EA029198B1

EA029198B1 - Полноразмерные иммуноглобулины изотипа igg, способные к распознаванию нейтрализующего эпитопа в области стебля гемагглютинина различных подтипов и их использование в качестве лекарственного средства против гриппа

Info

Publication number: EA029198B1
Application number: EA201290955A
Authority: EA
Inventors: Роберто Буриони; Массимо Клементи
Original assignee: Помона Ричерка С.Р.Л.
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-25
Publication date: 2018-02-28
Also published as: US20130022608A1; WO2011117848A1; SI2552485T1; CN102958539B; EP2552485A1; EP2552485B1; CN102958539A; EA201290955A1; HRP20170490T1

Abstract

Изобретение относится к моноклональным антителам, представляющим собой полноразмерные иммуноглобулины изотипа IgG и характеризующимся очень широким спектром нейтрализующей активности против вируса гриппа А и способным распознавать специфичный эпитоп гемагглютинина, т.е. высококонсервативный у различных подтипов вируса гриппа А. Кроме того, описаны терапевтические, профилактические и диагностические применения полноразмерных IgG по изобретению.

Description

Изобретение относится к моноклональным антителам, представляющим собой полноразмерные иммуноглобулины изотипа ΙβΟ и характеризующимся очень широким спектром нейтрализующей активности против вируса гриппа А и способным распознавать специфичный эпитоп гемагглютинина, т.е. высококонсервативный у различных подтипов вируса гриппа А. Кроме того, описаны терапевтические, профилактические и диагностические применения полноразмерных Ι§0 по изобретению. 029198 Изобретение в основном входит в область иммунологии. Более конкретно, изобретение относится к полноразмерным иммуноглобулинам, способным к связыванию и нейтрализации вируса гриппа А. На современном уровне техники известны антитела, распознающие вирус гриппа А. В международной патентной заявке РСТ/1В 2009/051068 описаны моноклональные антитела, предпочтительно в виде РаЬ-фрагментов, способные к связыванию множества различных подтипов вируса гриппа А (иммунитет к различным подтипам), где такие антитела также обладают важной нейтрализующей активностью. Предпочтительное антитело, описанное в указанной выше международной патентной заявке, представляет собой РаЬ-фрагмент 28, характеризующийся тем, что он содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕО ГО N0:2. Также в РСТ/1В 2009/051068 описаны соответствующие кодирующие последовательности, т.е. 8Е0 ГО N0:3 (вариабельная область тяжелой цепи) и 8Е0 ГО N0:4 (вариабельная область легкой цепи). В настоящем описании фрагмент антитела РаЬ 28 обозначен как "РаЬ Р^§1А28". В международной патентной заявке РСТ/1В2009/051068 авторы указывают, что антитело, являющееся объектом изобретения, в отличие от РаЬ-фрагмента можно альтернативно предоставлять в виде полноразмерного иммуноглобулина. Как известно, иммуноглобулины человека классифицируют на пять классов: 1§О, 1дА, Ι§Μ, Ι§Ό и 1дЕ, где каждый отличается по типу тяжелой цепи. Однако в РСТ/1В2009/051068 конкретный класс иммуноглобулина отдельно не определен, и не сделано указаний о предоставляемом типе тяжелой цепи так, чтобы позволить специалисту в данной области выбрать конкретный класс иммуноглобулина. Кроме того, в РСТ/1В 2009/051068 не предоставлено экспериментальных данных о нейтрализующей эффективности антитела Р^§1А28 при использовании в качестве полноразмерного иммуноглобулина. Неожиданно авторы настоящего изобретения в настоящее время выявили, что моноклональное антитело, характеризующееся аминокислотными последовательностями вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, описанными в РСТ/1В 2009/051068, конкретно предоставленное в виде полноразмерного иммуноглобулина класса Ι§0, по сравнению с соответствующим РаЬфрагментом демонстрирует значительное возрастание нейтрализующей активности в отношении вируса гриппа А, как в отношении эффективности, так и в отношении диапазона действия. Как известно, Ι§0 состоит из пары легких цепей (Ь) и пары тяжелых цепей (С). Каждая легкая цепь содержит два иммуноглобулиновых домена, один вариабельный (УЪ) и один константный (СЬ) домен. Тяжелые цепи представляют собой тип γ, и каждая из них содержит вариабельный иммуноглобулиновый домен (УН или Υγ) и три константных домена (СН1/2/3). γ-цепи в свою очередь классифицируют на четыре различных подтипа, обозначаемых как γ1, γ2, γ3 и γ4 соответственно. Моноклональное антитело в виде полноразмерного Ι§0, характеризуемое аминокислотными последовательностями вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, описанными в РСТ/1В 2009/051068, далее в настоящем документе обозначено как "Ι§0 Р^§1А28". В табл. 1 схематически представлены результаты, полученные авторами настоящего изобретения в отношении нейтрализующей активности Ι§0 Р^§1А28, выраженные в качестве сравнений. Существует доказательство высокой нейтрализующей активности в отношении различных штаммов подтипа НЗШ. которая вместе с этим является более низкой в случае соответствующего РаЬ-фрагмента. Кроме того, даже в крайне низких концентрациях полноразмерное 1§О демонстрирует очень сильную нейтрализующую активность в отношении различных штаммов подтипа НДО1, большую чем нейтрализующая активность соответствующего РаЬ-фрагмента по отношению к тем же штаммам Н1Ш. Авторы настоящего изобретения также провели предварительные эксперименты, позволившие оценить способность 1§О РК-81А28 также связывать рекомбинантные гемагглютинины, принадлежащие подтипам Н2, Н5 и Н9. Полученные результаты, которые подробно описаны в экспериментальном разделе, позволяют полагать, что нейтрализующая активность 1§О РК-81А28 распространяется по меньшей мере на подтипы Н2, Н5 и Н9, которые ранее не были описаны в отношении соответствующего РаЬфрагмента. Принимая во внимание выдающиеся нейтрализующие свойства 1§О Р^§1А28, авторы настоящего изобретения также провели чрезвычайно сложные исследования и эксперименты (подробно проиллюстрированные далее в настоящем документе), которые позволили им идентифицировать область гемагглютинина, представляющую собой эпитоп, специфически распознаваемый нейтрализующим антителом 1§О Р^§1А28. Идентификация нейтрализуемого эпитопа, распознаваемого 1§О Р^§1А28, особенно пригодна и важна, делая возможным идентифицировать дополнительные моноклональные антитела человека, распознающие этот эпитоп, и обладающие выдающимися нейтрализующими свойствами, по существу, сравнимыми с нейтрализующими свойствами 1§О Р^§1А28. Таким образом, одним из первых объектов настоящего изобретения является моноклональное антитело человека в форме полноразмерного 1§О, специфически распознающее антиген гемагглютинина вируса гриппа А и способное связываться и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, вклю- 1 029198 чающих по меньшей мере подтип Н1 и подтип Н3, характеризующееся тем, что антитело распознает консервативный эпитоп, расположенный в области стебля гемагглютинина, где указанный эпитоп содержит аминокислотные остатки НЕ25. Ηίδ45, ТЬт315 и АкиЗЗб полипептида гемагглютинина НА1 и аминокислотные остатки ТЬт358, Мс13б(). 11е3б1 или Уа13б1, А§р3б2, С1у3б3, Тгр3б4, УЬт384, ТЬт392, Уа1395, С1и400 полипептида гемагглютинина НА2, где нумерация аминокислотных остатков основана на аминокислотной последовательности гемагглютинина Η1Ν1, доступной в базе данных ΝΟΒΙ под номером доступа ЕР4б7821.1 и обозначенной в списке последовательностей как §Еф ГО N0:5. В предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело человека в форме полноразмерного 1дС. которое является объектом изобретения, способно связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3 и по меньшей мере один из подтипов Н5, Н2 и Н9. В другом предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело человека в форме полноразмерного 1дС, которое является объектом изобретения, способно связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3 и по меньшей мере два из подтипов Н5, Н2 и Н9. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело человека в форме полноразмерного фС, которое является объектом изобретения, способно связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3, подтип Н5, подтип Н2 и подтип Н9. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления моноклональное антитело человека в форме полноразмерного фС, которое является объектом изобретения, представляет собой Ι§0 ΡΝ§ЬА28, характеризующееся тем, что оно содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность §Еф ГО N0:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность §Еф ГО N0:2. Исследования, которые привели к определению эпитопа, распознаваемого антителом фС ΡΝ8ΙΑ28, подробно описаны в экспериментальном разделе, который приведен ниже. Также описаны сравнительные исследования, проведенные в отношении эпитопа, распознаваемого моноклональными антителами к гриппу на известном уровне техники С179, СКб2б1 и Р10. Благодаря проведенным сравнительным исследованиям, авторы настоящего изобретения смогли показать, что указанные выше антитела на известном уровне техники, которые представляют собой некоторые из наиболее известных и распространенных антител к гриппу, эффективно распознают эпитопы, отличающиеся от эпитопа, распознаваемого Ι§0 ΡΝ-8ΙΑ28. В приведенном ниже экспериментальном разделе также проиллюстрировано получение фС ΡΝ8ΙΑ28 и проводимые тесты по нейтрализации с соответствующими результатами. Полноразмерное фС, являющееся объектом изобретения, предпочтительно, но без ограничения, представляющее собой фС ΡΝ-8ΕΑ28, получают и используют в свободной форме или в конъюгированной с носителем форме. Носитель представляет собой любую молекулу или химическую или биологическую частицу, предназначенную для конъюгации с антителом и модификации его фармакокинетических характеристик, делая его иммуногенным или увеличивая его иммуногенность. Неограничивающими примерами носителей являются белки, такие как КЬН ("гемоцианин морского блюдца"), эдестин, тиреоглобулин, альбумины, такие как бычий сывороточный альбумин (ΒδΑ) или сывороточный альбумин человека (Н8А), эритроциты, такие как эритроциты овцы (8РВС), анатоксин столбняка, холерный анатоксин, полиаминокислоты, например, такие как поли(Э-лизинГО-глутаминовая кислота) и т.п. Для облегчения связывания антитела с носителем, С-конец или Ν-конец антитела можно модифицировать, например, посредством введения дополнительных аминокислотных остатков, например одного или нескольких остатков цистеина, которые способны формировать дисульфидные мостики. Вследствие его свойств, подробно проиллюстрированных в приведенном ниже экспериментальном разделе с особым акцентом на фС ΡΝ-8ΙΑ28, полноразмерное фС, являющееся объектом изобретения, особенно подходит для применения в приложениях в области медицины, в частности для получения лекарственного средства для профилактического или терапевтического лечения широкого спектра инфекций вирусом гриппа А. Таким образом, в объеме изобретения находится применение фС по изобретению, предпочтительно, но без ограничения, фС ΡΝ-8ΙΑ28, для получения лекарственного средства для профилактического или терапевтического лечения патологий, вызываемых инфекциями вирусом гриппа А, таких как, например, синдром гриппа. Результаты тестов по нейтрализации, проводимых и продемонстрированных в приведенном ниже экспериментальном разделе, заставляют верить, что фС ΡΝ-8ΙΑ28 является особенно эффективным в обеспечении у индивидуумов, которым вводят такое фС, пассивного иммунитета против вируса гриппа А, и что в результате оно особенно пригодно для профилактического или терапевтического лечения широкого спектра патологий, вызываемых инфекциями вирусом гриппа А, такими как, например, синдром гриппа, особенно у человека. Любое другое полноразмерное фС, распознающее тот же эпитоп гемагглютинина, который распознает Ι§0 ΡΝ-8ΙΑ28, обладает нейтрализующими возможностями, по существу, равными с фС ΡΝ-8ΙΑ28. - 2 029198 Таким образом, другим объектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента эффективное количество 1дС по изобретению, предпочтительно, но без ограничения, 1§С ΡΝ-δΙΑ28, и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель. Эффективное количество 1дС представляет собой количество, рассчитанное для осуществления благоприятного действия у индивидуума, которому вводят композицию, например, для нейтрализации вируса гриппа А, воздействуя на фазу его цикла репликации. В этом контексте термин "индивидуум" относится к любому животному-хозяину, которому вводят композицию, и она оказывает свое защитное действие, предпочтительно млекопитающее, более предпочтительно человек. Неограничивающие примеры фармацевтически приемлемых носителей или разбавителей, пригодных в фармацевтической композиции по изобретению, включают стабилизаторы, такие как 8ΡΟΑ, углеводы (например, сорбит, маннит, крахмал, сахароза, глюкоза, декстран), белки, такие как альбумин или казеин, средства, содержащие белки, такие как бычья сыворотка или обезжиренное молоко, и буферы (например, фосфатный буфер). 1дС по изобретению, предпочтительно, но без ограничения, Ι§0 ΡΝ-δΤΑ28, также предпочтительно можно использовать в качестве диагностического реагента в способе детекции ίη νίίτο в биологическом образце, ранее полученном у пациента (например, в таком, как образец сыворотки, плазмы, крови или любой другой подходящий биологический материал, получаемый у пациента, предпочтительно у человека), антител к вирусу гриппы А с перекрестной нейтрализующей активностью против различных подтипов вируса гриппа А. Эти антитела можно найти в биологическом образце, получаемом у пациента, например, в результате воздействия вируса гриппа А или вследствие предшествующего введения пациенту моноклонального антитела по изобретению с терапевтическими, или профилактическими, или исследовательскими целями. Таким образом, в объеме изобретения находится способ анализа для детекции в получаемом у пациента биологическом образце присутствия антител к вирусу гриппа А с перекрестной нейтрализующей активностью в отношении различных подтипов, где способ включает приведение указанного биологического образца в контакт, в качестве специфичного реагента для анализа, с 1дС по изобретению, предпочтительно, но без ограничения, с 1дС ΡΝ-δΙΑ28. Анализ может являться количественным или качественным. Детекцию и/или определение количества антител к вирусу гриппа А с перекрестной нейтрализующей активностью в отношении различных подтипов можно проводить, например, посредством конкурентного иммунологического анализа, например конкурентного ΕΟδΑ, в котором оценивают способность биологического образца, предварительно полученного у пациента, замещать связывание 1дС по настоящему изобретению с гемагглютинином. Общие свойства конкурентных иммунологических анализов в основном известны специалистам в данной области и в подробном описании в настоящем документе не нуждаются. Таким образом, также в объеме изобретения находится диагностический набор, содержащий в качестве специфичного реагента 1дО по изобретению, предпочтительно, но без ограничения, ДО ΡΝ-δΙΑ28, где указанный набор конкретно разработан для детекции и/или количественного определения в биологическом образце, предварительно полученном у пациента, антител к вирусу гриппа А с перекрестной нейтрализующей активностью в отношении различных подтипов вируса гриппа А. Аналогично ДО по изобретению, предпочтительно, но без ограничения, ДО ΡΝ-δΙΑ28, можно использовать в качестве специфичного реагента в способе анализа для детекции и/или количественного определения в предварительно полученной иммуногенной или вакцинной композиции эпитопа, способного к индукции у индивидуума, которому вводят такую композицию антител к вирусу гриппа А с нейтрализующими свойствами, идентичными или сходными со свойствами ДО по изобретению, т.е. с перекрестной нейтрализующей активностью в отношении различных подтипов вируса гриппа А. Полагают, что такой способ пригоден для оценки любого препарата, который необходимо использовать в качестве вакцины или иммуногенного препарата, так как распознавание моноклональным антителом по изобретению является показателем наличия в иммуногенном препарате и/или вакцине одного или нескольких эпитопов, способных к стимуляции продукции клонов антител, способных к распознаванию предпочтительного эпитопа, например, такого как эпитоп, способный к индукции иммунитета к различным подтипам вируса гриппа А, такой как эпитоп, идентифицированный авторами настоящего изобретения и подробно описанный в описании настоящего патента. Наконец, ДО по изобретению, предпочтительно, но без ограничения, ДО ΡΝ-δΙΑ28, можно использовать для получения мимеотопов, например, таких как антиидиотипические антитела, пептиды, укороченные или искусственные формы гемагглютинина или других, способных к индукции антител, подобных ДО ΡΝ-δΙΑ28. Из них предпочтительными являются антиидиотипические антитела. Антиидиотипические антитела представляют собой антитела специфически направленных к идиотипу широкого спектра нейтрализующих антител, используемых для их получения, и, таким образом, они способны имитировать ключевые эпитопы, которые они распознают. Получение антиидиотипических антител проводят, по существу, известными способами, которые не нуждаются в подробных объяснениях в настоящем документе. В качестве примера указана статья, опубликованная авторами изобретения (Вшгош с1 а1. (2008) - 3 029198 РЬо8 ΟΝΕ 3(10):е3423, относящаяся к получению антиидиотипического антитела, способного имитировать ключевой эпитоп §р120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Таким образом, в объеме изобретения также находятся мимеотопы, предпочтительно антиидиотипические антитела, направленные к 1§О по изобретению, предпочтительно, но без ограничения, 1§О ΡΝ§ЬА28. Приведенный ниже экспериментальный раздел предоставлен исключительно в качестве иллюстрации, а не ограничения объема изобретения, как определено в прилагаемой формуле изобретения. Экспериментальный раздел. 1. Получение Ι§0 ΡΝ-8ΙΛ28 и характеристика его нейтрализующих свойств. 1дС ΡΝ-8ΙΆ28, представляющий собой предпочтительный вариант осуществления изобретения, получали использованием бакуловирусов. Для экспериментов с трансфекцией и последующего получения исходного раствора вируса с высоким титром использовали клеточную линию §Г-9, в то время как для получения рекомбинантных белков использовали клеточную линию Ηί§1ι РАе (Н5). Их обе поддерживали в средах без сыворотки с использованием сред δί-900 II §РМ и Ехргекк-Иуе §РМ (СгЬсо) соответственно. Клетки инкубировали при 21°С и поддерживали в суспензии при концентрации приблизительно 106 клеток/мл. Получение рекомбинантного бакуловируса. Получение полноразмерных 1§О на основе РаЬ-фрагмента проводили, клонируя гены тяжелых и легких цепей в вектор для переноса, содержащий области, гомологичные геному бакуловируса ЛсОТУ (гены промоторов Р10 и полиэдрина). ДНК бакуловируса (ΒΌ Вюзшепсез РЬагтшдеи) содержит летальную делецию, таким образом, она не способна осуществлять продуктивную инфекцию после трансфекции в клетки насекомых. Когда линеаризованный геном бакуловируса котрансфицируют в клетки §Г-9 с комплементарным вектором для переноса, рекомбинация между гомологичными областями приводит к получению рекомбинантного бакуловируса, снова жизнеспособного, а также способного экспрессировать гетерологичные белки. В частности, для получения рекомбинантного бакуловируса, экспрессирующего полноразмерное антитело человека, использовали вектор для переноса рЛс-к-Рс (ΡΚΟΟΕΝ), который содержит Рс-участок иммуноглобулинов 1§О человека и в котором клонированы гены легких и тяжелых цепей РаЬ ΡΝ-8ΙΆ28. Гены легких цепей клонировали в вектор для переноса рАс-к-Рс с использованием участков рестрикции §аб, ЕсоКУ, тогда как гены тяжелых цепей клонировали с использованием участков рестрикции ΧΙιοΙ, §ре1. На фиг. 1 приведено схематическое представление вектора для переноса (Ρτο^η), где указаны участки клонирования тяжелых и легких цепей. Таким образом, вектор для переноса, подтвержденный посредством тестов с расщеплением и секвенированием, котрансфицировали 5 мкг бакуловирусной ДНК (ΒΌ) по протоколу, рекомендованному производителем (ΒΌ Вюзсепсез). Приблизительно через 6-7 суток собирали среду после трансфекции и анализировали на присутствие иммуноглобулинов человека в анализе ЕЬ1§А. Этот первый супернатант обозначали как "этап 0" (§0). Для получения чистой популяции рекомбинантного бакуловируса проводили анализ образования бляшек. В кратком изложении, 2х106 клеток §Г-9 высевали в 6-луночный планшет и получали серийные разведения (от 10-4 до 10-7) супернатанта §0. В каждую лунку добавляли 1 мл каждого разведения и через 1 час при 27°С инокулят удаляли и в каждую лунку добавляли полутвердую среду (раствор 1% агарозы). Планшет инкубировали при 27°С в течение приблизительно одной недели, т.е. до появления литических бляшек, детектируемых под микроскопом. Несколько бляшек индивидуально переносили в лунки 24луночного планшета, содержащего 105 клеток §Г-9. Приблизительно через одну неделю, каждый супернатант тестировали в анализе ЕЬ1§А на присутствие 1§О, секретируемых в среду для культивирования. Кроме того, снова посредством ЕЬ1§А подтверждали, что антитело сохраняет его специфичность связывания с антигеном. В частности, рекомбинантные антитела 1§О ΡN-§IА28, секретируемые в среду для культивирования, детектировали посредством общепринятого анализа связывания ЕЬ1§А с захватом, с использованием в качестве захватывающего реагента поликлонального антитела, способного связываться с РаЬ-фрагментами человека, и конъюгированного с пероксидазой хрена поликлонального антитела, способного связываться с Рс-фрагментом человека, для детекции. Для определения специфичности рекомбинантного антитела, анализ ЕЬ1§А проводили с использованием в качестве антигена вакцины от гриппа 1пДеха1 V (сезон 2007-08), ранее распознаваемой моноклональным антителом в виде РаЬфрагмента. Амплификация рекомбинантного бакуловируса. После получения чистой популяции рекомбинантных бакуловирусов в анализе образования бляшек, ее амплифицировали с получением исходного раствора вируса с высоким титром (приблизительно 109 БОЕ/мл). Проводили четыре этапа амплификации ίη νίίτο, первые три (§1, §2, §3) в прикрепленных клетках 8Г-9, тогда как последний этап (§4) - в суспендированных клетках. Затем §4 титровали в 96-луночных планшетах посредством анализа конечных разведений, и титр рассчитывали по формуле Рида-Менча. Экспрессия рекомбинантного антитела. Для определения оптимальных условий экспрессии клетки Н5 в суспензии инфицировали при различной множественности заражения (ΜΟΙ 1, 5 и 10) и среду собирали через различное количество суток - 4 029198 (3, 4, 5, 6 суток после инфицирования). Посредством вестерн-блоттинга тестировали различные аликвоты для установления оптимальных условий инфицирования и проверки целостности получаемой молекулы. Получаемые рекомбинантные иммуноглобулины детектировали с использованием конъюгированных с пероксидазой хрена поликлональных антител, способных связывать Ре-фрагмент человека. Анализ проводили в денатурирующих и невосстанавливающих условиях (10% δΌδ). Очистка и количественное определение рекомбинантных 1дС ΡΝ-δΡΑ28. После инфицирования 1 л клеток Н5 (ΜΟΙ 5) с концентрацией 106 клеток/мл контролировали жизнеспособность клеток посредством ежедневного окрашивания трипановым синим. Приблизительно через 4 суток (гибель приблизительно 70-80%), среду собирали, центрифугировали и фильтровали с использованием 0,2 мкм фильтров (МПИроге). Затем рекомбинантное антитело очищали из супернатанта культуры по аффинности, используя О-белок. Антитело элюировали в 10 мл буфера для элюции (0,1М лимонная кислота, рН 3) и концентрировали посредством ультрафильтрации через Аш1соп иНта-15 (МПИроге). Концентрацию и чистоту очищенных антител определяли посредством полиакриламидного геля (δΌδ-ΡΑΟΕ) и последующего окрашивания кумасси синим посредством соотнесения со стандартной кривой с ΒδΑ. Кроме того, проводили количественное определение рекомбинантного белка посредством ΕΡΙδΑ, посредством соотнесения со стандартной кривой, полученной с коммерческими 1дО человека. Микроанализ нейтрализации. Клетки МЭСК (4х 104 на лунку) высевали в 96-луночный планшет. Серийные разведения РаЬ ΡΝδΙΑ28 (20 мкг/мл-0,078 мкг/мл) и 1дО ΡΝ-δΙΑ28 (10 мкг/мл-0,039 мкг/мл) инкубировали с 100 ТСГО50 каждого вируса Η1Ν1 или Η3Ν2. Через 1 ч при 37°С в каждую лунку добавляли 100 мкл смеси вирус-РаЬ или вирус-1дО в различных концентрациях (для контроля инфицирования смесь состояла только из вируса). Через 1 ч при 37°С 100 мкл смеси удаляли и в каждую лунку добавляли 100 мкл МЕМ ТРСКтрипсин. Приблизительно через 7 ч при 37°С монослой клеток фиксировали и пермеабилизировали раствором холодного этанола в течение 10 мин при комнатной температуре. Затем клетки инкубировали в течение 30 мин при 37°С в увлажненной камере с моноклональным антителом к гриппу Α Огдене). которое детектировали с использованием конъюгированного с флуоресцеинизоцианатом (Р1ТС) антитела. В заключение клетки окрашивали окрашивающим ядра красителем НоесИз! 33342. Нейтрализующую активность антител определяли, рассчитывая уменьшение количества инфицированных клеток по сравнению с контрольным вирусом, т.е. с вирусом, предварительно не инкубируемым с представляющим интерес антителом. В эксперименты всегда включали отрицательный контроль (вирус + антитело, не специфичное к вирусам гриппа), неинфицированные клетки и контроль на токсичность используемых антител. Количество положительных ядер в каждой лунке рассчитывали в автоматизированной системе анализа клеток ОЕ НеаИИсате’з ΙΝ Се11 Αη;Π\^γ ЗуДет. Результаты. Получение полноразмерного антитела посредством бакуловирусов. Полноразмерные иммуноглобулины получали, клонируя гены тяжелой и легкой цепей РаЬ ΡΝδΙΑ28 в вектор для переноса рАс-к-Рс (Бгодеп). содержащий Рс-участок. После котрансфицирования клеток δί-9 вектором рΑс-к-Рс и линеаризованной бакуловирусной ДНК, авторы изобретения подтверждали, что среда для культивирования после трансфекции содержала ЦО человека. Кроме того, ЦО. секретированные в среду для культивирования, тестировали на сохранение специфичности связывания. С этой целью среду после трансфекции тестировали посредством ΕΡΙδΑ с использованием в качестве антигена, поликлональных антител, способных связывать РаЬ-фрагменты человека, и вакцину гриппа Iηί1еxа1 V (сезон 2007-08) соответственно. В обоих случаях моноклональное ЦО ΡΝ-δΙΑ28 детектировали посредством конъюгированных с пероксидазой хрена поликлональных антител, способных связывать Рс-фрагмент человека. В качестве отрицательного контроля антигена использовали 1% ΒδΑ. Параллельно также проводили соответствующим образом адаптированный иммуноферментный анализ с использованием РаЬ ΡΝ-δΙΑ28. Результаты ΕΡΙδΑ продемонстрировали, что вновь получаемые после трансфекции ЦО секретировались в среду для культивирования и сохраняли их специфичность связывания, т.е. способность связывать вакцину против гриппа, а также получаемые из нее РаЬ-фрагменты. Среду после трансфекции использовали для анализа образования бляшек с получением чистой популяции рекомбинантных бакуловирусов. Супернатант нескольких отдельных бляшек тестировали посредством ΕΡΙδΑ для оценки присутствия ЦО. секретируемых в среду для культивирования. Не все супернатанты являлись положительными на присутствие иммуноглобулинов в среде для культивирования, и, таким образом, их исключали. После получения исходного раствора вируса с высоким титром (108-109 БОЕ/мл) авторы изобретения проверяли экспрессию ЦО ΡΝ-δΙΑ28 с использованием различных ΜΟΙ и различных временных точек. Для тестов экспрессии использовали линию клеток Н5 и несколько аликвот среды, собранных на сутки 3, 4, 5 и 6 после инфицирования тестировали посредством вестерн-блоттинга в денатурирующих и невосстанавливающих условиях. На основе полученных результатов (данные не показаны) авторы изобретения выбрали ΜΟΙ 5 и отбор среды для получения рекомбинантных белков в клетках Н5 на сутки 4 после инфицирования. - 5 029198 Характеристика биологической активности ΐη νίίτο: микроанализ нейтрализации. Для оценки нейтрализующей активности антител проводили микроанализы нейтрализации в 96луночных планшетах с различными изолятами вируса, принадлежащими подтипам Η1Ν1 и Η3Ν2. Эксперименты проводили с использованием и РаЬ ΡΝ-8ΙΆ28, и ΙμΟ ΡΧ-8ΡΛ28. Результаты микроанализов нейтрализации приведены в табл. 1 ниже. Нейтрализующая способность антител выражена в виде 1С50, т.е. концентрации антитела (выраженной в виде мкг/мл), способной нейтрализовать инфицирование отдельными вирусными изолятами на 50%. Таблица 1 <table border="1"> <tr><td> </td><td> РаЬ 28</td><td> 1§С ΡΝ-3ΙΑ28</td></tr> <tr><td> Η1Ν1</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> А/Мйап/иНЗК 1/2009</td><td> 0.3</td><td> 0.2</td></tr> <tr><td> АЛУ8/33</td><td> 2.9</td><td> 1.3</td></tr> <tr><td> А/Ма1/302/54</td><td> 0.8</td><td> 0.64</td></tr> <tr><td> А/РК78/34</td><td> 2</td><td> 1.2</td></tr> <tr><td> АДЧС/20/99</td><td> 7.0</td><td> Н.П.*</td></tr> <tr><td> А/ЗМпе/Рагта/1 /97</td><td> 3.9</td><td> 2</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Η3Ν2</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> А/Ноп§ Коп§/8/68</td><td> 20</td><td> 0.8</td></tr> <tr><td> А/А1сЫ/2/68</td><td> 20</td><td> 0.6</td></tr> <tr><td> АЛ4с1опа/3/75</td><td> >20</td><td> 1.2</td></tr> <tr><td> А/РоИ СЬа1тегз/1/73</td><td> 13.19</td><td> 1.8</td></tr> <tr><td> АЛУ 15сопз1п/67/2005</td><td> >20</td><td> н.п*</td></tr> </table> *н.п.: эксперимент не проводили. Анализируемые моноклональные являлись способными к нейтрализации и в виде РаЬ-фрагмента (РаЬ ΡΝ-8ΙΆ 28) и в виде полноразмерного иммуноглобулина (1дО ΡΝ-8ΙΆ28), все тестируемые изоляты принадлежали к подтипу Η1Ν1 (эталонные штаммы АТСС и изолят Η1Ν1, приведший к пандемии 2009 года). Однако рекомбинантные белки в форме полноразмерного ΙμΟ продемонстрировали нейтрализующую активность, которая являлась намного более высокой, чем нейтрализующая активность РаЬ. Полноразмерный иммуноглобулин ΙμΟ ΡΝ-8ΙΆ28 в отличие от РаЬ ΡΝ-8ΙΆ 28 также продемонстрировал значительную нейтрализующую активность в отношении всех тестируемых изолятов подтипа Η3Ν2. Таким образом, в целом, полноразмерный иммуноглобулин ΙμΟ ΡΝ-8ΙΆ28 продемонстрировал значительно меньшую ΚΧ0, чем Ι(Χ0 РаЬ. 2. Материалы и способы для идентификации эпитопа. Отбор и характеристика мутантов, способных избегать ответа антителами (избегающие антител мутанты) под селективным давлением РаЬ ΡΝ-8ΙΆ 28. Эксперимент проводили на клетках МЭСК с 90% конфлуэнтностью, выращиваемых в колбах Т25 в МЕМ, дополненной 10% РВ8 (эмбриональная телячья сыворотка). Использовали РаЬ ΡΧ-8ΡΛ 28 и антитело к Е2/ИСУ е509, где последнее использовали в качестве отрицательного контроля (неспецифический контроль), которые разбавляли в 1,5 мл МЕМ, дополненной ТРСК трипсина (2 мкг/мл) с получением конечных концентраций антител 2, 10 и 20 мкг/мл. Получали 100 ТСГО50 Α/ΡΚ/8/34 (номер АТСС УК1469ТМ) в 1,5 мл той же среды. Смешивали два раствора, содержащие РаЬ и вирусы, с получением конечных концентраций РаЬ 1, 5 и 10 мкг/мл в конечном объеме 3 мл. Затем смеси инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Также включали положительный контроль инфекции (вирус без ΡΝ-8ΙΆ28), а также неинфицированные клетки. После двух отмывок стерильным 1Х ΡΒ8 1 мл каждой нейтрализующей смеси добавляли в колбы, содержащие клетки МЭСК, и инфицирование проводили в течение 1 ч при 34°С в присутствии 5% СО2. После абсорбции среду удаляли и монослой дважды отмывали стерильным ΡΒ8. К положительному контролю инфекции и к неинфицированным клеткам добавляли три мл МЕМ, дополненной трипсином (2 мкг/мл). К обработанным ранее инфицированным клеткам добавляли ΡΝ-8ΙΆ28 и е509, поддерживая концентрации, используемые на этапе инфицирования. Клетки инкубировали при 34°С с 5% СО2 и регулярно проверяли в течение 48 ч на присутствие цитопатического действия (СРЕ), сравнивая положительный контроль инфекции с обработанными инфицированными клетками. Затем собирали супернатанты, центрифугировали (2000 оцф в течение 10 мин) и хранили при -80°С. Все исходные растворы вирусов титровали и использовали для инфицирования новых клеточных препаратов с увеличением, где возможно, концентрации РаЬ. После 10 пересевов клетки с положительным контролем инфекции и отрицательным контролем (неспецифический контроль) сравнивали с клетками, инфицированными под селективным давлением ΡΝ-8ΙΆ28. Когда в положительном и отрицательном (неспецифическом) контролях становилось очевидным сильное цитопатическое действие, в обработанных ΡΝ-8ΙΆ28 инфицированных клетках оценивали присутствие или отсутствие СРЕ. Все супернатанты собирали, центрифугировали, хранили и использовали для секвенирования полноразмерной ДНК фрагмента генома 4 вируса гриппа, кодирующего вирус НА (гемагглютинин). - 6 029198 Клонирование и мутагенез НА. Амплифицировали гемагглютинин (НА) Ά/ΡΚ/8/34 (Η1Ν1) с использованием следующих олигонуклеотидов для ПЦР: АРК834 5: 5’-САССАТОААООСАААССТАСТО<}ТССТСТГАТОТО-3’ (ЗЕЦ ГО N0:6); АРК.834_а5: 5’-ТСАСАТОСАТАТТСТССАСТОСАААОАТССАТТАОА-3’ (ЗЕС) ГО N0:7). Продукты ПЦР клонировали в вектор реОХА 3.1Ώ/ν5-Ηΐδ-ΤΘΡΘ (ΙηνΐίΓΟβεη). Затем получали мутанты по гемагглютинину (НА) Η1Ν1 и НА Η3Ν2 с использованием системы для сайт-специфического мутагенеза Оепе ТаПог ЗНе-1)н'ес1ес1 Ми1адепе§1§ Зу§1еш (ΙπνΐίΓΟβεπ). Всего получили двадцать мутантов НА для Η1Ν1 и 4 мутанта НА для Η3Ν2. Анализ связывания РАСЗ. Активность связывания ΡΝ-Β1 ,А28 оценивали с использованием полноразмерных белков НА дикого типа и мутантных полноразмерных белков НА, клонированных, как описано выше. В кратком изложении, клетки почечного эпителия человека (ΗΕΚ) 293Т трансфицировали 4 мкг вектора ρεΏΝΑ 3.11)/\'5Ηΐδ-ΤΘΡΘ, содержащего нуклеотидные последовательности НА. После центрифугирования и фиксации 4% параформальдегидом трансфицированные клетки инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с 1дО ΡΝ-3ΙΑ28 (10 мкг/мл) или с антителами к Η1 или к Н3 (1 мкг/мл) мыши. Затем клетки отмывали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре с конъюгированными с Р1ТС моноклональными антителами к РаЬ человека или мыши. Затем клетки отмывали и анализировали посредством РАСЗ. Также в каждый эксперимент в качестве отрицательного контроля включали нетрансфицированные клетки. Для каждого НА для оценки эффективности трансфекции использовали моноклональные антитела к подтипам Η1 или Н3 мыши, направленные к линейному эпитопу. На клетках проводили анализ РАСЗ, где вычитали сигнал, получаемый от клеток, окрашенных только вторичными антителами. Связывание ΡΝ-3ΙΑ28 с различными мутантами выражали в виде процента связывания в сравнении с диким типом. Программное обеспечение. Для анализа последовательностей использовали следующее программное обеспечение: для визуализации и воспроизведения молекул применяли ЗецЗеаре (АррНеб Β^οδуδίешδ), (ΊιΐδΙαΡΧ (ТоЬу Οώδοη), Βίο Εάΐί (Тот ШИ, №ΐδ ΤЬе^аρеиί^сδ) и Тгее-\те\у (СиЬиЗой). ΚηδΜοΙ (Кодег Зау1е), 1шо1 (1шо1: программа для 30-просмотра химических структур на Заза с открытым кодом, Ьйр://ААА.)шо1.ог§/), Сп31) (ЕпПеП З1а1с^ ХаНопа1 I чЬгагу о!’ МесПсте, ΝΕΜ), сервер 1’ер11оре (ИерВоре: картирование эпитопов из выбранных по аффинности пептидов. Β^ο^ηίο^шаί^сδ 2007 23 (23):3244-3246.), М1шох (ВМС Β^ο^ηίο^шаί^сδ 2006, 7:451 йог 10.1186/1471-2105-7-451). В заключение, для анализа данных и графического редактирования использовали ΟιτψΙιΙΑκΙ Ρ^^δш. Результаты. Характеристика эпитопа гемагглютинина вируса Η1Ν1, распознаваемого моноклональным антителом. Отбор и характеристика мутантов, способных избегать ответа антителами под селективным давлением РаЬ ΡN-3IΑ28. После проведения для клеток многих этапов, описанных в способах, клетки инфицировали вирусом Η1Ν1 дикого типа Α/ΡΚ/8/34, демонстрирующим сильное цитопатическое действие (СРЕ) в отсутствие антитела ΡN-3IΑ28 и в присутствии антитела к Ε2/11С\' е509, используемого в качестве отрицательного контроля. Клетки, инфицированные вирусом дикого типа, не демонстрировали признаков СРЕ в присутствии ΡN-3IΑ28 в концентрации 10 мкг/мл. В отличие от этого клетки, инфицированные отобранным вариантом вируса, демонстрировали сильный СРЕ, несмотря на присутствие ΡN-3IΑ28 в концентрации 10 мкг/мл. Секвенирование полученных вариантов, способных избегать ответа антителами, выявило два различных мутанта, каждый из которых по сравнению с аминокислотной последовательностью вируса дикого типа содержал мутацию по одной аминокислоте в субъединице НА2 области стебля гемагглютинина. Две мутации представляют собой Не361ТЬг и Αδρ362О1у (пронумерованных относительно линейной аминокислотной последовательности НА А/ГК/8/34 (Η1Ν1), номер доступа NСΒI ЕР467821.1, ЗЕС) II) ΝΟ:5 в списке последовательностей). В различных штаммах различных подтипов в положении 361 в природе могут присутствовать изолейцин (I) или валин (V). Как описано позже, мутация Ι361ν не влияет на связывание ΡN-3^Α28 с НА. Природных изолятов с ТЬг в положении 361 или О1у положении 362 не существует. Идентификация области НА, связываемой шАЬ ΡN-3IΑ28. Антитело ΡN-3IΑ28 обладает сильной нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа А. В частности, ЕХ-ЗРЛ28 обладает нейтрализующей активностью в отношении различных подтипов в отношении вирусов подтипов Η1 (такого как Η1Ν1) и Н3 (такого как Η3Ν2), которые принадлежат к группе 1 и группе 2 соответственно. Когда ΡN-3IΑ28 тестировали в анализе ингибирования гемагглютинации, оно не ингибировало индуцированную вирусом кластеризацию эритроцитов. Анализ вестерн-блоттинга продемонстрировал, что ΡN-3IΑ28 распознает только незрелую форму - 7 029198 НА (НАО). В целом, данные, полученные на основе получения избегающих антител мутантов, анализа ингибирования гемагглютинации и анализа вестерн-блоттингом, позволяют предположить, что область, распознаваемая нейтрализующими антителами, расположена не в глобулярной области НА, а в области стебля. На основе этих наблюдений для характеристики эпитопа, распознаваемого ΡΝ-8ΙΑ28, получали молекулы НА, содержащие замены аминокислот, которые могут предотвращать связывание указанного выше антитела. В приведенном ниже описании аминокислотные остатки пронумерованы на основе линейной последовательности НА Α/ΡΚ/8/34 (Η1Ν1), номер доступа ΝΟΒΙ ЕР467821.1, 8ЕР ΙΌ N0:5 в списке последовательностей. Во-первых, авторы изобретения принимали во внимание, что под селективным давлением ΡΝ8ΙΑ28 получали два различных избегающих антител мутантов НА2 Α/ΡΚ/8/34 (Η1Ν1), в одном из которых остаток 11е361 мутировал в ТЬг, а в другом остаток А§р362 мутировал в О1у. ΡΝ-8ΙΑ28 уже не распознает эти два мутанта. На основе этих результатов получали мутанты НА, содержащие аланин в положении 361 (замена Пе361А1а) или аланин/глицин в положении 362 (замена А§р362А1а, А§р362О1у), и посредством анализа ЕАС8 оценивали способность ΡΝ-8ΙΑ28 связывать мутанты. ΡΝ-8ΙΑ28 могло только слабо связываться с мутантными НА (Ие361А1а, А§р362А1а, А§р362О1у), демонстрируя, что эти два остатка включены в эпитоп, распознаваемый этим антителом. Важно отметить, что аминокислотные остатки Пе361 и Α§ρ362 являются высококонсервативными во многих подтипах гемагглютинина (Η1, Н2, Н3, Н4, Н5, Н6, Н7, Н8, Н10, Н14, Н15). Для подробной характеристики эпитопа ΡΝ-8ΙΑ28 НА получали вторую группу мутантов с мутациями, направленными на возможную область, распознаваемую этим Ιμ('.ΐ. Всего получали двадцать содержащих замену на аланин в нескольких положениях аминокислот мутантов, включая Пе361А1а и А§р362А1а, см. табл. 2. Таблица 2 НА2 <table border="1"> <tr><td colspan="5"> НА1</td></tr> <tr><td rowspan="2"> I. II. III. IV. V.</td><td rowspan="2"> Ηϊ§25 (Ηίδ18 Р10 и Ηϊδ45 (Ηϊδ38 Р10 и ТЬг315 (ТНг318) Αδη336 11е337</td><td rowspan="2"> СК.6261) СК.6261)</td><td colspan="2"> I. Тгр357 II. ТНг358</td></tr> <tr><td> III. IV. V.</td><td> О1у359 Ме1360 Ие361 (Уа118 Р10)</td></tr> <tr><td> VI.</td><td> Рго338</td><td> </td><td> VI.</td><td> Азр362 (Азр 19 Р10 и С179)</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> VII.</td><td> О1у363 (О1у20 Р10 и С179)</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> νπι.</td><td> Τϊρ364 (Τιρ21 Р10, СК.6261, С179)</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> IX.</td><td> ТЬг384 (ТЬг41 Р10 и СК6261)</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> X.</td><td> Пе388 (Ие45 Р10 и СК.6261)</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> XI.</td><td> ТЬг392(ТЬг49Р10, СК6261 и С179)</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> хп.</td><td> Уа1395(Уа152Р10,СК6261 и С179)</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> хш.</td><td> Αδη396(Αδη53 Р10 и С179)</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> XIV.</td><td> 01и400 (ОШ57С179)</td></tr> </table> В табл. 2 нумерация основана на линейной последовательности НА Α/ΡΚ/8/34 (Η1Ν1), номер доступа NСΒI ЕЕ467821.1, 8ЕР ΙΌ Ν0:5 в списке последовательностей. В скобках предоставлена нумерация, основанная на исходных публикациях, в которых описаны антитела Е10, СК6261 и С179. Аминокислотные остатки области гемагглютинина, распознаваемой Ι§Ο ΡΝ-8ΙΑ28. Анализ ЕАС8 продемонстрировал, что связывание антитела ΡΝ-8ΙΑ28 снижалось у следующих мутантов: ΗΑ1-Ι, -ΙΙ, -ΙΙΙ и -Ιν; ΗΑ2-ΙΙ, -Ιν, -V, -νΙ, -УП, -УШ, -ΙΧ, -ΧΙ, ΧΙΙ и -ΧΙν (см. табл. 2). Эти результаты означают, что остатки Ηΐ§25, Ηΐ§45, ТЬг315, Α§π336, ТЬг358, Ме!360, Пе361, А§р362, О1у363, Тгр364, ТЬг384, ТЬг392, Уа1395 и 01и400 являются решающими для взаимодействия между ΡΝ-8ΙΑ28 и НА. Таким образом, эти остатки вовлечены в связывание антитела с областью стебля НА. Все другие мутации, указанные в табл. 2, не приводят к уменьшению связывания ΡΝ-8ΕΑ28 с НА. Получали дополнительный мутантный НА по положению НА2-Не361, где исходный остаток заменяли на валин. В пределах одного и того же подтипа природная последовательность в положении 361 может содержать или остаток изолейцина, или остаток валина. Когда тестировали взаимодействие ΡΝ8ΙΑ28 с мутантным по Не361Уа1 НА, уменьшения взаимодействия не наблюдали. Это означает, что антитело ΡΝ-8ΙΑ28 способно связывать оба варианта вируса, и вариант с изолейцином в положении 361, и вариант с валином в том же положении. Это означает, что ΡΝ-8ΕΑ28 способно связывать и нейтрализо- 8 029198 вать штаммы вирусов вне зависимости от того, какой из двух остатков находится в положении 361. Различия между эпитопами, распознаваемыми 1§С ΡΝ-8ΙΑ28 и антителом С179. Моноклональное антитело С179 мыши, описанное на существующем уровне техники, способно связываться с общим эпитопом в области стебля НА, содержащимся в НА подтипов Η1, Н2 и Н5. Связывание антитела С179 с этой областью ингибирует активность слияния НА и, таким образом, приводит к нейтрализации вируса. Эпитоп, распознаваемый С179, состоит из двух различных участков, одного, расположенного в субъединице НА1 и определяемого остатками 318-322, и другого, расположенного в субъединице НА2 и определяемого остатками 47-58. Так как эти два участка располагаются близко друг к другу в центре области стебля молекулы НА, полагают, что С179 распознает эти участки конформационно. С179 больше не распознает и не нейтрализует мутантные вирусы, способные избегать ответа антителами, содержащие НА, несущие одну замену ТЬг на Ьу8 в положении 318 субъединицы НА1 или одну замену Уа1 на С1и в положении 52 субъединицы НА2. Эпитоп, распознаваемый ΡΝ-8ΙΆ28, сравнивали с эпитопом, распознаваемым С179. Результаты анализа РАСУ продемонстрировали, что аминокислоты Ηίδ25, Ηίδ45, ТЬг315, ТЬг358, Мс1360. 11е361, Αδρ362, С1у363, Тгр364, ТЬг384 и Уа1395 (соответствующие мутантам ΗΑ1-Ι, -II и -III; ΗΑ2-ΙΙ, -ГУ, -У, -VI, -УП, -УШ, -IX и -XII, см. табл. 2) являются важными для связывания ΡΝ-8ΡΑ28 с НА. Они не описаны как ключевые остатки для связывания С179 с НА. Кроме того, Αδη336, ТЬг392, Уа1395 и О1и400 (соответствующие мутантам НАШУ; ΗΑ2-ΧΙ, -XII и -XIV) являются ключевыми остатками для взаимодействия НА с ΡΝ-8ΙΑ28, а также для С179. Кроме того, остаток Αδη396 (соответствующий мутанту ΗΑ2-XIII) вовлечен во взаимодействие между С179 и НА, при этом он не вовлечен во взаимодействие между ΡΝ-8ΙΑ28 и НА. В итоге, эпитопы, распознаваемые антителом ΡΝ-8ΙΑ28 и антителом С179, являются различными. Различия между эпитопами, распознаваемыми Ι§0 ΡΝ-8ΙΑ28 и антителом СК6261. Антитело СК6261, описанное в существующем уровне техники, обладает нейтрализующей активностью в отношении вируса гриппа А различных подтипов Η1, Н2, Н5, Н6, Н8 и Н9. Кристаллографические исследования, проводимые для взаимодействия СК6261-А/§ои1Ь Сагойпа/1/1918, продемонстрировали, что антитело распознает высококонсервативную спиральную область, расположенную в стебле, проксимально мембране, в НА1 (остатки 18, 38, 40, 42, 292) и НА2 (остатки 21, 41, 45, 49, 52, 56). Антитело нейтрализует вирус, блокируя конформационную перестановку, ассоциированную со слиянием мембран. Эпитоп, распознаваемый ΡΝ-8ΙΑ28, сравнивали с эпитопом, распознаваемым СК6261. Остатки ТЬг315, ТЬг358, Ме1360, Пе361, Αδρ362, О1у363, Тгр364 и ТЬг384 (соответствующие мутантам ΗΑ1-ΙΙΙ; ΗΑ2-ΙΙ, ТУ, -У, -У!, -УП, -УШ и -IX, см. табл. 2) важны для связывания ΡΝ-8ΤΑ2 8 с НА, но не описаны как ключевые остатки для связывания СК6261 с НА. Остатки Ηίδ25, Ηίδ45 (соответствующие мутантам ΗΑ1-Ι и -II, см. табл. 2), ТЬг392 и Уа1395 (соответствующие мутантам ΗΑ2-XII и -XII, см. табл. 2) являются ключевыми остатками для взаимодействия НА с ΡΝ-8ΤΑ28 и СК6261. Остаток Пе388 (соответствующий мутанту НА2-Х, см. табл. 2) по-видимому, не является важным для связывания ΡΝ-8ΙΑ28 с НА, при этом показано, что этот остаток находится в прямом контакте с антителом СК6261. В итоге, эпитопы, распознаваемые ΡΝ-8ΙΑ28 и СК6261, являются различными. Различия между эпитопами, распознаваемыми Ι§0 ΡΝ-8ΡΑ28 и антителом Р10. Р10, антитело, описанное на существующем уровне техники, представляет собой высокоаффинное нейтрализующее антитело, направленное к гемагглютинину, чрезвычайно эффективное против высокопатогенных подтипов вирусов Η5Ν1 и Η1Ν1. Это антитело ингибирует процесс слияния после связывания при распознавании высококонсервативного эпитопа, расположенного в области стебля гемагглютинина. Определяли кристаллическую структуру Р10 в комплексе с Н5 из штамма Α/У^еίηат/1203/04. Эпитоп, распознаваемый Р10, содержит гидрофобный карман, формируемый пептидом слияния НА2, фланкированным остатками НА1 с одной стороны и аА спиралью НА2 с другой стороны. Область НА1, распознаваемая Р10, содержит остатки 18 и 38, тогда как область НА2 содержит остатки 18-21, 41, 45, 49, 52, 53, 56. Исследования, проводимые с мутантами, продемонстрировали, что остатки Уа152, Αδη53 и Пе56, в участке аА в НА2, осуществляющие важные взаимодействия с Р10, сильно снижают или полностью отменяют связывание антитела. Эпитоп, распознаваемый ΡΝ-8ΙΑ28, сравнивали с эпитопом, распознаваемым Р10. Остатки Ηίδ25, Ηίδ45, Пе361, Αδρ362, О1у363, Тгр364, ТЬг384, ТЬг392 и Уа1395 (соответствующие мутантам НА14 и -II; ΗΑ2-Υ, -ΫΙ, -УП, -УШ, -IX, -XI и XII, см. табл. 2), важные для связывания ΡΝ8ΙΑ28, описаны как ключевые остатки для связывания Р10 с НА. В отличие от этого остатки ТЬг315, Αδη336, ТЬг358, Ме1360 и О1и400 (соответствующие мутантам ΗΑ1-ΙΙΙ, ТУ; ΗΑ2-ΙΙ, ТУ и ΑΙΥ, табл. 2) являются ключевыми остатками для взаимодействия ΡΝ-8ΙΑ28 с НА, но не для Р10. Кроме того, повидимому, Пе388 и Αδη396 (соответствующие мутантам НА2-Х, XIII, см. табл. 2) не являются важными для связывания ΡΝ-8ΙΑ28 с НА, при этом показано, что этот остаток находится в прямом контакте с Р10. В итоге, эпитопы, распознаваемые ΡΝ-8ΙΑ28 и Р10, являются различными. - 9 029198 Различия между Ι§Ο и РаЬ ΡΝ-8ΙΑ28 при связывании с НА. При мутации исходных остатков НА ТНг315, Л§п336, Рго338, ТНг392, О1и400 в остатки аланина 1§О ΡΝ-8ΡΑ28 лишь слабо их распознает. В отличие от этого РаЬ ΡΝ-8ΙΆ28 все еще способен к сильному связыванию с этими мутантами. Авторы настоящего изобретения предположили, что различия в характеристиках связывания может вызывать стерическое препятствие вследствие большего размера 1§О по сравнению с РаЬ-фрагментами. Характеристика эпитопа гемагглютинина вируса Η3Ν2, распознаваемого моноклональным антителом человека ΡΝ-8ΙΑ28. Получали вторую группу мутантов НА на основе НА Η3Ν2 (Α/ΑΐοΡΐ/2/68) для оценки нахождения эпитопа, распознаваемого, ΡΝ-8ΙΑ28 на НА Η1Ν1, также на НА Η3Ν2, см. табл. 3. Таблица 3 НА1 НА2 Ηί§34 (Ηϊδ25 Η1Ν1) ПеЗбЗ (ИеЗб 1 Η1Ν1) Азп54 (Ηϊδ45 Η1Ν1) Азр364 (Азр362 Η1Ν1) Нумерация основана на линейной последовательности НА Η3Ν2, номер доступа ΝΟΒΙ ЕР614251.1, 8Еф ΙΌ ΝΟ:8 в списке последовательностей. Аминокислотные остатки НА Η3Ν2, распознаваемые ΡΝ-8ΡΑ28. Анализ ΕΑΟ8 продемонстрировал, что связывание ΡΝ-8ΙΑ28 с НА Η3Ν2 уменьшалось у мутантов ΗΑ1-Ι и -ΙΙ; ΗΑ2-Ι, -ΙΙ, см. табл. 3. Эти результаты означают, что остатки Ηΐ§34, Α§π54, Йе363 и Α§ρ364 являются ключевыми для взаимодействия между ΡΝ-8ΡΑ28 и НА, таким образом, они являются частью эпитопа, распознаваемого антителом, и расположены в области стебля НА. Исследования с мутантами, проводимые на НА Η3Ν2, подтвердили, что эпитоп, распознаваемый ΡΝ-8ΙΑ28, также находится на гемагглютининах Η1Ν1 и Η3Ν2, несмотря на множество различий аминокислот, найденных в линейных последовательностях двух белков. Остатки, вовлеченные во взаимодействие антитела ΡΝ-8ΙΑ28 с НА, расположены в высококонсервативных областях у большинства подтипов вируса гриппа А. 3. Нейтрализующая активность Ι§Ο ΡΝ-8ΙΑ28 в отношении дополнительных подтипов вируса гриппа А. Нейтрализующая активность, выявленная для антитела Ι§Ο ΡΝ-8ΡΑ28 и области, которую оно распознает, допускает определенные предположения в отношении нейтрализующей активности этого моноклонального антитела также в отношении других подтипов вируса гриппа. В связи с этим полезно вспомнить, что до настоящего времени различают 16 подтипов НА, только три из которых были способными определять зарегистрированные у людей пандемии (Η1, Н2 и Н3), тогда как другие три из них (Н5, Н9 и Н7) у людей выделяли спорадически, но до настоящего времени они не были способны вызывать пандемию (РоисЫег И.Л., Мип§1ег V., А'аПепЛеп Α., е1 а1. СНагас1еп/аиоп о£ а поуе1 тИнеп/а Α У1ги§ Нешадд1ийтп зиЫуре (ΗΙ6) оЫатеб &ош Ь1аск-Неабеб ди11§. 1. νΐΐΌ1. 2005; 79 (5):2814-22). На основе филогенетического расстояния между этими 16 подтипами (от 40 до 60% гомологии), как правило, различают две филогенетических группы: группу 1, к которой принадлежат Η1, Н2, Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н12, Н13 и Н16, и группу 2, к которой принадлежат Н3, Н4, Н7, Н10, Н14 и Н15 (ТатЬеП Р.С., Раис1 Α8. ПтЛиеп/а уасстез £ог 1Не Ранге. Ν. Епд1. 1. Меб. 2010; 363 (21):2036-44; №Ье1 О.Р, Раис1 Α.8. Ыбисйоп о£ нппа1нга1 иптипПу: рго§рес1§ £ог а Ьгоаб1у рго1есруе итуег§а1 тРиеп/а уассте. №1. Меб. 2010; 16(12):1389-91). На фиг. 2 представлено филогенетическое дерево нескольких подтипов гемагглютининов (Н). Группу 1 можно дополнительно разделить на три кластера, т.е. кластер Н1-подобных (Η1, Н2, Н5, Н6), кластер Ш1-подобных (Н11, Н13 и Н16) и кластер Н9-подобных (Н9, Н8 и Н12). Подобным образом, группу 2 можно разделить на другие два кластера: кластер Н3-подобных (Н3, Н4 и Н14) и кластер Н7-подобных (Н7, Н10 и Н15). На основе широкой нейтрализующей активности (также распространяющейся на тестированные изоляты Н3), демонстрируемой Ι§Ο ΡΝ-8ΙΑ-28, и взаимного филогенетического расстояния между различными подтипами, вероятно, его нейтрализующая активность также направлена на изоляты, принадлежащие другим подтипам. В частности, авторы могут полагать, что 1) нейтрализующая активность с крайне высокой вероятностью распространяется на изоляты, принадлежащие всему кластеру Ш-подобных подтипов, т.е. Н2, Н5 и Н6. 2) Нейтрализующая активность с высокой вероятностью распространяется на изоляты, принадлежащие кластеру Н9-подобных подтипов, т.е. Н9, Н8 или Н12. 3) Нейтрализующая активность вероятно распространяется на изоляты, принадлежащие кластеру Η11-подобных подтипов, т.е. Н11, Н13 или Н12. 4) Активность в отношении подтипов, принадлежащих группе 2, предсказать менее легко. В связи с этим авторы могут утверждать, что: a. активность ΡΝ-8ΙΑ28 с крайне высокой вероятностью распространяется на другие изоляты, принадлежащие подтипу Н3, в дополнение к уже рассмотренным. b. Вероятно, что активность ΡΝ-8ΙΑ28 распространяется на изоляты, принадлежащие другим под- 10 029198 типам кластера НЗ-подобных подтипов, т.е. Н4 и Н14. с. Менее вероятно, что активность ΡΝ-8ΓΑ28 распространяется на изоляты, принадлежащие подтипам кластера Н7-подобных подтипов, т.е. Н7, Н10 и Н15. Проводили предварительные эксперименты для подтверждения этих гипотез, для оценки способности 1дО ΡΝ-8ΓΑ28 связывать рекомбинантные белки, принадлежащие подтипам, до настоящего времени выделенным из видов, выявленных у человека. Учитывая, что область, распознаваемая ΡΝ-8ΙΑ28, представляет собой сильнонейтрализуемый эпитоп, это открытие обеспечивает ассоциацию способности связывать определенный подтип с фактической способностью его нейтрализовать. В связи с этим было решено продолжать применение экспериментального подхода, уже ранее используемого авторами настоящего изобретения, который включает синтез искусственных генов, кодирующих полноразмерные гемагглютинины, принадлежащие различным подтипам, и последующую их экспрессию на поверхности клеток, трансфицированных отдельными конструкциями (Випош К., Сапйисс1 Е, Мапс1п1 Ν. е! а1. Мопос1опа1 апййоЛез 1зо1а1ей Ггот йитап В се11з пеийайхе а Ьгоай гапде оГ Н1 зиЫуре тйиепха Α уйизез тс1ийтд зшпе-опдт 1пЙиепха У1гиз (8-О1У). У1го1оду 2010; 399(1):144-52; Бипош К., Сапйисш Е, Мапшт Ν. е! а1. Мо1еси1аг с1оптд оГ !йе йгз£ йитап топос1опа1 апййоЛез пеийайхтд \\'ПЙ Й1дй ро!епсу з\те-опдт тйиепха Α рапйетщ уйиз (8-О1У). \е\у МюгоЫок 2009; 32(4):319-24). Таким образом, последовательности генов, кодирующих НА из изолятов, принадлежащих подтипам, которые, в дополнение к Н1 и Н3, уже поражали людей, выбирали из интерактивных баз данных (й!!р:/У\\\.псйгп1т.шй.доу/'писсоге; йцр:.... орепГ1и.уИа1-И.сй.. Ьгоузе.рйр#гезиИз). Были выбраны следующие изоляты: Α/Αпп Α^йо^/6/60 (Η2Ν2), Α/V^еΐпат/1203/2004 сЫе 1 (Η5Ν1), 1\ΐν Α. сЙ1скеп.. Нопд Копд/О9/97 (Η9Ν2), Α/Νε\ Уогк/107/2003 (Η7Ν2). Затем трансфицированные клетки анализировали посредством иммунофлуоресцентного анализа и ΡΑС8 с ΡΝ-8ΙΑ28, и результаты обобщены в табл. 4. Полученные результаты полностью подтвердили предположения, сделанные на основе филогенетического расстояния между различными подтипами. Таким образом, это позволяет считать, что активность ΡΝ-8ΓΑ28 распространяется, по меньшей мере, на подтипы Η2Ν2, Η5Ν1 и Η9Ν2. Таблица 4. Связывающая способность ΡΝ-8ΙΑ28 в отношении клеток, трансфицированных гемагглютининами, принадлежащими различным подтипам <table border="1"> <tr><td> Филогенетический кластер</td><td> Подтип НА</td><td> Изолят</td><td> ΙΓ</td><td> ГАС8</td></tr> <tr><td rowspan="2"> Н1-подобные</td><td> Н2</td><td> А/Апп Αγ6ογ/6/60/(Η2Ν2)</td><td> +</td><td> +</td></tr> <tr><td> Н5</td><td> АЛАе1пат/1203/2004 с1а<1е 1 (Η5Ν1)</td><td> +</td><td> +</td></tr> <tr><td> НЭ-подобные</td><td> Н9</td><td> А/сЫскеп/Нопд К.оид/09/97 (Η9Ν2)</td><td> +</td><td> +</td></tr> <tr><td> Н7-подобные</td><td> Н7</td><td> Α/Νε\ν Уогк/107/2003 (Η7Ν2)</td><td> -</td><td> -</td></tr> </table> - 11 029198Список последовательностей <110> ΡΟΜΟΝΑ ΚΙСЕКСА ЗКЬ <120> ПОЛНОРАЗМЕРНЫЕ ИММУНОГЛОБУЛИНЫ ИЗОТИПА 100, СПОСОБНЫЕ К РАСПОЗНАВАНИЮ НЕЙТРАЛИЗУЮЩЕГО ЭПИТОПА В ОБЛАСТИ СТЕБЛЯ ГЕМАГГЛЮТИНИНА РАЗЛИЧНЫХ ПОДТИПОВ И ИХ ИСП0ЛВ30ВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ПРОТИВ ГРИППА <130> РС1042ЕС <160> 8 <170> РаЛепНп νβΓβίοη 3.3 <210> 1 <211> 122 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 1 Ьеи С1и С1и Зег С1у С1у С1у Уа1 Уа1 С1п Рго С1у Агд Зег Ьеи Агд 10 15 Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у РНе Рго РНе Зег Зег Туг С1у Мер Н±з 20 25 30 Тгр Уа1 Агд С1п А1а Рго С1у Ьуз С1у Ьеи С1и Тгр Уа1 А1а С1у Уа1 35 40 45 Зег Туг Азр С1у Зег Туг Ьуз Туг Туг А1а Азр Зег Уа1 Ьуз С1у Агд 50 55 60 РНе ТНг Не Зег Агд Азр Зег Зег Ьуз Зег ТНг Ьеи Туг Ьеи С1п Мер 65 70 75 80 Азп Зег Ьеи Агд Рго С1и Азр ТНг А1а Уа1 Туг Туг Суз А1а Агд Рго 85 90 95 Зег А1а 11е РНе С1у 11е Туг 11е 11е Ьеи Азп С1у Ьеи Азр Уа1 Тгр 100 105 110 О1у С1п С1у ТНг ТНг Уа1 ТНг Уа1 Зег Зег 115 120 <210> 2 <211> 105 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 2 О1и Ьеи ТНг С1п Зег Рго Зег Зег Уа1 Зег А1а Зег Уа1 С1у Азр Агд 15 10 15 - 12 029198 Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Агд А1а ТЬг С1п С1у Ые Зег Зег Тгр Ьеи А1а 20 25 30 Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у Ьуз Рго Рго Ьуз Ьеи Ьеи Ые РЬе С1у 35 40 45 А1а Зег Зег Ьеи С1п Зег С1у Уа1 Рго Зег Агд РЬе Зег С1у Зег С1у 50 55 60 Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Зег Ьеи С1п Рго С1и Азр 65 70 75 80 РЬе А1а ТЬг Туг РЬе Суз С1п С1п А1а Низ Зег РЬе Рго Ьеи ТЬг РЬе 85 90 95 С1у С1у С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Ые Ьуз 100 105 <table border="1"> <tr><td> <210> 3 <211> 366 <212> ДНК <213> Нотс</td><td> ι зариепз</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> <400> 3 сЬсдаддадЬ</td><td> сЬдддддадд</td><td> сдЬддЬссад</td><td> ссЬдддаддЬ</td><td> сссЬдадасЬ</td><td> сЬссЬдЬдса</td><td> 60</td></tr> <tr><td> дссЬсЬддаЬ</td><td> ЬссссЬЬсад</td><td> ЬадЬЬаЬддс</td><td> аЬдсасЬддд</td><td> Ьссдссаддс</td><td> Ьссаддсаад</td><td> 120</td></tr> <tr><td> дддсЬддадЬ</td><td> дддЬддсадд</td><td> ЬдЬЬЬсаЬаЬ</td><td> даЬддаадЬЬ</td><td> аЬаааЬасЬа</td><td> ЬдсддасЬсс</td><td> 180</td></tr> <tr><td> дЬсаадддсс</td><td> даЬЬсассаЬ</td><td> сЬссададас</td><td> адЬЬссаада</td><td> дсасЬсЬаЬа</td><td> ЬсЬдсаааЬд</td><td> 240</td></tr> <tr><td> аасадссЬда</td><td> дассЬдадда</td><td> сасддсЬдЬд</td><td> ЬаЬЬасЬдЬд</td><td> сдадассЬЬс</td><td> сдсдаЬЬЬЬЬ</td><td> 300</td></tr> <tr><td> ддааЬаЬаса</td><td> ЬЬаЬЬсЬааа</td><td> сддЬЬЬддас</td><td> дЬсЬддддсс</td><td> аадддассас</td><td> ддЬсассдЬс</td><td> 360</td></tr> <tr><td> ЬсЬЬса</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 366</td></tr> <tr><td> <210> 4 <211> 315 <212> ДНК <213> Нотс</td><td> ι зариепз</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> <400> 4 дадсЬсасдс</td><td> адЬсЬссаЬс</td><td> ЬЬссдЬдЬсЬ</td><td> дсаЬсЬдЬад</td><td> дадасададЬ</td><td> сасЬаЬсасЬ</td><td> 60</td></tr> <tr><td> ЬдЬсдддсда</td><td> сЬсадддЬаЬ</td><td> ЬадЬадЬЬдд</td><td> ЬЬадссЬддЬ</td><td> аЬсадсадаа</td><td> ассадддааа</td><td> 120</td></tr> <tr><td> ссассЬааас</td><td> ЬссЬдаЬЬЬЬ</td><td> ЬддЬдсаЬсЬ</td><td> адЬЬЬдсааа</td><td> дЬддддЬссс</td><td> аЬсааддЬЬс</td><td> 180</td></tr> <tr><td> адсддсадЬд</td><td> даЬсЬдддас</td><td> адаЬЬЬсасЬ</td><td> сЬсассаЬса</td><td> дсадЬсЬаса</td><td> дссЬдаадаЬ</td><td> 240</td></tr> <tr><td> ЬЬЬдсаасЬЬ</td><td> асЬЬЬЬдЬса</td><td> асаддсЬсас</td><td> адЬЬЬсссдс</td><td> ЬсасЬЬЬсдд</td><td> сддсдддасс</td><td> 300</td></tr> <tr><td> ааддЬддада</td><td> Ьсааа</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 315</td></tr> </table> <210> 5 - 13 029198 <table border="1"> <tr><td colspan="2" rowspan="3"> <211> <212> <213> <400></td><td colspan="10"> 565 БЕЛОК</td><td rowspan="4"> А1а</td><td rowspan="4"> А1а</td><td rowspan="4"> А1а 15</td><td rowspan="4"> Азр</td></tr> <tr><td colspan="7"> Вирус гриппа Α (Η1Ν1)</td><td rowspan="3"> Суз 10</td><td rowspan="3"> А1а</td><td rowspan="3"> Ьеи</td></tr> <tr><td colspan="4"> 5</td><td rowspan="2"> Уа1</td><td rowspan="2"> Ьеи</td><td rowspan="2"> Ьеи</td></tr> <tr><td> МеЬ 1</td><td> Ьуз</td><td> А1а</td><td> Азп</td><td> Ьеи 5</td><td> Ьеи</td></tr> <tr><td> А1а</td><td> Азр</td><td> ТЬг</td><td> 11е 20</td><td> Суз</td><td> Ые</td><td> С1у</td><td> Туг</td><td> Шз 25</td><td> А1а</td><td> Азп</td><td> Азп</td><td> Зег</td><td> ТЬг 30</td><td> Азр</td><td> ТЬг</td></tr> <tr><td> Уа1</td><td> Азр</td><td> ТЬг 35</td><td> Уа1</td><td> Ьеи</td><td> С1и</td><td> Ьуз</td><td> Азп 40</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Шз 45</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> Азп</td></tr> <tr><td> Ьеи</td><td> Ьеи 50</td><td> С1и</td><td> Азр</td><td> Зег</td><td> Шз</td><td> Азп 55</td><td> С1у</td><td> Ьуз</td><td> Ьеи</td><td> Суз</td><td> Агд 60</td><td> Ьеи</td><td> Ьуз</td><td> С1у</td><td> Ые</td></tr> <tr><td> А1а 65</td><td> Рго</td><td> Ьеи</td><td> С1 п</td><td> Ьеи</td><td> С1у 70</td><td> Ьуз</td><td> Суз</td><td> Азп</td><td> Ые</td><td> А1а 75</td><td> С1у</td><td> Тгр</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи</td><td> С1у 80</td></tr> <tr><td> Азп</td><td> Рго</td><td> С1и</td><td> Суз</td><td> Азр 85</td><td> Рго</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи</td><td> Рго</td><td> Уа1 90</td><td> Агд</td><td> Зег</td><td> Тгр</td><td> Зег</td><td> Туг 95</td><td> Ые</td></tr> <tr><td> Уа1</td><td> С1и</td><td> ТЬг</td><td> Рго 100</td><td> Азп</td><td> Зег</td><td> С1и</td><td> Азп</td><td> С1у 105</td><td> Ые</td><td> Суз</td><td> Туг</td><td> Рго</td><td> С1у 110</td><td> Азр</td><td> РЬе</td></tr> <tr><td> Ые</td><td> Азр</td><td> Туг 115</td><td> С1и</td><td> С1и</td><td> Ьеи</td><td> Агд</td><td> С1и 120</td><td> С1п</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Уа1 125</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> РЬе</td></tr> <tr><td> С1и</td><td> Агд 130</td><td> РЬе</td><td> С1и</td><td> Ые</td><td> РЬе</td><td> Рго 135</td><td> Ьуз</td><td> С1и</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Тгр 140</td><td> Рго</td><td> Азп</td><td> Шз</td><td> Азп</td></tr> <tr><td> ТЬг 145</td><td> Азп</td><td> С1у</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> А1а 150</td><td> А1а</td><td> Суз</td><td> Зег</td><td> Шз</td><td> С1и 155</td><td> С1у</td><td> Ьуз</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> РЬе 160</td></tr> <tr><td> Туг</td><td> Агд</td><td> Азп</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи 165</td><td> Тгр</td><td> Ьеи</td><td> ТЬг</td><td> С1и</td><td> Ьуз 170</td><td> С1и</td><td> С1у</td><td> Зег</td><td> Туг</td><td> Рго 175</td><td> Ьуз</td></tr> <tr><td> Ьеи</td><td> Ьуз</td><td> Азп</td><td> Зег 180</td><td> Туг</td><td> Уа1</td><td> Азп</td><td> Ьуз</td><td> Ьуз 185</td><td> С1у</td><td> Ьуз</td><td> С1и</td><td> Уа1</td><td> Ьеи 190</td><td> Уа1</td><td> Ьеи</td></tr> <tr><td> Тгр</td><td> С1у</td><td> Не 195</td><td> Шз</td><td> Шз</td><td> Рго</td><td> Рго</td><td> Азп 200</td><td> Зег</td><td> Ьуз</td><td> С1и</td><td> С1п</td><td> С1п 205</td><td> Азп</td><td> Ьеи</td><td> Туг</td></tr> <tr><td> С1п</td><td> Азп 210</td><td> С1и</td><td> Азп</td><td> А1а</td><td> Туг</td><td> Уа1 215</td><td> Зег</td><td> Уа1</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Зег 220</td><td> Азп</td><td> Туг</td><td> Азп</td><td> Агд</td></tr> <tr><td> Агд 225</td><td> РЬе</td><td> ТЬг</td><td> Рго</td><td> С1и</td><td> Ые 230</td><td> А1а</td><td> С1и</td><td> Агд</td><td> Рго</td><td> Ьуз 235</td><td> Уа1</td><td> Агд</td><td> Азр</td><td> С1п</td><td> А1а 240</td></tr> </table> - 14 029198 С1у Агд МеЬ Азп Туг Туг Тгр ТЬг Ьеи Ьеи Ьуз Рго С1у Азр ТЬг Не 245 250 255 11е РЬе С1и А1а Азп С1у Азп Ьеи Не А1а Рго МеЬ Туг А1а РЬе А1а 260 265 270 Ьеи Зег Агд С1у РЬе С1у Зег С1у Не Не ТЬг Зег Азп А1а Зег МеЬ 275 280 285 Шз С1и Суз Азп ТЬг Ьуз Суз С1п ТЬг Рго Ьеи С1у А1а Не Азп Зег 290 295 300 Зег Ьеи Рго Туг С1п Азп 11е Нтз Рго Уа1 ТЬг 11е С1у С1и Суз Рго 305 310 315 320 Ьуз Туг Уа1 Агд Зег А1а Ьуз Ьеи Агд МеЬ Уа1 ТЬг С1у Ьеи Агд Азп 325 330 335 Азп Рго Зег Не С1п Зег Агд С1у Ьеи РЬе С1у А1а Не А1а С1у РЬе 340 345 350 Не С1и С1у С1у Тгр ТЬг С1у МеЬ Не Азр С1у Тгр Туг С1у Туг Нпз 355 360 365 Шз С1п Азп С1и С1п С1у Зег С1у Туг А1а А1а Азр С1п Ьуз Зег ТЬг 370 375 380 С1п Азп А1а Не Азп С1у Не ТЬг Азп Ьуз Уа1 Азп ТЬг Уа1 Не С1и 385 390 395 400 Ьуз МеЬ Азп Не С1п РЬе ТЬг А1а Уа1 С1у Ьуз С1и РЬе Азп Ьуз Ьеи 405 410 415 С1и Ьуз Агд МеЬ С1и Азп Ьеи Азп Ьуз Ьуз Уа1 Азр Азр С1у РЬе Ьеи 420 425 430 Азр Не Тгр ТЬг Туг Азп А1а С1и Ьеи Ьеи Уа1 Ьеи Ьеи С1и Азп С1и 435 440 445 Агд ТЬг Ьеи Азр РЬе Шз Азр Зег Азп Уа1 Ьуз Азп Ьеи Туг С1и Ьуз 450 455 460 Уа1 Ьуз Зег С1п Ьеи Ьуз Азп Азп А1а Ьуз С1и Не С1у Азп С1у Суз 465 470 475 480 РЬе С1и РЬе Туг Шз Ьуз Суз Азр Азп С1и Суз МеЬ С1и 485 490 Зег Уа1 Агд 495 - 15 029198 <table border="1"> <tr><td> Азп</td><td> С1у</td><td> ТЬг</td><td> Туг 500</td><td> Азр</td><td> Туг</td><td> Рго</td><td> Ьуз</td><td> Туг 505</td><td> Зег</td><td> С1и</td><td> С1и</td><td> Зег</td><td> Ьуз 510</td><td> Ьеи</td><td> Азп</td></tr> <tr><td> Агд</td><td> С1и</td><td> Ьуз 515</td><td> Уа1</td><td> Азр</td><td> С1у</td><td> Уа1</td><td> Ьуз 520</td><td> Ьеи</td><td> С1и</td><td> Зег</td><td> МеЬ</td><td> С1у 525</td><td> 11е</td><td> Туг</td><td> С1п</td></tr> <tr><td> Не</td><td> Ьеи 530</td><td> А1а</td><td> 11е</td><td> Туг</td><td> Зег</td><td> ТЬг 535</td><td> Уа1</td><td> А1а</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Ьеи 540</td><td> Уа1</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи</td><td> Уа1</td></tr> <tr><td> Зег 545</td><td> Ьеи</td><td> С1у</td><td> А1а</td><td> 11е</td><td> Зег 550</td><td> РЬе</td><td> Тгр</td><td> МеЬ</td><td> Суз</td><td> Зег 555</td><td> Азп</td><td> СТу</td><td> Зег</td><td> Ьеи</td><td> С1п 560</td></tr> <tr><td> Суз</td><td> Агд</td><td> 11е</td><td> Суз</td><td> 11е 565</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> </table> <210> 6 <211> 35 <212> ДНК <213> искусственная <220> <223> праймер для ПЦР <400> 6 сассаЬдаад дсааассЬас 'Ьдд'Ьсс'Ьд'Ь'Ь аЬдЬд 35 <210> 7 <211> 36 <212> ДНК <213> искусственная <220> <223> праймер для ПЦР <400> 7 ЬсадаЬдсаЬ аЬЬсЬдсасЬ дсааадаЬсс аЬЬада 36 <210> 8 <211> 566 <212> БЕЛОК <213> Вирус гриппа Α (Η3Ν2) <400> 8 <table border="1"> <tr><td> МеЬ 1</td><td> Ьуз</td><td> ТЬг</td><td> 11е</td><td> 11е 5</td><td> А1а</td><td> Ьеи</td><td> Зег</td><td> Туг</td><td> 11е 10</td><td> РЬе</td><td> Суз</td><td> Ьеи</td><td> А1а</td><td> Ьеи 15</td><td> С1у</td></tr> <tr><td> С1п</td><td> Азр</td><td> Ьеи</td><td> Рго 20</td><td> С1у</td><td> Азп</td><td> Азр</td><td> Азп</td><td> Зег 25</td><td> ТЬг</td><td> А1а</td><td> ТЬг</td><td> Ьеи</td><td> Суз 30</td><td> Ьеи</td><td> С1у</td></tr> <tr><td> Нтз</td><td> Нтз</td><td> А1а 35</td><td> Уа1</td><td> Рго</td><td> Азп</td><td> С1у</td><td> ТЬг 40</td><td> Ьеи</td><td> Уа1</td><td> Ьуз</td><td> ТЬг</td><td> 11е 45</td><td> ТЬг</td><td> Азр</td><td> Азр</td></tr> <tr><td> С1п</td><td> 11е 50</td><td> С1и</td><td> Уа1</td><td> ТЬг</td><td> Азп</td><td> А1а 55</td><td> ТЬг</td><td> С1и</td><td> Ьеи</td><td> Уа1</td><td> С1п 60</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> Зег</td><td> ТЬг</td></tr> </table> - 16 029198 - 17 029198 <table border="1"> <tr><td> Суз</td><td> Рго</td><td> Ьуз</td><td> Туг</td><td> Уа1 325</td><td> Ьуз</td><td> С1п</td><td> Азп</td><td> ТЬг</td><td> Ьеи 330</td><td> Ьуз</td><td> Ьеи</td><td> А1а</td><td> ТЬг</td><td> С1у 335</td><td> МеЬ</td></tr> <tr><td> Агд</td><td> Азп</td><td> Уа1</td><td> Рго</td><td> С1и</td><td> Ьуз</td><td> С1п</td><td> ТЬг</td><td> Агд</td><td> С1у</td><td> Ьеи</td><td> РЬе</td><td> С1у</td><td> А1а</td><td> Ые</td><td> А1а</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 340</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 345</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 350</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> С1у</td><td> РЬе</td><td> Ые</td><td> С1и</td><td> Азп</td><td> С1у</td><td> Тгр</td><td> С1и</td><td> С1у</td><td> МеЬ</td><td> Ые</td><td> Азр</td><td> С1у</td><td> Тгр</td><td> Туг</td><td> С1у</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 355</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 360</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 365</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> РЬе</td><td> Агд</td><td> Ηΐ3</td><td> С1п</td><td> Азп</td><td> Зег</td><td> С1и</td><td> С1у</td><td> ТЬг</td><td> С1у</td><td> С1п</td><td> А1а</td><td> А1а</td><td> Азр</td><td> Ьеи</td><td> Ьуз</td></tr> <tr><td> </td><td> 370</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 375</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 380</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Зег</td><td> ТЬг</td><td> С1п</td><td> А1а</td><td> А1а</td><td> Ые</td><td> Азр</td><td> С1п</td><td> Ые</td><td> Азп</td><td> С1у</td><td> Ьуз</td><td> Ьеи</td><td> Азп</td><td> Агд</td><td> Уа1</td></tr> <tr><td> 385</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 390</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 395</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 400</td></tr> <tr><td> Не</td><td> С1и</td><td> Ьуз</td><td> ТЬг</td><td> Азп</td><td> С1и</td><td> Ьуз</td><td> РЬе</td><td> Низ</td><td> С1п</td><td> Ые</td><td> С1и</td><td> Ьуз</td><td> С1и</td><td> РЬе</td><td> Зег</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 405</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 410</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 415</td><td> </td></tr> <tr><td> С1и</td><td> Уа1</td><td> С1и</td><td> С1у</td><td> Агд</td><td> Ые</td><td> С1п</td><td> Азр</td><td> Ьеи</td><td> С1и</td><td> Ьуз</td><td> Туг</td><td> Уа1</td><td> С1и</td><td> Азр</td><td> ТЬг</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 420</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 425</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 430</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Ьуз</td><td> 11е</td><td> Азр</td><td> Ьеи</td><td> Тгр</td><td> Зег</td><td> Туг</td><td> Азп</td><td> А1а</td><td> С1и</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи</td><td> Уа1</td><td> А1а</td><td> Ьеи</td><td> С1и</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 435</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 440</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 445</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Азп</td><td> С1п</td><td> Ηΐ3</td><td> ТЬг</td><td> Ые</td><td> Азр</td><td> Ьеи</td><td> ТЬг</td><td> Азр</td><td> Зег</td><td> С1и</td><td> МеЬ</td><td> Азп</td><td> Ьуз</td><td> Ьеи</td><td> РЬе</td></tr> <tr><td> </td><td> 450</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 455</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 460</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> С1и</td><td> Ьуз</td><td> ТЬг</td><td> Агд</td><td> Агд</td><td> С1п</td><td> Ьеи</td><td> Агд</td><td> С1и</td><td> Азп</td><td> А1а</td><td> С1и</td><td> Азр</td><td> МеЬ</td><td> С1у</td><td> Азп</td></tr> <tr><td> 465</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 470</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 475</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 480</td></tr> <tr><td> С1у</td><td> Суз</td><td> РЬе</td><td> Ьуз</td><td> Ые</td><td> Туг</td><td> Низ</td><td> Ьуз</td><td> Суз</td><td> Азр</td><td> Азп</td><td> А1а</td><td> Суз</td><td> Ые</td><td> С1и</td><td> Зег</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 485</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 490</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 495</td><td> </td></tr> <tr><td> Ые</td><td> Агд</td><td> Азп</td><td> С1у</td><td> ТЬг</td><td> Туг</td><td> Азр</td><td> Низ</td><td> Азр</td><td> Уа1</td><td> Туг</td><td> Агд</td><td> Азр</td><td> С1и</td><td> А1а</td><td> Ьеи</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> 500</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 505</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 510</td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Азп</td><td> Азп</td><td> Агд</td><td> РЬе</td><td> С1п</td><td> Ые</td><td> Ьуз</td><td> С1у</td><td> Уа1</td><td> С1и</td><td> Ьеи</td><td> Ьуз</td><td> Зег</td><td> С1у</td><td> Туг</td><td> Ьуз</td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> 515</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 520</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 525</td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Азр</td><td> Тгр</td><td> 11е</td><td> Ьеи</td><td> Тгр</td><td> Ые</td><td> Зег</td><td> РЬе</td><td> А1а</td><td> Ые</td><td> Зег</td><td> Суз</td><td> РЬе</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи</td><td> Суз</td></tr> <tr><td> </td><td> 530</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 535</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 540</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> Уа1</td><td> Уа1</td><td> Ьеи</td><td> Ьеи</td><td> С1у</td><td> РЬе</td><td> Ые</td><td> МеЬ</td><td> Тгр</td><td> А1а</td><td> Суз</td><td> С1п</td><td> Агд</td><td> СТу</td><td> Азп</td><td> Ые</td></tr> <tr><td> 545</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 550</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 555</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 560</td></tr> <tr><td> Агд</td><td> Суз</td><td> Азп</td><td> Ые</td><td> Суз</td><td> Ые</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> 565</td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> <tr><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td> </td><td colspan="8">

Claims

<claim-text>ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ</claim-text></td><td> </td><td> </td><td> </td></tr> </table> <claim-text>1. Моноклональное антитело человека, специфически направленное к антигену гемагглютинина вируса гриппа А и способное связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих по меньшей мере подтип Н1 и подтип Н3, характеризующееся тем, что оно представляет собой полноразмерный 1уО. содержащий вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8КО II) N0:1, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность 8КО ГО N0:2, и который распознает консервативный эпитоп, расположенный в области стебля гемагглютинина, где указанный эпитоп включает аминокислотные остатки Ηΐδ25, Ηΐδ45, ТЬт315 и Άδη336 субъединицы гемагглютинина НА1 и аминокислотные остатки ТЬт358, Ме1360, 11е361 или Уа1361, Αδρ362, О1у363, Тгр364, УЬт384, ТЬт392, Уа1395 и С1и400 субъединицы гемагглютинина НА2, где нумерация указанных аминокислотных остатков основана на Η1Ν1 аминокислотной последовательности гемагглютинина, обозначенной как 8КС) ГО N0:5.</claim-text>
2. Моноклональное антитело человека по п.1, способное связывать и нейтрализовать множество

- 18 029198

подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3 и подтип Н5.
3. Моноклональное антитело человека по п.1, способное связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3 и подтип Н2.
4. Моноклональное антитело человека по п.1, способное связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3 и подтип Н9.
5. Моноклональное антитело человека по п.1, способное связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3, подтип Н5 и подтип Н2.
6. Моноклональное антитело человека по п.1, способное связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3, подтип Н5 и подтип Н9.
7. Моноклональное антитело человека по п.1, способное связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3, подтип Н2 и подтип Н9.
8. Моноклональное антитело человека по п.1, способное связывать и нейтрализовать множество подтипов вируса гриппа А, включающих, по меньшей мере, подтип Н1, подтип Н3, подтип Н5, подтип Н2 и подтип Н9.
9. Моноклональное антитело человека по любому из пп.1-8, где вариабельная область тяжелой цепи кодирована последовательностью нуклеиновой кислоты δΕ^ ГО ΝΟ:3, а вариабельная область легкой цепи кодирована последовательностью нуклеиновой кислоты δΕ^ ГО ΝΟ:4.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного антитела по любому из пп.1-9 и фармацевтически приемлемый носитель и/или разбавитель.
11. Применение моноклонального антитела человека по любому из пп.1-9 в качестве терапевтического или профилактического лекарственного средства против патологии, которая прямо или опосредованно вызвана инфекцией вирусом гриппа А.
12. Применение моноклонального антитела человека по п.11, где патология, вызываемая инфекцией вируса гриппа А, представляет собой симптом гриппа.
13. Способ детекции или количественного определения в биологическом образце, полученном у пациента, присутствия антител к вирусу гриппа с перекрестной нейтрализующей активностью в отношении различных подтипов, включающий этап приведения указанного биологического образца в контакт с антителом по любому из пп.1-9 в качестве специфичного реагента для анализа.
14. Диагностический набор, содержащий в качестве специфического реагента антитело по любому из пп.1-9, где указанный набор, в частности, предназначен для применения в способе детекции или количественного определения в биологическом образце, полученном у пациента, антител к вирусу гриппа А, с перекрестной нейтрализующей активностью в отношении различных подтипов.
15. Способ детекции или количественного определения в иммуногенной или вакцинной композиции наличия эпитопов вируса гриппа А, способных индуцировать у индивидуума, которому ее вводят, антитела к вирусу гриппа А с перекрестной нейтрализующей активностью в отношении различных подтипов вируса гриппа А, включающий этап приведения указанной композиции в контакт с антителом по любому из пп.1-9, в качестве специфичного реагента для анализа.
16. Мимеотоп, специфически направленный к идиотипу антитела по любому из пп.1-9, полученный с помощью моноклонального антитела человека по любому из пп.1-9.

- 19 029198