ES2343351T3 - Procedimientos y composiciones para inhibir la lesion por reperfusion mediada por inmunoglobulina. - Google Patents
Procedimientos y composiciones para inhibir la lesion por reperfusion mediada por inmunoglobulina. Download PDFInfo
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Abstract
Una inmunoglobulina aislada que actúa como mediador en la lesión de tejidos posterior a una reperfusión, o parte de unión a antígeno de la misma, que tiene una CDR1 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 4 y una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 6.
Description
Procedimiento y composiciones para inhibir la
lesión por reperfusión mediada por inmunoglobulina.
El sistema del complemento participa tanto en la
inmunidad innata como en la inmunidad adaptativa
(Muller-Eberhard, H.J. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57,
321-347; Carroll, M.C. (1998) Ann. Rev. Immunol 16,
545-568; Fearon y col., (1995) Annu. Rev. Immunol
13, 127-149). Estudios recientes que usan ratones
deficientes en componentes específicos del complemento del suero o
receptores del complemento (por ejemplo, CD21/CD35) no sólo han
confirmado muchos papeles conocidos del complemento, sino que han
proporcionado nuevas perspectivas sobre mecanismos importantes en la
inmunidad natural y adaptativa (Carroll, M.C. (1998) supra).
Por ejemplo, un mecanismo por medio del cual el complemento potencia
la generación de respuestas de memoria a antígenos dependientes de
células T es mediando una señal de supervivencia en células B del
centro germinal (CG) a través del co-receptor
CD21/CD19/Tapa-1. Como alternativa, los ratones
deficientes han sido importantes para confirmar la importancia de
identificar la ruta clásica como esencial para la inducción de
lesiones (Weiser y col., (1996) J. Exp. Med.
1857-1864).
La lesión por
isquemia-reperfusión (I/R) se refiere a una lesión
inflamatoria en el endotelio y tejidos del parénquima subyacentes
después de la reperfusión de tejidos hipóxicos. Es un síndrome
general que es responsable tanto de la lesión aguda como de la
lesión crónica en diversos tejidos que incluyen, por ejemplo, el
miocardio, sistema nervioso central, extremidades inferiores e
intestino. La lesión por isquemia-reperfusión puede
producir necrosis y lesiones celulares irreversibles. Por ejemplo,
la reperfusión del músculo esquelético isquémico produce una lesión
en las células endoteliales caracterizada por fuga vascular con
edema de permeabilidad (Weiser y col., (1996) J. Exp. Med.
1857-1864) y la reperfusión del intestino delgado
conduce a la destrucción de la mucosa (Williams, y col., (1999) J.
Appl. Physiol., 938-942). En general, cuanto mayor
es el periodo de isquemia más pronunciada es la respuesta
inflamatoria. El grado de lesión por I/R también se determina por
factores tales como el tamaño de la región isquémica y los tejidos
particulares implicados (Williams, y col., (1999) J. Appl.Physiol.,
93 8-942).
Un mediador importante de la lesión por I/R es
el sistema del complemento. Weisman y col. informaron sobre un
mecanismo para bloquear parcialmente la lesión por I/R usando un
inhibidor soluble del complemento C3b (sCR1) en un modelo cardiaco
de rata (Weisman y col. (1990) Science 249,
146-151). El receptor CR1 soluble es muy eficaz para
inactivar la C3 convertasa, es decir, el complejo enzimático que
convierte C3 nativo en su forma C3b activa. El receptor CR1 actúa
tanto como cofactor en la escisión por el factor I de C3b como en el
desplazamiento de C3b de la convertasa. La inyección intravenosa en
ratones de sCR1 antes de la inducción de isquemia redujo
significativamente la lesión tras la reperfusión de los animales
tratados. El examen histológico de los animales tratados reveló una
reducción en el nivel de deposición del complemento en el músculo
cardíaco y en el grado de lesión en el tejido (Weisman y col. (1990)
supra). Se obtuvieron resultados similares pretratando
ratones con sCR1 en un modelo de lesión en extremidades inferiores
(Hill y col. (1992) J. Immunol. 149, 1723-1730). En
este modelo, se bloqueó el flujo sanguíneo a la extremidad inferior
durante aproximadamente 2 horas poniendo un torniquete en la
extremidad inferior. Antes de restablecer el flujo sanguíneo a los
tejidos, a los ratones se les administró albúmina radioyodada por
vía intravenosa como marcador de permeabilidad.
Aunque estos estudios determinan que la lesión
estaba mediada por el complemento no trataban la cuestión del
mecanismo de inicio de la lesión. Weiser y col. han demostrado que
los ratones deficientes en anticuerpo están parcialmente protegidos
de la lesión en el modelo de extremidad inferior. La lesión se
restaura por reconstitución con suero de ratón normal. Williams y
col. ampliaron esta observación al modelo de intestino delgado y
demostraron que la IgM purificada era suficiente para restaurar la
lesión en los ratones deficientes en anticuerpo.
Hechtman y col. (1998), FASEB Journal Volumen
12, página a34, examinaron el papel de IgM procedente de células
B1-a de un modelo murino de
isquemia-reperfusión intestinal. Concluyeron que la
lesión local después de la isquemia-reperfusión
intestinal depende de la IgM natural procedente de células
B1-a peritoneales.
Austin y col. (1998) Surgical Forum, Volumen 49,
páginas 341-342 compararon la respuesta de ratones
de tipo silvestre a la isquemia-reperfusión
intestinal con ratones deficientes en células B1 peritoneales, y
determinaron que la IgM derivada de células B1 peritoneales media la
lesión local después de la isquemia-reperfusión
intestinal.
La presente invención se basa, en parte, en la
identificación de inmunoglobulinas (Ig) patógenas, en particular IgM
patógenas, que reconocen un antígeno específico de isquemia. Sin
quedar ligado a teoría alguna, se cree que la unión de estas IgM
patógenas a un antígeno específico de isquemia desencadena, entre
otras cosas, la activación de la ruta del complemento, lo cual
finalmente tiene como resultado una lesión por reperfusión o
isquémica. Los solicitantes también descubrieron que las IgM
patógenas se producen por una subpoblación de células B, denominadas
en la presente memoria "células B-1":
La presente invención proporciona una
inmunoglobulina aislada que actúa de mediador en lesiones tisulares
después de la reperfusión, de acuerdo con la reivindicación 1.
Por consiguiente, también se describe un
procedimiento para tratar o prevenir una lesión por reperfusión o
isquémica mediada por inmunoglobulina en un sujeto, que comprende
administrar al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de una
interacción entre una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM
patógena, y un antígeno específico de isquemia, con lo que se reduce
el número de inmunoglobulinas patógenas unidas al antígeno
específico de isquemia, de tal forma que se inhibe o se reduce la
lesión.
En una realización preferida, la lesión por
reperfusión o isquémica se produce después de un episodio natural,
por ejemplo, como un ictus. La lesión por reperfusión o isquémica
puede producirse durante y/o después de un procedimiento quirúrgico.
Los procedimientos quirúrgicos ejemplares que produce la lesión
incluyen una técnica correctiva de vasos seleccionada entre el grupo
consistente en angioplastia, procedimiento de colocación de
endoprótesis vascular, aterectomía y cirugía de revascularización.
En una realización preferida, la lesión por reperfusión o isquemia
se produce en un tejido cardiovascular, por ejemplo, el corazón.
Preferentemente, el inhibidor antagoniza la
inmunoglobulina patógena mediante una o más de las siguientes
actividades: (i) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo,
unión) entre la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de
isquemia; (ii) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, unión)
entre la inmunoglobulina patógena y un componente de la ruta del
complemento; (iii) neutraliza la inmunoglobulina patógena, por
ejemplo secuestrando la inmunoglobulina y/o fijando como objetivo su
degradación; o (iv) inhibe o reduce la producción de la
inmunoglobulina patógena, por ejemplo, bloquea la síntesis,
ensamblaje y/o modificaciones postraduccionales del anticuerpo
patógeno. El inhibidor puede ser una proteína o un péptido; una
molécula pequeña; un anticuerpo o un fragmento del mismo, por
ejemplo, un anticuerpo anti-idiotípico; un
carbohidrato; o una glicoproteína. En otra realización preferida, el
inhibidor puede ser un anticuerpo modificado como se describe en la
presente memoria. En una realización preferida, el inhibidor se
administra en una o en exposiciones secuenciales durante un periodo
de horas, días, semanas, meses o años. El inhibidor puede
administrarse antes, durante y/o después de un episodio natural que
produce la lesión. El inhibidor también puede administrarse antes,
durante y/o después de un procedimiento quirúrgico, por ejemplo un
procedimiento quirúrgico asociado con lesión por reperfusión o
isquémica. En una realización preferida, el inhibidor se administra
en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, un
agente anti-coagulación, un inhibidor del
complemento.
En otro aspecto, también se describe un
procedimiento para tratar o prevenir una lesión por reperfusión o
isquémica mediada por inmunoglobulina, en un sujeto, que comprende
administrar al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de una
interacción entre una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM
patógena, y un componente de la ruta del complemento, con lo que se
reduce el número de inmunoglobulinas patógenas que activan la
actividad del complemento, de tal forma que se inhibe o reduce la
lesión.
En realizaciones preferidas, la inmunoglobulina
patógena es una IgM o una IgG (por ejemplo, una IgG1 e IgG3).
Preferentemente, la inmunoglobulina patógena es una IgM y más
preferentemente es una subclase de IgM. En otra realización
preferida, la inmunoglobulina patógena se produce por una
subpoblación de células B, por ejemplo, células B-1.
La inmunoglobulina patógena puede tener una región variable de
cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID Nº: 2, y una región variable de cadena pesada que
comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 8.
En una realización preferida, el antígeno específico de isquemia
está presente en la superficie de una célula endotelial y/o tejido
parenquimático.
En realizaciones preferidas, la ruta del
complemento es una ruta clásica del complemento, y el componente de
la ruta del complemento puede ser una molécula C1 o una subunidad de
la misma (por ejemplo, C1q). En otra realización, el sujeto es un
mamífero, por ejemplo un roedor (por ejemplo, un ratón) o un primate
(por ejemplo, un ser humano).
En una realización preferida, la lesión por
reperfusión o isquémica se produce después de un episodio natural,
por ejemplo, como un ictus. La lesión por reperfusión o isquémica
puede producirse durante y/o después de un procedimiento quirúrgico.
Los procedimientos quirúrgicos ejemplares que producen la lesión
incluyen una técnica correctiva de vasos seleccionada entre el grupo
consistente en angioplastia, procedimiento de colocación de
endoprótesis vascular, aterectomía y cirugía de revascularización.
En una realización preferida, la lesión por reperfusión o isquémica
se produce en un tejido cardiovascular, por ejemplo, el corazón.
Preferentemente, el inhibidor antagoniza la
inmunoglobulina patógena mediante una o más de las siguientes
actividades: (i) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo,
unión) entre la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de
isquemia; (ii) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, unión)
entre la inmunoglobulina patógena y un componente de la ruta del
complemento; (iii) neutraliza la inmunoglobulina patógena, por
ejemplo secuestrando la inmunoglobulina y/o fijando como objetivo su
degradación; o (iv) inhibe o reduce la producción de la
inmunoglobulina patógena, por ejemplo, bloquea la síntesis,
ensamblaje y/o modificaciones postraduccionales del anticuerpo
patógeno. El inhibidor puede ser una proteína o un péptido; una
molécula pequeña; un anticuerpo o un fragmento del mismo, por
ejemplo, un anticuerpo anti- idiotípico; un carbohidrato; o una
glicoproteína. En otra realización preferida, el inhibidor puede ser
un anticuerpo modificado como se describe en la presente memoria. En
una realización preferida, el inhibidor se administra en una o en
exposiciones secuenciales durante un periodo de horas, días,
semanas, meses o años. El inhibidor puede administrarse antes,
durante y/o después de un episodio natural que produce la lesión. El
inhibidor también puede administrarse antes, durante y/o después de
un procedimiento quirúrgico, por ejemplo un procedimiento quirúrgico
asociado con lesión por reperfusión o isquémica. En una realización
preferida, el inhibidor se administra en combinación con otros
agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente
anti-coagulación, un inhibidor del complemento.
También se describe un procedimiento para tratar
o prevenir una lesión por reperfusión o isquémica mediada por
inmunoglobulina en un sujeto, que comprende retirar del sujeto o
inactivar una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM
patógena como se describe en la presente memoria, y/o células B que
producen la inmunoglobulina patógena (por ejemplo, células
B-1, como se describe en la presente memoria), con
lo que se reduce la cantidad de inmunoglobulina patógena y/o células
B presentes en el sujeto.
En una realización preferida, la etapa de
retirada o inactivación se realiza ex vivo. En una
realización, las inmunoglobulinas patógenas o células B pueden
retirarse por hemoperfusión. En otra realización, las células B
pueden retirarse usando un anticuerpo específico de células B (por
ejemplo, un anticuerpo anti-B-1 o un
anticuerpo anti-CD5 o
anti-CD11G/CD18). La inmunoglobulina patógena, por
ejemplo, una IgM, puede retirarse poniendo en contacto sangre de un
sujeto con un antígeno inmovilizado (por ejemplo, un antígeno
específico de isquemia) o un anticuerpo
anti-idiotípico inmovilizado. En una realización
preferida, la etapa de retirada o inactivación de la inmunoglobulina
patógena se realiza administrando un anticuerpo anti- antidiotípico
al sujeto. En otra realización, la etapa de retirada o inactivación
de la célula B se realiza administrando al sujeto un resto que se
dirige a las células B (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de
unión a antígeno del mismo, o un antígeno) acoplado a una toxina,
por ejemplo ricina o toxina diftérica. En una realización preferida,
el sujeto es un mamífero, por ejemplo un roedor (por ejemplo, un
ratón) o un primate (por ejemplo, un ser humano). En una realización
preferida, la lesión por reperfusión o isquémica se produce después
de un episodio natural, por ejemplo, como un ictus. Preferentemente,
la etapa de retirada se realiza en el periodo de minutos, de una a
cinco horas, de cinco a diez horas, de diez a veinte horas, o de uno
a cinco días, posterior al episodio natural. En una realización
preferida, la lesión por reperfusión o isquémica se produce en un
tejido cardiovascular, por ejemplo, el corazón. En otra realización,
la lesión por reperfusión o isquémica se previene y/o reduce
retirando del sujeto la inmunoglobulina patógena y/o las células B
antes, durante y/o después del procedimiento quirúrgico. Por
ejemplo, la etapa de retirada puede realizarse al menos de una a
cinco horas, de cinco a diez horas, de diez a veinte horas, o uno,
dos o tres días antes al procedimiento quirúrgico. La etapa de
retirada también puede continuarse durante intervalos de tiempo
apropiados durante y después del procedimiento quirúrgico.
También se describe una inmunoglobulina patógena
aislada, por ejemplo, una IgM patógena como se describe en la
presente memoria. Preferentemente, la inmunoglobulina patógena tiene
una o más de las siguientes propiedades: (i) es capaz de
interaccionar con un antígeno específico de isquemia; (ii) es capaz
de fijarse al complemento; o (iii) se produce por una subpoblación
de células B. En una realización preferida, la inmunoglobulina
patógena se produce por una subpoblación de células B, por ejemplo,
células B-1. La inmunoglobulina patógena puede tener
una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 8. En otra realización, la
inmunoglobulina patógena tiene una región variable de cadena pesada
que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº:
2. En otra realización, la inmunoglobulina patógena interacciona con
(por ejemplo, se une a) un antígeno específico de isquemia que está
presente en la superficie de una célula endotelial.
En otro aspecto, en la presente memoria se
describe una inmunoglobulina patógena, por ejemplo una IgM patógena
como se describe en la presente memoria. En una realización
preferida, la inmunoglobulina patógena interacciona con (por
ejemplo, se une a) un antígeno específico de isquemia. La
inmunoglobulina patógena puede proporcionar una capacidad reducida
de activar el complemento. En una realización preferida, la
inmunoglobulina patógena tiene una o más sustituciones, deleciones
y/o inserciones de aminoácidos. Por ejemplo, uno o más de los restos
aminoacídicos implicados en la unión y/o activación del complemento
están mutados. En otra realización, el anticuerpo patógeno, o parte
de unión a antígeno del mismo, tiene una región variable de cadena
ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8
o un fragmento de la misma. En otras realizaciones, el anticuerpo
patógeno comprende al menos la región CDR1 de la SEC ID Nº: 10, o
partes de unión a antígeno de la misma, y/o al menos una región CDR2
de la SEC ID Nº: 12, o una parte de unión a antígeno de la misma.
Preferentemente, el anticuerpo patógeno comprende al menos la región
CDR1 de la SEC ID Nº: 10 y la región CDR2 de la SEC ID Nº: 12, o
partes de unión a antígeno de las mismas. En otra realización, el
anticuerpo patógeno, o parte de unión a antígeno del mismo, tiene
una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o un fragmento de la misma. En otras
realizaciones, el anticuerpo patógeno comprende al menos la región
CDR1 de la SEC ID Nº: 4, o partes de unión a antígeno de la misma
y/o al menos una región CDR2 de la SEC ID Nº: 6 o una parte de unión
a antígeno de la misma. Preferentemente, el anticuerpo patógeno
comprende al menos la región CDR1 de la SEC ID Nº: 4, y la región
CDR2 de la SEC ID Nº: 6, o partes de unión a antígeno de las
mismas.
En otra realización, el anticuerpo patógeno, o
parte de unión a antígeno del mismo, tiene una región variable de
cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en
la SEC ID Nº: 8, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, y
una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2, o un fragmento de unión a
antígeno de la misma. En otra realización, el anticuerpo patógeno
puede ser un anticuerpo no humano, por ejemplo un anticuerpo de
vaca, cabra, ratón, rata, oveja, cerdo o conejo. Preferentemente, el
anticuerpo no humano es un anticuerpo murino. El anticuerpo patógeno
puede ser un anticuerpo recombinante. En una realización preferida,
el anticuerpo patógeno es un anticuerpo humanizado.
También se describe un procedimiento para aislar
un antígeno específico de isquemia, que comprende proporcionar una
inmunoglobulina patógena, por ejemplo una IgM patógena, por ejemplo
una IgM patógena descrita en la presente memoria, poner en contacto
una muestra que contiene el antígeno específico de isquemia, por
ejemplo, un aislado bioquímico (por ejemplo, un aislado de células
endoteliales), o una colección de proteínas (por ejemplo, una
biblioteca de expresión) con la inmunoglobulina patógena en
condiciones que permiten la unión específica de la inmunoglobulina
patógena a la muestra, detectar cualquier cambio en el nivel de
unión del anticuerpo patógeno a la muestra con respecto a un
control, indicando un cambio en el nivel de unión de la
inmunoglobulina patógena en presencia de la muestra con respecto al
detectado en el control una unión específica, y aislar, por ejemplo,
purificar, el antígeno específico de isquemia de la muestra. En una
realización preferida, la muestra está enriquecida en el antígeno
específico de isquemia, por ejemplo, se obtiene a partir de un
sujeto (por ejemplo, un paciente humano) con lesión por reperfusión
o isquémica. En otras realizaciones, la muestra es un aislado
bioquímico, por ejemplo, un tejido endotelial, o una biblioteca de
expresión, por ejemplo una biblioteca derivada de un tejido
endotelial. En una realización preferida, la etapa de contacto se
produce in vitro.
También se describe un procedimiento para
identificar un inhibidor de una interacción entre una
inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM patógena, y un
antígeno específico de isquemia de uno o más (por ejemplo, una
pluralidad de) compuestos de ensayo, que comprende proporcionar una
mezcla de reacción que incluye la inmunoglobulina patógena y el
antígeno específico de isquemia (por ejemplo, un tejido endotelial o
lisado obtenido a partir de un sujeto (por ejemplo, un paciente
humano) con lesión por reperfusión o isquémica) en condiciones que
permiten la unión de la inmunoglobulina patógena y el antígeno
específico de isquemia, poner en contacto la inmunoglobulina
patógena y el antígeno específico de isquemia con uno o más
compuestos de ensayo (por ejemplo, miembros de una biblioteca
combinatoria) y detectar cualquier cambio en la unión de la
inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia en
presencia de un compuesto de ensayo dado con respecto a la detectada
en ausencia del compuesto de ensayo, indicando un cambio (por
ejemplo, reducción) en el nivel de unión entre la inmunoglobulina
patógena y el antígeno específico de isquemia en presencia del
compuesto de ensayo con respecto al detectado en ausencia del
compuesto de ensayo que el compuesto de ensayo es un inhibidor de la
interacción entre la inmunoglobulina patógena y el antígeno
específico de isquemia. En una realización preferida, la etapa de
contacto se realiza in vivo. El procedimiento puede incluir
además pretratar las inmunoglobulinas patógenas con uno o más
compuestos de ensayo. Las inmunoglobulinas patógenas tratadas
después pueden inyectarse en ratones deficientes en inmunoglobulinas
patógenas.
También se describe un procedimiento para
identificar un inhibidor de una interacción entre una
inmunoglobulina patógena, por ejemplo una IgM patógena, y un
componente de la ruta del complemento de uno o más (por ejemplo, una
pluralidad de) compuestos de ensayo, que comprende proporcionar una
mezcla de reacción que incluye la inmunoglobulina patógena y el
componente de la ruta del complemento en condiciones que permiten la
unión de la inmunoglobulina patógena y el componente de la ruta del
complemento, poner en contacto la inmunoglobulina patógena y el
componente de la ruta del complemento con uno o más compuestos de
ensayo (por ejemplo, miembros de una biblioteca combinatoria) y
detectar cualquier cambio en la unión de la inmunoglobulina patógena
y el componente de la ruta del complemento en presencia de un
compuesto de ensayo dado con respecto a la detectada en ausencia del
compuesto de ensayo, indicando un cambio (por ejemplo, reducción) en
el nivel de unión entre la inmunoglobulina patógena y el componente
de la ruta del complemento en presencia del compuesto de ensayo con
respecto al detectado en ausencia del compuesto de ensayo que el
compuesto de ensayo es un inhibidor de la interacción entre la
inmunoglobulina patógena y el componente de la ruta del complemento.
En realizaciones preferidas, la inmunoglobulina patógena es una IgM
patógena como se describe en la presente memoria y el antígeno
específico de isquemia se obtiene a partir de un tejido endotelial,
o un lisado, obtenido a partir de un sujeto (por ejemplo, un
paciente humano) con lesión por reperfusión o isquémica. En otra
realización, el procedimiento se realiza in vitro. En una
realización preferida, la inmunoglobulina patógena o el antígeno
específico de isquemia (o ambos) se marcan una señal detectable, por
ejemplo fluoróforos, enzimas colorimétricas, radioisótopos,
compuestos luminiscentes y similares. El procedimiento puede incluir
además repetir al menos una etapa, por ejemplo, la etapa de contacto
con un segundo o posterior miembro o miembros de la biblioteca. En
una realización preferida, se ensayan una pluralidad de compuestos
de ensayo, por ejemplo miembros de una biblioteca. La pluralidad de
compuestos de ensayo, por ejemplo de miembros de una biblioteca
puede incluir al menos 10, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5},
10^{6}, 10^{7} ó 10^{8} compuestos. En una realización
preferida, la pluralidad de compuestos de ensayo, por ejemplo,
miembros de la biblioteca, comparten una característica estructural
o funcional. El compuesto de ensayo puede ser un péptido o una
molécula orgánica pequeña. En otra realización, la ruta del
complemento es una ruta clásica del complemento. En una realización
preferida, el componente de la ruta del complemento es una molécula
C1 o una subunidad de la misma (por ejemplo, C1q).
También se describe un ácido nucleico aislado
que codifica un anticuerpo IgM patógeno, o fragmentos del mismo. En
realizaciones preferidas, el ácido nucleico aislado codifica una
región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 8. En otra
realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica una
región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la SEC ID
Nº: 10, o una parte de unión a antígeno de la misma. En otra
realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica una
región variable de cadena ligera que comprende una CDR2 de la SEC ID
Nº: 12, o una parte de unión a antígeno de la misma. En otra
realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica una
región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la SEC ID
Nº: 10, o una parte de unión a antígeno de la misma, y una CDR2 de
la SEC ID Nº: 12, o una parte de unión a antígeno de la misma. En
una realización preferida, el ácido nucleico codifica una región
variable de cadena ligera de origen murino, de origen humano, o una
combinación de secuencias de aminoácidos murina y humana. Por
ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una región variable de
cadena ligera que comprende la CDR1 de la SEC ID Nº: 10 y/o la CDR2
de la SEC ID Nº: 12 y una secuencia flanqueante humana.
En otras realizaciones preferidas, el ácido
nucleico aislado codifica una región variable de cadena pesada de la
SEC ID Nº: 2. En otra realización preferida, la secuencia de ácido
nucleico codifica una región variable de cadena pesada que comprende
una CDR1 de la SEC ID Nº: 4, o una parte de unión a antígeno de la
misma. En otra realización preferida, la secuencia de ácido nucleico
codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR2
de la SEC ID Nº: 6, o una parte de unión a antígeno de la misma. En
otra realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica
una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la
SEC ID Nº: 4, o una parte de unión a antígeno de la misma, y una
CDR2 de la SEC ID Nº: 6, o una parte de unión a antígeno de la
misma. En una realización preferida, el ácido nucleico codifica una
región variable de cadena pesada de origen murino, origen humano o
una combinación de secuencias de aminoácidos murina y humana. Por
ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una región variable de
cadena pesada que comprende la CDR1 de la SEC ID Nº: 4 y/o la CDR2
de la SEC ID Nº: 6, y una secuencia flanqueante humana. En otra
realización, el ácido nucleico aislado codifica tanto una región
variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos
de la SEC ID Nº: 8 como una región variable de cadena pesada que
comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.
También se describe una molécula de ácido
nucleico aislada y fragmentos de la misma. En una realización
preferida, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la
secuencia de nucleótidos de cadena ligera de la SEC ID Nº: 7. En
otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende la
secuencia de nucleótidos de la CDR1 de cadena ligera de la SEC ID
Nº: 9, o una parte de la misma. En otra realización preferida, la
molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de
CDR2 de cadena ligera de la SEC ID Nº: 11, o una parte de la misma.
En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico
comprende una secuencia de nucleótidos de CDR1 de cadena ligera de
la SEC ID Nº: 9, o una parte de la misma, y una secuencia de
nucleótidos de CDR2 de cadena ligera de la SEC ID Nº: 11, o una
parte de la misma. Las moléculas de ácido nucleico de la presente
invención que comprenden secuencias de cadena ligera, por ejemplo,
la SEC ID Nº: 7, la SEC ID Nº: 9, la SEC ID Nº: 11 o combinaciones
de las mismas, incluyen nucleótidos que tienen un 70%, 80%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con las mismas.
Además, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que
comprenden secuencias de cadena ligera, por ejemplo, la SEC ID Nº:
7, la SEC ID Nº: 9, la SEC ID Nº: 11 o combinaciones de las mismas,
incluyen nucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas, por
ejemplo, condiciones de rigurosidad baja, media, alta o muy alta con
las mismas.
En otra realización, la invención proporciona
moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 70%, 80%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una molécula
de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena ligera, por
ejemplo, un polipéptido de cadena ligera de la SEC ID Nº: 8, la SEC
ID Nº: 10 y la SEC ID Nº: 12. En otra realización, la invención
proporciona moléculas de ácido nucleico que hibridan con una
secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de
cadena ligera de un anticuerpo patógeno o parte del mismo, por
ejemplo, una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 8, la
SEC ID Nº: 10 y la SEC ID Nº: 12.
En otras realizaciones preferidas, las moléculas
de ácido nucleico comprenden la secuencia de nucleótidos de cadena
pesada de la SEC ID Nº: 1. En otra realización, la molécula de ácido
nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de CDR1 de cadena
pesada de la SEC ID Nº: 3, o una parte de la misma. En otra
realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende la
secuencia de nucleótidos de CDR2 de cadena pesada de la SEC ID Nº:
5, o una parte de la misma. En otra realización preferida, la
molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de
CDR1 de cadena pesada de la SEC ID Nº: 3, o una parte de la misma, y
una secuencia de nucleótidos de CDR2 de cadena pesada de la SEC ID
Nº: 5, o una parte de la misma. Las moléculas de ácido nucleico que
comprenden secuencias de cadena pesada, por ejemplo, la SEC ID Nº:
1, la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº: 5 o combinaciones de las mismas,
también incluyen nucleótidos que tienen un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%,
97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con las mismas. Además, las
moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de cadena
ligera, por ejemplo, la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº:
5 o combinaciones de las mismas, incluyen nucleótidos que hibridan
en condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones de rigurosidad
baja, media, alta o muy alta con las mismas.
En otra realización, la invención proporciona
moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 70%, 80%, 90%,
95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una molécula
de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena pesada, por
ejemplo, un polipéptido de cadena pesada de la SEC ID Nº: 2, la SEC
ID Nº: 4 y la SEC ID Nº: 6. En otra realización, la invención
proporciona moléculas de ácido nucleico que hibridan con una
secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de
cadena pasada de un anticuerpo patógeno o parte del mismo, por
ejemplo una región variable de cadena pasada de la SEC ID Nº: 2, la
SEC ID Nº: 4 y la SEC ID Nº: 6.
También se describen polipéptidos aislados y
fragmentos de los mismos. En realizaciones preferidas, el
polipéptido aislado comprende, por ejemplo, las secuencias de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 10 o la SEC ID Nº: 12,
o fragmentos o combinaciones de las mismas; o la SEC ID Nº: 2, la
SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o fragmentos o combinaciones de las
mismas. Los polipéptidos de la presente invención incluyen
polipéptidos que tienen al menos, pero no más de 20, 10, 5, 4, 3, 2
ó 1 aminoácidos que difieren de la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 10 o
la SEC ID Nº: 12; o la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº:
6. Son polipéptidos preferidos polipéptidos que retienen la
actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse a un
antígeno específico de isquemia, y/o la capacidad de unirse al
complemento. En otra realización, los polipéptidos comprenden
polipéptidos que tienen al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%,
98% y 99% de identidad de secuencia con una región variable de
cadena ligera o parte de la misma, por ejemplo, un polipéptido de
región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº:
10 o la SEC ID Nº: 12. En otra realización, los polipéptidos
comprenden polipéptidos que tienen al menos un 70%, 80%, 90%, 95%,
96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una región
variable de cadena pesada, o parte de la misma, por ejemplo un
polipéptido de región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº: 2,
la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6. En otra realización, los
presentes inventores describen un polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 y la SEC ID Nº: 2, que
comprende además una secuencia IRES.
También se describe un vector de expresión que
comprende las moléculas de ácido nucleico que codifican la SEC ID
Nº: 8, la SEC ID Nº: 10 o la SEC ID Nº: 12, o fragmentos o
combinaciones de las mismas; o la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la
SEC ID Nº: 6, o fragmentos o combinaciones de las mismas. En una
realización preferida, el vector de expresión comprende una molécula
de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de anticuerpo que
tiene una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos
de la SEC ID Nº: 8, o una parte de la misma, y una secuencia de
nucleótidos que codifica una cadena pesada de anticuerpo que tiene
una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la
SEC ID Nº: 2, o una parte de la misma. En otro aspecto, los
presentes inventores describen una célula huésped que comprende un
vector de expresión de la presente invención. En realizaciones
preferidas, la célula huésped puede incluir al menos 1 ó 2 o más
vectores de expresión, es decir un vector de expresión que codifica
una cadena ligera, por ejemplo la SEC ID Nº: 8 o una parte de la
misma, y un vector de expresión que codifica una cadena pesada, por
ejemplo la SEC ID Nº: 2 o una parte de la misma. En otra
realización, la célula huésped puede comprender un vector de
expresión capaz de expresar tanto la región variable de cadena
ligera como la región variable de cadena pesada. Como se usa en la
presente memoria, el término "vector" se refiere a una molécula
de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se
ha unido y puede incluir un plásmido, cósmido o vector viral. El
vector puede ser capaz de replicarse de forma autónoma o puede
integrarse en el ADN de un huésped. Los vectores virales incluyen,
por ejemplo, virus adenoasociados, adenovirus y retrovirus con
defectos en la replicación.
También se describen inhibidores de la
interacción de inmunoglobulina patógena/antígeno isquémico y/o
inmunoglobulina patógena/componente del complemento identificada
usando los procedimientos descritos en la presente memoria.
La Figura 1 es un gráfico de barras que
representa cambios en la permeabilidad intestinal de ratones
endogámicos después de isquemia intestinal y reperfusión o sin
lesión (simulado). WT representa la cepa parental para ratones
Cr2-/-. Cr2-/- se reconstituyó con IgG o IgM reunida o control
salino. Se administró IgG o IgM reunida (0,5 mg) por vía intravenosa
aproximadamente 1 hora antes del tratamiento. Los valores son medias
\pm error típico; n = número de ratones en grupos
experimentales.
La Figura 2 es un diagrama esquemático del papel
propuesto para el complemento y receptores del complemento en la
selección positiva de linfocitos B-1
peritoneales.
La Figura 3A demuestra la reconstitución de una
lesión por I/R en ratones deficientes en anticuerpo
(RAG-1) por IgM reunida a partir de 22 clones de
hibridoma de células B-1 individuales. Se reunieron
24 \mug de cada IgM de hibridoma y se inyectaron por vía
intravenosa 30 minutos antes de la laparotomía inicial. Después de
la reperfusión, se obtiene sangre y se calcula el índice de
permeabilidad como relación de cantidad de ^{125}I de intestino
seco frente a la de la sangre. Los valores representan medias \pm
ET; n = números de ratones usados en grupos experimentales. 1 =
solución salina normal; 2 = hibridoma reunido; 3 = 50 \mug de
hibridoma 22A5; 4 = 400 \mug de IgM reunida.
La Figura 3B demuestra que la IgM del clon de
hibridoma 22A5 restaura la lesión por I/R en ratones
RAG-1. Ratones reconstituidos con IgM reciben IgM de
suero total (400 \mug) o IgM de hibridoma 22A5 (50 \mug de cada
una). Los valores representan medias \pm ET; n = números de
ratones usados en grupos experimentales. 1 = solución salina normal;
2 = hibridoma reunido; 3 = 50 \mug de hibridoma 22A5; 4 = 400
\mug de IgM reunida.
La Figura 4A muestra un análisis de secuencia de
IgM del hibridoma 22A5 de B-1. Se muestra la
secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de IgM de 22A5 (SEC ID
Nº: 1). El ARN se purificó a partir de células de hibridoma 22A5 y
se sometió a transcripción inversa para proporcionar ADNc. Se usó
PCR semi-anidada usando un cebador oligonucleotídico
específico para 5' VH y 3' Cm para amplificar los ADNc de cadena
pesada de inmunoglobulina. Los productos de ADNc se purificaron en
geles de agarosa y la secuencia de nucleótidos se determinó por
secuenciación automática. Las regiones flanqueantes (FWR) y las
regiones determinantes de complementariedad (CDR) se indican encima
de los nucleótidos. Una búsqueda de la base de datos de nucleótidos
de NCBI encontró que la cadena pesada de 22A5 compartía un 95% de
homología con la secuencia de inmunoglobulina
VMU-3.2 (número de acceso X03088).
La Figura 4B muestra un análisis de la secuencia
de IgM del hibridoma 22A5 de B-1. Se muestra la
secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de IgM de 22A5 (SEC ID
Nº: 7). Se purificó ARN a partir de células de hibridoma 22A5 y se
sometió a transcripción inversa para proporcionar ADNc. Se usó PCR
semi-anidada usando un cebador oligonucleotídico
específico para 5' Vk y 3' Ck para amplificar los ADNc de cadena
ligera de inmunoglobulina. Los productos de ADNc se purificaron en
geles de agarosa y la secuencia de nucleótidos se determinó por
secuenciación automática. Las regiones flanqueantes (FWR) y las
regiones determinantes de complementariedad (CDR) se indican encima
de los nucleótidos. Una búsqueda de la base de datos de nucleótidos
de NCBI encontró que la cadena ligera de 22A5 compartía homología
con la secuencia de inmunoglobulina del gen Vk 19-23
(número de acceso AJ235961).
La Figura 5A muestra la secuencia de aminoácidos
correspondiente a la secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de
la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 2). Las regiones flanqueantes (FWR) y
las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se indican
encima de los restos aminoacídicos.
La Figura 5B muestra la secuencia de aminoácidos
correspondiente a la secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de
la SEC ID Nº: 7 (SEC ID Nº: 8). Las regiones flanqueantes (FWR) y
las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se indican
encima de los restos aminoacídicos.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se basa, en parte, en la
identificación de inmunoglobulinas (Ig) patógenas, en particular IgM
patógenas, que reconocen un antígeno específico de isquemia. Se cree
que la unión de estas IgM patógenas a un antígeno específico de
isquemia desencadena, entre otras cosas, la activación de la ruta
del complemento, que finalmente ocasiona una lesión por reperfusión
o isquémica. Los solicitantes también descubrieron que las IgM
patógenas se producen por una subpoblación de células B denominadas
en la presente memoria "células B-1". Por
consiguiente, en la presente memoria se describen procedimientos y
composiciones útiles para tratar o prevenir, en un sujeto, lesiones
tisulares posteriores a la reperfusión producidas por una
inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM patógena.
Antes de la descripción adicional de la
invención, aquí se recogen, por comodidad, ciertos términos
empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones
adjuntas.
Los términos "anticuerpo" e
"inmunoglobulina" se usan indistintamente en la presente
memoria.
Como se usa en la presente memoria, los términos
"inmunoglobulina" (o "Ig" en forma abreviada) y
"anticuerpo" se refieren a una glicoproteína que comprende al
menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadena ligeras (L)
interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está
compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en la
presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena
pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres
dominios, CH1, CH2 y CH3, o cuatro dominios en el caso de la IgM, es
decir, CH1, CH2, CH3 y CH4. Cada cadena ligera está compuesta por
una región variable de cadena ligera y una región constante de
cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta
por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse
adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas
regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con
regiones que están más conservadas, denominadas regiones
flanqueantes (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro
FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el
siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones
variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de
unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de
los anticuerpos pueden actuar como mediadores en la unión de la
inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo
diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras)
y el primer componente (Clq) del sistema del complemento
clásico.
Hay hasta cinco tipos principales de cadenas
pesadas, denominados \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y
\mu, subdividiéndose adicionalmente las cadenas \gamma en
\gamma1, \gamma2, \gamma3 y \gamma4 y las cadenas \alpha
en \alpha1 y \alpha2. Dos tipos de cadenas ligeras alternativas
se denominan \kappa y \lambda. La presencia de la cadena pesada
da lugar a las clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD,
IgE, IgG e IgM. Las IgG pueden subdividirse adicionalmente en las
subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y las IgA en las subclases IgA1 e
IgA2.
Como se usa en la presente memoria, el término
"inmunoglobulina M" o "IgM" se refiere a un pentámero de
cinco monómeros de IgM unidos por la cadena J. Las moléculas de IgM
monoméricas tienen la misma estructura básica que las moléculas de
inmunoglobulina descritas anteriormente. La IgM es la primera
inmunoglobulina sintetizada en una respuesta de anticuerpo. Como
pentámero, tiene múltiples dominios funcionales y, por lo tanto, es
un potente activador del complemento.
La expresión "inmunoglobulina patógena" se
refiere a una molécula de inmunoglobulina como se ha descrito
anteriormente que actúa como mediador de las lesiones tisulares
posteriores a una reperfusión. En una realización, la
inmunoglobulina patógena puede localizarse en una superficie
endotelial o tejido parenquimático, por ejemplo, por unión a un
antígeno (por ejemplo, un antígeno específico isquémico) presente en
una superficie de célula endotelial o tejido parenquimático. Una vez
localizada en la superficie endotelial o en la superficie de tejido
parenquimático, la inmunoglobulina patógena puede actuar como
mediador de la unión de células inmunes (por ejemplo, células
efectoras) o un componente del sistema del complemento clásico, por
ejemplo, Clq, desencadenando de esta manera la lesión en el tejido.
Los anticuerpos pueden ser de los diversos isotipos, incluyendo: IgG
(por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgA.sub.sec,
IgD o IgE. Preferentemente, la inmunoglobulina patógena es un
isotipo de anticuerpo que es un activador del complemento.
Preferentemente, la inmunoglobulina patógena es una IgM. Las
inmunoglobulinas patógenas son preferentemente de longitud completa
(por ejemplo, un anticuerpo IgM o IgG (por ejemplo, una IgG1 e
IgG3)).
La expresión "parte de unión a antígeno" de
un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo" o
"fragmento"), como se usa en la presente memoria, se refiere a
uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de
unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, un antígeno
diana, por ejemplo, un antígeno isquémico). Los ejemplos de
fragmentos de unión incluidos dentro de la expresión "parte de
unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab,
un fragmento monovalente compuesto por los dominios VL, VH, CL y
CH1; (ii) un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente
que comprende dos fragmentos Fab unidos por un enlace disulfuro en
la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd compuesto por los
dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv constituido por los dominios
VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb
(Ward y col., (1989) Nature 341: 544-546),
constituido por un dominio VH; y (vi) una región determinante de
complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del
fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes distintos, pueden
unirse, usando procedimientos recombinantes, por un enlazador
sintético que permite obtenerlos como una sola cadena proteica en la
que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas
monovalentes (conocidos como Fv monocatenarios (scFv); véase, por
ejemplo Bird y col. (1988) Science 242: 423-426; y
Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:
5879-5883). Estos anticuerpos monocatenarios también
deben considerarse incluidos dentro de la expresión "parte de
unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de
anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por
los especialistas en la técnica, y los fragmentos se exploran con
respecto a la utilidad de la misma manera que los anticuerpos
intactos.
Como se usa en la presente memoria,
"reperfusión" se refiere al procedimiento mediante el cual se
reinicia el flujo sanguíneo en los vasos sanguíneos después de una
constricción u obstrucción del flujo, como, por ejemplo, en caso de
isquemia.
La expresión "reperfusión isquémica" se
refiere a una respuesta inflamatoria aguda que sigue a la
reperfusión de tejidos isquémicos. La reperfusión puede producirse
después de un episodio natural, tal como un ictus, o durante un
procedimiento quirúrgico en el que se bloquea intencionadamente el
flujo sanguíneo en vasos. La constricción u obstrucción de un vaso
sanguíneo puede producirse como resultado, por ejemplo, de un
coágulo sanguíneo, que bloquea el flujo sanguíneo en el vaso. En
circunstancias tales como éstas, se altera la integridad endotelial
y, como resultado, puede empezar la cascada de la coagulación y se
forman nuevos coágulos que se alojan en capilares más pequeños
corriente abajo de la obstrucción del coágulo original. Es durante
este periodo de reflujo cuando se produce la lesión del tejido.
"Lesión por reperfusión mediada por
inmunoglobulina" se refiere a una destrucción de la integridad
endotelial que está mediada directa o indirectamente por una
inmunoglobulina, por ejemplo, una inmunoglobulina patógena. Sin
quedar ligado por teoría alguna, se cree que durante un periodo de
isquemia, se expresan o exponen nuevos antígenos (por ejemplo,
antígenos específicos isquémicos) en la superficie de las células
endoteliales. Estos nuevos antígenos después se reconocen por
inmunoglobulinas patógenas que se acumulan cerca del sitio de la
lesión. Las inmunoglobulinas patógenas localizadas pueden
desencadenar lesiones en el tejido endotelial, por ejemplo, por
activación de la función de células efectoras o rutas del
complemento.
Como se usa en la presente memoria, el término
"isquemia" se refiere a una deficiencia temporal o permanente
de flujo sanguíneo en un órgano o tejido. En tejidos
cardiovasculares, la isquemia puede producir al menos dos
enfermedades cardiacas - angina de pecho e infarto de miocardio
agudo (ataque cardiaco). Típicamente, la isquemia que implica el
músculo cardiaco puede producirse como resultado de trastornos de
arterias coronarias, tales como aterosclerosis o espasmos. La
expresión "lesión isquémica" se refiere a una destrucción de la
integridad endotelial, por ejemplo, en un tejido u órgano, que se
produce por una deficiencia temporal o permanente de flujo sanguíneo
en el tejido u órgano.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"antígeno específico de isquemia" se refiere a un antígeno
presente en la superficie de una célula endotelial. Preferentemente,
el antígeno específico de isquemia se expresa o expone en respuesta
a un agravio, por ejemplo, un agravio isquémico.
Como se usa en presente memoria, "células
B-1" se refiere a una subpoblación de células B
que producen las inmunoglobulinas patógenas. Típicamente, las
células B-1 expresan bajos niveles de IgD y CD23, y
una fracción importante de estas células expresan la proteína de la
superficie celular CD5 (Hardy y col. (1994) Immunol. Rev. 137, 91;
Kantor y col. (1993) Annu. Rev. Immunol. 11,
501-538). Típicamente están alojadas en los tejidos
peritoneales y mesentéricos y al menos en ratones no parecen
circular (Herzenberg y col., (1986) Immunol. Rev. 93:
81-102; Martin y col., Cur Op. Immunol. 13:
195-201). A diferencia de las células B
convencionales, no experimentan hipermutación somática ni maduración
de afinidad. Parecen surgir durante el desarrollo fetal y neonatal y
no se regeneran fácilmente por injerto de médula ósea adulta. Estas
células pueden distinguirse además por su frecuencia limitada en los
ganglios linfáticos periféricos y el bazo, y por localizarse
principalmente en la cavidad peritoneal.
El término "complemento" se refiere a una
cascada de proteínas compuesta por más de 20 proteínas (incluyendo
factores reguladores). Al igual que el sistema de coagulación
sanguínea, la activación del sistema inicia una cascada de
acontecimientos en los que se activan secuencialmente proenzimas de
forma proteolítica generando ligandos para receptores de la
superficie celular, péptidos bioactivos potentes y un complejo de
fase terminal que se intercala en las membranas de las células
ocasionando muerte celular. El componente central es el tercer
componente o C3. Puede activarse por tres rutas diferentes, es
decir, la ruta clásica, la de las lectinas o la alternativa (Reid y
col., (1981) Semin. Immunopathol. 15: 307-326;
Muller-Eberhard, (1988) Ann. Rev. Biochem. 57:
321-347).
En una realización, la inmunoglobulina patógena
puede actuar a través de la ruta clásica del complemento. La ruta
clásica se activa por una interacción entre un antígeno y
anticuerpo, que forma un complejo inmune. Los anticuerpos pueden
unirse o "fijarse" al complemento sólo después de reaccionar
con su antígeno. La formación del complejo provoca un cambio
conformacional en la molécula de anticuerpo que expone un sitio para
la unión del primer componente del complemento C1. C1 es un
compuesto multimérico formado por seis cadenas de tres polipéptidos
cada una, denominadas C1q, y dos de cada uno de C1s y C1r. Seis
cadenas C1q se disponen en un "grupo" y las cuatro moléculas de
C1r y C1s se unen en una interacción dependiente de calcio. Cuando
un anticuerpo se une a dos o más cabezas de C1q, C1r se escinde para
dar una molécula activa de C1r, que escinde C1s. C1s extiende el
proceso de activación por escisión del siguiente componente del
complemento C4 para dar C4b, que continúa el proceso de reacción, y
C4a. La escisión de C4 para dar C4b revela un enlace tioéster
interno, que se inactiva rápidamente por unión de moléculas de agua
a menos que pueda formar enlaces covalentes con proteínas o
carbohidratos de la superficie celular. Si esto ocurre, C4b se
vuelve relativamente estable y se une a C2 en una reacción
dependiente de magnesio. C2 después se escinde por C1s para formar
el complejo C4b2a, conocido como la C3 convertasa de la ruta
clásica. C3 es una molécula similar a C4, que tiene un enlace
tioéster interno. Por la escisión de C3 se obtienen dos fragmentos.
El más pequeño de éstos, C3a, tiene propiedades biológicas
poderosas. El C3b de mayor tamaño presenta el sitio de unión lábil
que permite que la molécula se una a C4b2a. La unión de C3b a C4b2a
conduce a la generación de la última enzima de la ruta clásica,
C4b2a3b, conocida como C5 convertasa de la ruta clásica, que escinde
C5, un componente de la ruta de ataque a la membrana.
En otra realización, la inmunoglobulina patógena
puede actuar a través de la ruta del complemento alternativa. En la
ruta alternativa, C3 genera C3b, C3bB y C3bBb, que a su vez escinde
C3. Este proceso se acelera si las enzimas activas están
estabilizadas en paredes de células bacterianas, o si se produce más
C3b a partir de la ruta clásica. Se genera la C5 convertasa de la
ruta alternativa C3bBb3b.
Como se una en la presente memoria, la expresión
"sujeto" pretende incluir seres humanos y animales no humanos.
Los seres humanos preferidos incluyen un paciente humano con lesión
por isquemia-reperfusión. La expresión "animales
no humanos" o "no humanos" de la invención incluye todos los
vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como
primates no humanos, roedores, ovejas, perros, vacas, pollos,
anfibios, reptiles, etc.
Como se usa en la presente memoria, un
"inhibidor" se refiere a un agente que reduce o bloquea
(completa o parcialmente) una interacción entre una inmunoglobulina
patógena y un antígeno específico de isquemia; o reduce o bloquea
una interacción entre una inmunoglobulina patógena y un componente
de la ruta del complemento, por ejemplo C1q. El término
"interacción" se refiere a una asociación física entre dos o
más moléculas, por ejemplo, una unión. La interacción puede ser
directa o indirecta. Preferentemente, el inhibidor antagoniza una o
más de las siguientes actividades de la inmunoglobulina patógena:
(i) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, la unión) entre la
inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia; (ii)
inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, la unión) entre la
inmunoglobulina patógena y un componente de la ruta del complemento,
por ejemplo, C1q; (iii) neutraliza la inmunoglobulina patógena, por
ejemplo, secuestrando la inmunoglobulina y/o fijando como objetivo
su degradación; o (iv) inhibe o reduce la producción de la
inmunoglobulina patógena; por ejemplo bloquea la síntesis, el
ensamblaje y/o modificaciones postraduccionales del anticuerpo
patógeno. El inhibidor puede ser una proteína (por ejemplo un
anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo
anti-idiotípico o un fragmento del mismo), un
péptido o una molécula orgánica pequeña. Los términos
"inhibidores" y "agentes" se usan indistintamente en la
presente memoria.
Como se usa en la presente memoria, una
"cantidad eficaz" de un inhibidor se refiere a una cantidad de
un agente que es eficaz, tras la administración de una sola dosis o
de múltiples dosis al sujeto, por ejemplo, un paciente, para reducir
o eliminar la lesión por reperfusión o isquémica. Dicha reducción o
eliminación de la lesión por reperfusión puede reflejarse como una
prolongación de la supervivencia del sujeto, por ejemplo, un
paciente más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento, o
cualquier mejora en el pronóstico del sujeto con respecto a la
ausencia de dicho tratamiento. El inhibidor puede usarse para tratar
(por ejemplo, reducir o eliminar una lesión existente) o para
prevenir (por ejemplo, retrasar la aparición del inicio o
recurrencia de) una lesión por reperfusión o isquémica. El experto
en la materia apreciará que ciertos factores influyen en la
dosificación y programa de tiempo necesarios para tratar de forma
eficaz a un sujeto, incluyendo pero sin limitación la gravedad de la
enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o
edad del sujeto, y otras enfermedades presentes.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"secuencia consenso" se refiere a la secuencia formada a partir
de los aminoácidos (o nucleótidos) que aparecen con más frecuencia
en una familia de secuencias relacionadas (véase, por ejemplo,
Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim,
Germany 1987). En una familia de proteínas, cada posición en la
secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que aparece con
más frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos
aparecen con la misma frecuencia, cualquiera puede incluirse en la
secuencia consenso. Una "región flanqueante consenso" se
refiere a la región flanqueante en la secuencia de inmunoglobulina
consenso.
Como se usa en la presente memoria, la expresión
"hibrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media,
rigurosidad alta o rigurosidad muy alta" describe condiciones de
hibridación y lavado. Pueden encontrarse pautas para realizar las
reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, que
se incorpora por referencia. En esta referencia se describen
procedimientos acuosos y no acuosos y puede usarse cualquiera de
ellos. Las condiciones de hibridación específicas mencionadas en la
presente memoria son las siguientes: 1) condiciones de hibridación
de baja rigurosidad en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6X a
aproximadamente 45ºC, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 1%
al menos a 50ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse a
55ºC en las condiciones de rigurosidad baja); 2) condiciones de
hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45ºC,
seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 1% a 60ºC; 3)
condiciones de hibridación de rigurosidad alta en SSC 6X a
aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS
al 0,1% a 65ºC; y preferentemente 4) son condiciones de hibridación
de rigurosidad muy alta fosfato sódico 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC,
seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 1% a 65ºC. Las
condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones
preferidas y las que deben usarse a menos que se especifique otra
cosa.
Los cálculos de homología o identidad de
secuencia entre secuencias (los términos se usan indistintamente en
la presente memoria) se realizan como se indica a continuación.
Para determinar el porcentaje de identidad de
dos secuencias de aminoácidos, o dos secuencias de ácido nucleico,
las secuencias se alinean para conseguir una comparación óptima (por
ejemplo, pueden introducirse huecos en una o en las dos de una
primera y una segunda secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico
para el alineamiento óptimo y pueden desecharse secuencias no
homólogas para la comparación. En una realización preferida, la
longitud de una secuencia de referencia alineada con fines
comparativos es de al menos el 30%, preferentemente al menos el 40%,
más preferentemente al menos el 50%, el 60% e incluso más
preferentemente al menos el 70%, el 80%, el 90% o el 100% de la
longitud de la secuencia de referencia. Después se comparan los
restos aminoacídicos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos
o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en
la primera secuencia está ocupada por el mismo resto aminoacídico o
nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia,
entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en
la presente memoria, "identidad" de aminoácidos o de ácidos
nucleicos es equivalente a "homología" de aminoácidos o de
ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos
secuencias es una función del número de posiciones idénticas
compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de
huecos, y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para
un alineamiento óptimo de las dos secuencias.
La comparación de secuencias y la determinación
del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse
usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el
porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se
determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol.
Biol. 48: 444-453) que se ha incorporado en el
programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en
http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz
PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de
longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización preferida, el
porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se
determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG
(disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP
y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso de longitud de
1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Una serie particularmente preferida de parámetros
(y la que debe usarse a menos que se especifique otra cosa) es una
matriz de puntuación Blossum 62 con una penalidad de hueco de 12,
una penalidad de extensión de hueco de 4 y una penalidad de hueco de
cambio de fase de 5.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias
de aminoácidos o de nucleótidos puede determinarse usando el
algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS,
4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN
(versión 2.0), usando una tabla de restos de peso PAM120, una
penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco
de 4.
En un aspecto, en la presente memoria se
describe un procedimiento para identificar un inhibidor de una
interacción entre una inmunoglobulina patógena y un antígeno
específico de isquemia, o una inmunoglobulina patógena y un
componente de la ruta del complemento de uno o más (por ejemplo, una
pluralidad de) compuestos de ensayo. El inhibidor puede ser una
proteína (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo); un
péptido, un carbohidrato; una glicoproteína; o una molécula orgánica
pequeña.
El inhibidor puede ser una molécula orgánica
pequeña, por ejemplo, un miembro de una biblioteca combinatoria.
En una realización, la invención proporciona
bibliotecas de inhibidores. La síntesis de bibliotecas combinatorias
es bien conocida en la técnica y se ha revisado (véase, por ejemplo,
E.M. Gordon y col, J. Med Chem. (1994) 37:
1385-1401; DeWitt, S. H.; Czarnik, A W. Acc. Chem.
Res. (1996) 29: 114; Armstrong, R W.; Combs, A. P.; Tempest, P. A;
Brown, S. D.; Keating, T. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 123; Ellman,
J. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 132; Gordon, E. M; Gallop, M. A.;
Patel, D. V. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 144; Lowe, G. Chem. Soc.
Rev. (1995) 309, Blondelle y col. Trends Anal. Chem. (1995) 14: 83;
Chen y col. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 2661; Patentes de Estados
Unidos Nº 5.359.115, 5.362.899 y 5.288.514; Publicaciones PCT Nº
W092/10092, WO93/09668, WO91/07087, WO93/20242 y WO94/08051).
Las bibliotecas de compuestos pueden prepararse
de acuerdo con una diversidad de procedimientos, de los que algunos
se conocen en la técnica. Por ejemplo, puede realizarse una
estrategia de "combinación-división"
("split-pool") de la siguiente manera: se ponen
perlas de un soporte polimérico funcionalizado en una pluralidad de
recipientes de reacción; se conoce una diversidad de soportes
poliméricos adecuados para la síntesis de péptidos en fase sólida, y
algunos están disponibles en el mercado (como ejemplos, véase, por
ejemplo M. Bodansky "Principles of Peptide Synthesis", 2ª
edición, Springer-Verlag, Berlin (1993)). A cada
alícuota de perlas se le añade una solución de un aminoácido
activado diferente y se deja que las reacciones continúen para
producir una pluralidad de aminoácidos inmovilizados, uno en cada
recipiente de reacción. Después se lavan las alícuotas de perlas
modificadas, se "reúnen" (es decir, se recombinan) y el
conjunto de perlas se divide de nuevo, poniéndose cada alícuota en
un recipiente de reacción separado. Después se añade otro aminoácido
activado a cada alícuota de perlas. El ciclo de síntesis se repite
hasta que se obtiene una longitud de péptido deseada. Los restos
aminoacídicos añadidos en cada ciclo de síntesis pueden
seleccionarse aleatoriamente; como alternativa, pueden seleccionarse
aminoácidos para proporcionar una biblioteca "sesgada", por
ejemplo, una biblioteca en la que ciertas partes del inhibidor se
seleccionan de forma no aleatoria, por ejemplo, para proporcionar un
inhibidor que tenga una similitud u homología estructural conocida
con un péptido conocido capaz de interaccionar con un anticuerpo,
por ejemplo, el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo
anti-idiotípico. Se apreciará que de esta manera
puede generarse fácilmente una amplia diversidad de compuestos
peptídicos, peptidomiméticos o no peptídicos.
La estrategia de
"combinación-división" produce una biblioteca
de péptidos, por ejemplo inhibidores, que pueden usarse para
preparar una biblioteca de compuestos de ensayos de la invención. En
otra síntesis ilustrativa, se crea una "biblioteca de
diversómeros" por el procedimiento de Hobbs DeWitt y col. (Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909 (1993)). También pueden usarse
otros procedimientos de síntesis, incluyendo la técnica de "bolsa
de té" de Houghten (véase, por ejemplo, Houghten y col., Nature
354: 84-86 (1991)) para sintetizar bibliotecas de
compuestos de acuerdo con la presente invención.
Las bibliotecas de compuestos pueden explorarse
para determinar si cualquier miembro de la biblioteca tiene una
actividad deseada y, si es así, identificar la especie activa. Se
han descrito procedimientos de exploración de bibliotecas
combinatorias (véase, por ejemplo, Gordon y col., J Med. Chem.,
supra). Las bibliotecas de compuestos solubles pueden
explorarse por cromatografía de afinidad con un receptor apropiado
para aislar ligandos del receptor, seguido de la identificación de
los ligandos aislados por técnicas convencionales (por ejemplo,
espectrometría de masas, RMN y similares). Los compuestos
inmovilizados pueden explorarse poniendo en contacto los compuestos
con un receptor soluble; preferentemente, el receptor soluble se
conjuga con un marcador (por ejemplo, fluoróforos, enzimas
colorimétricas, radioisótopos, compuestos luminiscentes y similares)
que puede detectarse para indicar la unión al ligando. Como
alternativa, los compuestos inmovilizados pueden liberarse
selectivamente y dejarse difundir a través de una membrana para
interaccionar con un receptor. A continuación se describen ensayos
ejemplares útiles para explorar las bibliotecas.
En una realización, los compuestos pueden
explorarse con respecto a la capacidad de interaccionar con una
inmunoglobulina patógena ensayando la actividad de cada compuesto de
unirse directamente a la inmunoglobulina o de inhibir una
interacción entre la inmunoglobulina y un antígeno isquémico, por
ejemplo, por incubación del compuesto de ensayo con una
inmunoglobulina y un lisado, por ejemplo, un lisado de células
endoteliales, por ejemplo en un pocillo de una placa de múltiples
pocillos, tal como un placa de microtitulación de 96 pocillos
convencional. En esta realización puede determinarse la actividad de
cada compuesto individual. Como control puede usarse uno o más
pocillos que no tengan compuesto de ensayo. Después de la
incubación, la actividad de cada compuesto de ensayo puede
determinarse ensayando cada pocillo. De esta manera, pueden
determinarse en paralelo las actividades de una pluralidad de
compuestos de ensayo.
Pueden identificarse inhibidores de proteínas o
péptidos usando, por ejemplo, los sistemas combinatorios descritos
anteriormente. Como alternativa, pueden usarse fragmentos o péptidos
de cualquiera de la inmunoglobulina patógena, un antígeno diana o un
componente de la ruta del complemento para bloquear interacciones
entre esas proteínas.
También se describen variantes de los fragmentos
o péptidos de cualquiera de la inmunoglobulina patógena, un antígeno
diana o un componente de la ruta del complemento que incluyen
sustituciones de aminoácidos "no esenciales". Sustituciones de
aminoácidos no esenciales se refiere a alteraciones de la secuencia
de tipo silvestre que pueden realizarse sin anular o, más
preferentemente, sin alterar sustancialmente una actividad
biológica, mientras que un resto aminoacídico "esencial"
produce dicho cambio.
Una "sustitución de aminoácidos
conservativa" es una en la que el resto aminoacídico se reemplaza
por un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En
la técnica se han definido familias de restos aminoacídicos que
tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen
aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina,
arginina, histidina), cadenas lateras ácidas (por ejemplo, ácido
aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga
(por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina,
tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo,
alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,
metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por
ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales
aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano,
histidina). De esta manera, un resto aminoacídico no esencial
previsto en una inmunoglobulina patógena puede reemplazarse
preferentemente por otro resto aminoacídico de la misma familia de
cadenas laterales. Como alternativa, en otra realización, pueden
introducirse aleatoriamente mutaciones a lo largo de toda o parte de
una secuencia codificante de inmunoglobulina patógena, tal como por
mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden
explorarse para determinar la actividad biológica.
En otro aspecto, se describe una inmunoglobulina
patógena modificada, por ejemplo, que funciona como un agonista
(mimético) o como un antagonista. Preferentemente, la
inmunoglobulina patógena modificada funciona como un antagonista de
la activación del complemento. Pueden generarse variantes de la
inmunoglobulina patógena por mutagénesis, por ejemplo, mutación
puntual discreta, la inserción o deleción de secuencias o el
truncamiento de una inmunoglobulina patógena. Un agonista de la
inmunoglobulina patógena puede retener sustancialmente la misma, o
una subserie, de las actividades biológicas de la forma natural de
la proteína. Un antagonista de una inmunoglobulina patógena puede
inhibir una o más de las actividades de la forma natural de la
inmunoglobulina patógena, por ejemplo, al ser capaz de unirse a un
antígeno específico isquémico, pero incapaz de activar la ruta del
complemento. De esta manera, pueden inducirse efectos biológicos
específicos por tratamiento con una variante de función
limitada.
En una realización, el sitio dentro de la
inmunoglobulina patógena (por ejemplo, una IgM patógena) que se une
a C1q puede mutarse de tal manera que ya no pueda unirse a C1q. Por
ejemplo, el dominio C_{H}2 de una IgG y el dominio C_{H}4 de una
IgM, que se sabe que contienen sitios de unión para C1q, pueden
mutarse (véase el documento WO 94/29351). Por ejemplo, puede mutarse
la mitad carboxilo terminal del dominio C_{H}2 de una IgG (restos
231 a 239, preferentemente dentro de 234 a 239), que parece mediar
en la unión de C1q y la posterior activación del complemento. Como
otro ejemplo, Wright y col., han demostrado que un cambio de un solo
nucleótido en el dominio de la región constante de la IgM hace que
el anticuerpo sea defectuoso para iniciar la citolisis dependiente
del complemento. El cambio de un solo nucleótido produce la
codificación de un resto de serina en lugar del resto de prolina
normal en la posición de aminoácido 436 en el tercer dominio
constante (Wright y col. 1988, J. Biol. Chem. 263: 11221). Las
sustituciones de aminoácidos que pueden realizarse en anticuerpos
para alterar la unión o actividad del complemento son bien conocidas
en la técnica (véase, por ejemplo Wright y col. 1988, J. Biol.
Chem. 263: 11221; Shulman y col. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83: 7678-7682; Arya y col., (1994) J. Immunol.
253: 1206-1212; Poon y col., (1995) J. Biol. Chem.
270: 8571-8577, incorporándose el contenido de todos
estos textos en la presente memoria por referencia). Por
consiguiente, en una realización, los anticuerpos de la presente
invención tienen una mutación que altera la unión o actividad del
complemento. Los anticuerpos en los que se han añadido, delecionado
o sustituido aminoácidos se denominan en la presente memoria
anticuerpos modificados o anticuerpos alterados. Como apreciará el
experto en la materia, los procedimientos usados para producir
dichos cambios en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos variarán
dependiendo de los resultados deseados.
Pueden identificarse variantes de una
inmunoglobulina patógena por exploración de bibliotecas
combinatorias de mutantes, por ejemplo mutantes de truncamiento, de
una inmunoglobulina patógena para determinar la actividad agonista o
antagonista.
Pueden usarse bibliotecas de fragmentos, por
ejemplo, fragmentos N terminales, C terminales o internos, de una
secuencia codificante de inmunoglobulina patógena para generar una
población variegada de fragmentos para la exploración y posterior
selección de variantes de esta proteína. Se prefieren
particularmente variantes en las que se añade o deleciona un resto
de cisteína o en las que se añade o deleciona un resto que está
glicosilado.
Como procedimientos para explorar productos
génicos de bibliotecas combinatorias obtenidas por mutaciones
puntuales o truncamiento, y para la exploración de bibliotecas de
ADNc para encontrar productos génicos que tienen una propiedad
seleccionada, puede usarse mutagénesis de conjunto recursiva (REM),
una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las
bibliotecas, en combinación con los ensayos de exploración para
identificar variantes (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 89: 7811-7815; Delgrave y col. (1993) Protein
Engineering 6(3): 327-331).
Pueden explotarse ensayos basados en células
para analizar una biblioteca variegada. Por ejemplo, una biblioteca
de vectores de expresión puede introducirse por transfección en una
línea celular, por ejemplo una línea celular que normalmente
responde a la proteína de una manera dependiente del sustrato.
Después puede recuperarse el ADN plasmídico de las células que
consiguen la inhibición o, como alternativa, la potenciación de la
señalización por el sustrato de la inmunoglobulina patógena, y
caracterizarse adicionalmente los clones individuales.
En otro aspecto, los presentes inventores
describen un procedimiento para obtener una inmunoglobulina
patógena, por ejemplo, una inmunoglobulina patógena que tiene una
actividad que no es de tipo silvestre, por ejemplo un antagonista,
agonista o superagonista de una inmunoglobulina patógena natural. El
procedimiento incluye: alterar la secuencia, por ejemplo, por
sustitución o deleción de uno o más restos de una inmunoglobulina
patógena, un dominio o resto descrito en la presente memoria, y
ensayar el polipéptido alterado con respecto a la actividad
deseada.
En otro aspecto, los presentes inventores
describen un procedimiento para obtener un fragmento o análogo de
una inmunoglobulina patógena que tiene una actividad biológica
alterada de una inmunoglobulina patógena natural. El procedimiento
incluye: alterar la secuencia, por ejemplo, por sustitución o
deleción de uno o más restos, de una inmunoglobulina patógena, por
ejemplo, alterando la secuencia de una región no conservada, o un
dominio o un resto descrito en la presente memoria, y ensayar el
polipéptido alterado con respecto a la actividad deseada.
En otras realizaciones, los inhibidores pueden
ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, por ejemplo, un
anticuerpo anti-idiotípico o una parte de unión a
antígeno del mismo.
La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb)
como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de
anticuerpo de una sola composición molecular. Una composición de
anticuerpo monoclonal presenta una sola especificidad y afinidad de
unión por un epítope particular. Por consiguiente, la expresión
"anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que
presentan una sola especificidad de unión que tienen regiones
variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina
de la línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos
monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una
célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por
ejemplo un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un
transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera
fusionado a una célula inmortalizada.
Los procedimientos para producir anticuerpos son
bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal
contra una diana (por ejemplo, una inmunoglobulina patógena o un
antígeno específico de isquemia en una célula) puede producirse por
una diversidad técnicas, incluyendo la metodología convencional de
anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica convencional de
hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256:
495 (1975). Aunque se prefieren procedimientos de hibridación de
células somáticas, en principio, pueden emplearse otras técnicas
para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación
viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para
preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de
hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. En
la técnica se conocen protocolos y técnicas de inmunización para el
aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión. También se
conocen compañeros de fusión (por ejemplo células de mieloma murino)
y procedimientos de fusión.
Los anticuerpos monoclonales humanos pueden
generarse usando ratones transgénicos que llevan los genes de
inmunoglobulina humana en lugar del sistema de ratón. Se usan
esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el
antígeno de interés para producir hibridomas que secretan mAb
humanas con afinidades específicas por epítopes de una proteína
humana (véase, por ejemplo, Wood y col. Solicitud Internacional WO
91/00906, Kucherlapati y col. Publicación PCT WO 91/10741; Lonberg y
col. Solicitud Internacional WO 92/03918; Kay y col. Solicitud
Internacional 92/03917; Lonberg, N. y col. 1994 Nature 368:
856-859; Green, L.L. y col. 1994 Nature Genet. 7:
13-21; Morrison, S.L. y col. 1994 Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman y col. 1993 Year
Immunol 7: 33-40; Tuaillon y col. 1993 PNAS 90:
3720-3724; Bruggeman y col. 1991 Eur J Immunol 21:
1323-1326).
En una realización, pueden generarse hibridomas
a partir de células B-1 CD5+ humanas. Como
alternativa, pueden usarse hibridomas murinos "humanizados" que
reconocen "antígenos isquémicos" de reacción cruzada.
También pueden generarse anticuerpos
monoclonales por otros procedimientos conocidos por los expertos en
la materia de la tecnología de ADN recombinante. Se ha desarrollado
un procedimiento alternativo, denominado procedimiento de
"presentación de anticuerpos combinatorios" para identificar y
aislar fragmentos de anticuerpo que tienen una especificidad de
antígeno particular, y puede utilizarse para producir anticuerpos
monoclonales (como descripciones de presentación de anticuerpos
combinatorios véase, por ejemplo, Sastry y col. 1989 PNAS 86: 5728;
Huse y col. 1989 Science 246: 1275; y Orlandi y col. 1989 PNAS 86:
3833). Después de inmunizar a un animal con un inmunógeno como se ha
descrito anteriormente, se clona el repertorio de anticuerpos del
conjunto de células B resultante. Generalmente se conocen
procedimientos para obtener la secuencia de ADN de las regiones
variables de una población diversa de moléculas de inmunoglobulina
por medio del uso de una mezcla de cebadores oligoméricos y PCR. Por
ejemplo, pueden usarse cebadores oligonucleotídicos mixtos
correspondientes a las secuencias líder 5' (péptido señal) y/o
secuencias flanqueantes 1 (FR1), así como cebadores para un cebador
de región constante 3' conservada para la amplificación por PCR de
las regiones variables de cadena pesada y ligera a partir de varios
anticuerpos murinos (Larrick y col., 1991, Biotechniques 11:
152-156). También puede usarse una estrategia
similar para amplificar regiones variables de cadena pesada y ligera
humana a partir de anticuerpos humanos (Larrick y col., 1991,
Methods: Companion to Methods in Enzymology 2:
106-110).
En una realización ilustrativa, se aísla ARN a
partir de linfocitos B, por ejemplo, células de sangre periférica,
médula ósea o preparaciones de bazo, usando protocolos
convencionales (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202;
Orlandi, y col. PNAS (1989) 86: 3833-3837; Sastry y
col., PNAS (1989) 86: 5728-5732; y Huse y col.
(1989) Science 246: 1275-1281). Se sintetiza ADNc de
primera cadena usando cebadores específicos para la región constante
de la cadena o cadenas pesadas y cada una de las cadenas ligeras
\kappa y \lambda, así como cebadores para la secuencia señal.
Usando cebadores de PCR de región variable, se amplifican las
regiones variables de las cadenas pesada y ligera, cada una sola o
en combinación, y se ligan en vectores apropiados para una
manipulación adicional en la generación de paquetes de presentación.
Los cebadores oligonucleotídicos útiles en los protocolos de
amplificación pueden ser únicos o degenerados o pueden incorporar
inosina en posiciones degeneradas. También pueden incorporarse
secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los
cebadores para permitir la clonación del fragmento amplificado en un
vector en una fase de lectura predeterminada para la expresión.
La biblioteca de genes V clonada a partir del
repertorio de anticuerpos obtenidos por inmunización puede
expresarse por una población de paquetes de presentación,
preferentemente procedentes de un fago filamentoso, para formar una
biblioteca de presentación de anticuerpos. Idealmente, el paquete de
presentación comprende un sistema que permite el muestreo de
bibliotecas de presentación de anticuerpos variegadas muy grandes,
una clasificación rápida después de cada vuelta de separación por
afinidad y un fácil aislamiento del gen de anticuerpo a partir de
los paquetes de presentación purificados. Además de los kits
disponibles en el mercado para generar bibliotecas de presentación
en fagos (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody
System, nº de catálogo 27-9400-01; y
el kit de presentación en fagos Stratagene SurfZAP™, nº de
catálogo 240612), pueden encontrarse ejemplos de procedimientos y
reactivos particularmente susceptibles de usarse en la generación de
una biblioteca de presentación de anticuerpos variegada en, por
ejemplo, Ladner y col. Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; Kang
y col. Publicación Internacional Nº WO 92/18619; Dower y col.
Publicación Internacional Nº WO 91/17271; Winter y col. Publicación
Internacional Nº WO 92/20791; Markland y col. Publicación
Internacional Nº WO 92/15679; Breitling y col. Publicación
Internacional Nº WO 93/01288; McCafferty y col. Publicación
Internacional Nº WO 92/01047; Garrard y col. Publicación
Internacional Nº WO 92/09690; Ladner y col. Publicación
Internacional Nº WO 90/02809; Fuchs y col. (1991) Bio/Technology 9:
1370-1372; Hay y col. (1992) Hum Antibod Hybridomas
3: 81-85; Huse y col. (1989) Science 246:
1275-1281; Griffths y col. (1993) EMBO J 12:
725-734; Hawkins y col. (1992) J Mol Biol 226:
889-896; Clackson y col. (1991) Nature 352:
624-628; Gram y col. (1992) PNAS 89:
3576-3580; Garrad y col. (1991) Bio/Technology 9:
1373-1377; Hoogenboom y col. (1991) Nuc Acid Res 19:
4133-4137; y Barbas y col. (1991) PNAS 88:
7978-7982.
En ciertas realizaciones, los dominios de la
región V de la cadena pesada y ligera pueden expresarse en el mismo
polipéptido, unirse por un enlazador flexible para formar un
fragmento Fv monocatenario y el gen de scFV posteriormente clonarse
en el vector de expresión o genoma de fago deseado. Como se describe
en general en McCafferty y col., Nature (1990) 348:
552-554, pueden usarse dominios de V_{H} y V_{L}
completos de un anticuerpo, unidos por un enlazador flexible
(Gly_{4}-Ser)_{3} para producir un
anticuerpo monocatenario que puede hacer el paquete de presentación
separable basándose en la afinidad por el antígeno. Posteriormente,
los anticuerpos scFV aislados inmunorreactivos con el antígeno
pueden formularse en una preparación farmacéutica para su uso en el
presente procedimiento.
Una vez presentada en la superficie de un
paquete de presentación (por ejemplo, un fago filamentoso), la
biblioteca de anticuerpos se explora con el antígeno diana, o un
fragmento peptídico del mismo, para identificar y aislar paquetes
que expresan un anticuerpo que tiene la especificidad por el
antígeno diana. Puede recuperarse el ácido nucleico que codifica el
anticuerpo seleccionado a partir del paquete de presentación (por
ejemplo, a partir del genoma del fago) y subclonarse en otros
vectores de expresión por técnicas de ADN recombinante
convencionales.
Pueden obtenerse moléculas de anticuerpo
específicas con altas afinidades por una proteína de la superficie
de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la
materia, por ejemplo, procedimientos que implican la exploración de
bibliotecas (Ladner, R.C., y col., Patente Estados Unidos Nº
5.233.409; Ladner, R.C., y col., Patente Estados Unidos Nº
5.403.484). Además, los procedimientos de estas bibliotecas pueden
usarse en exploraciones para obtener determinantes de unión que son
miméticos de los determinantes estructurales de anticuerpos.
En particular, la superficie de unión de Fv de
una molécula de anticuerpo particular interacciona con su ligando
diana de acuerdo con principios de interacciones
proteína-proteína, por lo tanto los datos de
secuencia para V_{H} y V_{L} (la última de las cuales puede ser
de tipo de cadena \kappa o \lambda) es la base para las técnicas
de ingeniería de proteínas conocidas por los expertos en la materia.
Pueden obtenerse detalles de la superficie de la proteína que
comprende los determinantes de unión a partir de información de la
secuencia del anticuerpo, por un procedimiento de modelado usando
estructuras tridimensionales determinadas previamente de otros
anticuerpos obtenidas por estudios de RMN o datos cristalográficos.
Bajorath, J. y S. Sheriff, 1996, Proteins: Struct., Funct., and
Genet. 24 (2), 152-157; Webster, D.M. y A. R. Rees,
1995, "Molecular modeling of antibody-combining
sites", en S. Paul, Ed., Methods in Molecular Biol. 51, Antibody
Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, págs.
17-49; y Johnson, G., Wu, T.T. y E.A. Kabat, 1995,
"Seqhunt: A program to screen aligned nucleotide and amino acid
sequences", en Methods in Molecular Biol. 51, op. cit.,
págs.1-15.
En una realización, una biblioteca de péptidos
variegada se expresa por una población de paquetes de presentación
para formar una biblioteca de presentación de péptidos. Idealmente,
el paquete de presentación comprende un sistema que permite el
muestreo de bibliotecas de presentación de péptidos variegadas muy
grandes, una rápida clasificación después de cada vuelta de
separación por afinidad y el fácil aislamiento del gen que codifica
el péptido a partir de los paquetes de presentación purificados. Las
bibliotecas de presentación de péptidos pueden estar, por ejemplo,
en organismos procariotas y virus, que pueden amplificarse
rápidamente; son relativamente fáciles de manipular y permiten la
creación de un gran número de clones. Los paquetes de presentación
preferidos incluyen, por ejemplo, células bacterianas vegetativas,
esporas bacterianas y, más preferentemente, virus bacterianos
(especialmente virus de ADN). Sin embargo, la presente invención
también contempla el uso de células eucariotas, incluyendo levaduras
y sus esporas, como posibles paquetes de presentación. Las
bibliotecas de presentación de fagos se han descrito
anteriormente.
Otras técnicas incluyen cromatografía de
afinidad con un "receptor" apropiado, por ejemplo, un antígeno
diana, seguido de la identificación de los agentes de unión o
ligandos aislados por técnicas convencionales (por ejemplo,
espectrometría de masas y RMN). Preferentemente, el receptor soluble
se conjuga con un marcador (por ejemplo fluoróforos, enzimas
colorimétricas, radioisótopos o compuestos luminescentes) que pueden
detectarse para indicar la unión al ligando. Como alternativa,
pueden liberarse selectivamente compuestos inmovilizados y dejarse
difundir a través de una membrana para interaccionar con un
receptor.
También pueden sintetizarse bibliotecas
combinatorias de compuestos con "marcadores" para codificar la
identidad de cada miembro de la biblioteca (véase, por ejemplo, W.C.
Still y col., Solicitud Internacional WO 94/08051). En general, este
procedimiento caracteriza el uso de marcadores inertes pero
fácilmente detectables que se unen al soporte sólido o a los
compuestos. Cuando se detecta un compuesto activo, la identidad del
compuesto se determina por la identificación del único marcador
adjunto. Este procedimiento de marcaje permite la síntesis de
grandes bibliotecas de compuestos que pueden identificarse a niveles
muy bajos entre la serie total de todos los compuestos de la
biblioteca.
La expresión "anticuerpo modificado"
pretende incluir anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales,
anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados que se han
modificado, por ejemplo, por deleción, adición o sustitución de
partes del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede modificarse
delecionando la región de bisagra, generando de esta manera un
anticuerpo monovalente. Un anticuerpo de la presente invención puede
ser uno en el que la región variable, o una parte de la misma, por
ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se
generan en un organismo no humano, por ejemplo una rata o ratón.
Están dentro de la invención los anticuerpos quiméricos, con CDR
injertadas y humanizados. Están dentro de la invención anticuerpos
generados en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o ratón,
y después modificados, por ejemplo, en la región flanqueante
variable o constante, para reducir la antigenicidad en un ser
humano. Cualquier modificación está dentro del ámbito de la
invención siempre que el anticuerpo tenga al menos una parte de
unión a antígeno.
Pueden producirse anticuerpos quiméricos (por
ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón-humano)
por técnicas de ADN recombinante conocidas en este campo. Por
ejemplo, un gen que codifica la región constante Fc de una molécula
de anticuerpo monoclonal murino (o de otra especie) se digiere con
enzimas de restricción para retirar la región que codifica la Fc
murina, y se sustituye por la parte equivalente de un gen que
codifica una región constante Fc humana. (Véase Robinson y col.,
Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, y col.,
Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, M., Solicitud de
Patente Europea 171.496; Morrison y col., Solicitud de Patente
Europea 173.494; Neuberger y col., Solicitud Internacional WO
86/01533; Cabilly y col. Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567;
Cabilly y col., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better y col.
(1988 Science 240: 1041-1043); Liu y col. (1987)
PNAS 84: 3439-3443; Liu y col., 1987, J. Immunol.
139: 3521-3526; Sun y col. (1987) PNAS 84:
214-218; Nishimura y col., 1987, Canc. Res. 47:
999-1005; Wood y col. (1985) Nature 314:
446-449; y Shaw y col., 1988, J. Natl Cancer Inst.
80: 1553-1559).
Un anticuerpo quimérico puede humanizarse
adicionalmente reemplazando secuencias de la región variable Fv que
no están implicadas directamente en la unión al antígeno por
secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas. Se
proporcionan procedimientos generales para generar anticuerpos
humanizados por Morrison, S. L., 1985, Science 229:
1202-1207, por Oi y col., 1986, BioTechniques 4:
214, y por Queen y col. documentos US 5.585.089, US 5.693.761 y US
5.693.762. Esos procedimientos incluyen el aislamiento, la
manipulación y la expresión de las secuencias de ácido nucleico que
codifican todo o parte de las regiones variables Fv de
inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Las
fuentes de dicho ácido nucleico son bien conocidas para los expertos
en la materia y pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de 7E3, un
hibridoma productor de anticuerpos
anti-GPII_{b}DIII_{a}. El ADN recombinante que
codifica el anticuerpo quimérico, o un fragmento del mismo, después
puede clonarse en un vector de expresión apropiado. Como
alternativa, pueden producirse anticuerpos humanizados adecuados por
sustitución de CDR. Patente de Estados Unidos Nº 5.225.539; Jones y
col. 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan y col. 1988
Science 239: 1534; y Beidler y col. 1988 J. Immunol. 141:
4053-4060.
Pueden producirse anticuerpos humanizados o con
CDR injertadas por injerto de CDR o sustitución de CDR, en los que
pueden reemplazarse una, dos o todas las CDR de una cadena de
inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, la Patente Estados Nº
5.225.539; Jones y col. 1986 Nature 321: 552-525;
Verhoeyan y col. 1988 Science 239: 1534; Beidler y col. 1988 J.
Immunol. 141: 4053-4060; Winter US 5.225.539. Winter
describe un procedimiento de injerto de CDR que puede usarse para
preparar anticuerpos humanizados (Solicitud de Patente del Reino
Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Winter US
5.225.539).
Un anticuerpo humanizado o con CDR injertadas
tendrá al menos una o dos, pero generalmente todas las CDR del
receptor (de cadenas de inmunoglobulina pesadas y/o ligeras)
remplazadas por una CDR del donante. Preferentemente, el donante
será un anticuerpo de roedor, por ejemplo, un anticuerpo de rata o
ratón, y el receptor será una región flanqueante humana o una región
flanqueante consenso humana. Típicamente, la inmunoglobulina que
proporciona la CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina
que proporciona la región flanqueante se denomina "aceptora".
En una realización, la inmunoglobulina donante es una
inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de roedor). La región
flanqueante aceptora puede ser una región flanqueante natural (por
ejemplo, humana) o una región flanqueante consenso, o una secuencia
con una identidad de aproximadamente un 85% o mayor, preferentemente
del 90%, 95%, 99% o mayor a la misma.
Todas las CDR de un anticuerpo particular pueden
reemplazarse por al menos una parte de una CDR no humana o sólo
algunas de las CDR pueden reemplazarse por CDR no humanas. Sólo es
necesario reemplazar el número de CDR necesarias para la unión del
anticuerpo humanizado al receptor Fc.
También están dentro del ámbito de la invención
anticuerpos quiméricos y humanizados en los que se han sustituido,
delecionado o añadido aminoácidos específicos. En particular, los
anticuerpos humanizados preferidos tienen sustituciones de
aminoácidos en la región flanqueante, para mejorar la unión al
antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado tendrá restos
flanqueantes idénticos al resto flanqueante del donante o a otro
aminoácido distinto del resto flanqueante del receptor. Como otro
ejemplo, en un anticuerpo humanizado que tiene CDR de ratón, pueden
reemplazarse aminoácidos localizados en la región flanqueante humana
por los aminoácidos localizados en las posiciones correspondientes
en el anticuerpo de ratón. Se sabe que estas sustituciones mejoran
la unión de anticuerpos humanizados al antígeno en algunos
casos.
Como se ha descrito anteriormente, la expresión
"parte de unión antígeno" o "parte de anticuerpo" o
"fragmento", como se usa en la presente memoria, se refiere a
uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de
unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, un antígeno
diana, por ejemplo un antígeno isquémico). Se obtienen fragmentos de
anticuerpo de la invención usando procedimientos convencionales
conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la digestión
de un anticuerpo con pepsina produce fragmentos F(ab')_{2}
y múltiples fragmentos pequeños. La reducción con mercaptoetanol de
un anticuerpo produce cadenas pesadas y ligeras individuales. La
digestión de un anticuerpo con papaína produce fragmentos Fab
individuales y el fragmento Fc. Los fragmentos de anticuerpos se
exploran con respecto a su utilidad de la misma manera que los
anticuerpos intactos, como se ha descrito anteriormente.
La secuencia de nucleótidos de la región
variable de la cadena pesada de IgM de 22A5 se muestra en la Figura
4A (SEC ID Nº: 1), y la secuencia de aminoácidos de la región
variable de la cadena pesada de la IgM de 22A5 se muestra en la
Figura 5A (SEC ID Nº: 2). El dominio CDR1 de la región variable de
cadena pesada corresponde a los aminoácidos aproximadamente 30 a 34
de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 4) y comprende los nucleótidos
aproximadamente 91-105 de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID
Nº: 3) y el dominio CDR2 de la región variable de cadena pesada
corresponde a los aminoácidos 49 a 65 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº:
6) e incluye los nucleótidos 148-198 de la SEC ID
Nº: 1 (SEC ID Nº: 5).
La secuencia de nucleótidos de la región
variable de cadena ligera de IgM de 22A5 se muestra en la Figura 4B
(SEC ID Nº: 7), y la secuencia de aminoácidos de la región variable
de cadena ligera de IgM de 22A5 se muestra en la Figura 5B (SEC ID
Nº: 8). El dominio CDR1 de la región variable de cadena ligera
corresponde a los aminoácidos aproximadamente 23 a 33 de la de la
SEC ID Nº: 8 (SEC ID Nº: 10) e incluye los nucleótidos
aproximadamente 71-103 de la SEC ID Nº: 7 (SEC ID
Nº: 9) y el dominio CDR2 de la región variable de cadena ligera
corresponde a aproximadamente los aminoácidos 49 a 55 de la SEC ID
Nº: 8 (SEC ID Nº: 12) e incluye los nucleótidos aproximadamente 149
a 169 de la SEC ID Nº: 7 (SEC ID Nº: 11).
El experto en la materia apreciará que pueden
obtenerse secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos de
la presente invención, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, un
dominio CDR, tal como un dominio CDR2, o fragmentos) a partir de las
secuencias de nucleótidos y aminoácidos descritas en la presente
solicitud usando el código genético y las técnicas de biología
molecular convencionales. Además, el experto en la materia apreciará
que debido a la degeneración del código genético, otras secuencias
de nucleótidos pueden codificar las secuencias de aminoácidos
indicadas en la presente memoria.
Las composiciones de ácido nucleico, aunque a
menudo están en una secuencia nativa (excepto sitios de restricción
modificados y similares) procedente de ADNc, genómico o mezclas,
pueden estar mutados, de acuerdo con técnicas convencionales, para
proporcionar secuencias génicas. En el caso de secuencias
codificantes, estas mutaciones pueden afectar a la secuencia de
aminoácidos cuando se desee. En particular, se contemplan secuencias
de nucleótidos substancialmente idénticas o derivadas de secuencias
nativas V, D, J, constantes, cambios y otras secuencias descritas en
la presente memoria (indicando "derivada" que una secuencia es
idéntica o está modificada a partir de otra secuencia).
En una realización, un ácido nucleico aislado
comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena
pesada de IgM de 22A5 que tiene una secuencia de nucleótidos como se
muestra en la Figura 4A (SEC ID Nº: 1) o una secuencia con al menos
un 96%, 97%, 98%, 99% de identidad, o mayor, con la misma. En otra
realización, el ácido nucleico aislado codifica una secuencia de
nucleótidos de región variable de cadena ligera de IgM de 22A5 que
tiene una secuencia de nucleótidos como la mostrada en la Figura 4B
(SEC ID Nº: 7) o una secuencia con al menos un 96%, 97%, 98% o 99%
de identidad, o mayor, con la misma.
En otra realización, los presentes inventores
describen un ácido nucleico aislado que codifica un dominio CDR1 de
cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 4, o un fragmento o forma modificada de la misma. Este ácido
nucleico puede codificar sólo la región CDR1 o puede codificar una
región variable de cadena pesada de anticuerpo entera. Por ejemplo,
el ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena
pesada que tiene un dominio CDR2 que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 6. En otra realización, la invención
proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un dominio CDR2
de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID Nº: 6, o un fragmento o forma modificada de la misma. Este ácido
nucleico puede codificar sólo la región CDR2 o puede codificar una
región variable de cadena pesada de anticuerpo entera. Por ejemplo,
el ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena
ligera que tiene un dominio CDR1 que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.
En otra realización, los presentes inventores
describen un ácido nucleico aislado que codifica un dominio CDR1 de
cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID
Nº: 10, o un fragmento o forma modificada de la misma. Este ácido
nucleico puede codificar sólo la región CDR1 o puede codificar una
región variable de cadena ligera de anticuerpo entera. Por ejemplo,
el ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena
ligera que tiene un dominio CDR2 que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 12. En otra realización más, la
invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un
dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID Nº: 12, o un fragmento o forma modificada
de la misma. Este ácido nucleico puede codificar sólo la región CDR2
o puede codificar una región variable de cadena ligera de anticuerpo
entera. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una región
variable de cadena ligera que tiene un dominio CDR1 que comprende la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10.
Los inhibidores pueden incorporarse en
composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un
sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un
inhibidor (por ejemplo, una inmunoglobulina patógena modificada) y
un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente
memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y
cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos,
agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de
retraso de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente
compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables
incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina
tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así
como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible
incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes
tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Los
vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además
cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes
humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que aumentan
la vida útil o eficacia del anticuerpo o parte de anticuerpo.
Una composición farmacéutica se formula para ser
compatible con la vía de administración para la que está destinada.
Los ejemplos de vías de administración pueden incluir, por ejemplo,
la administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intradérmica,
subcutánea, oral (por ejemplo inhalación), transdérmica (tópica),
transmucosa y rectal. De esta manera, las composiciones de la
presente invención pueden estar en una diversidad de formas. Éstas
incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y
sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones
inyectables y de infusión), dispersiones o suspensiones,
comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma
preferida depende del modo de administración y la aplicación
terapéutica deseados. Las composiciones preferidas típicas están en
forma de soluciones inyectables o de infusión, tales como
composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de
seres humanos con otros anticuerpos. Un modo de administración
preferido es la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa,
subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una realización
preferida, el anticuerpo se administra por infusión o inyección
intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se
administra por inyección intramuscular o subcutánea.
Las soluciones o suspensiones usadas para
aplicación parenteral, por ejemplo intradérmica o subcutánea, pueden
incluir, por ejemplo, los siguientes componentes: un diluyente
estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites
fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros
disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol
bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico
o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido
etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o
fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro
sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales
como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral
puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de
múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son
solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la
preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables
estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos
adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua
bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución
salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la
composición debe ser estéril y debe ser fluida en tal medida que se
pueda administrar fácilmente por medio de una jeringa. Debe ser
estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y tiene
que conservarse contra la acción contaminante de microorganismos
tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o
medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol
(por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y
similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada
puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento
tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de
partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso
de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos
puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y
antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido
ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible
incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes
tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La
absorción prolongada de las composiciones inyectables puede
conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la
absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.
Las composiciones terapéuticas típicamente deben
ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y
almacenamiento. La composición puede formularse como una solución,
microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada
adecuada para una alta concentración de fármaco. Las soluciones
inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto
activo (es decir, anticuerpo o parte de anticuerpo) en la cantidad
requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación
ingredientes enumerados anteriormente, cuando se requiera, seguido
de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se
preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que
contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes
requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos
estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles,
los procedimientos de preparación preferidos son secado al vacío y
liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más
cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución
filtrada de forma estéril previamente del mismo. La fluidez
apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el
uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento
del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y
mediante el uso de tensioactivos.
Los inhibidores pueden administrarse por una
diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, aunque para
muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo de administración
preferido es inyección o infusión intravenosa. Como apreciará el
experto en la materia, la vía y/o modo de administración variarán
dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el
compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá al
compuesto frente a la liberación rápida, tal como una formulación de
liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y
sistemas de liberación microencapsulados. Pueden usarse polímeros
biocompatibles y biodegradables tales como
etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido
poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos
procedimientos para la preparación de estas formulaciones están
patentados o se conocen en general por los expertos en la materia.
Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery
Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York,
1978.
En ciertas realizaciones, un inhibidor puede
administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o
un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros
ingredientes si se desea) también puede encerrarse en una cápsula de
gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos o
incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la
administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse
con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles,
comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones,
jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la
invención por una vía distinta de la administración parenteral,
puede ser necesario recubrir el compuesto o coadministrar el
compuesto con un material para impedir su inactivación. Para la
administración por inhalación, los compuestos se administran en
forma de una pulverización de aerosol desde un recipiente o
dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por
ejemplo un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.
El inhibidor puede prepararse con vehículos que
protegerán al compuesto frente a la eliminación rápida del cuerpo,
tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo
implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden usarse
polímeros biodegradables y biocompatibles tales como
etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido
poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Para
los expertos en la materia serán evidentes procedimientos para la
preparación de estas formulaciones. Los materiales también pueden
obtenerse comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals,
Inc. También pueden usarse suspensiones liposomales como vehículos
farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse de acuerdo con
procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por
ejemplo, como se describe en la Patente Estados Unidos Nº
4.522.811.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse
en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para
la administración.
Este ejemplo muestra que ratones deficientes en
el sistema del complemento eran resistentes a la lesión por
isquemia-reperfusión.
Para examinar el mecanismo de la lesión por
isquemia-reperfusión, se trataron ratones
deficientes en el componente C3 del complemento en el modelo de
extremidad inferior. Los ratones C3-/- se protegieron parcialmente
de la lesión basándose en una reducción aproximada del 50% en el
índice de permeabilidad (véase, Weiser y col. (1996) J. Exp. Med.
1857-1864). De esta manera, el componente C3 del
complemento es esencial para la inducción de la lesión completa en
este modelo murino.
Los experimentos en Weiser y col. no
identificaron cómo se activaba al complemento. El sistema del
complemento del suero puede activarse por al menos tres rutas
distintas, la ruta clásica, de lectinas o alternativa. El
conocimiento de qué ruta está implicada es importante, ya que
sugiere un mecanismo de la lesión. Por ejemplo, la ruta clásica se
activa muy eficazmente por los isotipos IgM e IgG de
inmunoglobulinas o por la proteína de reconocimiento del suero
proteína C reactiva. Sin embargo, la ruta de lectinas se activa
después del reconocimiento de carbohidratos específicos tales como
manano por la lectina de unión a manano (MBL) (Epstein y col.,
(1996) Immunol 8, 29-35). En ambas rutas, se
requiere el componente C4 del complemento para formar un complejo
enzimático con C2 que cataliza la escisión del componente central
C3. Por el contrario, la ruta alternativa activa espontáneamente la
conducción a la conversión de C3 en su formativa (C3b) y la unión a
tejidos extraños o propios. La ruta se regula estrechamente ya que
todas las células huésped expresan inhibidores de amplificación de
la ruta del complemento por inactivación o desplazamiento de la C3
convertasa (Muller-Eberhard, H.J., (1988) Ann. Rev.
Biochem. 57 321-347). Una estrategia para determinar
la ruta implicada es el uso de ratones deficientes en C4, es decir,
que no pueden formar C3 convertasa por la ruta clásica o de
lectinas. La comparación de ratones deficientes en C3 o C4 con
controles de tipo silvestre (WT) en el modelo de extremidad
inferior, reveló que también se requería C4 para la inducción de la
lesión completa (Weiser y col. supra). Este descubrimiento
era importante ya que sugería que podría estar implicado un
anticuerpo o MBL.
Este Ejemplo muestra que ratones deficientes en
inmunoglobulinas eran resistentes a la lesión por
isquemia-reperfusión.
Para determinar si un anticuerpo estaba
implicado en la mediación de la lesión por I/R, se caracterizaron
ratones totalmente deficientes en inmunoglobulina, RAG2-/-
(deficientes en el gen-2 de activación de
recombinasa) junto con los animales deficientes en el complemento en
el modelo intestinal. Significativamente, los ratones RAG2-/-
estaban protegidos en un nivel similar al observado en los animales
deficientes en el complemento (Weiser y col. supra). Como los
animales RAG2-/- también carecen de linfocitos maduros, era
importante determinar que el efecto patógeno era dependiente del
anticuerpo (Shinkai y col. (1992) Cell 68, 855-867).
Para confirmar que la lesión estaba mediada por anticuerpos del
suero, los animales deficientes se reconstituyeron con suero de
ratón normal (Weiser y col. supra) o IgM purificada (Williams
y col. (1999) J. Appl Physiol 86; 938-42). En ambos
casos, los ratones RAG2-/- reconstituidos ya no estaban protegidos y
se restauró la lesión. En los experimentos posteriores se usó un
modelo de lesión intestinal como en este modelo, se cree que la
lesión está mediada principalmente por el complemento.
La interpretación de estos resultados es que
durante el periodo de isquemia, los neo- antígenos se expresan o
exponen en la superficie de las células endoteliales. Las IgM
circulantes parecen reconocer el nuevo determinante, unirse y
activar la ruta clásica del complemento. Aunque no se conoce la
naturaleza del antígeno, la IgM en lugar de la IgG parece ser la
principal responsable de la activación del complemento ya que la
reconstitución de ratones deficientes con IgG reunida no restauraba
significativamente la lesión en los ratones. Una hipótesis
alternativa es que hay otro acontecimiento inicial tal como la ruta
de MBL que reconoce la superficie endotelial alterada, induce la
activación del complemento de bajo nivel que a su vez expone nuevos
sitios antigénicos y la ruta se amplifica por unión de IgM.
Como se cree que una fracción principal de la
IgM circulante representa el anticuerpo natural, es decir el
producto de genes de la línea germinal reordenados, es posible que
también puedan protegerse ratones que llevan deficiencias en la
fracción B-1 de los linfocitos. Las células
B-1 tienen un fenotipo distinto de las células
B-2 más convencionales ya que expresan bajos niveles
de IgD y CD23 y una fracción principal expresa la proteína de la
superficie celular (Hardy y col., (1994) Immunol. Rev.: 137, 91;
Kantor y col. (1993) Annu. Rev. Immunol. 11,
501-538, 1993. Las células B-1
también se distinguen por una circulación reducida en ratones, una
frecuencia limitada en los ganglios linfáticos periféricos y bazo y
están localizadas principalmente dentro de la cavidad peritoneal.
Para examinar un papel para las células B-1 como
fuente de IgM patógena, se reconstituyeron ratones deficientes en
anticuerpos (RAG2-/-) con 5 x 10^{5} células B-1
peritoneales y se dejaron en reposo aproximadamente 30 días antes
del tratamiento. Los niveles circulantes de IgM alcanzan un
intervalo casi normal en el mes posterior a la transferencia
adoptiva. La caracterización de los ratones reconstituidos con
células B-1 en el modelo de isquemia intestinal
confirmó que las células B-1 eran una fuente
principal de IgM patógena (véase Williams y col. (1999)
supra). Ésta fue una observación importante porque el
repertorio de anticuerpo natural de células B-1 está
considerablemente más limitado de lo que sería de esperar en el caso
de células B-2 convencionales. Por lo tanto, es
posible que el anticuerpo patógeno represente un producto de la
línea germinal.
La caracterización inicial de ratones knockout
Cr2-/- reveló una reducción de aproximadamente un 50% en la
frecuencia de células B-1a o B-1 o
CD5+ (Ahearn y col. (1996) Immunity 4: 251-262).
Aunque la caracterización de otra cepa de ratones deficientes en Cr2
no identificó una reducción similar (Molina y col. (1996) Proc.
Natl. Acad Sci. USA 93, 3357-3361). No se sabe si la
diferencia en frecuencia de células CD5+ se debía a una variación en
las características basales de la cepa o a diferencias ambientales.
A pesar de la menor frecuencia de células B-1a en
los ratones Cr2-/-, los niveles circulantes de IgM estaban dentro
del intervalo normal. Estos descubrimientos sugerían que el
repertorio de IgM podría ser diferente en los animales deficientes
en Cr2. Para ensayar esta hipótesis, se caracterizaron ratones en el
modelo intestinal I/R. Sorprendentemente, los ratones Cr2-/- estaban
igualmente protegidos que los ratones deficientes en anticuerpo
completo (Figura 1). La comparación de supervivencia durante el
periodo de cinco días después del tratamiento en el modelo
intestinal demostró un aumento significativo en la mortalidad del WT
en comparación con los animales deficientes en Cr2. De forma
coherente con una mayor mortalidad, se observó una notable reducción
en la lesión en secciones de tejido recogidas de ratones WT o
deficientes en Cr2-/- tratados.
Se observó una lesión extensa en la capa mucosa
del intestino en ratones WT o ratones Cr2-/- reconstituidos con
células B-1 o IgM reunida. Por el contrario, las
secciones de tejido aisladas a partir de ratones Cr2-/- tratados
eran similares a las de los controles simulados. De esta manera, a
pesar de los niveles circulantes normales de IgM, los ratones
deficientes en Cr2 estaban protegidos de la lesión. Estos resultados
no sólo confirman la importancia de células B-1 como
fuente de anticuerpo patógeno, sino que sugieren que el sistema del
complemento está implicado de alguna manera en la formación o
mantenimiento del repertorio de anticuerpos naturales. Por ejemplo,
el complemento puede estar implicado en la selección positiva de
células B-1.
Este Ejemplo describe la generación de un clon
de hibridoma específico a partir de células B-1
normales y la identificación de un clon que produce una IgM
patógena. Se demostró que la IgM patógena restauraba la lesión in
vivo en ratones deficientes en anticuerpo.
Los estudios en ratones que llevan una
deficiencia en receptores del complemento CD21/CD35 reveló que los
ratones carecían del anticuerpo patógeno. Este descubrimiento fue
inesperado porque tienen un nivel normal de IgM en su sangre. Estos
descubrimientos condujeron a la hipótesis de que una población
especial de células B denominadas células B-1 son
responsables de la secreción de la IgM patógena. Por ejemplo, el
injerto de ratones deficientes en el receptor (Cr2-/-) con células
B-1 de ratones normales restauró la lesión,
confirmando la importancia de las células B-1. Para
identificar el anticuerpo o anticuerpos específicos responsables de
la lesión, se construyó un panel de clones de hibridoma a partir de
un conjunto enriquecido de células B-1 peritoneales
recogidas a partir de ratones normales. La estrategia general para
preparar hibridomas a partir de una fracción enriquecida de células
peritoneales incluye la recolección de células peritoneales de
ratones tratados 7 días antes con IL-10 y
posteriormente enriquecidos en células B CD23^{+} por selección
negativa con perlas magnéticas. Las células B enriquecidas se
analizan por FACS después de la tinción con IgM,
Mac-1 y Mab específicos de CD23. La población
enriquecida se activa adicionalmente por cultivo con LPS durante 24
horas. Las células activadas se hibridan con células de mieloma como
compañeros de fusión en presencia de PEG y se cultivan en medio
selectivo de HAT. Los hibridomas se exploran con respecto a los
clones de secreción de IgM por ELISA y los pocillos positivos se
expanden para la purificación de IgM.
Se analizaron 22 clones de hibridoma de
secreción de IgM reuniendo una cantidad igual de producto de IgM a
partir de cada uno de los clones. El tratamiento de ratones
deficientes en anticuerpo con la IgM reunida restauró la lesión de
forma similar a la observada con la IgM reunida a partir del suero.
Este hallazgo confirmó que la IgM patógena estaba entre los 22
hibridomas producidos. Dividiendo los conjuntos en fracciones, es
decir 1-11 y 12-22, y los ratones de
tratamiento con las dos fracciones, se observó que el anticuerpo
patógeno se fraccionaba con el conjunto que incluía el clon número
22. Finalmente, los ratones se reconstituyeron con el clon 17 ó 22.
El clon 22 restauró la lesión mientras que los otros clones no lo
hicieron (véase la Fig. 3A y 3B).
Se han propuesto dos modelos diferentes para
explicar el desarrollo de células B-1. La hipótesis
del linaje propone que las células B-1 se
desarrollan en las primeras fases de la vida fetal como una
población distinta (Kantor y col. (1993) supra). Como
alternativa, las células B-1 se desarrollan a partir
de los mismos progenitores que las células B convencionales pero
dependiendo de su entorno, es decir si se encuentran con antígeno,
se desarrollan para dar B-1 o retienen el fenotipo
de las células B-2 (Wortis, H.H. (1992) Int. Rev.
Immunol. 8, 235; Clarke, J. (1998) Exp. Med. 187,
1325-1334). Independientemente de su origen, se sabe
que las células B-1 no se reponen por la médula ósea
de adulto a la misma frecuencia que las células B-2
y que su fenotipo es más similar al de las células B del hígado de
las primeras fases fetales o las células de médula ósea (MO) de
recién nacido. De forma coherente con un origen temprano, su
repertorio tiende a desviarse hacia la expresión de genes VH más
proximales y la adición de N-nucleótidos está
limitada (Gu y col. (1990) EMBO J 9, 2133; Feeney, J. (1990) Exp.
Med. 172, 1377). Parece razonable que dada la baja reposición por
células madre de MO adulta, las células B-1 se
auto-renuevan y la estimulación por antígeno podría
ser importante en su renovación, expansión o incluso la selección
inicial (Hayakawa y col., (1986) Eur. J. Immunol. 16, 1313). De
hecho, de forma intrínseca al modelo convencional, las células
B-1 deben seleccionarse con antígeno.
Las pruebas que respaldan un requisito de
señalización de receptor de células B (RCB) para la selección
positiva de células B-1 proceden de ratones que
llevan mutaciones que alteran la señalización de RCB. Por ejemplo,
la alteración en la señalización de RCB a través de CD19 (19, 20),
vav (21) o Btk (22) afecta espectacularmente al desarrollo de las
células B-1. Por el contrario, la pérdida de
selección negativa tal como en ratones deficientes CD22- o
SHP-1 puede llevar a un aumento en la frecuencia de
células B-1 (O'Keefe y col. (1996) Science 274,
798-801; Shultz y col. (1993) Cell 73, 1445).
Ciertos estudios elegantes recientes con ratones que llevan dos
transgenes de Ig distintos, V_{H}12 (fenotipo de célula
B-1) o V_{H}B1-8 (fenotipo de
célula B-2) respaldan la perspectiva de que las
células B-1 se seleccionan positivamente por
autoantígenos. Por ejemplo, las células B que expresan de V_{H}12
solo o junto con B1-8 desarrollaron un fenotipo de
célula B-1. Mientras tanto, se identificaron pocas
células B, si se identificó alguna, que expresaban el
B1-8 tg sólo. De esta manera, estos resultados
sugerían que encontrar células B transgénicas con
auto-PtC tenía como resultado la expansión de las
que expresaban V_{H}12. La selección de células
B-1 se notificó recientemente por Hardy y col.
(1994) Immunol. Rev. 137, 91). En su modelo, se seleccionaron
células B que expresaban un transgén de inmunoglobulina específico
para Thy 1.1 y se expandieron en ratones que expresaban el antígeno
afín. Por el contrario, no se encontraban células de transgén +
B-1 en ratones que expresaban el alotipo alternativo
Thy 1.2.
¿Dónde encaja el complemento en el desarrollo de
las células B-1? La reducción global en la
frecuencia de células B-1a y la pérdida más
específica de células B-1 que expresan IgM
implicadas en la lesión por I/R sugiere un papel para CD21/CD35 en
la selección positiva o mantenimiento de células
B-1a. Un posible papel del complemento es que
aumenta la señalización de RCB tras encontrarse con el antígeno
afín. Los estudios bioquímicos y análisis de ratones deficientes en
CD21/CD35 demuestran la importancia de la señalización de
co-receptores en la activación y supervivencia de
células B convencionales (Carroll, M.C., (1998) Ann. Rev. Immunol
16, 545-568; Fearon y col. (1995) Annu. Rev. Immunol
13, 127-149). Es muy probable que las células
B-1 de forma similar utilicen la señalización de
co-receptores para aumentar la señal de RCB. Por
ejemplo, las bacterias expresan antígenos de células
B-1 típicos tales como fosforilcolina y no es poco
razonable pensar que el recubrimiento de bacterias con ligando del
complemento C3d aumentaría el entrecruzamiento del
co-receptor con el RCB y aumentaría la señalización
global. De esta manera, los antígenos expresados a menores
concentraciones requerirían potenciación del complemento para que la
célula B afín lo reconociera y se expandiera o seleccionara
positivamente. Otro papel para los receptores del complemento está
en la localización del antígeno en células dendríticas foliculares
(CDF) dentro del compartimento linfoide. Sin embargo, como la
población principal de células B-1 ocupa los tejidos
peritoneales, no está claro si encontrarían CDF dentro de
estructuras linfoides. No se conoce el sitio o sitios reales en los
que las células B-1 experimentan selección positiva.
Es posible que tengan que encontrar un antígeno afín en las primeras
fases del desarrollo fetal o en MO de recién nacido. Si éste es el
caso, sería de esperar que los receptores del complemento en células
estromáticas dentro de estos compartimentos se unieran al antígeno
para la presentación a las células B. Es posible que los receptores
del complemento participen en las dos fases del desarrollo. En
primer lugar, podrían potenciar la señalización de antígenos en la
selección positiva inicial. En segundo lugar, como las células
B-1 seleccionadas se reponen en sitios periféricos,
los receptores del complemento de nuevo podrían estar implicados en
la potenciación de la señalización de RCB.
La Figura 2 es un diagrama esquemático del papel
propuesto para el complemento y los receptores del complemento en la
selección positiva de linfocitos B-1 peritoneales.
La interacción de los antígenos recubiertos con ligando del
complemento (propios y no propios) produce un
co-ligamiento del co-receptor de
CD21/CD19 y RCB en la superficie celular conduciendo una mayor
señalización y selección positiva.
Los expertos en la materia reconocerán o podrán
averiguar sin usar más de una experimentación rutinaria, muchos
equivalentes de las realizaciones específicas de la invención
descrita en la presente memoria.
<110> C. Carroll, Michael
\hskip1cm D. Moore, Jr. Francis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA
INHIBIR LA LESIÓN POR REPERFUSIÓN MEDIADA POR INMUNOGLOBULINA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 10861-024001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US60/210.272
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<151>
08-06-2000
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<160> 12
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión
4.0.
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<210> 1
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<211> 338
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<212> ADN
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<213> Mus musculus
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)...(338)
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<211> 111
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<212> ADN
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<212> ADN
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<400> 12
\hskip1cm12
Claims (6)
1. Una inmunoglobulina aislada que actúa como
mediador en la lesión de tejidos posterior a una reperfusión, o
parte de unión a antígeno de la misma, que tiene una CDR1 de cadena
pesada que comprende la SEC ID Nº: 4 y una CDR2 de cadena pesada que
comprende la SEC ID Nº: 6.
2. La inmunoglobulina aislada de la
reivindicación 1, que es una IgM.
3. La inmunoglobulina aislada de la
reivindicación 1, que se produce por células
B-1.
4. La inmunoglobulina aislada de la
reivindicación 1, que tiene una mutación que altera la unión o
actividad del complemento.
5. Una célula huésped que produce la
inmunoglobulina aislada de las reivindicaciones 1 ó 4.
6. La célula huésped de la reivindicación 5 que
es una célula huésped de mamífero.
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AU2012200909B2 (en) * | 2004-03-01 | 2013-10-03 | Immune Disease Institute, Inc | Natural lgM antibodies and inhibitors thereof |
CA2560066A1 (en) * | 2004-03-01 | 2005-09-15 | The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. | Natural igm antibodies and inhibitors thereof |
WO2009035055A1 (ja) * | 2007-09-14 | 2009-03-19 | Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute | インスリン様成長因子-1(igf-1)産生促進剤 |
Family Cites Families (35)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4522811A (en) | 1982-07-08 | 1985-06-11 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
JPS6147500A (ja) | 1984-08-15 | 1986-03-07 | Res Dev Corp Of Japan | キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法 |
EP0173494A3 (en) | 1984-08-27 | 1987-11-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chimeric receptors by dna splicing and expression |
GB8422238D0 (en) | 1984-09-03 | 1984-10-10 | Neuberger M S | Chimeric proteins |
JPS61134325A (ja) | 1984-12-04 | 1986-06-21 | Teijin Ltd | ハイブリツド抗体遺伝子の発現方法 |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
CA1340288C (en) | 1988-09-02 | 1998-12-29 | Robert Charles Ladner | Generation and selection of novel binding proteins |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
WO1991000906A1 (en) | 1989-07-12 | 1991-01-24 | Genetics Institute, Inc. | Chimeric and transgenic animals capable of producing human antibodies |
EP0502060A4 (en) | 1989-11-13 | 1993-05-05 | Affymax Technologies N.V. | Spatially-addressable immobilization of anti-ligands on surfaces |
ATE356869T1 (de) | 1990-01-12 | 2007-04-15 | Amgen Fremont Inc | Bildung von xenogenen antikörpern |
US5427908A (en) | 1990-05-01 | 1995-06-27 | Affymax Technologies N.V. | Recombinant library screening methods |
GB9015198D0 (en) | 1990-07-10 | 1990-08-29 | Brien Caroline J O | Binding substance |
AU665190B2 (en) | 1990-07-10 | 1995-12-21 | Cambridge Antibody Technology Limited | Methods for producing members of specific binding pairs |
ES2246502T3 (es) | 1990-08-29 | 2006-02-16 | Genpharm International, Inc. | Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos. |
WO1992003917A1 (en) | 1990-08-29 | 1992-03-19 | Genpharm International | Homologous recombination in mammalian cells |
DE69129154T2 (de) | 1990-12-03 | 1998-08-20 | Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. | Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften |
AU663300B2 (en) | 1990-12-06 | 1995-10-05 | Affymetrix, Inc. | Very large scale immobilized polymer synthesis |
EP0575485A1 (en) | 1991-03-01 | 1993-12-29 | Dyax Corp. | Process for the development of binding mini-proteins |
ATE269401T1 (de) | 1991-04-10 | 2004-07-15 | Scripps Research Inst | Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden |
DE4122599C2 (de) | 1991-07-08 | 1993-11-11 | Deutsches Krebsforsch | Phagemid zum Screenen von Antikörpern |
US5677195A (en) | 1991-11-22 | 1997-10-14 | Affymax Technologies N.V. | Combinatorial strategies for polymer synthesis |
US5233409A (en) | 1992-02-25 | 1993-08-03 | Schwab Karl W | Color analysis of organic constituents in sedimentary rocks for thermal maturity |
US5359115A (en) | 1992-03-26 | 1994-10-25 | Affymax Technologies, N.V. | Methods for the synthesis of phosphonate esters |
US5573905A (en) | 1992-03-30 | 1996-11-12 | The Scripps Research Institute | Encoded combinatorial chemical libraries |
US5288514A (en) | 1992-09-14 | 1994-02-22 | The Regents Of The University Of California | Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support |
ATE244769T1 (de) | 1992-10-01 | 2003-07-15 | Univ Columbia | Komplexe kombinatorische chemische banken, die mit markierungen versehen sind |
EP0714409A1 (en) | 1993-06-16 | 1996-06-05 | Celltech Therapeutics Limited | Antibodies |
US5362899A (en) | 1993-09-09 | 1994-11-08 | Affymax Technologies, N.V. | Chiral synthesis of alpha-aminophosponic acids |
JPH11505704A (ja) * | 1995-05-17 | 1999-05-25 | リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ | アンチcd−19抗体の単鎖可変領域フラグメントを含む免疫コンジュゲート |
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