CN112654711B - Cas蛋白抑制剂的组合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了能够结合并抑制Cas蛋白与核酸分子结合的能力的氨基酸序列，从而抑制所述Cas蛋白在基因组编辑中的功能。此类Cas蛋白抑制剂可由主要外壳蛋白(G8P)、所述G8P的胞外区(G8PEX)或生物等效物组成，可用于改善基于Cas蛋白的基因组编辑过程的特异性。

Description

Cas蛋白抑制剂的组合物及应用
本申请要求2018年8月29日提交的PCT/CN2018/102908的优先权，其全文通过引用并入本文。
背景技术
基因组编辑可用于修正隐藏在遗传疾病后的驱动突变，从而能够完全治愈在活生物体中的这些疾病；基因组编辑还可用于工程化作物的基因组，从而提高作物的产量并赋予作物对环境污染或病原体感染的抗性；同样，通过精确的基因组编辑进行微生物基因组转化对可再生生物能源的发展具有重要意义。
因其无与伦比的编辑效率、便利性以及在活生物体中的潜在应用，CRISPR/Cas(规律间隔成簇短回文重复序列/CRISPR相关蛋白)系统已成为最强大的基因组编辑工具。在向导RNA(guideRNA,gRNA)的引导下，Cas核酸酶可以在各种细胞(细胞系和活生物体的细胞)的靶基因组位点产生DNA双链断裂(DoubleStrandBreak,DSB)。然后通过内源性DNA修复系统修复这些DSB，可用于执行所需的基因组编辑。
最近开发了将CRISPR/Cas系统与APOBEC(载脂蛋白B mRNA编辑酶，催化多肽样)胞嘧啶脱氨酶家族整合的碱基编辑器(BaseEditor,BE)，其大大提高了CRISPR/Cas9介导的基因修正的效率。通过与Cas9切口酶(nCas9)或无催化活性的Cas9(dCas9)融合，可以将大鼠APOBEC1(rA1)的胞嘧啶(C)脱氨基活性定向到基因组中的靶碱基，并在这些碱基处催化C替换为胸腺嘧啶(T)。
在使用基因组编辑方法的过程中，会产生非特异性和非预期的(“脱靶”)遗传修饰。例如，在CRISPR/Cas系统中，如果复合物不结合靶序列(通常是同源序列和/或错配耐受的结果)，它们将切割脱靶的DSB并引起非特异性的遗传修饰。脱靶效应包括不需要的点突变、缺失、插入、倒位和易位。需要开发减少此类脱靶基因修饰的方法。
发明内容
本公开提供了用于Cas蛋白的肽抑制剂的组合物及其在基因组编辑中的用途。本公开的一个实施方案提供了一种改善基于Cas蛋白的基因组编辑过程的特异性的方法，所述方法包括将经过基于Cas蛋白的基因组编辑过程的样品与多肽或编码所述多肽的多核苷酸接触，其中，所述多肽包含能够结合所述Cas蛋白的主要外壳蛋白(G8P)、所述G8P的胞外区(G8PEX)、或所述G8P或所述G8PEX的生物等效物。
在一些实施方案中，所述Cas蛋白选自SpCas9、SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9、AsCpf1、FnCpf1、SsCpf1、PcCpf1、BpCpf1、CmtCpf1、LiCpf1、PmCpf1、Pb3310Cpf1、Pb4417Cpf1、BsCpf1、EeCpf1、RfCas13d、LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、其变体、以及其化学修饰形式组成的组，所述Cas蛋白可与所述多肽抑制剂或其化学修饰的形式相互作用。在一些实施方案中，向样品同时提供所述Cas蛋白和所述多肽或多核苷酸。
在一些实施方案中，所述多核苷酸还包含诱导型启动子。在一些实施方案中，在样品已经与所述Cas蛋白接触之后提供所述多肽或多核苷酸。在一些实施方案中，所述多肽是化学修饰的。
在一些实施方案中，所述基于Cas蛋白的基因组编辑过程是体外进行的。在一些实施方案中，样品不限于酵母、细菌或病毒。
在一个实施方案中，还提供了一种在受试者中进行基因组编辑的方法，所述方法包括：向受试者施用基于Cas蛋白的基因组编辑系统；并且之后向受试者施用多肽或编码所述多肽的多核苷酸，其中，所述多肽包含能够结合所述Cas蛋白的主要外壳蛋白(G8P)、所述G8P的胞外区(G8PEX)、或所述G8P或所述G8PEX的生物等效物。
在一些实施方案中，在基于Cas蛋白的基因组编辑系统的基因组编辑启动后施用所述多肽或多核苷酸。在一些实施方案中，在基于Cas蛋白的基因组编辑系统施用后至少12小时后施用所述多肽或多核苷酸。在一些实施方案中，所述施用是静脉注射、肌肉注射、鼻腔喷雾或局部施用。
另一个实施方案提供了一种在受试者中进行基因组编辑的方法，所述方法包括向所述受试者施用基于Cas蛋白的基因组编辑系统和编码可操作地连接诱导型启动子的多肽的多核苷酸，其中，所述多肽包含能够结合所述Cas蛋白的主要外壳蛋白(G8P)、所述G8P的胞外区(G8PEX)、或所述G8P或所述G8PEX的生物等效物。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在基于Cas蛋白的基因组编辑系统的基因组编辑启动之后，通过激活所述诱导型启动子来诱导所述多肽的表达。在一些实施方案中，所述Cas蛋白和所述多肽由同一核酸构建体编码。
在一个实施方案中，进一步提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，所述第一多核苷酸片段编码Cas蛋白；所述第二多核苷酸片段编码包含能够结合所述Cas蛋白的主要外壳蛋白(G8P)、所述G8P的胞外区(G8PEX)、或所述G8P或所述G8PEX的生物等效物的多肽。
在一些实施方案中，所述第二多核苷酸片段可操作地连接诱导型启动子，以在细胞中表达所述多肽。在一些实施方案中，所述Cas蛋白选自SpCas9、SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9、AsCpf1、FnCpf1、SsCpf1、PcCpf1、BpCpf1、CmtCpf1、LiCpf1、PmCpf1、Pb3310Cpf1、Pb4417Cpf1、BsCpf1、EeCpf1、RfCas13d、LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b及其变体组成的组。
在一些实施方案中，所述载体还包含一种或多种蛋白质的编码序列，所述蛋白质选自胞苷脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制剂(uracilglycosylaseinhibitor,UGI)组成的组。
另一个实施方案提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码多肽的核苷酸片段和用于在真核细胞中表达氨基酸序列的可操作连接的启动子，其中，所述多肽包含能够结合所述Cas蛋白的主要外壳蛋白(G8P)、所述G8P的胞外区(G8PEX)、或所述G8P或所述G8PEX的生物等效物。
在一些实施方案中，所述启动子在哺乳动物细胞中启动所述核苷酸片段的转录。在一些实施方案中，所述启动子是诱导型。
还提供了一种组合物、组合或试剂盒，其包含Cas蛋白和多肽，所述多肽包含能够结合所述Cas蛋白的主要外壳蛋白(G8P)、所述G8P的胞外区(G8PEX)、或所述G8P或所述G8PEX的生物等效物。
在一些实施方案中，本公开的所述多肽作为病毒颗粒(例如一个完整的M13噬菌体)或纳米颗粒的一部分提供。
在另一个实施方案中，本公开还提供了一种分子，所述分子包含Cas蛋白、多肽和连接所述Cas蛋白和所述多肽的可剪切的接头，所述多肽包含能够结合所述Cas蛋白的主要外壳蛋白(G8P)、所述G8P的胞外区(G8PEX)、或所述G8P或所述G8PEX的生物等效物。
在一些实施方案中，所述可剪切的接头是包含蛋白酶剪切位点的肽。在一些实施方案中，所述蛋白酶剪切位点是自剪切位点。在一些实施方案中，所述可剪切的接头是光激活或药物激活的。在一些实施方案中，所述Cas蛋白与胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶融合。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载体和多肽，所述多肽包含能够结合所述Cas蛋白的主要外壳蛋白(G8P)、所述G8P的胞外区(G8PEX)、或所述G8P或所述G8PEX的生物等效物。在一些实施方案中，所述组合物可以注射剂、片剂、胶囊剂、凝胶剂、乳膏剂或喷雾剂的形式提供。
在任何实施方案中，所述G8P可以选自SEQ ID NO:11-20组成的组。在任何实施方案中，所述G8PEX选自SEQ ID NO:1-10组成的组。在任何实施方案中，所述生物等效物与所述G8P或所述G8PEX具有至少70％的序列同一性。在任何实施方案中，所述生物等效物选自SEQID NO:37-436组成的组。
本发明还提供了包含氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列衍生自选自SEQ ID NO:1-22和37-436组成的组的序列中包括一个、两个、三个、四个或五个氨基酸的添加、缺失、替换或其组合，其中所述多肽能够结合Cas蛋白。还提供了一种在受试者中进行基因组编辑的方法，所述方法包括：向受试者施用基于Cas蛋白的基因组编辑系统；和向所述受试者施用所述多肽或编码所述多肽的多核苷酸。
附图说明
图1为来自噬菌体M13的主要外壳蛋白G8P抑制SpCas9的体外活性。a-b，在Cas9/sgRNA核糖核蛋白(Cas9RNP)组装之前(a)或之后(b)，完整的M13噬菌体对SpCas9的体外活性的抑制。c-d，在Cas9RNP装配之前(a)或之后(b)，通过G8PEX对SpCas9的体外活性的抑制。箭头指示剪切产物。两次生物学重复的结果显示为平均值±SD。图画不是按比例绘制的。
图2为确定G8PEX和SpCas9之间的相互作用位点。a，通过体外剪切确定，在6-11位的丙氨酸突变消除了G8PEX对SpCas9的抑制活性。(a)中显示的序列自上而下包括野生型：AEGDDPAKAAFDSLQASATEY(SEQ ID NO:3)，突变体1：AAAAAPAKAAFDSLQASATEY(SEQ ID NO:30)，突变体2：AEGDDAAAAAFDSLQASATEY(SEQ ID NO:31)，突变体2：AEGDDPAKAAAAAAAASATEY(SEQ ID NO:32)，和突变体4：AEGDDPAKAAFDSLQAAAAAA(SEQ ID NO:33)。b，G8PEX的结构分析。上图，图中显示了G8PEX的结构(PDB entry 2MJZ)，残基6-11显示为棒状。此图由PyMOL生成。下图是野生型(WT)和突变体2G8PEX肽的圆二色性(circulardichroism,CD)光谱。c，通过质谱分析鉴定SpCas9和交联的G8PEX之间的交界面。PyMOL显示与抑制蛋白AcrIIA4(PDBentry5VW1)复合的SpCas9结构。AcrIIA4显示为蓝色。SpCas9上的候选G8PEX结合位点分别以绿色和红色显示。d，丙氨酸扫描确定了KSVKEL(SEQ ID NO:23)和EKNPID(SEQ ID NO:34)位点对于SpCas9核酸酶的催化活性的重要性。箭头指示剪切产物。
图3为G8PEX对Cas9-sgRNA结合的影响。a，EMSA显示G8PEX破坏Cas9-sgRNA结合。b，G8PEX对Cas9-sgRNA结合的剂量依赖性抑制活性。结果显示为平均值±SD(n＝2)。c，在加入sgRNA之前或之后，G8PEX对Cas9-sgRNA结合的不同抑制作用。d，G8PEX突变体2对Cas9-sgRNA结合的抑制活性减弱。
图4为哺乳动物细胞中G8PEX对CRISPR/Cas基因组编辑活性的抑制。a-b，通过共同递送G8PEX肽抑制K562(a)和Hela(b)细胞中核转染的Cas9/sgRNARNP的基因组编辑活性。c-d，通过过表达G8PEX抑制HEK293(c)和Hela(d)细胞中瞬时转染的CRISPR/Cas9的基因组编辑活性。e，过表达G8PEX对CRISPR/Cas9特异性的影响。通过Student’st检验可以检验在不存在或存在G8PEX的情况下CRISPR/Cas9的特异性之间的显著差异。f-g，通过过表达G8PEX抑制K562(f)和小鼠N2A(g)细胞中瞬时转染的CRISPR/Cas12a(Cpf1)的基因组编辑活性。结果显示为平均值±SD(n＝2或3)。箭头指示T7E1测定中的剪切产物。
图5为SpCas9和噬菌体M13G8PEX之间的交界面的质谱(Massspectrometry,MS)分析。在SpCas9和G8PEX肽之间鉴定出两个交联事件，包括在KSVKEL(SEQ ID NO:23)和AEGDDPAKAAF(SEQ ID NO:24)之间的一个，以及在ENKPIDFLEAKGY(SEQ ID NO:25)和AEGDDPAKAAF(SEQ ID NO:24)之间的一个。
图6为SpCas9的KS和EK突变体的构建和纯化。a，S.pyogenesCas9的结构域组织的示意图。BH为桥接螺旋。PI为PAM相互作用结构域(KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDLEAK；SEQ ID NO:26)。丙氨酸突变位于KS(KGKSKKLAAAAAALGITIMERSSFEKNPIDLEAK；SEQ ID NO:35)和EK(KGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFAAAAAALEAK；SEQ ID NO:36)突变体中。b，纯化的SpCas9蛋白的WT、KS突变体和EK突变体。
图7为研究选定的G8PEX直系同源物。a，选定的G8PEX列表(最后一列从上而下的SEQID NO:1-10)。b，体外剪切反应显示了不同的G8PEX对SpCas9的抑制活性。结果显示为平均值±SD(n＝2)。箭头指示剪切产物。将10％ DMSO作为溶剂对照。c，M13和M7的G8PEX肽的氨基酸序列，分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:21。d-e，M7 G8PEX对SpCas9的sgRNA结合的抑制(d)和DNA剪切活性的抑制(e)。结果显示为平均值±SD(n＝2)。
图8为G8PEX抑制HEK293细胞中的A3A胞苷碱基编辑器(CBE，hAPOBEC1-nCas9-UGI)的C-T转化活性。通过下一代测序分析多个sgRNA和靶标位点。两次或三次生物学重复的结果显示为平均值±SD。
图9为G8PEX可以改善A3A CBE的靶向特异性。G8PEX处理对窗口外位点(C1、C12-C17)的抑制作用明显大于对靶标位点(C2-C11)的抑制作用。通过下一代测序分析多个sgRNA和靶标位点。两次或三次生物学重复的结果显示为平均值±SD。
发明详述
定义
应注意，术语“一种(个)”物体是指该物体中的一种(个)或多种(个)；例如，“一种多肽”解释为代表一种或多种多肽。因此，术语“一种(个)”、“一种(个)或多种(个)”和“至少一种(个)”可以在本文中互换使用。
主要外壳蛋白和片段、以及使用方法
本文中意见发现，来自噬菌体病毒的主要外壳蛋白(即G8P)可以结合并阻止Cas蛋白结合向导核苷酸。如实验实施例所示，所述结合可以发生在G8P的胞外区(也称为“G8PEX”)，具体是位于α-螺旋结构的N末端部分，以及Cas蛋白上RNA或DNA结合口袋的远端的一个位点之间。因此，这种结合变构抑制Cas蛋白的功能。
最初的发现来自Inoviridae inovirus噬菌体(M13)的G8P(包括噬菌体本身)，但进一步的实验表明其他G8PEX，例如由噬菌体Pf1、f1、I2-2和L.monocytogenes(李斯特氏菌)噬菌体M7制备的G8PEX也有效抑制了Cas与RNA的结合。此外，这些肽不仅抑制Cas9蛋白的功能，而且还与另一种Cas蛋白Cas12a(Cpf1)结合并具有抑制作用。这些结果表明，主要外壳蛋白是在噬菌体中广泛存在的Cas抑制剂。
所述G8P蛋白和片段可以为基因组编辑中的脱靶编辑问题提供现成的解决方案。基于Cas蛋白的基因组编辑复合物成功编辑了靶基因组位点后，G8P蛋白和片段可以防止对基因组其他部分的不需要的损害。
因此，根据本公开的一个实施方案，提供了一种改善细胞中基于Cas蛋白的基因组编辑过程的特异性的方法。该方法需要使细胞与主要外壳蛋白(G8P)、其细胞外部分或各自的生物衍生物接触。
下表1中提供了G8P蛋白及其胞外部分(G8PEX)的实例，已对其结合和抑制Cas蛋白的能力进行了检验。
表1示例性G8P和G8PEX
如实施例2中所示，G8PEX的同源物(生物等效物)也已通过信息学方法鉴定(例如，SEQ ID NO:37-436)，并且预期表现出相似的结合和抑制活性。
如实施例1所示，G8PEX中的某些氨基酸残基对于结合是重要的，而其他氨基酸残基则不那么重要或不重要。这些重要的氨基酸残基，例如，可以位于α-螺旋结构的N末端部分。因此，如果修饰(替换、缺失或添加)G8PEX其他部分中的一个、两个或多个氨基酸残基，则预期此类变体仍保留结合和抑制活性。因此，G8P和G8PEX的此类生物学等效物也在本公开的范围内。
参考氨基酸序列的术语“生物等效物”是指具有与参考氨基酸序列一定程度的序列同一性，同时保留了参考氨基酸序列的所需的结构、功能或活性的氨基酸序列。在一些方面，序列同一性至少为约70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％。在一些方面，与参考多肽相比，生物等效物具有1、2、3、4或5个氨基酸的添加、缺失、替换及其组合。G8P或G8PEX的生物学等效物的所需结构是α螺旋结构。G8P或G8PEX的生物等效物的所需活性是与Cas蛋白结合和/或抑制Cas蛋白与核酸分子(例如sgRNA)结合的能力。
在一些实施方案中，所述氨基酸替换、添加和/或缺失不在G8P或G8PEX序列的α-螺旋结构的N末端部分内(例如，N末端5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基)。在一些实施方案中，所述氨基酸替换、添加和/或缺失不在G8P或G8PEX序列的α-螺旋结构的N末端部分内(例如，N末端5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基)。在一些实施方案中，至少一些或全部的氨基酸替换、添加和/或缺失不在G8P或G8PEX序列的α-螺旋结构内。在一些实施方案中，所述G8P或G8PEX的生物等效物保留了α-螺旋结构。
在一些实施方案中，一个或多个氨基酸替换是保守氨基酸替换。“保守氨基酸替换”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，β-支链侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，免疫球蛋白多肽中的非必需氨基酸残基优选地由来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基替换。在另一个实施方案中，一条氨基酸可以用结构相似的另一条代替，二者在侧链家族成员的顺序和/或组成上不同。
下表提供了保守性氨基酸替换的非限制性示例，其中相似性得分为0或更高表示两个氨基酸之间发生了保守性替换。
表A氨基酸相似性矩阵
表B保守氨基酸替换
在一些实施方案中，G8P或G8PEX的生物等效物保留结合Cas蛋白和/或抑制Cas蛋白与核酸分子例如sgRNA结合的能力。
本公开的多肽包含G8P或G8PEX或生物等效物，可以作为融合蛋白的一部分、作为独立蛋白、或作为病毒颗粒诸如噬菌体的一部分来递送。如实验实施例所示，完整的M13噬菌体、分离的G8P蛋白和G8PEX片段均表现出抑制效应。因此，在一些实施方案中，所述多肽通过病毒颗粒提供，所述病毒颗粒包括含有G8P蛋白或生物等效物的病毒。
术语“Cas蛋白”或“成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)相关(Cas)蛋白”是指RNA引导的DNA核酸内切酶，其与酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、以及其他细菌中的CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)适应性免疫系统相关。Cas蛋白的非限制性实例包括酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(SaCas9)、氨基酸球菌(Acidaminococcus sp.)Cas12a(AsCpf1)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium)Cas12a(LbCpf1)和新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)Cas12a(FnCpf1)。在Komor et al.,“CRISPR-BasedTechnologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes,”Cell.2017Jan 12；168(1-2):20-36中提供了其他示例。
非限制性实例包括SpCas9、FnCas9、St1Cas9、St3Cas9、NmCas9、SaCas9、AsCpf1、LbCpf1、FnCpf1、VQR SpCas9、EQR SpCas9、VRER SpCas9、RHA FnCas9和KKH SaCas9。在一些实施方案中，Cas蛋白是选自以下蛋白的突变体：SpCas9、FnCas9、St1Cas9、St3Cas9、NmCas9、SaCas9、AsCpf1、LbCpf1、FnCpf1、VQR SpCas9、EQR SpCas9、VRER SpCas9、RHAFnCas9和KKH SaCas9，其中，所述突变体保留了DNA结合能力，但不引入双链DNA断裂。Cas蛋白还包括可以与Cas蛋白抑制剂或其化学修饰形式相互作用的化学修饰形式。
例如，已知在SpCas9中，残基Asp10和His840对于Cas9的催化(核酸酶)活性很重要。当两个残基都突变为Ala时，突变体失去了核酸酶活性。在另一个实施方案中，仅产生Asp10Ala突变，并且这种突变蛋白不能产生双链断裂，而是在其中一条链上产生切口。这种突变体也称为Cas9切口酶。
此类和更多实例如下表C所示。
表C示例性Cas蛋白
如本文所用，“基于Cas蛋白的基因组编辑过程”是指一种可以在体外或体内、在原核或真核细胞、组织、器官或体内使用Cas蛋白，优选与其他蛋白质和核酸一起使用，以实现在基因组中进行遗传改造的目的的方法。此类方法的实例包括但不限于CRISPR-Cas基因编辑，以及使用无催化活性的Cas(dCas)蛋白、胞苷脱氨酶和腺苷脱氨酶进行碱基编辑。
如本文所用，“基于Cas蛋白的基因组编辑系统”是指所需的生物分子的组合物或组合，以执行基于Cas蛋白的基因组编辑过程。此类生物分子包括如本文所述的Cas蛋白，以及任选地向导核酸、胞苷脱氨酶和/或尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)。
在一个实施方案中，提供本公开的“Cas蛋白抑制剂”(例如，G8P、G8PEX或其生物等效物)至进行基于Cas蛋白的基因组编辑过程例如基因组编辑或碱基编辑的细胞。在体外系统中，可以将所述Cas蛋白抑制剂添加到包括所述细胞在内的溶液中。对于在诸如患者的个体上进行的过程，可以使用本领域已知的途径来施用Cas蛋白抑制剂。
如在实施例中观察到的，G8P、G8PEX或其生物等效物与Cas蛋白在Cas蛋白的核酸结合位点的远端位点结合。因此，这种结合会变构地抑制Cas蛋白与核酸分子(例如sgRNA)的结合。因此，在Cas蛋白已经结合至核酸之后加入G8P、G8PEX或其生物等效物不会影响现有的结合。换句话说，加入G8P、G8PEX或其生物等效物将仅阻止或抑制新的Cas蛋白-核酸结合。这些肽的这种性质具有优势。
例如，当将基于Cas蛋白的基因组编辑系统引入细胞时，初始的基因组编辑更有可能是正确的(所需的)。在初始编辑阶段之后，更可能发生脱靶(不需要的)编辑。因此，为了减少由基于Cas蛋白的系统引起的不希望的基因组变化，可以在启动所需的编辑后加入(或诱导表达)G8P、G8PEX或其生物等效物。这样，G8P、G8PEX或其生物等效物的加入不会影响所需的编辑，而仅阻止/抑制不需要的编辑。
因此，在一些实施方案中，提供了一种基因组编辑方法，其中将基于Cas蛋白的基因组编辑系统和Cas蛋白抑制剂(例如G8P、G8PEX或其生物等效物)提供至样品(或向受试者施用)。在一些实施方案中，Cas蛋白和Cas蛋白抑制剂是同时提供的，例如在同一载体编码的结合的组合物中。在这样的设置中，Cas蛋白抑制剂可以可操作地连接至诱导型启动子，该启动子可以在Cas蛋白的基因组初始编辑阶段启动后用于诱导表达。
诱导型启动子是本领域已知的。化学试剂、温度和光都是可以导致启动子诱导的因素示例。化学试剂的常见示例是酒精、四环素、类固醇、异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、阿拉伯糖、金属和病原体相关的病原体(例如病原体感染。水杨酸、乙烯和苯并噻二唑(BTH))。
在一些实施方案中，在Cas蛋白之后提供/施用Cas蛋白抑制剂。可以针对具体情况确定这种提供/施用的时间。例如，对于哺乳动物而言，在施用基于Cas蛋白质的基因组编辑系统后，系统最多可能需要2、4、6、8、12、18、24小时或1、2、3或4天启动适当的基因组编辑。该时间段可以进一步调节，这取决于Cas蛋白抑制剂是以蛋白质还是需要转录和翻译的多核苷酸的形式施用。
不受限制并且如以下进一步详细描述，本公开的Cas蛋白抑制剂可以以凝胶、乳膏、溶液或雾化颗粒的形式提供。可以不限于通过静脉注射、肌肉注射或局部施用递送至受试者。
复合分子
设想在某些情况下，基于Cas蛋白的基因组编辑系统仅应在某些指定的时间或位置发挥作用。例如，当将该系统施用于受试者(人、动物、植物等)时，可能希望该系统仅在靶组织(例如，肝、皮肤)中起作用。换句话说，不需要系统在其他组织中发挥作用。本公开利用新发现的Cas蛋白抑制剂提供一种现成的解决方案。
在一个实施方案中，提供了一种复合分子，其包括Cas蛋白，包含主要外壳蛋白(G8P)、G8P的胞外区(G8PEX)、或者G8P或G8PEX的生物等效物的多肽，所述多肽具有结合Cas蛋白的能力(统称为Cas蛋白抑制剂)，以及连接Cas蛋白和所述多肽的可剪切的接头。
可选择或设计可剪切的接头，使得其仅在靶组织中或在靶时间被剪切。例如，可剪切的接头可以是光活化的，使得仅当将复合分子递送至皮肤时才剪切该接头，其中皮肤上的光激活了接头的剪切。在没有光照的组织中，鉴于Cas蛋白抑制剂结合复合分子中的Cas蛋白，从而阻止其与向导核酸结合，复合分子可能处于休眠状态。一旦Cas蛋白抑制剂被剪切(例如，在皮肤细胞中)，Cas蛋白就有机会结合到向导核酸上并开始发挥其基因组编辑功能(剪切的Cas蛋白抑制剂可能不具有足够的浓度来抑制Cas蛋白)。
可剪切的接头可以是包含蛋白酶剪切位点的肽。当可剪切的接头是肽时，复合分子可以是融合蛋白。在一些实施方案中，蛋白酶剪切位点包含自剪切肽，例如2A肽。“2A肽”是18-22个氨基酸长的病毒寡肽，在真核细胞的翻译过程中介导多肽的“剪切”。命名“2A”是指病毒基因组的特定区域，通常根据其病毒来源命名不同的病毒2A。最早发现的2A是F2A(口蹄疫病毒)，其后还鉴定了E2A(马鼻炎病毒)、P2A(猪破伤风病毒-1 2A)和T2A(胸腺病毒2A)。
如上所述，可剪切的接头可以是光活化的，或者是药物活化的、或者是pH依赖性的，不限于此。在一些实施方案中，将Cas蛋白与胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶融合。
变体、融合蛋白、载体和组合
SEQ ID NO:1-20是经检验具有Cas蛋白结合和抑制活性的野生型序列。预期它们的变体和同源物也具有这类活性。例如，通过生物信息学检索鉴定出SEQ ID NO:37-436。注意，这些序列中每一条的生物等效物也在本公开的范围内。
在任何实施方案中，本公开的Cas蛋白可以进一步与第二蛋白融合。第二蛋白可以选自FokI核酸酶结构域、转录激活因子样效应物(TALE)、锌指蛋白、转座酶、Krüppel氏关联盒(KRAB)转录抑制因子或转录激活因子。
在一些实施方案中，还提供了多核苷酸序列和载体，所述多核苷酸序列和载体编码本文所述的一条或多条氨基酸序列。除了Cas蛋白抑制剂的编码序列之外，载体还可以包括Cas蛋白的编码序列。另外或可选地，可以在相同的组合物、制剂、试剂盒或药盒中分开提供Cas蛋白或编码序列，以促使同时递送。在一些实施方案中，将Cas蛋白与胞苷脱氨酶融合，例如A3B(APOBEC3B)、A3C(APOBEC3C)、A3D(APOBEC3D)、A3F(APOBEC3F)、A3G(APOBEC3G)、A3H(APOBEC3H)、A1(APOBEC1)、A3(APOBEC3)和AID(AICDA)。在一些实施方案中，将Cas蛋白与腺苷脱氨酶融合，例如腺苷脱氨酶1(Ada1)和腺苷脱氨酶2(Ada2)(参见例如Gaudelli etal.,Nature,551,464-71(2017))。
在一些实施方案中，将Cas蛋白进一步与一种、两种、三种或更多种尿嘧啶糖基化酶抑制剂(UGI)融合。
组合物与施用
施用方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。Cas蛋白抑制剂或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如通过输注或大剂量注射、通过上皮或皮肤粘膜衬里(例如，口腔粘膜、直肠和胃肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。因此，包含本公开的多肽的药物组合物可以口服、直肠、肠胃外、鞘内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂、滴剂或透皮贴剂)、经颊或以口服或鼻喷雾剂的形式给药。
如本文所用，术语“肠胃外”是指施用形式，其包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输注。
施用可以是全身的或局部的。另外，可期望通过任何合适的途径将本公开的Cas蛋白抑制剂引入中枢神经系统，包括脑室内和鞘内注射；可以通过脑室内导管来促进脑室内注射，例如附接到诸如Ommaya容器的容器。也可以进行肺部给药，例如使用吸入器或喷雾器，并与雾化剂一起配制。
可以优选将Cas蛋白抑制剂或本公开的组合物局部施用于需要治疗的区域；这可以通过例如但不限于手术期间的局部输注、局部施用实现，例如与手术后的伤口敷料一起施用，通过导管、栓剂注射、或通过植入物施用，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜，例如唾液弹性膜或纤维。优选地，当施用本公开的蛋白时，必须注意使用不吸收蛋白的材料。
本公开的Cas蛋白抑制剂的量在治疗中是有效的。另外，可任选地采用体外分析以帮助确定最佳剂量范围。制剂中要使用的精确剂量还取决于给药途径以及疾病、病症或症状的严重性，并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可以从体外或动物模型检测系统的剂量反应曲线中推断出来。
本公开的Cas蛋白抑制剂可以以微粒或纳米颗粒的形式提供。因此，还提供了微粒或纳米颗粒的制备。可以通过形成水包油乳液，然后蒸发溶剂来制备微粒或纳米颗粒。油相可以选自那些具有低沸点的与水不混溶的溶剂，例如酯(例如乙酸乙酯、乙酸丁酯)，卤代烃(例如二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、氯乙烷、二氯乙烷、三氯乙烷)，醚(例如乙醚、异丙醚)，芳香烃(例如苯、甲苯、二甲苯)，碳酸盐(例如碳酸二乙酯)等或其混合物。油相还可包含各种比例的水混溶性溶剂(例如丙酮)和与水不混溶性溶剂(例如二氯甲烷)的混合物。合适的乳化剂可用于制备微粒或纳米颗粒，以增强油滴的抗聚结性，其中乳化剂选自但不限于包括聚氧乙烯脱水山梨糖醇酐脂肪酸酯例如单月桂酸酯和三月桂酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯和油酸酯；山梨糖醇脂肪酸酯聚山梨酯/>聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、卵磷脂、聚氧乙烯蓖麻油衍生物/>特别合适的是聚氧乙烯35蓖麻油和聚氧乙烯40氢化蓖麻油/>生育酚；生育酚聚乙二醇琥珀酸酯(维生素ETPGS)；棕榈酸酯生育酚和醋酸生育酚；聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(或/>)，钠CMC等或其混合物的组。用于配制微粒或纳米颗粒的合适的通道形成剂任选地选自但不限于聚乙二醇、乙基乙烯醇、甘油、季戊四醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯基吡咯烷酮、N-甲基吡咯烷酮、多糖例如糊精和/或水解淀粉、糖类、糖醇等或其混合物组成的组。
本公开还提供了药物组合物。这样的组合物包含有效量的蛋白和/或核苷酸，以及可接受的载体。在一个具体的实施方案中，术语“药学上可接受的”是指由联邦或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他公认的药典中列出的适用于动物，尤其是人类的药物。此外，“药学上可接受的载体”通常是任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包囊材料或制剂助剂。
术语“载体”是指施用于治疗的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体。此类药物载体可以是无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内给药时，水是优选的载体。盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如有需要，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐。抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠、螯合剂如乙二胺四乙酸、以及调节张力的试剂如氯化钠或右旋葡萄糖在本发明中也是可以预见的。这些组合物可以采取溶液剂、悬液、乳剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂等形式。该组合物可以用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可以包括标准载体，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例在E.W.Martin的Remington's PharmaceuticalSciences中有所描述，在此通过引用并入本发明。此类组合物将含有临床有效剂量的抗原结合多肽，优选以纯化后的形式，连同合适数量的载体，以提供适合于患者的给药形式。该制剂应该适用于给药方式。肠外制剂可以封装在安瓿瓶、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多剂量小瓶中。
在一个实施方案中，根据常规步骤将组合物配制成适合静脉内注射于人体的药物组合物。通常，用于静脉内给药的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因，从而缓解注射部位的疼痛。一般而言，有效成分单独供给或以单位剂量形式混合在一起供给，如以干燥的冻干粉末或无水浓缩物的形式装在可指示活性成分剂量的密封容器(如安瓿瓶或小袋)中。在通过输注施用组合物的情况下，可以用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶来分装组合物。在通过注射施用组合物的情况下，可以使用注射用的无菌水或盐水的安瓿瓶，使得可以在施用之前混合有效成分。
实施例
实施例1：噬菌体主要外壳蛋白衍生肽对CRISPR/Cas9的抑制
本实施例描述了以下发现：来自Inoviridae inovirus噬菌体(M13)的主要外壳蛋白G8P，或甚至完整的M13噬菌体，可以抑制酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9核酸酶(SpCas9)的活性。突变分析和高分辨率质谱确定了G8P肽和Cas9蛋白之间的候选交界面。发现G8P与SpCas9的结合位置在sgRNA或DNA结合口袋的远端。此外，体外DNA剪切和Cas9/sgRNA凝胶迁移率变动分析表明，G8P通过阻止形成Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物来抑制Cas9的活性。这些结果表明G8P在机理上不同于先前鉴定的抗CRISPR蛋白(Acrs)。G8P变构抑制SpCas9的功能。本实施例还显示，来自其他Inoviridae噬菌体和李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)血清型4a(M7菌株)噬菌体的G8P直系同源物可以抑制CRISPR/Cas9的活性，表明主要外壳蛋白是噬菌体入侵细菌免疫系统的通用机制。本实施例进一步表明G8P肽可以抑制人细胞中SpCas9的基因组编辑活性。
系统发生学分析表明噬菌体中广泛存在Acrs。但是到目前为止，只有一小部分的Acrs得到实验验证。在此，发现实验室广泛使用的噬菌体菌株M13可以抑制SpCas9的体外活性。在与sgRNA组装之前，对完整的M13噬菌体颗粒进行SpCas9处理可阻止底物DNA的剪切。抑制作用取决于M13噬菌体的浓度(图1a)。有趣的是，对噬菌体M13进行预先形成的Cas9/sgRNA RNP复合物处理并没有抑制剪切反应(图1b)。
这些发现促进了对噬菌体M13的表面蛋白的考察。本实施例发现主要外壳蛋白G8P(SEQ ID NO:11)的胞外区(SEQ ID NO:1)(G8PEX，SEQ ID NO:1)可以以类似于完整噬菌体的方式抑制SpCas9的活性。在RNP形成之前向Cas9中加入G8PEX可有效抑制DNA剪切，其半数最大抑制浓度(IC50)约为5μM(图1c)，而预先组装的Cas9 RNP的活性不受G8PEX的影响(图1d)。重要的是，完整的噬菌体或G8PEX的存在不会损害预先形成的Cas9 RNP对DNA剪切的活性，该结果表明，噬菌体或G8PEX不是sgRNA或DNA的直接竞争者。
为了理解抑制的机理，本实施例对21个氨基酸的G8PEX肽进行了丙氨酸扫描。设计了四个肽突变体，它们在G8PEX的不同片段上携带连续的丙氨酸。尽管突变体1、3和4显示出对Cas9有限的或没有降低的抑制活性，但是突变体2中6-11位的丙氨酸突变消除了G8PEX的抑制活性(图2a)。因为此片段包含三个天然丙氨酸残基，所以其他三个残基P6、K8和F11必然对G8PEX的抑制活性有关键作用。结构分析表明，G8PEX的6-11位位于α螺旋结构的N端。圆二色性(CD)光谱表明，该区域的丙氨酸突变阻止了α螺旋的形成(图2b)。G8PEX和Cas9之间的相互作用可能需要此α螺旋结构。
接下来，本实施例试图考察SpCas9上G8PEX的结合区。SpCas9和G8PEX使用碰撞诱导解离(collision-induced disassociation,CID)可剪切的交联剂二琥珀酰亚胺亚砜(DSSO)进行交联。交联产物用胰凝乳蛋白酶消化。通过单肽链片段离子的MS/MS和MS3，对CID诱导的交联肽的剪切进行整合分析，揭示来自SpCas9的[K]SVKEL肽的交联的残基K1158和E[K]NPIDFLEAKGY的K1176(图5)。这些肽在与间隔序列前体临近基序(protospaceradjacent motif,PAM)-相互作用(PI)结构域中占据一个连续区域，该区域负责识别非互补DNA链上的PAM序列(图2c和图6)。有趣的是，该候选G8PEX结合位点位于Cas9的sgRNA和DNA结合口袋的远端。这表明G8PEX可能作为一种变构抑制剂抑制Cas9的活性，这种机理不同于先前鉴定的Acrs，Acrs作为DNA模拟物与Cas9的DNA结合口袋结合。将这两个位点分别突变成丙氨酸，并纯化突变体(图6)。体外剪切反应表明，位于KSKVEL(K1158突变体)的丙氨酸突变消除了剪切活性，表明G8PEX结合位点对SpCas9的重要性。
SpCas9采用RNA诱导的结构构象变化来催化活化。K1158和K1176位于茎环1和2结合区的相对的表面，因此本实施例分析了G8PEX对Cas9核酸酶结合sgRNA的影响。使用固定浓度的sgRNA和递增浓度的Cas9蛋白进行凝胶电泳迁移率变动分析(electrophoresismobility shift assay,EMSA)。在不存在G8PEX的情况下，从Cas9:sgRNA的摩尔比为0.1开始观察到凝胶位移。在300μM G8PEX存在下，在较高的Cas9:sgRNA的摩尔比下观察到结合Cas9的sgRNA的凝胶位移，表明Cas9和sgRNA之间存在扰动的相互作用(图3a)。G8PEX对Cas9-sgRNA相互作用的抑制效应是浓度依赖性的。随着G8PEX浓度的增加，在较高的Cas9与sgRNA摩尔比下形成结合Cas9的sgRNA复合物(图3b)。
与剪切反应类似，G8PEX对Cas9-sgRNA相互作用的抑制取决于sgRNA加入的顺序。在固定的Cas9:sgRNA比例为0.4的情况下，在加入sgRNA之前，将Cas9与G8PEX孵育会完全抑制Cas9/sgRNA复合物的形成，此时G8PEX浓度为300和600μM。相反，当在加入sgRNA后补充G8PEX时，G8PEX在600μM或更低的浓度下未实现完全抑制(图3c)。这些结果表明G8PEX并不直接与sgRNA竞争结合Cas9。另外，携带P6至F11残基丙氨酸突变的G8PEX突变体2显示出对Cas9/sgRNA复合物形成的消除的抑制活性(图3d)。该结果与体外剪切一致(图2a)，并提供了进一步的证据表明G8PEX通过干扰Cas9与sgRNA的相互作用来抑制Cas9的核酸酶活性。总体而言，以上结果表明，G8PEX通过以变构形式破坏Cas9-sgRNA相互作用来抑制Cas9活性。
为了研究G8PEX是否是噬菌体用于抑制CRISPR/Cas的通用方法，本实施例分析了来自Inoviridae噬菌体的几种G8PEX肽(SEQ ID NO:2-10)(图7a)。结果发现，除了M13噬菌体G8PEX(SEQ ID NO:1)之外，来自噬菌体Pf1、f1和I2-2的G8PEX(分别为SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:9)可以在体外有效抑制SpCas9的剪切活性(图7b)。重要的是，来自L.monocytogenes(李斯特氏菌)(M7菌株)噬菌体M7的G8PEX直系同源肽(SEQ ID NO:21)(图7c)有效抑制SpCas9结合sgRNA(图7d)或剪切DNA底物(图7e)。这些结果表明，主要外壳蛋白G8P是噬菌体中广泛存在的CRISPR抑制剂。对与来自Psedomonas噬菌体Pf1的G8PEX交联的Cas9蛋白进行MS分析，鉴定出与观察到的M13噬菌体G8PEX相同的结合位点(图8)，支持了G8PEX以变构形式抑制Cas9活性。
为了探索G8PEX的适用性，本实施例评估了G8PEX对哺乳动物细胞中CRISPR/Cas的基因组编辑活性的影响。本实施例首先考察了G8PEX是否可以抑制作为共同递送肽的核转染的SpCas9蛋白的细胞活性。T7E1分析显示，G8PEX肽可在不同基因和细胞类型中使SpCas9蛋白失活(图4a-b)。与体外研究一致，当在Cas9/sgRNA RNP复合物形成之前而非之后补充G8PEX肽时，消除了SpCas9蛋白的基因组编辑活性(图4a-b)。这些数据进一步支持了G8PEX作为sgRNA或DNA的间接竞争者抑制Cas9的活性这一观点。接下来，本实施例评估了过表达的G8PEX对瞬时转染的CRISPR/Cas9的影响。通过脂质转染将Cas9和sgRNA编码质粒瞬时转染到人细胞中，在转染后6h转染G8PEX过表达质粒。发现在各种基因和细胞类型中G8PEX抑制瞬时转染的SpCas9的基因组编辑活性50％或更多(图4c-d)。重要的是，如在不存在或存在G8PEX的情况下的开/关剪切活性所证实的，G8PEX抑制了Cas9的活性而不损害其特异性(图4e)。为了研究G8PEX是否是不同CRISPR/Cas系统的通用转换开关，本实施例考察了其对CRISPR/Cas12a(Cpf1)的抑制作用。发现G8PEX抑制了人和小鼠细胞中Cpf1的基因组编辑活性(图4f-g)。
除了抑制CRISPR/Cas9的DNA的剪切活性外，G8PEX还可以用于调节Cas9衍生的碱基编辑器的活性。我们展示了G8PEX可以抑制HEK293细胞中A3A胞苷碱基编辑器(CBE，hAPOBEC1-nCas9-UGI)诱导的C-T转化。在不同sgRNA的多个基因组位点均观察到该抑制活性(图8)。此外，在相同的靶标位点中，G8PEX在不同的胞苷位点显示出不同程度的抑制作用。
A3A CBE可以在20-bp的靶标位点中的在靶位点(on-target site，2-11位)诱导C-T转化。此外，A3A CBE可以在窗口外位点(1位和12-20位)诱导C-T转化。令人惊讶的是，我们发现G8PEX在窗口外位点处显示出比在在靶位点处明显更强的抑制作用(图9)。换句话说，G8PEX存在的情况下，在靶位点和窗口外位点的比例升高。这表明G8PEX可用于改善在靶位点上的靶标特异性。
实施例2检索G8PEX同源序列
将在实施例1中成功检验的G8PEX序列作为检索同源物的输入序列。使用NCBIBLASTTM程序，以及以下参数(Expect threshold:10,Word size:6,Max matches in aquery range:0,Matrix:blosum62,Gap Costs:Existence:11Extension:1,Compositionaladjustments:Conditional compositional score matrix adjustment)。
如下表2所示，鉴定了400个重要的苗头序列。预期这些序列及其变体也具有结合Cas蛋白并抑制其结合核酸的功能的能力。
表2G8PEX同源物
/>
/>
/>
/>
/>
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/>
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/>
/>
/>
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/>
***
本发明的范围并不受所述旨在作为各个方面的单个说明的具体实施例的限制，并且功能上等同的任何组合物或方法均在本公开内容的范围内。对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可以对本发明的方法和组合物进行各种修改和改变。因此，本公开旨在覆盖落入本发明所附的权利要求及其等同物范围内的修改和变型。
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请都以引用的方式并入本文，其程度就像每个独立的出版物或专利申请都被具体地和单独地指示以引用的方式并入本文一样。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海科技大学
<120> Cas蛋白抑制剂的组合物及应用
<130> P21112018CP
<150> PCT/CN2018/102908
<151> 2018-08-29
<160> 436
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
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20
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Ala Thr Ser Leu Pro Ala Phe Ala Gly Val Ile Asp Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 3
Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala
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20
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<220>
<223> 合成的
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Gln
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1 5 10 15
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Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu
1 5 10 15
Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala
20 25 30
Ala Phe Asn Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala
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Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu
50 55 60
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Met Lys Ala Met Lys Gln Arg Ile Ala Lys Phe Ser Pro Val Ala Ser
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Phe Arg Asn Leu Cys Ile Ala Gly Ser Val Thr Ala Ala Thr Ser Leu
20 25 30
Pro Ala Phe Ala Gly Val Ile Asp Thr Ser Ala Val Glu Ser Ala Ile
35 40 45
Thr Asp Gly Gln Gly Asp Met Lys Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Val Gly
50 55 60
Ala Leu Val Ile Leu Ala Val Ala Gly Leu Ile Tyr Ser Met Leu Arg
65 70 75 80
Lys Ala
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Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr Leu
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Val Pro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala
20 25 30
Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala
35 40 45
Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu
50 55 60
Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser
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Met Gln Ser Val Ile Thr Asp Val Thr Gly Gln Leu Thr Ala Val Gln
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Ala Asp Ile Thr Thr Ile Gly Gly Ala Ile Ile Val Leu Ala Ala Val
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Val Leu Gly Ile Arg Trp Ile Lys Ala Gln Phe Phe
35 40
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<220>
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<400> 15
Met Arg Val Leu Ser Thr Val Leu Ala Ala Lys Asn Lys Ile Ala Leu
1 5 10 15
Gly Ala Ala Thr Met Leu Val Ser Ala Gly Ser Phe Ala Ala Glu Pro
20 25 30
Asn Ala Ala Thr Asn Tyr Ala Thr Glu Ala Met Asp Ser Leu Lys Thr
35 40 45
Gln Ala Ile Asp Leu Ile Ser Gln Thr Trp Pro Val Val Thr Thr Val
50 55 60
Val Val Ala Gly Leu Val Ile Arg Leu Phe Lys Lys Phe Ser Ser Lys
65 70 75 80
Ala Val
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<220>
<223> 合成的
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Met Lys Lys Ser Val Val Ala Lys Ile Ile Ala Gly Ser Thr Leu Val
1 5 10 15
Ile Gly Ser Ser Ala Phe Ala Ala Asp Asp Ala Thr Ser Gln Ala Lys
20 25 30
Ala Ala Phe Asp Ser Leu Thr Ala Gln Ala Thr Glu Met Ser Gly Tyr
35 40 45
Ala Trp Ala Leu Val Val Leu Val Val Gly Ala Thr Val Gly Ile Lys
50 55 60
Leu Phe Lys Lys Phe Val Ser Arg Ala Ser
65 70
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Ser Gly Val Gly Asp Gly Val Asp Val Val Ser Ala Ile Glu Gly Ala
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ile Ala Ala Ile Gly Gly Ala Val Leu Thr Val Met Val
20 25 30
Gly Ile Lys Val Tyr Lys Trp Val Arg Arg Ala Met
35 40
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Met Asp Phe Asn Pro Ser Glu Val Ala Ser Gln Val Thr Asn Tyr Ile
1 5 10 15
Gln Ala Ile Ala Ala Ala Gly Val Gly Val Leu Ala Leu Ala Ile Gly
20 25 30
Leu Ser Ala Ala Trp Lys Tyr Ala Lys Arg Phe Leu Lys Gly
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<223> 合成的
<400> 19
Met Ser Val Ile Thr Lys Val Ala Ala Ala Lys Asn Lys Ile Val Val
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Leu Met Ala Ser Ala Gly Ala Phe Ala Ala Asp Asp
20 25 30
Gly Thr Ser Thr Ala Thr Ser Tyr Ala Thr Glu Ala Met Asn Ser Leu
35 40 45
Lys Thr Gln Ala Thr Asp Leu Ile Asp Gln Thr Trp Pro Val Val Thr
50 55 60
Ser Val Ala Val Ala Gly Leu Ala Ile Arg Leu Phe Lys Lys Phe Ser
65 70 75 80
Ser Lys Ala Val
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Met Gly Asp Ile Leu Thr Gly Val Ser Gly Ala Glu Ala Ala Thr Ala
1 5 10 15
Met Ile Ala Ala Ala Ala Ile Ile Ala Leu Val Gly Phe Thr Lys Trp
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Gly Ala Lys Lys Val Ala Ser Phe Phe Gly
35 40
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<223> 合成的
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Ser Lys Gly Asn Asp Gln Val Phe Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Lys Asn Ala Val Arg Asp Ala Asn Glu Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Ala Asp Leu
35
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<220>
<223> 合成的
<400> 22
Met Ala Asn Glu Ile Thr Lys Leu Leu Asp Val Val Thr Pro Glu Val
1 5 10 15
Phe Asn Ala Tyr Met Asp Asn Phe Thr Ser Glu Lys Ser Ala Ile Ile
20 25 30
Gln Ser Gly Ile Ala Val Ala Asp Pro Ser Val Ala Gln Asn Ile Thr
35 40 45
Ala Gly Gly Leu Leu Val Asn Met Pro Phe Trp Asn Asp Leu Asp Gly
50 55 60
Glu Asp Glu Thr Leu Gly Asp Gly Glu Lys Gly Leu Glu Thr Gly Lys
65 70 75 80
Ile Thr Ala Ser Ala Asp Ile Ala Ala Val Met Tyr Arg Gly Arg Gly
85 90 95
Trp Ser Val Asn Glu Leu Ala Ala Val Ile Ser Gly Asp Asp Pro Leu
100 105 110
Asp Ala Leu Met Gly Lys Ile Ala Ser Trp Trp Met Arg Arg Glu Gln
115 120 125
Thr Val Leu Ile Ser Val Leu Asn Gly Leu Phe Ala Lys Asn Gly Ala
130 135 140
Leu Ala Ser Ser His Leu Leu Ser Lys Pro Thr Ser Ala Ile Ser Gly
145 150 155 160
Asn Leu Val Leu Asp Ala Lys Gln Leu Leu Gly Asp Ser Ser Asp Arg
165 170 175
Leu Ser Leu Met Val Met His Ser Ala Val Tyr Thr Ala Leu Gln Lys
180 185 190
Gln Asn Leu Ile Ala Phe Ile Pro Asn Ala Arg Gly Glu Val Asn Ile
195 200 205
Pro Thr Tyr Leu Gly Tyr Arg Val Val Val Asp Asp Gly Val Pro Ser
210 215 220
Thr Gly Thr Gly Ala Ala Lys Val Tyr Thr Ser Tyr Leu Phe Ala Thr
225 230 235 240
Gly Ser Ile Gly Arg Asn Ile Gly Asn Pro Ala Lys Leu Thr Thr Phe
245 250 255
Glu Thr Ala Arg Asp Ala Ser Lys Gly Asn Asp Gln Val Phe Thr Arg
260 265 270
Arg Ala Phe Thr Met His Pro Tyr Gly Val Lys Phe Lys Asn Ala Val
275 280 285
Arg Asp Ala Asn Glu Ile Thr Pro Thr Asn Ala Asp Leu Ala Lys Ala
290 295 300
Gly Asn Trp Glu Lys Val Tyr Glu Asp Lys Gln Ile Gly Ile Val Gly
305 310 315 320
Ile Gln His Leu Val Glu Glu Leu Pro Ala Ser Gly Ala
325 330
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<211> 6
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<213> Artificial Sequence
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Lys Ser Val Lys Glu Leu
1 5
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<223> 合成的
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Glu Asn Lys Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr
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<213> Artificial Sequence
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<223> 合成的
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Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile
1 5 10 15
Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Leu Glu
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Ala Lys
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Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr
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<223> 合成的
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Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr
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<223> 合成的
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1 5
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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<223> 合成的
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Ala Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala
1 5 10 15
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<223> 合成的
<400> 31
Ala Glu Gly Asp Asp Ala Ala Ala Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala
1 5 10 15
Ser Ala Thr Glu Tyr
20
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<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
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Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
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Ser Ala Thr Glu Tyr
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 33
Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Ala
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<213> Artificial Sequence
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<223> 合成的
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Glu Lys Asn Pro Ile Asp
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<211> 34
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
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Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Gly Ile
1 5 10 15
Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Leu Glu
20 25 30
Ala Lys
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<211> 34
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<213> Artificial Sequence
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<223> 合成的
<400> 36
Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile
1 5 10 15
Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Glu
20 25 30
Ala Lys
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
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Gly Thr Ala Thr Ala Thr Ser
1 5
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<211> 7
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<223> 合成的
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<213> Artificial Sequence
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<223> 合成的
<400> 39
Met Asp Phe Asn Pro Ser Glu Val
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 40
Met Glu Phe Asn Pro Ser Asp Val
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Pro Ser Glu Val Ala Ser Gln Val
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 42
Ser Gln Val Thr Asn Tyr Ile Gln
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Ala Ser Gln Val Thr Asp Tyr Ile Gln
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 44
Asp Phe Asn Pro Ser Ala Val Ala Ser
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Phe Asn Pro Ser Asp Val Ala Pro Gln
1 5
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<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 46
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<213> Artificial Sequence
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Met Asp Phe Asp Pro Ser Glu Val Ala
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<213> Artificial Sequence
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Pro Ser Glu Val Ala Ser Gln Val Thr
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<213> Artificial Sequence
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<220>
<223> 合成的
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<213> Artificial Sequence
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
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Glu Ala Ala Ser Gln Val Thr Asn Tyr Ile
1 5 10
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 56
Met Asp Ile Asn Pro Ser Asp Ile Ala Ser
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 58
Asn Pro Ser Glu Val Ala Pro Gln Val Thr
1 5 10
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Pro Ala Phe Ala Gly Val Ile Asp Thr Ser
1 5 10
<210> 60
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<213> Artificial Sequence
<220>
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Ser Ala Ala Ser Ser Tyr Ala Ala Glu Ala
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<400> 315
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<400> 318
Ala Phe Thr Gln Pro Ile Asp Thr Ser Ala Ile Glu Thr Ala Ile Ile
1 5 10 15
Asp Gln Ser Lys Gly Gln Gly
20
<210> 319
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 319
Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Tyr Ala Met Val
1 5 10 15
Arg Glu Gly Met Lys Asn Leu
20
<210> 320
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 320
Ser Thr Gly Gly Thr Asp Tyr Ala Gly Gln Ala Met Asp Ala Leu Leu
1 5 10 15
Thr Gln Ala Asn Asp Leu Ile
20
<210> 321
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 321
Thr Ala Thr Asn Tyr Ala Thr Glu Ala Met Thr Ser Leu Lys Thr Gln
1 5 10 15
Ala Thr Asp Leu Ile Ala Gln
20
<210> 322
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 322
Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Cys Ser Ile Ala
1 5 10 15
Lys Glu Ser Met Asn Ser Ile Lys
20
<210> 323
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 323
Ala Lys Gly Asn Asp Asn Val Phe Thr Arg Arg Ala Phe Val Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Trp Thr Asp
20
<210> 324
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 324
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1 5 10 15
Glu Ala Leu Pro Thr Ser Ala Thr
20
<210> 325
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 325
Ala Ser Ser Tyr Ala Asp Glu Ala Lys Ala Ser Leu Lys Thr Ala Gly
1 5 10 15
Val Leu Ala Ser Gln Ala Thr Asp
20
<210> 326
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 326
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1 5 10 15
Ile Ala Arg Asp Ala Leu Asp Gln
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 327
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1 5 10 15
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20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 328
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1 5 10 15
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20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 329
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1 5 10 15
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20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 330
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1 5 10 15
Arg Asp Leu Glu Ala Ser Glu Tyr
20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 331
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1 5 10 15
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20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 332
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1 5 10 15
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20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 333
Ser Leu Pro Ala Phe Ile Glu Val Ile Gly Thr Ser Gly Val Asp Ala
1 5 10 15
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20
<210> 334
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 334
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1 5 10 15
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20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 335
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1 5 10 15
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20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 336
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1 5 10 15
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20
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<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 337
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1 5 10 15
Pro Ile Glu Lys Glu Ile Ser Asn
20
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 338
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1 5 10 15
Asn Ala Ala Ile Glu Ala Ile Thr Asp
20 25
<210> 339
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 339
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1 5 10 15
Leu Leu Thr Gln Ala Asn Asp Leu Ile
20 25
<210> 340
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 340
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1 5 10 15
Asn Ala Ile Glu Lys Ala Ile Thr Asp
20 25
<210> 341
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 341
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1 5 10 15
Ala Gln Ile Gln Glu Gly Gln Gly Asp
20 25
<210> 342
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 342
Ala Thr Val Pro Ala Phe Ala Ala Val Val Asp Thr Ala Ala Ile Gln
1 5 10 15
Thr Gln Ile Gln Glu Gly Gln Ala Asp
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 343
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1 5 10 15
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20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 344
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1 5 10 15
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20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 345
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1 5 10 15
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20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 346
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1 5 10 15
Lys Thr Pro Ile Thr Gln Leu Ile Asp
20 25
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<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 347
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1 5 10 15
Leu Lys Thr Gln Ala Ile Asp Leu Ile
20 25
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<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 348
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1 5 10 15
Thr Gly Ile Thr Asp Ala Gln Thr Ala Met
20 25
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<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 349
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1 5 10 15
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20 25
<210> 350
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 350
Ser Leu Phe Gly Pro Val Phe Ala Gly Ile Ile Thr Ala Ala Val Leu
1 5 10 15
Ser Ala Ile Met Ser Thr Ala Asp Ser Gln
20 25
<210> 351
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 351
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1 5 10 15
Asp Ser Leu Leu Thr Gln Ala Asn Asp Leu Ile
20 25
<210> 352
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 352
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1 5 10 15
Leu Lys Thr Thr Ala Thr Asp Met Ile Glu Gln
20 25
<210> 353
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 353
Ala Ala Asp Gly Ser Thr Gly Gly Ala Asp Tyr Ala Gly Gln Ala Met
1 5 10 15
Asp Ala Leu Leu Thr Gln Ala Asn Asp Leu Ile
20 25
<210> 354
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 354
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1 5 10 15
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20 25
<210> 355
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 355
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1 5 10 15
Asp Ser Leu Leu Thr Gln Ala Asn Asp Leu Ile
20 25
<210> 356
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 356
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1 5 10 15
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20 25
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<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 357
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1 5 10 15
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20 25
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<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 358
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1 5 10 15
Pro Ala Leu Gly Pro Gly Ala Ser Ala Thr Glu
20 25
<210> 359
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 359
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1 5 10 15
Pro Ala Leu Gly Pro Gly Ala Ser Ala Thr Asp
20 25
<210> 360
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 360
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1 5 10 15
Leu Phe Thr Lys Thr Phe Ala Ile Thr Asp Gly
20 25
<210> 361
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 361
Ala Thr Ala Leu Pro Ala Trp Ala Ala Val Ile Asp Thr Thr Glu Val
1 5 10 15
Gln Ala Thr Phe Gly Glu Ala Lys Gly Asp Met
20 25
<210> 362
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 362
Ala Thr Ser Leu Pro Ala Phe Ala Gly Val Ile Asp Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Glu Ala Ala Ile Thr Asp Gly Lys Gly Asp Met
20 25
<210> 363
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 363
Ala Thr Ser Leu Pro Ala Phe Ala Gly Val Ile Gly Ala Val Ala Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ala Val Gly Asp Gly Asp Met Lys Ala
20 25
<210> 364
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 364
Ala Thr Thr Leu Pro Ala Val Ala Thr Arg Ala Gly Asp Thr Trp Ala
1 5 10 15
Val Glu Val Arg Ile Ser Asp Gly Glu Asp Met
20 25
<210> 365
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 365
Thr Ser Val Pro Ala Phe Ala Ala Ser Val Ile Asp Thr Xaa Ala Val
1 5 10 15
Glu Gln Ala Ile Thr Asp Gly Lys Ser Asp Met
20 25
<210> 366
<211> 27
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 366
Thr Ser Val Pro Ala Phe Ala Gly Ser Val Ile Asp Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Glu Thr Ala Ile Thr Asp Gly Lys Ser Asp Met
20 25
<210> 367
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 367
Ala Asp Asp Gly Thr Ser Thr His Ile Ser Tyr Met Gln Leu His Gly
1 5 10 15
Arg Val Cys Arg Phe Ala Asn Ala Leu Lys Ala Gln
20 25
<210> 368
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 368
Ala Phe Ala Asn Asp Asp Ala Ile Asp Thr Ala Val Gly Thr Ala Gln
1 5 10 15
Asn Val Thr Asp Thr Trp Leu Ala Gln Gly Asp Met
20 25
<210> 369
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 369
Ala Ser Ser Met Pro Val Trp Ala Ala Ser Val Ile Asp Thr Ser Ser
1 5 10 15
Val Glu Gln Ala Ile Thr Asp Gly Lys Gly Asp Met
20 25
<210> 370
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 370
Ala Ser Ser Val Pro Ala Trp Ala Gly Ser Val Ile Asp Thr Ser Ala
1 5 10 15
Val Glu Ser Ala Ile Ser Asp Gly Lys Gln Asp Met
20 25
<210> 371
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 371
Ala Thr Ser Leu Pro Ala Phe Ala Gly Val Ile Asp Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Glu Thr Ala Met Thr Asp Gly Gln Gly Asp Met Lys
20 25
<210> 372
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 372
Thr Ala Leu Pro Val Ile Glu Thr Ala Ala Gly Asp Val Ser Ala Phe
1 5 10 15
Val Pro Thr Asn Val Ile Ser Ile Thr Asp Gly Gln
20 25
<210> 373
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 373
Thr Ser Leu Pro Val Ile Glu Thr Gln Ala Gly Asp Val Ser Ala Tyr
1 5 10 15
Ile Pro Thr Asn Val Ile Ser Ile Thr Asp Gly Gln
20 25
<210> 374
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 374
Ala Glu Asp Pro Ala Met Gln Gln Arg Ser Val Ala Ala Phe Asp Ala
1 5 10 15
Leu Gln Leu Ser Ala Thr Asp Ala Glu Leu Arg Glu Tyr
20 25
<210> 375
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 375
Ala Glu Asp Pro Ala Met Gln Gln Arg Ser Val Ala Ala Phe Asp Ala
1 5 10 15
Leu Gln Gln Ser Ala Thr Asp Ala Glu Leu Arg Glu Tyr
20 25
<210> 376
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 376
Ala Glu Asp Pro Ala Met Gln Gln Arg Ser Val Ala Ala Phe Glu Ala
1 5 10 15
Leu Gln Glu Ser Ala Thr Asp Ala Gly Leu Arg Glu Tyr
20 25
<210> 377
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 377
Ala Ser Thr Leu Pro Ala Ile Ala Thr Arg Ala Gly Asp Val Trp Thr
1 5 10 15
Val Glu Val Arg Ile Thr Asp Gly Glu Asp Met Ser Ala
20 25
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<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 378
Asp Phe Asn Ile Ala Pro Gly Leu Ala Pro Leu Asn Gly Leu Leu Leu
1 5 10 15
Pro Ser Glu Val Val Ser Gln Ile Ser Ser Phe Ile Gln
20 25
<210> 379
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 379
Ser Thr Thr Thr Ser Tyr Ser Ser Glu Leu Ser Val Tyr Pro Ser Leu
1 5 10 15
Asn Ser Leu Lys Glu Thr His Gly Gln Asp Leu Ile Asp
20 25
<210> 380
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 380
Ala Thr Ser Leu Pro Ala Phe Ala Gly Val Ile Asp Thr Ser Ala Val
1 5 10 15
Glu Ser Ala Ile Thr Asp Gly Gln Gly Asp Met Lys Ala
20 25
<210> 381
<211> 29
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 381
Ala Asp Asp Gly Thr Ser Thr Ala Thr Ser Tyr Ala Thr Glu Ala Met
1 5 10 15
Asn Ser Leu Lys Thr Gln Ala Thr Asp Leu Ile Asp Gln
20 25
<210> 382
<211> 30
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 382
Ala Asp Asp Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ser Tyr Thr Val Glu Tyr Ala
1 5 10 15
Thr Ser Asn Ser Gly Pro Trp Thr Thr His Ser Thr Asn Leu
20 25 30
<210> 383
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 383
Met Phe Asn Pro Ser Glu Val Ala Asp Asn Leu Lys Arg Ser Gly Ala
1 5 10 15
Phe Val Pro Gly Ile Arg Pro Gly Gln Gln Thr Ala Asn Tyr Ile
20 25 30
<210> 384
<211> 32
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 384
Asp His Leu Glu Thr Arg Leu Ala Phe Asn Tyr His Pro Phe Gly His
1 5 10 15
Thr Tyr Ile Ser Ala Ile Leu Asp Ala Asn Asp Phe Thr Pro Thr Ser
20 25 30
<210> 385
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 385
Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Ile Tyr Ala Glu Ala Ile Phe
1 5 10 15
Asn Glu Gly Leu Lys Asn Val Val Ala Gly Ala Asp Ala Met Ser Leu
20 25 30
Lys
<210> 386
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 386
Gly Asp Asp Ile Leu Ile Asn Arg Gln Ala Phe Val Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Val Glu Phe Lys Asn Ala Ser Val Ala Gly Ala Thr Pro Ser Asn
20 25 30
Ala Glu Val
35
<210> 387
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 387
Gly Asp Asp Ile Leu Ile Asn Arg Gln His Phe Ile Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Val Lys Phe Lys Asn Thr Ser Val Ala Gly Ser Ser Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
<210> 388
<211> 35
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 388
Gly Asp Asp Ile Leu Ile Asn Arg Gln His Phe Leu Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Val Lys Phe Asn Asn Ala Ala Val Ala Gly Ser Ser Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
<210> 389
<211> 35
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
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Gly Asp Asp Ile Leu Ile Asn Arg Gln His Phe Leu Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Val Lys Phe Thr Asp Lys Ser Val Ala Gly Asn Ser Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
<210> 390
<211> 35
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 390
Gly Asp Asp Ile Leu Ile Asn Arg Gln His Phe Leu Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Val Lys Phe Thr Asp Lys Ser Val Ser Gly Ser Ser Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
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<211> 35
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<213> Artificial Sequence
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<223> 合成的
<400> 391
Gly Asp Asp Ile Leu Ile Asn Arg Gln His Phe Leu Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Val Lys Phe Thr Asn Lys Ser Val Ala Gly Ser Ser Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 392
Gly Asp Asp Ile Leu Val Asn Arg Gln His Phe Leu Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Val Lys Phe Thr Asn Lys Thr Val Thr Gly Ser Ser Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
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Gly Asp Asp Ile Leu Val Asn Arg Arg His Phe Val Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ile Lys Phe Thr Asn Ala Ser Val Ala Gly Val Ser Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
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<400> 394
Gly Glu Asp Ile Leu Ile Asn Arg Lys His Phe Val Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ile Lys Phe Thr Asn Ala Ser Val Ala Lys Thr Ala Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
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<400> 395
Gly Glu Asp Ile Leu Ile Asn Arg Lys His Phe Val Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ile Lys Phe Thr Asn Ala Thr Val Ala Lys Thr Ala Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
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Gly Glu Asp Ile Leu Ile Asn Arg Gln His Phe Val Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Val Ala Phe Gln Asn Ala Ser Val Ala Gly Ser Ser Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
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<400> 397
Gly Glu Asp Tyr Leu Ile Asn Arg Arg Thr Phe Ile Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Val Arg Phe Thr Ser Gly Ser Val Ala Gly Val Ser Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
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<223> 合成的
<400> 398
Gly Gly Asp Ile Leu Tyr Thr Arg Arg Gln Phe Val Leu His Pro Tyr
1 5 10 15
Gly Ile Ala Trp Gln Asp Ala Ser Val Ala Ala Glu Phe Pro Thr Asn
20 25 30
Val Glu Leu
35
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Gly Gly Asp Ile Leu Tyr Thr Arg Arg Gln Phe Val Leu His Pro Tyr
1 5 10 15
Gly Ile Lys Trp Thr Asp Ala Ser Val Ala Gly Glu Phe Pro Thr Thr
20 25 30
Ala Glu Met
35
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Gly Asn Asp Lys Leu Tyr Thr Arg Arg Ala Ile Val Met His Pro Tyr
1 5 10 15
Gly Leu Ser Phe Glu Pro Glu Glu Leu Ser Asp Phe Thr Pro Thr Asn
20 25 30
Gly Asp Leu
35
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Gly Val Asp Tyr Leu Ile Thr Arg Arg His Phe Leu Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ile Lys Phe Thr Asn Ser Ser Val Ala Gly Ala Ala Pro Thr Asn
20 25 30
Ala Glu Leu
35
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Gly Ile Asp Tyr Leu Ile Asn Arg Lys Thr Phe Ile Leu His Pro Arg
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Gly Val Lys Phe Thr Asn Thr Val Arg Ala Asn Thr Glu Thr Val Ser
20 25 30
Arg Ala Glu Leu
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Gly Val Asp Tyr Leu Ile Asn Arg Lys Ala Phe Ile Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ile Ala Tyr Thr Gly Ala Lys Arg Gly His Val Glu Thr Pro Thr
20 25 30
Arg Ala Glu Leu
35
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<400> 404
Gly Val Asp Tyr Leu Ile Asn Arg Lys Thr Phe Ile Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ile Lys Phe Thr Gly Ala Val Arg Ala Asn Gln Glu Thr Val Ser
20 25 30
Arg Ala Glu Leu
35
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<400> 405
Gln Gly Asp Asp Ile Leu Ile Asn Arg Gln His Phe Ile Leu His Pro
1 5 10 15
Arg Gly Val Glu Phe Lys Asn Ala Ala Val Ala Gly Pro Ser Pro Thr
20 25 30
Asn Ala Glu Leu
35
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<400> 406
Gln Gly Asp Asp Ile Leu Ile Asn Arg Gln His Phe Ile Leu His Pro
1 5 10 15
Arg Gly Val Glu Phe Lys Asn Ala Ala Val Ala Ser Ser Ser Pro Thr
20 25 30
Asn Thr Glu Leu
35
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<223> 合成的
<400> 407
Ala Ala Gly Ile Asp Glu Ile Phe Thr Arg Arg Ala Phe Val Tyr His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Thr Ser Lys Ala Val Ala Gly Leu Thr Pro
20 25 30
Ser Asn Ala Glu Leu
35
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<223> 合成的
<400> 408
Ala Ala Gly Asn Asp Arg Ile Phe Thr Arg Arg Ala Leu Val Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Ile Lys Trp Thr Asp Thr Ser Val Glu Gly Ala Thr Pro
20 25 30
Ser Asn Glu Glu Leu
35
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<220>
<223> 合成的
<400> 409
Ala Ala Gly Asn Asp Arg Val Phe Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Lys Ser Thr Thr Val Ala Gly Ala Thr Pro
20 25 30
Ser Asn Ala Glu Met
35
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Ala Ala Gly Val Asp Glu Leu Phe Thr Arg Arg Ala Phe Val Tyr His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Thr Ser Lys Ala Val Ala Gly Leu Thr Pro
20 25 30
Ser Asn Thr Glu Leu
35
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<400> 411
Ala Ala Gly Val Asp Glu Val Phe Thr Arg Arg Ala Phe Val Phe His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Thr Asp Thr Thr Val Ala Gly Leu Thr Pro
20 25 30
Ser Asn Thr Glu Leu
35
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 412
Ala Ala Gly Val Asp Glu Val Phe Thr Arg Arg Ala Phe Val Tyr His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Ile Lys Phe Lys Ser Thr Thr Val Thr Gly Glu Thr Pro
20 25 30
Ser Asn Ala Glu Leu
35
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<211> 37
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 413
Ala Ala Gly Val Asp Glu Val Tyr Thr Arg Arg Ala Phe Val Phe His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Ile Lys Phe Thr Asp Thr Thr Val Ala Gly Glu Thr Pro
20 25 30
Ser Asn Ala Glu Leu
35
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<213> Artificial Sequence
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<223> 合成的
<400> 414
Ala Ala Gly Val Asp Asn Val Tyr Thr Arg Arg Ala Leu Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Arg Trp Gln Asp Asn Ser Ile Val Gly Leu Thr Pro
20 25 30
Ser Asn Ala Glu Leu
35
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Gly Gln Asp Tyr Leu Val Thr Arg Arg His Tyr Val Leu His Pro Arg
1 5 10 15
Gly Ile Lys Trp Asp Pro Gly Ser Gly Val Pro Ala Ser Val Thr Pro
20 25 30
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35
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 416
Ser Lys Gly Ile Asp Glu Val Tyr Thr Arg Arg Ala Phe Val Phe His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Thr Asp Ala Thr Val Ser Gly Glu Thr Pro
20 25 30
Ser Asn Ala Glu Leu
35
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<220>
<223> 合成的
<400> 417
Ser Ser Gly Glu Asp Phe Leu Ile Asn Arg Gln Ile Tyr Ile Leu His
1 5 10 15
Pro Arg Gly Val Lys Phe Thr Asp Thr Ala Val Ala Asp Val Phe Pro
20 25 30
Thr Asn Ala Glu Leu
35
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Lys Gly Asn Asp Glu Val Tyr Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His Pro
1 5 10 15
Tyr Gly Val Lys Phe Thr Asn Ala Asp Arg Asp Ser Gly Glu Ile Thr
20 25 30
Pro Thr Asn Lys Asp Leu
35
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Lys Gly Asn Asp Glu Val Tyr Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His Pro
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Tyr Gly Val Lys Phe Thr Asn Ile Glu Arg Glu Glu Gly Glu Ile Thr
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Pro Thr Asn Asn Asp Leu
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Ala Lys Gly Asn Asp Met Ile Tyr Thr Arg Arg Ala Leu Val Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Trp Thr Gly Ala Glu Val Asp Ala Gly Asn Ile
20 25 30
Thr Pro Ser Asn Ala Asp Leu
35
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<400> 421
Ala Lys Gly Asn Asp Gln Val Phe Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Lys Asn Ala Val Arg Asp Ala Asn Glu Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Ala Asp Leu
35
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Ala Lys Gly Asn Asp Gln Val Phe Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Thr Asn Ala Asp Arg Glu Ala Gly Glu Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Lys Asp Leu
35
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<400> 423
Ala Lys Gly Asn Asp Gln Val Phe Thr Arg Arg Ala Ile Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Ile Lys Trp Thr Asp Asn Leu Arg Asp Asp Gly Asn Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Val Asp Leu
35
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<211> 39
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 424
Ala Lys Gly Asn Asp Gln Val Phe Thr Arg Arg Ala Ile Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Ile Lys Trp Thr Asp Asn Leu Arg Glu Glu Gly Asn Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Val Asp Leu
35
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<211> 39
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 425
Ala Lys Gly Asn Asp Gln Val Phe Thr Arg Arg Ala Ile Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Ile Lys Trp Thr Glu Asn Leu Arg Glu Glu Gly Asn Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Val Asp Leu
35
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<211> 39
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 426
Ala Lys Gly Asn Asp Arg Ile Phe Thr Arg Trp Ala Leu Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Trp Asn Asp Ser Thr Arg Glu Asp Gly Asn Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Val Asp Leu
35
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<400> 427
Ala Lys Gly Asn Asn Asn Ile Phe Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Thr Asn Ala Ala Arg Glu Ser Gly Phe Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Lys Asp Leu
35
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<211> 39
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<220>
<223> 合成的
<400> 428
Ala Lys Gly Thr Asp Ile Ile Tyr Thr Arg Arg Ala Val Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Trp Lys Asp Ala Glu Arg Glu Ala Gly Asn Met
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Val Asp Leu
35
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<220>
<223> 合成的
<400> 429
Asn Lys Gly Asn Asp Glu Val Tyr Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Thr Asn Thr Asp Arg Glu Ser Gly Glu Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Lys Asp Leu
35
<210> 430
<211> 39
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<220>
<223> 合成的
<400> 430
Ser Lys Gly Asn Asp Gln Val Phe Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Lys Asn Ala Val Arg Asp Val Asn Glu Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Ala Asp Leu
35
<210> 431
<211> 39
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 431
Ser Lys Gly Asn Asp Gln Val Phe Thr Arg Arg Ala Phe Thr Met His
1 5 10 15
Pro Tyr Gly Val Lys Phe Lys Asn Ala Val Arg Asp Ala Asn Asp Ile
20 25 30
Thr Pro Thr Asn Ala Glu Leu
35
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<211> 40
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 432
Asp Gly Thr Ser Tyr Val Ser Ser Thr Ala Ser Pro Tyr Ser Ala Thr
1 5 10 15
Glu Asn Ser Thr Leu Lys Gly Ile Glu Leu Ile Tyr Lys Phe Pro Leu
20 25 30
Ala Ala Met Asn Ser Leu Lys Thr
35 40
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<211> 44
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 433
Asp Asp Gly Ser Ser Thr Ala Ser Ala Ala Ser Val Ser Tyr Arg Val
1 5 10 15
Asp Gly Ala Pro Gly Ala Gln Val Ala Thr Ile Thr Leu Glu Arg Pro
20 25 30
Glu Ala Met Asn Gly Leu Asp Thr Glu Thr Lys Asp
35 40
<210> 434
<211> 50
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 434
Tyr Val Ile Thr Gly Ser Val Asn Pro Lys Arg Phe Ala Tyr Thr Glu
1 5 10 15
Arg Gly Asn Thr Gln Ile Val Ile Arg Glu Pro Phe Thr Asp His Pro
20 25 30
Ile Tyr Asp Ala Phe Lys Asp Cys Phe Tyr Asp Ala Tyr Asp Leu Glu
35 40 45
Leu Asp
50
<210> 435
<211> 67
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 435
Tyr Val Phe Gln Gly Gln Gly Asn Asp His Arg Phe Thr Thr Arg Pro
1 5 10 15
Phe Val Thr Gly Ser Lys Lys Phe Leu Phe Lys Asn Gln Val Arg Asp
20 25 30
Asn Met Ile Arg Thr Leu Thr Ser Ala Val Pro Ile Ile Thr Gly Tyr
35 40 45
Glu Val Phe Thr Tyr Trp Ala Phe Ala Asn Gly Tyr Leu Gly Leu Phe
50 55 60
Asp Leu Gly
65
<210> 436
<211> 69
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 合成的
<400> 436
Tyr Val Phe Gln Gly Gln Gly Asn Asp His Arg Phe Thr Thr Arg Pro
1 5 10 15
Phe Ala Thr Gly Ser Lys Lys Phe Leu Phe Lys Asn Gln Val Arg Asp
20 25 30
Asn Met Ile Arg Thr Leu Ala Ser Ala Val Pro Ile Ile Thr Gly Tyr
35 40 45
Glu Val Phe Thr Tyr Trp Ala Phe Ala Asn Gly Tyr Leu Gly Leu Phe
50 55 60
Asp Leu Gly Ser Ser
65

Claims (31)

1. 一种改善基于Cas蛋白的基因组编辑过程的特异性的方法，所述方法包括将经过基于Cas蛋白的基因组编辑过程的样品与多肽或编码多肽的多核苷酸接触，其中，所述多肽包含能够结合Cas蛋白的主要外壳蛋白G8P或G8P的胞外区G8PEX，所述多肽包含选自SEQ IDNO: 1-22组成的组的氨基酸序列，所述方法用于非治疗诊断目的。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Cas蛋白选自SpCas9、SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9、AsCpf1、FnCpf1、SsCpf1、PcCpf1、BpCpf1、CmtCpf1、LiCpf1、PmCpf1、Pb3310Cpf1、Pb4417Cpf1、BsCpf1、EeCpf1、RfCas13d、LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b、其变体及其化学修饰的形式组成的组，所述Cas蛋白能够与化学修饰的多肽相互作用。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，向样品同时提供所述Cas蛋白和多肽或多核苷酸。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸还包含诱导型启动子。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在样品已经与所述Cas蛋白接触之后提供多肽或多核苷酸。
6.如权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽为化学修饰的。
7.如权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述基于Cas蛋白的基因组编辑过程为体外进行。
8.如权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于，所述多肽作为病毒颗粒或纳米颗粒的一部分递送。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述病毒颗粒包含M13噬菌体。
10. 一种多肽或编码所述多肽的多核苷酸在制备基因组编辑药物中的用途，其中所述基因编辑包括：
向受试者施用基于Cas蛋白的基因组编辑系统；并且之后
向受试者施用所述药物，其中，所述多肽包含能够结合Cas蛋白的主要外壳蛋白G8P或G8P的胞外区G8PEX，所述多肽包含选自SEQ ID NO: 1-22组成的组的氨基酸序列。
11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，在基于Cas蛋白的基因组编辑系统的基因组编辑启动后施用所述药物。
12.如权利要求10所述的用途，其特征在于，在基于Cas蛋白的基因组编辑系统施用后至少12小时后施用所述药物。
13.如权利要求10-12任一项所述的用途，其特征在于，所述施用为静脉注射、肌肉注射、鼻腔喷雾或局部施用。
14.如权利要求10-12任一项所述的用途，其中所述多核苷酸可操作地连接诱导型启动子。
15.如权利要求14所述的用途，所述用途进一步包括在基于Cas蛋白的基因组编辑系统的基因组编辑启动之后，通过激活诱导型启动子来诱导多肽的表达。
16.如权利要求14或15所述的用途，其特征在于，所述Cas蛋白和多肽由同一核酸构建体编码。
17. 一种重组表达载体，所述重组表达载体包含第一多核苷酸片段和第二多核苷酸片段，第一多核苷酸片段编码Cas蛋白；第二多核苷酸片段编码包含能够结合Cas蛋白的具有主要外壳蛋白G8P或G8P的胞外区G8PEX，包含选自SEQ ID NO: 1-22组成的组的氨基酸序列。
18.如权利要求17所述的载体，其特征在于，所述第二多核苷酸片段可操作地连接诱导型启动子，以在细胞中表达多肽。
19.如权利要求17所述的载体，其特征在于，所述Cas蛋白选自SpCas9、SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9、AsCpf1、FnCpf1、SsCpf1、PcCpf1、BpCpf1、CmtCpf1、LiCpf1、PmCpf1、Pb3310Cpf1、Pb4417Cpf1、BsCpf1、EeCpf1、RfCas13d、LwaCas13a、PspCas13b、PguCas13b、RanCas13b及其变体组成的组。
20.如权利要求17-19任一项所述的载体，所述载体还包含一种或多种蛋白质的编码序列，蛋白质选自胞苷脱氨酶和尿嘧啶糖基化酶抑制剂UGI组成的组。
21. 一种组合物，其包含Cas蛋白和多肽，所述多肽包含能够结合Cas蛋白的主要外壳蛋白G8P或G8P的胞外区G8PEX，包含选自SEQ ID NO: 1-22组成的组的氨基酸序列。
22. 一种试剂盒，其包含Cas蛋白和多肽，所述多肽包含能够结合Cas蛋白的主要外壳蛋白G8P或G8P的胞外区G8PEX，包含选自SEQ ID NO: 1-22组成的组的氨基酸序列。
23. 一种分子，所述分子包含Cas蛋白、多肽和连接Cas蛋白和多肽的可剪切的接头，所述多肽包含能够结合Cas蛋白的主要外壳蛋白G8P或G8P的胞外区G8PEX，所述多肽包含选自SEQ ID NO: 1-22组成的组的氨基酸序列。
24.如权利要求23所述的分子，其特征在于，所述可剪切的接头为包含蛋白酶剪切位点的肽。
25.如权利要求24所述的分子，其特征在于，所述蛋白酶剪切位点为自剪切位点。
26.如权利要求23所述的分子，其特征在于，所述可剪切的接头为光激活或药物激活的。
27.如权利要求23-26任一项所述的分子，其特征在于，所述Cas蛋白与胞嘧啶脱氨酶或腺苷脱氨酶融合。
28. 一种药物组合物，所述药物组合物包含Cas蛋白和药学上可接受的载体和多肽，所述多肽包含能够结合Cas蛋白的主要外壳蛋白G8P或G8P的胞外区G8PEX，包含选自SEQ IDNO: 1-22组成的组的氨基酸序列。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其特征在于，所述多肽作为病毒颗粒或纳米颗粒的一部分递送。
30.如权利要求29所述的药物组合物，其特征在于，所述病毒颗粒包含M13噬菌体。
31.如权利要求28-30任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以注射剂、片剂、胶囊剂、凝胶剂、乳膏剂或喷雾剂的形式提供。
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