ES2343351T3 - Procedimientos y composiciones para inhibir la lesion por reperfusion mediada por inmunoglobulina. - Google Patents

Abstract

Una inmunoglobulina aislada que actúa como mediador en la lesión de tejidos posterior a una reperfusión, o parte de unión a antígeno de la misma, que tiene una CDR1 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 4 y una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 6.

Description

Procedimiento y composiciones para inhibir la lesión por reperfusión mediada por inmunoglobulina.

Antecedentes de la invención

El sistema del complemento participa tanto en la inmunidad innata como en la inmunidad adaptativa (Muller-Eberhard, H.J. (1988) Ann. Rev. Biochem. 57, 321-347; Carroll, M.C. (1998) Ann. Rev. Immunol 16, 545-568; Fearon y col., (1995) Annu. Rev. Immunol 13, 127-149). Estudios recientes que usan ratones deficientes en componentes específicos del complemento del suero o receptores del complemento (por ejemplo, CD21/CD35) no sólo han confirmado muchos papeles conocidos del complemento, sino que han proporcionado nuevas perspectivas sobre mecanismos importantes en la inmunidad natural y adaptativa (Carroll, M.C. (1998) supra). Por ejemplo, un mecanismo por medio del cual el complemento potencia la generación de respuestas de memoria a antígenos dependientes de células T es mediando una señal de supervivencia en células B del centro germinal (CG) a través del co-receptor CD21/CD19/Tapa-1. Como alternativa, los ratones deficientes han sido importantes para confirmar la importancia de identificar la ruta clásica como esencial para la inducción de lesiones (Weiser y col., (1996) J. Exp. Med. 1857-1864).

La lesión por isquemia-reperfusión (I/R) se refiere a una lesión inflamatoria en el endotelio y tejidos del parénquima subyacentes después de la reperfusión de tejidos hipóxicos. Es un síndrome general que es responsable tanto de la lesión aguda como de la lesión crónica en diversos tejidos que incluyen, por ejemplo, el miocardio, sistema nervioso central, extremidades inferiores e intestino. La lesión por isquemia-reperfusión puede producir necrosis y lesiones celulares irreversibles. Por ejemplo, la reperfusión del músculo esquelético isquémico produce una lesión en las células endoteliales caracterizada por fuga vascular con edema de permeabilidad (Weiser y col., (1996) J. Exp. Med. 1857-1864) y la reperfusión del intestino delgado conduce a la destrucción de la mucosa (Williams, y col., (1999) J. Appl. Physiol., 938-942). En general, cuanto mayor es el periodo de isquemia más pronunciada es la respuesta inflamatoria. El grado de lesión por I/R también se determina por factores tales como el tamaño de la región isquémica y los tejidos particulares implicados (Williams, y col., (1999) J. Appl.Physiol., 93 8-942).

Un mediador importante de la lesión por I/R es el sistema del complemento. Weisman y col. informaron sobre un mecanismo para bloquear parcialmente la lesión por I/R usando un inhibidor soluble del complemento C3b (sCR1) en un modelo cardiaco de rata (Weisman y col. (1990) Science 249, 146-151). El receptor CR1 soluble es muy eficaz para inactivar la C3 convertasa, es decir, el complejo enzimático que convierte C3 nativo en su forma C3b activa. El receptor CR1 actúa tanto como cofactor en la escisión por el factor I de C3b como en el desplazamiento de C3b de la convertasa. La inyección intravenosa en ratones de sCR1 antes de la inducción de isquemia redujo significativamente la lesión tras la reperfusión de los animales tratados. El examen histológico de los animales tratados reveló una reducción en el nivel de deposición del complemento en el músculo cardíaco y en el grado de lesión en el tejido (Weisman y col. (1990) supra). Se obtuvieron resultados similares pretratando ratones con sCR1 en un modelo de lesión en extremidades inferiores (Hill y col. (1992) J. Immunol. 149, 1723-1730). En este modelo, se bloqueó el flujo sanguíneo a la extremidad inferior durante aproximadamente 2 horas poniendo un torniquete en la extremidad inferior. Antes de restablecer el flujo sanguíneo a los tejidos, a los ratones se les administró albúmina radioyodada por vía intravenosa como marcador de permeabilidad.

Aunque estos estudios determinan que la lesión estaba mediada por el complemento no trataban la cuestión del mecanismo de inicio de la lesión. Weiser y col. han demostrado que los ratones deficientes en anticuerpo están parcialmente protegidos de la lesión en el modelo de extremidad inferior. La lesión se restaura por reconstitución con suero de ratón normal. Williams y col. ampliaron esta observación al modelo de intestino delgado y demostraron que la IgM purificada era suficiente para restaurar la lesión en los ratones deficientes en anticuerpo.

Hechtman y col. (1998), FASEB Journal Volumen 12, página a34, examinaron el papel de IgM procedente de células B1-a de un modelo murino de isquemia-reperfusión intestinal. Concluyeron que la lesión local después de la isquemia-reperfusión intestinal depende de la IgM natural procedente de células B1-a peritoneales.

Austin y col. (1998) Surgical Forum, Volumen 49, páginas 341-342 compararon la respuesta de ratones de tipo silvestre a la isquemia-reperfusión intestinal con ratones deficientes en células B1 peritoneales, y determinaron que la IgM derivada de células B1 peritoneales media la lesión local después de la isquemia-reperfusión intestinal.

Sumario de la invención

La presente invención se basa, en parte, en la identificación de inmunoglobulinas (Ig) patógenas, en particular IgM patógenas, que reconocen un antígeno específico de isquemia. Sin quedar ligado a teoría alguna, se cree que la unión de estas IgM patógenas a un antígeno específico de isquemia desencadena, entre otras cosas, la activación de la ruta del complemento, lo cual finalmente tiene como resultado una lesión por reperfusión o isquémica. Los solicitantes también descubrieron que las IgM patógenas se producen por una subpoblación de células B, denominadas en la presente memoria "células B-1":

La presente invención proporciona una inmunoglobulina aislada que actúa de mediador en lesiones tisulares después de la reperfusión, de acuerdo con la reivindicación 1.

Por consiguiente, también se describe un procedimiento para tratar o prevenir una lesión por reperfusión o isquémica mediada por inmunoglobulina en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de una interacción entre una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM patógena, y un antígeno específico de isquemia, con lo que se reduce el número de inmunoglobulinas patógenas unidas al antígeno específico de isquemia, de tal forma que se inhibe o se reduce la lesión.

En una realización preferida, la lesión por reperfusión o isquémica se produce después de un episodio natural, por ejemplo, como un ictus. La lesión por reperfusión o isquémica puede producirse durante y/o después de un procedimiento quirúrgico. Los procedimientos quirúrgicos ejemplares que produce la lesión incluyen una técnica correctiva de vasos seleccionada entre el grupo consistente en angioplastia, procedimiento de colocación de endoprótesis vascular, aterectomía y cirugía de revascularización. En una realización preferida, la lesión por reperfusión o isquemia se produce en un tejido cardiovascular, por ejemplo, el corazón.

Preferentemente, el inhibidor antagoniza la inmunoglobulina patógena mediante una o más de las siguientes actividades: (i) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, unión) entre la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia; (ii) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, unión) entre la inmunoglobulina patógena y un componente de la ruta del complemento; (iii) neutraliza la inmunoglobulina patógena, por ejemplo secuestrando la inmunoglobulina y/o fijando como objetivo su degradación; o (iv) inhibe o reduce la producción de la inmunoglobulina patógena, por ejemplo, bloquea la síntesis, ensamblaje y/o modificaciones postraduccionales del anticuerpo patógeno. El inhibidor puede ser una proteína o un péptido; una molécula pequeña; un anticuerpo o un fragmento del mismo, por ejemplo, un anticuerpo anti-idiotípico; un carbohidrato; o una glicoproteína. En otra realización preferida, el inhibidor puede ser un anticuerpo modificado como se describe en la presente memoria. En una realización preferida, el inhibidor se administra en una o en exposiciones secuenciales durante un periodo de horas, días, semanas, meses o años. El inhibidor puede administrarse antes, durante y/o después de un episodio natural que produce la lesión. El inhibidor también puede administrarse antes, durante y/o después de un procedimiento quirúrgico, por ejemplo un procedimiento quirúrgico asociado con lesión por reperfusión o isquémica. En una realización preferida, el inhibidor se administra en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente anti-coagulación, un inhibidor del complemento.

En otro aspecto, también se describe un procedimiento para tratar o prevenir una lesión por reperfusión o isquémica mediada por inmunoglobulina, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una cantidad eficaz de un inhibidor de una interacción entre una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM patógena, y un componente de la ruta del complemento, con lo que se reduce el número de inmunoglobulinas patógenas que activan la actividad del complemento, de tal forma que se inhibe o reduce la lesión.

En realizaciones preferidas, la inmunoglobulina patógena es una IgM o una IgG (por ejemplo, una IgG1 e IgG3). Preferentemente, la inmunoglobulina patógena es una IgM y más preferentemente es una subclase de IgM. En otra realización preferida, la inmunoglobulina patógena se produce por una subpoblación de células B, por ejemplo, células B-1. La inmunoglobulina patógena puede tener una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2, y una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 8. En una realización preferida, el antígeno específico de isquemia está presente en la superficie de una célula endotelial y/o tejido parenquimático.

En realizaciones preferidas, la ruta del complemento es una ruta clásica del complemento, y el componente de la ruta del complemento puede ser una molécula C1 o una subunidad de la misma (por ejemplo, C1q). En otra realización, el sujeto es un mamífero, por ejemplo un roedor (por ejemplo, un ratón) o un primate (por ejemplo, un ser humano).

En una realización preferida, la lesión por reperfusión o isquémica se produce después de un episodio natural, por ejemplo, como un ictus. La lesión por reperfusión o isquémica puede producirse durante y/o después de un procedimiento quirúrgico. Los procedimientos quirúrgicos ejemplares que producen la lesión incluyen una técnica correctiva de vasos seleccionada entre el grupo consistente en angioplastia, procedimiento de colocación de endoprótesis vascular, aterectomía y cirugía de revascularización. En una realización preferida, la lesión por reperfusión o isquémica se produce en un tejido cardiovascular, por ejemplo, el corazón.

Preferentemente, el inhibidor antagoniza la inmunoglobulina patógena mediante una o más de las siguientes actividades: (i) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, unión) entre la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia; (ii) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, unión) entre la inmunoglobulina patógena y un componente de la ruta del complemento; (iii) neutraliza la inmunoglobulina patógena, por ejemplo secuestrando la inmunoglobulina y/o fijando como objetivo su degradación; o (iv) inhibe o reduce la producción de la inmunoglobulina patógena, por ejemplo, bloquea la síntesis, ensamblaje y/o modificaciones postraduccionales del anticuerpo patógeno. El inhibidor puede ser una proteína o un péptido; una molécula pequeña; un anticuerpo o un fragmento del mismo, por ejemplo, un anticuerpo anti- idiotípico; un carbohidrato; o una glicoproteína. En otra realización preferida, el inhibidor puede ser un anticuerpo modificado como se describe en la presente memoria. En una realización preferida, el inhibidor se administra en una o en exposiciones secuenciales durante un periodo de horas, días, semanas, meses o años. El inhibidor puede administrarse antes, durante y/o después de un episodio natural que produce la lesión. El inhibidor también puede administrarse antes, durante y/o después de un procedimiento quirúrgico, por ejemplo un procedimiento quirúrgico asociado con lesión por reperfusión o isquémica. En una realización preferida, el inhibidor se administra en combinación con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente anti-coagulación, un inhibidor del complemento.

También se describe un procedimiento para tratar o prevenir una lesión por reperfusión o isquémica mediada por inmunoglobulina en un sujeto, que comprende retirar del sujeto o inactivar una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM patógena como se describe en la presente memoria, y/o células B que producen la inmunoglobulina patógena (por ejemplo, células B-1, como se describe en la presente memoria), con lo que se reduce la cantidad de inmunoglobulina patógena y/o células B presentes en el sujeto.

En una realización preferida, la etapa de retirada o inactivación se realiza ex vivo. En una realización, las inmunoglobulinas patógenas o células B pueden retirarse por hemoperfusión. En otra realización, las células B pueden retirarse usando un anticuerpo específico de células B (por ejemplo, un anticuerpo anti-B-1 o un anticuerpo anti-CD5 o anti-CD11G/CD18). La inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM, puede retirarse poniendo en contacto sangre de un sujeto con un antígeno inmovilizado (por ejemplo, un antígeno específico de isquemia) o un anticuerpo anti-idiotípico inmovilizado. En una realización preferida, la etapa de retirada o inactivación de la inmunoglobulina patógena se realiza administrando un anticuerpo anti- antidiotípico al sujeto. En otra realización, la etapa de retirada o inactivación de la célula B se realiza administrando al sujeto un resto que se dirige a las células B (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo, o un antígeno) acoplado a una toxina, por ejemplo ricina o toxina diftérica. En una realización preferida, el sujeto es un mamífero, por ejemplo un roedor (por ejemplo, un ratón) o un primate (por ejemplo, un ser humano). En una realización preferida, la lesión por reperfusión o isquémica se produce después de un episodio natural, por ejemplo, como un ictus. Preferentemente, la etapa de retirada se realiza en el periodo de minutos, de una a cinco horas, de cinco a diez horas, de diez a veinte horas, o de uno a cinco días, posterior al episodio natural. En una realización preferida, la lesión por reperfusión o isquémica se produce en un tejido cardiovascular, por ejemplo, el corazón. En otra realización, la lesión por reperfusión o isquémica se previene y/o reduce retirando del sujeto la inmunoglobulina patógena y/o las células B antes, durante y/o después del procedimiento quirúrgico. Por ejemplo, la etapa de retirada puede realizarse al menos de una a cinco horas, de cinco a diez horas, de diez a veinte horas, o uno, dos o tres días antes al procedimiento quirúrgico. La etapa de retirada también puede continuarse durante intervalos de tiempo apropiados durante y después del procedimiento quirúrgico.

También se describe una inmunoglobulina patógena aislada, por ejemplo, una IgM patógena como se describe en la presente memoria. Preferentemente, la inmunoglobulina patógena tiene una o más de las siguientes propiedades: (i) es capaz de interaccionar con un antígeno específico de isquemia; (ii) es capaz de fijarse al complemento; o (iii) se produce por una subpoblación de células B. En una realización preferida, la inmunoglobulina patógena se produce por una subpoblación de células B, por ejemplo, células B-1. La inmunoglobulina patógena puede tener una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 8. En otra realización, la inmunoglobulina patógena tiene una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2. En otra realización, la inmunoglobulina patógena interacciona con (por ejemplo, se une a) un antígeno específico de isquemia que está presente en la superficie de una célula endotelial.

En otro aspecto, en la presente memoria se describe una inmunoglobulina patógena, por ejemplo una IgM patógena como se describe en la presente memoria. En una realización preferida, la inmunoglobulina patógena interacciona con (por ejemplo, se une a) un antígeno específico de isquemia. La inmunoglobulina patógena puede proporcionar una capacidad reducida de activar el complemento. En una realización preferida, la inmunoglobulina patógena tiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos. Por ejemplo, uno o más de los restos aminoacídicos implicados en la unión y/o activación del complemento están mutados. En otra realización, el anticuerpo patógeno, o parte de unión a antígeno del mismo, tiene una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 o un fragmento de la misma. En otras realizaciones, el anticuerpo patógeno comprende al menos la región CDR1 de la SEC ID Nº: 10, o partes de unión a antígeno de la misma, y/o al menos una región CDR2 de la SEC ID Nº: 12, o una parte de unión a antígeno de la misma. Preferentemente, el anticuerpo patógeno comprende al menos la región CDR1 de la SEC ID Nº: 10 y la región CDR2 de la SEC ID Nº: 12, o partes de unión a antígeno de las mismas. En otra realización, el anticuerpo patógeno, o parte de unión a antígeno del mismo, tiene una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 o un fragmento de la misma. En otras realizaciones, el anticuerpo patógeno comprende al menos la región CDR1 de la SEC ID Nº: 4, o partes de unión a antígeno de la misma y/o al menos una región CDR2 de la SEC ID Nº: 6 o una parte de unión a antígeno de la misma. Preferentemente, el anticuerpo patógeno comprende al menos la región CDR1 de la SEC ID Nº: 4, y la región CDR2 de la SEC ID Nº: 6, o partes de unión a antígeno de las mismas.

En otra realización, el anticuerpo patógeno, o parte de unión a antígeno del mismo, tiene una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 8, o un fragmento de unión a antígeno de la misma, y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 2, o un fragmento de unión a antígeno de la misma. En otra realización, el anticuerpo patógeno puede ser un anticuerpo no humano, por ejemplo un anticuerpo de vaca, cabra, ratón, rata, oveja, cerdo o conejo. Preferentemente, el anticuerpo no humano es un anticuerpo murino. El anticuerpo patógeno puede ser un anticuerpo recombinante. En una realización preferida, el anticuerpo patógeno es un anticuerpo humanizado.

También se describe un procedimiento para aislar un antígeno específico de isquemia, que comprende proporcionar una inmunoglobulina patógena, por ejemplo una IgM patógena, por ejemplo una IgM patógena descrita en la presente memoria, poner en contacto una muestra que contiene el antígeno específico de isquemia, por ejemplo, un aislado bioquímico (por ejemplo, un aislado de células endoteliales), o una colección de proteínas (por ejemplo, una biblioteca de expresión) con la inmunoglobulina patógena en condiciones que permiten la unión específica de la inmunoglobulina patógena a la muestra, detectar cualquier cambio en el nivel de unión del anticuerpo patógeno a la muestra con respecto a un control, indicando un cambio en el nivel de unión de la inmunoglobulina patógena en presencia de la muestra con respecto al detectado en el control una unión específica, y aislar, por ejemplo, purificar, el antígeno específico de isquemia de la muestra. En una realización preferida, la muestra está enriquecida en el antígeno específico de isquemia, por ejemplo, se obtiene a partir de un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) con lesión por reperfusión o isquémica. En otras realizaciones, la muestra es un aislado bioquímico, por ejemplo, un tejido endotelial, o una biblioteca de expresión, por ejemplo una biblioteca derivada de un tejido endotelial. En una realización preferida, la etapa de contacto se produce in vitro.

También se describe un procedimiento para identificar un inhibidor de una interacción entre una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM patógena, y un antígeno específico de isquemia de uno o más (por ejemplo, una pluralidad de) compuestos de ensayo, que comprende proporcionar una mezcla de reacción que incluye la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia (por ejemplo, un tejido endotelial o lisado obtenido a partir de un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) con lesión por reperfusión o isquémica) en condiciones que permiten la unión de la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia, poner en contacto la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia con uno o más compuestos de ensayo (por ejemplo, miembros de una biblioteca combinatoria) y detectar cualquier cambio en la unión de la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia en presencia de un compuesto de ensayo dado con respecto a la detectada en ausencia del compuesto de ensayo, indicando un cambio (por ejemplo, reducción) en el nivel de unión entre la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia en presencia del compuesto de ensayo con respecto al detectado en ausencia del compuesto de ensayo que el compuesto de ensayo es un inhibidor de la interacción entre la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia. En una realización preferida, la etapa de contacto se realiza in vivo. El procedimiento puede incluir además pretratar las inmunoglobulinas patógenas con uno o más compuestos de ensayo. Las inmunoglobulinas patógenas tratadas después pueden inyectarse en ratones deficientes en inmunoglobulinas patógenas.

También se describe un procedimiento para identificar un inhibidor de una interacción entre una inmunoglobulina patógena, por ejemplo una IgM patógena, y un componente de la ruta del complemento de uno o más (por ejemplo, una pluralidad de) compuestos de ensayo, que comprende proporcionar una mezcla de reacción que incluye la inmunoglobulina patógena y el componente de la ruta del complemento en condiciones que permiten la unión de la inmunoglobulina patógena y el componente de la ruta del complemento, poner en contacto la inmunoglobulina patógena y el componente de la ruta del complemento con uno o más compuestos de ensayo (por ejemplo, miembros de una biblioteca combinatoria) y detectar cualquier cambio en la unión de la inmunoglobulina patógena y el componente de la ruta del complemento en presencia de un compuesto de ensayo dado con respecto a la detectada en ausencia del compuesto de ensayo, indicando un cambio (por ejemplo, reducción) en el nivel de unión entre la inmunoglobulina patógena y el componente de la ruta del complemento en presencia del compuesto de ensayo con respecto al detectado en ausencia del compuesto de ensayo que el compuesto de ensayo es un inhibidor de la interacción entre la inmunoglobulina patógena y el componente de la ruta del complemento. En realizaciones preferidas, la inmunoglobulina patógena es una IgM patógena como se describe en la presente memoria y el antígeno específico de isquemia se obtiene a partir de un tejido endotelial, o un lisado, obtenido a partir de un sujeto (por ejemplo, un paciente humano) con lesión por reperfusión o isquémica. En otra realización, el procedimiento se realiza in vitro. En una realización preferida, la inmunoglobulina patógena o el antígeno específico de isquemia (o ambos) se marcan una señal detectable, por ejemplo fluoróforos, enzimas colorimétricas, radioisótopos, compuestos luminiscentes y similares. El procedimiento puede incluir además repetir al menos una etapa, por ejemplo, la etapa de contacto con un segundo o posterior miembro o miembros de la biblioteca. En una realización preferida, se ensayan una pluralidad de compuestos de ensayo, por ejemplo miembros de una biblioteca. La pluralidad de compuestos de ensayo, por ejemplo de miembros de una biblioteca puede incluir al menos 10, 10^{2}, 10^{3}, 10^{4}, 10^{5}, 10^{6}, 10^{7} ó 10^{8} compuestos. En una realización preferida, la pluralidad de compuestos de ensayo, por ejemplo, miembros de la biblioteca, comparten una característica estructural o funcional. El compuesto de ensayo puede ser un péptido o una molécula orgánica pequeña. En otra realización, la ruta del complemento es una ruta clásica del complemento. En una realización preferida, el componente de la ruta del complemento es una molécula C1 o una subunidad de la misma (por ejemplo, C1q).

También se describe un ácido nucleico aislado que codifica un anticuerpo IgM patógeno, o fragmentos del mismo. En realizaciones preferidas, el ácido nucleico aislado codifica una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 8. En otra realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la SEC ID Nº: 10, o una parte de unión a antígeno de la misma. En otra realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica una región variable de cadena ligera que comprende una CDR2 de la SEC ID Nº: 12, o una parte de unión a antígeno de la misma. En otra realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica una región variable de cadena ligera que comprende una CDR1 de la SEC ID Nº: 10, o una parte de unión a antígeno de la misma, y una CDR2 de la SEC ID Nº: 12, o una parte de unión a antígeno de la misma. En una realización preferida, el ácido nucleico codifica una región variable de cadena ligera de origen murino, de origen humano, o una combinación de secuencias de aminoácidos murina y humana. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena ligera que comprende la CDR1 de la SEC ID Nº: 10 y/o la CDR2 de la SEC ID Nº: 12 y una secuencia flanqueante humana.

En otras realizaciones preferidas, el ácido nucleico aislado codifica una región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº: 2. En otra realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la SEC ID Nº: 4, o una parte de unión a antígeno de la misma. En otra realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR2 de la SEC ID Nº: 6, o una parte de unión a antígeno de la misma. En otra realización preferida, la secuencia de ácido nucleico codifica una región variable de cadena pesada que comprende una CDR1 de la SEC ID Nº: 4, o una parte de unión a antígeno de la misma, y una CDR2 de la SEC ID Nº: 6, o una parte de unión a antígeno de la misma. En una realización preferida, el ácido nucleico codifica una región variable de cadena pesada de origen murino, origen humano o una combinación de secuencias de aminoácidos murina y humana. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada que comprende la CDR1 de la SEC ID Nº: 4 y/o la CDR2 de la SEC ID Nº: 6, y una secuencia flanqueante humana. En otra realización, el ácido nucleico aislado codifica tanto una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 como una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2.

También se describe una molécula de ácido nucleico aislada y fragmentos de la misma. En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada comprende la secuencia de nucleótidos de cadena ligera de la SEC ID Nº: 7. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de la CDR1 de cadena ligera de la SEC ID Nº: 9, o una parte de la misma. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de CDR2 de cadena ligera de la SEC ID Nº: 11, o una parte de la misma. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de CDR1 de cadena ligera de la SEC ID Nº: 9, o una parte de la misma, y una secuencia de nucleótidos de CDR2 de cadena ligera de la SEC ID Nº: 11, o una parte de la misma. Las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que comprenden secuencias de cadena ligera, por ejemplo, la SEC ID Nº: 7, la SEC ID Nº: 9, la SEC ID Nº: 11 o combinaciones de las mismas, incluyen nucleótidos que tienen un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con las mismas. Además, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que comprenden secuencias de cadena ligera, por ejemplo, la SEC ID Nº: 7, la SEC ID Nº: 9, la SEC ID Nº: 11 o combinaciones de las mismas, incluyen nucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones de rigurosidad baja, media, alta o muy alta con las mismas.

En otra realización, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena ligera, por ejemplo, un polipéptido de cadena ligera de la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 10 y la SEC ID Nº: 12. En otra realización, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que hibridan con una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena ligera de un anticuerpo patógeno o parte del mismo, por ejemplo, una región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 10 y la SEC ID Nº: 12.

En otras realizaciones preferidas, las moléculas de ácido nucleico comprenden la secuencia de nucleótidos de cadena pesada de la SEC ID Nº: 1. En otra realización, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de CDR1 de cadena pesada de la SEC ID Nº: 3, o una parte de la misma. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de CDR2 de cadena pesada de la SEC ID Nº: 5, o una parte de la misma. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos de CDR1 de cadena pesada de la SEC ID Nº: 3, o una parte de la misma, y una secuencia de nucleótidos de CDR2 de cadena pesada de la SEC ID Nº: 5, o una parte de la misma. Las moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de cadena pesada, por ejemplo, la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº: 5 o combinaciones de las mismas, también incluyen nucleótidos que tienen un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con las mismas. Además, las moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de cadena ligera, por ejemplo, la SEC ID Nº: 1, la SEC ID Nº: 3, la SEC ID Nº: 5 o combinaciones de las mismas, incluyen nucleótidos que hibridan en condiciones rigurosas, por ejemplo, condiciones de rigurosidad baja, media, alta o muy alta con las mismas.

En otra realización, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que tienen al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de cadena pesada, por ejemplo, un polipéptido de cadena pesada de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 y la SEC ID Nº: 6. En otra realización, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que hibridan con una secuencia de ácido nucleico que codifica una región variable de cadena pasada de un anticuerpo patógeno o parte del mismo, por ejemplo una región variable de cadena pasada de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 y la SEC ID Nº: 6.

También se describen polipéptidos aislados y fragmentos de los mismos. En realizaciones preferidas, el polipéptido aislado comprende, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 10 o la SEC ID Nº: 12, o fragmentos o combinaciones de las mismas; o la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o fragmentos o combinaciones de las mismas. Los polipéptidos de la presente invención incluyen polipéptidos que tienen al menos, pero no más de 20, 10, 5, 4, 3, 2 ó 1 aminoácidos que difieren de la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 10 o la SEC ID Nº: 12; o la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6. Son polipéptidos preferidos polipéptidos que retienen la actividad biológica, por ejemplo, la capacidad de unirse a un antígeno específico de isquemia, y/o la capacidad de unirse al complemento. En otra realización, los polipéptidos comprenden polipéptidos que tienen al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una región variable de cadena ligera o parte de la misma, por ejemplo, un polipéptido de región variable de cadena ligera de la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 10 o la SEC ID Nº: 12. En otra realización, los polipéptidos comprenden polipéptidos que tienen al menos un 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% y 99% de identidad de secuencia con una región variable de cadena pesada, o parte de la misma, por ejemplo un polipéptido de región variable de cadena pesada de la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6. En otra realización, los presentes inventores describen un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8 y la SEC ID Nº: 2, que comprende además una secuencia IRES.

También se describe un vector de expresión que comprende las moléculas de ácido nucleico que codifican la SEC ID Nº: 8, la SEC ID Nº: 10 o la SEC ID Nº: 12, o fragmentos o combinaciones de las mismas; o la SEC ID Nº: 2, la SEC ID Nº: 4 o la SEC ID Nº: 6, o fragmentos o combinaciones de las mismas. En una realización preferida, el vector de expresión comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una cadena ligera de anticuerpo que tiene una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 8, o una parte de la misma, y una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada de anticuerpo que tiene una región variable que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2, o una parte de la misma. En otro aspecto, los presentes inventores describen una célula huésped que comprende un vector de expresión de la presente invención. En realizaciones preferidas, la célula huésped puede incluir al menos 1 ó 2 o más vectores de expresión, es decir un vector de expresión que codifica una cadena ligera, por ejemplo la SEC ID Nº: 8 o una parte de la misma, y un vector de expresión que codifica una cadena pesada, por ejemplo la SEC ID Nº: 2 o una parte de la misma. En otra realización, la célula huésped puede comprender un vector de expresión capaz de expresar tanto la región variable de cadena ligera como la región variable de cadena pesada. Como se usa en la presente memoria, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido y puede incluir un plásmido, cósmido o vector viral. El vector puede ser capaz de replicarse de forma autónoma o puede integrarse en el ADN de un huésped. Los vectores virales incluyen, por ejemplo, virus adenoasociados, adenovirus y retrovirus con defectos en la replicación.

También se describen inhibidores de la interacción de inmunoglobulina patógena/antígeno isquémico y/o inmunoglobulina patógena/componente del complemento identificada usando los procedimientos descritos en la presente memoria.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un gráfico de barras que representa cambios en la permeabilidad intestinal de ratones endogámicos después de isquemia intestinal y reperfusión o sin lesión (simulado). WT representa la cepa parental para ratones Cr2-/-. Cr2-/- se reconstituyó con IgG o IgM reunida o control salino. Se administró IgG o IgM reunida (0,5 mg) por vía intravenosa aproximadamente 1 hora antes del tratamiento. Los valores son medias \pm error típico; n = número de ratones en grupos experimentales.

La Figura 2 es un diagrama esquemático del papel propuesto para el complemento y receptores del complemento en la selección positiva de linfocitos B-1 peritoneales.

La Figura 3A demuestra la reconstitución de una lesión por I/R en ratones deficientes en anticuerpo (RAG-1) por IgM reunida a partir de 22 clones de hibridoma de células B-1 individuales. Se reunieron 24 \mug de cada IgM de hibridoma y se inyectaron por vía intravenosa 30 minutos antes de la laparotomía inicial. Después de la reperfusión, se obtiene sangre y se calcula el índice de permeabilidad como relación de cantidad de ^{125}I de intestino seco frente a la de la sangre. Los valores representan medias \pm ET; n = números de ratones usados en grupos experimentales. 1 = solución salina normal; 2 = hibridoma reunido; 3 = 50 \mug de hibridoma 22A5; 4 = 400 \mug de IgM reunida.

La Figura 3B demuestra que la IgM del clon de hibridoma 22A5 restaura la lesión por I/R en ratones RAG-1. Ratones reconstituidos con IgM reciben IgM de suero total (400 \mug) o IgM de hibridoma 22A5 (50 \mug de cada una). Los valores representan medias \pm ET; n = números de ratones usados en grupos experimentales. 1 = solución salina normal; 2 = hibridoma reunido; 3 = 50 \mug de hibridoma 22A5; 4 = 400 \mug de IgM reunida.

La Figura 4A muestra un análisis de secuencia de IgM del hibridoma 22A5 de B-1. Se muestra la secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de IgM de 22A5 (SEC ID Nº: 1). El ARN se purificó a partir de células de hibridoma 22A5 y se sometió a transcripción inversa para proporcionar ADNc. Se usó PCR semi-anidada usando un cebador oligonucleotídico específico para 5' VH y 3' Cm para amplificar los ADNc de cadena pesada de inmunoglobulina. Los productos de ADNc se purificaron en geles de agarosa y la secuencia de nucleótidos se determinó por secuenciación automática. Las regiones flanqueantes (FWR) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se indican encima de los nucleótidos. Una búsqueda de la base de datos de nucleótidos de NCBI encontró que la cadena pesada de 22A5 compartía un 95% de homología con la secuencia de inmunoglobulina VMU-3.2 (número de acceso X03088).

La Figura 4B muestra un análisis de la secuencia de IgM del hibridoma 22A5 de B-1. Se muestra la secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de IgM de 22A5 (SEC ID Nº: 7). Se purificó ARN a partir de células de hibridoma 22A5 y se sometió a transcripción inversa para proporcionar ADNc. Se usó PCR semi-anidada usando un cebador oligonucleotídico específico para 5' Vk y 3' Ck para amplificar los ADNc de cadena ligera de inmunoglobulina. Los productos de ADNc se purificaron en geles de agarosa y la secuencia de nucleótidos se determinó por secuenciación automática. Las regiones flanqueantes (FWR) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se indican encima de los nucleótidos. Una búsqueda de la base de datos de nucleótidos de NCBI encontró que la cadena ligera de 22A5 compartía homología con la secuencia de inmunoglobulina del gen Vk 19-23 (número de acceso AJ235961).

La Figura 5A muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico de cadena pesada de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 2). Las regiones flanqueantes (FWR) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se indican encima de los restos aminoacídicos.

La Figura 5B muestra la secuencia de aminoácidos correspondiente a la secuencia de ácido nucleico de cadena ligera de la SEC ID Nº: 7 (SEC ID Nº: 8). Las regiones flanqueantes (FWR) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se indican encima de los restos aminoacídicos.

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Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, en parte, en la identificación de inmunoglobulinas (Ig) patógenas, en particular IgM patógenas, que reconocen un antígeno específico de isquemia. Se cree que la unión de estas IgM patógenas a un antígeno específico de isquemia desencadena, entre otras cosas, la activación de la ruta del complemento, que finalmente ocasiona una lesión por reperfusión o isquémica. Los solicitantes también descubrieron que las IgM patógenas se producen por una subpoblación de células B denominadas en la presente memoria "células B-1". Por consiguiente, en la presente memoria se describen procedimientos y composiciones útiles para tratar o prevenir, en un sujeto, lesiones tisulares posteriores a la reperfusión producidas por una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una IgM patógena.

Antes de la descripción adicional de la invención, aquí se recogen, por comodidad, ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas.

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" se usan indistintamente en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, los términos "inmunoglobulina" (o "Ig" en forma abreviada) y "anticuerpo" se refieren a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadena ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3, o cuatro dominios en el caso de la IgM, es decir, CH1, CH2, CH3 y CH4. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones flanqueantes (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden actuar como mediadores en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del huésped, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

Hay hasta cinco tipos principales de cadenas pesadas, denominados \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu, subdividiéndose adicionalmente las cadenas \gamma en \gamma1, \gamma2, \gamma3 y \gamma4 y las cadenas \alpha en \alpha1 y \alpha2. Dos tipos de cadenas ligeras alternativas se denominan \kappa y \lambda. La presencia de la cadena pesada da lugar a las clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Las IgG pueden subdividirse adicionalmente en las subclases IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, y las IgA en las subclases IgA1 e IgA2.

Como se usa en la presente memoria, el término "inmunoglobulina M" o "IgM" se refiere a un pentámero de cinco monómeros de IgM unidos por la cadena J. Las moléculas de IgM monoméricas tienen la misma estructura básica que las moléculas de inmunoglobulina descritas anteriormente. La IgM es la primera inmunoglobulina sintetizada en una respuesta de anticuerpo. Como pentámero, tiene múltiples dominios funcionales y, por lo tanto, es un potente activador del complemento.

La expresión "inmunoglobulina patógena" se refiere a una molécula de inmunoglobulina como se ha descrito anteriormente que actúa como mediador de las lesiones tisulares posteriores a una reperfusión. En una realización, la inmunoglobulina patógena puede localizarse en una superficie endotelial o tejido parenquimático, por ejemplo, por unión a un antígeno (por ejemplo, un antígeno específico isquémico) presente en una superficie de célula endotelial o tejido parenquimático. Una vez localizada en la superficie endotelial o en la superficie de tejido parenquimático, la inmunoglobulina patógena puede actuar como mediador de la unión de células inmunes (por ejemplo, células efectoras) o un componente del sistema del complemento clásico, por ejemplo, Clq, desencadenando de esta manera la lesión en el tejido. Los anticuerpos pueden ser de los diversos isotipos, incluyendo: IgG (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA1, IgA2, IgA.sub.sec, IgD o IgE. Preferentemente, la inmunoglobulina patógena es un isotipo de anticuerpo que es un activador del complemento. Preferentemente, la inmunoglobulina patógena es una IgM. Las inmunoglobulinas patógenas son preferentemente de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgM o IgG (por ejemplo, una IgG1 e IgG3)).

La expresión "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "parte de anticuerpo" o "fragmento"), como se usa en la presente memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, un antígeno diana, por ejemplo, un antígeno isquémico). Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro de la expresión "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, un fragmento monovalente compuesto por los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un enlace disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd compuesto por los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv constituido por los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Nature 341: 544-546), constituido por un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes distintos, pueden unirse, usando procedimientos recombinantes, por un enlazador sintético que permite obtenerlos como una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidos como Fv monocatenarios (scFv); véase, por ejemplo Bird y col. (1988) Science 242: 423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Estos anticuerpos monocatenarios también deben considerarse incluidos dentro de la expresión "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando técnicas convencionales conocidas por los especialistas en la técnica, y los fragmentos se exploran con respecto a la utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Como se usa en la presente memoria, "reperfusión" se refiere al procedimiento mediante el cual se reinicia el flujo sanguíneo en los vasos sanguíneos después de una constricción u obstrucción del flujo, como, por ejemplo, en caso de isquemia.

La expresión "reperfusión isquémica" se refiere a una respuesta inflamatoria aguda que sigue a la reperfusión de tejidos isquémicos. La reperfusión puede producirse después de un episodio natural, tal como un ictus, o durante un procedimiento quirúrgico en el que se bloquea intencionadamente el flujo sanguíneo en vasos. La constricción u obstrucción de un vaso sanguíneo puede producirse como resultado, por ejemplo, de un coágulo sanguíneo, que bloquea el flujo sanguíneo en el vaso. En circunstancias tales como éstas, se altera la integridad endotelial y, como resultado, puede empezar la cascada de la coagulación y se forman nuevos coágulos que se alojan en capilares más pequeños corriente abajo de la obstrucción del coágulo original. Es durante este periodo de reflujo cuando se produce la lesión del tejido.

"Lesión por reperfusión mediada por inmunoglobulina" se refiere a una destrucción de la integridad endotelial que está mediada directa o indirectamente por una inmunoglobulina, por ejemplo, una inmunoglobulina patógena. Sin quedar ligado por teoría alguna, se cree que durante un periodo de isquemia, se expresan o exponen nuevos antígenos (por ejemplo, antígenos específicos isquémicos) en la superficie de las células endoteliales. Estos nuevos antígenos después se reconocen por inmunoglobulinas patógenas que se acumulan cerca del sitio de la lesión. Las inmunoglobulinas patógenas localizadas pueden desencadenar lesiones en el tejido endotelial, por ejemplo, por activación de la función de células efectoras o rutas del complemento.

Como se usa en la presente memoria, el término "isquemia" se refiere a una deficiencia temporal o permanente de flujo sanguíneo en un órgano o tejido. En tejidos cardiovasculares, la isquemia puede producir al menos dos enfermedades cardiacas - angina de pecho e infarto de miocardio agudo (ataque cardiaco). Típicamente, la isquemia que implica el músculo cardiaco puede producirse como resultado de trastornos de arterias coronarias, tales como aterosclerosis o espasmos. La expresión "lesión isquémica" se refiere a una destrucción de la integridad endotelial, por ejemplo, en un tejido u órgano, que se produce por una deficiencia temporal o permanente de flujo sanguíneo en el tejido u órgano.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "antígeno específico de isquemia" se refiere a un antígeno presente en la superficie de una célula endotelial. Preferentemente, el antígeno específico de isquemia se expresa o expone en respuesta a un agravio, por ejemplo, un agravio isquémico.

Como se usa en presente memoria, "células B-1" se refiere a una subpoblación de células B que producen las inmunoglobulinas patógenas. Típicamente, las células B-1 expresan bajos niveles de IgD y CD23, y una fracción importante de estas células expresan la proteína de la superficie celular CD5 (Hardy y col. (1994) Immunol. Rev. 137, 91; Kantor y col. (1993) Annu. Rev. Immunol. 11, 501-538). Típicamente están alojadas en los tejidos peritoneales y mesentéricos y al menos en ratones no parecen circular (Herzenberg y col., (1986) Immunol. Rev. 93: 81-102; Martin y col., Cur Op. Immunol. 13: 195-201). A diferencia de las células B convencionales, no experimentan hipermutación somática ni maduración de afinidad. Parecen surgir durante el desarrollo fetal y neonatal y no se regeneran fácilmente por injerto de médula ósea adulta. Estas células pueden distinguirse además por su frecuencia limitada en los ganglios linfáticos periféricos y el bazo, y por localizarse principalmente en la cavidad peritoneal.

El término "complemento" se refiere a una cascada de proteínas compuesta por más de 20 proteínas (incluyendo factores reguladores). Al igual que el sistema de coagulación sanguínea, la activación del sistema inicia una cascada de acontecimientos en los que se activan secuencialmente proenzimas de forma proteolítica generando ligandos para receptores de la superficie celular, péptidos bioactivos potentes y un complejo de fase terminal que se intercala en las membranas de las células ocasionando muerte celular. El componente central es el tercer componente o C3. Puede activarse por tres rutas diferentes, es decir, la ruta clásica, la de las lectinas o la alternativa (Reid y col., (1981) Semin. Immunopathol. 15: 307-326; Muller-Eberhard, (1988) Ann. Rev. Biochem. 57: 321-347).

En una realización, la inmunoglobulina patógena puede actuar a través de la ruta clásica del complemento. La ruta clásica se activa por una interacción entre un antígeno y anticuerpo, que forma un complejo inmune. Los anticuerpos pueden unirse o "fijarse" al complemento sólo después de reaccionar con su antígeno. La formación del complejo provoca un cambio conformacional en la molécula de anticuerpo que expone un sitio para la unión del primer componente del complemento C1. C1 es un compuesto multimérico formado por seis cadenas de tres polipéptidos cada una, denominadas C1q, y dos de cada uno de C1s y C1r. Seis cadenas C1q se disponen en un "grupo" y las cuatro moléculas de C1r y C1s se unen en una interacción dependiente de calcio. Cuando un anticuerpo se une a dos o más cabezas de C1q, C1r se escinde para dar una molécula activa de C1r, que escinde C1s. C1s extiende el proceso de activación por escisión del siguiente componente del complemento C4 para dar C4b, que continúa el proceso de reacción, y C4a. La escisión de C4 para dar C4b revela un enlace tioéster interno, que se inactiva rápidamente por unión de moléculas de agua a menos que pueda formar enlaces covalentes con proteínas o carbohidratos de la superficie celular. Si esto ocurre, C4b se vuelve relativamente estable y se une a C2 en una reacción dependiente de magnesio. C2 después se escinde por C1s para formar el complejo C4b2a, conocido como la C3 convertasa de la ruta clásica. C3 es una molécula similar a C4, que tiene un enlace tioéster interno. Por la escisión de C3 se obtienen dos fragmentos. El más pequeño de éstos, C3a, tiene propiedades biológicas poderosas. El C3b de mayor tamaño presenta el sitio de unión lábil que permite que la molécula se una a C4b2a. La unión de C3b a C4b2a conduce a la generación de la última enzima de la ruta clásica, C4b2a3b, conocida como C5 convertasa de la ruta clásica, que escinde C5, un componente de la ruta de ataque a la membrana.

En otra realización, la inmunoglobulina patógena puede actuar a través de la ruta del complemento alternativa. En la ruta alternativa, C3 genera C3b, C3bB y C3bBb, que a su vez escinde C3. Este proceso se acelera si las enzimas activas están estabilizadas en paredes de células bacterianas, o si se produce más C3b a partir de la ruta clásica. Se genera la C5 convertasa de la ruta alternativa C3bBb3b.

Como se una en la presente memoria, la expresión "sujeto" pretende incluir seres humanos y animales no humanos. Los seres humanos preferidos incluyen un paciente humano con lesión por isquemia-reperfusión. La expresión "animales no humanos" o "no humanos" de la invención incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, roedores, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor" se refiere a un agente que reduce o bloquea (completa o parcialmente) una interacción entre una inmunoglobulina patógena y un antígeno específico de isquemia; o reduce o bloquea una interacción entre una inmunoglobulina patógena y un componente de la ruta del complemento, por ejemplo C1q. El término "interacción" se refiere a una asociación física entre dos o más moléculas, por ejemplo, una unión. La interacción puede ser directa o indirecta. Preferentemente, el inhibidor antagoniza una o más de las siguientes actividades de la inmunoglobulina patógena: (i) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, la unión) entre la inmunoglobulina patógena y el antígeno específico de isquemia; (ii) inhibe o reduce una interacción (por ejemplo, la unión) entre la inmunoglobulina patógena y un componente de la ruta del complemento, por ejemplo, C1q; (iii) neutraliza la inmunoglobulina patógena, por ejemplo, secuestrando la inmunoglobulina y/o fijando como objetivo su degradación; o (iv) inhibe o reduce la producción de la inmunoglobulina patógena; por ejemplo bloquea la síntesis, el ensamblaje y/o modificaciones postraduccionales del anticuerpo patógeno. El inhibidor puede ser una proteína (por ejemplo un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo anti-idiotípico o un fragmento del mismo), un péptido o una molécula orgánica pequeña. Los términos "inhibidores" y "agentes" se usan indistintamente en la presente memoria.

Como se usa en la presente memoria, una "cantidad eficaz" de un inhibidor se refiere a una cantidad de un agente que es eficaz, tras la administración de una sola dosis o de múltiples dosis al sujeto, por ejemplo, un paciente, para reducir o eliminar la lesión por reperfusión o isquémica. Dicha reducción o eliminación de la lesión por reperfusión puede reflejarse como una prolongación de la supervivencia del sujeto, por ejemplo, un paciente más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento, o cualquier mejora en el pronóstico del sujeto con respecto a la ausencia de dicho tratamiento. El inhibidor puede usarse para tratar (por ejemplo, reducir o eliminar una lesión existente) o para prevenir (por ejemplo, retrasar la aparición del inicio o recurrencia de) una lesión por reperfusión o isquémica. El experto en la materia apreciará que ciertos factores influyen en la dosificación y programa de tiempo necesarios para tratar de forma eficaz a un sujeto, incluyendo pero sin limitación la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos previos, la salud general y/o edad del sujeto, y otras enfermedades presentes.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "secuencia consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) que aparecen con más frecuencia en una familia de secuencias relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). En una familia de proteínas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que aparece con más frecuencia en esa posición en la familia. Si dos aminoácidos aparecen con la misma frecuencia, cualquiera puede incluirse en la secuencia consenso. Una "región flanqueante consenso" se refiere a la región flanqueante en la secuencia de inmunoglobulina consenso.

Como se usa en la presente memoria, la expresión "hibrida en condiciones de baja rigurosidad, rigurosidad media, rigurosidad alta o rigurosidad muy alta" describe condiciones de hibridación y lavado. Pueden encontrarse pautas para realizar las reacciones de hibridación en Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, que se incorpora por referencia. En esta referencia se describen procedimientos acuosos y no acuosos y puede usarse cualquiera de ellos. Las condiciones de hibridación específicas mencionadas en la presente memoria son las siguientes: 1) condiciones de hibridación de baja rigurosidad en cloruro sódico/citrato sódico (SSC) 6X a aproximadamente 45ºC, seguido de dos lavados en SSC 0,2X, SDS al 1% al menos a 50ºC (la temperatura de los lavados puede aumentarse a 55ºC en las condiciones de rigurosidad baja); 2) condiciones de hibridación de rigurosidad media en SSC 6X a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 1% a 60ºC; 3) condiciones de hibridación de rigurosidad alta en SSC 6X a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 0,1% a 65ºC; y preferentemente 4) son condiciones de hibridación de rigurosidad muy alta fosfato sódico 0,5 M, SDS al 7% a 65ºC, seguido de uno o más lavados en SSC 0,2X, SDS al 1% a 65ºC. Las condiciones de rigurosidad muy alta (4) son las condiciones preferidas y las que deben usarse a menos que se especifique otra cosa.

Los cálculos de homología o identidad de secuencia entre secuencias (los términos se usan indistintamente en la presente memoria) se realizan como se indica a continuación.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para conseguir una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o en las dos de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o de ácido nucleico para el alineamiento óptimo y pueden desecharse secuencias no homólogas para la comparación. En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines comparativos es de al menos el 30%, preferentemente al menos el 40%, más preferentemente al menos el 50%, el 60% e incluso más preferentemente al menos el 70%, el 80%, el 90% o el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Después se comparan los restos aminoacídicos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto aminoacídico o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en la presente memoria, "identidad" de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a "homología" de aminoácidos o de ácidos nucleicos). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse usando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch ((1970) J. Mol. Biol. 48: 444-453) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso de hueco de 40, 50, 60, 70, u 80 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. Una serie particularmente preferida de parámetros (y la que debe usarse a menos que se especifique otra cosa) es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalidad de hueco de 12, una penalidad de extensión de hueco de 4 y una penalidad de hueco de cambio de fase de 5.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o de nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ((1989) CABIOS, 4:11-17) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de restos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4.

Procedimientos para Identificar Inhibidores de Inmunoglobulinas Patógenas

En un aspecto, en la presente memoria se describe un procedimiento para identificar un inhibidor de una interacción entre una inmunoglobulina patógena y un antígeno específico de isquemia, o una inmunoglobulina patógena y un componente de la ruta del complemento de uno o más (por ejemplo, una pluralidad de) compuestos de ensayo. El inhibidor puede ser una proteína (por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo); un péptido, un carbohidrato; una glicoproteína; o una molécula orgánica pequeña.

Bibliotecas de Compuestos de Ensayo

El inhibidor puede ser una molécula orgánica pequeña, por ejemplo, un miembro de una biblioteca combinatoria.

En una realización, la invención proporciona bibliotecas de inhibidores. La síntesis de bibliotecas combinatorias es bien conocida en la técnica y se ha revisado (véase, por ejemplo, E.M. Gordon y col, J. Med Chem. (1994) 37: 1385-1401; DeWitt, S. H.; Czarnik, A W. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 114; Armstrong, R W.; Combs, A. P.; Tempest, P. A; Brown, S. D.; Keating, T. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 123; Ellman, J. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 132; Gordon, E. M; Gallop, M. A.; Patel, D. V. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 144; Lowe, G. Chem. Soc. Rev. (1995) 309, Blondelle y col. Trends Anal. Chem. (1995) 14: 83; Chen y col. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 2661; Patentes de Estados Unidos Nº 5.359.115, 5.362.899 y 5.288.514; Publicaciones PCT Nº W092/10092, WO93/09668, WO91/07087, WO93/20242 y WO94/08051).

Las bibliotecas de compuestos pueden prepararse de acuerdo con una diversidad de procedimientos, de los que algunos se conocen en la técnica. Por ejemplo, puede realizarse una estrategia de "combinación-división" ("split-pool") de la siguiente manera: se ponen perlas de un soporte polimérico funcionalizado en una pluralidad de recipientes de reacción; se conoce una diversidad de soportes poliméricos adecuados para la síntesis de péptidos en fase sólida, y algunos están disponibles en el mercado (como ejemplos, véase, por ejemplo M. Bodansky "Principles of Peptide Synthesis", 2ª edición, Springer-Verlag, Berlin (1993)). A cada alícuota de perlas se le añade una solución de un aminoácido activado diferente y se deja que las reacciones continúen para producir una pluralidad de aminoácidos inmovilizados, uno en cada recipiente de reacción. Después se lavan las alícuotas de perlas modificadas, se "reúnen" (es decir, se recombinan) y el conjunto de perlas se divide de nuevo, poniéndose cada alícuota en un recipiente de reacción separado. Después se añade otro aminoácido activado a cada alícuota de perlas. El ciclo de síntesis se repite hasta que se obtiene una longitud de péptido deseada. Los restos aminoacídicos añadidos en cada ciclo de síntesis pueden seleccionarse aleatoriamente; como alternativa, pueden seleccionarse aminoácidos para proporcionar una biblioteca "sesgada", por ejemplo, una biblioteca en la que ciertas partes del inhibidor se seleccionan de forma no aleatoria, por ejemplo, para proporcionar un inhibidor que tenga una similitud u homología estructural conocida con un péptido conocido capaz de interaccionar con un anticuerpo, por ejemplo, el sitio de unión al antígeno de un anticuerpo anti-idiotípico. Se apreciará que de esta manera puede generarse fácilmente una amplia diversidad de compuestos peptídicos, peptidomiméticos o no peptídicos.

La estrategia de "combinación-división" produce una biblioteca de péptidos, por ejemplo inhibidores, que pueden usarse para preparar una biblioteca de compuestos de ensayos de la invención. En otra síntesis ilustrativa, se crea una "biblioteca de diversómeros" por el procedimiento de Hobbs DeWitt y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909 (1993)). También pueden usarse otros procedimientos de síntesis, incluyendo la técnica de "bolsa de té" de Houghten (véase, por ejemplo, Houghten y col., Nature 354: 84-86 (1991)) para sintetizar bibliotecas de compuestos de acuerdo con la presente invención.

Las bibliotecas de compuestos pueden explorarse para determinar si cualquier miembro de la biblioteca tiene una actividad deseada y, si es así, identificar la especie activa. Se han descrito procedimientos de exploración de bibliotecas combinatorias (véase, por ejemplo, Gordon y col., J Med. Chem., supra). Las bibliotecas de compuestos solubles pueden explorarse por cromatografía de afinidad con un receptor apropiado para aislar ligandos del receptor, seguido de la identificación de los ligandos aislados por técnicas convencionales (por ejemplo, espectrometría de masas, RMN y similares). Los compuestos inmovilizados pueden explorarse poniendo en contacto los compuestos con un receptor soluble; preferentemente, el receptor soluble se conjuga con un marcador (por ejemplo, fluoróforos, enzimas colorimétricas, radioisótopos, compuestos luminiscentes y similares) que puede detectarse para indicar la unión al ligando. Como alternativa, los compuestos inmovilizados pueden liberarse selectivamente y dejarse difundir a través de una membrana para interaccionar con un receptor. A continuación se describen ensayos ejemplares útiles para explorar las bibliotecas.

En una realización, los compuestos pueden explorarse con respecto a la capacidad de interaccionar con una inmunoglobulina patógena ensayando la actividad de cada compuesto de unirse directamente a la inmunoglobulina o de inhibir una interacción entre la inmunoglobulina y un antígeno isquémico, por ejemplo, por incubación del compuesto de ensayo con una inmunoglobulina y un lisado, por ejemplo, un lisado de células endoteliales, por ejemplo en un pocillo de una placa de múltiples pocillos, tal como un placa de microtitulación de 96 pocillos convencional. En esta realización puede determinarse la actividad de cada compuesto individual. Como control puede usarse uno o más pocillos que no tengan compuesto de ensayo. Después de la incubación, la actividad de cada compuesto de ensayo puede determinarse ensayando cada pocillo. De esta manera, pueden determinarse en paralelo las actividades de una pluralidad de compuestos de ensayo.

Inhibidores de Proteínas o Péptidos

Pueden identificarse inhibidores de proteínas o péptidos usando, por ejemplo, los sistemas combinatorios descritos anteriormente. Como alternativa, pueden usarse fragmentos o péptidos de cualquiera de la inmunoglobulina patógena, un antígeno diana o un componente de la ruta del complemento para bloquear interacciones entre esas proteínas.

También se describen variantes de los fragmentos o péptidos de cualquiera de la inmunoglobulina patógena, un antígeno diana o un componente de la ruta del complemento que incluyen sustituciones de aminoácidos "no esenciales". Sustituciones de aminoácidos no esenciales se refiere a alteraciones de la secuencia de tipo silvestre que pueden realizarse sin anular o, más preferentemente, sin alterar sustancialmente una actividad biológica, mientras que un resto aminoacídico "esencial" produce dicho cambio.

Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto aminoacídico se reemplaza por un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de restos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas lateras ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De esta manera, un resto aminoacídico no esencial previsto en una inmunoglobulina patógena puede reemplazarse preferentemente por otro resto aminoacídico de la misma familia de cadenas laterales. Como alternativa, en otra realización, pueden introducirse aleatoriamente mutaciones a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de inmunoglobulina patógena, tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden explorarse para determinar la actividad biológica.

En otro aspecto, se describe una inmunoglobulina patógena modificada, por ejemplo, que funciona como un agonista (mimético) o como un antagonista. Preferentemente, la inmunoglobulina patógena modificada funciona como un antagonista de la activación del complemento. Pueden generarse variantes de la inmunoglobulina patógena por mutagénesis, por ejemplo, mutación puntual discreta, la inserción o deleción de secuencias o el truncamiento de una inmunoglobulina patógena. Un agonista de la inmunoglobulina patógena puede retener sustancialmente la misma, o una subserie, de las actividades biológicas de la forma natural de la proteína. Un antagonista de una inmunoglobulina patógena puede inhibir una o más de las actividades de la forma natural de la inmunoglobulina patógena, por ejemplo, al ser capaz de unirse a un antígeno específico isquémico, pero incapaz de activar la ruta del complemento. De esta manera, pueden inducirse efectos biológicos específicos por tratamiento con una variante de función limitada.

En una realización, el sitio dentro de la inmunoglobulina patógena (por ejemplo, una IgM patógena) que se une a C1q puede mutarse de tal manera que ya no pueda unirse a C1q. Por ejemplo, el dominio C_{H}2 de una IgG y el dominio C_{H}4 de una IgM, que se sabe que contienen sitios de unión para C1q, pueden mutarse (véase el documento WO 94/29351). Por ejemplo, puede mutarse la mitad carboxilo terminal del dominio C_{H}2 de una IgG (restos 231 a 239, preferentemente dentro de 234 a 239), que parece mediar en la unión de C1q y la posterior activación del complemento. Como otro ejemplo, Wright y col., han demostrado que un cambio de un solo nucleótido en el dominio de la región constante de la IgM hace que el anticuerpo sea defectuoso para iniciar la citolisis dependiente del complemento. El cambio de un solo nucleótido produce la codificación de un resto de serina en lugar del resto de prolina normal en la posición de aminoácido 436 en el tercer dominio constante (Wright y col. 1988, J. Biol. Chem. 263: 11221). Las sustituciones de aminoácidos que pueden realizarse en anticuerpos para alterar la unión o actividad del complemento son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo Wright y col. 1988, J. Biol. Chem. 263: 11221; Shulman y col. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 7678-7682; Arya y col., (1994) J. Immunol. 253: 1206-1212; Poon y col., (1995) J. Biol. Chem. 270: 8571-8577, incorporándose el contenido de todos estos textos en la presente memoria por referencia). Por consiguiente, en una realización, los anticuerpos de la presente invención tienen una mutación que altera la unión o actividad del complemento. Los anticuerpos en los que se han añadido, delecionado o sustituido aminoácidos se denominan en la presente memoria anticuerpos modificados o anticuerpos alterados. Como apreciará el experto en la materia, los procedimientos usados para producir dichos cambios en la secuencia de nucleótidos o aminoácidos variarán dependiendo de los resultados deseados.

Pueden identificarse variantes de una inmunoglobulina patógena por exploración de bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo mutantes de truncamiento, de una inmunoglobulina patógena para determinar la actividad agonista o antagonista.

Pueden usarse bibliotecas de fragmentos, por ejemplo, fragmentos N terminales, C terminales o internos, de una secuencia codificante de inmunoglobulina patógena para generar una población variegada de fragmentos para la exploración y posterior selección de variantes de esta proteína. Se prefieren particularmente variantes en las que se añade o deleciona un resto de cisteína o en las que se añade o deleciona un resto que está glicosilado.

Como procedimientos para explorar productos génicos de bibliotecas combinatorias obtenidas por mutaciones puntuales o truncamiento, y para la exploración de bibliotecas de ADNc para encontrar productos génicos que tienen una propiedad seleccionada, puede usarse mutagénesis de conjunto recursiva (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, en combinación con los ensayos de exploración para identificar variantes (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave y col. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).

Pueden explotarse ensayos basados en células para analizar una biblioteca variegada. Por ejemplo, una biblioteca de vectores de expresión puede introducirse por transfección en una línea celular, por ejemplo una línea celular que normalmente responde a la proteína de una manera dependiente del sustrato. Después puede recuperarse el ADN plasmídico de las células que consiguen la inhibición o, como alternativa, la potenciación de la señalización por el sustrato de la inmunoglobulina patógena, y caracterizarse adicionalmente los clones individuales.

En otro aspecto, los presentes inventores describen un procedimiento para obtener una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, una inmunoglobulina patógena que tiene una actividad que no es de tipo silvestre, por ejemplo un antagonista, agonista o superagonista de una inmunoglobulina patógena natural. El procedimiento incluye: alterar la secuencia, por ejemplo, por sustitución o deleción de uno o más restos de una inmunoglobulina patógena, un dominio o resto descrito en la presente memoria, y ensayar el polipéptido alterado con respecto a la actividad deseada.

En otro aspecto, los presentes inventores describen un procedimiento para obtener un fragmento o análogo de una inmunoglobulina patógena que tiene una actividad biológica alterada de una inmunoglobulina patógena natural. El procedimiento incluye: alterar la secuencia, por ejemplo, por sustitución o deleción de uno o más restos, de una inmunoglobulina patógena, por ejemplo, alterando la secuencia de una región no conservada, o un dominio o un resto descrito en la presente memoria, y ensayar el polipéptido alterado con respecto a la actividad deseada.

Producción de Inmunoglobulinas

En otras realizaciones, los inhibidores pueden ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, por ejemplo, un anticuerpo anti-idiotípico o una parte de unión a antígeno del mismo.

La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se usa en la presente memoria, se refiere a una molécula de anticuerpo de una sola composición molecular. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta una sola especificidad y afinidad de unión por un epítope particular. Por consiguiente, la expresión "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una sola especificidad de unión que tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico, por ejemplo un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.

Los procedimientos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal contra una diana (por ejemplo, una inmunoglobulina patógena o un antígeno específico de isquemia en una célula) puede producirse por una diversidad técnicas, incluyendo la metodología convencional de anticuerpos monoclonales, por ejemplo, la técnica convencional de hibridación de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque se prefieren procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. En la técnica se conocen protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión. También se conocen compañeros de fusión (por ejemplo células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.

Los anticuerpos monoclonales humanos pueden generarse usando ratones transgénicos que llevan los genes de inmunoglobulina humana en lugar del sistema de ratón. Se usan esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés para producir hibridomas que secretan mAb humanas con afinidades específicas por epítopes de una proteína humana (véase, por ejemplo, Wood y col. Solicitud Internacional WO 91/00906, Kucherlapati y col. Publicación PCT WO 91/10741; Lonberg y col. Solicitud Internacional WO 92/03918; Kay y col. Solicitud Internacional 92/03917; Lonberg, N. y col. 1994 Nature 368: 856-859; Green, L.L. y col. 1994 Nature Genet. 7: 13-21; Morrison, S.L. y col. 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman y col. 1993 Year Immunol 7: 33-40; Tuaillon y col. 1993 PNAS 90: 3720-3724; Bruggeman y col. 1991 Eur J Immunol 21: 1323-1326).

En una realización, pueden generarse hibridomas a partir de células B-1 CD5+ humanas. Como alternativa, pueden usarse hibridomas murinos "humanizados" que reconocen "antígenos isquémicos" de reacción cruzada.

También pueden generarse anticuerpos monoclonales por otros procedimientos conocidos por los expertos en la materia de la tecnología de ADN recombinante. Se ha desarrollado un procedimiento alternativo, denominado procedimiento de "presentación de anticuerpos combinatorios" para identificar y aislar fragmentos de anticuerpo que tienen una especificidad de antígeno particular, y puede utilizarse para producir anticuerpos monoclonales (como descripciones de presentación de anticuerpos combinatorios véase, por ejemplo, Sastry y col. 1989 PNAS 86: 5728; Huse y col. 1989 Science 246: 1275; y Orlandi y col. 1989 PNAS 86: 3833). Después de inmunizar a un animal con un inmunógeno como se ha descrito anteriormente, se clona el repertorio de anticuerpos del conjunto de células B resultante. Generalmente se conocen procedimientos para obtener la secuencia de ADN de las regiones variables de una población diversa de moléculas de inmunoglobulina por medio del uso de una mezcla de cebadores oligoméricos y PCR. Por ejemplo, pueden usarse cebadores oligonucleotídicos mixtos correspondientes a las secuencias líder 5' (péptido señal) y/o secuencias flanqueantes 1 (FR1), así como cebadores para un cebador de región constante 3' conservada para la amplificación por PCR de las regiones variables de cadena pesada y ligera a partir de varios anticuerpos murinos (Larrick y col., 1991, Biotechniques 11: 152-156). También puede usarse una estrategia similar para amplificar regiones variables de cadena pesada y ligera humana a partir de anticuerpos humanos (Larrick y col., 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology 2: 106-110).

En una realización ilustrativa, se aísla ARN a partir de linfocitos B, por ejemplo, células de sangre periférica, médula ósea o preparaciones de bazo, usando protocolos convencionales (por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202; Orlandi, y col. PNAS (1989) 86: 3833-3837; Sastry y col., PNAS (1989) 86: 5728-5732; y Huse y col. (1989) Science 246: 1275-1281). Se sintetiza ADNc de primera cadena usando cebadores específicos para la región constante de la cadena o cadenas pesadas y cada una de las cadenas ligeras \kappa y \lambda, así como cebadores para la secuencia señal. Usando cebadores de PCR de región variable, se amplifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera, cada una sola o en combinación, y se ligan en vectores apropiados para una manipulación adicional en la generación de paquetes de presentación. Los cebadores oligonucleotídicos útiles en los protocolos de amplificación pueden ser únicos o degenerados o pueden incorporar inosina en posiciones degeneradas. También pueden incorporarse secuencias de reconocimiento de endonucleasas de restricción en los cebadores para permitir la clonación del fragmento amplificado en un vector en una fase de lectura predeterminada para la expresión.

La biblioteca de genes V clonada a partir del repertorio de anticuerpos obtenidos por inmunización puede expresarse por una población de paquetes de presentación, preferentemente procedentes de un fago filamentoso, para formar una biblioteca de presentación de anticuerpos. Idealmente, el paquete de presentación comprende un sistema que permite el muestreo de bibliotecas de presentación de anticuerpos variegadas muy grandes, una clasificación rápida después de cada vuelta de separación por afinidad y un fácil aislamiento del gen de anticuerpo a partir de los paquetes de presentación purificados. Además de los kits disponibles en el mercado para generar bibliotecas de presentación en fagos (por ejemplo, el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, nº de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación en fagos Stratagene SurfZAP™, nº de catálogo 240612), pueden encontrarse ejemplos de procedimientos y reactivos particularmente susceptibles de usarse en la generación de una biblioteca de presentación de anticuerpos variegada en, por ejemplo, Ladner y col. Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; Kang y col. Publicación Internacional Nº WO 92/18619; Dower y col. Publicación Internacional Nº WO 91/17271; Winter y col. Publicación Internacional Nº WO 92/20791; Markland y col. Publicación Internacional Nº WO 92/15679; Breitling y col. Publicación Internacional Nº WO 93/01288; McCafferty y col. Publicación Internacional Nº WO 92/01047; Garrard y col. Publicación Internacional Nº WO 92/09690; Ladner y col. Publicación Internacional Nº WO 90/02809; Fuchs y col. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay y col. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse y col. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffths y col. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins y col. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson y col. (1991) Nature 352: 624-628; Gram y col. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad y col. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom y col. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas y col. (1991) PNAS 88: 7978-7982.

En ciertas realizaciones, los dominios de la región V de la cadena pesada y ligera pueden expresarse en el mismo polipéptido, unirse por un enlazador flexible para formar un fragmento Fv monocatenario y el gen de scFV posteriormente clonarse en el vector de expresión o genoma de fago deseado. Como se describe en general en McCafferty y col., Nature (1990) 348: 552-554, pueden usarse dominios de V_{H} y V_{L} completos de un anticuerpo, unidos por un enlazador flexible (Gly_{4}-Ser)_{3} para producir un anticuerpo monocatenario que puede hacer el paquete de presentación separable basándose en la afinidad por el antígeno. Posteriormente, los anticuerpos scFV aislados inmunorreactivos con el antígeno pueden formularse en una preparación farmacéutica para su uso en el presente procedimiento.

Una vez presentada en la superficie de un paquete de presentación (por ejemplo, un fago filamentoso), la biblioteca de anticuerpos se explora con el antígeno diana, o un fragmento peptídico del mismo, para identificar y aislar paquetes que expresan un anticuerpo que tiene la especificidad por el antígeno diana. Puede recuperarse el ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado a partir del paquete de presentación (por ejemplo, a partir del genoma del fago) y subclonarse en otros vectores de expresión por técnicas de ADN recombinante convencionales.

Pueden obtenerse moléculas de anticuerpo específicas con altas afinidades por una proteína de la superficie de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, procedimientos que implican la exploración de bibliotecas (Ladner, R.C., y col., Patente Estados Unidos Nº 5.233.409; Ladner, R.C., y col., Patente Estados Unidos Nº 5.403.484). Además, los procedimientos de estas bibliotecas pueden usarse en exploraciones para obtener determinantes de unión que son miméticos de los determinantes estructurales de anticuerpos.

En particular, la superficie de unión de Fv de una molécula de anticuerpo particular interacciona con su ligando diana de acuerdo con principios de interacciones proteína-proteína, por lo tanto los datos de secuencia para V_{H} y V_{L} (la última de las cuales puede ser de tipo de cadena \kappa o \lambda) es la base para las técnicas de ingeniería de proteínas conocidas por los expertos en la materia. Pueden obtenerse detalles de la superficie de la proteína que comprende los determinantes de unión a partir de información de la secuencia del anticuerpo, por un procedimiento de modelado usando estructuras tridimensionales determinadas previamente de otros anticuerpos obtenidas por estudios de RMN o datos cristalográficos. Bajorath, J. y S. Sheriff, 1996, Proteins: Struct., Funct., and Genet. 24 (2), 152-157; Webster, D.M. y A. R. Rees, 1995, "Molecular modeling of antibody-combining sites", en S. Paul, Ed., Methods in Molecular Biol. 51, Antibody Engineering Protocols, Humana Press, Totowa, NJ, págs. 17-49; y Johnson, G., Wu, T.T. y E.A. Kabat, 1995, "Seqhunt: A program to screen aligned nucleotide and amino acid sequences", en Methods in Molecular Biol. 51, op. cit., págs.1-15.

En una realización, una biblioteca de péptidos variegada se expresa por una población de paquetes de presentación para formar una biblioteca de presentación de péptidos. Idealmente, el paquete de presentación comprende un sistema que permite el muestreo de bibliotecas de presentación de péptidos variegadas muy grandes, una rápida clasificación después de cada vuelta de separación por afinidad y el fácil aislamiento del gen que codifica el péptido a partir de los paquetes de presentación purificados. Las bibliotecas de presentación de péptidos pueden estar, por ejemplo, en organismos procariotas y virus, que pueden amplificarse rápidamente; son relativamente fáciles de manipular y permiten la creación de un gran número de clones. Los paquetes de presentación preferidos incluyen, por ejemplo, células bacterianas vegetativas, esporas bacterianas y, más preferentemente, virus bacterianos (especialmente virus de ADN). Sin embargo, la presente invención también contempla el uso de células eucariotas, incluyendo levaduras y sus esporas, como posibles paquetes de presentación. Las bibliotecas de presentación de fagos se han descrito anteriormente.

Otras técnicas incluyen cromatografía de afinidad con un "receptor" apropiado, por ejemplo, un antígeno diana, seguido de la identificación de los agentes de unión o ligandos aislados por técnicas convencionales (por ejemplo, espectrometría de masas y RMN). Preferentemente, el receptor soluble se conjuga con un marcador (por ejemplo fluoróforos, enzimas colorimétricas, radioisótopos o compuestos luminescentes) que pueden detectarse para indicar la unión al ligando. Como alternativa, pueden liberarse selectivamente compuestos inmovilizados y dejarse difundir a través de una membrana para interaccionar con un receptor.

También pueden sintetizarse bibliotecas combinatorias de compuestos con "marcadores" para codificar la identidad de cada miembro de la biblioteca (véase, por ejemplo, W.C. Still y col., Solicitud Internacional WO 94/08051). En general, este procedimiento caracteriza el uso de marcadores inertes pero fácilmente detectables que se unen al soporte sólido o a los compuestos. Cuando se detecta un compuesto activo, la identidad del compuesto se determina por la identificación del único marcador adjunto. Este procedimiento de marcaje permite la síntesis de grandes bibliotecas de compuestos que pueden identificarse a niveles muy bajos entre la serie total de todos los compuestos de la biblioteca.

La expresión "anticuerpo modificado" pretende incluir anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados que se han modificado, por ejemplo, por deleción, adición o sustitución de partes del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede modificarse delecionando la región de bisagra, generando de esta manera un anticuerpo monovalente. Un anticuerpo de la presente invención puede ser uno en el que la región variable, o una parte de la misma, por ejemplo, las regiones determinantes de complementariedad (CDR) se generan en un organismo no humano, por ejemplo una rata o ratón. Están dentro de la invención los anticuerpos quiméricos, con CDR injertadas y humanizados. Están dentro de la invención anticuerpos generados en un organismo no humano, por ejemplo, una rata o ratón, y después modificados, por ejemplo, en la región flanqueante variable o constante, para reducir la antigenicidad en un ser humano. Cualquier modificación está dentro del ámbito de la invención siempre que el anticuerpo tenga al menos una parte de unión a antígeno.

Pueden producirse anticuerpos quiméricos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de ratón-humano) por técnicas de ADN recombinante conocidas en este campo. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fc de una molécula de anticuerpo monoclonal murino (o de otra especie) se digiere con enzimas de restricción para retirar la región que codifica la Fc murina, y se sustituye por la parte equivalente de un gen que codifica una región constante Fc humana. (Véase Robinson y col., Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, y col., Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171.496; Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger y col., Solicitud Internacional WO 86/01533; Cabilly y col. Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Cabilly y col., Solicitud de Patente Europea 125.023; Better y col. (1988 Science 240: 1041-1043); Liu y col. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu y col., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun y col. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura y col., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood y col. (1985) Nature 314: 446-449; y Shaw y col., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559).

Un anticuerpo quimérico puede humanizarse adicionalmente reemplazando secuencias de la región variable Fv que no están implicadas directamente en la unión al antígeno por secuencias equivalentes de regiones variables Fv humanas. Se proporcionan procedimientos generales para generar anticuerpos humanizados por Morrison, S. L., 1985, Science 229: 1202-1207, por Oi y col., 1986, BioTechniques 4: 214, y por Queen y col. documentos US 5.585.089, US 5.693.761 y US 5.693.762. Esos procedimientos incluyen el aislamiento, la manipulación y la expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican todo o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Las fuentes de dicho ácido nucleico son bien conocidas para los expertos en la materia y pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de 7E3, un hibridoma productor de anticuerpos anti-GPII_{b}DIII_{a}. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo quimérico, o un fragmento del mismo, después puede clonarse en un vector de expresión apropiado. Como alternativa, pueden producirse anticuerpos humanizados adecuados por sustitución de CDR. Patente de Estados Unidos Nº 5.225.539; Jones y col. 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan y col. 1988 Science 239: 1534; y Beidler y col. 1988 J. Immunol. 141: 4053-4060.

Pueden producirse anticuerpos humanizados o con CDR injertadas por injerto de CDR o sustitución de CDR, en los que pueden reemplazarse una, dos o todas las CDR de una cadena de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, la Patente Estados Nº 5.225.539; Jones y col. 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan y col. 1988 Science 239: 1534; Beidler y col. 1988 J. Immunol. 141: 4053-4060; Winter US 5.225.539. Winter describe un procedimiento de injerto de CDR que puede usarse para preparar anticuerpos humanizados (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987; Winter US 5.225.539).

Un anticuerpo humanizado o con CDR injertadas tendrá al menos una o dos, pero generalmente todas las CDR del receptor (de cadenas de inmunoglobulina pesadas y/o ligeras) remplazadas por una CDR del donante. Preferentemente, el donante será un anticuerpo de roedor, por ejemplo, un anticuerpo de rata o ratón, y el receptor será una región flanqueante humana o una región flanqueante consenso humana. Típicamente, la inmunoglobulina que proporciona la CDR se denomina "donante" y la inmunoglobulina que proporciona la región flanqueante se denomina "aceptora". En una realización, la inmunoglobulina donante es una inmunoglobulina no humana (por ejemplo, de roedor). La región flanqueante aceptora puede ser una región flanqueante natural (por ejemplo, humana) o una región flanqueante consenso, o una secuencia con una identidad de aproximadamente un 85% o mayor, preferentemente del 90%, 95%, 99% o mayor a la misma.

Todas las CDR de un anticuerpo particular pueden reemplazarse por al menos una parte de una CDR no humana o sólo algunas de las CDR pueden reemplazarse por CDR no humanas. Sólo es necesario reemplazar el número de CDR necesarias para la unión del anticuerpo humanizado al receptor Fc.

También están dentro del ámbito de la invención anticuerpos quiméricos y humanizados en los que se han sustituido, delecionado o añadido aminoácidos específicos. En particular, los anticuerpos humanizados preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región flanqueante, para mejorar la unión al antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado tendrá restos flanqueantes idénticos al resto flanqueante del donante o a otro aminoácido distinto del resto flanqueante del receptor. Como otro ejemplo, en un anticuerpo humanizado que tiene CDR de ratón, pueden reemplazarse aminoácidos localizados en la región flanqueante humana por los aminoácidos localizados en las posiciones correspondientes en el anticuerpo de ratón. Se sabe que estas sustituciones mejoran la unión de anticuerpos humanizados al antígeno en algunos casos.

Como se ha descrito anteriormente, la expresión "parte de unión antígeno" o "parte de anticuerpo" o "fragmento", como se usa en la presente memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, un antígeno diana, por ejemplo un antígeno isquémico). Se obtienen fragmentos de anticuerpo de la invención usando procedimientos convencionales conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la digestión de un anticuerpo con pepsina produce fragmentos F(ab')_{2} y múltiples fragmentos pequeños. La reducción con mercaptoetanol de un anticuerpo produce cadenas pesadas y ligeras individuales. La digestión de un anticuerpo con papaína produce fragmentos Fab individuales y el fragmento Fc. Los fragmentos de anticuerpos se exploran con respecto a su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos, como se ha descrito anteriormente.

La secuencia de nucleótidos de la región variable de la cadena pesada de IgM de 22A5 se muestra en la Figura 4A (SEC ID Nº: 1), y la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de la IgM de 22A5 se muestra en la Figura 5A (SEC ID Nº: 2). El dominio CDR1 de la región variable de cadena pesada corresponde a los aminoácidos aproximadamente 30 a 34 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 4) y comprende los nucleótidos aproximadamente 91-105 de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 3) y el dominio CDR2 de la región variable de cadena pesada corresponde a los aminoácidos 49 a 65 de la SEC ID Nº: 2 (SEC ID Nº: 6) e incluye los nucleótidos 148-198 de la SEC ID Nº: 1 (SEC ID Nº: 5).

La secuencia de nucleótidos de la región variable de cadena ligera de IgM de 22A5 se muestra en la Figura 4B (SEC ID Nº: 7), y la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de IgM de 22A5 se muestra en la Figura 5B (SEC ID Nº: 8). El dominio CDR1 de la región variable de cadena ligera corresponde a los aminoácidos aproximadamente 23 a 33 de la de la SEC ID Nº: 8 (SEC ID Nº: 10) e incluye los nucleótidos aproximadamente 71-103 de la SEC ID Nº: 7 (SEC ID Nº: 9) y el dominio CDR2 de la región variable de cadena ligera corresponde a aproximadamente los aminoácidos 49 a 55 de la SEC ID Nº: 8 (SEC ID Nº: 12) e incluye los nucleótidos aproximadamente 149 a 169 de la SEC ID Nº: 7 (SEC ID Nº: 11).

El experto en la materia apreciará que pueden obtenerse secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos de la presente invención, o fragmentos de los mismos (por ejemplo, un dominio CDR, tal como un dominio CDR2, o fragmentos) a partir de las secuencias de nucleótidos y aminoácidos descritas en la presente solicitud usando el código genético y las técnicas de biología molecular convencionales. Además, el experto en la materia apreciará que debido a la degeneración del código genético, otras secuencias de nucleótidos pueden codificar las secuencias de aminoácidos indicadas en la presente memoria.

Las composiciones de ácido nucleico, aunque a menudo están en una secuencia nativa (excepto sitios de restricción modificados y similares) procedente de ADNc, genómico o mezclas, pueden estar mutados, de acuerdo con técnicas convencionales, para proporcionar secuencias génicas. En el caso de secuencias codificantes, estas mutaciones pueden afectar a la secuencia de aminoácidos cuando se desee. En particular, se contemplan secuencias de nucleótidos substancialmente idénticas o derivadas de secuencias nativas V, D, J, constantes, cambios y otras secuencias descritas en la presente memoria (indicando "derivada" que una secuencia es idéntica o está modificada a partir de otra secuencia).

En una realización, un ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena pesada de IgM de 22A5 que tiene una secuencia de nucleótidos como se muestra en la Figura 4A (SEC ID Nº: 1) o una secuencia con al menos un 96%, 97%, 98%, 99% de identidad, o mayor, con la misma. En otra realización, el ácido nucleico aislado codifica una secuencia de nucleótidos de región variable de cadena ligera de IgM de 22A5 que tiene una secuencia de nucleótidos como la mostrada en la Figura 4B (SEC ID Nº: 7) o una secuencia con al menos un 96%, 97%, 98% o 99% de identidad, o mayor, con la misma.

En otra realización, los presentes inventores describen un ácido nucleico aislado que codifica un dominio CDR1 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4, o un fragmento o forma modificada de la misma. Este ácido nucleico puede codificar sólo la región CDR1 o puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo entera. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena pesada que tiene un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6. En otra realización, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un dominio CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 6, o un fragmento o forma modificada de la misma. Este ácido nucleico puede codificar sólo la región CDR2 o puede codificar una región variable de cadena pesada de anticuerpo entera. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena ligera que tiene un dominio CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 4.

En otra realización, los presentes inventores describen un ácido nucleico aislado que codifica un dominio CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10, o un fragmento o forma modificada de la misma. Este ácido nucleico puede codificar sólo la región CDR1 o puede codificar una región variable de cadena ligera de anticuerpo entera. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena ligera que tiene un dominio CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 12. En otra realización más, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un dominio CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 12, o un fragmento o forma modificada de la misma. Este ácido nucleico puede codificar sólo la región CDR2 o puede codificar una región variable de cadena ligera de anticuerpo entera. Por ejemplo, el ácido nucleico puede codificar una región variable de cadena ligera que tiene un dominio CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 10.

Composiciones Farmacéuticas y Administración

Los inhibidores pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un inhibidor (por ejemplo, una inmunoglobulina patógena modificada) y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción, y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que aumentan la vida útil o eficacia del anticuerpo o parte de anticuerpo.

Una composición farmacéutica se formula para ser compatible con la vía de administración para la que está destinada. Los ejemplos de vías de administración pueden incluir, por ejemplo, la administración parenteral, por ejemplo intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. De esta manera, las composiciones de la presente invención pueden estar en una diversidad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y de infusión), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica deseados. Las composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o de infusión, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. Un modo de administración preferido es la administración parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea.

Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, por ejemplo intradérmica o subcutánea, pueden incluir, por ejemplo, los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito sódico; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminatetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH puede ajustarse con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido sódico. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de múltiples dosis hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en tal medida que se pueda administrar fácilmente por medio de una jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y tiene que conservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede conseguirse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina.

Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, anticuerpo o parte de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación ingredientes enumerados anteriormente, cuando se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son secado al vacío y liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución filtrada de forma estéril previamente del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partículas requerido en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos.

Los inhibidores pueden administrarse por una diversidad de procedimientos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo de administración preferido es inyección o infusión intravenosa. Como apreciará el experto en la materia, la vía y/o modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá al compuesto frente a la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden usarse polímeros biocompatibles y biodegradables tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos procedimientos para la preparación de estas formulaciones están patentados o se conocen en general por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

En ciertas realizaciones, un inhibidor puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes si se desea) también puede encerrarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, comprimirse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para la administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la invención por una vía distinta de la administración parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto o coadministrar el compuesto con un material para impedir su inactivación. Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de una pulverización de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.

El inhibidor puede prepararse con vehículos que protegerán al compuesto frente a la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de liberación microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Para los expertos en la materia serán evidentes procedimientos para la preparación de estas formulaciones. Los materiales también pueden obtenerse comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También pueden usarse suspensiones liposomales como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos pueden prepararse de acuerdo con procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, como se describe en la Patente Estados Unidos Nº 4.522.811.

Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para la administración.

Ejemplos Ejemplo 1 Mecanismo de Lesión por Isquemia-Reperfusión

Este ejemplo muestra que ratones deficientes en el sistema del complemento eran resistentes a la lesión por isquemia-reperfusión.

Para examinar el mecanismo de la lesión por isquemia-reperfusión, se trataron ratones deficientes en el componente C3 del complemento en el modelo de extremidad inferior. Los ratones C3-/- se protegieron parcialmente de la lesión basándose en una reducción aproximada del 50% en el índice de permeabilidad (véase, Weiser y col. (1996) J. Exp. Med. 1857-1864). De esta manera, el componente C3 del complemento es esencial para la inducción de la lesión completa en este modelo murino.

Los experimentos en Weiser y col. no identificaron cómo se activaba al complemento. El sistema del complemento del suero puede activarse por al menos tres rutas distintas, la ruta clásica, de lectinas o alternativa. El conocimiento de qué ruta está implicada es importante, ya que sugiere un mecanismo de la lesión. Por ejemplo, la ruta clásica se activa muy eficazmente por los isotipos IgM e IgG de inmunoglobulinas o por la proteína de reconocimiento del suero proteína C reactiva. Sin embargo, la ruta de lectinas se activa después del reconocimiento de carbohidratos específicos tales como manano por la lectina de unión a manano (MBL) (Epstein y col., (1996) Immunol 8, 29-35). En ambas rutas, se requiere el componente C4 del complemento para formar un complejo enzimático con C2 que cataliza la escisión del componente central C3. Por el contrario, la ruta alternativa activa espontáneamente la conducción a la conversión de C3 en su formativa (C3b) y la unión a tejidos extraños o propios. La ruta se regula estrechamente ya que todas las células huésped expresan inhibidores de amplificación de la ruta del complemento por inactivación o desplazamiento de la C3 convertasa (Muller-Eberhard, H.J., (1988) Ann. Rev. Biochem. 57 321-347). Una estrategia para determinar la ruta implicada es el uso de ratones deficientes en C4, es decir, que no pueden formar C3 convertasa por la ruta clásica o de lectinas. La comparación de ratones deficientes en C3 o C4 con controles de tipo silvestre (WT) en el modelo de extremidad inferior, reveló que también se requería C4 para la inducción de la lesión completa (Weiser y col. supra). Este descubrimiento era importante ya que sugería que podría estar implicado un anticuerpo o MBL.

Ejemplo 2 La IgM Natural Actúa como Mediador en la Lesión por Isquemia-Reperfusión (I/R)

Este Ejemplo muestra que ratones deficientes en inmunoglobulinas eran resistentes a la lesión por isquemia-reperfusión.

Para determinar si un anticuerpo estaba implicado en la mediación de la lesión por I/R, se caracterizaron ratones totalmente deficientes en inmunoglobulina, RAG2-/- (deficientes en el gen-2 de activación de recombinasa) junto con los animales deficientes en el complemento en el modelo intestinal. Significativamente, los ratones RAG2-/- estaban protegidos en un nivel similar al observado en los animales deficientes en el complemento (Weiser y col. supra). Como los animales RAG2-/- también carecen de linfocitos maduros, era importante determinar que el efecto patógeno era dependiente del anticuerpo (Shinkai y col. (1992) Cell 68, 855-867). Para confirmar que la lesión estaba mediada por anticuerpos del suero, los animales deficientes se reconstituyeron con suero de ratón normal (Weiser y col. supra) o IgM purificada (Williams y col. (1999) J. Appl Physiol 86; 938-42). En ambos casos, los ratones RAG2-/- reconstituidos ya no estaban protegidos y se restauró la lesión. En los experimentos posteriores se usó un modelo de lesión intestinal como en este modelo, se cree que la lesión está mediada principalmente por el complemento.

La interpretación de estos resultados es que durante el periodo de isquemia, los neo- antígenos se expresan o exponen en la superficie de las células endoteliales. Las IgM circulantes parecen reconocer el nuevo determinante, unirse y activar la ruta clásica del complemento. Aunque no se conoce la naturaleza del antígeno, la IgM en lugar de la IgG parece ser la principal responsable de la activación del complemento ya que la reconstitución de ratones deficientes con IgG reunida no restauraba significativamente la lesión en los ratones. Una hipótesis alternativa es que hay otro acontecimiento inicial tal como la ruta de MBL que reconoce la superficie endotelial alterada, induce la activación del complemento de bajo nivel que a su vez expone nuevos sitios antigénicos y la ruta se amplifica por unión de IgM.

Ejemplo 3 La IgM Patógena es un Producto de células B-1

Como se cree que una fracción principal de la IgM circulante representa el anticuerpo natural, es decir el producto de genes de la línea germinal reordenados, es posible que también puedan protegerse ratones que llevan deficiencias en la fracción B-1 de los linfocitos. Las células B-1 tienen un fenotipo distinto de las células B-2 más convencionales ya que expresan bajos niveles de IgD y CD23 y una fracción principal expresa la proteína de la superficie celular (Hardy y col., (1994) Immunol. Rev.: 137, 91; Kantor y col. (1993) Annu. Rev. Immunol. 11, 501-538, 1993. Las células B-1 también se distinguen por una circulación reducida en ratones, una frecuencia limitada en los ganglios linfáticos periféricos y bazo y están localizadas principalmente dentro de la cavidad peritoneal. Para examinar un papel para las células B-1 como fuente de IgM patógena, se reconstituyeron ratones deficientes en anticuerpos (RAG2-/-) con 5 x 10^{5} células B-1 peritoneales y se dejaron en reposo aproximadamente 30 días antes del tratamiento. Los niveles circulantes de IgM alcanzan un intervalo casi normal en el mes posterior a la transferencia adoptiva. La caracterización de los ratones reconstituidos con células B-1 en el modelo de isquemia intestinal confirmó que las células B-1 eran una fuente principal de IgM patógena (véase Williams y col. (1999) supra). Ésta fue una observación importante porque el repertorio de anticuerpo natural de células B-1 está considerablemente más limitado de lo que sería de esperar en el caso de células B-2 convencionales. Por lo tanto, es posible que el anticuerpo patógeno represente un producto de la línea germinal.

Ejemplo 4 Los Ratones Cr2-/- Están Protegidos de la Lesión por Isquemia Reperfusión

La caracterización inicial de ratones knockout Cr2-/- reveló una reducción de aproximadamente un 50% en la frecuencia de células B-1a o B-1 o CD5+ (Ahearn y col. (1996) Immunity 4: 251-262). Aunque la caracterización de otra cepa de ratones deficientes en Cr2 no identificó una reducción similar (Molina y col. (1996) Proc. Natl. Acad Sci. USA 93, 3357-3361). No se sabe si la diferencia en frecuencia de células CD5+ se debía a una variación en las características basales de la cepa o a diferencias ambientales. A pesar de la menor frecuencia de células B-1a en los ratones Cr2-/-, los niveles circulantes de IgM estaban dentro del intervalo normal. Estos descubrimientos sugerían que el repertorio de IgM podría ser diferente en los animales deficientes en Cr2. Para ensayar esta hipótesis, se caracterizaron ratones en el modelo intestinal I/R. Sorprendentemente, los ratones Cr2-/- estaban igualmente protegidos que los ratones deficientes en anticuerpo completo (Figura 1). La comparación de supervivencia durante el periodo de cinco días después del tratamiento en el modelo intestinal demostró un aumento significativo en la mortalidad del WT en comparación con los animales deficientes en Cr2. De forma coherente con una mayor mortalidad, se observó una notable reducción en la lesión en secciones de tejido recogidas de ratones WT o deficientes en Cr2-/- tratados.

Se observó una lesión extensa en la capa mucosa del intestino en ratones WT o ratones Cr2-/- reconstituidos con células B-1 o IgM reunida. Por el contrario, las secciones de tejido aisladas a partir de ratones Cr2-/- tratados eran similares a las de los controles simulados. De esta manera, a pesar de los niveles circulantes normales de IgM, los ratones deficientes en Cr2 estaban protegidos de la lesión. Estos resultados no sólo confirman la importancia de células B-1 como fuente de anticuerpo patógeno, sino que sugieren que el sistema del complemento está implicado de alguna manera en la formación o mantenimiento del repertorio de anticuerpos naturales. Por ejemplo, el complemento puede estar implicado en la selección positiva de células B-1.

Ejemplo 5 Identificación de IgM Patógena

Este Ejemplo describe la generación de un clon de hibridoma específico a partir de células B-1 normales y la identificación de un clon que produce una IgM patógena. Se demostró que la IgM patógena restauraba la lesión in vivo en ratones deficientes en anticuerpo.

Los estudios en ratones que llevan una deficiencia en receptores del complemento CD21/CD35 reveló que los ratones carecían del anticuerpo patógeno. Este descubrimiento fue inesperado porque tienen un nivel normal de IgM en su sangre. Estos descubrimientos condujeron a la hipótesis de que una población especial de células B denominadas células B-1 son responsables de la secreción de la IgM patógena. Por ejemplo, el injerto de ratones deficientes en el receptor (Cr2-/-) con células B-1 de ratones normales restauró la lesión, confirmando la importancia de las células B-1. Para identificar el anticuerpo o anticuerpos específicos responsables de la lesión, se construyó un panel de clones de hibridoma a partir de un conjunto enriquecido de células B-1 peritoneales recogidas a partir de ratones normales. La estrategia general para preparar hibridomas a partir de una fracción enriquecida de células peritoneales incluye la recolección de células peritoneales de ratones tratados 7 días antes con IL-10 y posteriormente enriquecidos en células B CD23^{+} por selección negativa con perlas magnéticas. Las células B enriquecidas se analizan por FACS después de la tinción con IgM, Mac-1 y Mab específicos de CD23. La población enriquecida se activa adicionalmente por cultivo con LPS durante 24 horas. Las células activadas se hibridan con células de mieloma como compañeros de fusión en presencia de PEG y se cultivan en medio selectivo de HAT. Los hibridomas se exploran con respecto a los clones de secreción de IgM por ELISA y los pocillos positivos se expanden para la purificación de IgM.

Se analizaron 22 clones de hibridoma de secreción de IgM reuniendo una cantidad igual de producto de IgM a partir de cada uno de los clones. El tratamiento de ratones deficientes en anticuerpo con la IgM reunida restauró la lesión de forma similar a la observada con la IgM reunida a partir del suero. Este hallazgo confirmó que la IgM patógena estaba entre los 22 hibridomas producidos. Dividiendo los conjuntos en fracciones, es decir 1-11 y 12-22, y los ratones de tratamiento con las dos fracciones, se observó que el anticuerpo patógeno se fraccionaba con el conjunto que incluía el clon número 22. Finalmente, los ratones se reconstituyeron con el clon 17 ó 22. El clon 22 restauró la lesión mientras que los otros clones no lo hicieron (véase la Fig. 3A y 3B).

Ejemplo 6 Implicación del complemento en la selección de células B-1

Se han propuesto dos modelos diferentes para explicar el desarrollo de células B-1. La hipótesis del linaje propone que las células B-1 se desarrollan en las primeras fases de la vida fetal como una población distinta (Kantor y col. (1993) supra). Como alternativa, las células B-1 se desarrollan a partir de los mismos progenitores que las células B convencionales pero dependiendo de su entorno, es decir si se encuentran con antígeno, se desarrollan para dar B-1 o retienen el fenotipo de las células B-2 (Wortis, H.H. (1992) Int. Rev. Immunol. 8, 235; Clarke, J. (1998) Exp. Med. 187, 1325-1334). Independientemente de su origen, se sabe que las células B-1 no se reponen por la médula ósea de adulto a la misma frecuencia que las células B-2 y que su fenotipo es más similar al de las células B del hígado de las primeras fases fetales o las células de médula ósea (MO) de recién nacido. De forma coherente con un origen temprano, su repertorio tiende a desviarse hacia la expresión de genes VH más proximales y la adición de N-nucleótidos está limitada (Gu y col. (1990) EMBO J 9, 2133; Feeney, J. (1990) Exp. Med. 172, 1377). Parece razonable que dada la baja reposición por células madre de MO adulta, las células B-1 se auto-renuevan y la estimulación por antígeno podría ser importante en su renovación, expansión o incluso la selección inicial (Hayakawa y col., (1986) Eur. J. Immunol. 16, 1313). De hecho, de forma intrínseca al modelo convencional, las células B-1 deben seleccionarse con antígeno.

Las pruebas que respaldan un requisito de señalización de receptor de células B (RCB) para la selección positiva de células B-1 proceden de ratones que llevan mutaciones que alteran la señalización de RCB. Por ejemplo, la alteración en la señalización de RCB a través de CD19 (19, 20), vav (21) o Btk (22) afecta espectacularmente al desarrollo de las células B-1. Por el contrario, la pérdida de selección negativa tal como en ratones deficientes CD22- o SHP-1 puede llevar a un aumento en la frecuencia de células B-1 (O'Keefe y col. (1996) Science 274, 798-801; Shultz y col. (1993) Cell 73, 1445). Ciertos estudios elegantes recientes con ratones que llevan dos transgenes de Ig distintos, V_{H}12 (fenotipo de célula B-1) o V_{H}B1-8 (fenotipo de célula B-2) respaldan la perspectiva de que las células B-1 se seleccionan positivamente por autoantígenos. Por ejemplo, las células B que expresan de V_{H}12 solo o junto con B1-8 desarrollaron un fenotipo de célula B-1. Mientras tanto, se identificaron pocas células B, si se identificó alguna, que expresaban el B1-8 tg sólo. De esta manera, estos resultados sugerían que encontrar células B transgénicas con auto-PtC tenía como resultado la expansión de las que expresaban V_{H}12. La selección de células B-1 se notificó recientemente por Hardy y col. (1994) Immunol. Rev. 137, 91). En su modelo, se seleccionaron células B que expresaban un transgén de inmunoglobulina específico para Thy 1.1 y se expandieron en ratones que expresaban el antígeno afín. Por el contrario, no se encontraban células de transgén + B-1 en ratones que expresaban el alotipo alternativo Thy 1.2.

¿Dónde encaja el complemento en el desarrollo de las células B-1? La reducción global en la frecuencia de células B-1a y la pérdida más específica de células B-1 que expresan IgM implicadas en la lesión por I/R sugiere un papel para CD21/CD35 en la selección positiva o mantenimiento de células B-1a. Un posible papel del complemento es que aumenta la señalización de RCB tras encontrarse con el antígeno afín. Los estudios bioquímicos y análisis de ratones deficientes en CD21/CD35 demuestran la importancia de la señalización de co-receptores en la activación y supervivencia de células B convencionales (Carroll, M.C., (1998) Ann. Rev. Immunol 16, 545-568; Fearon y col. (1995) Annu. Rev. Immunol 13, 127-149). Es muy probable que las células B-1 de forma similar utilicen la señalización de co-receptores para aumentar la señal de RCB. Por ejemplo, las bacterias expresan antígenos de células B-1 típicos tales como fosforilcolina y no es poco razonable pensar que el recubrimiento de bacterias con ligando del complemento C3d aumentaría el entrecruzamiento del co-receptor con el RCB y aumentaría la señalización global. De esta manera, los antígenos expresados a menores concentraciones requerirían potenciación del complemento para que la célula B afín lo reconociera y se expandiera o seleccionara positivamente. Otro papel para los receptores del complemento está en la localización del antígeno en células dendríticas foliculares (CDF) dentro del compartimento linfoide. Sin embargo, como la población principal de células B-1 ocupa los tejidos peritoneales, no está claro si encontrarían CDF dentro de estructuras linfoides. No se conoce el sitio o sitios reales en los que las células B-1 experimentan selección positiva. Es posible que tengan que encontrar un antígeno afín en las primeras fases del desarrollo fetal o en MO de recién nacido. Si éste es el caso, sería de esperar que los receptores del complemento en células estromáticas dentro de estos compartimentos se unieran al antígeno para la presentación a las células B. Es posible que los receptores del complemento participen en las dos fases del desarrollo. En primer lugar, podrían potenciar la señalización de antígenos en la selección positiva inicial. En segundo lugar, como las células B-1 seleccionadas se reponen en sitios periféricos, los receptores del complemento de nuevo podrían estar implicados en la potenciación de la señalización de RCB.

La Figura 2 es un diagrama esquemático del papel propuesto para el complemento y los receptores del complemento en la selección positiva de linfocitos B-1 peritoneales. La interacción de los antígenos recubiertos con ligando del complemento (propios y no propios) produce un co-ligamiento del co-receptor de CD21/CD19 y RCB en la superficie celular conduciendo una mayor señalización y selección positiva.

Equivalentes

Los expertos en la materia reconocerán o podrán averiguar sin usar más de una experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descrita en la presente memoria.

<110> C. Carroll, Michael

\hskip1cm D. Moore, Jr. Francis

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<120> PROCEDIMIENTOS Y COMPOSICIONES PARA INHIBIR LA LESIÓN POR REPERFUSIÓN MEDIADA POR INMUNOGLOBULINA

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<130> 10861-024001

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<150> US60/210.272

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<151> 08-06-2000

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<160> 12

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0.

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<210> 1

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<211> 338

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(338)

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<400> 1

1

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<210> 2

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<211> 111

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

2

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<210> 3

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<211> 15

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(15)

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<400> 3

3

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<210> 4

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<211> 5

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

\hskip1cm4

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<210> 5

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<211> 51

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(51)

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<400> 5

5

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<210> 6

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 6

\hskip1cm6

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<210> 7

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<211> 349

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (5)...(349)

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<400> 7

7

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<210> 8

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<211> 114

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 8

8

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<210> 9

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<211> 33

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(33)

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<400> 9

9

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<210> 10

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<211> 11

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 10

\hskip1cm10

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<210> 11

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(21)

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<400> 11

11

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<210> 12

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 12

\hskip1cm12

Claims (6)

1. Una inmunoglobulina aislada que actúa como mediador en la lesión de tejidos posterior a una reperfusión, o parte de unión a antígeno de la misma, que tiene una CDR1 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 4 y una CDR2 de cadena pesada que comprende la SEC ID Nº: 6.

2. La inmunoglobulina aislada de la reivindicación 1, que es una IgM.

3. La inmunoglobulina aislada de la reivindicación 1, que se produce por células B-1.

4. La inmunoglobulina aislada de la reivindicación 1, que tiene una mutación que altera la unión o actividad del complemento.

5. Una célula huésped que produce la inmunoglobulina aislada de las reivindicaciones 1 ó 4.

6. La célula huésped de la reivindicación 5 que es una célula huésped de mamífero.