JP6907229B2 - ヒト化抗ｃｌｅｖｅｒ−１抗体およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、特異的ＣＬＥＶＥＲ−１エピトープを認識することによりＣＬＥＶＥＲ−１タンパク質に特異的な薬剤およびその使用に関する。

本明細書において発明の背景を説明するために使用される刊行物およびその他の文献は、特に実施に関するさらなる詳細を提供する場合、参照として組み込まれる。

ＣＬＡＶＥＲ−１は、特許文献１に開示されるタンパク質、共通リンパ管内皮および血管内皮受容体−１である。それは、全身血管系およびリンパ管の両方におけるリンパ球の内皮への接着を介在する結合タンパク質である。ＣＬＥＶＥＲ−１とそのリンパ球基質との相互作用を阻害することにより、リンパ球の再循環およびリンパ球の遊走、リンパ球の組織への流入、および組織からの排出部位での炎症などの関連症状を同時に制御することが可能である。特許文献１は、さらにＣＬＥＶＥＲ−１が、単球および顆粒球などの他の種類のリンパ球のＨＥＣ−様管への結合を介在することを開示する。したがって、ＣＬＥＶＥＲ−１と悪性腫瘍細胞との相互作用をブロックすることにより、ＣＬＥＶＥＲ−１に結合する悪性細胞がリンパ管に取り込まれるのを防いで転移を制御し、その結果、リンパ節に悪性腫瘍が広がるのを防ぐことが可能となる。

ＣＬＥＶＥＲ−１、すなわち、スタビリン−１は、非特許文献１により総括されている。近年、ＣＬＥＶＥＲ−１によるＴｈ１リンパ球の抑制が非特許文献２により開示された。

特許文献２は、腫瘍、胎盤および妊婦の血液におけるマクロファージのサブタイプを開示している。マクロファージのそのサブタイプは、ＣＬＥＶＥＲ−１陽性マクロファージとして定義され、３型マクロファージと提案される。この細胞におけるＣＬＥＶＥＲ−１受容体をモジュレート、すなわち中和または刺激をそれぞれすることにより、個体における免疫系に影響を与えることができる。中和、すなわち受容体のダウンレギュレーションは、悪性腫瘍の大きさおよび／または悪性腫瘍の増殖を縮小する。刺激、すなわち受容体のアップレギュレーションは、胎児母体寛容の発生および妊娠合併症の予防に有用である。

腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭｓ）の機序は、非特許文献３にも開示されている。Ｍ２マクロファージは、ヒトがんにおいて優勢であり、腫瘍の増殖を刺激するが、これらの発がん促進マクロファージは、がん増殖を遅くするまたは停止することを目指して腫瘍増殖阻害マクロファージ（Ｍ１マクロファージあるいは炎症性マクロファージとも呼ばれる）へと変化され得る。しかしながら、ＴＡＭｓを標的とすることを目指す最近利用可能となった治療薬でがんを治療する試みは、望まない副作用を伴う。例えば、マクロファージ治療アプローチはすべてのマクロファージを標的とするため、全身毒性を示すかまたは逆説的に腫瘍増殖を促進する。

特に好ましいＣＬＥＶＥＲ−１アンタゴニストモノクローナル抗体３−２６６（ＤＳＭ ＡＣＣ２５１９）および３−３７２（ＤＳＭ ＡＣＣ２５２０）は、両方とも、２００１年８月２１日に特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約のもとＤＳＭＺ−ドイチェ・ザンルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハー、デー−３８１２４ ブラウンシュヴァイク マシェロデル ヴェク １ベー（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig）に寄託されており、特許文献１に開示されている。

国際公開第０３／０５７１３０号 国際公開第２０１０／１２２２１７号

Kzhyshkowska J. (2010), The Scientific world JOURNAL 10, 2039-2053. Palani et al. (2016), Journal of Immunology 196: 115-123. Noy R. and Pollard J. W., 「腫瘍関連マクロファージ：機序から治療まで（Tumour-Associated Macrophages: From Mechanisms to Therapy）」 Immunity 41, July 17, 2014, p.49-61.

本発明の１つの目的は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１の特定のエピトープに結合することのできる薬剤を提供することである。特に、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１の特定のエピトープに結合することのできる薬剤は、マクロファージを活性化し、その亜型をＭ２マクロファージからＭ１マクロファージに切り替えるために使用することができる。

さらに、本発明の１つの目的は、モノクローナル抗体３−３７２（ＤＳＭ ＡＣＣ２５２０、２００１年８月２１日にＤＳＭＺ−ドイチェ・ザンルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハーに寄託されている）と比較してより増加した結合活性でヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合するための、ヒト化抗体またはヒト化一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片を提供することである。

したがって、本発明は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープに結合することのできる薬剤であって、
該エピトープが不連続であり、配列：
ＰＦＴＶＬＶＰＳＶＳＳＦＳＳＲ（配列番号：１）、および
ＱＥＩＴＶＴＦＮＱＦＴＫ（配列番号：２）を含む
薬剤を提供する。

特に、本発明は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープに結合することのできる薬剤であって、
該エピトープが不連続であり、配列：
ＰＦＴＶＬＶＰＳＶＳＳＦＳＳＲ（配列番号：１）、および
ＱＥＩＴＶＴＦＮＱＦＴＫ（配列番号：２）を含み、
そして
ＴＳＧＭＧＩＧ（配列番号：７）、
ＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号：８）、
ＨＹＧＹＤＰＹＹＡＭＤＹ（配列番号：９）、
ＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号：１０）、
ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号：１１）、および
ＨＱＹＨＲＳＰＰＴ（配列番号：１２）
からなる群より選択される上記エピトープ配列に結合する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の配列を含む薬剤を提供する。

本発明によれば、本出願において定義されるＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープを認識するヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤は、上記エピトープに結合するのに十分な親和性を有する、抗体、一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片、ペプチドまたはあらゆる他のマクロ分子からなる群より選択される。

１つの実施態様において、本発明は、Ｍ２マクロファージをＭ１マクロファージに変化させることによる腫瘍または抗原誘発免疫抑制の除去における使用のための、個体におけるヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤を提供し、そこでは、該薬剤はヒトＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープに結合し、エピトープは不連続でありかつ配列：
ＰＦＴＶＬＶＰＳＶＳＳＦＳＳＲ（配列番号：１）、および
ＱＥＩＴＶＴＦＮＱＦＴＫ（配列番号：２）
を含む。

ＴＡＭｓ上のヒトＣＬＥＶＥＲ−１、好ましくはＣＬＥＶＥＲ−１上の特定のエピトープに結合することのできる本発明の薬剤は、悪性腫瘍の大きさを縮小することによる；個体における悪性腫瘍の増殖を減少することによる；および／またはがん細胞の移動および転移形成を阻害することによるがんの治療または予防における使用に適しており、そこでは、悪性腫瘍増殖を中心とする免疫抑制が、Ｍ２マクロファージをＭ１マクロファージに変化させることにより除去される。

ヒトＣＬＥＶＥＲ−１、好ましくはＣＬＥＶＥＲ−１の特定のエピトープ配列に結合することのできる本発明の薬剤は、個体における慢性感染症の治療における使用にも適しており、そこでは感染性抗原に対する免疫抑制がＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに変化させることにより除去される。

ヒトＣＬＥＶＥＲ−１、好ましくはＣＬＥＶＥＲ−１の特定のエピトープ配列に結合することのできる本発明の薬剤は、ワクチンのアジュバントとしての使用にも適しており、そこではワクチン抗原に対する免疫抑制がＭ２マクロファージをＭ１マクロファージに変化させることにより除去される。

別の実施態様において、本発明は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープに結合することができるヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片を提供し、そこでは、
エピトープは不連続でありかつ配列：
ＰＦＴＶＬＶＰＳＶＳＳＦＳＳＲ（配列番号：１）、および
ＱＥＩＴＶＴＦＮＱＦＴＫ（配列番号：２）
を含み、
かつ上記抗体または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片は、
ａ）ヒトＩｇＧ４重鎖およびカッパー軽鎖の定常領域、および
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の以下の配列の１つ以上
ｉ）重鎖
ＣＤＲ１：ＴＳＧＭＧＩＧ（配列番号：７）、および／または
ＣＤＲ２：ＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号：８）、および／または
ＣＤＲ３：ＨＹＧＹＤＰＹＹＡＭＤＹ（配列番号：９）；および
ii）軽鎖
ＣＤＲ１：ＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号：１０）、および／または
ＣＤＲ２：ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号：１１）、および／または
ＣＤＲ３：ＨＱＹＨＲＳＰＰＴ（配列番号：１２）
を含む。

本発明の別の目的はまた、本発明のヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤、またはヒト化抗体または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片および適切な賦形剤を含む医薬組成物を提供することである。

本発明はまた、腫瘍または抗原誘発性免疫抑制の除去における使用のための上記ヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤、またはヒト化抗体または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片および適切な賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

本発明の医薬組成物は、悪性腫瘍の大きさを縮小することによる；個体における悪性腫瘍の増殖を減少することによる；および／またはがん細胞の移動および転移形成を阻害することによるがんの治療または予防における使用に好適である。本発明の医薬組成物はまた、個体における慢性感染症の治療における使用またはワクチンのアジュバントとしての使用にも好適である。

抗体３−２６６および抗体ＡＫ ＦＵＭＭ ９−１１に対して得られた結果のヒートマップ表現を説明する。 抗体３−２６６および抗体ＡＫ ＦＵＭＭ ９−１１に対して得られた結果のヒートマップ表現を説明する。 抗体ＦＵ−ＨＩ−３−３７２に対して得られた結果のヒートマップ表現を説明する。 同定された結合モチーフのＣＬＥＶＥＲ−１位置のドメイン構成を概略的に説明する。 ハイブリドーマ３−３７２ ＲＴ−ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル分離を説明する。 タンパク質Ａ−精製キメラ３−３７２ ＩｇＧ４のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを説明した。 ＣＬＥＶＥＲ−１競合ＥＬＩＳＡを説明する。 アンチトープｐＡＮＴベクターダイアグラムを説明する。 選択されたタンパク質Ａ−精製抗体のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを説明する。 ＣＬＥＶＥＲ−１競合ＥＬＩＳＡを説明する。 ＣＤ１４陽性細胞からのＨＬＡ−ＤＲ発現の測定の結果を示す。 ＴＮＦ−アルファＥＬＩＳＡキット（インビトロゲン）を用い、培養培地から測定された可溶性ＴＮＦ−アルファの結果を示す。 ＣＬＥＶＥＲ−１に結合する抗体の投与後の同系Ｅ０７７１乳癌におけるＴＡＭ再分極を示す。 ＣＬＥＶＥＲ−１に結合する抗体の投与後のＥ０７７１同系乳癌由来のＴＡＭｓ上のＴＮＦ−アルファの分泌の増加を示す。 ９−１１および３−３７２抗体とのＣＬＥＶＥＲ−１ライゲーションが、ヒト末梢血中単球におけるｍＴＯＲおよびｃ−Ｊｕｎシグナル伝達に拮抗作用を促進するということを説明する。

用語
用語「ヒトＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープに結合することができる薬剤」は、抗体およびその断片、ペプチドなどであって、本出願において定義される特定のエピトープ配列に結合することができる薬剤を意味する。薬剤はまた、エピトープに結合する十分な親和性を有するあらゆる他のマクロ分子であってもよい。

用語「抗体またはその断片」は、個体においてＣＬＥＶＥＲ−１分子を結合する能力がある抗体またはその断片を包含する最も広い意味で使用される。特に、キメラ、ヒト化または霊長類化抗体、ならびに抗体断片および一本鎖抗体（例えばＦａｂ、Ｆｖ）を、それらが所望の生物学的な活性を発揮するかぎり、含むことが理解されるべきである。

用語、ヒト化抗体は、非−ヒト抗体の定常領域がその定常領域のヒト形態で完全に置換されており、かつ非−ヒト抗体の可変領域の少なくとも一部であって、標的構造に結合する各可変領域の外側の３つのアミノ酸配列のループを除くものが、ヒト抗体の対応する部分により完全にまたは部分的に置換されている任意の抗体を意味する。したがって、特に、医薬品に関する世界保健機関の国際一般名称（ＩＮＮ）または米国一般名（ＵＳＡＮ）に対する命名スキームによりサブステム−キシズ（xizu）−または−ズ（zu）−で命名された任意の抗体は、本出願においてヒト化抗体と称される。

用語、可変ドメインは、Ｆｖ領域とも称され、抗原に結合するための最も重要な領域である。具体的には、βストランドの可変ループ、各軽（Ｖ_L）および重（Ｖ_H）鎖上の３つが抗原への結合に関与している。これらのループは、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）とも呼ばれる。

用語、一本鎖Ｆｖ断片またはｓｃＦｖは、単一ポリペプチドにおいてリンカーによりＶ_LおよびＶ_Hドメインを連結することにより得られる断片を意味する。用語、ヒト化一本鎖Ｆｖ断片またはｓｃＦｖは、上述の用語、ヒト化抗体の定義と同様に、非−ヒト抗体由来の定常領域がその定常領域のヒト形態で完全に置換されており、かつ非−ヒト抗体由来の可変領域の少なくとも一部であって、標的構造に結合する各可変領域の外側の３つのアミノ酸配列のループを除くものが、ヒト抗体の対応する部分により完全にまたは部分的に置換されている任意の一本鎖Ｆｖ断片またはｓｃＦｖを意味する。

用語、Ｆａｂ断片は、抗原に結合する抗体上の領域をいう。用語、ヒト化Ｆａｂ断片はまた、上述の用語、ヒト化抗体の定義と同様に、非−ヒト抗体由来の定常領域がその定常領域のヒト形態で完全に置換されており、かつ非−ヒト抗体由来の可変領域の少なくとも一部であって、標的構造に結合する各可変領域の外側の３つのアミノ酸配列のループを除くものが、ヒト抗体の対応する部分により完全にまたは部分的に置換されている任意のＦａｂ断片をいう。

用語「ペプチド」は、本願において定義される相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の１つ以上のアミノ酸配列を含み、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１の少なくとも１つのエピトープに結合することのできる任意のペプチドをいう。

好ましい実施形態
本発明の一実施形態は、ＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープを認識するヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤であって、
該エピトープが不連続であり、かつアミノ酸配列：
ヒトＣＬＥＶＥＲ−１の
ＰＦＴＶＬＶＰＳＶＳＳＦＳＳＲ（配列番号：１）、および
ＱＥＩＴＶＴＦＮＱＦＴＫ（配列番号：２）を含み、
そして
ＴＳＧＭＧＩＧ（配列番号：７）、
ＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号：８）、
ＨＹＧＹＤＰＹＹＡＭＤＹ（配列番号：９）、
ＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号：１０）、
ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号：１１）、および
ＨＱＹＨＲＳＰＰＴ（配列番号：１２）
からなる群より選択される１つ以上の上記エピトープ配列に結合する相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列を含む薬剤に関する。

本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１の不連続エピトープはさらに、
ＡＴＱＴＧＲＶＦＬＱ（配列番号：３）、
ＤＳＬＲＤＧＲＬＩＹＬＦ（配列番号：４）、
ＳＫＧＲＩＬＴＭＡＮＱＶＬ（配列番号：５）、および
ＬＣＶＹＱＫＰＧＱＡＦＣＴＣＲ（配列番号：６）
からなる群より選択される１つ以上のアミノ酸配列を含む。

標的タンパク質、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１、すなわちヒトスタビリン−１の少なくとも一部が、配列番号３１で定義されている。ＣＬＥＶＥＲ−１上の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６のエピトープは、配列番号３１に定義される標的タンパク質ヒトＣＬＥＶＥＲ−１のアミノ酸４２０−４３４、４７３−４８４、３９０−３９９、５７６−５８７、６１５−６２７および３１３−３２７に対応する。

本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープに結合することのできる薬剤は、少なくとも２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つ、さらにより好ましくは５つ、そして最も好ましくは６つ全ての上記相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のアミノ酸配列を含む。

本発明によれば、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤は、抗体、一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片、ペプチドまたはマクロ分子からなる群より選択することができる。

本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤は、ヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片であり、その抗体またはヒト化一本鎖ＦｖまたはＦａｂ断片は、
ａ）ヒトＩｇＧ４重鎖およびカッパー軽鎖の定常領域、および
ｂ）相補性決定領域（ＣＤＲｓ）の以下の配列の１つ以上
ｉ）重鎖
ＣＤＲ１：ＴＳＧＭＧＩＧ（配列番号：７）、および／または
ＣＤＲ２：ＨＩＷＷＤＤＤＫＲＹＮＰＡＬＫＳ（配列番号：８）、および／または
ＣＤＲ３：ＨＹＧＹＤＰＹＹＡＭＤＹ（配列番号：９）；および
ii）軽鎖
ＣＤＲ１：ＴＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号：１０）、および／または
ＣＤＲ２：ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号：１１）、および／または
ＣＤＲ３：ＨＱＹＨＲＳＰＰＴ（配列番号：１２）
を含む。

上述したように、不連続エピトープ配列を認識するヒトＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープに結合することができるヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片。ヒトＣＬＥＶＥＲ−１の不連続エピトープは、少なくとも配列番号１および配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１の不連続エピトープはさらに、配列番号３、配列番号４、配列番号５、および配列番号６からなる群より選択される１つ以上の配列を含む。

上記の本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つ、さらにより好ましくは５つ、そして最も好ましくは６つ全ての上記ＣＤＲｓが、ヒト化抗体または一本鎖Ｆｖ若しくはＦａｂ断片に含まれる。

本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化抗体または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片のヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列は、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群、好ましくは配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択される。本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片のヒトＩｇＧ軽鎖可変領域配列は、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０からなる群より選択され、好ましくは配列番号３０である。

本発明のヒト化抗体または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片の多くの実施形態においては、ヒトＩｇＧ重鎖およびカッパー軽鎖の定常領域自体である。ヒトＩｇＧ４定常領域が好ましい。多くの好ましい実施形態は、突然変異Ｌ２４８Ｅおよび／または好ましくはおよびＳ２４１Ｐを有するヒトＩｇＧ４重鎖およびＩｇＧ４カッパー軽鎖を含む。

本発明のいくつかの実施形態において、ヒト化抗体または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１に、モノクローナル抗体３−３７２（ＤＳＭ ＡＣＣ２５２０、２００１年８月２１日にＤＳＭＺ−ドイチェ・ザンルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハーに寄託されている）のＩＣ５０と比較して、相対ＩＣ５０＜１．０、好ましくは＜０．８、より好ましくは＜０．６および最も好ましくは＜０．５で結合することができる。

本発明の１つの実施形態によれば、ヒトＩｇＧ重および軽鎖可変領域の組み合わせは、モノクローナル抗体３−３７２（ＤＳＭ ＡＣＣ２５２０、２００１年８月２１日にＤＳＭＺ−ドイチェ・ザンルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハーに寄託されている）のＩＣ５０と比較して、相対ＩＣ５０＜１．０を有するヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる表５に示される組み合わせから選択される。

本発明の医薬組成物は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤、または上述のヒト化抗体、若しくは一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片、ならびに適切な賦形剤を含む。

腫瘍促進マクロファージ（Ｍ２）の炎症性マクロファージ（Ｍ１）への変化
ヒトＣＬＥＶＥＲ−１に、特に本明細書において定義されたＣＬＥＶＥＲ−１上の具体的なエピトープ配列に結合できる薬剤は、マクロファージを活性化し、Ｍ２マクロファージからＭ１マクロファージにそれらの亜型を転換するために使用することができる。特に、ＴＡＭｓ上のＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤は、腫瘍促進マクロファージ（Ｍ２）の炎症性マクロファージ（Ｍ１）への変化を達成させるために使用することができる。この変化により、Ｔ−細胞活性化が増加し、最終的には、例えばがん起源の免疫抑制の除去につながる。より正確には、ＣＬＥＶＥＲ−１分子上の特異的配列に結合することができる薬剤は、Ｍ２マクロファージをＭ１マクロファージに変化させることにより、免疫抑制を除去するために使用することができるということが見出された。結論として、本知見は、個体における免疫系に影響を与える方法を提供し、特にがんを治療することまたは転移を予防することにおいて有用であるが、このアプローチに限定されるものではない。

マクロファージは、２つの異なる亜型：Ｍ１およびＭ２マクロファージに分けることができる。Ｍ１マクロファージは、古典的な炎症性マクロファージであり、大量の炎症性サイトカインおよび共刺激分子を産生し、Ｔ−細胞応答の活性化に非常に効率的である。Ｍ２マクロファージは、対照的に、免疫抑制細胞であり、抗炎症性サイトカインを合成し、制御性Ｔ−細胞を誘導し、したがって、抗原誘導Ｔ細胞活性化を大いに弱める。腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭｓ）は、腫瘍環境においてそれらがＭ２マクロファージ（腫瘍促進マクロファージ）に成熟し、抗腫瘍免疫応答を抑制し、がん増殖における重要な段階である脈管新生スイッチを媒介するため有害であるとみなされている。Ｍ２マクロファージは、Ｍ１マクロファージ（炎症性マクロファージ）に変化されることができ、そのようなＭ２からＭ１への亜型の変換は、腫瘍拒絶を直接または間接に引き起こし得る。

本文脈において、表現「Ｍ１マクロファージ」または「炎症性マクロファージ」は、マクロファージ／単球ＴＮＦ−アルファ（ＴＮＦ−α）分泌またはＨＬＡ−ＤＲ発現の測定値の増加により特徴付けられるマクロファージをいう。Ｍ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変化は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤投与前に測定された対照値、または同じ患者において異なる時点で行われた１つ以上の先の測定の値と比較して、単球ＴＮＦ−アルファ分泌およびＨＬＡ−ＤＲ発現も増加させるであろう。これらのマーカーの値は、一個体から別の個体まで変化し得、例えばインターフェロン−ガンマなどのサイトカインやＬＰＳ活性化は、Ｍ２マクロファージによるＴＮＦ−アルファ発現を増加させ得るので、単球ＴＮＦ−アルファ分泌およびＨＬＡ−ＤＲ発現の測定値を同じ患者の値と比較することは重要である。

驚くべきことに、本願において定義されるヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤、例えば抗体、そのフラグメント、ペプチドまたはマクロ分子にＭ２マクロファージを接触させることにより、Ｍ２マクロファージを活性化させ、Ｍ１マクロファージに変化させることができるということ見出した。特に、悪性腫瘍に関連したＭ２マクロファージは、ＴＡＭｓ上のヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤にＭ２マクロファージを接触させることにより、Ｍ１マクロファージに変化または再分極することができるということを見出した。両亜型は、同時に存在し、その亜型の両方が腫瘍中に見られ得る。

抗原またはそのフラグメント、ペプチドまたはマクロ分子などのヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤は、上記マクロファージ亜型の変化または再分極を達成するためにヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合される。ＣＬＥＶＥＲ−１タンパク質に特異的な薬剤は、本願において定義される特定のＣＬＥＶＥＲ−１エピトープ配列を認識することが同定された。

ＴＡＭｓ上のＣＬＥＶＥＲ−１の２つ以上の上記エピトープ配列への特異的結合は、マクロファージ亜型の所望の変化を達成するために特定のエピトープを標的とすることができるため、有害な副作用を伴わない新規ながんの治療方法、または転移の予防方法を提供する。結果として、本明細書に記載された知見は、腫瘍促進マクロファージの増加した量を伴うあらゆる種類の悪性腫瘍または個体が免疫抑制の優位性を示す慢性炎症などの他の病状の治療または予防において特に有用である。その結果として、がんの治療方法または転移の予防方法は、上述の、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１に、好ましくはＣＬＥＶＥＲ−１分子の特定のエピトープに結合することができる薬剤を個体に投与することを含む。この方法は、腫瘍の大きさを縮小することによる、および／または；個体における腫瘍の増殖を減少することによる；および／またはがん細胞の移動および転移形成を阻害することによるがんの治療または予防を含む。したがって、良性もしくは悪性腫瘍または悪性腫瘍の転移、例えば皮膚がんおよび結腸癌などを治療することができる。また、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫も治療することができる。とりわけ、黒色腫およびリンパ腫が、動物モデルに基づき治療に非常に良好に応答することが期待される。

マクロファージはまた、腫瘍の増殖または退行に影響を及ぼす以外に、炎症および感染の消散のあいだに重要な役割を有する。感染において、Ｍ１からＭ２マクロファージへの切り替えが起こり、エフェクター免疫を無効にする抑制環境の発生につながる。その結果、マクロファージ亜型を変化させる本明細書に記載される知見は、感染性抗原に対する免疫抑制の除去のための慢性感染の治療においても有用である。本発明はまた、本願に定義するＣＬＥＶＥＲ−１に、好ましくはＣＬＥＶＥＲ−１分子上の２つ以上の特異的エピトープ配列に結合することのできる薬剤を個体に投与することを含む慢性感染症を治療する方法であって、該薬剤がＭ２からＭ１にマクロファージの亜型を切り替えるためにそれらを活性化し得る方法に関する。

さらに、個体におけるマクロファージおよび単球上のＣＬＥＶＥＲ−１分子に結合することのできる薬剤は、ワクチンのアジュバントとして使用することができる。該薬剤は、マクロファージの再分極を実現し、したがって、ワクチン抗原に対する免疫抑制を除去または少なくとも減少させる。任意の抗原誘導性ワクチン接種は、宿主またはワクチン接種部位が、免疫抑制性エレメントから一時的に除去され得る場合に有益である。

Ｍ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変化は、ヒト血液試料から単球ＴＮＦ−アルファ分泌を測定することにより検証することができる。結果として、ＴＮＦ−アルファの分泌の増加は、個体における治療応答のモニタリングのためのマーカーとして使用することができる。ＴＮＦ−アルファ分泌は、患者から採取した血液から富化された末梢血単球から測定され得る。測定されたＴＮＦ−アルファのレベルは、ＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤を患者に投与することを含む治療への患者の応答に対するマーカーとして使用することができ、そのレベルは、該薬剤を患者に投与する前に同じ患者から測定された対照レベルと、または同じ患者における異なる時点で行われた１つ以上の先の測定値と比較される。

Ｍ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変化の発生をモニタリングすることによる抗−ＣＬＥＶＥＲ−１療法の有効性の評価方法は、ＣＬＥＶＥＲ−１に、好ましくはＣＬＥＶＥＲ−１上の１つ、２つ以上の特異的エピトープ配列に結合することのできる薬剤が患者に投与された場合、
（ａ）該患者から採取した血液試料から末梢血単球（ＰＢＬｓ）を得る工程、
（ｂ）該ＰＢＬｓのＴＮＦ−α分泌を測定する工程、および／または
（ｃ）ＣＤ１４陽性ＰＢＬｓ上のＨＬＡ−ＤＲ発現を測定する工程、および
（ｅ）工程（ｂ）および（ｃ）で測定されるＴＮＦ−α分泌および／またはＨＬＡ−ＤＲ発現の値を、抗ＣＬＥＶＥＲ−１治療の有効性を評価するために対照値と比較する工程であって、対照値は、ＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤を患者に投与する前に測定された値、または同じ患者における異なる時点で行われた１つ以上の先の測定の値であり、ＴＮＦ−アルファ分泌またはＨＬＡ−ＤＲ発現の増加はＭ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変化を示す工程
を含む。

患者から採取した血液試料から得られる末梢血単球からのＴＮＦ−アルファ分泌の測定は、一般的な公知の方法で行うことができ、例えば、市販のＴＮＦ−アルファＥＬＩＳＡキットを用いて行うことができる。ＣＤ１４陽性単球上のＨＬＡ−ＤＲ発現も、フローサイトメトリーによる公知の方法を用いてモニターすることができる。

Ｍ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変化の発生は、単球ＴＮＦ−アルファ分泌の測定レベルを、患者におけるＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤の投与前に特定された対照値または同じ患者における異なる時点で行われた１つ以上の先の測定の値と比較することによりモニターすることができる。例えば、先の測定の結果または対照と比較した単球ＴＮＦ−アルファ分泌のレベルの減少は、Ｍ２マクロファージの高い発現を示すために使用され得、一方、先の測定の結果または対照と比較したＴＮＦ−アルファのレベルの増加は、Ｍ２マクロファージのより低い発現を伴うＭ１マクロファージのより多い発現を示すために使用され、抗−ＣＬＥＶＥＲ−１治療の有効性を示すために使用することもできる。ＴＮＦ−アルファのレベルの増加は、Ｍ２マクロファージのより低い発現を伴うＭ１マクロファージのより多くの発現を示し、言い換えれば、それは該療法に対する応答性を特徴付ける。ＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤は、Ｍ２マクロファージの少なくとも一部を活性化し、Ｍ１マクロファージに再分極し、該薬剤の投与後、両マクロファージ亜型が存在するが、Ｍ１マクロファージの発現の増加が、該薬剤の投与前の状態と比較して観察され得る。典型的には、測定されるＴＮＦ−アルファ分泌の対照値と比較して少なくとも２倍の増加は、Ｍ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変化を示し、したがって治療に対する患者の応答性を示す。

治療に応答する疾患
免疫の活性化と抑制のバランスは、ヒト（または動物）に生まれた、またはヒト（または動物）に入る外来物質に対する戦いにおいて、ヒト（または動物）の恒常性に非常に重要である。Ｐａｌａｎｉら（２０１６）の例は、この生理学的な例であり、どうして局所免疫抑制が、母体の免疫防御により支配される環境において胚の幸せに重要であるかを示す。いくつかの病原体（例えば、結核）が宿主免疫系に対して同様の隠匿機序を利用することを学んでおり、慢性的に感染した部位（肝炎）確立する可能性があるので、慢性感染症においても同じことが起こり得る。この局所免疫抑制を取り除くことは、宿主がこれらの耐性病原体に対する予防接種を改善するためにこれらの感染と戦うのを助けることができる。

腫瘍は、その上この免疫抑制をそれらの利益に適応させる。腫瘍の大きさを縮小することによる；個体における腫瘍の増殖を減少することによる；および／またはがん細胞の移動および転移形成を阻害することによる、がんを治療または予防するための本発明の方法は、すべての形態のがんに適用可能である。したがって、任意の良性または悪性腫瘍または悪性腫瘍の転移、例えば皮膚がんおよび結腸癌などを治療することができる。また、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫も治療することができる。とりわけ、黒色腫およびリンパ腫が、動物モデルに基づき治療に非常に良好に応答することが期待される。

本発明のＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤、またはヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片または本発明の医薬組成物は、線維肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、平滑筋肉腫および横紋筋肉腫などのすべての種類の肉腫、中皮腫、髄膜腫、白血病、リンパ腫、ならびに扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、乳糖癌、嚢胞腺癌、気管支癌、黒色腫、腎細胞癌、肝細胞癌、移行上皮癌、絨毛腫、セミノーマおよび胎生期癌などのすべての種類の癌腫の治療または予防に有用であると考えられる。

本発明のＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤、またはヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片または本発明の医薬組成物は、該薬剤が本願に定義されるヒトＣＬＥＶＥＲ−１のエピトープ配列に結合し、Ｍ２マクロファージをＭ１マクロファージに変化させることによる腫瘍または抗原誘発性免疫抑制の除去における使用に適している。

本発明のＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤、またはヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片または本発明の医薬組成物は、腫瘍の大きさを縮小することによる；個体における腫瘍の増殖を減少することによる；および／またはがん細胞の移動および転移形成を阻害することにより、悪性腫瘍の増殖まわりの免疫抑制がＭ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変化により除去される、がんの治療または予防における使用に適している。

本発明のＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤、またはヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片または本発明の医薬組成物はまた、感染性抗原に対する免疫抑制がＭ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変化により除去される、個体における慢性感染症の治療における使用に適している。

本発明のＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる薬剤、またはヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片または本発明の医薬組成物はまた、ワクチン抗原に対する免疫抑制がＭ２マクロファージのＭ１マクロファージへの変化により除去される、ワクチンのアジュバントとしての使用に適している。

Ｍ２マクロファージをＭ１マクロファージへ変化させる方法は、それを必要とする対象にＣＬＥＶＥＲ−１に結合することのできる、好ましくは本願において定義されるＣＬＥＶＥＲ−１分子上の特定の配列に結合することのできる薬剤を投与することを含む。該方法は、個体におけるがんの治療または転移の予防、または個体における慢性感染症の治療において使用することができる。治療応答は、ＰＢＬｓのＴＮＦ−α分泌および／または本願に定義されるＣＤ１４陽性ＰＢＬｓ上のＨＬＡ−ＤＲ発現を測定することにより検証してもよい。

投与経路、製剤および必要用量
本発明において使用されるべき医薬組成物は、それらの意図する目的を達成するあらゆる手段により投与することができる。例えば、投与は、静脈内、吸入、腫瘍内または皮下とすることができる。薬学的に活性な化合物に加え、化合物の医薬製剤は、好ましくは、薬学的に使用することができる製剤への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および助剤などの適切な薬学的に許容され得る担体を含む。

選択される用量は、治療される疾患に関して治療的に有効なものとすべきである。したがって、免疫抑制は、本質的に治療の求める結果を危険にさらす影響を受けずに疾患を治療するのに充分である。がんを治療または予防する場合、用量は、腫瘍の大きさを縮小する、悪性腫瘍の増殖を減少する、および／またはがん細胞の移動および転移形成を阻害するのに十分なものとすべきである。用量は、投与される薬剤の代謝回転に依存するが、通常、これらの治療は、２〜４週おきに１〜５ｍｇ／ｋｇのレジメとなる。

以下の実験項は、実施例を提供することにより本発明を説明する。

実施例１〜１０は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１の不連続エピトープマッピングおよびＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術を用いる３−３７２マウスモノクローナル抗体（２００１年８月２１日にＤＳＭＺ−ドイチェ・ザンルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハーに寄託されたＤＳＭ ＡＣＣ２５２０）からのヒト化抗体の産生を説明する。抗−ＣＬＥＶＥＲ−１抗体の免疫活性化を促進する能力が実施例１１〜１４に説明されている。

実施例１は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１を標的とする抗体の全不連続エピトープマッピングを説明する。

実施例２〜６は、抗−Ｃｌｅｖｅｒ１抗体クローン３−３７２の重鎖および軽鎖Ｖ領域（ＶＨおよびＶＫ）配列の決定、および３−３７２可変領域およびヒトＩｇＧ４の重鎖およびカッパー軽鎖定常領域を含むキメラ抗体の産生を説明する。ｍＲＮＡは、ハイブリドーマクローン３−３７２から抽出され、逆転写され、ＰＣＲ増幅され、そして抗体特異的転写物をクローン化した。抗体の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を決定し、配列データの分析を、アンチトープ（Antitope’s）専用Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）技術を用いるヒト化のために行った。

実施例２〜６は、３−３７２マウス抗−Ｃｌｅｖｅｒ１抗体由来の可変領域がクローン化され配列決定されたということを証明する。可変領域遺伝子はヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）重鎖およびカッパー軽鎖定常領域と組み合わされ、ＮＳ０細胞で発現され、キメラ抗−Ｃｌｅｖｅｒ１抗体を産生した。ＮＳ０由来キメラ抗体からの競合ＥＬＩＳＡアッセイを、キメラ抗体のＣｌｅｖｅｒ−１に対する結合効率が原マウス抗体のものと同様であることを証明するために使用した。

実施例７〜１０は、発現され、ヒトＣｌｅｖｅｒ−１への結合について試験された抗−ＣＬＥＶＥＲ−１ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）のデザインを説明する。構造および抗−ＣＬＥＶＥＲ−１の結合に関与する重要な残基は、「抑制残基マップ」を作成するために、構造および相同性モデリングにより決定した。抑制残基マップは、非関連ヒト抗体配列を含むデータベースからヒトＶ領域配列のソースセグメントのテンプレートとして使用した。各選択された配列セグメント、ならびにセグメント間の接合は、インシリコ（ｉＴｏｐｅ（商標）およびＴＣＥＤ（商標））分析を用い、潜在的Ｔ細胞エピトープの存在について試験した。この方法を用い、すべてのＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）配列変異体をＴ細胞エピトープを回避するためにデザインした。Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）Ｖ領域遺伝子は、選択されたヒト配列セグメントの組み合わせをコードする合成オリゴヌクレオチドを用いて作製した。これらは、その後ヒトＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）重鎖およびカッパー軽鎖定常領域を含むベクターにクローン化し、抗体を産生し、元の参照マウスモノクローナル抗体と比較した競合ＥＬＩＳＡにより標的抗原への結合について試験した。

実施例７〜１０は、４つのＶＨおよび５つのＶｋのＨおよび５つのＶｋＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）Ｖ領域の構築を証明する。コンポジット重鎖および軽鎖の組み合わせがＮＳ０細胞で発現され、精製され、そして競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＣＬＥＶＥＲ−１への結合について試験された。その結果は、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）の多くのＣＬＥＶＥＲ−１への結合効率が少なくともキメラ参照抗体のものと同等に良好であり、いくつかは際立ってすぐれていたということを証明した。潜在的グリコシル化部位および不対システインが存在しないことに基づき、発現と結合効率データのセットを作製し、３つの潜在的リードが、以下、ＶＨ２／ＶＫ５、ＶＨ３／ＶＫ５およびＶＨ４／ＶＫ５として指定された。

実施例１１〜１２は、ヒト末梢血単球上に結合し、ヒト末梢血単球上のＴＮＦ−アルファ分泌を活性化するする抗−ＣＬＥＶＥＲ−１抗体を説明する。実施例１３は、マウス同系がんモデルにおける腫瘍随伴マクロファージ上の抗−ＣＬＥＶＥＲ−１抗体の作用機序を説明する。

実施例１４は、９−１１および３−３７２抗体によるＣＬＥＶＥＲ−１ライゲーションが、ヒト末梢血単球のｍＴＯＲおよびｃ−Ｊｕｎシグナル伝達に逆の作用を促進する。

実施例１
ヒトＣＬＥＶＥＲ−１の全不連続エピトープマッピング
４つの抗体について暫定的な不連続エピトープをＰｅｐｓｃａｎ分析を用いて確立した。抗体ＦＡＲ０２ ＶＨ３／ＶＫ５およびＦＵ−ＨＩ−３−３７２は同一の不連続エピトープを標的とし、抗体３−２６６およびＡＫ ＦＵＭＭ ９−１１は、他の異なるエピトープを標的とする。試験は、Ｐｅｐｓｃａｎ Ｐｒｅｓｔｏ ＢＶ（ＺＵＩＤＥＲＳＬＵＩＳＷＥＧ２、８２４３ＲＣ レイスタッド、オランダ）で行った。

抗体３−２６６、ＦＡＲ０２ ＶＨ３／ＶＫ５、ＦＵ−ＨＩ−３−３７２およびＡＫ ＦＵＭＭ ９−１１は、ファロン ファーマシューティカル オサケ ユキチュアより提供された。

標的タンパク質ヒトＣＬＥＶＥＲ−１、すなわちヒトスタビリン−１は、配列番号３１により定義された。ジスルフィド架橋が次の残基（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＳＴＡＢ１＿ＨＵＭＡＮ番号付）を接続する。

ＣＬＩＰＳ技術
用いられたＣＬＩＰＳ技術は、ペプチドを定義された三次元構造に構造的に固定した。これは、まさに最も複雑な結合部位の機能的な模倣体を生じた。ＣＬＩＰＳ技術は、ペプチドライブラリーを、一重、二重、三重ループ構造ならびにシートおよびへリックス様ホールドに形作るために現在ルーチンに使用される。ＣＬＩＰＳ反応は、ＣＬＩＰＳスキャフォールドのブロモ基とシステインのチオール側鎖との間で起こる。反応は、穏やかな条件下で速く、特異的である。この上品な化学を用い、天然のタンパク質の配列をＣＬＩＰＳ構築物中に構造の範囲で形質転換した（Timmerman et al., J. Mol. Recogniit. 2007; 20: 283-29）。

ＣＬＩＰＳライブラリースクリーニングは、標的タンパク質の１０，０００までの重複ペプチド構築物のライブラリーへの変換とともに、コンビナトリアルマトリックスデザインを用いて開始する。固体担体上で、線状ペプチドのマトリックスを合成し、その後、空間定義されたＣＬＩＰＳ構築物に形作られる。正しいコンフォメーションにおける不連続エピトープの両部分を表す構築物は、高い親和性で抗体に結合し、検出され、定量化される。不完全なエピトープを表す構築物は、低い親和性で抗体に結合し、エピトープを含まない構築物は、全く結合しない。親和性の情報は、エピトープの配列とコンフォメーションとを詳細に定義するために反復スクリーニングにおいて使用される。不連続コンフォメーションエピトープを含む標的タンパク質は、マトリックスライブラリーに変換される。コンビナトリアルペプチドは、独自のミニカードで合成され、空間的に定義されたＣＬＩＰＳ構築物に化学的に変換される。

ヒートマップ分析
ヒートマップは、二次元マップ内の変数によって取られた値が色として表されるデータのグラフ表示である。

二重ループＣＬＩＰＳペプチドに関し、そのような二方向マップを第一ループおよび第二ループの独立した配列から誘導することができる。例えば、１６ＣＬＩＰＳペプチドの配列は、例えば、ループ１における例えば４つの独自のサブ配列および、例えば、ループ２における４つの独自のサブ配列の効率的な突然変異である。したがって、観測されるＥＬＩＳＡデータは、４×４マトリックスにプロットすることができ、各Ｘ座標は第１ループの配列に対応し、各Ｙ座標は第２ループの配列に対応する。

視覚化をさらに容易にするために、ＥＬＩＳＡの値を連続グラジエントから色で置き換えることができる。例えば、極端に低い値は、緑に着色し、極端に高い値は赤に着色し、平均的な値は黒に着色する。

ペプチドの合成
標的分子のエピトープを再構築するため、ペプチドのライブラリーを合成した。アミノ機能化ポリプロピレン支持体は、専用の親水性ポリマー形成で接合し、Ｎ−ヒドロキシベンゾチアゾール（ＨＯＢｔ）とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いてｔ−ブチルオキシカルボニル−ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）と反応させ、その後、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を用いてＢｏｃ−基を切断することにより得た。ＪＡＮＵＳ液体取扱いステーション（パーキンエルマー）を慣習的に改変することによりアミノ機能化固体支持体上でペプチドを合成するために、標準的なＦｍｏｃ−ペプチド合成を用いた。

構造的模倣体の合成は、Ｐｅｐｓｃａｎ独自の足場上に化学的に結合されたペプチド（Chemically Linked Peptides on Scaffolds）（ＣＬＩＰＳ）技術を用いて行った。ＣＬＩＰＳ技術は、単一のループ、二重ループ、三重ループ、シート状折り畳み、へリックス状折り畳みおよびそれらの組み合わせにペプチドを構造化することができる。ＣＬＩＰＳテンプレートは、システイン残基に結合される。ペプチド内の複数のシステインの側鎖が１つまたは２つのＣＬＩＰＳテンプレートに結合される。例えば、Ｐ２ ＣＬＩＰＳ（２，６−ビス（ブロモメチル）ピリジン）の０．５ｍＭ溶液を炭酸水素アンモニウム（２０ｍＭ、ｐＨ７．８）／アセトニトリル（１：３（ｖ／ｖ））に溶解する。この溶液をペプチドアレイ上に添加する。ＣＬＩＰＳテンプレートは、ペプチド−アレイ（３μｌのウェルを有する４５５ウェルプレート）の固相結合ペプチド中に存在する２つのシステインの側鎖に結合する。ペプチドアレイを溶液中で完全に覆って３０〜６０分間穏やかに振とうする。最後に、ペプチドアレイを過剰のＨ₂Ｏで十分に洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）中の１％ＳＤＳ／０．１％β−メルカプトエタノールを含有する破壊緩衝液中で７０℃で３０分間超音波処理し、その後、Ｈ₂Ｏ中でさらに４５分間超音波処理する。Ｔ３ＣＬＩＰＳ担持ペプチドは、同様の、しかし３つのシステインで作製された。

ＥＩＬＳＡスクリーニング
各合成ペプチドへの抗体の結合をＰＥＰＳＣＡＮ−によるＥＬＩＳＡにおいて試験した。ペプチドアレイを一次抗体溶液でインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチドアレイを、適切な抗体ペルオキシダーゼ共役体（ＳＢＡ；表１）の１／１０００希釈液で２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’−アジノ−ジ−３−エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２０μｌ／ｍｌの３％Ｈ₂Ｏ₂を加えた。１時間後、発色を測定した。発色は、電荷結合素子（ＣＣＤ）−カメラおよび画像加工システムを用いて定量化した。

Langedijk et al. (2011)。リード同定および相互作用部位マッピングのためのHelicalペプチドアレイ、Analytical Biochemistry 417: 149-155

ペプチドの設計
ペプチドの様々なセットを以下の設計により合成した。いくつかのセットでは、ペプチドは順不同に合成したことに留意。以下、実際のペプチドオーダーを示す。

スクリーニングの詳細
抗体結合は、ＥＬＩＳＡ緩衝液における、抗体の濃度、量、競合タンパク質の性質に依存する。また、プレコート条件（実験試料とのインキュベーション前のペプチドアレイの特定の処理）も結合に影響する。これらの詳細を表２にまとめる。Ｐｅｐｓｃａｎ緩衝液とＰｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＳＱ）について、数字は競合タンパク質の相対的な量を示す（ウマ血清およびオボアルブミンの組み合わせ）。

結果
抗体３−２６６
高ストリンジェントな条件下で試験した場合、抗体３−２６６は、アレイ上に存在する任意のいずれのペプチドにも結合しなかった。低ストリンジェントな条件下で試験した場合、抗体は、全てのセットからペプチドを結合した。単純なエピトープ模倣体により得られた結果は、配列₁₀₃₀ＱＷＬＫＳＡＧＩＴＬＰＡＤＲＲ₁₀₄₄がエピトープの主要な部分を表していることを示唆する。コンビナトリアルエピトープ模倣体（図１）により得られた結果は、抗体がさらに配列₈₅₇ＬＨＡＲＣＶＳＱＥＧＶＡＲＣＲ₈₇₁を認識することを示唆する。さらに、配列₄₃₅ＴＭＮＡＳＬＡＱＱＬＣＲＱＨＩ₄₅₀を有するペプチドに関し、弱く一貫したシグナルが記録された。図１ａは、セット８（不連続エピトープ模倣体）上の抗体３−２６６について得られた結果のヒートマップ表示を説明する。平均シグナルは暗くプロットされ、極端に高いシグナルは明るくプロットされる。四角で囲まれた領域が拡大されている。

抗体ＡＫ ＦＵＭＭ ９−１１
高ストリンジェントな条件下で試験した場合、抗体ＡＫ ＦＵＭＭ ９−１１は、すべてのセットからペプチドを結合した。単純なエピトープ模倣体により得られた結果は、配列₈₈₅ＱＷＬＫＳＡＧＩＴＬＰＡＤＲＲ₈₉₆がエピトープの主要な部分を表していることを示唆する。コンビナトリアルエピトープ模倣体により得られた結果は、抗体がさらに配列₁₆₆ＬＨＡＲＣＶＳＱＥＧＶＡＲＣＲ₁₈₀を含むコンビナトリアルエピトープ模倣体を認識することを示唆する（図１ｂ）。図１ｂは、セット８（不連続エピトープ模倣体）上の抗体ＡＫ ＦＵＭＭ ９−１１について得られた結果のヒートマップ表示を説明する。平均シグナルは暗くプロットされ、極端に高いシグナルは明るくプロットされる。四角で囲まれた領域が拡大されている。

抗体ＦＡＲ０２ ＶＨ３／ＶＫ５およびＦＵ−ＨＩ：３−３７２
高ストリンジェントな条件下で試験した場合、抗体ＦＡＲ０２ ＶＨ３／ｖｋ５およびＦＵ−ＨＩ−３−３７２は、アレイ上に存在する任意のいずれのペプチドにも結合しなかった。低ストリンジェントな条件下で試験した場合、これらの抗体は、セット８からのみペプチドを結合した（図２）。不連続模倣体により得られた結果の解析は、抗体が、配列₃₉₀ＡＴＱＴＧＲＶＦＬＱ₃₉₉（配列番号：３）、₄₂₀ＰＦＴＶＬＶＰＳＶＳＳＦＳＳＲ₄₃₄（配列番号：１）、₄₇₃ＱＥＩＴＶＴＦＮＱＦＴＫ₄₈₄（配列番号：２）、₅₇₆ＤＳＬＲＤＧＲＬＩＹＬＦ₅₈₇（配列番号：４）、₆₁₅ＳＫＧＲＩＬＴＭＡＮＱＶＬ₆₂₇（配列番号：５）から構成され、配列₄₇₃ＱＥＩＴＶＴＦＮＱＦＴＫ₄₈₄（配列番号：２）および₄₂₀ＰＦＴＶＬＶＰＳＶＳＳＦＳＳＲ₄₃₄（配列番号：１）がコアエピトープを表すと考えられる。さらにより弱いシグナルが配列₃₁₃ＬＣＶＹＱＫＰＧＱＡＦＣＴＣＲ₃₂₇（配列番号：６）を含む不連続模倣体について記録された。単純なエピトープ模倣体により得られた結果は、エピトープ呼び出しの余地が無い。図２は、セット８（不連続エピトープ模倣体）上の抗体ＦＵ−ＨＩ−３−３７２について得られた結果のヒートマップ表示を説明する。平均シグナルは暗くプロットされ、極端に高いシグナルは明るくプロットされる。四角で囲まれた領域が拡大されている。

結論
抗体は、Ｐｅｐｓｃａｎペプチドアレイに対して試験された。仮の不連続エピトープをすべてのモノクローナル抗体に対して同定することが可能であった。エピトープを含むペプチド配列を表３に挙げる。抗体３−２６６およびＡＫ ＦＵＭＭ ９−１１は異なる不連続エピトープに結合する。抗体ＦＡＲ０２ ＶＨ３／ＶＫ５およびＦＵ−ＨＩ−３−３７２は、アレイ上で試験した場合、硬度に類似した結合パターンを本質的に表示し、したがって、ＦＡＳ１／ＦＡＳ２ドメインにおける同じ不連続エピトープを認識することを示した。

上記抗体について同定された仮のエピトープを視覚的に比較するために、図３の模式図を用いた。このスタビリン−１（ＣＬＥＶＥＲ−１）ドメイン組織を表す模式図は、Kzhyshkowska, TheScientificWorldJOURNAL (2010) 10, 2039-2053由来の図１から適用された。図３は、ＣＬＥＶＥＲ−１のドメイン組織（ａａ＿２５−１０２７／標的配列）を概略的に説明する。矢印は、同定された結合モチーフの相対位置を示す。循環された矢印は、主要なエピトープコアの位置を示す。

実施例２
ｍＲＮＡ抽出、ＲＴ−ＰＣＲおよびクローニング
ｍＲＮＡは、ハイブリドーマ細胞（ポリＡ追跡システム、プロメガカタログ番号Ｚ５４００）から首尾よく抽出された。ＲＴ−ＰＣＲは、一本鎖定常領域プライマーを有するマウスシグナル配列に対する縮重プライマープールを用いて行った。重鎖可変領域ｍＲＮＡを、６つの縮重プライマープール（ＨＡ〜ＨＦ）のセットを用いて増幅し、軽鎖可変領域ｍＲＮＡを８つの縮重プライマープール（κＡ〜κＧおよびλＡ）のセットを用いて増幅した。増幅産物は、重鎖プライマープールＨＤおよび軽鎖プライマープールκＢ、κＣおよびκＧにより得られ、軽鎖がκクラスター由来であることを確認した（図４）。各産物はクローン化され、それぞれからいくつかのクローンが配列決定された。

この方法を用い、一本鎖ＶＨ配列［配列番号：３２（塩基配列）および配列番号：３３（アミノ酸配列）］を、プールＨＤにおいて同定し、単一機能Ｖｋ配列［配列番号：３４（塩基配列）および配列番号：３５（アミノ酸配列）］を、プライマープールκＧにおいて同定した。重鎖のＣＤＲｓは、塩基９１〜１１１（配列番号：７）、１５４−２１０（配列番号：８）、および２９８−３３３（配列番号９）まで延び、軽鎖ＣＤＲｓは、塩基７０−１０５（配列番号：１０）、１５１−１７１（配列番号：１１）および２６８−２９４（配列番号１２）まで延びた。ＣＤＲの定義とタンパク質配列の番号付は、Ｋａｂａｔに従っている。通常ハイブリドーマ融合パートナーＳＰ２／０（ＧｅｎＢａｎｋ Ｍ３５６６９）と関連する異常なκ軽鎖転写物をプライマープールκＢおよびκＣにおいて同定した。

図４は、ハイブリドーマ３−３７２ ＲＴ−ＰＣＲ産物の１％アガロースゲル分離を説明する。ゲルをＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ染色（インビトロゲン、カタログ番号Ｓ−７５６７で染色し、紫外光で写真をとった。サイズマーカーはＧｅｎｅＲｕｌｅｒ（商品名） １ｋｂ Ｐｌｕｓである（フェルメンタスカタログ番号 ＳＭ１３３１）。四角で囲まれた領域が拡大されている。四角は、クローニングおよびシーケンシングのために単離したバンドを示す。

実施例３
配列分析
３−３７２を発現するハイブリドーマから得られた配列の分析を表４にまとめる。

マウス３−３７２可変ドメイン配列の構造およびホモロジー分析は、抗原結合に非常に重要またはおそらく重要であるとみなされる、重鎖可変領域に４つのフレームワーク残基と軽鎖可変領域に５つのフレームワーク残基とを同定した（拘束性残基）。追加の配列データベース分析により、ヒトフレームワークセグメントは、全ての望ましい拘束性残基および全てのＣＤＲ残基を含むことが見出され、したがって、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（商標）の構築が可能となることが明らかとなった。

３−３７２のＶ領域がいくつかの独自の特徴を含むことも注目された。ＶＨ鎖は、残基３０がＮで３２がＳであるため、ＣＤＲ１の初めにＮ−グリコシル化部位を含む（Ｎ−グルコシル化シグナルは、ＮＸＳまたはＮＸＴであり、Ｘは任意のアミノ酸であってよい）。抗体の表面上にこのモチーフが露出される可能性が高いため、この部位がグルコシル化される可能性が高い。したがって、今後の何らかの製造上の問題を回避するために、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓにおいてこの部位を（抗原結合に関与していないならば）避けることが有利であろう。Ｖｋ鎖もグルコシル化部位を含むが、Ｖｋドメインの最後のアミノ酸がアスパラギンであるため、ヒトκ定常領域の観点においてのみである。マウスκ定常ドメインは、ＲＡで始まるが、ヒトκ定常ドメインはＲＴで始まり、このためグルコシル化シグナルを形成する。したがって、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに対する配列は、このアスパラギンを回避するように選択されるであろう。

κドメインはまた、４７位に不対システインを含む。分子モデリングは、この残基が構造内に埋もれ、したがってジスルフィド結合に利用できないということを示唆しているが、Ｖｋ ＣＤＲ２のコンフォメーションを維持するための重要な残基であり、したがって、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓに対する配列は、抗原結合に対するその効果を調べるために、この残基を有する場合と有さない場合と（後者はこの位置にコンセンサスヒトＬを含む）が選択されるであろう。

実施例４
キメラ抗体の発現
３−３７２可変領域は、ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）重鎖およびカッパー軽鎖のためのアンチトープ（Antitope's）発現ベクターシステムにトランスファーされた。ＮＳ０細胞をエレクトロポーレーションを経てトランスフェクトし、メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いて選択した。ＭＴＸ耐性コロニーの数を、Ｆｃキャプチャー／カッパー鎖検出ＥＬＩＳＡを用いて同定し、ＩｇＧ発現陽性細胞株を、９６ウェルプレートから段階的に上昇させた濃度のＭＴＸを含む培地中でＴ１７５フラスコを通して連続的に拡大し、その後、液体窒素下で凍結した。各段階でＩｇＧ発現を定量した。

キメラ３−３７２ＩｇＧ４は、プロテイン−Ａセファロースカラム上で細胞培養上清から精製し、キメラＩｇＧの推定アミノ酸配列に基づき、１．５５の吸光係数（Ｅｃ（０．１％））を用いてＯＤ２８０ｎｍにより定量した。おおよそ９０μｇの抗体を精製し、試料を還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した（図５）。重鎖および軽鎖の推定サイズに対応するバンドがコンタミネーションの証拠なく観察されたが、キメラ軽鎖は、マウス軽鎖よりも大きな見かけ分子量からも明らかなようにグルコシル化されているようである。重鎖も、通常よりもゆっくりと走っているようであり、重鎖もグルコシル化されていることを示唆するが、それが本当であることを証明するために、グルコシダーゼによる消化が必要とされるであろう。

図５は、プロテイン−Ａ精製キメラ３−３７２ＩｇＧ４のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを説明する。１μｇの試料をＮｕＰａｇｅ４〜１２％ビス−トリスゲル上にロードし、２００Ｖで３０分間走らせた。レーン１＆４：染色前タンパク質標準（フェルメンタスＰａｇｅＲｕｌｅｒカタログ番号 ＳＭ１８１１）。レーン２：１．０μｇのキメラ３−３７２ＩｇＧ４抗体。レーン３：１．０μｇマウス３−３７２抗体。

実施例５
キメラ抗体のＣＬＥＶＥＲ−１への結合
ＮＳ０誘導キメラ３−３７２のＣＬＥＶＥＲ−１への結合は、競合ＥＬＩＳＡにより評価した。簡単に言えば、Ｎｕｎｃ Ｉｍｍｕｌｏｎの９６ウェルマキシソーププレート（フィッシャーカタログ番号 ＤＩＳ‐９７１−０３０Ｊ）を、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのＣＬＥＶＥＲ−１（１００μｌ／ウェル）で、４℃で一晩、翌朝３７℃でさらに１時間コートした。ウェルをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、その後、室温で４５分間、１％Ｍａｒｖｅｌ／１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中でブロックした。

キメラ３−３７２および参照マウス３−３７２の両方の一連の希釈（５〜０．０７８μｇ／ｍｌ）を、２％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の一定濃度（０．６μｇ／ｍｌ）のビオチン化マウス３−３７２抗体で事前混合した。ブロックしたＥＬＩＳＡプレートを前と同じように洗浄し、１００μｌの事前混合した抗体を各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートした。ビオチン化マウス３−３７２のＣＬＥＶＥＲ−１への結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（シグマカタログ番号 Ｓ５５１２）およびＴＭＢ単一溶液基質（インビトロゲンカタログ番号 ００−２０２３）を用いて検出した。反応を３ＭのＨＣｌで停止させ、吸光度をＤｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＭＲＸ ＴＣ ＩＩプレートリーダー上、４５０ｎｍで読み、キメラ３−３７２の結合曲線を参照マウス３−３７２抗体のものと比較した（図６）。

図６は、ビオチン化マウス抗体との競合におけるマウスおよびキメラ抗体のＣＬＥＶＥＲ−１に対する結合プロファイルを示す。曲線は、マウス抗体のＩＣ５０値０．７７と比較してキメラ抗体のＩＣ５０値は０．８９μｇ／ｍｌであり、ほとんど同一であった。これは、正しい可変領域配列がキメラ抗体において同定および発現されていることを確認している。

実施例７
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）可変領域配列およびバリアントの設計
マウス抗−ＣＬＥＶＥＲ−１抗体Ｖ領域の構造モデルは、スイスＰＤＢを用いて作製され、抗体の結合特性に不可欠である可能性の高いＶ領域における重要な「拘束」アミノ酸を同定するために解析された。多数のフレームワーク残基と共にＣＤＲｓ内に拘束された残基（ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ定義を両方用いる）は、重要であるとみなされた。抗−Ｃｌｅｖｅｒ−１のＶＨおよびＶｋ配列は両方、典型的なフレームワーク残基を含み、ＣＤＲ１、２および３モチーフは、多くのマウス抗体に匹敵する。しかしながら、我々は、ＶＨ配列におけるＮ−結合グルコシル化（３０Ｎ）およびＶｋ配列における不対システイン（４７Ｃ）に対する潜在的な部位を同定した。

上記分析から、抗−ＣＬＥＶＥＲ−１の複合ヒト配列は、ＣＤＲの外の選択肢の広い自由度と、ＣＤＲ内の潜在的な代替残基の狭いメニューのみとから作製することができると考えられた。予備分析は、いくつかのヒト抗体からの対応する配列セグメントを、マウス配列のＣＤＲｓと同様または同じＣＤＲｓを作製するために組み合わせることができるということを示した。ＣＤＲｓの外側の領域およびＣＤＲｓに隣接した領域に関し、ヒト配列セグメントの広い選択が、新規Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）Ｖ領域の潜在的な成分として同定された。

上記分析に基づき、抗−ＣＬＥＶＥＲ−１ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）バリアントを作製するために使用することができる配列セグメントの大きな予備セットが選択され、ヒトＭＨＣクラスＩＩアレルへのペプチド結合のインシリコ解析のためにｉＴｏｐｅ（商標）技術（Perry et al 2008）を用い、そして公知の抗体配列関連Ｔ細胞エピトープのＴＣＥＤ（商標）（Ｔ細胞エピトープデータベース）（Bryson et al 2010）を用いて分析された。ヒトＭＨＣクラスＩＩへの有意な非−ヒト生殖細胞系列結合体として同定されるかまたはＴＣＥＤ（商標）に対する有意なヒットを記録した配列セグメントは切り捨てられた。これは結果としてセグメントのセットを減少させ、これらの組み合わせが、上述のように、セグメント間の接点が潜在的なＴ細胞エピトープを含まないということを確かにするために再度分析された。その後、選択されたセグメントを組み合わせて、合成のための重鎖および軽鎖のＶ領域配列を作製した。抗−ＣＬＥＶＥＲ−１に関し、４つのＶＨ鎖、ＶＨ１、ＶＨ２；ＶＨ３およびＶＨ４［それぞれ、配列番号１３、１５、１７および１９（塩基配列）ならびに配列番号１４、１６、１８および２０（アミノ酸配列）］と５つのＶｋ鎖、ＶＫ１、ＶＫ２、ＶＫ３、ＶＫ４およびＶＫ５［それぞれ、配列番号２１、２３、２５、２７および２９（塩基配列）ならびに配列番号２２、２４、２６、２８および３０（アミノ酸配列）］を設計した。重鎖ＣＤＲｓＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４は、塩基９１〜１１１、１５４〜２０１および２９８〜３３３に伸び、そして軽鎖ＣＤＲｓ、ＶＫ１、ＶＫ２、ＶＫ３、ＶＫ４およびＶＫ５は、塩基７０〜１０５、１５１〜１７１および２６８〜２９４に伸びる。ＣＤＲの定義はおよびタンパク質配列の番号付は、Ｋａｂａｔに従う。注目すべきことに、３つのＶＨ鎖が潜在的なＮ−結合グリコシル化部位を除去し（ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４）、２つのＶｋ鎖が不対システインを除去している（ＶＫ４およびＶＫ５）。

実施例８
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）バリアントの構築
全てのバリアントＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）ＶＨおよびＶｋ領域遺伝子は、全長合成Ｖ領域を与えるためにアニールされ、ライゲートされ、そしてＰＣＲ増幅された一連のオーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いて合成した。その後、アセンブルされたバリアントを、ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）ＶＨ鎖およびＶｋ鎖に対してアンチトープｐＡＮＴ発現ベクターシステムに直接クローン化した（図７）。ＶＨ領域をＭｌｕｌおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてクローン化し、Ｖｋ領域をＢｓｓＨＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いてクローン化した。すべての構築物を配列決定により確認した。

図７は、アンチトープｐＡＮＴベクターダイアグラムを示す。ＶｈおよびＶＫベクターは両方、イントロンおよびポリＡ配列を組み込んだゲノムＤＮＡ断片を含む。両鎖の発現は、ＣＭＶプロモーターにより駆動し、選択（重鎖ベクター上の）は、ＤＨＦＲミニ遺伝子を経た。

実施例９
抗体の構築、発現および精製
複合ＩｇＧ４（Ｓ２４１Ｐ）ＶＨおよびＶｋ鎖のすべての組み合わせ（すなわち、合計２０対）を、ＮＳ０細胞にエレクトロポーレーションにより安定にトランスフェクトした。安定なトランスフェクションは、２００ｎＭメトトレキサート（ＭＴＸ）（シグマカタログ番号 Ｍ８４０７）を用いて選択し、各構築物に対してメトトレキサート耐性コロニーを、ＩｇＧ４ＥＬＩＳＡを用いてＩｇＧ発現レベルについて試験し、最良の発現株を選択し、拡大し、液体窒素を用いて凍結した。成功したトランスフェクションと安定なコロニー選択は、ＶＨ３／Ｖｋ３およびＶＨ４／Ｖｋ３を除くすべてのバリアントについて達成した。

抗−ＣＬＥＶＥＲ−１の複合バリアントは、プロテイン−Ａセファロースカラム（ＧＥヘルスケアカタログ番号 １１００３４−９３）上で細胞培養上清から精製し、緩衝液をＰＢＳに交換し、推定アミノ酸配列に基づき、吸光係数（Ｅｃ（０．１％）＝１．５５）を用いてＯＤ２８０ｎｍにより定量した。主要なＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）バリアントを還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＶＨおよびＶｋ鎖の推定サイズに対応するバンドがコンタミネーションの証拠なく観察された（図８）。

図８は、プロテイン−Ａ精製抗体のクーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを説明する。２μｇの各試料をＮｕＰａｇｅ４〜１２％ビス−トリスゲル（インビトロゲンカタログ番号 ＮＰ０３２２ＢＯＸ）上にロードし、２００Ｖで３５分間走らせた。サイズマーカーは、染色前タンパク質標準品、フェルメンタスＰａｇｅＲｕｌｅｒ（カタログ番号 ＳＭ１８１１）である。

実施例１０
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（商標）のＣＬＥＶＥＲ−１への結合
ＮＳ０誘導複合３−３７２抗体のＣＬＥＶＥＲ−１への結合は、競合ＥＬＩＳＡにより評価した。キメラおよび複合３−３７２抗体の両方の一連の希釈（５〜０．０７８μｇ／ｍｌ）を、一定濃度（０．６μｇ／ｍｌ）のビオチン化マウス３−３７２抗体で事前混合した。これらを、１μｇ／ｍｌのＣＬＥＶＥＲ−１で事前コートした９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎマキシソーププレート（フィッシャーカタログ番号 ＤＩＳ‐９７１−０３０Ｊ）上、室温で１時間インキュベートした。ビオチン化マウス３−３７２のＣＬＥＶＥＲ−１への結合は、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（シグマカタログ番号 Ｓ５５１２）およびＴＭＢ単一溶液基質（インビトロゲンカタログ番号 ００−２０２３）を用いて検出した。反応を３ＭのＨＣｌで停止させ、吸光度をＤｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＭＲＸ ＴＣ ＩＩプレートリーダー上、４５０ｎｍで読み、結合曲線をプロットした。各抗体のＩＣ５０値を算出し、これらを各々のＥＬＩＳＡプレート上に含まれるキメラのＩＣ５０値について正規化した。

得られたＩＣ５０は、多数のＣｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ 抗−ＣＬＥＶＥＲ−１Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（商標）がキメラ３−３７２よりもＣＬＥＶＥＲ−１に良好な結合を有することを示す。主要なバリアントについての競合データが図９に示される。

相対的ＩＣ５０は、試験抗体についての値を同一のプレートでアッセイされたキメラの値で除することにより計算した。

実施例１１：インビトロでの抗体結合
健常ドナー由来のヒト末梢血単球を集め、それらを約９ｍｌの末梢血からＦｉｃｏｌｌ−グラジエント遠心分離により富化した。その後、それらを低接着９６ウェルプレートに、１％ヒトＡＢ血清を補足したＩＭＤＭ培地中、１．２×１０⁶細胞／ウェルの密度で蒔いた。細胞を１μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの抗−ＣＬＥＶＥＲ−１抗体３−３７２（２００１年８月２１日にＤＳＭＺ−ドイチェ・ザンルング・フォン・ミクロオルガニズメン・ウント・ツェルクルツレン・ゲーエムベーハーに寄託されたＤＳＭ ＡＣＣ２５２０）またはＶＨ３／ＶＫ５（上記特定のＣＬＥＶＥＲ−エピトープを認識するヒト化抗−ＣＬＥＶＥＲ−１抗体、その抗体の詳細は以下に示す。）で４８時間処理した。ＨＬＡ−ＤＲ発現は、４８時間後、ＣＤ１４陽性細胞からＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリーを用いて測定した。死んだ細胞は、７−ＡＡＤ細胞生存染色に関する陽性シグナルに基づき解析から除外した。

ヒトＩｇＧｓを参照として用いた。

図１０Ａは、ＣＤ１４陽性細胞からのＨＬＡ−ＤＲ発現の測定の結果を示す。ＣＤ１４陽性細胞におけるＨＬＡ−ＤＲ発現は、ヒト化抗−ＣＬＥＶＥＲ−１抗体ＶＨ３／ＶＫ５の処置により、ヒトＩｇＧｓの参照と比較して増加した。

処置間の細胞生存率における差異は観察されなかった。したがって、ＣＬＥＶＥＲ−１標的化抗体は単球の生存に影響を与えないと結論付けることができる。

実施例１２：ＴＮＦ−アルファの測定
健常ドナー由来のヒト末梢血単球を集め、実施例１１に記載したように富化した。赤血球溶解緩衝液で処理した血液３ｍｌからの単球は、６ウェルプレートに一晩接着させ、ＰＢＳで一回洗浄し、３日間、１０μｇ／ｍｌの抗−ＣＬＥＶＥＲ−１抗体３−３７２またはＡＫ−１と共に培養した。

可溶性ＴＮＦ−アルファは、市販のＴＮＦ−アルファＥＬＩＳＡキット（インビトロゲン）を用いて培養培地から測定した。測定の結果は、図１Ｂに示す。ＴＮＦ−アルファ分泌の増加は、非処理試料またはＡＫ−１による対照処理試料と比較して、抗−ＣＬＥＶＥＲ−１抗体で処理した試料により分かった。

実施例１３：マウス同系がんモデル
樹立Ｅ０７７１マウス乳癌を、５ｍｇ／ｋｇの抗−ＣＬＥＶＥＲ−１（ｍＳｔａｂ１）または同位体対照で３〜４日ごとに腫瘍が１ｍｍ３のサイズになるまで処置した。抗−ＣＬＥＶＥＲ−１治療のＴＡＭｓの補充および亜型に対する効果、種々の単球サブセットおよび腫瘍浸潤白血球をフローサイトメトリーを用いて評価した。

図１１Ａは、ＣＬＥＶＥＲ−１に結合する抗体の投与後の同系Ｅ０７７１乳癌におけるＴＡＭ再分極を示す。ＴＡＭ再分極は、フローサイトメトリーによりＭＨＣＩＩ（ヒトＨＬＡ−ＤＲにおける）を発現するマクロファージ集団の増加により測定した。各ドットは、一匹のマウスにおけるＭＨＣＩＩ高ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋ＴＡＭｓの百分率を表す。抗−ＣＬＥＶＥＲ−１で処置した腫瘍は、対照処置腫瘍と比較して同様のレベルのＴＡＭｓ（ＣＤ１１ｂ＋Ｆ４／８０＋）を示した。しかしながら、抗−ＣＬＥＶＥＲ−１腫瘍におけるＴＡＭ集団は、ＩＩ型マーカー、ＣＤ２０６の低い発現と、より多くの炎症性マクロファージ（Ｌｙ６ＣｌｏＭＨＣＩＩｈｉ）とから構成された。

抗−ＣＬＥＶＥＲ−１処置ＴＡＭは、図１１Ｂに示すように、ＩｇＧ処置ＴＡＭｓと比較して有意に多くのＴＮＦ−アルファを分泌した。各ドットは、一匹のマウスから単離されたＴＡＭｓを表す。これと一致して、ＦｏｘＰ３＋腫瘍浸潤白血球の減少も観察された。

結果は、ＣＬＥＶＥＲ−１がマクロファージに基づく免疫療法の潜在的な標的であることを示す。

実施例１４
実施例１に示されているように、抗体９−１１および３−３７２は、ヒトＣＬＥＶＥＲ−１において異なるエピトープに結合し、今回ヒト末梢血単球におけるシグナル伝達にこの違いが及ぼす効果を調べた。図１２は、９−１１および３−３７２抗体とのＣＬＥＶＥＲ−１ライゲーションが、ヒト末梢血単球においてｍＴＯＲ（ラパマイシンの構造的標的）およびｃ−Ｊｕｎシグナル伝達に逆向きの作用を促進する。

図１２Ａは、ＣＤ１４陽性ヒト単球上の９−１１および３−３７２結合のフローサイトメトリー分析を示す（ｎ＝２ドナー、Ｄ１およびＤ２）。

図１２Ｂは、ヒトホスホキナーゼアレイ（Ｒ＆Ｄ）を使用した場合、９−１１および３−３７２の２０μｇ／ｍＬで１０分間の処理した後のＣＤ１４陽性細胞（ネガティブ選択により富化）上のホスホタンパク質の活性化を測定した結果を示す。ホスホシグナルは、関連同位体対照処置細胞、９−１１に対してラットＩｇＧ２ａ、３−３７２に対してマウスＩｇＧ１で正規化した。図１２Ｂに示されるように、抗体９−１１および３−３７２は、ヒト末梢血単球においてｍＴＯＲおよびｃ−Ｊｕｎシグナル伝達に逆向きの作用を促進する。ｍＴＯＲ経路はマクロファージの分極を制御し、免疫抑制マクロファージ亜型は、ｃ−Ｊｕｎリン酸化に依存するということが知られており、結果は３−３７２抗体がマクロファージを活性化し、それらの亜型をＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへと切り替えるということを示す。

他の好ましい態様
本発明の、抗体、一本鎖ＦｖまたはＦａｂ断片、ペプチドまたはマクロ分子、およびヒト化抗体またはヒト化一本鎖ＦｖまたはＦａｂ断片などのヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができる薬剤、および医薬組成物は、多種多様な態様の形態で組み込まれることができ、本明細書に開示されているのはそのうちの数例のみであることは理解されるであろう。他の実施態様が存在し、本発明の精神から逸脱しないことは当業者には明らかである。したがって、記載された実施態様は、説明のためのものであり、制限的なものとして解釈されるべきものではない。

Claims (6)

1. ヒトＣＬＥＶＥＲ−１に結合することができるヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片であって、
   前記抗体または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片は、
   ａ）ヒトＩｇＧ４重鎖およびカッパー軽鎖の定常領域、および
   ｂ）配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８および配列番号２０からなる群より選択されるヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列と、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８および配列番号３０からなる群より選択されるヒトＩｇＧ軽鎖可変領域配列との組み合わせ
   を含み、ヒトＩｇＧ重鎖可変領域とヒトＩｇＧ軽鎖可変領域との組み合わせが、配列番号１４および配列番号２２、配列番号１６および配列番号２２、配列番号１６および配列番号２４、配列番号１６および配列番号２６、配列番号１６および配列番号２８、配列番号１６および配列番号３０、配列番号１８および配列番号２２、配列番号１８および配列番号２４、配列番号１８および配列番号２８、配列番号１８および配列番号３０、配列番号２０および配列番号２４、または配列番号２０および配列番号３０から選択される
   ヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片。
2. ヒトＩｇＧ重鎖可変領域配列が配列番号１６、配列番号１８または配列番号２０を含み、
   ヒトＩｇＧ軽鎖可変領域配列が配列番号３０を含む請求項１記載のヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片。
3. 請求項１または２記載のヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片を含むがんまたは慢性感染症の治療または予防のための医薬。
4. がんの治療または予防が、悪性腫瘍の大きさを縮小することによる；個体における悪性腫瘍の増殖を減少することによる；および／またはがん細胞の移動および転移形成を阻害することによることを特徴とする請求項３記載の医薬。
5. 請求項１または２記載のヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片を含むワクチン。
6. 請求項１または２記載のヒト化抗体、または一本鎖ＦｖもしくはＦａｂ断片および適切な賦形剤を含む医薬組成物。

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