JP6940406B2 - キメラ抗原レセプター分子の制御的発現のためのレンチウイルスベクター - Google Patents

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Description

本発明は、組換えワクチン技術の分野の発明であり、治療および予防ワクチンとして使用することができるレンチウイルスベクターの改良に関する。当該ベクターは、他のベクターに比べて改良された免疫応答の誘導を提供する。
組換えワクチンは、改変ウイルスを作製するためのウイルスゲノムの改変を可能にする組換えＤＮＡ技術の進歩に伴い開発されてきた。このようにして、宿主で特異的免疫応答を発生させるために、感染または伝達すると標的細胞で発現される免疫原性タンパク質をコードするように遺伝子配列を非病原性ウイルスに導入することは可能であった。
このようなワクチンは、ワクチン技術における大きな進歩となっている（Ｋｕｔｚｌｅｒら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ、９（１０）：７７６〜７８８頁、２００８）。特に、これらは伝統的なワクチンに比べて、生（弱毒化）ウイルスを回避し、不活化ワクチンの製造に伴うリスクを排除する利点を有する。
改変レトロウイルス（レトロウイルスベクター）を用いる遺伝子送達は、１９８０年代前半にＭａｎｎら（Ｃｅｌｌ、３３（１）：１５３〜９頁、１９８３）により紹介された。最も一般的に使用されるオンコレトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づく。該ウイルスは、ポリタンパク質Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖが作製される単純なゲノムを有し、ウイルスの複製にトランスで必要とされる（Ｂｒｅｃｋｐｏｔら、２００７、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１４（１１）：８４７〜６２頁；Ｈｅら ２００７、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６（６）：９１３〜２４頁）。シスで通常必要とされる配列は、長末端反復配列（ＬＴＲ）ならびにこの近接：組み込みに必要とされる逆方向反復（ＩＲまたはａｔｔ部位）、パッケージング配列Ψ、トランスポートＲＮＡ結合部位（プライマー結合部位、ＰＢＳ）、および逆転写に関与する幾つかの付加配列（ＬＴＲ内の反復Ｒ、およびプラス鎖開始に必要なポリプリントラクト、ＰＰＴ）である。複製欠損レトロウイルスベクターを生成するには、一般に、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を完全に欠失させ、発現カセットと置き換える。
レンチウイルスゲノムに由来するレトロウイルスベクター（すなわちレンチウイルスベクター）は、他のウイルス系に比べて幾つかの利点を示すため、遺伝子治療および免疫療法目的の両方に対する有望なツールとして現れた。特に、レンチウイルスベクター自体毒性でなく、他のレトロウイルスと異なりレンチウイルスは、非分裂細胞、特に樹状細胞を形質導入することができ（Ｈｅら ２００７、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６（６）：９１３〜２４頁）、内因性経路を通じた抗原提示を可能にする。
レンチウイルスは、遺伝子組成の類似性、複製の分子機構、および該ウイルスの宿主との生物学的相互作用により連結される。レンチウイルスは、長期の不顕性感染後に知らぬ間に始まりゆっくりと進行するスロー病（ｓｌｏｗ ｄｉｓｅａｓｅ）症候群の病原体として最もよく知られ、故に、レンチウイルスは「スロー」ウイルスと呼ばれている（Ｎａｒａｙａｎら、１９８９、Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ、７０（７）：１６１７〜３９頁）。レンチウイルスは、全てのレトロウイルスと同じ基本構成を有するが、インビボでのレンチウイルス複製において重要な役割を果たすアクセサリー遺伝子（例えば、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、ｔａｔ、およびｒｅｖ）の存在のためより複雑である。
レンチウイルスはレトロウイルス科のスローウイルス属に相当し、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）を含む。レンチウイルスは宿主中でいつまでも持続し得、生涯にわたる感染の過程において可変的な速度で継続的に複製し得る。宿主における該ウイルスの持続複製は、宿主防御を回避する該ウイルスの能力に依存する。
組換え組み込みレンチウイルスベクターの設計は、レンチウイルスのシス作用性配列とトランス作用性配列の分離に基づく。非分裂細胞への効率的な形質導入は、レンチウイルスゲノム中の２つのシス作用性配列、セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ ｔｒａｃｔ）（ｃＰＰＴ）およびセントラルターミネーション配列（ｃｅｎｔｒａｌ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＣＴＳ）の存在を必要とする。これらは、樹状細胞（ＤＣ）を含む非分裂細胞の核への遺伝子移入の効率を最大化する、セントラルＤＮＡ「フラップ」と呼ばれる３本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらす（Ｚｅｎｎｏｕら、２０００、Ｃｅｌｌ、１０１（２）１７３〜８５頁；Ａｒｈｅｌら、２００７、ＥＭＢＯ Ｊ、２６（１２）：３０２５〜３７頁）。
樹状細胞は、主な機能が抗原を提示し免疫応答を開始することである抗原提示細胞（ＡＰＣ）の主要なクラスを構成するため、抗原提示に最も重要である。
免疫応答を生じるには、抗原タンパク質が細胞によりペプチドに処理され、該ペプチドが主要組織適合遺伝子複合体タンパク質（ＭＨＣ）により細胞表面に示されなければならない。循環ＡＰＣは、ペプチド−ＭＨＣ複合体を流入領域リンパ節でＴ細胞に提示し、該リンパ節で該複合体はＴ細胞受容体と相互作用し、共刺激シグナルと共にＴ細胞を活性化する。
様々な研究が、レンチウイルスベクターの接種はＤＣによる抗原提示、および抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）の強い活性化をもたらすことを示している。したがって、レンチウイルスベクターは、遺伝子導入および免疫療法適用のために少なくとも１０年間操作されてきた。
ベクターは、通常、ＣＭＶプロモーターのようなエンハンサーを含む強力な構成的プロモーターを含む。Ｍｉｃｈｅｌｉｎｉら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２７（３４）：４６２２〜２９頁（２００９）；Ｋａｒｗａｃｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３（７）：３０９４〜３１０３頁（２００９）；Ｎｅｇｒｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １５（９）：１７１６〜２３頁（２００７）；およびＢｕｆｆａら、Ｊ．Ｇｅｎｅｒａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８７：１６２５〜１６３４頁（２００６）。
レンチウイルスベクターは、ＬＴＲ Ｕ３配列の除去により安全性が改善され、ＬＴＲ内にもともと存在するウイルスプロモーターおよびエンハンサー配列を完全に欠く「自己不活性化」ベクターをもたらした。
レンチウイルスベクターを含有するレンチウイルス粒子は、種々のＤＮＡプラスミド、すなわち
（ｉ）パッケージングプラスミド（少なくともＧａｇ、Ｐｏｌ Ｒｅｖ、Ｔａｔおよび、幾つかの場合ではトランスファー構築物のパッケージングに必要な構造タンパク質および酵素タンパク質を発現する）；
（ｉｉ）プロウイルストランスファープラスミド（発現カセットならびにパッケージング、逆転写、および組み込みに必要なＨＩＶシス作用性因子を含有する）；ならびに
（ｉｉｉ）エンベロープコードプラスミド（ほとんどの場合、幅広い種類の細胞、特に、ＤＣを含む主要組織適合（ＭＨＣ）抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的にすることができる混合粒子（偽型）の形成を可能にするタンパク質である、水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質（ＶＳＶ．Ｇ））
によりＨＥＫ ２９３Ｔヒト培養細胞などを一過性トランスフェクションしたときに組換え技術により作製することができる。
この手順は、トランスフェクト細胞によるレンチウイルス粒子ベクターの一過性産生を得られるようにする。しかし、レンチウイルス粒子ベクターは、パッケージング遺伝子、プロウイルスコードＤＮＡ、およびエンベロープ遺伝子を細胞ゲノムに安定に挿入して、細胞により継続的に産生することもできる。これは、一過性トランスフェクションを必要とせずに細胞によるレンチウイルス粒子ベクターの継続的産生を可能にする。当然のことながら、これらの手順の組み合わせが使用されてもよく、ＤＮＡ／プラスミドの幾つかは細胞ゲノムに組み込まれ、他は一過性トランスフェクションにより提供される。
非組み込みレンチウイルスベクターは、特にワクチン接種目的での挿入変異事象に関連した潜在的発癌のリスクを軽減するように設計されている。非組み込みレンチウイルスベクターの例は、Ｃｏｕｔａｎｔら、ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７（１１）：ｅ４８６４４（２１０２）、Ｋａｒｗａｃｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８３（７）：３０９４〜３１０３頁（２００９）、Ｎｅｇｒｉら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １５（９）：１７１６〜１７２３頁（２００７）；Ｈｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：６６７５〜６６８３頁（２０１０）に示されている。結果的に、非組込みレンチウイルスベクター系は、組み込み系と比較して挿入変異誘発の潜在的リスクを軽減することができることが報告されている。 Ｈｕら、Ｖａｃｃｉｎｅ ２８：６６７５〜６６８３頁（２０１０）。
さらに、自己不活性化レンチウイルスベクターにおけるウイルスプロモーターおよびエンハンサー配列の３’ＬＴＲのＵ３領域における欠失は、内因性プロモーター活性化の可能性を制限する。この安全性に対する懸念により、Ｘ連鎖（ＳＣＩＤ−Ｘ１遺伝子）重症免疫不全症の稀な形態に罹患している子どもにモロニーウイルスベースのレトロウイルスベクターを用いて行われた、１９９８〜１９９９年に実施されたＳＣＩＤ−Ｘ１遺伝子治療試験から得られた経験を直接検討する（Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、２８８（５４６６）：６６９〜７２頁）。この試験中、ヒトＬＭ０２癌原遺伝子のすぐ近くでのモロニー由来レトロウイルスベクターの組み込みの結果、子ども９名中４名が白血病を発症した（Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ−Ａｂｉｎａら、２００８、Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．、１１８（９）：３１３２〜３１４２頁）。悪性腫瘍は、ＬＭ０２癌原遺伝子へのウイルスＵ３プロモーター／エンハンサーの近接の結果であることが示された。よって、安全性は、レンチベクターのヒトへの投与の際の主な懸念である。
エンハンサーは、転写活性化因子として離れて作用することができるシス作用性配列である。エンハンサーは、様々な細胞タイプ、特にＤＣにおいて導入遺伝子強発現を得るのに最も効率的であると思われるため、ウイルス由来ベクターで幅広く使用されている（Ｃｈｉｎｎａｓａｍｙら、２０００、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １１（１３）：１９０１〜９頁；Ｒｏｕａｓら、２００８、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９（９）：７１５〜２４頁；Ｋｉｍｕｒａら、２００７、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５（７）：１３９０〜９頁；Ｇｒｕｈら、２００８、Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ １０（１）２１〜３２頁）。しかし、挿入変異の安全性問題を考えると、このような転写エンハンサー配列は、エンハンサー近接効果による挿入変異のリスクをなくすためにレンチウイルスベクター構築物から欠失させるべきである。このエンハンサー近接効果は、挿入変異の圧倒的に最も多い機構であり、遺伝子導入後の腫瘍形成事象のヒトまたは動物症例において記載された唯一の効果である。
よって、ウイルスエンハンサーは含まないが、免疫原性ペプチドをコードする導入遺伝子の十分な発現、できればＣＭＶプロモーターを用いる場合に観察されるのと同じ程度の発現を可能にするレトロウイルス、特にレンチウイルスベクターを開発する必要がある。
主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ遺伝子（ＭＨＣクラスＩＩ）（Ｋｉｍｕｒａら、２００７、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １５（７）：１３９０〜９頁）およびデクチン−２遺伝子（Ｌｏｐｅｓら、２００８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ８２（１）：８６〜９５頁）に由来するＤＣ特異的プロモーターによるウイルスプロモーターの置換について報告している最近の研究がある。Ｌｏｐｅｓらにおいて使用されたデクチン−２遺伝子プロモーターは、推定エンハンサーおよびアデノウイルス保存配列（アデノウイルスプロモーター中の逆方向末端反復）を含有する（Ｂｏｎｋａｂａｒａら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６７：６８９３〜６９００頁）。Ｋｉｍｕｒａらにより使用されたＭＨＣクラスＩＩ遺伝子プロモーターは、いずれの既知のエンハンサーも含有しない。
けれども、エンハンサーがなければ、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、静脈内投与された場合には、ＤＣでは十分な導入遺伝子発現をもたらさないことが見出された。特に、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを含むレンチウイルスベクターは、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーで観察された免疫応答と対照的に、免疫応答性Ｃ５７ＢＬ／６マウスで免疫反応を引き起こさなかった。マウスに注射後、組み込みおよび持続的導入遺伝子発現は観察されたが、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを通じて転写されたレンチウイルスベクターは、ワクチン接種ブースト後でさえ抗原特異的ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球応答を刺激しなかった。したがって、これらの研究の著者らは、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターの使用は、免疫療法との関連ではなく遺伝子置換療法のように発現の持続性が求められる適用にのみ対象となると結論付けた。注目すべきことには、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターはほとんどの細胞種において発現が乏しい。
よって、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターは、ＩＶ注入を介した抗原に対する免疫応答の誘導に関してレンチウイルスベクターの適切なプロモーターではない。さらに、デクチン−２プロモーターは、ほとんどの細胞種において発現が乏しく、エンハンサーを含有するようである。よって、デクチン−２プロモーターは、安全性の理由のため、レンチウイルスベクターの良好なプロモーターではない。
好ましくは、免疫療法においてレンチウイルスベクターは、所望の特異的免疫応答を誘発する導入遺伝子の有効な発現を提供する。これは、樹状細胞などのＡＰＣにおいて発現が高レベルであることを必要とする。
レンチウイルスベクターにより形質導入された細胞は、より高度の安全性を提供するために免疫応答により排除されることも好ましい。すなわち、導入遺伝子に対して生じた免疫応答は、レンチウイルスベクターにより形質導入される細胞を排除するのに十分な宿主における免疫応答を誘発することができる。形質導入細胞の排除は、宿主におけるレンチウイルスベクターの持続性、および該ベクターの起こり得る副次的影響を排除する。形質導入細胞が排除されるためには、発現は、非樹状細胞において免疫応答による排除を可能にするレベルで求められる。よって、抗原の適切な発現が望まれる。
同時に、プロモーターは、ナイーブおよび記憶Ｔ細胞の活性化に関与する重要な細胞（すなわち、樹状細胞）による免疫刺激を最大化すべきであり、悪性腫瘍をもたらす幹細胞における挿入変異および遺伝毒性のリスクを最小化すべきである。故に、プロモーターは、樹状および他の細胞において十分に高い活性を有するべきであるが、エンハンサーを含有すべきでない。これらの基準に基づき、ＣＭＶプロモーターなどのウイルスプロモーターは、強力なエンハンサーが存在するため理想ではない。これらの基準は、次のように要約される：
最大の免疫応答を誘導するための、樹状細胞を含む抗原提示細胞における高発現；
誘導された免疫応答による排除に十分な他の形質導入細胞タイプにおける発現；および
挿入による影響を回避するためのエンハンサーエレメントの欠如。
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）は抗原の組換えレセプターである。Ｓａｄｅｌａｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３年４月３（４）：３８８〜３９８頁。それらは、典型的には天然の細胞表面抗原を標的とする組換えレセプターである。同文献。ＣＡＲは、認識されるペプチドプロセッシングまたはＨＬＡ発現を必要としない分子と結合する。同文献。ＣＡＲは、ＣＤ３−ζまたはＦｃレセプターγとＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２５またはＣＤ１６との間のキメラ分子を含む、Ｔ細胞増殖および活性化の可能性を単独で有することが示されている。ＣＡＲの抗原結合部分は、一般に、抗体由来のｓｃＦｖ、ライブラリーから選択されるＦａｂ、または天然レセプターリガンドのいずれかである。Ｈａｎ ＥＱら、Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ、６：４７、２０１３。
ＣＡＲは、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、ＧＤ２、ＰＳＭＡを含む多くの異なる細胞表面分子に対して生成されており、多くは臨床試験中である。Ｄａｖｉｌａら、Ｏｎｃｏ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １：９、１５７７〜１５８３頁；２０１２。ＣＡＲの最も有望な臨床転帰は、ＣＤ１９を標的とする自己ＣＡＲ改変Ｔ細胞で治療された患者において見られた。Ｍａｕｓ ＭＶら、１２３（１７）：２６２５〜３５頁、２０１４。
ＣＡＲを発現するＴ細胞のインビボでの排除が研究されている。ヒトＴ細胞は、カスパーゼ９の誘導性活性化に依存する自殺遺伝子を含むＣＤ２０−ＣＡＲを発現するようにレンチウイルスベクターで遺伝子改変されている。Ｂｕｄｄｅら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（１２）：ｅ８２７４２（２０１３）。このレンチベクターは、Ｔ細胞における発現を得るためにヒトＥＦ１αプロモーターを使用した。自殺ヒューズの活性化により、インビトロおよびインビボの両方で形質導入されたＴ細胞が効率良く除去された。同文献。
有害事象を防止し、発現が止まった後にシステムを再起動できるようにするために、細胞の表面でＣＡＲの発現を素早く止めることができる方が良いであろう。よって、ヒトの治療のために改良されたベクターおよび方法に対する必要性が当技術分野に存在する。本発明は、当技術分野におけるこれらの必要性を満たすものである。
本発明は、ＣＡＲをコードする核酸分子およびベクター、ならびに当該核酸分子およびベクターの作製方法および使用方法を包含する。一実施形態では、本発明は、結合ドメイン；膜貫通ドメイン；好ましくはストレプトアビジン結合ペプチドを含むフック（ｈｏｏｋ）結合ドメイン；および配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８、配列番号３３または配列番号３４の少なくとも１００アミノ酸のＴ細胞活性化断片を含む活性化ドメインを含むキメラ抗原レセプターを包含する。
一実施形態では、本発明は、結合ドメイン；膜貫通ドメイン；ストレプトアビジン結合ペプチドを含むフック結合ドメイン；および配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８、配列番号３３または配列番号３４の少なくとも１００アミノ酸のＴ細胞活性化断片を含む活性化ドメインを含むキメラ抗原レセプターを発現するレンチウイルスベクターを包含する。
一実施形態では、本発明は、結合ドメイン；膜貫通ドメイン；好ましくはストレプトアビジン結合ペプチドを含むフック結合ドメイン；および配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８、配列番号３３または配列番号３４の少なくとも１００アミノ酸のＴ細胞活性化断片を含む活性化ドメインを含むキメラ抗原レセプターをコードする核酸ベクターを包含する。
一実施形態では、本発明は、結合ドメイン；膜貫通ドメイン；好ましくはストレプトアビジン結合ペプチドを含むフック結合ドメイン；および配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、または配列番号８、配列番号３３または配列番号３４の少なくとも１００アミノ酸のＴ細胞活性化断片を含む活性化ドメインを含むキメラ抗原レセプターをコードするレンチウイルスベクター粒子を包含する。
一実施形態では、前記キメラ抗原レセプターまたは前記レンチウイルスベクターまたは前記核酸ベクターまたは前記レンチウイルスベクター粒子は、単鎖Ｆｖ抗体または単一ドメイン抗体（すなわち、ナノボディ）を含む。
一実施形態では、前記ベクターは、配列番号３１または配列番号３２のアミノ酸配列を含むフックをコードする。
一実施形態では、前記ベクターは、β２−ミクログロブリン、Ｕｂｉ、ＥＦ１α、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩプロモーターを含む。一実施形態では、ベクターはＤＮＡである。
一実施形態では、前記レンチウイルスベクター粒子は、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質を含む。一実施形態では、前記レンチウイルスベクター粒子は、ＨＩＶ−１サブタイプＤ ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質を含む。
一実施形態では、本発明は、本発明のベクターを含む単離された細胞を包含する。
本発明は、ヒトにおいて免疫応答を誘導するための、本発明のいずれかのキメラ抗原レセプターまたはレンチウイルスベクターまたは核酸ベクターまたはレンチウイルスベクター粒子の使用を包含する。
本発明は、ヒトにおいて免疫応答を誘導するための方法であって、前記レンチウイルスベクター粒子またはキメラ抗原レセプターをコードする前記レンチウイルスベクター粒子によって形質導入された細胞をヒトに投与する工程、および場合によってその後ヒトにビオチンを投与する工程を含む方法を包含する。
いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原レセプターまたは前記レンチウイルスベクターまたは前記核酸ベクターは、配列番号４５、配列番号４７または配列番号４９のいずれかのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、前記キメラ抗原レセプターは、配列番号４６、配列番号４８または配列番号５０のいずれかのアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、前記レンチウイルスベクターまたは前記核酸ベクターは、配列番号４２のアミノ酸配列をさらにコードし、または配列番号４３および／または配列番号４４の核酸配列を含む。
図に示すプロモーターを有するレンチベクターからのＨＥＫ２９３ＴおよびＢＤＣＭ細胞におけるＧＦＰ発現を示す。 ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇのデータセットを用いて分析した様々なプロモーターの細胞特異的発現を示す。発現レベルは、骨格筋における発現（＝１．０）に対して正規化したものである。 ヒトユビキチン、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、およびβ２ミクログロブリン（β２ｍ）プロモーターを有する様々なレンチベクターからのＴ細胞におけるＣＡＲの発現を示す。 フック−ストレプトアビジンをコードするベクターおよび＋／−ビオチンの用量漸増による、フック−ストレプトアビジンに融合したコドン最適化ＶＳＶ−Ｇタンパク質をコードするシュードタイピングベクターによる力価を示す。 ＣＡＲ−ＲＵＳＨの構造および発現を示す。Ａ）設計された３つのＣＡＲ−ＲＵＳＨ構造のスキーム。ＣＡＲ−ＲＵＳＨは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ゼータ細胞内ドメインを表す第２世代のＣＡＲである。ＣＡＲ−ＲＵＳＨの特異性は、ＳＢＰ（ストレプトアビジン結合タンパク質）領域の存在下に存在し、ストレプトアビジンに結合したＨＯＯＫタンパク質と相互作用し、結果として小胞体における保持を可能にする。ＳＢＰ１、ＳＢＰ２およびＳＢＰ３の違いは、膜貫通ドメインと４−１ＢＢの間、または４−１ＢＢとＣＤ３ゼータの間、またはＣ末端のそれぞれに置かれたＳＢＰ領域の位置にある。Ｂ）ＦＡＣＳによって分析されたＣＡＲ陽性Ｔリンパ球の中央値蛍光強度を示すＭＦＩ。細胞をＭＯＩ１０で形質導入し、形質導入後３日目に分析した。ヒストグラムで報告されたＭＦＩ値は、バックグラウンドに相当する非形質導入細胞からｍｆｉを差し引くことによって正規化される。すべてのＣＡＲ陽性Ｔ細胞は、同等のＭＦＩを示し、第２世代ＣＡＲ−ＣＤ１９（ポジティブコントロール）は、試験した他のコンストラクトよりも３倍高いＭＦＩを示した。３種のＣＡＲ−ＲＵＳＨ（ＳＢＰ１、ＳＢＰ２およびＳＢＰ３）タンパク質はすべて、非常に類似したＭＦＩを示し、それゆえ細胞表面で同様のレベルで発現された。 ＨＯＯＫ−ストレプトアビジンをコードするレンチベクターによる同時形質導入およびビオチン処理後のＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトの発現および反応を示す。ＦＡＣＳによって分析されたＣＡＲ陽性Ｔリンパ球のパーセンテージ（Ａ）および中央値蛍光強度を示すＭＦＩ（Ｂ）。細胞は、ＨＯＯＫ−ストレプトアビジン（ＭＯＩ５）をコードするレンチベクターおよびＣＡＲ−ＳＢＰ（ＭＯＩ５）をコードするレンチベクターで同時形質導入した。これは最終総ＭＯＩ１０に相当する。ビオチンを同時形質導入の時点で加え、形質導入後３日目に細胞を分析した。ヒストグラムで報告されたパーセンテージおよびＭＦＩ値は、バックグラウンドに相当する非形質導入細胞から値を差し引くことによって得た。ＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトは、ビオチンを培地に添加した後に特異的に低い割合で発現された。これは、共形質導入の状況において、ＣＡＲ−ＲＵＳＨがＨＯＯＫタンパク質によって効率良く保持され、ビオチン媒介誘導のみによって細胞膜に提示され得たことを示唆する。 ＣＡＲ−ＲＵＳＨバイシストロン性コンストラクトの発現および反応を示す。ＦＡＣＳによって分析されたＣＡＲ陽性Ｔリンパ球のパーセンテージおよび中央値蛍光強度を示すＭＦＩ。細胞を１０（Ａ）または３０（Ｂ）のＭＯＩで形質導入し、形質導入後３日目に分析した。ビオチンは形質導入時に加えた。ヒストグラムで報告されたパーセンテージおよびＭＦＩ値は、バックグラウンドに相当する非形質導入細胞からの値を差し引くことによって得た。ＳＢＰ１−ＣＤ１９およびＳＢＰ３−ＣＤ１９ ＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトは、培地中にビオチンを添加した場合にのみ細胞表面に発現を示した。これは、ＣＡＲ−ＲＵＳＨがビオチンの非存在下でＨＯＯＫ−ストレプトアビジンタンパク質によって特異的に保持され、ビオチンの送達後にＲＵＳＨ調節システムはその輸送とその原形質膜上での発現を誘導したことを示唆する。ＳＢＰ１−ＣＤ１９およびＳＢＰ３−ＣＤ１９ ＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトは、培地中にビオチンを添加すると細胞表面での発現を示した。高いＭＯＩ（ＭＯＩ＝３０）では、ビオチンの非存在下でさえ、ＳＢＰ１−ＣＤ１９は細胞表面でわずかな発現を示した。これらの結果を考慮すると、ＣＡＲ−ＲＵＳＨは、ビオチンの非存在下でＨＯＯＫストレプトアビジンタンパク質によって大きく保持されていると考えられた。さらに、予想されたように、ビオチン送達は、原形質膜へのその輸送およびそれらの発現を誘導した。 ＣＡＲ−ＲＵＳＨシステムスイッチ評価（ＯＦＦ／ＯＮ）を示す。精製したＴ細胞を、ＣＡＲ−ＲＵＳＨシステムをコードするレンチベクターで０日目に形質導入し、ビオチンを同時に添加したものまたは添加しないものを作製した。３日目に、Ｔ細胞表面のＣＡＲの発現についてフローサイトメトリーによってＴ細胞を分析した。ＦＡＣＳによって分析された１つの代表的なドナーからのＣＡＲ陽性Ｔリンパ球のパーセンテージ（Ａ）および中央値蛍光強度を示すＭＦＩ（Ｂ）。ＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトを１０または２０のＭＯＩで形質導入し、同時にビオチンを添加し、形質導入後３日目にＴ細胞を細胞表面のＣＡＲ発現について分析した。この実験の背後にある理論的根拠は、ビオチン送達時のＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトの誘導の動力学およびビオチン誘導物質の非存在下でのＣＡＲ−ＲＵＳＨ保持の効率を研究することであった。上のパネルに示すように、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の割合が低いことが検出され、ＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトに依存して、その効果はビオチン添加に依存するかまたは独立していた。分析したＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトに依存して、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の割合が低いことが検出された。ＣＡＲ−ＳＢＰ１およびＣＡＲ−ＳＢＰ２について、細胞表面でのＣＡＲ−ＲＵＳＨ発現を誘導するビオチンの能力が検出された。ＣＡＲ−ＳＢＰ３は、ビオチンの存在下および非存在下の両方でわずかなＣＡＲ発現を示した。 ＣＡＲ−ＲＵＳＨシステムスイッチ評価（ＯＦＦ／ＯＮ／ＯＦＦ）を示す。精製したＴ細胞をＣＡＲ−ＲＵＳＨシステムをコードするレンチベクターで０日目に形質導入し、ビオチンを同時に添加したものまたは添加しないものを作製した。３日目に、一連のウェルを、ビオチンの存在下および非存在下の両方でＣＡＲの発現についてフローサイトメトリーによって分析した。ＣＡＲの発現をオフにするＣＡＲ陽性細胞の能力をモニターするために、他の一連のウェルを洗浄し、ビオチンを含むまたは含まない培養物に戻した。次いで、７日目にＴ細胞をＴ細胞表面でのＣＡＲ発現について分析した。ＦＡＣＳによって分析され、健康なドナー３２に由来するＣＡＲ陽性Ｔリンパ球のパーセンテージ（Ａ）および中央値蛍光強度を示すＭＦＩ（Ｂ）。ＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトをＭＯＩ１０で形質導入し、３日目のビオチンの再添加または非添加後の形質導入後７日目に細胞表面のＣＡＲ発現について分析した。Ａ）に示されるように、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞の割合が低いことが検出された。ビオチンは、ＣＡＲ−ＳＢＰ２およびＣＡＲ−ＳＢＰ３の両方について細胞外表面でＣＡＲ−ＲＵＳＨ発現を誘導し、特にＣＡＲ−ＳＢＰ３については、３日目の洗浄およびビオチン再添加後にＣＡＲ発現が再び誘導された。ＦＡＣＳにより分析され、健康なドナー３１由来のＣＡＲ陽性Ｔリンパ球のパーセンテージ（Ｃ）および中央値蛍光強度を示すＭＦＩ（Ｄ）。ＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトをＭＯＩ２０で形質導入し、３日目のビオチンの再添加または非添加後の形質導入後７日目に細胞表面でのCAR発現について分析した。試験した３種すべてのＣＡＲ−ＲＵＳＨは、ＣＡＲ陽性細胞の割合が低かった。さらに、ビオチンの存在下および非存在下の両方においてＣＡＲ発現を示したＣＡＲ−ＳＢＰ１を除いて、０日目および／または７日目にビオチンを添加した条件下でＣＡＲ−ＲＵＳＨが排他的に発現した。 ｃａｒ−ｃｄ１９の第２世代およびその構成要素のアミノ酸およびヌクレオチド配列を示す。ａ）ヌクレオチド配列（配列番号３９）、ｂ）アミノ酸配列（配列番号５１）、およびｃ）シグナル配列、ｃｄ１９ ｓＣｆＶ、ｃｄ８ヒンジ、膜貫通ドメイン、４−１ｂｂおよびｃｄ３Ｚ配列を示す特徴。 バイシストロン性フックストレプトアビジン−ＩＲＥＳ−ＣＡＲ−ＳＢＰ−ＣＤ１９第２世代コンストラクトの構造を示す。
発明の詳細な説明
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）をコードする種々のレンチベクターコンストラクトを、Ｔ細胞でのＣＡＲの発現のために作製した。どのプロモーターがヒトＴ細胞における発現に最も適しているのかは不明であった。プロモーターを比較するために、腎細胞株および樹状細胞株に、種々のプロモーターから緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレンチウイルスベクターを形質導入した。ヒトＥＦ１αプロモーターは、樹状細胞株ＢＤＣＭにおいて最も強力なプロモーターであることが判明した（図１）。このプロモーターはまた、腎細胞株２９３Ｔにおいても非常に強力であった。様々なプロモーターの細胞特異的発現を、ｂｉｏｇｐｓ．ｏｒｇのデータセットを用いて分析した（図２）。このデータセットから、Ｔ細胞におけるＥＦ１αプロモーターの発現は、ＢＤＣＡ＋細胞における発現に類似している。実際、ヒトＥＦ１αプロモーターは、活性化されたヒトＴ細胞においてＣＡＲを発現するために既に使用されていた。Ｂｕｄｄｅら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（１２）：ｅ８２７４２（２０１３）。
異なる細胞種における発現の差に基づいて、どのプロモーターがヒトＴ細胞におけるＣＡＲの発現に成功裏に使用され得るかは明らかではなかった。ヒトユビキチンＭＨＣ Ｉ、ＭＨＣ ＩＩおよびβ２ミクログロブリン（β２ｍ）プロモーターを、ヒトＴ細胞におけるＣＡＲの発現に対する適合性について評価した。予期しないことに、これらプロモーターすべてがヒトＴ細胞で機能することが判明した（図３Ａ〜Ｃ）。
ＣＡＲ Ｔ細胞を生成する最良の条件を見出すために、Ｔ細胞形質導入およびＣＡＲ発現に影響を与える可能性のあるいくつかのパラメータを試験した（例えば、ＭＯＩ、インキュベーション時間、プロモーター、Ｔ細胞活性化および精製戦略）。
バックグラウンド（非形質転換（ＵＴＤ）コントロールにおけるＣＡＲ＋細胞の％）を減じた後、２４時間目（ＭＯＩ＝１０および３０でのＵＢＣベクター）、９６時間目（ＭＯＩ＝３のβ２ＭベクターおよびＭＯＩ＝３および１０のＵＢＣベクター）および８日目（ＭＯＩ＝３０のβ２Ｍベクターおよび試験したＭＯＩごとのＵＢＣベクター）に、ＣＡＲ＋細胞を検出した。９６時間目および８日目で、非形質導入リンパ球と比較して高い割合（約３０％）のＣＡＲ−ＣＤ１９陽性細胞が見られた。７日目に、生存ＣＤ３＋集団を分析すると、非形質導入リンパ球と比較して高い割合（約７０％）のＣＡＲ−ＣＤ１９陽性細胞が見られた。
いくつかのドナーではＣＡＲ−ＣＤ１９の強力な発現が見られた（ＣＤ３陽性リンパ球の最大７０％）。ＭＯＩ＝３であってもＣＡＲ発現が見られた。しかしながら、高い割合のＣＡＲ陽性細胞は、遅い時点（この実験では７日目）で達成された。興味深いことに、ドナー間のＣＡＲ発現は可変的であった。ＣＡＲ−ＣＤ１９については、ＣＤ３陰性細胞がＣＡＲ−ＣＤ１９を発現しなかったので、発現はＣＤ３陽性集団に限定されていた。
フック−ストレプトアビジン配列を、ＶＳＶ−Ｇとの融合体として、コドン最適化ＶＳＶ−Ｇタンパク質をコードするシュードタイピングベクターにクローニングした。このベクターを、ＧＦＰをコードするレンチベクターおよび漸増用量のフック−ストレプトアビジンコードベクターを用いた同時形質移入により評価した。ＥＲにおけるＶＳＶタンパク質の保持による力価の低下は見られなかった（図４）。免疫蛍光試験は、ＥＲにおけるＶＳＶタンパク質の保持の欠如を示した。これは、ＶＳＶタンパク質単独について見られる結果と対照的である。Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９（５）：４９３〜５００頁（２１０２）。したがって、ＣＡＲ発現がフック−ストレプトアビジンシステムで調節されるか否かは不明であった。
細胞内ドメイン間の様々な位置にストレプトアビジン結合タンパク質（ＳＢＰ）を有するＣＡＲ−ＣＤ１９またはＣＡＲ−ＣＤ１９のＴ細胞の表面での発現を評価して、ＳＢＰ配列の存在がＣＡＲ発現を改変しているか否かを調べた。様々な位置にＳＢＰを有するＣＡＲ−ＣＤ１９＋を、β２ｍプロモーターの制御下でレンチウイルスベクターにクローニングした。
ヒトＴ細胞にレンチウイルスベクターを形質導入し、ＣＤ１９の発現を細胞表面で評価した。ＣＡＲ−ＣＤ１９−ＳＢＰはＴ細胞の表面で発現され、ＣＡＲ−ＣＤ１９と比較してＭＦＩがわずかに低下する（図５）。
細胞内ドメイン間の様々な位置にＳＢＰを有するＣＡＲ−ＣＤ１９レンチベクターを、フック−ストレプトアビジンの存在下で評価した。ヒトＴ細胞を、ＣＡＲ−ＣＤ１９−ＳＢＰを発現するレンチベクターおよびフック−ストレプトアビジンを発現するレンチベクターにより同時形質導入し、形質導入細胞の割合およびＭＦＩをビオチンの添加の前または後に評価した。フック−ストレプトアビジンおよびＣＡＲ−ＣＤ１９−ＳＢＰは、ヒトＴ細胞において共発現され得ることが判明した。フック−ストレプトアビジンの存在は、Ｔ細胞の小胞体中にＣＡＲ−ＣＤ１９−ＳＢＰを保持することができ、培地中のビオチンの添加により、ＣＡＲ−ＣＤ１９の放出および細胞表面でのその発現が誘導された（図６）。
次いで、いくつかのレンチベクターを、様々な場所にＳＢＰを含むＣＡＲとフックの両方を含むように構築した（図１１）。コンストラクトは、フックストレプトアビジンに連結されたβ２ｍプロモーター、続いて３つの異なる位置にＳＢＰを有するＣＡＲ−ＣＤ１９に連結されたＩＲＥＳを含んでいた。
種々のドナーからのヒトＴ細胞にレンチウイルスベクターを形質導入し、ＣＡＲ−ＣＤ１９−ＳＢＰの発現をビオチンの存在下および非存在下で細胞の表面で評価した。フック−ＩＲＥＳ−ＣＡＲ−ＣＤ１９−ＳＢＰはヒトＴ細胞で発現された。フック−ストレプトアビジンの発現は、その位置にかかわらず、Ｔ細胞の小胞体中にＣＡＲ−ＣＤ１９−ＳＢＰを保持することができた。培地中のビオチンの添加は、その位置にかかわらず、ＣＡＲ−ＣＤ１９の放出および細胞表面での発現を誘導した（図７）。
本発明は、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクター、および宿主、特にヒトにおける免疫応答の誘導のためのそれらの使用を包含する。
本発明のタンパク質、組成物、方法および他の実施形態を開示および説明する前に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していないと理解されるべきである。明細書および添付の特許請求の範囲において、文脈から明らかに否定されない限り、単数形は複数の参照対象を包含すると理解されることに留意しなければならない。
本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含める（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」と同義であり、包括的又は開放式（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ）であり、追加の記載されていないメンバー、要素または方法ステップを排除しない。
本開示内容において、アミノ酸の完全な名称は、それぞれの標準的な３文字および１文字の略語と交換可能に使用される。疑いが生じないように、それらは以下の通りである：アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）。
本明細書において、「インビトロ」という用語は、生物（例えば、動物、植物または微生物）内でなく、人工的環境、例えば試験管又は反応容器中、細胞培養液中、ペトリ皿中等で起こる事象を指す。
本明細書において、「インビボ」という用語は、生物（例えば、動物、植物または微生物）内で起こる事象を指す。
本明細書において、「単離された」という用語は、（１）それが（自然の中でまたは実験環境で）最初に生産された時に付随していた成分の少なくとも一部から分離された、並びに（２）人の手によって生産、調製、および／または製造された、物質または実体を指す。単離された物質および／または実体は、それらに最初に付随していたその他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又はそれ以上から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された作用剤は、約８０％超、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書において、他の成分を実質的に含まない場合、物質は「純粋」である。
単離された核酸、タンパク質、ポリペプチドおよび抗体を含む本発明の「単離された」生成物は、天然の産物ではない（すなわち、「天然には存在しない」）。むしろ、本発明の「単離された」核酸、タンパク質、ポリペプチドおよび抗体は、「人工」生成物である。本発明の「単離された」生成物は、天然の生成物と「顕著に異なる」または「有意に異なる」ものとすることができる。非限定的な例として、単離された核酸は、精製され、組換えられ、合成され、標識され、および／または固体基質に結合され得る。そのような核酸は、天然に生じる核酸と顕著に異なるか、または著しく異なる可能性がある。さらなる非限定的な例として、本発明の「単離された」タンパク質、ポリペプチドおよび抗体は、精製され、組換えられ、合成され、標識され、および／または固体基質に結合され得る。そのようなタンパク質、ポリペプチドおよび抗体は、天然に存在するタンパク質、ポリペプチドおよび抗体と顕著に異なるか、または著しく異なる可能性がある。
本明細書において用いる「ペプチド」という用語は、短いポリペプチド、例えば典型的には約５０個未満のアミノ酸、より典型的には約３０個未満のアミノ酸を含むものを指す。本明細書で用いるこの用語は、構造的、したがって生物学的機能を模倣するアナログおよび模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃｓ）を包含する。
「ポリペプチド」という用語は、天然に生じるおよび非天然に生じる、両方のタンパク質およびその断片、変異体、誘導体、およびアナログを包含する。ポリペプチドは、単量体であっても多量体であってもよい。さらに、ポリペプチドは、それぞれが１または複数の別個の活性を有する複数の異なるドメインを含み得る。誤解を避けるために記すと、「ポリペプチド」は２アミノ酸以上の任意の長さであり得る。
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源または由来する源に基づいて、（１）天然状態においてそれに伴う天然に付随する成分が付随していないタンパク質またはポリペプチド、（２）天然には見出されない純度で存在し、その純度は他の細胞材料の存在に関連して決定され得る、タンパク質またはポリペプチド（例えば、同じ種に由来する他のポリペプチドを含まない）、（３）異なる種の細胞から発現されるタンパク質またはポリペプチド、あるいは（４）天然に生じないタンパク質またはポリペプチド（例えば、これは、天然に見出されるポリペプチドの断片であるか、天然には見出されないアミノ酸のアナログ若しくは誘導体または標準的ペプチド結合以外の結合を含む）、である。したがって、化学的に合成されるまたはそれが天然に生じる細胞とは異なる細胞系において合成されるポリペプチドは、その天然の付随成分から「単離され」ている。ポリペプチドまたはタンパク質はまた、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いた単離により、天然付随成分を実質的に含まないようにすることができる。これらの定義から、「単離された」とは、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが、それが合成された細胞から物理的に取り出されていることを必ずしも必要としない。
タンパク質またはポリペプチドは精製することができる。好ましくは、精製されたタンパク質またはポリペプチドは、純度が５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％超である。本発明の状況において、純度が５０％（等）を超える精製タンパク質とは、他のタンパク質を５０％（等）未満含む精製タンパク質試料を意味する。例えば、タンパク質を含む試料は、それが１％未満の混入宿主細胞タンパク質を含有する場合、９９％純粋であり得る。
本明細書で用いる「ポリペプチド断片」という用語は、天然に存在するタンパク質などの完全長ポリペプチドと比較して、欠失、例えばアミノ末端および/またはカルボキシ末端の欠失を有するポリペプチドを指す。一実施形態では、ポリペプチド断片は、断片のアミノ酸配列が天然に存在する配列中の対応する位置と同一である連続配列である。断片は通常、少なくとも５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸長、少なくとも１２、１４、１６もしくは１８アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５、３０、３５、４０もしくは４５アミノ酸、少なくとも５０もしくは６０アミノ酸長、少なくとも７０アミノ酸長、または少なくとも１００アミノ酸長である。
「融合タンパク質」という用語は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチドまたは断片を含むポリペプチドを指す。融合タンパク質は、２つ以上の異なるタンパク質に由来し得る２つ以上の所望の機能的要素を含むように構築できるので有用である。融合タンパク質は、目的のポリペプチドに由来する少なくとも１０連続アミノ酸、少なくとも２０もしくは３０アミノ酸、少なくとも４０、５０もしくは６０アミノ酸、または少なくとも７５、１００もしくは１２５アミノ酸を含む。融合タンパク質中に含まれる異種ポリペプチドは通常、少なくとも６アミノ酸長、少なくとも８アミノ酸長、または少なくとも１５、２０もしくは２５アミノ酸長である。ＩｇＧ Ｆｃ領域等のより大きなポリペプチドとさらに緑色蛍光タンパク質（「ＧＦＰ」）発色団含有タンパク質等のタンパク質全体を含む融合物は特に有用である。融合タンパク質は、異なるタンパク質またはペプチドをコードする核酸配列とインフレームでポリペプチドまたはその断片をコードする核酸配列を構築し、次いで融合タンパク質を発現させることにより、組換え的に生産することができる。あるいは、融合タンパク質は、ポリペプチドまたはその断片を別のタンパク質に架橋結合することにより化学的に生産することができる。
本明細書で使用される「組換え」とは、生体分子、例えば遺伝子もしくはタンパク質、または生物を指してもよい。「組換え」という用語は、クローニングされたＤＮＡ単離物、化学的に合成されたポリヌクレオチド、または異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチド、ならびにそのような核酸によってコードされるタンパク質またはポリペプチドおよび／またはＲＮＡに関して使用され得る。「組換え」核酸は、天然に連結されていないヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに連結された核酸である。「組換え」タンパク質またはポリペプチドは、（１）天然ではそれが連結していないアミノ酸またはポリペプチドに連結しているタンパク質またはポリペプチド、および／または（２）組換え核酸の転写および／または翻訳によって生成されたタンパク質またはポリペプチド、であってよい。したがって、微生物によって合成されたタンパク質は、例えば細胞内に存在する組換え核酸から合成されたｍＲＮＡから合成される場合、組換え体である。「組換え」細胞は、「組換え」生体分子を含む細胞である。例えば、「組換え」核酸を含むＴ細胞は「組換え」細胞である。
「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、「核酸」または「核酸配列」という用語は、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの重合体形態を指す。この用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムもしくは合成のＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然ヌクレオチドアナログ、非天然ヌクレオシド間結合または両方を含むＤＮＡまたはＲＮＡのアナログが含まれる。核酸は任意の形態的コンホメーションであり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的二本鎖、分岐鎖、ヘアピン、環状、または南京錠型（ｐａｄｌｏｃｋｅｄ）コンホメーションであり得る。核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび上記の合成形態および混合重合体のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含み得る。それらは、化学的または生化学的に改変されてよく、あるいは当業者には容易に理解されるように、非天然または誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでいてもよい。そのような改変には、例えば、標識、メチル化、１つ以上の天然ヌクレオチドの類似体による置換、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート化剤、アルキル化剤、および修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸など）のようなヌクレオチド間修飾が含まれる。また、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は当該分野で公知であり、例えば、ペプチド結合が分子の骨格中のリン酸結合を置換する分子を含む。他の修飾には、例えば、リボース環が架橋部分または「ロックされた」核酸に見られる修飾のような他の構造を含むアナログが含まれ得る。
「合成」ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合重合体とは、細胞の外側で作製されたもの、例えば化学的に合成されたものである。
本明細書において、「核酸断片」という用語は、全長参照ヌクレオチド配列と比べて欠失、例えば５’末端または３’末端の欠失を有する核酸配列を指す。一実施形態では、核酸断片は、断片のヌクレオチド配列が天然配列中の対応する位置と同一である連続配列である。いくつかの実施形態では、断片は少なくとも１０、１５、２０もしくは２５ヌクレオチド長、または少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０もしくは１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、核酸配列の断片はオープンリーディングフレーム配列の断片である。いくつかの実施形態では、そのような断片は、オープンリーディングフレームヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質のポリペプチド断片（本明細書で定義）をコードする。
核酸は精製することができる。好ましくは、精製された核酸は、純度が５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％超である。本発明の状況において、純度が少なくとも５０％である精製核酸とは、他の核酸を５０％未満含む精製核酸試料を意味する。例えば、プラスミドの試料は、それが１％未満の混入バクテリアＤＮＡを含有する場合、９９％純粋であり得る。
本明細書において、生物のゲノム中の内因性核酸配列（またはその配列にコードされるタンパク質生産物）は、異種配列が内因性核酸配列に隣接して配置される場合、本明細書中で「組換え型」と見なされる。この文脈で、異種配列とは、内因性核酸配列に天然には隣接していない配列であり、異種配列自体は内因性（同じ宿主細胞またはその子孫を起源とする）であっても、外因性（異なる宿主細胞またはその子孫を起源とする）であってもよい。例えば、宿主細胞のゲノム中の遺伝子の天然プロモーターを（例えば相同組換えにより）あるプロモーター配列に置換して、この遺伝子の発現パターンが変わるようにしてよい。この時、この遺伝子は、それに天然で隣接する配列の少なくとも一部から分離されているので、「組換え型」になる。
核酸はまた、ゲノム中の対応する核酸に天然に起こらない任意の修飾を含む場合、「組換え型」と見なされる。例えば、内因性コード配列は、例えばヒトの介入により、人為的に導入された挿入、欠失または点変異を含む場合、「組換え型」と見なされる。「組換え核酸」はさらに、異種部位の宿主細胞染色体中に組み込まれた核酸およびエピソームとして存在する核酸コンストラクトを含む。
本明細書において、参照核酸配列の「縮重変異体」という語句は、標準的な遺伝暗号に従って翻訳されて、参照核酸配列から翻訳されるのと同じアミノ酸配列を提供できる核酸配列を包含する。「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」という用語は、必ずしも配列が同一ではないが１または複数の特定のセグメント内で互いに相同である標的核酸配列にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを示すために使用される。
核酸配列の文脈における「パーセント配列同一性」または「同一」という用語は、対応が最大となるようにアラインメントした時に同じである２つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、一般的に少なくとも約２０ヌクレオチド、より一般的には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２、さらにより典型的には少なくとも約３６以上のヌクレオチドの一続きにわたり得る。ヌクレオチド配列同一性の測定に用いることができる複数の異なるアルゴリズムが当該技術分野で知られている。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅバージョン１０．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）に含まれるプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリー配列とサーチ配列の間で最も重複する領域のアラインメントおよびパーセント配列同一性を提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３〜９８頁（１９９０）。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、参照により本明細書に援用するＧＣＧバージョン６．１に提供されているように、ＦＡＳＴＡをデフォルトのパラメーター（ｗｏｒｄ ｓｉｚｅ：６、スコアリングマトリックスにＮＯＰＡＭファクター）で用いてまたはＧａｐをデフォルトのパラメーターで用いて決定することができる。あるいは、コンピュータープログラムＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０）；ＧｉｓｈおよびＳｔａｔｅｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６〜２７２頁（１９９３）；Ｍａｄｄｅｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１〜１４１頁（１９９６）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７）；ＺｈａｎｇおよびＭａｄｄｅｎ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９〜６５６頁（１９９７））、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７））を用いて配列を比較することができる。
本明細書において、「発現調節配列」とは、それらが作用可能に連結されているコード配列の発現に影響を与えるポリヌクレオチド配列を指す。発現調節配列は、核酸配列の転写、転写後事象および翻訳を調節する配列である。発現調節配列としては、適切な転写の開始配列、終結配列、プロモーター配列およびエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシングおよびポリアデニル化シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を高める配列；および、所望される場合、タンパク質の分泌を増大させる配列が含まれる。そのような調節配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物では、そのような調節配列としては通常、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列が含まれる。「調節配列」という用語は、最低限、発現にその存在が必須であるあらゆる成分を包含することが意図され、その存在が有利である付加的成分、例えばリーダー配列および融合パートナー配列をさらに包含し得る。
本明細書において、「機能的に連結した（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌ ｌｉｎｋｅｄ）」または「作用可能に連結した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」発現調節配列とは、目的の遺伝子を調節するための目的の遺伝子に発現調節配列が隣接している連鎖および目的の遺伝子を調節するためにトランスにまたは離れて作用する発現調節配列を指す。
本明細書において、「ベクター」とは、それに連結された別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの１種が「プラスミド」であり、これは通常、付加的なＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指すが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅によりまたは環状プラスミドの制限酵素処理により得られるもの等の線状二本鎖分子も含む。他のベクターとしては、コスミド、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。別の種類のベクターは、付加的ＤＮＡセグメントがウイルスゲノム中にライゲーションされ得るウイルスベクターである（以下にさらに詳細に説明）。ある特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的に複製できる（例えば、宿主細胞中で機能する複製起源を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得、それにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを本明細書中では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。組み込みコスミドベクターｐＹＵＢ４１２は「ベクター」の例である。
本明細書において、「組換え宿主細胞」（または単に「組換え細胞」または「宿主細胞」）という用語は、組換えベクター等の組換え核酸が導入された細胞を指すことが意図される。場合によっては、「細胞」という語は、細胞の種類を特定する名前で置き換えられる。例えば、「組換え微生物」とは、微生物宿主細胞である組換え宿主細胞である。このような用語は、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されると理解されるべきである。変異または環境の影響に起因して次の世代で特定の修飾が起こり得るので、そのような子孫は、事実上、親細胞と同一でないことがあるが、それでも本明細書において「組換え宿主細胞」、「組換え細胞」および「宿主細胞」という用語の範囲に含まれる。組換え宿主細胞は、培養中で成長させた単離された細胞または細胞株であってもよく、生きた組織または生物中にある細胞であってもよい。
本明細書において、「哺乳動物」という用語は、分類学的クラス哺乳動物の任意のメンバー、例えば胎盤性哺乳動物および有袋類哺乳動物を指す。したがって、「哺乳動物」には、ヒト、霊長類、家畜および実験哺乳動物が含まれる。哺乳動物の例としては、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、ラマ、ウシ、霊長類、ブタ、および任意の他の哺乳動物が含まれる。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、トランスジェニック哺乳動物、遺伝子操作された哺乳動物およびクローン化された動物の少なくとも１つである。
キメラ抗原レセプター
本発明は、細胞外抗原結合ドメイン（結合ドメイン）、ヒンジおよび膜貫通ドメイン（膜貫通ドメイン）；フック結合ドメイン；および細胞内シグナル伝達ドメイン（活性化ドメイン）を含むキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を包含する。ＣＡＲは、これらドメインのそれぞれの１つ、２つ、３つまたはそれ以上を含むことができる。
本発明は、本明細書中に列挙される特定のポリペプチドおよびその断片の可能なすべての組み合わせを個々に包含する。
本発明は、フック結合ドメインを含むＣＡＲを包含する。「フック結合ドメイン」は、細胞内の「フック」タンパク質に直接的または間接的に可逆的に結合するドメインであり、その結合によりＣＡＲが適切な条件下で小胞体（ＥＲ）またはゴルジから出るのが妨げられる。
一実施形態では、フック結合ドメインは、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）を含み、これにより、コアストレプトアビジンを持つフックタンパク質に結合することができる。ビオチンは、ＳＢＰを打ち負かすことによってフック結合ドメインを含むＣＡＲをフックから解放する。次いで、ＣＡＲは細胞膜に移動することができる。
好ましくは、ＲＵＳＨ（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｏｏｋｓ）システムと呼ばれるシステムを使用することができる。Ｂｏｎｃｏｍｐａｉｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：４９３〜４９８頁、２０１２が出典明記によって本明細書中に援用される。
好ましくは、フック結合ドメインは、アミノ酸配列：MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP（配列番号１）を含むか、あるいは、核酸配列：ATGGACGAGAAAACCACCGGCTGGCGGGGAGGCCACGTGGTGGAAGGACTGGCCGGCGAGCTGGAACAGCTGCGGGCCAGACTGGAACACCACCCCCAGGGCCAGAGAGAGCCC（配列番号２）によってコードされる。
そのＮ末端およびＣ末端で欠失したより短いＳＢＰ断片を、同一の有効性で使用してもよい。Ｂａｒｒｅｔｔｅ−Ｎｇ，Ｉ．Ｈ．、Ｓ．Ｃ．Ｗｕ、Ｗ．Ｍ．Ｔｊｉａ、Ｓ．Ｌ．ＷｏｎｇおよびＫ．Ｋ．Ｎｇ．２０１３、「Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＳＢＰ−Ｔａｇ−ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｈｅｌｉｃａｌ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｏｃｋｅｔｓ ｏｎ ｓｅｐａｒａｔｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ」、Ａｃｔａ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ６９：８７９〜８８７頁を参照のこと。
フック結合ドメインの一実施形態は、国際公開公報２０１０／１４２７８５に記載されており、これは出典明記により本明細書に援用される。ＦＫＢＰＦ−Ｋ５０６結合ドメイン１２（ＦＫＢＰＩ２）は、ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合タンパク質（ＦＲＡＰ）をフックとして使用することができる。この実施形態では、相互作用は、ＦＫＢＰ１２とＦＲＡＰとの間の相互作用を媒介することができ、特にＦＫＩ０１２、ＦＫ−ＣｓＡおよびラパマイシンからなる群から選択することができるラパマイシンまたはその類似体の存在下でのみ起こる。
一実施形態において、フック結合ドメインは、ＣＡＲの細胞質内領域に位置する。他の実施形態では、フック結合ドメインは、他の位置、すなわち、異なる細胞質内エレメント間（例えば、膜貫通領域と第一の共刺激エレメントとの間）または異なる共刺激エレメント間のすべての接合部に位置する。
本発明は、ヒトポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む結合ドメインを含むＣＡＲを含む。「抗体」という用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片などの断片、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、一ドメイン抗体フラグメント（ＶＨＨまたはナノボディ、好ましくは、ラクダ科動物）、および二価および三価の抗体断片（ダイアボディおよびトリアボディ）が挙げられる。
好ましくは、抗体は一本鎖Ｆｖ抗体またはナノボディである。
一実施形態では、抗体は単一特異性である。一実施形態では、抗体は、２、３または４つのポリペプチドに対して多重特異性である。好ましくは、抗体は二重特異性である。
抗体は、合成、モノクローナル、またはポリクローナルであってよく、当技術分野でよく知られる技術によって作製されうる。そのような抗体は、（非特異的結合とは対照的に）抗体の抗原結合部位を介してヒトタンパク質に特異的に結合する。ヒトタンパク質、ポリペプチド断片およびペプチドは、それと免疫反応する抗体を産生する際の免疫原として使用することができる。ヒトタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドは、抗体の形成を誘発する抗原決定基またはエピトープを含む。
これらの抗原決定基またはエピトープは、直鎖または立体配座（不連続）のいずれかでありうる。直鎖エピトープは、ポリペプチドのアミノ酸の単一セクションから構成され、立体構造または不連続エピトープは、タンパク質折りたたみ時に近接してもたらされるポリペプチド鎖の異なる領域からのアミノ酸セクションから構成される（ＣＡ Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．およびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：９（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、第２版、１９９６）参照）。折り畳まれたタンパク質は複雑な表面を有するため、利用可能なエピトープの数は非常に多い。しかしながら、タンパク質の立体配座および立体障害のために、エピトープに実際に結合する抗体の数は、利用可能なエピトープの数よりも少ない（ＣＡ Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．およびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、第２版、１９９６））。エピトープは、当該分野で知られる任意の方法によって同定することができる。
したがって、本発明の一態様は、ヒトタンパク質の抗原性エピトープに関する。そのようなエピトープは、以下に詳細に記載するように、抗体、特にモノクローナル抗体を産生するために有用である。
抗体は、約１０７Ｍ−１以上のＫａでヒトタンパク質またはポリペプチドに結合する場合、特異的に結合すると定義される。結合相手または抗体の親和性は、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０（１９４９）に記載されるものなどの従来技術を用いて容易に決定することができる。
ポリクローナル抗体は、当技術分野においてよく知られる手順を用いて、様々な供給源、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから容易に作製することができる。一般に、適切にコンジュゲートされた精製ヒトタンパク質またはポリペプチドは、典型的には、非経口注射によって宿主動物に投与される。免疫原性は、アジュバント、例えば、フロイント完全または不完全アジュバントの使用によって増強してもよい。追加免疫化後、少量の血清試料を採取し、ヒトタンパク質またはポリペプチドに対する反応性について試験する。このような測定に有用な種々のアッセイの例としては、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８に記載されるもの；ならびに、向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈降、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイおよびサンドイッチアッセイなどの手順が含まれる。米国特許第４３７６１１０号および第４４８６５３０号を参照のこと。
モノクローナル抗体は、よく知られる手順を用いて容易に調製することができる。例えば、米国特許第ＲＥ３２０１１号、第４９０２６１４号、第４５４３４３９号、第４４１１９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ： Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｋｅｎｎｅｔｔ、ＭｃＫｅａｍおよびＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０に記載されている手順を参照のこと。
例えば、マウスなどの宿主動物は、単離され精製されたヒトタンパク質またはコンジュゲートされたヒトポリペプチド、例えば、前記特定のアミノ酸を含むかまたはそれからなるペプチドを、およそ３週間間隔で少なくとも１回、好ましくは少なくとも２回腹腔内投与されうる。次いで、マウス血清を、従来のドットブロット技術または抗体捕捉（ＡＢＣ）によってアッセイして、どの動物が融合するために最も適切かを決定する。およそ２〜３週間後、マウスに、ヒトタンパク質またはポリペプチドの静脈内ブーストを与える。その後、マウスを屠殺し、確立されたプロトコールに従って、Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）などの市販の骨髄腫細胞と脾臓細胞を融合した。簡潔に述べると、骨髄腫細胞を培地中で数回洗浄し、マウス脾臓細胞と約３個の脾臓細胞と１個の骨髄腫細胞の比で融合させる。融合剤は、当技術分野で使用される任意の適切な薬剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であってよい。融合細胞を選択的に増殖させる培地を含むプレートに融合物をプレーティングする。次いで融合細胞を約８日間増殖させうる。得られたハイブリドーマからの上清を回収し、最初にヤギ抗マウスＩｇでコーティングしたプレートに加える。洗浄後、標識されたヒトタンパク質またはポリペプチドなどの標識を各ウェルに加え、続いてインキュベーションする。その後、陽性ウェルを検出することができる。陽性クローンをバルク培養で増殖させ、続いて上清をプロテインＡカラム（ファルマシア）で精製する。
本発明のモノクローナル抗体は、出典明記によって本明細書中に援用されるＡｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ： Ａ Ｒａｐｉｄ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３：１〜９頁（１９９０）に記載されるものなどの、代替的な技術を用いて製造されうる。同様に、特異的結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を組み込むために、組換えＤＮＡ技術を用いて結合パートナーを構築することができる。そのような技術は、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７：３９４（１９８９）に記載されている。
このような抗体の抗原結合断片（これは、従来の技術によって製造されうる）も本発明に包含される。このような断片の例としては、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子工学技術によって製造された抗体断片および誘導体もまた提供される。
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えばネズミ科モノクローナル抗体のヒト化バージョンが含まれる。そのようなヒト化抗体は、知られる技術によって調製することができ、抗体をヒトに投与する場合、免疫原性が低下するという利点を提供する。一実施形態では、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変領域（またはその抗原結合部位のみ）およびヒト抗体由来の定常領域を含む。あるいは、ヒト化抗体断片は、ネズミ科モノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域断片（抗原結合部位を欠く）を含みうる。キメラおよびさらなる改変モノクローナル抗体の製造のための手順には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３頁、１９８８）、Ｌｉｕ ら（ＰＮＡＳ ８４：３４３９頁、１９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋ ら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４頁、１９８９）およびＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ １４：１３９、Ｍａｙ、１９９３）に記載されているものが含まれる。抗体をトランスジェニックで作製する手順は、英国特許第２２７２４４０号、米国特許第５５６９８２５号および第５５４５８０６号に見られる。
標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製することができるヒトおよび非ヒト部分の両方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体などの、遺伝子工学的方法によって産生された抗体を使用することができる。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で知られる標準的なＤＮＡ技術を用いて、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎら、国際公開公報８７／０２６７１；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願０１８４１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、Ｍ．、欧州特許出願０１７１４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願０１７３４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ国際公開公報８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４８１６５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第０１２５０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１〜１０４３頁、１９８８；Ｌｉｕら、ＰＮＡＳ ８４：３４３９〜３４４３頁、１９８７；Ｌｉｕら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１〜３５２６頁、１９８７；Ｓｕｎら、ＰＮＡＳ ８４：２１４〜２１８頁、１９８７；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９〜１００５頁、１９８７；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４４６〜４４９頁、１９８５；およびＳｈａｗら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３〜１５５９頁、１９８８；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓ．Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２〜１２０７頁、１９８５；Ｏｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、１９８６；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５２２５５３９号；Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２ ５２５、１９８６；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４、１９８８；およびＢｅｉｄｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３〜４０６０頁、１９８８に記載の方法を用いた遺伝工学技術によって製造されうる。
免疫グロブリンライブラリーは、好ましくは糸状ファージに由来するディスプレイパッケージの集団によって発現されて、抗体ディスプレイライブラリーを形成することができる。抗体ディスプレイライブラリーを作製する際に特に使用しやすい方法および試薬の例は、例えば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５２２３４０９号；Ｋａｎｇら、国際公開公報９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、国際公開公報９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、国際公開公報９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、国際公開公報９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、国際公開公報９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際公開公報９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、国際公開公報９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら、国際公開公報９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０〜１３７２頁；Ｈａｙら、（１９９２）Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１〜８５頁；Ｈｕｓｅら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５〜１２８１頁；Ｇｒｉｆｆｔｈｓら、（１９９３）上掲；Ｈａｗｋｉｎｓら、（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９〜８９６頁；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４〜６２８頁；Ｇｒａｍら、（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６〜３５８０頁；Ｇａｒｒａｄら、（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３〜１３７７頁；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３〜４１３７頁；および、Ｂａｒｂａｓら、（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８〜７９８２頁に見られる。ディスプレイパッケージ（例えば、糸状ファージ）の表面上に表示されると、抗体ライブラリーをスクリーニングして、ヒトタンパク質またはポリペプチドに結合する抗体を発現するパッケージを同定および単離する。好ましい実施形態では、ライブラリーの一次スクリーニングは、固定化ヒトタンパク質またはポリペプチドによるパンニングを含み、固定化ヒトタンパク質またはポリペプチドに結合する抗体を発現するディスプレイパッケージが選択される。
合成および半合成の抗体に関連して、そのような用語は、抗体フラグメント、アイソタイプスイッチド抗体、ヒト化抗体（例えば、マウス−ヒト、ヒト−マウス）、ハイブリッド、多特異性を有する抗体、および完全に合成された抗体様分子を包含するが、これらに限定されない。
本発明は、ＣＤ３−ζまたはＦｃ受容体γアミノ酸配列を含む活性化ドメインを含むＣＡＲを包含する。出典明記によってここに援用されるＳａｄｅｌａｉｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３年４月、３（４）：３８８〜３９８頁を参照。本発明はさらに、ＣＤ３−ζ鎖と、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７またはＣＤ４０Ｌのような共刺激レセプターの細胞質ドメインを含む活性化ドメインを含むＣＡＲを包含する。上掲。
好ましくは、ＣＡＲは、Ｔ細胞活性化活性を有する以下のアミノ酸配列の少なくとも１つの少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０または２００アミノ酸の断片を含む。
ＣＤ３−ζ
MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP QRRKNPQEGL YNELQKDKMA EAYSEIGMKG ERRRGKGHDG LYQGLSTATK DTYDALHMQA LPPR （配列番号３）
ＣＤ２８：
MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLD SAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPP PYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLV TVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS （配列番号４）
４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）：
MGNSCYNIVA TLLLVLNFER TRSLQDPCSN CPAGTFCDNN RNQICSPCPP NSFSSAGGQR TCDICRQCKG VFRTRKECSS TSNAECDCTP GFHCLGAGCS MCEQDCKQGQ ELTKKGCKDC CFGTFNDQKR GICRPWTNCS LDGKSVLVNG TKERDVVCGP SPADLSPGAS SVTPPAPARE PGHSPQIISF FLALTSTALL FLLFFLTLRF SVVKRGRKKL LYIFKQPFMR PVQTTQEEDG CSCRFPEEEE GGCEL （配列番号５）
ＤＡＰ１０：
MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA SLLIVGAVFL CARPRRSPAQ EDGKVYINMP GRG （配列番号６）
ＯＸ４０（ＣＤ１３４）：
MCVGARRLGR GPCAALLLLG LGLSTVTGLH CVGDTYPSND RCCHECRPGN GMVSRCSRSQ NTVCRPCGPG FYNDVVSSKP CKPCTWCNLR SGSERKQLCT ATQDTVCRCR AGTQPLDSYK PGVDCAPCPP GHFSPGDNQA CKPWTNCTLA GKHTLQPASN SSDAICEDRD PPATQPQETQ GPPARPITVQ PTEAWPRTSQ GPSTRPVEVP GGRAVAAILG LGLVLGLLGP LAILLALYLL RRDQRLPPDA HKPPGGGSFR TPIQEEQADA HSTLAKI （配列番号：７）
ＩＣＯＳ：
MKSGLWYFFLFCLRIKVLTGEINGSANYEMFIFHNGGVQILCKYPDIVQQFKMQLLKGGQILCDLTKTKGSGNTVSIKSLKFCHSQLSNNSVSFFLYNLDHSHANYYFCNLSIFDPPPFKVTLTGGYLHIYESQLCCQLKFWLPIGCAAFVVVCILGCILICWLTKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL （配列番号：８）
ＣＤ２７：
MARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP （配列番号：３３）
ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）：
MIETYNQTSPRSAATGLPISMKIFMYLLTVFLITQMIGSALFAVYLHRRLDKIEDERNLHEDFVFMKTIQRCNTGERSLSLLNCEEIKSQFEGFVKDIMLNKEETKKENSFEMQKGDQNPQIAAHVISEASSKTTSVLQWAEKGYYTMSNNLVTLENGKQLTVKRQGLYYIYAQVTFCSNREASSQAPFIASLCLKSPGRFERILLRAANTHSSAKPCGQQSIHLGGVFELQPGASVFVNVTDPSQVSHGTGFTSFGLLKL （配列番号：３４）
様々な実施形態において、ＣＡＲは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号：３３または配列番号：３４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％より多く、より好ましくは９９％より多くの同一性を共有する、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０または２００アミノ酸の断片を含む。
様々な実施形態において、ＣＡＲの活性化ドメインは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号：３３または配列番号：３４のアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは９５％より多く、より好ましくは９９％より多くの同一性を共有する、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０または２００アミノ酸の断片の１つ、２つ、３つまたはそれ以上を含む。
本発明は、膜貫通（ＴＭ）ドメイン、好ましくは少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０または２００アミノ酸の断片、最も好ましくはＣＤ２８、ＣＤ３ｚ、ＣＤ８、ＣＤ４、ＦｃＲγ、ＴＭ領域の少なくとも１つのものを含む。
ＣＡＲは精製されうる。好ましくは、精製されたＣＡＲは、純度が５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％超である。本発明の文脈において、純度が５０％（等）超である精製されたＣＡＲは、５０％（等）未満の他のタンパク質を含有する精製されたＣＡＲ試料を意味する。例えば、宿主細胞から精製された組換えＣＡＲの試料は、それが１％未満の混入宿主細胞タンパク質を含有する場合、９９％純粋であり得る。
好ましい実施形態において、ＣＡＲは、配列番号４６、配列番号４８または配列番号５０のいずれかのアミノ酸配列をコードする。
特に好ましいＣＡＲは、シグナル配列、ＣＤ１９ ＳｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢおよび／またはＣＤ３ｚ配列を含む、図１１に示されるＣＡＲの構成要素のいずれかをコードするものを含む。他の好ましいＣＡＲには、配列番号４４?５０のＣＡＲの構成要素のいずれかをコードするものが含まれる。特に好ましいＣＡＲは、別の結合領域によって置換されたＣＤ１９ ＳｃＦｖドメインを有する。
核酸
本発明は、ＣＡＲをコードする核酸を包含する。核酸は、一本鎖または二本鎖でありうる。核酸は、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子でありうる。好ましい核酸は、本明細書に詳述される配列番号の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする。本発明は、ベクターに挿入された本発明の単離された核酸を包含する。
一実施形態では、核酸配列は、配列番号２の核酸配列を含む。一実施形態では、核酸配列は、以下の核酸配列の１つまたはそれ以上を含む。
ＨＯＯＫ：（ＣＯＲＥ＋ＨＡ ＴＡＧ＋他の配列)
ATGCACCGGAGGAGATCACGCTCTTGTAGGGAGGACCAGAAACCTGTCACCGGTGACCCTAGCAAAGACTCAAAAGCTCAGGTGTCCGCTGCCGAGGCTGGCATTACTGGAACATGGTACAATCAGCTCGGGAGCACCTTTATTGTGACTGCTGGAGCCGATGGAGCCCTCACCGGAACATACGAATCTGCTGTGGGAAACGCCGAATCACGGTACGTCCTCACTGGCCGATACGATAGTGCCCCTGCCACCGACGGATCTGGGACTGCCCTGGGATGGACTGTCGCTTGGAAAAACAACTACCGGAATGCTCATTCTGCCACAACATGGAGTGGACAGTACGTGGGAGGCGCTGAGGCTAGAATCAATACACAGTGGCTGCTCACATCTGGCACAACCGAGGCAAATGCTTGGAAATCCACCCTGGTGGGACATGACACATTCACCAAAGTGAAACCCTCCGCCGCTTCAATCGATGCCGCCAAAAAAGCCGGAGTCAACAACGGCAATCCTCTGGATGCCGTCCAGCAGGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCAGTCGGACCGATGGACGATCAGAGGGACCTCATTAGCAACAACGAACAGCTGCCTATGCTGGGACGGCGACCTGGAGCCCCTGAATCCAAATGCTCTAGGGGAGCACTGTACACTGGCTTCTCCATTCTCGTGACACTGCTGCTGGCCGGGCAGGCTACTACTGCTTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGGGCGGCTGGACAAACTCACTGTGACATCTCAGAACCTCCAGCTGGAAAATCTGAGGATGAAACTGCCCAAACCCCCTAAACCCGTGTCCAAAATGAGGATGGCCACACCTCTGCTCATGCAGGCACTGCCAATGGGAGCCCTGCCCCAGGGGCCCATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTGAAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACTGGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCACTGACGCTCCACCGAAAGAGTCACTGGAACTGGAGGACCCGTCTTCTGGGCTGGGTGTGACCAAGCAGGATCTGGGCCCAGTCCCCATGTGA （配列番号３５）。
コアストレプトアビジン：
GACCCTAGCAAAGACTCAAAAGCTCAGGTGTCCGCTGCCGAGGCTGGCATTACTGGAACATGGTACAATCAGCTCGGGAGCACCTTTATTGTGACTGCTGGAGCCGATGGAGCCCTCACCGGAACATACGAATCTGCTGTGGGAAACGCCGAATCACGGTACGTCCTCACTGGCCGATACGATAGTGCCCCTGCCACCGACGGATCTGGGACTGCCCTGGGATGGACTGTCGCTTGGAAAAACAACTACCGGAATGCTCATTCTGCCACAACATGGAGTGGACAGTACGTGGGAGGCGCTGAGGCTAGAATCAATACACAGTGGCTGCTCACATCTGGCACAACCGAGGCAAATGCTTGGAAATCCACCCTGGTGGGACATGACACATTCACCAAAGTGAAACCCTCCGCCGCTTCAATCGATGCCGCCAAAAAAGCCGGAGTCAACAACGGCAATCCTCTGGATGCCGTCCAGCAG （配列番号３６）。
ＨＡ ＴＡＧ：TATCCGTACGACGTACCAGACTACGCA （配列番号３７）。
好ましい核酸は、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１５０、２００、３００、４００、５００または６００ヌクレオチドである。
核酸は精製されうる。好ましくは、精製された核酸は、純度が５０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％超である。本発明の文脈において、純度が５０％超である精製された核酸は、５０％未満の他のタンパク質を含有する精製された核酸試料を意味する。例えば、宿主バクテリアから精製されたプラスミドの試料は、それが１％未満の混入バクテリアＤＮＡを含有する場合、９９％純粋であり得る。
特に好ましい核酸には、以下のものが含まれる。
ＣＡＲ＿ＣＤ１９ 第２世代：１５１８ｂｐ
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTCCTGCTGCATGCCGCCAGACCCGCTAGCGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACCGGCGGAGGCGGAAGTGGAGGTGGAGGATCTGGCGGCGGAGGCTCCGAAGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTCGTGGCCCCTAGCCAGAGCCTGTCCGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCCGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCTCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGCCATATGGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCCACCACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCCCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGATATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACAAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCATTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCAGCTGCCGGTTCCCCGAGGAAGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCCCAAGCTGTGCTACCTGCTGGACGGCATCCTGTTCATCTATGGCGTGATCCTGACCGCCCTGTTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCCAGCGGCGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTAC （配列番号３９）
ＣＡＲ＿ＣＤ１９第３世代：１６４１ｂｐ
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTCGCTCTGCTGCTGCATGCCGCCAGACCCGCTAGCGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACCGGCGGAGGCGGAAGTGGAGGGGGAGGATCTGGCGGCGGAGGCTCCGAAGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTGGCCCCTAGCCAGAGCCTGTCCGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCCGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGCCATATGGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCCACCACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCCCTGAGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGATATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCGGTCCAAGCGGAGCAGACTGCTGCACTCCGACTACATGAACATGACCCCCAGACGGCCTGGCCCCACCCGGAAGCACTACCAGCCTTACGCCCCTCCCCGGGACTTCGCCGCCTACAGAAGCAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCAGCTGCCGGTTCCCCGAGGAAGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCCCAAGCTGTGCTACCTGCTGGACGGCATCCTGTTCATCTATGGCGTGATCCTGACCGCCCTGTTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGCAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCTCAGCGGCGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTAC （配列番号４０）
特に好ましい核酸には、シグナル配列、ＣＤ１９ ＳｃＦｖ、ＣＤ８ヒンジ、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢおよび／またはＣＤ３ｚ配列を含む、図９に示されるＣＡＲの構成要素のいずれかを含むかまたはコードするものが含まれる。他の好ましい核酸には、配列番号４５〜５０のＣＡＲの構成要素のいずれかを含むかまたはコードするものが含まれる。
いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーター、好ましくはＵＢＣまたはβ２Ｍに作動可能に連結されたフック、およびＩＲＥＳに作動可能に連結されたフック結合タンパク質を含むＣＡＲを含む。好ましい実施形態において、フックはストレプトアビジンタンパク質、好ましくはコアストレプトアビジンであり、フック結合タンパク質はストレプトアビジン結合タンパク質である。
ベクター
本発明は、ＣＡＲおよびフック結合ドメインをコードするベクターを包含する。好ましいベクターは、核酸配列を含むか、または本明細書に詳述される配列番号の少なくとも１つのアミノ酸配列をコードする。
ベクターは、「フック」をさらにコードしうる。「フック」は、直接的または間接的にＣＡＲ内のフック結合ドメインを可逆的に結合することによって、フック結合ドメインを含むＣＡＲが小胞体（ＥＲ）またはゴルジ体から出るのを妨げるタンパク質である。
保持は、タンパク質のトポロジーおよび相互作用ドメインによるタグ付けの方向に依存して、ＥＲの内腔またはその細胞質面で起こりうる。出典明記により本明細書に援用されるＢｏｎｃｏｍｐａｉｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５．１９．１−１５．１９．１６、２０１２年１２月。
いくつかの実施形態では、ＥＲのためのフックは、ＥＲに局在するが、微小管に結合することができない間質相互作用分子１（ＳＴＩＭ１−ＮＮ；Ｉ型タンパク質）の変異体、Ｎ末端アルギニンベースのモチーフを有する主要組織適合複合体（Ｉｉ；ＩＩ型タンパク質）のヒト不変鎖のアイソフォーム；またはＣ末端ＥＲ保持シグナル（Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ；ＫＤＥＬ）を含む。出典明記により本明細書に援用されるＢｏｎｃｏｍｐａｉｎら、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ９：４９３〜４９８頁、２０１２。フックは、フック結合タンパク質に依存して、それらの腔内または細胞質ドメイン内のコアストレプトアビジンに融合することができる。上掲。図１。
他の実施形態において、ゴルジ体のためのフックは、細胞質ゴルジフックとして使用されるゴルジン−８４でありうる。上掲。
好ましくは、フックは、ストレプトアビジンタンパク質配列、最も好ましくはコアストレプトアビジンを含む。出典明記により本明細書に援用される米国特許第５６７２６９１号。
好ましくは、フックは、以下のストレプトアビジンタンパク質配列の１つを含む。
MDPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ （配列番号３１）、または、
MDPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYTLTGRYDSAPATDGSGTALGWRVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWTLTSGTTEANAWKSTLRGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQ （配列番号３２）、または、
MHRRRSRSCREDQKPVTGDPSKDSKAQVSAAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGNAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNYRNAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASIDAAKKAGVNNGNPLDAVQQVDYPYDVPDYAVGPMDDQRDLISNNEQLPMLGRRPGAPESKCSRGALYTGFSILVTLLLAGQATTAYFLYQQQGRLDKLTVTSQNLQLENLRMKLPKPPKPVSKMRMATPLLMQALPMGALPQGPMQNATKYGNMTEDHVMHLLQNADPLKVYPPLKGSFPENLRHLKNTMETIDWKVFESWMHHWLLFEMSRHSLEQKPTDAPPKESLELEDPSSGLGVTKQDLGPVPM （配列番号４２）。
好ましくは、フックは以下のヌクレオチド配列によってコードされる。
ATGCACCGGAGGAGATCACGCTCTTGTAGGGAGGACCAGAAACCTGTCACCGGTGACCCTAGCAAAGACTCAAAAGCTCAGGTGTCCGCTGCCGAGGCTGGCATTACTGGAACATGGTACAATCAGCTCGGGAGCACCTTTATTGTGACTGCTGGAGCCGATGGAGCCCTCACCGGAACATACGAATCTGCTGTGGGAAACGCCGAATCACGGTACGTCCTCACTGGCCGATACGATAGTGCCCCTGCCACCGACGGATCTGGGACTGCCCTGGGATGGACTGTCGCTTGGAAAAACAACTACCGGAATGCTCATTCTGCCACAACATGGAGTGGACAGTACGTGGGAGGCGCTGAGGCTAGAATCAATACACAGTGGCTGCTCACATCTGGCACAACCGAGGCAAATGCTTGGAAATCCACCCTGGTGGGACATGACACATTCACCAAAGTGAAACCCTCCGCCGCTTCAATCGATGCCGCCAAAAAAGCCGGAGTCAACAACGGCAATCCTCTGGATGCCGTCCAGCAGGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCAGTCGGACCGATGGACGATCAGAGGGACCTCATTAGCAACAACGAACAGCTGCCTATGCTGGGACGGCGACCTGGAGCCCCTGAATCCAAATGCTCTAGGGGAGCACTGTACACTGGCTTCTCCATTCTCGTGACACTGCTGCTGGCCGGGCAGGCTACTACTGCTTACTTCCTGTACCAGCAGCAGGGGCGGCTGGACAAACTCACTGTGACATCTCAGAACCTCCAGCTGGAAAATCTGAGGATGAAACTGCCCAAACCCCCTAAACCCGTGTCCAAAATGAGGATGGCCACACCTCTGCTCATGCAGGCACTGCCAATGGGAGCCCTGCCCCAGGGGCCCATGCAGAATGCCACCAAGTATGGCAACATGACAGAGGACCATGTGATGCACCTGCTCCAGAATGCTGACCCCCTGAAGGTGTACCCGCCACTGAAGGGGAGCTTCCCGGAGAACCTGAGACACCTTAAGAACACCATGGAGACCATAGACTGGAAGGTCTTTGAGAGCTGGATGCACCATTGGCTCCTGTTTGAAATGAGCAGGCACTCCTTGGAGCAAAAGCCCACTGACGCTCCACCGAAAGAGTCACTGGAACTGGAGGACCCGTCTTCTGGGCTGGGTGTGACCAAGCAGGATCTGGGCCCAGTCCCCATGTGA （配列番号４３）。
いくつかの実施形態では、配列番号３１または配列番号３２のａａ４９のグリシンがバルク残基（例えばスレオニン）で置換され、ＳＢＰ結合親和性に影響を及ぼさずにビオチン結合親和性を低下させる。出典明記により本明細書に援用されるＷｕら、ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（７）：ｅ６９５３０（２０１３）。ビオチンよりＳＢＰ結合をさらに好むように、別の突然変異を導入することもできる（突然変異Ｓ２７Ａ）。
いくつかの実施形態では、ベクターは、プロモーター、好ましくはＵＢＣまたはβ２Ｍに作動可能に連結されたフック、およびＩＲＥＳに作動可能に連結されたフック結合タンパク質を含むＣＡＲを含む。
好ましいＩＲＥＳヌクレオチド配列は、以下の通りである。
GCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACGCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAA （配列番号４４）
好ましい実施形態において、フックはストレプトアビジンタンパク質、好ましくはコアストレプトアビジンであり、フック結合タンパク質はストレプトアビジン結合タンパク質である。好ましいベクターは、以下のヌクレオチドまたはアミノ酸配列のいずれかを含むレンチベクターである。
ＣＡＲ−ＣＤ１９第２世代−ＳＢＰ１（ｎｔ）：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTCCTGCTGCATGCCGCCAGACCCGCTAGCGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACCGGCGGAGGCGGAAGTGGAGGTGGAGGATCTGGCGGCGGAGGCTCCGAAGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTCGTGGCCCCTAGCCAGAGCCTGTCCGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCCGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCTCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGCCATATGGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCCACCACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCCCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGATATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCACCGGTATGGACGAGAAAACCACCGGCTGGCGGGGAGGCCACGTGGTGGAAGGACTGGCCGGCGAGCTGGAACAGCTGCGGGCCAGACTGGAACACCACCCCCAGGGCCAGAGAGAGCCCAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCAGCTGCCGGTTCCCCGAGGAAGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCCCAAGCTGTGCTACCTGCTGGACGGCATCCTGTTCATCTACGGCGTGATCCTGACCGCCCTGTTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCCAGCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTAC （配列番号４５）
ＣＡＲ−ＣＤ１９第２世代−ＳＢＰ１（ａａ）：
MALPVTALLLPLALLLHAARPASDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSHMALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITTGMDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREPKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY （配列番号４６）
ＣＡＲ−ＣＤ１９第２世代−ＳＢＰ２（ｎｔ）：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTCCTGCTGCATGCCGCCAGACCCGCTAGCGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACCGGCGGAGGCGGAAGTGGAGGTGGAGGATCTGGCGGCGGAGGCTCCGAAGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTCGTGGCCCCTAGCCAGAGCCTGTCCGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCCGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCTCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGCCATATGGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCCACCACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCCCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGATATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACAAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCAGCTGCCGGTTCCCCGAGGAAGAGGAAGGCGGCTGCGAGCTGACCGGTATGGACGAGAAAACCACCGGCTGGCGGGGAGGCCACGTGGTGGAAGGACTGGCCGGCGAGCTGGAACAGCTGCGGGCCAGACTGGAACACCACCCCCAGGGCCAGAGGGAACCCCCCAAGCTGTGCTACCTGCTGGACGGCATCCTGTTCATCTACGGCGTGATCCTGACCGCCCTGTTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCCAGCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTAC （配列番号４７）
ＣＡＲ−ＣＤ１９第２世代−ＳＢＰ２（ａａ）：
MALPVTALLLPLALLLHAARPASDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSHMALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELTGMDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREPPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY （配列番号４８）
ＣＡＲ−ＣＤ１９第２世代−ＳＢＰ３（ｎｔ）：
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCTCTCCTGCTGCATGCCGCCAGACCCGCTAGCGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTGAGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTCCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCTGGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAAGGCAACACCCTGCCCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACCGGCGGAGGCGGAAGTGGAGGTGGAGGATCTGGCGGCGGAGGCTCCGAAGTGAAGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTCGTGGCCCCTAGCCAGAGCCTGTCCGTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCCGACTACGGCGTGTCCTGGATCAGACAGCCTCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGGCAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCATCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACCGTGTCCAGCCATATGGCCCTGAGCAACAGCATCATGTACTTCAGCCACTTCGTGCCCGTGTTTCTGCCCGCCAAGCCCACCACCACCCCTGCCCCTAGACCTCCCACCCCAGCCCCAACAATCGCCAGCCAGCCTCTGTCCCTGCGGCCCGAAGCCTGTAGACCTGCTGCCGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGATATCTACATCTGGGCCCCTCTGGCCGGCACCTGTGGCGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACAAAGCGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGCGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAAGAGGACGGCTGCAGCTGCCGGTTCCCCGAGGAAGAGGAAGGCGGCTGCGAACTGCCCAAGCTGTGCTACCTGCTGGACGGCATCCTGTTCATCTACGGCGTGATCCTGACCGCCCTGTTCCTGAGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGGGAAGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGCCGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCCAGCGGCGGAAGAACCCCCAGGAAGGCCTGTATAACGAACTGCAGAAAGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGCGGAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACACCGGTATGGACGAGAAAACCACCGGCTGGCGGGGAGGCCACGTGGTGGAAGGACTGGCCGGCGAGCTGGAACAGCTGCGGGCCAGACTGGAACACCACCCCCAGGGCCAGAGGGAACCC （配列番号４９）
ＣＡＲ−ＣＤ１９第２世代−ＳＢＰ３（ａａ）：
MALPVTALLLPLALLLHAARPASDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSHMALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYTGMDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP （配列番号５０）
ベクターは発現ベクターであってよい。ベクターはプラスミドベクターであってもよい。好ましくは、ベクターはレンチウイルスベクターである。
本発明の文脈内では「レンチウイルスベクター」は、シス作用性レンチウイルスＲＮＡまたはＤＮＡ配列を含み、トランスで提供されるレンチウイルスタンパク質（例えば、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、および／またはＥｎｖ）を必要とする導入遺伝子による宿主細胞の形質導入のための非複製ベクターを意味する。レンチウイルスベクターは、機能性Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖタンパク質の発現を欠く。レンチウイルスベクターは、前記レトロウイルスベクターの作製または開発の段階に応じてＲＮＡまたはＤＮＡ分子の形態で存在してもよい。
レンチウイルスベクターは、プラスミドなどの組換えＤＮＡ分子の形態にあってもよい。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスおよび他のタンパク質の複合体内のＲＮＡ分子などのレンチウイルスベクター粒子の形態であってもよい。典型的には、改変または組換えレンチウイルス粒子に相当するレンチウイルス粒子ベクターは、一本鎖ＲＮＡの２つのコピーからなるゲノムを含む。これらのＲＮＡ配列は、宿主細胞ゲノムに挿入された二本鎖ＤＮＡ配列（プロウイルスベクターＤＮＡ）からの転写により得ることができ、または形質転換された宿主細胞でのプラスミドＤＮＡ（プラスミドベクターＤＮＡ）の一過性発現から得ることができる。
好ましくは、レンチウイルスベクター粒子は、組み込みのための能力を有する。したがって、それらは機能的インテグラーゼタンパク質を含む。非組み込みベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子の組み込み能力の大部分またはすべてを除去する１つ以上の突然変異を有する。例えば、非組み込みベクター粒子は、組み込む能力の低下を引き起こすレンチウイルスpol遺伝子によってコードされるインテグラーゼに突然変異を含むことができる。対照的に、組み込みベクター粒子は、レンチウイルスベクター粒子の組み込み能力の大部分またはすべてを除去する突然変異を含まない機能的インテグラーゼタンパク質を含む。
レンチウイルスベクターは、レンチウイルス、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ感染性脳炎ウイルス（ＥＩＡＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）およびネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）に由来し、病原性に関与する遺伝的決定基を除去し、治療効果を得るのに有用な新たな決定基を導入するために改変される。
このようなベクターは、シスおよびトランス作用性配列の分離に基づく。複製欠損ベクターを生成するために、トランス作用性配列（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｔａｔ、ｒｅｖ、およびｅｎｖ遺伝子）を欠失させ、導入遺伝子をコードする発現カセットに置き換えることができる。
非分裂細胞への効率的な組み込みおよび複製は、通常、レンチウイルスゲノムの中心に２つのシス作用性配列、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）およびセントラルターミネーション配列（ＣＴＳ）の存在を必要とする。これらは、セントラルＤＮＡ「フラップ」と呼ばれる３本鎖ＤＮＡ構造の形成をもたらし、該フラップは、樹状細胞などの非分裂細胞の核孔での組み込み前複合体の脱コート、および核への発現カセットの効率的な移入のためのシグナルとして作用する。
ある実施形態において、本発明は、特に、欧州特許出願ＥＰ２１６９０７３号に記載されているようなｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列と呼ばれるセントラルポリプリントラクトおよびセントラルターミネーション配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。
宿主細胞ゲノムへのベクタープロウイルスＤＮＡ配列の組み込みに関与する長末端反復配列（ＬＴＲ）などのさらなる配列は、通常はシスで存在する。ベクターは、例えば前記ＬＴＲのドメインＵ３（ΔＵ３）中のＬＴＲ配列を変異させて得ることができる（Ｍｉｙｏｓｈｉ Ｈら、１９９８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７２（１０）：８１５０〜７頁；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（１２）：９８７３〜８０頁）。
好ましくは、ベクターはエンハンサーを含まない。ある実施形態において、本発明は、３’ＬＴＲ中のプロモーターおよびエンハンサー配列を除去している変異Ｕ３領域（ΔＵ３）を好ましくは有するＬＴＲ配列を含むレンチウイルスベクターを包含する。
パッケージング配列Ψ（プサイ）は、ポリヌクレオチド配列のキャプシド形成を助けるためにベクター粒子に取り込まれてもよい（Ｋｅｓｓｌｅｒら、２００７、Ｌｅｕｋｅｍｉａ、２１（９）：１８５９〜７４頁；Ｐａｓｃｈｅｎら、２００４、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ １２（６）：１９６〜２０３頁）。
ある実施形態において、本発明は、レンチウイルスパッケージング配列Ψ（プサイ）を含むレンチウイルスベクターを包含する。
トランスポートＲＮＡ結合部位もしくはプライマー結合部位（ＰＢＳ）またはウッドチャック転写後調節エレメント（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ＰｏｓｔＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＷＰＲＥ）などのさらなる追加の機能性配列も、インビボで導入遺伝子のより安定な発現を得るために、有利には本発明のレンチウイルスベクターポリヌクレオチド配列に含まれてもよい。
ある実施形態において、本発明は、ＰＢＳを含むレンチウイルスベクターを包含する。ある実施形態において、本発明は、ＷＰＲＥおよび／またはＩＲＥＳを含むレンチウイルスベクターを包含する。
よって、好ましい実施形態において、レンチウイルスベクターは、少なくとも１つのｃＰＰＴ／ＣＴＳ配列、１つのΨ配列、１つの（好ましくは２つの）ＬＴＲ配列、およびβ２ｍまたはクラスＩＭＨＣプロモーターの転写制御下で導入遺伝子を含む発現カセットを含む。
プロモーター
本発明は、Ｔ細胞、好ましくはヒトＴ細胞でのレンチベクターからのＣＡＲの高発現を促進するためのプロモーターの使用を包含する。好ましいプロモーターは、ヒトユビキチン、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、およびβ２ミクログロブリン（β２ｍ）プロモーターである。
様々な実施形態において、プロモーターは、樹状細胞を含む抗原提示細胞において高発現を促進する。好ましくは、プロモーターは、挿入の影響を避けるためにエンハンサー要素を欠いている。
最も好ましくは、プロモーターはＣＭＶプロモーター／エンハンサーではない。好ましくは、プロモーターはデクチン−２またはＭＨＣＩＩプロモーターではない。
様々な哺乳類（ヒト）のＭＨＣクラスＩプロモーターの配列を以下に示す。
ＨＬＡ−Ａ２（ＭＨＣ Ｉ）：
attggggagtcccagccttggggattccccaactccgcagtttcttttctccctctcccaacctatgtagggtccttcttcctggatactcacgacgcggacccagttctcactcccattgggtgtcgggtttccagagaagccaatcagtgtcgtcgcggtcgcggttctaaagtccgcacgcacccaccgggactcagattctccccagacgccgagg （配列番号９）
ＨＬＡ−Ｂ７（ＭＨＣ Ｉ）：
ggggaggcgcagcgttggggattccccactcccctgagtttcacttcttctcccaacttgtgtcgggtccttcttccaggatactcgtgacgcgtccccacttcccactcccattgggtattggatatctagagaagccaatcagcgtcgccgcggtcccagttctaaagtccccacgcacccacccggactcagag （配列番号１０）
ＨＬＡ−Ｃｗ５（ＭＨＣ Ｉ）：
cactggggaggcgccgcgttgaggattctccactcccctcagtttcacttcttctcccaacctgcgtcgggtccttcttcctgaatactcatgacgcgtccccaattcccactcccattgggtgtcgggttctagagaagccaatcagcgtctccgcagtcccggtctaaagtccccagtcacccacccggactcagattctccccagacgccgag （配列番号１１）
ＨＬＡ−Ｅ（ＭＨＣ Ｉ）：
taagaactgctgattgctgggaaactctgcagtttcccgttcctctcgtaacctggtcatgtgtccttcttcctggatactcatgacgcagactcagttctcattcccaatgggtgtcgggtttctagagaagccaatcagcgtcgccacgactcccgactataaagtccccatccggactcaagaagttctcaggactcagagg （配列番号１２）
ＨＬＡ−Ｆ（ＭＨＣ Ｉ）：
aggccccgaggcggtgtctggggttggaaggctcagtattgagaattccccatctccccagagtttctctttctctcccaacccgtgtcaggtccttcatcctggatactcataacgcggccccatttctcactcccattgggcgtcgcgtttctagagaagccaatcagtgtcgccgcagttcccaggttctaaagtcccacgcaccccgcgggactcatatttttcccagacgcggaggttggggtcatg （配列番号１３）
ヒトβ２ミクログロブリンプロモーターの配列を以下に示す。
aacatcacgagactctaagaaaaggaaactgaaaacgggaaagtccctctctctaacctggcactgcgtcgctggcttggagacaggtgacggtccctgcgggccttgtcctgattggctgggcacgcgtttaatataagtggaggcgtcgcgctggcgggcattcctgaagctgacagcattcgggccgag （配列番号１４）
ヒトユビキチン（Ｕｂｉ）プロモーターの配列を以下に示す。
ggcctccgcgccgggttttgggcctcccgcgggcgcccccctcctcacggcgagcgctgccacgtcagacgaagggcgcagcgagcgtcctgatccttccgcccggacgctcaggacagcggcccgctgctcataagactcggccttagaaccccagtatcagcagaaggacattttaggacgggacttgggtgactctagggcactggttttctttccagagagcggaacaggcgaggaaaagtagtcccttctcggcgattctgcggagggatctccgtggggcggtgaacgccgatgattatataaggacgcgccgggtgtggcacagctagttccgtcgcagccgggatttgggtcgcggttcttgtttgtggatcgctgtgatcgtcacttggtgagtagcgggctgctgggctggccggggctttcgtggccgccgggccgctcggtgggacggaagcgtgtggagagaccgccaagggctgtagtctgggtccgcgagcaaggttgccctgaactgggggttggggggagcgcagcaaaatggcggctgttcccgagtcttgaatggaagacgcttgtgaggcgggctgtgaggtcgttgaaacaaggtggggggcatggtgggcggcaagaacccaaggtcttgaggccttcgctaatgcgggaaagctcttattcgggtgagatgggctggggcaccatctggggaccctgacgtgaagtttgtcactgactggagaactcggtttgtcgtctgttgcgggggcggcagttatggcggtgccgttgggcagtgcacccgtacctttgggagcgcgcgccctcgtcgtgtcgtgacgtcacccgttctgttggcttataatgcagggtggggccacctgccggtaggtgtgcggtaggcttttctccgtcgcaggacgcagggttcgggcctagggtaggctctcctgaatcgacaggcgccggacctctggtgaggggagggataagtgaggcgtcagtttctttggtcggttttatgtacctatcttcttaagtagctgaagctccggttttgaactatgcgctcggggttggcgagtgtgttttgtgaagttttttaggcaccttttgaaatgtaatcatttgggtcaatatgtaattttcagtgttagactagtaaattgtccgctaaattctggccgtttttggcttttttgttagaccgatc （配列番号３８）
ヒトＨＬＡ−ＤＲαプロモーターの配列を以下に示す。
gtctagaagtcagattggggttaaagagtctgtccgtgattgactaacagtcttaaatacttgatttgttgttgttgttgtcctgtttgtttaagaactttacttctttatccaatgaacggagtatcttgtgtcctggaccctttgcaagaacccttcccctagcaacagatgcgtcatctcaaaatatttttctgattggccaaagagtaattgatttgcattttaatggtcagactctattacaccccacattctcttttcttttattcttgtctgttctgcctcactcccgagctc （配列番号４１）
様々な実施形態において、レンチウイルスベクターは、β２ｍ、Ｕｂｉ、ＭＨＣＩＩまたはＭＨＣクラスＩプロモーターを含む。好ましくは、ＭＨＣクラスＩプロモーターはＨＬＡ−Ａ２プロモーター、ＨＬＡ−Ｂ７プロモーター、ＨＬＡ−Ｃｗ５プロモーター、ＨＬＡ−ＦまたはＨＬＡ−Ｅプロモーターである。様々な実施形態では、プロモーター配列は、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号３８または配列番号４１のプロモーター配列と９０％超、好ましくは９５％超、より好ましくは９９％超の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ＢＤＣＡ＋樹状細胞におけるプロモーターの発現は、骨格筋細胞におけるそのプロモーターの発現の少なくとも１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０または６０倍である。
一実施形態では、本発明は、微生物または腫瘍抗原の発現を方向付ける樹状細胞特異的プロモーターを含むレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター粒子であって、前記レンチウイルスベクター粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞よりもＢＤＣＭ細胞において抗原の発現が高い、レンチウイルスベクター粒子を包含する。
本発明は、エンハンサーを含まないプロモーターを含むレンチウイルスベクターを包含する。
本発明は、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）、Ｕｂｉ、ＥＦ１αまたはβ２ミクログロブリン（β２ｍ）プロモーターのレンチウイルスベクターへの挿入を包含する。本明細書で使用される「ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）プロモーター」または「β２ミクログロブリンプロモーター」または「ＭＨＣクラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）」または「ヒトユビキチンプロモーター」は、天然または合成のＭＨＣクラスＩプロモーターまたはβ２ミクログロブリンプロモーターまたは ＭＨＣクラスＩＩプロモーターまたはヒトユビキチンプロモーターを含む。「ＭＨＣクラスＩプロモーター」なる用語は、β２ｍプロモーターを含まない。
一実施形態では、プロモーターを含むレンチウイルスベクター粒子は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞よりもＢＤＣＭ細胞においてより高い発現を示す。
プロモーターは、天然に生じるプロモーターであってよい。天然に生じるプロモーターの例は、ヒトβ２ｍ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−ＤＲαおよびユビキチン遺伝子プロモーターである。
これらの天然に生じるＭＨＣＩプロモーターは通常、ＭＨＣクラスＩタンパク質をコードする遺伝子、またはゲノムデータベース（例えば：ＮＣＢＩポリヌクレオチドデータベースｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｕｉｄｅ／ｄｎａ−ｒｎａ）中のこのようなタンパク質を推定的にコードすると見なされる遺伝子のプロモーター領域からクローン化または複製される。β２ｍおよびクラスＩ ＭＨＣタンパク質は両方とも、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に進入する。
これらの遺伝子によりコードされるタンパク質は、ほぼすべての細胞タイプにおいて見出される。ＭＨＣＩタンパク質は通常、白血球の膜の表面に存在し、ここでβ２ミクログロブリン（β２ｍ）と結合する。これらの結合タンパク質の役割は、内因性供給源由来のペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞に提示することである。よってこれらは、抗原特異的免疫応答の生成に中心的な役割を果たす。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、多年の間広く研究および記載されてきたため、この遺伝子は十分に特徴付けされ、およびＢＬＡＳＴ方法（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら（１９９０）．Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３〜４１０頁）などの配列比較ツールを用いて検出可能である。
ＭＨＣクラスＩプロモーターは、樹状細胞を含む抗原提示細胞で強力に活性化される能力のほか、他のヒト体組織の大部分において強度を低下させる能力を共有する。
本発明のプロモーターは、１つまたは複数のＳｐ１およびＥＴｓ結合部位などのさらなる調節エレメントを含有することができる。好ましい実施形態において、ＭＨＣクラスＩプロモーターは、２つのＳｐ１結合部位および１つのＥｔｓ結合部位を含有する。他の実施形態において、Ａｐ１および／またはＡｐ２部位がプロモーターにさらに含有される。
好ましいプロモーターは、天然に生じるヒトβ２ｍ、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｅ、およびＨＬＡ−Ｆプロモーターである。
プロモーターはまた、合成であってもよい。合成プロモーターには、プロモーターの個々の成分を集積（アセンブル）するために分子生物学的手法を用いて合成されるプロモーター、または分子生物学的手法を用いる自然発生プロモーターに由来するプロモーターが含まれる。
様々な実施形態において、合成プロモーターは、β2m、Ubi、MHCクラスＩＩまたはＭＨＣクラスＩの遺伝子プロモーター（例えば配列番号９〜１４、３８または４１）と90％超、好ましくは95％超、より好ましくは99％超、または１００％の同一性を共有するポリヌクレオチド配列を含む。
ＭＨＣクラス遺伝子の転写は、通常は２つの主要な調節エレメント：インターフェロン刺激応答エレメント（ＩＳＲＥ）およびＳＸＹモジュール（Ｗ／Ｓ、Ｘ１Ｘ２／部位αおよびＹ／エンハンサーＢ調節エレメントを包含する）により媒介される。Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｓｅｎ、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）４８：２０８〜２１１頁を参照のこと。
これらの調節プロモーターエレメントは、転写開始部位のヌクレオチド−２２０から−９５上流に広がる領域に局在化される。これらは、ＭＨＣクラスＩ遺伝子の組織特異的転写およびサイトカイン誘導転写を媒介する。
ＭＨＣクラスＩ遺伝子プロモーターのＩＳＲＥは通常、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）ファミリーメンバーに対する結合部位を含有している。ゆえに、インターフェロン調節因子（ＩＲＦ）ファミリーメンバーに結合することはＭＨＣクラスＩプロモーターの特性である。これは、例えば、ゲルシフトアッセイにより検証することができる。
別の調節エレメント、エンハンサーＡ（核内転写因子κＢ（ＮＦ−κＢ）に対する結合部位を含有する）は、ほとんどの場合で存在する。よって、核内転写因子κＢ（ＮＦ−κＢ）に結合することはＭＨＣクラスＩプロモーターの特性である。これは、例えば、ゲルシフトアッセイにより検証することができる。
ＩＳＲＥに加えて、ＭＨＣクラスＩプロモーターは通常、合わせてＳＸＹモジュールと呼ばれる３つの調節エレメント：ＳまたはＷボックス、Ｘ１／ＣＲＥＸ２ボックスまたは部位α、およびＹボックスまたはエンハンサーＢからなる保存された上流配列モチーフの別のセットを共有する。このＳＸＹモジュールは通常、調節因子Ｘ（ＲＦＸ；ＲＦＸ５、ＲＦＸＢ／ＡＮＫおよびＲＦＸＡＰからなる）、ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）／活性化転写因子（ＡＴＦ）、および核内因子Ｙ（ＮＦＹ）を含有する多タンパク質複合体により協同的に結合され、これらの遺伝子のトランス活性化を駆動するエンハンセオソームとして作用する。よって、これらの因子に結合することはＭＨＣクラスＩプロモーターの特性である。これは、例えば、ゲルシフトアッセイにより検証することができる。
対照的に、ＭＨＣクラスＩＩプロモーターはエンハンサーＡもＩＳＲＥエレメントも表示しない（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．ら、１９９８、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ． ４８：２０８〜２２１頁）。さらに、ＲＦＸサブユニットの１つまたはＣＩＩＴＡにおける変異による重症複合免疫不全、裸リンパ球症候群（ＢＬＳ）を有する患者から確立された細胞株を用いた研究により例証されているように、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子調節においてＲＦＸおよびＣＩＩＴＡは極めて重要であることが見出されている（ＤｅＳａｎｄｒｏ，Ａ．ら、１９９９、Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ、６５：２７９〜２８６頁）。また、ＣＩＩＴＡまたはＲＦＸサブユニットの１つのどちらかの欠如は、それぞれＭＨＣエンハンセオソームの機能および会合（アセンブル）に影響を及ぼし、ＭＨＣクラスＩＩの欠如およびＭＨＣクラスＩ転写レベルの低下をもたらす（Ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｊ．ら ２００４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６：６７〜７５頁）。
一実施形態では、本発明は、本発明のＣＡＲの発現を指示するレンチウイルスベクターに、本発明のプロモーター、特にβ２ｍ、Ｕｂｉ、ＭＨＣクラスＩＩまたはＭＨＣクラスＩプロモーターを挿入することを含む方法を包含する。この方法は、ＤＮＡフラップ配列のような、本明細書に記載の他の核酸要素のいずれかを挿入することをさらに含むことができる。
単離した細胞
本発明は、本発明のＣＡＲをコードするベクターおよびレンチウイルスベクター粒子を含む、細胞、特に免疫系の細胞を包含する。好ましくは、細胞は、ＴαβおよびＴ?δ細胞またはＮＫ細胞を含むＴ細胞である。
一実施形態では、細胞は、細胞ゲノムに組み込まれたベクターを含む。一実施形態では、細胞は、ＣＡＲを一過的に発現するベクターを含む。一実施形態では、細胞は、ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクター粒子を産生する。
様々な実施形態において、本発明は、ＣＡＲをコードするベクターおよびレンチウイルスベクター粒子を含む細胞株、細胞集団、または細胞培養物を包含する。
レンチウイルスベクター粒子
本発明は、レンチウイルスベクター粒子の製造方法を提供する。レンチウイルスベクター粒子（またはレンチウイルス粒子ベクター）は、ウイルスタンパク質と会合したレンチウイルスベクターを含む。ベクターは好ましくは組み込みベクターである。
一実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、本発明のＣＡＲをコードする。
ある実施形態において、レンチウイルスベクター粒子は、ＨＩＶ−１ ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質を含む。好ましくは、レンチウイルスベクター粒子は、サブタイプＤ、特にＨＩＶ−１ＮＤＫ、ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質を含む。
この方法のある実施形態によれば、レンチベクター粒子は、ＤＮＡプラスミドで形質転換された宿主細胞において得られる。
このようなＤＮＡプラスミドは、
−細菌複製起源（例えば、ｐＵＣ ｏｒｉ）、
−選別のための抗生物質耐性遺伝子（例えば、ＫａｎＲ）、およびより特定すると
−β２ｍ、Ｕｂｉ、ＭＨＣクラスＩＩまたはＭＨＣクラスＩプロモーターに転写的に連結されたＣＡＲをコードする少なくとも１つの核酸を含むレンチウイルスベクター
を含みうる。
このような方法により、以下のステップ：
ｉ）適切な宿主細胞にレンチウイルスベクターを核酸移入するステップと、
ｉｉ）前記宿主細胞に、レトロウイルス（好ましくはレンチウイルス）の少なくとも構造的およびポリメラーゼ（＋インテグラーゼ）活性をコードするウイルスＤＮＡ配列を含有するパッケージングプラスミドベクターを核酸移入するステップと（このようなパッケージングプラスミドは当技術分野で記載されている（Ｄｕｌｌら、１９９８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、７２（１１）：８４６３〜７１頁；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、１９９８、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（１２）：９８７３〜８０頁））、
ｉｉｉ）前記レンチウイルスベクターの発現およびレンチウイルスベクター粒子へのパッケージングを得るために、前記核酸移入した宿主細胞を培養するステップと、
ｉｖ）前記培養宿主細胞におけるステップｉｉｉ）の発現およびパッケージングの結果生じるレンチウイルスベクター粒子を回収するステップと
を含む、本発明に係る組換えベクター粒子の作製が可能となる。
種々の理由のため、得られたレトロウイルス粒子をシュードタイピングする、すなわち特異的粒子エンベロープタンパク質を付加または置換することが有用であり得る。例えば、これは、組換え粒子を天然粒子または他の組換え粒子と区別するために、異なるエンベロープタンパク質を有するのに有利であり得る。ワクチン接種戦略の問題において、レンチウイルスに対して既に免疫を生じている後者の場合、シュードタイピングされた粒子ベクターは免疫系を免れる可能性が高い。疾患に対して患者を免疫するのに類似の粒子ベクターの連続注射が必要とされる場合、これは特に有用である。
本発明のレトロウイルス粒子をシュードタイピングするために、宿主細胞は、ウイルスエンベロープタンパク質、好ましくはＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質をコードする１つまたは幾つかのエンベロープＤＮＡプラスミドでさらにトランスフェクトされ得る。
適切な宿主細胞は、好ましくは、例えばＨＥＫ細胞株のようなヒト培養細胞株である。
あるいは、ベクター粒子の作製方法は、ゲノムが１つまたは複数の以下の成分、すなわち、レンチウイルスベクターＤＮＡ配列、パッケージング遺伝子、およびエンベロープ遺伝子で安定に形質転換されている宿主細胞において実施される。このようなＤＮＡ配列は、ベクター配列の転写を可能にし、および粒子産生速度を向上させる追加のプロモーターを含む本発明によるプロウイルスベクターに類似していると見なすことができる。
好ましい実施形態において、宿主細胞は、全細胞を膨潤または死滅させることなしにウイルス粒子を培地中で連続的に産生することができるようにさらに改変される。ウイルス粒子を作製するためのこのような手法に関しては、Ｓｔｒａｎｇら、２００５、Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７９（３）：１１６５〜７１頁；Ｒｅｌａｎｄｅｒら、２００５、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １１（３）：４５２〜９頁；Ｓｔｅｗａｒｔら、２００９、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ、１６（６）：８０５〜１４頁；およびＳｔｕａｒｔら、２０１１、Ｈｕｍ ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒを参照することができる。
本発明のある目的物は、レンチウイルス粒子ベクターで形質転換された宿主細胞からなる。
レンチウイルス粒子ベクターは、以前に定義されているように、以下のエレメントを含みうる。
−ｃＰＰＴ／ＣＴＳポリヌクレオチド配列と、
−β２ｍ、ＵｂｉまたはＭＨＣＩプロモーターの制御下でＣＡＲをコードする核酸、および場合により、上に記載されたさらなるエレメントの１つ。
好ましくは、レンチベクター粒子は、１０６、２×１０６、５×１０６、１０７、２×１０７、５×１０７、１０８、２×１０８、５×１０８または１０９ＴＵの用量である。
細胞でＣＡＲを発現させるための方法
本発明は、細胞、好ましくはＴ細胞、好ましくは増殖したＴ細胞においてＣＡＲを発現させるための方法を包含する。この方法は、ＣＡＲの発現を可能にし、好ましくはＴ細胞を増殖させる条件下で、本発明のレンチウイルスベクターまたはレンチウイルス粒子ベクターで細胞を形質導入することを含む。
細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。特にヒト非分裂細胞が好ましい。
好ましくは、細胞は初代Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
この方法は、ＣＡＲを採取または単離することをさらに含みうる。
レンチウイルスベクターまたはレンチウイルス粒子ベクターは、好ましくは、本発明のプロモーターを含む。
一実施形態では、この方法は、細胞をビオチンで処理してＣＡＲをフックから解放することを含む。好ましくは、細胞をビオチンで、少なくとも０．２、０．４、０．８、１．６、２．５、５、１０、２０、４０または８０μＭの初期濃度で処理する。
一実施形態では、本発明は、ＣＡＲを発現するための方法であって、β２ｍ、ＵｂｉまたはＭＨＣＩプロモーターをレンチウイルスベクターに挿入して、ＣＡＲをコードする核酸の発現を指示することと、細胞、好ましくはＴまたはＮＫ細胞を、プロモーターを含むベクターてに形質導入することと、場合によっては少なくとも０．２、０．４、０．８、１．６、２．５、５、１０、２０、４０または８０μＭの初期濃度のビオチンで細胞を処理することを含む方法を包含する。
レンチウイルスベクターの治療的使用
本発明は、さらに、ベクターにコードされたＣＡＲとの免疫学的反応の発生または改善を誘導または促進することができる治療用組成物またはワクチンの調製のための、本発明に係るレンチウイルスベクターの、特にレンチウイルスベクター粒子の形態での使用に関する。
本発明は、ヒトへのレンチウイルスベクター（または「レンチベクター」）の投与方法を包含する。好ましくは、レンチベクター粒子は、機能的インテグラーゼタンパク質を含む組み込みレンチベクター粒子である。
好ましい投与様式には、改変Ｔ細胞の再注入、好ましくは静脈内または関節内投与、最も好ましくは腫瘍内投与が含まれる。
一実施形態では、本発明は、ヒトにおける免疫応答を誘導するための方法であって、機能的インテグラーゼタンパク質およびレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター粒子をＴ細胞またはＮＫ細胞に投与することと、改変された細胞をヒトに投与することであって、このとき組み込みレンチウイルスベクターは、ＣＡＲの発現を指示するプロモーターを含むことと、ＣＡＲとの免疫学的反応を生じさせることを含む方法を包含する。
本発明はまた、腫瘍および癌に対する治療プロトコールにおいて使用され得、特に、癌および腫瘍に対する免疫療法またはワクチン接種療法のためのプロトコールにおいて使用されうる。
本発明はさらに、先に定義したレンチウイルスベクターを含む免疫原性組成物に関する。
本発明の免疫原性組成物は、ベクターおよびベクター粒子にｃＰＰＴおよびＣＴＳ配列を含み、標的細胞におけるベクターゲノムの核内導入を誘導または刺激することが好ましい。
逆転写の間、ｃＰＰＴおよびＣＴＳ配列は、ＤＮＡ三重鎖と呼ばれる３本鎖ＤＮＡ構造の形成を誘導し、これがＤＮＡベクター配列の核内取り込みを刺激する。好ましくは、ベクターは、ＣＡＲと、レトロウイルスまたはレトロウイルス様起源のレトロ転写、発現およびキャプシド形成の制御シグナルを含む。
本発明に係るレンチウイルスベクターは、Ｔリンパ球および／または他の免疫細胞の特異性および機能を方向転換する能力を有する。それらは、特定の腫瘍抗原または自己免疫疾患のような他の病態に関連する抗原を標的とするＴ細胞を迅速に生成することができる。
本発明のレンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターを細胞、好ましくはＴ細胞またはＮＫ細胞に投与すること、細胞を宿主に投与すること、およびＴリンパ球および／または他の免疫細胞の特異性および機能を方向転換する特定の免疫応答を生成することを含む、免疫応答を誘導する方法および治療方法において使用することができる。
本発明の免疫原性組成物の特別な利点は、Ｔリンパ球および他の免疫細胞の特異性および機能を、ベクターまたはベクター粒子中のＣＡＲが指向する複数の抗原に対して方向転換するために使用できることである。
結果として、本発明は、治療的ワクチン接種プロトコルにおいて使用され得る組成物を包含する。
特に、該組成物は、アジュバント、他の免疫原性組成物、化学療法、または任意の他の治療的処置と組み合わせて使用することができる。
本発明は、機能的インテグラーゼタンパク質およびレンチウイルスベクターを含むレンチウイルスベクター粒子を含有する、ヒトへの投与のための組成物であって、前記レンチウイルスベクターのＤＮＡは、ＣＡＲを含むかまたはＣＡＲからなるアミノ酸の発現を方向付けるプロモーターを含む、組成物を包含する。
一実施形態では、本発明は、結合ドメイン；膜貫通ドメイン；好ましくはストレプトアビジン結合ペプチドを含むフック結合ドメイン；および配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８、配列番号３３または配列番号３４の少なくとも１００アミノ酸のＴ細胞活性化フラグメントを含む活性化ドメインを含むキメラ抗原レセプターをコードするレンチウイルスベクター、または当該レンチウイルスベクターによって形質導入された細胞を、好ましくは筋肉内投与を介してヒトに投与することを包含する。好ましくは、レンチウイルスベクターは、好ましくはストレプトアビジンタンパク質を含む、最も好ましくは配列番号３２、配列番号３３またはアミノ酸４９にグリシンから好ましくはトレオニンへの変異を有する前記配列番号の変異体を含むフックを包含する。好ましくは、フック結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むか、または配列番号２の核酸配列によってコードされる。
本方法は、ビオチンをヒトに投与してＣＡＲをＥＲまたはゴルジ体から放出させる工程をさらに含むことができる。好ましくは、ビオチンは、少なくとも０．２、０．４、０．８、１．６、３．２、５、１０、２０、４０または８０μＭの初期濃度で投与される。
よって、本発明の種々の実施形態を記載してきたが、本明細書における開示は例示のみであること、ならびに様々な他の代替、適合、および変更が本発明の範囲内で行われ得ることが当業者により留意されるべきである。したがって、本発明は、本明細書に例証されている特定の実施形態に限定されない。
実施例１．分子構造
ｐＴＲＩＰΔＵ３−ＣＭＶ−ＧＦＰ（１５）のプロウイルス領域のＰＣＲ増幅は、ＳｐｅＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位をそれぞれ含む順方向（5'-CTTACTAGTTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAC-3'；配列番号１５）および逆方向（5'-CATTCTAGAACTGCTAGAGATTTTCCACACTG-3'；配列番号１６）オリゴヌクレオチドを用いて行った。得られた断片を消化し、ＭｌｕＩ部位が欠失しているｐＶＡＸ−１プラスミド（インビトロジェン、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）のＳｐｅＩ部位とＸｂａＩ部位との間にクローニングした。得られたプラスミドをｐＦＬＡＰ−ＣＭＶ−ＧＦＰと命名した。ＳＶ４０配列は、ｐＴＲＩＰΔＵ３−ＣＭＶ−ＧＦＰプラスミド（5'-TACCCCGGGCCATGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTC-3'（配列番号１７）および5'-ACTCCCGGGTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCC-3'（配列番号１８）オリゴヌクレオチドを使用）からＰＣＲによって増幅し、ｐＦＬＡＰ−ＣＭＶ−ＧＦＰのＰｍｌ１部位にクローニングし、得られたプラスミドをｐＦＬＡＰ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＳＶと命名した。ＣＭＶプロモーターは、ＭｌｕＩおよびＢａｍＨＩ部位をそれぞれ含む順方向（5'-TACACGCGTGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGG-3'；配列番号１９）および逆方向（5'-CGTGGATCCGATCGCGGTGTCTTCTATGGAGGTCAAAAC-3'；配列番号２０）オリゴヌクレオチドで増幅した。得られた断片を、ｐＦｌａｐ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＳＶのＭｌｕＩとＢａｍＨＩ部位との間にクローニングして戻し、レンチウイルスベクター内のプロモーターの置換を容易にした。次いでプロモーターを、β２ｍプロモーターのための5'-GCCGGCGCGCCGAGAAACCCTGCAGGGAATTCCC-3'（配列番号２１）および5'-CGTGGATCCGATCGCTCGGCCCGAATGCTGTCAGCTTCAGG-3'（配列番号２２）にてＨＥＫ２９３Ｔ細胞ＤＮＡからＰＣＲにより増幅し、ｐＦＬＡＰ−ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＳＶのＭｌｕＩとＢａｍＨ１部位との間にクローニングしてｐＦｌａｐ−β２ｍ−ＳＶを作製した。増幅されたβ２ｍプロモーター配列は以下の通りである。GAGAAACCCTGCAGGGAATTCCCCAGCTGTAGTTATAAACAGAAGTTCTCCTTCTGCTAGGTAGCATTCAAAGATCTTAATCTTCTGGGTTTCCGTTTTCTCGAATGAAAAATGCAGGTCCGAGCAGTTAACTGGCGGGGGCACCATTAGCAAGTCACTTAGCATCTCTGGGGCCAGTCTGCAAAGCGAGGGGGCAGCCTTAATGTGCCTCCAGCCTGAAGTCCTAGAATGAGCGCCCGGTGTCCCAAGCTGGGGCGCGCACCCCAGATCGGAGGGCGCCGATGTACAGACAGCAAACTCACCCAGTCTAGTGCATGCCTTCTTAAACATCACGAGACTCTAAGAAAAGGAAACTGAAAACGGGAAAGTCCCTCTCTCTAACCTGGCACTGCGTCGCTGGCTTGGAGACAGGTGACGGTCCCTGCGGGCCTTGTCCTGATTGGCTGGGCACGCGTTTAATATAAGTGGAGGCGTCGCGCTGGCGGGCATTCCTGAAGCTGACAGCATTCGGGCCGAG （配列番号２３）。ＣＡＲは合成して、ｐＦｌｏｐ−β２ｍ−ＳＶのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ部位との間に、ＧＦＰ遺伝子の代わりにクローニングすることができる。
例えば、ｐＦｌａｐ−β２ｍ−ＧＦＰ−ＳＶは、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩにより消化することができ、マルチクローニングサイト（ＳａｌＩ、ＳａｃＩＩ、ＮｄｅＩ、ＡｓｃＩおよびＮｈｅＩ制限部位を有するＭＣＳ）を含むＤＮＡリンカーを、これらの部位の間に、ＧＦＰ遺伝子の代わりにクローニングし、ＣＡＲをコードする核酸配列を挿入させる。
パッケージングプラスミドｐＴＨＶ−ＧＰ−Ｎは、ＰＣＲ（5'-atgcatgcgtcgacctcgagttaatcctcatcctgtctacttgccac-3'（配列番号２４）および5'-gcatgcatcggccggggcggcgactgGTgagagGCCACCatgggtgcgagagcgtcagtattaag-3'（配列番号２５）を有するオリゴヌクレオチドを使用）によりＨＩＶ−１ ＮＤＫゲノムを増幅することにより構築した。得られた断片をＥａｇＩおよびＳａｌＩ制限酵素で消化し、Ｅａｇ１−ＳａｌＩ断片を予め除去したｐ８．７４パッケージングプラスミド（１５）に挿入した。
水疱性口内炎ウイルスインディアナ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＣＡＸ６２７２８．１、ニュージャージーＧｅｎＢａｎｋ＃ＣＡＸ６２７２９．１）およびコカール（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＣＡＸ６２７３１．１）株に対応するコドン最適化遺伝子を合成することにより、シュードタイピングプラスミドを作製した。次いで、これらの遺伝子をＥｃｏＲ１およびＢａｍＨＩで消化し、ｐＶＡＸ１プラスミド（インビトロジェン、Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）の対応する制限部位の間にクローニングした。
プラスミドは、Ｎｕｃｌｅｏｂｏｎｄ Ｘｔｒａ Ｍａｘｉ ＥＦカラムを用いて、製造者（マッハライ・ナーゲル）の指示に従って製造することができる。
実施例２ レンチウイルス製造
Ｒ＆Ｄ生産物：ベクターは、以前に記載されているように（２５）、ＨＥＫ２９３Ｔの一時的なリン酸カルシウムトランスフェクションによって製造されうる。ＨＥＫ２９３Ｔ（ヒト胚性腎細胞株、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１１２６８（Ｇｒａｈａｍら、１９７７））細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＰＡＡ）、１％Ｌ−グルタミン（ユーロビオ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（ライフテクノロジーズギブコ）および１％ピルビン酸ナトリウム（ライフテクノロジーズギブコ)を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ／高変法、ハイクローン）中で維持した。細胞株は３７℃、５％ＣＯ２の加湿した大気中の保温器に維持した。標準的なリン酸カルシウム沈殿プロトコールを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一過性形質転換によりレンチウイルスベクターを製造した。１０ｍｌの完全培養培地を含む１０ｃｍ２組織培養皿（ＢＤファルコン）に７×１０６のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播き、５％ＣＯ２の加湿大気、３７℃の恒温槽に２４時間維持し、接着させた。各ベクターの製造のために、一つの組織培養皿は以下のように形質転換する：レンチウイルス主鎖プラスミドｐＦｌａｐ−プロモーター−ＣＡＲ＿ＣＤ１９（１０μｇ）、ｐＴｈＶ−Ｅｎｖ１コード化エンベローププラスミド（２μｇ）およびｐＴｈＶ−ＧＰパッケージ化プラスミド（１０μｇ）を、３５３μｌの滅菌水（ライフテクノロジーズギブコ）および１２５μｌのＣａＣｌ２（フルカ）と混合した。次いで、ＤＮＡ混合液を５００μｌの３７℃に予め温めたＨＢＳ２×、ｐＨ＝７．３に少しずつ加え、得られた１ｍｌの沈殿物を細胞の培養培地に加えた。次いで形質転換した細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培地は、形質転換から２４時間後に、血清を含まない回収培地７ｍｌと交換し、さらに２４時間後にウイルス上清を回収し、２５００ｒｐｍで５分間遠心分離により浄化した。収穫された浄化バルク（２１０ｍＬ）を、ＭｇＣｌ２（シグマアルドリッチ）の存在下でＤＮアーゼ（ロッシュ）にて３０分間処理して、残りのトランスフェクションＤＮＡを避け、２２０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離して超濃縮した。各ベクターペレットを７０μｌのＰＢＳ−ラクトース（４０ｍｇ／Ｌ）に再懸濁し、プールし、３０μＬを等分し、−７０℃±１０℃で保存する。
製品特性評価および薬剤リリースのために、品質試験は、ワクチンに関する規制テキストに従って実施することができる：欧州薬局方（第６．１６節）によるワクチンに要求される品質管理「guideline on quality, non-clinical and clinical aspects of live recombinant viral vectored vaccines」(EMA/CHMP/141697/2009)、「guideline on development and manufacture of lentiviral vectors」(CHMP/BWP/2458/03)；遺伝子治療医薬製品に関する規制文書：欧州薬局方（第５．１４節）によるヒトの使用のための遺伝子導入医薬製品に要求される品質管理、「note for guidance on the quality, preclinical and clinical aspects of gene transfer medicinal products」(CHMP/BWP/3088/99)に定義される遺伝子治療製品に特異的な品質管理品質管理；バイオテクノロジー製品に関する規制文書（ＩＣＨ Ｑ５ＡからＩＣＨ Ｑ５Ｅ）；欧州薬局方（セクション７．０）に従って非経口製剤に要求される品質管理。
実施例３ レンチウイルスベクター力価
ｑＰＣＲ反応：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を培養培地を含む６ウェルプレート（ＢＤファルコン）に播種し、３７℃、５％ＣＯ２、加湿で４時間インキュベートする。細胞は、レンチウイルスベクターの３連続希釈物で形質導入される。インキュベートの７２時間後、細胞を回収し、形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞ペレットを生成する。形質導入された細胞ペレットから全ゲノムＤＮＡをＱＩＡＧＥＮ ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡミニキットハンドブックに基づく方法を用いて抽出する。プロウイルス定量は、Ｔａｑｍａｎ ｑＰＣＲを用いて行う。増幅は、Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｆｌａｐ Ａ（CCCAAGAACCCAAGGAACA；配列番号２６）およびＦｌａｐ Ｓ（AGACAA GATAGAGGAAGAGCAAAAC；配列番号２７）プライマーおよびＬＥＮＴＩ ＴＭプローブ（6FAM-AACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGG-BBQ；配列番号５２）にて行った。アクチン遺伝子（同じＭｉｘ、アクチンA-CGGTGAGGATCTTCATGAGGTAGT-（配列番号２８）、アクチンＳ -AACACCCCAGCCATGTACGT-（配列番号２９）プライマーおよびＨＵＭＵＲＡ?? ＡＣＴ ＴＭプローブ-6FAM-CCAGCCAGGTCCAGACGCAGGA-BBQ-（配列番号３０）の定量により正規化を行った。両方の反応は、ＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ Ｅｐ Ｒｅａｌｐｌｅｘ Ｓ（エッペンドルフ、５０℃で２分、９５℃で１０分、そして９５℃で１５秒および６３℃で１分を４０サイクル）で達成する。分析はＭａｓｔｅｒＣｙｃｌｅｒ Ｅｐ Ｒｅａｌｐｌｅｘソフトウエアで行った。
実施例４ 調製されたＣＡＲ
ＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターを作製した。ＣＡＲ＿ＣＤ１９第２および第３世代配列（配列番号３９および配列番号４０）は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈ）から購入し、必要とするプロモーターに応じてｐＦｌａｐ−ΔＵ３−β２ｍ−ＧＦＰ、ｐＦｌａｐ−ΔＵ３−ＨＬＡ−Ａ２−ＧＦＰ、ｐＦｌａｐ−ΔＵ３−ＨＬＡ−ＤＲα−ＧＦＰまたはｐＦｌａｐ−ΔＵ３−ＵＢＣ−ＧＦＰのＢａｍＨＩとＸｈｏＩ制限部位との間のＧＦＰ遺伝子を置換してクローニングした。
ＣＡＲは、３つの異なる位置でＳＢＰとの融合タンパク質として生成した。レンチウイルスベクターは、コアストレプトアビジンタンパク質に融合したＥＲのためのフックを含むようにさらに改変した。プロモーターはβ２ｍプロモーターであった。
これらのレンチウイルスベクターは、癌のインビトロおよび動物モデルにおいて使用されるであろう。ビオチンは、ＥＲからの放出を試験するために４０μＭ（より高濃度および低濃度の滴定を伴う）の初期濃度で投与される。最初に、ＣＡＲの細胞表面への移動（結合ドメインの代わりに、またはシグナル配列と結合ドメインとの間のＧＦＰ）をインビトロで分析する。次に、動物モデル（マウスおよびラット）において、ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入および動物からの細胞（ＧＦＰ）表面での移動の評価によって同様のことを行う。
フック結合ドメイン（ＳＢＰ）を含む「第二世代」ＣＡＲ（２つの細胞質内活性化ドメイン）および「第三世代」ＣＡＲ（３つの細胞質内活性化ドメイン）コンストラクトの両方が生成される。最初に、評価された結合ドメインは、抗ＣＤ１９、抗ＰＤＬ−１、抗ＰＤ１、抗ヘッジホッグ、抗ＣＤ１２３、および抗ＣＤ１２３／ＣＤ３３であろう。
ＣＡＲＭＩＮ１．０：ＣＤ１９（ＣＤ１９＋白血病およびリンパ腫の場合）、ＬＭＰ−１および−２（ＥＢＶ誘発性白血病の場合）に対して指向性のある第２世代（ＣＤ３＿および４−１ＢＢ共シグナル伝達ドメインを含む）および第３世代（ＣＤ３＿、ＣＤ２８および４−１ＢＢドメインを含む）のＣＡＲをコードするレンチウイルスベクターの開発。レンチウイルスベクターは、Ｔ細胞におけるＣＡＲの最適発現を可能にし、ＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性への影響が調査中である。血液悪性腫瘍をベンチマークとして用いることができる。
ＣＡＲＭＩＮ２．０：フックを介して小胞体（ＥＲ）の膜に固定されたＷタンパク質と、ＣＡＲ構造内に導入されたその結合パートナーＹに基づいたスイッチオン／オフシステムの開発。Ｘ−フック（例えば、ストレプトアビジン）とＹ（例えば、ストレプトアビジン−結合タンパク質）−ＣＡＲとの間の相互作用により、ＥＲ内部にＣＡＲが保持される。Ｚタンパク質（例えば、ビオチン）の添加は、ＹではなくＺへのＸの結合の平衡を置き換え、したがってＥＲからのＣＡＲの放出と細胞質膜へのその発現を導く。ＣＡＲの放出は、Ｚ枯渇（またはアンタゴニスト）により停止し、残りの細胞はＺ誘導物質の再導入によって容易に再活性化されうる。
フックとＣＡＲは１つのレンチベクターにベクトル化し、臨床の場で使用されうる（ｂ２ｍ−ＨＯＯＫ−ＩＲＥＳ−ＣＡＲ）。評価は、不死化細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｊｕｒｋａｔ、ＨｅＬａ）および初代細胞（Ｔ細胞）の両方でインビトロで行うことができる。このシステムは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の安全性を増加させる。スイッチ可能なＣＤ１９−ＣＡＲ系は、発現についてインビトロで、そして有効性についてインビボで評価することができる。
現在までに使用されているｓｃＦｖのほとんどはマウス起源である。これらのネズミ科ｓｃＦｖに対する中和抗体は、ＣＡＲの有効性を制限しうる。別法として、発明者らは、抗体のヒトＶＨドメインと高度に相同であり、高い抗原結合能力を示すので、結合ドメインとして使用されうるラクダナノボディを開発する。結合ドメインとしてＨｅｒ２に対して指向性のあるナノボディを含有する第２世代ＣＡＲにより概念実証を行う。これらの技術プラットフォームは、ＣＡＲ設計、製造および評価における柔軟性および反応性が可能になるので、最適なＣＡＲ−Ｔ細胞が生成される。この差別化された誘導的および可逆的（オン／オフ）ＣＡＲ Ｔ細胞技術は、患者のベッドサイド（自動化プロセス）で提供されることを目指している。
実施例５ ヒトＴ細胞における発現
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）上の密度勾配遠心分離によって末梢血から精製した。ＰＢＭＣ洗浄後、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（ミルテニー）を用いて、陰性磁気選択（すなわち、不要な細胞を磁気的に標識し、Ｔ細胞をそのままにしたもの）でＣＤ３＋Ｔ細胞を精製した。この工程は、高度に精製されたＴ細胞集団を得るために必要とされる。この単離工程後に得られた収量に基づき、ヒトＴ細胞（ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ミルテニー）の培養および増殖のために開発された最適化無血清細胞培養培地中で１０７〜１０８Ｔ細胞を２．５×１０６／ｍｌで培養した。これらのＴ細胞は、ミルテニーのＴ細胞活性化／増殖キットによって活性化される。このキットは、抗ビオチンＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子およびヒトＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ２８に対するビオチン化抗体からなる。ビオチン化抗体を負荷した抗ビオチンＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を用いて抗原提示細胞を模倣し、Ｔ細胞を活性化する。Ｔ細胞の最適な活性化は、２つの細胞あたり１つの負荷された抗ビオチンＭＡＣＳｉＢｅａｄ粒子を使用することによって達成される。Ｔ細胞を３日間活性化する。次いで活性化Ｔ細胞の形質導入を４のＭＯＩで行う。このＭＯＩ値は１つのＴ細胞が４つのレンチウイルス粒子形質導入単位と共にインキュベートされることを意味する。ＣＡＲ発現は、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧでマウスＣＤ１９結合ドメインを染色し、続いてフィコエリトリンにコンジュゲートしたストレプトアビジンにて染色することにより、フローサイトメトリーの４８または７２時間のレンチウイルス粒子添加により評価した。Ｔ細胞亜集団は、ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８の染色によって特徴付けた。これにより、Ｔ細胞の表面上のＣＡＲの特異的検出が可能になった。Ｔ細胞の生存および増殖を可能にするＴｅｘＭＡＣＳ培地を用いて全プロセスを実施した。
実施例６ ＣＡＲ−ＲＵＳＨの構造と発現
適格な血液は、フランスの血液機関（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ランジス、フランス））から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール（リンパ球分離培地、ユーロビオ）密度勾配分離によって精製した。次いで、Ｔ細胞を、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（ミルテニー）を用いた磁気単離によってＰＢＭＣから精製した。Ｔ細胞は製造者の指示に従って分離した。Ｔ細胞を、ＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニー）中３７℃／５％ＣＯ２で２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で培養物に入れ、ミルテニーのＴ細胞活性化／増殖キット（製造業者の指示によって調製した抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ナノ粒子）によりビーズ：Ｔ細胞比１：２で３日間活性化した。活性化後、Ｔ細胞を回収し、計数し、３７℃／５％ＣＯ２で２４ウェルプレート中のＴｅｘＭＡＣＳ培地中で培養した。形質導入は、異なるＭＯＩのレンチウイルスベクターをウェルに直接添加することによって行った。試験した種々のレンチウイルスベクターは、（ｉ）４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む第２世代の抗ＣＤ１９ ＣＡＲ；（ｉｉ）３つの異なる位置（ＣＡＲ−ＳＢＰ１、ＣＡＲ−ＳＢＰ２、ＣＡＲ−ＳＢＰ３）のストレプトアビジン結合タンパク質を含む同じベクターとした。
ＭＯＩに応じて各ウェルに添加するベクターの容量を、以下のように計算した：添加する量（μｌ）＝（ＭＯＩ×細胞の数（百万）／ベクターの濃度（導入単位／ｍｌ））×１０００。
３．１０９ＴＵ／ｍｌ［添加するベクター量（μｌ）＝（１０×０．２×１０６／３×１０９）×１０００＝０．５１μｌ］のベクター力価で１０のＭＯＩで２０００００細胞を形質導入した。ヒト組換えＩＬ−２（ミルテニー）を、形質導入の日に５０ＩＵ／ｍｌで加えた。３日目に、形質導入されたＴ細胞を回収し、ＤＰＢＳ１×で十分に洗浄し、９６ウェルプレートで目的の分子の免疫染色を行った。最初に、Ｔ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ７８０にコンジュゲートした生存色素（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ、イーバイオサイエンシス）と共にインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションは、アジドフリーおよびタンパク質フリーのＤＰＢＳ１×中で行った。次に細胞をＤＰＢＳ１×で洗浄し、次いでビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２（ジャクソン イムノリサーチ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファー（ミルテニー）で洗浄し、フィコエリトリンにコンジュゲートしたストレプトアビジン（ジャクソン イムノリサーチ）とＰＥ−Ｃｙ７にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤバイオサイエンシス）との混合物を用いて３回目のインキュベーションを行った。インキュベーションを４℃で３０分間行った。この３回目のインキュベーション後、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファーで洗浄し、ＣｅｌｌＦＩＸ（ＢＤバイオサイエンシス）で固定した後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置（ミルテニー）で取得した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
実施例７ フック−ストレプトアビジンをコードするレンチベクターによる同時形質導入後のＣＡＲ−ＲＵＳＨコンストラクトの発現および挙動と、ビオチン処理
適格な血液は、フランスの血液機関（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ランジス、フランス））から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール（リンパ球分離培地、ユーロビオ）密度勾配分離によって精製した。次いで、Ｔ細胞を、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（ミルテニー）を用いた磁気単離によってＰＢＭＣから精製した。Ｔ細胞は製造者の指示に従って分離した。Ｔ細胞を、ＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニー）中３７℃／５％ＣＯ２で２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で培養物に入れ、ミルテニーのＴ細胞活性化／増殖キット（製造業者の指示によって調製した抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ナノ粒子）によりビーズ：Ｔ細胞比１：２で３日間活性化した。
活性化後、Ｔ細胞を回収し、計数し、３７℃／５％ＣＯ２で２４ウェルプレート中のＴｅｘＭＡＣＳ培地中で培養した。同時形質導入は、異なるＭＯＩのレンチウイルスベクターをウェルに直接添加することによって行った。試験した２つのレンチウイルスベクターは、（ｉ）フック−ストレプトアビジンベクター、および（ｉｉ）３つの異なる位置（ＣＡＲ−ＳＢＰ１、ＣＡＲ−ＳＢＰ２、ＣＡＲ−ＳＢＰ３）のストレプトアビジン結合タンパク質を有する、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む第２世代の抗ＣＤ１９ ＣＡＲとした。
ＭＯＩに応じて各ウェルに添加する各ベクターの容量を、以下のように計算した：添加する量（μｌ）＝（ＭＯＩ×細胞の数（百万）／ベクターの濃度（導入単位／ｍｌ））×１０００。
ヒト組換えＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ、ミルテニー）およびビオチン（４０μＭ、シグマ−アルドリッヒ）を形質導入の日に加えた。
３日目に、形質導入されたＴ細胞を回収し、ＤＰＢＳ１×で十分に洗浄し、９６ウェルプレートで目的の分子の免疫染色を行った。最初に、Ｔ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ７８０にコンジュゲートした生存色素（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ、イーバイオサイエンシス）と共にインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションは、アジドフリーおよびタンパク質フリーのＤＰＢＳ１×中で行った。次に細胞をＤＰＢＳ１×で洗浄し、次いでビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２（ジャクソン イムノリサーチ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファー（ミルテニー）で洗浄し、フィコエリトリンにコンジュゲートしたストレプトアビジン（ジャクソン イムノリサーチ）とＰＥ−Ｃｙ７にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤバイオサイエンシス）との混合物を用いて３回目のインキュベーションを行った。インキュベーションを４℃で３０分間行った。この３回目のインキュベーション後、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファーで洗浄し、ＣｅｌｌＦＩＸ（ＢＤバイオサイエンシス）で固定した後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置（ミルテニー）で取得した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
実施例８ ＣＡＲ−ＲＵＳＨバイシストロン性コンストラクトの発現および挙動
適格な血液は、フランスの血液機関（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ランジス、フランス））から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール（リンパ球分離培地、ユーロビオ）密度勾配分離によって精製した。次いで、Ｔ細胞を、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（ミルテニー）を用いた磁気単離によってＰＢＭＣから精製した。Ｔ細胞は製造者の指示に従って分離した。Ｔ細胞を、ＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニー）中３７℃／５％ＣＯ２で２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で培養物に入れ、ミルテニーのＴ細胞活性化／増殖キット（製造業者の指示によって調製した抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ナノ粒子）によりビーズ：Ｔ細胞比１：２で３日間活性化した。
活性化後、Ｔ細胞を回収し、計数し、３７℃／５％ＣＯ２で２４ウェルプレート中のＴｅｘＭＡＣＳ培地中で培養した。形質導入は、異なるＭＯＩのレンチウイルスベクターをウェルに直接添加することによって行った。試験した異なるレンチウイルスベクターは、（ｉ）「典型的な」第２世代抗ＣＤ１９ＣＡＲ、（ｉｉ）フック−ストレプトアビジン、ＩＲＥＳ、および３つの異なる位置（フック−ＩＲＥＳ−ＣＡＲ−ＳＢＰ１、フック−ＩＲＥＳ−ＣＡＲ−ＳＢＰ２、フック−ＩＲＥＳ−ＣＡＲ−ＳＢＰ３）のストレプトアビジン結合タンパク質を有する、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む第２世代の抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含む３つのコンストラクトとした。
ＭＯＩに応じて各ウェルに添加する各ベクターの容量を、以下のように計算した：添加する量（μｌ）＝（ＭＯＩ×細胞の数（百万）／ベクターの濃度（導入単位／ｍｌ））×１０００。
試験した異なるＭＯＩは、実験に応じて１０、２０または３０とした。
ヒト組換えＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ、ミルテニー）およびビオチン（４０μＭ、シグマ−アルドリッヒ）を形質導入の日に加えた。
３日目および７日目に、形質導入されたＴ細胞を回収し、ＤＰＢＳ１×で十分に洗浄し、９６ウェルプレートで目的の分子の免疫染色を行った。最初に、Ｔ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ７８０にコンジュゲートした生存色素（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ、イーバイオサイエンシス）と共にインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションは、アジドフリーおよびタンパク質フリーのＤＰＢＳ１×中で行った。次に細胞をＤＰＢＳ１×で洗浄し、次いでビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２（ジャクソン イムノリサーチ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファー（ミルテニー）で洗浄し、フィコエリトリンにコンジュゲートしたストレプトアビジン（ジャクソン イムノリサーチ）とＰＥ−Ｃｙ７にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤバイオサイエンシス）との混合物を用いて３回目のインキュベーションを行った。インキュベーションを４℃で３０分間行った。この３回目のインキュベーション後、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファーで洗浄し、ＣｅｌｌＦＩＸ（ＢＤバイオサイエンシス）で固定した後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置（ミルテニー）で取得した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。
実施例９ ＣＡＲ−ＲＵＳＨシステムのスイッチ評価（オフ／オン／オフ）
適格な血液は、フランスの血液機関（Ｅｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ（ランジス、フランス））から入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール（リンパ球分離培地、ユーロビオ）密度勾配分離によって精製した。次いで、Ｔ細胞を、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（ミルテニー）を用いた磁気単離によってＰＢＭＣから精製した。Ｔ細胞は製造者の指示に従って分離した。Ｔ細胞を、ＴｅｘＭＡＣＳ培地（ミルテニー）中３７℃／５％ＣＯ２で２．５×１０６細胞／ｍｌの濃度で培養物に入れ、ミルテニーのＴ細胞活性化／増殖キット（製造業者の指示に従って調製した抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８ナノ粒子）によりビーズ：Ｔ細胞比１：２で３日間活性化した。
活性化後、Ｔ細胞を回収し、計数し、３７℃／５％ＣＯ２で２４ウェルプレート中のＴｅｘＭＡＣＳ培地中で培養した。形質導入は、異なるＭＯＩのレンチウイルスベクターをウェルに直接添加することによって行った。試験した異なるレンチウイルスベクターは、（ｉ）「典型的な」第２世代抗ＣＤ１９ＣＡＲ、（ｉｉ）フック−ストレプトアビジン、ＩＲＥＳ、および３つの異なる位置（フック−ＩＲＥＳ−ＣＡＲ−ＳＢＰ１、フック−ＩＲＥＳ−ＣＡＲ−ＳＢＰ２、フック−ＩＲＥＳ−ＣＡＲ−ＳＢＰ３）のストレプトアビジン結合タンパク質を有する、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含む第２世代の抗ＣＤ１９ ＣＡＲを含む３つのコンストラクトとした。
ＭＯＩに応じて各ウェルに添加するベクターの容量を、以下のように計算した：添加する量（μｌ）＝（ＭＯＩ×細胞の数（百万）／ベクターの濃度（導入単位／ｍｌ））×１０００。
試験した異なるＭＯＩは１０および２０とした。
ヒト組換えＩＬ−２（５０ＩＵ／ｍｌ、ミルテニー）およびビオチン（４０μＭ、シグマ−アルドリッヒ）を形質導入の日に加えた。
３日目に、細胞を洗浄して、ビオチンを４０μＭで添加して、あるいは添加しないで、ＣＡＲ−ＳＢＰ発現を再誘導した。
７日目に、形質導入されたＴ細胞を回収し、ＤＰＢＳ１×で十分に洗浄し、９６ウェルプレートで目的の分子の免疫染色を行った。最初に、Ｔ細胞を、ｅＦｌｕｏｒ７８０にコンジュゲートした生存色素（Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ、イーバイオサイエンシス）と共にインキュベートし、４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーションは、アジドフリーおよびタンパク質フリーのＤＰＢＳ１×中で行った。次に細胞をＤＰＢＳ１×で洗浄し、次いでビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆａｂ’）２（ジャクソン イムノリサーチ）と共に４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファー（ミルテニー）で洗浄し、フィコエリトリンにコンジュゲートしたストレプトアビジン（ジャクソン イムノリサーチ）とＰＥ−Ｃｙ７にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＣＤ３（ＢＤバイオサイエンシス）との混合物を用いて３回目のインキュベーションを行った。インキュベーションを４℃で３０分間行った。この３回目のインキュベーション後、細胞をａｕｔｏＭＡＣＳランニングバッファーで洗浄し、ＣｅｌｌＦＩＸ（ＢＤバイオサイエンシス）で固定した後、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ分析装置（ミルテニー）で取得した。

Claims (17)

  1. キメラ抗原レセプターであって、
    結合ドメイン；
    膜貫通ドメイン；
    ストレプトアビジン結合ペプチドを含むフック結合ドメイン；および
    配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号３３または配列番号３４の少なくとも１００アミノ酸のＴ細胞活性化断片、または配列番号６の少なくとも９０アミノ酸のＴ細胞活性化断片を含む活性化ドメイン
    を含み、
    前記フック結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、キメラ抗原レセプターの細胞質内領域に位置している、キメラ抗原レセプター。
  2. レンチウイルスベクターであって、
    結合ドメイン；
    膜貫通ドメイン；
    ストレプトアビジン結合ペプチドを含むフック結合ドメイン；および
    配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号３３または配列番号３４の少なくとも１００アミノ酸のＴ細胞活性化断片、または配列番号６の少なくとも９０アミノ酸のＴ細胞活性化断片を含む活性化ドメイン
    を含み、
    前記フック結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、キメラ抗原レセプターの細胞質内領域に位置している、キメラ抗原レセプターを発現する、レンチウイルスベクター。
  3. 核酸ベクターであって、
    結合ドメイン；
    膜貫通ドメイン；
    ストレプトアビジン結合ペプチドを含むフック結合ドメイン；および
    配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号３３または配列番号３４の少なくとも１００アミノ酸のＴ細胞活性化断片、または配列番号６の少なくとも９０アミノ酸のＴ細胞活性化断片を含む活性化ドメイン
    を含み、
    前記フック結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、キメラ抗原レセプターの細胞質内領域に位置している、キメラ抗原レセプターをコードする、核酸ベクター。
  4. 前記結合ドメインが、単鎖Ｆｖ抗体またはナノボディを含む、請求項１に記載のキメラ抗原レセプター、または請求項２に記載のレンチウイルスベクター、または請求項３に記載の核酸ベクター。
  5. 前記ベクターが、配列番号３１または配列番号３２のアミノ酸配列を含むフックをコードする、請求項２に記載のレンチウイルスベクター、または請求項３に記載の核酸ベクター。
  6. 前記ベクターが、β２−ミクログロブリン、ユビキチン、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩプロモーターを含む、請求項２から５のいずれか一項に記載のベクター。
  7. 前記ベクターがＤＮＡである、請求項２から６のいずれか一項に記載のベクター。
  8. レンチウイルスベクター粒子であって、
    結合ドメイン；
    膜貫通ドメイン；
    ストレプトアビジン結合ペプチドを含むフック結合ドメイン；および
    配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号３３または配列番号３４の少なくとも１００アミノ酸のＴ細胞活性化断片、または配列番号６の少なくとも９０アミノ酸のＴ細胞活性化断片を含む活性化ドメイン
    を含み、
    前記フック結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含み、キメラ抗原レセプターの細胞質内領域に位置している、キメラ抗原レセプターをコードする、レンチウイルスベクター粒子。
  9. 前記結合ドメインが、単鎖Ｆｖ抗体またはナノボディを含む、請求項８に記載のレンチウイルスベクター粒子。
  10. 前記レンチウイルスベクター粒子が、配列番号３１または配列番号３２のアミノ酸配列を含むフックをコードする、請求項８に記載のレンチウイルスベクター粒子。
  11. 前記レンチウイルスベクター粒子が、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。
  12. 前記レンチウイルスベクター粒子が、ＨＩＶ−１サブタイプＤ ＧａｇおよびＰｏｌタンパク質を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載のレンチウイルスベクター粒子。
  13. 請求項２から７のいずれか一項に記載のベクターを含む単離された細胞。
  14. ヒトにおいて免疫応答を誘導するための、請求項１に記載のキメラ抗原レセプターまたは請求項２に記載のレンチウイルスベクターまたは請求項３に記載の核酸ベクターまたは請求項８に記載のレンチウイルスベクター粒子。
  15. 配列番号４５、配列番号４７または配列番号４９のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項２に記載のレンチウイルスベクター、または請求項３に記載の核酸ベクター。
  16. 前記キメラ抗原レセプターが、配列番号４６、配列番号４８または配列番号５０のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキメラ抗原レセプター。
  17. 配列番号４２のアミノ酸配列をさらにコードするか、または配列番号４３および／または配列番号４４の核酸配列を含む、請求項１５に記載のレンチウイルスベクターまたは核酸ベクター。
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