ES2926511T3 - Anticuerpos anti-CLEVER-1 humanizados y utilización de los mismos - Google Patents

Abstract

Esta invención se refiere a un agente y un anticuerpo humanizado o fragmento Fv o Fab de cadena sencilla capaz de unirse a CLEVER-1 humano que reconoce un epítopo de CLEVER-1, en el que el epítopo es discontinuo y comprende las secuencias: PFTVLVPSVSSFSSR y QEITVTFNQFTK. Esta invención también se refiere a un agente capaz de unirse a un epítopo de CLEVER-1 humano para su uso en la eliminación de inmunosupresión inducida por antígeno o tumor. Además, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el agente capaz de unirse a CLEVER-1 humano y un excipiente apropiado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-CLEVER-1 humanizados y utilización de los mismos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-CLEVER-1 humanizados y a la utilización de los mismos

Antecedentes de la invención

CLEVER-1 es una proteína dada a conocer en el documento n° WO 03/057130, Common Lymphatic Endothelial and Vascular Endothelial Receptor-1. Es una proteína de unión que media en la adhesión de los linfocitos al endotelio tanto en la vasculatura sistémica como en los vasos linfáticos. Mediante el bloqueo de la interacción de CLEVER-1 y su sustrato linfocito, resulta posible controlar simultáneamente la recirculación de los linfocitos y la migración de los linfocitos, y condiciones relacionadas, tales como la inflamación, en el sitio de flujo de entrada de los linfocitos en los tejidos, y de flujo de salida de los mismos. El documento n° WO 03/057130 da a conocer, además, que CLEVER-1 media en la unión de otros tipos de leucocitos, tales como monocitos y granulocitos, a vasos de tipo HEV. De esta manera, mediante el bloqueo de la interacción de CLEVER-1 y las células tumorales malignas, se ha hecho posible controlar la metástasis mediante el bloqueo de la incorporación por los vasos linfáticos de las células malignas que se unen a CLEVER-1, y de esta manera, evitar la extensión de la neoplasia maligna hacia el interior de los ganglios linfáticos.

CLEVER-1, es decir, la estabilina-1, ha sido revisada por Kzhyshkowska J. (2010), TheScientificWorldJOURNAL 10, 2039-2053. La supresión de los linfocitos Th1 por CLEVER-1 ha sido dada a conocer recientemente por Palani et al. (2016), Journal of Immunology 196: 115-123, 1995.

El documento n° WO 2010/122217 da a conocer un subtipo de macrófagos en los tumores, en la placenta y en la sangre de las mujeres embarazadas. El subtipo de macrófagos se define como un macrófago positivo para CLEVER-1 y que se ha propuesto como macrófago de tipo 3. Mediante la modulación, es decir, contrarrestando o estimulando, respectivamente, el receptor de CLEVER-1 en dicha célula, puede influirse sobre el sistema inmunitario de un individuo. El contrarrestado o regulación negativa del receptor reduce el tamaño del tumor maligno y/o el crecimiento del tumor maligno. La estimulación o regulación positiva del receptor resulta útil en la generación de tolerancia fetomaternal y para la prevención de las complicaciones del embarazo.

Los mecanismos de los macrófagos asociados a tumores (MAT) también se da a conocer en la publicación de Noy R. y Pollard J. W., "Tumour-Associated Macrophages: From Mechanisms to Therapy", publicado en Immunity 41, 17 de julio de 2014, páginas 49 a 61. Los macrófagos M2 predominan en los cánceres humanos y estimulan el crecimiento tumoral, aunque estos macrófagos promotores de tumor pueden modularse en macrófagos inhibidores del crecimiento de tumores, también denominados macrófagos M1 o macrófagos proinflamatorios, con el objetivo de retrasar o detener el crecimiento del cáncer. Sin embargo, se ha observado que los intentos para tratar los cánceres con los terapéuticos actualmente disponibles dirigidos a dianas MAT se ven acompañados de efectos secundarios no deseados, p. ej., los enfoques terapéuticos de macrófagos pueden presentar toxicidad sistémica o, paradójicamente, estimular el crecimiento tumoral, ya que presentan como diana todos los macrófagos.

Los anticuerpos monoclonales antagonistas de CLEVER-1 particularmente preferentes 3-266 (DSM n° ACC2519) y 3.372 (DSM n° ACC2520) han sido depositados ambos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del Procedimiento en materia de Patentes el 21 de agosto de 2001, en el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, y se dan a conocer en el documento n° WO 03/057130.

En la publicación de Palani S., "CLEVER-1 as an immune suppressive molecule", University of Turku, 18 de marzo de 2016, se estudia la expresión y funciones de CLEVER-1 sobre las poblaciones de monocitos y macrófagos.

Objetivo y descripción resumida de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado capaz de unirse a un epítopo específico de CLEVER-1 humano. Especialmente, se ha encontrado que un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse a un epítopo específico de CLEVER-1 humano puede utilizarse para activar los macrófagos para cambiar su fenotipo de macrófagos M2 a macrófagos M1.

Además, un objetivo de la invención es proporcionar un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab humanizado para la unión a CLEVER-1 humano con una actividad de unión incrementada en comparación con el anticuerpo monoclonal 3-372 (DSM n° ACC2520 depositado en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 21 de agosto de 2001).

La invención proporciona un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab capaz de unirse a un epítopo del receptor endotelial vascular y endotelial linfático común humano (CLEVER-1), en el que un anticuerpo o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab comprende

a) regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera kappa de IgG4 humana, y

b) la combinación de las regiones variables de cadenas pesada y ligera de IgG humana seleccionadas del grupo que consiste en las combinaciones siguientes: SEC ID n° 14 y SEC ID n° 22, SEC ID n° 16 y SEC ID n° 22, ^s E^c ID n° 16 y SEC ID n° 24, SEC ID n° 16 y SEC ID n° 26, SEC ID n° 16 y SEC ID n° 28, SEC ID n° 16 y SEC ID n° 30, SEC ID n° 18 y SEC ID n° 22, SEC ID n° 18 y SEC ID n° 24, SEC ID n° 18 y SEC ID n° 28, SEC ID n° 18 y SEC ID n° 30, SEC ID n° 20 y SEC ID n° 24 y SEC ID n° 20 y SEC ID n° 30.

Otro objetivo de la presente invención es proporcionar, además, una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento Fv de cadena sencilla o Fab según la invención y un excipiente apropiado.

La presente invención proporciona, además, una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento Fv de cadena sencilla o Fab tal como se ha definido anteriormente y un excipiente apropiado para la utilización en la eliminación de la inmunosupresión tumoral o inducida por antígenos.

Una composición farmacéutica según la invención resulta adecuada para la utilización en el tratamiento o la prevención del cáncer mediante reducción del tamaño del tumor maligno; mediante reducción del crecimiento de tumores malignos en un individuo y/o mediante la inhibición de la transmigración de células de cáncer y la formación de metástasis. Una composición farmacéutica según la invención también resulta adecuada para la utilización en el tratamiento de infecciones crónicas en un individuo o para la utilización como un adyuvante de una vacuna.

Breve descripción de los dibujos

Las figuras 1a y 1b ilustran una representación de mapa térmico de los resultados obtenidos para el anticuerpo 3­ 266 y el anticuerpo AK FUMM 9-11.

La figura 2 ilustra una representación de mapa térmico de los resultados obtenidos para el anticuerpo FU-HI-3-372.

La figura 3 ilustra esquemáticamente la organización de dominios de las posiciones de CLEVER-1 de los motivos de unión identificados.

La figura 4 ilustra la separación en gel de agarosa al 1 % de los productos de RT-PCR de hibridoma de 3-372. La figura 5 ilustra un gel SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie de IgG43-372 quimérico purificado con proteína A.

La figura 6 ilustra un ELISA de competición de CLEVER-1.

La figura 7 ilustra un diagrama vectorial de pANT de Antitope.

La figura 8 ilustra un gel SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie de anticuerpos purificados con proteína A seleccionados.

La figura 9 ilustra un ELISA de competición de CLEVER-1.

La figura 10A muestra los resultados de la determinación de la expresión de HLA_DR de células positivas para CD14 y la figura 10B muestra los resultados de TNF-alfa soluble medida en medio de cultivo utilizando un kit ELISA de TNF-alfa (Invitrogen).

La figura 11A muestra la repolarización de TAM en carcinomas mamarios E0771 singénicos tras la administración de un anticuerpo de unión a CLEVER-1 y la figura 11B muestra una secreción incrementada de TNF-alfa en TAM de carcinoma mamario singénico E0771 tras la administración de un anticuerpo de unión a CLEVER-1.

La figura 12 ilustra que la ligación de CLEVER-1 con anticuerpos 9-11 y 3-372 promueve efectos opuestos sobre la señalización de mTOR y c-Jun en monocitos de sangre periférica humana.

Descripción detallada de la invención

Términos

La expresión "un agente capaz de unirse a un epítopo de CLEVER-1 humano" se refiere a anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, que son capaces de unirse a secuencias de epítopos específicos definidos en la presente solicitud.

La expresión "un anticuerpo o un fragmento del mismo" se utiliza en el sentido más amplio para cubrir un anticuerpo o un fragmento del mismo que sea capaz de unirse a la molécula CLEVER-1 en un individuo. Especialmente, se entiende que incluye los anticuerpos quiméricos, humanizados o primatizados, así como fragmentos de anticuerpos y anticuerpos de cadena sencilla (p. ej., Fab o Fv), con la condición de que muestren las actividades biológicas deseadas. Según la presente invención, la expresión "un agente capaz de unirse a un epítopo de CLEVER-1 humano" se refiere a un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo.

La expresión anticuerpo humanizado se refiere a cualquier anticuerpo en el que las regiones constantes de los anticuerpos no humanos se han sustituido por completo con la forma humana de las regiones constantes y por lo menos partes de las regiones variables de los anticuerpos no humanos, excluyendo los tres bucles de secuencias de aminoácidos en el exterior de cada región variable que se une a la estructura diana, han sido total o parcialmente sustituidos por las partes correspondientes de los anticuerpos humanos. De esta manera, en particular, cualquier anticuerpo denominado con el esquema de denominación de los Nombres no propietarios internacionales (INN, por sus siglas en inglés) de la OMS o los Nombres adoptados en Estados Unidos (USAN, por sus siglas en inglés) para farmacéuticos con los sufijos -xizu- o -zu- en la presente solicitud se refiere a un anticuerpo humanizado.

La expresión dominio variable, también denominado región Fv, es la región más importante para la unión a antígenos. Específicamente, los bucles variables de las cadenas p, tres en cada cadena ligera (V^l) y en cada cadena pesada (V^h), son responsables de la unión al antígeno. Dichos bucles se denominan regiones determinantes de complementariedad (RDC).

La expresión fragmento Fv de cadena sencilla, o scFv, se refiere a fragmentos que se obtienen mediante la conexión de los dominios V^h and the V^l mediante un conector en un solo polipéptido. La expresión fragmento Fv de cadena sencilla humanizado, o scFv, se refiere, análogamente a la definición de la expresión anticuerpo humanizado, anteriormente, a cualquier fragmento Fv de cadena sencilla o scFv, en el que las regiones constantes que se originan a partir de anticuerpos no humanos han sido totalmente sustituidas por la forma humana de las regiones constantes, y por lo menos partes de las regiones variables originadas en anticuerpos no humanos, excluyendo los tres bucles de secuencias de aminoácidos en el exterior de cada región variable que se unen a la estructura diana, han sido total o parcialmente sustituidos por las partes correspondientes de anticuerpos humanos.

La expresión fragmento Fab se refiere a una región en un anticuerpo que se une a antígenos. La expresión fragmento Fab humanizado se refiere, también análogamente a la definición de la expresión anticuerpo humanizado, anteriormente, a cualquier fragmento Fab, en el que las regiones constantes que se originan a partir de anticuerpos no humanos han sido totalmente sustituidas por la forma humana de las regiones constantes, y por lo menos partes de las regiones variables originadas en anticuerpos no humanos, excluyendo los tres bucles de secuencias de aminoácidos en el exterior de cada región variable que se unen a la estructura diana, han sido total o parcialmente sustituidos por las partes correspondientes de anticuerpos humanos.

El término "péptido" se refiere a cualquier péptido que comprende una o más secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de complementariedad (RDC) definidas en la presente solicitud y que es capaz de unirse a por lo menos un epítopo de CLEVER-1 humano.

Realizaciones preferentes

Según la presente invención, un anticuerpo humanizado o fragmento del mismo capaz de unirse a CLEVER-1 humano reconoce un epítopo de CLEVER-1, en el que el epítopo es discontinuo y comprende las secuencias de aminoácidos:

PFTVLVPSVSSFSSR (SEC ID n° 1), y

QEITVTFNQFTK (SEC ID n° 2) de CLEVER-1 humano,

y dicho anticuerpo humanizado o fragmento del mismo comprende una o más secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de complementariedad (RDC) de unión a dichas secuencias de epítopo seleccionadas del grupo que consiste en:

TSGMGIG (SEC ID n° 7),

HIWWDDDKRYNPALKS (SEC ID n° 8),

HYGYDPYYAMDY (SEC ID n° 9),

TASSSVSSSYLH (SEC ID n° 10),

RTSNLAS (SEC ID n° 11), y

HQYHRSPPT (SEC ID n° 12).

En algunas realizaciones preferentes de la presente invención, el epítopo discontinuo de CLEVER-1 humano comprende, además, una o más secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en:

ATQTGRVFLQ (SEC ID n° 3),

DSLRDGRLIYLF (SEC ID n° 4),

SKGRILTMANQVL (SEC ID n° 5), y

LCVYQKPGQAFCTCR (SEC ID n° 6).

Una parte de la proteína diana humana CLEVER-1, es decir, la estabilina-1 humana, se define en la SEC ID n° 31. Los epítopos SEC ID n° 1, SEC ID n° 2, SEC ID n° 3, SEC ID n° 4, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 6 en CLEVER-1 corresponden a los aminoácidos 420-434, 473-484, 390-399, 576-587, 615-627 y 313-327 de la proteína diana humana CLEVER-1 definida en la SEC ID n° 31.

En la presente invención, el anticuerpo humanizado o fragmento del mismo que puede unirse a un epítopo de CLEVER-1 humano comprende la totalidad de las seis secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (RDC) definidas anteriormente.

Según la presente invención, un agente que puede unirse a CLEVER-1 humano es un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab y dicho anticuerpo o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab humanizado comprende:

a) regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera kappa de IgG humana, y

b) una o más de las secuencias siguientes de las regiones determinantes de complementariedad (RDC)

i) de la cadena pesada

CDR 1: TSGMGIG (SEC ID n° 7), y/o

CDR 2: HIWWDDDKRYNPALKS (SEC ID n° 8), y/o

CDR 3: HYGYDPYYAMDY (SEC ID n° 9), y

ii) de la cadena ligera

CDR 1: TASSSVSSSYLH (SEC ID n° 10), y/o

CDR 2: RTSNLAS (SEC ID n° 11), y/o

CDR 3: HQYHRSPPT (SEC ID n° 12).

El anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab capaz de unión a un epítopo de CLEVER-1 humano que reconoce las secuencias de epítopo discontinuas tal como se han definido anteriormente. El epítopo discontinuo de CLEVER-1 humano comprende por lo menos las secuencias SEC ID n° 1 y SEC ID n° 2. En algunas realizaciones, el epítopo discontinuo de CLEVER-1 humano comprende, además, una o más de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID n° 3, SEC ID n° 4, SEC ID n° 5 y SEC ID n° 6.

En la presente invención, la totalidad de las seis RDC definidas anteriormente están comprendidas en el anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab.

En la presente invención, la secuencia de la región variable de cadena pesada de IgG humana del anticuerpo humano o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID n° 14, SEC ID n° 16, SEC ID n° 18 y SEC ID n° 20, preferentemente SEC ID n° 16, SEC ID n° 18 y SEC ID n° 20. En la presente invención, la secuencia de la región variable de cadena ligera de IgG humana del anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab se selecciona del grupo que consiste en la SEC ID n° 22, SEC ID n° 24, SEC ID n° 26, SEC ID n° 28 y SEC ID n° 30, preferentemente SEC ID n° 30.

en el anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab según la invención, las regiones constantes de la cadena pesada y cadena ligera kappa de IgG humana no presentan modificación. Las regiones constantes de IgG4 humana resultan preferentes. Muchas realizaciones preferentes comprenden la cadena pesada de IgG4 humana y la cadena ligera kappa de IgG4 con las mutaciones L248E y/o, preferentemente, S241P.

En la presente invención, el anticuerpo humanizado o el fragmento Fv de cadena sencilla o Fab es capaz de unirse a CLEVER-1 humano con una IC⁵⁰ relativa <1,0, preferentemente <0,8, más preferentemente <0,6 y lo más preferentemente <0,5 en comparación con la IC⁵⁰ del anticuerpo monoclonal 3-372 (DSM n° ACC2520, depositado en el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 21 de agosto de 2001).

Según la invención, la combinación de las regiones variables de cadena pesada y ligera de IgG humana se seleccionan de las combinaciones presentadas en la Tabla 5 que pueden unirse a CLEVER-1 humano con una IC⁵⁰ relativa <1,0 en comparación con la IC⁵⁰ del anticuerpo monoclonal 3-372 (DSM n° ACC2520 depositado en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 21 de agosto de 2001).

Una composición farmacéutica según la invención comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento Fv de cadena sencilla o Fab indicado anteriormente y un excipiente apropiado.

Una modulación de los macrófagos promotores de tumor (M2) en macrófagos proinflamatorios (M1).

Se ha encontrado, además, que un agente capaz de unirse a CLEVER-1 humano, especialmente a secuencias de epítopo específicas en CLEVER-1 definidas en la presente solicitud, puede utilizarse para activar macrófagos para cambiar su fenotipo de macrófagos M2 a macrófagos M1. Especialmente, un agente capaz de unirse a CLEVER-1 en los macrófagos asociados a tumor (MAT) para conseguir una modulación de los macrófagos promotores de tumor (M2) en macrófagos proinflamatorios (M1). Dicha modulación incrementa la activación de las células T y finalmente conduce, p. ej., a la eliminación de la inmunosupresión originada en cáncer. Más exactamente, se ha encontrado que un agente capaz de unirse a secuencias específicas en la molécula CLEVER-1 puede utilizarse para eliminar la inmunosupresión mediante modulación de los macrófagos M2 en macrófagos m 1. En consecuencia, el presente resultado proporciona un método para afectar al sistema inmunitario en un individuo y resulta especialmente útil en el tratamiento del cáncer o en la prevención de metástasis, aunque no se encuentra limitado a este enfoque.

Los macrófagos pueden clasificarse en dos fenotipos diferentes: macrófagos M1 y M2. Los macrófagos M1 son macrófagos proinflamatorios clásicos, que producen grandes cantidades de citoquinas proinflamatorias y moléculas coestimuladoras, y son muy eficientes en la activación de las respuestas de células T. Los macrófagos M2, en contraste, son células inmunosupresoras que sintetizan citoquinas antiinflamatorias e inducen las células T reguladoras y, por lo tanto, amortiguan profundamente la activación de las células T controlada por antígenos. Los macrófagos asociados a tumores (MAT) se consideran perjudiciales, ya que maduran en macrófagos M2 (macrófagos promotores de tumor) dentro del medio tumoral y suprimen las respuestas inmunitarias antitumorales y median en el cambio angiogénico, una etapa crucial en el crecimiento del cáncer. Los macrófagos M2 pueden modularse para formar macrófagos M1 (macrófagos proinflamatorios) y dicha conversión del fenotipo de M2 a M2 puede causar directa o indirectamente el rechazo tumoral.

En el presente contexto, la expresión "macrófagos M1" o "macrófagos proinflamatorios" se refiere a los macrófagos caracterizados por un nivel medido incrementado de secreción de macrófagos/monocitos TNF-alfa (TNF-a) o de expresión de HLA-DR. La modulación de los macrófagos M2 en macrófagos M1 incrementará la secreción de monocitos TNF-alfa y también la expresión de HLA-DR en comparación con los valores de control medidos antes de administrar un agente capaz de unirse a CLEVER-1 humano o los valores de una o más mediciones anteriores realizadas en diferentes puntos temporales en el mismo paciente. Es importante comparar los valores medidos de secreción de TNF-alfa por monocitos y de expresión de HLA-DR con los valores del mismo paciente, ya que el nivel de dichos marcadores puede variar de un individuo a otro y, p. ej., las citoquinas, tales como el interferón gamma y la activación de LPS pueden incrementar la expresión de TNF-alfa por parte de los macrófagos M2.

Inesperadamente, se ha encontrado que los macrófagos M2 pueden activarse para modularse en macrófagos M1 mediante el contacto de dichos macrófagos con un agente capaz de unirse a CLEVER-1 humano, p. ej., por un anticuerpo o un fragmento del mismo, uno o más péptidos o macromoléculas según se define en la presente solicitud. Especialmente, se ha encontrado que los macrófagos M2 asociados a tumores malignos pueden modularse o repolarizarse en macrófagos M1 mediante el contacto de dichos macrófagos con un agente capaz de unirse a CLEVER-1 humano sobre los MAT. Ambos fenotipos pueden encontrarse presentes simultáneamente y pueden encontrarse ambos fenotipos en los tumores.

Un agente capaz de unirse a CLEVER-1 humano, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo, uno o más péptidos o macromoléculas, se une a CLEVER-1 humano para conseguir dicha modulación o repolarización de los fenotipos de los macrófagos. Se ha identificado que los agentes específicos para la proteína CLEVER-1 reconocen unas secuencias específicas de epítopo de CLEVER-1 definidas en la presente solicitud.

La unión específica a dos o más de dichas secuencias de epítopo en CLEVER-1 sobre los MAT proporcionará un nuevo método para tratar los cánceres o para prevenir las metástasis sin efectos secundarios perjudiciales, ya que el tratamiento puede dirigirse a epítopos específicos para conseguir la modulación deseada del fenotipo de los macrófagos. En consecuencia, los resultados descritos en la presente memoria resultan especialmente útiles en el tratamiento o la prevención de todos los tipos de tumores malignos asociados a una cantidad incrementada de macrófagos promotores de tumor u otras patologías, tales como la inflamación crónica, en las que un individuo presenta una dominancia de inmunosupresión. En consecuencia, un método de tratamiento de cáncer o de prevención de metástasis comprende administrar en un individuo un anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado capaz de unión a CLEVER-1 humano. El método comprende tratar o prevenir el cáncer mediante la reducción del tamaño tumoral y/o mediante la reducción del crecimiento tumoral en un individuo, y/o mediante la inhibición de la transmigración de las células de cáncer y la formación de metástasis. De esta manera, puede tratarse cualquier tumor benigno o maligno, o metástasis de tumor maligno, tal como cáncer de piel y cáncer de colon. También pueden tratarse las leucemias, linfomas y mielomas múltiples. Particularmente, se espera que los melanomas y linfomas respondan muy bien al tratamiento, basándose en modelos animales.

Los macrófagos también presentan una función importante durante la inflamación y resolución de la infección, aparte de afectar el crecimiento o regresión de los tumores. En las infecciones puede producirse un cambio de macrófago M1 a M2, conduciendo a la generación de un medio supresor que anula la inmunidad de efectores. En consecuencia, los resultados descritos en la presente memoria que modulan el fenotipo de los macrófagos también resultan útiles en el tratamiento de infecciones crónicas para eliminar la inmunosupresión contra los antígenos infecciosos. La invención se refiere, además, a un método para tratar las infecciones crónicas, que comprende administrar en un individuo un anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado capaz de unirse a CLEVER-1, en el que dicho anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado puede activar los macrófagos para cambiar su fenotipo de M2 a M1.

Además, un anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado capaz de unirse a la molécula CLEVER-1 sobre los macrófagos y monocitos en un individuo puede utilizarse como un adyuvante en las vacunas. Dicho anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado consegue la repolarización de los macrófagos y, de esta manera, elimina, o por lo menos reduce, la inmunosupresión contra los antígenos de la vacuna. Cualquier vacunación inducida por antígenos puede resultar beneficiada si el huésped o el sitio de vacunación pueden eliminarse temporalmente de los elementos inmunosupresores.

La modulación de macrófagos M2 a M1 puede verificarse mediante la medición de la secreción de TNF-alfa por monocitos a partir de muestras de sangre humanas. En consecuencia, la secreción incrementada de TNF-alfa puede utilizarse como un marcador de seguimiento de la respuesta al tratamiento en un individuo. La secreción de TNF-alfa puede determinarse a partir de los monocitos de sangre periférica enriquecidos a partir de sangre extraída de un paciente. Puede utilizarse el nivel de TNF-alfa medido como marcador de la respuesta del paciente al tratamiento que comprende administrar un agente capaz de unirse a CLEVER-1 en el paciente, al comparar los niveles con un nivel de control medido en el mismo paciente antes de administrar dicho agente en el paciente, o los valores de una o más mediciones anteriores realizadas en diferentes puntos temporales en el mismo paciente.

Un método para estimar la eficacia de la terapia anti-CLEVER-1 mediante seguimiento del desarrollo de la modulación de los macrófagos M2 en macrófagos M1, al administrar en un paciente un anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado capaz de unirse a CLEVER-1, que comprende las etapas siguientes:

(a) obtener monocitos de sangre periférica (LSP) a partir de una muestra de sangre extraída de dicho paciente, (b) medir la secreción de TNF-a de dichas LSP, y/o

(c) medir la expresión de HLA-DR sobre las LSP positivas para CD14, y

(e) comparar los valores de secreción de TNF-a y/o la expresión de HLA-DR medidas en las etapas (b) y (c) para controlar los valores para una estimación de la eficacia del tratamiento anti-CLEVER-1, en el que los valores de control son los valores medidos antes de administrar un anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado capaz de unirse a CLEVER-1 en el paciente o los valores de una o más mediciones anteriores realizadas en diferentes puntos temporales en el mismo paciente, y en el que una secreción incrementada de TNF-a o de expresión de HLA-DR es indicativa de la modulación de los macrófagos M2 en macrófagos M1.

La determinación de la secreción de TNF-alfa a partir de monocitos de sangre periférica obtenida de una muestra de sangre extraída del paciente puede llevarse a cabo mediante métodos habitualmente conocidos, por ejemplo, mediante la utilización de un kit de ELISA de TNF-alfa comercial. La expresión de HLA-DR sobre los monocitos positivos para CD14 también puede monitorizarse mediante la utilización de un método conocido de citometría de flujo.

El desarrollo de la modulación de macrófagos M2 en macrófagos M1 puede seguirse mediante la comparación del nivel medido de secreción de TNF-alfa por los monocitos y los valores de control medidos antes de administrar un agente capaz de unirse a CLEVER-1 en el paciente, o los valores de una o más mediciones anteriores realizadas en diferentes puntos temporales en el mismo paciente. Por ejemplo, puede utilizarse la comparación de un nivel reducido de secreción de TNF-alfa por monocitos con los resultados de mediciones anteriores o con un control, a fin de indicar una expresión más alta de macrófagos M2, mientras que un nivel incrementado de TNF-alfa, en comparación con los resultados de mediciones anteriores o con un control, puede utilizarse para indicar una mayor expresión de macrófagos M1 con una expresión menor de macrófagos M2, en donde también puede utilizarse para indicar la eficacia del tratamiento anti-CLEVER-1. El nivel incrementado de TNF-alfa indica más expresión de macrófagos M1 con una menor expresión de los macrófagos M2, es decir, atribuye sensibilidad a dicha terapia. Un agente capaz de unirse a CLEVER-1 activará por lo menos una parte de los macrófagos M2 para repolarizarse en macrófagos M1 y, tras la administración de dicho agente, pueden encontrarse presentes ambos fenotipos de macrófago, aunque puede observarse una expresión incrementada de macrófagos M1 en comparación con la situación previa a la administración de dicho agente. Típicamente, un incremento de por lo menos dos veces de la secreción medida de TNF-alfa en comparación con el valor de control es indicativo de la modulación de los macrófagos M2 en macrófagos M1 y por lo tanto indica la sensibilidad del paciente a la terapia.

Enfermedades que responden al tratamiento.

El equilibrado de la activación y supresión inmunitarias resulta un punto muy crítico para la homeostasis de un ser humano (o animal) en la lucha contra el material foráneo que nace dentro del ser humano (o animal) o entra en el mismo. El ejemplo de Palani et al. (2016) es un ejemplo fisiológico de ello y muestra cómo la inmunosupresión local resulta crucial para el bienestar de un embrión en un medio dominado por la defensa inmunitaria de la madre. Lo mismo podría tener lugar en infecciones crónicas, ya que algunos patógenos (p. ej., la tuberculosis) han aprendido a utilizar un mecanismo similar de ocultación respecto al sistema inmunitario del huésped y podrían establecer sitios infectados crónicamente (hepatitis). La eliminación de esta inmunosupresión local podría ayudar al huésped a luchar contra dichas infecciones, al igual que mejorar la vacunación contra estos patógenos resistentes.

Los tumores también se han adaptado a dicha supresión inmunitaria en su beneficio. El método según la presente invención para el tratamiento o la prevención del cáncer mediante la reducción del tamaño del tumor maligno, mediante reducción del crecimiento del tumor maligno, y/o mediante la inhibición de la transmigración de las células de cáncer y la formación de metástasis es aplicable a todas las formas de cáncer. De esta manera, puede tratarse cualquier tumor benigno o maligno, o metástasis de tumor maligno, tal como cáncer de piel y cáncer de colon. También pueden tratarse las leucemias, linternas y mielomas múltiples. Particularmente, se espera que los melanomas y linternas respondan muy bien al tratamiento, basándose en modelos animales.

Los presentes inventores creen que un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab según la presente invención o la composición farmacéutica según la presente invención resulta útil en el tratamiento o la prevención de todos los tipos de sarcoma, por ejemplo, fibrosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, osteosarcoma, angiosarcoma, linfangisarcoma, leiomiosarcoma y rabdomiosarcoma, mesotelioma, meningoma, leucemias, linfomas, así como todos los tipos de carcinomas, tales como carcinomas de células escamosas, carcinoma de células basales, adenocarcinomas, carcinomas papilares, cistadenocarcinomas, carcinomas broncogénicos, melanomas, carcinomas de células renales, carcinoma hepatocelular, carcinomas de células transicionales, coriocarcinomas, seminomas y carcinomas embrionarios.

Un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o Fab o una composición farmacéutica según la invención resulta adecuada para la utilización en la eliminación de la inmunosupresión inducida por tumor o antígenos, mediante la modulación de los macrófagos M2 en macrófagos M1, en el que el agente se une a secuencias epitópicas de CLEVER-1 humanas definidas en la presente solicitud.

Un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab o una composición farmacéutica según la invención resulta adecuada para la utilización en el tratamiento o la prevención del cáncer mediante reducción del tamaño del tumor maligno; mediante reducción del crecimiento de tumores malignos en un individuo y/o mediante la inhibición de la transmigración de células de cáncer y la formación de metástasis, en el que la inmunosupresión del tumor maligno se elimina mediante modulación de los macrófagos M2 en macrófagos M1.

Un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab, o una composición farmacéutica según la invención, también resulta adecuada para la utilización en el tratamiento de infecciones crónicas en un individuo, en el que la inmunosupresión frente a antígenos infecciosos se elimina mediante modulación de los macrófagos M2 en macrófagos M1.

Un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab, o una composición farmacéutica según la invención, también resulta adecuado para la utilización como un adyuvante de vacuna, en el que la inmunosupresión frente a antígenos de vacuna se elimina mediante modulación de macrófagos M2 en macrófagos M1.

Un método para modular los macrófagos M2 en macrófagos M1 comprende administrar en el sujeto que lo necesita un anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado capaz de unirse a CLEVER-1, preferentemente capaz de unirse a secuencias específicas en la molécula de CLEVER-1 tal como se define en la presente solicitud. Dicho método puede utilizarse en el tratamiento del cáncer o en la prevención de metástasis en un individuo, o en el tratamiento de infecciones crónicas en un individuo. La respuesta al tratamiento puede verificarse mediante medición de la secreción de TNF-a de dichas LSP y/o la expresión de HLA-DR sobre los LSP positivos para CD14 tal como se indica en la presente solicitud.

Vías de administración, formulaciones y dosis requerida.

Las composiciones farmacéuticas que deben utilizarse en la presente invención pueden administrarse por cualesquiera medios que consigan su finalidad prevista. Por ejemplo, la administración puede ser intravenosa, intraarticular, intratumoral o subcutánea. Además de los compuestos farmacológicamente activos, las preparaciones farmacéuticas de los compuestos preferentemente contienen portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que pueden utilizarse farmacéuticamente.

La dosis seleccionada debe resultar terapéuticamente eficaz con respecto a la enfermedad tratada. De acuerdo con lo anterior, la inmunosupresión debería ser suficiente para tratar la enfermedad sin efectos que esencialmente pongan en peligro el resultado buscado del tratamiento. Al tratar o prevenir el cáncer, la dosis debería ser suficiente para reducir el tamaño del tumor maligno, reducir el crecimiento del tumor maligno y/o inhibir la transmigración de las células de cáncer y la formación de metástasis. La dosis es dependiente de la renovación del agente administrado, aunque típicamente estos tratamientos siguen un régimen de 1 a 5 mg/kg cada 2 a 4 semanas.

Ejemplos

La sección experimental a continuación ilustra la invención proporcionando ejemplos.

Los Ejemplos 1 a 10 ilustran un mapeado de epítopos discontinuos de CLEVER-1 humano y la generación de anticuerpos humanizados del anticuerpo monoclonal de ratón 3-372 (DSM n° ACC2520, depositado en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 21 de agosto de 2001) utilizando la tecnología Composite Human Antibody™. La capacidad de los anticuerpos anti-CLEVER-1 de fomentar la activación inmunitaria se ilustra en los Ejemplos 11 a 14.

El Ejemplo 1 ilustra el mapeado de epítopos discontinuos completo de anticuerpos con diana en CLEVER-1 humano.

Los Ejemplos 2 a 6 ilustran la determinación de las secuencias de región V de cadena pesada y ligera (V^h y V^k) del anticuerpo anti-Clever-1 CLON 3-372 y la producción de anticuerpos quiméricos que comprenden regiones variables de 3-372 y las regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera kappa de IgG4 humana. Se extrajeron los ARNm del hibridoma clon 3-372, se transcribieron inversamente, se amplificaron por PCR y se clonaron los transcritos específicos de anticuerpo. Se determinaron las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo y se llevó a cabo un análisis de los datos de secuencias para la humanización utilizando la tecnología propietaria de Antitope, Composite Human Antibody™.

Los Ejemplos 2 a 6 demuestran que: las regiones variables del anticuerpo anti-Clever-1 de ratón 3-372 han sido clonadas y secuenciadas. Los genes de región variable se han combinado con regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera kappa de IgG4(S241P) humana y se expresaron en células NS0 para producir un anticuerpo quimérico anti-Clever-1. Se utilizó un ensayo ELISA de competición de anticuerpo quimérico derivado de NS0 para demostrar que la eficiencia de unión del anticuerpo quimérico a Clever-1 es similar a la del anticuerpo murino parental.

Los Ejemplos 7 a 10 ilustran: el diseño de los anticuerpos Composite Human Antibodies™ anti-CLEVER-1 que se expresaron y sometieron a ensayo para la unión a Clever-1 humano. Se determinaron los residuos clave implicados en la estructura y unión de anti-CLEVER-1 mediante el modelado de la estructura y homología a fin de generar un "mapa de residuos restrictores". El mapa de residuos restrictores se utilizó como molde para obtener segmentos de la secuencia de región V humana de bases de datos que contienen secuencias de anticuerpo humano no relacionadas. Cada segmento de secuencia seleccionado, así como las uniones entre segmentos, se sometieron a ensayo para la presencia de epítopos potenciales de células T utilizando el análisis in silico (iTope™ y TCED™). Mediante la utilización de dicho método, se diseñaron todas las variantes de secuencia de Composite Human Antibody™para evitar los epítopos de las células T. Se generaron genes de la región V de Composite Human Antibody™mediante la utilización de oligonucleótidos sintéticos codificantes de combinaciones de los segmentos seleccionados de secuencia humana. A continuación, dichos segmentos se clonaron en vectores que contenían regiones constantes de la cadena pesada y cadena ligera kappa de IgG4(S241P) humana y se produjeron los anticuerpos y se sometieron a ensayo para la unión al antígeno diana mediante ELISA de competición en comparación con el anticuerpo monoclonal murino de referencia original.

Los Ejemplos 7 a 10 muestran la construcción de cuatro regiones V de V^h y cinco de V^k de Composite Human Antibody™. Las combinaciones de las cadenas pesada y ligera compuestas se expresaron en células NS0, se purificaron y se sometieron a ensayo para la unión a CLEVER-1 en un ensayo de ELISA de competición. Los resultados muestran que la eficiencia de unión de muchos de los anticuerpos de Composite Human Antibody™ a CLEVER-1 eran por lo menos tan buenos como los del anticuerpo de referencia quimérico y varios eran marcadamente mejores. Basándose en la ausencia de un potencial sitio de glucosilación y una cisteína no emparejada, y los conjuntos de datos de expresión y eficiencia de unión generados, se designaron tres potenciales compuestos "cabeza de serie": VH2/VK5, VH3/VK5 y VH4/VK5.

Los Ejemplos 11 a 12 ilustran la unión del anticuerpo anti-CLEVER-1 sobre monocitos de sangre periférica humana y la activación de la secreción de TNF-alfa en monocitos de sangre periférica humana. El Ejemplo 13 ilustra el modo de acción de los anticuerpos anti-CLEVER-1 sobre los macrófagos asociados a tumor en modelos de cáncer singénico de ratón.

El Ejemplo 14 ilustra que la ligación de CLEVER-1 con los anticuerpos 9-11 y 3-372 promueve efectos opuestos sobre la señalización de mTOR y c-Jun en monocitos de sangre periférica humana.

Ejemplo 1

Mapeado completo de epítopos discontinuos de CLEVER-1 humano.

Se han establecido epítopos discontinuos tentativos para cuatro anticuerpos utilizando análisis Pepscan. Los anticuerpos FAR02 VH3/VK5 y FU-HI-3-372 presentan como diana el mismo epítopo discontinuo, mientras que los anticuerpos 3-266 y AK FUMM 9-11 presentan como diana otros epítopos diferentes. El estudio se llevó a cabo en Pepscan Presto BV, (Zuidersluisweg 2, 8243RC Lelystad, Países Bajos).

Los anticuerpos 3-266, FAR02 VH3/VK5, FU-HI-3-372 y AK FUMM 9-11 fueron proporcionados por Faron Pharmaceuticals Oy.

La proteína diana humana CLEVER-1, es decir, la estabilina-1 humana, se define como SEC ID n° 31. Puentes disulfuro que conectan los residuos (numeración Uniprot STAB_HUMAN):

Tecnología CLIPS.

La tecnología CLIPS utilizó péptidos estructuralmente fijos en estructuras tridimensionales definidas. Lo anterior resulta en miméticos funcionales de incluso los sitios de unión más complejos. La tecnología CLIPS actualmente se utiliza rutinariamente para formar bibliotecas de péptidos en estructuras de un bucle, de doble o triple bucle, así como plegamiento de lámina y de tipo helicoidal. La reacción CLIPS tiene lugar entre grupos bromo del andamiaje CLIPS y cadenas laterales tiol de las cisteínas. La reacción es rápida y específica bajo condiciones suaves. Utilizando esta elegante química, se transformaron secuencias de proteína nativa en constructos CLIPS con un abanico de estructuras. (Timmerman et al., J. Mol. Recognit. 2007; 20: 283-29, 2013).

El cribado de la biblioteca CLIPS se inicia con la conversión de la proteína diana en una biblioteca de hasta 10.000 constructos péptidos solapantes utilizando un diseño de matriz combinatorial. Sobre un portador sólido, se sintetizó una matriz de péptidos lineales, que seguidamente se conformaron en constructos CLIPS definidos espacialmente. Los constructos que representan ambas partes del epítopo discontinuo en la conformación correcta se unen al anticuerpo con alta afinidad, que se detecta y se cuantifica. Los constructos que presentan el epítopo incompleto se unen al anticuerpo con afinidad más baja, mientras que los constructos que no contienen el epítopo no se unen en absoluto. Se utiliza la información de la afinidad en cribados iterativos para definir en detalle la secuencia y conformación de los epítopos. La proteína diana que contiene un epítopo conformacional discontinuo se convierte en una biblioteca de matrices. Los péptidos combinatoriales se sintetizan en una minitarjeta propietaria y se convierten químicamente en constructos CLIP definidos espacialmente.

Análisis de mapa térmico.

Un mapa térmico es una representación gráfica de los datos en la que los valores adoptados por una variable en un mapa bidimensional se representan con diferentes colores.

Para los péptidos CLIPS de doble bucle, dicho mapa bidimensional puede obtenerse a partir de secuencias independientes del primer y segundo bucles. Por ejemplo, las secuencias de los 16 péptidos CLIPS son efectivamente permutaciones de, p. ej., 4 subsecuencias únicas en, p. ej., el bucle 1 y, p. ej., 4 subsecuencias únicas en, p. ej., el bucle 2. De esta manera, los datos de ELISA observados pueden representarse gráficamente en una matriz 4x4, en la que cada coordenada X corresponde a la secuencia del primer bucle y cada coordenada Y corresponde a la secuencia del segundo bucle.

Con el fin de facilitar adicionalmente la visualización, los valores de ELISA pueden sustituirse por colores de un gradiente continuo. Por ejemplo, los valores extremadamente bajos pueden colorearse de verde; los valores extremadamente altos pueden colorearse de rojo, y los valores intermedios se colorean de negro.

Síntesis de péptidos.

Con el fin de reconstruir epítopos de la molécula diana, se sintetizó una biblioteca de péptidos. Se obtuvo un soporte de polipropileno funcionalizado con amino mediante injertación con una formulación propietaria de polímero hidrofílico, seguido de la reacción con t-butiloxicarbonil-hexametilén-diamina (BocHMDA) utilizando diciclohexilcarbodiimida (DCC) con N-hidroxibenzotriazol (HOBt) y el posterior corte de los grupos Boc utilizando ácido trifluoroacético (TFA). Se utilizó la síntesis con péptido Fmoc estándar para sintetizar péptidos en el soporte sólido funcionalizado con amino mediante estaciones de manipulación de líquidos JANUS personalizadas (Perkin Elmer).

Se llevó a cabo la síntesis de miméticos estructurales mediante la utilización de péptidos unidos químicamente propietarios de Pepscan en tecnología de andamiajes (CLIPS). La tecnología CLIPS permite estructurar péptidos en bucles individuales, dobles bucles, triple bucles, plegamientos de tipo laminar, plegamientos de tipo helicoidal y combinaciones de los mismos. Los moldes de CLIPS se acoplan con residuos de cisteína. Las cadenas laterales de múltiples cisteínas en los péptidos se acoplan con uno o dos moldes de CLIPS. Por ejemplo, se disuelve una solución 0,5 M de P2 CLIPS (2,6-bis(bromometil)piridina) en bicarbonato amónico (20 mM, pH 7,8)/acetonitrilo (1:3 (v/v)). Se añade dicha solución sobre matrices de péptidos. El molde de CLIPS se une a las cadenas laterales de dos cisteínas tal como se encuentran en los péptidos unidos a fase sólida de las matrices de péptidos (placas de 455 pocillos con pocillos de 3 |jl). Las matrices de péptidos se someten a agitación suave en la solución durante 30 a 60 minutos estando completamente cubiertas por solución. Finalmente, las matrices de péptidos se lavan a fondo con exceso de H²O y se sonicaron en tampón de disrupción que contenía SDS al 1 %/beta-mercaptoetanol al 0,1 % en PBS (pH 7,2) a 70°C durante 30 minutos, seguido de la sonicación en H²O durante 45 minutos adicionales. Los CLIPS T3 que portaban péptidos se prepararon de manera similar, aunque ahora con tres cisteínas.

Cribado mediante ELISA.

La unión del anticuerpo a cada uno de los péptidos sintetizados se sometió a ensayo en un ELISA basado en PEPSCAN. Se incubaron las matrices de péptidos con solución de anticuerpo primario (durante la noche a 4°C). Tras el lavado, las matrices de péptidos se incubaron con una dilución 1/1000 de un conjugado apropiado de anticuerpoperoxidasa (SBA, Tabla 1) durante una hora a 25°C. Tras el lavado, se añadió el sustrato de peroxidasa, sulfonato de 2,2'-azino-di-3-etilbenzotiazolina (ABTS) y 20 |jl/ml de 3 por ciento de H²O². Tras una hora, se midió el desarrollo de color. Se cuantificó el color desarrollado con una cámara-dispositivo de carga acoplada (CCD) y un sistema de procesamiento de imágenes.

Tabla 1. Datos de los anticuerpos.

Langedijk et al., Helical peptide arrays for lead identification and interaction site mapping, Analytical Biochemistry 417: 149-155

Diseño de péptidos.

Se sintetizaron diferentes juegos de péptidos según los diseños siguientes. Observar que en algunos juegos, los péptidos se sintetizaron en un orden aleatorio. Posteriormente se muestra el orden real de los péptidos.

Juego 1

Tipo de mimético lineal

Marcaje LIN

Descripción Péptidos 15-meros lineales derivados de la secuencia diana de Clever-1 humano con un desfase de un residuo.

Secuencias (primeras 10)

QVLFKGCDVKTTFVT VLFKGCDVKTTFVTH LFKGCDVKTTFVTHV FKGCDVKTTFVTHVP KGCDVKTTFVTHVPC GCDVKTTFVTHVPCT CDVKTTFVTHVPCTS DVKTTFVTHVPCTSC VKTTFVTHVPCTSCA KTTFVTHVPCTSCAA

Juego 2

Tipo de mimético lineal

Marcaje LIN.AA

Descripción Péptidos del juego n° 1, aunque con sustitución de los residuos en las posiciones 10 y 11 por Ala. En caso de encontrarse una Ala nativa en cualquiera de las posiciones, se sustituye por Gly.

Secuencias (primeras 10)

GAETPCNGHAACLDG

LTMANQVLAAAISEE ILLPPTILPAAPKHC DRNGTCVCQAAFRGS PGYTQQGSEAAAPNP PIDPCRAGNAACHGL HTDALCSYVAAGQSR KGCDVKTTFAAHVPC CQALNTSTCAANSVK RAVGGGQRVAACPPG

Juego 3

Tipo de mimético lineal

Mareaje LIN20.C

Descripción Péptidos lineales de longitud 20 derivados de la secuencia diana de Clever-1 humano con un desfase de un residuo. Los residuos de Cys se protegen con acetimidometilo (Acm, denotado "2").

Secuencias (primeras 10)

2H2PENYHGDGMV2LPKDP2

SGWLRELPDQITQD2RYEVQ

LAQH2HLHAR2VSQEGVAR2

IKKQT2PSGWLRELPDQITQ

2RESEVGDGRA2YGHLLHEV

QRV2T2PPGFGGDGFS2YGD

NGVFHWTGLRWQAPSGTPG AT2QVTADGKTS2V2RESEV

KYSYKYKDQPQQTFNIYKAN

2VYIH D PTGLN VLKKG2ASY

Juego 4

Tipo de mimético lineal

Marcaje LIN25.C

Descripción Péptidos lineales de longitud 25 derivados de la secuencia diana de Clever-1 humano con un desfase de un residuo. los residuos de Cys están protegidos con Acm ("2").

Secuencias (primeras 10)

KKG2ASY2NQTIMEQG22KGFFGPD

PD2QSV2S2VHGV2NHGPRGDGS2L

GPGQSR2T2KLGFAGDGYQ2SPIDP

IFPKE2VYIH DPTGLNVLKKG2ASY

PTILPILPKH2SEEQHKIVAGS2VD

ENFRGSA2QE2QDPNRFGPD2QSV2

QNTQ2SAEAPS2R2LPGYTQQGSE2

GRV2VAIDE2ELDMRGG2HTDAL2S

APSGTPGDPKRTIGQILASTEAFSR DGMV2LPKDP2TDNLGG2PSNSTL2

Juego 5

Tipo de mimético Péptidos restringidos, CLIPS mP2

Mareaje BUCLE

Descripción Péptidos de longitud 17. En las posiciones 2 a 16 se encuentran secuencias 15-meras derivadas de la proteína diana. En las posiciones 1 y 17 se encuentran residuos de Cys unidas mediante CLIPS mP2. Los residuos de Cys nativos están protegidos por Acm ("2").

Secuencias (primeras 10)

CL2SYVGPGQSR2T2KC

C2SYVGPGQSR2T2KLC

CSYVGPGQSR2T2KLGC

CYVGPGQSR2T2KLGFC

CVG PGQSR2T2 KLG FAC

CGPGQSR2T2KLGFAGC

CPGQSR2T2KLGFAGDC

CGQSR2T2KLGFAGDGC

CQSR2T2KLGFAGDGYC

CSR2T2KLGFAGDGYQC

Juego 6

Tipo de mimético Miméticos de disulfuro lineal

Marcaje CYS22

Descripción Miméticos de disulfuro lineal de longitud 22 diseñados basándose en información de Uniprot sobre puentes disulfuro para CLEVER-1 humano. Los residuos de Cys dentro de un mimético que no participan en la formación de puentes disulfuro están protegidos por Acm ("2").

Secuencias (primeras 10)

WGSR2HECPGGAETP2NGHGTC

SR2HECPGGAETP2NGHGTCLD

2HECPGGAETP2NGHGTCLDGM

ECPGGAETP2NGHGTCLDGMDR

GAETPCNGHGT2LDGMDRNGTC

ETPCNGHGT2LDGMDRNGTCV2

PCNGHGT2LDGMDRNGTCV2QE

LDGMDRNGT2VCQENFRGSACQ

GMDRNGT2VCQENFRGSACQE2

DRNGT2VCQENFRGSACQE2QD

Juego 7

Tipo de mimético Miméticos de puente disulfuro combinatoriales

Mareaje CYS27

Descripción Péptidos combinatoriales de longitud 27. En las posiciones 1 a 11 y 16 a 27 se encuentran secuencias 11-meras derivadas de la secuencia diana en la página 7 unidas mediante el conector "GGSGG". Dicho juego de péptidos se diseñó basándose en la información de puentes disulfuro obtenida de Uniprot. Los residuos de Cys dentro de un mimético que no participan en la formación de puentes disulfuro están protegidos por Acm ("2").

Secuencias (primeras 10)

PGYWGSR2HECGGSGGAETP2NGHGTC

YWGSR2HECPGGGSGGAETP2NGHGTC

GSR2HECPGGAGGSGGAETP2NGHGTC

R2HECPGGAETGGSGGAETP2NGHGTC

HECPGGAETP2GGSGGAETP2NGHGTC

CPGGAETP2NGGGSGGAETP2NGHGTC

PGYWGSR2HECGGSGGTP2NGHGTCLD

YWGSR2HECPGGGSGGTP2NGHGTCLD

GSR2HECPGGAGGSGGTP2NGHGTCLD

R2HECPGGAETGGSGGTP2NGHGTCLD

Juego 8

Tipo de mimético Matriz discontinua, CLIPS T3

Marcaje TAM

Descripción Péptidos de longitud 33. En las posiciones 2 a 16 y 18 a 32 se encuentran péptidos 15-meros derivados de la secuencia diana de Clever-1 humana. En las posiciones 1, 17 y 33 se encuentran residuos de Cys unidos mediante CLIPS T3. Los residuos de Cys nativos están protegidos por Acm ("2").

Secuencias (primeras 10)

CPNRFGPD2QSV2S2VCV2S2VHGV2NHGPRGC CHGDGMV2LPKDP2TDCSAG2FAF2SPFS2DRC C2VD2QALNTST2PPNCPKH2SEEQHKIVAGSC CPKH2SEEQHKIVAGSCGPD2TQ2PGGFSNP2C CRYEVQLGGSMVSMSGCVP2TS2AAIKKQT2PC CHKIVAGS2VD2QALNCIHMLDGILLPPTILPC CF2T2RPGLVSINSNACVTADGKTS2V2RESEC C2VYIHDPTGLNVLKKCGSGGV2QQGT2APGFC CLRVAVAMMDQG2REICDGRA2YGHLLHEVQKC

CYSYKYKD QPQQTFNICH E VQ KATQTGRVFLQC

Datos de cribado.

La unión de los anticuerpos depende de una combinación de factores, incluyendo la concentración del anticuerpo y las cantidades y naturaleza de las proteínas competidoras en el tampón de ELISA. Además, las condiciones de prerrecubrimiento (el tratamiento específico de las matrices de péptidos antes de la incubación con la muestra experimental) afectan a la unión. Se resumen estos datos en la Tabla 2. Para el tampón Pepscan y el preacondicionamiento (SQ), los números indican la cantidad relativa de proteína competidora (una combinación de suero de caballo y ovoalbúmina).

Tabla 2. Condiciones de cribado.

Resultados

Anticuerpo 3-266.

Al someterlo a ensayo bajo condiciones de alta restrictividad, el anticuerpo 3-266 no se unió a ningún péptido presente en las matrices. Al someterlo a ensayo bajo condiciones de baja restrictividad, el anticuerpo se unión a los péptidos de todos los juegos. Los resultados obtenidos con miméticos epitópicos simples sugieren que la secuencia ¹⁰³⁰QWLKSAGITLPADRR¹⁰⁴⁴ representa la parte dominante del epítopo. Los datos obtenidos con los miméticos epitópicos combinatoriales (figura 1) sugieren que el anticuerpo reconoce adicionalmente la secuencia ⁸⁵⁷ LHARCVSQEGVARCR⁸⁷¹. Además, se registró una señal débil y consistente para los péptidos con la secuencia ⁴³⁵TMNASLAQQLCRQHI⁴⁵⁰. La figura 1a ilustra la representación de mapa térmico de los resultados obtenidos para el anticuerpo 3-266 en el juego n° 8 (miméticos de epítopo discontinuo). Se representa gráficamente la señal media en negro y una señal extremadamente alta se representa en un tono claro. Las regiones en cajas están ampliadas. Anticuerpo AK FUMM 9-11.

Al someterlo a ensayo bajo condiciones de alta restrictividad, el anticuerpo AK-FUMM 9-11 se unió a los péptidos de todos los juegos. Los resultados obtenidos con miméticos epitópicos simples sugieren el anticuerpo 885PSNPCSHPDRGG896, que representa la parte dominante del epítopo. Los datos obtenidos con los miméticos epitópicos combinatoriales sugieren que el anticuerpo reconoce adicionalmente la secuencia que contiene el mimético epitópico combinatorial ¹⁶⁶FRGSACQECQDPNRF¹⁸⁰ (figura 1b). La figura 1b ilustra la representación de mapa térmico de los resultados obtenidos para el anticuerpo AK FUMM 9-11 en el juego n° 8 (miméticos de epítopo discontinuo). Se representa gráficamente la señal media en negro y una señal extremadamente alta se representa en un tono claro. Las regiones en cajas están ampliadas.

Anticuerpos FAR02 VH3/VK5 y FU-HI:3-372.

Al someterlos a ensayo bajo condiciones de alta restrictividad, los anticuerpos FAR02 VH3/vk5 y FU-HI-3-372 no se unieron a ningún péptido presente en las matrices. Al someterlos a ensayo bajo condiciones de baja restrictividad, dichos anticuerpos se unieron específicamente a péptidos únicamente del juego n° 8 (figura 2). El análisis de los resultados obtenidos con miméticos discontinuos sugiere que el anticuerpo reconoce un epítopo discontinuo compuesto de las secuencias ³⁹⁰ATQTGRVFLQ³⁹⁹ (SEC ID n° 3), ⁴²⁰PFTVLVPSVSSFSSR⁴³⁴ (SEC ID n° 1), ⁴⁷³QEITVTFNQFTK⁴⁸⁴ (SEC ID n° 2), ⁵⁷⁶DSLRDGRLIYLF⁵⁸⁷ (SEC ID n° 4), ⁶¹⁵SKGRILTMANQVL⁶²⁷ (SEC ID n° 5), en que las secuencias ⁴⁷³QEITVTFNQFTK⁴⁸⁴ (SEC ID n° 2) y ⁴²⁰PFTVLVPSVSSFSSR⁴³⁴ (SEC ID n° 1) aparentemente presentan epítopos nucleares. Se registró una señal más débil adicional para miméticos discontinuos que contenían la secuencia ³¹³LCVYQKPGQAFCTCR³²⁷ (SEC ID n° 6). Los resultados obtenidos de miméticos epitópicos simples no permiten identificar epítopos. La figura 2 ilustra la representación de mapa térmico de los resultados obtenidos para el anticuerpo FU-HI-3-372 en el juego n° 8 (miméticos de epítopo discontinuo). Se representa gráficamente la señal media en negro y una señal extremadamente alta se representa en un tono claro. Las regiones en cajas están ampliadas.

Conclusiones

Los anticuerpos se sometieron a ensayo frente a matrices de péptidos Pepscan. Resultó posible identificar epítopos discontinuos tentativos para todos los anticuerpos monoclonales. Las secuencias peptídicas que comprenden epítopos se indican en la Tabla 3. Los anticuerpos 3-266 y AK FUM 9-11 se unen a diferentes epítopos discontinuos. Los anticuerpos FAR02 VH/VK5 y FU-HI-3-372 esencialmente mostraron patrones de unión muy similares al someterlos a ensayo en las matrices y, por lo tanto, se mostró que reconocían el mismo epítopo discontinuo en los dominios FAS1/FAS2.

Tabla 3. Epítopos identificados.

Con el fin de comparar visualmente los epítopos tentativos identificados para los anticuerpos anteriormente indicados, se utilizó un dibujo esquemático en la figura 3. Dicho esquema se adaptó a partir de la figura 1 de Kzhyshkowska, TheScientificWorldJOURNAL (2010) 10, 2039-2053m que representa la organización de dominios de la estabilina-1 (CLEVER-1). La figura 3 ilustra esquemáticamente la organización de dominios de CLEVER-1 (aminoácidos 25 a 1027 según la secuencia de la diana). Las flechas señalan las posiciones relativas de los motivos de unión identificados. Las flechas circuladas indican las posiciones de los núcleos epitópicos dominantes.

Ejemplo 2

Extracción de ARNm, RT-PCR y clonación.

Se extrajo con éxito el ARNm de las células de hibridoma (sistema PolyA Tract, Promega, n° de cat. Z5400). Se llevó a cabo una RT-PCR utilizando agrupaciones de cebadores degenerados para secuencias de señal murinas con un único cebador de región constante. Se amplificó el ARNm de región variable de cadena pesada utilizando un juego de seis agrupaciones de cebadores degenerados (HA a HF) y se amplificó el ARNm de región variable de cadena ligera utilizando un juego de ocho agrupaciones de cebadores degenerados (kA a kG y AA). Los productos de amplificación se obtuvieron con la agrupación de cebadores de cadena pesada HD y las agrupaciones de cebadores de cadena ligera ^kB, ^kC y ^kG que confirman que la cadena ligera es del agrupado ^k (figura 4). Se clonó cada producto y se secuenciaron varios clones de cada secuencia.

Mediante la utilización de estos métodos, se identificó una secuencia VH única [SEC ID n° 32 (secuencia de bases) y n° 33 (secuencia de aminoácidos)] en la agrupación HD y se identificó una única secuencia V^k funcional [SEC ID n° 34 (secuencia de bases) y n° 35 (secuencia de aminoácidos)] en la agrupación de cebadores kG. Las RDC del tramo de cadena pesada entre las bases 91 y 111 (SEC ID n° 7), entre las bases 154 y 210 (SEC ID n° 8) y entre las bases 298 y 333 (SEC ID n° 9) y las CDR del tramo de cadena ligera entre las bases 70 y 105 (SEC ⁱD n° 10), entre las bases 151 y 171 (SEC iD n° 11) y entre las bases 268 y 294 (SEC ID n° 12). Las definiciones de las RDC y la numeración de las secuencias de las proteínas son según Kabat. También se identificó un transcrito aberrante de la cadena ligera k normalmente asociado a la pareja de fusión de hibridoma SP2/0 (GenBank M35669) en las agrupaciones de cebadores kB y kC.

La figura 4 ilustra la separación en gel de agarosa al 1 % de los productos de RT-PCR de hibridoma de 3-372. El gel se tiñó con pigmento verde SYBR® (Invitrogen, n° de cat, S-7567) y se fotografió con luz ultravioleta. El marcador de tamaños es GeneRuler™ 1Kb Plus (Fermentas, n° de cat. SM1331). Las cajas indican bandas que se aislaron para la clonación y la secuenciación.

Ejemplo 3

Análisis de secuencias.

El análisis de las secuencias obtenidas del hibridoma que expresa 3-372 se resume en la Tabla 4.

Tabla 4. Análisis de secuencia del anticuerpo 3-372a.

El análisis de estructuras y homologías de la secuencia del dominio variable de 3-372 murino identificó cuatro residuos de marco en la región variable de cadena pesada y cinco residuos de marco en la región variable de cadena ligera que se consideró que eran críticos o posiblemente importantes para la unión de antígeno ("residuos restrictores"). El análisis adicional de la base de datos de secuencias reveló que pueden encontrarse segmentos de marco humanos que incluyen todos los residuos restrictores deseables y todos los residuos de RDC, permitiendo de esta manea la construcción de anticuerpos Composite Human Antibodies™.

Se observó, además, que las regiones V de 3-372 contienen algunas características no habituales. La cadena VH contiene un sitio de N-glucosilación al inicio del RDC1, ya que el residuo 30 es N y el 32 es S (la señal de N-glucosilación es NXS o NXT, en donde X puede ser cualquier aminoácido). Debido a la exposición probable de dicho motivo sobre la superficie del anticuerpo, es probable que este sitio esté glucosilado. Por lo tanto, resultaría ventajoso (si no participa en la unión de antígenos) evitar dicho sitio en los anticuerpos Composite Human Antibodies con el fin de evitar cualquier problema de fabricación en el futuro. La cadena Vk contiene, además, un sitio de glucosilación, aunque solo en el contexto de una región constante k humana, ya que el aminoácido final del dominio Vk es asparagina. El dominio constante de k humano se inicia con RA, mientras que el dominio constante de k humano se inicia con RT, formando de esta manera una señal de glucosilación. Por lo tanto, se seleccionaron las secuencias de los anticuerpos Composite Human Antibodies que eviten dicha asparagina.

El dominio ^k contiene, además una cisteína no emparejada en la posición 47. El modelado molecular sugiere que dicho residuo se encontrará enterrado dentro de la estructura y, por lo tanto, no se encontrará disponible para la unión de disulfuros; sin embargo, podría ser un residuo clave para mantener la conformación de RDC2 Vk y, por lo tanto, las secuencias para los anticuerpos Composite Human Antibodies se seleccionarán con y sin dicho residuo (incluyendo estas últimas la L humana de consenso en esta posición) con el fin de investigar sus efectos sobre la unión de antígenos.

Ejemplo 4

Expresión de anticuerpo quimérico.

Las regiones variables de 3-372 se transfirieron al sistema de vector de expresión de Antitope para la cadena pesada y cadena ligera kappa de IgG4(S241P). Se transfectaron las células NS0 mediante electroporación y se seleccionaron utilizando metotrexato (MTX). Se identificaron varias colonias resistentes a MTX mediante la utilización de un ELISA de captura de Fc/detección de cadena kappa y se expandieron las líneas celulares para la expresión de IgG continuamente a partir de placas de 96 pocillos mediante matraces T175 en medios que contenían concentraciones gradualmente crecientes de MTX y posteriormente se congelaron bajo nitrógeno líquido. En cada etapa, se cuantificó la expresión de IgG.

Se purificó IgG43-372 quimérico a partir de sobrenadantes de cultivo celular en una columna con proteína A Sefarosa y se cuantificó mediante DO280 nm utilizando un valor del coeficiente de extinción (CE (0,1 %)) de 1,55 basado en la secuencia esperada de aminoácidos para IgG4 quimérica. Se purificaron aproximadamente 90 |jg de anticuerpo y se analizó una muestra mediante SDS-PAGE reductor (figura 5). Se observaron bandas correspondientes a los tamaños esperados de las cadenas pesada y ligera sin pruebas de ninguna contaminación; sin embargo, era destacable que la cadena ligera quimérica aparentemente se encontraba glucosilada, tal como pone de manifiesto un peso molecular aparente mayor que el de la cadena ligera de ratón. La cadena pesada aparentemente migraba más lentamente de lo habitual, sugiriendo que también se encontraba N-glucosilada; sin embargo, se requería la digestión con glucosidasas para demostrar que efectivamente este es el caso.

La figura 5 ilustra un gel SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie de IgG4 3-372 quimérico purificado con proteína A. Se cargó 1 |jg de muestra en un gel Bis-Tris al 4-12 % NuPage (Invitrogen, n° de cat. NP0322BOX) y se hizo migrar a 200 V durante 30 min. Carriles 1 y 4: patrón de proteína preteñido (Fermentas PageRuler, n° de cat. SM1811). Carril 2: 1,0 jg de anticuerpo IgG43-372 quimérico. Carril 3: 1,0 jg de anticuerpo 3-372 murino.

Ejemplo 5

Unión de anticuerpo quimérico a CLEVER-1.

La unión del anticuerpo 3-372 quimérico derivado de Ns0 a CLEVER-1 se evaluó mediante ELISA de competición. Brevemente, se recubrió una placa Maxisorp de 96 pocillos Nunc Immulon (Fisher, n° de cat. DIS-971-030J) con CLEVER-1 a una concentración de 1 jg/m l en PBS (100 jl/pocillo) durante la noche a 4°C, con 1 hora adicional a 37°C la mañana siguiente. Los pocillos se lavaron con PBS/Tween-20 al 0,1 % y después se bloquearon durante 45 min a temperatura ambiente en Marvel al 1 %/BSA al 1 %/PBS.

La serie de dilución de tanto 3-372 quimérico como el anticuerpo 3-372 de ratón de referencia (5-0,078 jg/m l) se premezcló con una concentración constante (0,6 jg/m l) de anticuerpo 3-372 de ratón biotinilado en BSA al 2 %/PBS. La placa de ELISA bloqueada se lavó tal como anteriormente y se añadieron a cada pocillo 100 j l de los anticuerpos premezclados. La placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La unión de 3-372 de ratón biotinilado a CLEVER-1 se detectó utilizando estreptavidina-HRP (Sigma, n° de cat. S5512) y sustrato de solución única TMB (Invitrogen, n° de cat. 00-2023). La reacción se detuvo con HCl 3 M; se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas MRX TC II de Dynex Technologies y la curva de unión del anticuerpo 3-372 quimérico se comparó con la del anticuerpo 3-372 de ratón de referencia (figura 6).

La figura 6 muestra el perfil de unión de los anticuerpos de ratón y quimérico para CLEVER-1 en competición con el anticuerpo de ratón biotinilado. Las curvas son prácticamente idénticas, proporcionando valores de IC⁵⁰ de 0,89 jg/m l para el anticuerpo quimérico, comparado con 0,77 jg/m l para el anticuerpo de ratón. Lo anterior confirma que se han identificado las secuencias de región variable correctas y que se han expresado en el anticuerpo quimérico.

Ejemplo 7

Diseño de secuencias y variantes de región variable de Composite Human Antibody™.

Se produjeron modelos estructurales de regiones V del anticuerpo anti-CLEVER-1 murino utilizando Swiss PDB y se analizaron con el fin de identificar los aminoácidos "restrictores" importantes en las regiones V que probablemente eran esenciales para las propiedades de unión del anticuerpo. Se consideró que eran importantes los residuos contenidos dentro de las RDC (utilizando tanto la definición de Kabat como la de Chothia) además de varios residuos de marco. Tanto las secuencias de VH como de V^k del anticuerpo anti-CLEVER-1 contienen residuos de marco típicos y los motivos RDC 1, 2 y 3 son comparables e los de muchos anticuerpos murinos. Sin embargo, los presentes inventores identificaron un sitio potencial para la glucosilación ligada a N en la secuencia de VH (30N) y una cisteína no hibridada en la secuencia de Vk (47C).

A partir del análisis anteriormente proporcionado, se consideró que podían crearse secuencias humanas compuestas del anticuerpo anti-CLEVER-1 con un amplio abanico de latitudes fuera de las RDC, aunque con solo una lista corta de posibles residuos alternativos dentro de las secuencias de la RDC. Un análisis preliminar indicó que los segmentos de secuencia correspondientes de varios anticuerpos humanos podrían combinarse para crear RDC similares o idénticos a los observados en las secuencias murinas. Para regiones en el exterior o flanqueantes a las RDC, se identificó una amplia selección de segmentos de secuencia humanos como posibles componentes de las nuevas regiones V de los anticuerpos Composite Human Antibody™.

Basándose en el análisis anterior, se seleccionó un grupo preliminar grande de segmentos de secuencia que poría utilizarse para crear variantes de anticuerpo Composite Human Antibody™ anti-CLEVER-1 y se analizó mediante tecnología iTope™ para el análisis in silico de la unión de péptidos a los alelos del CMH de clase II humano (Perry et al., 2008) y utilizando la TCED™ (por sus siglas en inglés, base de datos de epítopos de células T) de epítopos conocidos de células T relacionados con secuencias de anticuerpo. Se descartaron los segmentos de secuencia identificados como ligantes de línea germinal no humanos significativos de la CMH de clase II humana o que mostraron correspondencias significativas contra los epítopos TCEDTM. Lo anterior resultó en un grupo reducido de segmentos, y se analizaron nuevamente combinaciones de ellos, tal como anteriormente, a fin de garantizar que las uniones entre segmentos no contenían epítopos potenciales de células T. A continuación, se combinaron segmentos seleccionados para producir secuencias de región V de cadena pesada y ligera para la síntesis. Para el anticuerpo anti-CLEVER-1, se diseñaron cuatro cadenas de VH: VH1, VH2, VH3 y VH4 [SEC ID n° 13, 15, 17 y 19 (secuencia de bases) y n° 14, 16, 18 y 20 (secuencia de aminoácidos, respectivamente) y cinco cadenas de V^k : VK1, VK2, VK3, VK4 y VK5 [SEC ID n° 21, 23, 25, 27 y 29 (secuencia de bases) y n° 22, 24, 26, 28 y 30 (secuencia de aminoácidos, respectivamente). Las RDC de cadena pesada VH1, VH2, VH3 y VH4 se extienden entre las bases 91 a 111, 154 a 201 y 298 a 333; y las RDC de cadena ligera VK1, VK2, VK3, VK4 y VK5 se extienden entre las bases 70 a 105, 151 a 171, y 268 a 294. Las definiciones de las RDC y la numeración de las secuencias de las proteínas son según Kabat. Cabe destacar que en tres de las cadenas VH se ha eliminado el sitio potencial de glucosilación ligada a N (VH2, VH3 y VH4) y en dos de las cadenas V^k se ha eliminado la cisteína no hibridada (VK4 y VK5).

Ejemplo 8

Construcción de variantes de anticuerpos Composite Human Antibody™.

Todas las variantes de genes de región VH y Vk de anticuerpo Composite Human Antibody™ para anti-CLEVER-1 se sintetizaron utilizando una serie de oligonucleótidos solapantes que se hibridaron, ligaron y amplificaron por PCR, proporcionando regiones V sintéticas de longitud completa. A continuación, las variantes ensambladas se clonaron directamente en el sistema de vector de expresión pANT de Antitope para las cadenas VH y las cadenas Vk de IgG4(S241P) (figura 7). La región VH se clonó utilizando los sitios MluI e HindlII, y la región Vk se clonó utilizando los sitios de restricción BssHIl y BamHI. Todos los constructos se confirmaron mediante secuenciación.

La figura 7 muestra el diagrama del vector pANT de Antitope. Ambos vectores VH y VK contienen fragmentos de ADN genómico que incorporan intrones y secuencias de poliA. La expresión de ambas cadenas está controlada por un promotor del CMV y la selección (del vector de cadena pesada) es mediante un minigén DHFR.

Ejemplo 9

Construcción, expresión y purificación de anticuerpos.

Todas las combinaciones de cadenas VH y V^k de IgG4(S241P) compuesto (es decir, un total de 20 emparejamientos) se transfectaron establemente en células NS0 mediante electroporación. Se seleccionaron las transfecciones estables utilizando metotrexato (MTX) 200 nM (Sigma, n° de cat. M8407); se sometieron a ensayo las colonias resistentes a metotrexato de cada constructo para los niveles de expresión de IgG utilizando un ELISA de IgG4 y se seleccionaron, expandieron y congelaron en nitrógeno líquido las líneas con mejor expresión. Se consiguió una transfección exitosa y selección de clones estables para todas las variantes excepto VH3/Vk3 y VH4/Vk3.

Las variantes compuestas del anticuerpo anti-CLEVER-1 se purificaron a partir de sobrenadantes de cultivo celular en una columna de proteína A-sefarosa (GE Healthcare, n° de cat. 110034-93), se intercambió el tampón por PBS y se cuantificaron mediante DO280 nm utilizando un coeficiente de extensión (CE (0,1 %)=1,55) basado en la secuencia de aminoácidos esperada. Se analizaron mediante SDS-PAGE reductor las variantes cabeza de serie de los anticuerpos Composite Human Antibody™. Se observaron las bandas correspondientes a los tamaños esperados de las cadenas VH y Vk sin encontrar pruebas de ninguna contaminación (figura 8).

La figura 8 ilustra un gel SDS-PAGE con tinción con azul de Coomassie de anticuerpos purificados con proteína A seleccionados. Se cargaron 2 |jg de cada muestra en un gel Bis-Tris al 4-12 % NuPage (Invitrogen, n° de cat. NP0322BOX) y se hicieron migrar a 200 V durante 35 min. El marcador de tamaño es patrón de proteína preteñido Fermentas PageRuler (n° de cat. SM1811).

Ejemplo 10

Unión de anticuerpos Composite Human Antibodies™ a CLEVER-1.

La unión de los anticuerpos 3-372 compuestos derivados de NS0 a CLEVER-1 se evaluó mediante ELISA de competición. La serie de dilución de tanto anticuerpo quimérico como anticuerpo 3-372 compuesto (5-0,078 jg/m l) se premezcló con una concentración constante (0,6 jg/m l) de anticuerpo 3-372 de ratón biotinilado. Se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en una placa Maxisorp Immulon de 96 pocillos (Fisher, n° de cat. DIS-971-030J) prerrecubierta con 1 jg/m l de CLEVER-1. La unión de 3-372 de ratón biotinilado a CLEVER-1 se detectó utilizando estreptavidina-HRP (Sigma, n° de cat. S5512) y sustrato de solución única TMB (Invitrogen, n° de cat. 00-2023). La reacción se detuvo con HCl 3 M, se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de placas MRX TC II de Dynex Technologies y se representaron gráficamente las curvas de unión. Se calcularon los valores de IC⁵⁰ para cada anticuerpo y estos se normalizaron respecto a la IC⁵⁰ de la quimera, que se incluyó en cada placa ELISA respectiva.

Las IC⁵⁰ obtenidas mostraron que algunos de los anticuerpos Composite Human Antibodies™ anti-CLEVER-1 presentan mejor unión a CLEVER-1 que el anticuerpo 3-372 quimérico. Los datos de competición para las variantes cabeza de serie se muestran en la figura 9.

Tabla 5. Caracterización de la unión de anticuerpos Composite Human Antibodies™ anti-CLEVER-1.

Se calculó la IC⁵⁰ relativa mediante la división del valor para el anticuerpo de ensayo por la de la quimera sometida a ensayo en la misma placa.

Ejemplo 11: unión de anticuerpos in vitro.

Se recogieron monocitos de sangre periférica humana de donantes sanos y se enriquecieron a partir de aproximadamente 9 ml de sangre periférica mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. A continuación, se sembraron en placas de 96 pocillos de baja adherencia a una densidad de 1,2x106 células/pocillo en medio IMDM complementado con suero AB humano al 1 %. Las células se trataron con 1 pg/ml o 10 pg/ml de anticuerpo 3-372 anti-CLEVER-1 (DSM n° ACC2520, depositado en el DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH el 21 de agosto de 2001) o VH3/VK5 (un anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado según la presente invención que reconoce dicho epítopo específico de CLEVER-1) durante 48 horas. Se determinó la expresión de HLA-DR de células positivas para CD14 tras 48 horas mediante la utilización de citometría de flujo LSR Fortessa. Se eliminaron las células muertas del análisis basándose en la señal positiva para el pigmento de viabilidad celular 7-AAD.

Se utilizaron IgG humanas como referencia.

La figura 10A muestra resultados de determinación de la expresión de HLA-DR de células positivas para CD14. La expresión de HLA-Dr en células positivas para CD14 se incrementó con el tratamiento con anticuerpo anti-CLEVER-1 humanizado VH3/VK5 en comparación con las IgG humanas de referencia.

No se observó diferencia de viabilidad celular entre tratamientos. De esta manera, puede concluirse que los anticuerpos con diana en CLEVER-1 no afectan a la supervivencia de los monocitos.

Ejemplo 12: mediciones de TNF-a.

Los monocitos de sangre periférica humana de donantes sanos se recogieron y se enriquecieron tal como se indica en el Ejemplo 11. Se dejó que los monocitos presentes en 3 ml de sangre tratada con tampón de lisis de eritrocitos se adhirieran durante la noche sobre placas de 6 pocillos, se lavaron una vez con PBS y se cultivaron durante 3 días con 10 pg/ml de anticuerpo 3-372 o a K-1 anti-CLEVER-1.

Se midió TNF-alfa soluble en el medio de cultivo utilizando un kit ELISA comercial de TNF-alfa (Invitrogen). Los resultados de la medición se muestran en la figura 10B. Se observó una secreción incrementada de TNF-alfa en muestras tratadas con anticuerpo anti-CLEVER-1 en comparación con muestras no tratadas o muestras de control tratadas con AK-1.

Ejemplo 13: modelos de cáncer singénico de ratón.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1 Anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab capaz de unirse al receptor 1 endotelial vascular y endotelial linfático común humano (CLEVER-1), en el que un anticuerpo o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab comprende:

   a) regiones constantes de cadena pesada y cadena ligera kappa de IgG4 humana, y

   b) la combinación de las regiones variables de cadenas pesada y ligera de IgG humana seleccionadas del grupo que consiste en las combinaciones siguientes:

   SEC ID n° 14 y SEC ID n° 22

   SEC ID n° 16 y SEC ID n° 22

   SEC ID n° 16 y SEC ID n° 24

   SEC ID n° 16 y SEC ID n° 26

   SEC ID n° 16 y SEC ID n° 28

   SEC ID n° 16 y SEC ID n° 30

   SEC ID n° 18 y SEC ID n° 22

   SEC ID n° 18 y SEC ID n° 24

   SEC ID n° 18 y SEC ID n° 28

   SEC ID n° 18 y SEC ID n° 30

   SEC ID n° 20 y SEC ID n° 24, y

   SEC ID n° 20 y SEC ID n° 30.
2. 2 Anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab según la reivindicación 1, en el que la combinación de secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de IgG humana se selecciona preferentemente del grupo que consiste en las combinaciones siguientes: SEC ID n° 16 y SEC ID n° 30, SEC ID n° 18 y SEC ID n° 30 y SEC ID n° 20 y SEC ID n° 30.
3. 3 Anticuerpo humanizado según la reivindicación 1 o 2, en el que la región constante de la cadena pesada de IgG4 humana comprende las mutaciones L248E y/o S241P según Kabat.
4. 4 Anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la utilización en el tratamiento de cáncer o infecciones crónicas.
5. 5. Anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab para la utilización en el tratamiento de cáncer según la reivindicación 4, caracterizado por la utilización en el tratamiento o la prevención de cáncer mediante reducción del tamaño de los tumores malignos, mediante la reducción del crecimiento de tumores malignos en un individuo, y/o mediante la inhibición de la transmigración de células de cáncer y la formación de metástasis.

   6 Vacuna que comprende como adyuvante un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

   7 Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo humanizado o fragmento Fv de cadena sencilla o fragmento Fab según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un excipiente apropiado.