RU2603272C2 - Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения - Google Patents
Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2603272C2 RU2603272C2 RU2012151366/10A RU2012151366A RU2603272C2 RU 2603272 C2 RU2603272 C2 RU 2603272C2 RU 2012151366/10 A RU2012151366/10 A RU 2012151366/10A RU 2012151366 A RU2012151366 A RU 2012151366A RU 2603272 C2 RU2603272 C2 RU 2603272C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- tencon
- framework
- library
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 53
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 title abstract description 32
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 title abstract description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 174
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 165
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 30
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 30
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 102000002090 Fibronectin type III Human genes 0.000 claims description 7
- 108050009401 Fibronectin type III Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 101710167800 Capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 abstract description 6
- 101710130420 Probable capsid assembly scaffolding protein Proteins 0.000 abstract description 6
- 101710204410 Scaffold protein Proteins 0.000 abstract description 6
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 120
- 229940034880 tencon Drugs 0.000 description 63
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 26
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 26
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 21
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 20
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 14
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 14
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 12
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 102000007000 Tenascin Human genes 0.000 description 11
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- -1 combinations Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 230000006870 function Effects 0.000 description 10
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 10
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 10
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 9
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 8
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- 101000666340 Homo sapiens Tenascin Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 230000004540 complement-dependent cytotoxicity Effects 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 7
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 6
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 6
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 6
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 101710187798 60S ribosomal protein L23 Proteins 0.000 description 4
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102220475874 Keratin, type I cytoskeletal 10_L17A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 4
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 4
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 108010073807 IgG Receptors Proteins 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108010079246 OMPA outer membrane proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 3
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 3
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 3
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 3
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000009490 IgG Receptors Human genes 0.000 description 2
- 102100026120 IgG receptor FcRn large subunit p51 Human genes 0.000 description 2
- 101710177940 IgG receptor FcRn large subunit p51 Proteins 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102100029193 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Human genes 0.000 description 2
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 101710090029 Replication-associated protein A Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N Terfenadine Chemical compound C1=CC(C(C)(C)C)=CC=C1C(O)CCCN1CCC(C(O)(C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 GUGOEEXESWIERI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 2
- 235000011054 acetic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 229960002964 adalimumab Drugs 0.000 description 2
- 230000009824 affinity maturation Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 230000001387 anti-histamine Effects 0.000 description 2
- 239000000739 antihistaminic agent Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003508 chemical denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 2
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 2
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M lithium bromide Chemical compound [Li+].[Br-] AMXOYNBUYSYVKV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N octane Chemical compound CCCCCCCC TVMXDCGIABBOFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YVAIXJRFHXIRRE-UHFFFAOYSA-N 2-henicosylpropanedioic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(C(O)=O)C(O)=O YVAIXJRFHXIRRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BTBJCTWMARHHQD-UHFFFAOYSA-N 2-heptadecylpropanedioic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(C(O)=O)C(O)=O BTBJCTWMARHHQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 101710204899 Alpha-agglutinin Proteins 0.000 description 1
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-M Arachidonate Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC([O-])=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-M 0.000 description 1
- 101100136076 Aspergillus oryzae (strain ATCC 42149 / RIB 40) pel1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091008875 B cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N DMF Natural products CC1=CC=C(C)O1 GSNUFIFRDBKVIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 101710099301 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N Malonic acid Chemical compound OC(=O)CC(O)=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010067902 Peptide Library Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102220472147 Protein ENL_E11N_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101000720426 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L23-A Proteins 0.000 description 1
- 101000720428 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 60S ribosomal protein L23-B Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 102220483931 Serine/threonine-protein kinase Chk2_T68A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M Superoxide Chemical compound [O-][O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 150000001243 acetic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000009830 antibody antigen interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 229940114078 arachidonate Drugs 0.000 description 1
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 1
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229960004669 basiliximab Drugs 0.000 description 1
- 229940116224 behenate Drugs 0.000 description 1
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-M behenate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 238000013378 biophysical characterization Methods 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N carbonyldiimidazole Chemical class C1=CN=CN1C(=O)N1C=CN=C1 PFKFTWBEEFSNDU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229960005395 cetuximab Drugs 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000000978 circular dichroism spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- DGXRZJSPDXZJFG-UHFFFAOYSA-N docosanedicarboxylic acid Natural products OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O DGXRZJSPDXZJFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M dodecanoate Chemical compound CCCCCCCCCCCC([O-])=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000005313 fatty acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 125000003712 glycosamine group Chemical group 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000057345 human TNC Human genes 0.000 description 1
- 150000004678 hydrides Chemical class 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 229940070765 laurate Drugs 0.000 description 1
- 235000021190 leftovers Nutrition 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229940105132 myristate Drugs 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 229940049964 oleate Drugs 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008723 osmotic stress Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 101150040383 pel2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150050446 pelB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 1
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 101150088856 pix gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010064470 polyaspartate Proteins 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 102220283791 rs1555932650 Human genes 0.000 description 1
- 102200051957 rs2472553 Human genes 0.000 description 1
- 102220103283 rs878854732 Human genes 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000002804 saturated mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M sodium;1-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoyloxy]-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonate Chemical compound [Na+].O=C1C(S(=O)(=O)[O-])CC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)CCCC[C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1 JJGWLCLUQNFDIS-GTSONSFRSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- CWXZMNMLGZGDSW-UHFFFAOYSA-N tetracontanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O CWXZMNMLGZGDSW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQHCYKULIHKCEB-UHFFFAOYSA-N tetradecanedioic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCCCCCCCC(O)=O HQHCYKULIHKCEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- VHOCUJPBKOZGJD-UHFFFAOYSA-N triacontanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VHOCUJPBKOZGJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1044—Preparation or screening of libraries displayed on scaffold proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/39—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin, cold insoluble globulin [CIG]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
- C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
Abstract
Изобретения касаются способа конструирования библиотеки белков, полученных из консенсусной последовательности домена фибронектина типа III (FN3) с повышенной стабильностью, и библиотеки, полученной таким способом. Способ включает стадии: предоставление полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий консенсусную последовательность домена фибронектина типа III (FN3) с повышенной стабильностью, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 142-151; введение рандомизированных кодонов в полинуклеотидную последовательность в выбранных положениях; и размножение копий указанной полинуклеотидной последовательности с получением библиотеки полинуклеотидов, кодирующих варианты каркасных белков. Изобретения могут быть использованы в биофармацевтческой промышленности. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 9 ил., 5 табл., 4 пр.
Description
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к белковым каркасам с новыми характеристиками, включая возможность связывания с клеточными мишенями. Более конкретно, настоящее изобретение относится к белковому каркасу, основанному на консенсусной последовательности повтора фибронектина типа III (FN3).
Описание области применения
Когда необходимо добиться высокой аффинности и специфичности к молекуле-мишени, наиболее широко используется класс терапевтических белков - моноклональные антитела. Однако для биофармацевтической промышленности большой интерес также представляет конструирование не являющихся антителами белков, которые способны связываться с такими мишенями. Данные «альтернативные белковые» каркасы могут иметь преимущества перед традиционными антителами в связи с малым размером, отсутствием дисульфидных связей, высокой стабильностью и возможностью экспрессирования в прокариотических клетках-хозяевах. Для их очистки активно используют новые способы; они легко соединяются с лекарственными средствами/токсинами, эффективно проникают в ткани, и их можно без труда использовать в качестве полиспецифических связующих веществ (Skerra 2000 J Mol Recognit 13(4): 167-87; Binz and Pluckthun 2005 Curr Opin Biotechnol 16(4): 459-69).
Одним из таких альтернативных белковых каркасов является укладка цепи иммуноглобулинов (Ig). Данная укладка цепи встречается в вариабельных участках антител, а также в тысячах белков, не являющихся антителами. Исследования показывают, что один из таких белков Ig, десятый повтор фибронектина типа III (FN3) из фибронектина человека, может допускать ряд мутаций в поверхностных петлях при сохранении общей структуры укладки цепи Ig. Таким образом, в последовательности данных петель были встроены библиотеки аминокислотных вариантов, а также был проведен отбор специфических связующих веществ, выбранных для ряда разных мишеней (Koide et al. 1998 J Mol Biol 284(4): 1141-51; Karatan et al. 2004 Chem Biol 11(6): 835-44). Как было обнаружено, такие сконструированные домены FN3 связываются с мишенями с высокой аффинностью, сохраняя при этом свои важные биофизические характеристики (Parker et al. 2005 Protein Eng Des Sel 18(9): 435-44).
Желательные физические характеристики, которые должны иметь потенциальные альтернативные каркасные молекулы, включают в себя высокую термостабильность и обратимость термического свертывания и развертывания. Для повышения эффективной термостабильности белков и ферментов использовали несколько способов, включая детальный проект, основанный на сравнении с термостабильными последовательностями с высокой степенью сходства, конструирование стабилизирующих дисульфидных мостиков, создание мутаций для повышения склонности к образованию альфа-спирали, создание солевых мостиков, изменение поверхностного заряда белка, направленную эволюцию и изменение композиции консенсусных последовательностей (Lechmann and Wyss 2001 Curr Opin Biotechnol 12(4): 371-5). Высокая термостабильность относится к числу желательных характеристик таких каркасов, поскольку она может увеличивать выход полученного рекомбинантного белка, повышать растворимость очищенной молекулы, повышать активность внутриклеточных каркасов, снижать иммуногенность и сводить к минимуму потребность в «холодовой цепи» при производстве.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение представляет белковый каркас на основе белка с повтором фибронектина типа III (FN3), кодирующие или комплементарные нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева, композиции, комбинации, составы, устройства и способы их получения и применения. В предпочтительном варианте осуществления белковый каркас содержит консенсусную последовательность множества доменов FN3 из тенасцина-C человека (в дальнейшем - «тенасцин»). В дополнительном предпочтительном варианте осуществления белковый каркас, составляющий предмет настоящего изобретения, представляет собой консенсусную последовательность 15 доменов FN3 (SEQ ID NO: 1-15) или ее вариант. В конкретном аспекте настоящего изобретения белковый каркас, составляющий предмет настоящего изобретения, имеет замещающие остатки, что повышает устойчивость каркасного белка к термической и химической денатурации. Белковые каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения, можно сконструировать с использованием известных специалистам в данной области способов, включая вставку остатков в выбранных петлевых участках внутри каркаса, для получения связывающих доменов, селективных по отношению к партнеру по связыванию. Партнер по связыванию может представлять собой растворимую молекулу или закрепленную на клетке молекулу, например, внеклеточный домен рецепторного белка.
В одном варианте осуществления специфические замены остатков в консенсусной последовательности SEQ ID NO: 16 (Tencon), описанной в настоящем документе и выбранной за свойственную ей химическую и термостабильность, повышают термостабильность каркаса Tencon до 11°C и сдвигают среднюю точку индуцированной GdmCl денатурации с 3,4 М до более чем 5 М. В одном варианте осуществления специфические замены в последовательности SEQ ID NO: 16 (Tencon) являются одиночными, такие как N46V, E14P и E86I, тогда как в альтернативном варианте осуществления замены являются множественными, такие как N46V и E86I, все из замен E14P и N46V и E86I, а также все из замен L17A и N46V и E86I. Полипептиды на основе Tencon с повышенной стабильностью позволяют получить каркасы, допускающие более простые способы очистки, рецептуру и больший срок годности. Сконструированные партнеры по связыванию с повышенной общей стабильностью можно получить путем введения рандомизированных пептидов в петли стабилизированного каркаса.
Белковые каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения, могут применяться в виде мономерных звеньев или быть связаны с получением полимерных структур с такой же или другой специфичностью к партнеру по связыванию. Молекулы на основе белковых каркасов Tencon можно дополнительно модифицировать для улучшения одной или более их характеристик in vivo, связанных с биораспределением, временем жизни в организме или терапевтической эффективностью, такой как способность ассоциироваться с молекулами, которые изменяют скорость поглощения клетками, в частности, клетками эпителия, например, участком Fc антитела или молекулами, выполненными с возможностью связывания с белками сыворотки, такими как альбуминсвязывающий домен. В дополнительных вариантах осуществления белковые каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения, могут быть связаны с молекулой нуклеиновой кислоты, которая может кодировать белковый каркас.
Настоящее изобретение также представляет по меньшей мере один способ экспрессии по меньшей мере одного белкового каркасного полипептида, чья последовательность относится к консенсусной последовательности множества доменов FN3 в клетке-хозяине, включающий культивирование клетки-хозяина, как описано в настоящем документе в условиях, которые позволяют экспрессировать по меньшей мере один белковый каркас в количествах, допускающих детекцию и/или восстановление.
Настоящее изобретение также представляет по меньшей мере одну композицию, содержащую (a) белковый каркас на основе консенсусной последовательности множества доменов FN3 и/или кодирующей нуклеиновой кислоты, как описано в настоящем документе; и (b) пригодный и/или фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель.
Настоящее изобретение дополнительно включает способ образования библиотек белкового каркаса на основе повтора фибронектина типа III (FN3), предпочтительно консенсусной последовательности множества доменов FN3, а более предпочтительно - консенсусной последовательности множества доменов FN3 тенасцина человека с повышенной химической и термостабильностью. Библиотеки можно образовать путем изменения аминокислотной композиции одной петли, одновременного изменения множества петель или дополнительных положений каркасной молекулы. Изменяемые петли можно соответствующим образом удлинить или укоротить. Такие библиотеки можно образовать так, чтобы они включали в себя все возможные аминокислоты в каждом положении или заданное подмножество аминокислот. Элементы библиотеки можно использовать для скрининга путем фенотипирования, такого как фенотипирование in vitro (ДНК, РНК, рибосомное фенотипирование и т.д.), дрожжевое, бактериальное и фаговое фенотипирование.
Белковые каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения, обеспечивают улучшенные биофизические характеристики, такие как стабильность в условиях высокой осмотической силы и растворимость в высоких концентрациях. Домены каркасных белков не сшиты дисульфидными связями, что дает белкам возможность экспрессирования и сворачивания в системах, где отсутствуют ферменты, необходимые для образования дисульфидных связей, включая прокариотические системы, такие как E. coli, и в системах для транскрипции/трансляции in vitro, таких как система лизата ретикулоцитов кролика.
В дополнительном аспекте настоящее изобретение предоставляет способ образования каркасной молекулы, способной связываться с конкретной мишенью, включающий в себя пэннинг библиотеки каркаса, составляющей предмет настоящего изобретения, относительно мишени и выявление связующих веществ. В других связанных аспектах настоящее изобретение включает способы скрининга, которые можно использовать для образования или аффинного созревания белковых каркасов с желательной активностью, например, способных связываться с белками-мишенями с определенной аффинностью. Аффинного созревания можно достигнуть многократными итерационными циклами мутагенеза и селекции при помощи таких систем, как фаговое фенотипирование или фенотипирование in vitro. Мутагенез в ходе данного процесса может являться результатом сайтнаправленного мутагенеза по специфическим остаткам каркаса, неспецифического мутагенеза из-за ПЦР пониженной точности, перестановки в ДНК и/или комбинации данных способов. Настоящее изобретение дополнительно представляет любые изобретения, описанные в настоящем документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1. Анализ очищенного Tencon методом ДСН-ПААГ, используя бис-трис-гель NuPAGE 4-12% (Invitrogen) и окрашивание Кумасси синим. N означает нативные условия, R - условия восстановления.
На фигуре 2 представлены результаты анализа кругового дихроизма Tencon в PBS.
На фигуре 3 представлены результаты анализа кругового дихроизма третьего домена FN3 из тенасцина и Tencon в PBS, в котором получили температуры плавления 54°C и 78°C соответственно.
На фигуре 4 представлена конструкция фагемидной плазмиды pTencon-pIX. Экспрессию стимулируют промотор Lac и секреция посредством сигнальной последовательности OmpA.
На фигуре 5 представлено, как myc-Tencon можно фенотипировать на фаге M13 с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), демонстрируя связывание фага с лунками, покрытыми анти-Myc, CNTO95, а также лунками без покрытия.
На фигуре 6 представлена схема, показывающая петлевую структуру третьего домена FN3 тенасцина человека.
На фигуре 7 представлены результаты скрининга с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) результатов селекции IgG, в котором отдельные клоны тестировали на связывание с биотинилированным IgG или биотинилированным HSA в качестве контроля.
На фигурах 8A-B представлены графики, показывающие индуцированную GdmCl денатурацию одиночных мутантов (A) и комбинаторных мутантов (B) по измерению флуоресценции с возбуждением на 280 нм и эмиссией на 360 нм.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Сокращения
ADCC = антителозависимая клеточная цитотоксичность; CDC = комплементозависимая цитотоксичность; DSC = дифференциальная сканирующая калориметрия; ΔG = свободная энергия Гиббса; IgG = иммуноглобулин G; Tm = температура плавления.
Определения и объяснение терминологии
Термин «антитело» или «фрагмент антитела» означает антитела, продукты расщепления, указанные части и их варианты, включая без ограничений миметики антител или составные части антител, имитирующие структуру и/или функцию антитела или его указанного фрагмента либо части, включая без ограничений одноцепочечные антитела, однодоменные антитела, миниантитела, а также их фрагменты. Функциональные фрагменты включают в себя антигенсвязывающие фрагменты, которые обеспечивают связывание с представляющим интерес антигеном-мишенью. Например, фрагменты антитела, способные связываться с антигеном-мишенью или его участками, включая без ограничений фрагменты Fab (например, при расщеплении папаином), Fab' (например, при расщеплении пепсином и неполном восстановлении) и F(ab')2 (например, при расщеплении пепсином), facb (например, при расщеплении плазмином), pFc' (например, при расщеплении пепсином или плазмином), Fd (например, при расщеплении пепсином, неполном восстановлении и повторной агрегации), Fv или scFv (например, при помощи методов молекулярной биологии), включены в настоящее изобретение под термином «антитело». Антитело или фрагмент можно получить из любого млекопитающего, такого как без ограничений человек, мышь, кролик, крыса, грызун, примат, верблюд, коза или любая их комбинация, и они включают в себя выделенные антитела человека, примата, грызуна, млекопитающего, химерные, гуманизированные и/или CDR-привитые антитела, иммуноглобулины, продукты расщепления и другие указанные части и их варианты.
Термин «эпитоп» означает белковую детерминанту, способную специфически связываться с антителом, или сконструированный связывающий домен, такой как одна или более петель белков на основе каркасов. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностно расположенных групп молекул, таких как аминокислотные или сахарные боковые цепи, а также обычно имеют специфическую трехмерную структуру, а также специфические зарядовые характеристики. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что в присутствии денатурирующих растворителей теряется связывание с первыми, но не теряется связывание со вторыми. Конформационные эпитопы образуются в результате конформационного сворачивания молекулы-мишени, происходящего тогда, когда аминокислоты из разных участков линейной последовательности молекулы-мишени оказываются в трехмерном пространстве в непосредственной близости друг к другу. Такие конформационные эпитопы, как правило, распределены по внеклеточной стороне плазматической мембраны.
Используемые в настоящем документе термины «Fc», «Fc-содержащий белок» или «Fc-содержащая молекула» относятся к мономерным, димерным или гетеродимерным белкам, имеющим по меньшей мере домен CH2 и CH3 иммуноглобулина. Домены CH2 и CH3 могут образовывать по меньшей мере часть димерного участка белка или молекулы (например, антитела).
Используемый в настоящем документе термин «стабильность» относится к способности молекулы сохранять свернутое состояние в физиологических условиях, так чтобы сохранять по меньшей мере одну из своих обычных функциональных активностей, например, способность связываться с молекулой-мишенью, такой как цитокин или белок сыворотки. Измерение стабильности белка и лабильности белка можно рассматривать как один и тот же или как разные аспекты целостности белка. Белки чувствительны или «лабильны» к денатурации, вызванной нагревом, ультрафиолетовым или ионизирующим облучением, изменением осмолярности и pH при нахождении в жидком растворе, механической силой сдвига, вызванной фильтрованием через поры малого размера, ультрафиолетовым облучением, ионизирующим облучением, таким как гамма-облучение, химической или термической дегидратацией или любым другим воздействием или силой, которые могут привести к разрушению структуры белка. Стабильность молекулы можно определить стандартными способами. Например, стабильность молекулы можно определить путем измерения ее температуры теплового плавления («TM»). TM представляет собой температуру в градусах Цельсия (°C), при которой ½ молекул переходит в развернутое состояние. Как правило, чем выше TM, тем более стабильной является молекула. Помимо нагрева способность белка сохранять конкретную трехмерную структуру также можно изменять в зависимости от химического окружения.
Химическую денатурацию можно также измерить различными способами. Химический денатурирующий агент представляет собой агент с известной способностью разрушать нековалентные взаимодействия и ковалентные связи внутри белка, включая водородные связи, электростатические связи, Ван-дер-Ваальсовы силы, гидрофобные взаимодействия или дисульфидные связи. Химические денатурирующие агенты включают в себя гидрохлорид гуанидиния, тиоцианат гуанидиния, мочевину, ацетон, органические растворители (DMF, бензол, ацетонитрил), соли (сульфат аммония, бромид лития, хлорид лития, бромид натрия, хлорид кальция, хлорид натрия); восстановители (например, дитиотритол, бета-меркаптоэтанол, динитротиобензол, а также гидриды, такие как борогидрид натрия), неионные и ионные моющие средства, кислоты (например, соляная кислота (HCl), уксусная кислота (CH3COOH), галогензамещенные уксусные кислоты), гидрофобные молекулы (например, фосфолипиды), а также денатурирующие агенты направленного действия (Jain R.K и Hamilton A.D., Angew. Chem. 114(4), 2002). Количественная характеризация степени денатурации может основываться на степени потери функциональной характеристики, такой как способности к связыванию с молекулой-мишенью, или на физиохимических характеристиках, таких как склонность к агрегации, открытие доступа к ранее недоступным растворителю остаткам либо разрушение или образование дисульфидных связей.
В значении потери стабильности «денатурирование» или «денатурация» белка означают процесс, в котором происходит потеря некоторой части или всей трехмерной конформации, обеспечивающей функциональные характеристики белка, с соответствующей потерей активности и/или растворимости. Разрушаемые при денатурации силы включают в себя внутримолекулярные связи, включая без ограничений электростатические, гидрофобные, Ван-дер-Ваальсовы силы, водородные связи и дисульфидные связи. Денатурацию белка можно вызвать воздействием на белок или содержащий белок раствор, таким как механическое воздействие (например, сжимающая сила или сила сдвига), тепловой, осмотический стресс, изменение pH, электрические или магнитные поля, ионизирующее облучение, ультрафиолетовое облучение и дегидратация, а также воздействием химических денатурирующих агентов.
Используемый в настоящем документе термин «терапевтически эффективное» лечение или количество относится к количеству, достаточному для очевидного уменьшения или облегчения причин расстройства или его симптомов. Термин «облегчение» относится к уменьшению отрицательного эффекта расстройства на проходящего терапию пациента. В целях настоящего изобретения под объектом предпочтительно понимается человек, однако можно предположить, что для любого животного, нуждающегося в лечении патологических состояний, расстройства или болезни, можно применять разработанный для данной цели белок на основе каркасов.
Общее описание изобретения
Настоящее изобретение представляет выделенный, рекомбинантный и/или синтетический белковый каркас на основе консенсусной последовательности белка с повтором фибронектина типа III (FN3), включая без ограничений каркас, полученный из млекопитающих, а также композиции и кодирующие молекулы нуклеиновой кислоты, содержащие по меньшей мере один полинуклеотид, кодирующий белковый каркас на основе консенсусной последовательности FN3. Настоящее изобретение дополнительно включает в себя без ограничений способы изготовления и применения таких нуклеиновых кислот и белковых каркасов, включая применение в качестве платформы для изучения, а также в диагностических и терапевтических композициях, способах и устройствах.
Белковые каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения, обладают преимуществами по сравнению с более крупными биотерапевтическими агентами на основе иммуноглобулина благодаря своим небольшим, компактным размерам. В частности, размер и форма биологической молекулы может сказываться на возможности ее введения местным или пероральным способом, способности проходить через гематоэнцефалический барьер; возможности экспрессирования в недорогих системах, таких как E. coli; возможности встраивания в би- или полиспецифические молекулы для связывания с множеством мишеней или множеством эпитопов одной мишени, пригодности к конъюгации, например, с активными компонентами, полимерами и зондами; возможности введения композиции в высоких концентрациях; а также способности таких молекул к эффективному прохождению через пораженные ткани и опухоли.
Более того, белковые каркасы обладают многими характеристиками антител с точки зрения укладки их структуры, которая имитирует вариабельный участок антитела. Данная ориентация позволяет делать петли FN3 поверхностными подобно определяющим комплементарность участкам (CDR) антител. Предполагается, что они смогут связываться с клеточными мишенями, и петли можно будет изменять, например, подвергать аффинному созреванию, для улучшения определенных связывающих или смежных характеристик.
Три из шести петель белкового каркаса, составляющего предмет настоящего изобретения, топологически соответствуют связывающим доменам антитела, расположенным в петлях вариабельного домена, известного своей гипервариабельной природой (петли гипервариабельных доменов (HVL)), в положениях, определенных Кабатом как остатки определяющих комлементарность участков (CDR), т.е. антигенсвязывающих участков антитела, а остальные три петли являются поверхностными, подобно участкам CDR антитела. Данные петли охватывают или расположены на остатках 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81 последовательности SEQ ID NO: 16, как представлено в таблице 3 ниже и на фигуре 6, или около них. Для получения специфичности связывания и аффинности предпочтительно изменяют петлевые участки на остатках 22-28, 51-54 и 75-81 или около них. Один или более данных петлевых участков перемешивают случайным образом с другими петлевыми участками и/или другими нитями при сохранении их последовательности в качестве остовных участков библиотеки, при этом из библиотеки можно выбирать потенциально связующие агенты с высокой аффинностью к конкретному белку-мишени. Один или более петлевых участков могут взаимодействовать с белком-мишенью подобно тому, как участок CDR антитела взаимодействует с белком.
Каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения, могут включать в себя другие субъединицы, например, через ковалентное взаимодействие. Весь константный участок антитела или его часть может быть связан с каркасом для придания ему имитирующих антитело характеристик, особенно характеристик, ассоциируемых с участком Fc, например, комплементарной активности (ADCC), периода полужизни и т.п. Например, можно вводить и/или регулировать эффекторную функцию, например, путем модификации связывания с C1q и/или связывания с FcγR, тем самым изменяя активность CDC и/или активность ADCC. «Эффекторные функции» отвечают за активацию или уменьшение биологической активности (например, у объекта). Примеры эффекторных функций включают в себя без ограничений: связывание с C1q; комплементозависимую цитотоксичность (CDC); связывание с рецептором Fc; антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижение уровня экспрессии рецепторов на клеточной поверхности (например, рецепторов B-клеток; BCR) и т.п. Такие эффекторные функции могут требовать сочетания участка Fc со связывающим доменом (например, петлями белкового каркаса) и могут количественно характеризоваться с использованием различных анализов (например, анализов связывания с Fc, анализов ADCC, анализов CDC и т.п.).
К полипептиду на основе каркаса или его варианту можно добавить или ассоциировать с ним дополнительные фрагменты, например, для получения желательных характеристик к каркасной молекуле можно присоединить конъюгаты токсинов, альбумин или связывающиеся с альбумином вещества, молекулы полиэтиленгликоля (ПЭГ). Данные фрагменты могут представлять собой встроенные в кодирующую каркас последовательность слияния и могут быть получены стандартными способами, например, путем экспрессирования слитого белка с рекомбинантным кодирующим слияние вектором, выполненным с использованием общедоступных кодирующих нуклеотидных последовательностей. В альтернативном варианте осуществления для добавления фрагментов к рекомбинантно полученному каркасному белку можно использовать химические способы.
Каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения, можно использовать как моноспецифические в мономерной форме или как би- или полиспецифические (для разных белков-мишеней или эпитопов одного белка-мишени) в мультимерной форме. Связи между каждой каркасной единицей могут быть ковалентными или нековалентными. Например, димерный биспецифический каркас имеет одну субъединицу со специфичностью к первому белку-мишени или эпитопу и вторую субъединицу со специфичностью ко второму белку-мишени или эпитопу. Субъединицы каркаса можно соединять в различных конформациях, что может увеличить валентность и, таким образом, антигенсвязывающую авидность.
Образование и выработка каркасного белка
По меньшей мере один каркасный белок, составляющий предмет настоящего изобретения, можно необязательно получить при помощи линии клеток, смешанной линии клеток, иммортализованной клетки или клональной популяции иммортализованных клеток, как хорошо известно специалистам в данной области. См., например, публикации под ред. Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е издание, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); под ред. Colligan, et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001); Colligan et al., Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001).
Аминокислоты каркасного белка можно изменить, добавить и/или удалить для снижения иммуногенности или снижения, улучшения или модификации связывания, аффинности, скорости ассоциации, скорости диссоциации, авидности, специфичности, периода полужизни, стабильности, растворимости или любой другой пригодной характеристики, как известно специалистам в данной области.
Биоактивные каркасные белки можно сконструировать с сохранением высокой аффинности к антигену и других благоприятных биологических характеристик. Для достижения данной цели каркасные белки можно необязательно получить путем анализа родительских последовательностей и различных концептуальных сконструированных продуктов при помощи трехмерных моделей родительских и сконструированных последовательностей. Трехмерные модели широкодоступны и известны специалистам в данной области. Существуют компьютерные программы, иллюстрирующие и показывающие вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных последовательностей-кандидатов и способные измерять потенциальную иммуногеничность (например, программа Immunofilter разработки Xencor, Inc., г. Монровия, штат Калифорния). Изучение данных иллюстраций позволяет проанализировать предполагаемую роль остатков в функционировании последовательности-кандидата, например, остатков, влияющих на способность каркасного белка-кандидата связывать его антиген. Таким образом, возможны селекция и комбинирование остатков из родительской и референсной последовательностей для получения желательной характеристики, например, аффинности к антигенам-мишеням. В альтернативном варианте осуществления или помимо описанных выше процедур можно использовать другие пригодные способы конструирования последовательностей.
Скрининг
Скрининговый подход к конструированию каркасных белков или библиотек, содержащих каркасные белки с варьируемыми остатками или доменами для специфического связывания с подобными белками или фрагментами, можно удобным образом реализовать с использованием библиотек нуклеотидного (ДНК или РНК) или пептидного фенотипирования, например, фенотипирования in vitro. Данный способ включает в себя скрининг больших наборов пептидов для выявления отдельных пептидов, имеющих желательную функцию или структуру. Фенотипированный пептид с нуклеотидной последовательностью или без нее может содержать в длину от 3 до 5 000 и более нуклеотидов или аминокислот, обычно от 5 до 100 аминокислот, часто от приблизительно 8 до 25 аминокислот. Помимо способов на основе прямого химического синтеза для образования библиотек пептидов описано несколько способов с использованием рекомбинантных ДНК. Один из таких способов предусматривает фенотипирование последовательности пептидов на поверхности бактериофага или клетки. Каждый бактериофаг или клетка содержит последовательность нуклеотидов, кодирующую конкретную последовательность пептидов для фенотипирования.
Белковые каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения, могут связывать белки человека или других млекопитающих с разной степенью аффинности (KD). В предпочтительном варианте осуществления по меньшей мере один белковый каркас, составляющий предмет настоящего изобретения, может необязательно связываться с белком-мишенью с высокой аффинностью, например, с KD, меньшей либо равной приблизительно 10-7 М, такой как без ограничений в диапазоне 0,1-9,9 (или любом входящем в него диапазоне или значении)×10-8, 10-9, 10-10, 10-11, 10-12, 10-13, 10-14, 10-15, или любом входящем в него диапазоне или значении, как определено методом поверхностного плазмонного резонанса или методом Kinexa, как известно специалистам в данной области.
Аффинность или авидность белкового каркаса для антигена можно определить экспериментально любым пригодным способом (см., например, публикацию Berzofsky, et al., Antibody-Antigen Interactions, в Fundamental Immunology, под ред. Paul, W. E., Raven Press: New York, NY (1984); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992); а также способы, описанные в настоящем документе). Измеренная аффинность взаимодействия в конкретной паре белковый каркас - антиген может меняться в зависимости от разных условий измерения (например, осмолярности, pH). Таким образом, измерения аффинности и других параметров связывания антигена (например, KD, Kon, Koff) предпочтительно производить при помощи стандартизированных растворов белкового каркаса и антигена, а также стандартизированного буферного раствора, например, описанного в настоящем документе.
Для определения того, какие белки, антитела и другие антагонисты конкурируют за связывание белка-мишени с белковым каркасом, составляющим предмет настоящего изобретения, и/или совместно используют один и тот же участок-эпитоп, можно провести анализ конкурентного связывания белкового каркаса, составляющего предмет настоящего изобретения. Данные анализы, как хорошо известно специалистам в данной области, предназначены для оценки степени конкуренции между антагонистами или лигандами за ограниченный ряд сайтов связывания у белка. Белок и/или антитело иммобилизуют, выделяют или фиксируют до или после конкуренции, и образец, связавшийся с белком-мишенью, отделяют от несвязавшегося образца, например, путем декантирования (если белок/антитело предварительно перевели в нерастворимую форму) или центрифугирования (если белок/антитело осадили после конкурирующей реакции). Кроме того, конкурентное связывание можно определить по степени изменения функции в результате связывания или отсутствия связывания белкового каркаса с белком-мишенью: например, молекула белкового каркаса может ингибировать или стимулировать ферментативную активность, например, метки. Для данных целей можно использовать ИФА и другие функциональные анализы, как хорошо известно специалистам в данной области.
Молекулы нуклеиновых кислот
Молекулы нуклеиновых кислот, составляющие предмет настоящего изобретения, которые кодируют белковые каркасы, могут быть в форме РНК, такой как мРНК, гяРНК, тРНК или любая другая форма, либо в форме ДНК, включая без ограничений кДНК и геномную ДНК, полученные путем клонирования или синтеза, а также любой их комбинации. ДНК может быть трехцепочечной, двухцепочечной, одноцепочечной или комбинированной. Любая часть по меньшей мере одной цепи ДНК или РНК может быть кодирующей цепью, также известной как смысловая цепь, или некодирующей цепью, также называемой антисмысловой цепью.
Выделенные молекулы нуклеиновых кислот, составляющие предмет настоящего изобретения, могут включать в себя молекулы нуклеиновых кислот, содержащие открытую рамку считывания (ORF), необязательно с одним или более интронами, например, без ограничений по меньшей мере одну указанную часть по меньшей мере одного белкового каркаса; молекулы нуклеиновых кислот, содержащие кодирующую последовательность для белкового каркаса или петлевой участок, который связывается с белком-мишенью; и молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательность нуклеотидов, по существу отличающуюся от последовательностей, описанных выше, но из-за вырожденности генетического кода по-прежнему кодирующую белковый каркас, как описано в настоящем документе и/или известно специалистам в данной области. Очевидно, что генетический код хорошо известен специалистам в данной области. Таким образом, специалист в данной области без труда может образовать такие вырожденные варианты нуклеиновой кислоты, которые кодируют специфические белковые каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения. См., например, публикацию Ausubel, et al., приведенную выше. Такие варианты нуклеиновой кислоты включены в настоящее изобретение.
Как указано в настоящем документе, молекулы нуклеиновых кислот, составляющие предмет настоящего изобретения, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую белковый каркас, могут включать в себя без ограничений молекулы, кодирующие аминокислотную последовательность самого фрагмента белкового каркаса; кодирующую последовательность всего белкового каркаса или его части; кодирующую последовательность белкового каркаса, фрагмента или части, а также дополнительные последовательности, например, кодирующую последовательность по меньшей мере одного сигнального лидерного или слитого пептида с вышеуказанными дополнительными кодирующими последовательностями или без них, например, по меньшей мере один интрон, совместно с дополнительными некодирующими последовательностями, включая без ограничений некодирующие 5'- и 3'-концевые последовательности, например, транскрибированные, не подвергшиеся трансляции последовательности, которые играют роль в транскрипции, обработке мРНК, включая сигналы сплайсинга и полиаденилирования (например, связывание рибосом и стабильность мРНК); дополнительную кодирующую последовательность, которая кодирует дополнительные аминокислоты, например, такие, которые обеспечивают дополнительные функции. Таким образом, кодирующую белковый каркас последовательность можно слить с маркерной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая пептид, который облегчает очистку слитого белкового каркаса, содержащего фрагмент или часть белкового каркаса.
Молекулы нуклеиновых кислот
В настоящем изобретении также представлены нуклеиновые кислоты, кодирующие композиции, составляющие предмет настоящего изобретения, в виде выделенных полинуклеотидов или частей векторов экспрессии, включая векторы, совместимые с экспрессией в прокариотических, эукариотических или нитчатых фагах, выделением и/или фенотипированием композиций или их направленных мутагенов.
Выделенные нуклеиновые кислоты, составляющие предмет настоящего изобретения, можно получить при помощи:
(а) рекомбинантных способов, (b) синтетических способов, (c) способов очистки и/или (d) их комбинаций, как хорошо известно специалистам в данной области.
Полинуклеотиды, которые можно использовать в целях настоящего изобретения, кодируют функциональную часть белкового каркаса, описанного в настоящем документе. Полинуклеотиды, составляющие предмет настоящего изобретения, включают в себя последовательности нуклеиновых кислот, которые можно использовать для селективной гибридизации в полинуклеотид, кодирующий белковый каркас, составляющий предмет настоящего изобретения. Настоящее изобретение представляет выделенные нуклеиновые кислоты, которые в условиях селективной гибридизации образуют полинуклеотид, описанный в настоящем документе. Таким образом, полинуклеотиды, составляющие предмет настоящего варианта осуществления, можно использовать для выделения, детекции и/или количественного определения нуклеиновых кислот, содержащих такие полинуклеотиды. Например, полинуклеотиды, составляющие предмет настоящего изобретения, можно использовать для идентификации, выделения или амплификации частичных либо полноразмерных клонов в подготовленной библиотеке. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды являются последовательностями геномной ДНК или кДНК, выделенными или иным образом комплементарными к кДНК из библиотеки нуклеиновых кислот человека или млекопитающего.
Нуклеиновые кислоты могут для удобства содержать дополнительные последовательности к полинуклеотиду, составляющему предмет настоящего изобретения. Например, в нуклеиновую кислоту можно вставить сайт множественного клонирования, содержащий один или более сайтов эндонуклеазной рестрикции, чтобы облегчить выделение полинуклеотида. Кроме того, можно вставить транслируемые последовательности, чтобы облегчить выделение транслированного полинуклеотида, составляющего предмет настоящего изобретения. К примеру, удобным способом очистки белков, составляющих предмет настоящего изобретения, является введение гексагистидинмаркированной последовательности. Нуклеиновая кислота, составляющая предмет настоящего изобретения, за исключением кодирующей последовательности, может необязательно являться вектором, адаптером или линкером для клонирования и/или экспрессии полинуклеотида, составляющего предмет настоящего изобретения.
В такие клонирующие и/или экспрессирующие последовательности можно добавить дополнительные последовательности, чтобы оптимизировать их функционирование при клонировании и/или экспрессии, способствовать выделению полинуклеотида или улучшить проникновение полинуклеотида в клетку. Использование векторов клонирования, векторов экспрессии, адаптеров и линкеров хорошо известно специалистам в данной области.
Как указано в настоящем документе, молекулы нуклеиновых кислот, составляющие предмет настоящего изобретения, которые содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую белковый каркас, могут включать в себя без ограничений молекулы, кодирующие аминокислотную последовательность самого фрагмента белкового каркаса; кодирующую последовательность всего белкового каркаса или его части; кодирующую последовательность белкового каркаса, фрагмента или части, а также дополнительные последовательности, например, кодирующую последовательность по меньшей мере одного сигнального лидерного или слитого пептида с вышеуказанными дополнительными кодирующими последовательностями или без них, например, по меньшей мере один интрон, совместно с дополнительными некодирующими последовательностями, включая без ограничений некодирующие 5'- и 3'-концевые последовательности, например, транскрибированные, не подвергшиеся трансляции последовательности, которые играют роль в транскрипции, обработке мРНК, включая сигналы сплайсинга и полиаденилирования (например, связывание рибосом и стабильность мРНК); дополнительную кодирующую последовательность, которая кодирует дополнительные аминокислоты, например, такие, которые обеспечивают дополнительные функции. Таким образом, кодирующую белковый каркас последовательность можно слить с маркерной последовательностью, такой как последовательность, кодирующая пептид, который облегчает очистку слитого белкового каркаса, содержащего фрагмент или часть белкового каркаса.
Для бактериальной экспрессии, включая инфицированные фагом бактерии, предпочтительным сигналом секреции является сигнал секреции pelB или ompA, но можно использовать другие полипептидные домены сигнала секреции, как описано в патенте США № 5658727. При фаговом фенотипировании транслируемая далее последовательность ДНК кодирует покрывающий белок нитчатого фага, например, белок pIII или pIX. Предпочтительные фаговые белки можно получить из нитчатых фагов M13, f1, fd и аналогичных эквивалентных нитчатых фагов. Таким образом, транслируемая далее последовательность ДНК кодирует последовательность аминокислотных остатков, которая соответствует и предпочтительно является идентичной гену III или гену IX покрывающего полипептида нитчатого фага. Последовательности таких покрывающих белков известны и доступны в открытых базах данных, например, в NCBI.
Скрининг по библиотеке кДНК или генома можно провести при помощи зонда на основе последовательности полинуклеотида, составляющего предмет настоящего изобретения, например, описанного в настоящем документе. Зонды можно использовать для гибридизации с последовательностями геномной ДНК или кДНК для выделения гомологичных генов в тех же самых или разных организмах. Специалисты в данной области определят, что при выполнении анализа можно использовать различные степени строгости гибридизации и что как среда для гибридизации, так и среда для отмывки клеток могут соответствовать жестким условиям. По мере того как условия гибридизации становятся все более строгими, требуемая для образования дуплекса степень комплементарности между зондом и мишенью возрастает. Жесткость условий можно контролировать одним или более из следующих параметров: температура, ионная сила, pH и присутствие частично денатурирующего растворителя, например, формамида. Например, жесткость условий гибридизации обычно изменяют путем смены полярности раствора реагентов, например, при помощи изменения концентрации формамида в диапазоне от 0 до 50%. Степень комплементарности (идентичности последовательностей), необходимая для детектируемого связывания, варьируется в соответствии со строгостью среды для гибридизации и/или среды для отмывки клеток. Оптимальная степень комплементарности составляет 100%, или от 70% до 100%, или любой диапазон или значение в этих пределах. Однако следует понимать, что небольшие вариации последовательностей в зондах и праймерах могут быть компенсированы путем уменьшения строгости среды для гибридизации и/или среды для отмывки клеток.
В одном аспекте настоящего изобретения полинуклеотиды конструируют с использованием способов введения рандомизированных кодонов для варьирования полученного полипептида по одному или более специфическим остаткам или добавлению остатков в специфических положениях внутри последовательности. Для создания библиотек измененных полипептидных последовательностей можно использовать различные стратегии, включая рандомизированные, полурациональные и рациональные способы. По сравнению с рандомизированными стратегиями рациональные и полурациональные способы имеют преимущество большего контроля над последствиями вводимых в кодирующую последовательность замен. Кроме того, фокусируя варьирование только в определенных участках гена, можно исследовать все многообразие возможных аминокислотных вариантов в выбранных положениях.
Библиотека, построенная на стандартной схеме диверсификации NNK или NNS, предусматривает возможность введения 32 разных кодонов в каждом положении и всех 20 аминокислот. Размер такой библиотеки теоретически возрастает на 32n для каждого количества n остатков. Однако в терминах практической реализуемости фаговое фенотипирование ограничено размером библиотеки образцов 109-1010 вариантов, что означает возможность целевого варьирования всего лишь 6-7 остатков, если в библиотеке должно быть обеспечено полное покрытие последовательности. Таким образом, можно применять полурациональные или «фокусированные» способы создания библиотек вариантов каркасов путем идентификации ключевых положений для варьирования и выбора соответствующего режима диверсификации. Термин «набор кодонов» относится к набору разных последовательностей триплетов нуклеотидов, используемых для кодирования желательного варианта аминокислоты. Стандартной формой обозначения кодонов является код IUB, известный специалистам в данной области и описанный в настоящем документе. Термин «нерандомизированный набор кодонов» относится к набору кодонов, кодирующему выбранные аминокислоты. Специалистам в данной области хорошо известен синтез олигонуклеотидов с выбранной «вырожденностью» нуклеотидов в определенных положениях, например, подход TRIM (Knappek et al.; J. Mol. Biol. (1999), 296:57-86); Garrard & Henner, Gene (1993), 128:103). Такие наборы нуклеотидов с определенными наборами кодонов можно синтезировать при помощи коммерчески доступных нуклеотидных или нуклеозидных реагентов и оборудования.
Набор кодонов представляет собой набор разных последовательностей триплетов нуклеотидов, используемых для кодирования желательного варианта аминокислот. Наборы кодонов можно представить с использованием символов для указания конкретных нуклеотидов или эквимолярных смесей нуклеотидов в соответствии со стандартным кодом IUB, как представлено ниже.
Коды IUB
G гуанин
A аденин
T тимин
C цитозин
R (A или G)
Y (C или T)
M (A или C)
K (G или T)
S (C или G)
W (A или T)
H (A или C или T)
B (C или G или T)
V (A или C или G)
D (A или G или T)
N (A или C или G или T)
Например, в наборе кодонов DVK символ D может означать нуклеотиды A или G или T; V может представлять собой A или G или C; а K может представлять собой G или T. Данный набор кодонов может представлять 18 разных кодонов и может кодировать аминокислоты Ala, Trp, Tyr, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly и Cys.
Сфокусированные (т.е. нерандомизированные) библиотеки можно сформировать с использованием кодонов NNK и фокусировки варьирования на выбранных остатках, или же, в альтернативном варианте осуществления, варианты с нерандомизированными заменами можно сформировать с использованием, например, кодонов DVK, которые кодируют 11 аминокислот (ACDEGKNRSYW) и один стоп-кодон. В альтернативном варианте осуществления для варьирования желательных остатков или участков полипептида можно использовать мутагенез по Кункелю (Kunkel et al., Methods Enzymol. 154: 367-382, 1987).
Для клонирования библиотек в вектор для экспрессии используют стандартные способы клонирования. Библиотеку можно экспрессировать с использованием известной системы, например, библиотеку можно экспрессировать в качестве слитых белков. Для фенотипирования слитых белков можно использовать поверхность любого пригодного фага. Хорошо известны способы фенотипирования слитых полипептидов, содержащих фрагменты антитела на поверхности бактериофага (патент США № US6969108, принадлежащий Griffith; патент США № US6172197 принадлежащий McCafferty; патент США № US5223409 принадлежащий Ladner; патент США № US6582915 принадлежащий Griffiths; патент США № US6472147 принадлежащий Janda). Библиотеки для выделения de novo полипептидов можно фенотипировать на pIX (международная заявка на патент № WO2009085462A1). Библиотеки также можно транслировать in vitro, например, с использованием рибосомного фенотипирования (Hanes and Pluckthun, Proc. Natl. Acad. Scie. USA, 94:4937, 1997), мРНК-фенотипирования (Roberts and Szostak, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12297, 1997), CIS-фенотипирования (Odegrip et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:2806, 2004) или других бесклеточных систем (патент США № US5643768, принадлежащий Kawasaki).
Библиотеки с диверсифицированными участками можно сформировать с использованием векторов, содержащих полинуклеотид, кодирующий последовательность Tencon (SEQ ID NO: 16), или его предварительно заданного мутанта. Конструкция матрицы может иметь промоторную и сигнальную последовательности для полипептидной цепи. Для получения библиотек каркасов применяют реакции мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, кодирующих петлевые участки (A:B, B:C, C:D, D:E, E:F и F:G) каркаса. Чтобы обеспечить включение всех выбранных положений в схему рандомизации, в каждый участок, планируемый для диверсификации, можно ввести стоп-кодон (такой как TAA). Будут получены только клоны, в которых произошла замена стоп-кодонов.
Модифицированные каркасные полипептиды
Модифицированные белковые каркасы и фрагменты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут содержать одну или более частей, ковалентно связанных напрямую или опосредованно с другим белком.
При добавлении пептидных остатков или создании встроенных слитых белков добавление таких остатков можно осуществлять с использованием рекомбинантных способов из полинуклеотидной последовательности, как описано в настоящем документе. При расширенном, присоединенном или конъюгированном пептиде, белке, органическом химическом фрагменте, неорганическом химическом фрагменте или атоме или любой их комбинации связывание дополнительного фрагмента с белковым каркасом или фрагментом, составляющим предмет настоящего изобретения, как правило, производится связью, отличной от пептидной. Модифицированные белковые каркасы, составляющие предмет настоящего изобретения, можно получить путем реакции белкового каркаса или фрагмента с модифицирующим агентом. Например, органические фрагменты могут быть связаны с белковым каркасом не сайтспецифическим способом с использованием реагирующего с аминогруппами модифицирующего агента, например, NHS-эфира ПЭГ. Модифицированные белковые каркасы и фрагменты, содержащие органическую часть, связанную со специфическими сайтами белкового каркаса, составляющего предмет настоящего изобретения, можно получить с использованием пригодных способов, таких как обратный протеолиз (Fisch et al., Bioconjugate Chem., 3:147-153 (1992); Werlen et al., Bioconjugate Chem., 5:411-417 (1994); Kumaran et al., Protein Sci. 6(10):2233-2241 (1997); Itoh et al., Bioorg. Chem., 24(1): 59-68 (1996); Capellas et al., Biotechnol. Bioeng., 56(4):456-463 (1997)), а также способов, описанных в публикации Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academic Press: San Diego, CA (1996).
Если к каркасному белку присоединить полимер или цепь, то они могут независимо представлять собой гидрофильную полимерную группу, остаток жирной кислоты или эфира жирной кислоты. Используемый в настоящем документе термин «жирная кислота» включает в себя одноосновные и двухосновные карбоновые кислоты. Используемый в настоящем документе термин «гидрофильная полимерная группа» обозначает органический полимер, обладающий более высокой растворимостью в воде, чем в октане. Например, полилизин более растворим в воде, чем в октане. Таким образом, белковый каркас, модифицированный путем ковалентного присоединения полилизина, входит в состав настоящего изобретения. Гидрофильные полимеры, которые можно использовать для модификации белковых каркасов, составляющих предмет настоящего изобретения, могут быть линейными или разветвленными и включают в себя, например, полиалкангликоли (например, ПЭГ, монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), ППГ и т.п.), углеводороды (например, декстран, целлюлозу, олигосахариды, полисахариды и т.п.), полимеры гидрофильных аминокислот (например, полилизин, полиаргинин, полиаспартат и т.п.), оксиды полиалканов (например, полиэтиленоксид, полипропиленоксид и т.п.) и поливинилпирролидон. Гидрофильный полимер, модифицирующий белковый каркас, составляющий предмет настоящего изобретения, в качестве отделенной молекулярной единицы предпочтительно имеет молекулярную массу от приблизительно 800 до приблизительно 150 000 дальтон. Например, можно использовать ПЭГ5000 и ПЭГ20 000, где нижний индекс означает среднюю молекулярную массу полимера в дальтонах. Гидрофильная полимерная группа может иметь от одного до приблизительно шести заместителей, выбираемых из алкилов, группы жирных кислот или группы эфиров жирных кислот. Гидрофильные полимеры, имеющие в качестве заместителей группу жирных кислот или группу эфиров жирных кислот, можно получить с применением пригодных способов. Например, полимер, содержащий аминогруппу, можно ввести в реакцию сочетания с карбоксилатом жирной кислоты или эфира жирной кислоты, а активированный карбоксилат (например, активированный N,N-карбонилдиимидазолом) жирной кислоты или эфира жирной кислоты можно ввести в реакцию сочетания с гидроксильной группой полимера.
Жирные кислоты и эфиры жирных кислот, которые можно использовать для модификации белковых каркасов, составляющих предмет настоящего изобретения, могут быть насыщенными или могут содержать одну или более единицы ненасыщенных связей. Жирные кислоты, которые можно использовать для модификации белковых каркасов, составляющих предмет настоящего изобретения, включают в себя, например, н-додеканоат (C12, лаурат), н-тетрадеканоат (C14, миристат), н-октадеканоат (C18, стеарат), н-эйкозаноат (C20, арахидат), н-докозаноат (C22, бегенат), н-триаконтаноат (C30), н-тетраконтаноат (C40), цис-Δ9-октадеканоат (C18, олеат), полностью цис-Δ5,8,11,14-эйкозатетраэноат (С20, арахидонат), октандикарбоновую кислоту, тетрадекандикарбоновую кислоту, октадекандикарбоновую кислоту, докозандикарбоновую кислоту и т.п. Пригодные эфиры жирных кислот включают в себя моноэфиры дикарбоновых кислот, содержащие линейную или разветвленную группу низшего алкила. Группа низшего алкила может содержать от одного до приблизительно двенадцати, предпочтительно от одного до приблизительно шести, атомов углерода.
Функциональность Fc-содержащих белков можно сравнивать при помощи нескольких хорошо известных анализов in vitro. В частности, представляет интерес аффинность к членам семейства FcγRI, FcγRII и FcγRIII рецепторов Fcγ. Данные измерения можно производить с использованием рекомбинантных растворимых форм рецепторов или клеточноассоциированных форм рецепторов. Кроме того, можно измерять аффинность к FcRn, рецептору, ответственному за увеличенный период полужизни IgG, например, при помощи BIAcore с использованием рекомбинантного растворимого FcRn. Функциональные клеточные анализы, такие как анализы ADCC и CDC, дают представление о вероятных функциональных последствиях конкретных вариантных структур. В одном варианте осуществления анализ ADCC проводят таким образом, чтобы основной клеткой-эффектором были клетки NK, отражая тем самым функциональные эффекты на рецептор FcγRIIIA. Для сравнения иммунных эффекторных функций разных вариантов также можно использовать анализ фагоцитоза, а также анализы, измеряющие клеточные реакции, такие как выброс супероксида или медиатора воспаления. Также можно использовать модели in vivo, например, при использовании вариантов анти-CD3 антител для измерения активации T-клеток у мышей - активности, которая зависит от связывания доменов Fc со специфическими лигандами, такими как рецепторы Fcγ.
Выбор или конструирование клеток-хозяев
Как описано в настоящем документе, клетка-хозяин, выбранная для экпрессирования каркасного белка, оказывает значительное влияние на конечную композицию, включая без ограничений вариацию в наборе окружающих белок фрагментов олигосахаридов, если последние желательны, например, в домене CH2 иммуноглобулина, если он присутствует в молекуле. Таким образом, один аспект настоящего изобретения включает в себя выбор соответствующих клеток-хозяев для использования в качестве и/или создания на ее основе производящей клетки, экспрессирующей желаемый терапевтический белок.
Дополнительно клетка-хозяин может происходить от млекопитающего или быть выбрана из клеток COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, СНО, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, клеток миеломы, лимфомы, дрожжей, насекомых или растений или любых их производных, иммортализованных или трансформированных клеток.
В альтернативном варианте осуществления клетку-хозяина можно выбрать из клеток видов или организмов, неспособных гликозилировать полипептиды, например, прокариотических клеток или организмов, таких как природные или сконструированные бактерии E. coli, Klebsiella или Pseudomonas.
Выбор связывающих доменов
Полипептиды или гибридные белки или их компоненты и домены можно получить из библиотек таких доменов или компонентов, например, библиотеки фагов. Библиотеку фагов можно создать при помощи вставки библиотеки случайных олигонуклеотидов или библиотеки полинуклеотидов, содержащих представляющие интерес последовательности, такие как домены антитела из B-клеток иммунизированного животного или человека (Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317). Библиотеки фагов антител содержат пары вариабельных участков тяжелой (H) и легкой (L) цепей в одном фаге, что позволяет экспрессировать фрагменты Fv с одной цепью или фрагменты Fab (Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8). Разнообразие фагемидной библиотеки можно адаптировать для повышения и/или изменения специфичностей полипептидов библиотеки для получения и последующей идентификации дополнительных желательных характеристик молекул и кодирующих их полинуклеотидов.
Другие библиотеки связывающих компонентов-мишеней, которые могут включать в себя участки, отличные от вариабельных участков антитела, представляют собой рибосомное фенотипирование, CIS-фенотипирование, дрожжевое фенотипирование, бактериальное фенотипирование и фенотипирование клеток млекопитающих. Рибосомное фенотипирование представляет собой способ трансляции мРНК в соответствующие белки с сохранением белка прикрепленным к РНК. Кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты определяют методом ОТ-ПЦР (Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022). CIS-фенотипирование представляет собой альтернативный способ фенотипирования in vitro, в котором библиотека конструируется в виде белка, слитого с RepA. В ходе трансляции in vitro RepA связывается в цис-положении с ДНК, из которой он был получен, обеспечивая прямую связь между гентипом и фенотипом (Odegrip et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 101:2806, 2004). Дрожжевое фенотипирование основано на конструировании слитых белков связанного с мембраной альфа-агглютининового рецептора связывания дрожжей, aga1 и aga2, части системы типа спаривания (Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7). Бактериальное фенотипирование основано на слиянии мишени с экспортированными бактериальными белками, которые связываются с клеточной мембраной или стенкой клетки (Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503). Аналогичным образом, системы фенотипирования млекопитающих основаны на создании слитого белка из содержащего случайные последовательности полипептида и секретируемого якорного белка на мембране.
Области применения каркасных молекул
Композиции с использованием каркасных молекул, описанных в настоящем документе и образованных любым из описанных выше способов, можно применять для диагностики, мониторинга, модуляции, лечения, облегчения течения, профилактики или снижения симптомов болезней человека или специфических патологий клеток, тканей, органов, жидкостей или всего организма-хозяина. Сконструированную с конкретной целью каркасную молекулу можно применять для лечения иммуноопосредованного или иммунодефицитного заболевания, расстройства метаболизма, сердечнососудистого расстройства или заболевания; злокачественного заболевания; неврологического расстройства или заболевания; инфекции, такой как бактериальная, вирусная или паразитическая инфекция; или других известных или указанных связанных состояний, включая отеки, боль и некроз или фиброз тканей.
Такой способ может включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один каркасный белок, в клетку, ткань, орган, организм животного или пациента, которым требуется такое модулирование, лечение, облегчение, профилактика или сокращение симптомов, эффектов либо механизмов. Эффективное количество может составлять от приблизительно 0,001 до 500 мг/кг для однократного (например, болюсного), многократного или непрерывно введения, либо достигать сывороточной концентрации 0,01-5000 мкг/мл при однократном, многократном или непрерывном введении, либо может находиться в любом эффективном диапазоне или иметь эффективное значение в таком диапазоне, установленном или определенном известными способами, как описано в настоящем документе или известно специалистам в данной области.
Композиции, содержащие каркасные белки
Связывающиеся с мишенями каркасные белки, которые являются модифицированными или немодифицированными, одновалентными, би- или поливалентными, а также моно-, би- или мультинаправленными, можно выделить с использованием хорошо известных специалистам в данной области процедур разделения для захвата, иммобилизации, разделения или осаждения и очистить до такой степени, которая необходима для возможности коммерческого применения.
Для терапевтического применения каркасные белки можно вводить в состав композиции для соответствующего способа введения, включая без ограничений средства для парентерального, подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрисуставного, внутрибронхиального, внутрибрюшного, внутрикапсульного, внутрихрящевого, внутриполостного, внутриклеточного, внутримозжечкового, внутрицеребровентрикулярного, внутрикишечного, внутрицервикального, внутрижелудочного, внутрипеченочного, внутримиокардиального, внутрикостного, внутритазового, внутриперикардиального, внутрибрюшинного, внутриплеврального, внутрипредстательного, внутрилегочного, внутриректального, внутрипочечного, внутрисетчаточного, внутрипозвоночного, внутрисуставного, внутригрудного, внутриматочного, внутрипузырного, внутриочагового, болюсного, вагинального, ректального, буккального, сублингвального, интраназального или трансдермального способов введения. По меньшей мере одну композицию с каркасным белком можно получить для использования в форме таблеток или капсул; порошков, капель в нос или аэрозолей; геля, мази, лосьона, суспензии или ввести систему доставки на основе терапевтической повязки или «пластыря», как известно специалистам в данной области. Настоящее изобретение представляет стабильные композиции каркасных белков, которые предпочтительно представляют собой водный раствор на основе фосфатного буферного раствора или смешанного солевого раствора, а также растворы и композиции с консервантами, композиции с консервантами для многоразового использования, которые можно использовать в фармацевтических или ветеринарных целях, содержащие по меньшей мере один каркасный белок в фармацевтически приемлемой композиции. Пригодные для целей настоящего изобретения несущие среды и их композиция с возможностью введения других белков человека, например, сывороточный альбумин человека, описаны, например, в публикации Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21-е издание, под ред. Troy, D.B., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, часть 5, Pharmaceutical Manufacturing стр. 691-1092, см. особенно стр. 958-989.
Композиции можно использовать совместно или в составе одной рецептуры с другими активными компонентами, известными своими благоприятными характеристиками для лечения указанных расстройств, состояний или заболеваний, или тестировать путем получения комбинаций каркасных белков с новыми композициями и активными компонентами.
Хотя настоящее изобретение выше было описано в общих чертах, варианты осуществления настоящего изобретения будут дополнительно описаны в следующих примерах, которые никоим образом не ограничивают действия пунктов формулы изобретения.
ПРИМЕР 1. СОЗДАНИЕ ВАРИАНТОВ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ Fc
Конструкция Tencon
Третий домен FN3 тенасцина человека (SEQ ID NO: 3) можно использовать в качестве альтернативного каркаса, сконструированного со способностью связываться со специфическими молекулами-мишенями через поверхностные петли, структурно аналогичные определяющим комплементальность участкам (CDR) антител. Температура плавления данного домена в нативной форме в PBS составляет 54°С. Для получения каркасной молекулы с подобной структурой и улучшенными физическими характеристиками, например, улучшенной термостабильностью, сконструировали консенсусную последовательность на основе сопоставления 15 доменов FN3 тенасцина человека (SEQ ID NO: 1-15).
Результаты анализа множественного выравнивания последовательностей, приведенные в таблице 1, показывают, что данные 15 доменов имеют степень идентичности последовательностей друг друга в диапазоне от 13 до 80% со средней степенью идентичности последовательностей в парах 29%. Сконструировали консенсусную последовательность (SEQ ID NO: 16) путем включения наиболее сохраняемых (часто встречаемых) аминокислот в каждом положении из выравниваний, представленных в таблице 1. В попарных выравниваниях консенсусная последовательность, составляющая предмет настоящего изобретения (SEQ ID NO: 16), получившая название Tencon, идентична доменам FN3 тенасцина в 34-59% положений, при этом средняя степень идентичности последовательностей составляет 43%.
Экспрессия и очистка белка
Аминокислотную последовательность Tencon (SEQ ID NO: 16) подвергали обратной трансляции, получив последовательность ДНК, показанную в последовательности SEQ ID NO: 17. Данную последовательность конструировали при помощи ПЦР с перекрывающимися праймерами, субклонировали в модифицированный вектор pET15, трансформировали в BL21Star(DE3) E. coli (Invitrogen) и наносили на агаровые пластины (LB), содержащие 75 мкг/мл карбенициллина. Одну колонию выбирали и оставляли на ночь для выращивания при 37°C в 50 мл среды TB, содержащей 2% глюкозы и 100 мкг/мл карбенициллина. Данную культуру использовали для посева в 500 мл аутоиндукционной среды (среда Overnight Express Instant TB, Novagen) в колбе Ultra Yield объемом 2,5 л (Thomson Instrument Company). Рост и экспрессию осуществляли с использованием двухстадийной программы (3 часа при температуре 37°C, 300 об/мин и последующей инкубации 16 часов при температуре 30°C, 250 об/мин) в инкубаторе ATR Multitron с качающейся платформой.
Культуру собирали и центрифугировали в роторе JL8.1 при 7 000 об/мин в течение 15 минут для осаждения клеток. Клетки повторно растворяли в 30 мл буферного раствора, содержащего 20 мМ фосфата натрия, pH 7,5, 500 мМ NaCl, 10% глицерина, 20 мМ имидазола, 0,37 мг/мл лизоцима, 1X ингибитора протеаз, не содержащего ЭДТА (Roche), и бензоназу (Sigma-Aldrich, конечная концентрация 0,25 мкл/мл) и лизировали при помощи соникатора Misonix XL2020 в течение 5 минут на льду в импульсном режиме (включение в течение 5 секунд, выключение в течение 30 секунд). Нерастворимый материал удаляли при помощи центрифугирования в роторе JA-17 при 17 000 об/мин в течение 30 минут.
Белок Tencon отделяли от растворимого лизата с помощью двухстадийного хроматографического процесса. Сначала белок захватывали путем аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных металлов при добавлении к лизату 2 мл Ni-NTA агарозных частиц (Qiagen) и инкубировании смеси на качающейся платформе в течение 1 часа при температуре 4°C. Затем смолу помещали в колонку Poly-Prep (Bio-Rad) и промывали раствором 20 мМ фосфата натрия, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 20 мМ имидазола для удаления несвязанного материала. Белки элюировали из смолы при помощи раствора 20 мМ фосфата натрия, рН 7,5 500 мМ NaCl, 10% глицерина и 500 мМ имидазола. Фракции анализировали при помощи ДСН-ПААГ, включая окрашивание Кумасси и вестерн-блоттинг с использованием конъюгированных с пероксидазой хрена антител к гистамину (Immunology Consultants Laboratory). Желательные фракции объединяли и диализовали в PBS при рН 7,4. На второй стадии очистки белок загружали в колонку Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare), уравновешенную в PBS. Фракции анализировали при помощи ДСН-ПААГ, а фракции, содержащие Tencon, объединяли и концентрировали в концентраторе Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon).
Концентрацию белка определяли при помощи спектрофотометра вертикального сканирования BioTek для измерения оптической плотности образца на 280 нм. Конечный препарат анализировали путем окрашивания Кумасси (фигура 1), вестерн-блоттинга с использованием антител к гистамину и при помощи гель-проникающей ВЭЖХ в колонке G3000SW-XL (TOSOH Biosciences), уравновешенной в PBS. Анализ ДСН-ПААГ показывает, что масса Tencon варьируется от 6 до 14 кДа, что соответствует ожидаемой массе 10,7 кДа для мономерного белка. Выход чистого белка Tencon составил >50 мг чистого белка на литр культуры.
Биофизическая характеризация
Структуру и стабильность Tencon характеризовали при помощи спектроскопии кругового дихроизма и дифференциальной сканирующей калориметрии соответственно. Измерения кругового дихроизма проводили на спектрометре AVIV при температуре 20°C в PBS и в концентрации 0,2 мг/мл. Спектр на фигуре 8 имеет минимум при 218 нм, что свидетельствует о структуре типа бета-листа, ожидаемой для белка, принадлежащего семейству FN3. Данные ДСК получены путем нагрева 0,5 мг/мл растворов третьего домена FN3 из тенасцина или Tencon в PBS с 35°C до 95°C со скоростью 1°C/минута в калориметре N-DSCII (Applied Thermodynamics). Сначала из экспериментальных кривых вычитали кривую для контрольного образца чистого буферного раствора для получения профилей, представленных на фигуре 3. Исходя из указанных данных, с помощью программного обеспечения CpCalc (Applied Thermodynamics) рассчитывали температуры плавления 54°C и 78°С для 3-го домена FN3 и Tencon соответственно. Сворачивание и разворачивание обоих доменов при данных температурах является обратимым.
Анализ иммуногенности
Для сравнения предполагаемой иммуногенности последовательностей аминокислот, представляющих 3-й домен FN3 тенасцина человека, Tencon и несколько терапевтических антител (см. таблицу 2), использовали компьютерную программу, моделирующую иммуногенность человека к последовательностям аминокислот. После анализа химерных моноклональных антител (mAb) и моноклонального антитела (адалимумаба) человека в программе применили порог толерантности (удалив 9-мерные пептиды, на 100% идентичные последовательности, кодируемой зародышевой линией человека). К тенасцину или Tencon порог толерантности не применяли. Порог толерантности предполагает широкую толерантность Т-клеток к последовательностям моноклональных антител, кодируемым зародышевой линией, и позволяет сосредоточить внимание на анализе новой последовательности преимущественно в CDR и фланкирующих доменах.
Результаты данных анализов позволяют предположить низкий иммуногенный риск для тенасцина и Tencon, основанный на вероятности того, что 9-мерный пептид, полученный из проанализированной последовательности, свяжется с одной или более молекулами HLA. Оценка является взвешенной по распространенности каждого аллеля HLA. Оценки для моделей были суммированы для каждой последовательности для получения одного числа, описывающего общий предполагаемый иммуногенный риск каждой последовательности (суммарную оценку). Результаты данного анализа приведены в таблице 2. Тенасцин получил наименьшую общую оценку (11,9). Tencon, как и тенасцин, заработал баллы преимущественно за несвязующие вещества и агретопы с низким предполагаемым иммуногенным риском (оценка = 13,2). Оценки последовательностей тенасцина и Tencon оказались лучше оценок терапевтических антител.
Фенотипирование Tencon на фаге M13 путем слияния с pIX
Ген, кодирующий последовательность аминокислот Tencon, субклонировали в экспрессионный вектор-фагмид pPep9 при помощи ПЦР и рестрикционного клонирования с частичным расщеплением, получив вектор pTencon-pIX. Данная система экспрессирует N-терминально Myc-меченый Tencon как результат слияния C-конца с N-концом белка M13 pIX (фигура 4). Промотор Lac обеспечивает более низкий уровень экспрессии без IPTG и повышенный уровень экспрессии после добавления IPTG. К N-концу Tencon добавляли сигнальную последовательность OmpA, чтобы способствовать эффективной транслокации в периплазму. Между Tencon и pIX конструировали короткий линкер TSGGGGS (SEQ ID NO: 141) для предотвращения стерических взаимодействий между данными белками.
Чтобы подтвердить присутствие на поверхности фаговых частиц М13, pTencon-pIX трансформировали в XL1-Blue E. coli и одну колонию использовали для посева в 5 мл культуры LB с добавлением ампициллина. Данную культуру выращивали при температуре 37°С до достижения середины логарифмического роста, затем добавляли 610 БОЕ фага-помощника VCSM13 и инкубировали культуру при температуре 37°С в течение 10 минут без встряхивания, затем 50 минут со встряхиванием. Сохраненную фагом-помощником культуру затем разбавляли в 50 мл среды 2YT с добавлением ампициллина и канамицина и выращивали при температуре 37°C с встряхиванием до получения ОП600 0,7, затем добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ и снижали температуру до 30°C. Спустя 16 часов культуру центрифугировали при ускорении 4 000×g в течение 20 минут, затем собирали супернатант и помещали его на хранение при температуре 4°С для анализа.
Чтобы подтвердить присутствие Myc-Tencon на поверхности фага М13, использовали связывание фаговых частиц с антителом анти-Myc (Invitrogen). Планшет Maxisorp на ночь покрывали антителом анти-Myc или анти-αv (отрицательный контроль) при концентрации 2,5 мкг/мл и блокировали при помощи SuperBlock T20 (Pierce). Описанный выше супернатант фагмидной культуры дважды последовательно разбавляли в PBS и добавляли в лунки планшета с нанесенным покрытием. Через 1 час планшет промывали TBST, в каждую лунку добавляли антитело анти-M13 HRP и после инкубации в течение 1 часа промывали TBST. Добавляли субстрат Roche BD ELISA POD и измеряли интенсивность люминесценции при помощи спектрофотометра для прочтения планшетов (Tecan). На фигуре 5 представлено, что фаговые частицы Myc-Tencon концентрационнозависимо связываются с анти-myc, но не с теми лунками планшета, которые были покрыты антителами анти-αv, или с непокрытыми контрольными лунками, что подтверждает специфическое фенотипирование Myc-Tencon на фаговой частице M13.
Можно сконструировать дополнительный вектор-фагмид для фенотипирования Tencon и элементов библиотеки (см. пример 2) на фаге M13 в виде слияний с покрывающим белком pIII. В данной системе ген pIX заменяется геном, кодирующим усеченную версию pIII . Дополнительные изменения по сравнению с системой, представленной на фигуре 4, включают в себя замену сигнальной последовательности OmpA сигнальной последовательностью DsbA, поскольку известно, что секреция с использованием данной последовательности благоприятна для подтверждения присутствия стабильных альтернативных каркасных молекул (Steiner et al. 2006).
ПРИМЕР 2. Образование библиотек Tencon
Библиотеки вариантов Tencon можно получить множеством разных способов в зависимости от желательной сложности и относительного расположения мутаций в молекуле. Для создания мутаций, рассеянных по гену Tencon, предпочтительны методы синтеза ДНК. Также возможно использование клонирования при помощи рестрикционных ферментов для рекомбинирования фрагментов ДНК, содержащих мутации в разных участках гена. Насыщающий мутагенез в узком участке, таком как одна петля Tencon, можно ввести методом направленного мутагенеза с использованием вырожденных олигонуклеотидов и олигонуклеотиднаправленного мутагенеза (Kunkel et
Создали библиотеку Tencon, библиотеку FG7, предназначенную для замены петли FG на 7 случайных аминокислот при помощи олигонуклеотиднаправленного мутагенеза. Синтезировали олигонуклеотид (TconFG7-For-5'pho) с вырожденной последовательностью NNS с 21 парой оснований (п.о.) в положениях, кодирующих петлю FG, и двумя фланкирующими последовательностями нуклеотидов с 20-27 п.о., комплементарных кодирующей последовательности Tencon. При данной конструкции в петле FG можно представить все двадцать аминокислот. Расчетное разнообразие на уровне нуклеотидов составляет 1,3×109.
TconFG7-For5'pho: (SEQ ID NO: 18)
Матрицу для олигонуклеотиднаправленного мутагенеза, pDsbA-Tencon-Asc-loop-Myc-pIII, сконструировали путем замены последовательности, кодирующей петлю F:G Tencon, на последовательность типа «стебель-петля», содержащую сайт рестрикции AscI. Данная система допускает элиминирование фоновой матрицы ДНК после мутагенеза за счет расщепления полученной ДНК с помощью AscI перед трансформацией. Для очистки одноцепочечной матрицы ДНК для мутагенеза одну колонию E. coli CJ236, содержащую pDsbA-Tencon-Asc-loop-Myc-pIII, помещали в 5 мл питательной среды 2YT с карбенициллином (50 мкг/мл конечной концентрации) и хлорамфениколом (10 мкг/мл). Спустя 6 часов добавляли фаг-помощник VCSM13 до конечной концентрации 1010 БОЕ/мл и инкубировали без встряхивания в течение 10 минут, затем переносили в 150 мл среды 2YT с карбенициллином (10 мкг/мл) и уридином (0,25 мкг/мл) и инкубировали на ночь при температуре 37°C со встряхиванием при 200 об/мин. Клетки осаждали центрифугированием, супернатант собирали и фаг осаждали при помощи ПЭГа NaCl. Одноцепочечную ДНК получали из данного осадка при помощи набора QIAprep Spin M13 (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя.
Чтобы ренатурировать вырожденный олигонуклеотид с матрицей, 5 мкг матрицы ДНК соединяли с олигонуклеотидом TconFG7-For-5-pho с молярным отношением 10:1 в трис-HCl (50 мМ, pH 7,5) и MgCl2 (10 мМ) и инкубировали при температуре 90°C в течение 2 минут, 60°C - в течение 3 минут, а также 20°C - в течение 5 минут. После реакции ренатурирования в реакционную смесь добавляли ATP (10 мМ), dNTP (25 мМ каждый), DTT (100 мМ), T4-лигазу (7 единиц) и T7-ДНК-полимеразу (10 единиц) и инкубировали при температуре 14°C в течение 6 часов, затем при 20°C в течение 12 часов. Полученную ДНК очищали при помощи набора для очистки ПЦР (Qiagen) и восстанавливали в 100 мкл воды. Библиотеку ДНК расщепляли при помощи 10 единиц AscI в течение 4 часов, затем снова очищали при помощи набора для очистки ПЦР (Qiagen). Конечную библиотеку ДНК восстанавливали в 50 мкл воды. Полученную двухцепочечную ДНК трансформировали в E. coli MC1061F' электропорацией.
Продукты трансформации собирали в 20 мл среды SOC и оставляли восстанавливаться на 1 час при температуре 37°C. В конце восстановления аликвот трансформации последовательно разбавляли и наносили на пластины с карбенициллином (100 мкг/мл), содержащие 1% глюкозы, для оценки общего количества продуктов трансформации. Оставшуюся культуру SOC затем использовали для посева в 1 л среды 2xYT с карбенициллином и 1% глюкозы, которую выращивали до достижения значения ОП600 0,6. В 100 мл данной культуры сеяли фаг-помощник M13 до 1010/мл и инкубировали при температуре 37°C, затем центрифугировали. Полученный клеточный осадок повторно растворяли в 500 мл свежей среды 2xYT, содержащей карбенициллин (100 мкг/мл) и канамицин (35 мкг/мл), и оставляли на ночь для выращивания при температуре 30°C, затем центрифугировали. Фаговые частицы осаждали добавлением ПЭГ/NaCl и помещали на хранение при температуре -80°C.
Вторая библиотека, BC6/FG7, предназначалась для внесения разнообразия одновременно в петлях B:C и F:G Tencon. Для этого синтезировали два олигонуклеотида, TC-BC6-For-5'phos и POP149. Начальный олигонуклеотид был фосфорилирован и содержал 18 оснований кодона NNS в каждом положении, кодирующем петлю B:C, в то время как конечный олигонуклеотид был биотинилирован на 5'-конце и содержал 21 основание кодона NNS в каждом положении, кодирующем петлю F:G. Оба олигонуклеотида фланкируются двумя последовательностями нуклеотидов с 18 п.о., идентичными участку, идущему до и после участка, который подвергается мутагенезу (см. ниже описание праймера).
Tc-BC6-For-5'phos: (SEQ ID NO: 19)
POP 2149: (SEQ ID NO: 20)
Для конструирования библиотеки проводили шестнадцать реакций ПЦР объемом 100 мкл с использованием т-олигонуклеотидов Tc-CB6-For5'phos и POP2149 для амплификации матрицы ДНК Tencon, при этом одновременно вводили кодоны NNS в петли B:C и F:G. Двухцепочечный продукт ПЦР мешали с магнитными частицами, покрытыми стрептавидином (Dynal), в буферном растворе B&W (10 мМ трис-HCl, pH 7,5, 1 мМ ЭДТА, 2М NaCl, 0,1% Tween-20), инкубировали в течение 20 минут, отделяли при помощи магнитного поля и дважды промывали буферным раствором B&W. Начальную цепь элюировали из частиц при помощи 300 мкл 150 мМ NaOH. Данный «мегапраймер», смесь длинных праймеров с теоретическим разнообразием свыше 8×1016, использовали для ренатурирования с матрицей одноцепочечной библиотеки. Библиотеку конструировали по аналогии с описанной выше библиотекой FG7.
ПРИМЕР 3. Выбор связующих с IgG веществ
Для селекции элементов библиотеки Tencon, связывающихся с IgG, рекомбинантный IgG (подтип IgG1 человека) биотинилировали при помощи сульфо-NHS-LC-биотина (Pierce), а затем диализовали в PBS. Для селекции 200 мкл библиотек FG7 или BC6/FG7 на фаговом дисплее блокировали 200 мкл Chemiblocker, затем добавляли биотинилированный IgG в концентрациях 500 нМ (цикл 1) или 100 нМ (циклы 2 и 3). Связанные фаги восстанавливали магнитными частицами, покрытыми нейтравидином (Seradyne), в цикле 1 или магнитными частицами, покрытыми стрептавидином (Promega), в циклах 2 и 3. Несвязанные фаги удаляли с частиц путем 5-10 промывок 1 мл трис-буферного физиологического раствора с Tween (TBST), затем 2 раза по 1 мл трис-буферного физиологического раствора (TBS). Связанные фаги элюировали с частиц добавлением клеток E. coli MC1061F', находящихся в середине логарифмического роста. Инфицированные клетки наносили на планшеты с агаром LB с добавлением карбенициллина и глюкозы. На следующий день клетки соскребали с планшетов и выращивали до середины логарифмического роста, затем восстанавливали при помощи фага-помощника VCSM13 и оставляли на ночь для выращивания. Фаговые частицы выделяли осаждением ПЭГ/NaCl и использовали при следующем цикле селекции.
После 3 циклов пэннинга относительно IgG полученный продукт субклонировали в вектор pET27, модифицированный для включения лигаза-независимого сайта клонирования, путем ПЦР-амплификации гена Tencon. Данный продукт ПЦР ренатурировали с вектором и трансформировали в клетки BL21-GOLD(DE3) (Stratagene). Отдельные колонии собирали в культуры по 1 мл на 96-луночных планшетах с глубокими лунками (Corning) и оставляли на ночь для выращивания до насыщения при температуре 37°C. На следующий день 50 мкл ночной культуры использовали для посева 1 мл свежей культуры. Культуры выращивали при температуре 37°С в течение 2 часов, затем добавляли IPTG до 1 мМ и понижали температуру до 30°C. Клетки собирали центрифугированием спустя 16 часов после индукции и лизировали с 100 мкл BugBuster (Novagen). Полученные лизаты осветляли центрифугированием и использовали для тестирования связывания с IgG методом ИФА.
Планшеты Maxisorp (Nunc) на ночь покрывали 0,1 мкг анти-HIS антитела (Qiagen), промывали TBST и блокировали реагентом Starting Block T20 (Thermo Scientific). На планшеты добавляли осветленные лизаты, разведенные в соотношении 1:4 со Starting Block, и оставляли на 1 час для связывания, затем промывали TBST. Добавляли биотинилированный IgG или биотинилированный HSA в концентрации 1 мкг/мл и промывали TBST после инкубации в течение 1 часа. Детекцию связанного IgG или HSA осуществляли добавлением стрептавидин-HRP (Jackson Immunoresearch) и детектировали с использованием хемилюминесцентного субстрата POD. Результаты ИФА представлены на фигуре 7. Конструкции, связавшие биотинилированный IgG более чем в 10 раз больше, чем биотинилированный HSA согласно сигналу ИФА, секвенировали. После проведения нескольких экспериментов по селекции получили 60 индивидуальных связывающих последовательностей из библиотеки FG7 и 10 индивидуальных последовательностей из библиотеки BC6FG7. В таблице 4 представлены представительные последовательности связующих с IgG веществ, в которых петли B:C и/или F:G показаны в той мере, в которой они отличаются от петель последовательности SEQ ID NO:16. В таблице 4 также представлены многочисленные мутации в других участках каркаса.
Термостабильность сконструированного, экспрессированного и очищенного белка Tencon на 26°C лучше данного показателя у 3-го домена FN3 тенасцина человека, который использовали в качестве альтернативной каркасной молекулы. На основании данного повышения стабильности можно ожидать, что данная каркасная молекула будет более удобна для аминокислотной замены и проще в изготовлении. С повышением стабильности каркаса ожидается улучшение порога толерантности к мутациям, уменьшающим стабильность белка, таким образом, каркас с повышенной стабильностью, вероятно, обеспечит получение более функциональных, хорошо уложенных связующих веществ из библиотеки вариантов каркаса.
Таблица 2 | ||||||
Последова-тельность | Описание | Сумма 1-й оценки | Сумма 2-й оценки | Сумма оценки (цепь) | Сумма оценки (молекула) | |
Тенасцин | Альт. каркас | 6,01 | 5,85 | 11,86 | 11,86 | |
Tencon | Альт. каркас | 5,83 | 7,37 | 13,20 | 13,20 | |
Адалимумаб | Vh | Гуманизированное mAb | 9,45 | 8,06 | 17,50 | 45,42 |
Vl | 15,29 | 12,63 | 27,92 | |||
Цетуксимаб | Vh | Химерное mAb | 17,63 | 16,89 | 34,52 | 64,44 |
Vl | 14,45 | 15,47 | 29,92 | |||
Ритуксимаб | Vh | Химерное mAb | 16,57 | 14,38 | 30,96 | 61,65 |
Vl | 16,63 | 14,06 | 30,69 | |||
Базиликсимаб | Vh | Химерное mAb | 16,48 | 13,40 | 29,89 | 58,98 |
Vl | 16,05 | 13,05 | 29,09 |
Таблица 3 Петли |
||
Петля | Остатки SEQ ID NO: 16 | Последовательность аминокислот |
A-B | 13-16 | TEDS |
B-C | 22-28 | TAPDAAF |
C-D | 38-43 | SEKVGE |
D-E | 51-54 | GSER |
E-F | 60-64 | GLKPG |
F-G | 75-81 | KGGHRSN |
Таблица 4 Каркасы, связывающиеся с IgG |
|||
№ клона | Петля B:C Остатки 22-28 (SEQ ID NO) |
Петля F:G Остатки 75-81 (SEQ ID NO) |
Мутации каркаса |
1 | SYGFNN (21) | QIGPIIP (46) | |
2 | TYEGES (22) | QIGPIIP (46) | |
3 | TYESES (23) | QIGPIIP (46) | |
4 | TNWMDS (24) | SIRTIDS (47) | |
5 | KSVFIM (25) | PKFHSPL (48) | |
6 | YSSYAT (26) | WKTTIWF (49) | |
7 | RFHPFP (27) | RKNWKTR (50) | |
8 | MMCMPL (28) | RLFRIYQ (51) | |
9 | YCRVRD (29) | WLSRSYD (52) | |
10 | SYGFNN (21) | WLSRSYD (52) | |
11 | MDCFMG (30) | WLSRSCD (53) | |
12 | TYRFNS (31) | WMGPYCD (54) | |
13 | ASRRSL (32) | RRRRYSF (55) | |
14 | TIESES (33) | HIVPMVP (56) | |
15 | TL*MQS (34) | QIEPIIR (57) | |
16 | IYDSES (35) | PSAANNP (58) | |
17 | VRLRYVQ (59) | ||
18 | QVGPLIP (60) | ||
19 | RIGPILP (61) | ||
20 | QIGPLLP (62) | ||
21 | RIGPLLP (63) | ||
22 | QVGPLLP (64) | ||
23 | RIGPMLP (65) | ||
24 | QIGPVLP (66) | ||
25 | RIGPVLP (67) | ||
26 | QIGPMMP (68) | ||
27 | QVGPLVP (69) | ||
28 | QIGPMLP (70) | R18P | |
29 | QVGPILP (71) | ||
30 | QVGPLLP (64) | ||
31 | QVGPMLP (72) | ||
32 | QIGPIVP (73) | I33V | |
33 | MIGPLLP (74) | ||
34 | QIGPLFP (75) | ||
35 | QIGPVLP (66) | T59A | |
36 | QIGPMVP (76) | ||
37 | QIGPIVP (77) | ||
38 | RIEPILP (78) | V74G | |
39 | VAGSVWP (79) | ||
40 | REGATLY (80) | ||
41 | KQIPPIL (81) | S38G | |
42 | LSLSSVL (82) | ||
43 | HMLLPLP (83) | V74A | |
44 | MIGPLIP (84) | ||
45 | TIGPHIP (85) | ||
46 | EIGPCLP (86) | ||
47 | EIGPVLP (87) | ||
48 | KIGPCLP (88) | Y35H | |
49 | MIGPVLP (89) | ||
50 | QIGPILP (90) | S52P | |
51 | QIGPILP (90) | Q36R | |
52 | QIGPILP (90) | ||
53 | EVGPILP (91) | ||
54 | QVGPLLP (92) | A23T | |
55 | QIGPVMP (93) | ||
56 | QIGPCVP (94) | ||
57 | QIGPLVP (95) | ||
58 | RGLVMPM (96) | V74A | |
59 | MIGPILP (97) | ||
60 | QIGPILP (90) | E37G | |
61 | QIGPILP (90) | T68A | |
62 | QIGPILP (90) | T22I | |
63 | QIGPILP (90) | S52F | |
64 | QIGPILP (90) | Y56H | |
65 | QIGPILP (90) | A44V | |
66 | QIGPILP (90) | P24S | |
67 | RIGPILP (61) | ||
68 | CIGPMVP (98) | ||
69 | FIGPVLP (99) | ||
70 | HIGPILP (100) | ||
71 | HIGPIMP (101) | ||
72 | HIGPYLP (102) | ||
73 | HVGPILP (103) | ||
74 | IIGPLLP (104) | ||
75 | LIGPLLP (105) | ||
76 | MVGPLLP (106) | ||
77 | NIGPYLP (107) | ||
78 | NIGPYLP (108) | ||
79 | QIGPHLP (109) | ||
80 | QIGPIIP (46) | ||
82 | QIGPILG (110) | ||
83 | QIGPILS (111) | ||
83 | QIGPILT (112) | ||
84 | QIGPIMP (113) | ||
85 | QIGPIPI (114) | ||
86 | QIGPLLN (115) | ||
87 | QIGPLLP (62) | ||
88 | QIGPVFP (116) | ||
89 | QIGPVLS (117) | ||
90 | QIGPWLP (118) | ||
92 | QVGPILP (71) | ||
93 | QVGPILR (118) | ||
94 | QVGPIMN (119) | ||
95 | QVGPIMP (120) | ||
96 | QVGPIVP (121) | ||
97 | QVGPLLS (122) | ||
98 | QVGPVLP (123) | ||
99 | QVGPVLT (124) | ||
100 | RIGPIMP (125) | ||
101 | RIGPIVP (126) | ||
102 | RIGPMFP (127) | ||
103 | RIGPMIP (128) | ||
104 | RIGPMVP (129) | ||
105 | RIGPVIP (130) | ||
106 | RVGPILP (131) | ||
107 | RVGPLLP (132) | ||
108 | TVGPHIP (133) | ||
109 | DRKRFI (36) | PSWRSNW (134) | |
110 | EFWRGS (37) | QIGPLLP (62) | |
111 | GLLDPL (38) | ALRATLE (135) | |
112 | GLVLPE (39) | KYGYLTP (136) | |
113 | MASDGL (40) | RIGPMLP (137) | |
114 | NKTETN (41) | NPFCSRF (138) | |
115 | QAERKV (42) | QIGPLLP (62) | |
116 | QAERKV (42) | RIGPLLP (63) | |
117 | SQVCTL (43) | YYLHQWC (139) | |
118 | YFDKDS (44) | QIGPLLP (62) | |
119 | YFECEP (45) | HIVPLLR (140) |
Последовательности:
Последовательность Tencon с указанием петель (SEQ ID NO: 16)
ПРИМЕР 4. Стабилизирующие мутации Tencon
Для повышения стабильности сворачивания описанного выше каркаса Tencon (SEQ ID NO: 16) сконструировали специальные мутанты. Провели несколько точечных мутаций для получения замен отдельных остатков последовательности SEQ ID NO: 16, таких как N46V (Tencon17 - SEQ ID NO:142), E14P (Tencon18 - SEQ ID NO:143), E11N (Tencon19 - SEQ ID NO:144), E37P (Tencon20 - SEQ ID NO:145) и G73Y (Tencon21 - SEQ ID NO:146), для которых предсказывали повышение стабильности анализом в программе PoPMuSiC v2.0 . Ранее было показано, что мутант E86I (Tencon22 - SEQ ID NO:147) стабилизирует гомологичный белок, 3-й домен FN3 тенасцина человека (международная заявка на патент № WO2009/086116A2). Наконец, в экспериментах с аланиновым сканированием, в которых все остатки петли Tencon независимо заменяли на аланин, обнаружили, что мутация L17A значительно стабилизирует Tencon (данные не представлены). После проведения первого цикла экспериментов по анализу стабильности (см. ниже) для дополнительного повышения стабильности получили комбинаторные мутанты N46V/E86I (Tencon 23 - SEQ ID NO:148), E14P/N46V/E86I (Tencon24 - SEQ ID NO:149) и L17A/N46V/E86I (Tencon25 - SEQ ID NO:150).
Экспрессия и очистка
Мутации в кодирующей последовательности Tencon проводили с использованием набора для мутагенеза QuikChange (Stratagene). Полученные плазмиды трансформировали в E. coli BL21-GOLD (DE3) (Stratagene) для экспрессии. Одну колонию выбирали и оставляли на ночь для выращивания при температуре 37°C в 2 мл среды TB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина. Данную культуру использовали для посева в 100 мл аутоиндукционной среды (Overnight Express Instant TB media, Novagen) в колбе с перегородками объемом 500 мл и выращивали при температуре 37°C в течение 16 часов.
Культуру собирали и центрифугировали при 4 000×g в течение 20 минут, осажденные клетки повторно растворяли в 5 мл буфера BugBuster HT (Novagen) на грамм влажного осадка клеток. После 30-минутного инкубирования при комнатной температуре лизаты осветляли центрифугированием при 30 000xg в течение 20 минут и загружали на Ni-NTA колонку повышенной текучести (Novagen) объемом 3 мл естественным весом. После загрузки каждую колонку промывали 15 мл буферного раствора, содержащего 50 мМ фосфата натрия, pH 7,4, 500 мМ NaCl и 10 мМ имидазола. Связанный белок затем элюировали с колонки, используя 10 мл буферного раствора, содержащего 50 мМ фосфата натрия, pH 7,4, 500 мМ NaCl и 250 мМ имидазола. Чистоту белка анализировали методом ДСН-ПААГ. Перед биофизическим анализом каждый мутант тщательно диализовали в PBS, pH 7,4. Для каждого мутанта получали 28-33 мг очищенного белка из 100 мл культуры.
Характеризация термостабильности
Характеристики термостабильности исходного Tencon и каждого мутанта определяли с использованием капиллярной дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). Каждый образец тщательно диализовали в PBS, pH 7,4, и разбавляли до концентрации 2-3 мг/мл. Для данных образцов измеряли температуры плавления, используя анализатор VP-DSC с автоматическим пробоотборником (MicroCal, LLC). Образцы нагревали от 10°C до 95°C или 100°C со скоростью 1°C в минуту. Между сканированием каждого образца проводили сканирование чистого буферного раствора для расчета базовой линии для интегрирования. После вычитания сигнала от чистого буферного раствора данные фитировали с использованием модели сворачивания с двумя состояниями. Обратимость термической денатурации определяли путем повторного сканирования каждого образца без извлечения его из ячейки. Обратимость рассчитывали путем сравнения площади под фармакокинетической кривой, полученной при первом сканировании, и при втором сканировании. Результаты экспериментов по ДСК приведены в таблице 5 в виде значений, полученных на основе полных кривых плавления. Одиночные мутанты Tencon17, Tencon18, Tencon19 и Tencon22 имели повышенную термостабильность по сравнению с исходной последовательностью tencon. Значительную дестабилизацию наблюдали только для мутанта Tencon21. Комбинаторные образцы мутантов Tencon23, Tencon24 и Tencon25 все имели значительно повышенную стабильность, что указывает на аддитивный эффект таких сконструированных мутаций в отношении повышения термостабильности.
Денатурация гидрохлоридом гуанидина
Для оценки стабильности использовали измерение способности Tencon и каждого мутанта сохранять свернутую конформацию при обработке увеличиваемыми концентрациями гидрохлорида гуанидина (GdmCl) по результатам измерения флуоресценции триптофана. Tencon содержит только один остаток триптофана. Остаток триптофана находится в глубине гидрофобного ядра, таким образом, эмиссия флуоресценции на 360 нм является чувствительной мерой состояния свернутости данного белка. В лунки черных 96-луночных планшетов без связывания (Greiner) добавляли по 200 мкл раствора, содержащего 50 мМ фосфата натрия, pH 7,0, 150 мМ NaCl и вариабельную концентрацию GdmCl в диапазоне от 0,48 до 6,63 М, для получения титрования по 17 точкам. В каждую лунку планшета добавляли по 10 мкл раствора, содержащего мутанты tencon, до конечной концентрации белка 23 мкМ и перемешивали содержимое лунок осторожным пипетированием вверх и вниз. После инкубирования при комнатной температуре в течение 24 часов измеряли интенсивность флуоресценции на спектрофотометре для прочтения планшетов Spectramax M5 (Molecular Devices) с возбуждением на 280 нм и эмиссией на 360 нм. Данные, полученные из таких кривых, приведены на фигуре 8. Сигнал флуоресценции переводили в долю развернутой конформации с использованием следующего выражения (Pace 1986 Methods Enzymol 131: 266-80):
где yF - сигнал флуоресценции свернутого образца, а yU - развернутого образца.
Средние точки перехода разворачивания и наклон кривой разворачивания определяли с использованием следующего выражения :
где F - интенсивность флуоресценции при заданной концентрации денатурирующего агента, и - отрезки на оси y для нативного и денатурированного состояния, и - наклоны базовых линий для нативного и денатурированного состояния, [D] - концентрация GdmCl, [D]50% - концентрация GdmCl, при которой 50% образца находится в денатурированном состоянии, m - наклон кривой разворачивания, R - газовая постоянная, а T - температура. Свободную энергию разворачивания для каждого образца оценивали с использованием следующего выражения (Pace 1986 см. выше; Clarke, Hamill et al. 1997 J Mol Biol 270(5): 771-8): .
Для таких кривых часто трудно точно измерить наклон кривой разворачивания, m. Кроме того, можно ожидать, что мутации, описанные в настоящем документе, не изменят механизм разворачивания tencon. Таким образом, для каждого мутанта измеряли величину m и усредняли полученные значения (Pace 1986, см. выше), получив величину m=14,83 кДж/моль/М (3 544 кал/моль/М), которую использовали для всех расчетов свободной энергии. Результаты данных расчетов представлены в таблице 5. Результаты экспериментов по разворачиванию GdmCl показывают, что те же мутанты, которые стабилизуют термостабильность Tencon, также обеспечивают стабильность белка к индуцируемой GdmCl денатурации.
Эксклюзионная хроматография
Для оценки состояния агрегации дикого типа tencon и каждого мутанта использовали эксклюзионную хроматографию (SEC). 5 мкл каждого образца вводили шприцем в колонку Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) со скоростью потока 0,3 мл/мин с подвижной фазой PBS. Элюирование с колонки контролировали по поглощению на 280 нм. Для оценки состояния агрегации колонку предварительно калибровали с использованием глобулярных стандартов молекулярного веса (Sigma). Все из тестированных образцов, за исключением Tencon21, элюировали одним пиком при объеме элюирования, соответствующем мономерному образцу. Tencon21 элюировали двумя пиками, что указывает на присутствие агрегатов.
Таблица 5 | ||||
Конструкция | Мутации | Tm (кДж (ккал)) | [D]50% (M) | ΔG(H2O) (кДж/моль (ккал/моль)) |
Tencon 16 (SEQ ID NO: 16) |
326,52 (78,04) | 3,4 | 50,21 (12,0) | |
Tencon17 (SEQ ID NO:142) |
N46V | 342,59 (81,88) | 3,6 | 53,56 (12,8) |
Tencon18 (SEQ ID NO:143) |
E14P | 346,31 (82,77) | 3,5 | 51,89 (12,4) |
Tencon19 (SEQ ID NO:144) |
E11N | 330,54 (79,00) | 3,4 | 50,21 (12,0) |
Tencon20 (SEQ ID NO:145) |
E37P | 323,84 (77,40) | 3,4 | 50,21 (12,0) |
Tencon21 (SEQ ID NO:146) |
G73Y | 282,67 (67,56) | 2,4 | 35,6 (8,5) |
Tencon22 (SEQ ID NO:147) |
E86I | 346,35 (82,78) | 3,7 | 54,81 (13,1) |
Tencon23 (SEQ ID NO:148) |
N46V/E86I | 362,54 (86,65) | 4,1 | 60,67 (14,5) |
Tencon24 (SEQ ID NO:149) |
E14P/N46V/E86I | 365,97 (87,47) | 4,0 | 59,41 (14,2) |
Tencon25 (SEQ ID NO:150) |
L17A/N46V/E86I | 387,98 (92,73) | 5,1 | 75,73 (18,1) |
Tencon26 (SEQ ID NO:151) |
L17A | 355,22 (84,9) | 4,6 | 67,78 (16,2) |
Следует понимать, что настоящее изобретение можно реализовать и иными способами, отличными от конкретных способов, описанных в вышеприведенных описаниях и примерах. В свете приведенного выше описания возможны многочисленные изменения и вариации настоящего изобретения, которые, таким образом, включаются в прилагаемую формулу изобретения.
Claims (4)
1. Способ конструирования библиотеки белков, полученных из консенсусной последовательности домена фибронектина типа III (FN3) с повышенной стабильностью, включающий следующие стадии:
предоставление полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий консенсусную последовательность домена фибронектина типа III (FN3) с повышенной стабильностью, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 142-151;
введение рандомизированных кодонов в полинуклеотидную последовательность в выбранных положениях; и
размножение копий указанной полинуклеотидной последовательности с получением библиотеки полинуклеотидов, кодирующих варианты каркасных белков.
предоставление полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, содержащий консенсусную последовательность домена фибронектина типа III (FN3) с повышенной стабильностью, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 142-151;
введение рандомизированных кодонов в полинуклеотидную последовательность в выбранных положениях; и
размножение копий указанной полинуклеотидной последовательности с получением библиотеки полинуклеотидов, кодирующих варианты каркасных белков.
2. Способ по п. 1, в котором рандомизированные кодоны выбраны из группы NNS и NNK.
3. Способ по п. 2, в котором рандомизированные кодоны вводят в положения, кодирующие, по меньшей мере, один петлевой участок, выбранный из группы, состоящей из остатков в положениях 13-16, 22-28, 38-43, 51-54, 60-64 и 75-81 последовательности SEQ ID NO: 142-151 или около них.
4. Библиотека белков для скрининга и/или оптимизации белков, состоящая из белков, полученных из консенсусной последовательности домена фибронектина типа III (FN3) с повышенной стабильностью, созданная способом по п. 3.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US32998010P | 2010-04-30 | 2010-04-30 | |
US61/329,980 | 2010-04-30 | ||
PCT/US2011/034512 WO2011137319A2 (en) | 2010-04-30 | 2011-04-29 | Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016142690A Division RU2767543C2 (ru) | 2010-04-30 | 2011-04-29 | Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2012151366A RU2012151366A (ru) | 2014-06-10 |
RU2603272C2 true RU2603272C2 (ru) | 2016-11-27 |
Family
ID=44862129
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2012151366/10A RU2603272C2 (ru) | 2010-04-30 | 2011-04-29 | Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения |
RU2016142690A RU2767543C2 (ru) | 2010-04-30 | 2011-04-29 | Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2016142690A RU2767543C2 (ru) | 2010-04-30 | 2011-04-29 | Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US8569227B2 (ru) |
EP (4) | EP3569256B1 (ru) |
JP (5) | JP5997134B2 (ru) |
KR (1) | KR101863033B1 (ru) |
CN (1) | CN103002923B (ru) |
AU (1) | AU2011245225B2 (ru) |
BR (1) | BR112012027863B1 (ru) |
CA (1) | CA2797274C (ru) |
CY (1) | CY1117975T1 (ru) |
DK (2) | DK3569256T3 (ru) |
ES (3) | ES2923567T3 (ru) |
HR (1) | HRP20161117T1 (ru) |
HU (1) | HUE029622T2 (ru) |
IL (1) | IL222573B (ru) |
MX (1) | MX339126B (ru) |
PL (1) | PL2571531T3 (ru) |
PT (3) | PT3569256T (ru) |
RS (1) | RS55163B1 (ru) |
RU (2) | RU2603272C2 (ru) |
SI (1) | SI2571531T1 (ru) |
SM (1) | SMT201600309B (ru) |
WO (1) | WO2011137319A2 (ru) |
Families Citing this family (64)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005056764A2 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-23 | Compound Therapeutics, Inc. | Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors |
US8470332B2 (en) | 2006-11-22 | 2013-06-25 | Bristol-Myers Squibb Company | Targeted therapeutics based on engineered proteins for tyrosine kinases receptors, including IGF-IR |
CN102007145A (zh) | 2008-02-14 | 2011-04-06 | 百时美施贵宝公司 | 基于结合egfr的工程化蛋白质的靶向治疗剂 |
JP2011520961A (ja) | 2008-05-22 | 2011-07-21 | ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー | 多価フィブロネクチンをベースとする足場ドメインタンパク質 |
CN102307896B (zh) | 2008-10-31 | 2016-10-12 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 基于iii型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途 |
TWI496582B (zh) | 2008-11-24 | 2015-08-21 | 必治妥美雅史谷比公司 | 雙重專一性之egfr/igfir結合分子 |
EP3569256B1 (en) | 2010-04-30 | 2022-06-15 | Janssen Biotech, Inc. | Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses |
TW201138808A (en) | 2010-05-03 | 2011-11-16 | Bristol Myers Squibb Co | Serum albumin binding molecules |
ES2573108T3 (es) | 2010-05-26 | 2016-06-06 | Bristol-Myers Squibb Company | Proteínas de armazón a base de fibronectina que tienen estabilidad mejorada |
ES2876421T3 (es) | 2011-04-13 | 2021-11-12 | Bristol Myers Squibb Co | Proteínas de fusión Fc que comprenden enlazadores o disposiciones nuevos |
EP2709669A1 (en) | 2011-05-17 | 2014-03-26 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for maintaining pegylation of polypeptides |
EP2710382B1 (en) | 2011-05-17 | 2017-10-18 | Bristol-Myers Squibb Company | Improved methods for the selection of binding proteins |
EP4151785A1 (en) | 2011-09-27 | 2023-03-22 | Janssen Biotech, Inc. | Fibronectin type iii repeat based protein scaffolds with alternative binding surfaces |
WO2013067029A2 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin binding domains with reduced immunogenicity |
KR102053674B1 (ko) | 2012-05-25 | 2019-12-09 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 비-천연 컨센서스 알부민 결합 도메인 |
US8933199B2 (en) | 2012-09-13 | 2015-01-13 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold domain proteins that bind to myostatin |
EP3447069B1 (en) | 2012-11-21 | 2020-09-23 | Janssen Biotech, Inc. | Bispecific egfr/c-met antibodies |
US9695228B2 (en) * | 2012-11-21 | 2017-07-04 | Janssen Biotech, Inc. | EGFR and c-Met fibronectin type III domain binding molecules |
US20150361159A1 (en) | 2013-02-01 | 2015-12-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold proteins |
WO2014124017A1 (en) | 2013-02-06 | 2014-08-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin type iii domain proteins with enhanced solubility |
EP3617220B1 (en) | 2013-02-12 | 2021-03-24 | Bristol-Myers Squibb Company | High ph protein refolding methods |
WO2014126871A1 (en) | 2013-02-12 | 2014-08-21 | Bristol-Myers Squibb Company | Tangential flow filtration based protein refolding methods |
GB201302597D0 (en) | 2013-02-14 | 2013-04-03 | Univ Leeds | Novel Synthetic Proteins |
US9901647B2 (en) | 2013-02-28 | 2018-02-27 | Immunogen, Inc. | Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents |
WO2014134483A2 (en) | 2013-02-28 | 2014-09-04 | Immunogen, Inc. | Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents |
EP2968587A2 (en) | 2013-03-13 | 2016-01-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Fibronectin based scaffold domains linked to serum albumin or a moiety binding thereto |
WO2014194030A2 (en) | 2013-05-31 | 2014-12-04 | Immunogen, Inc. | Conjugates comprising cell-binding agents and cytotoxic agents |
CN105899226B (zh) * | 2013-10-14 | 2020-05-12 | 詹森生物科技公司 | 半胱氨酸工程化iii型纤连蛋白域结合分子 |
JP2017502002A (ja) | 2013-12-09 | 2017-01-19 | ニューヨーク・ユニバーシティ | 抗ブドウ球菌剤の食細胞送達用組成物及び方法 |
IL275497B (en) | 2014-03-20 | 2022-09-01 | Bristol Myers Squibb Co | Serum proteins with type iii fibronectin binding domains |
CA2943228C (en) | 2014-03-20 | 2023-03-14 | Bristol-Myers Squibb Company | Stabilized fibronectin based scaffold molecules |
US20160018406A1 (en) * | 2014-07-21 | 2016-01-21 | Unchained Labs Inc. | Determination of Protein Aggregation from the Concentration Dependence of Delta G |
CR20170111A (es) | 2014-09-03 | 2017-05-23 | Immunogen Inc | Derivados de benzodiazepina citotóxicos |
EP3189057A1 (en) | 2014-09-03 | 2017-07-12 | ImmunoGen, Inc. | Cytotoxic benzodiazepine derivatives |
ES2941895T3 (es) | 2014-11-25 | 2023-05-26 | Bristol Myers Squibb Co | Métodos y composiciones para radioetiquetado con 18F del dominio de fibronectina tipo (III) |
US20190316116A1 (en) * | 2014-12-15 | 2019-10-17 | Monash University | Highly stable polypeptide scaffolds |
US11263432B2 (en) | 2015-02-06 | 2022-03-01 | Veridium Ip Limited | Systems and methods for performing fingerprint based user authentication using imagery captured using mobile devices |
US9424458B1 (en) | 2015-02-06 | 2016-08-23 | Hoyos Labs Ip Ltd. | Systems and methods for performing fingerprint based user authentication using imagery captured using mobile devices |
KR20180002782A (ko) * | 2015-05-06 | 2018-01-08 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 전립선 특이적 막 항원(psma) 이중특이성 결합제 및 그의 용도 |
CN107849116A (zh) * | 2015-05-06 | 2018-03-27 | 詹森生物科技公司 | 前列腺特异性膜抗原结合iii型纤连蛋白结构域 |
JP2018517708A (ja) | 2015-06-05 | 2018-07-05 | ニューヨーク・ユニバーシティ | 抗ブドウ球菌生物学的薬剤のための組成物及び方法 |
WO2017015119A1 (en) * | 2015-07-17 | 2017-01-26 | The University Of Chicago | Methods and composition for modifying enzymes |
ES2967078T3 (es) | 2015-09-23 | 2024-04-25 | Bristol Myers Squibb Co | Dominios de fibronectina de tipo III de unión a seroalbúmina con velocidad de disociación rápida |
WO2017210335A1 (en) | 2016-06-01 | 2017-12-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Imaging methods using 18f-radiolabeled biologics |
UA126021C2 (uk) * | 2016-06-03 | 2022-08-03 | Янссен Байотек, Інк. | Домен фібронектину типу ііі, що зв'язується із сироватковим альбуміном |
JP2019527540A (ja) | 2016-06-21 | 2019-10-03 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | システイン操作フィブロネクチンiii型ドメイン結合分子 |
CA3036972A1 (en) | 2016-09-14 | 2018-03-22 | Janssen Biotech, Inc. | Chimeric antigen receptors comprising bcma-specific fibronectin type iii domains and uses thereof |
US20190119636A1 (en) | 2017-10-23 | 2019-04-25 | Poseida Therapeutics, Inc. | Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same |
WO2018111976A1 (en) | 2016-12-14 | 2018-06-21 | Janssen Biotech, Inc. | Pd-l1 binding fibronectin type iii domains |
US10626165B2 (en) | 2016-12-14 | 2020-04-21 | Janssen Biotech, Inc. | CD8a-binding fibronectin type III domains |
EP3554561B1 (en) | 2016-12-14 | 2023-06-28 | Janssen Biotech, Inc. | Cd137 binding fibronectin type iii domains |
RU2765098C2 (ru) | 2017-02-28 | 2022-01-25 | Иммуноджен, Инк. | Производные майтанзиноида с саморасщепляющимися пептидными линкерами и их конъюгаты |
US20180346488A1 (en) | 2017-04-20 | 2018-12-06 | Immunogen, Inc. | Cytotoxic benzodiazepine derivatives and conjugates thereof |
KR20200028447A (ko) * | 2017-07-17 | 2020-03-16 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | 피브로넥틴 iii형 도메인에 대한 항원 결합 영역 및 이의 사용 방법 |
WO2019040808A1 (en) * | 2017-08-25 | 2019-02-28 | Janssen Biotech, Inc. | TYPE III FIBRONECTIN BINDER FCγRII DOMAINS, THEIR CONJUGATES AND MULTISPECIFIC MOLECULES COMPRISING THE SAME |
US10329543B2 (en) | 2017-10-23 | 2019-06-25 | Poseida Therapeutics, Inc. | Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same |
JP2021508714A (ja) | 2017-12-28 | 2021-03-11 | イミュノジェン・インコーポレーテッド | ベンゾジアゼピン誘導体 |
KR20220022112A (ko) | 2019-03-21 | 2022-02-24 | 이뮤노젠 아이엔씨 | 세포-결합 제제-약물 콘쥬게이트를 준비하는 방법 |
TW202102506A (zh) | 2019-03-29 | 2021-01-16 | 美商伊繆諾金公司 | 苯二氮平衍生物 |
PT3958977T (pt) | 2019-04-26 | 2023-12-15 | Immunogen Inc | Derivados de camptotecina |
US20220275069A1 (en) | 2019-07-12 | 2022-09-01 | Janssen Pharmaceutica Nv | Binding agents and uses thereof |
JP2022551204A (ja) | 2019-10-14 | 2022-12-07 | アロ・バイオセラピューティクス・カンパニー | Cd71結合フィブロネクチンiii型ドメイン |
WO2021076574A2 (en) | 2019-10-14 | 2021-04-22 | Aro Biotherapeutics Company | Fn3 domain-sirna conjugates and uses thereof |
JP2023515633A (ja) | 2020-02-28 | 2023-04-13 | ブリストル-マイヤーズ スクイブ カンパニー | 放射性標識されたフィブロネクチンに基づく足場および抗体ならびにそのセラノスティクス的使用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2238326C2 (ru) * | 1999-02-09 | 2004-10-20 | Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн | Способ продуцирования библиотеки белков (варианты), способ отбора нужного белка и нуклеиновой кислоты |
US20090176654A1 (en) * | 2007-08-10 | 2009-07-09 | Protelix, Inc. | Universal fibronectin type III binding-domain libraries |
Family Cites Families (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6018030A (en) | 1986-11-04 | 2000-01-25 | Protein Polymer Technologies, Inc. | Peptides comprising repetitive units of amino acids and DNA sequences encoding the same |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
KR0185192B1 (ko) | 1989-10-05 | 1999-04-01 | 제임스 더블유. 데이비 | 신규의 유전자 및 폴리펩티드의 무세포 합성 및 분리 |
US6172197B1 (en) | 1991-07-10 | 2001-01-09 | Medical Research Council | Methods for producing members of specific binding pairs |
DK1471142T3 (da) | 1991-04-10 | 2009-03-09 | Scripps Research Inst | Heterodimere receptor-biblioteker under anvendelse af fagemider |
DE69233782D1 (de) | 1991-12-02 | 2010-05-20 | Medical Res Council | Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken |
ES2301198T3 (es) | 1997-06-12 | 2008-06-16 | Novartis International Pharmaceutical Ltd. | Polipeptidos artificiales de anticuerpos. |
US6670127B2 (en) | 1997-09-16 | 2003-12-30 | Egea Biosciences, Inc. | Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide |
WO1999014318A1 (en) | 1997-09-16 | 1999-03-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Method for the complete chemical synthesis and assembly of genes and genomes |
US6846655B1 (en) | 1998-06-29 | 2005-01-25 | Phylos, Inc. | Methods for generating highly diverse libraries |
US6818418B1 (en) | 1998-12-10 | 2004-11-16 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
DK1137941T4 (da) | 1998-12-10 | 2014-01-06 | Brystol Myers Squibb Company | Protein-scaffolds til antistof-mimetika og andre bindingsproteiner |
US7115396B2 (en) | 1998-12-10 | 2006-10-03 | Compound Therapeutics, Inc. | Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins |
US6472147B1 (en) | 1999-05-25 | 2002-10-29 | The Scripps Research Institute | Methods for display of heterodimeric proteins on filamentous phage using pVII and pIX, compositions, vectors and combinatorial libraries |
JP2004526419A (ja) | 2000-10-16 | 2004-09-02 | フィロス インク. | 抗体模倣物および他の結合タンパク質のためのタンパク質骨格 |
WO2004058821A2 (en) | 2002-12-27 | 2004-07-15 | Domantis Limited | Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand |
GB0119476D0 (en) | 2001-08-09 | 2001-10-03 | Novartis Forschungsstiftlung Z | Anti-tumour agents and method of identifying anti-tumour agents |
JP4602614B2 (ja) | 2001-09-26 | 2010-12-22 | アイシン精機株式会社 | 自動車用ドア |
AU2003243436A1 (en) | 2002-06-06 | 2003-12-22 | Shohei Koide | Reconstituted polypeptides |
ATE488586T1 (de) | 2002-09-06 | 2010-12-15 | Isogenica Ltd | In vitro peptid-expressionsbank |
WO2004029224A2 (en) | 2002-09-30 | 2004-04-08 | Compound Therapeutics, Inc. | Methods of engineering spatially conserved motifs in polypeptides |
WO2005056764A2 (en) | 2003-12-05 | 2005-06-23 | Compound Therapeutics, Inc. | Inhibitors of type 2 vascular endothelial growth factor receptors |
US20080220049A1 (en) | 2003-12-05 | 2008-09-11 | Adnexus, A Bristol-Myers Squibb R&D Company | Compositions and methods for intraocular delivery of fibronectin scaffold domain proteins |
US20060040278A1 (en) | 2004-01-27 | 2006-02-23 | Cojocaru Gad S | Novel nucleotide and amino acid sequences, and assays and methods of use thereof for diagnosis of ovarian cancer |
SG134283A1 (en) | 2006-01-24 | 2007-08-29 | Ind Tech Res Inst | Biomarkers for liver fibrotic injury |
WO2007085815A2 (en) | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Domantis Limited | Ligands that bind il-4 and/or il-13 |
WO2008079973A2 (en) | 2006-12-21 | 2008-07-03 | Centocor, Inc. | Egfr binding peptides and uses thereof |
US20110009323A1 (en) | 2007-06-15 | 2011-01-13 | Vasgene Therapeutics, Inc. | Non-immunoglobulin antigen binding scaffolds for inhibiting angiogenesis and tumor growth |
KR101686247B1 (ko) * | 2007-10-31 | 2016-12-14 | 메디뮨 엘엘씨 | 단백질 스캐폴드 |
ES2564523T3 (es) | 2007-12-19 | 2016-03-23 | Janssen Biotech, Inc. | Diseño y generación de bibliotecas de presentación en fago por pIX de novo humanas mediante fusión con pIX o pVII, vectores, anticuerpos y métodos |
CA2709994A1 (en) * | 2007-12-19 | 2009-07-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Non-antibody scaffold protein fusions phage display via fusion to pix of m13 phage |
EP2383292A1 (en) | 2008-05-02 | 2011-11-02 | Novartis AG | Improved fibronectin-based binding molecules and uses thereof |
CN102307896B (zh) * | 2008-10-31 | 2016-10-12 | 森托科尔奥索生物科技公司 | 基于iii型纤连蛋白结构域的支架组合物、方法及用途 |
US8415291B2 (en) * | 2008-10-31 | 2013-04-09 | Centocor Ortho Biotech Inc. | Anti-TNF alpha fibronectin type III domain based scaffold compositions, methods and uses |
TWI496582B (zh) | 2008-11-24 | 2015-08-21 | 必治妥美雅史谷比公司 | 雙重專一性之egfr/igfir結合分子 |
JP5873335B2 (ja) | 2009-02-12 | 2016-03-01 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | フィブロネクチンiii型ドメインに基づくスカフォールド組成物、方法及び使用 |
WO2011005133A1 (en) | 2009-07-07 | 2011-01-13 | Siemens Aktiengesellschaft | Apparatus and method for measuring multi-phase fluid flow |
EP3569256B1 (en) * | 2010-04-30 | 2022-06-15 | Janssen Biotech, Inc. | Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses |
CN103403027A (zh) | 2010-07-30 | 2013-11-20 | 诺华有限公司 | 纤连蛋白摇篮分子和其库 |
-
2011
- 2011-04-29 EP EP19169579.0A patent/EP3569256B1/en active Active
- 2011-04-29 ES ES19169579T patent/ES2923567T3/es active Active
- 2011-04-29 CN CN201180021908.5A patent/CN103002923B/zh active Active
- 2011-04-29 RU RU2012151366/10A patent/RU2603272C2/ru active
- 2011-04-29 EP EP16175500.4A patent/EP3103478B1/en active Active
- 2011-04-29 RS RS20160760A patent/RS55163B1/sr unknown
- 2011-04-29 CA CA2797274A patent/CA2797274C/en active Active
- 2011-04-29 JP JP2013508278A patent/JP5997134B2/ja active Active
- 2011-04-29 AU AU2011245225A patent/AU2011245225B2/en active Active
- 2011-04-29 PT PT191695790T patent/PT3569256T/pt unknown
- 2011-04-29 KR KR1020127031470A patent/KR101863033B1/ko active IP Right Grant
- 2011-04-29 SI SI201130909A patent/SI2571531T1/sl unknown
- 2011-04-29 MX MX2012012653A patent/MX339126B/es active IP Right Grant
- 2011-04-29 BR BR112012027863-0A patent/BR112012027863B1/pt active IP Right Grant
- 2011-04-29 PT PT117756163T patent/PT2571531T/pt unknown
- 2011-04-29 EP EP11775616.3A patent/EP2571531B1/en active Active
- 2011-04-29 RU RU2016142690A patent/RU2767543C2/ru active
- 2011-04-29 EP EP22178430.9A patent/EP4115911A1/en active Pending
- 2011-04-29 ES ES16175500T patent/ES2730693T3/es active Active
- 2011-04-29 PL PL11775616.3T patent/PL2571531T3/pl unknown
- 2011-04-29 DK DK19169579.0T patent/DK3569256T3/da active
- 2011-04-29 US US13/097,587 patent/US8569227B2/en active Active
- 2011-04-29 ES ES11775616.3T patent/ES2592511T3/es active Active
- 2011-04-29 PT PT16175500T patent/PT3103478T/pt unknown
- 2011-04-29 WO PCT/US2011/034512 patent/WO2011137319A2/en active Application Filing
- 2011-04-29 HU HUE11775616A patent/HUE029622T2/en unknown
- 2011-04-29 DK DK16175500.4T patent/DK3103478T3/da active
-
2012
- 2012-10-21 IL IL222573A patent/IL222573B/en active IP Right Grant
-
2013
- 2013-09-23 US US14/033,994 patent/US9234029B2/en active Active
-
2015
- 2015-12-15 US US14/969,361 patent/US9982253B2/en active Active
-
2016
- 2016-08-24 JP JP2016163216A patent/JP6356748B2/ja active Active
- 2016-09-01 HR HRP20161117TT patent/HRP20161117T1/hr unknown
- 2016-09-07 CY CY20161100884T patent/CY1117975T1/el unknown
- 2016-09-09 SM SM201600309T patent/SMT201600309B/it unknown
-
2018
- 2018-06-13 JP JP2018112762A patent/JP2018183143A/ja not_active Withdrawn
-
2020
- 2020-09-09 JP JP2020151322A patent/JP2021010368A/ja active Pending
-
2024
- 2024-02-26 JP JP2024026238A patent/JP2024059819A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2238326C2 (ru) * | 1999-02-09 | 2004-10-20 | Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн | Способ продуцирования библиотеки белков (варианты), способ отбора нужного белка и нуклеиновой кислоты |
US20090176654A1 (en) * | 2007-08-10 | 2009-07-09 | Protelix, Inc. | Universal fibronectin type III binding-domain libraries |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
C. ANDERS OLSON et al., Design, expression, and stability of a diverse proteinlibrary based on the human fibronectin type III domain, Protein Science 2007, Vol.16, pp.476-484. * |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2603272C2 (ru) | Композиции на основе стабилизированных фибронектиновых доменов, способы и области их применения | |
AU2011245225A1 (en) | Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses | |
JP6722263B2 (ja) | 選択的結合表面を有するフィブロネクチンiii型反復ベースのタンパク質スカフォールド | |
AU2017202915B2 (en) | Stabilized fibronectin domain compositions, methods and uses |