KR101863033B1 - 안정화된 파이브로넥틴 도메인 조성물, 방법 및 용도 - Google Patents

안정화된 파이브로넥틴 도메인 조성물, 방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

단백질 스캐폴드를 암호화하는 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 및 그의 제조 및 사용 방법을 포함하는, 인간 파이브로넥틴(인간 테나신) 유래의 제10 FN3 반복체와 같은 파이브로넥틴 III형(FN3) 단백질의 콘센서스 서열을 기반으로 하는 단백질 스캐폴드. 본 발명의 단백질 스캐폴드 분자는, 진단 및/또는 치료 조성물, 방법 및 장치에서의 응용을 위한 표적에 결합할 수 있는 결합 파트너를 형성하도록 조작될 수 있는 6개의 개질가능한 루프 도메인을 제공하면서, 향상된 열안정성 및 화학적 안정성을 나타낸다.

Description

안정화된 파이브로넥틴 도메인 조성물, 방법 및 용도 {STABILIZED FIBRONECTIN DOMAIN COMPOSITIONS, METHODS AND USES}
본 발명은 세포 표적에 결합하는 능력을 비롯한 신규한 특성을 갖는 단백질 스캐폴드(scaffold)에 관한 것이다. 더욱 특히는, 본 발명은 파이브로넥틴 III형(FN3) 반복체의 콘센서스(consensus) 서열을 기반으로 하는 단백질 스캐폴드에 관한 것이다.
단클론 항체는 표적 분자에 대한 높은 친화성 및 특이성이 요망될 때 가장 널리 사용되는 치료 단백질 부류이다. 그러나, 그러한 표적에 결합하도록 조작될 수 있는 비-항체 단백질이 생의약품 산업에서 또한 매우 흥미가 있다. 이들 "대안적 스캐폴드" 단백질은 그의 작은 크기, 다이설파이드 결합의 결여, 높은 안정성, 및 원핵 숙주에서 발현되는 능력으로 인하여 전통적인 항체에 비해 이점을 가질 수 있다. 신규의 정제 방법이 용이하게 적용되며; 그들은 약물/독소에 용이하게 접합되고, 조직 내에 효율적으로 침투하며 다중 특이적 바인더로 용이하게 포맷된다(문헌[Skerra 2000 J Mol Recognit 13(4): 167-87]; 문헌[Binz and Pluckthun 2005 Curr Opin Biotechnol 16(4): 459-69]).
한 가지 그러한 대안적 스캐폴드로는 면역글로불린(Ig) 폴드(fold)가 있다. 이 폴드는 수천 가지의 비-항체 단백질뿐만 아니라 항체의 가변 영역에서도 발견된다. 한 가지 그러한 Ig 단백질, 인간 파이브로넥틴 유래의 제10 파이브로넥틴 III형(FN3) 반복체는 전체 Ig-폴드 구조는 유지하면서 표면 노출된 루프 내의 많은 돌연변이를 견딜 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 아미노산 변이체 라이브러리는 이들 루프로 만들어졌으며 많은 상이한 표적에 특이적인 바인더가 선택되었다(문헌[Koide et al. 1998 J Mol Biol 284(4): 1141-51]; 문헌[Karatan et al. 2004 Chem Biol 11(6): 835-44]). 그러한 조작된 FN3 도메인은 중요한 생물물리학적 특성은 유지하면서 높은 친화성으로 표적에 결합하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Parker et al. 2005 Protein Eng Des Sel 18(9): 435-44]).
잠재적인 대안적 스캐폴드 분자의 바람직한 물리적 특성은 높은 열안정성과, 열적 폴딩 및 폴딩 해제(unfolding)의 가역성을 포함한다. 단백질 및 효소의 겉보기 열안정성을 증가시키기 위하여 몇몇 방법이 적용되었으며, 이는 고도로 유사한 열안정성 서열들에 대한 비교를 기반으로 하는 합리적인 디자인, 다이설파이드 가교체를 안정화하는 디자인, 알파-나선 성향을 증가시키는 돌연변이, 염 가교체의 조작, 단백질의 표면 전하의 변경, 방향적 진화, 및 콘센서스 서열들의 조성을 포함한다(문헌[Lechmann and Wyss 2001 Curr Opin Biotechnol 12(4): 371-5]). 높은 열안정성은 그러한 스캐폴드의 요망되는 특성이며, 그 이유는 이것이 얻어진 재조합 단백질의 수율을 증가시키고, 정제된 분자의 용해도를 향상시키고, 세포내 스캐폴드의 활성을 향상시키고, 면역원성을 감소시키고 제조에 있어서 저온 유통 체계(cold chain)의 필요성을 최소화할 수 있기 때문이다.
본 발명은 파이브로넥틴 III형(FN3) 반복체 단백질을 기반으로 하는 단백질 스캐폴드, 암호화 핵산 또는 상보적 핵산, 벡터, 숙주 세포, 조성물, 조합물, 제형, 장치 및 이들의 제조 및 사용 방법을 제공한다. 바람직한 실시 형태에서, 단백질 스캐폴드는 인간 테나신(Tenascin)-C(이하, "테나신") 유래의 다중 FN3 도메인들의 콘센서스 서열로 이루어진다. 추가의 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 15개의 FN3 도메인들의 콘센서스 서열(서열 번호 1 내지 15) 또는 그의 변이체이다. 본 발명의 특정 태양에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는, 스캐폴드 단백질이 열적 변성 및 화학적 변성에 저항하는 향상된 능력을 나타내게 하는 치환 잔기를 갖는다. 본 발명의 단백질 스캐폴드는, 스캐폴드 내의 지정된 루프 영역에 잔기를 삽입하여 결합 파트너에 선택적인 결합 도메인을 형성시키는 것을 포함하는, 당업계에 공지된 방법에 의해 조작될 수 있다. 결합 파트너는 가용성 분자 또는 세포에 고정된 분자, 예를 들어, 수용체 단백질의 세포외 도메인일 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 고유의 열안정성 및 화학적 안정성에 대해 선택적인 서열 번호 16(텐콘)의 콘센서스-기반의 서열 내의 특이적 치환은 텐콘 스캐폴드의 열안정성을 최대 11℃ 만큼 개선하고 GdmCl 유도된 변성의 중간점을 3.4 M로부터 5 M 초과로 이동시킨다. 일 실시 형태에서, 서열 번호 16(텐콘)에 대한 특이적 치환은 N46V, E14P, 및 E86I와 같이 단일 치환이며, 대안적인 실시 형태에서 치환은 N46V 및 E86I, E14P 및 N46V 및 E86I 전부, 및 L17A 및 N46V 및 E86I 전부와 같이 다중 치환이다. 안정성이 향상된 텐콘-기반의 폴리펩티드는 제형화, 정제의 용이성이 개선되고, 저장 수명이 증가된 스캐폴드를 제공한다. 안정화된 스캐폴드의 루프 내로 랜덤화 펩티드를 도입함으로써 전반적인 안정성이 개선된 조작된 결합 파트너를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 단량체 단위로 사용하거나 연결하여 동일하거나 상이한 결합 파트너 특이성을 가진 중합체 구조를 형성할 수 있다. 세포, 특히 상피 세포 흡수를 변경하는 분자, 예를 들어, 항체의 Fc 영역, 또는 알부민 결합 도메인과 같은 혈청 단백질에 결합하도록 디자인된 분자와의 연계와 같이, 텐콘 단백질 스캐폴드-기반의 분자를 추가로 개질하여 생체분포, 체내 지속성, 또는 치료 효능에 관련된 하나 이상의 생체내 특성을 향상시킬 수 있다. 추가의 실시 형태에서, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 단백질 스캐폴드를 암호화할 수 있는 핵산 분자에 결합될 수 있다.
또한 본 발명은 하나 이상의 단백질 스캐폴드가 검출가능한 양 및/또는 회수가능한 양으로 발현되는 조건 하에서 본 명세서에 기재된 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 숙주 세포에서 다중 FN3 도메인들의 콘센서스 서열에 관련된 서열을 가진 하나 이상의 단백질 스캐폴드 폴리펩티드를 발현시키는 하나 이상의 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 다중 FN3 도메인들의 콘센서스 서열 및/또는 본 명세서에 기재된 암호화 핵산을 기반으로 하는 단백질 스캐폴드; 및 (b) 적합하고/하거나 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 하나 이상의 조성물을 제공한다.
추가로 본 발명은 파이브로넥틴 III형(FN3) 반복체 단백질, 바람직하게는 다중 FN3 도메인들의 콘센서스 서열, 그리고 더욱 바람직하게는 열안정성 및 화학적 안정성이 향상된 인간 테나신 유래의 다중 FN3 도메인들의 콘센서스 서열을 기반으로 하는 단백질 스캐폴드의 라이브러리를 생성하는 방법을 포함한다. 라이브러리는 단일 루프의 아미노산 조성의 변경에 의해 또는 다중 루프 또는 스캐폴드 분자의 추가의 위치의 동시 변경에 의해 생성될 수 있다. 변경된 루프는 그에 따라 길어지거나 짧아질 수 있다. 그러한 라이브러리는 각각의 위치의 모든 가능한 아미노산, 또는 아미노산의 디자인된 하위세트를 포함하도록 생성될 수 있다. 라이브러리 구성원은 시험관 내 디스플레이(DNA, RNA, 리보좀 디스플레이 등), 효모, 박테리아 및 파지 디스플레이와 같은 디스플레이에 의한 스크리닝에 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 향상된 생물물리학적 특성, 예를 들어 높은 삼투 강도의 조건 하에서의 안정성 및 고농도에서의 용해도를 제공한다. 스캐폴드 단백질의 도메인은 다이설파이드 결합되어 있지 않으며, 이는 E. 콜라이(E. coli)와 같은 원핵 시스템, 및 토끼 망상적혈구 용해물 시스템과 같은 시험관내 전사/번역 시스템을 포함하는, 다이설파이드 연결부 형성에 필요한 효소가 없는 시스템에서 그들이 발현되고 폴딩되는 것을 가능하게 한다.
부가적인 태양에서 본 발명은, 본 발명의 스캐폴드 라이브러리를 표적 및 검출 바인더로 패닝(panning)함으로써 특정 표적에 결합하는 스캐폴드 분자를 생성시키는 방법을 제공한다. 다른 관련된 태양에서, 본 발명은 원하는 활성을 갖는, 예를 들어 특정 친화성으로 표적 단백질에 결합할 수 있는 단백질 스캐폴드를 생성하거나 친화성에 의해 성숙시키는 데 사용될 수 있는 스크리닝 방법을 포함한다. 친화성 성숙은 파지 디스플레이 또는 시험관 내 디스플레이와 같이 시스템을 이용하여 돌연변이 유발 및 선별의 반복 라운드에 의해 달성될 수 있다. 이 과정 동안의 돌연변이 유발은 특정 스캐폴드 잔기에 대한 부위 특이적 돌연변이 유발, 변이 유발(error-prone) PCR로 인한 랜덤 돌연변이 유발, DNA 셔플링(shuffling) 및/또는 이들 기술의 조합의 결과일 수 있다. 본 발명은 추가로 본 명세서에 기재된 임의의 발명을 제공한다.
<도 1>
도 1 도 1. NuPAGE 4 내지 12% 비스-트리스 젤(인비트로젠(Invitrogen))에서 실시되고 쿠마시 블루(coomassie blue)로 염색된 정제된 텐콘(Tencon)의 SDS-PAGE 분석. N은 천연 조건을 상징하며 R은 환원 조건을 상징한다.
<도 2>
도 2는 PBS 중의 텐콘의 원편광 이색성 분석을 나타낸다.
<도 3>
도 3은 PBS 중의 테나신 및 텐콘 유래의 제3 FN3 도메인의 원평광 이색성 분석을 나타내며, 여기서 각각 54℃ 및 78℃의 융해 온도가 얻어졌다.
<도 4>
도 4는pTencon-pIX의 파지미드 플라스미드 디자인을 나타낸다. 발현은 Lac 프로모터에 의해 구동되고 분비는 OmpA 시그널 서열을 통하여 구동된다.
<도 5>
도 5는 항-Myc 코팅된 웰, CNTO95 코팅된 웰, 및 코팅되지 않은 웰에 대한 파지의 결합을 입증하는 ELISA를 사용하여 myc-텐콘이 M13 파지 상에 디스플레이될 수 있음을 나타낸다.
<도 6>
도 6은 인간 테나신의 제3 FN3 도메인의 루프 구조를 도시하는 도면이다.
<도 7>
도 7은 IgG 선택의 ELISA 출력에 의한 스크리닝을 나타내며, 이에 의해 대조군으로서의 비오틴화 HSA 또는 비오틴화 IgG에 대한 결합에 대해 개별 클론을 시험하였다.
<도 8a 내지 b>
도 8a 내지 b는 280 ㎚의 형광 여기 및 360 ㎚의 방출에 의해 측정되는 단일 돌연변이체(a) 및 조합 돌연변이체(b)에 대한 GdmCl 유도된 변성을 나타내는 그래프이다.
약어
ADCC = 항체 의존성 세포 독성; CDC = 보체 의존성 세포 독성; DSC = 시차 주사 열량법; ΔG = 깁스 자유 에너지(Gibbs Free Energy); IgG = 면역글로불린 G; Tm = 융해 온도;
정의 및 용어의 설명
용어 "항체" 또는 "항체 부분"은 항체, 그의 분해 단편, 특정 부분 및 변이체를 포함하고자 의도되며, 이는 한정됨이 없이 항체 모방체(mimetic)를 포함하거나 한정됨이 없이 단쇄 항체, 단일 도메인 항체, 미니항체 및 그의 단편을 포함하는, 항체 또는 그의 특정 단편 또는 부분의 구조 및/또는 작용을 모방하는 항체의 부분을 포함한다. 작용성 단편은 관심의 대상인 표적 항원에 결합하는 항원-결합 단편을 포함한다. 예를 들어, Fab(예를 들어, 파파인 분해에 의해), Fab'(예를 들어, 펩신 분해 및 부분적인 환원에 의해) 및 F(ab')2(예를 들어, 펩신 분해에 의해), facb(예를 들어, 플라스민 분해에 의해), pFc'(예를 들어, 펩신 또는 플라스민 분해에 의해), Fd(예를 들어, 펩신 분해, 부분적인 환원 및 재응집에 의해), Fv 또는 scFv(예를 들어, 분자생물학 기술에 의해) 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 표적 항원 또는 그의 부분에 결합할 수 있는 항체 단편이 용어 항체에 포함된다. 항체 또는 단편은 임의의 포유류, 예를 들어, 그에 한정되는 것은 아니지만 인간, 마우스, 토끼, 랫트, 설치류, 영장류, 카멜리드, 염소, 또는 이들의 임의의 조합으로부터 유래될 수 있으며, 이는 단리된 인간, 영장류, 설치류, 포유류, 키메라, 인간화 및/또는 CDR-그래프팅(grafted) 항체, 면역글로불린, 이들의 절단 산물 및 기타 특정 부분 및 변이체를 포함한다.
용어 "에피토프"는 항체에 대한 특이적 결합이 가능한 단백질 결정부위(determinant) 또는 스캐폴드-기반의 단백질의 하나 이상의 루프와 같은 조작된 결합 도메인을 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당류 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹화로 구성되며, 통상적으로 특이적인 3차원 구조 특징 뿐 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 배좌(conformational) 에피토프 및 비배좌(nonconformational) 에피토프는, 변성화 용매의 존재 하에 전자에 대한 결합은 손실되나 후자에 대한 결합은 손실되지 않는다는 점으로 구별된다. 배좌 에피토프는 표적 분자의 선형 서열의 상이한 부분으로부터의 아미노산이 3-차원 공간에서 함께 인접할 때 발생하는 표적 분자의 배좌 폴딩으로부터 유발된다. 이러한 배좌 에피토프는 전형적으로 원형질막의 세포외 측면 상에 분포한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc", "Fc-함유 단백질" 또는 "Fc-함유 분자"는 적어도 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 단량체형, 이량체형 또는 헤테로이량체형 단백질을 말한다. CH2 및 CH3 도메인은 단백질/분자(예를 들어, 항체)의 이량체 영역의 적어도 일부분을 형성할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "안정성"은, 분자가 그의 하나 이상의 정상적 작용 활성, 예를 들어, 사이토카인 또는 혈청 단백질과 같은 표적 분자에 대한 결합을 보유하도록 생리적 조건 하에서 폴딩된 상태를 유지하는 분자의 능력을 지칭한다. 단백질 안정성 및 단백질 라이어빌리티(protein liability)의 측정은 단백질 견고성(protein integrity)의 동일하거나 상이한 측면이라고 볼 수 있다. 단백질은 열, 자외선 또는 전리 방사선, 액체 용액 중에서의 경우에는 주위 삼투 몰농도 및 pH의 변화, 작은 기공-크기의 여과에 의해 가해지는 기계적 전단력, 자외선 방사, 감마선 조사에 의한 것과 같은 전리 방사선, 화학적 탈수 또는 열 탈수, 또는 단백질 구조 붕괴를 유발할 수 있는 임의의 다른 작용 또는 힘에 의해 유발되는 변성화에 대해 민감하거나 "불안정"하다. 분자의 안정성은 표준 방법을 사용하여 결정할 수 있다. 예를 들어, 분자의 안정성은 열 융해("TM": thermal melt) 온도를 측정함으로써 결정할 수 있다. TM은 분자의 ½이 언폴딩되는 섭씨°(℃) 단위의 온도이다. 전형적으로, TM이 더 높을수록 분자는 더 안정하다. 열 뿐 아니라, 화학적 환경 또한 특정 3 차원 구조를 유지하는 단백질의 능력을 변화시킨다.
다양한 방법에 의해 유사하게 화학적 변성을 측정할 수 있다. 화학적 변성제는 단백질 내의 비-공유 상호작용 및 공유 결합, 예를 들어 수소 결합, 정전기적 결합, 반 데르 발스 힘, 소수성 상호작용, 또는 다이설파이드 결합을 붕괴시키는 것으로 알려진 약제이다. 화학적 변성제는 구아니디늄 하이드로클로라이드, 구아나디늄 티오시아네이트, 우레아, 아세톤, 유기 용매(DMF, 벤젠, 아세토니트릴), 염(암모늄 설페이트 리튬 브로마이드, 리튬 클로라이드, 소듐 브로마이드, 칼슘 클로라이드, 소듐 클로라이드); 환원제(예를 들어, 다이티오트레이톨, 베타-메르캅토에탄올, 다이니트로티오벤젠, 및 하이드라이드, 예를 들어 소듐 보로하이드라이드) , 비-이온성 및 이온성 세제, 산(예를 들어, 염산(HCl), 아세트산(CH3COOH), 할로겐화 아세트산), 소수성 분자(예를 들어, 인지질), 및 표적화 변성제(문헌[Jain R.K and Hamilton A. D., Angew. Chem. 114(4), 2002])를 포함한다. 변성 정도의 정량화는 표적 분자에 결합하는 능력과 같은 작용성 특성의 손실, 또는 물리화학적 특성, 예를 들어 응집에 대한 경향, 이전에는 용매가 접근할 수 없었던 잔기의 노출, 또는 다이설파이드 결합의 붕괴 또는 형성에 의존할 수 있다.
안정성의 손실에 관하여, 즉, 단백질의 "변성화" 또는 "변성"은 단백질의 작용성 특성을 부여하는 3-차원 배좌의 일부 또는 전부가 활성 및/또는 용해도의 동반 손실과 함께 손실되는 과정을 의미한다. 변성 중에 붕괴되는 힘은, 정전기적, 소수성, 반 데르 발스 힘, 수소 결합, 및 다이설파이드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 분자내 결합을 포함한다. 기계적 힘(예를 들어, 압축력 또는 전단력)과 같이 단백질 또는 단백질을 포함하는 용액에 적용되는 힘, 열적 스트레스, 삼투 스트레스, pH의 변화, 전기장 또는 자기장, 전리 방사선, 자외선 방사 및 탈수에 의해, 그리고 화학적 변성제에 의해, 단백질 변성이 유발될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "치료적으로 유효한" 처리 또는 양은, 장애 또는 그의 증상의 원인의 검출가능한 경감 또는 개선을 유발하기에 충분한 분량의 양을 지칭한다. "개선하다"는 요법을 받는 환자에게서 장애의 유해 효과를 경감시키는 것을 지칭한다. 본 발명의 대상은 바람직하게는 인간이지만, 해로운 병태, 장애, 또는 질환에 대한 치료를 필요로 하는 임의의 동물을 그 목적을 위해 디자인된 스캐폴드-기반의 단백질로 치료할 수 있을 것으로 예상할 수 있다.
개관
본 발명은 파이브로넥틴 III형(FN3) 반복체 단백질의 콘센서스 서열을 기반으로 하는 단리된 재조합 및/또는 합성 단백질 스캐폴드를 제공하며, 이는 한정됨이 없이 포유류 유래의 스캐폴드를 포함하고, 이외에도 콘센서스 FN3 서열을 기반으로 하는 단백질 스캐폴드를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 조성물 및 암호화 핵산 분자를 제공한다. 추가로, 본 발명은 진단 및 치료 조성물, 방법 및 장치를 발견 기반으로서 포함하는, 상기 핵산 및 단백질 스캐폴드의 제조 방법 및 사용 방법을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 그의 작고 조밀한 크기로 인해 더 큰 면역글로불린 기반의 생물의약품에 비해 이점을 제공한다. 특히, 생물학적 분자의 크기 및 형상은, 국소적, 경구적으로 투여되거나 혈류-뇌 장벽을 통과하는 그의 능력; E. 콜라이와 같은 저비용 시스템에서 발현되는 능력; 다중 표적 또는 동일한 표적의 다중 에피토프에 결합하는 이중- 또는 다중-특이적 분자로 조작되는 능력, 접합을 위한 적합성(즉, 활성제, 중합체, 및 탐침에 대한); 고농도로 제형화되는 능력; 및 질환에 걸린 조직 및 종양에 효과적으로 침투하는 이러한 분자의 능력에 영향을 줄 수 있다.
게다가, 단백질 스캐폴드는 항체의 가변 영역을 모방하는 이의 폴드와 관련하여 항체의 특성들 중 많은 것을 보유한다. 이러한 배향은 FN3 루프가 항체 상보성 결정 영역(complementarity determining region; CDR)과 유사하게 노출될 수 있도록 한다. 상기 루프는 세포 표적에 결합할 수 있어야 하며, 루프는 변경되어, 예를 들어 친화성 성숙되어 소정 결합 특성 또는 관련 특성을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드의 6개 루프 중 3개는 특성상 과가변성인 것으로 공지된 가변 도메인의 루프(카바트(Kabat)에 의해 항체의 상보성 결정 영역(CDR), 즉, 항원-결합 영역의 잔기로서 정의된 바와 같은 위치의, 과가변 도메인 루프(HVL: hypervariable domains loop))에 위치하는 항체의 결합 도메인에 위상학적으로 상응하고, 반면에 나머지 3개 루프는 항체 CDR과 유사한 방식으로 표면 노출된다. 이들 루프는 하기 표 3 및 도 6에 나타낸 바와 같이 서열 번호 16의 잔기 13 내지 16, 22 내지 28, 38 내지 43, 51 내지 54, 60 내지 64, 및 75 내지 81에, 또는 그 근처에 걸쳐 있거나 위치한다. 바람직하게는, 잔기 22 내지 28, 51 내지 54, 및 75 내지 81의 또는 그 근처의 루프 영역은 결합 특이성 및 친화성을 위하여 변경된다. 이들 루프 영역들 중 하나 이상을 다른 루프 영역들 및/또는 다른 가닥들에 의해 랜덤화시켜 이들의 서열을 골격 부분으로서 유지하여 라이브러리를 채우며, 특정 단백질 표적에 대하여 친화성이 높은 강력한 바인더를 상기 라이브러리로부터 선별할 수 있다. 루프 영역들 중 하나 이상은 항체 CDR의 단백질과의 상호작용과 유사하게 표적 단백질과 상호작용할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드는 예를 들어 공유 결합에 의한 상호작용을 통하여 다른 서브유닛을 포함할 수 있다. 항체 불변 영역의 전부 또는 부분은 스캐폴드에 부착되어 항체-유사 특성, 특히 Fc 영역에 연계된 특성, 예를 들어 보체 활성(ADCC), 반감기 등을 부여할 수 있다. 예를 들어, 이펙터 작용은 예를 들어 C1q 결합 및/또는 FcγR 결합을 개질하고 이에 의해 CDC 활성 및/또는 ADCC 활성을 변화시킴으로써 제공 및/또는 제어될 수 있다. "이펙터 작용"은 (예를 들어, 대상에서) 생물학적 활성의 활성화 또는 저감을 담당한다. 이펙터 작용의 예는, C1q 결합; 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개성 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity); 식작용; 세포 표면 수용체(예를 들어, B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 이러한 이펙터 작용은 결합 도메인(예를 들어, 단백질 스캐폴드 루프)과 조합될 Fc 영역을 필요로 할 수 있으며, 다양한 어세이(예를 들어, Fc 결합 어세이, ADCC 어세이, CDC 어세이 등)를 사용하여 평가할 수 있다.
부가적인 부분이 스캐폴드-기반의 폴리펩티드 또는 변이체와 연계되거나 첨부될 수 있으며, 예를 들어 독소 접합체, 알부민 또는 알부민 바인더, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 분자를 목적하는 특성을 위해 스캐폴드 분자에 부착할 수 있다. 이들 부분은 스캐폴드 코딩 서열과 인라인 융합될 수 있으며, 표준 기술, 예를 들어, 공중 이용이 가능한 코딩 뉴클레오티드 서열을 사용하여 작제된 재조합 융합 암호화 벡터로부터의 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다. 대안적으로, 화학적 방법을 사용하여 재조합으로 생성시킨 스캐폴드-기반의 단백질에 부분을 부착할 수 있다.
본 발명의 스캐폴드는 단량체 형태로 1특이성으로서 또는 다량체 형태로 2특이성 또는 다중 특이성으로 (상이한 단백질 표적에 대하여 또는 동일 단백질 표적 상의 에피토프들에 대하여) 사용될 수 있다. 각각의 스캐폴드 단위 사이의 부착은 공유 또는 비-공유일 수 있다. 예를 들어, 이량체성 2특이성 스캐폴드는 제1 표적 단백질 또는 에피토프에 대하여 특이성을 갖는 하나의 서브유닛 및 제2 표적 단백질 또는 에피토프에 대하여 특이성을 갖는 제2 서브유닛을 갖는다. 스캐폴드 서브유닛들은 결합가를 증가시키고 따라서 항원 결합의 결합성(avidity)을 증가시킬 수 있는 다양한 배좌로 연결될 수 있다.
스캐폴드 단백질의 생성 및 제조
본 발명의 하나 이상의 스캐폴드 단백질은 당업계에 주지된 바와 같이 세포주, 혼합된 세포주, 불멸화(immortalized) 세포 또는 불멸화 세포의 클론 집단에 의해 임의로 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001)]; 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)]; 문헌[Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001)]; 문헌[Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001)]을 참조한다.
당업계에 공지된 바와 같이, 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화성, 온-레이트(on-rate), 오프-레이트(off-rate), 결합성, 특이성, 반감기, 안정성, 용해도 또는 임의의 다른 적합한 특성을 감소, 향상, 또는 개질하기 위해 스캐폴드 단백질로부터의 아미노산을 변경, 부가 및/또는 결실시킬 수 있다.
항원에 대한 높은 친화성 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보존하면서 생물활성 스캐폴드-기반의 단백질을 조작할 수 있다. 이 목적을 달성하기 위하여, 모(parental) 서열 및 조작된 서열의 3차원 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적(conceptual) 조작 산물의 분석 과정에 의해 스캐폴드 단백질을 임의로 제조할 수 있다. 3차원 모델이 통상 이용가능하고 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 서열의 가능한 3차원 입체형태적 구조를 묘사하고 디스플레이하여 가능한 면역원성을 측정할 수 있는 컴퓨터 프로그램(예를 들어, 미국 캘리포니아주 몬로비아 소재의 젠코, 인크.(Xencor, Inc.)의 이뮤노필터(Immunofilter) 프로그램)이 입수가능하다. 이들 디스플레이를 조사하여, 후보 서열이 작용함에 있어서의 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉, 후보 스캐폴드 단백질이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 잔기는 요구되는 특징, 예를 들어 표적 항원(들)에 대한 친화성이 달성되도록 모 서열 및 기준 서열로부터 선택되고 조합될 수 있다. 상기 절차에 대하여 대안적으로, 또는 그에 더하여, 다른 적합한 조작 방법이 사용될 수 있다.
스크리닝
다양화된 잔기 또는 도메인을 가진 스캐폴드-기반의 단백질을 포함하는 조작된 스캐폴드-기반의 단백질 또는 라이브러리를 유사한 단백질 또는 단편에 대한 특이적 결합에 대해 스크리닝하는 단계는, 뉴클레오티드(DNA 또는 RNA 디스플레이) 또는 펩티드 디스플레이 라이브러리, 예를 들어, 시험관내 디스플레이를 사용하여 편리하게 달성할 수 있다. 이 방법은 요구되는 작용 또는 구조를 갖는 개별 멤버에 대하여 거대 펩티드 집단을 스크리닝하는 것을 포함한다. 뉴클레오티드 서열을 동반하거나 동반하지 않는 디스플레이된 펩티드의 길이는 3 내지 5000개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산, 빈번하게는 5 내지 100개 아미노산의 길이, 흔히 약 8 내지 25개 아미노산의 길이일 수 있다. 펩티드 라이브러리를 생성하기 위한 직접적인 화학적 합성 방법 이외에, 몇몇 재조합 DNA 방법이 기재되어 있다. 한 종류는 박테리오파지 또는 세포의 표면 상에 펩티드 서열을 디스플레이하는 것을 포함한다. 각각의 박테리오파지 또는 세포는 특정 디스플레이된 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명의 단백질 스캐폴드는 광범위한 친화성(KD)으로 인간 또는 기타 포유류 단백질에 결합할 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 하나 이상의 본 발명의 단백질 스캐폴드는 높은 친화성으로, 예를 들어, 당업자에 의해 실시되는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명법(surface plasmon resonance) 또는 키넥사법(Kinexa method)에 의해 결정할 때, 약 10-7 M 이하, 예를 들어, 그에 한정되는 것은 아니지만, 0.1 내지 9.9(또는 그 안의 임의의 범위 또는 값) X 10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15 또는 그 안의 임의의 범위 또는 값의 KD로, 표적 단백질에 임의로 결합될 수 있다.
임의의 적합한 방법을 사용하여 항원에 대한 단백질 스캐폴드의 친화성 또는 결합성을 실험적으로 결정할 수 있다. (예를 들어, 문헌[Berzofsky, et al., "Antibody-Antigen Interactions," In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984)]; 문헌[Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992)]; 및 본 명세서에 기재된 방법을 참조한다). 상이한 조건(예를 들어, 삼투 몰농도, pH) 하에 측정될 경우, 특정 단백질 스캐폴드-항원 상호작용의 측정된 친화성은 변동될 수 있다. 따라서, 친화성 및 기타 항원-결합 파라미터(예를 들어, KD, Kon, Koff)의 측정은 바람직하게는 단백질 스캐폴드 및 항원의 표준화된 용액, 및 표준화된 완충제, 예를 들어 본 명세서에 기재된 바와 같은 완충제로 행해진다.
경쟁적 분석을 본 발명의 단백질 스캐폴드를 이용하여 실시하여 어떤 단백질, 항체 및 기타 길항제가 표적 단백질에의 결합에 대하여 본 발명의 단백질 스캐폴드와 경쟁하는지 및/또는 에피토프 영역을 공유하는지를 결정할 수 있다. 당업자에게 쾌히 공지되어 있는 이들 분석은 단백질 상의 제한된 개수의 결합 부위들에 대한 길항제들 또는 리간드들 사이의 경쟁을 평가한다. 단백질 및/또는 항체는 경쟁 전 또는 후에 고정되거나, 단리되거나, 포획되며, 표적 단백질에 결합된 샘플은 예를 들어 (단백질/항체가 사전 불용화되었을 경우) 데칸팅(decanting)에 의해, 또는 (단백질/항체가 경쟁 반응 후에 침전되었을 경우) 원심분리에 의해 미결합 샘플로부터 분리된다. 또한, 경쟁적 결합은 표적 단백질에의 단백질 스캐폴드의 결합에 의해 또는 상기 결합의 결여에 의해 작용이 변경되는지에 의해, 예를 들어 단백질 스캐폴드 분자가 예를 들어 표지체의 효소적 활성을 저해하는지 또는 강화하는지에 의해 결정될 수 있다. 당업계에 잘 알려져 있는 바와 같이 ELISA 및 기타 작용성 분석이 사용될 수 있다.
핵산 분자
단백질 스캐폴드를 암호화하는 본 발명의 핵산 분자는 RNA 형태, 예를 들어 mRNA, hnRNA, tRNA 또는 임의의 다른 형태, 또는 클로닝에 의해 얻어지거나 합성에 의해 생성된 게놈 DNA 및 cDNA, 또는 그의 임의의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 DNA의 형태일 수 있다. DNA는 삼중가닥, 이중가닥 또는 단일가닥, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. DNA 또는 RNA의 하나 이상의 스트랜드의 임의의 부분은 센스 스트랜드로도 공지된 코딩 스트랜드일 수 있고, 안티-센스 스트랜드로도 언급되는 비-코딩 스트랜드일 수 있다.
본 발명의 단리된 핵산 분자는, 임의로, 하나 이상의 인트론, 예를 들어, 그에 한정되는 것은 아니지만, 하나 이상의 단백질 스캐폴드의 하나 이상의 특정 부분을 가진 개방 해독틀(ORF: open reading frame)을 포함하는 핵산 분자; 표적 단백질에 결합하는 루프 영역 또는 단백질 스캐폴드에 대한 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자; 및 상기의 것들과 실질적으로 상이한 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 유전자 코드의 축퇴성으로 인하여, 본 명세서에 기재되고/되거나 당업계에 공지된 단백질 스캐폴드를 여전히 암호화하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 물론, 유전자 코드는 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 당업자가 본 발명의 특이적인 단백질 스캐폴드를 코딩하는 상기 축퇴성 핵산 변이체를 생성시키는 것은 통상적일 것이다. 예를 들어, 문헌[Ausubel, et al., 상기 문헌]을 참조하며, 이러한 핵산 변이체는 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, 단백질 스캐폴드를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는, 단독으로 단백질 스캐폴드 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 것들; 전체 단백질 스캐폴드 또는 그의 부분에 대한 코딩 서열; 단백질 스캐폴드, 단편 또는 부분에 대한 코딩 서열과 더불어, 부가적인 서열, 예를 들어 전기의 부가적인 코딩 서열, 예를 들어 하나 이상의 인트론을 동반하거나 동반하지 않는 하나 이상의 시그널 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열과 함께, 부가적인 비-코딩 서열, 예를 들어, 그에 한정되는 것은 아니지만, 비-코딩 5' 및 3' 서열, 예를 들어, 전사, mRNA 프로세싱, 예를 들어 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널(예를 들어, mRNA의 안정성 및 리보좀 결합)에 있어서 역할을 하는 전사, 비-번역 서열; 부가적인 작용성을 제공하는 것들과 같은, 부가적인 아미노산을 코딩하는 부가적인 코딩 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 단백질 스캐폴드를 암호화하는 서열은 마커 서열, 예를 들어 단백질 스캐폴드 단편 또는 부분을 포함하는 융합 단백질 스캐폴드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 암호화하는 서열에 융합될 수 있다.
핵산 분자
또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 암호화하는 핵산을 조성물 또는 그의 유도된 돌연변이원의 원핵, 진핵 또는 사상 파지 발현, 분비 및/또는 디스플레이와 상용성인 벡터를 포함하는 발현 벡터의 부분으로서 또는 단리된 폴리뉴클레오티드로서 제공한다.
본 발명의 단리된 핵산은 당업계에 잘 알려진 바와 같이 (a) 재조합 방법, (b) 합성 기술, (c) 정제 기술 및/또는 (d) 이들의 조합에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 실시에 유용한 폴리뉴클레오티드는 본 명세서에 기재된 단백질 스캐폴드의 작용성 부분을 암호화할 것이다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 단백질 스캐폴드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 선택적으로 혼성화하기 위해 사용될 수 있는 핵산 서열을 포함한다. 본 발명은 선택적인 혼성화 조건 하에서 본원에서 설명되는 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 단리된 핵산을 제공한다. 따라서, 상기 실시 형태의 폴리뉴클레오티드는 그러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 핵산을 단리, 검출, 및/또는 정량하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 기탁된 라이브러리에서 부분적인 또는 전장 클론을 확인, 단리, 또는 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된 게놈 또는 cDNA 서열이거나, 또는 그렇지 않으면 인간 또는 포유동물 핵산 라이브러리로부터의 cDNA에 상보적이다.
핵산은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 부가적으로 서열을 편리하게 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 엔도뉴클레아제 제한 부위를 포함하는 다중-클로닝 부위는 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 핵산 내로 삽입될 수 있다. 또한, 번역가능한 서열은 본 발명의 번역된 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕기 위해 삽입될 수 있다. 예를 들어, 헥사-히스티딘 마커 서열은 본 발명의 단백질을 정제하는 편리한 수단을 제공한다. 코딩 서열을 제외한 본 발명의 핵산은 선택적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 발현을 위한 벡터, 어댑터, 또는 링커이다.
부가적인 서열은 클로닝 및/또는 발현에서 그 작용을 최적화하거나, 폴리뉴클레오티드의 단리를 돕거나 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입을 개선하기 위해 상기 클로닝 및/또는 발현 서열에 부가될 수 있다. 클로닝 벡터, 발현 벡터, 어댑터, 및 링커의 용도는 당업계에 주지되어 있다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이, 단백질 스캐폴드를 암호화하는 핵산을 포함하는 본 발명의 핵산 분자는, 단독으로 단백질 스캐폴드 단편의 아미노산 서열을 암호화하는 것들; 전체 단백질 스캐폴드 또는 그의 부분에 대한 코딩 서열; 단백질 스캐폴드, 단편 또는 부분에 대한 코딩 서열과 더불어, 부가적인 서열, 예를 들어 전기의 부가적인 코딩 서열, 예를 들어 하나 이상의 인트론을 동반하거나 동반하지 않는 하나 이상의 시그널 리더 또는 융합 펩티드의 코딩 서열과 함께, 부가적인 비-코딩 서열, 예를 들어, 그에 한정되는 것은 아니지만, 비-코딩 5' 및 3' 서열, 예를 들어, 전사, mRNA 프로세싱, 예를 들어 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그널(예를 들어, mRNA의 안정성 및 리보좀 결합)에 있어서 역할을 하는 전사, 비-번역 서열; 부가적인 작용성을 제공하는 것들과 같은, 부가적인 아미노산을 코딩하는 부가적인 코딩 서열을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 단백질 스캐폴드를 암호화하는 서열은 마커 서열, 예를 들어 단백질 스캐폴드 단편 또는 부분을 포함하는 융합 단백질 스캐폴드의 정제를 용이하게 하는 펩티드를 암호화하는 서열에 융합될 수 있다.
파지 감염된 박테리아를 포함하는 박테리아 발현에 있어서, 바람직한 분비 시그널은 pelB 또는 ompA 분비 시그널이지만 미국특허 제5,658,727호에 기재된 바와 같이 다른 분비 시그널 폴리펩티드 도메인을 사용할 수 있다. 파지 디스플레이에서는, 다운스트림 번역가능한 DNA 서열이 사상 파지 코트 단백질, 예를 들어 pIII 또는 pIX 단백질을 암호화한다. 바람직한 파지 단백질은 사상 파지 M13, f1, fd 등 균등한 사상 파지로부터 얻을 수 있다. 따라서, 다운스트림 번역가능한 DNA 서열은 사상 파지 유전자 III 또는 유전자 IX 코트 폴리펩티드에 상응하고, 바람직하게는 동일한 아미노산 잔기 서열을 암호화한다. 이러한 코트 단백질의 서열은 NCBI와 같은 공중 데이터베이스에 공지되어 있으며 접근가능하다.
cDNA 또는 게놈 라이브러리는 본원에 설명된 것과 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열에 기초한 프로브를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 프로브는 게놈 DNA 또는 cDNA 서열과 혼성화하여 동일하거나 상이한 유기체 내의 상동 유전자를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 다양한 혼성화 엄격성 정도를 어세이에 채택할 수 있으며; 혼성화 또는 세척 매질이 엄격할 수 있음을, 당업자는 인식할 것이다. 혼성화 조건이 보다 더 엄격해지면, 이중체 형성의 발생을 위해 프로브와 표적 사이의 상보성 정도가 보다 커야 한다. 엄격성 정도는 온도, 이온강도, pH 및 포름아미드와 같은 부분 변성 용매의 존재 중 하나 이상에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 0% 내지 50%의 범위 내에서 포름아미드의 농도의 조정을 통해 반응물 용액의 극성을 변화시킴으로써, 예를 들어, 혼성화의 엄격성이 편리하게 변동된다. 검출가능한 결합을 위해 필요한 상보성(서열 동일성)의 정도는 혼성화 매질 및/또는 세척 매질의 엄격성에 따라 변동될 것이다. 상보성 정도는 최적으로는 100%, 또는 70 내지 100%, 또는 그안의 임의의 범위 또는 값일 것이다. 그러나, 프로브 및 프라이머에서의 작은 서열 변이는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격성을 감소시켜 보상될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 일 태양에서는, 생성되는 폴리펩티드를 하나 이상의 특이적 잔기에서 다양화하거나 서열 내의 특이적 위치에 잔기를 부가하기 위하여 램덤화 코돈의 혼입을 위한 기술을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 작제한다. 랜덤, 반-합리적, 및 합리적 방법을 포함하는 다양한 전략을 사용하여, 변경된 폴리펩티드 서열의 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 합리적 및 반-합리적 방법은, 코딩 서열 내로 도입된 변화의 결과에 대해 더 많은 제어를 갖는다는 점에서, 랜덤 전략에 비해 이점을 갖는다. 또한, 유전자의 소정 영역에 변이를 집중시킴으로써, 선택된 위치에서 가능한 모든 아미노산 변이체의 세계를 탐색할 수 있다.
통상의 NNK 또는 NNS 다양화 스킴 상에 구축된 라이브러리는 모든 위치에 가능한 32개의 상이한 코돈 및 20개의 아미노산 모두를 도입한다. 이러한 라이브러리는 이론적으로 n개의 잔기 수마다 32n 만큼 성장한다. 그러나, 실용적인 관점에서, 파지 디스플레이는 109 내지 1010 변이체의 샘플링 라이브러리로 한정되며, 이는 라이브러리 내에 전체 서열 커버리지를 달성하고자 하는 경우에 단지 6 내지 7개의 잔기를 다양화를 위한 표적으로 삼을 수 있음을 시사한다. 따라서, 다양화하고자 하는 중심 위치를 동정하고 이에 부합하는 다양화 체제를 선택함으로써 스캐폴드 변이체의 라이브러리를 생성하는 반-합리적 또는 "집중적인" 방법을 적용할 수 있다. "코돈 세트"는 목적하는 변이체 아미노산을 암호화하기 위해 사용되는 상이한 뉴클레오티드 트리플렛 서열의 세트를 지칭한다. 코돈 표기의 표준 형태는 IUB 코드의 것이며, 이는 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재된다. "비-랜덤 코돈 세트"는 선택된 아미노산을 암호화하는 코돈 세트를 지칭한다. 소정 위치에 선택된 뉴클레오티드 "축퇴성"을 가진 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, TRIM 접근방법(문헌[Knappek et al.; J. Mol. Biol. (1999), 296:57-86]; 문헌[Garrard & Henner, Gene (1993), 128:103])). 소정 코돈 세트를 갖는 이러한 뉴클레오티드의 세트는 구매가능한 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 시약 및 장치를 사용하여 합성할 수 있다.
코돈 세트는 목적하는 변이체 아미노산을 암호화하기 위해 사용되는 상이한 뉴클레오티드 트리플렛 서열의 세트이다. IUB 코드에 따라 하기에 나타낸 바와 같이 특정 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드의 등몰 혼합물을 표기하는 기호를 사용하여 코돈 세트를 나타낼 수 있다.
IUB 코드
G 구아닌
A 아데닌
T 티민
C 사이토신
R(A 또는 G)
Y(C 또는 T)
M(A 또는 C)
K(G 또는 T)
S(C 또는 G)
W(A 또는 T)
H(A 또는 C 또는 T)
B(C 또는 G 또는 T)
V(A 또는 C 또는 G)
D(A 또는 G 또는 T)
N(A 또는 C 또는 G 또는 T)
예를 들어, 코돈 세트 DVK에서, D는 뉴클레오티드 A 또는 G 또는 T일 수 있고; V는 A 또는 G 또는 C일 수 있으며; K는 G 또는 T일 수 있다. 이 코돈 세트는 18개의 상이한 코돈을 제공할 수 있으며 아미노산 Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly, 및 Cys를 암호화할 수 있다.
NNK 코돈을 사용하고 선택된 잔기에 변이를 집중시켜 집중된(예를 들어, 비-랜덤) 라이브러리를 생성할 수 있거나, 대안적으로는, 예를 들어 DVK 코돈을 사용하여 비-랜덤 치환을 가진 변이체를 생성할 수 있으며, 이는 11개의 아미노산(ACDEGKNRSYW) 및 1개의 정지 코돈을 암호화한다. 대안적으로, 쿤켈(Kunkel) 돌연변이 유발을 사용하여 폴리펩티드의 목적하는 잔기 또는 영역을 다양화할 수 있다(문헌[Kunkel et al., Methods Enzymol. 154:367-382, 1987]).
표준 클로닝 기술을 사용하여 라이브러리를 발현용 벡터내에 클로닝한다. 예를 들어, 융합 단백질로서 라이브러리를 발현시키는 공지의 시스템을 사용하여 라이브러리를 발현시킬 수 있다. 융합 단백질은 임의의 적합한 파지의 표면 상에 디스플레이될 수 있다. 항체 단편을 포함하는 융합 폴리펩티드를 박테리오파지의 표면 상에 디스플레이하는 방법은 주지되어 있다(제US 6,969,108호(Griffith); 제US 6,172,197호(McCafferty); 제US 5,223,409호(Ladner); 제US 6,582,915호(Griffiths); 제US6472147호(Janda)). 드 노보(de novo) 폴리펩티드 단리를 위한 라이브러리를 pIX 상에 디스플레이할 수 있다(WO2009085462A1). 또한, 예를 들어 리보좀 디스플레이(문헌[Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Scie. USA, 94:4937, 1997]), mRNA 디스플레이(문헌[Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12297, 1997]), CIS-디스플레이(문헌[Odegrip et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:2806, 2004]) 또는 다른 무세포 시스템(US 5,643,768(Kawasaki))을 사용하여 라이브러리를 시험관내 번역할 수 있다.
텐콘 서열(서열 번호 16) 또는 그의 소정의 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 사용하여 다양화 영역을 가진 라이브러리를 생성할 수 있다. 주형 작제물은 폴리펩티드 쇄를 위한 시그널 서열 및 프로모터를 가질 수 있다. 스캐폴드 라이브러리를 만들기 위하여, 스캐폴드의 루프 영역(A:B, B:C, C:D, D:E, E:F, 및 F:G)을 코딩하는 올리고뉴클레오티드를 사용하는 돌연변이 유발 반응을 사용한다. 모든 선택된 위치가 랜덤화 스킴 내로 혼입되는 것을 보장하기 위하여, 다양화시키고자 의도되기를 원하는 각각의 영역 내에 정지 코돈(예를 들어 TAA)을 혼입시킬 수 있다. 정지 코돈이 대체된 클론만이 나타날 것이다.
개질된 스캐폴드 폴리펩티드
본 발명의 개질된 단백질 스캐폴드 및 단편은 다른 단백질에 직접 또는 간접적으로 공유결합된 하나 이상의 부분을 포함할 수 있다.
펩티드 잔기의 부가, 또는 인라인 융합 단백질의 생성의 경우, 본 명세서에 기재된 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 재조합 기술을 통해 이러한 잔기를 부가할 수 있다. 첨부되거나, 부착되거나, 접합된 펩티드, 단백질, 유기 화학물질, 무기 화학물질, 또는 원자, 또는 그의 임의의 조합의 경우, 전형적으로 펩티드 결합 이외의 것을 통해 본 발명의 단백질 스캐폴드 또는 단편에 부가적인 부분을 결합시킨다. 본 발명의 변형된 단백질 스캐폴드는 단백질 스캐폴드 또는 단편을 변형제와 반응시킴으로써 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 유기 모이어티는 아민-반응성 변형제, 예를 들어 PEG의 NHS 에스테르를 사용함으로써 부위 비-특이적 방식으로 단백질 스캐폴드에 결합될 수 있다. 본 발명의 단백질 스캐폴드의 특이적인 부위에 결합되는 유기 부분을 포함하는 개질된 단백질 스캐폴드 및 단편은 적합한 방법, 예를 들어 역 단백질 분해(reverse proteolysis)(문헌[Fisch et al., Bioconjugate Chem, 3:147-153 (1992)]; 문헌[Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994)]; 문헌[Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997)]; 문헌[Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996)]; 문헌[Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)]), 및 문헌[Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996)]에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
중합체 또는 쇄가 스캐폴드 단백질에 부착되는 경우, 중합체 또는 쇄는 독립적으로 친수성 중합체 기, 지방산 기 또는 지방산 에스테르 기일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지방산"은 모노-카르복실산 및 다이-카르복실산을 포함한다. "친수성 중합체 기"는, 이 용어가 본 명세서에 사용될 때, 옥탄 중에서보다 물 중에서 더 가용성인 유기 중합체를 지칭한다. 예를 들어, 폴리라이신은 옥탄 중에서보다 물 중에서 더 가용성이다. 따라서, 폴리라이신의 공유 결합적 부착에 의해 변형된 단백질 스캐폴드가 본 발명에 포함된다. 본 발명의 단백질 스캐폴드의 변형에 적합한 친수성 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 예를 들어 폴리알칸 글리콜(예를 들어, PEG, 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), PPG 등), 탄수화물(예를 들어, 덱스트란, 셀룰로오스, 올리고당, 다당류 등), 친수성 아미노산의 중합체(예를 들어, 폴리라이신, 폴리아르기닌, 폴리아스파테이트 등), 폴리알칸 옥사이드(예를 들어, 폴리에틸렌옥사이드, 폴리프로필렌 옥사이드 등) 및 폴리비닐 피롤리돈을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 단백질 스캐폴드를 변형시키는 친수성 중합체는 별개의 분자 엔티티(entity)로서 약 800 내지 약 150,000 달톤의 분자량을 갖는다. 예를 들어, PEG5000 및 PEG20000(여기서, 아래첨자는 중합체의 평균 분자량(달톤)임)이 사용될 수 있다. 친수성 중합체기는 1 내지 6개의 알킬, 지방산 또는 지방산 에스테르기로 치환될 수 있다. 지방산 또는 지방산 에스테르기로 치환된 친수성 중합체를 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 아민기를 포함하는 중합체는 지방산 또는 지방산 에스테르의 카르복실레이트에 커플링될 수 있고, 지방산 또는 지방산 에스테르 상의 활성화된 카르복실레이트(예를 들어, N,N-카르보닐 다이이미다졸로 활성화됨)는 중합체 상의 히드록실기와 커플링될 수 있다.
본 발명의 단백질 스캐폴드의 변형에 적합한 지방산과 지방산 에스테르는 포화될 수 있거나 하나 이상의 불포화 단위를 함유할 수 있다. 본 발명의 단백질 스캐폴드 개질에 적합한 지방산은, 예를 들어 n-도데카노에이트(C12, 라우레이트), n-테트라데카노에이트(C14, 미리스테이트), n-옥타데카노에이트(C18, 스테아레이트), n-에이코사노에이트(C20, 아라키데이트), n-도코사노에이트(C22, 베헤네이트), n-트라이아콘타노에이트(C30), n-테트라콘타노에이트(C40), 시스-Δ9-옥타데카노에이트(C18, 올레에이트), 모든 시스-Δ5,8,11,14-에이코사테트라에노에이트(C20, 아라키도네이트), 옥탄다이오익산, 테트라데칸다이오익산, 옥타데칸다이오익산, 도코산다이오익산 등을 포함한다. 적합한 지방산 에스테르는 선형 또는 분지형 저급 알킬기 포함하는 다이카르복실산의 모노-에스테르를 포함한다. 저급 알킬기는 1 내지 약 12개, 바람직하게는 1 내지 약 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
Fc-함유 단백질은 몇몇의 잘 알려진 시험관 내 분석법에 의해 작용성에 대하여 비교될 수 있다. 특히, Fcγ 수용체의 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 패밀리의 구성원에 대한 친화성이 관심의 대상이다. 이들 측정은 재조합 가용성 형태의 수용체 또는 세포-회합된 형태의 수용체를 사용하여 실행할 수 있다. 또한, 예를 들어 재조합 가용성 FcRn을 사용하는 비아코어(BIAcore)에 의해, IgG의 장기간 순환 반감기를 담당하는 수용체인 FcRn에 대한 친화성을 측정할 수 있다. 세포-기반의 작용성 어세이, 예를 들어 ADCC 어세이 및 CDC 어세이는, 특정 변이체 구조의 가능한 작용성 결과에 대한 고찰을 제공한다. 일 실시 형태에서, ADCC 어세이는 NK 세포가 주요 이펙터 세포가 되게 하도록 구성됨으로써, FcγRIIIA 수용체 상에 작용성 효과를 반영한다. 또한 식작용 어세이를 사용하여 상이한 변이체들의 면역 이펙터 작용을 비교할 수 있으며, 이는 세포 반응, 예를 들어 수퍼옥사이드(superoxide) 또는 염증 매개자 방출을 측정하는 어세이가 그러할 수 있는 바와 같다. 예를 들어, Fcγ 수용체와 같이, 특이적 리간드에 결합하는 Fc 도메인에 의존성인 활성인, 마우스에서 T 세포 활성화를 측정하기 위한 항-CD3 항체의 변이체를 사용하는 경우에서와 같이, 생체내 모델 또한 사용할 수 있다.
숙주 세포 선택 또는 숙주 세포 조작
본 명세서에 기재된 바와 같이, 스캐폴드-기반의 단백질의 발현용으로 선택된 숙주 세포는, 바람직한 경우, 예를 들어 존재하는 경우에 면역글로불린 CH2 도메인에서 단백질을 장식하는 올리고당 부분의 조성에서의 변이를 한정됨이 없이 포함하는, 최종 조성물에 대한 중요한 기여자이다. 따라서, 본 발명의 일 태양은 원하는 치료적 단백질을 발현하는 생산 세포의 사용 및/또는 개발에 적절한 숙주 세포의 선택을 포함한다.
또한, 숙주 세포는 포유류 기원일 수 있거나, COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 그의 임의의 유도체, 불멸화 또는 형질전환 세포로부터 선택될 수 있다.
대안적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어 원핵 세포 또는 유기체, 예를 들어 천연 또는 조작 E. 콜라이 spp, 클렙시엘라(Klebsiella) spp., 또는 슈도모나스(Pseudomonas) spp.로부터 선택될 수 있다.
결합 도메인의 선택
폴리펩티드 또는 융합 단백질 또는 그의 구성요소 및 도메인 또한 이러한 도메인 또는 구성요소의 라이브러리, 예를 들어 파지 라이브러리로부터의 선택에 의해 얻어질 수 있다. 면역화된 동물 또는 인간의 B-세포 유래의 항체 도메인과 같은 관심의 대상인 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리 또는 랜덤 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 삽입함으로써 파지 라이브러리를 생성할 수 있다(문헌[Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317]). 항체 파지 라이브러리는 하나의 파지 내에 중쇄(H) 및 경쇄(L) 가변 영역 쌍을 함유하는데, 이는 단쇄 Fv 단편 또는 Fab 단편의 발현을 허용한다(문헌[Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8]). 라이브러리의 폴리펩티드의 특이성을 증가 및/또는 변경시키도록 파지미드 라이브러리의 다양성을 조정하여, 부가적인 바람직한 분자 특성 및 그들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생성시킨 후에 동정할 수 있다.
항체 가변 영역 이외의 것을 포함할 수 있는 표적 결합 구성성분의 다른 라이브러리는 리보좀 디스플레이, CIS-디스플레이, 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, 및 포유류 세포 디스플레이이다. 리보좀 디스플레이는 단백질이 RNA에 계속하여 부착되게 하면서 mRNA를 그의 동계 단백질로 번역하는 방법이다. 핵산 코딩 서열은 RT-PCR에 의해 회복된다(문헌[Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022]). CIS-디스플레이는, 라이브러리가 RepA를 가진 융합 단백질로서 작제되는 대안적인 시험관내 디스플레이 방법이다. 시험관내 번역 중에, RepA는 그것이 만들어진 DNA에 시스로 결합하며, 유전자형과 표현형 사이의 직접 연결을 제공한다(문헌[Odegrip et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:2806, 2004]). 효모 디스플레이는 교배형 시스템의 일부인 막-회합된 알파-응집소 효모 부착 수용체, aga1 및 aga2의 융합 단백질의 작제를 기반으로 한다(문헌[Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7]). 박테리아 디스플레이는 세포막 또는 세포벽과 회합된 엑스포트된(exported) 박테리아 단백질에의 표적의 융합을 기반으로 한다(문헌[Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503]). 마찬가지로, 포유류 디스플레이 시스템은 분비되는 막 고정 단백질과 랜덤화 서열을 함유하는 폴리펩티드 사이의 융합 단백질의 생성을 기반으로 한다.
스캐폴드-기반의 분자의 용도
본 명세서에 기재되고 상기의 방법 중 임의의 것에 의해 생성된 스캐폴드-기반의 분자의 조성물은, 세포, 조직, 기관, 유체, 또는 일반적으로 숙주 내의 특이적 병리현상 또는 인간 질환을 진단, 관찰, 조정, 치료, 완화하거나, 그의 발병 예방을 보조하거나, 그의 증상을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 특이적 목적을 위해 조작된 스캐폴드-기반의 분자는, 면역-매개성 또는 면역-결핍성 질환, 대사성 질환, 심혈관계 장애 또는 질환 ; 악성 질환; 신경계 장애 또는 질환; 박테리아, 바이러스 또는 기생충 감염과 같은 감염; 또는 부종, 통증, 및 조직 괴사 또는 섬유화를 포함하는 다른 공지되거나 특정된 관련 병태를 치료하기 위해 사용할 수 있다.
이러한 방법은 증상, 효과 또는 기전에 있어서의 이러한 조절, 치료, 완화, 예방 또는 감소를 필요로 하는 세포, 조직, 기관, 동물 또는 환자에게 하나 이상의 스캐폴드 단백질을 포함하는 유효량의 조성물 또는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 유효량은 본 명세서에 기재되어 있거나 관련 기술 분야에 공지되어 있는 바와 같이 공지된 방법을 사용하여 실행되고 결정될 때, 단일(예를 들어, 볼루스), 다중 또는 연속 투여당 약 0.001 내지 500 ㎎/㎏의 양, 또는 단일, 다중 또는 연속 투여당 0.01 내지 5000 ug/㎖ 혈청 농도의 혈청 농도를 달성하는 양, 또는 임의의 유효 범위 또는 그 안의 값을 포함할 수 있다.
스캐폴드-기반의 단백질을 포함하는 조성물
개질되거나 개질되지 않은, 1가, 2가, 또는 다가의, 단일 표적화, 이중 표적화, 또는 다중 표적화의 표적 결합 스캐폴드 단백질은, 포획, 고정화, 분배(partitioning), 또는 침강을 위한 당업계에 주지된 분리 절차를 사용하여 단리되고, 상업적 응용가능성에 필요한 정도까지 정제될 수 있다.
치료 용도를 위하여, 비경구, 피하, 근내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내(intracavitary), 체강내(intracelial), 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골막내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 수단을 포함하지만 이에 한정되지 않는 적절한 투여 모드의 스캐폴드-기반의 단백질을 제형화할 수 있다. 하나 이상의 단백질 스캐폴드 조성물을, 당업계에 공지된 바와 같이 정제 또는 캡슐; 분말, 점비액, 또는 에어로졸; 겔, 연고, 로션, 현탁액 형태의 용도로 제조하거나, 치료 붕대 또는 "패치" 전달 시스템 내로 혼입시킬 수 있다. 본 발명은 스캐폴드-기반의 단백질의 안정한 제형을 제공하며, 이는 바람직하게는, 하나 이상의 스캐폴드-기반의 단백질을 약학적으로 허용가능한 제형으로 포함하는, 약학적 용도 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도 보존성 제형을 비롯한 보존성 용액 및 제형을 비롯한 수성 포스페이트 완충된 염수 또는 혼합 염 용액이다. 다른 인간 단백질, 예를 들어 인간 혈청 알부민을 포함하는 적합한 비히클 및 그의 제형은, 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092](특히 pp. 958-989 참조)에 기재되어 있다.
본 조성물은 단일 제형으로 사용되거나 단일 제형 내에 혼입될 수 있으며, 신규의 조성물 및 활성제와 스캐폴드-기반의 단백질의 조합을 제조함으로써, 제시된 장애, 병태, 또는 질환의 치료에 유익한 것으로 공지된 다른 활성제를 시험할 수 있다.
본 발명을 일반적인 개념으로 개시하였지만, 본 발명의 실시 형태는 특허청구범위의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 되는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.
실시예 1. Fc 글리코실화 변이체의 작제
텐콘 디자인
인간 테나신(서열 번호 3) 유래의 제3 FN3 도메인은 항체 상보성 결정 영역(CDR)에 구조적으로 유사한 표면 노출 루프를 통해 특정 표적 분자에 결합하도록 조작될 수 있는 대안적 스캐폴드로서 사용될 수 있다. 이 도메인의 융해 온도는 그 천연 형태에서 PBS에서 54℃이다. 유사한 구조 및 개선된 물리적 특성, 예를 들어, 개선된 열안정성을 가진 스캐폴드 분자를 생성시키기 위하여, 인간 테나신 유래의 15개 FN3 도메인의 배열에 기초하여 콘센서스 서열을 디자인하였다(서열 번호 1-15).
표 1의 다중 서열 정렬의 분석은, 이들 15개 도메인이 서로에 대해 13 내지 80% 범위의 서열 동일성을 가지며, 쌍 중의 평균 서열 동일성은 29%임을 나타낸다. 표 1에 나타낸 정렬로부터 각각의 위치에 가장 보존된(빈번한) 아미노산을 혼입함으로써 콘센서스 서열(서열 번호 16)을 디자인하였다. 쌍 정렬에서, 텐콘으로 표기된 본 발명의 콘센서스 서열(서열 번호 16)은 34 내지 59%의 위치에서 테나신 유래의 FN3 도메인과 동일하였으며, 평균 서열 동일성은 43%였다.
단백질 발현 및 정제
텐콘(서열 번호 16)의 아미노산 서열을 역번역하여, 서열 번호 17에 나타낸 DNA 서열을 생성시켰다. 이 서열을 오버랩핑 PCR에 의해 조립하고, 개질된 pET15 벡터내로 서브클로닝하고, BL21Star(DE3) E. 콜라이(인비트로젠)내로 형질전환시키고 75 ㎍/㎖ 카르베니실린을 함유하는 LB 한천 플레이트상에 플레이팅하였다. 단일 콜로니를 피킹하여 2% 글루코스 및 100 ㎍/㎖ 카르베니실린을 함유하는 50 ㎖의 TB 배지 중에 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이 배양물을 사용하여 2.5L 울트라 일드(Ultra Yield) 플라스크(톰슨 인스트루먼트 컴퍼니(Thomson Instrument Company))에서 자가유도 배지(오버나이트 익스프레스 인스탄트(Overnight Express Instant) TB 배지, 노바젠(Novagen)) 500 ㎖에 접종시켰다. 성장과 발현은 ATR 멀티트론(Multitron) 진탕 인큐베이터에서 이중 프로그램(37℃, 300 rpm에서 3시간, 이어서 30℃, 250 rpm에서 16시간)을 사용하여 실행되었다.
배양물을 수집하고 JL8.1 로터에서 15분 동안 7000 rpm으로 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 20 mM 소듐 포스페이트, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤, 20 mM 이미다졸, 0.37 ㎎/㎖ 라이소자임, 1X 컴플리트 프로테아제 인히비터(Complete Protease inhibitor)(무-EDTA; 로슈(Roche)) 및 벤조나제(Benzonase)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 최종 0.25 ㎕/㎖)를 함유하는 30 ㎖의 완충제 중에 세포를 재현탁하고 마이소닉스(Misonix) XL2020 소니케이터로 5 분 동안 얼음 상에서 펄스 모드(5 초 작동, 30 초 중지)로 용해시켰다. 불용성 물질을 JA-17 로터에서 30분 동안 17,000 rpm에서 원심분리하여 제거하였다.
텐콘 단백질을 2단계 크로마토그래프 과정에서 가용성 용해물로부터 정제하였다. 먼저, 용해물에 2 ㎖의 Ni-NTA 아가로즈 비드(퀴아젠(Qiagen))를 첨가하고 이를 4℃에서 1 시간 동안 진동 플랫폼 상에 두어 고정화 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질을 포획하였다. 이어서 수지를 폴리-프렙(Poly-Prep) 컬럼(바이오-래드(Bio-Rad))에 패킹시키고 20 mM 인산나트륨, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 20 mM 이미다졸로 세척하여 미결합 물질을 제거하였다. 단백질을 20 mM 인산나트륨, pH 7.5, 500 mM NaCl, 10% 글리세롤 및 500 mM 이미다졸을 이용하여 수지로부터 용출시켰다. 분획을 쿠마시 염색 및 HRP-접합된 항-His 항체(이뮤놀로지 컨설탄츠 래보래토리(Immunology Consultants Laboratory))에 의해 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 원하는 분획을 모아서 PBS pH 7.4 내로 투석시켰다. 두번째 정제 단계로서 단백질을 PBS 에서 평형화된 수퍼덱스(Superdex)-75 하이로드(HiLoad) 16/60 컬럼(지이 헬스케어(GE Healthcare))상에 로딩하였다. 분획을 SDS-PAGE에 의해 분석하였으며, 텐콘을 함유한 분획을 모아서 센트리프렙 울트라셀(Centriprep UltraCel) YM-3 농축기(아미콘(Amicon))를 이용하여 농축시켰다.
단백질 농도는 280 ㎚에서 샘플의 흡광도를 측정하기 위하여 바이오텍(BioTek) 플레이트 판독기를 이용하여 결정하였다. 최종 제제를 쿠마시 염색(도 1), 항-His 항체를 이용한 웨스턴 블롯, 및 PBS에 평형화된 G3000SW-XL 컬럼(토소 바이오사이언시즈(TOSOH Biosciences))을 이용한 HPLC-SEC에 의해 분석하였다. SDS-PAGE 분석은 텐콘이 6 내지 14 kDa 사이에서 이동함을 보여주며, 단량체 단백질에 대한 10.7 kDa의 예상 질량과 일치한다. 배양물 1리터 당 >50 ㎎의 순수한 텐콘 단백질의 수율이 얻어졌다.
생물물리학적 특성화
텐콘의 구조 및 안정성을 원편광 이색성 분광법 및 시차 주사 열량계에 의해 각각 특성화하였다. 20℃에서 PBS 중에 0.2 ㎎/㎖의 농도에서 AVIV 분광계 상에서 CD 측정을 실행하였다. 도 8의 스펙트럼은 218 ㎚에서 최소를 나타내며, 이는 디자인된 바와 같이 FN3 패밀리에 속하는 단백질에 대해 예상되는 베타-시트 구조를 시사한다. PBS중의 테나신 또는 텐콘 유래의 제3 FN3 도메인의 0.5 ㎎/㎖ 용액을 N-DSCII 열량계 (어플라이드 서모다이나믹스(Applied Thermodynamics))에서 35℃로부터 95℃까지 1℃/ 분의 속도로 가열하여 DSC 데이터를 얻었다. 먼저, 완충제 블랭크의 곡선을 감산하여 도 3에 나타낸 프로파일을 생성시켰다. 이 데이터로부터, CpCalc(어플라이드 써모다이나믹스) 소프트웨어를 사용하여, 각각 제3 FN3 도메인과 텐콘에 대해 54℃ 및 78℃의 융해 온도를 계산하였다. 두 도메인의 폴딩과 언폴딩은 이들 온도에서 가역적이다.
면역원성 분석
아미노산 서열의 인간에 대한 면역원성을 모델링하는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 인간 테나신, 텐콘, 및 몇몇 치료 항체의 제3 FN3 도메인을 나타내는 아미노산 서열의 예상 면역원성을 비교하였다(표 2에 나타남). 프로그램으로 분석된 키메릭 mAb 및 인간 mAb(아다리무맙)는 허용오차 역치의 적용이 이어졌다(인간 생식세포계열 코딩된 서열과 100% 동일성을 가진 9-머 펩티드를 제거함). 허용오차 역치는 테나신 또는 텐콘에 적용되지 않았다. 허용오차 역치는 생식세포계 코딩된 mAb 서열에 대한 넓은 T 세포 허용을 가정하며 주로 CDR 및 인접 도메인에서 신규 서열에 대한 분석에 집중한다.
이들 분석은 분석된 서열로부터 유래된 9-머 펩티드가 하나 이상의 HLA 분자에 결합할 가능성에 기초하여 테나신과 텐콘 둘 모두에 대한 낮은 면역원성 위험을 예측한다. 점수는 각 HLA 대립유전자의 출현율에 대하여 가중된다. 모델을 위한 점수는 각 서열에 대해 요약되어 각 서열의 전체 PIR을 설명하는 단일 수를 제공한다(점수 합). 이 분석으로부터의 결과가 표 2에 요약된다. 테나신은 가장 낮은 전체 점수(11.9)를 갖는 것으로 나타났다. 테나신처럼, 텐콘은 주로 비결합제 및 낮은 예상 면역원성 위험 애그리토프 점수를 가졌다(점수 = 13.2). 테나신과 텐콘 서열은 치료 항체에 비교하여 우호적인 점수를 가졌다.
pIX 융합에 의한 M13 파지에서의 텐콘의 디스플레이
텐콘 아미노산 서열을 코딩하는 유전자를 PCR 및 제한 분해 클로닝에 의해 파지미드 발현 벡터 pPep9내로 서브클로닝하여, 벡터 pTencon-pIX를 생성하였다. 이 시스템은 M13 pIX 단백질의 N-말단에의 C-말단 융합으로서 N-말단에 Myc-태깅된 텐콘을 발현한다(도 4). Lac 프로모터는 IPTG없이 더 낮은 수준의 발현을 허용하며 IPTG의 첨가 후 발현 증가를 허용한다. OmpA 시그널 서열을 텐콘의 N-말단에 부착시켜 주변세포질로의 효율적인 전좌를 촉진하였다. 텐콘과 pIX 사이에 짧은 TSGGGGS 링커(서열 번호 141)를 작제하여 이들 단백질 사이의 입체적 상호작용을 방지하였다.
M13 파지 입자의 표면 상의 디스플레이의 확인을 위해, pTencon-pIX를 XL1-Blue E. 콜라이 내로 형질전환시키고 단일 콜로니를 사용하여 암피실린으로 보충된 5 ㎖의 LB 배양물을 접종하였다. 이 배양물을 중간-로그 단계에 도달할 때까지 37℃에서 성장시키고 이 시점에 610 pfu의 VCSM13 헬퍼 파지를 첨가하고 배양물을 37℃에서 진탕없이 10 분 동안, 이어서 진탕하면서 50 분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 헬퍼 파지 구제된 배양물을 암피실린 및 가나마이신으로 보충된 50 ㎖의 2YT 배지에 희석하고 O.D.600이 0.7에 도달할 때까지 37℃에서 진탕하면서 성장시켰으며, 이 시점에 IPTG를 1 mM의 최종 농도로 첨가하고 온도를 30℃로 감소시켰다. 16 시간 후, 배양물을 20분 동안 4000 X g에서 원심분리하고, 상등액을 수집한 후 분석을 위해 4℃에 보관하였다.
항-Myc 항체(인비트로겐)에의 파지 입자의 결합을 이용하여 M13 파지 표면에서 Myc-텐콘 구조체의 디스플레이를 확인하였다. 맥시솔프(Maxisorp) 플레이트를 항-Myc 또는 항-αv 항체(음성 대조군)로 2.5 ug/㎖의 농도로 밤새 코팅하고 수퍼블록(SuperBlock) T20 (피얼스(Pierce))로 차단시켰다. 상기한 파지미드 배양 상청액의 2배 연속 희석물을 PBS에서 제조하고 코팅된 플레이트의 웰에 첨가하였다. 1시간 후에, 플레이트를 TBST로 세척하고 각각의 웰에 항-M13 HRP 항체를 첨가하고 1시간 인큐베이션 후에 TBST로 세척하였다. 로슈 BD ELISA POD 기질을 첨가하고 플레이트 판독기(테칸(Tecan))에서 발광을 검출하였다. 도 5는 Myc-텐콘 파지 입자가 농도 의존적인 방식으로 플레이트의 항-myc 코팅된 웰에 결합하지만, 항-αv 항체 코팅된 웰 또는 코팅되지 않은 대조군 웰에는 결합하지 않음을 나타내며, M13 파지 입자 상의 Myc-텐콘의 특이적 디스플레이를 확인한다.
추가의 파지미드 벡터는 단백질 pIII를 코팅하기 위한 융합체로서 M13 파지 상에 텐콘과 라이브러리 구성원(실시예 2 참고)을 디스플레이하기 위해 구성될 수 있다. 이 시스템에 있어서, pIX를 위한 유전자는 pIII의 절단 버젼을 암호하는 유전자로 대체된다(문헌[Bass et al. 1990]). 도 4에 나타난 시스템에 비교하여 부가적인 변화는 DsbA를 위한 시그널 서열로 OmpA 시그널 서열을 대체한 것을 포함하며, 이는 이 서열을 이용한 분비가 안정한 대안적 스캐폴드 분자의 디스플레이에 유익한 것으로 나타났기 때문이다(문헌[Steiner et al. 2006]).
실시예 2: 텐콘 라이브러리의 생성
텐콘 변이체 라이브러리는 원하는 복잡성과 분자 내의 돌연변이의 상대적 위치에 따라, 많은 상이한 방법에 의해 제조할 수 있다. DNA 합성법은 텐콘 유전자에 걸쳐 산재된 돌연변이를 생성하기에 바람직하다. 제한 효소 클로닝 또한 유전자의 상이한 영역에서 돌연변이를 함유한 DNA 단편을 재조합하기 위해 사용될 수 있다. 단일 텐콘 루프와 같은 작은 정의 영역 내의 포화성 돌연변이 유발은 축퇴성 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발을 사용하여 도입할 수 있다(문헌[Kunkel et al. 1987]).
올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발을 사용하여 7개의 임의의 아미노산으로 FG 루프를 대체하기 위해 디자인된, 텐콘 라이브러리인 라이브러리 FG7을 작제하였다. FG 루프를 암호화하는 위치에서 NNS의 21개 염기쌍(bp) 축퇴 서열 및 텐콘 코딩 서열에 상보적인 2개의 인접 20 내지 27 bp 뉴클레오티드 서열을 갖도록 올리고뉴클레오티드 (TconFG7-For-5'pho)를 합성하였다. 이 디자인에서, 모든 20개 아미노산은 FG 루프에서 나타내질 수 있다. 뉴클레오티드 수준에서 계산된 다양성은 1.3x109이다.
TconFG7-For5 pho: (서열 번호 18)
GAATACACCGTTTCTATCTACGGTGTTNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNSCCGCTGTCTGCGGAATTCAC
올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발을 위한 주형인 pDsbA-텐콘-Asc-루프-Myc-pIII는, 텐콘 F:G 루프 코딩 서열을 AscI 제한 부위를 함유한 스템 루프 서열로 대체함으로써 작제하였다. 이 시스템은 형질전환 전에 AscI로 생성된 DNA를 분해함으로써 돌연변이 유발 후 백그라운드 주형 DNA의 제거를 허용한다. 돌연변이 유발을 위한 단일 가닥 DNA 주형을 정제하기 위하여, pDsbA-텐콘-Asc-루프-Myc-pIII를 보유한 E. 콜라이 CJ236의 단일 콜로니를 카르베니실린(50 ug/㎖ 최종 농도) 및 클로람페니콜(10 ug/㎖)을 가진 5 ㎖의 2YT 성장 배지 내로 피킹하였다. 6시간 후에, VCSM13 헬퍼 파지를 1010 pfu/㎖의 최종 농도로 첨가하고 10 분 동안 진탕없이 인큐베이션한 후 카르베니실린(10 ug/㎖) 및 유리딘(0.25 ug/㎖)을 가진 150 ㎖의 2YT로 옮기고 200 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠렛화하고 상청액을 수집하고 파지를 PEG NaCl로 펠렛화하였다. 단일 가닥 DNA를 제조사의 설명서에 따라 퀴아프렙(QIAprep) 스핀(Spin) M13 kit(퀴아젠)을 이용하여 이 펠렛으로부터 정제하였다.
주형에 축퇴 올리고뉴클레오티드를 어닐링하기 위하여, 5 ug의 주형 DNA를 트리스-HCl(50 mM, pH7.5) 및 MgCl2(10 mM)에서 10:1의 몰비로 올리고 TconFG7-For-5-pho와 조합하고 90℃에서 2 분 동안, 60℃에서 3 분 동안, 그리고 20℃에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 어닐링 반응 후에, ATP(10 mM), dNTP(각각 25 mM), DTT(100 mM), T4 리가아제(7 단위), 및 T7 DNA 폴리머라아제(10 단위)를 반응 혼합물에 첨가하고 6 시간 동안 14℃에서, 이어서 12 시간 동안 20℃에서 인큐베이션하였다. 생성된 DNA를 PCR 정제 키트(퀴아젠)를 사용하여 정제하고 100 uL의 물 중에 회수하였다. 라이브러리 DNA를 4시간 동안 10 단위의 AscI로 분해한 후 다시 퀴아젠 PCR 정제 키트로 정제하였다. 최종 라이브러리 DNA를 50 uL의 물 중에 회수하였다. 이어서, 생성된 이중 가닥 DNA 산물을 전기천공에 의해 E. 콜라이 MC1061F' 내로 형질전환시켰다.
형질전환체를 20 ㎖ SOC 배지 중에 수집하고 1 시간 동안 37℃에서 회복시켰다. 회복 마지막에, 형질전환 분액을 연속 희석하고 1% 글루코스를 함유한 카르베니실린(100 ug/㎖) 플레이트에 플레이팅하여 전체 형질전환체 수를 평가하였다. 나머지 SOC 배양물을 사용하여 카르베니실린과 1% 글루코스를 가진 1 L의 2xYT 배지를 접종시키고 OD600이 0.6에 도달할 때까지 성장시켰다. 100 ㎖의 이 배양물을 M13 헬퍼 파지로 1010/㎖로 접종하고 37℃에서 인큐베이션한 후 원심분리하였다. 생성되는 세포 펠렛을 카르베니실린(100 ug/㎖)과 카나마이신(35 ug/㎖)을 함유한 500 ㎖의 신선한 2xYT 배지에 재현탁시키고 30℃에서 밤새 성장시킨 후 원심분리하였다. PEG/NaCl을 첨가하여 파지 입자를 침전시키고 -80℃에서 보관하였다.
두번째 라이브러리인 BC6/FG7은 텐콘의 B:C 및 F:G 루프 내에 동시에 다양성을 도입하도록 디자인하였다. 그렇게 하기 위하여, 2가지 올리고뉴클레오티드인 Tc-BC6-For-5'phos 및 POP149를 합성하였다. 전방 올리고는 인산화되었고 B:C 루프를 암호화하는 각각의 위치에서 NNS 코돈의 18개 염기를 함유한 반면에, 역방 올리고는 5' 단부에서 비오틴화되었고 F:G 루프를 암호화하는 각각의 위치에서 NNS 코돈의 21개 염기를 함유하였다. 두 올리고뉴클레오티드 모두 돌연변이될 영역의 선행 및 후행 영역과 동일한 두 개의 18 bp 뉴클레오티드 서열에 의해 인접된다(프라이머 상세사항을 위해 하기 참조).
Tc - BC6 - For -5' phos : (서열 번호 19)
gactctctgcgtctgtcttggNNSNNSNNSNNSNNSNNSTTCGACTCTTTCCTGATCCAGTACC
POP 2149: (서열 번호 20)
GTGAATTCCGCAGACAGCGGSNNSNNSNNSNNSNNSNNSNNAACACCGTAGATAGAAACGGTG
라이브러리를 작제하기 위하여, 올리고 Tc-CB6-For5' phos 및 POP2149를 사용하여 16개의 100 uL PCR 반응을 수행하여 텐콘 DNA 주형을 증폭시키고, 과정 중에 동시에 B:C 및 F:G 루프 내로 NNS 코돈을 도입하였다. 이중 가닥 PCR 생성물을 B&W 버퍼(10mM 트리스-HCl, pH7.5, 1mM EDTA, 2M NaCl, 0.1% 트윈-20)에서 자기 스트렙타비딘 비드(다이날(Dynal))와 혼합하고, 20분 동안 항온처리하고, 자석으로 무너뜨리고(pulled down) B&W 버퍼로 2회 세척하였다. 300 uL의 150 mM NaOH를 이용하여 비드로부터 전방 가닥을 용출시켰다. 이론적 다양성이 8x1016을 초과하는 긴 프라이머들의 혼합물인 이 "메가프라이머(megaprimer)" 를 사용하여 단일 가닥 라이브러리 주형에 어닐링시켰다. 라이브러리 작제는 FG7 라이브러리에 대해 상기한 대로 실시하였다.
실시예 3: IgG 바인더의 선택
IgG에 결합하는 텐콘 라이브러리 구성원의 선택을 실시하기 위하여, 재조합 IgG(인간 IgG1 아형)를 설포-NHS-LC-비오틴(피얼스)을 이용하여 비오틴화한 후 PBS 내로 투석시켰다. 선택을 위해, 200 uL의 파지 디스플레이 라이브러리 FG7 또는 BC6/FG7을 200 uL의 케미블로커(chemiblocker)로 차단시킨 후 500 nM(1라운드) 또는 100 nM(2 라운드 및 3 라운드)의 농도로 비오틴화 IgG를 첨가하였다. 1 라운드에서는 뉴트라비딘(Neutravidin) 자기 비드(세라다인(Seradyne))에 의해, 또는 2 라운드 및 3 라운드에서는 스트렙타비딘 자기 비드(프로메가(Promega))에 의해 결합된 파지를 회수하였다. 미결합 파지는 트윈을 가진 트리스 완충된 염수(TBST) 1 ㎖로 5 내지 10회 세척하고 이어서 트리스 완충된 염수(TBS)로 1 ㎖ 세척을 2회하여 비드로부터 세척하였다. 중간-로그 단계 E. 콜라이 MC1061F' 의 첨가에 의해 비드로부터 결합된 파지를 용출시켰다. 카르베니실린 및 글루코스로 보충된 LB 한천 플레이트 상에 감염된 세포를 플레이팅하였다. 다음날, 세포를 플레이트로부터 스크래핑하여 중간-로그 단계까지 성장시킨 후 VCSM13 헬퍼 파지로 구제하고 밤새 성장시켰다. 파지 입자를 PEG/NaCl 침전에 의해 단리하고 다음 라운드의 선택을 위해 사용하였다.
IgG에 대한 3 라운드의 패닝 후, PCR에 의해 텐콘 유전자를 증폭시켜 리가아제 독립적 클로닝 부위를 포함하도록 변경된 pET27 벡터 내로 결과물을 서브클로닝하였다. 이 PCR 생성물을 벡터에 어닐링시키고 BL21-GOLD(DE3) 세포(스트라타젠(Stratagene)) 내로 형질전환시켰다. 개별 콜로니를 96 딥웰 플레이트(코닝(Corning)) 내의 1 ㎖ 배양물 내로 피킹하여 포화시까지 37℃에서 밤새 성장시켰다. 다음날, 50 마이크로리터의 밤샘 배양물을 사용하여 신선한 1 ㎖ 배양물을 접종시켰다. 배양물을 2 시간 동안 37℃에서 성장시킨 후 IPTG를 1 mM로 첨가하고 온도를 30℃로 감소시켰다. 유도 후 16 시간에 세포를 원심분리하여 수확하고 100 마이크로리터의 버그버스터(BugBuster)(노바젠(Novagen))로 용해시켰다. 생성된 용해물을 원심분리에 의해 청정화하여 ELISA에 의해 IgG에의 결합에 대해 시험하였다.
맥시솔프 플레이트(눈크(Nunc))를 0.1 ㎍의 항-HIS 항체(퀴아젠)로 밤새 코팅하고, TBST로 세척하고, 스타팅 블록(Starting Block) T20(써모 사이언티픽(Thermo Scientific))으로 차단시켰다. 출발 블록에서 1:4로 희석한 투명하게 한 용해물을 플레이트에 첨가하고, 1시간 동안 결합시킨 후 TBST로 세척하였다. 비오틴화 IgG 또는 비오틴화 HSA를 1 ug/㎖의 농도로 첨가하고, 1 시간 인큐베이션 후 TBST로 세척하였다. 결합 IgG 또는 HSA의 검출은 스트렙타비딘-HRP(잭슨 이뮤노리서치)를 첨가하고 POD 화학발광 기질을 이용하여 검출함으로써 달성하였다. ELISA의 결과가 도 7에 예시되어 있다. ELISA 시그널에 의해 판단할 때 비오틴화 HSA에 비하여 비오틴화 IgG에 10배 초과로 결합하는 작제물을 서열결정하였다. 몇몇 선택 실험의 완료 후에, 라이브러리 FG7로부터 60개의 고유한 결합 서열, 및 라이브러리 BC6FG7로부터 10 개의 고유한 서열이 얻어졌으며; 표 4는 IgG 바인더의 대표적인 서열을 나타내고, 여기에는 B:C 및/또는 F:G 루프를 그들이 서열 번호16의 것들과 상이한 범위까지 나타낸다. 또한 도 4에는 스캐폴드의 다른 영역의 많은 돌연변이가 예시되어 있다.
여기서 디자인하고, 발현시키고, 정제한 텐콘 단백질은 대안적 스캐폴드 분자로서 사용되어온 인간 테나신 유래의 제3 FN3 도메인의 열안정성에 대하여 26℃만큼 개선된 열안정성을 갖는다. 이러한 안정성 증가에 기반하여, 이 스캐폴드 분자는 아미노산 치환을 더욱 잘 따르고 제조가 더욱 용이할 가능성이 있다. 단백질 안정성을 감소시키는 돌연변이는 더욱 안정한 스캐폴드의 맥락에서 더욱 우수하게 견디어질 가능성이 있으며, 따라서 안정성이 향상된 스캐폴드는 스캐폴드 변이체의 라이브러리 유래의, 더욱 작용성이고 잘 폴딩된 바인더를 생성할 가능성이 있다.
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서열
서열 번호 1:
sppkdlvvtevteetvnlawdnemrvteylvvytpthegglemqfrvpgdqtstiiqelepgveyfirvfailenkksipvsarvat
서열 번호 2
tylpapeglkfksiketsvevewdpldiafetweiifrnmnkedegeitkslrrpetsyrqtglapgqeyeislhivknntrgpglkrvtttrld
서열 번호 3
dapsqievkdvtdttalitwfkplaeidgieltygikdvpgdrttidltedenqysignlkpdteyevslisrrgdmssnpaketftt
서열번호 4
tgldaprnlrrvsqtdnsitlewrngkaaidsyrikyapisggdhaevdvpksqqattkttltglrpgteygigvsavkedkesnpatinaateldtpkd
서열번호 5
dtpkdlqvsetaetsltllwktplakfdryrlnyslptgqwvgvqlprnttsyvlrglepgqeynvlltaekgrhkskpakskparvk
서열번호 6
qapelenltvtevgwdglrlnwtaadqayehfiiqvqeankveaarnltvpgslravdipglkaatpytvsiygviqgyrtpvlsaeastge
서열번호 7
etpnlgevvvaevgwdalklnwtapegayeyffiqvqeadtveaaqnltvpgglrstdlpglkaathytitirgvtqdfsttplsvevlte
서열번호 8
evpdmgnltvtevswdalrlnwttpdgtydqftiqvqeadqveeahnltvpgslrsmeipglragtpytvtlhgevrghstrplavevvte
서열번호 9
dlpqlgdlavsevgwdglrlnwtaadnayehfviqvqevnkveaaqnltlpgslravdipgleaatpyrvsiygvirgyrtpvlsaeastakepe
서열번호 10
kepeignlnvsditpesfnlswmatdgifetftieiidsnrlletveynisgaertahisglppstdfivylsglapsirtktisatatte
서열번호 11
alpllenltisdinpygftvswmasenafdsflvtvvdsgklldpqeftlsgtqrklelrglitgigyevmvsgftqghqtkplraeivte
서열번호 12
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서열번호 13
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서열번호 14
dgpsglvtanitdsealarwqpaiatvdsyvisytgekvpeitrtvsgntveyaltdlepateytlrifaekgpqksstitakfttdl
서열번호 15
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서열번호 16
LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT
서열번호 17
ctgccggcgccgaaaaacctggttgtttctgaagttaccgaagactctctgcgtctgtcttggaccgcgccggacgcggcgttcgactctttcctgatccagtaccaggaatctgaaaaagttggtgaagcgatcaacctgaccgttccgggttctgaacgttcttacgacctgaccggtctgaaaccgggtaccgaatacaccgtttctatctacggtgttaaaggtggtcaccgttctaacccgctgtctgcggaattcaccacc
루프를 나타내는 텐콘 서열(서열 번호 16)
A-B B-C C-D
1-LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEA-44
D-E E-F F-G
45-INLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT-89
실시예 4: 텐콘의 안정화 돌연변이
본 명세서의 상기 텐콘 스캐폴드(서열 번호 16)의 폴딩 안정성을 개선하기 위한 돌연변이체를 디자인하였다. 몇몇 점돌연변이를 만들어 서열 번호 16의 개별 잔기의 치환, 예를 들어 N46V(텐콘17 - 서열 번호 142), E14P(텐콘18 - 서열 번호 143), E11N(텐콘19 - 서열 번호 144), E37P(텐콘20 - 서열 번호 145), 및 G73Y(텐콘21 - 서열 번호 146)를 생성시켰으며, 이들은 프로그램 PoPMuSiC v2.0(문헌[Dehouck, Grosfils et al. 2009])에 의해 안정성을 개선시킬 것으로 예상되었다. 돌연변이체 E86I(텐콘22 - 서열 번호 147)는 동종 단백질인 인간 테나신 유래의 제3 FN3 도메인을 안정화시키는 것으로 이전에 밝혀진 바 있다(WO2009/086116A2). 최종적으로, 텐콘의 모든 루프 잔기가 독립적으로 알라닌으로 대체된 알라닌 스캐닝 실험 중에 L17A 돌연변이가 텐콘을 유의적으로 안정화시키는 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음). 초기 라운드의 안정성 어세이(하기 참조)에 이어서, 안정성을 추가로 증가시키기 위하여 조합 돌연변이체 N46V/E86I(텐콘 23 - 서열 번호 148), E14P/N46V/E86I(텐콘24 - 서열 번호 149), 및 L17A/N46V/E86I(텐콘25 - 서열 번호 150)를 생성시켰다.
발현 및 정제
퀵체인지(QuikChange) 돌연변이 유발 키트(스트라타젠)를 사용하여 텐콘 코딩 서열 내의 돌연변이를 만들었다. 생성된 플라스미드를 발현을 위해 BL21-GOLD(DE3) E. 콜라이(스트라타젠) 내로 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 피킹하여 100 ㎍/㎖ 암피실린을 함유하는 2 ㎖의 TB 배지 중에 37℃에서 밤새 성장시켰다. 이 배양물을 사용하여 500 ㎖ 배플 플라스크 내에서 100 ㎖의 자가유도 배지(오버나이트 익스프레스 인스탄트 TB 배지, 노바젠)를 접종하고 37℃에서 16 시간 동안 성장시켰다.
4000xg에서 20 분 동안 원심분리하여 배양물을 수확하고, 펠렛화된 세포를 습윤 세포 펠렛 그램당 5 ㎖의 버그버스터 HT(노바젠)에 재현탁하였다. 실온에서 30 분의 인큐베이션 후에, 30,000xg에서 20 분 동안 원심분리하여 용해물을 청정화하고 3 ㎖ Ni-NTA 수퍼플로우(superflow) 컬럼(노바젠) 상에 중력에 의해 로딩하였다. 로딩 후에, 50 mM 소듐 포스페이트 pH 7.4, 500 mM NaCl, 및 10 mM 이미다졸을 함유하는 15 ㎖의 완충제로 각각의 컬럼을 세척하였다. 이어서, 50 mM 소듐 포스페이트 pH 7.4, 500 mM NaCl, 및 250 mM 이미다졸을 함유하는 10 ㎖의 완충제를 사용하여 컬럼으로부터 결합된 단백질을 용출시켰다. SDS-PAGE에 의해 단백질 순도를 평가하였다. 생물물리학적 분석에 앞서, 각각의 돌연변이체를 PBS pH 7.4 내로 완전히 투석하였다. 각각의 돌연변이체에 대해 100 ㎖의 배양물로부터 28 내지 33 ㎎의 정제된 단백질이 얻어졌다.
열안정성의 특성화
모세관 시차 주사 열량법(DSC: differential scanning calorimetry)에 의해 모 텐콘 및 각각의 돌연변이체의 열안정성을 측정하였다. 각각의 샘플을 PBS pH 7.4에 대해 완전히 투석하고 2 내지 3 ㎎/㎖의 농도로 희석하였다. 자동 시료 주입기(마이크로칼(MicroCal), LLC)가 장착된 VP-DSC 기기를 사용하여 이들 샘플에 대해 융해 온도를 측정하였다. 샘플을 10℃로부터 95℃ 또는 100℃까지 분당 1℃의 속도로 가열하였다. 적분을 위한 기준선을 계산하기 위하여 각각의 샘플 스캔 사이에 완충제 단독의 스캔을 완료하였다. 완충제 단독의 시그널을 감산한 후에 데이터를 2 단계 언폴딩 모델에 적합시켰다. 각각의 샘플에 대해 셀(cell)로부터 그것을 수거하지 않으면서 스캔을 반복함으로써 열적 변성의 가역성을 결정하였다. 제1 스캔으로부터의 곡선 아래의 면적을 제2 스캔과 비교함으로써 가역성을 계산하였다. DSC 실험의 결과는 표 5에 완전 융해 곡선으로부터 유래된 값으로서 제공된다. 단일 돌연변이체 텐콘17, 텐콘18, 텐콘19, 및 텐콘22는 모 텐콘 서열에 비교하여 열안정성을 개선하였다. 단지 텐콘21만 유의적으로 불안정화시키고 있었다. 조합 돌연변이체 샘플 텐콘23, 텐콘24, 및 텐콘25는 모두 유의적으로 더 큰 안정성 향상을 가졌으며, 이는 디자인된 돌연변이가 열안정성 개선에 대하여 상가적임을 나타낸다.
구아니딘 하이드로클로라이드에 의한 변성
증가하는 농도의 구아니딘 하이드로클로라이드(GdmCl)로 처리할 때 텐콘 및 각각의 돌연변이체가 폴딩된 채로 유지되는 능력(트립토판 형광에 의해 측정됨)을 사용하여 안정성을 평가하였다. 텐콘은 단 하나의 트립토판 잔기를 함유한다. 트립토판 잔기는 소수성 코어 내에 묻혀 있으므로 360 ㎚에서의 형광 방출은 이 단백질의 폴딩된 상태의 민감한 척도이다. 50 mM 소듐 포스페이트 pH 7.0, 150 mM NaCl, 및 0.48 내지 6.63 M의 가변적인 농도의 GdmCl을 함유하는 200 uL의 용액을 흑색, 비-결합, 96-웰 플레이트(그라이너(Greiner)) 내로 피펫팅하여 17 점 적정을 생성시켰다. 텐콘 돌연변이체를 함유하는 10 uL의 용액을 플레이트 전체의 각각의 웰에 첨가하여 23 uM의 최종 단백질 농도가 되게 하고 상하로 부드럽게 피펫팅하여 혼합하였다. 실온에서 24 시간 동안 인큐베이션한 후에, 스펙트라맥스(Spectramax) M5 플레이트 판독기(몰리큘라 디바이시즈(Molecular Devices))를 사용하여 280 ㎚에서의 여기 및 360 ㎚에서의 방출로 형광을 판독하였다. 이러한 곡선으로부터 생성된 데이터를 도 8에 나타낸다. 하기 수학식을 사용하여 형광 시그널을 언폴딩된 분율로 환산하였다(문헌[Pace 1986 Methods Enzymol 131: 266-80]):
Figure 112012099486418-pct00010
여기서, yF는 폴딩된 샘플의 형광 시그널이고 yu는 언폴딩된 샘플의 형광 시그널이다.
하기 수학식에 적합시킴으로써 언폴딩 변이의 중간점 및 변이의 기울기를 결정하였다(문헌[Clarke, Hamill et al. 1997]):
Figure 112012099486418-pct00011
여기서, F는 주어진 변성제 농도에서의 형광이고, α N 및 α D 는 천연 상태 및 변성된 상태의 y-절편이며, β N 및 β D 는 천연 상태 및 변성된 상태에 대한 기준선의 기울기이고, [D]는 GdmCl의 농도이며, [D]50%는 샘플의 50%가 변성되는 시점에서의 GdmCl 농도이고, m은 변이의 기울기이며, R은 기체 상수이고, T는 온도이다. 하기 수학식을 사용하여 각각의 샘플에 대하여 폴딩의 자유 에너지를 추산하였다(문헌[Pace 1986 상기 문헌];문헌[Clarke, Hamill et al. 1997 J Mol Biol 270(5): 771-8]): ΔG = m[D]50%
이러한 곡선에 대하여 변이의 기울기, m을 정확하게 측정하는 것은 종종 어렵다. 부가적으로, 여기에 기재된 돌연변이는 텐콘의 폴딩 기전을 변경할 것으로 예상되지 않는다. 따라서, 각각의 돌연변이체에 대한 m 값을 측정하고 그 값을 평균하여(문헌[Pace 1986 상기 문헌]), 모든 자유 에너지 계산에 사용된 m = 14.83 kJ/mol/M(3544 cal/mol/M)을 산출하였다. 이들 계산의 결과는 표 5에 제공된다. GdmCl 언폴딩 실험의 결과는 열안정성에 대하여 텐콘을 안정화시키는 동일한 돌연변이체가 GdmCl 유도된 변성에 대해서도 단백질을 안정화시킨다는 것을 입증한다.
크기 배제 크로마토그래피
크기 배제 크로마토그래피(SEC: Size exclusion chromatography)를 사용하여 야생형 텐콘 및 각각의 돌연변이체의 응집 상태를 평가하였다. PBS 이동상을 사용하여 0.3 ㎖/min의 유속에서 5 uL의 각 샘플을 수퍼덱스 75 5/150 컬럼(GE 헬스케어) 상에 주입하였다. 컬럼으로부터의 용출을 280 ㎚에서의 흡광도에 의해 관찰하였다. 응집 상태를 평가하기 위하여, 구상 분자량 표준품(globular molecular weight standard)(시그마(Sigma))으로 사전에 컬럼을 보정하였다. 텐콘21을 제외하고는, 모든 시험 샘플이 단량체 샘플의 것과 일치하는 용출 부피에서 1개의 피크로 용출되었다. 텐콘21은 2개의 피크로 용출되었으며, 이는 응집체의 존재를 나타낸다.
Figure 112012099486418-pct00012
본 발명은 상기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 및 실시예에서 구체적으로 설명된 것과 다르게 실시할 수 있음이 명백할 것이다. 상기 교시 내용에 비추어 본 발명의 많은 변형 및 변경이 가능하며, 따라서 이들은 첨부된 특허청구범위의 범주 내이다.
SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN BIOTECH, INC. <120> STABILIZED FIBRONECTIN DOMAIN COMPOSITIONS, METHODS AND USES <130> CEN5292PCT <150> US 61/329980 <151> 2010-04-30 <160> 151 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 87 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val 1 5 10 15 Asn Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu Tyr Leu Val Val 20 25 30 Tyr Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met Gln Phe Arg Val Pro 35 40 45 Gly Asp Gln Thr Ser Thr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Pro Gly Val Glu 50 55 60 Tyr Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys Lys Ser Ile Pro 65 70 75 80 Val Ser Ala Arg Val Ala Thr 85 <210> 2 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe Lys Ser Ile Lys Glu 1 5 10 15 Thr Ser Val Glu Val Glu Trp Asp Pro Leu Asp Ile Ala Phe Glu Thr 20 25 30 Trp Glu Ile Ile Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu Asp Glu Gly Glu Ile 35 40 45 Thr Lys Ser Leu Arg Arg Pro Glu Thr Ser Tyr Arg Gln Thr Gly Leu 50 55 60 Ala Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Ile Ser Leu His Ile Val Lys Asn Asn 65 70 75 80 Thr Arg Gly Pro Gly Leu Lys Arg Val Thr Thr Thr Arg Leu Asp 85 90 95 <210> 3 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala 1 5 10 15 Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu 20 25 30 Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu 35 40 45 Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr 50 55 60 Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Ser Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn 65 70 75 80 Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr 85 <210> 4 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Thr Gly Leu Asp Ala Pro Arg Asn Leu Arg Arg Val Ser Gln Thr Asp 1 5 10 15 Asn Ser Ile Thr Leu Glu Trp Arg Asn Gly Lys Ala Ala Ile Asp Ser 20 25 30 Tyr Arg Ile Lys Tyr Ala Pro Ile Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Val 35 40 45 Asp Val Pro Lys Ser Gln Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly 50 55 60 Leu Arg Pro Gly Thr Glu Tyr Gly Ile Gly Val Ser Ala Val Lys Glu 65 70 75 80 Asp Lys Glu Ser Asn Pro Ala Thr Ile Asn Ala Ala Thr Glu Leu Asp 85 90 95 Thr Pro Lys Asp 100 <210> 5 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Thr Pro Lys Asp Leu Gln Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu 1 5 10 15 Thr Leu Leu Trp Lys Thr Pro Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu 20 25 30 Asn Tyr Ser Leu Pro Thr Gly Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg 35 40 45 Asn Thr Thr Ser Tyr Val Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr 50 55 60 Asn Val Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala 65 70 75 80 Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val Lys 85 <210> 6 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Gln Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Gly Trp Asp 1 5 10 15 Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gln Ala Tyr Glu His Phe 20 25 30 Ile Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Lys Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Lys Ala 50 55 60 Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Glu 85 90 <210> 7 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val Ala Glu Val Gly Trp Asp 1 5 10 15 Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe 20 25 30 Phe Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala 50 55 60 Ala Thr His Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Ser 65 70 75 80 Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu 85 90 <210> 8 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Val Pro Asp Met Gly Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Ser Trp Asp 1 5 10 15 Ala Leu Arg Leu Asn Trp Thr Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gln Phe 20 25 30 Thr Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Gln Val Glu Glu Ala His Asn Leu 35 40 45 Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ser Met Glu Ile Pro Gly Leu Arg Ala 50 55 60 Gly Thr Pro Tyr Thr Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser 65 70 75 80 Thr Arg Pro Leu Ala Val Glu Val Val Thr Glu 85 90 <210> 9 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val Ser Glu Val Gly Trp Asp 1 5 10 15 Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His Phe 20 25 30 Val Ile Gln Val Gln Glu Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu 35 40 45 Thr Leu Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu Ala 50 55 60 Ala Thr Pro Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr Arg 65 70 75 80 Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Lys Glu Pro Glu 85 90 95 <210> 10 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Lys Glu Pro Glu Ile Gly Asn Leu Asn Val Ser Asp Ile Thr Pro Glu 1 5 10 15 Ser Phe Asn Leu Ser Trp Met Ala Thr Asp Gly Ile Phe Glu Thr Phe 20 25 30 Thr Ile Glu Ile Ile Asp Ser Asn Arg Leu Leu Glu Thr Val Glu Tyr 35 40 45 Asn Ile Ser Gly Ala Glu Arg Thr Ala His Ile Ser Gly Leu Pro Pro 50 55 60 Ser Thr Asp Phe Ile Val Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Pro Ser Ile Arg 65 70 75 80 Thr Lys Thr Ile Ser Ala Thr Ala Thr Thr Glu 85 90 <210> 11 <211> 91 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Ala Leu Pro Leu Leu Glu Asn Leu Thr Ile Ser Asp Ile Asn Pro Tyr 1 5 10 15 Gly Phe Thr Val Ser Trp Met Ala Ser Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe 20 25 30 Leu Val Thr Val Val Asp Ser Gly Lys Leu Leu Asp Pro Gln Glu Phe 35 40 45 Thr Leu Ser Gly Thr Gln Arg Lys Leu Glu Leu Arg Gly Leu Ile Thr 50 55 60 Gly Ile Gly Tyr Glu Val Met Val Ser Gly Phe Thr Gln Gly His Gln 65 70 75 80 Thr Lys Pro Leu Arg Ala Glu Ile Val Thr Glu 85 90 <210> 12 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Glu Pro Glu Val Asp Asn Leu Leu Val Ser Asp Ala Thr Pro Asp 1 5 10 15 Gly Phe Arg Leu Ser Trp Thr Ala Asp Glu Gly Val Phe Asp Asn Phe 20 25 30 Val Leu Lys Ile Arg Asp Thr Lys Lys Gln Ser Glu Pro Leu Glu Ile 35 40 45 Thr Leu Leu Ala Pro Glu Arg Thr Arg Asp Leu Thr Gly Leu Arg Glu 50 55 60 Ala Thr Glu Tyr Glu Ile Glu Leu Tyr Gly Ile Ser Lys Gly Arg Arg 65 70 75 80 Ser Gln Thr Val Ser Ala Ile Ala Thr Thr Ala Met 85 90 <210> 13 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Gly Ser Pro Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu Asn Ser Ala 1 5 10 15 Thr Val Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile 20 25 30 Thr Tyr Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp 35 40 45 Gly Thr Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val Glu 50 55 60 Tyr Leu Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser Glu Pro 65 70 75 80 Val Ser Gly Ser Phe Thr Thr Ala Leu 85 <210> 14 <211> 88 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Gly Pro Ser Gly Leu Val Thr Ala Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala 1 5 10 15 Leu Ala Arg Trp Gln Pro Ala Ile Ala Thr Val Asp Ser Tyr Val Ile 20 25 30 Ser Tyr Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu Ile Thr Arg Thr Val Ser Gly 35 40 45 Asn Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr 50 55 60 Thr Leu Arg Ile Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gln Lys Ser Ser Thr Ile 65 70 75 80 Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu 85 <210> 15 <211> 89 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Asp Ser Pro Arg Asp Leu Thr Ala Thr Glu Val Gln Ser Glu Thr Ala 1 5 10 15 Leu Leu Thr Trp Arg Pro Pro Arg Ala Ser Val Thr Gly Tyr Leu Leu 20 25 30 Val Tyr Glu Ser Val Asp Gly Thr Val Lys Glu Val Ile Val Gly Pro 35 40 45 Asp Thr Thr Ser Tyr Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro Ser Thr His Tyr 50 55 60 Thr Ala Lys Ile Gln Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg Ser Asn Met Ile 65 70 75 80 Gln Thr Ile Phe Thr Thr Ile Gly Leu 85 <210> 16 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding polypeptide <400> 16 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 17 <211> 267 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide encoding binding polynucleotide <400> 17 ctgccggcgc cgaaaaacct ggttgtttct gaagttaccg aagactctct gcgtctgtct 60 tggaccgcgc cggacgcggc gttcgactct ttcctgatcc agtaccagga atctgaaaaa 120 gttggtgaag cgatcaacct gaccgttccg ggttctgaac gttcttacga cctgaccggt 180 ctgaaaccgg gtaccgaata caccgtttct atctacggtg ttaaaggtgg tcaccgttct 240 aacccgctgt ctgcggaatt caccacc 267 <210> 18 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> unknown <222> (28)(29)(31)(32)(34)(35)(37)(38)(40)(41)(43)(44)(46)(47) <223> Primer wherein n can be represented by a, c, t or g <400> 18 gaatacaccg tttctatcta cggtgttnns nnsnnsnnsn nsnnsnnscc gctgtctgcg 60 gaattcac 68 <210> 19 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> unknown <222> (22)(23)(25)(26)(28)(29)(31)(32)(34)(35)(37)(38) <223> Primer wherein n can be represented by a, c, t or g <400> 19 gactctctgc gtctgtcttg gnnsnnsnns nnsnnsnnst tcgactcttt cctgatccag 60 tacc 64 <210> 20 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> unknown <222> (21)(22)(23)(24)(25)(26)(27)(28)(29)(30)(31)(32)(33) (34)(35)(36)(37)(38)(39)(40)(41) <223> Primer wherein n can be represented by a, c, t or g and s can be represented by g or c. <400> 20 gtgaattccg cagacagcgg snnsnnsnns nnsnnsnnsn naacaccgta gatagaaacg 60 gtg 63 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 21 Ser Tyr Gly Phe Asn Asn 1 5 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 22 Thr Tyr Glu Gly Glu Ser 1 5 <210> 23 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 23 Thr Tyr Glu Ser Glu Ser 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 24 Thr Asn Trp Met Asp Ser 1 5 <210> 25 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 25 Lys Ser Val Phe Ile Met 1 5 <210> 26 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 26 Tyr Ser Ser Tyr Ala Thr 1 5 <210> 27 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 27 Arg Phe His Pro Phe Pro 1 5 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 28 Met Met Cys Met Pro Leu 1 5 <210> 29 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 29 Tyr Cys Arg Val Arg Asp 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 30 Met Asp Cys Phe Met Gly 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 31 Thr Tyr Arg Phe Asn Ser 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 32 Ala Ser Arg Arg Ser Leu 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 33 Thr Ile Glu Ser Glu Ser 1 5 <210> 34 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 34 Thr Leu Met Gln Ser 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 35 Ile Tyr Asp Ser Glu Ser 1 5 <210> 36 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 36 Asp Arg Lys Arg Phe Ile 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 37 Glu Phe Trp Arg Gly Ser 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 38 Gly Leu Leu Asp Pro Leu 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 39 Gly Leu Val Leu Pro Glu 1 5 <210> 40 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 40 Met Ala Ser Asp Gly Leu 1 5 <210> 41 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 41 Asn Lys Thr Glu Thr Asn 1 5 <210> 42 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 42 Gln Ala Glu Arg Lys Val 1 5 <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 43 Ser Gln Val Cys Thr Leu 1 5 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 44 Tyr Phe Asp Lys Asp Ser 1 5 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 45 Tyr Phe Glu Cys Glu Pro 1 5 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 46 Gln Ile Gly Pro Ile Ile Pro 1 5 <210> 47 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 47 Ser Ile Arg Thr Ile Asp Ser 1 5 <210> 48 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 48 Pro Lys Phe His Ser Pro Leu 1 5 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 49 Trp Lys Thr Thr Ile Trp Phe 1 5 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 50 Arg Lys Asn Trp Lys Thr Arg 1 5 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 51 Arg Leu Phe Arg Ile Tyr Gln 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 52 Trp Leu Ser Arg Ser Tyr Asp 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 53 Trp Leu Ser Arg Ser Cys Asp 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 54 Trp Met Gly Pro Tyr Cys Asp 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 55 Arg Arg Arg Arg Tyr Ser Phe 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 56 His Ile Val Pro Met Val Pro 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 57 Gln Ile Glu Pro Ile Ile Arg 1 5 <210> 58 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 58 Pro Ser Ala Ala Asn Asn Pro 1 5 <210> 59 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 59 Val Arg Leu Arg Tyr Val Gln 1 5 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 60 Gln Val Gly Pro Leu Ile Pro 1 5 <210> 61 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 61 Arg Ile Gly Pro Ile Leu Pro 1 5 <210> 62 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 62 Gln Ile Gly Pro Leu Leu Pro 1 5 <210> 63 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 63 Arg Ile Gly Pro Leu Leu Pro 1 5 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 64 Gln Val Gly Pro Leu Leu Pro 1 5 <210> 65 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 65 Arg Ile Gly Pro Met Leu Pro 1 5 <210> 66 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 66 Gln Ile Gly Pro Val Leu Pro 1 5 <210> 67 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 67 Arg Ile Gly Pro Val Leu Pro 1 5 <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 68 Gln Ile Gly Pro Met Met Pro 1 5 <210> 69 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 69 Gln Val Gly Pro Leu Val Pro 1 5 <210> 70 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 70 Gln Ile Gly Pro Met Leu Pro 1 5 <210> 71 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 71 Gln Val Gly Pro Ile Leu Pro 1 5 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 72 Gln Val Gly Pro Met Leu Pro 1 5 <210> 73 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 73 Gln Ile Gly Pro Ile Val Pro 1 5 <210> 74 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 74 Met Ile Gly Pro Leu Leu Pro 1 5 <210> 75 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 75 Gln Ile Gly Pro Leu Phe Pro 1 5 <210> 76 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 76 Gln Ile Gly Pro Met Val Pro 1 5 <210> 77 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 77 Gln Ile Gly Pro Ile Val Pro 1 5 <210> 78 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 78 Arg Ile Glu Pro Ile Leu Pro 1 5 <210> 79 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 79 Val Ala Gly Ser Val Trp Pro 1 5 <210> 80 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 80 Arg Glu Gly Ala Thr Leu Tyr 1 5 <210> 81 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 81 Lys Gln Ile Pro Pro Ile Leu 1 5 <210> 82 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 82 Leu Ser Leu Ser Ser Val Leu 1 5 <210> 83 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 83 His Met Leu Leu Pro Leu Pro 1 5 <210> 84 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 84 Met Ile Gly Pro Leu Ile Pro 1 5 <210> 85 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 85 Thr Ile Gly Pro His Ile Pro 1 5 <210> 86 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 86 Glu Ile Gly Pro Cys Leu Pro 1 5 <210> 87 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 87 Glu Ile Gly Pro Val Leu Pro 1 5 <210> 88 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 88 Lys Ile Gly Pro Cys Leu Pro 1 5 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 89 Met Ile Gly Pro Val Leu Pro 1 5 <210> 90 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 90 Gln Ile Gly Pro Ile Leu Pro 1 5 <210> 91 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 91 Glu Val Gly Pro Ile Leu Pro 1 5 <210> 92 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 92 Gln Val Gly Pro Leu Leu Pro 1 5 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 93 Gln Ile Gly Pro Val Met Pro 1 5 <210> 94 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 94 Gln Ile Gly Pro Cys Val Pro 1 5 <210> 95 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 95 Gln Ile Gly Pro Leu Val Pro 1 5 <210> 96 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 96 Arg Gly Leu Val Met Pro Met 1 5 <210> 97 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 97 Met Ile Gly Pro Ile Leu Pro 1 5 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 98 Cys Ile Gly Pro Met Val Pro 1 5 <210> 99 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 99 Phe Ile Gly Pro Val Leu Pro 1 5 <210> 100 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 100 His Ile Gly Pro Ile Leu Pro 1 5 <210> 101 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 101 His Ile Gly Pro Ile Met Pro 1 5 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 102 His Ile Gly Pro Tyr Leu Pro 1 5 <210> 103 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 103 His Val Gly Pro Ile Leu Pro 1 5 <210> 104 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 104 Ile Ile Gly Pro Leu Leu Pro 1 5 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 105 Met Val Gly Pro Leu Leu Pro 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 106 Met Val Gly Pro Leu Leu Pro 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 107 Asn Ile Gly Pro Tyr Leu Pro 1 5 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 108 Asn Ile Gly Pro Tyr Leu Pro 1 5 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 109 Gln Ile Gly Pro His Leu Pro 1 5 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 110 Gln Ile Gly Pro Ile Leu Gly 1 5 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 111 Gln Ile Gly Pro Ile Leu Ser 1 5 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 112 Gln Ile Gly Pro Ile Leu Thr 1 5 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 113 Gln Ile Gly Pro Ile Met Pro 1 5 <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 114 Gln Ile Gly Pro Ile Pro Ile 1 5 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 115 Gln Ile Gly Pro Leu Leu Asn 1 5 <210> 116 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 116 Gln Ile Gly Pro Val Phe Pro 1 5 <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 117 Gln Ile Gly Pro Val Leu Ser 1 5 <210> 118 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 118 Gln Ile Gly Pro Trp Leu Pro 1 5 <210> 119 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 119 Gln Val Gly Pro Ile Met Asn 1 5 <210> 120 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 120 Gln Val Gly Pro Ile Met Pro 1 5 <210> 121 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 121 Gln Val Gly Pro Ile Val Pro 1 5 <210> 122 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 122 Gln Val Gly Pro Leu Leu Ser 1 5 <210> 123 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 123 Gln Val Gly Pro Val Leu Pro 1 5 <210> 124 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 124 Gln Val Gly Pro Val Leu Pro 1 5 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 125 Arg Ile Gly Pro Ile Met Pro 1 5 <210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 126 Arg Ile Gly Pro Ile Val Pro 1 5 <210> 127 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 127 Arg Ile Gly Pro Met Phe Pro 1 5 <210> 128 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 128 Arg Ile Gly Pro Met Ile Pro 1 5 <210> 129 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 129 Arg Ile Gly Pro Met Val Pro 1 5 <210> 130 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 130 Arg Ile Gly Pro Val Ile Pro 1 5 <210> 131 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 131 Arg Val Gly Pro Ile Leu Pro 1 5 <210> 132 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 132 Arg Val Gly Pro Leu Leu Pro 1 5 <210> 133 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 133 Thr Val Gly Pro His Ile Pro 1 5 <210> 134 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 134 Pro Ser Trp Arg Ser Asn Trp 1 5 <210> 135 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 135 Ala Leu Arg Ala Thr Leu Glu 1 5 <210> 136 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 136 Lys Tyr Gly Tyr Leu Thr Pro 1 5 <210> 137 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 137 Arg Ile Gly Pro Met Leu Pro 1 5 <210> 138 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 138 Asn Pro Phe Cys Ser Arg Phe 1 5 <210> 139 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 139 Tyr Tyr Leu His Gln Trp Cys 1 5 <210> 140 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 140 His Ile Val Pro Leu Leu Arg 1 5 <210> 141 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Protein Scaffold Based On A Human Fibronectin Type III (FN3) Domain Sequence <400> 141 Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 142 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding polypeptide <400> 142 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 143 <211> 89 <212> PRT <213> Binding polypeptide <400> 143 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Pro Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 144 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding polypeptide <400> 144 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Asn Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 145 <211> 89 <212> PRT <213> Binding polypeptide <400> 145 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Pro Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 146 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding polypeptide <400> 146 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Tyr Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85 <210> 147 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding polypeptide <400> 147 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 148 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding polypeptide <400> 148 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 149 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding polypeptide <400> 149 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Pro Asp Ser 1 5 10 15 Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 150 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding polypeptide <400> 150 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr 85 <210> 151 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Binding polypeptide <400> 151 Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu 20 25 30 Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr 35 40 45 Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly 50 55 60 Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser 65 70 75 80 Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr 85

Claims (38)

  1. 서열 번호 142 내지 144 및 147 내지 151로 이루어진 군으로부터 선택된 파이브로넥틴 III형 도메인의 안정성 향상된 콘센서스 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하는 단계;
    상기 폴리뉴클레오티드 서열 내 적어도 하나의 루프 영역을 암호화하는 위치에서 랜덤화 코돈들을 도입하는 단계; 및
    상기 폴리뉴클레오티드 서열의 카피를 증식시켜(propagate) 변이체 스캐폴드 단백질들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리를 형성시키는 단계를 포함하는,
    폴리펩티드 변이체들을 생성시키기 위하여, 랜덤화 코돈들을 혼입하는 파이브로넥틴 III형 도메인의 안정성 향상 콘센서스 서열로부터 유래되는 스캐폴드 기반의 단백질 라이브러리를 작제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 랜덤화 코돈들이 NNS 및 NNK의 군으로부터 선택되는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 랜덤화 코돈들이 서열 번호 142 내지 144 및 147 내지 151의 위치 13 내지 16, 22 내지 28, 38 내지 43, 51 내지 54, 60 내지 64, 및 75 내지 81에서의 잔기들로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 루프 영역을 암호화하는 위치들에서 혼입되는, 방법.
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