JP2004502412A - 免疫グロブリンを介した再灌流障害を抑制するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法および組成物を提供する。病原性免疫グロブリンと虚血抗原または補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質を同定するための方法を提供する。病原性免疫グロブリンおよびその変異型も開示する。
Description
【０００１】
発明の背景
補体系は先天性免疫および適応免疫の両方に関与する（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ， Ｈ．Ｊ．（１９８８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７、３２１〜３４７；Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｍ．Ｃ．（１９９８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １６、５４５〜５６８；Ｆｅａｒｏｎら（１９９５）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １３、１２７〜１４９）。血清補体または補体受容体の特定の成分（例えば、ＣＤ２１／ＣＤ３５）が欠損したマウスを用いた最近の研究により、補体に関する既知の多くの役割が確認されただけでなく、自然免疫および適応免疫における重要な機構に対する新たな解明の糸口も得られている（Ｃａｒｒｏｌｌ， ＭＣ．（１９９８）前記）。例えば、Ｔ依存性抗原に対する記憶応答の発生を補体が増強する機序の一つは、ＣＤ２１／ＣＤ１９／Ｔａｐａ−１補助受容体を介して胚中心（ＧＣ）のＢ細胞における生存シグナルを媒介することによる。また、欠損マウスは古典経路が障害の誘導に不可欠であることを特定するという重要な点を確かめる上でも重要なものとなっている（Ｗｅｉｓｅｒら（１９９６）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５７〜１８６４）。
【０００２】
虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害とは、低酸素組織の再灌流後にみられる内皮および下層の実質組織に対する炎症性障害のことを指す。これは、例えば心筋、中枢神経系、後肢および腸を含む、種々の組織に対する急性障害および慢性障害の両方の原因となる一般的な症候群である。虚血再灌流障害は壊死および非可逆的細胞障害を引き起こす恐れがある。例えば、虚血性骨格筋の再灌流は透過性亢進型水腫を伴う血管漏出を特徴とする内皮細胞障害を引き起こし（Ｗｅｉｓｅｒら（１９９６）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５７〜１８６４）、小腸の再灌流は粘膜の損傷を招く（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９３８〜９４２）。一般に、虚血期間が長いほど炎症反応が顕著である。Ｉ／Ｒ障害の程度は、虚血領域の大きさおよび具体的な罹患組織などの要因によっても決定される（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９３８〜９４２）。
【０００３】
Ｉ／Ｒ障害を主に媒介するのは補体系である。ワイズマン（Ｗｅｉｓｍａｎ）らは、ラット心臓モデルにおいて補体Ｃ３ｂ（ｓＣＲ１）の可溶性阻害物質を用いて、Ｉ／Ｒ障害を部分的に阻止するための機構を報告している（Ｗｅｉｓｍａｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９、１４６〜１５１）。可溶性ＣＲ１受容体は、Ｃ３転換酵素、すなわち自然状態のＣ３を活性Ｃ３ｂ型に変換する酵素複合体を不活性化するのに非常に有効である。ＣＲ１受容体は、第Ｉ因子によるＣ３ｂの切断および転換酵素からのＣ３ｂの転位の両方において補助受容体としての役割を果たす。マウスに対して虚血誘導前にｓＣＲ１の静脈内注射を行ったところ、投与したマウスの再灌流後の障害は著しく軽減された。投与したマウスの組織検査により、心筋内の補体沈着レベルおよび組織障害の程度の低下が判明した（Ｗｅｉｓｍａｎら（１９９０）前記）。下肢障害モデルのマウスに対するｓＣＲ１の前投与でも同様の結果が得られた（Ｈｉｌｌら（１９９２）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９、１７２３〜１７３０）。このモデルでは、下肢に駆血帯を装着することによって下腿部に対する血流を約２時間にわたり遮断した。組織への血流を回復させる前に、マウスに対して透過性のマーカーとして放射性ヨウ化アルブミンの静脈内投与を行った。
【０００４】
これらの試験により、障害が補体によって媒介されることは確定したものの、彼らは障害の発生機序という問題には取り組まなかった。ワイザー（Ｗｅｉｓｅｒ）らは、抗体の欠損したマウスが後肢モデルにおいて障害から部分的に防御されることを示した。正常マウス血清を再構成することによって障害が再び生じた。ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）らはこの観察所見を小腸モデルにまで拡大適用させ、抗体欠損マウスにおける障害を再生させるには精製ＩｇＭで十分であることを示した。
【０００５】
発明の概要
本発明は一部には、虚血特異的抗原を認識する病原性免疫グロブリン（Ｉｇ）、特に病原性ＩｇＭの同定に基づく。理論に拘束されるものではないが、これらの病原性ＩｇＭと虚血特異的抗原との結合は特に補体経路の活性化を誘発し、これは最終的には再灌流障害または虚血障害を引き起こすと考えられている。本出願者らは、病原性ＩｇＭが、本明細書で「Ｂ−１細胞」と称するＢ細胞のサブポピュレーションによって産生されることも見いだした。
【０００６】
したがって、本発明は、対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、障害が抑制または軽減されるように、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質の有効量を対象に投与し、それによって虚血特異的抗原と結合した病原性免疫グロブリンの数を減少させることを含む方法を特徴とする。
【０００７】
好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は、例えば脳卒中として、自然に発生した発作の後に結果として生じる。再灌流障害または虚血障害は外科的処置の最中および／または後に生じることもある。障害の原因となる外科的処置の例には、血管形成術、ステント処置、アテローム切除術およびバイパス手術からなる群から選択される血管矯正技術が含まれる。好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は心血管組織（例えば心臓）において生じる。
【０００８】
好ましくは、本発明の阻害物質は、以下の活性の１つまたは複数により、病原性免疫グロブリンと拮抗する：（ｉ）病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉ）病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉｉ）例えば免疫グロブリンの隔離および／もしくはその分解のターゲティングにより、病原性免疫グロブリンを中和する；または（ｉｖ）病原性免疫グロブリンの産生を阻害もしくは抑制する、例えば病原性抗体の合成、集合および／もしくは翻訳後修飾を阻止する。阻害物質は、タンパク質もしくはペプチド；低分子；抗体もしくはその断片、例えば抗イディオタイプ抗体；糖質；または糖タンパク質であってよい。別の好ましい態様において、阻害物質は本明細書に記載する改変抗体でもよい。好ましい態様において、阻害物質は１回、あるいは数時間、数日、数週、数カ月または数年という期間にわたる連続的な曝露として投与される。阻害物質は、障害の原因となる自然発生性の発作の前、最中および／または後のいずれに投与してもよい。また、阻害物質を外科的処置、例えば再灌流障害または虚血障害を招くことのある外科的処置の前、最中および／または後に投与することもできる。好ましい態様では、阻害物質を、他の治療薬、例えば抗凝固薬、補体阻害物質と組み合わせて投与する。
【０００９】
もう１つの局面において、本発明は、対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、障害が抑制または軽減されるように、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質の有効量を対象に投与し、それによって補体活性を活性化する病原性免疫グロブリンの数を減少させることを含む方法を特徴とする。
【００１０】
好ましい態様において、病原性免疫グロブリンはＩｇＭまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３）である。好ましくは、病原性免疫グロブリンはＩｇＭであり、より好ましくはＩｇＭのサブクラスである。別の好ましい態様において、病原性免疫グロブリンはＢ細胞のサブポピュレーション、例えばＢ−１細胞によって産生されるか、または病原性免疫グロブリンはＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号（ｐａｔｅｎｔ ｄｅｐｏｓｉｔ ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される。病原性免疫グロブリンは、配列番号：２に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号：８に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有しうる。好ましい態様において、虚血特異的抗原は内皮細胞および／または実質組織の表面に存在する。
【００１１】
好ましい態様において、補体経路は補体の古典経路であり、補体経路の成分はＣ１分子またはそのサブユニット（例えば、Ｃ１ｑ）でありうる。もう１つの態様において、対象は哺乳動物、例えばげっ歯動物（例えば、マウス）または霊長動物（例えば、ヒト）である。
【００１２】
好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は、例えば脳卒中として、自然に発生した発作の後に結果として生じる。再灌流障害または虚血障害は外科的処置の最中および／または後に生じることもある。障害の原因となる外科的処置の例には、血管形成術、ステント処置、アテローム切除術およびバイパス手術からなる群から選択される血管矯正術が含まれる。好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は心血管組織（例えば心臓）において生じる。
【００１３】
好ましくは、本発明の阻害物質は、以下の活性の１つまたは複数により、病原性免疫グロブリンと拮抗する：（ｉ）病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉ）病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉｉ）例えば免疫グロブリンの隔離および／もしくはその分解のターゲティングにより、病原性免疫グロブリンを中和する；または（ｉｖ）病原性免疫グロブリンの産生を阻害もしくは抑制する、例えば病原性抗体の合成、集合および／もしくは翻訳後修飾を阻止する。阻害物質は、タンパク質もしくはペプチド；低分子；抗体もしくはその断片、例えば抗イディオタイプ抗体；糖質；または糖タンパク質でありうる。別の好ましい態様において、阻害物質は本明細書に記載する改変抗体でありうる。好ましい態様において、阻害物質は１回、または数時間、数日、数週、数カ月もしくは数年という期間にわたる連続的な曝露として投与される。阻害物質は、障害の原因となる自然発生性の発作の前、最中および／または後のいずれに投与してもよい。また、阻害物質を外科的処置、例えば再灌流障害または虚血障害を招くことのある外科的処置の前、最中および／または後に投与することもできる。好ましい態様では、阻害物質を、他の治療薬、例えば抗凝固薬、補体阻害物質と組み合わせて投与する。
【００１４】
もう１つの局面において、本発明は、対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、病原性免疫グロブリン、例えば本明細書に記載の病原性ＩｇＭ、および／もしくは病原性免疫グロブリンを産生するＢ細胞（例えば、本明細書に記載のＢ−１細胞）を対象から除去し、またはそれを不活性化し、それによって対象に存在する病原性免疫グロブリンおよび／またはＢ細胞の量を減らすことを含む方法を特徴とする。
【００１５】
好ましい態様において、除去または不活性化の段階はエクスビボで行われる。１つの態様において、病原性免疫グロブリンまたはＢ細胞は血液灌流によって除去可能である。さらにもう１つの態様において、Ｂ細胞はＢ細胞特異的抗体（例えば、抗Ｂ−１抗体または抗ＣＤ５抗体または抗ＣＤ１１Ｇ／ＣＤ１８）を用いて除去しうる。病原性免疫グロブリン、例えばＩｇＭは、対象からの血液を固定化抗原（例えば、虚血特異的抗原）または固定化した抗イディオタイプ抗体と接触させることによって除去しうる。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンの除去または不活性化の段階は、抗イディオタイプ抗体を対象に投与することによって行われる。もう１つの態様において、Ｂ細胞の除去または不活性化の段階は、Ｂ細胞標的指向性部分（例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗原）を毒素、例えばリシンまたはジフテリア毒素と結合させたものを対象に投与することによって行われる。好ましい態様において、対象は哺乳動物、例えばげっ歯動物（例えば、マウス）または霊長動物（例えば、ヒト）である。好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は、例えば脳卒中として、自然に発生した発作の後に結果として生じる。除去の段階は、自然発生性の発作から数分以内、１〜５時間以内、５〜１０時間以内、１０〜２０時間以内、１〜５日以内に行うことが好ましい。好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は心血管組織（例えば心臓）において生じる。
【００１６】
もう１つの局面において、再灌流障害または虚血障害は、外科的処置の前、最中および／または後に病原性免疫グロブリンおよび／またはＢ細胞を対象から除去することによって予防および／または軽減される。例えば、除去の段階は、外科的処置の少なくとも１〜５時間前、５〜１０時間前、１０〜２０時間前、または１、２もしくは３日前に行うことができる。また、除去の段階を外科的処置の最中および後に適した期間にわたって継続することもできる。もう１つの局面において、本発明は、単離された病原性免疫グロブリン、例えば本明細書に記載の病原性ＩｇＭを特徴とする。好ましくは、病原性免疫グロブリンは以下の特性のうち１つまたは複数を有する：（ｉ）虚血特異的抗原との相互作用が可能である；（ｉｉ）補体を固定することができる；（ｉｉｉ）Ｂ細胞のサブポピュレーションによって産生される。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンはＢ細胞のサブポピュレーション、例えばＢ−１細胞によって産生される。もう１つの態様において、病原性免疫グロブリンは、ＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される。病原性免疫グロブリンは、配列番号：８に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有しうる。もう１つの態様において、病原性免疫グロブリンは、配列番号：２に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有しうる。もう１つの態様において、病原性免疫グロブリンは、内皮細胞の表面に存在する虚血特異的抗原と相互作用する（例えば、結合する）。
【００１７】
もう１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリン（例えば本明細書に記載の病原性ＩｇＭ）を特徴とする。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンは虚血特異的抗原と相互作用する（例えば、結合する）。病原性免疫グロブリンは、補体を活性化する能力の低いことを特徴としうる。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンは、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を有する。例えば、補体の結合および／または活性化に関与するアミノ酸残基の１つまたは複数が変異している。好ましい態様において、ＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される病原性免疫グロブリンである病原性免疫グロブリン。他の態様において、病原性抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域またはその断片を有する。他の態様において、病原性抗体は、配列番号：１０の少なくともＣＤＲ１領域もしくはその抗原結合部分；および／または配列番号：１２の少なくとも１つのＣＤＲ２領域もしくはその抗原結合部分を含む。好ましくは、病原性抗体は少なくとも、配列番号：１０のＣＤＲｌ領域および配列番号：１２のＣＤＲ２領域、またはそれらの抗原結合部分を含む。もう１つの態様において、病原性抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはその断片を含む。他の態様において、病原性抗体は、配列番号：４の少なくともＣＤＲ１領域もしくはその抗原結合部分、および／または配列番号：６の少なくとも１つのＣＤＲ２領域もしくはその抗原結合部分を含む。好ましくは、病原性抗体は少なくとも、配列番号：４のＣＤＲ１領域および配列番号：６のＣＤＲ２領域、またはそれらの抗原結合部分を含む。
【００１８】
もう１つの態様において、病原性抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：８に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および配列番号：２に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはその抗原結合断片を含む。病原性抗体は、虚血特異的抗原に対する結合親和性が、ＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される病原性抗体の結合親和性と同程度である、例えばそれよりも高い、低いまたは等しい、ヒト抗体でありうる。もう１つの態様において、病原性抗体は非ヒト抗体、例えばウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタまたはウサギのものでありうる。好ましくは、非ヒト抗体はマウス抗体である。病原性抗体が組換え抗体であってもよい。好ましい態様において、病原性抗体はヒト化抗体である。もう１つの態様において、単離された病原性免疫グロブリンは、ＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される免疫グロブリンと同じ抗原特異性を有する。
【００１９】
もう１つの局面において、本発明は、虚血特異的抗原を単離するための方法であって、病原性免疫グロブリン（例えば本明細書に記載の病原性ＩｇＭ）を提供すること、虚血特異的抗原を含む試料、例えば生化学的単離物（例えば、内皮細胞単離物）またはタンパク質の集成物（例えば、発現ライブラリー）を病原性免疫グロブリンと、病原性免疫グロブリンと試料との特異的結合が可能な条件下で接触させること、対照と比較して病原性抗体と試料との結合レベルの変化を検出することであって、試料の存在下における病原性免疫グロブリンの結合レベルに対照で検出されたものと比べて変化があることによって特異的結合が示されるような検出、および虚血特異的抗原を試料から単離すること、例えば精製することを含む方法を特徴とする。好ましい態様において、試料は虚血特異的抗原を豊富に含み、例えばこれは再灌流障害または虚血障害のある対象（例えば、ヒト患者）から得られるものである。他の態様において、試料は生化学的単離物、例えば内皮組織、または発現ライブラリー、例えば内皮組織由来のライブラリーである。好ましい態様では、接触の段階はインビトロで行われる。
【００２０】
もう１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭと、虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質を１つまたは複数の（例えば、多数の）被験化合物から同定するための方法であって、病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原（例えば、再灌流障害または虚血障害のある対象（例えば、ヒト患者）から採取した内皮組織または可溶化物）を、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下で含む反応混合物を提供すること、病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原を１つまたは複数の被験化合物（例えば、コンビナトリアルライブラリーの構成要素）と接触させること、ならびに被験化合物の非存在下において検出されたものと比べて、所定の被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合の変化を検出することを含み、被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合レベルに被験化合物の非存在下において検出されたものと比べて変化（例えば、低下）があることによって、被験化合物が病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質であることが示されるような方法を特徴とする。好ましい態様において、接触の段階はインビボで行われる。本方法はさらに、病原性免疫グロブリンを１つまたは複数の被験化合物によって前処理することを含みうる。続いて、前処理した病原性免疫グロブリンを、病原性免疫グロブリンが欠損したマウスに注入することができる。
【００２１】
もう１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭと、補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質を１つまたは複数の（例えば、多数の）被験化合物から同定するための方法であって、病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下で含む反応混合物を提供すること、病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を１つまたは複数の被験化合物（例えば、コンビナトリアルライブラリーの構成要素）と接触させること、ならびに被験化合物の非存在下において検出されたものと比べて、所定の被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合の変化を検出することを含み、被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合レベルに被験化合物の非存在下において検出されたものと比べて変化（例えば、低下）があることによって、被験化合物が病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質であることが示されるような方法を特徴とする。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンは本明細書に記載の病原性ＩｇＭであり、虚血特異的抗原は再灌流障害または虚血障害のある対象（例えば、ヒト患者）から採取した内皮組織または可溶化物から得られる。もう１つの態様において、本方法はインビトロで行われる。好ましい態様では、病原性免疫グロブリンまたは虚血特異的抗原のいずれか（または両方）を、検出可能なシグナル、例えば、蛍光団、比色定量用酵素、放射性同位体、発光性化合物などによって標識する。本方法はさらに、少なくとも１つの段階、例えば接触の段階を、ライブラリーの第２の構成要素または次の１つもしくは複数の構成要素を用いて反復することを含む。好ましい態様では、多数の被験化合物、例えば、ライブラリーの複数の構成要素の試験を行う。多数の被験化合物、例えばライブラリーの構成要素は、少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７種または１０８種の化合物を含みうる。好ましい態様において、多数の被験化合物、例えばライブラリーの構成要素は、共通の構造的または機能的な特徴を有する。被験化合物はペプチドまたは有機低分子でありうる。もう１つの態様において、補体経路は補体の古典経路である。好ましい態様において、補体経路の成分はＣ１分子またはそのサブユニット（例えば、Ｃ１ｑ）である。
【００２２】
もう１つの局面において、本発明は、病原性ＩｇＭ抗体またはその断片をコードする単離された核酸を特徴とする。好ましい態様において、単離された核酸は配列番号：８の軽鎖可変領域をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：１０のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域またはその抗原結合部分をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：１２のＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域またはその抗原結合部分をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：１０のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域またはその抗原結合部分、および配列番号：１２のＣＤＲ２またはその抗原結合部分をコードする。好ましい態様において、本核酸は、マウス由来、ヒト由来またはマウスおよびヒトのアミノ酸配列の組み合わせである軽鎖可変領域をコードする。例えば、本核酸は、配列番号：１０のＣＤＲ１および／または配列番号：１２のＣＤＲ２、ならびにヒトフレームワーク配列を含む軽鎖可変領域をコードしうる。
【００２３】
さらに他の好ましい態様において、単離された核酸は配列番号：２の重鎖可変領域をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：４のＣＤＲ１を含む重鎖可変領域またはその抗原結合部分をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：６のＣＤＲ２を含む重鎖可変領域またはその抗原結合部分をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：４のＣＤＲ１を含む重鎖可変領域またはその抗原結合部分、および配列番号：６のＣＤＲ２またはその抗原結合部分をコードする。好ましい態様において、本核酸は、マウス由来、ヒト由来またはマウスおよびヒトのアミノ酸配列の組み合わせである軽鎖可変領域をコードする。例えば、本核酸は、配列番号：４のＣＤＲ１および／または配列番号：６のＣＤＲ２、ならびにヒトフレームワーク配列を含む重鎖可変領域をコードしうる。さらにもう１つの態様において、単離された核酸は、配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の両方を含む。
【００２４】
もう１つの局面において、本発明は、単離された核酸分子およびその断片を特徴とする。好ましい態様において、単離された核酸分子は配列番号：７の軽鎖ヌクレオチド配列を含む。もう１つの態様において、核酸分子は、配列番号：９の軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列またはその一部分を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号：１１の軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列またはその部分を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は配列番号：９の軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列またはその一部分、および配列番号：１１の軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列またはその部分を含む。軽鎖配列、例えば配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１またはそれらの組み合わせを含む本発明の核酸分子には、それらに対する配列同一性が７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であるヌクレオチドが含まれる。さらに、軽鎖配列、例えば配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１またはそれらの組み合わせを含む本発明の核酸分子には、ストリンジェントな条件下（例えば低い、中程度、高いまたは極めて高いストリンジェンシーの条件下）でそれらとハイブリダイズするヌクレオチドが含まれる。
【００２５】
もう１つの態様において、本発明は、軽鎖ポリペプチド、例えば配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸分子との配列同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％である核酸分子を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、病原性抗体の軽鎖可変領域またはその部分、例えば配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２の軽鎖可変領域をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸分子を特徴とする。
【００２６】
さらに他の好ましい態様において、核酸分子は配列番号：１の重鎖ヌクレオチド配列を含む。もう１つの態様において、核酸分子は、配列番号：３の重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列またはその一部分を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号：５の重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列またはその一部分を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号：３の重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列またはその一部分、および配列番号：５の重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列またはその一部分を含む。重鎖配列、例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５またはそれらの組み合わせを含む本発明の核酸分子には、それらとの配列同一性が７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であるヌクレオチドも含まれる。さらに、軽鎖配列、例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５またはそれらの組み合わせを含む本発明の核酸分子には、ストリンジェントな条件下、例えば低い、中程度、高いまたは極めて高いストリンジェンシーの条件下でそれらとハイブリダイズするヌクレオチドが含まれる。
【００２７】
もう１つの態様において、本発明は、重鎖ポリペプチド、例えば配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６の重鎖ポリペプチドをコードする核酸分子との配列同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％である核酸分子を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、病原性抗体の重鎖可変領域またはその部分、例えば、配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６の重鎖可変領域をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を特徴とする。
【００２８】
もう１つの局面において、本発明は単離されたポリペプチドおよびその断片を特徴とする。 好ましい態様において、単離されたポリペプチドは、例えば、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２またはそれらの断片もしくは組み合わせ；または配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６またはそれらの断片もしくは組み合わせであるアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドには、配列番号：８、配列番号：１０もしくは配列番号：１２；または配列番号：２、配列番号：４もしくは配列番号：６との差異が少なくとも２０、１０、５、４、３、２または１アミノ酸であるがそれを上回ることはないポリペプチドが含まれる。好ましいポリペプチドは、生物活性、例えば虚血特異的抗原との結合能および／または補体との結合能を保っているポリペプチドである。もう１つの態様において、ポリペプチドには、軽鎖可変領域またはその部分、例えば配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２の軽鎖可変領域ポリペプチドとの配列同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であるポリペプチドが含まれる。もう１つの態様において、ポリペプチドには、重鎖可変領域またはその部分、例えば配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６の重鎖可変領域ポリペプチドとの配列同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であるポリペプチドが含まれる。もう１つの態様において、本発明は、配列番号：８および配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ＩＲＥＳ配列をさらに含むポリペプチドを特徴とする。
【００２９】
もう１つの局面において、本発明は、配列番号：８、配列番号：１０もしくは配列番号：１２またはそれらの断片もしくは組み合わせ；または配列番号：２、配列番号：４もしくは配列番号：６またはそれらの断片もしくは組み合わせをコードする本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。好ましい態様において、発現ベクターは、配列番号：８のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体軽鎖またはその一部分をコードする核酸分子；および配列番号：２のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体重鎖またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含む。もう１つの局面において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましい態様において、宿主細胞は少なくとも１つもしくは２つまたはそれ以上の発現ベクター、すなわち軽鎖、例えば配列番号：８またはその一部分をコードする１つの発現ベクターおよび重鎖、例えば配列番号：２またはその一部分をコードする１つの発現ベクターを含みうる。もう１つの態様において、宿主細胞は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方を発現しうる発現ベクターを含みうる。本明細書で用いる「ベクター」という用語は、それと結合した別の核酸を輸送しうる核酸分子のことを指し、これにはプラスミドベクター、コスミドベクターまたはウイルスベクターが含まれうる。ベクターは自律複製を行うことができるか、または宿主ＤＮＡの中に組み込まれうる。ウイルスベクターには例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれる。
【００３０】
本明細書に記載の方法を用いて同定される、病原性免疫グロブリン／虚血抗原および／または病原性免疫グロブリン／補体成分の相互作用に対する阻害物質も本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は一部には、虚血特異的抗原を認識する病原性免疫グロブリン（Ｉｇ）、特に病原性ＩｇＭの同定に基づく。これらの病原性ＩｇＭと虚血特異的抗原との結合は特に補体経路の活性化を誘発し、これは最終的には再灌流障害または虚血障害を引き起こすと考えられている。また本出願者らは、病原性ＩｇＭが、本明細書で「Ｂ−１細胞」と称するＢ細胞のサブポピュレーションによって産生されることも見いだした。したがって、本発明は、対象における、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭによって引き起こされる再灌流後の組織障害を治療または予防するために有用な方法および組成物を提供する。
【００３２】
本発明をさらに説明する前に、明細書、実施例および添付する請求の範囲において用いる特定の用語を、便宜を図るためにここにまとめる。
【００３３】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は本明細書で互換的に用いられる。
【００３４】
本明細書で用いる「免疫グロブリン」（または略語形の「Ｉｇ」）および「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって互いに連結した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質のことを指す。各重鎖は、１つの重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および１つの重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＲ３という３つのドメインから構成されるか、またはＩｇＭの場合には４つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から構成される。各軽鎖は１つの軽鎖可変領域および１つの軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域はＣＬという１つの領域から構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域が、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域の間に散在するものとして細分することができる。各々のＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順序に並んだ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域が、免疫グロブリンと、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子との結合を媒介することもある。
【００３５】
主な重鎖の種類にはα、β、ε、γおよびμと呼ばれる５つのものがあり、ｇ鎖はさらにγ１、γ２、γ３およびγ４に細分され、α鎖はα１およびα２に細分される。２つの代替的な軽鎖の種類はκおよびλと呼ばれる。重鎖の存在により、免疫グロブリンの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが生じる。ＩｇＧはさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブクラスに細分することができ、ＩｇＡはＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラスに細分することができる。
【００３６】
本明細書で用いる「免疫グロブリンＭ」または「ＩｇＭ」という用語は、５つのＩｇＭ単量体がＪ鎖によって連結した五量体のことを指す。単量体ＩｇＭ分子は、上記の免疫グロブリン分子と同じ基本構造を有する。ＩｇＭは抗体産生反応において合成される最初の免疫グロブリンである。これは五量体であるために多くの機能ドメインを有しており、このため、補体の強力な活性化物質である。
【００３７】
「病原性免疫グロブリン」という用語は、再灌流後の組織障害を媒介する上記の免疫グロブリン分子のことを指す。１つの態様において、病原性免疫グロブリンは、例えば内皮細胞表面または実質組織上に存在する抗原（例えば、虚血特異的抗原）との結合により、内皮表面または実質組織に局在してもよい。内皮表面または実質組織表面に局在すると、病原性免疫グロブリンは免疫細胞（例えば、エフェクター細胞）または古典的補体系の成分、例えばＣ１ｑの結合を媒介し、これによって組織障害を誘発する可能性がある。抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡ．ｓｕｂ．ｓｅｃ、ＩｇＤ、またはＩｇＥを含む、種々のアイソタイプのものでありうる。病原性免疫グロブリンは、補体の活性化物質である抗体アイソタイプであることが好ましい。好ましくは、病原性免疫グロブリンはＩｇＭである。病原性免疫グロブリンは好ましくは完全長である（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３）抗体）。
【００３８】
本明細書で用いる、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」または「断片」）という用語は、抗原（例えば、標的抗原、例えば、虚血抗原）と特異的に結合する能力を保っている、抗体の１つまたは複数の断片のことを指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例には、（ｉ） ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）２つのＦａｂ断片がヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合したものを含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）１つのＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるものの、それらを組換え法を用いて、ＶＬ領域およびＶＨ領域の対が一価分子を形成した一本鎖タンパク質として作製することを可能にする合成リンカーによって連結することもできる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３を参照）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲に含まれるものとする。これらの抗体断片は当業者に知られた従来の技法を用いて得られ、断片の有用性に関するスクリーニングは完全な抗体と同じ様式で行われる。
【００３９】
本明細書で用いる「再灌流」とは、例えば虚血の場合のように、血流の狭窄または閉塞の後に血管内の血流が再開することを指す。
【００４０】
「虚血再灌流」という用語は、虚血組織の再灌流後に起こる急性炎症反応のことを指す。再灌流は、脳卒中などの自然発生性の発作の後、または血管内の血流を意図的に遮断する外科的処置の最中に生じうる。血管の狭窄または閉塞は、例えば、血管内の血流を遮断する血塊の結果として誘発されることがある。このような状況では内皮の完全性が損なわれ、その結果として凝固カスケードが始まり、新たな塊が生じて、最初に塊が閉塞した部分の下流のより細い毛細血管に詰まる可能性がある。組織障害が起こるのはこの血流再開時である。
【００４１】
「免疫グロブリンを介した再灌流障害」とは、免疫グロブリン、例えば病原性免疫グロブリンによって直接的または間接的に媒介される、内皮の完全性の破壊のことを指す。理論に拘束されるものではないが、虚血時には新たな抗原（例えば、虚血特異的抗原）が内皮細胞表面に発現または露出されると考えられている。これらの新たな抗原はその後、障害部位の付近に蓄積した病原性免疫グロブリンによって認識される。この局在性の免疫グロブリンは、例えばエフェクター細胞機能または補体経路の活性化により、内皮組織障害を誘発しうる。
【００４２】
本明細書で用いる「虚血」という用語は、臓器または組織への血流の一時的または永続的な欠乏のことを指す。心血管組織では、虚血によって少なくとも２つの心疾患―狭心症および急性心筋梗塞（心発作）が生じる可能性がある。心筋にかかわる虚血は、アテローム性動脈硬化または攣縮などの冠動脈疾患の結果として生じることが典型的である。「虚血障害」という用語は、組織または臓器への血流の一時的または永続的な欠乏によって生じる、例えば組織または臓器における、内皮の完全性の破壊のことを指す。
【００４３】
本明細書で用いる「虚血特異的抗原」という用語は、内皮細胞の表面に存在する抗原のことを指す。虚血特異的抗原は、発作、例えば虚血発作に対する反応として発現または露出されることが好ましい。
【００４４】
本明細書で用いる「Ｂ−１細胞」とは、病原性免疫グロブリンを産生するＢ細胞のサブポピュレーションのことを指す。一般にＢ−１細胞はＩｇＤおよびＣＤ２３を低レベルで発現し、これらの細胞のかなりの割合は細胞表面タンパク質ＣＤ５を発現する（Ｈａｒｄｙら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １３７、９１；Ｋａｎｔｏｒら（１９９３）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１、５０１〜５３８）。それらは一般に腹膜組織および腸間膜組織に存在し、少なくともマウスでは循環しないように思われる（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ９３：８１〜１０２；Ｍａｒｔｉｎら、Ｃｕｒ Ｏｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：１９５〜２０１）。通常のＢ細胞とは異なり、それらは体細胞超変異および親和性成熟を起こさない。それらは胎児および新生児の発生期間中に生じるようにと思われ、成体骨髄を移植しても容易には再生しない。これらの細胞はさらに、末梢リンパ節および脾臓における頻度が低いこと、ならびに腹腔に主として局在することによっても識別できる。
【００４５】
「補体」という用語は、２０種を上回るタンパク質（調節因子を含む）から構成されるタンパク質カスケードのことを指す。血液凝固系と同様に、この系の活性化により、プロ酵素がタンパク質分解によって逐次的に活性化されて、細胞表面受容体のリガンド、強力な生理活性ペプチド、および細胞膜に介入して細胞死を招く最終段階複合体が生成される一連のイベントが開始される。その中心的な成分は第三成分すなわちＣ３である。これは３つの異なる経路、すなわち古典経路、レクチン経路または第二経路によって活性化されうる（Ｒｅｉｄら（１９８１）Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． １５：３０７〜３２６；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：３２１〜３４７）。
【００４６】
ある態様において、病原性免疫グロブリンは古典補体経路を介して作用しうる。古典経路は、免疫複合体を形成する抗原と抗体との相互作用によって活性化される。抗体は、自らの抗原と反応した後にのみ、補体との結合または「固定」が可能である。この複合体の形成によって抗体分子のコンフォメーション変化が誘発され、補体第一成分Ｃ１の結合部位が露出される。Ｃ１は、Ｃ１ｑと命名された３種のポリペプチドの鎖がそれぞれ６本ずつ、ならびに各２本ずつのＣ１ｓおよびＣ１ｒから構成される多量体化合物である。６本のＣ１ｑ鎖はそれ自体で「束」状に配列し、４本のＣ１ｒおよびＣ１ｓ分子はカルシウム依存的な相互作用によって結合する。抗体がＣ１ｑの２つまたはそれ以上の頭部に結合すると、Ｃ１ｒが切断されて活性型Ｃ１ｒ分子が生じ、それがＣ１ｓを切断する。Ｃ１ｓは次の補体成分Ｃ４を、反応プロセスを継続させるＣ４ｂ、およびＣ４ａに切断することによって活性化プロセスを進展させる。Ｃ４のＣ４ｂへの切断によって内部チオエステル結合が露出され、これは水分子の結合によって速やかに不活性化されるが、それが起こらない場合にはこれは細胞表面タンパク質または炭水化物と共有結合を形成することができる。これが起こるとＣ４ｂは比較的安定となり、マグネシウム依存的な反応によってＣ２と結合する。続いてＣ２はＣ１ｓによって切断され、古典経路Ｃ３転換酵素として知られる複合体Ｃ４ｂ２ａを形成する。Ｃ３はＣ４と類似した分子であり、内部チオエステル結合を有する。Ｃ３切断によって２つの断片が生じる。このうち小さい方であるＣ３ａには強力な生物特性がある。大きい方のＣ３ｂには、この分子とＣ４ｂ２ａとの結合を可能とする不安定な結合部位がある。Ｃ３ｂのＣ４ｂ２ａとの結合は、古典経路の最後の酵素であり、膜侵襲経路の成分であるＣ５を切断する古典経路Ｃ５転換酵素として知られるＣ４ｂ２ａ３ｂの生成をもたらす。
【００４７】
もう１つの態様において、病原性免疫グロブリンは補体第二経路を介して作用しうる。第二経路では、Ｃ３がＣ３ｂ、Ｃ３ｂＢおよびＣ３ｂＢｂを生じ、Ｃ３ｂＢｂが続いてＣ３を切断する。このプロセスは、活性酵素を細菌細胞壁上に安定化させた場合、またはより多くのＣ３ｂが古典経路によって生成された場合に加速される。これにより、第二経路Ｃ５転換酵素Ｃ３ｂＢｂ３ｂが生成される。
【００４８】
本明細書で用いる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。好ましいヒト動物には、虚血再灌流障害のあるヒト患者が含まれる。本発明の「非ヒト動物」または「非ヒト」には、すべての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、げっ歯動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。
【００４９】
本明細書で用いる「阻害物質」とは、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用を（完全または部分的に）抑制もしくは遮断する；または病原性免疫グロブリンと補体経路の構成要素（例えばＣ１ｑ）との相互作用を抑制または遮断する、作用物質のことを指す。「相互作用」という用語は、２つまたはそれ以上の分子の物理的結びつき、例えば結合のことを指す。相互作用は直接的でも間接的でもよい。好ましくは、阻害物質は病原性免疫グロブリンの以下の活性のうち１つまたは複数と拮抗する：（ｉ）病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉ）病原性免疫グロブリンと補体経路の成分、例えばＣ１ｑとの相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉｉ）例えば免疫グロブリンの隔離および／もしくはその分解のターゲティングにより、病原性免疫グロブリンを中和する；または（ｉｖ）病原性免疫グロブリンの産生を阻害もしくは抑制する、例えば病原性抗体の合成、集合および／もしくは翻訳後修飾を阻止する。阻害物質は、タンパク質（例えば、抗体、例えば抗イディオタイプ抗体またはその断片など）、ペプチドまたは有機低分子でありうる。「阻害物質」および「作用物質」という用語は本明細書で互換的に用いられる。
【００５０】
本明細書で用いる、阻害物質の「有効量」とは、患者などの対象に対して単回投与または多回投与を行った場合に再灌流障害または虚血障害の軽減または除去に有効な、作用物質の量のことを指す。再灌流障害のこのような軽減または除去は、患者などの対象の生存期間がこのような治療を行わない場合に予想されるよりも延長すること、または対象の予後がこのような治療を行わない場合よりも改善されることに反映されうる。阻害物質を再灌流障害または虚血障害の治療（例えば、既存の障害の軽減または除去）のために用いることもでき、または予防（例えば、発現または再発の発生を遅らせること）のために用いることもできる。当業者は、疾患または障害の重症度、過去の治療、全般的健康状態および／または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患を非制限的に含む特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要な投与量および時期に影響を及ぼすことを認識していると考えられる。
【００５１】
本明細書で用いる「コンセンサス配列」という用語は、関連配列のファミリーにおいて最も高い頻度でみられるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列のことを指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、「遺伝子からクローンまで（Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ）」（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７を参照）。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列内の各位置は、そのファミリーでその位置に最も高い頻度でみられるアミノ酸によって占められる。２種のアミノ酸が同じ頻度でみられる場合には、そのいずれをコンセンサス配列に含めることもできる。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域のことを指す。
【００５２】
本明細書で用いる「低ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件または極めて高いストリンジェンシーの条件の下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件のことを指す。ハイブリダイゼーション反応の実施に関する手引きは、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６に記載があり、これは参照として組み入れられる。水系および非水系による方法がこの参考文献には記載されており、そのいずれを用いることもできる。本明細書で言及する具体的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：１）低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、約４５℃の６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続いて、少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー条件の場合は洗浄時の温度を５５℃まで高めることができる）の０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回の洗浄；２）中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、約４５℃の６Ｘ ＳＳＣに続いて、６０℃の０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回または複数回の洗浄；３）高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、約４５℃の６Ｘ ＳＳＣに続いて、６５℃の０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回または複数回の洗浄；および好ましくは、４）極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、６５℃の０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳに続いて、６５℃の０．２Ｘ ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で１回または複数回の洗浄。極めて高いストリンジェンシーの条件（４）が好ましい条件であり、別に特定しない場合に用いるべきものである。
【００５３】
配列間の相同性または配列同一性（これらの用語は本明細書において互換的に用いられる）の算出は、以下の通りに行われる。
【００５４】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の一致率を決定するには、最適な比較がなされるように配列を整列化する（例えば、最適な整列化が得られるように、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを挿入することができ、比較のために非相同配列を無視することができる）。好ましい態様において、比較のために整列化する参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％であり、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。続いて、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置を、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが占めている場合には、２つの分子はその位置で同一である（本明細書で用いる場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同義である）。
【００５５】
２つの配列間の一致率は、２つの配列の最適な整列化を行うために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた上で、２つの配列が共有する同一な位置の数の関数である。
【００５６】
配列の比較および２つの配列間の一致率の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。好ましい態様では、２つのアミノ酸配列の間の一致率を、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれているニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（（１９７０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４〜４５３）のアルゴリズムを用い、ブロッサム６２行列（Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２ ｍａｔｒｉｘ）またはＰＡＭ２５０行列、およびギャップ加重（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）として１６、１４、１２、１０、８、６または４、長さ加重（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）として１、２、３、４、５または６を用いて決定する。さらに別の好ましい態様では、２つのヌクレオチド配列の間の一致率を、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、およびギャップ加重（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）として４０、５０、６０、７０または８０、長さ加重（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）として１、２、３、４、５または６を用いて決定する。特に好ましいパラメーターのセット（別に特定しない場合に用いるべきもの）としては、ブロッサム６２スコア行列を、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４およびフレームシフトギャップペナルティ５で用いる。
【００５７】
２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の一致率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているマイヤーズ（Ｅ． Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７）を用い、ＰＡＭ１２０加重残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて決定することができる。
【００５８】
病原性免疫グロブリンの阻害物質を同定するための方法
１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用または病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質を、１つまたは複数の（例えば、多数の）被験化合物から同定するための方法を提供する。阻害物質は、タンパク質（例えば、抗体またはその断片）；ペプチド；糖質；糖タンパク質；または有機低分子でありうる。
【００５９】
被験化合物のライブラリー
阻害物質は有機低分子、例えばコンビナトリアルライブラリーの構成要素でありうる。
【００６０】
１つの態様において、本発明は阻害物質のライブラリーを提供する。コンビナトリアルライブラリーの合成は当技術分野で周知であり、総説もなされている（例えば、Ｅ．Ｍ． Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９４）３７：１３８５〜１４０１；ＤｅＷｉｔｔ， Ｓ． Ｈ．；Ｃｚａｒｎｉｋ， Ａ． Ｗ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．（１９９６）２９：１１４；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｒ． Ｗ．；Ｃｏｍｂｓ， Ａ． Ｐ．；Ｔｅｍｐｅｓｔ， Ｐ． Ａ．；Ｂｒｏｗｎ， Ｓ． Ｄ．；Ｋｅａｔｉｎｇ， Ｔ． Ａ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．（１９９６）２９：１２３；Ｅｌｌｍａｎ， Ｊ． Ａ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．（１９９６）２９：１３２；Ｇｏｒｄｏｎ， Ｅ． Ｍ．；Ｇａｌｌｏｐ， Ｍ． Ａ．；Ｐａｔｅｌ， Ｄ． Ｖ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．（１９９６）２９、１４４；Ｌｏｗｅ， Ｇ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．（１９９５）３０９、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９５）１４：８３；Ｃｈｅｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：２６６１；米国特許第５，３５９，１１５号、第５，３６２，８９９号および第５，２８８，５１４号；ＰＣＴ公報・国際公開公報第９２／１００９２号、国際公開公報第９３／０９６６８号、国際公開公報第９１／０７０８７号、国際公開公報第９３／２０２４２号、国際公開公報第９４／０８０５１号を参照されたい）。
【００６１】
本発明の化合物のライブラリーは、さまざまな方法を用いて調製することができ、そのいくつかは当技術分野で知られている。例えば、「スプリットプール（ｓｐｌｉｔ−ｐｏｏｌ）」法を以下のようにして実施することができる：官能基を付与したポリマー性支持体のビーズを多数の反応容器内に入れる；固相ペプチド合成に適したさまざまなポリマー性支持体が知られており、そのいくつかは市販されている（例えば、Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｋｙ「ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）を参照されたい）。ビーズのアリコートのそれぞれに対して種々の活性化アミノ酸溶液を添加し、反応を進行させて、多数の固定化したアミノ酸を各反応容器に１つずつ生成させる。続いて、誘導体化したビーズのアリコートを洗浄し、「プール」して（すなわち、まとめて）、ビーズのプールを再び分割し、各アリコートを別々の反応容器に入れる。続いて、ビーズの各アリコートに別の活性化アミノ酸を添加する。この合成サイクルを望ましいペプチド長が得られるまで繰り返す。各合成サイクルに添加するアミノ酸残基は無作為に選択することができる；または、抗体と相互作用しうる既知のペプチド、例えば抗イディオタイプ抗体の抗原結合部位との構造的類似性または相同性があることが知られた阻害物質を得るために、「偏りのある（ｂｉａｓｅｄ）」ライブラリー、例えば阻害物質の特定の部分が作為的に選択されたライブラリーが得られるようにアミノ酸を選択することもできる。非常に広範囲にわたるペプチド性、ペプチド模倣性または非ペプチド性の化合物が、この方法によって容易に生成されることは理解されるであろう。
【００６２】
この「スプリットスプール」法により、本発明の被験化合物のライブラリーの調製に用いうる、ペプチド、例えば阻害物質のライブラリーが得られる。もう１つの例示的な合成においては、ホッブス・デウィット（Ｈｏｂｂｓ ＤｅＷｉｔｔ）らの方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９０：６９０９（１９９３））によって「ダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）ライブラリー」を作製する。ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）の「ティーバッグ（ｔｅａｂａｇ）」法（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４〜８６（１９９１））を含む他の合成法を、本発明による化合物のライブラリーを合成するために用いることもできる。
【００６３】
ライブラリーのいずれかの構成要素が望ましい活性を有するか否かを判定するため、および仮に有する場合にはそのような活性種を同定するために、化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングの方法は記載されている（例えば、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、前記を参照）。受容体のリガンドを単離するのに適した受容体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって可溶性化合物のライブラリーをスクリーニングした後に、単離したリガンドを従来の技法（例えば、質量分析、ＮＭＲなど）によって同定することができる。固定化した化合物は、化合物を可溶性受容体と接触させることによってスクリーニングが可能である；可溶性受容体は、その検出によってリガンド結合が示される標識（例えば、蛍光団、比色定量用酵素、放射性同位体、発光性化合物など）と結合させることが好ましい。または、固定化した化合物を選択的に遊離させ、膜を通して拡散させて、受容体と相互作用させることもできる。本発明のライブラリーのスクリーニングに有用なアッセイの例は以下に述べる。
【００６４】
１つの態様では、本発明の化合物が病原性免疫グロブリンと相互作用する能力に関するスクリーニングを、例えば、標準的な９６穴マイクロタイタープレートなどのマルチウェルプレートの１つのウェル内で、被験化合物を免疫グロブリンおよび可溶化物、例えば内皮細胞可溶化物とインキュベートすることにより、各化合物が免疫グロブリンと直接結合する活性または免疫グロブリンと虚血抗原との相互作用を阻害する活性をアッセイすることによって行うことができる。この態様では、個々の化合物のそれぞれの活性を決定することができる。被験化合物を加えていない１つまたは複数のウェルを対照として用いうる。インキュベーションの後に各ウェルをアッセイすることにより、各被験化合物の活性を決定することができる。このようにして、多数の被験化合物の活性を平行して決定することが可能である。
【００６５】
タンパク質またはペプチドの阻害物質
タンパク質またはペプチドの阻害物質は、例えば、上記のコンビナトリアルシステムを用いて同定可能である。または、病原性免疫グロブリン、標的抗原または補体経路の成分のいずれかの断片またはペプチドを用いて、これらのタンパク質の間の相互作用を遮断することもできる。
【００６６】
「非必須」アミノ酸置換を含む、病原性免疫グロブリン、標的抗原または補体経路の成分のいずれかの断片またはペプチドの変種も本発明の範囲に含まれる。非必須アミノ酸置換とは、生物活性を消失させずに、または好ましくは実質的に変化させずに野生型配列を変更することであり、一方、「必須」アミノ酸残基はこのような変化を引き起こす。
【００６７】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されたもののことである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。このため、病原性免疫グロブリン内部の予想される非必須アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーに属する別のアミノ酸残基によって選好的に置換することができる。または、もう１つの態様では、飽和変異誘発法などにより、病原性免疫グロブリンのコード配列の全体または一部に沿って変異を無作為に導入し、その結果得られた変異体を生物活性に関してスクリーニングすることができる。
【００６８】
もう１つの局面において、本発明は、例えばアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する、改変された病原性免疫グロブリンも特徴とする。改変された病原性免疫グロブリンは、補体活性化に対するアンタゴニストとして機能することが好ましい。病原性免疫グロブリンの変種は、変異誘発、例えば離散的点変異、配列の挿入もしくは除去または病原性免疫グロブリンの切断によって作製することができる。病原性免疫グロブリンのアゴニストは、天然型のタンパク質と実質的に同じ生物活性、またはそのサブセットを保持しうる。病原性免疫グロブリンのアンタゴニストは、例えば、虚血特異的抗原との結合は可能であるが補体経路を活性化することはできないことにより、天然型の病原性免疫グロブリンの１つまたは複数の活性を阻害しうる。このように、機能が限定された変種を投与することにより、特定の生物学的作用を誘発させることができる。
【００６９】
１つの態様では、Ｃ１ｑと結合する病原性免疫グロブリン（例えば、病原性ＩｇＭ）内部の部位を変異させ、Ｃ１ｑと結合できないようにすることができる。例えば、Ｃ１ｑの結合部位を含むことが知られているＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＩｇＭのＣＨ４ドメインを変異させることが可能である（国際公開公報第９４／２９３５１号を参照）。例えば、Ｃ１ｑ結合およびその後の補体活性化を媒介すると思われるＩｇＧのＣＨ２ドメインのカルボキシル末端側の半分（残基２３１〜２３９、好ましくは２３４〜２３９の内部）を変異させることができる。別の例として、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）らは、ＩｇＭ定常領域ドメイン内の単一ヌクレオチドの変化により、抗体が補体依存性細胞溶解を惹起する能力を失うことを示した。この単一ヌクレオチドの変化は、第３の定常ドメイン内のアミノ酸位置４３６に正常なプロリン残基の代わりにセリン残基を生じさせる（Ｗｒｉｇｈｔら１９８８、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１１２２１）。補体結合性または活性を変化させる目的で抗体に加えることができるアミノ酸置換は当技術分野で周知である（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、１９８８、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１１２２１；Ｓｈｕｌｍａｎら（１９８６）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７６７８〜７６８２；Ａｒｙａら（１９９４）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５３：１２０６〜１２１２；Ｐｏｏｎら（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：８５７１〜８５７７を参照されたい。これらのすべての内容は参照として本明細書に組み入れられる）。したがって、１つの態様において、本発明の抗体は補体結合性または活性を変化させる変異を有する。アミノ酸が付加、除去または置換された抗体を、本明細書では改変された抗体（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）または改変抗体（ａｌｔｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と呼ぶ。当業者には理解されると思われるが、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列にこのような変化を生じさせるために用いられる方法は、求める結果に応じてさまざまであると考えられる。
【００７０】
病原性免疫グロブリンの変種は、病原性免疫グロブリンの変異体、例えば切断変異体のコンビナトリアルライブラリーを、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることによって同定可能である。
【００７１】
病原性免疫グロブリンコード配列のＮ末端、Ｃ末端または内部断片などの断片のライブラリーは、本タンパク質の変種のスクリーニングおよびその後の選択を目的として断片の多様化した集団を作製するために用いることができる。システイン残基が付加もしくは除去された変種、またはグリコシル化された残基が付加もしくは除去された変種が特に好ましい。
【００７２】
点変異または切断によって作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングのため、および選択した特性を有する遺伝子産物に関するＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための方法。機能的変異体の頻度を高める技法である反復帰納的変異誘発法（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、変種を同定するためのスクリーニングアッセイ法と併用することができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７８１１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７〜３３１）。
【００７３】
細胞系アッセイを多様化ライブラリーの分析に用いることができる。例えば、発現ベクターのライブラリーを細胞系、例えば、タンパク質に対して基質依存的な様式で通常反応する細胞系に対してトランスフェクトする。続いて、病原性免疫グロブリン−基質によるシグナル伝達の阻害または増強が認められる細胞からプラスミドＤＮＡを収集し、個々のクローンの特徴をさらに調べることができる。
【００７４】
もう１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリン、例えば野生型と異なる活性を有する病原性免疫グロブリン、例えば天然の病原性免疫グロブリンのアンタゴニスト、アゴニストまたはスーパーアゴニストの作製方法を特徴とする。本方法は以下を含む：病原性免疫グロブリンの配列を、例えば本明細書に開示する非保存的領域、ドメインまたは残基の１つまたは複数の残基の置換または除去によって改変すること、および改変ポリペプチドを望ましい活性に関して試験すること。
【００７５】
もう１つの局面において、本発明は、天然の病原性免疫グロブリンとは変化した生物活性を有する、病原性免疫グロブリンの断片または類似体の作製方法を特徴とする。本方法は以下を含む：病原性免疫グロブリンの配列を、例えばその１つまたは複数の残基の配列の置換または除去によって改変すること、例えば本明細書に記載の非保存的領域、またはドメインもしくは残基の配列を改変すること、および改変ポリペプチドを望ましい活性に関して試験すること。
【００７６】
免疫グロブリンの作製
他の態様において、阻害物質は抗体またはその断片、例えば抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合部分でありうる。
【００７７】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、単一の分子組成からなる抗体分子のことを指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体のことを指す。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を不死化細胞と融合させたものを含むハイブリドーマによって産生される。
【００７８】
抗体の作製の方法は当技術分野で周知である。例えば、ある標的（例えば、病原性免疫グロブリンまたは細胞上の虚血特異的抗原）に対するモノクローナル抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む、さまざまな技法によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーションの手順が好ましいものの、原理的には、モノクローナル抗体を作製するための他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルストランスフォーメーションまたは発癌トランスフォーメーションも用いうる。ハイブリドーマの調製のために好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は非常に確立した手順である。免疫処置のプロトコール、および免疫処置を受けた融合用の脾細胞の単離のための技法は当技術分野で知られている。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も知られている。
【００７９】
ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスをマウス系の代わりに用いて作製することができる。関心対象の抗原による免疫処置を行ったこれらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を、ヒトタンパク質由来のエピトープに対する特異的親和性を備えたヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマの作製に用いうる（例えば、Ｗｏｏｄら、国際出願・国際公開公報第９１／００９０６号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、ＰＣＴ公報・国際公開公報第９１／１０７４１号；Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際出願・国際公開公報第９２／０３９１８号；Ｋａｙら、国際出願第９２／０３９１７号；Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９；Ｇｒｅｅｎ， Ｌ．Ｌ．ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７：１３〜２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．ら、１９９４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１〜６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９３、Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３〜４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３、ＰＮＡＳ ９０：３７２０〜３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９１、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３〜１３２６を参照）。
【００８０】
１つの態様においては、ハイブリドーマをヒトＣＤ５＋、Ｂ−１細胞から作製することができる。または、交差反応性「虚血抗原」を認識する「ヒト化」マウスハイブリドーマを用いることもできる。
【００８１】
モノクローナル抗体を、組換えＤＮＡ技術の分野の当業者に知られた他の方法によって作製することもできる。特定の抗原特異性を有する抗体断片の同定および単離のために「コンビナトリアル抗体ディスプレイ」法と呼ばれる１つの代替的な方法が開発されており、これをモノクローナル抗体の作製に用いることができる（コンビナトリアル抗体ディスプレイ法の説明については、例えば、Ｓａｓｔｒｙら、１９８９、ＰＮＡＳ ８６：５７２８；Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５；およびＯｒｌａｎｄｉら、１９８９、ＰＮＡＳ ８６：３８３３を参照されたい）。上記の免疫原を動物に接種した後に、その結果得られたＢ細胞プールの抗体レパートリーのクローニングを行う。免疫グロブリン分子の多様な集団の可変領域のＤＮＡ配列を、オリゴマープライマーの混合物およびＰＣＲを用いることによって入手するための方法は一般に知られている。例えば、５’リーダー（シグナルペプチド）配列および／またはフレームワーク１（ＦＲ１）配列に対応する混合オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに保存的な３’定常領域プライマーに対するプライマーを用いて、さまざまなマウス抗体から重鎖および軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅を行うことができる（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：１５２〜１５６）。同様の手法を用いて、ヒト抗体からヒト重鎖および軽鎖可変領域を増幅することもできる（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６〜１１０）。
【００８２】
１つの例示的な態様では、標準的なプロトコール（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｏｒｌａｎｄｉら、ＰＮＡＳ（１９８９）８６：３８３３〜３８３７；Ｓａｓｔｒｙら、ＰＮＡＳ（１９８９）８６：５７２８〜５７３２；およびＨｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１）を用いて、Ｂリンパ球、例えば末梢血細胞、骨髄または脾臓調製物からＲＮＡを単離する。重鎖の定常領域ならびにκおよびλ軽鎖のそれぞれに対して特異的なプライマー、さらにはシグナル配列に対するプライマーを用いて、第一鎖ｃＤＮＡを合成する。可変領域ＰＣＲプライマーを用いて、重鎖および軽鎖の双方の可変領域をそれぞれ単独でまたは組み合わせとして増幅し、ディスプレイパッケージの作製における操作をさらに行うために適切なベクター中に連結する。増幅プロトコールにおいて有用なオリゴヌクレオチドプライマーは一意的なものでも縮重性のものでもよく、または縮重した位置にイノシンを組み込んだものでもよい。増幅断片を発現のためにベクター中の所定のリーディングフレーム内にクローニングすることが可能となるように、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をプライマーに組み入れてもよい。
【００８３】
免疫処置に由来する抗体レパートリーからクローニングしたＶ−遺伝子ライブラリーを、好ましくは繊維状ファージに由来するディスプレイパッケージの集団により発現させ、抗体ディスプレイライブラリーを生成させることができる。理想的には、ディスプレイパッケージは、極めて大規模な多様化抗体ディスプレイライブラリーのサンプリング、各々の親和性分離の工程後の迅速な選別、および精製したディスプレイパッケージからの抗体遺伝子の容易な単離を可能とするシステムを含む。ファージディスプレイライブラリーを作製するための市販のキット（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）のほかに、多様化抗体ディスプレイライブラリーの作製における使用に特に適した方法および試薬の例は、例えば、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、米国特許第５，２２３，４０９号；カン（Ｋａｎｇ）ら、国際公開公報第９２／１８６１９号；ダワー（Ｄｏｗｅｒ）ら、国際公開公報第９１／１７２７１号；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、国際公開公報第９２／２０７９１号；マークランド（Ｍａｒｋｌａｎｄ）ら、国際公開公報第９２／１５６７９号；ブライトリング（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ）ら、国際公開公報第９３／０１２８８号；マッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、国際公開公報第９２／０１０４７号；ガラード（Ｇａｒｒａｒｄ）ら、国際公開公報第９２／０９６９０号；ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、国際公開公報第９０／０２８０９号；フックス（Ｆｕｃｈｓ）ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０〜１３７２；ヘイ（Ｈａｙ）ら（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１〜８５；ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１；グリフィス（Ｇｒｉｆｆｔｈｓ）ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５〜７３４；ホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９〜８９６；クラックソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８；グラム（Ｇｒａｍ）ら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６〜３５８０；ガラード（Ｇａｒｒａｄ）ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３〜１３７７；フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３〜４１３７；およびバーバス（Ｂａｒｂａｓ）ら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８〜７９８２に記載されている。
【００８４】
ある種の態様では、重鎖および軽鎖のＶ領域ドメインを柔軟なリンカーにより連結した同一ポリペプチド上で発現させて一本鎖Ｆｖ断片を形成させ、その後にこの一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦＶ）遺伝子を望ましい発現ベクターまたはファージゲノム中にクローニングすることができる。マッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２〜５５４に一般的に記載された通り、柔軟な（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカーによって連結した抗体の完全なＶＨおよびＶＬドメインを用いて、ディスプレイパッケージを抗原親和性に基づいて分離できるようにする一本鎖抗体を作製することができる。続いて、抗原に対する免疫反応性のある単離されたｓｃＦＶ抗体を、本方法に用いるための薬学的調製物として製剤化することができる。
【００８５】
ディスプレイパッケージ（例えば、繊維状ファージ）の表面に提示されたところで、標的抗原に対する特異性を有する抗体を発現するパッケージの同定および単離のために、抗体ライブラリーを標的抗原またはそのペプチド断片を用いてスクリーニングする。選択した抗体をコードする核酸をディスプレイパッケージ（例えば、ファージゲノム）から回収し、標準的な組換えＤＮＡ法によって他の発現ベクターへのサブクローニングを行うことができる。
【００８６】
表面タンパク質に対する高い親和性を有する特異的抗体分子は、当技術分野で知られた方法、例えばライブラリーのスクリーニングを用いる方法に従って作製することができる（Ｌａｄｎｅｒ， Ｒ．Ｃ．ら、米国特許第５，２３３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒ， Ｒ．Ｃ．ら、米国特許第５，４０３，４８４号）。さらに、これらのライブラリーの方法を、抗体の構造決定基の模倣物である結合性決定基を入手するためのスクリーニングに用いることもできる。
【００８７】
特に、個々の抗体分子のＦｖ結合表面はタンパク質間相互作用の原理に従ってその標的リガンドと相互作用するため、ＶＨおよびＶＬ（後者はκ鎖のものでもλ鎖のものでもよい）に関する配列データは、当業者に知られたタンパク質工学の技法の基盤となる。結合性決定基を含むタンパク質表面に関する詳細は、ＮＭＲ試験または結晶学的データから得られた他の抗体の以前に決定された三次元構造を用いるモデル化手順により、抗体の配列情報から得ることができる。例えば、バジョラス（Ｂａｊｏｒａｔｈ， Ｊ．）およびシェリフ（Ｓ． Ｓｈｅｒｉｆｆ） 、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．， Ｆｕｎｃｔ．， および Ｇｅｎｅｔ． ２４（２）、１５２〜１５７；ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ， Ｄ．Ｍ．）およびリース（Ａ． Ｒ． Ｒｅｅｓ）、１９９５、「抗体結合部位の分子モデリング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）、ポール（Ｓ． Ｐａｕｌ）編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ． ５１、「抗体工学のプロトコール（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、ｐｐ １７〜４９；ならびにジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇ．）、ウー（Ｗｕ， Ｔ．Ｔ．）およびカバット（Ｅ．Ａ． Ｋａｂａｔ）、１９９５、「Ｓｅｑｈｕｎｔ：整列化したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のスクリーニング用のプログラム（Ｓｅｑｈｕｎｔ：Ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ａｌｉｇｎｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ． ５１、前掲書中、ｐｐ １〜１５を参照されたい。
【００８８】
１つの態様では、多様化したペプチドライブラリーをディスプレイパッケージの集団により発現させて、ペプチドディスプレイライブラリーを生成させる。理想的には、ディスプレイパッケージは、極めて大規模な多様化抗体ディスプレイライブラリーのサンプリング、各々の親和性分離の工程後の迅速な選別、および精製したディスプレイパッケージからの抗体遺伝子の容易な単離を可能とするシステムを含む。ペプチドディスプレイライブラリーは例えば、迅速増幅が可能であり、操作が比較的容易であって、多数のクローンの作製が可能な原核生物およびウイルスでありうる。好ましいディスプレイパッケージには例えば、増殖性細菌細胞、細菌胞子、および最も好ましくは細菌ウイルス（特にＤＮＡウイルス）が含まれる。しかし、本発明は、酵母およびその胞子を含む真核細胞をディスプレイパッケージの可能性があるものとして用いることも考えている。ファージディスプレイライブラリーについては先に述べた。
【００８９】
他の技法には、適した「受容体」、例えば標的抗原を用いるアフィニティークロマトグラフィーの後に、単離された結合性物質またはリガンドを従来の技法（例えば、質量分析およびＮＭＲ）によって同定することが含まれる。好ましくは、可溶性受容体を、その検出によってリガンド結合が示されるような標識（例えば、蛍光団、比色定量用酵素、放射性同位体または発光性化合物）と結合させる。または、固定化した化合物を選択的に遊離させ、膜を通して拡散させて、受容体と相互作用させることもできる。
【００９０】
化合物のコンビナトリアルライブラリーを、ライブラリーの各構成要素の実体を符号化するための「タグ」付きで合成することもできる（例えば、Ｗ．Ｃ． Ｓｔｉｌｌら、国際出願・国際公開公報第９４／０８０５１号を参照）。本方法は一般に、固体支持体または化合物に結合させた、不活性ではあるが容易に検出可能なタグを用いることを特徴する。活性化合物が検出された場合には、一意的な随伴タグの同定によって化合物の実体を決定する。このタグ標識法により、極めて低いレベルでもライブラリーのすべての化合物の全集合からの同定が可能な化合物の大規模ライブラリーを合成することが可能となる。
【００９１】
「改変された抗体」という用語は、抗体の部分の除去、付加または置換などによって改変された、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体を含むものとする。例えば、抗体は、ヒンジ領域を除去し、それにより一価抗体を作製することによって改変しうる。本発明の抗体は、可変領域またはその一部、例えば相補性決定領域（１つまたは複数のＣＤＲ）が、非ヒト生物、例えばラットまたはマウスにおいて産生されるものでありうる。キメラ抗体、ＣＤＲグラフト（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）抗体およびヒト化抗体は本発明の範囲に含まれる。非ヒト生物（例えばラットまたはマウス）において産生され、その後、ヒトにおける抗原性を低下させるために、例えば可変フレームワークまたは定常領域抗体に改変がなされた抗体は、本発明の範囲に含まれる。抗体が少なくとも１つの抗原結合部分を有する限り、あらゆる改変が本発明の範囲に含まれる。
【００９２】
キメラ抗体（例えば、マウス−ヒトモノクローナル抗体）は、当技術分野で知られた組換えＤＮＡ技術によって作製可能である。例えば、マウス（または他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を、マウスＦｃをコードする領域を除去するために制限酵素で消化し、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の同等な部分によって置換する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許公報ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際出願・国際公開公報第８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３）；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら、１９８７、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６〜４４９；およびＳｈａｗら、１９８８、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３〜１５５９を参照のこと）。
【００９３】
抗原結合に直接には関与しないＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域由来の同等な配列によって置換することにより、キメラ抗体をさらにヒト化することができる。ヒト化抗体を作製するための一般的な方法は、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ．）、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７、オイ（Ｏｉ）ら、１９８６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、およびクイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号に提示されており、これらのすべての内容は参照として本明細書に組み入れられる。このような方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域の全体または一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、発現させることを含む。このような核酸の源は当業者に周知であり、例えば、抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ抗体を産生するハイブリドーマである７Ｅ３から入手可能である。続いて、キメラ抗体またはその断片をコードする組換えＤＮＡを適切な発現ベクター中にクローニングすることができる。または、適したヒト化抗体をＣＤＲ置換によって作製することもできる。米国特許第５，２２５，５３９号；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５；バーホエアン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびバイドラー（Ｂｅｉｄｌｅｒ）ら、１９８８、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３〜４０６０。
【００９４】
ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体は、免疫グロブリン鎖の１つ、２つまたはすべてのＣＤＲを置換することが可能なＣＤＲグラフト法またはＣＤＲ置換によって作製することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５；バーホエアン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびバイドラー（Ｂｅｉｄｌｅｒ）ら、１９８８、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３〜４０６０；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。これらのすべての内容は参照として本明細書に明示的に組み入れられる。ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）は、本発明のヒト化抗体の調製に用いうるＣＤＲグラフト法を記載しており（１９８７年３月２６日に提出された英国特許出願第ＧＢ ２１８８６３８Ａ号、Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号）、その内容は参照として明白に開示される。
【００９５】
ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体は、少なくとも１つまたは２つの、しかし一般的にはすべてのレシピエントＣＤＲ（免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の）がドナーＣＤＲによって置換されていると考えられる。ドナーは齧歯類抗体、例えば、ラットまたはマウスの抗体であり、レシピエントはヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークであることが好ましい。一般に、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。１つの態様において、ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えば、齧歯類）のものである。アクセプターのフレームワークは天然（例えば、ヒト）のフレームワークまたはコンセンサスフレームワークでもよく、それとの同一性が約８５％またはそれ以上、好ましくは９０％、９５％、９９％またはそれ以上である配列でもよい。
【００９６】
特定の抗体のすべてのＣＤＲを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部によって置換してもよく、ＣＤＲのいくつかのみを非ヒトＣＤＲによって置換してもよい。必要なのは、ヒト化抗体のＦｃ受容体との結合に必要な数のＣＤＲを置換することのみである。
【００９７】
特定のアミノ酸が置換、除去または付加されたキメラ抗体およびヒト化抗体も本発明の範囲に含まれる。特に、好ましいヒト化抗体は、抗原との結合性を改善するためにフレームワーク領域にアミノ酸置換を有する。例えば、ヒト化抗体は、ドナーのフレームワーク残基またはレシピエントのフレームワーク残基以外の別のアミノ酸と同一なフレームワーク残基を有すると考えられる。もう１つの例として、マウスＣＤＲを有するヒト化抗体の場合には、ヒトフレームワーク領域に位置するアミノ酸を、マウス抗体の対応する位置にあるアミノ酸によって置換することができる。ある種の場合には、このような置換がヒト化抗体の抗原との結合性を改善させることが知られている。
【００９８】
本明細書で用いる「抗原結合部分」または「抗体部分」または「断片」という用語は、抗原（例えば、標的抗原、例えば、虚血抗原）と特異的に結合する能力を保っている、抗体の１つまたは複数の断片のことを指す。本発明の抗体断片は、当業者に知られた従来の手順を用いて得られる。例えば、ペプシンで抗体を消化すると、Ｆ（ａｂ’）２断片および多数の小さな断片が得られる。抗体のメルカプトエタノール還元により、個々の重鎖および軽鎖が得られる。抗体をパパインで消化すると、個々のＦａｂ断片およびＦｃ断片が得られる。上記の通り、抗体断片の有用性に関するスクリーニングは完全な抗体と同じ様式で行う。
【００９９】
２２Ａ５ ＩｇＭ重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図４Ａ（配列番号：１）に示し、２２Ａ５ ＩｇＭ重鎖可変領域のアミノ酸配列を図５Ａに示す（配列番号：２）。重鎖可変領域のＣＤＲ１ドメインは配列番号：２のアミノ酸約３０番目〜３４番目（配列番号：４）に対応しており、配列番号：１のヌクレオチド約９１位〜１０５位（配列番号：３）を含み、重鎖可変領域のＣＤＲ２ドメインは配列番号：２のアミノ酸４９番目〜６５番目（配列番号：６）に対応しており、配列番号：１のヌクレオチド１４８位〜１９８位（配列番号：５）を含む。
【０１００】
２２Ａ５ ＩｇＭ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列図４Ｂ（配列番号：７）に示し、２２Ａ５ ＩｇＭ軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図５Ｂ（配列番号：８）に示す。軽鎖可変領域のＣＤＲ１ドメインは配列番号：８のアミノ酸約２３番目〜３３番目（配列番号：１０）に対応しており、配列番号：７ヌクレオチド約７１位〜１０３位（配列番号：９）を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ２ドメインは配列番号：８のアミノ酸約４９番目〜５５番目（配列番号：１２）に対応しており、配列番号：７のヌクレオチド約１４９位〜１６９位（配列番号：１１）を含む。
【０１０１】
本発明の抗体またはその断片（例えば、ＣＤＲ２ドメインなどのＣＤＲドメイン、または断片）をコードするヌクレオチド配列を、遺伝暗号および標準的な分子生物学の技法を用いて、本出願に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列から導き出せることを当業者は理解すると考えられる。さらに、当業者は、遺伝暗号の縮重性のために、他のヌクレオチド配列が本明細書に挙げたアミノ酸配列を列挙しうることも理解すると考えられる。
【０１０２】
本発明の核酸組成物は、天然の配列（改変された制限部位などを除く）であることがしばしばであるが、遺伝子配列を得るための標準的な技法に従ってｃＤＮＡ、ゲノムまたは混合物から変異させてもよい。コード配列の場合、これらの変異はアミノ酸配列に要望通りの影響を及ぼすことがある。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常領域、スイッチおよび本明細書に記載の他のこのような配列と実質的に同一な、またはそれらに由来するヌクレオチド配列を考えている（ここで「由来する」とは、配列が他の配列と同一であるか、またはそれから改変されたことを意味する）。
【０１０３】
１つの態様において、単離された核酸は、図４Ａに示したヌクレオチド配列を有する２２Ａ５ ＩｇＭ重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号：１）、またはそれとの同一性が少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上である配列を含む。もう１つの態様において、単離された核酸は、図４Ｂに示したヌクレオチド配列を有する２２Ａ５ ＩｇＭ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号：７）、またはそれとの同一性が少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上である配列を含む。
【０１０４】
もう１つの態様において、本発明は、配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、またはその断片もしくは改変型をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸はＣＤＲ１領域のみをコードすることもでき、または抗体重鎖可変領域全体をコードすることもできる。例えば、本核酸は、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する重鎖可変領域をコードしうる。さらにもう１つの態様において、本発明は、配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、またはその断片もしくは改変型をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸はＣＤＲ２領域のみをコードすることもでき、または抗体重鎖可変領域全体をコードすることもできる。例えば、本核酸は、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域をコードしうる。
【０１０５】
さらにもう１つの態様において、本発明は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、またはその断片もしくは改変型をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸はＣＤＲ１領域のみをコードすることもでき、または抗体軽鎖可変領域全体をコードすることもできる。例えば、本核酸は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する軽鎖可変領域をコードしうる。さらにもう１つの態様において、本発明は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、またはその断片もしくは改変型をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸はＣＤＲ２領域のみをコードすることもでき、または抗体軽鎖可変領域全体をコードすることもできる。例えば、本核酸は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域をコードしうる。
【０１０６】
薬学的組成物および投与
本発明の阻害物質を、対象への投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。典型的な例として、薬学的組成物は、本発明の阻害物質（例えば、改変された病原性免疫グロブリン）および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」には、生理的な適合性のある任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張液および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせのうち１つまたは複数が含まれる。多くの場合には、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコ−ル、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいと考えられる。薬学的に許容される担体が、抗体または抗体部分の貯蔵寿命または有効性を増大させる、湿潤剤もしくは乳化剤、保存料または緩衝剤などの微量の補助物質をさらに含んでもよい。
【０１０７】
薬学的組成物は、その意図する投与経路と適合しうるように製剤化される。投与経路の例には、静脈内、皮内、皮下、経口（吸入など）、経皮（局所）、経粘膜および直腸内投与などの非経口的なものが含まれる。このように、本発明の組成物はさまざまな剤形をとりうる。これらには例えば、溶液（例えば、注射用および注入用の液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体、固体の剤形が含まれる。好ましい剤形は、意図する投与様式および治療用途に応じて決まる。典型的な好ましい組成物は、ヒトに対する他の抗体による受動免疫処置に用いられるものと類似した組成物などの注射用および注入用の液剤の剤形である。好ましい投与様式は、非経口的（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）なものである。好ましい態様では、抗体を静脈内注入または注射によって投与する。別の好ましい態様では、抗体を筋肉内注射または皮下注射によって投与する。
【０１０８】
非経口的、皮内または皮下適用のために用いられる液剤または懸濁剤は以下の成分を含みうる：注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸鉛、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調整しうる。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザルシリンジまたはガラスもしくは合成樹脂製の多回投与用バイアル中に封入することができる。
【０１０９】
注射用に適した薬学的組成物には、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の要時調合用製剤（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために適した担体には、生理食塩水、滅菌精製水、クレモフォア（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、シリンジ注入が容易に行える程度に流動的である必要がある。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護される必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその適した混合物などを含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合には必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持しうる。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌薬および抗真菌薬によって実現しうる。多くの場合には、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコ−ル、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいと考えられる。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含めることによって実現しうる。
【０１１０】
治療的組成物は一般に、無菌である上、製造および保存の条件下で安定性がある必要がある。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散系、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序立った構造として製剤化することができる。滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物（すなわち、抗体または抗体部分）を、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに適した溶媒中に組み入れた後に濾過滅菌を行うことによって調製しうる。分散液は一般に、基本的な分散媒、および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を含めることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製の方法は、活性成分の粉末に加えて、あらかじめ滅菌濾過された溶液から望ましい任意の付加的な成分が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用により、分散系の場合には必要な粒径を保つことにより、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
【０１１１】
本発明の阻害物質は、当技術分野で知られたさまざまな方法によって投与することができるが、多くの治療的用途に対して好ましい投与の経路／様式は静脈内への注射または注入である。当業者は理解すると考えられるが、投与の経路および／または様式は求める結果に応じて異なると考えられる。ある種の態様においては、活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル封入送達系を含む制御放出型製剤などの、急速放出から化合物を保護すると思われる担体とともに調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性の重合体を用いることもできる。このような製剤を調製するための多くの方法は特許が取得されており、当業者に広く知られている。例えば、徐放性および制御放出型の薬物送達系（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ロビンソン（Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８を参照されたい。
【０１１２】
ある種の態様では、本発明の阻害物質を、例えば不活性希釈剤または可食担体とともに経口投与してもよい。化合物（および必要に応じて他の成分）を硬もしくは軟ゼラチンカプセル内に封入すること、圧縮して錠剤にすること、または対象の食事に直接組み入れることも可能である。経口的治療投与の目的には、化合物を賦形剤とともに組み入れ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、カシェ剤などの形態で用いることができる。非経口的投与以外によって本発明の化合物を投与するためには、化合物をその失活を防ぐ物質でコーティングすること、または化合物をそれとともに同時投与することが必要なことがある。吸入による投与のためには、化合物は、二酸化炭素などのガスなどの適した噴霧剤を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０１１３】
本発明の阻害物質は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル封入送達系を含む制御放出型製剤などの、身体からの急速放出から化合物を保護すると思われる担体とともに調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性の重合体を用いることもできる。このような製剤を調製するための方法は当業者には明らかであると考えられる。これらの物質を、アルザ社（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバファーマシューティカルズ社（Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）から購入することもできる。リポソーム懸濁液を薬学的に許容される担体として用いることもできる。これらは当業者に知られた方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号の記載に従って調製することができる。
【０１１４】
本薬学的組成物は、投与のための指示とともに、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１１５】
実施例
実施例１：虚血再灌流障害の機序
本実施例では、補体系に欠損のあるマウスが虚血再灌流障害に対して抵抗性であったことを示す。
【０１１６】
虚血再灌流障害の機序を検討するために、補体Ｃ３が欠損したマウスに対して後肢モデルとしての処置を行った。Ｃ３−／−マウスは、透過性指数が約５０％低下したという根拠により、障害から部分的に防御された（Ｗｅｉｓｅｒら（１９９６）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５７〜１８６４を参照）。したがって、補体Ｃ３はこのマウスモデルにおける完全な障害の誘導に必須である。
【０１１７】
ワイザー（Ｗｅｉｓｅｒ）らの実験では、補体がいかにして活性化されるかは特定されていない。血清補体系は、古典経路、レクチン経路または第二経路という少なくとも３つの異なる経路によって活性化されうる。どの経路が関与するかを知ることは、これによって障害の機序が推定されるため重要である。例えば、古典経路は免疫グロブリンのＩｇＭおよびＩｇＧアイソタイプにより、または血清認識タンパク質であるＣ反応性タンパク質により、非常に効率的に活性化される。これに対して、レクチン経路はマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）によるマンナンの認識などの特定の糖質の認識後に活性化される（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ ８、２９〜３５）。いずれの経路においても、補体Ｃ４は中心的成分であるＣ３の切断を触媒するＣ２との酵素複合体の形成に必要である。これに対して、第二経路は自発的に活性化し、Ｃ３の活性型（Ｃ３ｂ）への変換、および異物または自己の組織への結合をもたらす。すべての宿主細胞が、Ｃ３転換酵素の不活性化または変位による補体経路の増幅に対する阻害物質を発現することからみて、この経路は厳密に調節されている（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ， Ｈ．Ｊ．，（１９８８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７． ３２１〜３４７）。関与する経路を決定するための１つのアプローチは、Ｃ４が欠損したマウス、すなわち古典経路またはレクチン経路を介してＣ３転換酵素を形成することができないマウスを用いることである。Ｃ３またはＣ４のいずれかが欠損したマウスおよび野生型（ＷＴ）対照の後肢モデルにおける比較により、Ｃ４も完全な障害の誘導に必要なことが判明した（Ｗｅｉｓｅｒら、前記）。この所見は、抗体またはＭＢＬが関与している可能性を示唆する点で重要である。
【０１１８】
実施例２：自然ＩｇＭは虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害を媒介する
本実施例では、免疫グロブリンが欠損したマウスが虚血再灌流障害に対して抵抗性であったことを示す。
【０１１９】
抗体がＩ／Ｒ障害の媒介に関与するか否かを明らかにするために、免疫グロブリンが完全に欠損したマウスであるＲＡＧ２−／−（リコンビナーゼ活性化遺伝子−２の欠損）の腸管モデルにおける特徴分析を補体欠損マウスとともにおいて行った。重要なことに、ＲＡＧ−２−／−マウスは補体欠損マウスに観察されたものと同程度のレベルで防御された（Ｗｅｉｓｅｒら、前記）。ＲＡＧ２−／−マウスには成熟リンパ球も存在しないため、病原性作用が抗体依存的であるかを明らかにすることは重要であった（Ｓｈｉｎｋａｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８、８５５〜８６７）。障害が血清抗体によって媒介されることを確認するために、欠損マウスに対して正常マウス血清（Ｗｅｉｓｅｒら、前記）または精製ＩｇＭ（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）Ｊ． Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８６；９３８〜４２）の再構成を行った。いずれの場合にも、再構成したＲＡＧ−２−／−マウスは防御されなくなり、障害が再び生じた。後者の実験では、腸管障害のモデルをこのモデルと同じように用いており、障害は主として補体によって媒介されると考えられる。
【０１２０】
これらの結果から、虚血期間中には内皮細胞表面に新たな抗原が発現されることも露出されることもないと解釈される。流血中ＩｇＭが新たな決定基を認識して結合し、補体の古典経路を活性化するように思われる。抗原の性質は明らかでないが、プールしたＩｇＧを欠損マウスに対して再構成してもマウスの障害の明らかな再生は起こらなかったため、主として補体の活性化の原因となるのはＩｇＧではなくＩｇＭであるように思われる。これと別の仮説は、変化した内皮表面を認識して低レベルの補体活性化を誘導し、新たな抗原性部位を露出させるＭＢＬ経路などの別の初期イベントが存在し、ＩｇＭの結合によってこの経路が増幅されるというものである。
【０１２１】
実施例３：病原性ＩｇＭはＢ−１細胞の産物である：
流血中ＩｇＭのかなりの割合は天然の抗体、すなわち再配列が起こった生殖系列遺伝子の産物であると考えられているため、リンパ球のＢ−１画分に欠損のあるマウスも防御される可能性がある。Ｂ−１細胞は、ＩｇＤおよびＣＤ２３を低レベルで発現し、かなりの割合が細胞表面タンパク質ＣＤ５を発現するという点で、通常のＢ−２細胞とは明確に異なる表現型を有する（Ｈａｒｄｙら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．：１３７、９１；Ｋａｎｔｏｒら（１９９３）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１、５０１〜５３８、１９９３）。Ｂ１細胞は、マウスでは循環量が少ないこと、末梢リンパ節および脾臓における頻度が低いこと、ならびに腹腔に主として局在することによっても識別できる。病原性ＩｇＭの源としてのＢ−１細胞の役割を検討するために、抗体欠損マウス（ＲＡＧ−２−／−）に対して５×１０５個の腹腔Ｂ−１細胞の再構成を行い、処置の前に約３０日の安静期間をおいた。養子移入から１カ月以内に流血中ＩｇＭレベルはほぼ正常範囲に達した。Ｂ−１細胞の再構成を行ったマウスの腸管虚血モデルにおける特徴分析により、Ｂ−１細胞が病原性ＩｇＭの主な源であることが確かめられた（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）、前記を参照）。Ｂ−１細胞の自然抗体レパートリーは従来のＢ−２細胞に対して予想されるよりもかなり少ないため、これは重要な観察所見であった。このため、この病原性抗体は生殖系列の産物である可能性がある。
【０１２２】
実施例４：Ｃｒ２−／−マウスは虚血再灌流障害から防御される：
Ｃｒ２−／−ノックアウトマウスの最初の特徴分析により、Ｂ−１ａまたはＣＤ５＋Ｂ−１細胞の頻度が約５０％低下していることが判明している（Ａｈｅａｒｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：２５１〜２６２）。しかし、Ｃｒ２欠損マウスの別の系統の特徴分析では同様の低下は特定されなかった（Ｍｏｌｉｎａら（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３、３３５７〜３３６１）。ＣＤ５＋細胞の頻度の低下が系統バックグラウンドまたは環境の違いに起因するか否かは不明である。Ｃｒ２−／−マウスにおけるＢ−１ａ細胞の頻度は低いにもかかわらず、ＩｇＭの流血中レベルは正常範囲にあった。これらの所見により、Ｃｒ２欠損マウスにおけるＩｇＭのレパートリーが異なる可能性が示唆された。この仮説を検証するために、マウスの腸管Ｉ／Ｒモデルにおける特徴分析を行った。驚いたことに、Ｃｒ２−／−マウスは抗体完全欠損マウスと同程度に防御された（図１）。処置後の腸管モデルにおける５日間の生存率の比較により、ＷＴの方がＣｒ２欠損マウスよりも死亡率が有意に高いことが示された。死亡率の高さと一致して、処置を行ったＷＴまたはＣｒ２−／−欠損マウスから採取した組織切片においても障害の劇的な軽減が観察された。
【０１２３】
ＷＴマウス、またはプールしたＩｇＭもしくはＢ−１細胞の再構成を行ったＣｒ２−／−マウスでは、腸粘膜層の広範囲にわたる障害が認められた。これに対して、処置を行ったＣｒ２−／−マウスから単離した組織切片は偽処置対照のものと類似していた。このように、ＩｇＭの流血中レベルは正常であるものの、Ｃｒ２欠損マウスは障害から防御された。これらの結果により、Ｂ−１細胞が病原性抗体の源として重要なことだけでなく、補体系が自然抗体のレパートリーの形成または維持にも何らかの関与を行っていることが示唆された。例えば、補体はＢ−１細胞の陽性選択に関与している可能性がある。
【０１２４】
実施例５：病原性ＩｇＭの同定
本実施例には、正常Ｂ−１細胞からの特定のハイブリドーマクローンの作製、および病原性ＩｇＭを産生するクローンの同定について述べる。病原性ＩｇＭは抗体欠損マウスにおけるインビボでの障害を再び生じさせることが示された。
【０１２５】
補体受容体ＣＤ２１／ＣＤ３５が欠損したマウスの検討により、このマウスには病原性抗体がないことが判明した。それらの血中のＩｇＭレベルは正常であったため、この所見は予想外であった。これらの所見から、Ｂ−１細胞と呼ばれるＢ細胞の特定の集団が病原性ＩｇＭを分泌する原因であるという仮説が導かれた。例えば、受容体欠損マウス（Ｃｒ２−／−）に正常マウス由来のＢ−１細胞を移植することによって障害が再生し、Ｂ−１細胞の重要性が裏づけられた。障害の原因となる特定の１つまたは複数の抗体を同定するために、正常マウスから採取した腹腔Ｂ−１細胞の集積プールから一群のハイブリドーマクローンを作製した。腹腔細胞の集積画分からハイブリドーマを調製するための一般的なアプローチには、７日前にＩＬ−１０を投与したマウスから腹腔細胞を採取し、その後に磁気ビーズを用いる陰性選択によってＣＤ２３＋ Ｂ細胞を集積させることが含まれる。集積したＢ細胞を、ＩｇＭ、Ｍａｃ−１およびＣＤ２３特異的Ｍａｂで染色した後にＦＡＣＳにより分析する。この集積集団をＬＰＳの存在下で２４時間培養することによってさらに活性化する。活性化された細胞を、ＰＥＧの存在下で融合パートナーである骨髄腫細胞とハイブリダイズさせ、ＨＡＴ選択培地中で増殖させる。ハイブリドーマをＥＬＩＳＡによってＩｇＭ分泌性クローンに関してスクリーニングし、ＩｇＭの精製のために陽性ウェルを増殖させる。
【０１２６】
２２種のＩｇＭ分泌性ハイブリドーマクローンを、各々のクローンから同量のＩｇＭ産物をプールすることによって分析した。抗体欠損マウスにプールしたＩｇＭを投与したところ、血清由来のプールＩｇＭで認められたものと類似の障害が再び生じた。この所見により、作製した２２種のハイブリドーマの中に病原性ＩｇＭがあることが確認された。プールを２つの画分、すなわち１〜１１および１２〜２２に分割し、マウスにこの２つの画分を投与したところ、病原性抗体はクローン＃２２を含むプールに分画されることがわかった。さらに、マウスに対してクローン１７または２２の再構成を行った。クローン２２は障害を再生させたが、他のクローンは再生させなかった（図３Ａおよび３Ｂ参照）。
【０１２７】
実施例６：Ｂ−１細胞の選択における補体の関与：
Ｂ−１細胞の発生に関しては２つの異なるモデルが提唱されている。系譜仮説では、Ｂ−１細胞が初期胎児において明確な集団として発生すると提唱している（Ｋａｎｔｏｒら（１９９３）前記）。または、Ｂ−１細胞は通常のＢ細胞と同じ前駆細胞から発生するが、環境に応じて、すなわち抗原との遭遇により、それらがＢ−１に分化するか、またはＢ−２細胞の表現型を維持するという説もある（Ｗｏｒｔｉｓ， Ｈ．Ｈ．（１９９２）Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８、２３５；Ｃｌａｒｋｅ， Ｊ．（１９９８）Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７、１３２５〜１３３４）。その由来にかかわらず、Ｂ−１細胞は成体骨髄からはＢ−２細胞と同じ頻度では補充されず、その表現型は初期胎児肝Ｂ細胞または新生児骨髄（ＢＭ）細胞のものの方に類似している。初期に由来することに一致して、そのレパートリーはより近位側のＶＨ遺伝子の発現に偏る傾向があり、Ｎ−ヌクレオチド付加は少ない（Ｇｕら（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ ９、２１３３；Ｆｅｅｎｅｙ， Ｊ．（１９９０）Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２、１３７７）。成体ＢＭ幹細胞による補充が少ないと想定すれば、Ｂ−１細胞が自己再生し、抗原刺激がその再生、増殖またはさらに初期選択に重要と思われることは妥当と思われる（Ｈａｙａｋａｗａら（１９８６）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６、１３１３）。実際に従来のモデルに備わっているように、Ｂ−１細胞は抗原により選択される必要がある。
【０１２８】
Ｂ−１細胞の陽性選択にＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達が必要なことを裏づける証拠が、ＢＣＲシグナル伝達を変化させる変異を有するマウスから得られている。例えば、ＣＤ１９（１９、２０）、ｖａｖ（２１）またはＢｔｋ（２２）によるＢＣＲシグナル伝達の障害はＢ−１細胞の発生に重大な影響を及ぼす。これに対して、ＣＤ２２−またはＳＨＰ−１欠損マウスなどの場合のように陰性選択がなされないと、Ｂ−１細胞の頻度が高くなる（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、７９８〜８０１；Ｓｈｕｌｔｚら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７３、１４４５）。最近、ＶＨ１２（Ｂ−１細胞表現型）またはＶＨＢ１−８（Ｂ−２細胞表現型）という２つの異なるＩｇ導入遺伝子を有するマウスを用いたエレガントな研究により、Ｂ−１細胞が自己抗原によって選択されるとの見解が裏づけられた。例えば、ＶＨ１２を単独で、またはＢ１−８とともに発現するＢ細胞からはＢ−１細胞表現型が生じた。一方、Ｂ１−８ｔｇのみを発現するＢ細胞は、同定された場合でもわずかであった。このように、これらの結果から、トランスジェニックＢ細胞の自己ＰｔＣとの遭遇により、ＶＨ１２を発現するものの増殖が起こることが示唆された。Ｂ−１細胞の選択は、ハーディ（Ｈａｒｄｙ）ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １３７、９１）によって最近報告されている。彼らのモデルでは、Ｔｈｙ １．１に対して特異的な免疫グロブリン導入遺伝子を発現するＢ細胞が、コグネイト抗原を発現するマウスにおいて選択されて増殖した。これに対して、導入遺伝子＋Ｂ−１細胞は、代替的なアロタイプであるＴｈｙ １．２を発現するマウスには認められなかった。
【０１２９】
補体はどこでＢ−１細胞の発生に組み込まれるのであろうか。Ｂ−１ａ細胞の頻度の全体的な低下、およびＩ／Ｒ障害に関与するＩｇＭを発現するＢ−１細胞のより特異的な減少から、Ｂ−１ａ細胞の陽性選択または維持におけるＣＤ２１／ＣＤ３５の役割が示唆される。補体に関して考えられる１つの役割は、コグネイト抗原と遭遇するとＢＣＲシグナル伝達を増強させるというものである。ＣＤ２１／ＣＤ３５欠損マウスの生化学的検討および分析により、通常のＢ細胞の活性化および生存における補助受容体シグナル伝達の重要性が示されている（Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｍ．Ｃ．，（１９９８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １６、５４５〜５６８；Ｆｅａｒｏｎら（１９９５）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １３、１２７〜１４９）。Ｂ−１細胞も同じようにＢＣＲシグナルの増強に補助受容体シグナル伝達を利用している可能性が非常に高い。例えば、細菌はホスホリルコリンなどの典型的なＢ−１細胞抗原を発現しており、細菌が補体リガンドＣ３ｄによって覆われると補助受容体とＢＣＲとの架橋が増大して全体的なシグナル伝達が増強されるという考えは不当とは言えない。このため、比較的低い濃度で発現される抗原の場合、コグネイトＢ細胞がそれを認識して増殖するため、または陽性選択されるためには、補体による増強が必要と考えられる。補体受容体に関するもう１つの役割は、抗原をリンパ系区画内部の濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）上に局在させることである。しかし、Ｂ−１細胞の集団の大半は腹腔組織に存在するため、それらがリンパ系構造の内部でＦＤＣと遭遇するかどうかは明確でない。Ｂ−１細胞が陽性選択を受ける１つまたは複数の実際の部位はわかっていない。それらは初期胎児発生時または新生児ＢＭにおいてコグネイト抗原に遭遇する必要がある。もしそうであれば、これらの区画内の実質細胞の表面にある補体受容体は抗原と結合してそれをＢ細胞に提示することが予想される。補体受容体は発生の両方の段階に関与する可能性がある。第一に、それらは初期陽性選択における抗原シグナル伝達を増強する可能性がある。第二に、選択されたＢ−１細胞が末梢部位に補充される際に、補体受容体は再びＢＣＲシグナル伝達の増強に関与する可能性がある。
【０１３０】
図２は、腹腔Ｂ−１リンパ球の陽性選択における補体および補体受容体の役割を提唱した模式図である。補体−リガンドで覆われた抗原（自己および非自己）の相互作用によって、細胞表面でＣＤ２１／ＣＤ１９補助受容体およびＢＣＲの共連結（ｃｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）が起こり、これがシグナル伝達の増強および陽性選択をもたらす。
【０１３１】
等価物
当業者は、日常的な実験により、本明細書に記載された特定の態様の等価物を認識する、または確認することができるだろう。このような等価物は添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】腸管虚血および再灌流後の、または障害を加えなかった（偽処置）近交系マウスの腸管透過性の変化を示した棒グラフである。ＷＴはＣｒ２−／−マウスの親系統を表す。Ｃｒ２−／−はプールしたＩｇＧもしくはＩｇＭまたは生理食塩水対照を用いて再構成した。プールしたＩｇＭまたはＩｇＧ（０．５ｍｇ）を処置の約１時間前に静脈内に投与した。各値は平均＋標準誤差である；ｎ＝実験群におけるマウスの数。
【図２】腹腔Ｂ−１リンパ球の陽性選択における補体および補体受容体の役割を提唱した模式図である。
【図３Ａ】２２種の個別のＢ−１細胞ハイブリドーマクローンからプールしたＩｇＭによる、抗体欠損マウス（ＲＡＧ−１）におけるＩ／Ｒ障害の再構成を示す。２４μｇの各ハイブリドーマＩｇＭをプールし、最初の腹腔切開を行う３０分前に静脈内に注射した。再灌流を終えた時点で血液を採取し、乾燥腸管と血液との１２５Ｉカウントの比として透過性指数を算出する。各値は平均±ＳＥを表す；ｎ＝実験群に用いたマウスの数。１＝生理食塩水；２＝プールしたハイブリドーマ；３＝５０μｇのハイブリドーマ２２Ａ５；４＝４００μｇのプールしたＩｇＭ。
【図３Ｂ】ハイブリドーマクローン２２Ａ５からのＩｇＭによってＲＡＧ−１マウスにおけるＩ／Ｒ障害が再び生じることを示す。ＩｇＭによる再構成を行ったマウスには総血清ＩｇＭ（４００μｇ）または２２Ａ５ハイブリドーマＩｇＭ（各５０μｇ）を投与している。各値は平均±ＳＥを表す；ｎ＝実験群に用いたマウスの数。１＝生理食塩水；２＝プールしたハイブリドーマ；３＝５０μｇのハイブリドーマ２２Ａ５；４＝４００μｇのプールしたＩｇＭ。
【図４Ａ】Ｂ−１ハイブリドーマ２２Ａ５のＩｇＭ配列解析を示す。２２Ａ５ ＩｇＭの重鎖核酸配列を示す（配列番号：１）。ＲＮＡを２２Ａ５ハイブリドーマ細胞から精製し、逆転写を行ってｃＤＮＡとした。免疫グロブリン重鎖ｃＤＮＡの増幅には、５’ ＶＨおよび３’ Ｃｍに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるセミネステッド（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを用いた。ｃＤＮＡ産物をアガロースゲルで精製し、ヌクレオチド配列を自動シークエンシングによって決定した。フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）をヌクレオチドの上方に示す。ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースの検索により、２２Ａ５重鎖の免疫グロブリン配列ＶＭＵ−３．２（アクセッション番号Ｘ０３０８８）との相同性が９５％であることが明らかになった。
【図４Ｂ】Ｂ−１ハイブリドーマ２２Ａ５のＩｇＭ配列解析を示す。２２Ａ５ ＩｇＭの軽鎖核酸配列を示す（配列番号：７）。ＲＮＡを２２Ａ５ハイブリドーマ細胞から精製し、逆転写を行ってｃＤＮＡとした。免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡの増幅には、５’ Ｖｋおよび３’ Ｃｋに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるセミネステッドＰＣＲを用いた。ｃＤＮＡ産物をアガロースゲルで精製し、ヌクレオチド配列を自動シークエンシングによって決定した。フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）をヌクレオチドの上方に示す。ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースの検索により、２２Ａ５軽鎖の免疫グロブリン配列Ｖｋ １９−２３遺伝子（アクセッション番号ＡＪ２３５９６１）との相同性が明らかになった。
【図５Ａ】配列番号：１の重鎖核酸配列に対応するアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）をアミノ酸残基の上方に示す。
【図５Ｂ】配列番号：７の軽鎖核酸配列に対応するアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）をアミノ酸残基の上方に示す。
発明の背景
補体系は先天性免疫および適応免疫の両方に関与する（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ， Ｈ．Ｊ．（１９８８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７、３２１〜３４７；Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｍ．Ｃ．（１９９８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １６、５４５〜５６８；Ｆｅａｒｏｎら（１９９５）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １３、１２７〜１４９）。血清補体または補体受容体の特定の成分（例えば、ＣＤ２１／ＣＤ３５）が欠損したマウスを用いた最近の研究により、補体に関する既知の多くの役割が確認されただけでなく、自然免疫および適応免疫における重要な機構に対する新たな解明の糸口も得られている（Ｃａｒｒｏｌｌ， ＭＣ．（１９９８）前記）。例えば、Ｔ依存性抗原に対する記憶応答の発生を補体が増強する機序の一つは、ＣＤ２１／ＣＤ１９／Ｔａｐａ−１補助受容体を介して胚中心（ＧＣ）のＢ細胞における生存シグナルを媒介することによる。また、欠損マウスは古典経路が障害の誘導に不可欠であることを特定するという重要な点を確かめる上でも重要なものとなっている（Ｗｅｉｓｅｒら（１９９６）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５７〜１８６４）。
【０００２】
虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害とは、低酸素組織の再灌流後にみられる内皮および下層の実質組織に対する炎症性障害のことを指す。これは、例えば心筋、中枢神経系、後肢および腸を含む、種々の組織に対する急性障害および慢性障害の両方の原因となる一般的な症候群である。虚血再灌流障害は壊死および非可逆的細胞障害を引き起こす恐れがある。例えば、虚血性骨格筋の再灌流は透過性亢進型水腫を伴う血管漏出を特徴とする内皮細胞障害を引き起こし（Ｗｅｉｓｅｒら（１９９６）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５７〜１８６４）、小腸の再灌流は粘膜の損傷を招く（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９３８〜９４２）。一般に、虚血期間が長いほど炎症反応が顕著である。Ｉ／Ｒ障害の程度は、虚血領域の大きさおよび具体的な罹患組織などの要因によっても決定される（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．、９３８〜９４２）。
【０００３】
Ｉ／Ｒ障害を主に媒介するのは補体系である。ワイズマン（Ｗｅｉｓｍａｎ）らは、ラット心臓モデルにおいて補体Ｃ３ｂ（ｓＣＲ１）の可溶性阻害物質を用いて、Ｉ／Ｒ障害を部分的に阻止するための機構を報告している（Ｗｅｉｓｍａｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９、１４６〜１５１）。可溶性ＣＲ１受容体は、Ｃ３転換酵素、すなわち自然状態のＣ３を活性Ｃ３ｂ型に変換する酵素複合体を不活性化するのに非常に有効である。ＣＲ１受容体は、第Ｉ因子によるＣ３ｂの切断および転換酵素からのＣ３ｂの転位の両方において補助受容体としての役割を果たす。マウスに対して虚血誘導前にｓＣＲ１の静脈内注射を行ったところ、投与したマウスの再灌流後の障害は著しく軽減された。投与したマウスの組織検査により、心筋内の補体沈着レベルおよび組織障害の程度の低下が判明した（Ｗｅｉｓｍａｎら（１９９０）前記）。下肢障害モデルのマウスに対するｓＣＲ１の前投与でも同様の結果が得られた（Ｈｉｌｌら（１９９２）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９、１７２３〜１７３０）。このモデルでは、下肢に駆血帯を装着することによって下腿部に対する血流を約２時間にわたり遮断した。組織への血流を回復させる前に、マウスに対して透過性のマーカーとして放射性ヨウ化アルブミンの静脈内投与を行った。
【０００４】
これらの試験により、障害が補体によって媒介されることは確定したものの、彼らは障害の発生機序という問題には取り組まなかった。ワイザー（Ｗｅｉｓｅｒ）らは、抗体の欠損したマウスが後肢モデルにおいて障害から部分的に防御されることを示した。正常マウス血清を再構成することによって障害が再び生じた。ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）らはこの観察所見を小腸モデルにまで拡大適用させ、抗体欠損マウスにおける障害を再生させるには精製ＩｇＭで十分であることを示した。
【０００５】
発明の概要
本発明は一部には、虚血特異的抗原を認識する病原性免疫グロブリン（Ｉｇ）、特に病原性ＩｇＭの同定に基づく。理論に拘束されるものではないが、これらの病原性ＩｇＭと虚血特異的抗原との結合は特に補体経路の活性化を誘発し、これは最終的には再灌流障害または虚血障害を引き起こすと考えられている。本出願者らは、病原性ＩｇＭが、本明細書で「Ｂ−１細胞」と称するＢ細胞のサブポピュレーションによって産生されることも見いだした。
【０００６】
したがって、本発明は、対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、障害が抑制または軽減されるように、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質の有効量を対象に投与し、それによって虚血特異的抗原と結合した病原性免疫グロブリンの数を減少させることを含む方法を特徴とする。
【０００７】
好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は、例えば脳卒中として、自然に発生した発作の後に結果として生じる。再灌流障害または虚血障害は外科的処置の最中および／または後に生じることもある。障害の原因となる外科的処置の例には、血管形成術、ステント処置、アテローム切除術およびバイパス手術からなる群から選択される血管矯正技術が含まれる。好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は心血管組織（例えば心臓）において生じる。
【０００８】
好ましくは、本発明の阻害物質は、以下の活性の１つまたは複数により、病原性免疫グロブリンと拮抗する：（ｉ）病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉ）病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉｉ）例えば免疫グロブリンの隔離および／もしくはその分解のターゲティングにより、病原性免疫グロブリンを中和する；または（ｉｖ）病原性免疫グロブリンの産生を阻害もしくは抑制する、例えば病原性抗体の合成、集合および／もしくは翻訳後修飾を阻止する。阻害物質は、タンパク質もしくはペプチド；低分子；抗体もしくはその断片、例えば抗イディオタイプ抗体；糖質；または糖タンパク質であってよい。別の好ましい態様において、阻害物質は本明細書に記載する改変抗体でもよい。好ましい態様において、阻害物質は１回、あるいは数時間、数日、数週、数カ月または数年という期間にわたる連続的な曝露として投与される。阻害物質は、障害の原因となる自然発生性の発作の前、最中および／または後のいずれに投与してもよい。また、阻害物質を外科的処置、例えば再灌流障害または虚血障害を招くことのある外科的処置の前、最中および／または後に投与することもできる。好ましい態様では、阻害物質を、他の治療薬、例えば抗凝固薬、補体阻害物質と組み合わせて投与する。
【０００９】
もう１つの局面において、本発明は、対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、障害が抑制または軽減されるように、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質の有効量を対象に投与し、それによって補体活性を活性化する病原性免疫グロブリンの数を減少させることを含む方法を特徴とする。
【００１０】
好ましい態様において、病原性免疫グロブリンはＩｇＭまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３）である。好ましくは、病原性免疫グロブリンはＩｇＭであり、より好ましくはＩｇＭのサブクラスである。別の好ましい態様において、病原性免疫グロブリンはＢ細胞のサブポピュレーション、例えばＢ−１細胞によって産生されるか、または病原性免疫グロブリンはＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号（ｐａｔｅｎｔ ｄｅｐｏｓｉｔ ｎｕｍｂｅｒ）ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される。病原性免疫グロブリンは、配列番号：２に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号：８に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有しうる。好ましい態様において、虚血特異的抗原は内皮細胞および／または実質組織の表面に存在する。
【００１１】
好ましい態様において、補体経路は補体の古典経路であり、補体経路の成分はＣ１分子またはそのサブユニット（例えば、Ｃ１ｑ）でありうる。もう１つの態様において、対象は哺乳動物、例えばげっ歯動物（例えば、マウス）または霊長動物（例えば、ヒト）である。
【００１２】
好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は、例えば脳卒中として、自然に発生した発作の後に結果として生じる。再灌流障害または虚血障害は外科的処置の最中および／または後に生じることもある。障害の原因となる外科的処置の例には、血管形成術、ステント処置、アテローム切除術およびバイパス手術からなる群から選択される血管矯正術が含まれる。好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は心血管組織（例えば心臓）において生じる。
【００１３】
好ましくは、本発明の阻害物質は、以下の活性の１つまたは複数により、病原性免疫グロブリンと拮抗する：（ｉ）病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉ）病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉｉ）例えば免疫グロブリンの隔離および／もしくはその分解のターゲティングにより、病原性免疫グロブリンを中和する；または（ｉｖ）病原性免疫グロブリンの産生を阻害もしくは抑制する、例えば病原性抗体の合成、集合および／もしくは翻訳後修飾を阻止する。阻害物質は、タンパク質もしくはペプチド；低分子；抗体もしくはその断片、例えば抗イディオタイプ抗体；糖質；または糖タンパク質でありうる。別の好ましい態様において、阻害物質は本明細書に記載する改変抗体でありうる。好ましい態様において、阻害物質は１回、または数時間、数日、数週、数カ月もしくは数年という期間にわたる連続的な曝露として投与される。阻害物質は、障害の原因となる自然発生性の発作の前、最中および／または後のいずれに投与してもよい。また、阻害物質を外科的処置、例えば再灌流障害または虚血障害を招くことのある外科的処置の前、最中および／または後に投与することもできる。好ましい態様では、阻害物質を、他の治療薬、例えば抗凝固薬、補体阻害物質と組み合わせて投与する。
【００１４】
もう１つの局面において、本発明は、対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、病原性免疫グロブリン、例えば本明細書に記載の病原性ＩｇＭ、および／もしくは病原性免疫グロブリンを産生するＢ細胞（例えば、本明細書に記載のＢ−１細胞）を対象から除去し、またはそれを不活性化し、それによって対象に存在する病原性免疫グロブリンおよび／またはＢ細胞の量を減らすことを含む方法を特徴とする。
【００１５】
好ましい態様において、除去または不活性化の段階はエクスビボで行われる。１つの態様において、病原性免疫グロブリンまたはＢ細胞は血液灌流によって除去可能である。さらにもう１つの態様において、Ｂ細胞はＢ細胞特異的抗体（例えば、抗Ｂ−１抗体または抗ＣＤ５抗体または抗ＣＤ１１Ｇ／ＣＤ１８）を用いて除去しうる。病原性免疫グロブリン、例えばＩｇＭは、対象からの血液を固定化抗原（例えば、虚血特異的抗原）または固定化した抗イディオタイプ抗体と接触させることによって除去しうる。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンの除去または不活性化の段階は、抗イディオタイプ抗体を対象に投与することによって行われる。もう１つの態様において、Ｂ細胞の除去または不活性化の段階は、Ｂ細胞標的指向性部分（例えば、抗体もしくはその抗原結合断片、または抗原）を毒素、例えばリシンまたはジフテリア毒素と結合させたものを対象に投与することによって行われる。好ましい態様において、対象は哺乳動物、例えばげっ歯動物（例えば、マウス）または霊長動物（例えば、ヒト）である。好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は、例えば脳卒中として、自然に発生した発作の後に結果として生じる。除去の段階は、自然発生性の発作から数分以内、１〜５時間以内、５〜１０時間以内、１０〜２０時間以内、１〜５日以内に行うことが好ましい。好ましい態様において、再灌流障害または虚血障害は心血管組織（例えば心臓）において生じる。
【００１６】
もう１つの局面において、再灌流障害または虚血障害は、外科的処置の前、最中および／または後に病原性免疫グロブリンおよび／またはＢ細胞を対象から除去することによって予防および／または軽減される。例えば、除去の段階は、外科的処置の少なくとも１〜５時間前、５〜１０時間前、１０〜２０時間前、または１、２もしくは３日前に行うことができる。また、除去の段階を外科的処置の最中および後に適した期間にわたって継続することもできる。もう１つの局面において、本発明は、単離された病原性免疫グロブリン、例えば本明細書に記載の病原性ＩｇＭを特徴とする。好ましくは、病原性免疫グロブリンは以下の特性のうち１つまたは複数を有する：（ｉ）虚血特異的抗原との相互作用が可能である；（ｉｉ）補体を固定することができる；（ｉｉｉ）Ｂ細胞のサブポピュレーションによって産生される。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンはＢ細胞のサブポピュレーション、例えばＢ−１細胞によって産生される。もう１つの態様において、病原性免疫グロブリンは、ＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される。病原性免疫グロブリンは、配列番号：８に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有しうる。もう１つの態様において、病原性免疫グロブリンは、配列番号：２に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有しうる。もう１つの態様において、病原性免疫グロブリンは、内皮細胞の表面に存在する虚血特異的抗原と相互作用する（例えば、結合する）。
【００１７】
もう１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリン（例えば本明細書に記載の病原性ＩｇＭ）を特徴とする。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンは虚血特異的抗原と相互作用する（例えば、結合する）。病原性免疫グロブリンは、補体を活性化する能力の低いことを特徴としうる。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンは、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を有する。例えば、補体の結合および／または活性化に関与するアミノ酸残基の１つまたは複数が変異している。好ましい態様において、ＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される病原性免疫グロブリンである病原性免疫グロブリン。他の態様において、病原性抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域またはその断片を有する。他の態様において、病原性抗体は、配列番号：１０の少なくともＣＤＲ１領域もしくはその抗原結合部分；および／または配列番号：１２の少なくとも１つのＣＤＲ２領域もしくはその抗原結合部分を含む。好ましくは、病原性抗体は少なくとも、配列番号：１０のＣＤＲｌ領域および配列番号：１２のＣＤＲ２領域、またはそれらの抗原結合部分を含む。もう１つの態様において、病原性抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはその断片を含む。他の態様において、病原性抗体は、配列番号：４の少なくともＣＤＲ１領域もしくはその抗原結合部分、および／または配列番号：６の少なくとも１つのＣＤＲ２領域もしくはその抗原結合部分を含む。好ましくは、病原性抗体は少なくとも、配列番号：４のＣＤＲ１領域および配列番号：６のＣＤＲ２領域、またはそれらの抗原結合部分を含む。
【００１８】
もう１つの態様において、病原性抗体またはその抗原結合部分は、配列番号：８に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域またはその抗原結合断片、および配列番号：２に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域またはその抗原結合断片を含む。病原性抗体は、虚血特異的抗原に対する結合親和性が、ＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される病原性抗体の結合親和性と同程度である、例えばそれよりも高い、低いまたは等しい、ヒト抗体でありうる。もう１つの態様において、病原性抗体は非ヒト抗体、例えばウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタまたはウサギのものでありうる。好ましくは、非ヒト抗体はマウス抗体である。病原性抗体が組換え抗体であってもよい。好ましい態様において、病原性抗体はヒト化抗体である。もう１つの態様において、単離された病原性免疫グロブリンは、ＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される免疫グロブリンと同じ抗原特異性を有する。
【００１９】
もう１つの局面において、本発明は、虚血特異的抗原を単離するための方法であって、病原性免疫グロブリン（例えば本明細書に記載の病原性ＩｇＭ）を提供すること、虚血特異的抗原を含む試料、例えば生化学的単離物（例えば、内皮細胞単離物）またはタンパク質の集成物（例えば、発現ライブラリー）を病原性免疫グロブリンと、病原性免疫グロブリンと試料との特異的結合が可能な条件下で接触させること、対照と比較して病原性抗体と試料との結合レベルの変化を検出することであって、試料の存在下における病原性免疫グロブリンの結合レベルに対照で検出されたものと比べて変化があることによって特異的結合が示されるような検出、および虚血特異的抗原を試料から単離すること、例えば精製することを含む方法を特徴とする。好ましい態様において、試料は虚血特異的抗原を豊富に含み、例えばこれは再灌流障害または虚血障害のある対象（例えば、ヒト患者）から得られるものである。他の態様において、試料は生化学的単離物、例えば内皮組織、または発現ライブラリー、例えば内皮組織由来のライブラリーである。好ましい態様では、接触の段階はインビトロで行われる。
【００２０】
もう１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭと、虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質を１つまたは複数の（例えば、多数の）被験化合物から同定するための方法であって、病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原（例えば、再灌流障害または虚血障害のある対象（例えば、ヒト患者）から採取した内皮組織または可溶化物）を、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下で含む反応混合物を提供すること、病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原を１つまたは複数の被験化合物（例えば、コンビナトリアルライブラリーの構成要素）と接触させること、ならびに被験化合物の非存在下において検出されたものと比べて、所定の被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合の変化を検出することを含み、被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合レベルに被験化合物の非存在下において検出されたものと比べて変化（例えば、低下）があることによって、被験化合物が病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質であることが示されるような方法を特徴とする。好ましい態様において、接触の段階はインビボで行われる。本方法はさらに、病原性免疫グロブリンを１つまたは複数の被験化合物によって前処理することを含みうる。続いて、前処理した病原性免疫グロブリンを、病原性免疫グロブリンが欠損したマウスに注入することができる。
【００２１】
もう１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭと、補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質を１つまたは複数の（例えば、多数の）被験化合物から同定するための方法であって、病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下で含む反応混合物を提供すること、病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を１つまたは複数の被験化合物（例えば、コンビナトリアルライブラリーの構成要素）と接触させること、ならびに被験化合物の非存在下において検出されたものと比べて、所定の被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合の変化を検出することを含み、被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合レベルに被験化合物の非存在下において検出されたものと比べて変化（例えば、低下）があることによって、被験化合物が病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質であることが示されるような方法を特徴とする。好ましい態様において、病原性免疫グロブリンは本明細書に記載の病原性ＩｇＭであり、虚血特異的抗原は再灌流障害または虚血障害のある対象（例えば、ヒト患者）から採取した内皮組織または可溶化物から得られる。もう１つの態様において、本方法はインビトロで行われる。好ましい態様では、病原性免疫グロブリンまたは虚血特異的抗原のいずれか（または両方）を、検出可能なシグナル、例えば、蛍光団、比色定量用酵素、放射性同位体、発光性化合物などによって標識する。本方法はさらに、少なくとも１つの段階、例えば接触の段階を、ライブラリーの第２の構成要素または次の１つもしくは複数の構成要素を用いて反復することを含む。好ましい態様では、多数の被験化合物、例えば、ライブラリーの複数の構成要素の試験を行う。多数の被験化合物、例えばライブラリーの構成要素は、少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７種または１０８種の化合物を含みうる。好ましい態様において、多数の被験化合物、例えばライブラリーの構成要素は、共通の構造的または機能的な特徴を有する。被験化合物はペプチドまたは有機低分子でありうる。もう１つの態様において、補体経路は補体の古典経路である。好ましい態様において、補体経路の成分はＣ１分子またはそのサブユニット（例えば、Ｃ１ｑ）である。
【００２２】
もう１つの局面において、本発明は、病原性ＩｇＭ抗体またはその断片をコードする単離された核酸を特徴とする。好ましい態様において、単離された核酸は配列番号：８の軽鎖可変領域をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：１０のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域またはその抗原結合部分をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：１２のＣＤＲ２を含む軽鎖可変領域またはその抗原結合部分をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：１０のＣＤＲ１を含む軽鎖可変領域またはその抗原結合部分、および配列番号：１２のＣＤＲ２またはその抗原結合部分をコードする。好ましい態様において、本核酸は、マウス由来、ヒト由来またはマウスおよびヒトのアミノ酸配列の組み合わせである軽鎖可変領域をコードする。例えば、本核酸は、配列番号：１０のＣＤＲ１および／または配列番号：１２のＣＤＲ２、ならびにヒトフレームワーク配列を含む軽鎖可変領域をコードしうる。
【００２３】
さらに他の好ましい態様において、単離された核酸は配列番号：２の重鎖可変領域をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：４のＣＤＲ１を含む重鎖可変領域またはその抗原結合部分をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：６のＣＤＲ２を含む重鎖可変領域またはその抗原結合部分をコードする。別の好ましい態様において、核酸配列は、配列番号：４のＣＤＲ１を含む重鎖可変領域またはその抗原結合部分、および配列番号：６のＣＤＲ２またはその抗原結合部分をコードする。好ましい態様において、本核酸は、マウス由来、ヒト由来またはマウスおよびヒトのアミノ酸配列の組み合わせである軽鎖可変領域をコードする。例えば、本核酸は、配列番号：４のＣＤＲ１および／または配列番号：６のＣＤＲ２、ならびにヒトフレームワーク配列を含む重鎖可変領域をコードしうる。さらにもう１つの態様において、単離された核酸は、配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域の両方を含む。
【００２４】
もう１つの局面において、本発明は、単離された核酸分子およびその断片を特徴とする。好ましい態様において、単離された核酸分子は配列番号：７の軽鎖ヌクレオチド配列を含む。もう１つの態様において、核酸分子は、配列番号：９の軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列またはその一部分を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号：１１の軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列またはその部分を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は配列番号：９の軽鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列またはその一部分、および配列番号：１１の軽鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列またはその部分を含む。軽鎖配列、例えば配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１またはそれらの組み合わせを含む本発明の核酸分子には、それらに対する配列同一性が７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であるヌクレオチドが含まれる。さらに、軽鎖配列、例えば配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１またはそれらの組み合わせを含む本発明の核酸分子には、ストリンジェントな条件下（例えば低い、中程度、高いまたは極めて高いストリンジェンシーの条件下）でそれらとハイブリダイズするヌクレオチドが含まれる。
【００２５】
もう１つの態様において、本発明は、軽鎖ポリペプチド、例えば配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２の軽鎖ポリペプチドをコードする核酸分子との配列同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％である核酸分子を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、病原性抗体の軽鎖可変領域またはその部分、例えば配列番号：８、配列番号：１０および配列番号：１２の軽鎖可変領域をコードする核酸配列とハイブリダイズする核酸分子を特徴とする。
【００２６】
さらに他の好ましい態様において、核酸分子は配列番号：１の重鎖ヌクレオチド配列を含む。もう１つの態様において、核酸分子は、配列番号：３の重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列またはその一部分を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号：５の重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列またはその一部分を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、配列番号：３の重鎖ＣＤＲ１ヌクレオチド配列またはその一部分、および配列番号：５の重鎖ＣＤＲ２ヌクレオチド配列またはその一部分を含む。重鎖配列、例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５またはそれらの組み合わせを含む本発明の核酸分子には、それらとの配列同一性が７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であるヌクレオチドも含まれる。さらに、軽鎖配列、例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５またはそれらの組み合わせを含む本発明の核酸分子には、ストリンジェントな条件下、例えば低い、中程度、高いまたは極めて高いストリンジェンシーの条件下でそれらとハイブリダイズするヌクレオチドが含まれる。
【００２７】
もう１つの態様において、本発明は、重鎖ポリペプチド、例えば配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６の重鎖ポリペプチドをコードする核酸分子との配列同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％である核酸分子を特徴とする。もう１つの態様において、本発明は、病原性抗体の重鎖可変領域またはその部分、例えば、配列番号：２、配列番号：４および配列番号：６の重鎖可変領域をコードする核酸分子とハイブリダイズする核酸分子を特徴とする。
【００２８】
もう１つの局面において、本発明は単離されたポリペプチドおよびその断片を特徴とする。 好ましい態様において、単離されたポリペプチドは、例えば、配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２またはそれらの断片もしくは組み合わせ；または配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６またはそれらの断片もしくは組み合わせであるアミノ酸配列を含む。本発明のポリペプチドには、配列番号：８、配列番号：１０もしくは配列番号：１２；または配列番号：２、配列番号：４もしくは配列番号：６との差異が少なくとも２０、１０、５、４、３、２または１アミノ酸であるがそれを上回ることはないポリペプチドが含まれる。好ましいポリペプチドは、生物活性、例えば虚血特異的抗原との結合能および／または補体との結合能を保っているポリペプチドである。もう１つの態様において、ポリペプチドには、軽鎖可変領域またはその部分、例えば配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２の軽鎖可変領域ポリペプチドとの配列同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であるポリペプチドが含まれる。もう１つの態様において、ポリペプチドには、重鎖可変領域またはその部分、例えば配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６の重鎖可変領域ポリペプチドとの配列同一性が少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％および９９％であるポリペプチドが含まれる。もう１つの態様において、本発明は、配列番号：８および配列番号：２のアミノ酸配列を含み、ＩＲＥＳ配列をさらに含むポリペプチドを特徴とする。
【００２９】
もう１つの局面において、本発明は、配列番号：８、配列番号：１０もしくは配列番号：１２またはそれらの断片もしくは組み合わせ；または配列番号：２、配列番号：４もしくは配列番号：６またはそれらの断片もしくは組み合わせをコードする本発明の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。好ましい態様において、発現ベクターは、配列番号：８のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体軽鎖またはその一部分をコードする核酸分子；および配列番号：２のアミノ酸配列を含む可変領域を有する抗体重鎖またはその一部分をコードするヌクレオチド配列を含む。もう１つの局面において、本発明は、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましい態様において、宿主細胞は少なくとも１つもしくは２つまたはそれ以上の発現ベクター、すなわち軽鎖、例えば配列番号：８またはその一部分をコードする１つの発現ベクターおよび重鎖、例えば配列番号：２またはその一部分をコードする１つの発現ベクターを含みうる。もう１つの態様において、宿主細胞は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の両方を発現しうる発現ベクターを含みうる。本明細書で用いる「ベクター」という用語は、それと結合した別の核酸を輸送しうる核酸分子のことを指し、これにはプラスミドベクター、コスミドベクターまたはウイルスベクターが含まれうる。ベクターは自律複製を行うことができるか、または宿主ＤＮＡの中に組み込まれうる。ウイルスベクターには例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれる。
【００３０】
本明細書に記載の方法を用いて同定される、病原性免疫グロブリン／虚血抗原および／または病原性免疫グロブリン／補体成分の相互作用に対する阻害物質も本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
発明の詳細な説明
本発明は一部には、虚血特異的抗原を認識する病原性免疫グロブリン（Ｉｇ）、特に病原性ＩｇＭの同定に基づく。これらの病原性ＩｇＭと虚血特異的抗原との結合は特に補体経路の活性化を誘発し、これは最終的には再灌流障害または虚血障害を引き起こすと考えられている。また本出願者らは、病原性ＩｇＭが、本明細書で「Ｂ−１細胞」と称するＢ細胞のサブポピュレーションによって産生されることも見いだした。したがって、本発明は、対象における、病原性免疫グロブリン、例えば病原性ＩｇＭによって引き起こされる再灌流後の組織障害を治療または予防するために有用な方法および組成物を提供する。
【００３２】
本発明をさらに説明する前に、明細書、実施例および添付する請求の範囲において用いる特定の用語を、便宜を図るためにここにまとめる。
【００３３】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は本明細書で互換的に用いられる。
【００３４】
本明細書で用いる「免疫グロブリン」（または略語形の「Ｉｇ」）および「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって互いに連結した少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質のことを指す。各重鎖は、１つの重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略記する）および１つの重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域はＣＨ１、ＣＨ２およびＣＲ３という３つのドメインから構成されるか、またはＩｇＭの場合には４つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から構成される。各軽鎖は１つの軽鎖可変領域および１つの軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域はＣＬという１つの領域から構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域が、より保存性の高いフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域の間に散在するものとして細分することができる。各々のＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって次の順序に並んだ３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域が、免疫グロブリンと、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子との結合を媒介することもある。
【００３５】
主な重鎖の種類にはα、β、ε、γおよびμと呼ばれる５つのものがあり、ｇ鎖はさらにγ１、γ２、γ３およびγ４に細分され、α鎖はα１およびα２に細分される。２つの代替的な軽鎖の種類はκおよびλと呼ばれる。重鎖の存在により、免疫グロブリンの主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが生じる。ＩｇＧはさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４のサブクラスに細分することができ、ＩｇＡはＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラスに細分することができる。
【００３６】
本明細書で用いる「免疫グロブリンＭ」または「ＩｇＭ」という用語は、５つのＩｇＭ単量体がＪ鎖によって連結した五量体のことを指す。単量体ＩｇＭ分子は、上記の免疫グロブリン分子と同じ基本構造を有する。ＩｇＭは抗体産生反応において合成される最初の免疫グロブリンである。これは五量体であるために多くの機能ドメインを有しており、このため、補体の強力な活性化物質である。
【００３７】
「病原性免疫グロブリン」という用語は、再灌流後の組織障害を媒介する上記の免疫グロブリン分子のことを指す。１つの態様において、病原性免疫グロブリンは、例えば内皮細胞表面または実質組織上に存在する抗原（例えば、虚血特異的抗原）との結合により、内皮表面または実質組織に局在してもよい。内皮表面または実質組織表面に局在すると、病原性免疫グロブリンは免疫細胞（例えば、エフェクター細胞）または古典的補体系の成分、例えばＣ１ｑの結合を媒介し、これによって組織障害を誘発する可能性がある。抗体は、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧＩ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＡ．ｓｕｂ．ｓｅｃ、ＩｇＤ、またはＩｇＥを含む、種々のアイソタイプのものでありうる。病原性免疫グロブリンは、補体の活性化物質である抗体アイソタイプであることが好ましい。好ましくは、病原性免疫グロブリンはＩｇＭである。病原性免疫グロブリンは好ましくは完全長である（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３）抗体）。
【００３８】
本明細書で用いる、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」または「断片」）という用語は、抗原（例えば、標的抗原、例えば、虚血抗原）と特異的に結合する能力を保っている、抗体の１つまたは複数の断片のことを指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例には、（ｉ） ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）２つのＦａｂ断片がヒンジ領域でジスルフィド結合によって結合したものを含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）１つのＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４〜５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によってコードされるものの、それらを組換え法を用いて、ＶＬ領域およびＶＨ領域の対が一価分子を形成した一本鎖タンパク質として作製することを可能にする合成リンカーによって連結することもできる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３〜４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９〜５８８３を参照）。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語の範囲に含まれるものとする。これらの抗体断片は当業者に知られた従来の技法を用いて得られ、断片の有用性に関するスクリーニングは完全な抗体と同じ様式で行われる。
【００３９】
本明細書で用いる「再灌流」とは、例えば虚血の場合のように、血流の狭窄または閉塞の後に血管内の血流が再開することを指す。
【００４０】
「虚血再灌流」という用語は、虚血組織の再灌流後に起こる急性炎症反応のことを指す。再灌流は、脳卒中などの自然発生性の発作の後、または血管内の血流を意図的に遮断する外科的処置の最中に生じうる。血管の狭窄または閉塞は、例えば、血管内の血流を遮断する血塊の結果として誘発されることがある。このような状況では内皮の完全性が損なわれ、その結果として凝固カスケードが始まり、新たな塊が生じて、最初に塊が閉塞した部分の下流のより細い毛細血管に詰まる可能性がある。組織障害が起こるのはこの血流再開時である。
【００４１】
「免疫グロブリンを介した再灌流障害」とは、免疫グロブリン、例えば病原性免疫グロブリンによって直接的または間接的に媒介される、内皮の完全性の破壊のことを指す。理論に拘束されるものではないが、虚血時には新たな抗原（例えば、虚血特異的抗原）が内皮細胞表面に発現または露出されると考えられている。これらの新たな抗原はその後、障害部位の付近に蓄積した病原性免疫グロブリンによって認識される。この局在性の免疫グロブリンは、例えばエフェクター細胞機能または補体経路の活性化により、内皮組織障害を誘発しうる。
【００４２】
本明細書で用いる「虚血」という用語は、臓器または組織への血流の一時的または永続的な欠乏のことを指す。心血管組織では、虚血によって少なくとも２つの心疾患―狭心症および急性心筋梗塞（心発作）が生じる可能性がある。心筋にかかわる虚血は、アテローム性動脈硬化または攣縮などの冠動脈疾患の結果として生じることが典型的である。「虚血障害」という用語は、組織または臓器への血流の一時的または永続的な欠乏によって生じる、例えば組織または臓器における、内皮の完全性の破壊のことを指す。
【００４３】
本明細書で用いる「虚血特異的抗原」という用語は、内皮細胞の表面に存在する抗原のことを指す。虚血特異的抗原は、発作、例えば虚血発作に対する反応として発現または露出されることが好ましい。
【００４４】
本明細書で用いる「Ｂ−１細胞」とは、病原性免疫グロブリンを産生するＢ細胞のサブポピュレーションのことを指す。一般にＢ−１細胞はＩｇＤおよびＣＤ２３を低レベルで発現し、これらの細胞のかなりの割合は細胞表面タンパク質ＣＤ５を発現する（Ｈａｒｄｙら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １３７、９１；Ｋａｎｔｏｒら（１９９３）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１、５０１〜５３８）。それらは一般に腹膜組織および腸間膜組織に存在し、少なくともマウスでは循環しないように思われる（Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ９３：８１〜１０２；Ｍａｒｔｉｎら、Ｃｕｒ Ｏｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：１９５〜２０１）。通常のＢ細胞とは異なり、それらは体細胞超変異および親和性成熟を起こさない。それらは胎児および新生児の発生期間中に生じるようにと思われ、成体骨髄を移植しても容易には再生しない。これらの細胞はさらに、末梢リンパ節および脾臓における頻度が低いこと、ならびに腹腔に主として局在することによっても識別できる。
【００４５】
「補体」という用語は、２０種を上回るタンパク質（調節因子を含む）から構成されるタンパク質カスケードのことを指す。血液凝固系と同様に、この系の活性化により、プロ酵素がタンパク質分解によって逐次的に活性化されて、細胞表面受容体のリガンド、強力な生理活性ペプチド、および細胞膜に介入して細胞死を招く最終段階複合体が生成される一連のイベントが開始される。その中心的な成分は第三成分すなわちＣ３である。これは３つの異なる経路、すなわち古典経路、レクチン経路または第二経路によって活性化されうる（Ｒｅｉｄら（１９８１）Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ． １５：３０７〜３２６；Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ（１９８８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：３２１〜３４７）。
【００４６】
ある態様において、病原性免疫グロブリンは古典補体経路を介して作用しうる。古典経路は、免疫複合体を形成する抗原と抗体との相互作用によって活性化される。抗体は、自らの抗原と反応した後にのみ、補体との結合または「固定」が可能である。この複合体の形成によって抗体分子のコンフォメーション変化が誘発され、補体第一成分Ｃ１の結合部位が露出される。Ｃ１は、Ｃ１ｑと命名された３種のポリペプチドの鎖がそれぞれ６本ずつ、ならびに各２本ずつのＣ１ｓおよびＣ１ｒから構成される多量体化合物である。６本のＣ１ｑ鎖はそれ自体で「束」状に配列し、４本のＣ１ｒおよびＣ１ｓ分子はカルシウム依存的な相互作用によって結合する。抗体がＣ１ｑの２つまたはそれ以上の頭部に結合すると、Ｃ１ｒが切断されて活性型Ｃ１ｒ分子が生じ、それがＣ１ｓを切断する。Ｃ１ｓは次の補体成分Ｃ４を、反応プロセスを継続させるＣ４ｂ、およびＣ４ａに切断することによって活性化プロセスを進展させる。Ｃ４のＣ４ｂへの切断によって内部チオエステル結合が露出され、これは水分子の結合によって速やかに不活性化されるが、それが起こらない場合にはこれは細胞表面タンパク質または炭水化物と共有結合を形成することができる。これが起こるとＣ４ｂは比較的安定となり、マグネシウム依存的な反応によってＣ２と結合する。続いてＣ２はＣ１ｓによって切断され、古典経路Ｃ３転換酵素として知られる複合体Ｃ４ｂ２ａを形成する。Ｃ３はＣ４と類似した分子であり、内部チオエステル結合を有する。Ｃ３切断によって２つの断片が生じる。このうち小さい方であるＣ３ａには強力な生物特性がある。大きい方のＣ３ｂには、この分子とＣ４ｂ２ａとの結合を可能とする不安定な結合部位がある。Ｃ３ｂのＣ４ｂ２ａとの結合は、古典経路の最後の酵素であり、膜侵襲経路の成分であるＣ５を切断する古典経路Ｃ５転換酵素として知られるＣ４ｂ２ａ３ｂの生成をもたらす。
【００４７】
もう１つの態様において、病原性免疫グロブリンは補体第二経路を介して作用しうる。第二経路では、Ｃ３がＣ３ｂ、Ｃ３ｂＢおよびＣ３ｂＢｂを生じ、Ｃ３ｂＢｂが続いてＣ３を切断する。このプロセスは、活性酵素を細菌細胞壁上に安定化させた場合、またはより多くのＣ３ｂが古典経路によって生成された場合に加速される。これにより、第二経路Ｃ５転換酵素Ｃ３ｂＢｂ３ｂが生成される。
【００４８】
本明細書で用いる「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含むものとする。好ましいヒト動物には、虚血再灌流障害のあるヒト患者が含まれる。本発明の「非ヒト動物」または「非ヒト」には、すべての脊椎動物、例えば非ヒト霊長類、げっ歯動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などの哺乳動物および非哺乳動物が含まれる。
【００４９】
本明細書で用いる「阻害物質」とは、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用を（完全または部分的に）抑制もしくは遮断する；または病原性免疫グロブリンと補体経路の構成要素（例えばＣ１ｑ）との相互作用を抑制または遮断する、作用物質のことを指す。「相互作用」という用語は、２つまたはそれ以上の分子の物理的結びつき、例えば結合のことを指す。相互作用は直接的でも間接的でもよい。好ましくは、阻害物質は病原性免疫グロブリンの以下の活性のうち１つまたは複数と拮抗する：（ｉ）病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉ）病原性免疫グロブリンと補体経路の成分、例えばＣ１ｑとの相互作用（例えば、結合）を阻害もしくは抑制する；（ｉｉｉ）例えば免疫グロブリンの隔離および／もしくはその分解のターゲティングにより、病原性免疫グロブリンを中和する；または（ｉｖ）病原性免疫グロブリンの産生を阻害もしくは抑制する、例えば病原性抗体の合成、集合および／もしくは翻訳後修飾を阻止する。阻害物質は、タンパク質（例えば、抗体、例えば抗イディオタイプ抗体またはその断片など）、ペプチドまたは有機低分子でありうる。「阻害物質」および「作用物質」という用語は本明細書で互換的に用いられる。
【００５０】
本明細書で用いる、阻害物質の「有効量」とは、患者などの対象に対して単回投与または多回投与を行った場合に再灌流障害または虚血障害の軽減または除去に有効な、作用物質の量のことを指す。再灌流障害のこのような軽減または除去は、患者などの対象の生存期間がこのような治療を行わない場合に予想されるよりも延長すること、または対象の予後がこのような治療を行わない場合よりも改善されることに反映されうる。阻害物質を再灌流障害または虚血障害の治療（例えば、既存の障害の軽減または除去）のために用いることもでき、または予防（例えば、発現または再発の発生を遅らせること）のために用いることもできる。当業者は、疾患または障害の重症度、過去の治療、全般的健康状態および／または対象の年齢、ならびに存在する他の疾患を非制限的に含む特定の要因が、対象を効果的に治療するために必要な投与量および時期に影響を及ぼすことを認識していると考えられる。
【００５１】
本明細書で用いる「コンセンサス配列」という用語は、関連配列のファミリーにおいて最も高い頻度でみられるアミノ酸（またはヌクレオチド）から形成される配列のことを指す（例えば、Ｗｉｎｎａｋｅｒ、「遺伝子からクローンまで（Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ）」（Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ １９８７を参照）。タンパク質のファミリーにおいて、コンセンサス配列内の各位置は、そのファミリーでその位置に最も高い頻度でみられるアミノ酸によって占められる。２種のアミノ酸が同じ頻度でみられる場合には、そのいずれをコンセンサス配列に含めることもできる。「コンセンサスフレームワーク」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列におけるフレームワーク領域のことを指す。
【００５２】
本明細書で用いる「低ストリンジェンシー条件、中程度のストリンジェンシー条件、高ストリンジェンシー条件または極めて高いストリンジェンシーの条件の下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件のことを指す。ハイブリダイゼーション反応の実施に関する手引きは、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１〜６．３．６に記載があり、これは参照として組み入れられる。水系および非水系による方法がこの参考文献には記載されており、そのいずれを用いることもできる。本明細書で言及する具体的なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：１）低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、約４５℃の６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続いて、少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー条件の場合は洗浄時の温度を５５℃まで高めることができる）の０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２回の洗浄；２）中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、約４５℃の６Ｘ ＳＳＣに続いて、６０℃の０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回または複数回の洗浄；３）高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、約４５℃の６Ｘ ＳＳＣに続いて、６５℃の０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で１回または複数回の洗浄；および好ましくは、４）極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、６５℃の０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳに続いて、６５℃の０．２Ｘ ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中で１回または複数回の洗浄。極めて高いストリンジェンシーの条件（４）が好ましい条件であり、別に特定しない場合に用いるべきものである。
【００５３】
配列間の相同性または配列同一性（これらの用語は本明細書において互換的に用いられる）の算出は、以下の通りに行われる。
【００５４】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の一致率を決定するには、最適な比較がなされるように配列を整列化する（例えば、最適な整列化が得られるように、第１および第２のアミノ酸配列または核酸配列にギャップを挿入することができ、比較のために非相同配列を無視することができる）。好ましい態様において、比較のために整列化する参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％であり、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。続いて、対応するアミノ酸の位置またはヌクレオチドの位置でアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置を、第２の配列の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが占めている場合には、２つの分子はその位置で同一である（本明細書で用いる場合、アミノ酸または核酸の「同一性」は、アミノ酸または核酸の「相同性」と同義である）。
【００５５】
２つの配列間の一致率は、２つの配列の最適な整列化を行うために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた上で、２つの配列が共有する同一な位置の数の関数である。
【００５６】
配列の比較および２つの配列間の一致率の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。好ましい態様では、２つのアミノ酸配列の間の一致率を、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれているニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）およびブンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）（（１９７０）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４４〜４５３）のアルゴリズムを用い、ブロッサム６２行列（Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２ ｍａｔｒｉｘ）またはＰＡＭ２５０行列、およびギャップ加重（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）として１６、１４、１２、１０、８、６または４、長さ加重（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）として１、２、３、４、５または６を用いて決定する。さらに別の好ましい態様では、２つのヌクレオチド配列の間の一致率を、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、およびギャップ加重（ｇａｐ ｗｅｉｇｈｔ）として４０、５０、６０、７０または８０、長さ加重（ｌｅｎｇｔｈ ｗｅｉｇｈｔ）として１、２、３、４、５または６を用いて決定する。特に好ましいパラメーターのセット（別に特定しない場合に用いるべきもの）としては、ブロッサム６２スコア行列を、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４およびフレームシフトギャップペナルティ５で用いる。
【００５７】
２つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の間の一致率は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているマイヤーズ（Ｅ． Ｍｅｙｅｒｓ）およびミラー（Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ）のアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ、４：１１〜１７）を用い、ＰＡＭ１２０加重残基表（ｗｅｉｇｈｔ ｒｅｓｉｄｕｅ ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いて決定することができる。
【００５８】
病原性免疫グロブリンの阻害物質を同定するための方法
１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用または病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質を、１つまたは複数の（例えば、多数の）被験化合物から同定するための方法を提供する。阻害物質は、タンパク質（例えば、抗体またはその断片）；ペプチド；糖質；糖タンパク質；または有機低分子でありうる。
【００５９】
被験化合物のライブラリー
阻害物質は有機低分子、例えばコンビナトリアルライブラリーの構成要素でありうる。
【００６０】
１つの態様において、本発明は阻害物質のライブラリーを提供する。コンビナトリアルライブラリーの合成は当技術分野で周知であり、総説もなされている（例えば、Ｅ．Ｍ． Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．（１９９４）３７：１３８５〜１４０１；ＤｅＷｉｔｔ， Ｓ． Ｈ．；Ｃｚａｒｎｉｋ， Ａ． Ｗ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．（１９９６）２９：１１４；Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｒ． Ｗ．；Ｃｏｍｂｓ， Ａ． Ｐ．；Ｔｅｍｐｅｓｔ， Ｐ． Ａ．；Ｂｒｏｗｎ， Ｓ． Ｄ．；Ｋｅａｔｉｎｇ， Ｔ． Ａ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．（１９９６）２９：１２３；Ｅｌｌｍａｎ， Ｊ． Ａ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．（１９９６）２９：１３２；Ｇｏｒｄｏｎ， Ｅ． Ｍ．；Ｇａｌｌｏｐ， Ｍ． Ａ．；Ｐａｔｅｌ， Ｄ． Ｖ． Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．（１９９６）２９、１４４；Ｌｏｗｅ， Ｇ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｒｅｖ．（１９９５）３０９、Ｂｌｏｎｄｅｌｌｅら、Ｔｒｅｎｄｓ Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９５）１４：８３；Ｃｈｅｎら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：２６６１；米国特許第５，３５９，１１５号、第５，３６２，８９９号および第５，２８８，５１４号；ＰＣＴ公報・国際公開公報第９２／１００９２号、国際公開公報第９３／０９６６８号、国際公開公報第９１／０７０８７号、国際公開公報第９３／２０２４２号、国際公開公報第９４／０８０５１号を参照されたい）。
【００６１】
本発明の化合物のライブラリーは、さまざまな方法を用いて調製することができ、そのいくつかは当技術分野で知られている。例えば、「スプリットプール（ｓｐｌｉｔ−ｐｏｏｌ）」法を以下のようにして実施することができる：官能基を付与したポリマー性支持体のビーズを多数の反応容器内に入れる；固相ペプチド合成に適したさまざまなポリマー性支持体が知られており、そのいくつかは市販されている（例えば、Ｍ． Ｂｏｄａｎｓｋｙ「ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ（１９９３）を参照されたい）。ビーズのアリコートのそれぞれに対して種々の活性化アミノ酸溶液を添加し、反応を進行させて、多数の固定化したアミノ酸を各反応容器に１つずつ生成させる。続いて、誘導体化したビーズのアリコートを洗浄し、「プール」して（すなわち、まとめて）、ビーズのプールを再び分割し、各アリコートを別々の反応容器に入れる。続いて、ビーズの各アリコートに別の活性化アミノ酸を添加する。この合成サイクルを望ましいペプチド長が得られるまで繰り返す。各合成サイクルに添加するアミノ酸残基は無作為に選択することができる；または、抗体と相互作用しうる既知のペプチド、例えば抗イディオタイプ抗体の抗原結合部位との構造的類似性または相同性があることが知られた阻害物質を得るために、「偏りのある（ｂｉａｓｅｄ）」ライブラリー、例えば阻害物質の特定の部分が作為的に選択されたライブラリーが得られるようにアミノ酸を選択することもできる。非常に広範囲にわたるペプチド性、ペプチド模倣性または非ペプチド性の化合物が、この方法によって容易に生成されることは理解されるであろう。
【００６２】
この「スプリットスプール」法により、本発明の被験化合物のライブラリーの調製に用いうる、ペプチド、例えば阻害物質のライブラリーが得られる。もう１つの例示的な合成においては、ホッブス・デウィット（Ｈｏｂｂｓ ＤｅＷｉｔｔ）らの方法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９０：６９０９（１９９３））によって「ダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）ライブラリー」を作製する。ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）の「ティーバッグ（ｔｅａｂａｇ）」法（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４〜８６（１９９１））を含む他の合成法を、本発明による化合物のライブラリーを合成するために用いることもできる。
【００６３】
ライブラリーのいずれかの構成要素が望ましい活性を有するか否かを判定するため、および仮に有する場合にはそのような活性種を同定するために、化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングの方法は記載されている（例えば、Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、前記を参照）。受容体のリガンドを単離するのに適した受容体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって可溶性化合物のライブラリーをスクリーニングした後に、単離したリガンドを従来の技法（例えば、質量分析、ＮＭＲなど）によって同定することができる。固定化した化合物は、化合物を可溶性受容体と接触させることによってスクリーニングが可能である；可溶性受容体は、その検出によってリガンド結合が示される標識（例えば、蛍光団、比色定量用酵素、放射性同位体、発光性化合物など）と結合させることが好ましい。または、固定化した化合物を選択的に遊離させ、膜を通して拡散させて、受容体と相互作用させることもできる。本発明のライブラリーのスクリーニングに有用なアッセイの例は以下に述べる。
【００６４】
１つの態様では、本発明の化合物が病原性免疫グロブリンと相互作用する能力に関するスクリーニングを、例えば、標準的な９６穴マイクロタイタープレートなどのマルチウェルプレートの１つのウェル内で、被験化合物を免疫グロブリンおよび可溶化物、例えば内皮細胞可溶化物とインキュベートすることにより、各化合物が免疫グロブリンと直接結合する活性または免疫グロブリンと虚血抗原との相互作用を阻害する活性をアッセイすることによって行うことができる。この態様では、個々の化合物のそれぞれの活性を決定することができる。被験化合物を加えていない１つまたは複数のウェルを対照として用いうる。インキュベーションの後に各ウェルをアッセイすることにより、各被験化合物の活性を決定することができる。このようにして、多数の被験化合物の活性を平行して決定することが可能である。
【００６５】
タンパク質またはペプチドの阻害物質
タンパク質またはペプチドの阻害物質は、例えば、上記のコンビナトリアルシステムを用いて同定可能である。または、病原性免疫グロブリン、標的抗原または補体経路の成分のいずれかの断片またはペプチドを用いて、これらのタンパク質の間の相互作用を遮断することもできる。
【００６６】
「非必須」アミノ酸置換を含む、病原性免疫グロブリン、標的抗原または補体経路の成分のいずれかの断片またはペプチドの変種も本発明の範囲に含まれる。非必須アミノ酸置換とは、生物活性を消失させずに、または好ましくは実質的に変化させずに野生型配列を変更することであり、一方、「必須」アミノ酸残基はこのような変化を引き起こす。
【００６７】
「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されたもののことである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。このため、病原性免疫グロブリン内部の予想される非必須アミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーに属する別のアミノ酸残基によって選好的に置換することができる。または、もう１つの態様では、飽和変異誘発法などにより、病原性免疫グロブリンのコード配列の全体または一部に沿って変異を無作為に導入し、その結果得られた変異体を生物活性に関してスクリーニングすることができる。
【００６８】
もう１つの局面において、本発明は、例えばアゴニストまたはアンタゴニストとして機能する、改変された病原性免疫グロブリンも特徴とする。改変された病原性免疫グロブリンは、補体活性化に対するアンタゴニストとして機能することが好ましい。病原性免疫グロブリンの変種は、変異誘発、例えば離散的点変異、配列の挿入もしくは除去または病原性免疫グロブリンの切断によって作製することができる。病原性免疫グロブリンのアゴニストは、天然型のタンパク質と実質的に同じ生物活性、またはそのサブセットを保持しうる。病原性免疫グロブリンのアンタゴニストは、例えば、虚血特異的抗原との結合は可能であるが補体経路を活性化することはできないことにより、天然型の病原性免疫グロブリンの１つまたは複数の活性を阻害しうる。このように、機能が限定された変種を投与することにより、特定の生物学的作用を誘発させることができる。
【００６９】
１つの態様では、Ｃ１ｑと結合する病原性免疫グロブリン（例えば、病原性ＩｇＭ）内部の部位を変異させ、Ｃ１ｑと結合できないようにすることができる。例えば、Ｃ１ｑの結合部位を含むことが知られているＩｇＧのＣＨ２ドメインおよびＩｇＭのＣＨ４ドメインを変異させることが可能である（国際公開公報第９４／２９３５１号を参照）。例えば、Ｃ１ｑ結合およびその後の補体活性化を媒介すると思われるＩｇＧのＣＨ２ドメインのカルボキシル末端側の半分（残基２３１〜２３９、好ましくは２３４〜２３９の内部）を変異させることができる。別の例として、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）らは、ＩｇＭ定常領域ドメイン内の単一ヌクレオチドの変化により、抗体が補体依存性細胞溶解を惹起する能力を失うことを示した。この単一ヌクレオチドの変化は、第３の定常ドメイン内のアミノ酸位置４３６に正常なプロリン残基の代わりにセリン残基を生じさせる（Ｗｒｉｇｈｔら１９８８、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１１２２１）。補体結合性または活性を変化させる目的で抗体に加えることができるアミノ酸置換は当技術分野で周知である（例えば、Ｗｒｉｇｈｔら、１９８８、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３：１１２２１；Ｓｈｕｌｍａｎら（１９８６）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：７６７８〜７６８２；Ａｒｙａら（１９９４）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５３：１２０６〜１２１２；Ｐｏｏｎら（１９９５）Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：８５７１〜８５７７を参照されたい。これらのすべての内容は参照として本明細書に組み入れられる）。したがって、１つの態様において、本発明の抗体は補体結合性または活性を変化させる変異を有する。アミノ酸が付加、除去または置換された抗体を、本明細書では改変された抗体（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）または改変抗体（ａｌｔｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と呼ぶ。当業者には理解されると思われるが、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列にこのような変化を生じさせるために用いられる方法は、求める結果に応じてさまざまであると考えられる。
【００７０】
病原性免疫グロブリンの変種は、病原性免疫グロブリンの変異体、例えば切断変異体のコンビナトリアルライブラリーを、アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性に関してスクリーニングすることによって同定可能である。
【００７１】
病原性免疫グロブリンコード配列のＮ末端、Ｃ末端または内部断片などの断片のライブラリーは、本タンパク質の変種のスクリーニングおよびその後の選択を目的として断片の多様化した集団を作製するために用いることができる。システイン残基が付加もしくは除去された変種、またはグリコシル化された残基が付加もしくは除去された変種が特に好ましい。
【００７２】
点変異または切断によって作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングのため、および選択した特性を有する遺伝子産物に関するＤＮＡライブラリーのスクリーニングのための方法。機能的変異体の頻度を高める技法である反復帰納的変異誘発法（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ ｅｎｓｅｍｂｌｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）を、変種を同定するためのスクリーニングアッセイ法と併用することができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７８１１〜７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ６（３）：３２７〜３３１）。
【００７３】
細胞系アッセイを多様化ライブラリーの分析に用いることができる。例えば、発現ベクターのライブラリーを細胞系、例えば、タンパク質に対して基質依存的な様式で通常反応する細胞系に対してトランスフェクトする。続いて、病原性免疫グロブリン−基質によるシグナル伝達の阻害または増強が認められる細胞からプラスミドＤＮＡを収集し、個々のクローンの特徴をさらに調べることができる。
【００７４】
もう１つの局面において、本発明は、病原性免疫グロブリン、例えば野生型と異なる活性を有する病原性免疫グロブリン、例えば天然の病原性免疫グロブリンのアンタゴニスト、アゴニストまたはスーパーアゴニストの作製方法を特徴とする。本方法は以下を含む：病原性免疫グロブリンの配列を、例えば本明細書に開示する非保存的領域、ドメインまたは残基の１つまたは複数の残基の置換または除去によって改変すること、および改変ポリペプチドを望ましい活性に関して試験すること。
【００７５】
もう１つの局面において、本発明は、天然の病原性免疫グロブリンとは変化した生物活性を有する、病原性免疫グロブリンの断片または類似体の作製方法を特徴とする。本方法は以下を含む：病原性免疫グロブリンの配列を、例えばその１つまたは複数の残基の配列の置換または除去によって改変すること、例えば本明細書に記載の非保存的領域、またはドメインもしくは残基の配列を改変すること、および改変ポリペプチドを望ましい活性に関して試験すること。
【００７６】
免疫グロブリンの作製
他の態様において、阻害物質は抗体またはその断片、例えば抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合部分でありうる。
【００７７】
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、単一の分子組成からなる抗体分子のことを指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す。したがって、「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来する可変領域および定常領域を有する、単一の結合特異性を示す抗体のことを指す。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を不死化細胞と融合させたものを含むハイブリドーマによって産生される。
【００７８】
抗体の作製の方法は当技術分野で周知である。例えば、ある標的（例えば、病原性免疫グロブリンまたは細胞上の虚血特異的抗原）に対するモノクローナル抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルシュタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション法を含む、さまざまな技法によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーションの手順が好ましいものの、原理的には、モノクローナル抗体を作製するための他の技法、例えば、Ｂリンパ球のウイルストランスフォーメーションまたは発癌トランスフォーメーションも用いうる。ハイブリドーマの調製のために好ましい動物系はマウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの作製は非常に確立した手順である。免疫処置のプロトコール、および免疫処置を受けた融合用の脾細胞の単離のための技法は当技術分野で知られている。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）および融合手順も知られている。
【００７９】
ヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスをマウス系の代わりに用いて作製することができる。関心対象の抗原による免疫処置を行ったこれらのトランスジェニックマウスからの脾細胞を、ヒトタンパク質由来のエピトープに対する特異的親和性を備えたヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマの作製に用いうる（例えば、Ｗｏｏｄら、国際出願・国際公開公報第９１／００９０６号、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、ＰＣＴ公報・国際公開公報第９１／１０７４１号；Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際出願・国際公開公報第９２／０３９１８号；Ｋａｙら、国際出願第９２／０３９１７号；Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ．ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６〜８５９；Ｇｒｅｅｎ， Ｌ．Ｌ．ら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７：１３〜２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．ら、１９９４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１〜６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９３、Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３〜４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎら、１９９３、ＰＮＡＳ ９０：３７２０〜３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎら、１９９１、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３〜１３２６を参照）。
【００８０】
１つの態様においては、ハイブリドーマをヒトＣＤ５＋、Ｂ−１細胞から作製することができる。または、交差反応性「虚血抗原」を認識する「ヒト化」マウスハイブリドーマを用いることもできる。
【００８１】
モノクローナル抗体を、組換えＤＮＡ技術の分野の当業者に知られた他の方法によって作製することもできる。特定の抗原特異性を有する抗体断片の同定および単離のために「コンビナトリアル抗体ディスプレイ」法と呼ばれる１つの代替的な方法が開発されており、これをモノクローナル抗体の作製に用いることができる（コンビナトリアル抗体ディスプレイ法の説明については、例えば、Ｓａｓｔｒｙら、１９８９、ＰＮＡＳ ８６：５７２８；Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５；およびＯｒｌａｎｄｉら、１９８９、ＰＮＡＳ ８６：３８３３を参照されたい）。上記の免疫原を動物に接種した後に、その結果得られたＢ細胞プールの抗体レパートリーのクローニングを行う。免疫グロブリン分子の多様な集団の可変領域のＤＮＡ配列を、オリゴマープライマーの混合物およびＰＣＲを用いることによって入手するための方法は一般に知られている。例えば、５’リーダー（シグナルペプチド）配列および／またはフレームワーク１（ＦＲ１）配列に対応する混合オリゴヌクレオチドプライマー、ならびに保存的な３’定常領域プライマーに対するプライマーを用いて、さまざまなマウス抗体から重鎖および軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅を行うことができる（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９９１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１：１５２〜１５６）。同様の手法を用いて、ヒト抗体からヒト重鎖および軽鎖可変領域を増幅することもできる（Ｌａｒｒｉｃｋら、１９９１、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２：１０６〜１１０）。
【００８２】
１つの例示的な態様では、標準的なプロトコール（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号；Ｏｒｌａｎｄｉら、ＰＮＡＳ（１９８９）８６：３８３３〜３８３７；Ｓａｓｔｒｙら、ＰＮＡＳ（１９８９）８６：５７２８〜５７３２；およびＨｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１）を用いて、Ｂリンパ球、例えば末梢血細胞、骨髄または脾臓調製物からＲＮＡを単離する。重鎖の定常領域ならびにκおよびλ軽鎖のそれぞれに対して特異的なプライマー、さらにはシグナル配列に対するプライマーを用いて、第一鎖ｃＤＮＡを合成する。可変領域ＰＣＲプライマーを用いて、重鎖および軽鎖の双方の可変領域をそれぞれ単独でまたは組み合わせとして増幅し、ディスプレイパッケージの作製における操作をさらに行うために適切なベクター中に連結する。増幅プロトコールにおいて有用なオリゴヌクレオチドプライマーは一意的なものでも縮重性のものでもよく、または縮重した位置にイノシンを組み込んだものでもよい。増幅断片を発現のためにベクター中の所定のリーディングフレーム内にクローニングすることが可能となるように、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をプライマーに組み入れてもよい。
【００８３】
免疫処置に由来する抗体レパートリーからクローニングしたＶ−遺伝子ライブラリーを、好ましくは繊維状ファージに由来するディスプレイパッケージの集団により発現させ、抗体ディスプレイライブラリーを生成させることができる。理想的には、ディスプレイパッケージは、極めて大規模な多様化抗体ディスプレイライブラリーのサンプリング、各々の親和性分離の工程後の迅速な選別、および精製したディスプレイパッケージからの抗体遺伝子の容易な単離を可能とするシステムを含む。ファージディスプレイライブラリーを作製するための市販のキット（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社の組換えファージ抗体システム、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＳｕｒｆＺＡＰ（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号２４０６１２）のほかに、多様化抗体ディスプレイライブラリーの作製における使用に特に適した方法および試薬の例は、例えば、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、米国特許第５，２２３，４０９号；カン（Ｋａｎｇ）ら、国際公開公報第９２／１８６１９号；ダワー（Ｄｏｗｅｒ）ら、国際公開公報第９１／１７２７１号；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、国際公開公報第９２／２０７９１号；マークランド（Ｍａｒｋｌａｎｄ）ら、国際公開公報第９２／１５６７９号；ブライトリング（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ）ら、国際公開公報第９３／０１２８８号；マッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、国際公開公報第９２／０１０４７号；ガラード（Ｇａｒｒａｒｄ）ら、国際公開公報第９２／０９６９０号；ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）ら、国際公開公報第９０／０２８０９号；フックス（Ｆｕｃｈｓ）ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０〜１３７２；ヘイ（Ｈａｙ）ら（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１〜８５；ヒューズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１；グリフィス（Ｇｒｉｆｆｔｈｓ）ら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５〜７３４；ホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９〜８９６；クラックソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８；グラム（Ｇｒａｍ）ら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６〜３５８０；ガラード（Ｇａｒｒａｄ）ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３〜１３７７；フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３〜４１３７；およびバーバス（Ｂａｒｂａｓ）ら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８〜７９８２に記載されている。
【００８４】
ある種の態様では、重鎖および軽鎖のＶ領域ドメインを柔軟なリンカーにより連結した同一ポリペプチド上で発現させて一本鎖Ｆｖ断片を形成させ、その後にこの一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦＶ）遺伝子を望ましい発現ベクターまたはファージゲノム中にクローニングすることができる。マッカファティ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２〜５５４に一般的に記載された通り、柔軟な（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３リンカーによって連結した抗体の完全なＶＨおよびＶＬドメインを用いて、ディスプレイパッケージを抗原親和性に基づいて分離できるようにする一本鎖抗体を作製することができる。続いて、抗原に対する免疫反応性のある単離されたｓｃＦＶ抗体を、本方法に用いるための薬学的調製物として製剤化することができる。
【００８５】
ディスプレイパッケージ（例えば、繊維状ファージ）の表面に提示されたところで、標的抗原に対する特異性を有する抗体を発現するパッケージの同定および単離のために、抗体ライブラリーを標的抗原またはそのペプチド断片を用いてスクリーニングする。選択した抗体をコードする核酸をディスプレイパッケージ（例えば、ファージゲノム）から回収し、標準的な組換えＤＮＡ法によって他の発現ベクターへのサブクローニングを行うことができる。
【００８６】
表面タンパク質に対する高い親和性を有する特異的抗体分子は、当技術分野で知られた方法、例えばライブラリーのスクリーニングを用いる方法に従って作製することができる（Ｌａｄｎｅｒ， Ｒ．Ｃ．ら、米国特許第５，２３３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒ， Ｒ．Ｃ．ら、米国特許第５，４０３，４８４号）。さらに、これらのライブラリーの方法を、抗体の構造決定基の模倣物である結合性決定基を入手するためのスクリーニングに用いることもできる。
【００８７】
特に、個々の抗体分子のＦｖ結合表面はタンパク質間相互作用の原理に従ってその標的リガンドと相互作用するため、ＶＨおよびＶＬ（後者はκ鎖のものでもλ鎖のものでもよい）に関する配列データは、当業者に知られたタンパク質工学の技法の基盤となる。結合性決定基を含むタンパク質表面に関する詳細は、ＮＭＲ試験または結晶学的データから得られた他の抗体の以前に決定された三次元構造を用いるモデル化手順により、抗体の配列情報から得ることができる。例えば、バジョラス（Ｂａｊｏｒａｔｈ， Ｊ．）およびシェリフ（Ｓ． Ｓｈｅｒｉｆｆ） 、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．， Ｆｕｎｃｔ．， および Ｇｅｎｅｔ． ２４（２）、１５２〜１５７；ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ， Ｄ．Ｍ．）およびリース（Ａ． Ｒ． Ｒｅｅｓ）、１９９５、「抗体結合部位の分子モデリング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）、ポール（Ｓ． Ｐａｕｌ）編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ． ５１、「抗体工学のプロトコール（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、ＮＪ、ｐｐ １７〜４９；ならびにジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇ．）、ウー（Ｗｕ， Ｔ．Ｔ．）およびカバット（Ｅ．Ａ． Ｋａｂａｔ）、１９９５、「Ｓｅｑｈｕｎｔ：整列化したヌクレオチド配列およびアミノ酸配列のスクリーニング用のプログラム（Ｓｅｑｈｕｎｔ：Ａ ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ ｓｃｒｅｅｎ ａｌｉｇｎｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ． ５１、前掲書中、ｐｐ １〜１５を参照されたい。
【００８８】
１つの態様では、多様化したペプチドライブラリーをディスプレイパッケージの集団により発現させて、ペプチドディスプレイライブラリーを生成させる。理想的には、ディスプレイパッケージは、極めて大規模な多様化抗体ディスプレイライブラリーのサンプリング、各々の親和性分離の工程後の迅速な選別、および精製したディスプレイパッケージからの抗体遺伝子の容易な単離を可能とするシステムを含む。ペプチドディスプレイライブラリーは例えば、迅速増幅が可能であり、操作が比較的容易であって、多数のクローンの作製が可能な原核生物およびウイルスでありうる。好ましいディスプレイパッケージには例えば、増殖性細菌細胞、細菌胞子、および最も好ましくは細菌ウイルス（特にＤＮＡウイルス）が含まれる。しかし、本発明は、酵母およびその胞子を含む真核細胞をディスプレイパッケージの可能性があるものとして用いることも考えている。ファージディスプレイライブラリーについては先に述べた。
【００８９】
他の技法には、適した「受容体」、例えば標的抗原を用いるアフィニティークロマトグラフィーの後に、単離された結合性物質またはリガンドを従来の技法（例えば、質量分析およびＮＭＲ）によって同定することが含まれる。好ましくは、可溶性受容体を、その検出によってリガンド結合が示されるような標識（例えば、蛍光団、比色定量用酵素、放射性同位体または発光性化合物）と結合させる。または、固定化した化合物を選択的に遊離させ、膜を通して拡散させて、受容体と相互作用させることもできる。
【００９０】
化合物のコンビナトリアルライブラリーを、ライブラリーの各構成要素の実体を符号化するための「タグ」付きで合成することもできる（例えば、Ｗ．Ｃ． Ｓｔｉｌｌら、国際出願・国際公開公報第９４／０８０５１号を参照）。本方法は一般に、固体支持体または化合物に結合させた、不活性ではあるが容易に検出可能なタグを用いることを特徴する。活性化合物が検出された場合には、一意的な随伴タグの同定によって化合物の実体を決定する。このタグ標識法により、極めて低いレベルでもライブラリーのすべての化合物の全集合からの同定が可能な化合物の大規模ライブラリーを合成することが可能となる。
【００９１】
「改変された抗体」という用語は、抗体の部分の除去、付加または置換などによって改変された、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体などの抗体を含むものとする。例えば、抗体は、ヒンジ領域を除去し、それにより一価抗体を作製することによって改変しうる。本発明の抗体は、可変領域またはその一部、例えば相補性決定領域（１つまたは複数のＣＤＲ）が、非ヒト生物、例えばラットまたはマウスにおいて産生されるものでありうる。キメラ抗体、ＣＤＲグラフト（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ）抗体およびヒト化抗体は本発明の範囲に含まれる。非ヒト生物（例えばラットまたはマウス）において産生され、その後、ヒトにおける抗原性を低下させるために、例えば可変フレームワークまたは定常領域抗体に改変がなされた抗体は、本発明の範囲に含まれる。抗体が少なくとも１つの抗原結合部分を有する限り、あらゆる改変が本発明の範囲に含まれる。
【００９２】
キメラ抗体（例えば、マウス−ヒトモノクローナル抗体）は、当技術分野で知られた組換えＤＮＡ技術によって作製可能である。例えば、マウス（または他の種）のモノクローナル抗体分子のＦｃ定常領域をコードする遺伝子を、マウスＦｃをコードする領域を除去するために制限酵素で消化し、ヒトＦｃ定常領域をコードする遺伝子の同等な部分によって置換する（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許公報ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４，１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ， Ｍ．、欧州特許出願第１７１，４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３，４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、国際出願・国際公開公報第８６／０１５３３号；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３）；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：３４３９〜３４４３；Ｌｉｕら、１９８７、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１〜３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ ８４：２１４〜２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９８７、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９〜１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６〜４４９；およびＳｈａｗら、１９８８、Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３〜１５５９を参照のこと）。
【００９３】
抗原結合に直接には関与しないＦｖ可変領域の配列をヒトＦｖ可変領域由来の同等な配列によって置換することにより、キメラ抗体をさらにヒト化することができる。ヒト化抗体を作製するための一般的な方法は、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌ．）、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７、オイ（Ｏｉ）ら、１９８６、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、およびクイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第５，６９３，７６２号に提示されており、これらのすべての内容は参照として本明細書に組み入れられる。このような方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変領域の全体または一部をコードする核酸配列を単離し、操作し、発現させることを含む。このような核酸の源は当業者に周知であり、例えば、抗ＧＰＩＩｂＩＩＩａ抗体を産生するハイブリドーマである７Ｅ３から入手可能である。続いて、キメラ抗体またはその断片をコードする組換えＤＮＡを適切な発現ベクター中にクローニングすることができる。または、適したヒト化抗体をＣＤＲ置換によって作製することもできる。米国特許第５，２２５，５３９号；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５；バーホエアン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびバイドラー（Ｂｅｉｄｌｅｒ）ら、１９８８、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３〜４０６０。
【００９４】
ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体は、免疫グロブリン鎖の１つ、２つまたはすべてのＣＤＲを置換することが可能なＣＤＲグラフト法またはＣＤＲ置換によって作製することができる。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２〜５２５；バーホエアン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４；およびバイドラー（Ｂｅｉｄｌｅｒ）ら、１９８８、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３〜４０６０；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）、米国特許第５，２２５，５３９号を参照されたい。これらのすべての内容は参照として本明細書に明示的に組み入れられる。ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）は、本発明のヒト化抗体の調製に用いうるＣＤＲグラフト法を記載しており（１９８７年３月２６日に提出された英国特許出願第ＧＢ ２１８８６３８Ａ号、Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号）、その内容は参照として明白に開示される。
【００９５】
ヒト化抗体またはＣＤＲグラフト抗体は、少なくとも１つまたは２つの、しかし一般的にはすべてのレシピエントＣＤＲ（免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖の）がドナーＣＤＲによって置換されていると考えられる。ドナーは齧歯類抗体、例えば、ラットまたはマウスの抗体であり、レシピエントはヒトフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークであることが好ましい。一般に、ＣＤＲを提供する免疫グロブリンは「ドナー」と呼ばれ、フレームワークを提供する免疫グロブリンは「アクセプター」と呼ばれる。１つの態様において、ドナー免疫グロブリンは非ヒト（例えば、齧歯類）のものである。アクセプターのフレームワークは天然（例えば、ヒト）のフレームワークまたはコンセンサスフレームワークでもよく、それとの同一性が約８５％またはそれ以上、好ましくは９０％、９５％、９９％またはそれ以上である配列でもよい。
【００９６】
特定の抗体のすべてのＣＤＲを非ヒトＣＤＲの少なくとも一部によって置換してもよく、ＣＤＲのいくつかのみを非ヒトＣＤＲによって置換してもよい。必要なのは、ヒト化抗体のＦｃ受容体との結合に必要な数のＣＤＲを置換することのみである。
【００９７】
特定のアミノ酸が置換、除去または付加されたキメラ抗体およびヒト化抗体も本発明の範囲に含まれる。特に、好ましいヒト化抗体は、抗原との結合性を改善するためにフレームワーク領域にアミノ酸置換を有する。例えば、ヒト化抗体は、ドナーのフレームワーク残基またはレシピエントのフレームワーク残基以外の別のアミノ酸と同一なフレームワーク残基を有すると考えられる。もう１つの例として、マウスＣＤＲを有するヒト化抗体の場合には、ヒトフレームワーク領域に位置するアミノ酸を、マウス抗体の対応する位置にあるアミノ酸によって置換することができる。ある種の場合には、このような置換がヒト化抗体の抗原との結合性を改善させることが知られている。
【００９８】
本明細書で用いる「抗原結合部分」または「抗体部分」または「断片」という用語は、抗原（例えば、標的抗原、例えば、虚血抗原）と特異的に結合する能力を保っている、抗体の１つまたは複数の断片のことを指す。本発明の抗体断片は、当業者に知られた従来の手順を用いて得られる。例えば、ペプシンで抗体を消化すると、Ｆ（ａｂ’）２断片および多数の小さな断片が得られる。抗体のメルカプトエタノール還元により、個々の重鎖および軽鎖が得られる。抗体をパパインで消化すると、個々のＦａｂ断片およびＦｃ断片が得られる。上記の通り、抗体断片の有用性に関するスクリーニングは完全な抗体と同じ様式で行う。
【００９９】
２２Ａ５ ＩｇＭ重鎖可変領域のヌクレオチド配列を図４Ａ（配列番号：１）に示し、２２Ａ５ ＩｇＭ重鎖可変領域のアミノ酸配列を図５Ａに示す（配列番号：２）。重鎖可変領域のＣＤＲ１ドメインは配列番号：２のアミノ酸約３０番目〜３４番目（配列番号：４）に対応しており、配列番号：１のヌクレオチド約９１位〜１０５位（配列番号：３）を含み、重鎖可変領域のＣＤＲ２ドメインは配列番号：２のアミノ酸４９番目〜６５番目（配列番号：６）に対応しており、配列番号：１のヌクレオチド１４８位〜１９８位（配列番号：５）を含む。
【０１００】
２２Ａ５ ＩｇＭ軽鎖可変領域のヌクレオチド配列図４Ｂ（配列番号：７）に示し、２２Ａ５ ＩｇＭ軽鎖可変領域のアミノ酸配列を図５Ｂ（配列番号：８）に示す。軽鎖可変領域のＣＤＲ１ドメインは配列番号：８のアミノ酸約２３番目〜３３番目（配列番号：１０）に対応しており、配列番号：７ヌクレオチド約７１位〜１０３位（配列番号：９）を含み、軽鎖可変領域のＣＤＲ２ドメインは配列番号：８のアミノ酸約４９番目〜５５番目（配列番号：１２）に対応しており、配列番号：７のヌクレオチド約１４９位〜１６９位（配列番号：１１）を含む。
【０１０１】
本発明の抗体またはその断片（例えば、ＣＤＲ２ドメインなどのＣＤＲドメイン、または断片）をコードするヌクレオチド配列を、遺伝暗号および標準的な分子生物学の技法を用いて、本出願に記載のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列から導き出せることを当業者は理解すると考えられる。さらに、当業者は、遺伝暗号の縮重性のために、他のヌクレオチド配列が本明細書に挙げたアミノ酸配列を列挙しうることも理解すると考えられる。
【０１０２】
本発明の核酸組成物は、天然の配列（改変された制限部位などを除く）であることがしばしばであるが、遺伝子配列を得るための標準的な技法に従ってｃＤＮＡ、ゲノムまたは混合物から変異させてもよい。コード配列の場合、これらの変異はアミノ酸配列に要望通りの影響を及ぼすことがある。特に、天然のＶ、Ｄ、Ｊ、定常領域、スイッチおよび本明細書に記載の他のこのような配列と実質的に同一な、またはそれらに由来するヌクレオチド配列を考えている（ここで「由来する」とは、配列が他の配列と同一であるか、またはそれから改変されたことを意味する）。
【０１０３】
１つの態様において、単離された核酸は、図４Ａに示したヌクレオチド配列を有する２２Ａ５ ＩｇＭ重鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号：１）、またはそれとの同一性が少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上である配列を含む。もう１つの態様において、単離された核酸は、図４Ｂに示したヌクレオチド配列を有する２２Ａ５ ＩｇＭ軽鎖可変領域ヌクレオチド配列（配列番号：７）、またはそれとの同一性が少なくとも９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上である配列を含む。
【０１０４】
もう１つの態様において、本発明は、配列番号：４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１ドメイン、またはその断片もしくは改変型をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸はＣＤＲ１領域のみをコードすることもでき、または抗体重鎖可変領域全体をコードすることもできる。例えば、本核酸は、配列番号：６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する重鎖可変領域をコードしうる。さらにもう１つの態様において、本発明は、配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２ドメイン、またはその断片もしくは改変型をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸はＣＤＲ２領域のみをコードすることもでき、または抗体重鎖可変領域全体をコードすることもできる。例えば、本核酸は、配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域をコードしうる。
【０１０５】
さらにもう１つの態様において、本発明は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１ドメイン、またはその断片もしくは改変型をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸はＣＤＲ１領域のみをコードすることもでき、または抗体軽鎖可変領域全体をコードすることもできる。例えば、本核酸は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２ドメインを有する軽鎖可変領域をコードしうる。さらにもう１つの態様において、本発明は、配列番号：１２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２ドメイン、またはその断片もしくは改変型をコードする、単離された核酸を提供する。本核酸はＣＤＲ２領域のみをコードすることもでき、または抗体軽鎖可変領域全体をコードすることもできる。例えば、本核酸は、配列番号：１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１ドメインを有する軽鎖可変領域をコードしうる。
【０１０６】
薬学的組成物および投与
本発明の阻害物質を、対象への投与に適した薬学的組成物に組み入れることができる。典型的な例として、薬学的組成物は、本発明の阻害物質（例えば、改変された病原性免疫グロブリン）および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」には、生理的な適合性のある任意およびすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌薬および抗真菌薬、等張液および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的に許容される担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、ならびにそれらの組み合わせのうち１つまたは複数が含まれる。多くの場合には、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコ−ル、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいと考えられる。薬学的に許容される担体が、抗体または抗体部分の貯蔵寿命または有効性を増大させる、湿潤剤もしくは乳化剤、保存料または緩衝剤などの微量の補助物質をさらに含んでもよい。
【０１０７】
薬学的組成物は、その意図する投与経路と適合しうるように製剤化される。投与経路の例には、静脈内、皮内、皮下、経口（吸入など）、経皮（局所）、経粘膜および直腸内投与などの非経口的なものが含まれる。このように、本発明の組成物はさまざまな剤形をとりうる。これらには例えば、溶液（例えば、注射用および注入用の液剤）、分散剤または懸濁剤、錠剤、丸剤、粉剤、リポソームおよび坐剤などの液体、半固体、固体の剤形が含まれる。好ましい剤形は、意図する投与様式および治療用途に応じて決まる。典型的な好ましい組成物は、ヒトに対する他の抗体による受動免疫処置に用いられるものと類似した組成物などの注射用および注入用の液剤の剤形である。好ましい投与様式は、非経口的（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）なものである。好ましい態様では、抗体を静脈内注入または注射によって投与する。別の好ましい態様では、抗体を筋肉内注射または皮下注射によって投与する。
【０１０８】
非経口的、皮内または皮下適用のために用いられる液剤または懸濁剤は以下の成分を含みうる：注射用水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈液；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；アスコルビン酸または重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸鉛、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための薬剤。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基によって調整しうる。非経口製剤は、アンプル、ディスポーザルシリンジまたはガラスもしくは合成樹脂製の多回投与用バイアル中に封入することができる。
【０１０９】
注射用に適した薬学的組成物には、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液の要時調合用製剤（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために適した担体には、生理食塩水、滅菌精製水、クレモフォア（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ；Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。すべての場合において、組成物は無菌でなければならず、シリンジ注入が容易に行える程度に流動的である必要がある。それは製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護される必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびその適した混合物などを含む溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合には必要な粒子径の維持、および界面活性剤の使用によって維持しうる。微生物の作用の防止は、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの種々の抗菌薬および抗真菌薬によって実現しうる。多くの場合には、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコ−ル、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいと考えられる。注射用組成物の持続的吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの、吸収を遅延させる薬剤を組成物中に含めることによって実現しうる。
【０１１０】
治療的組成物は一般に、無菌である上、製造および保存の条件下で安定性がある必要がある。本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散系、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の秩序立った構造として製剤化することができる。滅菌注射用溶液は、必要な量の活性化合物（すなわち、抗体または抗体部分）を、必要に応じて上に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに適した溶媒中に組み入れた後に濾過滅菌を行うことによって調製しうる。分散液は一般に、基本的な分散媒、および上記に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を含めることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合には、好ましい調製の方法は、活性成分の粉末に加えて、あらかじめ滅菌濾過された溶液から望ましい任意の付加的な成分が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティング剤の使用により、分散系の場合には必要な粒径を保つことにより、および界面活性剤の使用により、維持することができる。
【０１１１】
本発明の阻害物質は、当技術分野で知られたさまざまな方法によって投与することができるが、多くの治療的用途に対して好ましい投与の経路／様式は静脈内への注射または注入である。当業者は理解すると考えられるが、投与の経路および／または様式は求める結果に応じて異なると考えられる。ある種の態様においては、活性化合物を、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル封入送達系を含む制御放出型製剤などの、急速放出から化合物を保護すると思われる担体とともに調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性の重合体を用いることもできる。このような製剤を調製するための多くの方法は特許が取得されており、当業者に広く知られている。例えば、徐放性および制御放出型の薬物送達系（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ロビンソン（Ｊ．Ｒ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９７８を参照されたい。
【０１１２】
ある種の態様では、本発明の阻害物質を、例えば不活性希釈剤または可食担体とともに経口投与してもよい。化合物（および必要に応じて他の成分）を硬もしくは軟ゼラチンカプセル内に封入すること、圧縮して錠剤にすること、または対象の食事に直接組み入れることも可能である。経口的治療投与の目的には、化合物を賦形剤とともに組み入れ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、カシェ剤などの形態で用いることができる。非経口的投与以外によって本発明の化合物を投与するためには、化合物をその失活を防ぐ物質でコーティングすること、または化合物をそれとともに同時投与することが必要なことがある。吸入による投与のためには、化合物は、二酸化炭素などのガスなどの適した噴霧剤を含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアロゾル噴霧の形態で送達される。
【０１１３】
本発明の阻害物質は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル封入送達系を含む制御放出型製剤などの、身体からの急速放出から化合物を保護すると思われる担体とともに調製することができる。エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性の重合体を用いることもできる。このような製剤を調製するための方法は当業者には明らかであると考えられる。これらの物質を、アルザ社（Ａｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびノバファーマシューティカルズ社（Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．）から購入することもできる。リポソーム懸濁液を薬学的に許容される担体として用いることもできる。これらは当業者に知られた方法、例えば米国特許第４，５２２，８１１号の記載に従って調製することができる。
【０１１４】
本薬学的組成物は、投与のための指示とともに、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１１５】
実施例
実施例１：虚血再灌流障害の機序
本実施例では、補体系に欠損のあるマウスが虚血再灌流障害に対して抵抗性であったことを示す。
【０１１６】
虚血再灌流障害の機序を検討するために、補体Ｃ３が欠損したマウスに対して後肢モデルとしての処置を行った。Ｃ３−／−マウスは、透過性指数が約５０％低下したという根拠により、障害から部分的に防御された（Ｗｅｉｓｅｒら（１９９６）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８５７〜１８６４を参照）。したがって、補体Ｃ３はこのマウスモデルにおける完全な障害の誘導に必須である。
【０１１７】
ワイザー（Ｗｅｉｓｅｒ）らの実験では、補体がいかにして活性化されるかは特定されていない。血清補体系は、古典経路、レクチン経路または第二経路という少なくとも３つの異なる経路によって活性化されうる。どの経路が関与するかを知ることは、これによって障害の機序が推定されるため重要である。例えば、古典経路は免疫グロブリンのＩｇＭおよびＩｇＧアイソタイプにより、または血清認識タンパク質であるＣ反応性タンパク質により、非常に効率的に活性化される。これに対して、レクチン経路はマンナン結合レクチン（ＭＢＬ）によるマンナンの認識などの特定の糖質の認識後に活性化される（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌ ８、２９〜３５）。いずれの経路においても、補体Ｃ４は中心的成分であるＣ３の切断を触媒するＣ２との酵素複合体の形成に必要である。これに対して、第二経路は自発的に活性化し、Ｃ３の活性型（Ｃ３ｂ）への変換、および異物または自己の組織への結合をもたらす。すべての宿主細胞が、Ｃ３転換酵素の不活性化または変位による補体経路の増幅に対する阻害物質を発現することからみて、この経路は厳密に調節されている（Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｂｅｒｈａｒｄ， Ｈ．Ｊ．，（１９８８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７． ３２１〜３４７）。関与する経路を決定するための１つのアプローチは、Ｃ４が欠損したマウス、すなわち古典経路またはレクチン経路を介してＣ３転換酵素を形成することができないマウスを用いることである。Ｃ３またはＣ４のいずれかが欠損したマウスおよび野生型（ＷＴ）対照の後肢モデルにおける比較により、Ｃ４も完全な障害の誘導に必要なことが判明した（Ｗｅｉｓｅｒら、前記）。この所見は、抗体またはＭＢＬが関与している可能性を示唆する点で重要である。
【０１１８】
実施例２：自然ＩｇＭは虚血再灌流（Ｉ／Ｒ）障害を媒介する
本実施例では、免疫グロブリンが欠損したマウスが虚血再灌流障害に対して抵抗性であったことを示す。
【０１１９】
抗体がＩ／Ｒ障害の媒介に関与するか否かを明らかにするために、免疫グロブリンが完全に欠損したマウスであるＲＡＧ２−／−（リコンビナーゼ活性化遺伝子−２の欠損）の腸管モデルにおける特徴分析を補体欠損マウスとともにおいて行った。重要なことに、ＲＡＧ−２−／−マウスは補体欠損マウスに観察されたものと同程度のレベルで防御された（Ｗｅｉｓｅｒら、前記）。ＲＡＧ２−／−マウスには成熟リンパ球も存在しないため、病原性作用が抗体依存的であるかを明らかにすることは重要であった（Ｓｈｉｎｋａｉら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８、８５５〜８６７）。障害が血清抗体によって媒介されることを確認するために、欠損マウスに対して正常マウス血清（Ｗｅｉｓｅｒら、前記）または精製ＩｇＭ（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）Ｊ． Ａｐｐｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ８６；９３８〜４２）の再構成を行った。いずれの場合にも、再構成したＲＡＧ−２−／−マウスは防御されなくなり、障害が再び生じた。後者の実験では、腸管障害のモデルをこのモデルと同じように用いており、障害は主として補体によって媒介されると考えられる。
【０１２０】
これらの結果から、虚血期間中には内皮細胞表面に新たな抗原が発現されることも露出されることもないと解釈される。流血中ＩｇＭが新たな決定基を認識して結合し、補体の古典経路を活性化するように思われる。抗原の性質は明らかでないが、プールしたＩｇＧを欠損マウスに対して再構成してもマウスの障害の明らかな再生は起こらなかったため、主として補体の活性化の原因となるのはＩｇＧではなくＩｇＭであるように思われる。これと別の仮説は、変化した内皮表面を認識して低レベルの補体活性化を誘導し、新たな抗原性部位を露出させるＭＢＬ経路などの別の初期イベントが存在し、ＩｇＭの結合によってこの経路が増幅されるというものである。
【０１２１】
実施例３：病原性ＩｇＭはＢ−１細胞の産物である：
流血中ＩｇＭのかなりの割合は天然の抗体、すなわち再配列が起こった生殖系列遺伝子の産物であると考えられているため、リンパ球のＢ−１画分に欠損のあるマウスも防御される可能性がある。Ｂ−１細胞は、ＩｇＤおよびＣＤ２３を低レベルで発現し、かなりの割合が細胞表面タンパク質ＣＤ５を発現するという点で、通常のＢ−２細胞とは明確に異なる表現型を有する（Ｈａｒｄｙら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ．：１３７、９１；Ｋａｎｔｏｒら（１９９３）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１、５０１〜５３８、１９９３）。Ｂ１細胞は、マウスでは循環量が少ないこと、末梢リンパ節および脾臓における頻度が低いこと、ならびに腹腔に主として局在することによっても識別できる。病原性ＩｇＭの源としてのＢ−１細胞の役割を検討するために、抗体欠損マウス（ＲＡＧ−２−／−）に対して５×１０５個の腹腔Ｂ−１細胞の再構成を行い、処置の前に約３０日の安静期間をおいた。養子移入から１カ月以内に流血中ＩｇＭレベルはほぼ正常範囲に達した。Ｂ−１細胞の再構成を行ったマウスの腸管虚血モデルにおける特徴分析により、Ｂ−１細胞が病原性ＩｇＭの主な源であることが確かめられた（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９９）、前記を参照）。Ｂ−１細胞の自然抗体レパートリーは従来のＢ−２細胞に対して予想されるよりもかなり少ないため、これは重要な観察所見であった。このため、この病原性抗体は生殖系列の産物である可能性がある。
【０１２２】
実施例４：Ｃｒ２−／−マウスは虚血再灌流障害から防御される：
Ｃｒ２−／−ノックアウトマウスの最初の特徴分析により、Ｂ−１ａまたはＣＤ５＋Ｂ−１細胞の頻度が約５０％低下していることが判明している（Ａｈｅａｒｎら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ４：２５１〜２６２）。しかし、Ｃｒ２欠損マウスの別の系統の特徴分析では同様の低下は特定されなかった（Ｍｏｌｉｎａら（１９９６）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３、３３５７〜３３６１）。ＣＤ５＋細胞の頻度の低下が系統バックグラウンドまたは環境の違いに起因するか否かは不明である。Ｃｒ２−／−マウスにおけるＢ−１ａ細胞の頻度は低いにもかかわらず、ＩｇＭの流血中レベルは正常範囲にあった。これらの所見により、Ｃｒ２欠損マウスにおけるＩｇＭのレパートリーが異なる可能性が示唆された。この仮説を検証するために、マウスの腸管Ｉ／Ｒモデルにおける特徴分析を行った。驚いたことに、Ｃｒ２−／−マウスは抗体完全欠損マウスと同程度に防御された（図１）。処置後の腸管モデルにおける５日間の生存率の比較により、ＷＴの方がＣｒ２欠損マウスよりも死亡率が有意に高いことが示された。死亡率の高さと一致して、処置を行ったＷＴまたはＣｒ２−／−欠損マウスから採取した組織切片においても障害の劇的な軽減が観察された。
【０１２３】
ＷＴマウス、またはプールしたＩｇＭもしくはＢ−１細胞の再構成を行ったＣｒ２−／−マウスでは、腸粘膜層の広範囲にわたる障害が認められた。これに対して、処置を行ったＣｒ２−／−マウスから単離した組織切片は偽処置対照のものと類似していた。このように、ＩｇＭの流血中レベルは正常であるものの、Ｃｒ２欠損マウスは障害から防御された。これらの結果により、Ｂ−１細胞が病原性抗体の源として重要なことだけでなく、補体系が自然抗体のレパートリーの形成または維持にも何らかの関与を行っていることが示唆された。例えば、補体はＢ−１細胞の陽性選択に関与している可能性がある。
【０１２４】
実施例５：病原性ＩｇＭの同定
本実施例には、正常Ｂ−１細胞からの特定のハイブリドーマクローンの作製、および病原性ＩｇＭを産生するクローンの同定について述べる。病原性ＩｇＭは抗体欠損マウスにおけるインビボでの障害を再び生じさせることが示された。
【０１２５】
補体受容体ＣＤ２１／ＣＤ３５が欠損したマウスの検討により、このマウスには病原性抗体がないことが判明した。それらの血中のＩｇＭレベルは正常であったため、この所見は予想外であった。これらの所見から、Ｂ−１細胞と呼ばれるＢ細胞の特定の集団が病原性ＩｇＭを分泌する原因であるという仮説が導かれた。例えば、受容体欠損マウス（Ｃｒ２−／−）に正常マウス由来のＢ−１細胞を移植することによって障害が再生し、Ｂ−１細胞の重要性が裏づけられた。障害の原因となる特定の１つまたは複数の抗体を同定するために、正常マウスから採取した腹腔Ｂ−１細胞の集積プールから一群のハイブリドーマクローンを作製した。腹腔細胞の集積画分からハイブリドーマを調製するための一般的なアプローチには、７日前にＩＬ−１０を投与したマウスから腹腔細胞を採取し、その後に磁気ビーズを用いる陰性選択によってＣＤ２３＋ Ｂ細胞を集積させることが含まれる。集積したＢ細胞を、ＩｇＭ、Ｍａｃ−１およびＣＤ２３特異的Ｍａｂで染色した後にＦＡＣＳにより分析する。この集積集団をＬＰＳの存在下で２４時間培養することによってさらに活性化する。活性化された細胞を、ＰＥＧの存在下で融合パートナーである骨髄腫細胞とハイブリダイズさせ、ＨＡＴ選択培地中で増殖させる。ハイブリドーマをＥＬＩＳＡによってＩｇＭ分泌性クローンに関してスクリーニングし、ＩｇＭの精製のために陽性ウェルを増殖させる。
【０１２６】
２２種のＩｇＭ分泌性ハイブリドーマクローンを、各々のクローンから同量のＩｇＭ産物をプールすることによって分析した。抗体欠損マウスにプールしたＩｇＭを投与したところ、血清由来のプールＩｇＭで認められたものと類似の障害が再び生じた。この所見により、作製した２２種のハイブリドーマの中に病原性ＩｇＭがあることが確認された。プールを２つの画分、すなわち１〜１１および１２〜２２に分割し、マウスにこの２つの画分を投与したところ、病原性抗体はクローン＃２２を含むプールに分画されることがわかった。さらに、マウスに対してクローン１７または２２の再構成を行った。クローン２２は障害を再生させたが、他のクローンは再生させなかった（図３Ａおよび３Ｂ参照）。
【０１２７】
実施例６：Ｂ−１細胞の選択における補体の関与：
Ｂ−１細胞の発生に関しては２つの異なるモデルが提唱されている。系譜仮説では、Ｂ−１細胞が初期胎児において明確な集団として発生すると提唱している（Ｋａｎｔｏｒら（１９９３）前記）。または、Ｂ−１細胞は通常のＢ細胞と同じ前駆細胞から発生するが、環境に応じて、すなわち抗原との遭遇により、それらがＢ−１に分化するか、またはＢ−２細胞の表現型を維持するという説もある（Ｗｏｒｔｉｓ， Ｈ．Ｈ．（１９９２）Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８、２３５；Ｃｌａｒｋｅ， Ｊ．（１９９８）Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８７、１３２５〜１３３４）。その由来にかかわらず、Ｂ−１細胞は成体骨髄からはＢ−２細胞と同じ頻度では補充されず、その表現型は初期胎児肝Ｂ細胞または新生児骨髄（ＢＭ）細胞のものの方に類似している。初期に由来することに一致して、そのレパートリーはより近位側のＶＨ遺伝子の発現に偏る傾向があり、Ｎ−ヌクレオチド付加は少ない（Ｇｕら（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ ９、２１３３；Ｆｅｅｎｅｙ， Ｊ．（１９９０）Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２、１３７７）。成体ＢＭ幹細胞による補充が少ないと想定すれば、Ｂ−１細胞が自己再生し、抗原刺激がその再生、増殖またはさらに初期選択に重要と思われることは妥当と思われる（Ｈａｙａｋａｗａら（１９８６）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６、１３１３）。実際に従来のモデルに備わっているように、Ｂ−１細胞は抗原により選択される必要がある。
【０１２８】
Ｂ−１細胞の陽性選択にＢ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達が必要なことを裏づける証拠が、ＢＣＲシグナル伝達を変化させる変異を有するマウスから得られている。例えば、ＣＤ１９（１９、２０）、ｖａｖ（２１）またはＢｔｋ（２２）によるＢＣＲシグナル伝達の障害はＢ−１細胞の発生に重大な影響を及ぼす。これに対して、ＣＤ２２−またはＳＨＰ−１欠損マウスなどの場合のように陰性選択がなされないと、Ｂ−１細胞の頻度が高くなる（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、７９８〜８０１；Ｓｈｕｌｔｚら（１９９３）Ｃｅｌｌ ７３、１４４５）。最近、ＶＨ１２（Ｂ−１細胞表現型）またはＶＨＢ１−８（Ｂ−２細胞表現型）という２つの異なるＩｇ導入遺伝子を有するマウスを用いたエレガントな研究により、Ｂ−１細胞が自己抗原によって選択されるとの見解が裏づけられた。例えば、ＶＨ１２を単独で、またはＢ１−８とともに発現するＢ細胞からはＢ−１細胞表現型が生じた。一方、Ｂ１−８ｔｇのみを発現するＢ細胞は、同定された場合でもわずかであった。このように、これらの結果から、トランスジェニックＢ細胞の自己ＰｔＣとの遭遇により、ＶＨ１２を発現するものの増殖が起こることが示唆された。Ｂ−１細胞の選択は、ハーディ（Ｈａｒｄｙ）ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． １３７、９１）によって最近報告されている。彼らのモデルでは、Ｔｈｙ １．１に対して特異的な免疫グロブリン導入遺伝子を発現するＢ細胞が、コグネイト抗原を発現するマウスにおいて選択されて増殖した。これに対して、導入遺伝子＋Ｂ−１細胞は、代替的なアロタイプであるＴｈｙ １．２を発現するマウスには認められなかった。
【０１２９】
補体はどこでＢ−１細胞の発生に組み込まれるのであろうか。Ｂ−１ａ細胞の頻度の全体的な低下、およびＩ／Ｒ障害に関与するＩｇＭを発現するＢ−１細胞のより特異的な減少から、Ｂ−１ａ細胞の陽性選択または維持におけるＣＤ２１／ＣＤ３５の役割が示唆される。補体に関して考えられる１つの役割は、コグネイト抗原と遭遇するとＢＣＲシグナル伝達を増強させるというものである。ＣＤ２１／ＣＤ３５欠損マウスの生化学的検討および分析により、通常のＢ細胞の活性化および生存における補助受容体シグナル伝達の重要性が示されている（Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｍ．Ｃ．，（１９９８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １６、５４５〜５６８；Ｆｅａｒｏｎら（１９９５）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ １３、１２７〜１４９）。Ｂ−１細胞も同じようにＢＣＲシグナルの増強に補助受容体シグナル伝達を利用している可能性が非常に高い。例えば、細菌はホスホリルコリンなどの典型的なＢ−１細胞抗原を発現しており、細菌が補体リガンドＣ３ｄによって覆われると補助受容体とＢＣＲとの架橋が増大して全体的なシグナル伝達が増強されるという考えは不当とは言えない。このため、比較的低い濃度で発現される抗原の場合、コグネイトＢ細胞がそれを認識して増殖するため、または陽性選択されるためには、補体による増強が必要と考えられる。補体受容体に関するもう１つの役割は、抗原をリンパ系区画内部の濾胞樹状細胞（ＦＤＣ）上に局在させることである。しかし、Ｂ−１細胞の集団の大半は腹腔組織に存在するため、それらがリンパ系構造の内部でＦＤＣと遭遇するかどうかは明確でない。Ｂ−１細胞が陽性選択を受ける１つまたは複数の実際の部位はわかっていない。それらは初期胎児発生時または新生児ＢＭにおいてコグネイト抗原に遭遇する必要がある。もしそうであれば、これらの区画内の実質細胞の表面にある補体受容体は抗原と結合してそれをＢ細胞に提示することが予想される。補体受容体は発生の両方の段階に関与する可能性がある。第一に、それらは初期陽性選択における抗原シグナル伝達を増強する可能性がある。第二に、選択されたＢ−１細胞が末梢部位に補充される際に、補体受容体は再びＢＣＲシグナル伝達の増強に関与する可能性がある。
【０１３０】
図２は、腹腔Ｂ−１リンパ球の陽性選択における補体および補体受容体の役割を提唱した模式図である。補体−リガンドで覆われた抗原（自己および非自己）の相互作用によって、細胞表面でＣＤ２１／ＣＤ１９補助受容体およびＢＣＲの共連結（ｃｏ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）が起こり、これがシグナル伝達の増強および陽性選択をもたらす。
【０１３１】
等価物
当業者は、日常的な実験により、本明細書に記載された特定の態様の等価物を認識する、または確認することができるだろう。このような等価物は添付の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】腸管虚血および再灌流後の、または障害を加えなかった（偽処置）近交系マウスの腸管透過性の変化を示した棒グラフである。ＷＴはＣｒ２−／−マウスの親系統を表す。Ｃｒ２−／−はプールしたＩｇＧもしくはＩｇＭまたは生理食塩水対照を用いて再構成した。プールしたＩｇＭまたはＩｇＧ（０．５ｍｇ）を処置の約１時間前に静脈内に投与した。各値は平均＋標準誤差である；ｎ＝実験群におけるマウスの数。
【図２】腹腔Ｂ−１リンパ球の陽性選択における補体および補体受容体の役割を提唱した模式図である。
【図３Ａ】２２種の個別のＢ−１細胞ハイブリドーマクローンからプールしたＩｇＭによる、抗体欠損マウス（ＲＡＧ−１）におけるＩ／Ｒ障害の再構成を示す。２４μｇの各ハイブリドーマＩｇＭをプールし、最初の腹腔切開を行う３０分前に静脈内に注射した。再灌流を終えた時点で血液を採取し、乾燥腸管と血液との１２５Ｉカウントの比として透過性指数を算出する。各値は平均±ＳＥを表す；ｎ＝実験群に用いたマウスの数。１＝生理食塩水；２＝プールしたハイブリドーマ；３＝５０μｇのハイブリドーマ２２Ａ５；４＝４００μｇのプールしたＩｇＭ。
【図３Ｂ】ハイブリドーマクローン２２Ａ５からのＩｇＭによってＲＡＧ−１マウスにおけるＩ／Ｒ障害が再び生じることを示す。ＩｇＭによる再構成を行ったマウスには総血清ＩｇＭ（４００μｇ）または２２Ａ５ハイブリドーマＩｇＭ（各５０μｇ）を投与している。各値は平均±ＳＥを表す；ｎ＝実験群に用いたマウスの数。１＝生理食塩水；２＝プールしたハイブリドーマ；３＝５０μｇのハイブリドーマ２２Ａ５；４＝４００μｇのプールしたＩｇＭ。
【図４Ａ】Ｂ−１ハイブリドーマ２２Ａ５のＩｇＭ配列解析を示す。２２Ａ５ ＩｇＭの重鎖核酸配列を示す（配列番号：１）。ＲＮＡを２２Ａ５ハイブリドーマ細胞から精製し、逆転写を行ってｃＤＮＡとした。免疫グロブリン重鎖ｃＤＮＡの増幅には、５’ ＶＨおよび３’ Ｃｍに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるセミネステッド（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲを用いた。ｃＤＮＡ産物をアガロースゲルで精製し、ヌクレオチド配列を自動シークエンシングによって決定した。フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）をヌクレオチドの上方に示す。ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースの検索により、２２Ａ５重鎖の免疫グロブリン配列ＶＭＵ−３．２（アクセッション番号Ｘ０３０８８）との相同性が９５％であることが明らかになった。
【図４Ｂ】Ｂ−１ハイブリドーマ２２Ａ５のＩｇＭ配列解析を示す。２２Ａ５ ＩｇＭの軽鎖核酸配列を示す（配列番号：７）。ＲＮＡを２２Ａ５ハイブリドーマ細胞から精製し、逆転写を行ってｃＤＮＡとした。免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡの増幅には、５’ Ｖｋおよび３’ Ｃｋに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いるセミネステッドＰＣＲを用いた。ｃＤＮＡ産物をアガロースゲルで精製し、ヌクレオチド配列を自動シークエンシングによって決定した。フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）をヌクレオチドの上方に示す。ＮＣＢＩヌクレオチドデータベースの検索により、２２Ａ５軽鎖の免疫グロブリン配列Ｖｋ １９−２３遺伝子（アクセッション番号ＡＪ２３５９６１）との相同性が明らかになった。
【図５Ａ】配列番号：１の重鎖核酸配列に対応するアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）をアミノ酸残基の上方に示す。
【図５Ｂ】配列番号：７の軽鎖核酸配列に対応するアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。フレームワーク領域（ＦＷＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）をアミノ酸残基の上方に示す。
Claims (81)
- 対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、
障害が抑制または軽減されるように、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質の有効量を対象に投与し、それによって虚血特異的抗原と結合した病原性免疫グロブリンの数を減少させることを含む方法。 - 対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、
障害が抑制または軽減されるように、病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質の有効量を対象に投与し、その結果、補体活性を活性化する病原性免疫グロブリンの数を減少させることを含む方法。 - 病原性免疫グロブリンがＩｇＭである、請求項１または２記載の方法。
- 病原性免疫グロブリンがＩｇＭのサブクラスである、請求項１または２記載の方法。
- 病原性免疫グロブリンがＢ細胞のサブポピュレーションによって産生される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
- 虚血特異的抗原が内皮細胞または実質組織の表面に存在する、請求項１記載の方法。
- 対象が哺乳動物である、請求項１または２記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項７記載の方法。
- 再灌流障害または虚血障害が自然発生性の発作の後に結果として生じる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
- 再灌流障害または虚血障害が外科的処置の最中または後に生じる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
- 外科的処置が、血管形成術、ステント処置、アテローム切除術およびバイパス手術からなる群から選択される、請求項１０記載の方法。
- 阻害物質が、タンパク質、ペプチド、有機低分子、抗体またはその断片、糖質および糖タンパク質からなる群から選択される、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
- 障害が心血管組織において生じる、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
- 対象における免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、
病原性免疫グロブリンまたは病原性免疫グロブリンを産生するＢ細胞を対象から除去し、またはそれを不活性化し、それによって対象に存在する病原性免疫グロブリンまたはＢ細胞の量を減らすことを含む方法。 - 除去または不活性化の段階がエクスビボで行われる、請求項１４記載の方法。
- 病原性免疫グロブリンの除去または不活性化の段階が、抗イディオタイプ抗体を対象に投与することによって行われる、請求項１５記載の方法。
- Ｂ細胞の除去または不活性化の段階が、Ｂ細胞標的指向性部分を毒素と結合させたものを対象に投与することによって行われる、請求項１６記載の方法。
- 対象が哺乳動物である、請求項１４記載の方法。
- 哺乳動物がヒトである、請求項１８記載の方法。
- 障害がインビボで生じる、請求項１４記載の方法。
- 障害が心血管組織において生じる、請求項１４記載の方法。
- 以下の特性のうち１つまたは複数を有する、単離された病原性免疫グロブリンまたはその抗原結合部分：（ｉ）虚血特異的抗原との相互作用が可能である；（ｉｉ）補体を固定することができる；または（ｉｉｉ）Ｂ細胞のサブポピュレーションによって産生される。
- ＩｇＭである、請求項２２記載の病原性免疫グロブリン。
- 補体結合性または活性を変化させる変異を有する、改変された病原性免疫グロブリン。
- 虚血特異的抗原との相互作用が可能である、請求項２４記載の改変された病原性免疫グロブリン。
- ＩｇＭである、請求項２４記載の改変された病原性免疫グロブリン。
- 虚血特異的抗原を単離するための方法であって、
病原性免疫グロブリンを提供する工程；
虚血特異的抗原を含む試料を病原性免疫グロブリンと、病原性免疫グロブリンと試料との特異的結合が可能な条件下で接触させる工程；
対照と比較して病原性抗体と試料との結合レベルの変化を検出する工程であって、試料の存在下における病原性免疫グロブリンの結合レベルに対照で検出されたものと比較して変化があることによって特異的結合が示される、工程；および 虚血特異的抗原を試料から単離する工程
を含む方法。 - 試料が虚血特異的抗原を豊富に含む、請求項２７記載の方法。
- 試料が再灌流障害または虚血障害のある対象から得られる、請求項２７記載の方法。
- 試料が生化学的単離物である、請求項２７記載の方法。
- 試料が発現ライブラリーである、請求項２７記載の方法。
- 病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質を多数の被験化合物から同定するための方法であって、
病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下において、病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原を含む反応混合物を提供する工程；
病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原を１つまたは複数の被験化合物と接触させる工程；ならびに
被験化合物の非存在下において検出されたものと比較して、被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合のいかなる変化も検出する工程、を含み、
被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合レベルに被験化合物の非存在下において検出されたものと比較して変化があることによって、被験化合物が病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質であることが示される、方法。 - 病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質を多数の被験化合物から同定するための方法であって、
病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下で、病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を含む反応混合物を提供する工程；
病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を１つまたは複数の被験化合物と接触させる工程；ならびに
被験化合物の非存在下において検出されたものと比較して、被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合のいかなる変化も検出する工程、を含み、
被験化合物の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合レベルに被験化合物の非存在下において検出されたものと比較して変化があることによって、被験化合物が病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質であることが示される、方法。 - 病原性免疫グロブリンが病原性ＩｇＭである、請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
- 虚血特異的抗原が内皮組織または内皮性の溶解産物から得られる、請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
- インビトロで行われる、請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
- 病原性免疫グロブリンを検出可能なシグナルによって標識する、請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
- 虚血特異的抗原を検出可能なシグナルによって標識する、請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
- 少なくとも１つの段階を反復することをさらに含む請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
- 多数の被験化合物が、少なくとも１０、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７種または１０８種の化合物を含む、請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
- 被験化合物がペプチドまたは有機低分子である、請求項３２または３３のいずれかに記載の方法。
- 請求項３２記載の方法によって同定された、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質。
- 請求項３３記載の方法によって同定された、病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質。
- 免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、
病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用を阻害する特性を有することが以下の方法によって決定された作用物質を対象に投与することを含む方法：
病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下で病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原を含む反応混合物を提供する工程；
病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原を作用物質と接触させる工程；ならびに
作用物質の非存在下において検出されたものと比較して、作用物質の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合の変化を検出する工程を含み、
作用物質の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合レベルに作用物質の非存在下において検出されたものと比較して変化があることによって、作用物質が病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質であることが示されるような方法。 - 免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、
病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用を阻害する特性を有することが以下の方法によって決定された作用物質を対象に投与することを含む方法：
病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下で含む反応混合物を提供すること；
病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を作用物質と接触させること；ならびに
作用物質の非存在下において検出されたものと比較して、作用物質の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合の変化を検出することを含み、
作用物質の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合レベルに作用物質の非存在下において検出されたものと比較して変化があることによって、作用物質が病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質であることが示されるような方法。 - 免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、
以下のアッセイ法において試験した際に病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用を阻害することができる作用物質を対象に投与することを含む方法：
病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原を、病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下で含む反応混合物を提供すること；
病原性免疫グロブリンおよび虚血特異的抗原を作用物質と接触させること；ならびに
作用物質の非存在下において検出されたものと比較して、作用物質の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合の変化を検出することを含み、
作用物質の存在下における病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合レベルが作用物質の非存在下において検出されたものと比較して阻害されていることによって、作用物質が病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用に対する阻害物質であることが示されるようなアッセイ法。 - 免疫グロブリンを介した再灌流障害または虚血障害を治療または予防するための方法であって、
以下のアッセイ法において試験した際に病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との相互作用を阻害することができる作用物質を対象に投与することを含む方法：
病原性免疫グロブリンと虚血特異的抗原との結合が生じうる条件下で、病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を含む反応混合物を提供すること；
病原性免疫グロブリンおよび補体経路の成分を作用物質と接触させること；ならびに
作用物質の非存在下において検出されたものと比較して、作用物質の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合の変化を検出することを含み、
作用物質の存在下における病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との結合レベルが作用物質の非存在下において検出されたものと比較して阻害されていることによって、作用物質が病原性免疫グロブリンと補体経路の成分との相互作用に対する阻害物質であることが示されるようなアッセイ法。 - 免疫グロブリンがＢ−１細胞によって産生される、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- ＡＴＣＣに寄託される予定であるアクセッション番号（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−３５０７）のハイブリドーマによって産生される、請求項２２記載の単離された病原性抗体。
- 配列番号：８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 配列番号：２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 配列番号：１０に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ１領域を含む軽鎖可変領域を有する、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 配列番号：１２に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域を含む軽鎖可変領域を有する、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 配列番号：４のアミノ酸配列を含むＣＤＲｌ領域を含む重鎖可変領域を有する、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 配列番号：６に示したアミノ酸配列を含むＣＤＲ２領域を含む重鎖可変領域を有する、請求項２２記載の単離された病原性抗体。
- 配列番号：８に示したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、および配列番号：２に示したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- ヒト免疫グロブリンである、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 免疫グロブリンが非ヒト免疫グロブリンである、請求項２２記載の単離された病原性抗体。
- 非ヒト抗体が哺乳動物由来である、請求項５８記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 哺乳動物がウシ、ヤギ、マウス、ラット、ヒツジ、ブタおよびウサギからなる群から選択される、請求項５９記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 組換え抗体である、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 配列番号：４および配列番号：６に示した重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域またはその抗原結合断片、ならびに配列番号：１０および配列番号：１２に示した軽鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域またはその抗原結合断片を含む、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 免疫グロブリンがヒトフレームワーク領域を含む、請求項６２記載の単離された病原性抗体。
- 以下のものからなる群から選択される、単離された核酸分子：
ａ）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５のヌクレオチド配列との同一性が少なくとも９６％であるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：１、配列番号：３または配列番号：５のヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
ｃ）配列番号：１のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。 - 配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ベクター核酸配列をさらに含む、請求項６４記載の核酸分子。
- 請求項６４記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- 哺乳動物宿主細胞である、請求項６６記載の宿主細胞。
- 以下のものからなる群から選択される、単離された核酸分子：
ａ）配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１のヌクレオチド配列との同一性が少なくとも９６％であるヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｂ）配列番号：７、配列番号：９または配列番号：１１のヌクレオチド配列を含む核酸分子；および
ｃ）配列番号：７のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子。 - 配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
- ベクター核酸配列をさらに含む、請求項６９記載の核酸分子。
- 請求項６９記載の核酸分子を含む宿主細胞。
- 哺乳動物宿主細胞である、請求項７２記載の宿主細胞。
- 配列番号：２、配列番号：４または配列番号：６のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号：２のアミノ酸配列を含む、請求項７４記載のポリペプチド。
- 配列番号：８、配列番号：１０または配列番号：１２のアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
- 配列番号：８のアミノ酸配列を含む、請求項７６記載のポリペプチド。
- ポリペプチドを生産するための方法であって、請求項６７記載の宿主細胞を、核酸分子が発現される条件下で培養することを含む方法。
- ポリペプチドを生産するための方法であって、請求項７２記載の宿主細胞を、核酸分子が発現される条件下で培養することを含む方法。
- 配列番号：１２に示したアミノ酸配列および配列番号：１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を有する、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
- 配列番号：４に示したアミノ酸配列および配列番号：６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を有する、請求項２２記載の単離された病原性免疫グロブリン。
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