KR102354845B1 - 인간화 항 clever-1 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CLEVER-1의 에피토프를 인식하는 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 및 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편에 관한 것으로서, 상기 에피토프는 불연속적이고 서열 PFTVLVPSVSSFSSR 및 QEITVTFNQFTK를 포함한다. 본 발명은 또한 종양 또는 항원 유도된 면역억제를 제거하는 데 사용하기 위한, 인간 CLEVER-1의 에피토프에 결합할 수 있는 제제에 관한 것이다. 또한, 발명은 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 및 적합한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

인간화 항 CLEVER-1 항체 및 이의 용도
본 발명은 특정 CLEVER-1 에피토프를 인식함으로써 CLEVER-1 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 배경을 밝히기 위해 본원에 사용된 공보 및 다른 자료, 특히 실시에 관한 추가 세부사항을 제공하는 경우는 참고로 포함된다.
CLEVER-1은 WO 03/057130, 일반적인 림프 내피 및 혈관 내피 수용체-1에 개시된 단백질이다. 이것은 전신 혈관계와 임파선 모두에서 내피에 대한 림프구의 부착을 매개하는 결합 단백질이다. CLEVER-1과 이의 림프구 기질의 상호작용을 차단함으로써 림프구 재순환과 림프구 이동 및 염증과 같은 관련 상태를 조직으로 림프구 유입 부위 및 조직으로부터 림프구 유출 부위에서 동시에 조절할 수 있다. WO 03/057130은 또한 CLEVER-1이 단핵구 및 과립구와 같은 다른 유형의 백혈구와 HEV 유사 혈관의 결합을 매개한다는 것을 개시한다. 따라서, CLEVER-1과 악성 종양 세포의 상호작용을 차단함으로써, CLEVER-1에 결합하는 악성 세포가 림프 혈관에 의해 흡수되는 것을 방지하여 전이를 조절함으로써 악성 종양의 림프절로의 확산을 방지하게 되었다.
CLEVER-1, 즉 스타빌린-1은 문헌(참조: Kzhyshkowska J. (2010), TheScientificWorldJOURNAL 10, 2039-2053)에 의해 검토되었다. CLEVER-1에 의한 Th1 림프구의 억제는 최근에 문헌(참조: Palani et al. (2016), Journal of Immunology 196: 115-123)에 개시되었다.
WO 2010/122217은 임신부의 종양, 태반 및 혈액 중의 대식세포의 아형을 개시한다. 대식세포의 아형은 CLEVER-1 양성 대식세포로 정의되고, 유형 3 대식세포로서 제안된다. 이 세포의 CLEVER-1 수용체를 조절함으로써, 즉 각각 대응하거나 자극함으로써, 이 세포에서 개체의 면역계가 영향을 받을 수 있다. 수용체의 대응 또는 하향 조절은 악성 종양의 크기 및/또는 악성 종양 성장을 감소시킨다. 수용체를 자극하거나 상향 조절하는 것은 태아 내성의 생성 및 임신 합병증의 예방에 유용하다.
종양 관련 대식세포(TAM)의 기전은 또한 공보(참조: Noy R. and Pollard J. W., "Tumour-Associated Macrophages: From Mechanisms to Therapy", published in Immunity 41, July 17, 2014, p. 49-61)에 개시되어 있다. M2 대식세포는 인간의 암에서 우세하고, 종양 성장을 자극하지만, 이러한 종양 촉진 대식세포는 암 성장을 늦추거나 정지시키는 것을 목표로 하는 M1 대식세포 또는 전염증성 대식세포로도 칭명되는 종양 성장 억제 대식세포로 조절될 수 있다. 그러나, TAM의 표적화를 목표로 하는 현재 이용 가능한 치료제로 암을 치료하려는 시도는 바람직하지 않은 부작용을 동반했다, 예를 들면, 대식세포 치료 접근법은 모든 대식세포를 표적으로 할 때 전신 독성을 갖거나 역설적으로 종양 성장을 촉진시킬 수 있다는 것이 주시되었다.
특허 절차의 목적을 위한 미생물 기탁의 국제 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라 2001년 8월 21일에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig로 기탁된 특히 바람직한 CLEVER-1 길항제 모노클로날 항체 3-266(DSM ACC2519) 및 3-372(DSM ACC2520)는 WO 03/057130에 개시되어 있다.
본 발명의 목적은 인간 CLEVER-1의 특정 에피토프에 결합할 수 있는 제제를 제공하는 것이다. 특히, 인간 CLEVER-1의 특정 에피토프에 결합할 수 있는 제제가 그들의 표현형을 M2 대식세포에서 M1 대식세포로 전환시키기 위해 대식세포를 활성화시키는 데 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다.
또한, 본 발명의 목적은 모노클로날 항체 3-372(2001년 8월 21일에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 DSM ACC2520)와 비교하여 증가된 결합 활성으로 인간 CLEVER-1에 결합하기 위한 인간화 항체 또는 인간화 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편을 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 인간 CLEVER-1의 에피토프에 결합할 수 있는 제제로서, 상기 에피토프가 불연속적이고, 서열
PFTVLVPSVSSFSSR (서열 번호 1) 및
QEITVTFNQFTK (서열 번호 2)을 포함하는, 제제를 제공한다.
특히, 본 발명은 CLEVER-1의 에피토프를 인식하는 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제로서, 상기 에피토프가 불연속적이고, 서열
PFTVLVPSVSSFSSR (서열 번호 1) 및
QEITVTFNQFTK (서열 번호 2)을 포함하고,
상기 제제가
TSGMGIG (서열 번호 7),
HIWWDDDKRYNPALKS (서열 번호 8),
HYGYDPYYAMDY (서열 번호 9),
TASSSVSSSYLH (서열 번호 10),
RTSNLAS (서열 번호 11) 및
HQYHRSPPT (서열 번호 12)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 에피토프 서열에 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)의 서열을 포함하는, 제제를 제공한다.
본 발명에 따라서, 본원에 정의된 CLEVER-1의 에피토프를 인식하는 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제는 항체, 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편(들), 펩티드(들) 또는 상기 에피토프에 결합하는 데 적합한 친화도를 갖는 임의의 다른 거대분자로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절하여 종양 또는 항원 유도 면역억제를 제거하는 데 사용하기 위한, 개체 중 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제로서, 상기 제제가 인간 CLEVER-1의 에피토프에 결합하고, 이 에피토프가 불연속적이고, 서열
PFTVLVPSVSSFSSR (서열 번호 1) 및
QEITVTFNQFTK (서열 번호 2)을 포함하는, 제제를 제공한다.
TAM 상에서 인간 CLEVER-1에, 바람직하게는 CLEVER-1 상의 특정 에피토프 서열에 결합할 수 있는 본 발명에 따르는 제제는 악성 종양의 크기를 감소시키고; 개체에서 악성 종양 성장을 감소시키고/시키거나; 암 세포 이행 및 전이 형성을 억제함으로써 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기에 적합하고, 여기서 악성 증식 주위의 면역 억제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 제거된다.
인간 CLEVER-1에, 바람직하게는 CLEVER-1 상의 특정 에피토프 서열에 결합할 수 있는 본 발명에 따르는 제제는 또한 개체에서 만성 감염을 치료하는 데 사용하기에 적합하고, 여기서 감염성 항원에 대한 면역 억제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 제거된다.
인간 CLEVER-1에, 바람직하게는 CLEVER-1 상의 특정 에피토프 서열에 결합할 수 있는 본 발명에 따르는 제제는 또한 백신의 보조제로서 사용하기에 적합하고, 상기 백신 항원에 대한 면역 억제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 제거된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 인간 CLEVER-1의 에피토프에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편으로서, 상기 에피토프가 불연속적이고 서열
PFTVLVPSVSSFSSR (서열 번호 1) 및
QEITVTFNQFTK (서열 번호 2)을 포함하고,
상기 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편이
a) 인간 IgG4 중쇄 및 카파 경쇄의 불변 영역 및
b) 다음과 같은 상보성 결정 영역(CDR)의 서열 중 하나 이상을 포함하는, 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편을 제공한다:
i) 중쇄
CDR1: TSGMGIG (서열 번호 7), 및/또는
CDR2: HIWWDDDKRYNPALKS (서열 번호 8), 및/또는
CDR 3: HYGYDPYYAMDY (서열 번호 9); 및
ii) 경쇄
CDR 1: TASSSVSSSYLH (서열 번호 10), 및/또는
CDR 2: RTSNLAS (서열 번호 11), 및/또는
CDR 3: HQYHRSPPT (서열 번호 12).
본 발명의 또 다른 목적은 또한 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 또는 본 발명에 따르는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편 및 적합한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 종양 또는 항원 유도 면역억제를 제거하는 데 사용하기 위한, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 또는 상기 정의된 바와 같은 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편 및 적합한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 악성 종양의 크기를 감소시키고; 개체에서 악성 종양 성장을 감소시키고/시키거나; 암 세포 이행 및 전이 형성을 억제함으로써 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기에 적합하다. 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 또한 개체에서 만성 감염을 치료하는 데 사용하기에 또는 백신의 보조제로서 사용하기에 적합하다.
도 1a 및 1b는 항체 3-266 및 항체 AK FUMM 9-11에 대해 수득된 결과의 히트 맵 표현을 도시한다.
도 2는 항체 FU-HI-3-372에 대해 수득된 결과의 히트맵 표현을 도시한다.
도 3은 동정된 결합 모티프의 CLEVER-1 위치의 도메인 구성을 개략적으로 도시한다.
도 4는 하이브리도마 3-372 RT-PCR 제품의 1% 아가로스 겔 분리를 도시한다.
도 5는 단백질 A-정제된 키메라 3-372 IgG4의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한다.
도 6은 CLEVER-1 경쟁 ELISA를 도시한다.
도 7은 안티토프 pANT 벡터 다이어그램을 도시한다.
도 8은 선택된 단백질 A-정제된 항체의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한다.
도 9는 CLEVER-1 경쟁 ELISA를 도시한다.
도 10a는 CD14 양성 세포로부터 HLA-DR 발현의 결정 결과를 도시하고, 도 10b는 TNF-α ELISA 키트(Invitrogen)를 사용하여 배양 배지로부터 측정된 가용성 TNF-α의 결과를 도시한다.
도 11a는 CLEVER-1에 결합하는 항체 투여 후 동계 E0771 유방 암종에서 TAM재분극화를 도시하고, 도 11b는 CLEVER-1에 결합하는 항체 투여 후 E0771 동계 유방 암종으로부터 TAM 상의 TNF-α의 증가된 분비를 도시한다.
도 12는 9-11 및 3-372 항체에 의한 CLEVER-1 결찰이 인간 말초 혈액 단핵구에서 mTOR 및 c-Jun 신호전달에 대한 반대 효과를 촉진시킨다는 것을 도시한다.
용어
용어 "인간 CLEVER-1의 에피토프에 결합할 수 있는 제제"는 본원에서 정의된 특정 에피토프 서열에 결합할 수 있는 항체 및 이의 단편, 펩티드 등을 포함하는 제제를 의미한다. 상기 제제는 또한 상기 에피토프에 결합하기에 적절한 친화도를 갖는 임의의 다른 거대분자일 수 있다.
용어 "항체 또는 이의 단편"은 개체에서 CLEVER-1 분자를 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 포괄하는 가장 넓은 의미로 사용된다. 특히, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 항체 단편 및 단일 쇄 항체(예: Fab, Fv)뿐만 아니라 키메라, 인간화 또는 영장류 항체를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
용어 인간화 항체는 비-인간 항체의 불변 영역이 불변 영역의 인간 형태로 완전히 치환되고, 표적 구조에 결합하는 각 가변 영역의 외부에서 아미노산 서열의 3개의 루프를 제외한 비-인간 항체의 가변 영역의 적어도 일부가 인간 항체의 상응하는 부분으로 완전히 또는 부분적으로 치환된 임의의 항체를 의미한다. 따라서, 특히, 세계 보건 기구(WHO)의 국제 일반명(INN)에 대한 명명 방식 또는 하위줄기 -xizu- 또는 -zu-를 갖는 약제에 대해 미국 채택 명칭(USAN)에 의해 명명된 임의의 항체는 본원에서 인간화 항체로 지칭된다.
Fv로서 지칭되기도 하는 용어 가변 도메인은 항원에 대한 결합에 가장 중요한 영역이다. 특이적이기 위해, 각각의 경(VL)쇄 및 중(VH)쇄 상의 3개의 β-가닥의 가변 루프가 항원에 결합하는 원인이 된다. 이러한 루프는 상보성 결정 영역(CDR)이라고 지칭된다.
용어 단일-쇄 Fv 단편 또는 scFv는 단일 폴리펩티드의 링커에 의해 VH 및 VL 도메인을 연결함으로써 수득되는 단편을 의미한다. 상기 용어 인간화 항체의 정의와 유사하게 용어 인간화 단일-쇄 Fv 단편 또는 scFv는 비인간 항체로부터 유래되는 불변 영역이 불변 영역의 인간 형태로 완전 치환되고, 표적 구조에 결합하는 각 가변 영역의 외부에서 아미노산 서열의 3개의 루프를 제외한 비-인간 항체로부터 유래하는 가변 영역의 적어도 일부가 인간 항체의 상응하는 부분으로 완전히 또는 부분적으로 치환된 임의의 단일-쇄 Fv 단편 또는 scFv를 의미한다.
용어 Fab 단편은 항원에 결합하는 항체 상의 영역을 의미한다. 또한, 상기 용어 인간화 항체의 정의와 유사하게, 용어 인간화 Fab 단편은 비인간 항체로부터 유래되는 불변 영역이 불변 영역의 인간 형태로 완전 치환되고, 표적 구조에 결합하는 각 가변 영역의 외부에서 아미노산 서열의 3개의 루프를 제외한 비-인간 항체로부터 유래하는 가변 영역의 적어도 일부가 인간 항체의 상응하는 부분으로 완전히 또는 부분적으로 치환된 임의의 Fab 단편을 의미한다.
용어 "펩티드"는 본원에서 정의된 상보성 결정 영역(CDR)의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 임의의 펩티드를 의미하고, 이 펩티드는 인간 CLEVER-1의 적어도 하나의 에피토프에 결합할 수 있다.
바람직한 구현예
본 발명의 한 구현예는 CLEVER-1의 에피토프를 인식하는 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제에 관한 것으로서, 상기 에피토프는 불연속적이고 다음 아미노산 서열
PFTVLVPSVSSFSSR (서열 번호 1) 및
인간 CLEVER-1의 QEITVTFNQFTK (서열 번호 2)을 포함하고,
상기 제제는
TSGMGIG (서열 번호 7),
HIWWDDDKRYNPALKS (서열 번호 8),
HYGYDPYYAMDY (서열 번호 9),
TASSSVSSSYLH (서열 번호 10),
RTSNLAS (서열 번호 11),
HQYHRSPPT (서열 번호 12)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 상기 에피토프 서열에 결합하는 상보성 결정 영역(CDR)의 하나 이상의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 인간 CLEVER-1의 불연속 에피토프는
ATQTGRVFLQ (서열 번호 3),
DSLRDGRLIYLF (서열 번호 4),
SKGRILTMANQVL (서열 번호 5) 및
LCVYQKPGQAFCTCR (서열 번호 6)로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
표적 단백질 인간 CLEVER-1의 일부, 즉 인간 스타빌린-1은 서열 번호 31로 정의된다. CLEVER-1 상의 에피토프 서열 번호 1, 서열 번호 2, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6은 서열 번호 31로 정의된 표적 단백질 인간 CLEVER-1의 아미노산 420-434, 473-484, 390-399, 576-587, 615-627 및 313-327에 상응한다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 인간 CLEVER-1의 에피토프에 결합할 수 있는 제제는 적어도 2개, 바람직하게는 3개, 보다 바람직하게는 4개, 더욱 더 바람직하게는 5개, 가장 바람직하게는 모두 6개의 상기 정의된 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따라서, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제는 항체, 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편(들), 펩티드(들) 또는 거대분자(들)로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편이고, 상기 항체 또는 인간화 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편은
a) 인간 IgG 중쇄 및 카파 경쇄의 불변 영역 및
b) 다음과 같은 상보성 결정 영역(CDR)의 서열 중 하나 이상을 포함한다:
i) 중쇄
CDR 1: TSGMGIG (서열 번호 7) 및/또는
CDR 2: HIWWDDDKRYNPALKS (서열 번호 8) 및/또는
CDR 3: HYGYDPYYAMDY (서열 번호 9); 및
ii) 경쇄
CDR 1: TASSSVSSSYLH (서열 번호 10) 및/또는
CDR 2: RTSNLAS (서열 번호 11) 및/또는
CDR 3: HQYHRSPPT (서열 번호 12).
인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편은 상기 정의된 불연속 에피토프 서열을 인식하는 인간 CLEVER-1의 에피토프에 결합할 수 있다. 인간 CLEVER-1의 불연속 에피토프는 적어도 서열 서열 번호 1 및 서열 번호 2를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 CLEVER-1의 불연속 에피토프는 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5 및 서열 번호 6으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 서열을 추가로 포함한다.
상기 지칭된 본 발명의 일부 구현예에서, 상기 정의된 적어도 2개, 바람직하게는 3개, 보다 바람직하게는 4개, 더욱 더 바람직하게는 5개, 가장 바람직하게는 모두 6개의 CDR은 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편에 포함된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편의 인간 IgG 중쇄 가변 영역은 서열 번호 14, 서열 번호 16, 서열 번호 18 및 서열 번호 20, 바람직하게는 서열 번호 16, 서열 번호 18 및 서열 번호 20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 일부 구현예에서, 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편의 인간 IgG 경쇄 가변 영역은 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28 및 서열 번호 30으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 바람직하게는 서열 번호 30이다.
본 발명에 따르는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편의 많은 구현예에서, 인간 IgG 중쇄 및 카파 경쇄의 불변 영역은 그러하다. 인간 IgG4 불변 영역이 바람직하다. 많은 바람직한 구현예는 돌연변이 L248E 및/또는 바람직하게는 및 S241P를 갖는 인간 IgG4 중쇄 및 IgG4 카파 경쇄를 포함한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편은 모노클로날 항체 3-372(2001년 8월 21일에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 DSM ACC2520)의 IC50과 비교하여 상대적 IC50 < 1.0, 바람직하게는 < 0.8, 더욱 바람직하게는 < 0.6, 가장 바람직하게는 < 0.5로 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에 따라서, 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 조합은 모노클로날 항체 3-372(2001년 8월 21일에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 DSM ACC2520)의 IC50과 비교하여 상대적 IC50 < 1.0으로 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 표 5에 제시된 조합으로부터 선택된다.
본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 상기 기재된 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 또는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편 및 적합한 부형제를 포함한다.
종양 촉진성 대식세포(M2)의 전염증성 대식세포(M1)로의 조절
인간 CLEVER-1, 특히 본원에서 정의된 CLEVER-1 상의 특정 에피토프 서열에 결합할 수 있는 제제가 그들의 표현형을 M2 대식세포에서 M1 대식세포로 전환하기 위해 대식세포를 활성화시키는 데 사용될 수 있다는 것이 또한 밝혀졌다. 특히, TAM 상의 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제는 종양 촉진성 대식세포(M2)를 전염증성 대식세포(M1)로의 조절을 달성하는 데 사용될 수 있다. 이 조절은 T 세포 활성화를 증가시키고, 결국, 예를 들면, 암 유발 면역 억제의 제거를 유도한다. 보다 정확하게는, CLEVER-1 분자 상의 특정 서열에 결합할 수 있는 제제가 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 면역 억제를 제거하는 데 사용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 결과적으로, 본 발견은 개체에서 면역계에 영향을 주는 방법을 제공하고, 특히 암을 치료하거나 전이를 예방하는 데 유용하지만, 이 접근법에 국한되지는 않는다.
대식세포는 다음 두 개의 별개의 표현형으로 구분될 수 있다: M1 및 M2 대식세포. M1 대식세포는 전염증성 사이토카인 및 보조 자극 분자를 대량 생산하는 고전적인 전염증성 대식세포이며 T-세포 반응의 활성화에 매우 효과적이다. 대조적으로, M2 대식세포는 항염증성 사이토카인을 합성하고 조절 T 세포를 유도하여 항원-구동된 T 세포 활성화를 크게 저해하는 면역 억제 세포이다. 종양 관련 대식세포(TAM)는 종양 환경 내에서 M2 대식세포(종양 촉진성 대식세포)로 성숙하고 항종양 면역 반응을 억제하고 암 성장에서 중요한 단계인 혈관신생 전환을 중재함에 따라 해롭다고 간주된다. M2 대식세포는 M1 대식세포(전염증성 대식세포)로 조절될 수 있으며, M2에서 M1로의 이러한 표현형 전환은 직접적으로 또는 간접적으로 종양 거부를 유발할 수 있다.
본 맥락에서, "M1 대식세포" 또는 "전염증성 대식세포"라는 표현은 대식세포/단핵구 TNF-알파(TNF-α) 분비 또는 HLA-DR 발현의 증가된 측정 수준을 특징으로하는 대식세포를 의미한다. M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절은 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 투여하기 전에 측정된 대조군 값 또는 동일한 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정 값과 비교하여 단핵구 TNF-α 분비 및 또한 HLA-DR 발현을 증가시킬 것이다. 이러한 마커의 수준은 개체마다 다를 수 있고, 예를 들면, 인터페론 감마와 같은 사이토카인 및 LPS 활성화가 M2 대식세포에 의해 TNF-α 발현을 증가시킬 수 있기 때문에, 단핵구 TNF-α 분비와 HLA-DR 발현의 측정 값을 동일한 환자의 값과 비교하는 것이 중요하다.
놀랍게도, M2 대식세포는 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제, 예를 들면, 본원에 정의된 바와 같은 항체 또는 이의 단편, 펩티드(들) 또는 거대분자(들)에 의해 상기 대식세포를 접촉시킴으로써 M1 대식세포를 조절하도록 활성화될 수 있음이 밝혀졌다. 특히, 악성 종양과 관련된 M2 대식세포는 TAM 상의 인간 CLEVER-1 에 결합할 수 있는 제제에 의해 상기 대식세포를 접촉시킴으로써 M1 대식세포로 조절되거나 재분극될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 두 표현형이 동시에 존재할 수 있으며, 두 표현형 모두가 종양에서 발견될 수 있다.
인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제, 예를 들면, 항원 또는 이의 단편, 펩티드(들) 또는 거대분자(들)는 대식세포 표현형의 상기 조절 또는 재분극화를 달성하기 위한 인간 CLEVER-1에 결합된다. CLEVER-1 단백질에 특이적인 제제가 본원에 정의된 특정 CLEVER-1 에피토프 서열을 인식한다는 것이 동정되었다.
TAM 상의 CLEVER-1 상의 2개 이상의 상기 에피토프에 대한 특이적 결합은 치료가 대식세포 표현형의 목적하는 조절을 달성하기 위한 특정 에피토프로 표적화될 수 있기 때문에 유해한 부작용 없이 암을 치료하거나 전이를 예방하기 위한 새로운 방법을 제공할 것이다. 결과적으로, 여기에 기재된 발견은 증가된 양의 종양 촉진성 대식세포 또는 개체가 면역 억제의 우위를 나타내는 만성 염증과 같은 다른 병리학과 관련된 모든 종류의 악성 종양의 치료 또는 예방에 특히 유용하다. 결과적으로, 암을 치료하거나 전이를 예방하는 방법은 개체에게 인간 CLEVER-1, 바람직하게는 상기 정의된 CLEVER-1 분자 상의 특정 에피토프에 결합할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 종양 크기를 감소시키고/시키거나; 개체에서 종양 성장을 감소시키고/시키거나; 암 세포 이행 및 전이 형성을 억제하여 암을 치료하거나 예방함을 포함한다. 따라서, 임의의 양성 또는 악성 종양 또는 악성 종양의 전이, 예를 들면, 피부암 및 결장암를 치료할 수 있다. 또한, 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종도 치료할 수 있다. 특히, 흑색종 및 림프종은 동물 모델에 기초한 치료에 매우 잘 반응할 것으로 기대된다.
대식세포는 또한 종양의 성장 또는 퇴화에 영향을 주는 것 외에 염증 및 감염 이완 동안 중요한 역할을 한다. 감염에서, M1에서 M2 대식세포로의 전환이 발생하여 이펙터 면역을 파괴하는 억압 환경을 생성할 수 있다. 결론적으로, 대식세포 표현형을 조절하기 위해 여기에 기재된 발견은 감염성 항원에 대한 면역 억제를 제거하기 위해 만성 감염 치료에도 유용하다. 또한, 본 발명은 CLEVER-1, 특히 본원에서 정의된 CLEVER-1 분자 상의 2개 이상의 특정 에피토프 서열에 결합할 수 있는 제제를 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 만성 감염을 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 제제는 그들의 표현형을 M2에서 M1으로 전환시키기 위해 대식세포를 활성화시킬 수 있다.
또한, 대식세포 및 단핵구 상의 CLEVER-1 분자에 결합할 수 있는 제제는 백신의 보조제로서 사용할 수 있다. 상기 제제는 대식세포의 재분극화를 달성하고, 따라서 백신 항원에 대한 면역 억제를 제거하거나 적어도 감소시킨다. 숙주 또는 백신 접종 부위가 일시적으로 면여 억제 요소로부터 제거될 수 있다면 임의의 항원 유도 백신 접종이 도움이 될 수 있다.
M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절은 인간 혈액 샘플로부터 단핵구 TNF-알파 분비를 측정함으로써 확인할 수 있다. 결과적으로, TNF-알파의 증가된 분비는 개체의 치료 반응을 모니터링하기 위한 마커로서 사용될 수 있다. TNF-알파 분비는 환자로부터 채취된 혈액으로부터 농축된 말초 혈액 단핵구로부터 결정될 수 있다. 수준이 상기 제제를 환자에게 투여하기 전에 동일 환자로부터 측정된 대조군 수준 또는 동일 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정 값과 비교되는 경우, 측정된 TNF-알파의 수준은 환자에서 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함하는 치료에 대한 환자 반응의 마커로서 사용될 수 있다.
CLEVER-1에, 바람직하게는 CLEVER-1 상의 상기 하나 둘 이상의 특정 에피토프 서열에 결합할 수 있는 제제가 환자에게 투여될 때, M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절 발달을 모니터링함으로써 항-CLEVER-1 요법의 효능을 평가하는 방법은
(a) 상기 환자로부터 채취된 혈액 샘플로부터 말초 혈액 단핵구(PBL)를 수득하는 단계;
(b) 상기 PBL의 TNF-α 분비를 측정하는 단계, 및/또는
(c) CD14 양성 PBL 상의 HLA-DR 발현을 측정하는 단계, 및
(e) 단계 (b) 및 (c)에서 측정된 TNF-α 분비 및/또는 HLA-DR 발현의 값을 항-CLEVER-1 치료 효능의 평가를 위한 대조군 값과 비교하는 단계로서, 상기 대조군 값이 상기 환자에서 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 투여하기 전에 측정된 값 또는 동일한 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정 값이며, 증가된 TNF-알파 분비 또는 HLA-DR 발현이 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 나타내는, 단계를 포함한다.
환자로부터 체취된 혈액 샘플로부터 수득된 말초 혈액 단핵구로부터 TNF-α 분비의 결정은 통상적으로 공지된 방법, 예를 들면, 시판 중인 TNF-알파 ELISA 키트를 사용하여 수행할 수 있다. CD14 양성 단핵구 상의 HLA-DR 발현은 또한 유동 세포 계측법에 의한 공지된 방법을 사용하여 모니터링할 수 있다.
M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절 발달은 단핵구 TNF-알파 분비의 측정된 수준을 환자에서 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제를 투여하기 전에 측정된 대조군 값 또는 동일한 환자에서 상이한 시점에 수행된 하나 이상의 이전 측정 값과 비교함으로써 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 이전 측정 결과 또는 대조군에 비해 단핵구 TNF-알파 분비의 감소된 수준을 사용하여 M2 대식세포의 보다 높은 발현을 나타낼 수 있지만, 이전 측정 결과 또는 대조군과 비교하여 TNF-알파의 증가된 수준은 M1 대식세포의 더 많은 발현이 M2 대식세포의 더 낮은 발현을 갖는다는 것을 나타내기 위해 사용될 수 있으며, 이는 또한 항-CLEVER-1 치료의 효능을 나타내기 위해 사용될 수 있다. TNF-알파의 증가된 수준은 M2 대식세포의 발현이 낮은 M1 대식세포의 더 많은 발현을 나타내고, 즉 상기 요법에 대한 반응성을 부여한다. CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제는 M1 대식세포로 재분극화하기 위해 M2 대식세포의 적어도 일부를 활성화시키고, 상기 제제의 투여 후 두 대식세포 표현형이 존재할 수 있지만, 상기 제제의 투여 전 상황과 비교하여 M1 대식세포의 증가된 발현이 관찰될 수 있다. 전형적으로, 대조군 값과 비교하여 측정된 TNF-알파 분비의 적어도 2배 증가는 M2 대식세포의 M1 대식세포로의 조절을 나타내고, 따라서 요법에 대한 환자의 반응성을 나타낸다.
치료에 반응하는 질환
면역 활성화와 억제의 균형은 또는 사람 (또는 동물)에서 태어나거나 들어온 이물질에 대항하여 싸우는 인간 (또는 동물)의 항상성에 매우 중요하다. 문헌(참조: Palani et al. (2016))의 예는 이의 생리학적 예이고, 국소적인 면역 억제가 모체 면역 방어가 지배적인 환경에서 태아의 웰빙에 얼마나 중요한지를 보여준다. 일부 병원균(예: 결핵)이 숙주 면역계에 대해 유사한 은폐 기전을 이용하고 만성 감염 부위(간염)를 확립할 수 있기 때문에, 동일한 것이 만성 감염에서 발생할 수 있다. 이러한 국소적인 면역 억제를 제거하는 것은 이러한 내성 병원균에 대한 백신 접종을 개선하는 것처럼 숙주가 이들 감염에 대항하여 싸울 수 있도록 도울 수 있었다.
종양은 이 면역 억제를 그들의 이익에도 적용시켰다. 악성 종양의 크기를 감소시키고; 악성 종양 성장을 감소시키고/시키거나; 암 세포 이행 및 전이 형성을 억제함으로써 암을 치료하거나 예방하기 위한 본 발명에 따르는 방법은 모든 형태의 암에 적용 가능하다. 따라서, 임의의 양성 또는 악성 종양 또는 악성 종양, 예를 들면, 피부암 및 결장암의 전이가 치료될 수 있다. 또한, 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종도 치료할 수 있다. 특히, 흑색종 및 림프종은 동물 모델에 기초한 치료에 매우 잘 반응할 것으로 기대된다.
본 발명자들은 CLEVER-1에 결합할 수 제제 또는 본 발명에 따르는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편 또는 본 발명에 따르는 약제학적 조성물이 모든 종류의 육종, 예를 들면, 섬유 육종, 지방 육종, 연골 육종, 골육종, 혈관 육종, 림프관 육종, 평활근 육종 및 횡문근 육종, 중피종, 수막종, 백혈병, 림프종뿐만 아니라 모든 종류의 암종, 예를 들면, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 유두상 암종, 낭선 암종, 기관지 암종, 흑색종, 신장 세포 암종, 간세포 암종, 이행 세포 암종, 융모 암종, 준 종양 및 배아 암종을 치료하거나 예방하는 데 유용하다.
개체에서 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 또는 본 발명에 따르는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편 또는 약제학적 조성물은 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절하여 종양 또는 항원 유도 면역억제를 제거하는 데 사용하기에 적합하고, 여기서 상기 제제는 본원에서 정의된 인간 CLEVER-1의 에피토프 서열에 결합한다.
개체에서 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 또는 본 발명에 따르는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편 또는 약제학적 조성물은 악성 종양의 크기를 감소시키고; 개체에서 악성 종양 성장을 감소시키고/시키거나; 암 세포 이행 및 전이 형성을 억제함으로써 암을 치료하거나 예방하는 데 사용하기에 적합하고, 여기서 악성 성장 주위의 면역 억제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 제거된다.
개체에서 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 또는 본 발명에 따르는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편 또는 약제학적 조성물은 또한 개체에서 만성 감염을 치료하는 데 사용하기에 적합하고, 여기서 감염성 항원에 대한 면역 억제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 제거된다.
개체에서 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제 또는 본 발명에 따르는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편 또는 약제학적 조성물은 또한 백신의 보조제로서 사용하기에 적합하고, 여기서 백신 항원에 대한 면역 억제는 M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절함으로써 제거된다.
M2 대식세포를 M1 대식세포로 조절하는 방법은 이를 필요로 하는 환자에게 CLEVER-1에 결합할 수 있는, 바람직하게는 본원에서 정의된 바와 같은 CLEVER-1 분자 상의 특정 서열에 결합할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 암을 치료하거나, 개체에서 전이를 예방하거나, 개체에서 만성 감염을 치료하는 데 사용될 수 있다. 치료 반응은 상기 PBL의 TNF-α 분비 및/또는 본원에서 기재된 바와 같은 CD14 양성 PBL 상의 HLA-DR 발현을 측정함으로써 확인할 수 있다.
투여 경로, 제형 및 필요한 투여량
본 발명에서 사용되는 약제학적 조성물은 그들의 의도된 목적을 달성하는 임의의 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 투여는 정맥내, 관절내, 종양내 또는 피하일 수 있다. 약리학적 활성 화합물 이외에, 화합물의 약제학적 제제는 바람직하게는 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 활성 화합물의 처리를 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다.
선택된 투여량은 치료될 질환에 대해 치료적으로 효과적이어야 한다. 따라서, 면역억제는 치료의 목표로 하는 결과를 근본적으로 위태롭게 하는 효과 없이 질환을 치료하기에 충분해야 하다. 암을 치료하거나 예방할 때, 투여량은 악성 종양의 크기를 감소시키고, 악성 종양 성장을 감소시키고/시키거나 암 세포 이행 및 전이 형성을 억제하기에 충분해야 한다. 투여량은 투여된 제제의 회전율에 의존하지만, 전형적으로 이들 치료는 2 내지 4주 간격으로 1 내지 5mg/kg의 섭생을 따른다.
실시예
다음 실험 섹션은 실시예를 제공하여 본 발명을 설명한다.
실시예 1 내지 10은 인간 CLEVER-1의 불연속 에피토프 맵핑 및 복합 인간 항체TM 기술을 사용하여 3-372 마우스 모노클로날 항체(2001년 8월 21일에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 DSM ACC2520)로부터 인간화 항체의 생성을 예시한다. 면역 활성화를 촉진시키는 항-CLEVER-1 항체 능력은 실시예 11 내지 14에 예시된다.
실시예 1은 인간 CLEVER-1을 표적화하는 항체의 완전 불연속 에피토프 맵핑을 예시한다.
실시예 2 내지 6은 항-Clever 1 항체 클론 3-372의 중쇄 및 경쇄 V 영역(VH 및 VK) 서열의 결정 및 3-372 가변 영역 및 인간 IgG4 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 키메라 항체의 생산을 예시한다. mRNA는 하이브리도마 클론 3-372으로부터 추출하고, 역 전사시키고, PCR 증폭시키고, 항체 특이적 전사체를 클로닝하였다. 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 결정하고, 서열 데이터의 분석은 안티토프의 독점적인 복합 인간 항체™ 기술을 사용하여 인간화를 위해 수행하였다.
실시예 2 내지 6은 다음을 입증한다: 3-372 마우스 항-Clever 1 항체의 가변 영역이 클로닝되고 서열 분석되었다. 가변 영역 유전자는 인간 IgG4(S241P) 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역과 결합되고 NS0 세포에서 발현되어 키메라 항-Clever 1 항체를 생성한다. NS0 유래된 키메라 항체로부터 경쟁 ELISA 검정은 Clever-1에 대한 키메라 항체의 결합 효율이 모체 뮤린 항체의 결합 효율과 유사함을 입증하기 위해 사용되었다.
실시예 7 내지 10은 인간 Clever-1에 대한 결합을 위해 발현되고 시험된 항-CLEVER-1 복합 인간 항체TM의 설계를 예시한다. 항-CLEVER-1의 구조 및 결합에 관여하는 핵심 잔기는 구조 및 상동성 모델링에 의해 결정되어 '구속 잔기 맵'을 생성했다. 구속 잔기 맵은 비관련된 인간 항체 서열을 함유하는 데이터베이스로부터 인간 V 영역 서열의 세그먼트를 공급하는 주형으로서 사용되었다. 각각 선택된 서열 세그먼트뿐만 아니라 세그먼트 사이의 접합부는 인 실리코(in silico)(iTope™ 및 TCED™) 분석을 사용하여 점재적인 T 세포 에피토프의 존재에 대해 시험하였다. 이 방법을 사용하여 모든 복합 인간 항체™ 서열 변이체가 T 세포 에피토프를 피하도록 설계되었다. 복합 인간 항체™ V 영역 유전자는 선택된 인간 서열 세그먼트의 조합을 코딩하는 합성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 생성되었다. 이어서, 이들을 인간 IgG4(S241P) 중쇄 및 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 벡터로 클로닝하고, 항체를 생성하고, 원래의 참조 뮤린 모노클로날 항체와 비교하여 경쟁 ELISA에 의해 표적 항원에 대한 결합을 시험하였다.
실시예 7 내지 10은 4개의 VH 및 5개의 VK 복합 인간 항체™ V 영역의 작제를 입증한다. 복합 중쇄 및 경쇄의 조합을 NS0 세포에서 발현시키고, 정제하고 경쟁 ELISA 검정에서 CLEVER-1에 대한 결합에 대해 시험하였다. 결과는 CLEVER-1에 대한 다수의 복합 인간 항체™의 결합 효율은 키메라 참조 항체의 결합 효율처럼 적어도 양호했고, 몇몇은 현저하게 더 양호했다. 잠재적인 글리코실화 부위 및 짝이 없는 시스테인의 부재 및 생성된 발현 및 결합 효율 데이터 세트에 기초하여, 다음과 같이 3개의 잠재적인 선례가 설계되었다: VH2/VK5, VH3/VK5 및 VH4/VK5.
실시예 11 내지 12는 인간 말초 혈액 단핵구 상의 항-CLEVER-1 항체 결합 및 인간 말초 혈액 단핵구 상의 활성화 TNF-알파 분비를 예시한다. 실시예 13은 마우스 동계 암 모델에서 종양-관련 대식세포에 대한 항-CLEVER-1 항체의 작용 방식을 예시한다.
실시예 14는 9-11 및 3-372 항체와의 CLEVER-1 결찰이 인간 말초 혈액 단핵구에서 mTOR 및 c-Jun 신호 전달에 대한 반대 효과를 촉진시킨다는 것을 예시한다.
실시예 1
인간 CLEVER-1의 완전 불연속 에피토프 맵핑
펩스캔(Pepscan) 분석을 사용하여 4개의 항체에 대한 잠정적인 불연속 에피토프를 확립하였다. 항체 FAR02 VH3/VK5 및 FU-HI-3-372는 동일한 불연속 에피토프를 표적화하는 반면, 항체 3-266 및 AK FUMM 9-11은 다른 별개의 에피토프를 표적화한다. 이 연구는 Pepscan Presto BV (Zuidersluisweg 2, 8243RC Lelystad, The Netherlands)에서 수행되었다.
항체 3-266, FAR02 VH3/VK5, FU-HI-3-372 및 AK FUMM 9-11은 Faron Pharmaceuticals Oy에 의해 제공되었다.
표적 단백질 인간 CLEVER-1, 즉 인간 스타빌린-1은 서열 번호 31에 의해 정의된다. 디설파이드 브릿지는 잔기를 연결한다(Uniprot STAB1_HUMAN 넘버링):
112 126 | 120 136 | 138 147 | 160 171 | 164 181 | 183 192
199 210 | 204 217 | 236 247 | 241 257 | 259 270 | 732 746
740 756 | 758 767 | 822 837 | 831 846 | 865 879 | 873 889
891 902 | 908 922 | 916 932 | 934 945 | 951 964 | 958　974
CLIPS 기술
사용된 CLIPS 기술은 정의된 3차원 구조에 펩티드를 구조적으로 고정시킨다. 이는 심지어 가장 복잡한 결합 부위의 기능적 모방체를 초래한다. CLIPS 기술은 이하 펩티드 라이브러리를 단일, 이중 또는 삼중 루프 구조뿐만 아니라 시트형 및 나선형 중첩으로 형성시키는 데 일상적으로 사용된다. CLIPS 반응은 CLIPS 스캐폴드의 브로모 그룹과 시스테인의 티올 측쇄 사이에서 일어난다. 반응은 온화한 조건하에서 빠르고 특이적이다. 이 고급 화학을 사용하여 천연 단백질 서열은 다양한 구조의 CLIPS 작제물로 형질전환된다(참조: Timmerman et al., J. Mol. Recognit. 2007; 20: 283-29).
CLIPS 라이브러리 스크리닝은 조합 매트릭스 설계를 사용하여 표적 단백질의최대 10,000개의 중첩 펩티드 작제물의 라이브러리로의 전환으로 개시한다. 고체 담체 상에서, 선형 펩티드의 매트릭스가 합성되고, 이어서 공간적으로 정의된 CLIPS 작제물로 형성된다. 올바른 형태의 불연속 에피토프의 두 부분을 나타내는 작제물은 검출되고 정량화된 고친화도로 항체와 결합한다. 불완전 에피토프를 제시하는 작제물은 보다 낮은 친화도로 항체를 결합하는 반면, 에피토프를 함유하지 않는 작제물은 전혀 결합하지 않는다. 친화도 정보는 에피토프의 서열 및 형태를 상세하게 정의하기 위해 반복 스크린에서 사용된다. 불연속 형태 에피토프를 함유 하는 표적 단백질은 매트릭스 라이브러리로 전환된다. 조합 펩티드는 독점적인 미니카드 상에서 합성되고 공간적으로 정의된 CLIPS 작제물로 화학적으로 전환된다.
히트 맵 분석
히트 맵은 2차원 맵의 변수에 의해 취해진 값이 컬러로 표현되는 데이터의 그래프 표현이다.
이중 루프 CLIPS 펩티드의 경우, 이러한 2차원 맵은 제1 및 제2 루프의 독립적인 서열로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 16개의 CLIPS 펩티드의 서열은, 예를 들면, 루프 1에서, 예를 들면, 4개의 독특한 하위 서열 및, 예를 들면, 루프 2에서, 예를 들면, 4개의 독특한 하위 서열의 효과적인 순열이다. 따라서, 관찰된 ELISA 데이터는 4 × 4 매트릭스로 플롯팅할 수 있고, 여기서 각 X 좌표는 제1 루프의 서열에 상응하고, 각 Y 좌표는 제2 루프의 서열에 상응한다.
시각화를 추가로 촉진시키기 위해, ELISA 값은 연속 구배로부터의 컬러로 대체될 수 있다. 예를 들면, 매우 낮은 값은 그린으로, 매우 높은 값은 레드로, 평균 값은 블랙으로 착색될 수 있다.
펩티드의 합성
표적 분자의 에피토프를 재작제하기 위해, 펩티드의 라이브러리를 합성했다. 아미노 작용화 폴리프로필렌 지지체는 독점적인 친수성 중합체 제형에 의한 그래프팅 후, N하이드록시벤조트리아졸(HOBt)을 갖는 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)를 사용하는 3급-부틸옥시카보닐-헥사메틸렌디아민(BocHMDA)과의 반응 및 트리플루오로아세트산(TFA)을 사용하는 Boc-그룹의 후속적인 절단에 의해 수득되었다. 표준 Fmoc-펩티드 합성은 맞춤 변형된 JANUS 액체 처리 스테이션(Perkin Elmer)에 의해 아미노 작용화 고체 지지체 상에서 펩티드를 합성하는 데 사용되었다.
구조적 모방체의 합성은 스캐폴드 상의 펩스캔의 독점적인 화학적으로 연결된 펩티드(CLIPS) 기술을 사용하여 수행하였다. CLIPS 기술은 펩티드를 단일 루프, 이중 루프, 삼중 루프, 시트형 중첩, 나선형 중첩 및 이들의 조합으로 구조화할 수 있게 한다. CLIPS 주형은 시스테인 잔기에 결합된다. 펩티드 내의 다수의 시스테인의 측쇄는 하나 또는 두 개의 CLIPS 주형에 결합된다. 예를 들면, P2 CLIPS(2,6-비스(브로모메틸)피리딘)의 0.5mM 용액을 중탄산암모늄(20mM, pH 7.8)/아세토니트릴(1:3(v/v))에 용해시킨다. 이 용액을 펩티드 어레이에 첨가한다. CLIPS 주형은 펩티드-어레이의 고체-상 결합 펩티드(3㎕ 웰을 갖는 455개 웰 플레이트)에 존재하는 2개의 시스테인의 측쇄에 결합할 것이다. 펩티드 어레이를 용액으로 완전히 피복시키면서 30분 내지 60분 동안 용액에서 부드럽게 진탕시킨다. 마지막으로, 펩티드 어레이를 과량의 H2O로 광범위하게 세척하고, 70℃에서 30분 동안 PBS(pH 7.2) 중 1% SDS/0.1% 베타-머캅토에탄올을 함유하는 파쇄 완충액에서 초음파 처리한 후, H2O에서 추가의 45분 동안 초음파 처리했다. 펩티드를 운반하는 T3 CLIPS는 이하 3개의 시스테인을 사용하지만 유사한 방식으로 만들어졌다.
ELISA 스크리닝
합성된 펩티드 각각에 대한 항체의 결합은 PEPSCAN-기반 ELISA로 시험하였다. 펩티드 어레이를 1차 항체 용액으로 배양하였다(4℃에서 밤새). 세척 후, 펩티드 어레이를 25℃에서 1시간 동안 적절한 항체 퍼옥시다아제 접합체(SBA; 표 1)의 1/1000 희석물로 배양하였다. 세척 후, 퍼옥시다제 기질 2,2'-아지노-디-3-에틸벤즈티아졸린 설포네이트(ABTS) 및 20㎕/ml의 3% H2O2를 첨가했다. 1시간 후, 발색을 측정했다. 발색은 전하 결합 장치(CCD)- 카메라 및 화상 처리 시스템으로 정량화했다.
항체의 상세
명칭 공급자 카탈로그 번호
염소 항-인간 HRP 접합체 사우던 바이오테크
(Southern Biotech)		 2010-05
토끼 항-마우스 IgG (J+L) HRP 접합체 사우던 바이오테크 6175-05
염소 항-랫트 IgM+IgG (H+L) HRP 접합체 사우던 바이오테크 2010-05
Langedijk et al. (2011). Helical peptide arrays for lead identification and interaction site mapping, Analytical Biochemistry 417 : 149-155
펩티드 설계
상이한 세트의 펩티드가 다음 설계에 따라 합성되었다. 일부 세트에서는 펩티드가 무작위 순서로 합성되었음에 유의한다. 실제 펩티드 순서가 아래에 제시된다.
세트 1
모방 유형 선형
라벨 LIN
기술 1개 잔기의 오프셋을 갖는 인간 Clever-1의 표적 서열로부터 유도된 선형 15-mer 펩티 드.
서열 (처음 10개)
QVLFKGCDVKTTFVT
VLFKGCDVKTTFVTH
LFKGCDVKTTFVTHV
FKGCDVKTTFVTHVP
KGCDVKTTFVTHVPC
GCDVKTTFVTHVPCT
CDVKTTFVTHVPCTS
DVKTTFVTHVPCTSC
VKTTFVTHVPCTSCA
KTTFVTHVPCTSCAA
세트 2
모방 유형 선형
라벨 LIN.AA
기술 위치 10 및 11에 Ala로 대체된 잔기를 갖는 1 세트 1의 펩티드. 천연 Ala가 어느 하나의 위치에서 발생하면, 이는 Gly로 대체된다.
서열 (처음 10개)
GAETPCNGHAACLDG
LTMANQVLAAAISEE
ILLPPTILPAAPKHC
DRNGTCVCQAAFRGS
PGYTQQGSEAAAPNP
PIDPCRAGNAACHGL
HTDALCSYVAAGQSR
KGCDVKTTFAAHVPC
CQALNTSTCAANSVK
RAVGGGQRVAACPPG
세트 3
모방 유형 선형
라벨 LIN20.C
기술 1개 잔기의 오프셋을 갖는 인간 Clever-1의 표적 서열로부터 유도된 길이 20의 선형 펩 티드. Cys 잔기는 아세트이미도메틸(Acm, "2"로 표시됨)로 보호된다.
서열 (처음 10개)
2H2PENYHGDGMV2LPKDP2
SGWLRELPDQITQD2RYEVQ
LAQH2HLHAR2VSQEGVAR2
IKKQT2PSGWLRELPDQITQ
2RESEVGDGRA2YGHLLHEV
QRV2T2PPGFGGDGFS2YGD
NGVFHVVTGLRWQAPSGTPG
AT2QVTADGKTS2V2RESEV
KYSYKYKDQPQQTFNIYKAN
2VYIHDPTGLNVLKKG2ASY
세트 4
모방 유형 선형
라벨 LIN25.C
기술 1개 잔기의 오프셋을 갖는 인간 Clever-1의 표적 서열로부터 유도된 길이 25의 선형 펩 티드. Cys 잔기는 Acm("2")으로 보호된다.
서열 (처음 10개)
KKG2ASY2NQTIMEQG22KGFFGPD
PD2QSV2S2VHGV2NHGPRGDGS2L
GPGQSR2T2KLGFAGDGYQ2SPIDP
IFPKE2VYIHDPTGLNVLKKG2ASY
PTILPILPKH2SEEQHKIVAGS2VD
ENFRGSA2QE2QDPNRFGPD2QSV2
QNTQ2SAEAPS2R2LPGYTQQGSE2
GRV2VAIDE2ELDMRGG2HTDAL2S
APSGTPGDPKRTIGQILASTEAFSR
DGMV2LPKDP2TDNLGG2PSNSTL2
세트 5
모방 유형 구속된 펩티드, mP2 CLIPS
라벨 LOOP
기술 길이 17의 펩티드. 위치 2 내지 16에 표적 단백질로부터 유도된 15-mer 서열이 존재한 다. 위치 1 및 17에 mP2 CLIPS에 의해 결합 된 Cys가 존재한다. 천연 Cys 잔기는 Acm("2")으로 보호된다.
서열 (처음 10개)
CL2SYVGPGQSR2T2KC
C2SYVGPGQSR2T2KLC
CSYVGPGQSR2T2KLGC
CYVGPGQSR2T2KLGFC
CVGPGQSR2T2KLGFAC
CGPGQSR2T2KLGFAGC
CPGQSR2T2KLGFAGDC
CGQSR2T2KLGFAGDGC
CQSR2T2KLGFAGDGYC
CSR2T2KLGFAGDGYQC
세트 6
모방 유형 선형 디설파이드 모방체
라벨 CYS22
기술 인간 CLEVER-1에 대한 디설파이드 브릿지에 대한 Uniprot 정보에 기초하여 설계된 길이 22의 선형 디설파이드 모방체. 디설파이드 브릿지 형성에 참여하지 않는 모방체 내의 Cys 잔기는 Acm("2")으로 보호된다.
서열 (처음 10개)
WGSR2HECPGGAETP2NGHGTC
SR2HECPGGAETP2NGHGTCLD
2HECPGGAETP2NGHGTCLDGM
ECPGGAETP2NGHGTCLDGMDR
GAETPCNGHGT2LDGMDRNGTC
ETPCNGHGT2LDGMDRNGTCV2
PCNGHGT2LDGMDRNGTCV2QE
LDGMDRNGT2VCQENFRGSACQ
GMDRNGT2VCQENFRGSACQE2
DRNGT2VCQENFRGSACQE2QD
세트 7
모방 유형 조합 디설파이드 브릿지 모방체
라벨 CYS27
기술 길이 27의 조합 펩티드. 위치 1 내지 11 및 16 내지 27에 "GGSGG" 링커에 의해 결합된 7 페이지 상의 표적 서열로부터 유도된 11-mer 서열이 존재한다. 이 펩티드 세트는 Uniprot 로부터 수득된 디설파이드 브릿지 정보에 기 초하여 설계되었다. 디설파이드 브릿지 형 성에 참여하지 않는 모방체 내의 Cys 잔기는 Acm("2")으로 보호된다.
서열 (처음 10개)
PGYWGSR2HECGGSGGAETP2NGHGTC
YWGSR2HECPGGGSGGAETP2NGHGTC
GSR2HECPGGAGGSGGAETP2NGHGTC
R2HECPGGAETGGSGGAETP2NGHGTC
HECPGGAETP2GGSGGAETP2NGHGTC
CPGGAETP2NGGGSGGAETP2NGHGTC
PGYWGSR2HECGGSGGTP2NGHGTCLD
YWGSR2HECPGGGSGGTP2NGHGTCLD
GSR2HECPGGAGGSGGTP2NGHGTCLD
R2HECPGGAETGGSGGTP2NGHGTCLD
세트 8
모방 유형 불연속 매트릭스, T3 CLIPS
라벨 MAT
기술 길이 33의 펩티드. 위치 2 내지 16 및 18 내지 32에 인간 Clever-1의 표적 서열로부터 유도된 15-mer 펩티드가 존재한다. 위치 1, 17 및 33에 T3 CLIPS에 의해 결합된 Cys 잔 기가 있다. 천연 Cys 잔기는 Acm("2")으로 보호된다.
서열 (처음 10개)
CPNRFGPD2QSV2S2VCV2S2VHGV2NHGPRGC
CHGDGMV2LPKDP2TDCSAG2FAF2SPFS2DRC
C2VD2QALNTST2PPNCPKH2SEEQHKIVAGSC
CPKH2SEEQHKIVAGSCGPD2TQ2PGGFSNP2C
CRYEVQLGGSMVSMSGCVP2TS2AAIKKQT2PC
CHKIVAGS2VD2QALNCIHMLDGILLPPTILPC
CF2T2RPGLVSINSNACVTADGKTS2V2RESEC
C2VYIHDPTGLNVLKKCGSGGV2QQGT2APGFC
CLRVAVAMMDQG2REICDGRA2YGHLLHEVQKC
CYSYKYKDQPQQTFNICHEVQKATQTGRVFLQC
스크리닝 세부 사항
항체 결합은 항체의 농도 및 ELISA 완충제 내 경쟁 단백질의 양 및 성질을 포함하는 인자들의 조합에 의존한다. 또한, 프리-코트 조건(실험 샘플에 의한 배양 전에 펩티드 어레이의 특정 처리)은 결합에 영향을 미친다. 이러한 세부 사항은 표 2에 요약되어 있다. 펩스캔 완충제 및 사전 조정(SQ)의 경우, 숫자는 경쟁 단백질 (말 혈청과 난백 알부민의 조합)의 상대적 양을 나타낸다.
스크리닝 조건
라벨 희석 샘플 완충제 사전 조정
3-266 5 μg/ml 10%SQ 10%SQ
AK FUMM 9-11 1 μg/ml 50%SQ 50%SQ
FAR02 VH3/VK5 3 μg/ml 1%SQ 1%SQ
FU-HI_3-372 5 μg/ml 1%SQ 1%SQ
결과
항체 3-266
매우 엄격한 조건하에서 시험했을 때, 항체 3-266은 어레이 상에 존재하는 임의의 펩티드와 결합하지 않았다. 낮은 엄격한 조건하에서 시험했을 때, 항체는 모든 세트의 펩티드를 결합시켰다. 간단한 에피토프 모방체로 수득된 결과는 서열 1030QWLKSAGITLPADRR1044가 에피토프의 우세한 부분을 나타낸다는 것을 시사한다. 조합 에피토프 모방체로 수득된 데이터(도 1)는 항체가 추가로 서열 857LHARCVSQEGVARCR871을 인식한다는 것을 시사한다. 더욱이, 약하고 일관된 신호가 서열 435TMNASLAQQLCRQHI450을 갖는 펩티드에 대해 기록되었다. 도 1a는 세트 8(불연속 에피토프 모방체) 상의 항체 3-266에 대해 수득된 결과의 히트맵 표현을 도시한다. 평균 신호는 블랙으로 플롯팅되고, 매우 높은 신호는 밝게 플롯팅된다. 박스 영역이 확대된다.
항체 AK FUMM 9-11
매우 엄격한 조건하에서 시험했을 때, 항체 AK-FUMM 9-11은 모든 세트의 펩티드를 결합시켰다. 간단한 에피토프 모방체로 수득된 결과는 항체 885PSNPCSHPDRGG896이 에피토프의 우세한 부분을 나타낸다는 것을 시사한다. 조합 에피토프 모방체로 수득된 데이터는 항체가 서열 166FRGSACQECQDPNRF180(도 1b)을 함유하는 조합 에피토프 모방체를 부가적으로 인식한다는 것을 시사한다. 도 1b는 세트 8(불연속 에피토프 모방체) 상의 항체 AK FUMM 9-11에 대해 수득된 결과의 히트맵 표현을 도시한다. 평균 신호는 블랙으로 플롯팅되고, 매우 높은 신호는 밝게 플롯팅된다. 박스 영역이 확대된다.
항체 FAR02 VH3/VK5 및 FU-HI:3-372
매우 엄격한 조건하에서 시험했을 때, 항체 FAR02 VH3/vk5 및 FU-HI-3-372는 어레이 상에 존재하는 임의의 펩티드를 결합하지 않았다. 낮은 엄격한 조건하에서 시험했을 때, 이들 항체는 세트 8의 펩티드만을 특이적으로 결합시켰다(도 2). 불연속 모방체로 수득된 결과의 분석은 항체가 서열 390ATQTGRVFLQ399(서열 번호 3), 420PFTVLVPSVSSFSSR434(서열 번호 1), 473QEITVTFNQFTK484(서열 번호 2), 576DSLRDGRLIYLF587(서열 번호 4), 615SKGRILTMANQVL627(서열 번호 5)로 구성된 불연속 에피토프를 인식한다는 것을 시사하고, 여기서 서열 473QEITVTFNQFTK484(서열 번호 2) 및 420PFTVLVPSVSSFSSR434(서열 번호 1)는 코어 에피토프를 나타내는 것으로 나타난다. 추가의 더 약한 신호가 서열 313LCVYQKPGQAFCTCR327(서열 번호 6)을 함유하는 불연속 모방체에 대해 기록되었다. 단순한 에피토프 모방체로 수득된 결과는 에피토프 호출을 허용하지 않는다. 도 2는 세트 8(불연속 에피토프 모방체) 상의 항체 FU-HI-3-372에 대해 수득된 결과의 히트맵 표현을 도시한다. 평균 신호는 블랙으로 플롯팅되고, 매우 높은 신호는 밝게 플롯팅된다. 박스 영역이 확대된다.
결론
항체는 펩스캔 펩티드 어레이에 대해 시험하였다. 모든 모노클로날 항체에 대한 잠정적인 불연속 에피토프를 동정할 수 있었다. 에피토프를 포함하는 펩티드 서열은 표 3에 열거되어 있다. 항체 3-266 및 AK FUMM 9-11은 별개의 불연속 에피토프를 결합한다. 항체 FAR02 VH3/VK 5 및 FU-HI-3-372는 어레이 상에서 시험했을 때 본질적으로 매우 유사한 결합 패턴을 나타내었고, 따라서 FAS1/FAS2 도메인에서 동일한 불연속 에피토프를 인식하는 것으로 나타났다.
발견된 에피토프
항체 에피토프 서열 도메인
3-266 1030 QWLKSAGITLPADRR 1044
857LHARCVSQEGVARCR871
435TMNASLAQQLCRQHI450 		FAS 3
EGF-형 6 FAS 1
AK FUMM 9-11 885 PSNPCSHPDRGG 896
166 FRGSACQECQDPNRF 180 		EGF-형 6
EGF-형 1
FAR02 VH3/VK5 + FU-HI-3-372 420 PFTVLVPSVSSFSSR 434
473 QEITVTFNQFTK 484
390ATQTGRVFLQ399
576DSLRDGRLIYLF587
615SKGRILTMANQVL627 		FAS 1
FAS 1
FAS 1
FAS 2
FAS 2
상기 언급된 항체에 대해 동정된 잠정적인 에피토프를 시각적으로 비교하기 위해, 도 3의 개략도를 사용했다. 이 개략도는 스타빌린-1 (CLEVER-1) 도메인 조직을 나타내는 문헌(참조: Kzhyshkowska, TheScientificWorldJOURNAL (2010) 10, 2039-2053)의 도 1로부터 개조되었다. 도 3은 CLEVER-1(표적 서열 당 aa_25-1027)의 도메인 조직을 개략적으로 도시한다. 화살표는 동정된 결합 모티프의 상대적 위치를 나타낸다. 순환 화살표는 지배적인 에피토프 코어의 위치를 나타낸다.
실시예 2
mRNA 추출, RT-PCR 및 클로닝
mRNA는 하이브리도마 세포(PolyA Tract system, Promega 카탈로그 번호 Z5400)로부터 성공적으로 추출하였다. RT-PCR은 단일 불변 영역 프라이머를 갖는 뮤린 신호 서열에 대한 축퇴 프라이머 풀을 사용하여 수행하였다. 중쇄 가변 영역 mRNA는 6개의 축퇴 프라이머 풀의 세트(HA 내지 HF)를 사용하여 증폭시키고, 경쇄 가변 영역 mRNA는 8개의 퇴화 프라이머 풀의 세트(κA 내지 κG 및 λA)를 사용하여 증폭시켰다. 증폭 생성물은 중쇄 프라이머 풀 HD 및 경쇄 프라이머 풀 κB, κC 및 κG로 수득하여 경쇄가 κ 클러스터(도 4)로부터 유래된다는 것을 확인했다. 각 생성물을 클로닝하고, 각각으로부터 일부 클론을 서열분석했다.
이 방법론을 사용하여, 단일 VH 서열[서열 번호 32 (염기 서열) 및 서열 번호 33 (아미노산 서열)]은 풀 HD에서 동정되었고, 단일 기능적 Vκ 서열[서열 번호 34 (염기 서열) 및 서열 번호 35 (아미노산 서열)]은 프라이머 풀 κG에서 동정되었다. 중쇄의 CDR은 염기 91-111 (서열 번호 7), 154-210 (서열 번호 8) 및 298-333 (서열 번호 9)으로부터 연장되고; 경쇄의 CDR은 염기 70-105 (서열 번호 10), 151-171 (서열 번호 11) 및 268-294 (서열 번호 12)로부터 연장된다. CDR 정의와 단백질 서열 넘버링은 카바트(Kabat)에 따른다. 하이브리도마 융합 파트너 SP2/0 (GenBank M35669)과 통상적으로 관련된 비정상적인 κ 경쇄 전사체가 또한 프라이머 풀 κB 및 κC에서 동정되었다.
도 4는 하이브리도마 3-372 RT-PCR 생성물의 1% 아가로스 겔 분리를 도시한다. 겔은 SYBR® 그린 염료(Invitrogen 카탈로그 번호 S-7567)로 염색하고, 자외선 광으로 촬영했다. 크기 마커는 GeneRuler™ 1Kb Plus (Fermentas 카탈로그 번호 SM1331)이다. 박스는 클로닝 및 서열 분석을 위해 단리된 밴드를 나타낸다.
실시예 3
서열 분석
3-372를 발현하는 하이브리도마로부터 수득된 서열 분석은 표 4에 요약된다.
3-372 항체 서열 분석a
H-쇄 L-쇄
CDR 1 길이 7aa 12aa
CDR 2 길이 16aa 7aa
CDR 3 길이 12aa 9aa
가장 가까운 인간 생식 세포 b IGHV2-5*10 (73%) IGKV3D-20*01 (65%)
가장 가까운 인간 FW1 b IGHV2-70*06 (73%) IGKV1D-17*01 (68%)
가장 가까운 인간 FW2 b IGHV2-5*09 (86%) IGKV1D-39*01 (73%)
가장 가까운 인간 FW3 b IGHV2-70*13 (72%) IGKV1D-43*01 (78%)
가장 가까운 인간 J b IGHJ1 (91%) IGKJ4 (80%)
a 카바트에 따르는 CDR 정의 및 서열 넘버링
b 상동성 %가 이어지는 생식세포 ID(들)를 나타냄
뮤린 3-372 가변 도메인 서열의 구조 및 상동성 분석은 항원 결합에 중요하거나 중요할 것으로 여겨진("구속 잔기") 중쇄 가변 영역에서 4개의 골격 잔기 및 경쇄 가변 영역에서 5개의 골격 잔기를 동정하였다. 추가의 서열 데이터베이스 분석은 인간 골격 세그먼트가 모든 바람직한 구속 잔기 및 모든 CDR 잔기를 포함하여 복합 인간 항체™의 작제를 가능하게 하는 것으로 밝혀질 수 있음을 나타냈다.
또한, 3-372 V 영역이 일부 특이한 특징을 함유한다는 것이 주시되었다. VH 쇄는 잔기 30이 N이고 32가 S이기 때문에 CDR1의 도입부에 N-글리코실화 부위를 함유한다(N-글리코실화 신호는 NXS 또는 NXT이고, 여기서 X는 임의의 아미노산일 수 있다). 이 모티프가 항체의 표면에서 노출될 가능성이 높기 때문에, 이 부위가 글리코실화될 가능성이 높다. 따라서, 미래에 임의의 제조 상의 문제를 피하기 위해 복합 인간 항체에서 이 부위를 피하는 것이 유리할 것이다(항원 결합에 관여하지 않는다면). Vκ 쇄는 Vκ 도메인의 최종 아미노산이 아스파라긴이기 때문에 인간 κ 불변 영역의 맥락에서만 글리코실화 부위를 또한 함유한다. 마우스 κ 불변 도메인은 RA를 시작한 반면에, 인간 κ 불변 도메인은 RT를 시작하여 글리코실화 신호를 형성한다. 따라서, 복합 인간 항체의 서열은 이 아스파라긴을 피하기 위해 선택될 것이다.
κ 도메인은 또한 위치 47에 짝이 없는 시스테인을 함유한다. 분자 모델링은 이 잔기가 구조 내에 묻혀서 디설파이드 결합에 이용할 수 없지만, 이는 Vκ CDR2의 형태를 유지하기 위한 중요한 잔기일 수 있으므로, 항원 결합에 대한 이의 효과를 조사하기 위해 복합 인간 항체의 서열은 이 잔기를 갖거나 갖지 않고 선택될 수 있다(후자는 이 위치에 컨센서스 인간 L을 포함한다)는 것을 시사한다.
실시예 4
키메라 항체의 발현
3-372 가변 영역을 IgG4 (S241P) 중쇄 및 카파 경쇄를 위한 안티토프 발현 벡터 시스템으로 옮겼다. NS0 세포를 전기천공을 통해 형질 감염시키고, 메토트렉세이트(MTX)를 사용하여 선택했다. 다수의 MTX 내성 콜로니는 Fc 포획/카파 쇄 검출 ELISA를 사용하여 동정하고, IgG 발현에 양성인 세포주를 MTX 농도가 점진적으로 증가하는 배지에서 96웰 플레이트에서 T175 플라스크까지 연속적으로 팽창시키고, 이어서 액체 질소하에 동결시켰다. 각 단계에서, IgG 발현을 정량화했다.
키메라 3-372 IgG4를 단백질-A 세파로스 컬럼 상의 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 키메라 IgG4에 대해 예측된 아미노산 서열을 기준으로 1.55의 흡광 계수(Ec(0.1%)) 값을 사용하여 OD280nm로 정량화했다. 항체 약 90μg을 정제하고 샘플을 SDS-PAGE를 감소시켜 분석하였다(도 5). 중쇄 및 경쇄의 예측된 크기에 상응하는 밴드가 어떤 오염의 증거없이 관찰되었지만; 키메라 경쇄가 마우스 경쇄보다 더 큰 겉보기 분자량에 의해 입증된 바와 같이 글리코실화된 것으로 나타난다는 것이 주목할 만했다. 중쇄는 또한 평소보다 더 느리게 진행되는 것처럼 보여 N-글리코실화됨을 시사하지만, 글리코시다제에 의한 소화가 이것이 실제로 그러하다는 것을 입증하기 위해 필요할 것이다.
도 5는 단백질 A-정제된 키메라 3-372 IgG4의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 샘플 1μg을 NuPage 4-12% 비스-트리스 겔(Invitrogen 카탈로그 번호 NP0322BOX)에 부하하고, 200V에서 30분 동안 작동시켰다. 레인 1 & 4: 미리염색된 단백질 표준(Fermentas PageRuler 카탈로그 번호 SM1811). 레인 2: 1.0μg 키메라 3-372 IgG4 항체. 레인 3: 1.0㎍ 뮤린 3-372 항체.
실시예 5
CLEVER-1에 대한 키메라 항체의 결합
CLEVER-1에 대한 NS0 유래된 키메라 3-372의 결합은 경쟁 ELISA로 평가했다. 간단히 말하면, Nunc Immulon 96 웰 maxisorp 플레이트(Fisher 카탈로그 번호 DIS-971-030J)를 4℃에서 밤새, 다음날 아침 37℃에서 추가 1시간 동안 PBS(100㎕/웰) 중에서 1㎍/㎖로 CLEVER-1로 코팅했다. 웰을 PBS/0.1% 트윈(Tween) 20으로 세척한 후, 1% 마벨/1% BSA/PBS에서 실온에서 45분 동안 차단시켰다.
키메라 3-372 및 참조 마우스 3-372 모두의 희석 시리즈(5-0.078μg/ml)를 2% BSA/PBS 중의 비오티닐화 마우스 3-372 항체의 일정 농도(0.6μg/ml)와 예비혼합했다. 차단된 ELISA 플레이트를 이전과 같이 세척하고, 예비 혼합된 항체 100㎕를 각 웰에 첨가했다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 배양했다. 스트렙타비딘-HRP(Sigma 카탈로그 번호 S5512) 및 TMB 단일 용액 기질(Invitrogen 카탈로그 번호 00-2023)을 사용하여 CLEVER-1에 대한 비오티닐화 마우스 3-372의 결합을 검출하였다. 반응을 3M HCl로 중단시키고, 흡광도는 Dynex Technologies MRX TC II 플레이트 판독기에서 450nm에서 판독하고, 키메라 3-372의 결합 곡선은 참조 마우스 3-372 항체의 결합 곡선과 비교했다(도 6).
도 6은 비오티닐화 마우스 항체와 경쟁하여 CLEVER-1에 대한 마우스 및 키메라 항체의 결합 프로파일을 도시한다. 곡선은 거의 동일하여 마우스 항체에 대한 0.77μg/ml와 비교하여 키메라 항체에 대해 0.89μg/ml의 IC50 값을 제공한다. 이것은 정확한 가변 영역 서열이 키메라 항체에서 동정되고 발현되었음을 확인한다.
실시예 7
복합 인간 항체™ 가변 영역 서열 및 변이체의 설계
뮤린 항-CLEVER-1 항체 V 영역의 구조적 모델은 스위스 PDB를 사용하여 생산하고, 항체의 결합 특성에 필수적일 수 있는 V 영역에서 중요한 "구속" 아미노산을 동정하기 위해 분석했다. CDR 내에 함유된 잔기(카바트(Kabat)와 코티아(Chothia) 정의 모두 사용)는 다수의 골격 잔기와 함께 중요하다고 간주되었다. 항-Clever 1의 VH 및 Vκ 서열은 모두 전형적인 골격 잔기를 함유하고, CDR 1, 2 및 3 모티프는 많은 뮤린 항체에 필적할 만하다. 그러나, 본 발명자들은 VH 서열(30N)에서 N- 연결된 글리코실화 및 Vκ 서열(47C)에서 짝이 없는 시스테인을 위한 잠재적인 부위를 동정하였다.
상기 분석으로부터, 항-CLEVER-1의 복합 인간 서열은 CDR 외부의 넓은 범위의 대안으로 생성될 수 있지만, CDR 서열 내의 가능한 대체 잔기의 좁은 메뉴만으로 생성될 수 있는 것으로 간주되었다. 예비 분석은 여러 인간 항체로부터의 상응하는 서열 세그먼트가 조합되어 뮤린 서열에서의 것들과 유사하거나 동일한 CDR을 생성할 수 있음을 나타냈다. CDR의 외부 영역 및 측면 영역에 대하여, 인간 서열 세그먼트의 다양한 선택이 새로운 복합 인간 항체TM V 영역의 가능한 성분으로 동정되었다.
상기 분석에 기초하여, 항-CLEVER-1 복합 인간 항체™ 변이체를 생성하는 데 사용될 수 있는 서열 세그먼트의 큰 예비 세트를 선택하고, 인간 MHC 부류 II 대립 형질에 결합하는 펩티드의 인 실리코 분석을 위한 iTope™ 기술(Perry et al 2008) 및 공지된 항체 서열 관련 T 세포 에피토프의 TCEDTM(T 세포 에피토프 데이타베이스)(Bryson et al 2010)를 사용하여 분석했다. 인간 MHC 부류 II에 대한 중요한 비인간 생식 세포 결합제로서 동정되었거나, TCED™에 대한 상당한 히트를 기록한 서열 세그먼트는 폐기했다. 이는 감소된 세트의 세그먼트를 유도하고, 이들의 조합을 상기한 바와 같이 다시 분석하여 세그먼트 사이의 접합부가 잠재적인 T 세포 에피토프를 함유하지 않았음을 보장했다. 이어서, 선택된 세그먼트를 합하여 합성을 위해 중쇄 및 경쇄 V 영역 서열을 생성했다. 항-CLEVER-1의 경우, 4개의 VH 쇄인 VH1, VH2; VH3 및 VH4[각각, 서열 번호 13, 15, 17 및 19(염기 서열) 및 서열 번호 14, 16, 18 및 20(아미노산 서열)] 및 5개의 Vκ 쇄인 VK1, VK2, VK3, VK4 및 VK5[각각, 서열 번호 21, 23, 25, 27 및 29(염기 서열) 및 서열 번호 22, 24, 26, 28 및 30(아미노산 서열)]를 설계했다. 중쇄 CDR VH1, VH2, VH3 및 VH4는 염기 91 내지 111, 154 내지 201 및 298 내지 333으로부터 연장되고, 경쇄 CDR VK1, VK2, VK3, VK4 및 VK5는 염기 70 내지 105, 151 내지 171 및 268 내지 294로부터 연장된다. CDR 정의 및 단백질 서열 넘버링은 카바트에 따른다. 유의할 점은, VH 쇄 중 3개가 제거된 잠재적인 N-결합 글리코실화 부위(VH2, VH3 및 VH4)를 갖고, Vκ 쇄 중 2개가 제거된 짝이 없는 시스테인(VK4 및 VK5)을 갖는다.
실시예 8
복합 인간 항체™ 변이체의 작제
항-Clever 1을 위한 모든 변이체 복합 인간 항체™ VH 및 Vκ 영역 유전자 는 전장 합성 V 영역을 수득하기 위해 어닐링되고, 결찰되고 PCR 증폭된 일련의 중첩 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 합성했다. 이어서, 조립된 변이체는 IgG4 (S241P) VH 쇄 및 Vκ 쇄에 대한 안티토프의 pANT 발현 벡터 시스템에 직접 클로닝했다(도 7). VH 영역은 MluI 및 HindIII 부위를 사용하여 클로닝하였고, Vκ 영역은 BssHII 및 BamHI 제한 부위를 사용하여 클로닝했다. 모든 작제물은 서열 분석에 의해 확인했다.
도 7은 안티토프 pANT 벡터 다이어그램을 도시한다. Vh 및 VK 벡터 모두가 인트론 및 폴리 A 서열을 포함하는 게놈 DNA 단편을 함유한다. 두 쇄의 발현은 CMV 프로모터에 의해 구동되고, (중쇄 벡터 상의) 선택은 DHFR 미니 유전자를 통해서이다.
실시예 9
항체의 작제, 발현 및 정제
복합 IgG4 (S241P) VH 및 Vκ 쇄(즉, 총 20쌍)의 모든 조합은 전기천공을 통해 NS0 세포로 안정하게 형질 감염시켰다. 안정한 형질감염은 200nM 메토트렉세이트(MTX)(시그마 카탈로그 번호 M8407)를 사용하여 선택하고, 각 작제물에 대한 메토트렉세이트 내성 콜로니를 IgG4 ELISA를 사용하여 IgG 발현 수준에 대해 시험하고, 최적 발현 라인을 선택하고, 팽창시키고 액체 질소하에서 동결시켰다. VH3/Vκ3 및 VH4/Vκ3을 제외한 모든 변이체에 대해 성공적인 형질감염 및 안정한 클론 선택이 달성되었다.
항-CLEVER-1의 복합 변이체는 단백질 A 세파로스 컬럼(GE 헬스케어 카탈로그 번호 110034-93) 상에서 세포 배양 상청액으로부터 정제하고, 완충제를 PBS로 교환하고, 예측된 아미노산 서열에 기초하는 흡광 계수(Ec(0.1%) = 1.55)를 사용하여 OD280nm에 의해 정량화했다. 선도적인 복합 인간 항체™ 변이체는 SDS-PAGE를 감소시켜 분석했다. VH 및 Vκ 쇄의 예측된 크기에 상응하는 밴드가 어떠한 오염의 증거도 없이 관찰되었다(도 8).
도 8은 선택된 단백질 A-정제된 항체의 쿠마시 블루 염색된 SDS-PAGE 겔을 도시한다. 각 샘플 2μg을 NuPage 4-12% 비스-트리스 겔(Invitrogen 카탈로그 번호 NP0322BOX)에 부하하고, 35분 동안 200V에서 작동시켰다. 크기 마커는 미리 염색된 단백질 표준 Fermentas PageRuler(카탈로그 번호 SM1811)이다.
실시예 10
CLEVER-1에 대한 복합 인간 항체 TM 의 결합
CLEVER-1에 대한 NS0 유도된 복합 3-372 항체의 결합은 경쟁 ELISA로 평가했다. 키메라 및 복합 3-372 항체의 희석 시리즈(5-0.078 μg/ml)를 일정 농도(0.6 μg/ml)의 비오티닐화 마우스 3-372 항체와 미리 혼합했다. 이들을 1μg/ml CLEVER-1로 미리 코팅된 96 웰 Immulon maxisorp 플레이트(Fisher 카탈로그 번호 DIS-971-030J) 상에서 실온에서 1시간 동안 배양했다. CLEVER-1에 대한 비오티닐화 마우스 3-372의 결합은 스트렙타비딘-HRP(Sigma 카탈로그 번호 S5512) 및 TMB 단일 용액 기질(Invitrogen 카탈로그 번호 00-2023)을 사용하여 검출했다. 반응은 3M HCl로 중단시키고, 흡광도는 Dynex Technologies MRX TC II 플레이트 판독기 상에서 450nm에서 판독하고, 결합 곡선을 플롯팅했다. 각각의 항체에 대한 IC50 값을 계산하고, 이들을 각각의 ELISA 플레이트에 포함된 키메라의 IC50으로 표준화했다.
수득된 IC50은 다수의 복합 인간 항-CLEVER-1 항체TM가 키메라 3-372보다 CLEVER-1에 더 잘 결합함을 보여준다. 선도적인 변이체의 경쟁 데이터는 도 9에 도시된다.
복합 인간 항-CLEVER-1 항체TM의 결합 특성화

V 영역 ID		 상대적
IC50
CH/CK 1.0
VH1/VK1 0.84
VH1/VK2 1.37
VH1/VK3 1.63
VH1/VK4 1.17
VH1/VK5 1.13
VH2/VK1 0.82
VH2/VK2 0.95
VH2/VK3 0.7
VH2/VK4 0.79
VH2/VK5 0.52
VH3/VK1 0.76
VH3/VK2 0.51
VH3/VK3 -
VH3/VK4 0.47
VH3/VK5 0.42
VH4/VK1 1.86
VH4/VK2 0.9
VH4/VK3 -
VH4/VK4 1.2
VH4/VK5 0.46
상대적 IC50은 시험 항체의 값을 동일한 플레이트에서 검정된 키메라의 값으로 나눔으로써 계산하였다.
실시예 11: 시험관내 항체 결합
건강한 공여자로부터 인간 말초 혈액 단핵구를 수집하고, 그들을 피콜-구배 원심분리에 의해 말초 혈액 약 9ml로부터 농축시켰다. 그 후, 그들은 1% 인간 AB 혈청이 보충된 IMDM 배지에서 1.2 × 106 세포/웰의 밀도로 낮은 부착 96-웰 플레이트에 도말된다. 세포를 1㎍/ml 또는 10㎍/ml의 항-CLEVER-1 항체 3-372(2001년 8월 21일에 DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 DSM ACC2520) 또는 VH3/VK5(상기 특정 CLEVER-1 에피토프를 인식하는 본 발명에 따르는 인간화 항-CLEVER-1 항체)로 48시간 동안 처리했다. HLA-DR 발현은 LSR Fortessa 유동 세포 계측법을 사용하여 48시간 후 CD14 양성 세포로부터 결정했다. 죽은 세포는 7-AAD 세포 생존 능력 염료에 대한 양성 신호에 기초한 분석으로부터 제거했다.
인간 IgG는 참조로서 사용했다.
도 10a는 CD14 양성 세포로부터 HLA-DR 발현의 결정 결과를 도시한다. CD14 양성 세포에서의 HLA-DR 발현은 인간 IgG의 참조와 비교하여 인간화 항-CLEVER-1 항체 VH3/VK5의 처리로 증가했다.
처리 사이의 세포 생존율의 차이는 관찰되지 않았다. 따라서, CLEVER-1 표적화 항체는 단핵구 생존에 영향을 미치지 않는다고 결론지을 수 있다.
실시예 12: TNF-α의 측정
실시예 11에 기재된 바와 같이 건강한 공여자로부터 인간 말초 혈액 단핵구를 수집하고 농축시켰다. 적혈구 용해 완충액 처리된 혈액 3ml로부터의 단핵구를 6-웰 플레이트에 밤새 접착시키고, PBS로 한 번 세척한 후 10㎍/ml의 항-CLEVER-1 항체 3-372 또는 AK-1과 함께 3일 동안 배양했다.
가용성 TNF-알파는 상업적 TNF-α ELISA 키트(Invitrogen)를 사용하여 배양 배지로부터 측정했다. 측정 결과는 도 10b에 도시된다. 증가된 TNF-알파 분비는 미처리 샘플 또는 AK-1과 함께 대조군 처리된 샘플과 비교하여 항-CLEVER-1 항체로 처리된 샘플들에 의해 주시되었다.
실시예 13: 마우스 동계 암 모델
확립된 E0771 마우스 유방 암종을 종양이 1mm3 크기에 도달할 때까지 3 내지 4일 마다 5mg/kg의 항-CLEVER-1(mStab1) 또는 이소타입 대조군으로 처리했다. TAM, 상이한 단핵구 부분 집합 및 종양 침윤성 백혈구의 모집 및 표현형에 대한 항-CLEVER-1 치료의 효과를 유동 세포 계측법을 사용하여 평가했다.
도 11a는 CLEVER-1에 결합하는 항체 투여 후 동계 E0771 유방 암종에서의 TAM 재분극화를 도시한다. TAM 재분극화는 유동 세포 계측법에 의해 MHCII(인간 HLA-DR에서)를 발현하는 증가된 대식세포 집단에 의해 측정된다. 각 점은 하나의 마우스에서 MHCII고 CD11b+F4/80+ TAM의 백분율을 나타낸다. 항-CLEVER-1로 처리된 종양은 대조군 처리된 종양과 비교하여 유사한 수준의 TAM (CD11b+F4/80+)을 나타냈다. 그러나, 항-CLEVER-1 종양 중의 TAM 집단은 II형 마커인 CD206의 발현이 낮은 더욱 전염증성 대식세포(Ly6CloMHCIIhi)로 구성되었다.
항-CLEVER-1 처리된 TAM은 도 11b에 도시된 바와 같이, IgG 처리된 TAM과 비교하여 유의하게 많은 TNF-알파를 분비했다. 각 점은 하나의 마우스로부터 단리된 TAM을 나타낸다. 이것과 일치하여, FoxP3+ 종양 침윤성 백혈구의 감소도 또한 관찰되었다.
결과는 CLEVER-1이 대식세포 지시된 면역요법의 잠재적 표적이라는 것을 나타낸다.
실시예 14
실시예 1에서 나타낸 바와 같이, 항체 9-11 및 3-372는 인간 CLEVER-1에서 별개의 에피토프에 결합하고, 이하 인간 말초 혈액 단핵구에서 신호 전달에 대한 이 차이의 효과를 연구했다. 도 12는 9-11 및 3-372 항체에 의한 CLEVER-1 결찰이 인간 말초 혈액 단핵구에서 mTOR (라파마이신의 기계적 표적) 및 c-Jun 신호 전달에 대한 반대 효과를 촉진시킨다는 것을 도시한다.
도 12a는 CD14 양성 인간 단핵구(n=2 공여자, D1 및 D2) 상의 9-11 및 3-372결합의 유동 세포 계측법 분석을 도시한다.
도 12b는 인간 포스포-키나제 어레이(R & D)를 사용하여 20㎍/mL의 9-11 및 3-372로 10분 처리 후 CD14 양성 세포(음성 선별에 의해 농축됨) 상에서 포스포 단백질의 활성화를 측정하는 경우의 결과를 도시한다. 포스포 신호는 관련된 아이소 타입 대조군 처리된 세포인 9-11에 대한 ratIgG2a 및 3-372에 대한 마우스 IgG1로 표준화했다. 도 12b에 도시된 바와 같이, 항체 9-11 및 3-372는 인간 말초 혈액 단핵구에서 mTOR 및 c-Jun 신호전달에 대한 반대 효과를 촉진시킨다. mTOR의 경로는 대식세포 분극화를 조절하고, 면역억제성 대식세포 표현형은 c-Jun 인산화에 의존하는 것으로 공지되어 있고, 여기서 결과는 3-372 항체가 대식세포를 활성화시켜 그들의 표현형을 M2 대식세포로부터 M1 대식세포로 전환시킨다는 것을 나타낸다.
다른 바람직한 구현예
인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 제제, 예를 들면, 항체, 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편(들), 펩티드(들), 거대분자(들), 및 인간화 항체 또는 인간화 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편(들) 및 본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태의 구현예에 혼입될 수 있고, 그 중 몇 가지만 본원에 개시되어 있다는 것이 인식될 것이다. 다른 구현예가 존재하고 본 발명의 취지로부터 벗어나지 않는다 것이 당업자에게 자명할 것이다. 따라서, 개시된 구현예는 예시적이며, 제한적인 것으로 해석되어서는 안된다.
<110> Faron Pharmaceuticals Oy <120> HUMANIZED ANTI CLEVER-1 ANTIBODIES AND THEIR USE <130> PCT/FI2017/050285 <150> FI20165335 <151> 2016-04-18 <150> FI20165336 <151> 2016-04-18 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Phe Thr Val Leu Val Pro Ser Val Ser Ser Phe Ser Ser Arg 1 5 10 15 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Gln Glu Ile Thr Val Thr Phe Asn Gln Phe Thr Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Thr Gln Thr Gly Arg Val Phe Leu Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Asp Ser Leu Arg Asp Gly Arg Leu Ile Tyr Leu Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Lys Gly Arg Ile Leu Thr Met Ala Asn Gln Val Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Cys Val Tyr Gln Lys Pro Gly Gln Ala Phe Cys Thr Cys Arg 1 5 10 15 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Heavy Chain CDR <400> 7 Thr Ser Gly Met Gly Ile Gly 1 5 <210> 8 <211> 16 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Gln Pro Ser Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gcc cac att tgg tgg gac gac gac aag cgg tac aac ccc gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctg aag tcc cgg ctg acc atc agc aag gac acc agc aag aac cag gtg 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 gtg ctg acc atg acc aac atg gac ccc gtg gac acc gcc acc tac tac 288 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgc gcc aga cac tac ggc tac gac ccc tac tac gcc atg gac tac tgg 336 Cys Ala Arg His Tyr Gly Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 ggc cag ggc acc agc gtg acc gtg tct agc 366 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 366 <212> DNA <213> Heavy Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 15 cag gtc aca ctg aaa gag tcc ggc ccc acc ctg gtg aag ccc acc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 acc ctg acc ctg aca tgc agc ttc agc ggc ttc agc ctg agc acc agc 96 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggc atg ggc atc gga tgg atc aga cag ccc agc ggc aag gcc ctg gaa 144 Gly Met Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gcc cac att tgg tgg gac gac gac aag cgg tac aac ccc gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctg aag tcc cgg ctg acc atc agc aag gac acc agc aag aac cag gtg 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 gtg ctg acc atg acc aac atg gac ccc gtg gac acc gcc acc tac tac 288 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgc gcc aga cac tac ggc tac gac ccc tac tac gcc atg gac tac tgg 336 Cys Ala Arg His Tyr Gly Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 ggc cag ggc acc ctc gtg acc gtg tct agc 366 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 366 <212> DNA <213> Heavy Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 17 cag gtc aca ctg aaa gag tcc ggc ccc acc ctg gtg aag ccc acc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 acc ctg acc ctg aca tgc agc ttc agc ggc ttc agc ctg agc acc agc 96 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggc atg ggc atc gga tgg atc aga cag ccc cct ggc aag gcc ctg gaa 144 Gly Met Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gcc cac att tgg tgg gac gac gac aag cgg tac aac ccc gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctg aag tcc cgg ctg acc atc agc aag gac acc agc aag aac cag gtg 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 gtg ctg acc atg acc aac atg gac ccc gtg gac acc gcc acc tac tac 288 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgc gcc aga cac tac ggc tac gac ccc tac tac gcc atg gac tac tgg 336 Cys Ala Arg His Tyr Gly Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 ggc cag ggc acc ctc gtg acc gtg tct agc 366 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 366 <212> DNA <213> Heavy Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 19 cag gtc aca ctg aaa gag tcc ggc ccc acc ctg gtg aag ccc acc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 acc ctg acc ctg aca tgc acc ttc agc ggc ttc agc ctg agc acc agc 96 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 ggc atg ggc atc gga tgg atc aga cag ccc cct ggc aag gcc ctg gaa 144 Gly Met Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gcc cac att tgg tgg gac gac gac aag cgg tac aac ccc gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctg aag tcc cgg ctg acc atc agc aag gac acc agc aag aac cag gtg 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 gtg ctk acc atg acc aac atg gac ccc gtg gac acc gcc acc tac tac 288 Val Xaa Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgc gcc aga cac tac ggc tac gac ccc tac tac gcc atg gac tac tgg 336 Cys Ala Arg His Tyr Gly Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 ggc cag ggc acc ctc gtg acc gtg tct agc 366 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 324 <212> DNA <213> Light Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 21 cag atc gtg ctg acc cag agc ccc ggc atc ctg tct ctg agc cct ggc 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag agg gcc acc atg agc tgt acc gcc agc agc agc gtg tcc tcc agc 96 Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc aag ctg tgc 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Cys 35 40 45 atc tac cgg acc agc aac ctg gcc agc ggc gtg ccc agc aga ttt tct 192 Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agc ggc agc ggc acc gac tac acc ctg acc atc agc agc ctg cag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 gcc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cac cag tac cac aga agc ccc 288 Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ccc acc ttc ggc cag ggc acc aaa ctg gaa atc aag 324 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 324 <212> DNA <213> Light Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 23 cag atc gtg ctg acc cag agc ccc ggc acc ctg tct ctg agc cct ggc 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag agg gcc acc atg agc tgt acc gcc agc agc agc gtg tcc tcc agc 96 Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc aag ctg tgc 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Cys 35 40 45 atc tac cgg acc agc aac ctg gcc agc ggc gtg ccc agc aga ttt tct 192 Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agc ggc agc ggc acc gac tac acc ctg acc atc agc agc ctg cag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cac cag tac cac aga agc ccc 288 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ccc acc ttc ggc cag ggc acc aaa ctg gaa atc aag 324 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 25 <211> 324 <212> DNA <213> Light Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 25 gag atc gtg ctg acc cag agc ccc ggc acc ctg tct ctg agc cct ggc 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag agg gcc acc atg agc tgt acc gcc agc agc agc gtg tcc tcc agc 96 Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc aag ctg tgc 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Cys 35 40 45 atc tac cgg acc agc aac ctg gcc agc ggc gtg ccc agc aga ttt tct 192 Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agc ggc agc ggc acc gac tac acc ctg acc atc agc agc ctg cag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cac cag tac cac aga agc ccc 288 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ccc acc ttc ggc cag ggc acc aaa ctg gaa atc aag 324 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 27 <211> 324 <212> DNA <213> Light Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 27 cag atc gtg ctg acc cag agc ccc ggc atc ctg tct ctg agc cct ggc 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag agg gcc acc atg agc tgt acc gcc agc agc agc gtg tcc tcc agc 96 Glu Arg Ala Thr Met Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc aag ctg ctg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tac cgg acc agc aac ctg gcc agc ggc gtg ccc agc aga ttt tct 192 Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agc ggc agc ggc acc gac tac acc ctg acc atc agc agc ctg cag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 gcc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cac cag tac cac aga agc ccc 288 Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ccc acc ttc ggc cag ggc acc aaa ctg gaa atc aag 324 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 29 <211> 324 <212> DNA <213> Light Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 29 gag atc gtg ctg acc cag agc ccc ggc acc ctg tct ctg agc cct ggc 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gag agg gcc acc ctg agc tgt acc gcc agc agc agc gtg tcc tcc agc 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tac ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc aag ctg ctg 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 atc tac cgg acc agc aac ctg gcc agc ggc gtg ccc agc aga ttt tct 192 Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agc ggc agc ggc acc gac tac acc ctg acc atc agc agc ctg cag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cac cag tac cac aga agc ccc 288 Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ccc acc ttc ggc cag ggc acc aaa ctg gaa atc aag 324 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 1051 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Leu Cys Cys Ala Cys Leu Leu Glu Leu Ile Pro Tyr Ala Pro Thr Leu 1 5 10 15 Ser Trp Thr Ala Cys Pro Pro Ala Met Ala Gly Pro Arg Gly Leu Leu 20 25 30 Pro Leu Cys Leu Leu Ala Phe Cys Leu Ala Gly Phe Ser Phe Val Arg 35 40 45 Gly Gln Val Leu Phe Lys Gly Cys Asp Val Lys Thr Thr Phe Val Thr 50 55 60 His Val Pro Cys Thr Ser Cys Ala Ala Ile Lys Lys Gln Thr Cys Pro 65 70 75 80 Ser Gly Trp Leu Arg Glu Leu Pro Asp Gln Ile Thr Gln Asp Cys Arg 85 90 95 Tyr Glu Val Gln Leu Gly Gly Ser Met Val Ser Met Ser Gly Cys Arg 100 105 110 Arg Lys Cys Arg Lys Gln Val Val Gln Lys Ala Cys Cys Pro Gly Tyr 115 120 125 Trp Gly Ser Arg Cys His Glu Cys Pro Gly Gly Ala Glu Thr Pro Cys 130 135 140 Asn Gly His Gly Thr Cys Leu Asp Gly Met Asp Arg Asn Gly Thr Cys 145 150 155 160 Val Cys Gln Glu Asn Phe Arg Gly Ser Ala Cys Gln Glu Cys Gln Asp 165 170 175 Pro Asn Arg Phe Gly Pro Asp Cys Gln Ser Val Cys Ser Cys Val His 180 185 190 Gly Val Cys Asn His Gly Pro Arg Gly Asp Gly Ser Cys Leu Cys Phe 195 200 205 Ala Gly Tyr Thr Gly Pro His Cys Asp Gln Glu Leu Pro Val Cys Gln 210 215 220 Glu Leu Arg Cys Pro Gln Asn Thr Gln Cys Ser Ala Glu Ala Pro Ser 225 230 235 240 Cys Arg Cys Leu Pro Gly Tyr Thr Gln Gln Gly Ser Glu Cys Arg Ala 245 250 255 Pro Asn Pro Cys Trp Pro Ser Pro Cys Ser Leu Leu Ala Gln Cys Ser 260 265 270 Val Ser Pro Lys Gly Gln Ala Gln Cys His Cys Pro Glu Asn Tyr His 275 280 285 Gly Asp Gly Met Val Cys Leu Pro Lys Asp Pro Cys Thr Asp Asn Leu 290 295 300 Gly Gly Cys Pro Ser Asn Ser Thr Leu Cys Val Tyr Gln Lys Pro Gly 305 310 315 320 Gln Ala Phe Cys Thr Cys Arg Pro Gly Leu Val Ser Ile Asn Ser Asn 325 330 335 Ala Ser Ala Gly Cys Phe Ala Phe Cys Ser Pro Phe Ser Cys Asp Arg 340 345 350 Ser Ala Thr Cys Gln Val Thr Ala Asp Gly Lys Thr Ser Cys Val Cys 355 360 365 Arg Glu Ser Glu Val Gly Asp Gly Arg Ala Cys Tyr Gly His Leu Leu 370 375 380 His Glu Val Gln Lys Ala Thr Gln Thr Gly Arg Val Phe Leu Gln Leu 385 390 395 400 Arg Val Ala Val Ala Met Met Asp Gln Gly Cys Arg Glu Ile Leu Thr 405 410 415 Thr Ala Gly Pro Phe Thr Val Leu Val Pro Ser Val Ser Ser Phe Ser 420 425 430 Ser Arg Thr Met Asn Ala Ser Leu Ala Gln Gln Leu Cys Arg Gln His 435 440 445 Ile Ile Ala Gly Gln His Ile Leu Glu Asp Thr Arg Thr Gln Gln Thr 450 455 460 Arg Arg Trp Trp Thr Leu Ala Gly Gln Glu Ile Thr Val Thr Phe Asn 465 470 475 480 Gln Phe Thr Lys Tyr Ser Tyr Lys Tyr Lys Asp Gln Pro Gln Gln Thr 485 490 495 Phe Asn Ile Tyr Lys Ala Asn Asn Ile Ala Ala Asn Gly Val Phe His 500 505 510 Val Val Thr Gly Leu Arg Trp Gln Ala Pro Ser Gly Thr Pro Gly Asp 515 520 525 Pro Lys Arg Thr Ile Gly Gln Ile Leu Ala Ser Thr Glu Ala Phe Ser 530 535 540 Arg Phe Glu Thr Ile Leu Glu Asn Cys Gly Leu Pro Ser Ile Leu Asp 545 550 555 560 Gly Pro Gly Pro Phe Thr Val Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Val Asp 565 570 575 Ser Leu Arg Asp Gly Arg Leu Ile Tyr Leu Phe Thr Ala Gly Leu Ser 580 585 590 Lys Leu Gln Glu Leu Val Arg Tyr His Ile Tyr Asn His Gly Gln Leu 595 600 605 Thr Val Glu Lys Leu Ile Ser Lys Gly Arg Ile Leu Thr Met Ala Asn 610 615 620 Gln Val Leu Ala Val Asn Ile Ser Glu Glu Gly Arg Ile Leu Leu Gly 625 630 635 640 Pro Glu Gly Val Pro Leu Gln Arg Val Asp Val Met Ala Ala Asn Gly 645 650 655 Val Ile His Met Leu Asp Gly Ile Leu Leu Pro Pro Thr Ile Leu Pro 660 665 670 Ile Leu Pro Lys His Cys Ser Glu Glu Gln His Lys Ile Val Ala Gly 675 680 685 Ser Cys Val Asp Cys Gln Ala Leu Asn Thr Ser Thr Cys Pro Pro Asn 690 695 700 Ser Val Lys Leu Asp Ile Phe Pro Lys Glu Cys Val Tyr Ile His Asp 705 710 715 720 Pro Thr Gly Leu Asn Val Leu Lys Lys Gly Cys Ala Ser Tyr Cys Asn 725 730 735 Gln Thr Ile Met Glu Gln Gly Cys Cys Lys Gly Phe Phe Gly Pro Asp 740 745 750 Cys Thr Gln Cys Pro Gly Gly Phe Ser Asn Pro Cys Tyr Gly Lys Gly 755 760 765 Asn Cys Ser Asp Gly Ile Gln Gly Asn Gly Ala Cys Leu Cys Phe Pro 770 775 780 Asp Tyr Lys Gly Ile Ala Cys His Ile Cys Ser Asn Pro Asn Lys His 785 790 795 800 Gly Glu Gln Cys Gln Glu Asp Cys Gly Cys Val His Gly Leu Cys Asp 805 810 815 Asn Arg Pro Gly Ser Gly Gly Val Cys Gln Gln Gly Thr Cys Ala Pro 820 825 830 Gly Phe Ser Gly Arg Phe Cys Asn Glu Ser Met Gly Asp Cys Gly Pro 835 840 845 Thr Gly Leu Ala Gln His Cys His Leu His Ala Arg Cys Val Ser Gln 850 855 860 Glu Gly Val Ala Arg Cys Arg Cys Leu Asp Gly Phe Glu Gly Asp Gly 865 870 875 880 Phe Ser Cys Thr Pro Ser Asn Pro Cys Ser His Pro Asp Arg Gly Gly 885 890 895 Cys Ser Glu Asn Ala Glu Cys Val Pro Gly Ser Leu Gly Thr His His 900 905 910 Cys Thr Cys His Lys Gly Trp Ser Gly Asp Gly Arg Val Cys Val Ala 915 920 925 Ile Asp Glu Cys Glu Leu Asp Met Arg Gly Gly Cys His Thr Asp Ala 930 935 940 Leu Cys Ser Tyr Val Gly Pro Gly Gln Ser Arg Cys Thr Cys Lys Leu 945 950 955 960 Gly Phe Ala Gly Asp Gly Tyr Gln Cys Ser Pro Ile Asp Pro Cys Arg 965 970 975 Ala Gly Asn Gly Gly Cys His Gly Leu Ala Thr Cys Arg Ala Val Gly 980 985 990 Gly Gly Gln Arg Val Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Gly Gly Asp Gly 995 1000 1005 Phe Ser Cys Tyr Gly Asp Ile Phe Arg Glu Leu Glu Ala Asn Ala His 1010 1015 1020 Phe Ser Ile Phe Tyr Gln Trp Leu Lys Ser Ala Gly Ile Thr Leu Pro 1025 1030 1035 1040 Ala Asp Arg Arg Val Thr Ala Leu Val Pro Ser 1045 1050 <210> 32 <211> 366 <212> DNA <213> Heavy Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(366) <400> 32 cag gtt act ctg aaa gag tct ggc cct ggg ata ttg cag ccc tcc cag 48 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 acc ctc agt ctg act tgt tct ttc tct ggg ttt tca ctg aac act tct 96 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Asn Thr Ser 20 25 30 ggt atg ggt ata ggc tgg att cgt cag cct tca ggg aag ggt ctg gag 144 Gly Met Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ctg gca cac att tgg tgg gat gat gac aag cgc tat aac cca gcc 192 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 ctg aag agc cga ctg aca atc tcc aag gat acc tcc agc aac cag gta 240 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gln Val 65 70 75 80 ttc ctc aag atc gcc agt gtg gac act gca gat act gcc aca tac tac 288 Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 tgt gct cgc cac tat ggt tac gac ccc tac tat gct atg gac tac tgg 336 Cys Ala Arg His Tyr Gly Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 ggt caa gga acc tca gtc acc gtc tcc tca 366 Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 34 <211> 324 <212> DNA <213> Light Chain <220> <221> CDS <222> (1)..(324) <400> 34 caa att gtt ctc acc cag tct cca gca atc atg tct gca tct cta ggg 48 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 gaa cgg gtc acc atg acc tgc act gcc agc tca agt gta agt tcc agt 96 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 tat ttg cac tgg tac cag cag agg cca gga tcc tcc ccc aaa ctc tgc 144 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Cys 35 40 45 att tat aga aca tcc aac ctg gct tct gga gtc cca cct cgc ttc agt 192 Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser 50 55 60 ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct ctc aca atc agc agc atg gag 240 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc cac cag tat cat cgt tcc cca 288 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ctg gaa atc aac 324 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn 100 105

Claims (22)

  1. 인간 일반 내피 및 혈관 내피 수용체-1(CLEVER-1)에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편으로서,
    인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편은,
    a) 인간 IgG4 중쇄 불변 영역 및 카파 경쇄의 불변 영역과,
    b) 하기의 조합들:
    서열 번호 14 및 서열 번호 22,
    서열 번호 16 및 서열 번호 22,
    서열 번호 16 및 서열 번호 24,
    서열 번호 16 및 서열 번호 26,
    서열 번호 16 및 서열 번호 28,
    서열 번호 16 및 서열 번호 30,
    서열 번호 18 및 서열 번호 22,
    서열 번호 18 및 서열 번호 24,
    서열 번호 18 및 서열 번호 28,
    서열 번호 18 및 서열 번호 30,
    서열 번호 20 및 서열 번호 24, 및
    서열 번호 20 및 서열 번호 30
    으로 이루어진 그룹에서 선택되는, 인간 IgG 중쇄 가변 영역 및 인간 IgG 경쇄 가변 영역의 조합
    을 포함하는, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편은,
    PFTVLVPSVSSFSSR (서열 번호 1), 및
    QEITVTFNQFTK (서열 번호 2)의 인간 CLEVER-1의 에피토프 서열들에 결합하는, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편은 또한,
    ATQTGRVFLQ (서열 번호 3),
    DSLRDGRLIYLF (서열 번호 4),
    SKGRILTMANQVL (서열 번호 5) 및
    LCVYQKPGQAFCTCR (서열 번호 6)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인간 CLEVER-1의 에피토프 서열들 중 하나 이상의 서열들에 결합하는, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 IgG 중쇄 가변 영역 서열은, 서열 번호 16, 서열 번호 18 또는 서열 번호 20을 포함하고,
    상기 인간 IgG 경쇄 가변 영역 서열은, 서열 번호 30을 포함하는, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 IgG 중쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 18을 포함하고,
    상기 인간 IgG 경쇄 가변 영역 서열은 서열 번호 30을 포함하는, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 IgG4 중쇄 및 카파 경쇄의 불변 영역이: 돌연변이 L248E 및 S241P, 중 적어도 하나를 포함하는, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편은, 암 또는 만성 감염의 치료나 예방에 사용되는, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편은,
    악성 종양의 크기를 감소시키는 것;
    개체에서 악성 종양 성장을 감소시키는 것; 및
    암 세포 이행 및 전이 형성을 억제하는 것
    중의 적어도 하나에 의해, 암 또는 만성 감염의 치료나 예방에 사용되는 것에 특성화된, 인간 CLEVER-1에 결합할 수 있는 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편을 포함하는, 백신.
  10. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 인간화 항체 또는 단일 쇄 Fv 또는 Fab 단편 및 적합한 부형제를 포함하는, 종양 또는 항원 유도 면역억제를 제거하는데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    암을 치료 또는 예방하거나, 만성 감염을 치료하거나, 또는 백신의 보조제로서 사용하기 위해 특성화된, 면역억제를 제거하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물.
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