 재현탁시켰다. 10 mL의 완충액 B [300 mM Tris- HCl pH 8.5, 100 mM EDTA, 4 mg/ml 리소자임]를 첨가하고, 현탁액을 얼음 위에서 때로 와동시키며 10-30분 동안 인큐베이션시켰다. 50 mL의 완충액 C [1M LiCl, 20 mM EDTA, 0.5 % (v/v) NP-40]을 이후 첨가하고 현탁액을 프렌치 프레스(French Press)를 통해 20,000 psi에서 2회 통과시켰다. 균질액을 이후 16,00Og rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리시키고 펠렛을 유지시켰다. 펠렛을 40 ml의 완충액 D[10 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1 mM EDTA, 0.5 M LiCl, 0.5 % (v/v) NP-40, 1 mM DTT, 용해된 프로테아제 정제]에 재현탁시키고 종전대로 프렌치 프레스를 통과시키고 원심분리하였다. 이 단계를 반복하였다. 이후 펠렛을 40 ml의 완충액 E[10 mM Tris-HCl pH 8.5, 0.1 mM EDTA, 0.5 % (v/v) NP-40, 1 mM DTT, 용해된 프로테아제 정제]에 재현탁시키고 종전대로 프렌치 프레스를 통과시키고 원심분리하였다. 이 단계를 반복하였다. 최종 펠렛을 6 mL 6 M GuHCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0에 용해시키고 48,000 g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리시켜 정화시켰다. 상청액을 유지하고 용해된 IL-6을 분광광도계에 의해 정량하였다.

용해된 IL-6을 5 M GuHCl, 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 2 mM GSH, 0.2 mM GSSG, 1 mM EDTA, pH 8.0에서 2.5 mg/ml로 희석하고 25℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 샘플을 적가식으로 50 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 2 mM GSH, 0.2 mM GSSG, 1 mM EDTA, pH 8.0에서 250 ㎍/mL까지 추가로 희석하고 25℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 이 단계에서 형성된 임의의 침전물을 30,000 g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 제거하였다. 정화된 재료를 50 mM Tris-HCl, 10 % (v/v) 글리세롤, pH 9.0에 대해 최소 16시간 동안 4℃에서 완충액을 2회 변화시키 며 투석하였다. 투석 후, 용액을 30,000 g에서 30분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 정화시켰다. 상청액을 유지하고 8 mL의 monoQ (Amersham Biosciences) 이온 교환 컬럼상에 로딩하고 선형 구배의 염화나트륨(0-1.0 M)으로 용리시켰다. 재폴딩된 IL-6을 함유하는 분획을 SDS-PAGE에 의해 동정한 다음 푸울링시키고 25 mM 인산나트륨, 100 mM NaCl, 0.01 % (w/v) NaN₃, pH 6.5로 디필터링(difilter)하였다.

CA030_00240.g1의 Fab' 단편을 생성하고, 정제하고 25 mM 인산나트륨, 100 mM NaCl, 0.01 % (w/v) NaN₃, pH 6.5에서 제형화하였다. 동일 몰 량의 단백질을 약 0.2-0.6 mM의 농도로 혼합시켜 CA030_00240.g1의 IL-6 및 Fab' 단편간의 1:1 복합물을 NMR 분석을 위해 제조하였다.

NMR 분광법:

25 mM 인산나트륨, 100 mM 염화나트륨 및 0.01% (w/v) 아지드화 나트륨 완충액 (pH 6.5)(95% H₂O 및 5% D₂O) 중의 단백질 및 복합물의 0.35 ml의 샘플 상에서 NMR 실험을 수행하였다. 동일 몰 량의 단백질을 혼합시켜 0.1 mM의 최종 농도를 달성함에 의해 CA030_00240.g1의 ¹⁵N/¹³C/²H 표지된 IL-6 및 비표지된 Fab' 단편간의 1:1 복합물을 NMR 분석을 위해 제조하였다. CA030_00240.g1 복합물의 유리 IL-6 및 IL-6:Fab' 단편에 대해서 삼중-공명(¹⁵N/¹³C/¹H) 크리오프로브(cryoprobe)가 구비된 800 MHz 브러커 어드밴스 스펙트로미터 상에서 NMR 데이터를 수득하였다. 기준 HNCACB, CBCA(CO)NH 및 HNCO 스펙트럼(Wittekind, M., and Mueller, L. (1993) J Magn Reson , Series B 101(2), 201; Grzesiek, S., and Bax, A. (1993) J Biomol NMR 3(2), 185-204; Muhandiram, D. R., and Kay, L. E. (1994) J Magn Reson, Series B 103(3), 203; Grzesiek, S., and Bax, A. (1992) J Magn Reson 96(2), 432)을 이용하여 유리 IL-6에 대해 0.9 mM 균일하게 ¹⁵N/¹³C 표지된 샘플을 이용하여 완전한 서열-특이적 백본 공명 어사인먼트(¹⁵N, ¹³C 및 ¹H)를 제조하였다.

CA030_00240.g1 결합의 Fab' 단편에 의해 유도된 IL-6 백본 신호의 위치에서의 변화를 3D TROSY-HNCO 스펙트럼(Salzmann, M. et al., (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(23), 13585-13590)을 이용하여 검출하였다. 모든 3D NMR 실험에 대한 통상적인 획득 파라미터가 표 1에 제공된다.

모든 스펙트럼을 NMRPipe (Delaglio, F. et al., (1995) J Biomol NMR 6(3), 277-293)를 이용하여 프로세싱하였고, 3D 데이터의 ¹⁵N 디멘션에서 유효한 획득 시간을 약 30 ms까지 연장하기 위해 선형 예측을 이용하였다. 변화된 사인-제곱 함수(shifted sine-squared function)를 이용하여 모든 디멘션에 마일드(mild) 분해 개선을 적용시켰다. 스파키(Sparky)(Goddard, T. D., and Kneller, D. G. SPARKY 3. In., University of California, San Francisco)를 이용하여 스펙트럼을 분석하였다.

Fab 결합 데이터의 분석:

최소 시프트 접근법(minimal shift approach) (Farmer, B. T. et al., (1996) Nat Struct Mol Biol 3(12), 995; Muskett, F. W. et al., (1998) J Biol Chem 273(34), 21736-21743)을 이용하여 CA030_00240.g1 결합의 Fab' 단편으로부터 생성된 IL-6 NMR의 위치의 변화를 측정하였다. 초기에, 유리 IL-6의 3D HNCO 스펙트럼 및 g132E09 Fab에 결합된 IL-6의 3D TROSY-HNCO 스펙트럼에서의 모든 피크를 이들의 중앙에 골라 냈다. 백본 공명의 ¹⁵N 및 ¹H 화학적 시프트 값을 복합물 및 유리 단백질의 스펙트럼 간의 온도 차이에 대해 수정하였다(¹⁵N의 경우 -0.8 ppm 및 ¹H의 경우 -0.05ppm) (Baxter, N. J., and Williamson, M. P. (1997) J Biomol NMR 9(4), 359-369). 유리 및 Fab-결합된 IL-6의 피크에 대한 위치에서의 최소의 변화를 마이크로소프트 엑셀을 이용하여 수득함으로써 Fab 복합물의 TROSY-HNCO 스펙트럼에서 관찰된 모든 피크와 비교하여 유리 단백질의 HNCO 스펙트럼에서 각각 할당된 피크에 대한 ¹⁵N, ¹³C 및 ¹H의 조합된 화학적 시프트 차이를 산출하였다. 조합된 아미드 양성자, 질소 및 탄소 화학적 시프트 차이(Δδ)를 하기 방정식(방정식 1)에 따라 정의하였고, 여기에서 Δδ_HN, Δδ_N 및 Δδ_C는 비교된 HNCO 피크 쌍 사이의 ¹H, ¹⁵N 및 ¹³C 시프트의 차이에 상응하고 α_N 및 α_C는 아미드 양성자, 아미드 질소 및 탄소 화학적 시프트의 범위내에 있는 차이를 설명하는데 필요한 0.2 및 0.33의 크기조정(scaling) 인자이다. 각 개별적인 HNCO 피크에 대해서, Fab 결합에 의해 유도된 최소의 시프트를 가능한 가장 낮은 조합된 시프트 값(Δδ)으로서 취하였다.

IL-6 상의 Fab 결합 부위(에피토프)를 동정하기 위해, 조합된 최소 시프트 대 단백질 서열의 히스토그램을 이용하여 현저하게 교란된 신호를 함유하는 IL-6의 영역을 드러내었다. 개개 아미노산에 대해 조합된 화학적 시프트 변화의 크기가 모든 아미노산에 대해 조합된 화학적 시프트 변화의 평균의 역치값 + 그 평균으로부터의 1 표준 편차를 초과하는 경우, 이러한 잔기를 Fab 결합 부위에서의 가능한 접촉 잔기로서 추가의 조사를 위해 선택하였다. 후보가 되는 결합 부위 잔기의 위치를 IL-6의 고 분해 구조상에서 마지막으로 조사하고(Xu, G. Y. et al.,, (1997) J Mol Biol 268(2), 468-481) 단백질 표면에 정위된 잔기만을 Fab 결합에 이용할 수 있는 것으로 고려하였다.

평균 최소 시프트 + 1SD (0.143) 및 평균 최소 시프트 + 2SD (0.213)의 두 상이한 역치를 적용시켜 Fab에 의해 결합된 잔기를 동정하였다. 항체의 결합 부위는 Trp157의 임계 부위 3 서명 잔기를 포함하는 것으로 밝혀졌다(Boulanger et al., 2003, Science, 300, 2101-2104). 상술한 보랑거(Boulanger) 등에 사용된 아미노산 넘버링을 이용하여, 항체 24Og.1이 적어도 하기 잔기에 결합되는 것이 밝혀졌다(평균 + 2SD (0.213)) S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 및 S169. 항체는 하기 잔기 모두에 결합될 수 있다(평균 + 1SD (0.143)) C44, S47, C50, S53, A58, E93, V96, Rl04, F105, E106, T149, K150, Q152, A153, Q154, N155, Q156, W157, Q159, T163, L165, S169 및 E172.

동일한 잔기가 IL-6의 비프로세싱된 전구체의 아미노산 넘버링에 기초하여 넘버링될 수도 있음이 이해될 것이다(Swiss Prot Accession number P05231). 상기 넘버링을 이용하여 항체 24Og.1이 적어도 하기 잔기에 결합된다: S75, C78, E121, R132, F133, E134, T177, K178, A181, Q182, Q187 및 S197. 항체는 하기 잔기 모두에 결합될 수 있다: C72, S75, C78, S81, A86, E121, V124, R132, F133, E134, T177, K178, Q180, A181, Q182, N183, Q184, W185, Q187, T191, L193, S197 및 E200.

표 1: NMR 실험의 기본 파라미터

직접 ¹H 디멘션(F3 또는 F2)을 14 ppm의 스윕(sweep) 폭 및 85 ms의 획득 시간으로 획득하였다.

본 발명이 단지 실시예에 의해 기술되었으나 이것이 조금이라도 제한하고자 하는 것이 아니며 상세한 설명의 개질이 하기 청구범위 내에서 이루어질 수 있음이 당연히 이해될 것이다. 본 발명의 각 구체예의 바람직한 특징은 필요한 변경을 가하여 다른 구체예 각각에 대해서도 동일하다. 특허 및 특허 출원을 포함하나 이로 제한되는 것은 아닌 본 명세서에 인용된 모든 공개문헌이, 이들 개개의 공개문헌이 구체적으로 및 개별적으로 완전히 기술된 대로 본원에 참조로서 포함된다고 표시되어 있는 것처럼 참조로서 본원에 포함된다 .

SEQUENCE LISTING <110> UCB S.A. gelinas, richard popplewell, andrew adams, ralph singhal, mitra zhang, yi <120> Antibody molecules having specificity for human IL-6 <130> A0018 <160> 22 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Rattus rattus <400> 1 gaggtgcaaa ttttggagac tggaggaggc ttggtgaagc ccggtggttc cctgagactg 60 tcttgtgcaa cgtctggatt caacttcaat gattatttca tgaactgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg gactagagtg gcttgctcaa atgagaaaca aaaattatca atatggcaca 180 tattatgcgg agtctttgga aggcagagtc acagtctcac gagacgatgc caaaaacagt 240 gtctacctgc aagtgagcag tttaagagct gaggacacgg ccatttatta ctgtacaaga 300 gagtcatact acggctttac ctcctactgg ggccaaggag tcatggtcac agtctcg 357 <210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 2 Glu Val Gln Ile Leu Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ala Gln Met Arg Asn Lys Asn Tyr Gln Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Leu Glu Gly Arg Val Thr Val Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Val Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Glu Ser Tyr Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 321 <212> DNA <213> Rattus rattus <400> 3 gacatccaga tgacacagtc tcctgcctcc ctgtctgcat ctctggaaga aattgtcacc 60 atcacatgcc aggcaagcca ggacattggt atttctttat catggtatca gcagaaacca 120 gggaggactc ctcagctcct gatccaaaat gcaaacaact tggcagatgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gccgtagatt tggcacacag ttttctctta cgatcagtac accacaggtt 240 gaagatactg gagtctatta ctgtctccag cataatagtg ctccgtacac gtttggaact 300 gggacccagc tggaaatcaa a 321 <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Glu 1 5 10 15 Glu Ile Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ile Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Thr Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Gln Asn Ala Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Arg Phe Gly Thr Gln Phe Ser Leu Thr Ile Ser Thr Pro Gln Val 65 70 75 80 Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Thr Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 5 Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr Phe Met Asn 1 5 10 <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 6 Gln Met Arg Asn Lys Asn Tyr Gln Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Gly <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 7 Glu Ser Tyr Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr 1 5 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 8 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ile Ser Leu Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 9 Asn Ala Asn Asn Leu Ala Asp 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 10 Leu Gln His Asn Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5 <210> 11 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> gH13 <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Met Arg Asn Lys Asn Tyr Gln Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Tyr Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> gH13 <400> 12 gaagtccagc tcgttgagag tggcggtggc ctggtccagc ccggtggatc actccgactg 60 tcctgcgctg caagcgggtt taattttaat gattacttca tgaactgggt tcggcaggca 120 cctggcaaag gcctggaatg ggtggctcag atgaggaaca agaattatca gtacgggaca 180 tactatgccg agagtctgga gggaaggttc accatctcca gggacgattc taagaacagc 240 ctctaccttc agatgaactc tttgaaaacc gaggacacag ccgtgtacta ttgtgctaga 300 gaaagttatt acgggttcac atcttattgg ggacagggaa ccctggtgac tgtctcgagc 360 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> gL10 <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ile Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 14 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> gL10 <400> 14 gatatccaga tgactcaatc acccagttcc ctgagcgcct ctgtcggcga cagggtgacc 60 atcacatgcc aggcctctca agacattggc atcagcctgt cctggtacca gcaaaaaccc 120 ggcaaggccc ctaagctcct gatctacaat gctaacaacc tggccgatgg cgtgcctagt 180 aggtttagcg ggtctggttc cggaacagat ttcacactca ccatcagctc actgcagccc 240 gaggacttcg ccacttacta ttgcctgcag cacaacagcg ccccctacac cttcggacaa 300 ggcactaaac tggagatcaa gcgt 324 <210> 15 <211> 2008 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 240g1 heavy chain <400> 15 atggagtgga gctgggtgtt tttgttcttc ctgtccgtga ccacaggcgt gcactctgaa 60 gtccagctcg ttgagagtgg cggtggcctg gtccagcccg gtggatcact ccgactgtcc 120 tgcgctgcaa gcgggtttaa ttttaatgat tacttcatga actgggttcg gcaggcacct 180 ggcaaaggcc tggaatgggt ggctcagatg aggaacaaga attatcagta cgggacatac 240 tatgccgaga gtctggaggg aaggttcacc atctccaggg acgattctaa gaacagcctc 300 taccttcaga tgaactcttt gaaaaccgag gacacagccg tgtactattg tgctagagaa 360 agttattacg ggttcacatc ttattgggga cagggaaccc tggtgactgt ctcgagcgct 420 tctacaaagg gcccatccgt cttccccctg gcgccctgct ccaggagcac ctccgagagc 480 acagccgccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 540 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 600 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac gaagacctac 660 acctgcaacg tagatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tggtgagagg 720 ccagcacagg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agccctcctg cctggacgca 780 ccccggctgt gcagccccag cccagggcag caaggcatgc cccatctgtc tcctcacccg 840 gaggcctctg accaccccac tcatgcccag ggagagggtc ttctggattt ttccaccagg 900 ctccgggcag ccacaggctg gatgccccta ccccaggccc tgcgcataca ggggcaggtg 960 ctgcgctcag acctgccaag agccatatcc gggaggaccc tgcccctgac ctaagcccac 1020 cccaaaggcc aaactctcca ctccctcagc tcagacacct tctctcctcc cagatctgag 1080 taactcccaa tcttctctct gcagagtcca aatatggtcc cccatgccca ccatgcccag 1140 gtaagccaac ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga caggtgccct agagtagcct 1200 gcatccaggg acaggcccca gccgggtgct gacgcatcca cctccatctc ttcctcagca 1260 cctgagttcc tggggggacc atcagtcttc ctgttccccc caaaacccaa ggacactctc 1320 atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc gtggtggtgg acgtgagcca ggaagacccc 1380 gaggtccagt tcaactggta cgtggatggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 1440 cgggaggagc agttcaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1500 gactggctga acggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaaggcct cccgtcctcc 1560 atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt gggacccacg gggtgcgagg gccacatgga 1620 cagaggtcag ctcggcccac cctctgccct gggagtgacc gctgtgccaa cctctgtccc 1680 tacagggcag ccccgagagc cacaggtgta caccctgccc ccatcccagg aggagatgac 1740 caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc taccccagcg acatcgccgt 1800 ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga 1860 ctccgacggc tccttcttcc tctacagcag gctaaccgtg gacaagagca ggtggcagga 1920 ggggaatgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacacagaa 1980 gagcctctcc ctgtctctgg gtaaatga 2008 <210> 16 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 240g1 heavy chain <400> 16 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Phe Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Gln Met Arg Asn Lys Asn Tyr Gln Tyr Gly Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Leu Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Ser Tyr Tyr Gly Phe Thr Ser Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val 225 230 235 240 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 245 250 255 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu 260 265 270 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 275 280 285 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 290 295 300 Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 305 310 315 320 Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile 325 330 335 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro 340 345 350 Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu 355 360 365 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 370 375 380 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 385 390 395 400 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 405 410 415 Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 420 425 430 His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 445 <210> 17 <211> 705 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 240g1 light chain <400> 17 atgagcgtgc ctacccaggt cctcggcctg ttgctgctct ggctgaccga tgcccgctgc 60 gatatccaga tgactcaatc acccagttcc ctgagcgcct ctgtcggcga cagggtgacc 120 atcacatgcc aggcctctca agacattggc atcagcctgt cctggtacca gcaaaaaccc 180 ggcaaggccc ctaagctcct gatctacaat gctaacaacc tggccgatgg cgtgcctagt 240 aggtttagcg ggtctggttc cggaacagat ttcacactca ccatcagctc actgcagccc 300 gaggacttcg ccacttacta ttgcctgcag cacaacagcg ccccctacac cttcggacaa 360 ggcactaaac tggagatcaa gcgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca 420 tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 480 cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 540 gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 600 ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 660 ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 705 <210> 18 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 240g1 light chain <400> 18 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ile Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Asn Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 19 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp His 20 25 30 Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Thr Arg Asn Lys Ala Asn Ser Tyr Thr Thr Glu Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg 100 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 15 <210> 21 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10

Claims (34)

1. 중쇄를 포함하며 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화(neutralising) 항체로서,

   중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1의 경우 서열번호 5로 제공된 서열을 지니는 CDR, CDR-H2의 경우 서열번호 6으로 제공된 서열을 지니는 CDR 및 CDR-H3의 경우 서열번호 7로 제공된 서열을 지니는 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체.
2. 제 1항에 있어서, 중쇄의 가변 도메인이 CDR-H1의 경우 서열번호 5로 제공된 서열, CDR-H2의 경우 서열번호 6으로 제공된 서열 및 CDR-H3의 경우 서열번호 7로 제공된 서열을 포함하는 중화 항체.
3. 경쇄를 포함하며 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체로서,

   경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1의 경우 서열번호 8로 제공된 서열을 지니는 CDR, CDR-L2의 경우 서열번호 9로 제공된 서열을 지니는 CDR 및 CDR-L3의 경우 서열번호 10으로 제공된 서열을 지니는 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체.
4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 경쇄를 추가로 포함하며, 경쇄의 가변 도메인 이 CDR-L1의 경우 서열번호 8로 제공된 서열을 지니는 CDR, CDR-L2의 경우 서열번호 9로 제공된 서열을 지니는 CDR 및 CDR-L3의 경우 서열번호 10으로 제공된 서열을 지니는 CDR 중 적어도 하나를 포함하는 중화 항체.
5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서, 경쇄의 가변 도메인이 CDR-L1의 경우 서열번호 8로 제공된 서열, CDR-L2의 경우 서열번호 9로 제공된 서열 및 CDR-L3의 경우 서열번호 10으로 제공된 서열을 포함하는 중화 항체.
6. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 중쇄가 서열 gH13 (서열번호 11)을 포함하는 항체.
7. 제 1항 내지 제 5항 중의 어느 한 항에 있어서, 경쇄가 서열 gL10 (서열번호 13)을 포함하는 항체.
8. 서열 gH13 (서열번호 11)을 포함하는 중쇄 및 서열 gL10 (서열번호 13)을 포함하는 경쇄를 지니는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체.
9. 경쇄의 가변 도메인이 제 8항의 항체의 경쇄 가변 도메인과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하고 중쇄의 가변 도메인이 제 8항의 항체의 중쇄 가변 도메인과 60% 이상의 동일성 또는 유사성을 지니는 서열을 포함하는 사 람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체.
10. 서열번호 2로 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 4로 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 지니는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체.
11. 서열번호 16으로 제공된 서열을 포함하는 중쇄 및 서열번호 18로 제공된 서열을 포함하는 경쇄를 지니는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체.
12. 중쇄 및 경쇄가 제 11항의 항체의 상응하는 중쇄 및 경쇄와 60% 이상 동일하거나 유사한 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체.
13. 사람 IL-6에 대해 500 pM 또는 이보다 양호한 결합 친화력을 지니는 사람화된 중화 항체 또는 완전한 사람 중화 항체.
14. 사람 IL-6에 대해 50 pM 또는 이보다 양호한 결합 친화력을 지니는 사람화된 중화 항체, 완전한 사람 중화 항체 또는 키메라 중화 항체.
15. 제 8항의 항체에 의해 결합되는 사람 IL-6 상의 에피토프.
16. 제 15항에 있어서, 사람 IL-6의 아미노산 잔기 S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 및 S169를 포함하는 에피토프.
17. 제 16항에 있어서, 아미노산 잔기 S47, C50, E93, R104, F105, E106, T149, K150, A153, Q156, Q159 및 S169, 및 C44, S53, A58, V96, Q152, Q154, N155, W157, T163, L165 및 E172로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하는 에피토프.
18. 제 15항, 제 16항 또는 제 17항의 에피토프에 결합되는, 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 사람화된 중화 항체, 완전한 사람 중화 항체 또는 키메라 중화 항체.
19. 사람 IL-6에 대한 제 8항의 항체의 결합을 교차-차단(cross-block)하거나 사람 IL-6과의 결합이 제 8항의 항체에 의해 교차-차단되는 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 사람화된 중화 항체, 완전한 사람 중화 항체 또는 키메라 중화 항체.
20. 0.038 nM 사람 IL-6의 활성을 100 pM 미만의 농도에서 50%까지 억제할 수 있고, 상기 억제 활성이 T1165 세포의 IL-6 유도된 증식에 대해 측정된 것인, 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체.
21. 3.84 nM 사람 IL-6의 활성을 1 nM 미만의 농도에서 50%까지 억제할 수 있고, 상기 억제 활성이 사람 IL-6 및 sIL-6R에 반응하는 HUVEC에 의한 MCP-1의 생성에 대해 측정된 것인, 사람 IL-6에 대해 특이성을 지니는 중화 항체.
22. 제 20항 또는 제 21항에 있어서, 제 8항의 항체가 사람 IL-6에 결합하는 것을 교차 차단하는 중화 항체.
23. 제 19항 내지 제 22항 중의 어느 한 항에 있어서, 사람 IL-6에 대해 50 pM 또는 이보다 양호한 결합 친화력을 지니는 항체.
24. 제 1항 내지 제 14항 또는 제 18항 내지 제 23항 중의 어느 한 항에 따른 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 엔코딩하는 단리된 DNA 서열.
25. 제 24항에 있어서, 중쇄를 엔코딩하는 DNA 서열이 서열번호 12 또는 서열번호 15로 제공된 서열 또는 서열번호 15의 누클레오티드 58-2008을 포함하는 단리된 DNA 서열.
26. 제 24항에 있어서, 경쇄를 엔코딩하는 DNA 서열이 서열번호 14 또는 서열번호 17로 제공된 서열 또는 서열번호 17의 누클레오티드 61-705를 포함하는 단리된 DNA 서열.
27. 제 24항 내지 제 26항 중의 어느 한 항에 따른 하나 이상의 DNA 서열을 포함 하는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터.
28. 제 27항에 있어서, 벡터가 서열번호 15로 제공된 서열 및 서열번호 17로 제공된 서열을 포함하는 벡터.
29. 제 27항 또는 제 28항에 따른 하나 이상의 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
30. 제 29항의 숙주 세포를 배양하고 항체를 단리시키는 것을 포함하여, 사람 IL-6에 대해 결합 특이성을 지니는 항체를 제조하는 방법.
31. 제 1항 내지 제 14항 또는 제 18항 내지 제 23항 중의 어느 한 항에 따른 항체를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
32. 제 31항에 있어서, 다른 활성 성분을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
33. IL-6에 의해 매개되거나 IL-6의 증가된 수준과 관련된 병리적 질병을 치료하거나 예방하는데 이용되는 제 1항 내지 제 14항 또는 제 18항 내지 제 23항 중의 어느 한 항에 따른 항체 또는 제 31항 또는 제 32항에 따른 약제학적 조성물.
34. IL-6에 의해 매개되거나 IL-6의 증가된 수준과 관련된 병리적 질병을 치료 또는 예방하기 위한 약제의 제조에서 사람 IL-6에 대해 500 pM 또는 이보다 양호한 결합 친화력을 지니는 사람화된 중화 항체 또는 완전한 사람 중화 항체의 용도.

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