UA113308C2

UA113308C2 - St2-антигензв'язувальний білок

Info

Publication number: UA113308C2
Application number: UAA201413587A
Authority: UA
Priority date: 2012-05-18
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2017-01-10
Also published as: AR118080A2; MA37523B1; MA37523A1

Abstract

Винахід належить до антигензв'язувальних білків, що зв'язуються з ST2 людини, антитіл, нуклеїнових кислот, що їх кодують, а також до способу отримання та застосування таких антитіл для запобігання аутоімунним та запальним захворюванням.

Description

Кигоїхма еїг а. 2001).

Додаткові свідчення, які пов'язують каскад реакцій 1І.-33/512 із захворюваннями людини, надані генетичними дослідженнями, в яких було виявлено наявність поліморфизму гену ІІ. -33 та/або 512 в загальній популяції, які в значній мірі пов'язані з підвищеним ризиком захворювання або параметрами важкості захворювання. В деяких великих загальногеномних дослідженнях генетичу варіацію в 5712 (ПРІ 1) або ІІ -33 пов'язали з підвищеним ризиком астми (Спабіатіхзоп, Віогтівдоніг еї аї!. 2009; Мойакн, См еї аІ. 2010; Ми, Котіец еї аІ. 2010), а в інших дослідженнях на генетиченому рівні цей каскад реакцій пов'язали з підвищеним ступінем важкості астми (Ай, 7Вапе еї аїЇ. 2009) та бронхіальною гіперчутливістю (Кеї)тетіпК, Розипа еї аі. 2008). Подібні дослідження показали, що цей каскад реакцій на генетичному рівні має відношення до алергічних захворювань, таких як атопічний дерматит (5Вітіи, Маїзида еї аі. 2005), риносинусит (5аКавйна, Уо5Вітого еї а!. 2008; Савгапо К 2009), а також назальний поліпоз (Впухесваеті, Стоїі» еї а). 2010).

В сукупності ці дані пов'язані з декількома захворюваннями людини та здатністю цього цитокіну стимулювати багато форм небезпечних запальних процесів, що робить його придатною мішенню для терапевтичного втручання.

Суть винаходу

У винаході запропоновані анти-5Т2 антигензв'язувальні блки, наприклад, антитіла та їх функціональні фрагменти, що мають властивості, які підходять для комерційного виробництва та терапевтичного застосування для людини. Особливо застосування анти-512 антигензв'язувальних білків доцільно в способах лікування захворювань та порушень, пов'язаних з системою ІІ -33/512. В цьому документі запропоновані 5Т2-зв'язувальні антитіла, які зв'язують 512 з високою афінністю та ефективно блокують зв'язування ІІ/-33, чим знижують ІІ-33-опосередковану передачу сигналу в клітині.

В першому аспекті реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок містить а) варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095 ідентичним, щонайменше на 9595 ідентичним, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ХЕО 10 МО:95, 5ЕО ІЮ МО:96, 5ЕО ІЮ МО:97,

ЗЕО ІЮ МО:98, 5ЕО ІЮО МО:99, 5ЕО ІЮ МО:100, 5ЕО ІО МО:101, 5ЕО ІО МО:102, 5ЕО ІЮ МО:103,

ЗЕО І0 МО: 104, 5БО 10 МО: 105, 5БО І МО:163, 5ЕБО І МО: 164 або 5ЕО І МО: 165; Б) варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095 ідентичним, щонайменше на 9595 ідентичним, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО

ІЮО МО:30, 5ЕО І МО:31, 5БО 10 МО:32, 5ЕО І МО:33, БО І МО:34, 5БО 10 МО:35, 5ЕО І

МО:36, 5ЕО ІЮ МО:37, 5ЕО І МО:38, 5ЕО І МО:39, 5ЕО ІЮ МО:145, 5БЕО 10 МО:146 або 5ЕО ІЮ

МО:147; або с) варіабельний домен легкого ланцюга згідно з а) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з б).

Переважні антигензв'язувальні білюим в першому аспекті реалізації включають ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:95, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:29; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІО МО:96, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5БЕО І МО:30; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотний послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:97, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:31; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотнії послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:98, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:32; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІО МО:99, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕБЕО І МО:33; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в БЕО 10 МО:100, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 90595, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5БЕО ІЮ МО:34; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, приведеній в 5ЕО ІЮ МО:101, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:35; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІО МО:102, та варіабельнії домен важкого ланцюга,

який є щонайменше на 9095, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5БЕО І МО:36; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ХЕО 10 МО:103, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:37; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:104, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:38; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮО МО:105, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО 10 МО:39; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО 10 МО:163, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО 10 МО:145; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО 10 МО:164, та варіабельній домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:146; та ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:165, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в ХЕО ІО МО:147.

В другому аспекті реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок містить а) варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в ЗЕО ІО МО:95, 5ЕО ІЮ МО:96, 5ЕО 10

МО:97, 5ЕО ІО МО:98, 5ЕО І МО:99, 5ЕО І МО:100, 5ЕО 10 МО:101, 5ЕО І МО:102, 5ЕО І

МО:103, 5ЕО ІЮ МО:104, 5ЕО І МО:105, 5ЕО І МО:163, 5ЕО ІЮ МО:164 або 5ЕО І МО:165; Б) варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотіой послідовності, наведеної в ЕС

І МО:29, 5ЕО ІЮО МО:30, 5ЕО ІЮО МО:З31, 5ЕО І МО:32, 5ЕО ІО МО:33, 5ЕО І МО:34, 5ЕО І

МО:35, БЕО 10 МО:36, 5ЕО 10 МО:37, 5ЕО ІО МО:38, 5ЕО ІЮ МО:39, 5ЕО ІЮ МО:145, 5ЕО ІЮ МО:146 або 5ЕО ІЮ МО:147; або с) варіабельний домен легкого ланцюга згідно з а) та варіабельний домен важкого лагцюга згідно з б).

Переважні антигензв'язувальні білюи в другому аспекті реалізації включають ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІЮ МО:95, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:29; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО 10 МО:96, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:30; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5БЕО ІО МО:97, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІО МО:31; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІО МО:98, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:32; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5БЕО ІО МО:99, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІО МО:33; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:100, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:34; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:101, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІО МО:35; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:102, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:36; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:103, та варіабельний домен важкого ланцюга , який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІО МО:37; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:104, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:38; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:105, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІО МО:39; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:163, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО 10 МО:145; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:164, та варіабельний домен важкого ланцюга який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІЮ МО:146; та ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:165, та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:147.

В третьому аспекті реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить а) ЇСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:106; І СОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОР, наведеної в 5ЕО І МО:117; та І СОВАЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності | СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО: 128; Б) І СОВІ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:107; І СОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності Ї СОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:118; та І СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності Ї СОВЗ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:129; с) І СОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності | СОВІ1, наведеної в 5ЕО 10 МО:108; І СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:119; та І СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності | СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:130; 4) ІСОВ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності ЇЇ СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:109; І СОВ82, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:120; та /СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:131; є) І СОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОН, наведеної в 5ЕО І МО: 110; 1ІС082, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:121; та І СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності ЇСОВЗ, наведеної в 5ЕО І МО:132; ) ІСОВ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності ЇЇ СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:111; І СОВ82, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:122; та /СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:133; 9) І СОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОН, наведеної в 5ЕО І МО: 112; ІСОВА2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:123; та І СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності | СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:134; п) ІСОВ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності ЇЇ СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:113; І СОН82, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:124; та /СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:135; ії) І СОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОН, наведеної в 5ЕО І МО: 114; ІСОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:125; та І СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності ЇСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:136; |) СОВА, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності ЇЇ СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:115; І СОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:126; та /СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:137; К) І СОН, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОН, наведеної в 5ЕО І МО: 116; ІСО0А82, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:127; та І СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності ЇСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:138; І) І СОВ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності ЇЇ СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:166; І СОВ82, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:169; та /СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності | СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:172; т) І СОН, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОН, наведеної в 5ЕО І МО:167; ІСО082, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності ЇЇ СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:170; та І СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності Ї/СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:173; або п) /СОВ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності | СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:168; І СОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:171; та /СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:174; та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить о) НСОВ'І1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВІ, наведеної в 5ЕО

ІО МО:40; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОНВ2, наведеної в 5БО ІЮ МО:51; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО І

МО:62; р) НСОНІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕСО ІЮ МО:41; НОСОВ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВ2, наведеної в 5ЕО І

МО:52; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО 0 МО:63; 4) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І

МО:42; НСОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОНВ2, наведеної в 5БО І МО:53; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО І

МО:64; г) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:43; НОСОВ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВ2, наведеної в 5ЕО І

МО:54; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:65; 5) НОСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І

МО:44; НСОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОНВ2, наведеної в 5БО І МО:55; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО І

МО:66; 1) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:45; НОСОВ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВ2, наведеної в 5ЕО І

МО:56; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО 10 МО:67; ш) НОСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І

МО:46; НСОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОНВ2, наведеної в 5БЕО І МО:57; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО І

МО:68; м) НСОНВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:47; НОСОВ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВ2, наведеної в 5ЕО І

МО:58; та НСОНВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОНВЗ, наведеної в 5ЕО І МО:69; м) НОСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І

МО:48; НСОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОНВ2, наведеної в 5БЕО І МО:59; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО І

МО:70; х) НСОНВТ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:49; НОСОВ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВ2, наведеної в 5ЕО І

МО:60; та НСОНВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:71; у) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І

МО:50; НСОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОНВ2, наведеної в 5БЕО ІЮ МО:61; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО І

МО:72; 7) НСОНВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:148; НСОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВ2, наведеної в 5ЕО І

МО:151; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в БЕО ІЮ МО:154; аа) НСОВІ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВІ, наведеної в 5ЕО

ІО МО:149; НСОНІ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:152; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО І

МО:155; або рЬ) НОСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:150; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВ2, наведеної в 5ЕО І

МО:153; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в ХЕО 10 МО:156.

Переважні 5Т2-антигензв'язувальні білки в третьому аспекті реалізації включають ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з а) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з о); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з р) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з р); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з с) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з а); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з а) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з г); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з є) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з 5); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з ї) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з ї); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з 9) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з и); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з І) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з м); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з ї) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з м/); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з |) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з х); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з К) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з у); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з І) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з 7); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з т) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з аа); та ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з п) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з рб).

В четвертому аспекті реалізації винаходу 5Т2-антигензв'язувальний білок відповідно до першого, другого або третього аспекту зв'язується з 512 людини з афінністю, яка є меншою або дорівнює 1 х 1079 М.

В п'ятому аспекті реалізації винаходу 5Т2-антигензв'язувальний білок відповідно до першого, другого, третього або четвертого аспекту пригнічує зв'язування 512 людини з ІЇ -33 людини.

В шостому аспекті реалізації винаходу 5Т2-антигензв'язувальний білок відповідно до першого, другого, третього, четвертого або п'ятого аспекту знижує ІІ-33-опосередковану передачу сигналу

512 людини в клітинах людини, які експресують 512.

В сьомому аспекті реалізації винаходу 5Т2-антигензв'язувальний білок відповідно до шостого аспекту знижує ІІ -33-опосередковану передачу сигналу 512 яванської макаки в клітинах яванської макаки, які експресують 512.

У восьмому аспекті реалізації винаходу 5Т2-антигензв'язувальний білок відповідно до першого, другого, третього, четвертого, п'ятого, шостого або сьомого аспекту є антитілом, таким як антитіло людини. Переважні антитіла включають такі антитіла, які містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10:84, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:18; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10:85, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮО МО:19; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10:86, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО

ІО МО:20; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО

І0:87, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮО МО:21; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО І0О:88, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:22; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10:89, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10 МО:23; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10:90, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:24; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10:91, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:25; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10:92, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮО МО:26; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10:93, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО

ІО МО:27; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО

І0:94, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:28; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО 10:160, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:142; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО І0:161, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:143; ті, що містять легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕС 10162, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО :144.

В дев'ятому аспекті реалізації винаходу запропоновані відділені нуклеїнові кислоти, які кодують один або більше поліпептидних компонентів 5Т2-антигензв'язувального білка, наприклад, легкий ланцюг антитіла або важкий ланцюг антитіла. В переважних варіантах реалізації винаходу нуклеїнова кислота кодує поліпептид, що містить: а) варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9595 ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО 10 МО:95, 5ЕО ІЮ МО:96, 5ЕО 10 МО:97, 5ЕО ІЮО МО:98, 5ЕО ІЮ

МО:99, 5ЕО 10 МО:100, 5ЕО І МО:101, 5ЕО І МО:102, 5ЕО 10 МО:103, 5ЕО І МО:104, 5ЕО ІЮ

МО:105, БЕО ІЮ МО:163, 5ЕО ІЮО МО:164 або 5ЕО ІО МО:165;

Б) варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9595 ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО І МО:29, 5ЕО ІЮ МО:30, 5ЕО ІЮО МО:31, 5ЕО І

МО:32, 5ЕО І МО:33, 5ЕО ІЮ МО:34, 5ЕО ІЮ МО:35, 5ЕО І МО:36, 5ЕО 10 МО:37, 5ЕО ІЮ МО:З38,

ЗЕО ІО МО:39, 5ЕО 10 МО:145, 5ЕО ІЮ МО:146 або 5ЕО ІЮ МО:147; с) варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотній послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:95, 5ЕО І

МО:96, 5ЕО ІЮО МО:97, 5ЕО ІЮ МО:98, 5ЕО І МОС99, 5ЕО 10 МО:100, 5ЕО 10 МО:101, 5ЕО І

МО:102, 5ЕО ІЮ МО:103, 5ЕО ІЮ МО:104, 5ЕО ІО МО:105, 5ЕО ІЮ МО:163, 5ЕО І МО:164 або 5ЕО

ІО МО:165; а) варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотній послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:29, 5ЕО І

МО:30, 5ЕО І МО:СЗ31, 5ЕО ІЮ МО:32, 5ЕО ІЮ МО:33, 5ЕО ІЮ МО:34, 5ЕО 10 МО:35, 5ЕО ІЮ МО:З6,

ЗЕО ІО МО:37, 5ЕО 10 МО:38, 5ЕО ІЮ МО:39, 5ЕО 10 МО 145, 5ЕО ІЮ МО:146 або 5ЕО ІЮ МО:147; е) варіабельний домен легкого ланцюга, що містить: її СО, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5БЕО ІЮ МО:106; І СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:117; та І СОВАЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:128; ії) СОВА, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:107; І! СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР,

наведеної в 5ЕО І МО:118; та І! СОВАЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:129; ії) СОВА, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5БЕО ІЮ МО:108; І! СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:119; та І! СОВАЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:130; їм) ГСОВІ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5БЕО ІЮ МО:109; І СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:120; та І! СОВАЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:131; м) ГСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5БЕО ІЮ МО:110; І! СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:121; та І СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:132; мі) ГЕСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВ1, наведеної в 5ЕО 10 МО:111; І! СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:122; та І! СОВЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:133; мії) ГЕСОВІ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:112; І! СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:123; та І! СОВЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:134; мії) СОВА, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:113; І! СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:124; та І! СОВЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:135; їх) ЇСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5БЕО 10 МО:114; І СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:125; та І! СОВЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:136; х) СОН, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5БЕО ІЮ МО:115; І СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:126; та І! СОВЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:137; хі) ГСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:116; І СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:127; та І! СОВЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:138; хії) СОН, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5БЕО ІЮ МО:166; І СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:169; та І! СОВЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:172; хії) ГСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:167; І СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:170; та І! СОВАЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:173; або хім) ГСОВІ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в 5БЕО ІЮ МО:168; І СОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І! СОР, наведеної в 5ЕО І МО:171; та І СОВЗ3, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:174; або

І) варіабельний домен важкого ланцюга, що містить:

її НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І МО:40; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:51; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:62;

і) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:41; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО 10 МО:52; і НСОРВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:63;

ії) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І МО:42; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:53; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:64;

їм) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:43; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:54; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:65;

м) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І МО:44; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:55; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:66;

мі) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І МО:45; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:56; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:67;

мії) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І МО:46; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:57; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:68;

мії) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І МО:47; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:58; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:69;

їх) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І МО:48; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:59; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:70;

х) НОСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І МО:49; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:60; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО 10 МО:71;

хі) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО І МО:50; НСОН2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:61; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО І МО:72;

хії) НСОНВІТ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНІ, наведеної в 5ЕО 10 МО 148; НСОНВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:151; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ОО МО 154;

хії) НСОНВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНІ, наведеної в 5ЕО І МО: 149; НСОНВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2,

наведеної в 5ЕО ІЮ МО:152; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:155; або хім) НСОВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНІ, наведеної в 5ЕО 100 МО150; НСОНВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:153; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО 10 МО: 156.

В окремих варіантах реалізації дев'ятого аспекту поліпептид кодує легкий ланцюг антитіла та є щонайменше на 8095, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595 або на 10095 ідентичним нуклеотидній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:73, 5ЕБЕО ІЮ МО:74, 5БЕО ІЮ МО:75, 5ЕО ІЮ

МО:76, 5ЕО ІЮ МО:77, 5ЕО ІЮ МО:78, 5ЕО ІЮ МО:79, 5ЕО І МО:80, 5ЕО 10 МО:81, 5ЕО ІЮ МО:82,

ЗЕО Ір МО:83, 5ЕО 10 МО:157, 5ЕО ІО МО:158 або 5ЕО ІЮО МО:159. В інших варіантах реалізації дев'ятого аспекту поліпептид кодує важкий ланцюг антитіла та є щонайменше на 8095, щонайменше на 9095, щонайменше на 9595 або на 10095 ідентичним нуклеотидній послідовності, наведеній в 5ХЕО ІЮ МО:7, 5ЕО ІЮ МО:8, 5ЕО І МО:9, 5ЕО 10 МО:10, 5ЕО ІЮ МО:11, 5ЕО ІЮ МО:12,

ЗЕО ІО МО:13, 5ЕО ІЮ МО:14, 5ЕО ІО МО:15, 5ЕО ІЮ МО:16, 5ЕО І МО:17, 5ЕО ІЮ МО:139, 5ЕО ІЮ

МО:140 або 5ЕО ІОЮ МО:141.

В десятому аспекті реалізації винаходу запропонований вектор експресії, що містить одну або більше виділених нуклеїнових кислот відповідно до восьмого аспекту. В окремих варіантах реалізації вектор експресії кодує легкий ланцюг антитіла, важкий ланцюг антитіла або і легкий ланцюг і важкий ланцюг антитіла.

В одинадцятому аспекті реалізації винаходу запропонована клітина-хазяїн, що містить одну або більше виділених нуклеїнових кислот відповідно до дев'ятого аспекту, які функціонально пов'язані з промотором, включаючи рекомбінантні клітини-хазяїни, що містять один або більше векторів експресії відповідно до десятого аспекту реалізації винаходу. В переважних варіантах реалізації рекомбінантна клітина-хазяїн секретує антитіло, яке зв'язує 512. Переважними клітинами- хазяїнами є клітини-хазяїни ссавців, включачи клітинні лінії СНО.

У дванадцятому аспекті реалізації винаходу запропоновані способи лікування аутоімунних або запальних захворювань, при чому цей спосіб включає введення пацієнту, який цього потребує, терапевтично ефективної кількості 5Т2-антигензв'язувального білка відповідно до будь-якого аспекту з першого, другого, третього, четвертого, п'ятого, шостого, сьомого або восьмого. В переважних варіантах реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок являє собою антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:95, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО І МО 29 (наприклад, АБІ), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:96, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:30 (наприклад, АБр2г), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену, в 5ЕО ІЮ МО:97, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:З31 (наприклад, АБЗ), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену, в 5ЕО ІЮ МО:98, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:32 (наприклад, АБбБ4), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:99, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:33 (наприклад, АБ5), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену, в 5ЕО ІЮ

МО:100, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО

ІО МО:34 (наприклад, Абб), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:101, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в ЗЕО ІЮ МО:35 (наприклад, Аб7), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:102, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:36 (наприклад, АБВ), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО І МО:103, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:37 (наприклад, АБО), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:104, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:38 (наприклад, АБІ10), антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ

МО:105, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО

ІЮО МО:39 (наприклад, АБІ11); антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в ЕС ІЮ МО:163, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:145 (наприклад, АБЗО0); антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮО МО:164, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:146

(наприклад, АБЗ32); або антитіло, що містить амінокислотну послідовність варіабельного домену легкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІО МО:165, та амінокислотну послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, наведену в 5ЕО ІЮ МО:147 (наприклад, АБ33). В переважних варіантах реалізації

ЗТ2-антигензв'язувальний білок пригнічує зв'язування І/-33 з 512. В особливо переважних варіантах реалізації аутоїмунним або запальним захворюванням є астма, запальне захворювання кишечнику, ревматоїдний артрит, псоріаз, атопічний дерматит, фіброз, хронічне обструктиве захворювання легенів,зсистемний червоний вовчак, склероз, гранулематоз Вегенера, хвороба

Бехчета, риносинусит, назальний поліпоз, еозинофільний бронхіт та серцево-судинне захворювання.

У тринадцятому аспекті реалізації винаходу запропонований спосіб виготовлення 5т2- антигензв'язувального білка відповідно до будь-якого аспекту з першого, другого, третього, четвертого, п'ятого, шостого, сьомого або восьмого, шляхом культивування рекомбінантної клітини- хазяїна відповідно до одинадцятого аспекту та виділення із зазначеної культури 5т2- антигензв'язувального білка.

У чотирнадцятому аспекті реалізації винаходу запропоновані 5Т2-антигензв'язувальні білки відповідно до будь-якого аспекту з першого, другого, третього, четвертого, п'ятого, шостого, сьомого або восьмого, які перехресно конкурують з антитілом, вибраним з групи, що складається з: а) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 10:84, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в ЕС ІО МО:18; р) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 10:85, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:19; с) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 10:86, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20;

Я) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 10:87, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:21; е) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 10:88, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:22;

І) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в БЕО

ІО:89, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:23; 9) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 10:90, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:24;

М) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 10:91, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:25; ї) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в БЕО

І0:92, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:26;

Ї) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ХЕО

І0:93, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:27;

К) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 10:94, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:28;

І0:160, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:142; т) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 1І0:161, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО І

МО:143; та п) антитіла, яке містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в

ЗЕО 10:162, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО І

МО:144.

У п'ятнадцятому аспекті реалізації винаходу запропонований виділений /-512- антигензв'язувальний білок, який переважно є антитілом або його функціональним фрагментом, який зв'язує поліпептид, що містить домен 1 та домен 2 512 людини (5ЕО ІЮ МО:175), при чому зв'язування в значній мірі пригнічується у випадку введення одиничної мутації в домен 1 та домен 2 512 людини цього поліпептиду, а одинична мутація вибрана з групи, що складається з І 14Н, 1158,

ЗЗЗА, Е4ЗВ, М47В, Аб2В, а65Н, Т798, 0928, 097, М1048, с1388, М1528 та М176В. Під "в значній мірі пригнічується" мається на увазі те, що виміряна різниця у зв'язуванні є статично значною. У переважних варіантах реалізації зв'язування в значній мірі пригнічується для двох або більше представників групи, включаючи всіх представників групи. В окремих варіантах реалізації п'ятнадцятого аспекту зв'язування в значній мірі активується у випадку введення одиничної мутації в домен 1 та домен 2 512 людини цього поліпептиду, а одинична мутація вибрана з групи, що складається з /53Щ8, В72А та 573ВА. Під "в значній мірі активується" мається на увазі те, що виміряна різниця в зв'язуванні є статично значною. В переважних варіантах реалізації зв'язування в значній мірі активується для всіх представників групи. В окремих варіантах реалізації п'ятнадцятого аспекту 5Т2-зв'язувальний білок перехресно конкурує за зв'язування з 512 людини з антитілом, який містить легкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО

І0:85, та важкий ланцюг, що містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО І МО:19. В особливо переважних варіантах реалізації антигензв'язувальний білок є антигензв'язувальним білком відповідно до першого, другого, третього, четвертого, п'ятого, шостого, сьомого або восьмого аспекту.

В шістнадцятому аспекті реалізації винаходу запропонований антигензв'язувальний білок відповідно до першого, другого, третього, четвертого, п'ятого, шостого, сьомого, восьмого, чотирнадцятого або п'ятнадцятого аспекту, при чому зазначений 5Т2-зв'язувальний білок переважно являє собою антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, зв'язує частину 512, що містить амінокислоти 33-44 та/або 88-94 з 5ЕО ІЮО МО:1, що визначено за допомогою аналізу воднево-дейтерієвого обміну.

В сімнадцятому аспекті реалізації винаходу запропонований антигензв'язувальний білок, який переважно є антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, відповідно до першого, другого, третього, четвертого, п'ятого, шостого, сьомого, восьмого, чотирнадцятого, п'ятнадцатого або шістнадцятого аспекту, який зв'язується з 512 з утворенням області контакту, при чому область контакту, утворена за зазначеного зв'язування, містить залишок 512, вибраний з групи, яка складається з КІ, Е2, РІ19, 820, 021, 22, К23, М26, 170, М71, 872, 573, Р74, 175, 76, М77, 878, 779 та У81. В переважних варіантах реалізації область контакту, утворена за зазначеного зв'язування, містить залишок 512, вибраний з Р19, 820, 021, 22, К23, та/(або 26, залишок 512, вибраний з 170, М71, 872, 573, Р74, 175, Е76, М77, Н78, 179, та/або У81, або залишки 512, вибрані з РІ9, 820, 021, 222, К23, м26, 170, М71, 872, 573, Р74, 175, Е76, М77, 878, 179 та У81. Область контакту можна визначити за різницею в площі поверхні, яка є доступною для розчинника, між зв'язаним та незв'язаним 512, при чому залишки з області контакту визначають як ті амінокислоти, які характеризуються різницею більше 1095, та ті, що утворюють опосередковані водою водневі зв'язки із зазначеним антитілом, або визначають як ті амінокислоти, які містять щонайменше один атом в межах 5А від антитіла.

У вісімнадцятому аспекті реалізації винаходу запропонований відділений /5т2- антигензв'язувальний білок, який переважно є оантитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, що містить а) варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095 або щонайменше на 9595 ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:С:96, б) варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095 або щонайменше на 9595 ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5БЕО ІЮ МО:30; с) варіабельний домен легкого ланцюга згідно з а) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з Б), 4) варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІО МО:96; е) варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО І МО:30; У) варіабельний домен легкого ланцюга згідно з а) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з є), 9) варіабельний домен легкого ланцюга, який містить | СОВ1, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І! СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:107; І СОН82, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:118; та І СОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності І СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:129, І) варіабельний домен важкого ланцюга, який містить НСОНВІ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВІ, наведеної в 5ЕО І

МО:41; НСОВ2, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОНВ2, наведеної в 5БО І МО:52; та НСОВЗ, що містить не більше трьох амінокислотних вставок, делецій або замін відносно послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО І

МО:63, або ї) варіабельний домен легкого ланцюга згідно з у) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з п).

У переважних варіантах реалізації вісімнадцятого аспекту варіабельна ділянка легкого ланцюга містить Ю28 або його консервативну заміну, 129 або його консервативну заміну, 530 або його консервативну заміну, МЗ31 або його консервативну заміну, У32 або його консервативну заміну, 49 або його консервативну заміну, 050 або його консервативну заміну, М53 або його консервативну заміну, Е55 або його консервативну заміну, Т56 або його консервативну заміну, 091 або його консервативну заміну, 092 або його консервативну заміну, МУЗ або його консервативну заміну, Е94 або його консервативну заміну або 196 або його консервативну заміну. В інших переважних варіантах реалізації варіабельна ділянка легкого ланцюга містить 028 або його консервативну заміну, М31 або його консервативну заміну, 050 або його консервативну заміну, М5З3 або його консервативну заміну, Е55 або його консервативну заміну, 091 або його консервативну заміну та

Срог2 або його консервативну заміну. В інших переважних варіантах реалізації варіабельна ділянка легкого ланцюга містить 028, МЗ31, 050, М5З, Е55, 091 та 0092.

У вісімнадцятий аспект реалізації також включені 5Т2-зв'язувальні білки, переважно антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, при чому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить МУЗЗ3

ІЗ або його консервативну заміну, І5О або його консервативну заміну, 057 або його консервативну заміну, 859 або його консервативну заміну, НОЗ або його консервативну заміну, 100 або його консервативну заміну, Т101 або його консервативну заміну, 5102 або його консервативну заміну,

З103 або його консервативну заміну, 0104 або його консервативну заміну, М105 або його консервативну заміну або У106 або його консервативну заміну; при чому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить 5102 або його консервативну заміну, 5103 або його консервативну заміну, 0104 або його консервативну заміну та М105 або його консервативну заміну; та при чому варіабельна ділянка важкого ланцюга містить 5102, 5103, 0104 та М105.

У певних варіантах реалізації вісімнадцятого аспекту 5Т2-антигензв'язувальний білок специфічно зв'язує 512 людини з афінністю, яка є меншою або дорівнює 1 х 1079 М, пригнічує зв'язування 512 людини з ІЇ-33 людини, знижує ІЇ-33-опосередковану передачу сигналу 512 людини в експресуючих 512 клітинах людини, пригнічує зв'язування 512 яванської макаки з ІЇ-33 яванської макаки, знижує ІІ-33-опосередковану передачу сигналу 512 яванської макаки в експресуючих 512 клітинах яванської макаки та/або є антитілом, таким як антитіло людини.

Короткий опис фігур

Фіг1 Обробка 512 тАбБ призводить до значного пригнічення ІІ -33- індукованого 1ІІ/-5 в рідині бронхоальвеолярного лаважу (РБАЛ) мишей штамів ВаїЇБ/с та С57ВІ/6.

Фіг.2 Обробка 5Т2 тАБ є ефективною в алерген (СВА)-індукованій моделі астми таргана. У мишей, які були оброблені антитілом до 512, спостерігали значно меншу кількість еозинофілів

РБАЛ, ніж у мишей ізотипичного контролю, які були оброблені 1д.

Фіг.3 Пригнічення 5Т2 тАбвз ІІ-33-індукованого вироблення І/-5 людини з СО4- Т-клітин, отриманих від різних донорів. Лінія (-- ) відображає значення для позитивного контролю ІЇ-33 людини в комбінації з ЇЇ -2 людини за відсутності пригнічення. (г) відображає значення для позитивного контролю ІЇ-2 людини. Лінія (- - ) відображає значення для контролю середовища.

Фіг.4 Аналіз залежності доза-відповідь для ІЇ -33 людини в МК-клітинах людини.

Фіг.5 Зниження активності ІІ -33 внаслідок впливу Аб2, зареєстроване під час аналізу МК-клітин людини, порівняно з комерційно доступними антитілами до 512. Клони НВ12, ЕВУ та 2А5 отримали від міднародної корпорації МВІ.. Клон В4Еб отримали від МО Віозсієпсе5. Клон 97203 отримали від

Во 5узієтв.

Фіг.б Розташування ділянок 512, що зв'язані АБ2, визначених за допомогою НОХ (дивіться

Приклад 12). Ділянка, яка відповідає амінокислотам 15-26 позаклітинного домену 512, виділена червоним, а ділянка, яка відповідає амінокислотам 70-76 позаклітинного домену 512 виділена пурпуровим.

Фіг.7 Загальна структура комплексу 5Т2/Ар2 5с-а5Ем. На фігурі наведено зображення двох молекул Ар2 5с-05Ем, із забарвленою відповідно у ціановий/лакитний або світло- жовтий/золотистий парою легкий ланцюг (І С)/важкий ланцюг (НС). Дві молекули 512 зображені пурпуровим та зеленим кольором.

Фіг.8 Область зв'язування. 512 зображен жовтим кольором. Важкий ланцюг та легкий ланцюг

Араг зображені сірим та пшеничним кольором. Петлі СОВ для важкого ланцюга та легкого ланцюга забарвлені у наступному порядку: СОВА: червоним (НС) або світло-червоним (І С); СОВ2: зеленим (НС) або світло-зеленим (І С); та СОВЗ: блакитним (НС) або світло-блакитним (І С).

Фіг.9 Карта розподілу електростатичного поверхневого потенціалу для 512 та АБ2 5с-авгм.

Фіг.9А) Комплементарність заряду та поверхні для 512 та Ар2 5с-й5Ем. Область зв'язування обведена колом. Фіг.9В) Ліва частина: АБ2 (сірий/лпшеничний колір) зв'язується позитивно зарядженою ділянкою на (поверхні) 512; Права частина: 512 (жовтий колір) зв'язується з кислотною ділянкою (поверхні) Ар2 5с-й5Ем. На карті розподілу електростатичного поверхневого потенціалу червона поверхня відповідає негативному заряду, а блакитна поверхня відповідає позитивному заряду.

Фіг.10 Залишки в межах варіабельних доменів АБ2, які утворюють область контакту з 512 за зв'язування з антигеном. Ділянки СОМ обведені. Залишки в межах області контакту виділені жирним текстом. Залишки, які утворюють водневі зв'язки або сольові містки з амінокислотами в межах 512, виділені курсивом.

Детальний опис винаходу

Заголовки розділів, які використовуються в цьому документі, наведені з метою структуризації та не обмежують предмету винаходу, що описується. Всі роботи, які перераховані в цьому описі, в повному об'ємі включені в документ як посилання.

Для синтезу рекомбінантних ДНК та олігонуклеотидів, культивування та трансформації тканин, очищення білка та таке інше, можна використовувати загальноприйнятні способи. Ферментативні реакції та очищення можна проводити відповідно до інструкції виробника або способами, які є загальноприйнятними в цій галузі техніки або описаними в цьому документі. Нижченаведені процедури та способи в загальному випадку можна здійснити відповідно до стандартних способів, широковідомих в цій галузі техніки, які описані в багатьох загальних та більш спеціалізованих роботах, що перелічені та обговорюються в описі винаходу. Дивіться, наприклад, Затрьгоок 6ї аї.,

2001, Моіесшаг Сіопіпо: А І арогаюгу Мапиєї, 39 єд., Соїд бргіпд Нагог І арогаїогу Ргевв, соїд брігіпу

Наброг, М.У., яка включена в цей документ як посилання для використовування з будь-якою метою.

У випадку якщо не наведені окремі визначення, термінологія, а також лабораторні процедури та методи аналітичної хімії, органічної хімії, медицинської та фармацевтичної хімії, які описані в цьому описі, є широковідомими за загальвживані в цій галузі техніки. Для хімічного синтезу, хімічного аналізу, фармацевтичного виготовлення, складання рецептури, а також доставки препаратів та лікування пацієнтів можна використовувати стандартні методи.

ЗІ2

Антигензв'язувальні білки, які описані в цьому документі, зв'язуються з 512. 512 експресується як у вигляді розчинного несигнального варіанта (розчинний 512 або 5512), так і в повнорозмірній трансмембранній формі (Б 512, 5Т2 або 5121). Приклад амінокислотної послідовності 5121. людини наведений в Таблиці 1. Білок складається з декількох доменів. Амінокислоти 1-18 відповідають лідерній послідовності, яка може відщеплюватись під час процесингу білка в клітинах ссавців; амінокислоти 19-331 відповідають позаклітинному домену; амінокислоти 332-350 відповідають трансмембранному домену; а амінокислоти 351-556 відповідають внутрішньоклітинному домену. В переважних варіантах реалізації антигензв'язувальний білок зв'язується з позаклітинним доменом 5121! та запобігає взаємодії 512 з 1І/-33. Приклад амінокислотної послідовності Ії -33 людини наведений в Таблиці 1.

Передача сигналу ІІ -33 здійснюється через гетеродимерний рецептор, що містить 5121 та Аср.

Приклад амінокислотної послідовності АсР людини наведений в Таблиці 1. Цей білок також складається з декількох доменів: амінокислоти 1-20 відповідають лідерній послідовності, яка може відщеплюватися під час процесингу білка в клітинах ссавців; амінокислоти 21-367 відповідають позаклітинному домену; амінокислоти 368-388 відповідають трансмембранному домену; а амінокислоти 389-570 відповідають внутрішньоклітинному домену. В прикладах, які ілюструють варіанти реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок зв'язує 5Т2Ї та перешкоджає ІІ-33- опосередкованій передачі сигналу в клітинах, що експресують 5121 та Аср.

Таблиця 1

Аминокіслотна послідовність 512 людини (5ЕО 10 МО:1)

МагРУАТІМУЗТААКЕЗКОВУИ,Ї ЕМЕАМАСРАОСКРОУТ МОМ ММЗОТМКОІРТОЕВМАМЕАЗИО

Г'СКЕсРАХМАЮЗИСЇМТСІМАЗРТЕМАТаМАММУТІМККОВОСМУРОМІ МУЗТУЗавзЕКМ5ЗКІМСРТІСІ МУ

ТАРГЕМРКМСОАІ ОСЗАМАВАНКЗОЕЇ МІОМУМТЕОСАСОМТСОКРІНМНЕМСАМУЗМТАТАЗЕТУКОЕОСЕБІ.

ЕРМІСАРАОМЕІКЕМЕІСКМАМІ ТСЗАСЕРС,КИтОвРІ ААМІ МОЇ МаткІТогаСЕРВІООЄЕСОМОЕЗМИЇ.

АСІ ОММІ ВІАОУКЕЕОІ ГП ОМОСІ АІ МІ Наге!АеНТУВІ ЗАКМРІОННІЗІМСПАМСЗМ ЕІ МОМ МІ КМЕ

МЕАТИ М АОІАКРУКТАМОСКІ МВАМУММРАМУКЗЗТОСАЗБАМЕНЕМНОЇІ РОМ ЕМКОССОаМТІ СІМС ВО

МІ РЕЕОММТАМЕТМІВКЗАВНІРІ ТРОЇ ТНМКЕРАМЕОЕМАЇ НСАПОМОАКМІ ТЕМЕАЇ ЗЕГОМІ ОАЕАЇ.

ОО5І ОНІ МКМОСТІКУ ВЕОНІАМКАБІ МЗАКЕУМУКНУВМОМРУРЗКІРАКА55БІ ТРІ АДОКО

Х-ЕабоА

МТМ СУМІ МЕМИапгОо5ОАЗЕНСООМаИа и отТМвОЮМЕЕОЕРАВІКСРІРЕНЕС КЕМУЗТАНЗАС ТІ МУ

УМ ТВОЇ ЕЕРІМЕВІ РЕМАІЗКЕКОМІ М/ЕВРТ І МОТамМУТ СМ АМТТУСЗКМАЕРІГЕММОКОЗСЕМ

ЗРМКІ РУНКІ МІЕЕМСІОВІ ТСРМУМрамЕРБЗБЗУКРТІ ПУУМасуУКІОМЕМММІРЕСММІ ЗЕЛАСІЗММаИамит

СУМТУРЕМОаВТЕНІ ТАТ ТУКУМаЗРКМАМРРМІНВРМОНУУМЕКЕРЕЕЄЕ ГІРСТУМЕЗЕРЇ МОЗАМЕММУ

М/ПраккРОВІТІЮМТІМЕБЗІЗНЗАТЕОЕТВАТОЇІ ЗІККУТЗЕРІ КАЗМУСНАВЗАКИОЕМАКААКУКОКМРА

РАУТУЕГ АСОаРаАТМИ УМІНУМУНУМУЛ ЕММ ЕМАВАНЕИТОЕТІ СИКЕМОЇМУЗМАВМАЕЕЕЕРМИ ТІ.

ВОМ ЕМЕРОУКІ СІЕЄОВОБІ РОСІМТОЕТІ 5ГІОКЗАВІ І УМІ ЗРМУМІ ОСТОА І ЕІ КАСІ ЕММАЗАИМІ

ММІ/РМОУКАМКЕТКУКЕЇ КВАКТМІ ТМІКУКСЕКЗКУРОСВЕМУ КО ОМАМРУККОЗРА АЗ5ЗОЕОСІ 55

ЗІ КМУ

МКРКЕМКУЗТМКІЗТАКУКМТАЗКАЇ СЕК ИКЗООКАКЕМСРМУЕМКІ АЗИаЇ МІККЕАСУЕАВЕТТКА РО

ІЇКкТавкнНКкАНІМІ ААСОСОЗТУЕСЕАРИІЗаМОкКмУТВАІ НОБЗБІТИИІЗРІТЕМІ АБІ БТУМООБІТЕАГЕОЕ

ЗУБЕІММЕОІ ККОЕККОКМ ЇЇ 5ММЕБОНРОМЕЗО СИМ РИКМІ ММУТІ 5РТКОРМ/І НАММКЕНЗМУЕЇ НКСЕ

КРІ РООАРЕМ-НЯІМНОЗМСУЗЕЕСКТОРЕМЕІаМКОМНІ АСКМОЗЗЕМССТЕМІ ЕКІ ЗЕТ

В прикладах, які ілюструють варіанти реалізації цього винаходу, відбувається високоафінне зв'язування як 512 людини, так і 512 яванської макаки, включаючи ті випадки, коли відбувається високоафінне зв'язування та блокується взаємодія ІІ -33 яванської макаки з 512 яванської макаки.

Ці характеристики забеспечують інформативне токсикологічне дослідження на приматах за винятком людини.

Приклад амінокислотної послідовності 5121 яванської макаки наведений в Таблиці 2. Цей білок складається з декількох доменів: амінокислоти 1-18 відповідають лідерній послідовності, яка може відщепдюватись під час процесингу білка в клітинах ссавців; амінокислоти 19-331 відповідають позаклітинному домену; амінокислоти 332-350 відповідають трансмембранному домену; а амінокислоти 351-556 відповідають внутришньоклітинному домену.

Приклад амінокислотної послідовності АсР яванської макаки наведений в Таблиці 2. Цей білок складається з декількох доменів: амінокислоти 1-20 відповідають лідерній послідовності, яка може відщеплятися під час процесингу білка в клітинах ссавців; амінокислоти 21-367 відповідають позаклітинному домену; амінокислоти 368-388 відповідають трансмембранному домену; а амінокислоти 389-570 відповідають внутришньоклітинному домену.

Приклад амінокислотної послідовності ІЇ -33 яванської макаки наведений в Таблиці 2.

Таблиця 2

Амінокислотна послідовність 512 яванської макаки (5ЕО 1О МО:4)

Маг АІТІ ММ5ТААКЕВКОБУ, ЕМЕА ІМАСРАВОСКООУМОМ УМБОТМКОІРТОЕАМАМЕАБСОЇ.

ЇКЕ-РАЕМАОБИИМТСІМАЗРТЕМАТаМАММТІУККОРОСМУРОМІ МУЗ УБаБЗЕКМЗКІМСРТІОЇ МММУУТ

АРГЕЖМЕКМСОАГОСОАУКАНКОЕЇ МІОМММТ ООАСОМТСКЕІНМЕМСАМУ5УМТАТАЗЕТУКОЕОСЕЗА

ЕРМІВАРАНМЕТКЕМЕІСЕМТМІ ТС5БАСЕРИКОаАОГІ АТМОУМОЇ МЕОМКІТОЕБЕРВІСОЕЄЕСОМОБЕЗМОИ

ГАСУМТМІ ВІАЛОМКЕЕОПІ І ВМОСІ А МІ На! ВЕНТтІВІ ЗАКМРІВОНОБТУСПАМСБМ ЕМО МІ МПЕКТЕМУ

ІЕАТ М/ВСІАКРУКТАМОСКІ МОАММІМРАМУТ55АОСАБАМЕМЕМНОЇЇ РОМ ЕМКССОМТІ СІМЕВОМІ.

РОЕОММТАМЕТМІВКЗАВАНІРІ ТРОЇ ТНОЕЕРАМЕОЕМАЇ НБАПОМОБКМІ ТЕМЕАЇ 5ЕГОМІ ОАЕАГ ОО

ЗІ ВНІ МЕМОСТІКМУ ВЕОНМАМКА5І МЗАКЕМ КНМАХОМРУРОЗКМРЕАКА55БІ Т5І АДОКО

МТМ СММУ5БІ МЕМа! ОоБОАЗЕВНСООМ СІ ОТМАОСІОМЕЕОЕРАВІКСРІ ГЕНРІ КЕМУЗТАНЗАСІ ТИМ

МТ ВООВОГЕЕРІМЕВ РЕМВІЗКЕКОМІ М/'ЕВРТ І МОТамМУТ СМ АМТТИС5КМАЕРІ ЕММОКОБСЕМ

ЗРМКІ РУНКІ МІЕМСІОВІ ТСРММОСМЕРББУМКРТІ ГПУ УМасмкІОМЕМММІРЕСММІ ЗЕПАРІЗММИ МУ

СУУТУРЕМОВТЕНІ ТАТ ТУКУМавРКМАМРРМІНВРМОНМУММЕКЕРСОЕЕП ІРСТУМЕ5РІ МОБАМЕММУ

М/ПІРОаККкКРООВІРІОМТІМЕБІЗНОАТЕОЕТАТОЇ 5ІККУТЗЕОІ КАВБЕУМСНАВБАКОЕМАКААТУКОКМРА

РАМТМЕГ АСОБЕСАТМИ МУМІНМУМУНУМУМІ ЕММІЕМААНЕСТОЕТІ ССКЕМОІММ5МАНМАЕЕЕЕРМІ ТІ.

ВОМІ ЕМЕРОУКІ СІЕЄОВОБІ РЕСІМТОЕТІ 5РІОКОАВ І ММІ 5БРМУМІ ОСТОАГІ ЕІ КАСІ ЕММАБОСМІ

ММ. МОУКАМКЕТКМУКЕЇ КААКТМУМІ ТМІКУКИЕКЗКУРОСВЕМ КО ОМАМРУККЗРААЗ55ОЕОСІ 55

І КММ

МКРКМКУ5ТМКІЗТАКАКМТА5БКАЇ СЕКІ ЕКБООКАКЕМСНУМ ЕМКІ АБИ МІККЕАСУЕРАВЕТТКАРБО

І КкТаакнкКаенНІ МІ ААСОСО5БТМЕСЕАБИаІ5аУРКУТВАЇІ НОББІТИЇІ5РІТЕБІ АБІ 5БТУМООБІТЕАГЕОЕ

ЗУБІММЕОІ ККОКККОКМІ І 5 ЕБОНРОЗЕЗИВИМОСаКМІ ММТІ БРТКОРМІ ОАММКЕНЗМЕЇІ НКСЕ

КРІ РООАЕРЕМІ НМАЗ5ЕМСУМ5ЕЕСКТОРЕМЕІСМКОМНІ АСГІКМОНЗЕМІ СЗЕМІЇІ ЕКІ 5ЕЇ

ЗТ2-антигензв'язувальні білки

В цьому винаході запропоновані антигензв'язувальні білки, які специфічно зв'язують 512.

Варіанти реалізації антигензв'язувальних білків включають пептиди та/або поліпептиди, які специфічно зв'язують 512. Такі пептиди або поліпептиди в деяких випадках можуть включати одну або більше посттрансляційних модифікацій. Варіанти реалізації антигензв'язувальних білків включають антитіла та їх фрагменти відповідно до наведених в цьому описі визначенням, які специфічно зв'язують 512. Вони включають антитіла, які специфічно зв'язують 512 людини, включаючи ті, що пригнічують зв'язування та/або активацію 512 ІІ -33.

Антигензв'язувальні білки, які є об'єктами винаходу, специфічно зв'язуються з 512. Вираз «специфічно зв'язує", який вживають в цьому описі, значить, що антигензв'язувальний білок серед інших білків переважно зв'язує 512. В деяких варіантах реалізації вираз "специфічно зв'язує" значить, що 5Т2-антигензв'язувальний білок має більш високу афінність до 512, ніж до інших білків. 5Г2-антигензв'язувальні білки, які специфічно зв'язують 512, можуть мати афінність зв'язування до 512 людини, яка менше або дорівнює 1 х 10-7 М, менше або дорівнює 2 х 107 М, менше або дорівнює З х 107 М, менше або дорівнює 4 х 10-77 М, менше або дорівнює 5 х 107 М, менше або дорівнює б х 107 М, менше або дорівнює 7 х 107 М, менше або дорівнює 8 х 107 М, менше або дорівнює 9 х 107 М, менше або дорівнює 1 х 109 М, менше або дорівнює 2 х 109 М, менше або дорівнює З х 108 М, менше або дорівнює 4 х 109 М, менше або дорівнює 5 х 109 М, менше або дорівнює 6 х 108 М, менше або дорівнює 7 х 109 М, менше або дорівнює 8 х 102 М, менше або дорівнює 9 х 108 М, менше або дорівнює 1 х 109 М, менше або дорівнює 2 х 109 М, менше або дорівнює З х 109 М, менше або дорівнює 4 х 109 М, менше або дорівнює 5 х 109 М, менше або дорівнює 6 х 107 М, менше або дорівнює 7 х 107 М, менше або дорівнює 8 х 107 М, менше або дорівнює 9 х 107 М, менше або дорівнює 1 х 10792 М, менше або дорівнює 2 х 1079 М, менше або дорівнює З х 1079 М, менше або дорівнює 4 х 1079 М, менше або дорівнює 5 х 1079 М, менше або дорівнює 6 х 1079 М, менше або дорівнює 7 х 1079 М, менше або дорівнює 8 х 1079 М, менше або дорівнює 9 х 1079 М, менше або дорівнює 1 х 107! М, менше або дорівнює 2 х 107" М,

менше або дорівнює З х 107! М, менше або дорівнює 4 х 107! М, менше або дорівнює 5 х 107 М, менше або дорівнює 6 х 107! М, менше або дорівнює 7 х 107! М, менше або дорівнює 8 х 107" М, менше або дорівнює 9 х 107! М, менше або дорівнює 1 х 1072 М, менше або дорівнює 2 х 1072 М, менше або дорівнює З х 1072 М, менше або дорівнює 4 х 1072 М, менше або дорівнює 5 х 1072 М, менше або дорівнює 6 х 1072 М, менше або дорівнює 7 х 1072 М, менше або дорівнює 8 х 1072 М або менше або дорівнює 9 х 1072 М.

Спосіби визаначення афінності зв'язування антигензв'язувального білка добре відомі в цій галузі техніки. Загальноприйнятні способи визанчення афінності включають поверхневий плазмонний резонанс (ППР) (Могіоп апа Муз2Ка "Кіпеїйс апаїузіз ої тасготоїесціаг іптегасіпв изіпд зиптасе ріазтоп гезопапсе Біозепзоге" Меїйоа5 іп Еплутоіоду (1998) 295, 268-294), біо-шарову інтерферометрію, (Араїспе еї а! "Овівгтіпіпо Кіпеїїс5 апа АНПіпйев5 ої Ргоївїп Іпіегасіоп5 Ов5іпд а

Рагайе! Аеаї!І-йте Іаре!-їтеєе Віозепзог, Ше Осіе! Апаїуїїса! Віоспетівму (2008) 377, 209-217), кінетичний ексклюзійний аналіз (КіпЕхА) (Оагіпуд апа Вгацшй "Кіпеїіс ехсіибзіоп аззау Тесппо!оду: спагасіегіланоп ої тоїесціаг іпіегасноп5" Аззау апа ЮОпа Оем Тесп (2004) 2, 647-657), ізотермічну калориметрію (Ріегсе еї а! "Ізоїпегта! Тійгайоп СапІюогітеїгу ої Ргоївіп-Ргоївіп Іпіегасіопз" Меїйоаз5 (1999) 19, 213-221) та аналітичне ультрацентрифугування (Гером/й; еї а! "Модегп апаїуїсаї ийгасепігітидаєоп іп ргоїеіп 5сіепсе: А ішогіа!ч геміеми" Ргоївіпй Зсієпсе (2002), 11:2067-2079).

Приклади таких способів наведені в Прикладі 3.

Слід розуміти, що під час посилання в цьому описі до різних варіантів реалізації 5тТ2- антигензв'язувальних білків, останні включають також 5Т2-зв'язувальні фрагменти. 512- зв'язувальний фрагмент містить будь-який з фрагментів, які описані в цьому описі, або доменів антитіла, яке зберігає здатність специфічно зв'язуватись з 512. 5Т2-зв'язувальний фрагмент може знаходитись в будь-якій з каркасних структур, які описані в цьому описі.

В певних терапевтичних варіантах реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок пригнічує зв'язування 512 з ІІ -33 та/або пригнічує одну або більше біологічних функцій, які асоціюються зі зв'язуванням 512 з ІІ -33, наприклад, ІЇ-339-опосередковану передачу сигналу. Вважається, що такі антигензв'язувальні білки є "нейтралізуючими". В певних варіантах реалізації нейтралізуючий 51Т2- антигензв'язувальний білок специфічно зв'язує 512 та пригнічує зв'язування 512 з 1-33 на величину від 1095 до 10095, наприклад, щонайменше на близько 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 4З, 44, 45, Аб, 47, А8, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99965 або більше. Наприклад, можна досліджувати нейтралізуючу здатність 5ЗТ2-антигензв'язувальних білків шляхом визначення здатності антигензв'язувального білка блокувати зв'язування ІІ -33 з 5712 або ІІ/-33 з корецепторами 512 та

АсР, дивіться, наприклад, аналіз блокування ІІ/-33, наведений в Прикладі 6. В іншому варіанті можна досліджувати нейтралізуючу здатність 5Т2-антигензв'язувальних білків методом, в якому визначається ефект від присутності 5Т2-антигензв'язувального білка в аналізі, який визначає ЇЇ -33- опосередковану біологічну функцію. Наприклад, це здатність 1-33 індукувати біологічну відповідь, таку як внутрішньоклітинна передача сигналу або підвищена експресія медіаторов мРНК або секреція медіаторів, таких як цитокіни та хемокіни з клітин, таких як еозинофіли, базофіли, Т- клітини, тучні клітини, МК-клітини, МКТ-клітини, нейтрофіли або природні хелперні клітини. В іншому варіанті це може бути здатність І/-33 стимулювати диференціацію, проліферацію, виживання, хемотаксис, зміну форми або адгезивних властивостей клітин, таких як еозинофіли, базофіли, Т-клітини, тучні клітини, МК-клітини, МКТ-клітини, нейтрофіли або природні хелперні клітини. В іншому варіанті це може бути здатність ІІЇ-33 індукувати поверхневу експресію певних маркерів клітинної активації, таких як СО116, на клітинах, таких як еозинофіли, базофіли, Т-клітини, тучні клітини, МК-клітини, МКТ-клітини, нейтрофіли або природні хелперні клітини. Приклади таких способів наведені в Прикладах 7-10.

Варіанти реалізації антигензв'язувальних білків включають каркасні структури відповідно до наведених в цьому описі визначенням з однією або більше гіперваріабельними ділянками (СОВ5 - від англ. "сотріеєтепіагпіу еїептіпіпу гедіоп5"). Варіанти реалізації додатково включають антигензв'язувальні білки, що містять каркасну структуру з одним або більше варіабельними доменами антитіла, як важкими, так і легкими. Варіанти реалізації включають антитіла, які містять варіабельний домен легкого ланцюга, вибраний з групи, яка складається з варіабельного домену легкого ланцюга (І См) АВТ, АБ2 І См, АБЗ І См, АБА І См, АБ5 І См, АБб І См, АБ? І См, АБВ І См, АБО

Ї См, АБТОЇ См, АБІТ1 І См, АБЗО І См, АБЗ2 І См та АБЗЗ І См (5ЕО 10 МО:95-105, 163-165, відповідно), та/або варіабельний домен важкого ланцюга, вибраний з групи, яка складається з варіабельного домену важкого ланцюга (НС) АБІ, АБ2 НСм, АЬЗ НСм, АБ4 НС, АБО НС, АБб НС, АБ7 НСм, АБВ8

НСм, АБЗ НСм, АВТО НС, АБ11НСуУ, АЬБЗОНСУ, АЬЗ2НСмМ та АБЗЗНСм (5ЕО ІЮ МО:29-39, 145-147, відповідно), а також їх фрагменти, похідні, мутеїни та варіанти.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБІ І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:84.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АбБа2 І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:85.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБЗ І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:86.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АбБА І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:87.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБ5 І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:88.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБб І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:89.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБ7 І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:90.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБВ І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:91.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБО І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:92.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБ10 І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:93.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБІ1 І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО :94.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБЗО І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в БЕ І МО:160.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АбБЗа2 І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО І МО:161.

Прикладом легкого ланцюга, що містить АБЗЗ І Су, є легкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО І МО:162.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБІ НсСу, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:18.

Прикладом важкого ланцюга, що містить Ар2 НсСу, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:19.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБЗ НСу, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:20.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБ4 НсСу, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:21.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБ5 НсСу, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО :22.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБб НсСу, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО 23.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБ7 НсСу, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО 24.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБ8 НсСу, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:С25.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБЗ НсСу, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:26.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБІО НС, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:27.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБІї НС, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:28.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБбБЗО НС, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО :142.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБбБЗ2 НС, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО :143.

Прикладом важкого ланцюга, що містить АБбБЗЗ НС, є важкий ланцюг, який містить амінокислотну послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО :144.

Додаткові приклади передбачених каркасних структур включають: фібронектин, неокарциностатин СВМА-2, ліпокаліни, рецептори Т-клітин, домен протеїну-А (протеїн 7), Іт9, ТРА білки, цинк-пальцеві домени, рМмІІї, пташиний панкреатичний поліпептид, ССМ4, домен М/МУ, домен ого-гомології З, домени РОЛ, ТЕМІ бета-лактамазу, тіоредоксин, стафілококову нуклеазу, РНО- пальцеві домени, СІ -2, ВРТІ, АРРІ, НР5ТІ, екотин, І АСІ-О1, І ОТІ, МТІ-ІІ, токсини скорпіону, пептид дефензин-А комах, ЕЕТІ-ІЇ, Міп-23, СВО, РВР, цитохром Б0Б-562, домени рецептора Гаї, гамма- кристалін, убіквітин, трансферин та/або лектин-подібні домени С-типу. Огляд каркасних структур, які не належать антитілам, а також їх використання як терапевтичних препаратів, наведений у

Серацег апа 5Кета, Сит. Оріп. Спет. Віої., 13:245-255 (2009) та Віп; еї аї., Маї. Віоїесн., 23(10):1257-1268 (2005), які в повному обсязі включені в цей описі як посилання.

В аспекти реалізації цього винаходу включені антитіла, що містять наступні варіабельні домени:

АРІ І См/АБТ Неом (5ЕО ІЮ МО:95/5ЄО ІЮ МО: 29), АБВ2 І См/Ар2 Нем (5ЕО 10 МО:96/5ЄО 10 МО:30),

АрЗ І См/АЬЗ Неом (5ЕО ІЮ МО:97/5ЄО ІЮ МО:З31), АБ4 І См/АВа Не (5ЕО 10 МО:98/5ЕЄО 10 МО:32),

АРрБ5 І См/Ар5 Неом (5ЕО ІЮ МО:99/55Б0О І МО:33), АЬб І См/АБб НС (5ЕО 10 МО 100/5БО І МО:З4),

Ар7 І См/АбБ7 НбСм (5ЕО 10 МО:101/5ЄО 10 МО:35), АБ8 І См/АВБ8 НСм (5ЕО 10 МО:102/5О 10

МО:З36), АБУ І См/АБВО Нсм (5ЕО І МО:103/5ЄО 10 МО:37), АВТО І См/Абт10 НеСм (5ЕО ІЮ МО104/5О

ІЮО МО:38), АБІ1 І См/АБ11 НОСм (5ЕО 10 МО:105/5ЄО 10 МО:39), АБЗО І См/АВБ30 Нм (5ЕО І

МО:163/5ЕО І МО:145), АрЗ2 І См/АрЗ32 НСм (5ЕО 10 МО:164/5ЄО 10 МО:146), АВЬЗЗ І См/АЬЗ3 НСм (ЗЕО ІЮ МО :165/560 ІЮ МО:147) та їх комбінації, а також їх фрагменти, похідні, мутеїни та варіанти.

Приклади антитіл, які є об'єккгами цього винаходу, включають АБІ (5ЕО ІЮ МО:84/5ЕО І

МО:18), АБ2 (ЗЕО І МО:85/5ЕЄО І МО:19), АБЗ (5ЕО ІЮ МО:86/5БО ІБ МО:20), АБА (5ЕО І

МО:87/5БО ІЮ МО:21), АБ5 (ЗЕО І МО:88/5БО І МО:22), АЬб (ЗЕО ІЮ МО:89/5О ІЮ МО:23), АБУ (ЗЕО 0 МО:90/5О ІС МО:24), АБ8 (5ЕО ІЮ МО:91/5Є6О 10 МО:25), АБУ (5ЕО ІЮ МО:92/5ЕО Ір

МО:26), АВТО (ЗЕО ІЮ МО:93/5ЄО ІЮ МО:27), АБ11 (5ЕО ІЮ МО:94/5БО ІЮ МО:28), АБЗО (5ЕО Ір

МО:160/5ЄО ІЮ МО 142), АЬЗ2 (5ЕО І МО: 161/55БО 10 МО:143) та АБЗЗ (5ЕО ІЮ МО:162/5Е0О Ір

МО:144).

Зазвичай, кожний варіабельний домен легкого або важкого ланцюга антитіла містить три СОВ5.

Варіабельний домен важкого ланцюга містить СОВІ важкого ланцюга (НСОВІ), СОВ2 важкого ланцюга (НСОВ2) та СОВЗ важкого ланцюга (НСОВЗ). Варіабельний домен легкого ланцюга містить СОВІ1 легкого ланцюга (СОР), СОВ2 легкого ланцюга (І СОВ2) та СОВЗ легкого ланцюга (І СОВ3). В окремих варіантах реалізації винаходу антигензв'язувальний білок містить один або більше СОН», які знаходяться в межах бажаних варіабельних доменів, які описані в цьому описі.

Приклади СОВ» включають, але не обмежуються цим:

СОН», які належать до АБІ І Су: І! СОВА (5ЕО ІЮ МО:106), І СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:117) та І СОВЗ (ЗЕО ІЮ МО 728);

СОН, які належать до АБ2 І Су: І СОВ1 (ЗЕО І МО:107), ГСОВ2 (5ЕО 10 МО:118) та І СОВЗ (ЗЕО ІЮ МО 729);

СОН», які належать до АБЗ І Су: І! СОВА (5ЕО І МО:108), І СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:119) та І СОВЗ (ЗЕО І МО 130);

СОН», які належать до АБ4 І Су: І! СОВА (5ЕО І МО:109), І СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:120) та І СОВЗ (ЗЕО ІЮ МО 131);

СОН, які належать до АБ5 І Су: І СОВ1 (ЗЕО І МО:110), ГСОВ2 (5ЕО 10 МО:121) та І СОВЗ (ЗЕО ІЮ МО 132);

СОН», які належать до АБб І Су: І! СОВА (5ЕО І МО:111), І СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:122) та І СОВЗ (ЗЕО І МО 133);

СОН», які належать до АБ7 І Су: І! СОВА (5ЕО І МО:112), І СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:123) та І СОВЗ (ЗЕО ІО МО 134);

СОН», які належать до АБ8 І Су: І! СОВА (5ЕО І МО:113), І СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:124) та І СОВЗ (ЗЕО ІО МО 135);

СОН», які належать до АБО І Су: І! СОВА (5ЕО І МО:114), І СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:125) та І СОВЗ (ЗЕО ІЮ МО 136);

СОН», які належать до АБО І Су: І СОВ1 (5ЕО ІЮ МО:115), І СОВ2 (5ЕО ІО МО:126) та І СОВЗ (ЗЕО І МО: 137);

СОН», які належать до АБІ1 І Су: І СОВ1 (5ЕО ІЮ МО:116), І СОВ2 (5ЕО ІО МО:127) та СОВЗ (ЗЕО І МО 138);

СОН», які належать до АБЗО І Су: І СОВ1 (5ЕО ІЮ МО:166), І СОВ2 (5ЕО ІО МО:169) та І СОВЗ (ЗЕО ІЮ МО 172);

СОН», які належать до АБЗ2 І Су: І СОВ1 (5ЕО ІЮ МО:167), І СОВ2 (5ЕО ІО МО:170) та СОВЗ (ЗЕО І МО 173);

СОН», які належать до АБЗЗ І Су: І СОВ1 (5ЕО ІЮ МО:168), І СОВ2 (5ЕО ІО МО:171) та СОВЗ (ЗЕО І МО 174);

СОН», які належать до АБІ НСм: НСОВІ (5ЕО ІЮ МО:40), НСОН2 (5ЕО ІО МО:51) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮ МО:62);

СОН», які належать до АрБ2 НСм: НСОВІ (5ЕО І МО:41), НСОН2 (5ЕО І МО:52) та НСОВЗ (ЗЕО ІО МО:63);

СОН», які належать до АБЗ НСм: НСОВІ (5ЕО І МО:42), НСОН2 (5ЕО І МО:53) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮ МО:64);

СОН», які належать до АБ4 НСм: НСОВІ (5ЕО І МО:43), НСОН2 (5ЕО І МО:54) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮ МО:65);

СОН», які належать до АБО НСм: НСОВІ (5ЕО ІЮ МО:44), НСОН2 (5ЕО І МО:55) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮО МО:66);

СОН», які належать до АБб НСм: НСОВІ (5ЕО 10 МО:45), НСОН2 (5ЕО І МО:56) та НСОВЗ (ЗЕО ІО МО:67);

СОН», які належать до АБ7 НСм: НСОВІ (5ЕО 10 МО:46), НСОН2 (5ЕО І МО:57) та НСОВЗ (ЗЕО ІО МО:68);

СОН», які належать до АБ8 НСм: НСОВІ (5ЕО І МО:47), НСОН2 (5ЕО І МО:58) та НСОВЗ (ЗЕО ІО МО:69);

СОН», які належать до АБУ НСм: НСОВІ (5ЕО ІЮ МО:48), НСОН2 (5ЕО І МО:59) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮ МО:70);

СОН», які належать до АБ1О НСу: НСОВІ (5ЕО І МО:49), НСОВ2 (5ЕО ІЮ МО:60) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮ МО:71);

СОН», які належать до АБ11 НСу: НСОВІ (5ЕО І МО:50), НСОВ2 (5ЕО ІЮ МО:61) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮ МО:72);

СОН», які належать до АЬБЗО НСу: НСОВІТ (5ЕО І МО:148), НСОН2 (5ЕО І МО:151) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮ МО 154);

СОН», які належать до АЬБЗ2 НСу: НСОВІ (5ЕО І МО:149), НСОН2 (5ЕО ІЮ МО:152) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮО МО:155) і

СОН», які належать до АБ3З3 НСу: НСОВІ (5ЕО І МО:150), НСОН2 (5ЕО ІОЮ МО:153) та НСОВЗ (ЗЕО ІЮ МО 156).

В деяких варіантах реалізації антигензв'язучий білок містить: А) поліпептид, наприклад, легкий ланцюг, який містить І! СОВІ1 з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з

ЗЕО ІЮ МОБ5:106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 166, 167 та 168; І СОВ2 з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з 5ЕБЕО ІЮ МО5:117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 169, 170 та 171; тал"або ІСОВЗ з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО5:128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 172, 173 та 174; та/або В) поліпептид, наприклад, важкий ланцюг, який містить

НООВІ з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з БЕО І МО5:40, 41, 42, АЗ, 44, 45, Аб, 47, 48, 49, 50, 148, 149 та 150; НСОН2 з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО5:51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 151, 152 та 153; та/лабо НСОВЗ з амінокислотною послідовністю, вибраною з групи, яка складається з 5ЕО І

МО5:62, 63, 64, 65, 66,67, 68, 69, 70, 71, 72, 154, 155 та 156.

В додаткових варіантах реалізації антигензв'язуюий білок містить: А) амінокислотну послідовність легкого ланцюга, що містить І! СОНА1, І СОВ2 та І СОВЗ, які належать до будь-якого з

АРІ І См, АБ2 І См, АрЗ І Су, АБ4А І См, АББ5 І См, АБб І См, АБ7 І См, АБВ8 І Су, АБО І См, АВТО І См,

АРрІ1 І См, АБЗО І См, АБЗ2 І См та АБЗЗ І Су, та В) амінокислотну послідовність важкого ланцюга, що містить НСОВІ, НСОВ2 та НСОНЗ, які належать до будь-якого з АБІ1 НСм, Ар2 НсСму, АБЗ Нсу,

Арі НС, АБ5 НС, АБб НС, АБ7 НС, АБ8 НСм, АБО НС, АБІТО НС, АБ11 НСм, АрзЗО НС, АрЗ2

НСм та АБЗЗ НсСу.

В певних варіантах реалізації СОН» містять не більше однієї, не більше двох, не більше трьох, не більше чотири, не більше п'яти або не більше шести амінокислотних вставок, делецій або замін відносно СОВ, наведеного в цьому описі як приклад.

В аспекти реалізації цього винаходу включені антитіла, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, вибраний з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО5:95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 та 165. В аспекти реалізації цього винаходу включені антитіла, що містять варіабельний домен важкого ланцюга, вибраний з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО5:29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146 та 147. В додаткові аспекти реалізації цього винаходу включені антитіла, що містять А) варіабельний домен легкого ланцюга, вибраний з групи, яка складається з БЕО ІЮ МОБ5:95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 та 165, та В) варіабельний домен важкого ланцюга, вибраний з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО5:29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146 та 147.

Антитіла, які є об'єктами цього винаходу, можуть містити будь-яку відому в цій галузі техніки константну область. Константною областю легкого ланцюга може бути, наприклад, константна область легкого ланцюга каппа- або лямбда-типу, наприклад, людська константна область легкого ланцюга каппа- або лямбда-типу. Константною областю важкого ланцюга може бути, наприклад, константна область важкого ланцюга альфа-, дельта-, іпсилон-, гамма- або мю-типу, наприклад, людська константна область важкого ланцюга і альфа-, дельта-, іпсилон-, гамма- або мю-типу. В одному варіанті реалізації константною областю легкого або важкого ланцюга є фрагмент, похідна, варіант або мутеїн константної області природного походження.

В аспекти реалізації цього винаходу включені антитіла, що містять варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з БЕО І МО5:95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 та 165, що містить не більше однієї, не більше двох, не більше трьох, не більше чотири, не більше п'яти, не більше шести, не більше семи, не більше восьми, не більше дев'яти або не більше десяти амінокислотних вставок, делецій або замін. В аспекти реалізації цього винаходу включені антитіла, що містять варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5БЕО ІЮО МО5:29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146 та 147, що містить не більше однієї, не більше двох, не більше трьох, не більше чотири, не більше п'яти, не більше шести, не більше семи, не більше восьми, не більше дев'яти або не більше десяти амінокислотних вставок, делецій або замін. В додаткові аспекти реалізації цього винаходу включені антитіла, що містять А) варіабельну ділянку легкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з 5ЕО І

МО5:95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 та 165, що містить не більше чотири, не більше п'яти, не більше шести, не більше семи, не більше восьми, не більше дев'яти або не більше десяти амінокислотних вставок, делецій або замін, та В) варіабельну ділянку важкого ланцюга, вибрану з групи, яка складається з ФБЕО ІЮ МО5:29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146 та 147, що містить не більше чотири, не більше п'яти, не більше шести, не більше семи, не більше восьми, не більше дев'яти або не більше десяти амінокислотних вставок, делецій або замін.

В одному з варіантів реалізації антигензв'язувальний білок містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 8095, щонайменше на 8195, щонайменше на 8295, щонайменше на 8395, щонайменше на 8495, щонайменше на 8595, щонайменше на 8695, щонайменше на 8795, щонайменше на 8895, щонайменше на 8995, щонайменше на 9095, щонайменше на 91965, щонайменше на 9295, щонайменше на 9395, щонайменше на 9495, щонайменше на 95965, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895 або щонайменше на 9995 ідентичною амінокислотній послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга, вибраної з групи, яка складається з БЕО ІЮ МОБ5:95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 та 165. В іншому варіанті реалізації антигензв'язувальний білок містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 8095, щонайменше на 8195, щонайменше на 8295, щонайменше на 83965, щонайменше на 8495, щонайменше на 8595, щонайменше на 8695, щонайменше на 87965, щонайменше на 8895, щонайменше на 8995, щонайменше на 9095, щонайменше на 9195, щонайменше на 9295, щонайменше на 9395, щонайменше на 9495, щонайменше на 95965, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895 або щонайменше на 9995 ідентичною амінокислотній послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО І МОБ5:29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146 та 147. У додатковому варіанті реалізації антигензв'язувальний білок містить А) амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 8095, щонайменше на 819565, щонайменше на 829565, щонайменше на 8395, щонайменше на 8495, щонайменше на 8595, щонайменше на 8695, щонайменше на 87965, щонайменше на 8895, щонайменше на 8995, щонайменше на 9095, щонайменше на 91965, щонайменше на 9295, щонайменше на 9395, щонайменше на 9495, щонайменше на 9595, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895 або щонайменше на 9995 ідентичною амінокислотній послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга, вибраної з групи, яка складається з 5ЕО ІЮ МО5:95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 163, 164 та 165, та В) амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 8095, щонайменше на 8195, щонайменше на 8296, щонайменше на 8395, щонайменше на 8495, щонайменше на 8595, щонайменше на 86965, щонайменше на 8795, щонайменше на 8895, щонайменше на 8995, щонайменше на 9095, щонайменше на 9195, щонайменше на 9295, щонайменше на 9395, щонайменше на 945965, щонайменше на 9595, щонайменше на 9695, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895 або щонайменше на 9995 ідентичною амінокислотній послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга, вибраної з групи, яка складається з БЕО ІЮ МО5:29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 145, 146 і 147.

В окремих варіантах реалізації антигензв'язувальний білок містить СОВЗ легкого ланцюга та/або важкого ланцюга. В деяких варіантах реалізації антигензв'язувальний білок містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ МО5:128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 172, 173, 174, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 154, 155 та 156. В окремих варіантах реалізації зазначена амінокислотна послідовність містить не більше однієї, не більше двох, не більше трьох, не більше чотири, не більше п'яти або не більше шести амінокислотних вставок, делецій або замін відносно зразкової послідовності, наведеної в

ЗЕО ІЮ МО5:128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 172, 173, 174, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 154, 155 та 156. Таким чином, варіанти реалізації цього винаходу включають антигензв'язувальний білок, що містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 8095, щонайменше на 8195, щонайменше на 8295, щонайменше на 8395, щонайменше на 845965, щонайменше на 8595, щонайменше на 8695, щонайменше на 8795, щонайменше на 88595, щонайменше на 8995, щонайменше на 9095, щонайменше на 9195, щонайменше на 92965, щонайменше на 9395, щонайменше на 9495, щонайменше на 9595, щонайменше на 96965, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895 або щонайменше на 9995 ідентичною амінокислотній послідовності, вибраної з групи послідовностей, наведених в 5ЕО І МО5:128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 172, 173, 174, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 154, 155 та 156.

В окремих варіантах реалізації антигензв'язувальний білок містить СОВ2 легкого ланцюга та/або важкого ланцюга. В деяких варіантах реалізації антигензв'язувальний білок містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ МО5:117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 169, 170, 171, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 151, 152 та 153. В окремих варіантах реалізації ця амінокислотна послідовність містить не більше однієї, не більше двох, не более трьох, не более чотири, не более п'яти або не более шести амінокислотних вставок, делецій або замін відносно зразкової послідовності, наведеної в 5ЕО І

МО5:117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 169, 170, 171, 51, 52,53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 151, 152 та 153. Таким чином, варіанти реалізації цього винаходу включають антигензв'язувальний білок, що містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 8095, щонайменше на 8195, щонайменше на 8295, щонайменше на 8395, щонайменше на 845965, щонайменше на 8595, щонайменше на 8695, щонайменше на 8795, щонайменше на 88595, щонайменше на 8995, щонайменше на 9095, щонайменше на 9195, щонайменше на 92965, щонайменше на 9395, щонайменше на 9495, щонайменше на 9595, щонайменше на 96965, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895 або щонайменше на 9995 ідентичною амінокислотній послідовності, вибраної з групи послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ МО5:117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 169, 170, 171, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 151, 152 та 153.

В окремих варіантах реалізації антигензв'язувальний білок містить СОВІ легкого ланцюга та/або важкого ланцюга. В деяких варіантах реалізації антигензв'язувальний білок містить амінокислотну послідовність, вибрану з групи послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ МО5:106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 166, 167, 168, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 148, 149 та 150. В окремих варіантах реалізації ця амінокислотна послідовність містить не більше однієї, не більше двох, не більше трьох, не більше чотири, не більше п'яти або не більше шести амінокислотних вставок, делецій або замін відносно зразкової послідовності, наведеної в 5ЕО І

МО5:106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 166, 167, 168, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 148, 149 та 150. Таким чином, варіанти реалізації цього винаходу включають антигензв'язувальний білок, що містить амінокислотну послідовність, яка є щонайменше на 8095, щонайменше на 8195, щонайменше на 8295, щонайменше на 8395, щонайменше на 845965, щонайменше на 8595, щонайменше на 8695, щонайменше на 8795, щонайменше на 88595, щонайменше на 8995, щонайменше на 9095, щонайменше на 9195, щонайменше на 92965, щонайменше на 9395, щонайменше на 9495, щонайменше на 9595, щонайменше на 96965, щонайменше на 9795, щонайменше на 9895 або щонайменше на 9995 ідентичною амінокислотній послідовності, вибраної з групи послідовностей, наведених в 5ЕО ІЮ МО5:106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 166, 167, 168, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 148, 149 та 150.

Антигензв'язувальні білки, які є об'єктами винаходу, містять каркасні структури традиційних антитіл, включаючи людські та моноклональні антитіла, біспецифічні антитіла, діатіла, мінітіла, доменні антитіла, синтетичні антитіла (іноді називають "міметиками антитіл"), химерні антитіла, злиті антитіла (іноді називають "кон'югатами антитіл) та фрагменти кожного з перелічених елементів. Вищеописані СОВ5, включаючи різні комбінації СОВА», можуть бути прищеплені до будь- якої з наступних каркасних структур.

Термін "антитіло", який вживається в цьому описі, стосується різних форм мономірних або мультимерних білків, що містять один або більше поліпептидних ланцюгів, які специфічно зв'язуються з антигеном відповідно до наведених в описі описів. В окремих варіантах реалізації антитіла отримують за допомогою рекомбінатних ДНК-технологій. В додаткових варіантах реалізації антитіла отримують за допомогою ферментативного або хімічного розщепления антитіл природного походження. В іншому аспекті реалізації антитіло вибране з групи, яка складається з: а) людського антитіла; Б) гуманізованого антитіла; с) химерного антитіла; 4) моноклонального антитіла; є) поліклонального антитіла; Її) рекомбінантного антитіла; 4) антигензв'язувального фрагмента; І) одноланцюгового антитіла; і) діатіла; )) триатіла, К) тетратіла, І) фрагмента Рар; т) фрагмента К(аб», п) антитіла ІдА, о) антитіла дО, р) антитіла ІДЕ, ад) антитіла ІДС, г) антитіла

Іс, 5) антитіла ІдДСЗ, ) антитіла Ідс4 та и) антитіла ІДМ.

Варіабельна ділянка або домен містить щонайменше три СОН: важкого або легкого ланцюгів, розміщених в межах каркасної області (каркасні області позначають як ЕВТ, ЕН2, ЕВЗ та ЕНа).

Кабаї єї аї., 1991, Зедиепсе5 ої Ргоївїп5 ої Іттипоіодіса! Іпієгеві, Рибіїс Неайй 5егмісе М.І.Н.,

Веїйезаа, МО. Структурні одиниці традиційного антитіла, зазвичай, містять тетрамер. Кожний тетрамер зазвичай складається з двох ідентичних пар поліпептидних ланцюгів, при чому кожна пара містить один "легкий" та один "важкий" ланцюг. Аміно-термінальна частина кожного ланцюга містить варіабельну ділянку довжиною від близько 100 до 110 або більше амінокислот, яка відповідає головним чином за впізнання антигену. Карбокси-термінальна частина кожного ланцюга визначає константну область, яка відповідає головним чином за ефекторну функцію. Людські легкі ланцюги класифікують як каппа або лямбда легкі ланцюги. Важкі ланцюги класифікують як мю, дельта, гамма, альфа або іпсилон, та саме вони визначають ізотип антитіла, відповідно як ДМ, до,

Ід, ІА та ІЗЕ. да має декілька підкласів, включаючи, але не обмежуючись цим, да, Ідаг, аз та аа. ІДМ має підкласи, включаючи, але не обмежуючись цим, ІДМ1 та І9М2. Варіанти реалізації винаходу включають всі подібні класи та підкласи антитіл, які містять варіабельний домен або СОВ антигензв'язувальних білків, як описано в цьому описі.

Деякі антитіла природного походження, такі, що виявляють у верблюдів та лам, являють собою димери, які складаються з двох важких ланцюгів та не містять легкі ланцюги. В цей винахід включені димерні антитіла, які складаються з двох важких ланцюгів, або їх фрагменти, які можуть зв'язуватися з 512.

Зазвичай, варіабельні ділянки важкого та легкого ланцюгів мають однакову загальну структуру консервативних каркасних областей (ЕВ), які з'єднані трьома гіперваріабельними ділянками, тобто такими, що визначають комплементарність ділянками або СОН5. СОВНб5 головним чином відповідають за впізнання та зв'язування антигену. СОН5 з двох ланцюгів кожної пари сполучаються за допомогою каркасних областей, що забезпечує можливість зв'язування зі специфічним епітопом. Від М-кінця до С- кінця та легкий та важкий ланцюги містять домени ЕН,

СОВІ, ЕН2, СОВ2, ЕВЗ, СОВЗ та ЕН4. Віднесення амінокислот до кожного з доменів проводять відповідно до визначень Кабата.

СОВ5 визначають основні поверхневі точки контакту для зв'язування антигену. СОНЗ легкого ланцюга та, особливо, СОНЗ важкого ланцюга визначають найбільш важливі детермінанти для зв'язування антигену в межах варіабельних ділянок легкого та важкого ланцюгів. Для деяких антитіл СОВЗ важкого ланцюга може визначати основну область контакту між антигеном та антитілом. Схеми іп мйго відбору, в яких варіюється тільки СОВЗ, можна використовувати для змінення зв'язувальних властивостей антитіла або для визначення, які залишки є важливими для зв'язування антигену.

Зазвичай, антитіла природного походження містять сигнальну послідовність, яка сприяє участі антитіла в клітинному шляху, пов'язаному з секрецією білка, та яка звичайно не є присутньою в зрілому антитілі. Полінуклеотид, який кодує антитіло, що є об'єктом винаходу, може кодувати сигнальну послідовність природного походження або гетерологічну сигнальну послідовність як описується нижче.

В одному варіанті реалізації антигензв'язувальний білок являє собою антитіло, що містить від одного до шести СОВ5 з прикладів, які описані в цьому описі. Антитіла, які є об'єктами винаходу, можуть належати до будь-якого типу, включаючи антитіла ІДМ, да (включаючи Іда1, дае, ІдаЗ,

І4с4), дО, ІдА або ІЗЕ. В конкретному варіанті реалізації антигензв'язувальний білок являє собою антитіло типу да, наприклад, антитіло дат.

В деяких варіантах реалізації, наприклад, коли антигензв'язувальний білок являє собою антитіло з повнорозмірними важким та легким ланцюгами, всі СОН» належать до одного виду, наприклад, людині В іншому варіанті наприклад, у варіантах реалізації, в яких антигензв'язувальний білок містить менше шести СОН5 з наведених вище послідовностей, додаткові СОН» можуть належати як до інших видів, так і бути СОН» людини, які відрізняються від тих, які наведені в зразкових послідовностях. Наприклад, ділянки НСОВЗ та І СОВЗ з визначених в цьому описі відповідних послідовностей можна використовувати разом з НСОВІ, НСОН2, І СОН та ІСОН2, додатково вибраними з таких, що належать до інших видів або людських послідовностей антитіл, які відрізняються, або їх комбінацій. Наприклад, СОН», які є об'єктами винаходу, можна заміщати ділянки СОВ химерних або гуманізованих антитіл, що мають комерційну цінність.

В конкретних варіантах реалізації використовують каркасні компоненти антигензв'язувальних білків, які є компонентами людського походження. При цьому в деяких варіантах реалізації каркасні компоненти можуть являти собою суміш компонентів від різних видів. В такому випадку, якщо антигензв'язувальний білок являє собою антитіло, таке антитіло може бути химерним антитілом та/або гуманізованим антитілом. В загальному випадку, як "химерні антитіла", так і "гуманізовані антитіла" належать до антитіл, в яких об'єднані ділянки, що належать до більше ніж одного виду.

Наприклад, "химерні антитіла" зазвичай містять варіабельну ділянку(ки), що належить миші (або, в деяких випадках, щуру), та константну область(ї), що належать людині. "Гуманізовані антитіла", зазвичай, належать до антитіл нелюдського походження, в яких каркасні області варіабельного домену були замінені послідовностями з антитіл людини. В загальному випадку гуманізованого антитіла все антитіло, за винятком одного або більше СОНВ5, кодується полінуклеотидом людського походження або є ідентичним такому антитілу, за винятком одного або больше СОН». СОН», деякі або всі з яких кодуються нуклеїновими кислотами, які належать організму нелюдського походження, прищеплюють в каркас складчастого бета-шару варіабельної ділянки людського антитіла, щоб отримати антитіло, специфічность якого визначається прищепленими СОН5. Отримання подібних антитіл описане, наприклад, в УМО 92/11018, Чдопе5 1986, Майте 321:522-525, Мептоеуеєп еї аї!., 1988, Зсієпсе 239:1534-1536. Також гуманізовані антитіла можна отримати, використовуючи мишей з імунною системою, яка є генетично сконструйована. Нодиє еї а!., 2004, Віотесппої. Ргод. 20:639-654. В зразкових варіантах реалізації, які описані в цьому описі, ідентифіковані СОН» є людськими, та, отже, в цьому контексті як гуманізовані, так і химерні антитіла містять деяку кількість СОН» нелюдського походження; наприклад, можуть бути отримані гуманізовані антитіла, що містять ділянки НСОВЗ та І СОВЗ, при цьому один або більше інших ділянок СОН» належать до іншого виду.

В одному варіанті реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок являє собою мультиспецифічне антитіло та, зокрема, біспецифічне антитіло, яке іноді також називають "діатілом". Це такі антитіла,

які зв'язуються з двома або більше різними антигенами або різними епітопами на одному антигені.

В окремих варіантах реалізації біспецифічне антитіло зв'язує 512 та антиген на людській ефекторній клітині (наприклад, Т-клітині). Такі антитіла корисні за націлювання на відповідь ефекторних клітин проти експресуючих 512 клітин, таких як експресуючі 572 пухлинні клітини. В переважних варіантах реалізації людським антигеном ефекторної клітини є СОЗ3. Патент США Мо 7,235,641. Способи отримання специфічних антитіл відомі в цій галузі техніки. Один з таких способів включає конструювання Ес-фрагмента важких ланцюгів таким чином, щоб створити "випуклості" та "западини", які сприяють утворенню гетеродимерів з важких ланцюгів за їх сумісної експресії в клітині. США 7,695,963. Інший спосіб також включає конструювання Ес-фрагмента важкого ланцюга, але при цьому використовує електростатичну взаємодію для стимуляції утворення гетеродимерів, в той же час, пригнічуючи утворення гомодимерів важких ланцюгів за їх сумісної експресії в клітині. М/О 09/089,004, яка в повному обсязі включена в цей документ як посилання.

В одному варіанті реалізації 5Г2-антигензв'язувальний білок являє собою мінітіло. Мінітіла є мінімізованими антитіло-подібними білками, що містять 5сЕм, який з'єднаний з доменом СНЗ. Ни єї а!., 1996, Сапсег Рез. 56:3055-3061.

В одному варіанті реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок являє собою доменне антитіло; дивіться, наприклад, патент США Мо 6,248,516. Доменні антитіла (дАр5) являють собою функціональні зв'язувальні домени антитіл, які відповідають варіабельним ділянкам важкого (МН) або легкого (МІ) ланцюга людських антитіл. ЗАВ5 мають молекулярну масу приблизно в 13 кДа або менше однієї десятої від маси повнорозмірного антитіла. ЧАВ5 добре експресуються в великій кількості організмів-хазяїнів, включаючи клітинні системи бактерій, дріжджів та ссавців. До того ж, аАрз є високостабільними та зберігають активність навіть в жостких умовах, таких як за ліофілізації або теплової денатурації. Дивіться, наприклад, патенти США 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; заявку на патент США Мо 2004/0110941; Європейський патент 0368684; патент США 6,696,245, МО04/058821, М 004/003019 та М/003/002609.

В одному варіанті реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок являє собою фрагмент антитіла, який є фрагментом будь-якого з наведених в цьому описі антитіл, який зберігає специфічність зв'язування з 512. В різних варіантах реалізації антигензв'язувальні білки містять без обмежень фрагменти К(аб), Каб), Е(ар)2, Ем або одноланцюгового Ем. Як мінімум, антитіло, відповідно до цього опису, містить поліпептид, який може специфічно зв'язуватись з 512, що містить повністю або частково варіабельний домен легкого або важкого ланцюга, наприклад, один або більше СОН5.

Додаткові приклади фрагментів 5Т2-зв'язувального антитіла включають, але не обмежуються цим, () фрагмент Раб, що складається з доменів МІ, МН, Сі та СНІ, (ї) фрагмент Ей, що складається з доменів УН та СНІ, (ії) фрагмент Гм, що складається з Мі та МН доменів одного антитіла; (м) фрагмент АБ (У/ага еї аї., 1989, Маїшге 341:544-546), що складається з одиничного варіабельного домену, (у) виділені ділянки СОР, (мі) фрагмент Е(аб')2г - бівалентний фрагмент, що містить два зв'язані фрагменти Раб, (мії) одноланцюгові молекули Ем (5сЕм), в яких домен МН та домен МІ з'єднані пептидним лінкером, який робить можливою асоціацію двох доменів для утворення антигензв'язувальної ділянки (Віга еї а!., 1988, 5сіепсе 242:423-426, Нивюп еї аї!., 1988,

Ргос. Май. Асай. сі. Ш.5.А. 85:5879-5883), (мії) біспецифічні одноланцюгові димери Ем (РСТ/О592/09965) та (їх) "діатіла" або "триатіла" - мультивалентні або мультиспецифічні фрагменти, сконструйовані шляхом генного злиття (Тотіїпбоп еї. аї., 2000, Меїнпод5 Епгутої. 326:461-479; М/094/13804; Ноіїїдег еї аї.,, 1993, Рос. Майї. Асай. Зсі. Ш.5.А. 90:6444-6448).

Фрагменти антитіл можна модифікувати. Наприклад, молекули можна стабілізувати шляхом впровадження дисульфідних містиків, які з'єднують домени МН та МІ (Неїйег еї а!., 1996, Маїшге

Віотесн. 14:1239-1245). Аспекти цього винаходу включають ті варіанти реалізації, в яких компоненти цих фрагментів, що не належать до СОЕВ,, є людськими послідовностями.

В одному варіанті реалізації 5Г2-антигензв'язувальний білок являє собою повністю людське антитіло. В цьому варіанті реалізації, як зазначено вище, окремі структури містять повнорозмірні важкий та легкий ланцюги, які містять СОВА ділянки. В додаткових варіантах реалізації використовують один або більше СОН5, які є об'єктами винаходу, спільно з іншими СОНЕ5, каркасними областями, . та О ділянками, константними областями та так далі, що отримані з інших людських антитіл. Наприклад, СОН», які є об'єктами винаходу, можна заміщувати СОН» будь-якою кількістю людських антитіл, зокрема антитіл, що мають комерційну цінність.

Одноланцюгові антитіла можуть утворюватись за з'єднання фрагментів варіабельного домену (Гм ділянка) важкого та легкого ланцюга за допомогою амінокислотного містка (короткого пептидного лінкеру), що призводить до утворення одиничного поліпептидного ланцюга. Такі одноланцюгові Ем5 (5сЕм5) отримували за допомогою внесення ДНК, яка кодує пептидний лінкер, між ДНК, які кодують два поліпептиди варіабельного домену (Мі та Мн). Отримані в результаті поліпептиди можуть кон'югувати самі з собою, утворюючі антигензв'язувальні мономери, або вони можуть утворювати мультимери (наприклад, димери, тримери або тетрамери) залежно від довжини гнучкого лінкеру між двома варіабельними доменами (Котпі вї а!., 1997, Ргої. Епд. 10:423; Коні евї аї.,

2001, Віотої. Епа. 18:95-108). Комбінуючи різні поліпептиди, що містять Мі та Мн, можна отримувати мультимерні 5сЕмв5, які зв'язуються з різними епітопами (К/апоКит еї а!., 2001, Віотої!. Епо. 18:31- 40). Методи, розроблені для отримання одноланцюгових антитіл, включають ті, що описані в патенте США Мо 4,946,778; Віга, 1988, бсієпсе 242:423; Низіюоп вї а!., 1988, Ргос. Маї). Асад. осі. ОБА 85:5879; Мага еї аї!., 1989, Маїште 334544, де Стааї еї аї!., 2002, Меїнодз Мої! Віої. 178:379-87. В цей винахід включені одноланцюгові антитіла, отримані із запропонованих в цьому описі антитіл (включаючи, але не обмежуючись 5сЕм5, що містять такі комбінації варіабельніх доменів: Арі

І См/АрІТ НСм (5ЕО ІС МО:95/5ЕО 10 МО:29), Ар2 І См/Ар2 Ном (5ЕО І МО:96/56О І МО:30), АБЗ

Ї См/АрЗ НСм (5ЕО І МО:97/5Б6О ІЮО МО:З31), АБА І См/Ар4 Ном (5ЕО ІЮ МО:98/5ЄО І МО:32), Ар

Ї См/Ар5 Нсм (5ЕО ІЮ МО:99/5560О ІО МО:33), АЬб І См/АБб НеСм (5ЕО ІЮ МО:100/5ЕО ІЮ МО:34), АБ7

І См/Аб7 НСм (5ЕО 10 МО:101/5ЄО 10 МО:35), АБВ8 І См/АЬ8 НСм (5ЕО 10 МО:102/5Е6О ІЮ МО:36),

АрО І См/АрУ НСм (5ЕО 10 МО:103/5ЄО ІЮ МО:37), АБ10 І См/АВБ10 НСм (5ЕО ІФ МО:104/5Б60О 10

МО:38), ії АБІ1 І См/АБ11 НОСм (5ЕО 10 МО: 105/5ЄО 10 МО:39), АБ3ЗО І См/АЬЗО НСм (5ЕО І

МО:163/5ЕО ІО МО:145), АЬЗ2 І См/АЬзЗа2 НСм (5ЕО 10 МО:164/5Б6О 10 МО:146), АЬЗЗ І См/АЬЗ3 НСм (ЗЕО ІЮ МО:165/5ЕО І МО 147)), та їх комбінації.

В одному варіанті реалізації 5 Г2-антигензв'язувальний білок являє собою злитий білок антитіла (який іноді називають в цьому описі "кон'югатом антитіла"). Другий учасник кон'югації може мати білкову або небілкову природу; в загальному випадку останній отримують, використовуючи функціональні групи на антигензв'язувальному білку та на другому учасникові кон'югації. В окремих варіантах реалізації антитіло кон'югують з хімічною (лікарською) речовиною небілкової природи для отримання кон'югату з антитіла та лікарської речовини.

В одному варіанті реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок являє собою аналог антитіла, який іноді називають "синтетичним антитілом"'. Наприклад, в багатьох роботах використовують як альтернативні білкові каркаси, так і штучні каркаси з прищепленими СОНВ5. Такі каркаси включають, але не обмежуються цим, мутації, введені для стабілізації тримірної структури зв'язувального білка, а також повністю синтетичні каркаси, які складаються, наприклад, з біосумісних полімерів.

Дивіться, наприклад, Когпаопег єї аї!., 2003, Ргоївіпв: Зіписішиге, Еипсійоп, апа Віоіптогтаїйсв5, Моїнте 53, І5це 1:121-129. Нодиє єї аї.,, 2004, ВіоїесппоЇ. Ргод. 20:639-654. До того ж, можна використовувати пептидні міметики антитіл ("РАМ5"), а також роботу на основі міметиків антитіл, в якій компоненти фібронектину використовуються в якості каркасів.

Під час вживання в цьому описі під "білююом" мається на увазі щонайменше дві ковалентно зв'язаних амінокислоти, а сам термін включає в себе білки, поліпептиди, олігопептиди та пептиди.

В деяких варіантах реалізації дві або більше ковалентно зв'язані амінокислоти з'єднані за допомогою пептидного зв'язку. Білок може складатися з амінокислот природного походження та пептидних зв'язків, наприклад, у випадку, коли білок отриманий рекомбінантним методом з використанням експресійних систем та клітин-хазяїнів, як описано нижче. В іншому варіанті реалізації білок може містить синтетичні амінокислоти (наприклад, гомофенілаланін, цитрулін, орнітин та норлейцин) або пептидоміметичні структури, тобто, "пептидні або білкові аналоги", такі як пептоїди (дивіться 5ітоп еї аї., 1992, Ргос. Май). Асад. бсі. 0.5.А. 89:9367, яка включена в цей опис як посилання), які можуть бути стійкими до протеазів або в інших фізіологічних умовах та/або в умовах зберігання. Такі синтетичні амінокислоти можна вносити, зокрема, коли антигензв'язувальний білок синтезують іп міо за допомогою стандартних методів, добре відомих в цій галузі техніки. До того ж, можна використовувати будь-яку комбінацію з пептидоміметика та синтетичних і природних залишків/структур. Термін "амінокислота" також включає амінокислотні залишки, такі як пролін та гідроксипролін. "В-група" або "бічний ланцюг" амінокислоти може мати як ()-, так і (5)-конфігурацію. В конкретному варіанті реалізації амінокислоті знаходяться в (І)- або (5)-конфігурації.

В окремих аспектах реалиїіації винаходу запропоновані рекомбінантні антигензв'язувальні білки, які зв'язують 512 та, в деяких варіантах реалиіації, рекомбінантний 512 людини або його частину.

В цьому контексті "рекомбінантним білком' називається білок, який отримують за допомогою рекомбінантних технологій з використанням будь-яких відомих в цій галузі техніки способів та методів, тобто, за допомогою експресії рекомбінантної нуклеїнової кислоти, як описано в цьому описі. Способи та методи отримання рекомбінантних білків добре відомі в цій галузі техніки.

Варіанти реалізації винаходу включають рекомбінантні антигензв'язувальні білки, які зв'язують 512 дикого типу та його варіанти. "Який складається перважно з" означає, що амінокислотна послідовність може змінюватись в межах близько 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 або 1595 відносно перерахованих як ЕС ІЮ

МО: послідовностей та при цьому зберігає біологічну активність, як описано в цьому описі.

В деяких варіантах реалізації антигензв'язувальні білки, які є об'єктами винаходу, є виділеними білками або в значній мірі очищеними білками. "Виділений білок не містить щонайменше деякі речовини, з якими він зазвичай пов'язаний в своєму природному стані, наприклад, в заданому зразку він становить щонайменше 595 або щонайменше 5095 за масою від загального білка.

Зрозуміло, що виділений білок може становити від 5 до 99,995 за масою від загального вмісту білка залежно від обставин. Наприклад, білок може бути отриманий за значно вищої концентрації шляхом використання індуцибельного промотору або промотору високого рівня експресії, при цьому отримують підвищений рівень концентрації білка. Це визначення включає в себе вироблення антигензв'язувального білка у великій кількості організмів та/або клітин-хазяїнів, які відомі в цій галузі техніки.

У випадку амінокислотних послідовностей ідентичність та/або подібність послідовностей визначають, використовуючи стандартні відомі в цій галузі методи, включаючи, але не обмежуючись цим, алгоритм локальної ідентичності послідовностей Сміта та Ватермана, 1981,

Аду. Аррі. Маїй. 2:482, алгоритм вирівнювання послідовностей Нідлмана та Вунша, 1970, У. Мої.

Віо!. 48:443, метод пошуку подібності Пірсона та Ліпмана, 1988, Ргос. Маї. Асад. 5сі. 0О.5.А. 85:2444, комп'ютеризовані реалізації цих алгоритмів (АР, ВЕЗТРІТ, БЕА5ТА та ТЕА5ТА, які входять до

Муівсопвіп Сепеїйс5 5оймаге РасКаде, Сепеїйсв Сотршег Стоир, 575 Зсієпсе Огіме, Мадізоп, МУів.), програму для вирівнювання послідовностей Веві Рії, яка описана Оемегеєих еї аї!., 1984, Мисі. Асіа

Вез. 12:387-395, переважно викристовуючи налаштування за замовчуванням або за допомогою підбору. Перважно відсоток ідентичності розраховується за допомогою азіОВ на підставі наступних параметрів: штраф за порушення комплементарності - 1; штраф за наявність гепу - 1; штраф за розмір гепу - 0,33; та штраф за з'єднання - 30, "Сштепі Меїнодз іп ЗХедоепсе Сотрагізоп апа Апаїувів," Масготоїесціє зедиепсіпд апа Зупіпевів, ЗеІесієд Меїнодз апа Арріїсайопв, рр 127- 149 (1988), Аїап В. І 55, Іпс.

Прикладом алгоритму, що підходить, є РІГЕОР. РІГЕОР дозволяє проводити численне вирівнювання послідовностей з групи споріднених послідовностей, використовуючи прогресивне попарне вирівнювання. Також в ньому є функція побудови дерева, яке показує кластерні взаємозв'язки, які використовуються для створення вирівнювання. У РІГЕЄОР використовується спрощений метод прогресивного вирівнювання Фенга та Дулітла, 1987, У. Мої. Емої. 35:351-360; цей метод схожий з тим, який був описаний Хігінсом та Шарпом, 1989, САВІО5 5:151-153. Параметри

РІГЕОР, що підходять, включають вагу гепу за замовчуванням 3,00, вагу довжини гепу за замовчуванням 0,10 та зважені кінцеві гепи.

Іншим прикладом алгоритму, що підходить, є алгоритм ВІ А5Т, який описаний у: АЇїбспи! еї аї., 1990, 9. Мої. Віої. 215:403-410; АйбспиЇї єї а!., 1997, Мисівїс Асід5 Вевз. 25:3389-3402; та Каїіп еї аї., 1993, Ргос. МаїЇ. Асад. Осі. Ш0.5.А. 90:5873-5787. Програмою ВІ А5Т, яка особливо підходить, є програма М/О-ВІ А5Т-2, яка була створена за Айвсниї єї а!., 1996, Меїйоав5 іп ЕплутоЇоду 266:460- 480. МО-ВІАБТ-2 використовує декілька пошукових параметрів, значення більшості з яких встановлені за замовчуванням. Для підгінних параметрів встановлюють наступні значення: інтервал перекриття-1, частка перекриттів-0,125, граничні розміри ділянки (Т)-ІІ. Параметри НОР

З та НОР 52 є динамічними величинами та встановлюються програмою залежно від змісту конкретної послідовності та змісту конкретної бази даних, відносно яких проводиться пошук послідовності, яка цікавить; при цьому значення можуть бути підібрані так, щоб збільшити чутливість.

Додатковим алгоритмом, що підходить, є ВІ А5Т з гепами, який описаний АЇїбсНиЇ єї аї., 1993,

Мисі. Асій5 ВНевз. 25:3389-3402. ВІАБТІ з гепами використовує показники замін ВІ О5ИМ-62; пороговий параметр Т, який встановлений на 9; метод двох збігів для запуску продовжень без гепів, витрати за довжини гепу К, які складають 10-К; величину Ху, яка встановлена на 16, та величину Ху, яка встановлена на 40 на етапі пошуку по базі даних та на 67 на вихідному етапі алгоритмів. Вирівнювання з гепами запускається за показника, який відповідає приблизно 22 біт.

В загальному випадку амінокислотна гомологія, подібність або ідентичність між окремими варіантами СОВ5 та наведеними в цьому описі послідовностями становить щонайменше 809595, та, частіше, має ступінь гомології або ідентичності, яка переважно збільшується та становить щонайменше 8595, 9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 та практично 10095.

Аналогічно "відсоток (95) ідентичності нуклеотидних послідовностей" відносно визначених в цьому описі нуклеотидних послідовностей визначається як відсотковий вміст нуклеотидних залишків в кандидатній послідовності, які є ідентичними нуклеотидним залишкам послідовності антигензв'язувального білка, яка кодує. В конкретному методі використовується ВІ АБТМ модуль

МО-ВІАБТ-2 зі встановленими за замовчуванням параметрами з інтервалом перекриття та часткою перекриття, які становлять відповідно 1 та 0,125.

В загальному випадку гомологія, подібність або ідентичність між нуклеотидними послідовностями, що кодують індивідуальні варіантні СОН», та наведеними в цьому описі нуклеотидними послідовностями становить щонайменше 8095, та, частіше, має ступінь гомології або ідентичності, яка переважно збільшується та становить щонайменше 8095, 8195, 8290, 8390, 8496, 8595, 869о, 8795, 88905, 8990, 9095, 9195, 92905, 9395, 9495, 9595, 96905, 9790, 9895, 9990 та практично 10095.

Таким чином, "варіантним СОН" є ділянка, яка має визначену гомологію, подібність або ідентичність батьківському СОВ, який є об'єктом винаходу, та характеризується біологічною дією, яка складає, без обмежень щонайменше 8095, 8195, 8295, 83905, 8490, 85905, 8695, 8795, 8895, 8995,

9095, 9195, 9295, 9395, 9495, 9595, 9695, 9795, 9895 або 9995 від специфічності та/або активності батьківського СОВ.

У випадку, якщо ділянка або область впровадження варіації амінокислотної послідовності є обумовленою, немає необхідності в обумовленні самої мутації. Наприклад, з метою оптимізації введення мутації на заданій ділянці можна провести випадковий мутагенез в цільовому кодоні або области та провести скринінг експресуючих варіантів СОВ антигензв'язувальних білків, щоб обрати оптимальну комбінацію необхідої активності. Методи введення мутації заміщення в обумовлені ділянки ДНК з відомою послідовністю добре відомі, наприклад, це мутагенез з використанням праймерів М1З3 та мутагенез з використанням ПЛР. Скринінг мутантів проводять за допомогою аналізу антигензв'язувальної активності білка, наприклад, зв'язування 512.

Амінокислотні заміни зазвичай складаються з одиничних залишків; інсерції зазвичай складають від близько одного (1) до близько двадцяти (20) амінокислотних залишків, хоча припустимі й значно більші за розміром інсерції. Діапазон делецій становить від близько одного (1) до близько двадцяти (20) амінокислотних залишків, хоча в деяких випадках делеції можуть бути й більшими.

Заміни, делеції, інсерції або будь-які їх комбнації можна використовувати для отримання кінцевої похідної або варіанта. В загальному випадку такі зміни проводять для декількох амінокислот, щоб мінімізувати зміни молекули, зокрема, імуногенність та специфічність антигензв'язувальнго білка. Проте за певних обставин припустимі й більш значні зміни.

Консервативні заміни проводять в загальному випадку згідно з наступною схемою, наведеною у вигляді Таблиці 3.

Таблиця З

Аа зег

Аг9 Гуз

Авп сій, Ні

Азр Сім

Сувз зег

Сип Авп

Сп Ар спіу Ро

Ніб Азп, Сп

Пе І еи, Ма!

Ї еи Пе, Маї

Гуз Аг9, Сп, Спи

Меї Ї еи, Пе

Рпе Меї, ГГ еи, Туг зег Тиг

ТА зег

Тр Туг

Ту Тер, Рпе

Ма! Пе, Гей

Значні зміни функціональності або імунологічної ідентичності здійснюють, вибираючи заміни, менш консервативні, ніж заміни, наведені в Таблиці 3. Наприклад, можна проводити заміни, які помітно впливають на: структуру поліпептидного скелету в області зміни, наприклад, структуру альфа-спіралі або бета-складчастого шару; заряд або гідрофобність молекули на ділянці-мішені; або на розмір бічного ланцюга. Замінами, для яких в загальному випадку передбачається, що вони призводять до найбільших змін у властивостях поліпептидів, є такі заміни, в яких: (а) гідрофільний залишок, наприклад, серил або треоніл, замінений на гідрофобний залишок, наприклад, лейцил, ізолейцил, фенілаланіл, валіл або аланіл; (р) цистеїн або пролін замінений на будь-який інший залишок; (с) залишок, що містить електропозитивний бічний ланцюг, наприклад, лізил, аргиніл або гістидил, замінений на електронегативний залишок, наприклад, глутаміл або аспартил; або (а) залишок, що містить об'ємний бічний ланцюг, наприклад, фенілаланін, замінений на залишок, який не має бічного ланцюга, наприклад, гліцин.

Зазвичай варіанти проявляють таку ж якісну біологічну активність та викликають таку ж імунну відповідь, як аналог природного походження, хоча за необхідності вибирають також варіант для того, щоб модифікувати характеристики антигензв'язувальних білків. Або ж, варіант можна сконструювати таким чином, щоб змінити біологічну активність антигензв'язувального білка.

Наприклад, можна змінити або видалити сайт глікозилювання, як обговорюється в цьому описі.

Інші похідні антитіл до 512, які входять в об'єм цього винаходу, включають ковалентні або агрегаційні кон'югати антитіл до 512 або їх фрагментів з іншими білками або поліпептидами,

отримані, наприклад, за експресії рекомбінантних злитих білків, що містять гетерологічні поліпептиди, зшиті з М-кінцем або С-кінцем поліпептиду антитіла до 512. Наприклад, кон'югований пептид може бути гетерологічним сигнальним (або лідерним) поліпептидом, наприклад, альфа- фактором лідером дріжджів, або пептидом, таким як епітопна мітка. Злиті білки, що містять антитіло до 512, можуть містить пептиди, які додані для того, щоб сприяти очищенню або ідентифікації антитіла до 512 (наприклад, полі-Ніє). Поліпептид антитіла до 512 також може битбутиь з'єднаний з пептидом РІ АС, як описано у Норр есеї аї!., Віо/ТесппоЇоду 6:1204, 1988, та в патенте США 5,011,912. Пептид РІГ АС є високоантигенним та забезпечує наявність епітопу, обортно зв'язаного специфічним моноклональним антитілом (тАБ), створюючи можливість швидкого аналізу та легкого очищення рекомбінантного білка, що експресується. Реагенти, які підходять для виготовлення злитих білків, в яких пептид РІ АСі зшитий із заданим поліпептидом, є комерційно доступними (5ідта, Сент-Луїс, Міссурі).

В одному варіанті реалізації отримують олігомер, використовуючи поліпептид, виділений з імуноглобулінів. Отримання злитих білків, що містять визначені гетерологічні поліпептиди, зшиті з різними фрагментами поліпептидів, виділених з антитіл, (включаючи Ес-домен), було описано, наприклад, АвПКепаі єї аіІ., 1991, РМАБ ОБА 88:10535; Вугп єї аїЇ., 1990, Маште 344:677; та

НоїІєпрацой еї аї., 1992 "Сопвігисіоп ої Іттиподіориїйп Ривіоп Ргоївїпв", в Ситепі Ргоїосоїв5 іп

Іттипоіоду, Зиррі. 4, сторінки 10.19.1 - 10.19.11.

Один варіант реалізації цього винаходу стосується димерів, що містять злиті білки, отриманні шляхом злиття 5Т2-зв'язувального фрагмента антитіла до 512 з Ес-областю антитіла. Димер можна отримати, наприкад, шляхом вставки гібридного гену, який кодує злитий білок, в вектор експресії, що підходить, експресії гібридного гену в клітинах-хазяїнах, трансформованих за допомогою рекомбінантного вектору експресії, та забезпечуючи можливості збирання злитого білка, що експресується, на зразок молекул антитіл, внаслідок чого між Ес-елементами утворюються міжланцюгові дисульфидні зв'язки, що призводить до утворювання димеру.

Термін "Рс-поліпептид", що вживається в цьому описі, включає нативні та мутеїнові форми поліпептидів, які виділені з Ес-області антитіла. Також включені процесовані форми таких поліпептидів, що містять шарнірну ділянку, яка стимулює димеризацію. Злиті білки, що містять Ес- елементи (та утворені ними олігомери) мають перевагу, яка складає легкість очищення за допомогою афінної хроматографії на колонках з протеїном А або протеїном 0.

Одним з Ес-поліпептидів, що підходить, описаний в заявці відповідно до РСТ МО 93/10151 (яка включена в цей опис як посилання), є одноланцюговий поліпептид, що розташовується від М- кінцевої шарнірної ділянки до нативного С-кінця ЕРс-області людського антитіла ІДС. Іншим Ес- поліпептидом, що підходить, є Ес-мутеїн, описаний в патенті США 5,457,035 та у Вайт еї аї., 1994,

ЕМВО 3. 13:3992-4001. Амінокислотна послідовність цього мутеїну є ідентичною нативній послідовності Ес, наведеної в МО 93/10151, за винятком того, що проведена заміна амінокислоти 19 з Гей на Аа, амінокислоти 20 з Їей на Сі та амінокислоти 22 з Спіу на Аа. Цей мутеїн демонструє знижену афінність до рецепторів Ес.

В інших варіантах реалізації варіабельний фрагмент важкого та/або легкого ланцюга антитіла до 512 можна замінити варіабельним фрагментом важкого та/або легкого ланцюга іншого антитіла.

Інший спосіб отримання олігомерних похідних антитіла до 512 включає використання лейцинової блискавки. Домени лейциново блискавки являють собою пептиди, які стимулюють олігомеризацію білків, в яких вони знаходяться. Спочатку лейцинові блискавки були виявлені в декільках ДНК-зв'язувальних білках (І апазсниї єї а!., 1988, Зсієпсе 240:1759) та з того часу були знайдені у великій кількості різних білків. Сеед відомих лейцинових блискавок присутні пептиди природного походження та їх похідні, які димеризуються або тримеризуються. Приклади доменів лейцинових блискавок, які підходять для отримання розчинних олігомерних білків, описані в заявці відповідно до РСТ М/О 94/10308, а лейцинова блискавка, виділена з поверхнево-активного протеїну

О (5Р0) легенів, описана у Норре 6вї аї!., 1994, РГЕВ5 І енег5 344:191, обидві роботи включені в цей опис як посилання. Застосування модифікованої лейцинової блискавки, яка забезпечує стабільну тримеризацію зшитого з нею гетерологічного білка, описано у ЕРапзіому єї аї!., 1994, бетіп. Іттипої. 6:267-78. В одному з підходів рекомбінантні злиті білки, що містять фрагмент або похідну антитіла до 512, зшиті з пептидом лейцинової блискавки, експресуються в клітинах-хазяїнах, що підходять, а розчинні олігомерні фрагменти або похідні антитіла до 512, які утворюються, виділяють із супернатанту літинної культури.

Ковалентні модифікації антигензв'язувальних білків також включені в об'єм цього винаходу, та, зазвичай, але не завжди, здійснюються посттрансляційно. Наприклад, деякі види ковалентних модифікацій антигензв'язувального білка вносять в молекулу шляхом проведення реакції між певними амінокислотними залишками антигензв'язувального білка та органічною дериватизуючою речовиною, яка здатна реагувати з вибраними бічними ланцюгами або М- або С-кінцевими залишками.

Найчастіше проводять реакцію між залишками цистенілу та с-галоацетатами (та відповідними амінами), такими як хлороцтова кислота або хлорацетамід, для отримання похідних карбоксиметилу або карбоксиамідометилу. Також залишки цистенілу дериватизують за допомогою проведення реакції з бромтрифторацетоном, са-бром-В-(5-імідозоїлупропіоновою кислотою, хлорацетилфосфатом, М-алкілмалеїімідами, З-нітро-2-піридилдисульфідом, метил-2- пірідилдисульфідом, п-хлормеркурбензоатом, 2-хлормеркур-4-нітрофенолом або хлор-7- нітробензо-2-окса-1,3-діазолом.

Залишки гістидилу дериватизують за допомогою реакції з діетилпірокарбонатом за рН 5,5-7,0, оскільки цей агент є відносно специфічним до бічного ланцюга гістидилу. Також застосовують пара- бромфенацилбромід; реакцію проводять переважно у 0,1 М какодилаті натрію за рН 6,0.

Для залишків лізинілу та амінокінцевих залишків проводять реакцію з ангідридами бурштинової або іншої карбонової кислоти. Дериватизація ціма речовинами призводит до зміни полярності лізинових залишків. Інші реагенти, що підходять для дериватизації альфа-аміновмісних залишків, включають імідоефіри, такі як метилпіколінімідат; піридоксальфосфат; піридоксаль; хлорборгідрид; тринітробензенсульфонову кислоту; О-метилізосечовину; 2,4-пентандіон; та реакцію з гліоксилатом, яка каталізується трансаміназою.

Залишки аргінілу модифікують за допомогою реакції з одним або декількома загальприйнятними реагентами, серед яких фенілгліоксаль, 2,3-бутандіон, 1,2-циклогександіон та нінгідрин. Дериватизація залишків аргініну потребує, щоб реакція проводилась в лужних умовах внаслідок високого значення рКа функціональної групи гуанідину. Крім того, ці реагенти можуть вступати в реакцію з групами лізину, а також з іпсилон-аміногрупою аргініну.

Можна проводити певні модифікації залишків тирозилу з акцентом на внесення спектральних міток до залишків тирозилу за допомогою проведення реакції з ароматичними сполуками діазонію або тетранітрометану. Найчастіше для утворення молекул О-ацетилтирозилу та З-нітропохідних використовують, відповідно, М-ацетилімідизол та тетранітрометан. Залишки тирозилу йодують за допомогою 725| або "| для приготування мічених білків для вживання в радіоімунологічному аналізі, при чому підходить вищеописаний спосіб з використанням хлораміну Т.

Карбоксильні бічні групи (аспартил або глутаміл) вибірково модифікують за допомогою реакції з карбодиїмідами (Б--М-С-М--8, де В та В" опційно є різними алкільними групами, такими як 1- циклогексил-3-(2-морфолініл-4-етил) карбодиіїмід або /1-етил-3-(4-азоніа-4,4-диметилпентил) карбодиїмід. Крім того, залишки аспартилу та глутамілу перетворюють на залишки аспарагінілу та глутамінілу за допомогою реакції з іонами амонію.

Дериватизація з біфункціональними речовинами підходить для перехресного зшивання антигензв'язувальних білків з водонерозчинною матрицею підкладки або поверхнею для застосування в різних методах. Зазвичай вживані речовини, які перехресно зшиваються, включають, наприклад, 1,1-біс(діазоацетил)-2-фенілетан, глутаральдегід, М- гідроксисукцинімідефіри, наприклад, ефіри з 4-азидосаліциловою кислотою, гомобіфункціональні імідоефіри, включаючи дісукцинімідилефіри, такі як 3,3'-дитіобіс(сукцинімідилпропіонат), та біфункціональні малеїіміди, такі як біс-М-малеїімідо-1,8-октан. Дериватизуючі речовини, такі як метил-3-Кп-азидофеніл)дитіо|пропіоїмідат, дозволяють отримати проміжні продукти, що фотоактивуються, які здатні утворювати перехресні зв'язки під дією світла. У іншому варіанті для іммобілізації білка використовують реактивні водонерозчинні матриці, такі як вуглеводи, що ціаноген-бромід-активуються, та реакційноздатні підкладки, які описані в патентах США Мо 3,969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247 642; 4,229,537; та 4,330,440.

Залишки глутамінілу та аспарагінілу часто дезамідують для отримання, відповідно, залишків глутамілу та аспартилу. У іншому варіанті ці залишки дезамідують в м'яких кислих умовах. Всі форми цих залишків входять в об'єм цього винаходу.

Інші модифікації включають гідроксилювання проліну та лізину, фосфорилювання гідроксильних груп залишків серилу або треонілу, метилювання са-аміногруп лізину, аргініну та бічних ланцюгів гістидину (Т. Е. Стєеідйіоп, Ргоївіпе: ЗштисіШте ап Моїіесшіаг Ргорепіє5, МУ. Н.

Егеетап 8 Со., Зап Егапсізсо, 1983, рр. 79-86), адетилювання М-кінцевого аміну амідування будь- яких С- кінцевих карбоксильних груп.

Інший вигляд ковалентної модифікації антигензв'язувального білка, що входить в об'єм цього винаходу, включає зміну профілю глікозилювання білка. Як відомо в цій галузі техніки, профілі глікозилювання можуть залежати як від білкової послідовності (наприклад, наявності або відсутності певних амінокислотних залишків глікозилювання, що обговорюється нижче), так і від клітини- або організму-хазяїна, в якому виробляється білок. Конкретні експресійні системи обговорюються нижче.

Глікозилювання поліпептидів зазвичай є М-зв'язаним або О-зв'язаним. М-зв'язане глікозилювання означає приєднання вуглеводної сполуки до бічного ланцюга залишку аспарагіну.

Трипептідні послідовності аспарагін-Х-серин та аспарагін-Х-треонін, де ХХ є будь-якою амінокислотою за винятком проліну, являють собою послідовності впізнання для ферментативного приєднання вуглеводної сполуки з бічного ланцюга аспарагіну. Таким чином, наявність в поліпептиді будь-якої з цих трипептидних послідовностей створює потенційну ділянку глікозилювання. О-зв'язане глікозилювання означає приєднання одного з цукрів /М-

ацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до гідроксиамінокислоти, як правило, серину або треоніну, хоча також можна застосовувати 5-гідроксипролін або 5-гідроксилізин.

Додавання ділянок глікозилювання в антигензв'язувальний білок зручно проводити шляхом зміни амінокислотної послідовності так, щоб вона містила одну або більше з вищеописаних трипептидних послідовностей (для М-зв'язаних ділянок глікозилювання). Також зміну можна здійснити шляхом додавання або заміщення одного або більше залишків серину або треоніну у вихідній послідовності (для О-зв'язаних ділянок глікозилювання). Для зручності амінокислотну послідовність антигензв'язувального білка переважно перетворюють шляхом внесення змін на рівні

ДНК, зокрема, за допомогою введення в ДНК, що кодує цільовий поліпептид, мутацій в заздалегідь вибраних основах, так, щоб отримати кодони, які транслюватимуться в необхідні амінокислоти.

Інші способи збільшення кількості вуглеводних сполук в антигензв'язувальному білкі полягають в хімічному або ферментативному сполученні глікозидів з білюом. Перевагою подібних способів є те, що вони не вимагають вироблення білка в клітині-хазяїни, для якої можливе М- або О- глікозилювання. Залежно від способу, який використовується, сполучення цукру(ів) можна приєднати до (а) аргініну тагістидину, (Б) вільних карбоксильних груп, (с) вільних сульфгідрильних груп, таких як групи цистеїну, (4) вільних гідроксильних груп, таких як групи серину, треоніну або гідроксипроліну, (є) ароматичних залишків, таких як залишки фенілаланіну, тирозину або триптофану, або (7) амідної групи глутаміну. Ці способи описані у УУО 87/05330, яка опублікована 11 вересня 1987 р., та у Аріїп апа МУгівіоп, 1981, САС сії. Веу. Віоспет., рр. 259-306.

Видалення вуглеводних сполук, присутніх у вихідному антигензв'язувальному білку, можна здійснити хімічно або ферментативно. Хімічне деглікозилювання вимагає обробки білка сполукою трифторметансульфонової кислоти або аналогічниною сполукою. Ця обробка призводить до відщеплення більшості або всіх цукрів за винятком зв'язувального цукру (М-ацетилглюкозаміну або

М-ацетилгалактозаміну), при чому поліпептид залишається неушкодженим. Хімічне деглікозилювання описане НаКітиааїп еї аї., 1987, Атгсп. Віоспет. Віорпу5. 259:52 та Едде еї аї., 1981, Апаї. Віоспет. 118:131. Ферментативне відщеплення вуглеводних сполук від поліпептиду можна здійснити за допомогою великої кількості ендо- та екзоглікозидаз, як описано в ТпоїаКига єї аІ., 1987, Меїйп. Епгутої. 138:350. Глікозилюванню в потенційних ділянках глікозилювання можна запобігти, використовуючи сполуку тунікаміцину, як описано в РизкКіп еї аї!., 1982, 9. ВіоІ. Снет. 257:3105. Тунікаміцин блокує утворення зв'язків білок-М-глікозид.

Інший вигляд ковалентної модифікації антигензв'язувального білка включає з'єднання антигензв'язувального білка з різними небілковими полімерами, включаючи, але не обмежуючись цим, різні поліоли, такі як поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь або поліоксіалкілени, способами, описаними в патентах США Мо 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 або 4,179,337.

До того ж, як відомо в цій галузі техніки, амінокислотні заміни можна проводити в різних позиціях в межах антигензв'язувального білка для полегшення додавання полімерів, таких як ПЕГ.

У деяких варіантах реалізації ковалентна модифікація антигензв'язувальних білків, які є об'єктами винаходу, включає додавання однієї або більше міток.

Термін "група, що мітить", позначає будь-яку мітку, яка детектується. Приклади відповідних груп, що мітять, включають, але не обмежуються цим, наступні елементи: радіоїзотопи або радіонукліди (наприклад, ЗН, 770, М, 355, 0, 99Тсо, 111, 125І, 1911), флуоресцентні групи (наприклад,

ФІТЦ, родамін, люмінофори на основі комплексів лантанидів), ферментативні групи (наприклад, пероксидаза хріну, рД-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза), хемолюмінісцентні групи, біотинільні групи, зумовлені поліпептидні епітопи, які розпізнаються вторинним репортером (наприклад, парні послідовності лейцинової блискавки, сайти зв'язування для вторинних антитіл, металозв'язувальні домени, епітопні мітки). У деяких варіантах реалізації група, що мітить, є сполученою з антигензв'язувальним білюом за допомогою спейсерних "ніжок" різної довжини для зниження потенційної стеричної невідповідності. В цій галузі техніки відома велика кількість способів для мічення білків, які можна застосовувати в реалізації цього винаходу.

У загальному випадку мітки діляться на множину класів залежно від способу їх детекції: а) ізотопні мітки, які можуть бути радіоактивними або важкими ізотопами; б) магнітні мітки (наприклад, магнітні частки); с) редокс-активні речовини; 4) речовини барвники; ферментативні групи (наприклад, пероксидаза хріна, В-галактозидаза, люцифераза, лужна фосфатаза); є) біотинільні групи; та ї) зумовлені поліпептидні епітопи, розпізнавані вторинним репортером (наприклад, парні послідовності лейцинової блискавки, сайти зв'язування для вторинних антитіл, металозв'язувальні домени, епітопні мітки і так далі). У деяких варіантах реалізації група, що мітить, сполучена з антигензв'язувальним білком за допомогою спейсерних "ніжок' різної довжини для зниження потенційної стеричної невідповідності. В цій галузі техніки відома велика кількість способів для мічення білків, які можна застосовувати в реалізації цього винаходу.

Специфічні мітки включають оптичні барвники, включаючи, але не обмежуючись цим, хромофори, люмінофори та флуорофори, при чому останні є специфічними у багатьох випадках.

Флуорофори можуть бути як низькомолекулярними флуорофорами, так і белковоподібними флуорофорами.

Під "флуоресцентною міткою" мається на увазі будь-яка молекула, яку можна детектувати за її характерними флуоресцентними властивостями. Відповідні флуоресцентні мітки включають, але не обмежуються цим, флуоресцеїн, родамін, тетраметилродамін, еозин, еритрозин, кумарин, метил-кумарини, пірен, малахітовий зелений, стильбен, люциферовий жовтий, каскад синій, техаський червоний, ІАЕСАМО, ЕОАМ5, ВОПІРМУ РІ, І С Вей 640, Су 5, Су 5.5, І С Вей 705, зелений

Орегон, барвники Аїеха-Рішог (Аіеха Ріног 350, АІеха Рійог 430, АІеха Рішог 488, АІеха Ріног 546,

АІеха Рісог 568, АІеха Рісог 594, АіІеха Рійог 633, АІеха Рійог 660, АІеха Рійог 680), каскад синій, каскад жовтий та Н-фікоеритрин (РЕ) (МоІесшаг Ргобе5, Юджин, Орегон), ФІТЦ, родамін та техаський червоний (Рієгсе, Рокфорд, Іллинойс), Суб, Суб.5, Су7 (АтегзНнат І Те бЗсієпсе, Піттобург,

Пенсильванія). Оптичні барвники, які підходять, включаючи флуорофори, описані в Моіесшаг

Ргорез Напароок авторства Віспага Р. Нацйдіапао, яка окремо включена в цей документ як посилання.

Білковоподібні флуоресцентні мітки, які підходять, також включають, але не обмежуються цим, зелений флуоресцентний білок, включаючи види ЗФБ РепіПа, Рійозагси5 або Аєдиогєа (СНайіе єї аім, 1994, Зсієпсе 263:802-805), УЗФБ (Сіопівеснй Іарогаюгтев, Іпс., Номер доступу в Сепрапк

И55762), блакитний флуоресцентний білок (БФБ, Опцапішт Віоїєснпоіодієз, пс. 1801 ае

Маїізоппейме Віма. УУеві, Вій Ріоог, Мопітєаї, Оцебес, Сапада НЗН 129; єгайбетг, 1998, Віотесппіднев 24:462-471; Неїт еї аї., 1996, Ст. ВіоІ. 6:178-182), посилений жовтий флуоресцентний білок (ПЖФБ, Сіопіесі І абогаютієв, Іпс.), люциферазу (ІспікКі еї аї!., 1993, 9. Іттипої. 150:5408-5417), р- галактозидазу (Моїап еї а!., 1988, Ргос. Маї)!. Асад. 5сі. 0.5.А. 85:2603-2607) та Вепійа (М092/15673,

МО95/07463, МУ098/14605, М/О98/26277, М099/49019, патенти США Мо 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558). Всі вищеперелічені посилання включені в цей опис як посилання.

Наведені як приклади антигензв'язувальні білки, які описані в цьому описі, мають властивості, обумовлені унікальним епітопом на 5172, що зв'язується антигензв'язувальним білком. Термін "епітоп" позначає амінокислоти молекули-мішені, з якими контактує антигензв'язувальний білок, наприклад, антитіло, коли антигензв'язувальний білок зв'язується з молекулою-мішенню. Епітоп може бути таким, що замінюється або не замінюється (наприклад, (|) в одноланцюговому поліпептиді це амінокислотні залишки, які не є такими, що замінюються по відношенню один до одного в поліпептидній послідовності, але в контексті молекули-мішені вони зв'язуються антигензв'язувальним білком, або (ії) в мультимерному рецепторі, що містить два або більше індивідуальних компонентів, наприклад, 512 та АсР, це амінокислотні залишки, присутні в одному або більше з індивідуальних компонентів, але які зв'язуються при цьому антигензв'язувальним білком). Епітопні детермінанти можуть включати хімічно активні поверхневі групи молекул, такі як амінокислоти, бічні ланцюги цукрів, фосфорильні або сульфонільні групи, та можуть мати специфічні тривимірні структурні характеристики та/або специфічні зарядові характеристики. У загальному випадку антигензв'язувальні білки, специфічні відносно конкретної молекули-мішені, розпізнають переважно епітоп на молекулі-мішені в комплексній суміші з білків та/або макромолекул.

Методи характеристики зв'язування епітопу антигензв'язувальним білком добре відомі в цій галузі техніки, включаючи, але не обмежуючись цим, сортування (перехресне конкурування) (МіПег еї а! "Ерйоре бБіппіпд ої тигіпе топосіопа! апіродіеє ру а тийіріехей раїгіпд аззау" у) Іттипої

Меїпоадвз (2011) 365, 118-25), пептидне картирування (наприклад, РЕРОРОТ""М) (АїбБегі еї а! "Тве В- сей Еріюре ої Ше Мопосіопа! Апі-Басют МШ Апібоду ЕН СпВагастегілейд Бу Рерііде Аїтау Апаїувзіє" 2008

Тптотр Наєтозі 99, 634-7), методи мутагенезу, такі як отримання химер (5опд еї а! "Ерйоре

Марріпа ої Іраїїгитаб, а Нитапігед Апіі-С04 Мопосіопа! Апіїроду м/йй Апіі-НІМ-1 Асіїмйу іп Іп'єсієйд

Райцепів" у. Міг. (2010) 84, 6935-6942), аланінове сканування (Сиппіпдпат апа Умеїї5 "Нідн- гевоЇшіоп ерйоре тарріпд ої НанН-гесеріог іпіегасіоп5 ру аїапіпе-зсаппіпд тшиїадепевів" Зсієпсе (1989) 244, 1081- 1085), аргінінове сканування (І іт еї а! "А дімегейу ої апібоду ерйорез сап іпдисе зідпаїпу «Фгоцди (Ше егуїпгороїіеїйіп гесеріог" Віоспетівігу (2010) 49, 3797-3804), метод НО-обміну (Соагез еї а! "Ерйоре тарріпд Бу атіде пуагодеп/дешегічшт ехспапде соцМирієй м/п ітторбіїї:ацоп ої апіїроду, оп-їїпе ргоїеоїувіб5, Ідцій спготайдгарпу апа тавз5 5ресіготеїйу Варій Соттип. Мав55

Зресігот. (2009) 23 639- 647), ЯМР-метод з перехресним насиченням (Могадап еї а! "Ргесізе ерйоре тарріпа ої таїагтіа рагазіїе іппірйогу апіїбодіеєз Бу ТВО5У ММЕ сгоз5-зайшгайоп" Віоспетівігу (2005) 44, 518-23) та кристалографію (Сетагаї еї а! "Зігисіиге ої 1--17А іп сотріех мїй а роїепі, шу питап пецїгаїїгіпд апіроду" у. Мої. Віо! (2009) 394, 905-21). Ці методи розрізняються за рівнем деталізації, який вони забезпечують, відносно амінокислот, які складають епітоп.

Антигензв'язувальні білки, що є об'єктами цього винаходу, включають ті, що містять епітопи, які перекриваються з описаними в даному описі зразковими антигензв'язувальними білками, наприклад, АБІ, АБ2, АБЗ, АБ4, Ар5, АБб, АБ7, АЬ8, АБО, АБ10, АБІ1, АЬЗО, АЬЗ2 або АрЗ3. В окремих варіантах реалізації антигензв'язувальний білок містить епітопи, аналогічні епітопам зразкових антигензв'язувальних білків. В інших варіантах реалізації антигензв'язувальний білок зв'язує только підгрупу з амінокислот, аналогічних амінокислотам зразкових антигензв'язувальних білків.

В окремих варіантах реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок містить епітоп, який є ідентичним або перекривається з АБІ, Ар2, АБЗ, АБ4, АБ5, АБб, АБ, АЬ8, АБО, АВТО, АБІ1, АБЗО,

АрЗ2 або АБЗ3З, та містить а) варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній у 5ЕО ІЮ МО:95,

ЗЕО ІЮ МО:96, 5ЕО ІЮ МО:97, 5ЕО ІЮ МО:98, 5ЕО ІЮ МО:99, 5ЕО І МО:100, 5ЕО 10 МО 101, 5ЕО

ІО МО:102, 5ЕО ІЮ МО:103, 5ЕО ІЮ МО:104, БО 10 МО:105, БО 10 МО:163, 5ЕО ІЮ МО:164 або

ЗЕБЕО 10 МО:165; БЮ) варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній у 5ЕО ІЮ МО:29,

ЗЕО ІЮ МО:30, 5ЕО І МО:З31, 5ЕО ІЮ МО:32, 5ЕО ІЮ МО:33, 5ЕО ІЮ МО:34, 5ЕО 10 МО:35, 5ЕО ІЮ

МО:36, 5ЕО 10 МО:37, 5ЕО ІЮ МО:38, 5ЕО І МО:39, БО 10 МО:145, 5ЕО ІЮ МО:146 або 5ЕО ІЮ

АрЗ2 або АБЗ3, та містить варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 90595, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в БЕО ІЮ МО:95, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:29; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІО МО:96, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5БЕО ІО МО:З30; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:97, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 90595, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО 31; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:98, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведенійв 5ЕО ІЮ МО:32; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІО МО:99, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО І МО:33; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в БЕО 10 МО:100, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 90595, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО 34; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:101, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:З35; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:102, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:З6; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в БЕО 10 МО:103, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 90595, щонайменше на 95595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО 37; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:104, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:З38; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:105, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:39; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в БЕО 10 МО:163, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 90595, щонайменше на 9555», або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ХЕО 10 МО:145; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:164, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:146; та ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ЕО ІЮ МО:165, та варіабельний домен важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095, щонайменше на 9595, або є ідентичним амінокислотній послідовності, наведеній в 5ХЕО ІО МО:147.

В окремих варіантах реалізації і 5Т2-антигензв'язувальний білок містить епітоп, який є ідентичним або перекривається з АБІ, Ар2, АБЗ, АБ4, АБ5, АБб, АБ, АЬ8, АБО, АВТО, АБІ1, АБЗО,

АрЗ2 або АБЗЗ, та містить а) варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:95, 5ЕО ІЮО МО:96, 5ЕО 10 МО:97, 5ЕО 10 МО:С:98, 5ЕО І

МО:99, 5ЕО ІЮ МО:100, 5ЕО І МО:101, 5ЕО ІЮ МО:102, 5ЕО ІЮ МОС103, 5ЕО ІЮ МО:104, 5ЕО І

МО:105, 5ЕО І МО1163, 5ЕО ІЮ МО:164 або 5ЕО ІЮ МО:165; 5) варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:29, 5ЕО ІЮО МО:30, 5ЕО І

МО:31, 5ЕО ІЮ МО:32, 5ЕО І МО:33, 5ЕО ІЮ МО:34, 5ЕО ІЮ МО:З35, 5ЕО ІЮ МО:36, 5ЕО ІЮ МО:37,

ЗЕО І МО:38, 5ЕО ІЮ МО:39, 5ЕО ІЮ МО 145, 5БО І МО 146 або 5ЕО ІЮО МО 147; або с) варіабельний домен легкого ланцюга згідно з а) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з

Б).

АрЗ2 або АБЗЗ, та містить варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:95, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в БЕО ІЮ МО:29; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в БЕО 10 МО:96, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:З30; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5БЕО ІО МО:97, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІЮ МО:З1; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:98, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:32; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:99, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІО МО:33; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО 10 МО:100, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:34; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:101, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІО МО:35; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО 10 МО:102, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:36; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:103, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІО МО:37; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО 10 МО:104, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності,

наведеної в 5ЕО ІЮ МО:38; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:105, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІО МО:39; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО 10 МО:163, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:145; ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:164, та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ЕО І МО:146; та ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в

ЗЕО ІЮ МО:165 та варіабельний домен важкого ланцюга, що містить не більше десяти або не більше п'яти амінокислотних вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності, наведеної в 5ХЕО І МО:147.

В окремих варіантах реалізації і 5Т2-антигензв'язувальний білок містить епітоп, який є ідентичним або перекривається з АБІ, Ар2, АБЗ, АБ4, Ар5, АБб, АБУ, АЬ8, АБО, АВТО, АБІ11, АрЗО,

Арза2 або АБрЗЗ, та містить а) І СОНВІ1, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ, наведеної в 5ЕО 10 МО:106;

І СОН2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:117; та І СОВАЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності

ЇСОВЗ, наведеної в 5ЕО 10 МОМл28; Б) СОВА, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВІ1, наведеної в

ЗЕО І МО:107; І СОН, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:118; та І СОВЗ3, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВЗ3, наведеної в БЕО ІЮ МО:129; с) І СОВІ1, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності

І СОН, наведеної в 5ЕО І МО:108; І СОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності Ї/СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:119; та І СОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВЗ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:130; а) І СОН, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності СОН, наведеної в 5ЕО І0 МО: 109; 1ІСО082, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОН, наведеної в 5ЕО І МО:120; та І! СОВАЗ3, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:131; є) І СОН, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності Ї СОВ1, наведеної в БЕО ІЮ МО:110; І СОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:121; та /СОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності Ї СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:132; У І СОВ1, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності Ї/СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:111; І СОВ82, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:122; та І СОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:133; 9) ЇСОВ1, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності Ї СОВІ1, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:112; І СОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОН2, наведеної в 5БЕО ІЮО МО:123; та

І СОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:134; пт) І СОВІ1, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності

І СОН, наведеної в 5ЕО І МО:113; І СОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:124; та І СОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВ3, наведеної в БЕО ІЮ МО:135; ї) І СОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності СОН, наведеної в 5ЕО І МО: 114; ІСОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОН, наведеної в 5ЕО І МО:125; та І! СОВЗ3, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:136; |) І СОН, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності і І СОВА, наведеної в БЕО 10 МО:115; І СОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:126; та /СОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності Ї СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:137; К) 1СОВ1, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВ1, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:116; І СОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:127; та І СОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності ЇСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:138; І) І СОВ1, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності Ї СОВІ1, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:166; І СОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОН2, наведеної в БЕО ІЮО МО:169; та

І СОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВЗ, наведеної в БЕО ІЮ МО:172; т) І СОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності

І СОН, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:167; І СОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:170; та І СОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності Ї/СОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮО МО:173; або п) /СОВ1, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності І СОВ1, наведеної в 5ХЕО ІЮ МО:168; І СОН2, с що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності

ЇСОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:171; та ІСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності | СОВЗ, наведеної в

ЗЕО ІЮ МО:174; та варіабельний домен важкого ланцюга, який містить о) НСОНВІ1, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕСО ІЮ МО:40; НОСОВ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:51; та НСОНВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:62; р) НСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНІ, наведеної в 5ЕО 10 МО:41; НСОН2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНВ2, наведеної в 5БО І МО:52; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в ЗЕО ІЮ МО:63; а) НСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕО І МО:42;

НООН2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:53; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності

НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:64; ту) НСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ1, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:43; НСОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:54; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:65; 5) НОСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВ'І, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:44; НСОН2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:55; та

НОСОВУ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО 10 МО:66; НСОНВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності

НООНІ, наведеної в 5ЕО 10 МО:45; НСОНг, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:56; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:67; и) НСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:46; НСОНВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНВ2, наведеної в 5ЕО 0 МО:57; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:68; м) НОСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:47; НСОНг, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5БЕО ІЮ МО:58; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО 10 МО: 69; м) НОСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:48; НСОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВ2, наведеної в ЕС ІЮ МО:59; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:70; х) НСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВ'І, наведеної в 5ЕО 10 МО:49; НСОН2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:60; та

НОСОВУ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО/71; у) НСОНВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності

НООНТ, наведеної в 5ЕО 10 МО:50; НСОНг, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:61; та НСОРВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:72; 7) НСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:148; НСОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНВ2, наведеної в 5ЕО ІЮ МО:151; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ЕО ІЮ

МО:154; аа) НСОНВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НОСОВІ, наведеної в 5ЕО І МО:149; НСОВ2, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО 10 МО:152; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності

НСОВЗ, наведеної в ЗЕО ІО МО:155; або рЬ) НОСОВІ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОНІ, наведеної в

ЗЕО ІЮ МО:150; НОСОВ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОН2, наведеної в 5ЕО І МО:153; та НСОВЗ, що містить не більше трьох аминокіслотних вставок, вставок, делецій або замін відносно амінокислотної послідовності НСОВЗ, наведеної в 5ХЕО ІЮ МО:156.

Переважні 5Т2-антигензв'язувальні білки, які безпосередньо описані вище в описі, включають ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з а) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з о); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з р) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з р); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з с) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з д); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з 4) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з г); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з є) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з 5); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з Її) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з ї); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з 9) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з и); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з НМ) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з у); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з ї) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з м/); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з |) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з х); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з К) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з у); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з І) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з 7); ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з т) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з аа); та ті, що містять варіабельний домен легкого ланцюга згідно з п) та варіабельний домен важкого ланцюга згідно з рб).

Антигензв'язувальні білки, що містять ідентичний епітоп або такий, що перекривається, часто перехресно конкурують за зв'язування антигену. Таким чином, в окремих варіантах реалізації антигензв'язувальний білок, який є об'єктом винаходу, перехресно конкурує з АБІ, Ар2, АБЗ, АБА4,

Арб5, АБб, АБ7, АЬ8, АБО, АБ10, АБІ11, АБЗО, АВБ32 вбо АБЗ33. Вираз "перехресно конкурувати " або "перехресна конкуренція " позначають, що антигензв'язувальні білки конкурують за один й той самий епітоп або ділянку зв'язування на мішені. Таку конкуренцію можна виявити за допомогою методу, в якому контрольний антигензв'язувальний білок (наприклад, антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент) запобігає або пригнічує специфічне зв'язування антигензв'язувального білка, який досліджується, і навпаки. Для того, щоб визначити, чи конкурує молекула, яка досліджується, з контрольною молекулою за зв'язування, можна використовувати численні види аналізу конкурентного зв'язування. Приклади аналитічних методів, які застосовують, включають твердофазний прямий та непрямий радіоімунологічний аналіз (РІА), твердофазний прямий та непрямий імуноферментний аналіз (ІФА), конкурентний "сендвіч-метод' (дивіться, наприклад, 5іапйії еї аі. (1983) Меїйоав іп Епгутоіоду 9:242-253), твердофазний прямий біотин- авідиновий ІФА (дивіться, наприклад, КікІапа еї аїЇ., (1986) 9. Іттипої. 137:3614-3619), твердофазний прямий аналіз з використанням міток, твердофазний прямий "сендвіч-аналіз' з використанням міток, І итіпех (Ла еї а! "А поме! теїной ої Мийіріеєхей Сотреїйме Апіїроаду Віппіпд ог Ше сПагасієггайоп ої топосіопа! апіроадієв" У. Іттипоїіодіса! Мештоав5 (2004) 288, 91-98) та поверхневий плазмонний резонанс (50п9 єї а! "Еріоре Марріпо ої Ібаїї2гитаб, а Нитапігей Апіі-С04

Мопосіопа! Апіїбоду м/п Апіі-НІМ-1 Асіїмйу іп ІпТєсієд Райепіє" У. Мігої. (2010) 84, 6935-6942).

Приклад методу для визначення перехресної конкуренції описаний в Прикладі 5. Зазвичай, якщо конкуруючий антигензв'язувальний білок є присутнім у надлишковій кількості, він пригнічує зв'язування контрольного антигензв'язувального білка із загальним антигеном щонайменше на 5095, 5595, 6095, 6590, 7095 або 7595. В деяких випадках зв'язування пригнічується щонайменше на 8095, 8595, 9095, 9595, 9695, 9795, 9895, 9995 або більше.

Ара2 зв'язує 512 людини та яванської макаки з високою афінністю та блокує зв'язування І! -33 з 512, таким чином, блокуючи ІІ -33-опосередковану передачу сигналу 512. Антитела, що містять ідентичні, подібні або такі, що перекриваються з АБ2, епітопи, також можуть мати ці характерні особливості. В переважних варінтах реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок перехресно конкурує з Ар2 за зв'язування з 512. Приклади 5Т2-антигензв'язувальних білків, які перехресно конкурують з Ар2, включають АБІ, АБЗ, АБ5, АБ7, Ар8 та АрЗО (дивіться Приклад 5). Щоб знайти антитіла, які зв'язують такий, що перекривається, подібний або ідентичний епітоп, що й АБ2, можна дослідити одне або більше антитіл на предмет перехресного конкурування з Ар2. Більше того, отримуючи варіанти антитіла, яке перехресно реагує з Ар2, можна дослідити такі антитіла, щоб визначити, чи зберігається перехресна конкуренція після варіації передбачаючи, що епітоп варіанта несуттєво змінився порівняно з батьківською молекулою. Таким чином, в окремих варіантах реалізації винаходу запропоновані варіанти антитіла, які перехресно конкурують з АбБа2 за зв'язування з 512.

Окрім перехресного конкурування один з одним на антитіла з такими, що перекриваються, подібними або ідентичними епітопами може аналогічно впливати мутагенез 512. Певні мутації можуть пригнічувати зв'язування антитіла; інші можуть посилювати або активувати зв'язування. У

Прикладі 11 проводили аргінін/аланін скануючий мутагенез фрагмента позаклітинного домену 572 та визначали його вплив на наведені як приклади антитіла. В об'єм цього винаходу включені 5Т2- зв'язувальні білки, які характеризуються аналогичним впливом на них мутагенезу, що й наведені як приклади антитіла.

В окремих варіантах реалізації зв'язування 5Т2-антигензв'язувального білка пригнічується введенням одиничної мутації у 512, при чому одинична мутація вибрана з групи, яка складається з 148, І158, 5338, Е4ЗВ, М47В, Аб2В, сб65В, 798, 0928, 0978, М1048, С1388, М152В та М1768. В переважних варіантах реалізації будь-які дві або більше, три або більше, чотири або більше, п'ять або більше, шість або більше, сім або більше, вісім або більше, дев'ять або більше, десять або більше або всі одиничні мутації з вищенаведеної групи незалежно пригнічують зв'язування 512- зв'язувального білка. В інших варіантах реалізації зв'язування 5Т2-антигензв'язувального білка активується введенням одиничной мутації у 512, при чому одиничнаа мутація вибрана з групи, яка складається з Ї!53В8, В72А та 5738. В переважних варіантах реалізації всі одиничні мутації з вищенаведеної групи незалежно активують зв'язування 5Т2-зв'язувального білка. В переважних варіантах реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок має характерні властивості АБ2, які пригнічуються будь-якою з І 148, 1158, 5З3З3А, Е4ЗА, М47В, Аб2А, а65В8, Т798, 0928, 0978, М1048,

Сс1388, М1528 та М176В та активуються будь-якою з І 538, В72А, 573.

Іншим методом аналізу антитіла на основі його епітопу є амідний воднево-дейтерієвий обмін (НОХ). НОХ широко застосовувався у вивченні білкової конформації та динаміки, взаємодій білок- ліганд та білок-білюових взаємодій (7Вапе апа 5ті 1993, Епреп апа тій 2001). Мас-спектрометричні вимірювання забезпечують ефективний інструмент для визначення ступіню обміну, оскільки заміщення одного водню дейтерієм призводить до збільшення маси на 1 Да під час кожного обміну.

Ступінь НОХ легко можна визначити на рівні пептиду, аналізуючи протеолітичне розщеплення білка за допомогою рідинної хроматографії спільно з тандемною мас-спектрометрією в умовах, які регулюються (Епреп апа 5тій 2001, Ваегеа-Огн7, Нирез еї а. 2002, Содгеапи, І адпег еї аІ. 2002, Натитго,

Соаї!їез ет аІ. 2006, Соаїев, ТивКе еї а. 2009, 7Вапе, 7 Бапе ет а. 2012).

Шляхом порівняння НОХ-профілів антигену для протеолітичного розщеплення 512 у відсутності або у присутності антитіла (у вільному та зв'язаному стані) можна виявити ділянки взаємодії.

Зокрема, коли антитіло зв'язується з 512, доступні для розчинника водні аміду вільного 5Т2 можуть виявитися захищеними, в результате чого спостерігається більш низька швидкість обміну. Отже, ті ділянки, які у присутності антитіла отримують менше дейтерію ніж у його відсутності, потенційно є зв'язувальними епітопами. Інші фактори, які включають швидкість обміну у вільному стані, знання білкової структури антигену, а також результат інших методів картирування епітопів, враховуються за визначення епітопів.

Зв'язування АБ2 з 512 аналізували за допомогою НОХ, як описано у Прикладі 12. Аналіз показує, що АБр2 зв'язується з/змінює швидкість обміну фрагмента структури 512, що містить амінокислоти 33-44 та 88-94 з амінокислот 19-322 з 5ЕО ІЮ МО:1 (амінокислоти 15-26 та 70-76 зрілого 512, відповідно). Антитіла з епітопами, що перекриваються, подібними або ідентичними епітопами з АБ2 також будуть зв'язуватись з/змінювати швидкість обміну амінокислот в межах 33- 44 та 88-94 з 5ЕО ІЮ МО:1. В окремих варіантах реалізації 5Т2-зв'язувальний білок, наприклад, антитіло, захищає будь-яку з амінокислот 33-44 з БЕО ІЮ МО'1 за зв'язування з 512 та аналізу за допомогою НОХ. В інших варіантах реалізації захищені будь-які з амінокислот 88-94. Обидва варіанти вказують на часткове перекривання зв'язувальних епітопів з АБ2. В переважних варіантах реалізації захищені будь-які амінокислоти з 33-44 та будь-які з 88-94. В окремих варіантах реалізації 5Т2-зв'язувальний білок, наприклад, антитіло, захищає всі амінокислоти 33-44 з БЕО ІЮ

МО-1 за зв'язування з 512 та аналізу за допомогою НОХ. В інших варіантах реалізації захищені всі амінокислоти з 88-94. Обидва варіанти вказують на наявність подібного зв'язувального епітопу з

Арг2. В переважних варіантах реалізації зв'язувальних 33-44 та всі з 88-94, що вказує на наявність ідентичного або практично ідентичного епітопу з Аг.

Зв'язування АБ2 з 512 додатково аналізували за допомогою рентгенівської кристалографії. Дані рентгенівської кристалографії узгоджувалися з даними НОХ-аналізу. Область контакту між АБ та антигеном можна визначити/виявити більшою кількістю способів. В Прикладі 13 область контакту визначали за різницею у площі поверхні, яка є доступною для розчинника, та за відстанню.

Залишками 5172, які знаходяться в межах області контакту з Ар2, визначеними за різницею у площі поверхні, яка є доступною для розчинника, та за відстанню менше БА, є (згідно з позиціями у зрілому 512 (з відсутньою лідерною послідовністю)) КІ, Е2, Р19, В20, 021, 222, К23, М26, 170, М71,

В72, 573, Р74, 175, Е76, М77, 878, 179 та У81. В окремих варіантах реалізації 5Т2-зв'язувальний білок утворює область контакту з 512, яка перекривається з такою ж у Ар2, включаючи ті варіанти, в яких будь-які з КІ, Е2, Р19, 820, 021, 22, К23, М26, 170, М71, 872, 573, Р74, 175, Е76, М77, 878, 779 або МУ81 знаходяться в межах області контакту. В деяких варіантах реалізації 5т2- зв'язувальний білок утворює область контакту з 512, при цьому Р19, 820, 021, с22, К2З та/або 26 знаходяться в межах області контакту. В інших варіантах реалізації 170, М71, 872, 573, Р74, 175,

Е76, М77, 878, 179 та/або У81 знаходяться в межах області контакту. В переважних варіантах реалізації КТ, Е2, РІ1Т9, 20, 021, 22, К23, М26, 170, М71, 872, 573, Р74, 175, Е76, М77, В78, 179 та

У81 знаходяться межах області контакту.

Кристалічна структура вказує на те, що визначені амінокислотні залишки утворюють водневі зв'язки або сольові містки з амінокислотами АБ2. Такі залишки включають КІ, 20, К23, М26, 175,

М77, В78 та 179. В окремих варіантах реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок утворює водневі зв'язки або сольові містки з одним або більше з КІ, 820, К23, 26, 175, М77, В78 та 179.

Кристалічна структура додатково дає інформацію відносно того, які залишки Ар2 утворюють область контакту з 512. На ФІГ. 10 показані залишки у варіабельній ділянці легкого ланцюга та у варіабельній ділянці важкого ланцюга, які утворюють область контакту з 512. Також показані залишки, які утворюють водневі зв'язки або сольові містки з амінокислотами в 512. Цю інформацію можна використовувати для конструювання варіантів Ар2, включаючи ті, що містять варіабельні домени, які є на 9095 ідентичними, на 9595 ідентичними, та 10 або менше інсерцій, делецій та/або замін в межах варіабельного домену легкого ланцюга або важкого ланцюга Ар2. Може виникнути необхідність зберігання амінокислот в межах області контакту, та при цьому зміни залишків, які не входять в цю область. Таким чином можна сконструювати та отримати варіанти АБр2, що містять одну або більше амінокислотних вставок, замін та/або делецій в межах одного або більше СОН5, що належать до АБ, які підтримують зв'язування з 512.

В деяких варіантах реалізації 5Т2-зв'язувальний білок містить варіант варіабельної ділянки легкого ланцюга АБ2 (ЗЕО ІЮ МО:96), в якій 028, І29, 530, М31, 32, 49, 050, М53, Е55, Т56, 091, рог, М93, Г94 та/або 96 залишаються незмінними або містять консервативні заміни, та/або варіант варіабельної ділянки важкого ланцюга Ар2 (ЗЕО ІЮ МО:30), в якому МУЗ33, І5О, 057, 859,

НОЗ, 100, Т101, 5102, 5103, 0104, М105 та/"або уУ106 залишаються незмінними або містять консервативні мутації. В переважних варіантах реалізації 028, М31, 050, М5З3, Е55, 091 та 092 варіабельної ділянки легкого ланцюга залишаються незмінними та 5102, 5103, 0104 та У105 важкого ланцюга залишаються незмінними.

Полінуклеотиди, які кодують 5Т2-антигензв'язувальні білки

У цей винахід включені нуклеїнові кислоти, які кодують 5Т2-антигензв'язувальні білки, включаючи антитіла, визначені відповідно до цього опису. Переважні нуклеїнові кислоти, включаючи ті, що кодують, наведені як приклади та описані в цьому описі легкі та важкі ланцюги.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБі ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:73.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує Ар2 ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:74.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБЗ ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:75.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБ4 ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:76.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБ5 ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:77.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБб 1С, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:78.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБ7 1С, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:79.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБ8 ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:80.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБО ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:81.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБІ0 ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:82.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБІ1 ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:83.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує й АБЗО ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:157.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБЗ2 ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО І МО:158.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБЗЗ3З ІС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО І МО:159.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБі НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в ЕС ІЮ МО:7.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБр2 НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:8.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБЗ НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в ЕС ІЮ МО:9.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБ4 НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:10.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБО НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО 1О МО:11.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБб НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:12.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБбБ7 НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:13.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБ8 НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО 14.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБО НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:15.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБІО НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ХЕО ІО МО:16.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБІ1 НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО І1О МО:17.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБЗО НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІО МО:1 39.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБЗ2 НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО І МО:140.

Прикладом нуклеїнової кислоти, яка кодує АБЗЗ3 НС, є нуклеїнова кислота, що містить послідовність, наведену в 5ЕО ІЮ МО:141.

Аспекти реалізації цього винаходу включають полінуклеотидні варіанти (отримані, наприклад, внаслідок дегенерації), які кодують амінокислотні послідовності, які описані в цьому описі.

Аспекти реалізації цього винаходу включають множину варіантів реалізації, включаючи, але не обмежуючись цим, наступні варіанти реалізації, наведені як приклади.

Виділений полінуклеотид, при чому зазначений полінуклеотид кодує один або більше поліпептидів, що містять амінокислотну послідовність, вибрану з групи, яка складається з:

А. 1. послідовності варіабельного домену легкого ланцюга, який є щонайменше на 9095 ідентичним послідовності варіабельного домену легкого ланцюга, наведеній в 5ЕО ІЮ МОз:95-105, 163-165; 2. послідовності варіабельного домену важкого ланцюга, який є щонайменше на 9095 ідентичним послідовності варіабельного домену важкого ланцюга, наведеній в 5ЕО ІЮ МО5:29-39, 145-147; 3. варіабельного домену легкого ланцюга згідно з (1) та варіабельного домену важкого ланцюга згідно з (2); та

В. варіабельного домену легкого ланцюга, що містить СОВІ, СОН2, СОВЗ, та/або варіабельного домену важкого ланцюга, що містить СОВІ, СОН2, СОВЗ, які є однаковими або різняться не більше, ніж на три амінокислотні вставки, заміні та/або делеції в кожному СОВ з наступних послідовностей: 1. СОВІ (ЗЕО І МОс:106), СОВ2 (ЗЕО ІЮ МО:117), СОВЗ (5ЕО ІЮ МО:128) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО: 40), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:51), СОВЗ (ЗЕО ІО МО:62) важкого ланцюга, які належать до АБІ1; 2. СОВІ (ЗЕО І МО:107), СОВ2 (ЗЕО Ір МО:118), СОВЗ (5ЕО І МО:129) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО С41), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:52), СОВЗ (ЗЕО І МО:63) важкого ланцюга, які належать до Ар2; 3. СОВА (ЗЕО І МО:108), СОВ2 (ЗЕО ІЮ МО:119), СОВЗ (5ЕО ІЮ МО:130) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО 42), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:53), СОВЗ (ЗЕО ІО МО:64) важкого ланцюга, які належать до АБЗ; 4. СОВ1 (ЗЕО І МО:109), СОВ2 (5ЕО Ір МО:120), СОВЗ (5ЕО ІЮ МО:131) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО 43), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:54), СОВЗ (ЗЕО ІО МО:65) важкого ланцюга, які належать до АрА; 5. СОВА (5ЕО Ір МО:110), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:121), СОВЗ (ЗЕО І МО:132) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО 44), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:55), СОВЗ (ЗЕО ІО МО:66) важкого ланцюга, які належать до АБ5; 6. СОВА (5ЕО ІЮ МО:111), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:122), СОВЗ (ЗЕО ІО МО:133) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО 45), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:56), СОВЗ (ЗЕО І МО:67) важкого ланцюга, які належать до АБб; 7. СОВІ1 (5ЕО ІЮ МО:112), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:123), СОВЗ (ЗЕО І МО:134) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО 46), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:57), СОВЗ (ЗЕО ІО МО:68) важкого ланцюга, які належать до АБ7; 8. СОВІ (5ЕО ІЮ МО:113), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:124), СОВЗ (ЗЕО І МО:135) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО 47), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:58), СОВЗ (ЗЕО ІО МО:69) важкого ланцюга, які належать до АБВ; 9. СОВА (ЗЕО ІЮ МО: 114), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:125), СОВАЗ (5ЕО ІО МО:136) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО 48), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:59), СОВЗ (ЗЕО ІО МО:70) важкого ланцюга, які належать до АБО; 10. СОВІ (5ЕО І МО:115), СОВ2 (5ЕО І МО:126), СОВЗ (ЗЕО І МО:137) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО ІЮ МО: 49), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:60), СОВЗ (5ЕО І МО:71) важкого ланцюга, які належать до АБРІ10; 11. СОВІ (5ЕО І МО:116), СОВ2 (5ЕО І МО:127), СОВЗ (ЗЕО ІЮ МО:138) легкого ланцюга або

СОВА (ЗЕО І МОС50), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:61), СОВЗ (ЗЕО І МО:72) важкого ланцюга, які належать до АрІ11; 12. СОВІ (5ЕО І МО:166), СОВ2 (5ЕО І МО:169), СОВЗ (ЗЕО ІЮ МО:172) легкого ланцюга або

СОВА (5ЕО І МО 148), СОВ2 (5ЕО І МО 151), СОВЗ (5ЕО ІЮО МО:154) важкого ланцюга, які належать до АБЗО; 13. СОВІ (5ЕО І МО:167), СОВ2 (5ЕО І МО:170), СОВЗ (ЗЕО ІЮ МО:173) легкого ланцюга або

СОВА (5ЕО І МО 149), СОВ2 (5ЕО І МО 152), СОВЗ (5ЕО ІЮО МО:155) важкого ланцюга, які належать до АБЗ2; та 14. СОВ1 (5ЕО І МО:168), СОВ2 (5ЕО ІЮ МО:171), СОВЗ (ЗЕО І МО:174) легкого ланцюга або

СОВА (5ЕО І МОс 150), СОН2 (5ЕО І МО 153), СОВЗ (5ЕО ІЮО МО:156) важкого ланцюга, які належать до АБЗ3.

В переважних варіантах реалізації поліпептид, який кодується виділеною нуклеїновою кислотою, є компонентом антигензв'язувального білка, який зв'язує 512.

Нуклеотидні послідовності, що відповідають описаним у цьому описі амінокислотним послідовностям, призначені для того, щоб слугувати зондами або праймерами для виділення нуклеїнових кислот або пошуковими послідовностями для проведення пошуку за базами даних, можна одержати за допомогою "зворотної трансляції" амінокислотних послідовностей або за допомогою визначення ділянок амінокислотної ідентичності з поліпептидами, для яких була визначена кодуюча послідовність ДНК. Добре відому процедуру полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) можна застосовувати для виділення і ампліфікації послідовності ДНК, що кодує 51Т2- антигензв'язувальні білки або необхідну комбінацію поліпептидних фрагментів 512- антигензв'язувального білка. Олігонуклеотиди, що визначають необхідні кінці в комбінації з фрагментів ДНК, застосовують як 5' ії 3 праймери. Олігонуклеотиди можуть додатково містити ділянки пізнавання рестрикційних ендонуклеаз, щоб полегшити інсерцію ампліфікованої комбінації з фрагментів ДНК у вектор експресії. Способи ПЛР описані в заїкКі єї аі!., 5сіепсе 239487 (1988);

Весотбріпапі ОМА Меїйодоіоаду, Ми еї аї., єд5., Асадетіс Ргезв, Іпс., Зап ОРієдо (1989), рр. 189-196; та РСВ Ргоюсої!5: А Сціде ю Меїйпоавз апа Арріїсайопв, Іппіз єї. а!., ед5., Асадетіс Ргез5, Іпс. (1990).

Молекули нуклеїнових кислот, що є об'єктами за цим винаходом, містять ДНК і РНК, як в одноланцюжковій, так і в дволанцюжковій формах, а також відповідні комплементарні послідовності. ДНК містять, наприклад, кКДНК, геномну ДНК, хімічно синтезовану ДНК, ДНК, ампліфіковану за допомогою ПЛР, і їх комбінації. Молекули нуклеїнових кислот, що є об'єктами за цим винаходом, містять повнорозмірні гени або молекули кДНК, а також комбінації з їх фрагментів.

Нуклеїнові кислоти, що є об'єктами за цим винаходом, переважно одержані з джерел людського походження, але у винахід також включені нуклеїнові кислоти, одержані від інших видів. "Виділеною нуклеїновою кислотою" є нуклеїнова кислота, яка була відокремлена від суміжних генетичних послідовностей, присутніх у геномі організму, з якого була виділена нуклеїнова кислота, у випадку нуклеїнових кислот, виділених із джерел природного походження. У випадку нуклеїнових кислот, ферментативно синтезованих із матриці або синтезованих хімічно, таких як продукти ПЛР, молекули кКДНК або, наприклад, олігонуклеотиди, зрозуміло, що нуклеїнові кислоти, одержані за допомогою цих процесів, є виділеними нуклеїновими кислотами. Виділеною молекулою нуклеїнової кислоти називається молекула нуклеїнової кислоти у вигляді окремого фрагмента або у вигляді компонента крупнішої нуклеотидної конструкції В одному переважному варіанті реалізації винаходу нуклеїнові кислоти є в значній мірі чистими від домішкового ендогенного матеріалу.

Переважно молекула нуклеїнової кислоти отримана з ДНК або РНК, які щонайменше один раз були виділені практично у чистому вигляді в кількості або при концентрації, які дозволяють провести ідентифікацію, обробку і виділення компонентів їх нуклеотидних послідовностей стандартними біохімічними способами (такими, як ті, що описані в хатрогоок еї а!., МоіІєсшіаг Сіопіпд: А І абогайгу

Мапаиаї, 2па єд., Соїд Зргіпд Нагбог І арогаїогу, Соїд Зргіпуд Нагбог, ММ (1989)). Такі послідовності переважно надаються та/або конструюються у вигляді відкритої рамки зчитування, що не переривається внутрішніми нетрансльованими послідовностями або інтронами, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетрансльованої ДНК можуть бути присутніми у напрямках 5' або 3' від відкритої рамки зчитування, де вони не заважають маніпуляціям з або експресії кодуючої ділянки.

Також у цей винахід включені нуклеїнові кислоти, що гібридизуються в умовах помірної жорсткості, і, переважніше, в умовах високої жорсткості, з нуклетїновими кислотами, що кодують описані в цьому описі 5Т2-антигензв'язувальні білки. Базові параметри, що впливають на вибір умов гібридизації, і керівництво по вибору прийнятних умов наведені в ЗатюбгоокК, Егіїзсй, апа

Мапіаїіз (1989, МоїІесшаг Сіопіпа: А І арогаюгу Мапиаї!ї, Соїд 5ргіпд Нагброг І арогаїогу Ргезв, Соїай

Зргіпу Натотг, М.У., розділи 9 та 11; і Сигтепі Ргоїосої5 іп МоіІесшіаг Віоіоду, 1995, А!,зиБбеї еї а!., єдв.,

Уонп Уіїєу б 5опв, Іпс., зесіоп5 2.10 апа 6.3-6.4), і можуть бути легко визначені фахівцями у цій галузі техніки на основі, наприклад, довжини та/або складу основ ДНК. Один із способів забезпечити умови помірної жорсткості включає використання розчину для попереднього відмивання, що містить 5 х 55С, 0,595 ДСН, 1,0 мМ ЕДТК (рН 8,0), гібридизаційного буфера з близько 5095 формаміду, 6 х 55С, і температури гібридизації близько 55 градусів Цельсія (або інших схожих гібридизаційних розчинів, таких як розчин, що містить близько 5095 формаміду, з температурою гібридизації близько 42 градусів Цельсія), і умов відмивання при близько 60 градусів

Цельсія, в 0,5 х 55С, 0,195 ДСН. У загальному випадку умови високої жорсткості визначаються так само, як і наведені вище умови гібридизації, але з відмиванням при близько 68 градусах Цельсія, 0,2 х З55С, 0,195 ДСН. У гібридизаційному і відмивальному буферах 55С (1х55С є 0,15 М Масі і 15

ММ цитрату натрію) можна замінити на ЗОРЕ (1х55РЕ є 0,15 М Масі, 10 мМ МанНгРох ії 1,25 мм

ЕДТК, рН 7,4); відмивання проводять через 15 хвилин після завершення гібридизації. Потрібно розуміти, що температуру відмивання і концентрацію солі можна за необхідності доводити так, як це необхідно для досягнення бажаного ступеня жорсткості, спираючись на основні принципи, що впливають на реакції гібридизації і стабільність спіралей, як відомо фахівцям у цій галузі техніки і додатково описано нижче (див., наприклад, Затрьгоок еї аї., 1989). При гібридизації нуклеїнової кислоти з цільовою нуклеїновою кислотою з невідомої послідовності за довжину гібриду приймають довжину нуклеїнової кислоти, що гібридизується. При гібридизації нуклеїнових кислот з відомими послідовностями довжину гібриду можна визначити шляхом вирівнювання нуклеотидних послідовностей і виявлення ділянки або ділянок з оптимальною комплементарністю послідовностей. Температура гібридизації для гібридів із передбачуваною довжиною менше 50 пар основ має бути на 5-10 градусів Цельсія нижче за температуру плавлення (Тт) гібриду, при цьому

Тт визначають згідно з наступним рівнянням. Для гібридів завдовжки менше 18 пар основ: Тт (градуси Цельсія) - 2(Ж основ А - Т)- 4(2Ж4 основ ЖО ж С). Для гібридів завдовжки більше 18 пар основ: Тт (градуси Цельсія) - 81,5 ж 16,6(І0дто (Ма"1)-- 0,41(95 Сх - С) - (600/М), де М - кількість основ у гібриді, а (Ма-| - концентрація іонів натрію в гібридизаційному буфері (Ма"| для їх55С - 0,165 М).

Переважно кожна з нуклеїнових кислот, що гібридизується, має довжину, що складає щонайменше нуклеотидів (або, переважніше, щонайменше 18 нуклеотидів, або щонайменше 20 нуклеотидів, або щонайменше 25 нуклеотидів, або щонайменше 30 нуклеотидів, або щонайменше 40 нуклеотидів, або, найпереважніше, щонайменше 50 нуклеотидів) або щонайменше 2595 (переважніше, щонайменше 5095, або щонайменше 6095, або щонайменше 709595 і, найпереважніше, щонайменше 8095) від довжини нуклеїнової кислоти, що є об'єктом за цим винаходом, з якою вона гібридизується, і є щонайменше на 6095 (переважніше, щонайменше 7095, щонайменше 7595, щонайменше 8095, щонайменше 8195, щонайменше 8295, щонайменше 8395, щонайменше 84905, щонайменше 8595, щонайменше 8695, щонайменше 8795, щонайменше 8895, щонайменше 8995, щонайменше 9095, щонайменше 9195, щонайменше 9295, щонайменше 9395, щонайменше 9495, щонайменше 9595, щонайменше 9695, щонайменше 97965, щонайменше 9895 або щонайменше 9995, і, найпереважніше, щонайменше 99,595) ідентичною в послідовностях з нуклеїновою кислотою, що є об'єктом за цим винаходом, з якою вона гібридизується, причому ідентичність послідовностей визначають шляхом порівняння послідовностей нуклеїнових кислот, що гібридизуються при вирівнюванні їх таким чином, щоб максимізувати перекривання і ідентичність, при цьому мінімізуючи гепи у послідовностях, як детальніше описано вище.

Варіанти реалізації винаходу одержують за допомогою стандартного сайт- специфічного мутагенезу нуклеотидів у ДНК, що кодує антигензв'язувальний білок, використовуючи касету або

ПЛР-мутагенез або інші відомі в даній галузі техніки способи одержання ДНК, що кодує варіант, і згодом експресуючи рекомбінантну ДНК у клітинній культурі, як описується у цьому описі. При цьому фрагменти антигензв'язувального білка, що містять варіантні СОК5, що мають у своєму складі до близько 100-150 залишків, можна отримувати за допомогою іп мйго синтезу, використовуючи відомі способи. Зазвичай варіанти демонструють таку саму якісну біологічну активність, що і їх аналоги природного походження, наприклад, зв'язування з 512, хоча варіанти також можна вибирати так, щоб вони мали модифіковані характеристики, як детальніше буде описано нижче.

Для фахівця у цій галузі техніки зрозуміло, що внаслідок дегенерації генетичного коду можна одержати дуже велику кількість нуклеїнових кислот, усі з яких кодують СОКз5 (а також важкі і легкі ланцюги або інші компоненти антигензв'язувального білка), що є об'єктами за цим винаходом.

Таким чином, визначивши склад конкретної амінокислотної послідовності, фахівці у цій галузі техніки можуть одержати будь-яку кількість різних нуклеїнових кислот, просто модифікуючи послідовність одного або більше кодонів способом, який не призводить до зміни амінокислотної послідовності кодованого білка.

Також у цьому винаході запропоновані системи експресії і конструкції у вигляді плазмід, векторів експресії, транскрипцій або касет експресії, що містять щонайменше один із вищеописаних полінуклеотидів. Додатково у винаході запропоновані клітини-хазяїни, що містять такі системи експресії або конструкції.

Зазвичай вектори експресії застосовують у будь-яких клітинах-хазяїнах, які містять послідовності для підтримки плазмід і для клонування і експресії екзогенних нуклеотидних послідовностей. Такі послідовності, що у сукупності називаються "фланкуючими послідовностями", в окремих варіантах реалізації винаходу зазвичай містять одну або більше з наступних нуклеотидних послідовностей: промотор, одну або більше енхансерних послідовностей, точку початку реплікації, послідовність термінації транскрипції, повну інтронну послідовність, що містить донорний і акцепторний сайт сплайсингу, послідовність, що кодує лідерну послідовність для секреції поліпептиду, ділянку зв'язування рибосоми, послідовність поліаденілювання, полілінкерну ділянку для інсерції нуклеїнової кислоти, що кодує призначений для експресії поліпептид, і маркерний елемент, що селектується. Кожна з цих послідовностей обговорюється нижче.

У деяких випадках вектор може містити послідовність, що кодує "мітку", тобто, молекулу олігонуклеотида, розташовану в 5' або 3' кінці кодуючої послідовності 5Т12-антигензв'язувального білка; олігонуклеотидна послідовність кодує поліні (наприклад, гексанів) або будь-яку іншу "мітку", таку як ЕГАС, НА (гемаглютинін вірусу грипу) або тус, для яких існують комерційно доступні антитіла. Зазвичай така мітка зшивається з поліпептидом при експресії поліпептиду і може слугувати як засіб для афінного очищення або детектування 5Т2-антигензв'язувального білка у клітині-хазяїни. Афінне очищення можна здійснити, наприклад, за допомогою хроматографії на колонках, використовуючи як афінну матрицю антитіла до мітки. У деяких випадках мітку з очищеного 5Т2-антигензв'язувального білка можна згодом видалити різними способами, такими як застосування визначених пептидаз для розщеплювання.

Фланкуючі послідовності можуть бути гомологічними (тобто, отриманими від тих самих видів та/або штамів, що і клітина-хазяїн), гетерологічними (тобто, отриманими від видів, відмінних від виду або штаму клітини-хазяїна), гібридними (тобто, такими, що є комбінацією з фланкуючих послідовностей із понад одного джерела), синтетичними або нативними. Отже, джерелом фланкуючої послідовності може бути будь-який прокаріотичний або еукаріотичний організм, будь- який організм хребетної або безхребетної тварини або будь-яка рослина, за умови, що фланкуюча послідовність є функціональною і може бути активована механізмом клітини-хазяїна.

Фланкуючі послідовності, що застосовуються у векторах, що є об'єктами за цим винаходом, можна одержати будь-яким із декількох відомих у цій галузі техніки способів. Зазвичай фланкуючі послідовності, що застосовуються у даній роботі, є заздалегідь ідентифікованими за допомогою картування та/або розщеплювання рестрикційними ендонуклеазами, і, отже, можуть бути виділені з відповідного тканинного джерела за допомогою відповідних рестрикційних ендонуклеаз. У деяких випадках може бути відома повна нуклеотидна послідовність фланкуючої послідовності. У даному випадку фланкуючу послідовність можна синтезувати за допомогою описаних у цьому описі способів синтезу або клонування нуклеїнових кислот.

У випадку, якщо відома вся послідовність або фрагмент фланкуючої послідовності, її можна одержати, використовуючи полімеразну ланцюгову реакцію (ПЛР), та/(або за допомогою скринінгу бібліотеки генома з відповідним зондом, таким як олігонуклеотид та/або фрагмент фланкуючої послідовності того ж самого або іншого виду. У випадку, якщо фланкуюча послідовність невідома, можна виділити фрагмент ДНК, що містить фланкуючу послідовність, з крупнішої ділянки ДНК, яка може містити, наприклад, кодуючу послідовність або навіть інший ген або гени. Виділення можна здійснити за допомогою розщеплювання рестрикційними ендонуклеазами для одержання необхідного фрагмента ДНК з подальшим виділенням з використанням очищення в арагозному гелі, хроматографії на колонках Оіадеп? (Чатсворт, Каліфорнія) або інших відомих фахівцеві у цій галузі техніки способів. Вибір прийнятних ферментів для реалізації цієї мети не утруднить фахівця у цій галузі техніки.

Точкою початку реплікації зазвичай є фрагмент прокаріотичних векторів експресії, які набувають на комерційній основі, і така точка допомагає при ампліфікації вектора в клітині-хазяїни.

Якщо вибраний вектор не містить початку ділянки реплікації, його можна синтезувати хімічно на основі відомої послідовності і лігувати у вектор. Наприклад, точка початку реплікації з плазміди рвАЗ22 (Мем Епдіапа Віоіарх, Беверли, Массачусетс) є прийнятною для більшості грамнегативних бактерій, а велика кількість вірусних точок (наприклад, 5М40, поліоми, аденовіруса, вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) або папіломавірусів, таких як ВПЛ або ВПКРС) є прийнятними для клонуючих векторів у клітинах ссавців. У загальному випадку компонент точки початку реплікації не є необхідним для векторів експресії ссавців (наприклад, точку з 5М40 часто використовують лише тому, що вона також містить ранній вірусний промотор).

Послідовність термінації транскрипції зазвичай розташовується в 3' кінці кодуючої ділянки поліпептиду і слугує для термінації транскрипції. Зазвичай у прокаріотичних клітинах послідовність термінації транскрипції є багатим 5-С фрагментом, за яким йде полі-Т послідовність. Оскільки цю послідовність легко клонувати з бібліотеки або навіть придбати на комерційній основі як частину вектора, її також неважко синтезувати, використовуючи способи для нуклеотидного синтезу, такі як ті, що описані у цьому документі.

Ген маркера, що селектується, кодує білок, необхідний для виживання і росту клітини-хазяїна, вирощеної в селективному культуральному середовищі. Типові гени селективних маркерів кодують білки, які (а) додають прокаріотичним клітинам-хазяїнам стійкість до антибіотиків або інших токсинів, наприклад, ампіциліну, тетрацикліну або канаміцину; (Б) заповнюють ауксотрофні недоліки в клітинах; або (с) поставляють необхідні поживні речовини, недоступні у комплексному середовищі або середовищі з визначеним складом. Спеціальними селектованими маркерами є ген стійкості до канаміцину, ген стійкості до ампіциліну і ген стійкості до тетрацикліну. Також зручно використовувати ген стійкості до неоміцину для селекції як у прокаріотичних, так і в еукаріотичних клітинах-хазяїнах.

Інші селектовані гени можна використовувати для ампліфікації гена, призначеного для експресії. Ампліфікація є процесом, в якому гени, потрібні для вироблення білка, необхідного для росту або клітинної виживаності, багато разів повторюються один за іншим у межах хромосом послідовних генерацій рекомбінантних клітин. Приклади прийнятних для клітин ссавців селектованих маркерів охоплюють гени дегідрофолатредуктази (ДГФР) і безпромоторної тимідинкінази. Трансформанти клітин ссавців потраплють під селекційний тиск, коли лише трансформанти однозначно пристосовані до виживання завдяки присутності у векторі селектованого гена. Селекційний тиск обумовлений культивуванням трансформованих клітин в умовах, в яких концентрація селекційної речовини в середовищі значно підвищена, що призводить до ампліфікації як селектованого гена, так і ДНК, що кодує інший ген, такий як антигензв'язувальний білок антитіла, яке зв'язується з поліпептидом 512. В результаті з ампліфікованої ДНК синтезується підвищена кількість поліпептиду, такого як 512- антигензв'язувальний білок.

Ділянка зв'язування рибосоми зазвичай необхідна для ініціації трансляції мРНК і є послідовністю Шайна-Дальгарно (прокаріоти) або послідовність Козака (еукаріоти). Цей елемент зазвичай розташований у напрямку З до промотору і у напрямку 5' до кодуючої послідовності поліпептиду, що експресується. В окремих варіантах реалізації винаходу одна або більше кодуючих ділянок можуть бути функціонально пов'язаними з внутрішньою ділянкою зв'язування рибосоми (ІКЕ5), що робить можливою трансляцію двох відкритих рамок зчитування з одного РНК- транскрипту.

В деяких випадках, наприклад, якщо необхідне глікозилування в експресійній системі еукаріотичної клітини-хазяїна, можна оперувати різними пре- і пропослідовностями для того, щоб покращити глікозилування або вихід продукту. Наприклад, можна внести зміни в ділянку розщеплювання пептидазою визначеного сигнального пептиду або додати пропослідовності, які також можуть впливати на глікозилування. Кінцевий білковий продукт може містити в -1 позиції (по відношенню до першої амінокислоти зрілого білка) одну або більше додаткових амінокислот, властивих для експресії, які моглі виявитися не повністю видаленими. Наприклад, кінцевий білковий продукт може містити один або два амінокислотні залишки, що виявляються в ділянці розщеплювання пептидазою, приєднаних до амінокінця. В іншому варіанті реалізації винаходу використання деяких ділянок розщеплювання ферментами може призвести до появи злегка усіченої форми необхідного поліпептиду, у випадку, якщо фермент робить надріз у такій ділянці в межах поліпептиду.

Експресійні і клонуючі вектори, що є об'єктами за цим винаходом, зазвичай містять промотор, який розпізнається організмом-хазяїном і функціонально зв'язаний з молекулою, що кодує 5Т2- антигензв'язувальний білок. Промотори є нетрансткрибуємими послідовностями, розташованими вище (тобто, у напрямку 5") стартового кодона структурного гена (зазвичай у межах від близько 100 до 1000 п.о.), які керують транскрипцією структурного гена. Традиційно промотори об'єднують у два класи: індуцибельні промотори і конститутивні промотори. Індуцибельні промотори ініціюють підвищення рівня транскрипції з контрольованої ними ДНК у відповідь на деякі зміни умов культивування, таких як наявність або відсутність поживних речовин або зміна температури.

Конститутивні промотори, з іншого боку, постійно транскрибують ген, з яким вони функціонально зв'язані, при цьому контроль генної експресії є слабким або відсутній. Велика кількість промоторів, що впізнаються потенційними клітинами-хазяїнами, є добре відомими. Прийнятний промотор функціонально зв'язують з ДНК, що кодує важкий ланцюг або легкий ланцюг, що містить 512- антигензв'язувальний білок, що є об'єктом за цим винаходом, шляхом видалення промотору з первинної ДНК за допомогою розщеплювання рестрикційними ферментами і вставки необхідної промоторної послідовності у вектор.

У цій галузі техніки також відомі промотори, прийнятні для застосування з дріжджовими організмами-хазяїнами. Дріжджові енхансери переважно використовуються з дріжджовими промоторами. Промотори, що є прийнятними для використання у клітинах-хазяїнах ссавців, добре відомі і охоплюють, але не обмежуються цим, ті, які одержані з геномів вірусів, таких як вірус поліоми, вірус віспи курей, аденовірус (такий як аденовірус-2), вірус папіломи великої рогатої худоби, вірус саркоми птахів, цитомегаловірус, ретровіруси, вірус гепатиту В і, найпереважніше, вірус мавп 40 (5М40). Інші прийнятні для ссавців промотори охоплюють гетерологічні промотори для ссавців, наприклад, промотори теплового шоку і промотор актину.

Додаткові промотори, які можуть представляти інтерес, охоплюють, але не обмежуються цим: ранній промотор 5М40 (Вепоїбі апа Спатбоп, 1981, Майшге 290:304-310); промотор СММ (ТПогпзеп еї а!., 1984, Ргос. Маї). Асад. О.5.А. 81:659-663); промотор, що знаходиться в 3' довгому кінцевому повторі вірусу саркоми Рауса (Хататоїо еї аї., 1980, Се 22:787-797); промотор герпесної тимідинкінази (М/адпег еї аї.,, 1981, Ргос. Май. Асай. зЗсі. О.5.А. 78:1444-1445); промотор і регуляторні послідовності з гена металотіонеїну (РгіпеїТег еї аїЇ.,, 1982, Маїшге 296:39-42); і прокаріотичні промотори, такі як промотор бета-лактамази (Міа-Катагоїї еї аї., 1978, Ргос. Маї).

Асад. босі. 0О.5.А. 75:3727-3731); або їас-промотор (ОеВоег" вї а!., 1983, Ргос. Маї). Асад. 5сі. 0.5.А. 80:21-25). Також інтерес представляють наступні транскрипційні контрольні ділянки тваринного походження, які проявляють тканинну специфічність і використовувалися на трансгенних тваринах: контрольна ділянка гена еластази І, яка активна в панкреатичних ациноцитах (5міїї вї а!., 1984, СеїЇ 38:639-646; Огпії єї а!І., 1986, Соїд бргіпа Нагбог Зутр. Оцапі. Віої. 50:399-409; Масбопаїа, 1987,

Нерайюіоду 7:425-515); контрольна ділянка гена інсуліну, яка активна в панкреатичних бета-клітинах (Напанап, 1985, Маїште 315:115-122); контрольна ділянка гена імуноглобуліну, яка активна в лімфоцитах (Сто55сНейі єї аЇ., 1984, Сеї! 38:647-658; Адатев єї аїЇ., 1985, Маїште 318:533-538;

АІехапаег єї а!., 1987, Мої. СеїІ. ВіоїІ. 7:1436-1444); контрольна ділянка вірусу пухлини молочної залози мишей, яка активна в клітинах тестикул, молочної залози, лімфоцитах і тучних клітинах (І едег еї аї., 1986, Сеї! 45:485-495); контрольна ділянка гена альбуміну, яка активна у печінці (Ріпкеп єї а!., 1987, Ссепез апа Оємеї. 1 268-276); контрольна ділянка гена альфа-фетопротеїну, яка активна в печінці (Кгитіаицї еї а!., 1985, Мої. СеїІ. ВіоїЇ. 5:1639-1648; Наттег вї аї!., 1987, бсіепсе 253:53-58); контрольна ділянка гена 1-антитрипсину, яка активна у печінці (КеїЇзеу еї аї., 1987,

Сепе5 апа Оємеї. 1:161-171); контрольна ділянка гена бета-глобіну, яка активна в мієлоїдних клітинах (Модгат еї аї., 1985, Маїшге 315:338-340; Коїавз єї аї!., 1986, Сеї! 46:89-94); контрольна ділянка гена основного білка мієліну, яка активна в олігодендроцитах мозку (Кеааднеаа еї аї., 1987,

Сеї! 48:703-712); контрольна ділянка гена легкого ланцюга-2 міозину, який активний у скелетних м'язах (Запі, 1985, Майшге 314:283-286); і контрольна ділянка гена гонадотропного рилізинг-гормона, яка активна в гіпоталамусі (Мазоп еї а!., 1986, Зсієпсе 234:1372-1378).

Енхансерну послідовність можна вставити у вектор, щоб підсилити транскрипцію ДНК, що кодує легкий ланцюг або важкий ланцюг, що містить 5Т2-антигензв'язувальний білок, що є об'єктом за цим винаходом, вищими еукаріотами. Енхансери є цис-діючими елементами ДНК завдовжки, як правило, близько 100-300 п.о., які впливають на промотор таким чином, щоб підсилити транскрипцію. Енхансери відносно орієнтаційно і позиційно незалежні і виявляються як у 5", такі в

З' позиціях відносно одиниці транскрипції. Відомо декілька енхансерних послідовностей, доступних з генів тварин (наприклад, глобіну, еластази, альбуміну, альфа-фетопротеїну і інсуліну). Проте, використовуються, як правило, енхансери, одержані з вірусів. Відомі у цій галузі техніки енхансер

ЗМ40, енхансер раннього промотору цитомегаловіруса, енхансер поліоми і енхансери аденовірусів є прикладами енхансерних елементів для активації еукаріотичних промоторів. Хоча енхансер може знаходитися у векторі як у 5", так і в 3 положенні відносно кодуючої послідовності, зазвичай він розташований у позиції 5 від промотору. У вектор експресії можна включити послідовність, що кодує відповідну нативну або гетерологічну сигнальну послідовність (лідерну послідовність або сигнальний пептид) для того, щоб стимулювати позаклітинну секрецію антитіл. Вибір сигнального пептиду або лідера залежить від типу клітин-хазяїнів, в яких вироблятимуться антитіла, а гетерологічна сигнальна послідовність може замінити нативну сигнальну послідовність. Приклади функціональних у клітинах-хазяїнах сигнальних пептидів ссавців охоплюють наступні: сигнальну послідовність для інтерлейкіну-7 (І/-7), описану в патенті США Мо 4,965,195; сигнальну послідовність для рецептора інтерлейкіну-2, описану в Со5зтап еї аї.,1984, Маїшге 312:768; сигнальний пептид рецептора інтерлейкіну-4, описаний в Європейському патенті Мо 0367 566; сигнальний пептид рецептора інтерлейкіну-і типу І. описаний у патенті США Мо 4,968,607; сигнальний пептид рецептора інтерлейкіну-17 типу ІІ, описаний у Європейському патенті Мо 0 460 846.

Вектор може містити один або більше елементів, які сприяють експресії у випадку, коли вектор інтегрований у геном клітини-хазяїна. Приклади охоплюють елемент ЕАБЕ (Аїйгісп еї аїЇ. 2003

Віотесппо! Ргод. 19:1433-38) і ділянку прикріплення до ядерного матриксу (МАК). МАКз5 опосередковують структурне впорядкування хроматину і можуть захистити інтегрований вектор від ефекту "положення". Таким чином, МАК5 виключно корисні у випадку використання векторів для одержання стабільних трансфектантів. У цій галузі техніки відома множина природних і синтетичних нуклеїнових кислот, що містять МАК, описаних, наприклад, у патентах США Мо б,239,328; 7,326,567; 6,177,612; 6,388,066; 6,245,974; 7,259,010; 6,037,525; 7,422,874; 7,129,062.

Вектори експресії, що є об'єктами за цим винаходом, можна конструювати на основі первинного вектора, такого як комерційно доступний вектор. Такі вектори можуть містити або не містити всі необхідні фланкуючі послідовності. Якщо одна або більше з описаних у цьому описі фланкуючих послідовностей не присутні у векторі спочатку, їх можна одержати окремо і лігувати у вектор.

Способи, що використовуються для одержання будь-якої з фланкуючих послідовностей добре відомі фахівцеві у цій галузі техніки.

Після того, як вектор був сконструйований, а молекула нуклеїнової кислоти, що кодує легкий ланцюг, важкий ланцюг або легкий ланцюг і важкий ланцюг, що містять 512-антигензв'язувальну послідовність, була вставлена у відповідну ділянку вектора, повноцінний вектор можна вносити до відповідної клітини-хазяїна для ампліфікації та/або експресії поліпептиду. Трансформацію вектора експресії для ЗТ2-антигензв'язувального білка у вибрану клітину-хазяїна можна здійснити за допомогою широко відомих способів, зокрема трансфекцію, інфікування, спільне осадження фосфату кальцію, електропорацію, мікроін'єкцію, ліпофекцію, ДЕАЕ-декстран опосередковану трансфекцію або інші відомі способи. Вибраний спосіб частково залежатиме від типу клітини- хазяїна, що використовується. Ці способи і інші прийнятні способи добре відомі фахівцеві у цій галузі техніки і наведені, наприклад, у Затргоок еї а!., 2001, вище.

Клітина-хазяїн при культивуванні у відповідних умовах синтезує 512-антигензв'язувальний білок, який згодом можна вилучити з культурального середовища (якщо клітина-хазяїн секретує в середовище) або прямо з тієї клітини-хазяїна, що виробляє його (якщо він не секретується). Вибір прийнятної клітини-хазяїна залежить від різних чинників, таких як необхідні рівні експресії, поліпептидні модифікації, які бажані або необхідні для активності (такий як глікозилування або фосфорилування) і легкості фолдингу в біологічно активну молекулу. Клітина-хазяїн може бути еукаріотичною або прокаріотичною.

Доступні як організми-хазяїни для експресії клітинні лінії ссавців добре відомі в цій галузі техніки і охоплюють, але не обмежуються цим, імморталізовані клітинні лінії, доступні з Американської колекції типових культур (АТСС), а будь-які клітинні лінії що використовуються у відомій у цій області експресійній системі, можна застосовувати для одержання рекомбінантних поліпептидів, що є об'єктами за цим винаходом. У загальному випадку клітини-хазяїни трансформують за допомогою рекомбінантних векторів експресії, які містять ДНК, що кодує необхідний поліпептид антитіла до 512. Серед клітин-хазяїнів, які можна застосовувати у цих цілях, знаходяться прокаріоти, дріжджові або вищі еукаріотичні клітини. Прокаріоти охоплюють грамнегативні або грампозитивні організми, наприклад, Е. соїї або бацили. Вищі еукаріотичні клітини охоплюють клітини комах і стійкі клітинні лінії, що походять від ссавців. Приклади прийнятних клітинних ліній ссавців охоплюють лінію СО5-7 клітин нирок мавп (АТСС СК 1651) (СіІи7тап еї аї., 1981, СеїЇ 23:175), І-клітини, клітини 293, клітини С127, клітини ЗТ3 (АТСС ССІ 163), клітини яєчників китайського хом'яка (СНО) або їх похідні, такі як Меддіє СНО і споріднені клітинні лінії, які зростають у безсироваткових середовищах (Кавттиз5еп еї аї., 1998, Суюіесппоіоду 28: 31), клітини Нега, клітинні лінії ВНК (АТСС СІ 10) ї клітинну лінію СМІИЕВМА, одержану з клітинної лінії нирок африканської зеленої мавпи СМІ (АТСС СС 70), як описано в МеМапйап еї аї., 1991, ЕМВО .). 10: 2821, людські ембріональні клітини нирок, такі як 293, 293 ЕВМА або М5К 293, людські епідермальні клітини А431, людські клітини СоіІо205, інші трансформовані клітинні лінії приматів, нормальні диплоїдні клітини, клітинні штами, одержані з іп міго культури первинної тканини, первинні експлантати, НІ -60, 0937, Нак або клітини Юрката. В деяких випадках клітинні лінії ссавців, такі як, наприклад, Нерс2/3В, КВ, МІН З3Т3 або 549, можна використовувати для експресії поліпептиду, коли поліпептид необхідно використовувати у різних способах сигнальної трансдукції або репортерних способах. В іншому варіанті реалізації винаходу можна здійснювати вироблення поліпептиду у нижчих еукаріотах, таких як дріжджі, або в прокаріотах, таких як бактерії. Прийнятні види дріжджів охоплюють Засспаготусе5 сегемізіає, ЗспПігозасспаготусе5 ротбре, штами

Кісумеготусе5, Сапаїйда або будь-які дріжджові штами, здатні експресувати гетерологічні поліпептиди. Прийнятні бактеріальні штами охоплюють ЕзспПегіспіа соїї, Васійив5 5и,ибіййв, ЗаіІтопеїа їурпітигішт або будь-які бактеріальні штами, здатні експресувати гетерологічні поліпептиди. Якщо поліпептид одержаний із дріжджів або бактерій, може виникнути необхідність модифікувати поліпептид, що виробляється ними, наприклад, за допомогою фосфорилування або глікозилування відповідних ділянок, з метою одержання функціонального поліпептиду. Такі ковалентні приєднання можна здійснити, використовуючи відомі хімічні або ферментативні способи. Також поліпептид можна одержати, функціонально зв'язавши виділену нуклеїнову кислоту, що є об'єктом за цим винаходом, з прийнятними контрольними послідовностями в одному або більше векторі експресії комах і використовуючи експресійну систему комах. Матеріали і способи для експресійних систем на основі клітин бакуловірусів/комах комерційно доступні у вигляді наборів, наприклад, від

Іпмйгодеп, Зап Оієдо, Саїїї., Ш0.5.А (МахВасоф Кі), а такі способи добре відомі у цій галузі техніки і описані в Зиттетгв5 апа Зтіїй, Теха5 Адгісинига! Ехрегітепі (айоп ВиПейп Мо. 1555 (1987), і ГисКом/ апа Зйиттег:5, Віо/Гесппоїоду 6:47 (1988). Також можна застосовувати безклітинні трансляційні системи для одержання поліпептидів за допомогою РНК, одержаних з розкритих у цьому описі нуклеотидних конструкцій. Прийнятні клонуючі і вектори експресії для застосування в клітинах- хазяїнах бактерій, грибів, дріжджів і ссавців описані в Роцмеї5 еї аї. (Сіопіпд Месіогв: А І арогаюгу

Мапиаї, ЕІвеміег, Мем/ МогКк, 1985). Клітина-хазяїн, яка містить виділену нуклеїнову кислоту, що є об'єктом за цим винаходом, переважно функціонально пов'язану з щонайменше однією експресійною контрольною послідовністю, називається "рекомбінантною клітиною-хазяїном".

В окремих варіантах реалізації клітинні лінії можуть бути вибрані за допомогою визначення, які клітинні лінії мають високі рівні експресії і постійно виробляють антигензв'язувальні білки з властивостями зв'язування 512. В іншому варіанті реалізації винаходу може бути вибрана клітинна лінія з лінії В-клітин, яка не виробляє власних антитіл, але має здатність виробляти і секретувати гетерологічні антитіла.

ЗТ2-антигензв'язувальні білки, що руйнують клітини

У переважних варіантах реалізації винаходу 5Т2-антигензв'язувальний білок зв'язує 512 і пригнічує зв'язування ІЇ/-33, тим самим знижуючи ІІ -33-опосередковану передачу сигналу в експресуючих 512 клітинах. При цьому в окремих варіантах реалізації винаходу 512- антигензв'язувальний білок зв'язує 512 і націлений на руйнування експресуючих 512 клітин.

Звичайно, 5Т2-антигензв'язувальний білок може пригнічувати зв'язування ІІ -33 і бути націленим на руйнування 51Т2-клітин.

ЗТ2-антигензв'язувальні білки, які руйнують клітини, виключно ефективні при лікуванні захворювань, пов'язаних з надекспресією 512, наприклад, запальних захворювань або експресуючих 512 пухлин. Способи націлювання на клітини антигензв'язувальних білків, наприклад, антитіл, добре відомі у цій галузі техніки. Приклади варіантів реалізації обговорюються нижче.

Кон'югати антитіла з лікарською речовиною

Варіанти реалізації цього винаходу охоплюють кон'югати антитіла з лікарською речовиною (АОС5). У загальному випадку АОС містить антитіло, кон'юговане до хіміотерапевтичного агента, наприклад, цитотоксичному агенту, цитостатичному агенту, токсину або радіоактивному агенту.

Для кон'югації лікарської речовини до антитіла можна використовувати лінкерну молекулу. У цій галузі техніки відома множина лінкерів і лікарських речовин, які є прийнятними для застосування в

АрС ії можуть бути використані в реалізації цього винаходу. (Див. И520090028856;

О52гО09/0274713;. 0052007/0031402; М/О2005/084390; М/О2009/099728; 55208020; 55416064; 55475092; 5585499; 6436931; 6372738; і 6340701, які всі включені у цей опис шляхом посилання).

Лінкери

В окремих варіантах реалізації АОС містить лінкер, що складається з одного або більше зв'язувальних компонентів. Приклади зв'язувальних компонентів охоплюють 6б-малеімідокапроїл, малеїімідопропаноїл, валін-цитрулін, аланін-фенілаланін, п-амінобензилоксикарбоніл і ті, які одержують унаслідок кон'югації зі зв'язувальними реагентами, зокрема, але не обмежуючись цим,

М-сукцинімідил-4-(2-піридилтіо) пентаноат СЗРР"),, М-сукцинімідил-4-(М- малеїімідометил)циклогексан-1-карбоксилат («5МОС», що також називається у цьому описі "МСС", і

М-сукцинімідил(4-йодацетил) амінобензоат (ЗІАВ".

Лінкери можуть бути лінкерами, що "віддеплюються", або лінкерами, що "не віддеплюються" (Юистгу апа Зштр, Віосопіндаїє Спет. 2010, 21, 5-13; у повному обсязі включена в цей опис шляхом посилання). Лінкери, що відщеплюються, сконструйовані таким чином, щоб вивільняти лікарську речовину при дії певних зовнішніх чинників, наприклад, при інтерналізації клітиною-мішенню.

Лінкери, що відщеплюються, охоплюють кислотолабільні лінкери, лінкери, чутливі до протеаз, фотолабільні лінкери, лінкери диметилів або лінкери, що містять дисульфід. Лінкери, що не відщеплюються, залишаються ковалентно зв'язаними зі щонайменше однією амінокислотою антитіла і лікарською речовиною при інтерналізації і деградації всередині клітини-мішені.

Прикладом лінкера, що не відщеплюється, є МСС.

Лікарські речовини

В окремих варіантах реалізації антитіло кон'юговане до хіміотерапевтичного агента. Приклади хіміотерапевтичних агентів охоплюють алкілуючі агенти, такі як тіотепа і циклофосфамід (СУТОХАМ.ТМ.); алкілсульфонати, такі як бусульфан, імпросульфан і піпосульфан; азиридини, такі як бензодопа, карбоквон, метуредопа і уредопа; етиленіміни і метиламеламіни, зокрема алтретамін, триетиленмеламін, триетиленфосфорамід, триетилентіофосфорамід і триметилолмеламін; ацетогеніни (особливо булатацин і булатацинон); камптотецин (зокрема синтетичні аналоги топотекану); бріостатин; калістатин; СС-1065 (зокрема його адозелезинові, карзелезинові і бізелезинові синтетичні аналоги); криптофіцини (особливо криптофіцин 1 і криптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (зокрема синтетичні аналоги КМУ/У-2189 і СВІ-ТМІ); елеутеробін; панкратистатин; саркодиктіїн; спонгістатин; азотисті іприти, такі як хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамід, естрамустин, іфосфамід, меклоретамін, гідрохлорид оксиду меклоретаміна, мелфалан, новембіхін, фенестерин, преднімустин, трофосфамід, урациліприт; нітросечовина, такі як кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, німустин, ранімустин; антибіотики, такі як енедіїнові антибіотики (наприклад, каліхеаміцин, особливо каліхеаміцин гамма 1 і каліхеаміцин тета І, див., наприклад, Адпем/у, Спет. Іпі!. Ед. Еподі., 33:183-186 (1994); динеміцин, зокрема динеміцин А, еспераміцин; а також неокарциностатиновий хромофор і споріднені хромопротеїненедеїнові антибіотичні хромофори), аклациномізини, актиноміцин, аутраміцин, азасерин, блеоміцини, кактиноміцин, карабіцин, карміноміцин, карцинофілін; хромоміцини, дактиноміцин, даунорубіцин, деторубіцин, б-діазо-5-оксо-І-норлейцин, доксорубіцин (зокрема морфоліно-доксорубіцин, ціаноморфоліно-доксорубіцин, 2-піроліно-доксорубіцин і дезоксидоксорубіцин), епірубіцин, езорубіцин, ідарубіцин, марцелломіцин, мітоміцини, мікофенолову кислоту, ногаламіцин, олівоміцини, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидин, убенімекс, циностатин, зорубіцин; антиметаболити, такі як метотрексат і 5-фторурацил (5-Е)); аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурину, такі як флударабін, б-меркаптопурин, тіаміприн, тіогуанін; аналоги піримідину, такі як анцитабін, азацитидин, 6- азауридин, кармофур, цитарабін, дидезоксіуридин, доксифлуридин, еноцитабін, флоксуридин, 5-

ЕШ; андрогени, такі як калустерон, дромостанолона пропіонат, епітиостанол, мепітиостан, тестолактон; анти-адренальні речовини, такі як аміноглутетимид, мітотан, трилостан; компенсатор фолієвої кислоти, такий як фролінієва кислота; ацеглатон; глікозид альдофосфаміду; амінолевулінова кислота; амсакрин; бестрабуцил; бізантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазиквон; ельфорнітин; ацетат еліптинію; епотилон; етоглюцид; нітрат галію; гідроксисечовина; лентинан; лонідамін; майтанзиноїди, такі як майтанзин і ансамітоцини; мітогуазон; мітоксантрон; мопідамол; нітракрин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; подофілінова кислота; 2-етилгідразид; прокарбазин; РБОК.АКТМ.; разоксан; ризоксин; сизофуран; спірогерманіум; тенуазонова кислота; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриетиламін; трихотецени (особливо токсин Т-2, веракурин А, роридин А і ангуїдин); уретан; віндезин; дакарбазин; маномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозин; арабінозид ("Ага-С"); циклофосфамід; тіотепа; таксоїди, наприклад, паклітаксел (ТАХОЇ .ТМ., ВгівіоІ-Муєте Запцірь Опсоіоду, Ргіпсеюп, М...) і доксетаксел (ТАХОТЕКЕ.КТМ., Кпопе-

Рошепс ВРотгег, Апіопу, Егапсє); хлорамбуцил; гемцитабін; б-тіогуанін; меркаптопурин; метотрексат;

аналоги платини, такі як цисплатин і карбоплатин; вінбластин; платина; етопозид (МР-16); іфосфамід; митоміцин С; мітоксантрон; вінкристин; вінорелбін; навелбін; новантрон; теніпозид; дауноміцин; аміноптерин; кселода; ібандронат; СРТ-11; інгібітор топоїзомерази КЕБ5 2000; дифторметилорнітин (ДФМО); ретиноєва кислота; капецитабін; і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-яких вищеперелічених сполук. Також у дане визначення включені антигормональні агенти, які регулюють або інгібують гормональну активність у пухлинах, такі як антиестроген, зокрема, наприклад, тамоксифен, ралоксифен, 4(5)-імідазоли, що інгібують ароматазу, 4-гідрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, І М117018, онапристон і тореміфен (Рагевіоп); і антіандрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалутамід, лейпролід і госерелін; міРНК і фармацевтично прийнятні солі, кислоти або похідні будь-яких вищеперелічених сполук. Інші хіміотерапевтичні агенти, яких можна застосовувати у межах цього винаходу, розкриті в публікації

США Мо 20080171040 або публікації США 20080305044 і у повному обсязі включені у цей опис як посилання.

Передбачається, що антитіло може бути кон'юговане до двох або більше різних хіміотерапевтичних агентів або фармацевтична композиція може містити суміш антитіл, при цьому компоненти антитіл є однаковими за винятком того, що вони кон'юговані до різних хіміотерапевтичних агентів. Подібні варіанти реалізації можуть бути доцільні при націлюванні на множинні біологічні процеси у клітині-мішені.

У переважних варіантах реалізації АОС містить антитіло, кон'юговане до однієї або більше молекулам майтанзиноїда, які є мітотичними інгібіторами, що діють шляхом пригнічення полімеризації тубуліну. Майтанзиноїди, зокрема різні модифікації, описані в патентах США Мо 3896111; 4151042; 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; 4371533; ії МО 2009/099728. Лікарські речовини на основі майтанзиноїдів можуть бути виділені з природних джерел, одержані за допомогою рекомбінантних технологій або виготовлені синтетично. Приклади майтанзиноїдів охоплюють С-19-дехлор (патент США Мо 4256746), С-20- гідрокси (або С-20-деметил) ж/- С-19-дехлор (патенти США Мо 4307016 і 4361650), С-20-деметокси (або С-20-ацилокси (-ОСОВ) -/- дехлор (патент США Мо 4294757), С-9-5Н (патент США Мо 4.424219), С-14-алкоксиметил (деметокси/СН2ОК) (патент США Мо 4,331,598), С-14-гідроксиметил або ацилоксиметил (СН2ОН або СН2ОДАс) (патент США Мо 4,450,254), С-15-гідрокси/ацилокси (патент США Мо 4,364,866), С-15-метокси (патенти США Мо 4,313,946 і 4,315,929), С-18-М-деметил (патенти США Мо 4,362,663 і 4,322,348) і 4,5-дезокси (патент США Мо 4,371,533).

Залежно від необхідного типу зв'язку як позиції для зв'язування можна використовувати різні позиції у сполуках майтанзиноїдів. Наприклад, для утворення ефірного зв'язку добре підходять позиція С-3, що містить гідроксильну групу, позиція С-14, модифікована гідрозиметилом, позиція С- 15, модифікована гідроксильною групою, і позиція С-20, що містить гідроксильну групу (патенти

США Мо 5208020, КЕ39151 і 6913748; патентні публікації США Мо 20060167245 і 20070037972, і УМО 2009099728).

Переважні майтанзиноїди охоплюють відомі у цій галузі техніки сполуки ЮОМІ, ЮМЗ ії ОМА (патентні публікації США Мо 2009030924 і 20050276812, включені у цей опис шляхом посилання).

АМС5, що містять майтанзиноїди, способи одержання таких АОС5 і їх терапевтичні застосування описані в патентах США Мо 5208020 і 5416064, патентній публікації США Мо 20050276812 ії МО 2009099728 (які всі включено у цей опис шляхом посилання). Лінкери, прийнятні для одержання АЮС5, що містять майтанзиноїди, відомі в цій галузі техніки (патент США Мо 5208020 і патентні публікації США Мо 2005016993 і 20090274713; які всі включено в цей опис шляхом посилання). АОС», що містять майтанзиноїди, що містять лінкери БМСОСС, можна одержати згідно опису, наведеному в патентній публікації США Мо 2005/0276812.

Антитіла з посиленою ефекторною функцією

Однією з функцій Ес-фрагмента антитіла є взаємодія з імунною системою при зв'язуванні антитілом своєї мішені. Це називається "ефекторною функцією". Ця взаємодія призводить до антитілозалежної клітинної цитотоксичності (АЗКЦ), антитілозалежного клітинного фагоцитозу (АЗКФ) та/або комплементзалежної цитотоксичності (КЗЦ). АЗКЦ і АЗКФ опосередковуються через зв'язування Ес з Ес-рецепторами на поверхні клітин імунної системи. КЗЦ опосередковується через зв'язування Ес з білками системи комплементу, наприклад, С14.

Підкласи дО розрізняються за своєю здатністю опосередкувати ефекторні функції. Наприклад, 901 набагато перевершує Ідс2 і Іде4 в опосередкуванні АКЗЦ і КЗЦ. Отже, у варіантах реалізації винаходу, які націлені на руйнування клітини, що експресує 512, переважним буде Ідс1-антитіло до 512.

Ефекторну функцію антитіла можна підвищити або знизити за допомогою введення однієї або більше мутацій у Ес. Варіанти реалізації цього винаходу охоплюють антигензв'язувальні білки, наприклад, антитіла, що містять Ес, сконструйовані таким чином, щоб підвищувати ефекторну функцію (США 7,317,091 і БігопІ, Сигг. Оріп. Віоїесп., 20:685-691, 2009; які обидві у повному обсязі включені у цей опис шляхом посилання). Приклади ІДС! Ес молекул, що мають підвищену ефекторну функцію, охоплюють (на основі системи нумерації Кабата) такі, що містять наступні заміни: 52390/332Е з2г39р/АЗ305/ІЗЗ2Е з2г39р/АЗЗОІ /ІЗЗ2Е з2ЗВА/ЮЗЗЗА/КЗЗ4А

Р2АЛ/АЗЗ390

Р2АЛ/АЗ39О ргвон/кг905 ревон/кг905/52980 ревон/кг905/5298М

Е2431І /ЛН292Р/УЗО0І.

Е2431І /ЯН292Р/УЗО01 /Р 3961.

Е2431І /Я292Р/УЗО00І //3051/Р 3961. сезбА/з2390/332Е

КЗ2б6А/ЕЗЗЗА

КЗ26М//ЕЗЗ335

К2г9ОЕ/52980/Т1299А к2г9о0Мм/52980/1299А

К29ОЕ/52980/1299А/К326Е к2г9о0м/5298,1/1299А/К326Е

Додаткові варіанти реалізації цього винаходу включають антигензв'язувальні білки, наприклад, антитіла, що містять Ес, сконструйовані таким чином, щоб знижувати ефекторну функцію.

Приклади Ес молекул, що мають знижену ефекторну функцію, охоплюють (на основі системи нумерації Кабата) такі, що містять наступні заміни:

М297А (ІдДа1)

І 234А/ 235А (Ідс1)

М234А/с237А (ІдИа2)

І 235А/4237А/ЕЗ18А (ІдИ4)

Н2г680/УЗО9І /АЗ305/АЗ3315 (ЗИ)

С2ггов/С2265/С2295/Р2385 (І9И1) б2265/02295/Е2З3ЗР/Л 234М/ 235А (ІДСИ1)

Г234Р/ 235Е/РЗ315 (41)

З267Е/І 328Е (Іда1)

Іншим способом підвищення ефекторної функції ІдС: білків, що містять Ес, є зниження флукозилування Ес. Видалення ядром фукози з 2-антенарних олігосахаридів комплексного типу, приєднаних до Ес, значно підвищує ефекторну функцію АЗКЦ без зміни у зв'язуванні антигена або ефекторної функції КЗЦ. Відомо декілька способів зниження або припинення флукозилування молекул, що містять Ес, наприклад, антитіл. Вони включають рекомбінантну експресію в певних клітинних лініях ссавців, зокрема клітинну лінію з генним нокаутом РОТ8, варіантну СНО-лінію

І ес13, клітинну лінію гібридоми щурів УВ2/0, клітинну лінію, що містить малу інтерферуючу РНК, специфічну проти гена ЕБИТ8, і клітинну лінію, що спільно експресує /В-1,4-М- ацетилглюкозамінилтрансферазу ПШ ії Гольджі а-манозидазу ІІ. В іншому варіанті молекули, що містять Ес, можуть експресуватися в клітині, що не належить ссавцеві, такій як рослинна клітина, дріжджова або прокаріотична клітина, наприклад, Е. соїї. Отже, у визначених варіантах реалізації винаходу композиція містить антитіло, наприклад, АБІ, Ар2, АБЗ, Ар4, АБ5, АБб, АБ7, АБ8, АБО,

АБрІ10 або АБІ11, що характеризується зниженим фукозилуванням або відсутністю флукозилування.

Фармацевтичні композиції

У деяких варіантах реалізації винаходу запропонована фармацевтична композиція, що містить терапевтично ефективну кількість одного з множини антигензв'язувальних білків, що є об'єктами за цим винаходом, спільно з фармацевтично ефективними розчинниками, носіями, розчинниками, емульгаторами, консервантами та/або ад'ювантами. В окремих варіантах реалізації антигензв'язувальний білок є антитілом. Фармацевтичні композиції, що є об'єктами за цим винаходом, охоплюють, але не обмежуються цим, рідкі, заморожені і ліофілізовані композиції.

Переважно матеріали для виготовлення лікарських препаратів нетоксичні для пацієнта при дозуваннях і концентраціях, що застосовуються. У конкретних варіантах реалізації винаходу запропоновані фармацевтичні композиції, що містять терапевтично ефективну кількість 512- антигензв'язувального білка, наприклад, 512-зв'язувального антитіла.

У окремих варіантах реалізації винаходу фармацевтична композиція може містити матеріали для виготовлення лікарських препаратів для модифікації, підтримки або збереження, наприклад, рівня рН, осмолярності, в'язкості, прозорості, кольору, ізотонічності, запаху, стерильності, стабільності, швидкості розчинення або вивільнення, поглінання або проникності композиції. У таких варіантах реалізації внаходу прийнятні матеріали для виготовлення лікарських препаратів охоплюють, але не обмежуються цим, амінокислоти (такі як гліцин, глутамін, аспарагін, аргінін,

пролін або лізин); протимікробні речовини; антиоксиданти (такі як аскорбінова кислота, сульфіт натрію або гідрогенсульфіт натрію); буфери (такі як борат, бікарбонат, Тріс-НСЇ, цитрати, фосфати або інші органічні кислоти); об'ємоутворювальні агенти (наприклад, маніт або гліцин); хелатуючі агенти (такі як етилендіамінтетраоцтова кислота (ЕДТК)); комплексоутворювальні агенти (такі як кофеїн, полівінілпіролідон, бета-циклодекстрин або гідроксипропіл-бета-циклодекстрин), наповнювачі; моносахариди; дисахариди; і інші вуглеводи (такі як глюкоза, маноза або декстрин); білки (такі як сироватковий альбумін, желатин або імуноглобуліни); забарвлюючі, ароматизуючі і розбавляючі агенти; емульгатори; гідрофільні полімери (такі як полівінілпіролідон); низькомолекулярні поліпептиди; солетворні протиїони (такі як натрій); консерванти (такі як бензалконійхлорид, бензойна кислота, саліцилова кислота, тимерозал, фенетиловий спирт, метилпарабен, пропілпарабен, хлоргексидин, сорбінова кислота або перекис водню); розчинники (такі як гліцерин, поліпропіленгліколь або поліетиленгліколь); цукрові спирти (такі як маніт або сорбіт); суспендуючі агенти; поверхнево-активні речовини або змочувальні агенти (такі як плюроніки, ПЕГ, ефіри сорбітану, полісорбати, такі як полісорбат 20, полісорбат, тритон, трометамін, лецитин, холестерин або тилоксапал); агенти, що підвищують стабільність (такі як сахароза або сорбіт); агенти, що підвищують тонічність (такі як галіди лужних металів, переважно, хлорид натрію або калію або маніт-сорбіт); засоби доставки; розчинники; допоміжні речовини та/або фармацевтичні ад'юванти. Див. ВЕМІМСТОМ'Є РНАВМАСЕШТІСАЇ ЗСІЕМСЕ5, 18" Еайіоп, (А. А. Сепгтто, єд.), 1990, Маск Рибіїзпіпд Сотрапу.

В окремих варіантах реалізації оптимальна фармацевтична композиція визначається фахівцем у цій галузі техніки залежно від, наприклад, вибраного способу введення, форми доставки і необхідного дозування. Дивитеся, наприклад, НЕМІМЕТОМ'Є РНАВМАСЕШТІСАЇ 5СІЕМСЕЗ5, вище. У окремих варіантах реалізації винаходу такі композиції можуть чинити вплив на фізичний стан, стабільність, швидкість іп мімо вивільнення і швидкість іп мімо виведення антигензв'язувальних білків, що є об'єктами за цим винаходом. У окремих варіантах реалізації винаходу первинний наповнювач або носій у фармацевтичній композиції може бути водного або неводного походження.

Наприклад, прийнятним наповнювачем або носієм може бути вода для ін'єкції, фізіологічний розчин або штучна цереброспінальна рідина, за можливістю, з додаванням інших речовин, що часто застосовуються у композиціях для парентерального введення. Додатковими прикладами носіїв є нейтральний буферний фізіологічний розчин або фізіологічний розчин, змішаний з сироватковим альбуміном. У конкретних варіантах реалізації винаходу фармацевтичні композиції містять Трис- буфер з рівнем рН близько 7,0-8,5 або ацетатний буфер з рН близько 4,0-5,5, і можуть додатково містити сорбіт або його прийнятний замінник. У окремих варіантах реалізації винаходу композиції, що містять 5Т2-антигензв'язувальний білок, можна підготувати для зберігання шляхом змішування вибраного складу, що має необхідний ступінь очищення, з довільними агентами для приготування лікарського препарату (КЕМІМОТОМ'З РНАКМАСЕШТІСАЇ 5СІЕМСЕЗ, вище) у вигляді ліофілізованої пігулки або водного розчину. Крім того, в окремих варіантах реалізації продукт, що містить ЗТ2-антигензв'язувальний білок, можна виготовити у вигляді ліофілізату, використовуючи відповідні допоміжні речовини, такі як сахарозу.

Для фармацевтичних композицій, що є об'єктами за цим винаходом, можна вибрати парентеральний спосіб доставки. В іншому варіанті реалізації винаходу для композицій можна вибрати інгаляційний спосіб або доставку через травний тракт, наприклад, пероральну.

Виготовлення таких фармацевтично прийнятних композицій відоме у цій галузі техніки. Компоненти лікарського препарату переважно містяться в концентраціях, які є прийнятними для цього місця введення. В окремих варіантах реалізації винаходу використовують буфери для підтримки у складі фізіологічного рівня рН або трохи меншого рн, зазвичай, в інтервалі від близько 5 до близько 8.

У випадках, коли передбачається парентеральне введення, терапевтичні композиції для застосування у цьому винаході можуть надаватися у вигляді апірогенного, парентеральний прийнятного водного розчину, що містить необхідний 5Т2-антигензв'язувальний білок у фармацевтично прийнятному носієві. Виключно прийнятним носієм для парентеральної ін'єкції є стерильна дистильована вода, в якій препарат 5Т2-антигензв'язувального білка одержують у вигляді стерильного ізотонічного розчину з додаванням відповідних консервантів. У окремих варіантах реалізації винаходу виготовлення лікарського препарату може включати змішування необхідної молекули разом з агентами, такими як мікросфери, що ін'єктуються, біоруйновані частки, полімерні сполуки (такі як полімолочна кислота або полігліколева кислота), гранули або ліпосоми, які можуть забезпечити контрольоване або тривале вивільнення продукту, який потім можна доставити за допомогою ін'єкції речовин сповільненого всмоктування. В окремих варіантах реалізації можна також застосовувати гіалуронову кислоту, яка сприяє тривалому знаходженню в системі циркуляції. У окремих варіантах реалізації винаходу для внесення необхідного антигензв'язувального білюка можна використовувати пристрої, що імплантуються, для доставки лікарських речовин.

Фармацевтичні композиції, що є об'єктами за цим винаходом, можна одержати для введення шляхом інгаляції. У цих варіантах реалізації 5Т2-антигензв'язувальні білки переважно виготовляють у вигляді сухого інгалюємого порошку. У конкретних варіантах реалізації винаходу інгаляційні розчини, що містять 5Т2-антигензв'язувальний білок, також можна виготовити разом з пропелентом для аерозольної доставки. В окремих варіантах реалізації розчини можуть розпилятися. Інгаляційне введення і способи виготовлення відповідних лікарських препаратів додатково описані у міжнародній патентній заявці Мо РСТ/О594/001875, яка включена у цей опис шляхом посилання і описує інгаляційне введення хімічно модифікованих білків.

Також передбачається, що лікарські препарати можна вводити перорально. 57Т12- антигензв'язувальні білки, які вводять у такий спосіб, можна виготовляти з або без носіїв, що зазвичай використовуються при одержанні твердих дозованих форм, таких як пігулки і капсули. У окремих варіантах реалізації винаходу капсулу можна виготовити так, щоб вивільнення активної частини лікарського препарату відбувалося в тому місці шямково-кишкового тракту, де максимізована біологічна доступність і мінімізована пресистемна деградація. Для полегшення абсорбції 5Т2-антигензв'язувального білка можна додавати додаткові агенти. Також можна застосовувати розчинники, ароматизатори, легкоплавкий віск, рослинні олії, лубриканти, суспендуючі агенти, речовини для покращення розпаданості пігулок і зв'язувальні речовини.

Наявність додаткових фармацевтичних композицій очевидна для фахівців у цій галузі техніки, зокрема лікарські препарати, що містять 5Т2-антигензв'язувальні білки у вигляді, який забезпечує тривалу або контрольовану доставку. Способи для виготовлення великої кількості засобів тривалої або контрольованої доставки, таких як ліпосомні носії, біорозкладані мікрочастки або пористі гранули і ін'єкція речовин сповільненого всмоктування, також відомі фахівцям у цій галузі техніки.

Див., наприклад, міжнародну патентну заявку Мо РСТ/О593/00829, яка включена у цей опис шляхом посилання і описує контрольоване вивільнення пористих полімерних мікрочасток для доставки фармацевтичних композицій. Препарати тривалого вивільнення можуть містити напівпроникні полімерні матриці у вигляді формованих виробів, наприклад, плівок або мікрокапсул. Матриці з тривалим вивільненням можуть містити складні поліефіри, гідрогелі, полілактиди (що розкрите в патенті США Мо 3,773,919 і публікації Європейської патентної заявки Мо ЕР 058481, які включені у цей опис шляхом посилання), кополімери ГІ -глутамінової кислоти і гамма-етил-і -глутамата (5ідтап еї а!., 1983, Віороїтутегв 2:547-556), полі-(2-гідроксіетилметакрилат) (І апдег еї аї., 1981, 9. Віотеа.

Маїег. Нев. 15:167-277 і Гапдег, 1982, Спет. Тесп. 12:98-105), етиленвінілацетат (І апдег еї аї., 1981, зирга) або полі-Д(-)-3-гідроксимасляну кислоту (публікація Європейської патентної заявки Мо

ЕР 133,988). Композиції з тривалим вивільненням можуть також містити ліпосоми, які можна одержати одним з декількох відомих у цій галузі техніки способів. Див., наприклад, Еррзієвїп еї аї., 1985, Ргос. Маї). Асад. 5сі. 0.5.А. 82:3688-3692; публікації Європейських патентних заявок Мо ЕР 036,676; ЕР 088,046 і ЕР 143,949, включені шляхом посилання.

Фармацевтичні композиції для іп мімо введення зазвичай одержують у вигляді стерильних препаратів. Стерилізацію можна здійснити шляхом фільтрації через стерильні фільтруючі мембрани. У випадку, якщо композиція ліофілізована, стерилізацію із застосуванням вказаного способу можна провести як до, так і після ліофілізації і відновлення. Композиції для парентерального введення можна зберігати в ліофілізованій формі або в розчині. Парентеральні композиції зазвичай поміщають у контейнер, що має стерильний вхідний отвір, наприклад, пакет для внутрішньовенного розчину або ємність з пробкою, через яку вводиться гіподермальна голка для ін'єкції.

Аспекти цього винаходу включають препарати 5Т2-антигензв'язувального білка, які самі слугують буфером і які можна застосовувати як фармацевтичні композиції, як описано у міжнародній патентній заявці УМО 06138181А2 (РСТ/О52006/022599), яка включена у цей опис у повному обсязі шляхом посилання.

Як обговорювалося вище, в окремих варіантах реалізації запропоновані композиції, що містять

ЗТ2-антигензв'язувальні білки, зокрема, фармацевтичні композиції що містять 512- антигензв'язувальні білки, які окрім 5Т2-антигензв'язувального білка містять одну або більше допоміжних речовин, таких як ті, що описані в ілюстративних цілях у цьому розділі і в інших частинах опису. У зв'язку з цим, допоміжні речовини можна використовувати у винаході у різних цілях, таких як регулювання фізичних, хімічних або біологічних властивостей лікарських препаратів, наприклад, регулювання в'язкості, тал"або у способах згідно цьому винаходу для того, щоб покращити ефективність та/або стабілізувати такі лікарські препарати або способи відносно деградації і псування внаслідок, наприклад, дій, які можуть мати місце під час виробництва, перевезення, зберігання, попереднього приготування, введення і так далі.

Доступна велика кількість робіт по стабілізації білка і способам і матеріалам для виготовлення препаратів, що використовуються у зв'язку з цим, таких як АгаКамжа еї аї., "Зоїмепі іптіегасіопв іп рпаптасешіса! Топтиіайопв", Рнагт Нез. 8(3): 285-91 (1991); КепаїскК еї аї., "РНузісаї! «іабіїїгайноп ої ргоївіп5 іп адиеои5 зоЇшіоп", уд КАТІОМАЇ ОЕБІСМ ОБ ЗТАВІЕ РКОТЕЇМ РОКМИЇГАТІОМ5:

ТНЕОВНМ АМО РЕАСТІСЕ, Сагрепієї апа Маппіпа, єд5. РНаптасешііса! Віоїесппоіоду. 13: 61-84 (2002), і Вапаосірн еї а!ї., "Зипасіапі-ргоїєїп іпіегасіопв", Рнагт Віоїеснпої!. 13: 159-75 (2002), які всі у повному обсязі включені у цей опис шляхом посилання, зокрема, у розділах, що стосуються допоміжних речовин і відповідних способів приготування білкових препаратів згідно цьому винаходу, які самі служать буфером, особливо, до білюових фармацевтичних продуктів і способів застосування у ветеринарії і медицині людини.

Згідно деяким варіантам реалізації винаходу можна використовувати солі для того, щоб, наприклад, регулювати іонну силу та/або ізотонічність лікарського препарату та/або покращити розчинність та/або фізичну стабільність білка або іншого інгредієнта композиції згідно з винаходом.

Як добре відомо, іони можуть стабілізувати нативний стан білків за допомогою зв'язування із зарядженими залишками на поверхні білка і за допомогою екранування заряджених і полярних груп на білка і зменшення сили їх електростатичної взаємодії, тяжіння і відштовхування. Також іони можуть стабілізувати денатурований стан білка, зокрема, за допомогою зв'язування з денатурованими пептидними зв'язками (-СОМН) білка. Більше того, іонна взаємодія із зарядженими і полярними групами на білка також може зменшити внутрішньомолекулярну електростатичну взаємодію і, тим самим, запобігти або знизити агрегацію пептиду і нерозчинність.

Різновиди іонів істотно розрізняються по своїй дії на білки. Було створено велику кількість класифікацій для іонів і їх дії на білки, які можна використовувати при виготовленні фармацевтичних композицій згідно цього винаходу. Одним з прикладів є ряд Гофмейстера, в якому іонні і полярні неійонні розчини розташовуються відповідно до своєї дії на конформаційну стабільність білків у розчині. Стабілізуючі розчини називаються "космотропними". Дестабілізуючі розчини називаються "хаотропними". Космотропи зазвичай використовують при високих концентраціях (наприклад, »1-молярного сульфату амонію) для преципітації білків з розчину (Свисолювання"). Хаотропи зазвичай використовують для денатурації та/або розчинення білків

Сусолювання"). Відносна ефективність іонів при "усолюваннії і "висолюваннії визначає їх положення у ряді Гофмейстера.

Згідно різним варіантам реалізації винаходу у препаратах, що містять, 512- антигензв'язувальний білок, можна застосовувати вільні амінокислоти як об'ємоутворювальні агенти, стабілізатори і антиоксиданти, а також для інших стандартних застосувань. Лізин, пролін, серин і аланін можна використовувати для стабілізації білків у препаратах. Гліцин є прийнятним для застосування в ліофілізації для того, щоб гарантувати правильну структуру і властивості пігулок. Аргінін можна застосовувати для пригнічення агрегації білка, як у рідких, так і в ліофілізованих препаратах. Метіонін є прийнятним як антиоксидант.

Поліоли охоплюють цукри, наприклад, маніт, цукрозу і сорбіт, і багатоатомні спирти, такі як, наприклад, гліцерол і пропіленгліколь, і, з метою обговорення у цьому описі, поліетиленгліколь (ПЕГ) і споріднені сполуки. Поліоли є космотропними. Вони є прийнятними стабілізуючими агентами як у рідких, так і в ліофілізованих препаратах, для захисту білка від фізичних і хімічних процесів деградації. Також поліоли застосовні для регулювання тонічності препаратів.

Серед поліолей, що застосовуються у вибраних варіантах реалізації, можна назвати маніт, який зазвичай використовують для гарантії структурної стабільності пігулки в ліофілізованих препаратах. Він забезпечує структурну стабільність пігулки. Як правило, його використовують разом з ліопротектантом, наприклад, цукрозою. Сорбіт і цукроза є одними з переважних агентів для регулювання тонічності і як стабілізатори для захисту при заморожуванні-розморожуванні під час транспортування або при виготовленні великих об'ємів препаратів під час процесу виробництва.

Відновні цукри (які містять альдегідні або кетонові групи), такі як глюкоза і лактоза, можуть глікувати поверхневі залишки лізину і аргініну. Отже, у загальному випадку вони не є переважними поліолями для застосування згідно винаходу. Додатково, цукри, які утворюють такі реактивні сполуки, такі як цукроза, яка в кислотних умовах гідролізується до фруктози і глюкози, і, отже, стимулює глікування, також не є в даному відношенні переважними поліолями згідно винаходу.

ПЕГ застосовують для стабілізації білків і як кріопротектант, і він також може бути в цьому відношенні застосований у винаході.

Варіанти реалізації фармацевтичних композицій, що містять 5Т2-антигензв'язувальні білки, додатково включають поверхнево-активні речовини. Білкові молекули можуть адсорбуватися на поверхнях і денатурувати з подальшою агрегацією на поверхнях розділу повітря-рідина, тверде тіло-рідина і рідина-рідина. У загальному випадку ці ефекти є зворотно пропорційними концентрації білка. Ці шкідливі взаємодії, як правило, є зворотно пропорційними до концентрації білка і зазвичай посилюються при фізичній дії, такій як та, що виникає під час транспортування і експлуатації продукту.

Поверхнево-активні речовини зазвичай використовують для запобігання, мінімізації або зниження фізичної адсорбції. Корисні у цьому відношенні поверхнево-активні речовини згідно винаходу охоплюють полісорбат 20, полісорбат 80, інші ефіри жирних кислот поліетоксилатів сорбітану і полоксамер 188.

Поверхнево-активні речовини зазвичай використовують для контролю конформаційної стабільності білка. У зв'язку з цим використання поверхнево-активних речовин є специфічним для білка, оскільки будь-яка задана поверхнево-активна речовина, як правило, стабілізує одні білки і дестабілізує інші.

Полісорбати сприйнятливі до окислювальної деградації і часто, у тому вигляді, в якому вони поставляються, містять достатню кількість пероксидів для того, щоб призвести до окислення бічних ланцюгів білкових залишків, особливо, метіоніну. Отже, застосовувати полісорбати слід обережно, і використовувати при найнижчій ефективній концентрації. У даному відношенні полісорбати відображують загальне правило, що допоміжні речовини слід застосовувати при найнижчих ефективних концентраціях.

Варіанти реалізації фармацевтичних композицій, що містять 5Т2-антигензв'язувальні білки, додатково охоплюють один або більше антиоксидантів. Шкідливому ефект від окислення білків у фармацевтичних препаратах можна у деякій мірі запобігти за допомогою підтримки належного рівня атмосферного кисню і температури і за допомогою запобігання дії світла. Допоміжні антиоксиданти можна також використовувати для запобігання окислювальній деградації білків.

Серед корисних у цьому відношенні антиоксидантів можна назвати відновні агенти, акцептори кисню/вільних радикалів і хелатуючі агенти. Антиоксиданти для застосування у терапевтичних білкових препаратах згідно винаходу переважно є водорозчинними і зберігають свою активність упродовж терміну зберігання продукту. В цьому відношенні ЕДТК є переважним антиоксидантом згідно винаходу.

Антиоксиданти можуть пошкодити білки. Наприклад, відновні агенти, такі як, зокрема, глутатіон, можуть руйнувати внутрішньомолекулярні дисульфідні зв'язки. Отже, антиоксиданти для застосування у цьому винаході вибирають так, щоб, серед іншого, усунути або істотно знизити можливість пошкодження ними білків у препаратах.

Препарати згідно винаходу можуть містити іони металів, які є кофакторами білка і необхідні для утворення білкових координаційних комплексів, такі як цинк, який необхідний для одержання визначених інсулінових суспензій. (они металів також можуть пригнічувати деякі процеси, в ході яких відбувається деградація білка. При цьому іони металів також каталізують фізичні і хімічні процеси, у ході яких відбувається деградація білка.

Іони магнію (10-420 мМ) можна застосовувати для пригнічення ізомеризації аспарагінової кислоти до ізоаспарагінової кислоти. ни Са? (до 100 мМ) можуть збільшувати стабільність людської дезоксирибонуклеази. Ма", Мп"? і 212, при цьому, можуть дестабілізувати рлДНКазу.

Аналогічно, Са"? і Зі"? можуть стабілізувати фактор МІЇ, але він може бути дестабілізований Ма,

Мп» і 2пе2, бу і Ре-2, а його агрегація може бути посилена іонами А.

Варіанти реалізації фармацевтичних композицій, що містять 5Т2-антигензв'язувальні білки, додатково охоплюють один або більше консервантів. Консерванти необхідні при розробці парентеральних препаратів, розрахованих на багаторазове дозування, яке має на увазі неодноразове використання препарату з одного і того самого контейнера. Їх первинною функцією є пригнічення мікробного росту і гарантія стерильності продукту упродовж терміну зберігання або терміну використання лікарського продукту. Зазвичай консерванти, що використовуються, містять бензиловий спирт, фенол і м-крезол. Хоча консерванти мають довгу історію спільного застосування з низькомолекулярними парентеральними препаратами, розробка білкових препаратів, які містять консерванти, може бути ускладнена. Консерванти практично завжди надають дестабілізуючий ефект (агрегації) на білки, і це стало основним чинником, що обмежує їх застосування у препаратах, розрахованих на багаторазове дозування. У даний час більшість білкових лікарських препаратів виготовляють лише для одноразового застосування. Проте, у тих випадках, коли можливі препарати, розраховані на багаторазове дозування, вони мають додаткову перевагу, що полягає у зручності для пацієнта, і підвищену конкурентоспроможність на ринку продажів. Хорошим прикладом є людський гормон росту (ПОН), для якого розробка препаратів, що містять консерванти, призвела до комерційної реалізації зручнішого багаторазового шприца-ручки.

Щонайменше чотири таких пристрої-ручки, що містять препарати ПОН з консервантами, доступні на цей момент на ринку продажів. Нордитропін (рідина, Момо МогаїбК), нутропін АС (рідина,

Сепепіесі) і генотропін (ліофілізований, з двокамерним картриджем, Рпаптасіа 5 Оріопп) містять фенол, тоді як соматроп (Еїї ПІПу) виготовлений з додаванням м-крезолу.

При виготовленні і розробці дозованих форм, що містять консерванти, потрібно брати до уваги деякі аспекти. Ефективна концентрація консерванта в лікарському продукті має бути оптимізованою. Це вимагає дослідження заданого консерванта у формі дозування в діапазоні концентрацій, який забезпечує протимікробну дію без зниження стабільності білка.

Слід чекати, що розробка рідких лікарських препаратів, що містять консерванти, є важчим завданням, ніж у випадку ліофілізованих препаратів. Сублімовані продукти можна ліофілувати без консервантів і відновити у розчиннику, що містить консервант, перед використанням. Це знижує час контакту консерванта і білка, що істотно мінімізує пов'язаний з таким контактом ризик дестабілізації. У випадку рідких лікарських препаратів ефективність консерванта і стабільність повинні підтримуватися упродовж всього терміну зберігання продукту (близько від 18 до 24 місяців). Важливим моментом є те, що консервант повинен проявляти ефективність у кінцевому препараті, що містить активну лікарську речовину і всі допоміжні компоненти.

У загальному випадку препарати 5Т2-антигензв'язувальних білків повинні розроблятися з урахуванням визначених способів і методів застосування, для визначених дозувань, що застосовуються, і частоти застосування, для визначених видів лікування визначених захворювань і у визначених діапазонах біологічної доступності і стійкості серед іншого. Отже, лікарські препарати згідно цього винаходу можна розробити для доставки будь-яким відповідним способом, зокрема, але не обмежуючись цим, пероральним, внутрішньовушним, офтальмологічним, ректальним і вагинальним, а також парентеральними способами, зокрема внутрішньовенну (рі внутрішньоартеріальну ін'єкцію, внутрішньом'язову ін'єкцію і підшкірну ін'єкцію.

Після виготовлення фармацевтична композиція можна зберігати в стерильних флаконах у вигляді розчину, суспензії, гелю, емульсії, у твердому стані, в кристалічному стані або у вигляді дегідратованого або ліофілізованого порошку. Такі препарати можна зберігати як у готовій для застосування формі, так і у формі (наприклад, ліофілізованої) яка відновлюється перед застосуванням. Також у винаході запропоновані набори для одержання одноразової дози препарату. Набори, що є об'єктами за цим винаходом, можуть містити перший контейнер, що містить сухий білок, і другий контейнер, що містить водний препарат. У окремих варіантах реалізації цього винаходу запропоновані набори, що містять мультикамерні заздалегідь наповнені шприци (наприклад, шприци з рідиною або шприци з ліофілізатом).

Застосована терапевтично ефективна кількість фармацевтичного складу, що містить 512- антигензв'язувальний білок, залежить, наприклад, від терапевтичного контексту і обставин. Для фахівця у цій галузі техніки зрозуміло, що прийнятні рівні дозування для лікування частково залежать від молекули, що доставляється, у ролі якої використовується 5Т2-антигензв'язувальний білок, способу застосування і параметрів (маса тіла, площа поверхні тіла і розмір органів) і стану (віку і загального здоров'я) пацієнта. В окремих варіантах реалізації лікар, який лікує, може титрувати дозування і модифікувати спосіб застосування для одержання оптимального терапевтичного ефекту. Типовий діапазон дозувань складає від близько 0,1 мкг/кг до близько 30 мг/кг або більше залежно від вищезазначених чинників. У конкретних варіантах реалізації діапазон дозувань може складати від 1,0 мкг/кг до близько 20 мг/кг, у деяких випадках - від 10 мкг/кг до близько 10 мг/кг або від 100 мкг/кг до близько 5 мг/кг.

Застосування терапевтично ефективної кількості 5Т2-антигензв'язувального білка переважно призводить до зниження міри важкості симптомів захворювання, збільшення частоти або тривалості періодів відсутності симптомів захворювання або запобігання появі патологій або інвалідності внаслідок ураження хворобою.

Фармацевтичні композиції можна вводити за допомогою медичних інструментів. Приклади медичних інструментів для введення фармацевтичних композицій описані в патентах США Мо 4,475,196; 4,439,196; 4,447 224; 4,447, 233; 4,486,194; 4,487,603; 4,596,556; 4,790,824; 4,941,880; 5,064,413; 5,312,335; 5,312,335; 5,383,851; і 5,399,163, які всі включені у цей опис шляхом посилання.

Способи діагностики або лікування захворювань і порушень, пов'язаних з 512 5Т2-антигензв'язувальні білки, що є об'єктами за цим винаходом, застосовні, зокрема, для детектування 512 у біологічному зразку. В окремих варіантах реалізації біологічний зразок, одержаний від пацієнта, приводять у контакт з 5Т2-антигензв'язувальним білком. Потім детектують зв'язування 5Т2-антигензв'язувального білка з 512, щоб визначити наявність відносної кількості

ЗТІ2 у зразку. Такі способи можуть бути корисні для діагностики або виявлення пацієнтів, які сприйнятливі до лікування 5Т2-антигензв'язувальним білком.

У окремих варіантах реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок, що є об'єктом за цим винаходом, застосовують для діагностики, детектування або лікування аутоїмунних або запальних захворювань. При лікуванні аутоїмунних або запальних захворювань 5Т2-антигензв'язувальний білок може бути націлений на експресуючі 572 клітини імунної системи для їх руйнування та/або може блокувати взаємодію 512 і 1-33.

Захворювання, які пов'язані і опосередкованою 1/-33 передачею сигналу, виключно сприйнятливі до лікування одним або більше 5Т2-антигензв'язувальними білками, розкритими у цьому описі. Такі захворювання охоплюють, але не обмежуються цим, запалення, аутоїмунне захворювання, паранеопластичні аутоїмунні захворювання, запалення хрящової тканини, фіброзуючі хвороби та/або руйнування кісткової тканини, артрит, ревматоїдний артрит, ювенільний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит, пауциартикулярний ювенільний ревматоїдний артрит, поліартикулярний ювенільний ревматоїдний артрит, ювенільний ревматоїдний артрит з системним початком, ювенільний анкілозуючий спондиліт, ювенільний ентеропатичний артрит, ювенільний реактивний артрит, ювенільний синдром Рейтера, 5ЕА-синдром (синдром серонегативної ентезопатії і артропатії), ювенільний дерматоміозит, ювенільний псоріатичний артрит, ювенільну склеродермію, ювенільний системний червоний вовчак, ювенільний васкуліт, пауциартикулярний ревматоїдний артрит, поліартикулярний ревматоїдний артрит, ревматоїдний артрит з системним початком, анкілозуючий спондиліт, ентеропатичний артрит, реактивний артрит, синдром Рейтера,

ЗЕА-синдром (синдром серонегативної ентезопатії і артропатії), дерматоміозит, псоріатичний артрит, склеродермію, системний червоний вовчак, васкуліт, мієліт, поліомієліт, дерматоміозит,

вузликовий поліартеріїт, гранулематоз Вегенера, артеріїт, ревматичну поліміалгію, саркоїдоз, склеродерму, склероз, первинний склероз жовчних проток, склерозуючий холангіт, синдром

Шегрена, псоріаз, плямистий псоріаз, каплевидний псоріаз, псоріаз складок, псоріаз пустули, еритродермічний псоріаз, дерматит, атопічний дерматит, атеросклероз, вовчак, хворобу Стілла, системний червоний вовчак (ВКВ), міастенію гравіс, запальне захворювання кишечника (ЗЗК), хворобу Крону, виразковий коліт, глютенову хворобу, множинний склероз (МС), астму, ХОЗЛ, риносинусит, риносинусит з поліпами, еозинофільний езофагіт, еозинофільний бронхіт, хвороба

Гійєна-Барре, цукровий діабет типу І, тиреоїдит (наприклад, хвороба Грейвса), хвороба Адісона, феномен Рейно, аутоїмунний гепатит, хронічна БТПХ, відторгнення при трансплантації, пошкодження нирок і тому подібне.

У переважних варіантах реалізації аутоїімунним або запальним захворюванням є астма, хронічне обструктивне захворювання легенів, легеневий фіброз, сепсис і травми, ВІЛ-інфекція, системний червоний вовчак, запальне захворювання кишковика, ревматоїдний артрит, склероз, гранулематоз Вегенера, хвороба Бехчета, серцевосудинне захворювання, риносинусит, назальний поліпоз і еозинофільний бронхіт.

У окремих варіантах реалізації 5Т2-антигензв'язувальний білок, що є об'єктом за цим винаходом, застосовують для діагностики, детектування або лікування раку або пухлинного захворювання. При лікуванні раку або пухлинного захворювання 5Т2-антигензв'язувальний білок може бути націлений на клітини, що експресують 5Т2, для їх руйнування і може блокувати взаємодію 512 і 1-33, тим самим знижуючи опосередковану 1-33 передачу сигналу. Наприклад, висока експресія розчинного 5712 пов'язана з підвищенням виживаності серед пацієнтів з раком молочної залози. (Ргеспїеї еї аї, Габ Іпмевзі (2001) 81:159-165). Оскільки розчинний 512 зв'язує і блокує опосередковану 1-33 передачу сигналу, передбачається, що 5Т2-антигензв'язувальні білки, які блокують опосередковану І/-33 передачу сигналу, виявляться ефективними, сприяючи підвищенню виживаності серед пацієнтів з раком молочної залози. Рак або пухлинні захворювання, які можна діагностувати, детектувати або лікувати за допомогою 5Т2-антигензв'язувального білка, охоплюють, але не обмежуються цим, тверді пухлини в цілому, рак легенів, рак яєчників, рак молочної залози, рак простати, рак ендометрію, рак нирок, рак стравоходу, рак підшямкової залози, плоскоклітинну карциному, увеальну меланому, рак шийки матки, колоректальний рак, рак сечового міхура, мозку, підшямкової залози, голови, шиї, печінки, лейкемію, лімфому і хворобу Ходжкіна, множинну мієлому, меланому, рак шямково-кишкового тракту, астроцитому, рак шлунку і аденокарциному легені.

Антігензв'язувальні білюои можна використовувати для пригнічення росту пухлин, прогресу та/або метастазу. Таке пригнічення можна відстежувати за допомогою різних способів. Наприклад, пригнічення може призвести до зниження розміру пухлини та/або зниження метаболічної активності всередині пухлини. Обидва ці параметри можна визначити, наприклад, за допомогою МРТ- або

ПЕТ-сканування. Також пригнічення можна відстежувати за біопсією для того, щоб встановити рівень некрозу, загибелі пухлинних клітин і рівня васкулярності усередині пухлини. Ступінь метастазу можна відстежувати за допомогою відомих способів.

Приклади

Наступні приклади, практичні і теоретичні, наведені для того, щоб проілюструвати конкретні варіанти реалізації або відмітні ознаки цього винаходу, але при цьому не обмежують його обсяг.

Приклад 1: Антитіла до 512 ефективні у мишачій моделі астми

Цей приклад демонструє, що введення антитіл, які зв'язують 512 і пригнічують 1/-33- опосередковану передачу сигналу, є ефективним у тваринній моделі запального захворювання, тобто, астми. Нейтралізуюче мишаче 512 тА (5Т12-сурогатне тАб) пригнічувало активність 1-33, що вводилося екзогенно іп мімо. Мишам інтраназально вводили 200 нг рекомбінантного мишачого

І/-33 через дві години після внутрішньовенної ін'єкції 100 мкг анти-512 тАбр. Наступного дня визначали концентрації ІЇ/-5 у рідині бронхоальвеолярного лаважа (РБАЛ) за допомогою ЕГІЗА.

Контрольні концентрації І.-5 отримували з РБАЛ мишей, оброблених сольовим розчином перед введенням сольового розчину. Максимальні концентрації І -5 у РБАЛ були одержані для ізотипічних контрольних оброблених мишей Ід, яким вводили 1ІЇ/-33. Порівняно з ізотипічною контрольною обробкою Ід, обробка 5712 тАБ призвела до істотного пригнічення ІІ -33-індукованого

І/-5 у РБАЛ обох мишачих штамів - ВАГ В/с і С57ВІ /6 (Фіг. 1).

ЗТ2-сурогатне тАБ проявило ефективність в індукованій алергеном (СВА) таргана моделі астми, при цьому в РБАЛ мишей, оброблених антитілами до 512, містилося істотно менше еозинофілів, ніж в ізотипічних контрольних оброблених мишей Ід. Мишам ВАЇ В/с вводили 100 мкг

СВА на 1, 3, 6, 8, 10 ї 13 днів. Мишам робили ін'єкцію 250 мкг або анти-5Т2 тАБ або ізотипічного контрольного Ід на 0, 7 ї 13 днів, причому на 13 день ін'єкцію антитіл проводили перед останнім інтраназальним введенням СА. На 14 день мишей анестезували і проводили лаваж легенів.

Клітинні популяції РБАЛ оцінювали кількісно, а обробка анти-5Т2 тАб призвела до істотно меншої загальної кількості клітин РБАЛ, при цьому еозинофіли складали незначну частину клітинної популяції (Фіг. 2).

Приклад 2: Одержання антитіл до 512 з використанням платформи Хепотоизе?

Дослідження генерації повністю людських антитіл, направлених проти людського 512, проводили, використовуючи технологію ХЕМОМОШБЕФ (патенти США Мо 6,114,598; 6,162,963; 6,833,268; 7,049,426; 7,064 244, які у повному обсязі включені у цей опис шляхом посилання; Стеєп еї а, 1994, Маїшге Сепеїісв 7:13-21; Мепає? єї аї., 1997, Маїшге Сепеїйсв 15:146-156; Стеєп апа

УаКороміїї5, 1998, У. Ех. Мей. 188:483-495, КеПептапп апа Стеєп, 2002, Ситепі Оріпіоп іп

Віотесппоіоду, 13:593-597).

Імунізацію ХМОС2К, ХМОа4К і ХМО4КІ ХЕМОМОЗЕФ тварин проводили як поліпептидом, що містить позаклітинний домен людського 5Т2, зшитий з Ес-доменом людського антитіла, так і людським гібридним білком 5Т2-Бс, комплексованим з людським 1-33. Прийнятну кількість імуногена (тобто, десять мкг/імиша розчинного 512) використовували для первинної імунізації

ХЕМОМОИШЗЕФ тварин згідно зі способами, описаними у патентній заявці США, серійний Мо 08/759,620, зареєстрованої З грудня 1996 р., і міжнародних патентних заявках Мо М/О 98/24893, опублікованій 11 червня 1998 р., ії М/О 00/76310, опублікованій 21 грудня 2000 р., описи яких включені у цей опис шляхом посилання. Після первинної імунізації проводили послідовні бустерні імунізації імуногена (п'ять мкг/миша розчинного 512 або комплексу 5Т2/ЛІ33) згідно схемі і впродовж терміну, необхідного, щоб індукувати необхідний титр антитіл до 512 у мишей. Титри визначали прийнятним способом, наприклад, ЕГІ5ЗА або за допомогою сортування флуоресцентно- активованих клітин (ЕАС5).

Визначали тварин з прийнятними титрами і лімфоцити, одержані з дренуючих лімфатичних вузлів, і, за необхідності, об'єднані для кожної групи. Лімфоцити виділяли з лімфоїдної тканини за допомогою розмелювання у прийнятному середовищі (наприклад, середовищі Ігла, модифікованому за способом Дульбекко; ОМЕМ, що надається Іпмігодеп, Сагізрай, СА) для вивільнення клітин із тканин і суспендували в ОМЕМ. В-клітини відбирали та/або збагачували прийнятним способом і зшивали з прийнятними партнерами по злиттю, наприклад, клітинами

РЗХбЗА9В8.653 несекреторної мієломи (Американська колекція типових культур СК. 1580; Кеагпеу еї аї, 9. Іттипої. 123, 1979, 1548-1550), за допомогою відомих у цій галузі техніки способів.

В одному способі злиття лімфоцити змішували з клітинами-партнерами по злиттю у співвідношенні 1:4. Клітинну суміш акуратно пелетували за допомогою центрифугування при 400 х 9 упродовж 4 хвилин, супернатант зціджували, а клітинну суміш акуратно перемішували (наприклад, за допомогою 1 мл піпетки). Злиття індукували ПЕГ/ДМСО (поліетиленгліколь/диметилсульфоксид; бідта-Аїагісй, що надається, 5. , Місі оці5, МО; 1 мл на мільйон лімфоцитів). ПЕГ/ДМСО додавали повільно, акуратно струшували через одну хвилину з подальшим перемішуванням вупродовж однієї хвилини. Потім через 2 хвилини додавали ІОМЕМ (ОМЕМ без глутаміну; 2 м/Л на мільйон В-клітин), акуратно струшуючи, з подальшим додатковим додаванням ІОМЕМ (8 мл на мільйон В-клітин) через З хвилини.

Злиті клітини акуратно пелетували (400 х 9, 6 хвилин) і перерозчиняли в 20 мл селекційного середовища (ОМЕМ, що містить азасерин і гіпоксантин ІНАЇ і інші допоміжні речовини у випадку потреби) на мільйон В-клітин. Клітини інкубували упродовж 20-30 хвилин при 37"С і потім перерозчиняли в 200 мл селекційного середовища і культивували від трьох до чотири днів у колбах

Т175 перед висіванням у 96-ямкові планшети.

Клітини розподіляли по 9б-ямкових планшетах, використовуючи стандартні способи для максимізації клональності одержаних у результаті колоній. Після декількох днів культивування супернатанти збирали і проводили скринінгове дослідження. Скринінг гібридомних супернатантів, одержаних з мишей, імунізованих комплексом 512-ЕсЛІ-33, проводили способом на основі ЕГІ5А, використовуючи 96-ямкові планшети полістиролів ЕГІ5ЗА, пасивно покриті на ніч при 47С 0,5 мкг/м/Л

ЗТ2-РІад/піз, комплексованим до людського ІЇ-33. Для визначення специфічного зв'язування 512 проводили другий ЕГІЗА-скринінг, використовуючи 9б-ямкові планшети полістиролів, пасивно покриті на ніч при 4"С 10 мкг/мЛ нейтравідину. Потім планшети відмивали і завантажували 0,5 мкг/мл біотинільованого людського І33. За допомогою цього ЕГІЗА-скринінгу ідентифікували більше 1200 анти-5Т12 специфічних зв'язувальних елементів.

Скринінг гібридомних супернатантів, одержаних із мишей, імунізованих розчинним 512-Ес, для виявлення 5Т2-антигенспецифічних антитіл здійснювали способом флуоресцентного мікрооб'ємного дослідження (ЕМАТ), проводячи скринінг відносно рекомбінантних клітин НЕК29ЗТ, тимчасово трансфікованих повнорозмірним людським 512, і контрскринінг відносно хибнотрансфікованих клітин НЕК293Т. Коротко, клітини висівали у 384-ямкові планшети ЕМАТ в об'ємі 40 мкл/ямку зі густиною 6,000 5Т2-позитивних клітин/ямку і 14,000 хибнотрансфікованих 5Т2- негативних клітин/ямку. Потім додавали гібридомний супернатант і залишали для зв'язування на 1 годину при кімнатній температурі з подальшим відмиванням і вторинною детекцією з використанням вторинного антитіла до людського Ес-Су5. За допомогою даного ЕМАТ-скринінгу ідентифікували більше 2200 анти-5Т12 специфічних зв'язувальних елементів з гібридом, одержаних з мишей, імунізованих позаклітинним доменом 512.

Потім цю комбіновану панель з 3400 анти-5Т2 специфічних гібридомних супернатантів додатково досліджували на предмет здатності функціонально протидіяти передачі сигналу 512, застосовуючи аналіз вивільнення цитокіна інтерферон-у. Коротко, очищені людські мононуклеарні клітини периферійної крові (ОМКПК) або очищені людські МК-клітини висівали у 96-ямкові планшети для тканинного культивування і стимулювали людськими //-33 і 1-12, індукуючи вивільнення інтерферону-гамма в супернатант. Проводили кількісну оцінку рівнів інтерферону- гамма в супернатанті, і виявили, що вони прямо корелюють з ІІ-33/5Т2-залежною передачею сигналу. За допомогою цього біоаналізу зразки гібридом досліджували на предмет здатності блокувати вивільнення інтерферону-гамма за допомогою блокування сигнального шляху 512. За допомогою цього скринінгу ідентифікували 578 гібридомних супернатантів, одержаних унаслідок імунізації 5Т12-Ес, які пригнічують вивільнення інтерферону-гамма більше ніж на 8095. Додатково, ідентифікували 505 гібридомних супернатантів, одержаних унаслідок імунізації комплексом

ЗТ2ЕСЛІ -33, які пригнічують вивільнення інтерферону-гамма більше ніж на 7095.

Потім цю панель з 1083 гібридомних супернатантів додатково досліджували на предмет перехресно-реактивного зв'язування з 512 мишей і яванських макак, на предмет градації відносної афінності за допомогою обмеженого способу ЕГІЗА для антигенів, на предмет біохімічного блокування рецепторів/лігандів за допомогою ЕГІЗА, і на предмет ендогенного зв'язування за допомогою ЕАСз5, використовуючи клітинні лінії. Дані, одержані у цих вторинних дослідженнях, використовували для розділення великої панелі на 2 групи по 40 гібридомних ліній, які потім субклонували, нарощували їх клітинну масу і очищали.

Приклад 3: Визначення Ко

У цьому прикладі визначали афінність 5Т2-зв'язувальних антитіл. Проводили оцінку способом поверхневого плазмонного резонансу, використовуючи оптичний біосенсор Ргоїеоп ХРЕ-36, обладнаний сенсорним чіпом СІ С (Віо-Кай). Біосенсорний аналіз проводили при 25"7С у буферній системі НВ5-ЕР-- (1Х) (10 мМ НЕРЕЗ, рН 7,4, 150 мМ Масі, 3,0 мМ ЕДТК, 0,0595 сурфактанту Р20,

СЕ Неайсаге). До ін'єкції всі реагенти зберігали при 87С.

Козячий антилюдський /Ідс (специфічний до Ес-фрагмента, ЧУаскзоп ІттипоКезеагсй) іммобілізували на поверхні сенсора у вертикальному напрямку шляхом стандартного сполучення аміну на лініях 1-6 (4000 к.е.), а потім блокували етаноламіном. Антитіла іммобілізували (540-100 ке.) у вертикальному напрямку на лініях 1-5. Вертикальну лінію б залишали порожньою і використовували як контроль. Дані отримували для груп, що містять по 15 антитіл (три підгрупи по 5).

Реагенти 512 (людини або яванської макаки) доводили в робочому буфері до концентрації 25

НМ, а потім З-кратно розбавляли до 309 пМ. За допомогою одиничної ін'єкції в горизонтальному напрямку доставляли серії молекул 512, що містять їх повну концентрацію, використовуючи буфер для того, щоб укомплектувати ряд з шести зразків і забезпечити наявність потокового подвійного контролю для даних у відповідь. Швидкості асоціації (З хв) і дисоціації (30 хв) фіксували при швидкості потоку 100 мкЛ/хв.

Поверхню відновлювали при швидкості потоку 100 мкЛ/хв., використовуючи 10 мМ гліцину (рн 1,5, 30 мкл).

Дані коректували відносно базису, відбирали необхідні, вибудовували в ряд, віднімали контроль (іпегеро), а потім описували 111 моделлю зв'язування за допомогою РгоїєОп Мападег (версия 2.1.2.05). Результати наведені в Таблиці 4.

Таблиця 4

Афінність додаткових антитіл визначали, використовуючи трохи змінений протокол для плазмонного резонансу. Оцінку антитіл АБІ, Ар2, АБЗ ії АБ4 за допомогою поверхневого плазмонного резонансу проводили при 25"С, використовуючи вимірювальний прилад Віасоге 3000 (Віасоге Іпіегпайопа! АВ, Оррзаїа, Змєдеп), обладнаний сенсорним чіпом СМ5. Специфічні до Есу захоплюючі антитіла ковалентно іммобілізували у двох проточних вічках на чіпі СМА4, використовуючи стандартну реакцію сполучення аміну з НВ5З-ЕР (10 мМ НЕРЕЗ, рН 7,4, 150 мм масі, 3 мМ ЕДТК, 0,0595 сурфактанту Р20, СЕ Неаїйсаге) як робочий буфер. Коротко, кожне проточне вічко активували 1:1 (0/0) сумішшю з 0,1 М МНЗ5 і 0,4 М ЕДК. Козячий антилюдський Ід

АйіпіРиге, специфічне до Есу-фрагмента антитіло (Часкзхоп ІттипоКезеагсі Іпс., М/езі Стоме, РА), іммобілізували при 30 мкг/мл у 10 мМ ацетаті натрію, рН 5,0, із заданим рівнем у 3,000 к.е. на двох проточних вічках. Поверхні із залишковою активністю дезактивували за допомогою ін'єкції 1 М етаноламіну. Потім робочий буфер міняли на НВ5-ЕР я- 0,1 мг/мл БСА на всі етапи, що залишилися.

Всі антитіла готували в робочому буфері в потрійному екземплярі, З-кратно розбавляли і ін'єккгували так, щоб трихвилинна ін'єкція при 10 мкл/хв через випробувальне проточне вічко призводила до появи близько 75-90 одиниць відповіді антитіл, захоплених на поверхні випробувального проточного вічка. На поверхні контрольного проточного вічка захоплення антитіл не відбувалося. Потім 5Т2 людини або яванської макаки при різних концентраціях (200 нМ - 0,0914

НМ) разом з порожнім буфером проводили через два проточні вічка. Використовували швидкість потоку 50 мкл/хв. і двохвилинну фазу асоціації, за якою слідувала чотирихвилинна фаза дисоціації.

Після кожного циклу поверхні відновлювали 50 мкл ін'єкцією 10 мМ гліцину, рН 1,5. Потім свіжі антитіла іммобілізували на поверхні випробувального проточного вічка, щоб підготувати до наступного циклу. Окремий тривалий експеримент по дисоціації (60 хв.) проводили у трьох екземплярах при концентрації у 200 нМ.

Дані двічі коректували, віднімаючи спочатку контрольну поверхневу відповідь, щоб виключити зміну об'ємного коефіцієнта заломлення, а потім віднімаючи усереднену відповідь контрольного буфера, щоб виключити систематичні артефакти для експериментальних проточних вічок. Дані по 512 обробляли і описували у загальному випадку 1:11 моделлю взаємодії з локальним Кіптах за допомогою ВІА емаїЇчайоп Зоїмаге м 4.1. (Віасоге Іпіегпайопа! АВ, Оррзаїа, Змуєдеп). Визначали константи швидкості асоціації (Ка) ії дисоціації (Ка) ії використовували ці дані для розрахунку рівноважної константи дисоціації (Ко). Константи швидкості дисоціації і рівноважні константи дисоціації для АБІ, АБ2, АБЗ і АБ4А наведені у Таблиці 5.

Таблиця 5 61771111 |Макака//// 17 169406 | 19756047 117

Ара 0 |Макака///// 17 3605405 | 1605 77777322 47 63 0 |Макака///// 017 6би4ЕЮЮ5 | 85505 17777127 64 0 |Макака///// 17 250Е:06 | 1296-03... | 2 .ЮюЮюЮКЮ-чівшШшШ

Приклад 4: рН-чутливе зв'язування антитіл

Терапевтичні антитіла, які при низьких значеннях рН зв'язуються зі зниженою афінністю зі своїми мішенями, можуть мати посилені ФК властивості, які дозволяють здійснювати їх доставку менш часто або у нижчих дозуваннях. (Маї Віоїєснппої. 2010 28(11):1203-7 Т. Ідамжа еї а! Апіїроду гесусіїпуд Бу епдіпеегей рН-дерепаепі апіїдеп Біпаїіпу ітргоме5 Ше ашгайоп ої апіїдеп пешгаїї2айноп).

Це відбувається унаслідок вивільнення мішені антитілом при низькому рівні рН лізосоми з подальшою деградацією мішені і поверненням у цикл антитіла.

Проводили біосенсорний аналіз рН-чутливого зв'язування антитіл АБІ, АБ2, АБЗ і АБ4 за допомогою Віасоге 4000. Установка була аналогічною такій у Прикладі 3, в якому проводили визначення Ко для цих антитіл, за винятком того, що дані відповідали подвійній ін'єкції одиничної концентрації в 2,46 нМ антитіла а-512. Фіксували швидкість асоціації (5 хв.) при рН 7,4 і дисоціаціях (10 хв.) при рН 5,5 і 7,4 при швидкості потоку 30 мкЛ/хв. Дані з урахуванням віднятого контролю описували 1:11 моделлю за допомогою бсгибрег. Деякі з антитіл демонстрували набагато вищі швидкості дисоціації при нижчому рівні рН, як показано у Таблиці 6.

Таблиця 6 . Кратність зміни

Ар 71111 Ї17117171717175Б11 17711111 6б018 17777771

Ар 77777771 Ї771717171717171774 11 | 00000298. |..7777171711180с721С

Ара 7777111 Ї771717171717171755 7 77711 6000238 | ..//ЮюЮюЮИьИЙю-ЙСС

АБУ 77777711 Ї7717171717171755 017111 б0000791... | ..ЙЄЮКК

АБ Ї7711171717175Б111 1711111 06007 | 77777771

Приклад 5: Перехресне конкурування антитіл

Проведення експериментів по конкуруванню є стандартним способом характеристики епітопів.

Антитіла, які конкурують один з одним, можна вважати такими, які зв'язують одну і ту саму ділянку на мішені. У цьому Прикладі описаний спосіб визначення конкурування за зв'язування 512 і наведені результати, одержані згідно цього способу при його застосуванні до описаних у цьому описі антитіл.

Експерименти по сортуванню можна проводити різними способами, а спосіб, що застосовується, може чинити вплив на результати аналізу. Стандартним для даного способу є те, що 512 зазвичай зв'язується одним контрольним антитілом, а зондується іншим. У випадку, якщо контрольне антитіло запобігає зв'язуванню зондуючого антитіла, вважається, що антитіла належать одному сорту. Важливий порядок, в якому застосовують антитіла. Якщо антитіло А застосовується як контрольне антитіло і блокує зв'язування антитіла В, то зворотне не завжди є справедливим: антитіло В, що застосовується як контрольне антитіло, не обов'язково блокуватиме антитіло А. Існує багато чинників, які відіграють роль у цьому випадку: зв'язування антитілом може викликати конформаційні зміни мішені, які запобігають зв'язуванню другим антитілом, або епітопи, які перекриваються, але не повністю екранують один одного, можуть залишати можливість високоафінної взаємодії з мішенню для другого антитіла, що призводить до зв'язування. У загальному випадку, якщо конкурування спостерігається при будь-якому порядку, вважається, що антитіла належать одному сорту, і якщо обидва антитіла можуть блокувати один одного, то існує вірогідність того, що епітопи перекриваються у повнішій мірі.

У цьому Прикладі використовували модифікацію мультиплексного методу сортування, описаного в «Ла, еї а! (9. Іттипоїодіса! Метоавз, 288 (2004) 91-98). Використовували розчинний 5Т2-

ЕГАС Ні. Для мічених різним кодом покритих стрептавідином гранул І итіпех (Гитіпех, ЖІ 100-

Ї1ХХ-01, ХХ визначає код гранули) проводили інкубацію в 100 мкл розчину, що містить 6 пг/гранула біотинільованих моновалентних мишачих антилюдських захоплюючих антитіл до (ВО РПагтіпдеп, 555785 ), упродовж 1 години при кімнатній температурі у темряві, потім відмивали Зх ФОБА - фосфатно-сольовим буфером (ФСБ) плюс 195 бичачий сироватковий альбумін (БСА). Гранули, що несуть різні мітки, окремо інкубували з 100 мкл 1:10 розчину антитіл до 512 (покриваючі антитіла) упродовж 1 години, а потім відмивали. Гранули збирали, потім розподіляли в 96б-ямковому фільтрувальному планшеті (Мійїроге, ЯМ5ВММ1250). У лунки до половини додавали 100 мкл 2 мкг/мл 512, а в половину, що залишилася, - буфер, і інкубували впродовж 1 години, а потім відмивали. 100 мкл 1:10 розчину антитіл до 512 (детекторні антитіла) додавали в одну ямку з 512 і однією ямкою без 512, інкубували впродовж 1 години, а потім відмивали. Як негативний контроль використовували нерелевантний людський ІдсС (дЧаскбзоп, Ж009-000-003), а також умову, що відповідає відсутності антитіл (контроль). У кожну ямку додавали 20 мкл РЕ-кон'югованого моновалентного мишачого антилюдського ДС (ВО РІагтіпдеп, 25555787), інкубували впродовж 1 години, а потім відмивали. Гранули перерозчиняли в 75 мкл ФСОБА і за допомогою установки

ВіоРієх (ВіоКад) отримували щонайменше 100 сигналів/код.

Середню інтенсивність флуоресценції (СІФ) пари антитіл у відсутність 5712 віднімали від сигналу відповідної реакції за участю 512. Для пари антитіл, для яких приймається, що вони зв'язуються одночасно і, відповідно, належать різним сортам, величина реакції повинна відповідати двом критеріям: 1) величини мають бути у 2 рази більше, ніж для покриваючого антитіла, спареного з самим собою, нерелевантним або контрольним антитілом, залежно від того, яка з цих трьох величин є найбільшою, і 2) величини мають бути більше, ніж сигнал від детекторного антитіла, яке пов'язане з гранулою, покритою нерелевантними або контрольними антитілами. Було виявлено як мінімум три сорти антитіл, як показано у Таблиці 7, що наведена нижче.

Таблиця 7 ннннннШИ ГТ я ПО МТ Ге ПО ннннпІ"н:?ИШУІЬССПШИС жили тн 1111111 ФАВа5 77777777 |Сорт3////////// ФАБ2УЇГ/Г/://///:ИКЗПЖ8К 1111 ФАМаЕ 7 Ї1111111111111111111Ї1111111111111111 00001 ТФАВІЄ С ЇЇ ни ТТ Я ПОЛЯ ПО 001 ТФАМВ С Ї7111111111111111111Ї11111111111111111

САМ ЇЇ пи ГУ Я ПО ПО недо СТХ х п ПО КО 11011 ФАЯ 7 Ї1111111111111111111Ї11111111111111111

С ДАМ111111Ї111111111111111111Ї11 нн ГТ ТІ ПО ПО нд ГТх Я ПОЛЯ ПО

САМО Ї1111111111111111111Ї11111111111111111 0001 ТФАМЄ С Ї1111111111111111111Ї1111111111111111

СТАВ? Ї1111111111111111111Ї1111111111111111

ТАБ ЇЇ нн?"6:7ОЛИЇ УІШШШОООВВВВВВВВ ІВЛВІИОВОВОВВВНЯ І

СТАВ Ї1111111111111111111Ї1111111111111111

САМІ ЇЇ

СТАЮ Ї1111111111111111111Ї11111111111111111 недо СХ Сп ПО КО пи СУ: п ПОЛЯ ПО

Приклад 6: Аналіз блокування ІІ -33

Досліджували механізм дії антитіл до 512 за допомогою двох АІрпазЗсгееп5. Ці два способи застосовували в комбінації для того, щоб визначити, чи можуть антитіла пригнічувати зв'язування

І/-33 з 512 або, навпаки, чи можуть антитіла специфічно блокувати зв'язування корецепторів 512 і

АсР і у той же час не перешкоджати зв'язуванню ІІ -33 з 512. АІрпабсгееп є абревіатурою Атрійіей

Гитіпезсепі Ргохітйу Нотодепоизх Аззау 5сгееп (посилений люмінесцентний гомогенний аналіз).

У першому дослідженні оцінювали здатність антитіл блокувати зв'язування між І/-33 і 512. У цьому аналізі визначали здатність антитіл до 512 блокувати зв'язування біотинільованого людського ІЇ/-33 (спареного із стрептавідиновою донорною гранулою) з 6 х гістидин-міченим людським 512 (спареним з Мі-хелатною акцепторною гранулою). АІрпазсгееп-аналіз ІІ -33/5712 проводили, використовуючи 40 мкл реакції у 96-ямковому планшеті з половинним об'ємом ямок (Регкіп ЕІтег). Буфер для аналізу, який використовували для обох АІрпазЗсгееп5, містив 40 мМ

НЕРЕЗ (рН-7,4), 1 мМ Сасіг, 0,195 БСА, 0,0595 Твін-20 і 100 мМ Масі. Кожна ямка для аналізу містила 0,3 нМ біотинільованого людського 1І--33, 0,3 нМ людського 512-ЕН (ЕН є скороченням від

НГ АС- і 6 х Гістидин-міток), 10 мкг/мл покритих стрептавідином донорних гранул (РегКіп ЕІтег,

УМайшат, МА), 10 мкг/мл покритих Мі-хелатом акцепторних гранул (РегКіп ЕІптег) і 12,5 мкг/мл антитіл до 512. Після додавання всіх компонентів аналізу планшети інкубували протягом ночі в темряві при кімнатній температурі. Наступного дня планшети зчитували на мультирідері 2103

Епмізіоп (РегКіп ЕІтег). Лазерне збудження донорних гранул на 680 нм використовували для генерування активного кисню, який може ініціювати люмінесцентний/флуоресцентний каскад в акцепторних гранулах, які знаходяться в безпосередній близькості внаслідок взаємодії зв'язаних з гранулою білків, що призводить до випромінення світла, що реєструється на 570 нм.

У другому дослідженні оцінювали здатність антитіл пригнічувати ІІ -33-опосередковане зв'язування 5Т2 з ко-рецептором АсР. У цьому аналізі визначали здатність антитіл до 512 блокувати ІІ-33-опосередковане зв'язування біотинільованого людського 5Т12-Ес (спареного із стрептавідиновою донорною гранулою) з міченим 6 х гістидином людським АсР (спареним з Мі- хелатною акцепторною гранулою). АІрпазсгееп-аналіз 5Т2/АсР проводили в 8 мкл реакціях у 384- ямковому планшеті (оріїріаїє, Регкіп ЕІтег). Кожна ямка для аналізу містила 5 нМ людського ІІ -33,

НМ біотинільованого людського 512-Бс, 5 НМ людського АсР-ЕН, 10 мкг/мл покритих стрептавідином донорних гранул, 10 мкг/мл покритих Мі-хелатом акцепторних гранул і 12,5 мкг/мл антитіл до 512. Після додавання всіх компонентів аналізу планшети інкубували протягом ночі в темряві при кімнатній температурі. Наступного дня планшети зчитували на мультирідері 2103

Епмізіоп (Регкіп ЕІтег), використовуючи ті самі параметри, які наведені вище для першого дослідження.

Результати два АІрпазсгееп5 наведені нижче у Таблиці 8. Пригнічення для кожного з антитіл наведене у вигляді процентної долі пригнічення сигналу в АІрпазсгееп при застосуванні заданого антитіла в концентрації 12,5 мкг/мл відносно сигналу, отриманого у випадку, коли у лунці для аналізу не було антитіл. Деякі антитіла пригнічували взаємодію 512 і 1-33 у повнішій мірі, ніж вони пригнічували взаємодію 5Т2/ІІ-33/АсР, а деякі антитіла пригнічували взаємодію 5Т2/ЛІ-33/АсР. у повнішій мірі, ніж вони пригнічували взаємодію 5172 і ІІ -33. Всі антитіла пригнічували взаємодію І - 33 з 512 щонайменше на 5095.

Таблиця 8 мкг/мл ЗТ2-АсР АБЗ 12,5 мкг/мл

Приклад 7: Іп Міїго біоаналіз людського ІІ-33

Приклади людських 512 тАБр5 досліджували у ході людського біоаналізу із застосуванням очищених Т-клітин СО4-ж, що одержані від різних донорів і стимульованих людським 1-33 і людським 1-2. Процедура аналізу полягає у наступному. Клітини висівають у кількості 250.000 клітин на ямку у 60 мкл об'єм у 96-ямковий планшет з круглим дном. Після попередньої інкубації в кожну ямку додають 30 мкл 4х суміші пи -2 -- пи -33. Загальний об'єм у 96-ямковому планшеті з круглим дном складає 120 мкл. Починають із концентрації антитіл у 20 мкг/мл і проводять розбавлення в пропорції 1:3, щоб одержати 10-точкову криву. Процедуру проводять 4х у 30 мкл.

Після попередньої інкубації антитіл з клітинами в кожну ямку додають 30 мкл 4х суміші з пи -2 -- пи -33. Витримують при 37"С, 595 СО02 упродовж 48 годин. Супернатанти збирають. Аналізують пригнічення 1-5 пи -5 за допомогою ЕГІЗА.

На Фігурі З показано пригнічення 512 тАбрв ІІ-3З-індукованого вироблення І/-5 СО4- Т- клітинами, отриманими від різних донорів. Лінія (--) відповідає значенню позитивного контролю людського 1-33 у комбінації з людським ІЇ-2 у відсутність пригнічення. (:»: ) відповідає значенню позитивного контролю людського ІІ -2. Лінія (- - ) відповідає середньому контрольному значенню.

Людські Т-клітини СО4- заздалегідь інкубували впродовж 30 хвилин з анти-5Т2 тАбр», а потім стимулювали впродовж 48 годин людським 1-33 (4 нг/мл) і людським 1-2 (10 нг/мл). На Фіг. З показано, що антитіла до 512 здатні пригнічувати індуковану людським 1-33 активацію 512, що визначене по виробленню 1-5 СО4- Т-клітинами. Антитіла до 5712 виявилися здатні протидіяти індукованому 1-33 виробленню 1-5 СО4-- Т-клітинами з величинами ІС50, що становлять близько «100 нМ. У Таблиці 9 наведені типові величини для ІС50.

Таблиця 9

ІСБО ни шининнинниншнши: шишшшшш ог 68011 нини нини

Приклад 8: Аналіз вивільнення ІЕМу СО4.- Т-клітинами яванських макак

Мононуклеарні клітини периферійної крові (МКПК) яванських макак збагачували з нормальної донорської периферійної крові, обробленої кислою цитрат-декстрозою (КЦД), за допомогою градієнтного центрифугування ІЗОЇ УМРН (Саїйага-5спієзіпдег Іпадивійев, Ріаіпміему, МУ). Подальше виділення СО4-- Т-клітин яванських макак проводили за допомогою набору для виділення СО4-- Т- клітин яванських макак від Мікепуї Віоїес. Виділені СО4-- Т-клітини макак (2х10» клітин/ямку в 96-

ямкових планшетах) інкубували з очищеними моноклональними антитілами при різних концентраціях упродовж 30 хвилин при кімнатній температурі, а потім стимулювали 1-33 (10 нг/мЛ), 1С-2 (10 нг/мл) ї І-12р70 (50 нг/мЛ) упродовж вісімдесяти чотири годин. Потім одержані в результаті безклітинні супернатанти культури СО4- Т-клітин яванських макак аналізували на предмет присутності ІЕМу яванських макак за допомогою ЕГІЗБА (приклади даних наведені у

Таблиці 10). Ефективність очищених моноклональних антитіл визначали в процесі дослідження вивільнення ІЕМу СО4-- Т-клітинами яванських макак, узятими від трьох різних донорів.

Таблиця 10 11111111 Величини! 17771711 пМссСсСсСсСс2С

Приклад 9: Аналіз вивільнення 1-8 еозинофілами людини

Людські еритроцити і гранулоцити збагачували з гепаринізованої нормальної донорської периферійної крові за допомогою градієнтного центрифугування ІЗОЇ УМРН (Заїїага-5сНіевзіпдег

Іпдивійев, Ріаіпміем, МУ). Еритроцити видаляли, використовуючи лізуючий буфер, АСК (бібсо,

Сапізрад, СА). Подальше виділення еозинофілів проводили за допомогою набору для виділення еозинофілів від Мінкепуї Віоїес. Виділені еозинофіли (2х107 клітин/'ямку у 96-ямкових планшетах) інкубували з неклональними або клональними супернатантами з різною мірою розведення або з очищеними моноклональними антитілами при різних концентраціях упродовж 30 хвилин при кімнатній температурі, а потім стимулювали 1-33 (2 нг/мл) і 1-3 (100 нг/мЛ) упродовж трьох днів.

Потім одержані в результаті безклітинні супернатанти культури еозинофілів аналізували на предмет присутності І/-8 за допомогою ЕЇГІ5А. Приклади даних наведені у Таблиці 11.

Ефективність очищених моноклональних антитіл визначали в процесі дослідження вивільнення ЇЇ - 8 еозинофілами, взятими від трьох різних донорів.

Таблиця 11 ни: нини или т пиши

Приклад 10: Ефективність антитіл до 512 порівняно з комерційно доступними антитілами

Дослідження залежності доза-ефект для людського 1-33 у людських МК-клітинах

Первинні СО56б-позитивні людські МК-клітини (5 х 10е4 клітин) обробляли людським 1-12 (1 нг/мЛ), додаючи кількості людського 1-33, що збільшуються, як показано на Фіг. 4. Через двадцять чотири години безклітинні супернатанти збирали і вимірювали концентрацію ІЄМ-у, використовуючи комерційний способ аналізу (КО Зувіетв). 10 нг/мЛ І--33 використовували як стимулюючу дозу для пригнічення антитілами до 512.

Пригнічення активності ІІ -33 антитілами

Людські МК-клітини стимулювали як описано вище. За тридцять хвилин до додавання ЇЇ -33 і ЇЇ - 12 у клітини додавали антитіла до 512 у концентраціях, наведених на Фіг. 5. Через двадцять дві години після обробки 1-33 безклітинні супернатанти збирали і вимірювали концентрацію ІЕМ-у, використовуючи комерційний метод аналізу (КО Зузіетв5). Назви клонів вказані для комерційно доступних антитіл. Лише Ар2 повністю пригнічувало І/-33-залежна ІЄМ-у-відповідь і виявилося істотно ефективнішим, ніж будь-яке з комерційно доступних антитіл пи5Т2. Величини ІС5О, що відповідають кожному антитілу, наведені в Таблиці 12.

Таблиця 12

Приклад 11: Аланін/аргінін скануючий мутагенез 572

Цей приклад характеризує антитіла до 512 на основі дії мутагенезу 512 на їх здатність зв'язувати мішень. Попередні дані по зв'язуванню вказують на те, що за зв'язування антитіл відповідають головним чином домени 1 і 2 5712 у випадку панелі антитіл, яку аналізували за допомогою скануючого мутагенезу 512 у цьому Прикладі. Таким чином, у випадку повнорозмірного

З12 при конструюванні мутаційних ділянок у структурному відношенні враховували лише домени 1 і 2 (0102) 512.

Координати комплексної моделі 512 і 1-33 отримали з І іпдеї еї аї!., Зігисіиге (Гопаоп, Епдіапа: 1993). ЕІбвемієї а 17, 1398-410. Сприйнятливість до розчинника, що доводиться на кожен залишок бічного ланцюга 512, розраховували за допомогою Моїіесшаг Орегаїйпуд Епмігоптепі (Моїіесшіаг

Орегаїіпа Епмігоптепі (МОЄ), 2011.10; Спетіса! Сотриййпа Стор Іпс., 1010 ЗпегтооКе 51. М/еві,

Зийе 2910, Мопітєаії, ОС, Сапада, НЗА 287, 2011.). Потім ці значення сприйнятливості до розчинника використовували при виборі поверхневих залишків 0102 для мутагенезу, вибираючи спочатку всі залишки 0102, що мають відкриті ділянки бічного ланцюга з площею у щонайменше 10

Аг, або залишки гліцину із загальною відкритою площею у щонайменше 10 Аг. Залишки гліцину, що мають позитивне значення кута Фі, видаляли, як і залишки проліну, оскільки існує висока вірогідність того, що мутації у цих позиціях призведуть до спотворення локальної білкової структури. Залишки цистеїну також видаляли з вибірки для збереження дисульфідних зв'язків.

Залишок А82 видалили після візуальної перевірки. За допомогою даного методу отримали перелік із 140 залишків для мутагенезу. Всі залишки були замінені аргініном за винятком залишків аргініну і лізину, які були замінені аланіном.

Всі конструкції мутантів батьківського Нібз-Амі-міченого позаклітинного домену (ВКД) 512 у векторі рТТ5 експресували у тимчасово трансфікованих суспензійних клітинах 293-6Е (МАСС) у 24- ямкових планшетах. Іп-мімо біотинілювання здійснювали за допомогою котрансфекції ВА А у вектор рТТ5. Для видалення надлишку біотину супернатанти діалізували з ФСБ.

Для визначення зв'язування антитіл до 512 з точковими мутаціями в 512 використовували аналіз зв'язування ВіоРіех. Біотінільовані мутанти зв'язували з 80 міченими різним кодом покритими стрептавідином гранулами (Гитіпех, ЖІ 100-І1ХХ-01, ХХ визначає код гранули).

Наявність 80 різних код для гранул надала можливість об'єднати дві групи по 70 мутантів у загальну групу з 140. Кожна група містила 6 батьківських контрольних проб, З контрольних проби, що містять нерелевантний білок, і одну порожню контрольну пробу. Зв'язування антитіл з білком мутанта порівнювали зі зв'язуванням антитіл з батьківським білком. 100 мкл 1:7 розчину мутантів 512, батьківських і контрольних проб, заздалегідь зв'язаних з гранулами, або розчину, що не містить білка, відмивали 5Х ФСБ 195 БСА, збирали і розділяли на аліквоти у 96-ямковому фільтрувальному планшеті (Міїроге), а потім знову відмивали. Додавали по 100 мкл З-кратного розчину антитіл до 5712, щоб втричі збільшити об'єм ямок, інкубували упродовж 1 години при КТ і відмивали. У кожну ямку додавали 100 мкл 1:500 розчину РЕ- кон'югованого антилюдського Ідс Ес (даскбоп, йЖ109-116-170), інкубували впродовж 0,5 годин і відмивали. Гранули перерозчиняли у 75 мкЛ, струшували протягом щонайменше З хвилин і зчитували на ВіоРіех.

Перед проведенням аналізу зв'язування проводили валідаційний експеримент, щоб визначити варіабельність "ділянки гранули" до "ділянки гранули" (Г-Г). У цьому валідаційному експерименті всі гранули кон'югували з одним і тим самим контрольним білком дикого типу. Отже, відмінності між ділянками гранул були пов'язані виключно з мінливістю Г-г, а не викликані відмінностями між білками дикого типу і мутантами. Титрування антитіл проводили для дванадцяти реплік у різних лунках.

Метою даного статистичного аналізу була оцінка Г-Г варіабельності розрахункової величини

ЕС5О для кривих зв'язування. Розрахункове стандартне відхилення (СО) для Г-Г потім використовували для побудови довірчих інтервалів величини ЕС5О для білків дикого типу і мутантних у ході експериментів по порівнянню кривих.

Дані по зв'язуванню для кожної ділянки гранули описували логістичною моделлю з чотирма параметрами. Результуючий файл "зитоці.хів", що містить результати контролю якості (КЯ) і оцінки параметрів для найбільшого значення (тах), найменшого значення (тіп), кута нахилу (5іІоре) і натурального логарифма ЕС5О (хтій) для кривих, використовували як вихідні дані для аналізу.

Потім оцінювали Г-Г варіабельність для кожного з параметрів за допомогою моделі зі змішаними ефектами, використовуючи процедуру БАЗ РКОС МІХЕО. В аналіз були включені лише ті криві, які мали "хороший" КЯ-статус. Кінцева модель із змішаними ефектами містила як випадковий ефект лише залишок (тобто, окремі ділянки гранул). Межа середнього (МС) для кожного параметра також оцінювали за допомогою моделі із змішаними ефектами. СО для Г-Г розраховували, витягаючи квадратний корінь з Г-Г варіації. Також розраховували кратність зміни між МС я 2СО і МС - 200, яка відповідає близько верхньому і нижньому 97,5-му процентилю популяції.

Для визначення мутантів, які порівняно з контролем дикого типу не демонстрували значної відповіді, визначали і позначали як Нітах мутантів, для яких максимальне значення (МЕЇ) складає менше 3095 від максимального значення (МЕ) для контролю дикого типу.

Порівнювали величини ЕС5О кривих зв'язування мутантів і кривих зв'язування білків дикого типу. Статистично значні відмінності визначали як результати для подальшого розгляду. Криві з мітками "пої і "радії" виключили з цього аналізу.

При порівнянні розрахункових величин ЕС5О враховували два джерела варіацій - варіацію з підбору кривої і варіацію гранула-гранула. Білки дикого типу і білки мутантів поєднували з різними гранулами, оскільки їх відмінності обумовлені відмінностями гранула-гранула. Варіацію підбору кривої оцінювали за допомогою стандартної погрішності розрахункових величин Ід ЕС50. Варіацію гранула-гранула визначали експериментально, проводячи експеримент, в якому контрольні білки дикого типу зв'язували з кожною з гранул. Пов'язану з гранулами варіацію у розрахункових величинах ЕС5О кривих зв'язування білків дикого типу у цьому експерименті використовували для розрахунку варіації гранула-гранула у поточному експерименті по картуванню.

Порівняння двох значень ЕС5О (у логарифмічній шкалі) проводили, використовуючи І-критерій

Стьюдента. Ї-статистику визначали як співвідношення між дельтою (абсолютна різниця між розрахунковими величинами ЕС50) і стандартним відхиленням дельта. Дисперсію дельта оцінювали по сумі з трьох компонентів - оцінкової дисперсії ЕС50 для кривих білків мутантів і білків дикого типу, що характеризуються нелінійною регресією, і подвійної дисперсії гранула-гранула, визначеною в окремому експерименті. Множення на дві дисперсії гранула-гранула відбувається внаслідок припущення, що гранули мутантів і гранули дикого типу мають однакову дисперсію.

Ступені свободи стандартного відхилення дельти розраховували, використовуючи апроксимацію Саттертвайта (1946).

Індивідуальні р-значения і довірчі інтервали (9595 і 9995) отримували на основі розподілу

Стьюдента для кожного порівняння.

У випадку великої кількості контролів дикого типу використовували консервативний підхід, в якому вибирали контроль дикого типу, який був найбільш схожий з мутантом, тобто, вибирали ті зразки, які мали найбільші р-значения.

Множинні коректування важливі для того, щоб контролювати псевдопозитивні результати при одночасному проведенні великої кількості досліджень. У даному аналізі застосовували два види множинних коректувань: контроль помилки з поправкою на ефект множинних порівнянь (ЕУМЕ) і контроль долі псевдопозитивних результатів (ОК). У підході ЕМУЕ контролюється можливість того, що один або більше результатів є помилковими; у підході ЕОМК контролюється очікуваний вміст псевдопозитивних результатів серед вибраних результатів. Перший підхід є консервативнішим і менш ефективнішим, ніж останній. Існує множина методів, доступних для обох підходів; для цього дослідження ми вибрали метод Хохберга (1988) для аналізу ЕМ/УЕ і РОК-метод Бенджаміні-

Хохберга (1995) для аналізу ЕОР. Скоректовані р-значення для обох підходів розраховували як для кожного антитіла, так і для аналізу в цілому.

Мутант вважали таким, що чинить вплив, за наступними критеріями: 1) якщо для цього мутанта одержували погане узгодження або не отримували узгодження результатів, 2) якщо мутант був вибраний за критерієм Ніїтах, 3) якщо р-значення для помилки з поправкою на ефект множинних порівнянь склало менше 0,01 або 4) якщо значення Втах склало більше, ніж 20095 від батьківського. Результат визначали як інгібітор, якщо його вплив призводив до зниження Втах або збільшенню значення ЕС5БО, результат визначали як активатор, якщо він призводив до збільшення

Втах або зниженню значення ЕС5О. 8 мутацій виключили із списку збігів через їх вплив на 59095 досліджуваних антитіл, серед них: КЗ7А, ВАбА, Юб6ЗНА, М718, С10О6Н, К112А, М1328, 0137 і 1418.

Результати аналізу наведені к Таблицях 13 і 14.

Таблиця 13

Активу

Ар Со Інгібуючі мутанти юЧІі рт мутант и

Таблиця 13

Активу

Со . . ючі

Ар рт Інгібуючі мутанти мутант и

ГБЗА, др) (148, И5В, 8338, Е4ЗВ, МА7В, АЄ2Н, С5В, Т798, 0928, 0978, МІ04НВ, СІЗВА, | В72А, 2 МІ152В, М1768 573 ргов,

І БЗВ, др). |53В, Е1ОВ, 5, 5338, Е4ЗВ, МА7В, Аб2В, С65В, Е76В, Т798, 0928, 0978, У1О4В,| МВА,

З Т1248, КІЗ1А, 01348, С1388, Е147В, М1768, М1848 ВА, тів2в до. |83В, 158, УЗ2В, 533В, Е4ЗВ, М47В, 55ОВ, КББА, АбОВ, С5В, Т798, 0928, У9БВ, вто 32 | 1 | 0978, 1048, Е1288, 01348, СІЗ88, 21468, 1478, М1768 др |83В, 15, УЗ2В, 5338, ТЗ5А, ЗВ, МАВ, 5508, КББА, АВ, БВ, Т79В, 0928, вто 33 | 1 |Мо958, 0978, М104Н, Е1288, О134В, С1З88, 51468, 1478, М1528, 1768

АБ. |Б5ЗАИЛАН,уУ2бА, ЗА, ТЗБА,Е4ЗА МАТ АбоВ,СбБА, 7, рег МОН, б1ЗВА, ТЯ ВА | 7 |3В,Е1478,М1528М1768, 1848

УУ7В,

ЕТОВ,

І148,

ОІВ,

Е4ЗВ, т79В, ль о 8БОВ, 51758 Ця

Т1778 міваВ

К1І8БА

КА,

ОВ,

УУ7В,

ЕТОВ,

І148, и 5В,

ОІВ, у268,

Е4ЗВ, т79В,

Мо

В, ль » А49В, 85ОВ, І7ОВ, 5175В, БІВІТА М де

М11ов

Т1г4В

К14БА

Т1778 міваВ

КІ85БА

Таблиця 13

Активу

Со : . ючі

Ар рт Інгібуючі мутанти мутант и ізн; ТИП

З

29 А1728

Таблиця 14

КТА, Г28, 538, КАА, О5В8, 56, М/7В, 198, ЕТОВ, МІТА, ЕТ12В, АТ1ЗВ, М16НВ, А17А, Р2ОА,

О218, К2ЗА, 5258, 268, М28Н8, 0298, 318, 328, 034, ТЗ35В, МЗбЕ, 5388, ТАТА, 0428, В44А, МА5В, А49В, 5508, 2518, 0528, К5ОБА, 1578, ЕбОВ, МОВ, 5648, ІббВ,

У67В, Т688, 1708, Т75Н8, Е768, М77В, А78А, 80, 81, М8ЗА, Т85Н, у87В, КВ8ВА, дьо КВОА, 090, 5918, М94В, М958, 988, МІООВ, Мт1О18, 51028, ТОВ, 51078, ЕТО8В,

КТО9А, МІ1тТОВ, м1148, Т1178, 01198, 11208, М1218, М1228, М/1238, Т1248, Е1288,

Е1ЗОВ, КІЗТА, 01348, А1З35В, 51398, А140А, В142А, А143В8, НІ44В, К145А, 51468,

Е1478, М1498, 01518, М154Н8, Т1558 Е1568, А158Н8, 01608, Т1628, К164А, І1668,

НІ1678, М1688, М170О8, А1728, М17ЗВ, М174В, 51758, Т177В, В180А, 51818, Т1838,

М1848, КІ85А, 01868, Е187В8

КТА, Г2В8, К4А, О5НВ, 568, М/7В, 198, М118, ЕТ12А, АТЗ, 1148, М16В, В17А, В2ОА,

О218, К2ЗА, 5258, 268, М28Н8, 318, 328, 034, ТЗ35В, МЗбВ, 5388, ТА1В, 0428,

В44А, М45НВ, А498, 5508, 2518, 0528, КББА, І 578, ЕбОН, 5648, ІЄ6В, У67В, Т688,

І7ОВ8, 573, 7758, М77В, В78А, п8ОР, 818, М8ЗЕА, Т858, У87В, КВ8ВА, КВЗА, 0908,

АрЗ 5918, МО4В, М95А, 988, МІООВ, Мт1018, 51028, Т1ОЗВ, 51078, ЕТО8ЕА, КТО9А, МІ11ОВ,

У1148, Т1178, 01198, 11208, 1218, М1228, М/1238, Е1288, Е1ЗОВ, А135В, 51398,

В140А, В142А, АТ4ЗВ, НІ44В, К145А, 51468, М1498, 01518, М1528, М1548, Т155Н8,

Е1568, А1588, 01608, К164А, І1668, НІ67В, М1688, М170В, А1728, М17ЗВ, м1748, 51758, 11778, ВІ80А, 51818, Т1838, К1І85А, 01868, Е1878

КТА, Р2В8, К4А, О5НВ, 568, М/7В, 198, ЕТОВ, МТА, ЕТ2А, АТЗ, І 148, М16Н, А17А,

В20А, 0218, К2ЗА, 5258, 268, М288, 318, 0348, ТЗ35В, МЗбА, 5388, ТАТ, 0428,

В44А, МА5В8, А498, 2518, О528, 1538, 1578, ЕбОВ, М61В, 5648, ІЄ6В, У67В, Т688,

І7ОВ, 573, 1758, Е76В, М77В, В78А, 2808, 818, М8ЗА, Т85НВ, 878, КВВА, КВОА,

Арз2г 1О908, 5918, МО4ВА, 988, МІООВ, М1018, 51028, Т1ОЗВ, 51078, ЕТО8В, КТО9А, М11ОВ,

У1148, Т1178, 01198, 11208, М1218, М1228, М1238, Т1248, Е130В, КІЗ1А, А1З5В,

З1398, А140А, А142А, А143В8, НІ44В, К145А, М1498, 01518, М1528, М154Н, Т155Н,

Е1568, А1588, 01608, Т162Н, К164А, І1668, НІ67В, М168Н8, М1708, А1728, М17ЗВ,

У1748, 51758, 11778, В180А, 51818, Т1838, М1848, КІ85А, 01868, Е1878

В20А, 0218, К2ЗА, 5258, 268, М288, 318, 0348, МЗбА, 5388, ТАТВ, 0428, ВАЧА,

М45В, А498, 2518, 0528, 1538, 1578, ЕбОВ, МОВ, 5648, ІЄЄВ, У67В, Т688, 1708,

З7ЗВ, Т758, Е76В, М77В, А78А, 80, У81в, М8ЗА, Т85Н8, У87В, КВВА, КВОА, 0908,

АрЗзЗз 15918, М94В8, 988, МІООВ, М1018, 51028, Т1ОЗВ, 51078, ЕТО8В, КТО9А, МІТОВ,

У1148, Т1178, 01198, 11208, 1218, М1228, М/1238, Т1248, Е130В, К131А, А1З35В,

З1398, А140А, А142А, АТ14З3В, НІ44В8, К145А, М1498, 01518, М1548, Т1558, Е156Н,

А1588, 01608, Т162Н, К164А, І1668, НІ67В, М1688, М1708, А1728, М17ЗВ, м1748, 51758, 11778, В180А, 51818, Т1838, М1848, КІ85А, 01868, Е187А

КТА, Р2В8, К4А, О5НВ, 568, М/7В, 198, ЕТОВ, МІТА, ЕТ12А, АТЗ, 158, М16В, В17А,

В20А, 0218, К2ЗА, 5258, М288, 0298, УЗ1В, 328, 0348, МЗб6В, 5388, ТАТА, 0428,

В44А, М45НВ, А498, 5508, 2518, О52Н, І 538, КББА, І 578, ЕбОВ, Мб61Н, 5648, ІбЄВ,

У67В, Т688, 1708, 573, Т758, г76В, М77В, В78А, 2808, 818, М8ЗВ, Т85Н8, У87В, дьЬЗО КВ8А, КВОА, 090, 5918, М94В, М958, 0978, 988, МІООВ, Мт1О1в8, 51028, 1038, 51078, ЕТО8В, КТО9А, М1ТОВ, м1148, Т1178, 01198, 11208, М1218, М1228, М/1238,

Т1248, Е1288, Е1З3ОВ, КІЗ1А, 01348, АТ1З35В, 51398, В140А, В142А, НІ1Т44В, К145А, 1468, М1498, 01518, М154В, Т1558, Е1568, АТ1588, 0160, Т162Н, К164А, І1668,

К185А, 01868, Е187В

Таблиця 14

КТА, Г28, 538, КАА, О5В8, 56, 198, МІ118, ЕТ2НВ, АТЗ, І158, М16НВ, А17А, В2ОА, К2ЗА, 525, 268, М288, 0298, У31в, 328, 533, 034, 35, МЗбА, 5388, ТА1В, 0428,

В44А, М45Н8, М47В8, А49В, 2518, О52Н, І 538, КББА, І 578, ЕбОВ, Мб1Н8, Аб2В, 5648, са65В, Іб6В, 678, Т68В, 1708, В72А, 573, Т758, Е76В, М77В, В78А, 2808, х818, дЬ М8ЗЕА, Т858, У87В, КВ8А, КВОЗА, 090, 5918, 928, МО4В, М95В, 0978, 988, МІВ, 1018, 51028, Т1ОЗА, М1048, 51078, ЕТО8В, КТО9А, м114Н8, Т1178, 01198, 11208,

Уу1218, М1228, М/1238, Т1248, Е128Н, Е1308, КІЗ1А, 01348, А1358, Сс1388, 51398,

В140А, В142А, АТ4ЗВ, НІ44В, К145А, 51468, 1478, М1498, 01518, М1528, М1548,

Т1558, Е156Н8, А158Н8, 0160Н, Т1628, К164А, І1668, НІ167В, М1688, М17ОВ8, А1728,

М17ЗВ8, м174В8, М1768, В180А, 51818, Т1838, 01868, Е1878

КТА, Р28, 538, ЗБЕ, 198, МІ11В, ЕТ2В, АТЗ, М16В, В17А, Н2ОА, К2ЗА, 5258, М288, ргов, 318, 328, 533, 034, ТЗ35А, МЗбА, 5388, ТА1В, 0428, В44А, МА5В, М47В,

Са518, 0528, І 538, КББА, 1578, ЕбОВ, М618, Аб2Е, 5648, 65, ІббР, 678, Т688,

І7ОВ8, В72А, 5738, Т758, Е76В8, М77В, В78А, во, 818, М8ЗЕА, Т858, 87, КВВА,

АрІО |КВ8ОА, 090, 5918, 0928, МО4НВ, М958, 0978, МО88, М1018, 51028, Т1ОЗВ, М1048, 51078, ЕТО8В, У1148, Т1178, 01198, 11208, 1218, М1228, М/1238, Е1288, Е1ЗОВ,

К1ІЗТА, 01348, А1З35В, с1388, 51398, В140А, В142А, АТ4З3В, НІ44Н8, 51468, Е147В,

М1498, 01518, М152Н8, М154Н, Т1558, Е1568, А158Н, 01608, Т1628, К164А, І1668,

НІ67В8, М1688, А1728, М17ЗВ, У174Н, М176Н, Н180А, Т183Н8, 01868, Е187А

КТА, Г28, 538, КАА, О5В8, 56, М/7В, 198, ЕТОВ, Е12В, АТЗА, 1148, І15В, М16В, В17А,

В20А, 0218, К2ЗА, 5258, 268, М288, 0298, У318, 32, 533, 0348, ТЗ35А, Мб,

ЗЗ88, ТА1В, 0428, Е4ЗВ, ВА4А, М458, А49В, 2518, О52Н, І 538, К5БА, І 578, ЕбОВ,

М618, Аб2Н, 5648, С65В, ІбЄЄВ, Т688, 1708, В72А, 5738, Т75Н8, Е768, М77В, В7ВА, дьга т798, 808, У818, Т85Н8, 878, КВВА, КВОА, О90Н, 5918, 0928, М94В, М95НВ, 0978,

У988, МІООВ, 1018, 51028, ТОВ, 51078, ЕТО8В8, КТО9А, М11ОВ, м114Н, Т1178, рі198, м1218, М1228, М/1238, Т1248, Е1288, Е1ЗОВ, КІЗ1А, 01348, А135В, В140А,

В142А, АТ4З3В, НІ44Н8, К145А, М149Н, 01518, М1528, М154Н, Т155Н, Е156Н8, А1588, р1ібов, 1628, К164А, 11668, НІ67В, М1688, М1708, М17З3В8, М1748, 51758, М1768,

Т177В, ВІ80А, 51818, 1838, М1848, К1І85А, 01868, Е187А

Приклад 12: Аналіз воднево-дейтерієвого обміну (НОХ)

У цьому Прикладі АбБа2 зв'язували з 512 і визначали ефект від зв'язування за допомогою НОХ.

Розчинний білок 512 (домени 1-3, що містять амінокислоти 19-322 з 5ЕО ІО МО) з РІ Аа- міткою і Ніб-міткою у С-кінці тимчасово експресували в клітинах 293-6Е ссавців, очищали за допомогою ІМАС (афінній хроматографії на іммобілізованих іонах металу) і додатково очищали за допомогою препаративної 5ЕС (ексклюзійної хроматографії). Потім білок концентрували до 3,5 мг/мл, використовуючи ультра-фільтрацію. Антитіло до 512 - Ар2 експресували у сконструйованих клітинах СНО-С59 і очищали за допомогою афінної хроматографії з протеїном А і послідовною препаративною 5ЕС. Аналітичні 5ЕС використовували для визначення того, що молярне співвідношення антитілогантиген 0,75:1,00 є оптимальним, щоб гарантувати повне зв'язування білка 5712 антитілом. Вільний білок 572 і комплекс антиген-антитіло зберігали у ФОБ-буфері, рн 7,2.

НОХ експеримент проводили за допомогою автоматизованої НОХ-системи (2папод, 2Ппапо еї а). 2012). Коротко, процес обміну Н/О починається з розведення 5 мкЛ розчину вільного білка 512 (3,5 мг/мЛ) або комплексу 5ЗТ2-антитіло (з концентрацією |5Т2 у 3,5 мг/мЛ, співвідношенням антиген:антитіло 1:0,75) у 25 мкЛ буфера 02О в 100 мМ ФСБ, рн 7,2, який готували, розчиняючи пігулку ФСБ у 020 воді при 25"С. Реакцію обміну інкубували упродовж різного часу мічення (30 секунд, 2, 8, 30 хвилин і 2, 8 годин) для кожного НОХ експерименту, а реакцію мічення завершували за допомогою змішування 20 МКкл розчину, що мітить, З 80 МКкл завершуючого/денатуючого/відновлювального буфера (7,25 М сечовини і 625 мМ трис(2- карбоксиетил) фосфіна (ТКЕФ), 0,45 М гліцину, рН 2,7) при 17С. мкЛ аліквоту отриманого розчину переносили в 120 мкЛ розчин, що містить 0,4 мг/мЛл свиного пепсину (бідта, 51. І оці, МО). Розщеплюючий розчин негайно ін'єктували у пробовідбірну петлю при 1"С і залишали на б хв для повного розщеплювання. Далі гідролізат розділяли колонками С18 (З колонки у ряду, ВЕН С18, 2,1 ммх5 мм, УУаїєт5 Согр., Мійога, МА). НРІ С- сепарацію проводили при 17С з 5-хв. градієнтом АСМ у 1-4095. Елюент С аналізували за допомогою мас-спектрометра Огбйгар Еїйе (Тпегто 5сіепійіс, Зап доз5е, СА) у залежному від даних

І С-М5/М5 експерименті.

Введення дейтерієвої мітки, завершення реакції, протеолітичне розщеплювання і ін'єктування проводили за допомогою системи ГЕАР НО-Х РАЇ, керованою ГЕАР ЗпПеїї5 (ГЕАР Тесппоїподіев,

Сатпбого, МС).

Експерименти повторювали тричі, а в кожному експерименті вимірювання для кожної часової точки проводили двічі. У зразки додавали стандартну пептидну суміш, щоб відстежувати і коректувати варіабельність, пов'язану із зворотним обміном. Суміш містить три пептиди: брадикінін, ангіотензин І і лейцин-енкефалін. Спеціально сконструйований тетрапептид РРРІ (синтезований АпазЗрес, Егетопі, СА) використовували як другий внутрішній стандарт для мінімізації варіабельності, пов'язаною з проведенням великої кількості експериментів. Також як контроль аналізували розщеплювання білка 512 у відсутність Н/О обміну.

Файли, що містять результуючі дані, обробляли за допомогою програми МаззАпаїуег (7Напо, 7папуд єї а). 2012). Це програмне забезпечення дозволяє визначати пептиди з продуктів розщеплювання антигена, розраховувати швидкість обміну для кожного пептиду, коректувати дані з урахуванням інформації по зворотному обміну, отриманої за допомогою внутрішніх стандартів, і описувати дані моделлю, яка кожному залишку присвоює фактор захисту.

Порівняння змінних профілів для вільного 512 і зв'язаного антитілом 572 виявило дві ділянки, що представляють інтерес, які потенційно можуть бути епітопами. Дві ділянки у послідовності 512 були визначені як ІМАСРАВОСКРБ5БУ (амінокислоти 33-44 з БЕО ІЮ МО", відповідні амінокислотам 15-26 зрілого 512) і ІМА5РТЕ (амінокислоти 88-94 з БЕО ІЮО МО, відповідні амінокислотам 70-76 зрілого 512) за допомогою великої кількості пептидів, що перекриваються. Ці ділянки були менш захищені, коли 512 знаходився у вільному стані, при цьому швидкість обміну різко падала при зв'язуванні 512 і антитіла. Більше того, на основі гомологічної структурної моделі 512, наведеної на Фігурі б, можна зробити висновок, що обидві ці ділянки послідовності займають аналогічне просторове положення на зовнішній поверхні білка. Ці результати дозволяють зробити висновок, що ці два пептиди беруть участь у зв'язуванні між Аба2 і білком 512.

Приклад 13: Рентгеноструктурна кристалографія

У цьому Прикладі кристалічна структура комплексу з 50с-а5Ем фрагмента АБ2г і 5Т2 забезпечує наявність визначених амінокислотних залишків у ділянці взаємодії.

Аро 5с-д5Ем експресували у клітинах ВІ/21(0Е3) баг. Коротко, АБ2 50-05Ем містить варіабельний домен важкого ланцюга, зв'язаний з варіабельним доменом легкого ланцюга за допомогою лінкера (б45)з. Для додаткової стабілізації молекули в структуру молекули додавали дисульфідний зв'язок за допомогою заміни на цистеїн у позиції 44 варіабельної ділянки важкого ланцюга і у позиції 101 варіабельної ділянки легкого ланцюга. Білок експресували у вигляді тіла включення. Тіло включення розчиняли і проводили рефолдинг. Білок додатково очищали на ексклюзійній колонці (ЗЕС) і іонообмінній колонці Мопос), а потім шліфували за допомогою ЗЕС..

ЗІ2 експресували в клітинах 2935. Білок очищали за допомогою Мі-афінної колонки і деглікозилували з ЕМООН. Білок додатково очищали за допомогою 5ЕС.

Комплекс з АБ2 5с-авгм і 5Т2 отримували, змішуючи Ара2 5с-й5Ем з надлишковою кількістю 512.

Комплекс очищали за допомогою 5ЕС і концентрували до 12 мг/мл для кристалізації. Білковий комплекс кристалізували у 32-3695 ПЕГ400 ії 0,1 М НЕРЕЗ5, рН 7,5-8,5, при 16"С, застосовуючи спосіб дифузії пари у сидячій краплі.

Масив даних із дозволом 1,9 А отримували з Аамапсеод І ід боишгсе, І амтепсе ВегКкеїєу Маїйопаї!

Гаь (Вегкеїєу, Саїїогтіа). Дані обробляли за допомогою МОБ5БРЇ-М (І евіїє, 1992) і оцінювали за допомогою ЗСАГА у програмному пакеті ССРА (СоПарогаїме Сотршиайопа! Рго|есі, Мо 4. (1994)).

Структуру розшифровували за способом молекулярного заміщення в програмі РНА5ЕВ (МесСоу еї а!., 2007), використовуючи як пошукові моделі домен 0102 з відомої структури 1-1 ВІЇ (раб соде: 3040) і варіабельний домен із структури Бар АБ2. Уточнення структури, що повторюється, і побудову моделі здійснювали за допомогою ВЕЕМАС5 (Митгзпцдом еї аї!., 1997) і СООТ (Етвієу апа

Соулап, 2004).

Аналіз ділянки контакту проводили за допомогою програм РІЗБА, АКЕАМОЇ і МСОМТАСТ з програмного пакету ССР4. Фігури будували за допомогою Руто!ї (Те РУМОЇ. Моїесшаг Старпісв зузіет. Зспгбаїпдег).

Кристалічну структуру комплексу 5Т2/Ар2 5с-д5Ем розшифровували до дозволу в 1,9 А. В асиметричному вічку знаходяться дві незалежні пари комплексів 5Т2/Ар2 5со-азЕм (Фіг. 7). Кожен комплекс складається з молекули 512 і одного фрагмента 56-й5Ем АБ2. Молекула 572 складається з двох Ідо-подібних доменів (домени О1 і 02). Ем-домен АбБ2 задіює всі шість петель СОК важкого ланцюга і легкого ланцюга для взаємодії з молекулою 512 (Фіг. 8). У молекулі 5712 дві петлі (петля

ВС ї петля ЕС) і М-кінець 5Т2 прямо взаємодіють з антитілом. Загальна внутрішня доступна для розчинника площа поверхні між 512 і АБ2 5с-а5Ем складає 1803 А".

Ділянка контакту між 512 і Ар2 є високозарядженою. 512 містить кластер з основних залишків (Гуз і Агу) у домені 01. Ця позитивно заряджена ділянка поверхні доповнює негативно заряджену ділянку на АбБ2, утворений кластерами з кислотних залишків (А5р і СІ) у СОК-ділянках (Фіг. 9).

Для визначення залишків ділянки контакту застосовували два різні способи. У першому способі залишки ділянки контакту визначали за допомогою різниці у площі поверхні, доступної для розчинника. Для кожного залишку у 512 (або АБ2 5с0-й5Ем) у комплексі розраховували площу поверхні, доступну для розчинника, і порівнювали з площею поверхні, доступної для розчинника, відповідних залишків у 512 (або АБр2 5с0-й05Ем) поза комплексом. Усі амінокислоти з різницею більше 1095 перераховані у Таблиці 15 і Таблиці 16, відповідно, для 512 і АБ2. Різниця у площі поверхні, доступної для розчинника, для Аг972 і Туг81 в 5Т2 складає менше 1095. При цьому дослідження структури комплексу виявило, що обидва залишки утворюють водно-опосередковані водневі зв'язки із залишками важкого ланцюга АбБ2 і тому вони включені у перелік.

Таблиця 15

Залишки, що складають епітоп, визначені за допомогою різниці у площі поверхні, доступної для розчинника: 512. Номери залишків відповідають позиціям амінокислот у зрілому 5712, тобто, амінокислота 1 відповідає амінокислоті 19 з ЗЕО ІЮ МО:1. датня ря певну ! МУ | ДІЯ 0 Спрвідне! вілюсткснва . ЗМІНИ | Немераниу | комелекеї окомцлеюсю вЕННЯ | змі сеї ; каси нини ин кН КН НН ж; ЕЛ КК кн ак КН А НН НН - ж і і ж ї у ї днз : подУть З дод ек З кс ши пшн нни Сн пвн Си но Ке

В нн нн В о ВВ В ше в о НН ННЩЙНЩьНННп оо тка ово Ж М пусдж опору Кров в м ВВ

З ЗБК КЕ КК ВВ ко в З и НН нн НН

АН рн нн мн НН нн В нн нн НВ

Мн нм : п нн НН З

ОН У НН в В и КН М М У М в и - п нн ня З

ОК в В М

Таблиця 16

Залишки, що складають паратоп, визначені за допомогою різниці у площі поверхні, доступної для розчинника: АБ 2

. | | ОВО | с. ши ши шини ша ши сш - 2 с. а ман нн а НН В в ОВ ше лише шшшш ше сш НН НН НН по ва о

У другому способі вибирали залишки ділянки контакту, які містять щонайменше один атом у межах зумовленої відстані до свого парного білка. На основі різних граничних відстаней були визначені дві оболонки.

Внутрішня оболонка містить усі залишки на відстані до 5,0 А.

Гранична оболонка містить усі залишки на відстані більше 5,0 А, але менше 8,0 А.

Повний перелік амінокислотних залишків у кожній оболонці для 512, важкому і легкому ланцюзі

Ар2 наведений у Таблицях 17, 18 і 19, відповідно. Для тих залишків, які утворюють водневий зв'язок або соляні містки зі своїми парними білками тип специфічної взаємодії вказаний у дужках після назви залишку (ВЗ для водневого зв'язку і СМ для соляного містка).

Таблиця 17

Залишки, що складають епітоп, визначені за граничною відстанню: 512. Номери залишків відповідають позиціям амінокислот у зрілому 512, тобто, амінокислота 1 відповідає амінокислоті 19 з БЕО ІЮ МО1. 23(-У5) (ВЗ/СМ) 26(ТУв) (83)

НЕТУ НИМ КО

РОЇ

75(ТНЕ) (В3) нн

ЯбРНЕЇ ССС

ЯЦАЗМВЗ) 11111111 78(АРС) (ВЗ/СМ) нини 79(ТНЕ) (В3) нини і Бог(мМАСЄ) АВМ 1111

Таблиця 18

Залишки, що складають паратоп, визначені за граничною відстанню: важкий ланцюг Ар2 102(ЗЕВ) (ВЗ) 103(5ЕВ) (ВЗ) 104(АЗР) (ВЗ/СМ) 1о5(ТУР) (В3) побту

Таблиця 19

Залишки, що складають паратоп, визначені за граничною відстанню: легкий ланцюг АБ2 28(АЗР) (83)

З1(АБМ) (ВЗ)

БО(АБР) (ВЗ/СМ) 55(51) (ВЗ/СМ) 91(АБР) (ВЗ/СМ) 92(АБР) (ВЗ/СМ)

ЗАДРНЕ)ЇГГ////СССС1111111111Г1

ПЕТТІ 5) ННЯ КО

Залишки, що складають епітоп, визначені за допомогою різниці у площі поверхні, доступної для розчинника, збігалися із залишками з внутрішніх груп взаємодії, визначених за граничною відстанню. У Таблиці 20 перераховані всі пари у межах ділянки контакту, що містять водневі зв'язки або соляні містки.

Таблиця 20

Взаємодіючі пари у ділянці контакту

Легкий ланцюг АБ2-512 Важкий ланцюг АБ2-5272 ше ЕЕ ОО в пеня я тіше ШО) Мох ВОВК Ж зопевам срок жо он вае 5 Її ФО 1 Ж. і дова тк Її МБХ яке мав

Й 7 Й Зоре охлЯ РОМШІ 1 ох. З дови с ох тонке БЖ ро леви У МБО, жор оБІВНМ ЕХ ТОЛІ 0308 1 АЗАШИ 7 : ОК

Ділянки, що відповідають епітопам 512, визначені за допомогою НОХ-М5 аналізу, описаного у

Прикладі 12, підтверджуються кристалографічними даними. Два епітопи (15-26 і 70-76) згідно НОХ були ідентифіковані як епітопи згідно тим кристалографічним даним, що мають вищий дозвіл.

Зокрема, було виявлено, що Агод20, СіІу22, Гуз23 і Туг2б6, а також Тпг75 розташовані близько до антитіла на відстані менше 3,4 А. Додаткові залишки, для яких визначена відстань до антитіла, склала між 3,4 і 5 А (Рго19, Сіп21, Пе70, МаІ71, Аг972, бег73 Рго74 і Рпе76), також входили до складу епітопів згідно з НОХ.

У загальному випадку результати підтверджують, що ділянки, що відповідают епітопам 512, визначені за допомогою НОХ-М5 і кристалографій, збігаються. Основними ділянками взаємодії є

ВС-петля і ЕбС-петля Домену 1 (див. кристалографічні дані).

Посилання

АЇї, М., а. 2Напо, еї аї. (2009). "Іпмевіїдайоп5 іпіо Ше гоЇе ої 572 іп асшіе авіпта іп спіїдгеп."

Тіввце Апіідеп5 73(3): 206-212.

Веап, С. 9., М. Е. Мипег, єї аї. (2010). "Спагасівгігайоп ої ШТе поме! 5Т2ЛІ--33 5узієт іп раїйепів мйй іпйаттайогу ром! аізеазе." Іпїатт Вомеї! ів 16(7): 1097-1107.

Вгиппег, М., С. Ктепп, еї аї. (2004). "Іпстеазей Іеємеїв ої зоїШбіє 572 ргоївїп апа да ргодисійоп іп райепів м/йй зервзів апа ігашта." Іпіепвзіме Саге Мей 30(7): 1468-1473.

Виуззспаєті, І. 0., М. СіуШіоїів, еї аї. (2010). "Сепеїйс емідепсе ог а гоїє ої ІІ 33 іп паза! роїуровів."

АПегду 65(5): 616-622.

Савіапо НВ, В. У., Міипа Епдат І, Оевговівтв М (2009). "Ємідепсе ої азвзосіайоп ої Іпіепешкіп 1 гесеріог-ІЇКе 1 депе роїутогрпізт5 м/п зигдегу ипгезропзіме Спгопіс ВНіпозіпивійів." Атегісап дошитаї ої Апіпоіоду іп ргез5(МА): МА.

Ссюпабіанвезоп, 0. Е., Ш. 5. Віотпзаонціг, єї аї!. (2009). "Зедоепсе магіапів анесіїпа еозіпорніЇ питбрегв5 азвосіаїе м/йй азійта апа туосагаїаї іптагсііоп." Маї Сепеї 41(3): 342-347.

НасКег, 5., б. ІГатбрегз, єї а). (2009). "Іпстеазед 5оЇШбіє б5егпит тагКег5 сазразе-сієахейд суюкКегаїїп-18, пізіопев, апа 512 іпаісате ароріоїїс Штомег апа спгопіс іттипе гезропзе іп СОРО." У

Сіїп Габ Апаї 23(6): 372-379.

Кигоїма, К., Т. Агаї, еї аї. (2001). "Ідепійісайоп ої питап 572 ргоїєїп іп Ійе зега ої райепів м/н ашоїттипе дізеазевз." Віоспет Віорпуз Ве5 Соттип 284(5): 1104-1108.

Мапейі, М., Г. Ірра-Маппезсні, єї аї. (2009). "Тне 1--1-ІКе суюкКіпе 1-33 апа її5 гесеріог 572 аге арпогтайу ехргеззей іп їпе аїйесієй 5Кіп апа мізсега! огдап5 ої райепів м/йп 5увієтіс 5сіеговів." Апп

Апеит бів.

Магміє, Р., М. І івроппе, еї аї. (2009). ""птепеиКіп-33 омегехргеввіоп і5 аззосіаїва мій Імег Пргов5ів іп тісе апа питапв." ) СеїЇ Мої! Мед.

Маїзцуата, У., Н. ОКалакі, єї аї!. (2010). "Іпстєазей Іємеїв ої іпіепеицйкКіп 33 іп зега апа з5упоміа! Яшїа їгот раїйепів м/п асіїме теитайіа аппийів." У ВПпештаїйо! 371): 18-25.

Міуадакі, Т., М. Б!дауа, єї аї. (2011). "Нідн І еме!5 ої Боїшбіе 512 апа І ому І емеїв ої 1-33 іп Зега ої

Райїепів млій НІМ Іптесііоп." ) Іпмез5і Оегптацйі 131(3): 794-796.

Мопаїй, М. Р., І. (5. (ші, еї аї. (2010). "А Іагде-зсаІє, сопзопішт-разед депотем/іде аззосіайоп вішау ої авіпта." М Епаді У Меа 363(13): 1211-1221.

МОоК, М. У., Р. Р. Ниапод, еї а!. (2010). "Бегит Іемеї5 ої 1. -33 апа зоЇШшбіе 572 апа іНеїг аззосіайоп м/йй дібвазе асіїміу іп зузієтіс Іприв егуйтета!йозив." ВНештаїйоіоау (Охіога) 49(3): 520-527.

Меї!, 0. А., 5. Н. У/опо, еї аї. (2010). "Миосуїез гергезепі а пем/ іппаїе еПесіог ІеиКосуїе (йаї теадіатез їуре-2 іттипйу." Машге 464(7293): 1367-1370.

О5пікама, К., К. Кигоїма, еї аї. (2001). "ЕІемаїей зоЇШріє 5Т2 ргоївіп Іемеї!5 іп зега ої раїепів м/їй азіпта м/йй ап асціє ехасеграїйоп." Ат У Незріг Стії Саге Мей 164(2): 277-281.

О5пікама, К., К. Кигоїма, еї аї. (2001). "Асціє еовіпорпіїїс рпештопіа м/йй іпстеазеай зоїЇшбіе 512 іп вегит апа ргопспоаїмеоїаг Іамаде Яд." Незріг Мей 95(6): 532-533.

Раїтег, с, О. Таїарої-Ауеєг, еї аї. (2009). "Іппірйіоп ої іпіепецйКіп-33 відпаїпуд айепиагев Ше вемепу ої ехрегітепіаї! апнтйів." АйПийїї5 Апеит 60(3): 738-749.

Разіюгеїї, І.., АВ. В. Саго, єї а). (2010). "ЕріїНеїіа!-дегімей І. -33 апа її гесерюг 512 аге дузгедціаїєа іп цісегаїїме соїй»вб апа іп ехрегітепіа! ТИ1/ТН2 агмеп епіегйів." Ргос Маї! Асай 5сі ОО 5 А 107(17): 8017-8022.

Ріадет", 0. А., у. б. Кані, єї аї. (2010). "Сепе ІМапзсгіріїоп спапдез іп авіптаїййс спгопіс гппіповіпивійів м/ їй пазаї роїурз апа сотрагізоп о повзе іп аріс дептаййів." РІ о5 ОМЕ 5(7): е11450.

Ргегопіаіпе, О., 5. І аїоїе-Кадоси, еї аї. (2009). "Іпстеазей ехргезвіоп ої І/-33 іп бемеге азіпта: емідепсе ої ехргезвіоп Бу аігмау зтооїій тивсіе сеїЇв5." ) Іттипої 183(8): 5094-5103.

Ргегопіаіпе, 0., У. Маадідеї, еї а. (2010). "пстеазей 1-33 ехргез5віоп Бу еріїпеїа! сеї іп Бгопспіаї азіпта." У АІегду Сіїп Іттипої! 125(3): 752-754.

Ригпрагаї, Р. М., Н. К. Тау, еї аї. (2009). "Те суїокКіпе іпіепеийКіп-33 теадіаїе5 апарнпуїасіїс 6поскК."

Ргос Маї! Асай 5сі 0 5 А 106(24): 9773-9778.

ВвіїтеппКк, М. Е., Ю. 5. Ровіта, єї аї. (2008). "Авзосіайоп ої 1811, І 18А1, апа І/18ВАР депе сіивієг роїтутогрпізт5 м/йй азіпта апа аїру." У АПегау Сіїп Іттипої! 122(3): 651-654 еб658. закКазийа, М., Т. Мо5Ппітоїо, еї аї. (2008). "Аввосіайоп ої взегит іпіепПеиКіп-33 Іеме! апа Ше іптепецйКкіп-33 депеїїс магіапі м/йй дарапезе сеєдаг роїІїповів." Сііп Ехр АїІПегау 38(12): 1875-1881. зпап, В. М. апа у. С. дапиглі, уг. (2010). "5Т2: а поме! тетоадеїїпуд БіотагКег іп асціє апа спгопіс пеай Тайиге." Си Неанп Раї Вер 71): 9-14.

Зпітіг2ги, М., А. Маївида, єї аї. (2005). "Рипсіопа! ЗМР іп Те діва! рготоїег ої Ше 572 депе аге азвосіаїєа м/йй аоріс дептаїййів." Нит Мої Сепеї 14(19): 2919-2927.

Зропеїт, «)., У. РоїІНеітетг, еї аї. (2010). "пЯаттайюгу ром! аізеазе-аззосіаїед іпіепецйКіп-33 ів ргеГегепіапПу ехргеззеад іп псегайоп-аз5зосіаївєд туоііргоБріавів." Ат У Раїної 177(6): 2804-2815.

Таіта, 5., К. Озпікама, єї аІ. (2003). "Те іпстеазєе іп зегит 5оЇШбіє 52 ргоївіп ироп асціє ехасетаїйоп ої ідіорайніс риїтопагу їїбговів." Спеві 124(4): 1206-1214.

ТНеоНагідев, Т. С., В. 7Напо, єї аї. (2010). "7-33 ашдтепів зиреїапсе Р-іпдисед МЕСЕЕ зестеїйоп тот питап тазі сеїЇ5 апа і5 іпстєазеад іп рзогіаїййс 5Кіп." Ргос Маї! Асай 5сі 0 5 А 107(9): 4448-4453.

Меті, М. А. г. А. Т. Сиеїтего, єї аі. (2008). "/-33 теаіагев апідеп-іпдисед сшапеоив апа апісшцаг Нурегпосісерійоп іп тісе." Ргос Маї! Асай 5сі ОО 5 А 105(7): 2723-2728.

Ми, Н., І. Вотієи, єї а!. (2010). "ЄмаІсайоп ої сапаідаїе депев іп а депоте-м/іде аззосіайноп вішау ої спідноса азіпта іп Мехісапв." ) АІегду Сіїп Іттипої! 125(2): 321-327 еЗ313.

Хи, 0., Н. А. ап, єї аї. (2008). "І -33 ехасегбаїез апіїдеп-іпдисей апйпййв ру асіїмайпд табві сеїІв." Ргос Маї! Асай бсі О 5 А 105(31): 10913-10918.

Уапабра, К., А. Мовпігакі, еї аї. (2011). "Бегит 1-33 Ієме!Ів аге гаїзей іп раїепібв м/йп 5увієтіс 5сіІеговів: аззосіайоп м/йй ехіепі ої 5Кіп 5сіегові5 апа земепйу ої риїтопагу Прговів." Сіп Впештацо). папу, 2; 2папод, А. апа Хіао, б.; "Чпргомей Ргоїєїп Нудгодеп/Оешегішт Ехспапде Маз5 зЗресіготеїгу Ріафеггт у/ййп Ешу Ашотаїеа бага Ргосеззіпд", Апаїуїсаї Спетівзігу, 2012, 84(11), 4942-9 7папд 7, Зтіїн ОЇ. Ргоївєїп 5сі. 1993; 2: 522.

Епаеп УВ, тій 0. Апаї. Снет. 2001; 73: 256А.

Содгеапи 50, ІГадпег УЕ, Хіао С, 5іошитап ММ, Наспеу 0, сСійШапа с, Аптвігопа ВМ.

Віоспетівгу 2002; 41:15161.

Натиго У, Соаіез 5У, Моїтом/ УА, Моїпаг К5, ТизКе 5У, Зошпегт МА, Сапійіп РА. Ргоївїп осі. 2006; 15:1.

Ваегоаа-Опі: А, Ниднез СА, Мапавеї! Чаї, Котімез ЕА. Ргоївіп 5сі. 2002;11:1300.

Соаїез, 5). єї а. Варій Соттип. Мавт5 Зресігот. 2009; 23: 639-647.

ССРА (СоПарогайме Сотриіайопа! Ргоіесі, Мо 4. (1994). Тне ССРА 5ийе: ргодгат:5 ог ргоївіп сгузіаПоагарну. Аста Стузіайвнодг О Віо! СтузіайвнНодг 50, 760-763.

Етвієу, Р., апа Соулап, К. (2004). Соої: тоаве!-Бийаіпу їооі5 їог тоїесшіаг дгарнісв5. Асіа

Стузіаводг О Віої СтузіаПодг 60, 2126-2132.

І езіїє, А.С... (1992). Весепі спапдев 0 Ше МОББЇ М расКаде ог ргосеззіпд Пт апа ітаде ріаїе дата доіїпії ССРА 4 ЕЗЕ-ЕАМСВ Мемзіенег оп Ргоївїп СтувіаПодгарну 26.

МесСоу, А.)., Стоззе-КипвзіЦеме, Н.МУ., Адатв, Р.Ю., М/іпп, М.О., еогопі, І.С... апа Веєай, В... (2007). Рпазег сгузіаПодгарніс зоймаге. уошттаї ої арріїєд сгувіаПйодгарну 40, 658-674.

Мигепидом, Сі.М., Мадіп, А.А., апа Оодзоп, Е./). (1997). Веїпетепі ої тасготоїіесшіаг вігисіиге5 Бу

Ше тахітит-іїКеїїноса теїнод. Асіа СтузіайПодг О Віо! СтувіаПНодг 53, 240-255.

Тпе РУМОГ. МоїІесшаг сгарпіс5 Зузіет. Зспгбаїіподег, Г.

Ваєгда-Опі7, А., б. А. Ниднев, у). с. Мапаєї! апа Е. А. Котімев (2002). "Ерпоре тарріпд ої а топосіопаї! апіїроду адаінвії питап Шготбіп ру Н/О-ехспапде таз5 5ресіготеїгу гемуваї5 зеІесіопоїа дімегб5е зедиепсе іп а підпу сопзегуєа ргоївіп." Ргоївїп сі. 11(6): 1300-1308.

Соаїев5, 5. 9У., 5. у. Тив5Ке, у). б. Тотавзбзо апа У. Натиго (2009). "Еріоре тарріпуд Бу атіде

Нуагодеп/дешегпцт ехспапде соцйирієй м/йй іттобій2айоп ої апіїбоду, оп-Іпе ргоїеоїувів, Ідшїа сптотаїйодгарну апа тавзз зресіготеїгу." Варій Соттип. Мавх5 5ресігот. 23(5): 639-647.

Соадгеапи, 5. С., У. Е. Іадпег, Сх. Хіао, М. М. 5іоигтап, 0. І. Наспеу, сх. ЇЇ. сіПШШапа апа В. М.

Агтвігопа (2002). "оса! Ргоїєїп Оупатісв апа Саїаїувів: Оеїесіп ої Бедтепіа! Моїоп Авзосіаїєа м/ їй Раїв-і ітйпа Ргодисі НеїІеазе Бу а Сішашйіопе Тгапвіегазе." Віоспетівігу 41(51):15161-15172.

Епаеп, у. А. апа 0. Її. тій (2001). "Іпуевіїдайпу ргоївіп зігисіште апа адаупатісв Бу Нуйгодеп ехспапде М5." Апаї. Спет. 73(9): 256А-265А.

Натиго, У., 5. у). Соаїев, у. А. Мотому, К. 5. МоіІпаг, 5. У. ТивКе, М. А. Зошнет апа Р. ВА. сиїйіп (2006). "Нудгодеп/дешегтішт-ехспапде (Н/О-Ех) ої РРАКУ І ВО іп їпе ргезепсе ої магіоиз тоашацогв5."

Ргоївїп сі. 15(8): 1883-1892. 7папо, 7. апа 0. Її. тій (1993). "Оеїептіпайоп ої атіде Нудгоодеп ехспапде Бу таз5 зресіготеїгу: А пему ї001 гог ргоївїп зігисіиге еійсідайіоп." Ргоївїп 5сі. 2(4): 522-591. папа, 2., А. 7папд апа а. Хіао (2012). "Ітргомей Ргоївіп Нудгодеп/Оешегішт Ехспапде Мав55

Зресіготеїгу Ріайогт м/їйп Ешу Ашіотаїгїеа баїа Ргосезвіпд." Апа|уїїса! Спетівігу 84(11): 4942-4949.

х і ї

ЕРЕЖКЧ КУН НО ВНОСІТКИ

«Наж АМОБМ КС. !

МЕН, ЮвЖк Кк

РОСТИ, аа

КК Спи к т

ІМ, АБОСВівВЕ

СТАНЕ Ва

СОМБАТ, Міснне К

КЕТСНЕМ, Клайщ В

ММ. хіп

ЗНЕ боти

АМС, ВНИВ «Ще ГАУЗАНТИГЕНЗЕЯЗУВАЛЬНЕБИКИ «1 АТО «ДЕ» - Буде завОвнено піз нал «їх МИЛОМ «б» СБ ета «іх» ЗНЯВ «Іщк ПО Ме «Тр» ЗОРОМ «не 175 «ККЕ» Раєпіа версія Зх «а «51» 535 «ЗІЗ» Білок «І Хж Напо хавевь «Ло «ар примітки «ВЕ ГТЕК УВІ жайаю Жви влозиНи 5 є Се або Лід

Км

МЕС У Ве ко Пе тва Аа Не ев ГОх Пе бен Мі Буг 5ке ТВу і З Не 15

Ав лів ую ве Зег Бу а зе Тер СИХ Пе сна АМС Аа Гех

У ЗО

Пе У ат Су Ріо йбгв а Су бух Рв) зе Гук Те Уві Акрв тр ча 45 в.

Ту Ту ве ОВ ТВ ха бух зок Це Ро СОН СО КВ АН Аме

ВІВ а 5О

Ма Ра А бек оу Спо бем бен іже ВВ ек го АВЕжНа Ма іа

Ба 7 5 ко

Авр Бег У Це Тех Пе Сух Не Ущі Аги бек то МІНОР Аа Ате 85 ой 95

ТВЕЄЛУ Тур Ма Ав Уві Тв Пе тує Бех СУК ЗВ Зег АХо Су лев

Що 15 о

Маі то АБр отут оец Меєттк бек їв У бег Су ес спо Бу дев

Нх о 125 зе Бу» Не Гук Сух Ре ТВЕ Не хр бом Туг Аза То Ту АВ Бех 130 125 Не

Сех св Тер Ре Дав Сук Аза бец о Стік ех Аги Тут Ат

НІ 155 150

Аз Ні Ех бе Бе їм У ПЕ Ар Ах Уві Ме г Св Ази Ав 152 гою РУБ

Су Аза Гук Тв Су уз вне Не ВН Депп Се Аза СУ ліз ав Тує

ІБ вх Не ес ВЕ Те Аа Ве тв у Бе р Уві АХ СНИ СТЕ СУ Ве це зо ща ще без Ре реа УдЕ Не СМУ Ав го Аа ств Аа СНО Ле я Є с 1 23) мн сів ВЕУ Бук ни ів хи ев ТВ Су» бек Ав ую Ве Сну

Ва; 3 вв а їде кНу Пи сна ре їсв аа Вів уві їжа бо Сп Бех Авв СНУ ТВ а 230 235

В: що

Ек Бе Те ав РВЕ СПУ СНО Ро Аг НЕ ОВ овени ОВЕ Оу Са ко - КК.

Аа Сів Зеє Ре ру Аа СНУ вм АВ Су ік АБО Мега ев ато 218 ЩО 785

Це Ав бр уві уз СИа Се бхрієв іч іє ОВ Б Азов су еВ 290 У Зо

Аве Ахвією На сМУ ев Ат Ах Ні ГБ Уві хи без ет АВ

М в: З 320

Туз АХА Бе ко Б На бе НЕ Ук Сук Це ЛЕ мів Уві ух

Кн Ка 335

ХегУвЕ Рів си Мері си Пе ав Уді би уві Це Ве бев Був МЕ

ЗА ве 350 вне в Не Сів Аа тн ев бе Бо Аг Ако Пе Аа Бу Кв ТУ

Зх зай 365

Гек Пи Агро ана ар су Тл ев Ту Ар ліз Бук Уві УВІ Буг Ро

З Ух в

АтроАВВ Бук Сук Бек ек Те Ахр СН АВ бе АВ УВО НК РНе

Зк 90 Ко БА

Уа Ех св Пе бен Ро дер ак ев ци Аза ув Су СНУ Кує ТВ

ОХ з СН теку ве тує у Ар Ане Мега Ро СНУ Со яр Уві ха Ву

БК ой 30 дів УВЕ ста Тв АХА Пе Ате Гуз Бек ги ТЕ ЕН ПЕ ББе Ме рев

ЖвВе го св Пе Вік Ав ж Ов Ре Аа тує СПЕ ОПО Уві

З БяЗи чо лів Пец Ні Єу5 АБ ев Це Спа хе Акр Аа бук Ук Не без пе 68 Се 875 45

Сле Мегст Ата бев бек Си Кеч Ако Местуен Сію Аа спа АВ ей ве а 495 св Ар як беп спа Ні бен Ме бух Уві са Ну Тіт Пе бух Бер хЮ ЗХ т

АВ СИЧ Акр іх Де АВ Аза бух ат бе ген Ахп ек Був РВЕ то щі УМ Іх

Ге ма Ат Гук спв Меєрк У Бко есе Пе Рез Ага ух 53 235 яЯО

Ав бе Бег Бен ГВК Ро без а із СЯ Гук СВ 50 ЗА «вів «31» 55 «312 Білок «213» Бопію арієвв

ВК й

Ме ТБкТейхіви тру» У Уві дек їжи Гук Кве Гук СЛУ Пе без і З їв Не

Спа АК АД ОК СТЕ Ат Сх кв Ахо Гру Ген аа Пе Ме

Ко 3

Ах ОЗівВ Песню Уві рве Ов Аз В Ре» Мій Аве Не був Су во

Б Б ах

Теа Ре СП БК Ре ер дов ріж Аве Кук баг ТВ Дів Ні: Мет Аа за 53 5 спУ ее ТВ ев Не Тер Гук тто ве Аеюбів дер ту Ав ен Ов ба 70 та ко с ро Пе Ази ре ати Без Ре сно Ази Ато Не бех їде СН ув

Не 5 ща

Ав Уа ев Пр рве Ат Бго Ті бе ев Ав Азв ТВ сну Аяв Кут х 1 Не: НН

Твесує Мері ев Ар лах ТНК ур ух Баг ікв Уві АВ Рос о 1ї5 о 15

Гев спо Уві У Сів ж Ажр Зек Су РВЕ Ака бек Ру Ме був бев 1ю З іо

Рв У Ні лук без Ту Пе СТ Тут СНУ Пе ОН Ак Пе несу 1 їхо їз5 15

Рг Акп Уві Акр сну Тут Ріе Бгто хех ян Уві Гук Ре Те Пе ств 1655 г 175

Тхр Гус Меп у сук Бус іт ПЕ Аква ве Аквовян МІ Пе ро їБО 155 19) спа СПУ Мекки Бен 5 Ре ев Не іа ба Це баг АЗИ Аква Су ев: зо ОХ зав те ПЕ Су У Уві Пи тує То СНЕ Акв су Ав Те Ре НВ в р а їев бу Аг твкісв Пе УЖ ба У УС у ех Рух ех и В 225 а 235 Ай

У Ро Ро уч Цех зер Ах ар Нв У Уа Тут Сб ух

С Р СОІУ Св СЯ ев ев Пе ру ух Тр у густе 5 КНе 260 ток ж

Гео Ме дАкр еє Аг Ах Сп м Тер їтр ЕК Ве Ар ЄНУ ув Був

Рез Ахр ов Не ве Не Ахро Уві Пи Пе Ап Ср ех Не бех БЦ

ЩО 235 БІВ

Зег Аге ТВО: Ар Єна Тк Ат ТВесна Пе бецбех Не Бу Був мк з З З б

Уа ци ес АхВісн у Ат за тя УВЕСУЄ КО АВ АВ Бег 30Я З 35

Аве Оу св Уві ма хе ма Аа ув УВІ ув Св ж Мо

В кеВ 33

Аве Ат Тут У ОВ тен ів Суб Спу Ве Су» АЗС ЕВЕ Уві 355 зо 365

Тен Теч уві Узі Пе ев Пе Уві уві и Ні Уві Гук Тер іа СЕ

БЖ: ЗУ ЗВО

МесУз ев Ре Туга Ма БЦ Све СНУ Кк ажр с Ж КТ і

ЗКУ кю ОК ще

АяВСНУ Бе Сн Гук Ар Не ТУ УЗЕЗет Ту Ав Атв Ази ЛІВ С аа ще 15 спе СПЛЮ ЗВ КВе ув без ев УВК ев Аг су У їем Є АХА 2 ях Ва

Ріесну Гук де ев Су НО РНЕ кв АТе Ар Зег ев РОСИ У СПУ а 440 за

Те Уві Пе зе о Тв ем зе Рне Не Св Був ех ге Ати ва 450 355 Я їси Уві Уа еко Ро Аха Тує Уві Ге кив сту Ку СВ А ТІВ

Зх ЗД х 50

БГеп сіб ва Бук Аа СНУ Тем Св: Ази Ме дв Хек ато СИ Ж Аве ак ж 5

Аа че ПВ бен УвеСня Бест іа жабу СНУ Те ех Уа щх 5

Си бен ук ек ма ун Пе уві Те ТВ уві Пе ув тр Бук СНУ зі5 а ЗАВ

СВБ ук ет ід тує Без Св Ну тв Ре Ттр ев Св ев СНИ Уві

З 535 0 ів Мер Уві їде ух Хе Ро ато Ав Чет Зог бек ак Си ОВ 55 З 355 56

Сптбеи нен Гук ех ук Бен бух Ази Ущі з05 5 «м «аю о «ЛА» Бівох «13 Мен карі «НЮ» З

Ме іух Ро бля Мербує Тук Хе Тв Би ух Пе Бех Тв Ав бух

І 5 їй ІЗ

Те ух Аа Ве а Ве Бу Аа їх У Не уві СНУ Бук ех

Ку

Св св хв Аза Те Ох ж ух КВУ Ме тую Ре Ме був ев те за ЗО : в

Бебі во Моє Не бу Бу ча Аівнстук Гук рве Аги Ате ОО Ну що 55 що

ТвВкідя Ага Ріо бек Ге ТК ВК СНУ Ага Бе БО» Муз Ато Ніж Тем вх М 75 5 маса Аіз ків Сук ОСЬ Сів бе Гве уві Ох Сук Ре хів Ве

Я що 95

СИХ Пе Бе Ну УВО ук Ту Трач Ан Тв БИ» АБО нн ет що 5 1

Пе ТВР СПУ Пе бе ую Пе Те ВЬ ТУ ев Афн бек бе ех Те

ПУ. Не, 125

Тут Ази дквЄтв 5еє Пе ТЕ РНЕ А Ге спи МеВ ЛО бек ТУ СНИ

Ж Я 3

І.

Ме лук У Се Арі ув іле Арон ую З вербує Уві бер ї45 їх 15 і6о

Тео ве Гук Тек СИ бер НО БК Ріо бах Аа КН бен Су АЗВЯУ 165 ії 175

Уві Аз Ну ух Ме еу Ме уд Ге ом яег Ро Тр ух АБО РНе 18 ТХ 130

Тевіжо Ні Ав АЗИ Ах Сук Ні Заг УА СИМ Беца Ех Сук ух 195 щю 205

Си бує Ро Га Ру Ахр СП АЦЕ РНе Ре ул бен Ніх Ак МОСС 1 віх ва:

БегАБа Су Уві бек РВЕ В Сух Сх вх хр Бех СПУ У не Бе а 2 а АЙ

СМуУ УЖ гів дер Аа НІХ бев Ма ев Пе бук Уві Ан Зег Зах СПИ лах З 253

Аза бевств Пе Спа Не бом Ре бух бе аг Спо ТВу 250 255 и ке «11» 5 «іш ВИК «1» Мавка Гнесчія «НН

Масу ви Ко» Не ев Ада Пе Там ті Пе їхо Уве тує бер ТВ 1 5 10 ІЗ

АВ АБЕСУЄРЬе Заг Туз Со ее Сех СЯЄ Сем Сх Аква СЯ А же да ве КО)

Ве Ущ Атв Сук Рекс Аг сна СПУ Є ух Мет Хег Гує Ме Уві хв Тер ї5 40 а

Ту ту чергова Тве хв Сук ех Не го Так СКОВІ Ат бяв аг

ЗО ка во

З чУаЕРне АВ Зе Усі жа Бей бу ке бен та ча и УЗА й й їх хо Е

Акубекопу Це Туг Пи Ста Не Уві Ат бег Бр ПИ ОВе ха Аг я5 ча 95

Те су Туг Ав Ах Уа Тв Не Бук в бут Сів Ро АхрСує Аква що 5 по

УМ рт Аяр бу ее МБ ТУ ЖЕК Я Уві ст су За Спа Ек ля

МІ 120 12 егбже Ве Гук Сук Ро Пе Не Ах Два Туди Кто Те Абе Бк

ІЗ 13 Не

Его сін Ттр Рне був Ан Св ца Ме Сем в СУ Бег Ати Гук Ду 133 156 155 цю га ВИ ух Зак РНе Сен Уві Пе Ар Ав Уві Меє тк Азр ки а 1655 БО 175 зу АЕРО У Ве ув ут Не ТО БИ» «кха СЯ Аа СУ А А Ук

НТ 155 1

Хе Уа Те Аа ТВ Аг ог бе Зв Уві Бу Ар СНО СУ У Не 155 Ре ДО хег Ага РВЕ то Уві ЦЕ Аг АВ РТЮ А ОХ Ах СЯ ТВ уУЄ В

НЕ 15 КК асп пе у СЯ ам Е Ава Сов У Су бех Аіа Сук ВО КНУ

З ях КЕ

Бук СНУ Аа СИ Ре ев ААУ Уа ГО Ге ха СПУ АхВ ах 25 хі у Це би Ахо Ре ес бли бо Ат Ве ота Спа СЕС В Су СВ 0 Уа ви девіз Бех Ріє чес аз» Су кв Аа Сух Уві Ава ТВг У ев АгЕ

ІК р ХЯО КІ

Келлі ер Уві Бу СН СНО Ахв ідо еВ Бема ТУ АК СУК ТВ

МА. 295 КК дів ло Ази Це НІ КПУ ев Ат АКЕ Нх ТНе Це Ага Гербег ме

Ко що ЗІХ З

Бк хи то Пе ар Ні Са бек Пи Буг Суз Пе Це Аа Уві ув дх щюЮ 35 я Уа Б ви Ме без Ле Аа Не бе ЖЕ ПЕ Пе ев 5 ВУ

За іх 35

Ре Тер Пе бів А Ме ом тром Ар Не лів ух Ро Тух 355 БІЄВ лез

ТУ ЕВ Аго йхя Вер оу Гук їла Туг аа АВ ТУ У ПЕВ о

БНО ка 350

Ав Ахи Гук ВЕ ес мех АБ ААВ СК АВ Заг Ах Ма сив ук Ре 385 ю Ко жо

Уві ВХ КНв Не беб Ро Ах Ж вм и Аха був Ст СНУ ГУК КВ чи УНІ чі іже Су Пеб Ус НуУ Ат Ахо Мерів Ро СПУ СНУ хр УВУ ТВ?

Я У Ба: щі УВУ Ти ази Пе ев Тл бек Лех ек НВ Пе ке їв ев ща я 4

Явобво юю Це лрв нів бе СНУ СНУ Ко Аа Тег Одеса Мо У

ЗО 455 чо вів тбем НІ бек АТ ен Це Но Ахи бере ід Уві Пе ев пе

Зах Я 475 ЗО и Мессть Аве че ко хо яр Ме Ге СВ Ома СЯ ЛІВ без

ЕХ вЕці ва

ІВ:

СНАУ ев АТ НІВ ен Мер Уві сла СНУ ТВ НЕ У Тр щю З ОН

АН АЗОВ Аж Аза ув Ати Хек во дев бе Сук Ве то

ЗІЗ в З дв Мі м Ага Тут в Мег вк ма Ре Хег у Мес Ру о ув 3 535 ї3о дів ех ген ГГ Зег бе а АВ сна Зоух СВ 4 5 333 «Афіх 7й «т» Буюх «Зо Масвса акорд «В а

УНК Ву ес беч Їтрісух Уде Уві ех бе БУК РНе тут СПУ Пе ви 1 5 в 15 сі ее Аво дів че сла Аг СТВ во Ар тр СНУ бе) АБИ ТЕ Ме зо 5 З

Атв Спа Ле сна Уві ВВЕ СНИ ко ОВЕ Р то ів Атя НЕ у СУ

КВ: і 43 їжи Ре ів Нік Ре ев Ре АЖ Тує Хкк ТНК А ЕНя ЕК АВ

Зо З 5 се рев т без Не тр ТУ Тро ТР Ах Са дхровти Ар бен о та 75 що

СН Рез пе йав Ре ати вн Ре Он ха йге Пе бег Бу ЄВА їде о З 5

Ахв аг бев ТО Ре Аув Ре НК ви бвм Аква АВ ТНУ Сік Ах ух 1 ох По

Тв Суб Мер бен ан ен Ве ТВ Гук Сук бег був УВІ Ан вве Рг 115 а НЕ

Еш

Ах ов У У Сів ев Ази зег Су Ріє Ав Бегїхо МЕС бук бе

КО ТЗ о

Ро У Не ев тує ДЕСЬ Гук СУ Не Спо Ат Пе Бр сух 145 ЩІ 155 150

Рто Ази жа Ав у ГУр РВЕ Рез бор бе У ух Рез Вк Ле 155 По ТУ

То Те ме су су; Гук ех ДЕ СПО АБИ РВЕ АЗИ Аква Уві Пе го

КО 85 еВ

СВ СУ Ме АЄВ С ез бог НЕ Бе Пе АБ РВЕ Пе хе Ази Аня Сну 195 КВ 203

Ав ж тн ств Уві уд Ве Туг тю С Аа СНУ Ага ТУ РВЕ БЕ о Зх 2

Тех пе Ву іо кг ж Бк УВІ М Су БЕК РАК ух кВ АНА

Кр 3 35 ве

УВЕРе вв УЗ Це Бх Бог Роза Аз Вів Уа мату спи ук аа 85 3 си Рез мВ Са еп бе пе бо Сук ВЕ Уві Гує Ре ЕЕ Ре я; З жо

Бен кн ар зе АКА Б УМ То бив Те Пе зро Бу дув

Кука КЕ ЗХ

Ре АБр Аж Пе Бе Це Ах УВІ Ве Не Ака Спо ех Не Чек МВ ло ща 300

Бен ВЕ СВУ Ар НЕ Аве ТЕ ОВ Пе ее бе Пе ук ух

Зх Зо 5 ЗМ

Уч тв че ОВ віхи ік ати Хек Тег уві Сук Нє дів Але бог жа 330 З38

ІЇ3 ів ле су Об У АВ Сук АВ АВ ПЕ КВ Буча уз Уві Ро

Б ЗХ ЗО і іа ре Ас тує ть Ус ев АМС СУ Ре С АВ Май 45 дю Зо

Геніен у Уа йе Се пе Ж Ма Гук Ні Уві Тут Тр дов Се па 375 ко

Ме ма бе) Кіа срурамв Аве Вих ве сну Тех Ахрв сх Ву ПЕВ 35 Б 95 о

АхроїУ ух бів Туга Пе бує Уві бек Гує АВ йти Дав АК ОЇВ 405 о Ех се ОЇ РНе Уайісв ов БП їв Аг СПУ Уві Гек ОВ АХА КВ в Б ВВ ве Ох Туг ув ем Сув Пе РВЕ Ар Аг Ахр дет ен то Сну СТУ 335 о в

Пе ба тн Ахо ВХ БВх беу век ВНе Це Оз Бу бах Ате Ат Бе яп їжв Уві ха бен ее то ав Ту Узі ев спів СНУ ХВг сно Аз Сем чої БР ря ЗО ев тн а Су АН СНУ Гео СН ло Мег Аа Бех На МУ Аво Не

Бе З Я ха ий це їжи УВІ Бе ТУЄ ж Ав Уві ув СН М бе Ма жх 50О За Ів см лек ук еВ Ма ев Пи У ді в ев Тур хв СН 315 5 525

Спи бує Зк ре Гук бро Су Агр ВНе Тер Бук Св ев Спів Уа хо 335 З

Ав Месрає Уа ех ук нЕК РУ АгО те Бек Бех Баг АВМ С не За 5а5 560

І

Су Теги чес тує вет лес тен ук Аза Уа 65 57) «3 6 «1 ЗО кА» Білок «ії» Масова Пахевівих «Мох б

Міесіха Ро бле ме Був Гу бек ТВ Ахв ух Не Зег Тк Аа ох і х 10 їх

АтвБує Ав ТЕ Аа ваті ув а ев ух Бе був ев СНУ Ту Бк

В. 25 КІ) сп сни ув Ав о и ма Сов з УВІ Бут Ріє Меріоук бом Аг

За 45 45 вет Сну ев Мег Не бує Сук сч Аа ух Бут Бе Атв Лев ЄлО Ту во

Ж Бу» Ате Ро бе ев Був ТЕ СНУ Су Був Ех Був СИХ НІК Сем

Кк 70 5 5

У ев АТ Аа ув спа На сна бек Гн Уві Сів Су» Ре ад Ре 3 КІ 5

Су Не бек СУ Уві Р хх РУ ТНЕ хв аб еу Ні Акр ех мю 105 ЦО

Не бе сну Не ес Рез Пе Тести бе тен іа Хек еп бах ТЕ о 120 155

Тукавп Азр ів Бек Пе ве ве Аби ев Спи Ахр Со де бук СН г 13Х 14

Нет У ОВ Ар бен бух ія Ар бух Бук Су Ар бує Уві ем

ІЯУ І5а Еж5 160

Гепожег Гук Ту Со бек Сів Ні Рез зок ет СНО бек СНУ Аа СНУ я ер. їх їва 17 На

Уві хвої БУХ Мег те Ме УВІ Те без ер Ру Те Сук АХ Ре

То І8Х 150

Те ев Аа Ах Акп дв СМ Ніх Бек УВЕ СНО ев Ніж Був ух і щЮ 205 спе Гл вхо Гак Різ АзросЯв Аа Ре Ре уві ги Ні Ако Ер ех

Ве; 815 Бег:

РЕ Аха Сук Ма бе РІ ОВ СУ ж ТВ др Ре Уві Бе пе д25 т БК ве

Сх Узі бук Ах АК НІК ів ід без Пе бух Уа Аква і Бег СНИ со ке 23

Авпісц Су зе Ов Аа Пе ев БЕ ув бе Бе СНО Не 26 ог ато хаМНре 7 «а 3 «25» Нотекарну «Ох 7 сардеісвас штасавіс епосі ав івано сиве осісівзавнє ба іссівованя Шосе сосні павцоса аснсіве спарених ссвоваЗав сесиоявів зриви піиносіе аава нива вас 150 зевоазиаріісозоеооде ви асеВо весрарраса сама озеа знеавосіве 0 шзрзасіви воно ие вч вакнвас синові НЕ іі візс засанавня 00 асп В каста но носсав позою рн сном сісписівне НО зесианворе свв м обсестнров ссскоеса резеесвесіс сизнавасв СО ішхрреоо Іварсневив со ооюовсе Поссаосів сові сісцовае ОБ ївессіса вовосеТної висеотовос госавсвасє ісввсвесся зносі 000 ірсаведіви зесловароє салевасвеє замоноси драсаруря версознадів: 60 я б (БОНевЗя! вереск ссовисяоси ССП еВсне ВИСО МСВЕ спссне 720 секосаваае се здиваєве омемеме песивассс старою москве 780 ее ка десжеввиех сегерлввіс сависва вогмевірев сриснівевя 5 вінсшав ссанеасвах посаенокав ванонеуся асаеснсви сомів 0900 звсшессісз сспнвівсв ссвинно ни сіннаєнсов нпрапідсна рідсваннє 60 ксавовак вемоссаек сессневан анаасснєк і ссзаанссаа звеновнеєк 1050 сенсі вл нак сетвоессов осв новоо весвассоа вааееанє ОБО вдос весівієва невечоцю сссанедаса рості вке віровамаве БЮ вва ксанс сикавниєви ства нвсс еаосіссва вч онанс севеносє 1900 пкикокК асвоссивисє осо ирас вон всаов кисзисвнер даси 1900 пев ев рес иЗ іст есас са стясв сроаранеав соска ЦО

Бнссдеей ва не «Ві» В «аж 1 «ліло дик «23» Нео знрієвх «а00» В палврсаре інрівсаме: с веВисвиви віназваве соквхвавно крики То ізсівівннЕ висеаана света завіз вина рост кої веросавай 12 сссвнанази ВесцомНЯє пи не ває Вісмнесух мія на пасоонНо 150 каоосви т іссавевосВ піс азесасв авіссяспе сисскоєвю С СНУ «ис нев сан ай вис вово здоро апасцмос схов СЮ щеовсскавсвсвасне монаснісінриоосави вопосвскві саовнє 0 ЗВО мара ссваненос ВК ис осн асве реве ваневК Я варанове сроссс ков сеосстеог вареастки гососкавос когоаевніх ЗВО заменаяє сао какснисвос відун фессвнс не ссмеВее ОЗ товивасіс ясен сВЕСрір Ід ксмососксеанрааоМ сус к БЮ силос всвасвізна саезавосє ародасноса аонінрасав васавінаи ОБО г одеваанМі вевіСеВиВх обсасове содеКасеВе сбиховани досві таза пещемсе сосовиааюс саанеесасє сісав весвнчо знак Нясе 7 тес нремис івана н ссср юс ваеКс вно вісвівнає БО врекричее шсаннйре свадаснанх совсеи ване арсавіоав сироневие об срімевіса весно сн отново савои вис 1внасросав виаБІАСННО ЗО їрспврив освасванви скіорсарек сосисмава пааюєтіс сазлассває НО квнсавссос внпанссяси вегрівсноє сірсоосств соснвинева вНБКаєснаю ОКО азосарніса вості в состава оисмстоє ссарсвас скоснв їв індранаса вірнрсароє Вененієває Гасваеорса свесроссве виівачняс ОО касидоюс іспееа спвуснвасіс зосріднаси вдаоспрвів вопоснинио ЗВО айовісног свсіссві рінловінав вестися св ассастсво поанайаваро 1320 семессци сіссекога а Ма «вій» З «иіїз ГБ «32» ДНЕ «13 Ноте хвріках «щЮ» З

ЕНИчЕвОВее Вер света ос порі нес нео сссовиасю 00 клвівсан соклеван сасспевве весасваси ПисвствиВі севокавня зо теВЕкавана Не ЕЕ Сай анна не Сік оюне астиося ОБО кЕсіссиіна пекоеси В сасовітє зеавнардну созанаа спри ОС соваснвнсй хосірвицеє срмсеаснов веб зстнінсизи змоковавні зов

ЕНН ОВАН ЯСванлаКіВ сви орвас Кік енвес авЕрасво виСсВоснх ЗО леви св осоасюлание сенс Неси снеків канд нео УНН шеваненея савсвнсив пк мовив васі яспоснзв зосомнаюв ЯКО ннисегнва висо чюєсани носове сспоессвре каса ОЗ еісавдчо вве сорсенеді Вівассвве осіоврозв снСввюовев 00 саивачася сстренасврпиоовсне сссавсавов ссчвоніров сваваєвай 600 вадерсалає вн ВЕВІСКа ВІбсссвюсв росевисяе спострірис вкрассвієв 730 вснесію порсеосяна ассежце вас нессіонена ісксстеве сссіннвє БО ще певне; помпони: «г евасвасема васссевави ксзнисав сте васві БЮ каскоспіох вити нан оснивасв кавесаснко авиарсари саасаровея СК посів озвевіссі озосвн ни слосвЕанеї посівнасно сазновиютаю СЮ заджооване севзасва зроксмхов косе зинадеосаесієсвнйвоєю 00 «ваввисяво сосувуівсе вененінвас зессіноссс своссвиви сдеВКаеВос ОБО чаковмевне вно ас касове аосокарека. сасвссвів НО) варівквцка вопагиовох весрипіалю яавоаоварх сезспосісс ово 0 БЮ серед еснспост скювисван ссасоющвк асвавзреав ннесансяк 1960 кекавсрі кмсВівие свт пев ез зренчро арвассаа спековвяае ТА песевносо гос сах 1344 «ХХ «З ТЯ «АК» ДН «1» Нон вавішая «ХК «ивкіссвде вріса окис дучнинаде с вевосе нац и БО келосваав осн вай свв савнаск нас хен ведасвнвсї СО сстпваваєв еропозкіи Ковані каст ачомрнаа васавісвє 150 ковевивавс іссавн сви вино: деснанемов спстаснра свекалаєю 0 дішнансіна кознесівцо зістрзсеас звис апосимосазсннок З еко бе кно веинссврови вести вісд сс несавовоє 360 аавкрсссв сиосо смонеросо івсіссаров псжсстсва рарсасанов ОО

ВЕССІНеНЕК Восінеюви ві аСче соснесен риси НЕ віренасію Я

ВЕС ЛяН ССНВопоСВЕ Всвсносне ково нісс ізеввіосіс авиаени ОСЮ наевевисв нені рас віник вве в воасосакае свечоє СЮ застава вечавоссия «аасоссвае щікрасавяа саріномсе саван: бо вснанес ово вессагосдесассі шінесневас смсаніен сою новс 0780 сеааанссса воиасвСссі сао сеиВоссрів ависасві сві БО насвіравос вевазеасс сна веОСад повастевх Зсеевисре сно 0 ВЯО овбкц весь валезвавою повеенаКНУ саднккнов посасвнесв інно 00 зихнелоси цВівсассв песо авскосааеи аисааюів свайвнюс НО дасваженсс среаносес сао кчрана зесніова азассаварв везвесосвя ОСНО назссасння інбсвово порессеє соки авн ірвссвновн ссннесаве 0 НО скраесівсо вісник сук юс висраємсв ссрівсярір кварановає АЮ

ЕЕНСВНСсКО пана сан єВся собоссжос свакіссва сне СОЮ

Норікчвса псапесісає спірна посннсве висаровона своя 1960 знеосріве і всВінанее ре осавУ саствеаснє зпавиавссі сісссін 0 БАД сова х Іжа «АМНух «а» 3 сіла ДН «2135 Бмво зарієня ее

ЕВЕЕНеані Евіннавіс вкл ониЕс ен Каво и ви Енн ССБКЯ ЕН 5 сілівсне сс асассмеаві ака нас ас еовескосааосє ГО восаекодааев сані вим свно Знос кормове ока ОКО ваивекка КЕ кос НО має веранд сежнцнвяс сині 240 саавгвнасв сп днодве сровесВси Спи сіни асиі вічно виною СО вВІкаснчи мізнаско пловасо опори коассвоноє асо 360 марспшей свинок ссеноесве се сви Карен ОО вибаренве спро ов сіно запо ас посссваноє вонасевів 0 Я5О

МЕ ЕВНСЕ спон веії Виосавевис відоасвосі совревє ссасвеюс СЮ ісариасіст астссісне своснінно зесріоессі ссвнсвасн соповоссвю БЮ нссівсассі воласпіана овсяаоосє кноваєвюи аоніниесав асоарнеає 0ВОО

ПИЕСИВИ КО КаріЬ сесаюеріве севиовесяє спмеЕсВмО аосмавіє ОО івжаснес сероачнвесовавнестос сн ної сссвопесюстеаоиієнев 7КО ен неи раси нав ссисочаеас сосена ес авйоаасіе асвівнаю Я косшнварк сома схавнсавно сслстоване ароавсва сарсасдис 900 свв ев вевіссісае сенвівсас савнивсіхне іраасквова правово 0060 квсааршої ссавсаанов сснхсдоює сосаісрвев задосес сна 1020

Внрсарсосс Бабавсосвса ветрісвсс спксусся сосривоива свіцассвае ОБО пвсниви восівваое сс веОває веснсінес ссаровас снесвіввав 140 ідвдирявся вонренє кововасває озанарси сассссоне дебвиасює ЛОЮ пасристюсі снсскиа савсавно с всемодаов арчосаритв всзесвкоко 136О засвіснеї саксосрі анвощнає всвмесисв зесисрюве всиваннанс 150 «тв сере ан АБ «НЕ 1 «а БЕЗ «212» ДНК «13» Ноо карієде «КО» 1

Баршневне Вервес ник овевс ізнівсанс справив свя о варки сеісі ден спсоневе! асо нсн ссср огосносвав 120 асвноанави всі нан встав ай вніспе сів нінасасмаєциссть ВО

ЕВеКедійИ Вибув сю є вапожнасе сазан спо -0 свайтваса нествасвис соноваоасьв осоявНі ас есави еко внає 000 висівснай аовастастя сренніавне вне оревос аниевворас внісВесніє 300 іонна Есассвавнви состевніс цессосіне свсесірє савланєтюєс 5О

Шшсварнрсв свронвоссгрирсівеми вісазковсі вепесссва аосврідаси ЯКО пімевмряв встав немс с иаосявс виснікевса сепесовно пріасде ОМ) мекв тихі санснисвів вбхнсспінс ссієсарсйв сцерінює 600 сариссрюв «неви вашслевав срривеансв ссване ва свавнсУВе БО равсроелам вишіетова вдсссассо Госсоднювс свссінінос Зковеєра 70

ВЕСНСС осссесяа оре вас зросієвіцісіссспвас со очивю ЛО ща ре воківсвівкікріенасві кавссасваа кассосвоня везкпсаа сів вУ. АЮ вес вІЕУ Еш еаан Геесвавостаавоссви кава ни кацоановев 900 носківн свооВт свесви ши Спссавечоь кис овсяв савковнає СУ парссааое сс висве врпосссса рососеєшск авааверса сосвавісє МО ваш новне сссрарваєю асп пексруєєюс спісседеле Кеакнінаює 1080 аквавссари ісаносінас сіно ріс янасисів всессвисви сакосв БЮ камін вева воза кекеа восковнаво віасвана своєю снроіеви ВО

Ксрасвас сонне вет скасовев асоазравсве вівнвеносав о ХО

ЕКЕЗВСВКЯ Каса СВІННіВоВЕ вавесТС всоцосіют садове Ная о труни фути Ку хф ие руту ут ех зиск сс ірис вив ад ІМ «Ів 13 ее» 13 шт, та «125 ДИК я пекучі. ко «ах Нею зарієв» ев 13 каверів Ос пика Кв коеавео писане меКаКе соКавас 0 ризехфику ех же ую ек . двожучфитіх ужив ит фені (рат птеууит ух ту кепидсвд ви сарснсенЕ юну оон нен ссвеспвиеь 12 "пр в кс и иу КУТУ МЕ 5 су іівм й РЕ й УК ух ух кВ мух пк хі иа о: повин Вістжеаее ввиЧчКанеї аида сівнтвасно винне с ОКО сф ук ки; іеусу у теме пір жцет рми ВЕК вже висіоства ввивОосени овес зиакзавнця ссцаеаного сн Се смію еугрчи чи еф увіЕ Ки ; с пили ВЕНУ сування десіаеВос сесвовсеє см Вегінсяавне певна СЮ спеухф ли т ди су є су УВІ усу с Іф омху тех хтеуф мук Зде

Висіесаан сват а севіВіне Ве в прноос папенасонс врювесие МЮ небварівасюрааизи сосен віс кре ев свссірк саден иосноє ЗО тремо розуму щі. Ук уЖу тихе РОТІ гЯ ПЕК іч меХД мудру Ех, ер ой ту 3 щі жнив СВЕСЕВесО шия КАН иКеасх ие жсева НСС З

Мона весанреро лева ре висвівсасв ссср СО інфу тики. Вик у АЙ ух ук гейш ма гріх сті я г неживі сс саесвие вінвосііне ссіссарова спсуосаєє 00 пакарсімев сон асрі зивісвсави сссарсваря содарввка саасов МЮ вишевеци винен а реоск екс сво вінос вврасєвКа 0750 вишів мч ин МК А осо п в ОД КЕКВ о,

ЗЕ ту т УЕКт фури кину х сек аку кі вузов сеча х узи тиж хв ШІ шсрснки юшоеусвая вессчвнеде пеееовшна Кн Но если 5 сут кі тегу. г приуко дух фусьуютьуххх -- сутичку пику ву М Ж мк зевівсріри ирівнамв: вавосасева пзссосраве осавнесва сіре 0 Ка касквс ве и СВ. песнйеая жавоесиовеи зирарсави сансадовси Я пессрцмех своем свосвп кри сносакоВої восіваасво саановоає Кю завівсазно пУссваєзи авносвжса ноероссмсо ввяазасеВе сна.

ОД вавпвневис ссевавиасс вецишівівс ассстнессс сабоосоном визиа насе СОБО задзасснви свиесікис сіВосів ріс азалиснуЗ асоссансоа свіснесвн 1 нази шсиава всанивиов совка оНнио пвсміслеавя ссасвесос ові иио БОЮ ксвасенсї сеченист СІК овснин лев юов зсварнокар віврсаисви 1 шидазон й кісвес ск нове варесісінє асаассною сновевеааа МО арок ске ЕН осЕне А 154 «кое 15 ср» 3 «175 ДНК «1 Но харіенвя ка» 14 кайвінсано мине тнЕекракис Прегасвес сне т внвасіс й сідає ССС ови саронсвоєвеснювноса масо соносваве СО варни вра евайнево сарі нас навів цюнсов ОО 15О зиск свіва косо сасоаює вкзнавани оса співав ОЛЯ сазвівнаєа восіпвнаві сиревасасе неп асцмосвав авоспшіває 000 їаерасіетспанасне ПМееасКн іно восснак волассвево кер СЮ вас сив осо СВД НО сеосівесве спінсвюви маровюєюе СНО виозисвсав сироти посі ко зара поссокавос корвасові 0 ЯО ісвіревас сани азссввсвне нінсвоноі сова сени ОС) пара ст усосвК саненонв осеокі ксавсонаси свисвосюва БО аосіасвес: ровасиінок спсааессс вислиювоса вибо сосва масакйове Во свравеИ вів в сосзюр не кснасссно спін невни Зосвіоває У й оюеснааноє ованеаєВес рен емососнинорес ка ніовсю СО сени а пБаси ває сенсинарас сссвавніос вмнсваеі віасвіноюс ОБО

ВИСЕЦапе в Бен с сезвасаван сснсвонни: 0 весні снвсасвне 900

СВІВЦЕВІСВ Вокер вні ново сет де ваасерсав вуноновян 960

Ген вік соавсао ес вос оп кива важеїє сванаеєвай НМ пЕВСВИССОС вав НИОСВ ВК віцсвсс сівсссссві босвомавна кайосєвай 1050 вассвновса кеснностк ссквнісвав вна сопасвас сосен 1

Б еЕсараиса дв Є веВнНвснис Мієдярвсси сасоссові осенаоюєю 120 васедеіссі епесіств савсависіс ассдіневся зрароарети возрсавиов Зб васретня сацччссрі ва не осв все всснеасве поанаананє 20

КвлОреіні сосна ГИ «41» 15 «ВИ» ТК «АТХ» ДНК «ВРУ» Ноте мухеве «МИ 15 саршЕсаис Ме НИс іван Ес Віваро пива чВніК хана ща вхавівсав сви лЛивИ сасопране пекінес во еваг осиосявиоє СОЮ ссвенсване вив анЕ пів лозвн зе ноатх вібкаанвіннавюви КО неВнасе кави осе свині нови вов свя нва саено я дев КВ сажки важ ванвас ви нвої вн вич киКанасчае Б

КВКЕВЕШЕ аствсікекв совкекнасс сцен евесн скоснне п авоспесНе 350

ДЕС шЙШОСОСЄ ввСВКОосіве осавкарса осісспярав сасивеввос о 20 соврдеє екіскчо ка стновоє кеноскитва соте ннєвове МО восени ов ясвеасисВя саесцюсся оп осіно зрази сн асі 0 сеарониси рцносві воссвсвис аасмсруєз сосвнасєва схмровас ОО дівиатєнсяй песосадева суксани вів озоаавасза Модиссеаа МеНННЧЄ 00 канкерене оківоесовеє асеаесі ніх вопррюєкЕ сарене сйссюєсюв 0700 зваорачви все есн ввів: жооріране овес вені 075 кевнвесісв ванассоюдВ войссчвНне засмрасн емо вЕ кооеріеВі ВО знсспчва сваниссЗеВ вана ноае йонасчвса српсовни вніонеск 900 сісвссвця тясакочива сін исває песвариниї вена Ви еОюичо зво занвзосісє саиоссссві сриваннасє айсбосвана сопло веоскецеза 1920 ссасВеї асисєсвоссосвіссски павенемоз сснасаасси ввісаресів ОО ассіцеосіце свавеосв сіоссовос виспісовосв грраоисва паксашнив 1 скарссввава всвасінсяя опєвсс сосацеєвю ассссасвв сосцеве СЮ сімасвнев прсіраєсее коасваевиє десіввсавспскровасві нев 1260 сна чоавиююі веастюсвоівсасесара драросюісссмеюсв БО нвізаи те «У 16 «Вт ГК «віз» ДНК «ТЯ» Ноннузавіня «КА а сарвінслре пвіеаС еле руавалс вевніссаро покичерісогінакаєе 50 телвівече сен ечи ассисви века Та ЕЕв ос вОеТавись хо сезвровави вести вової вас вима роза вана ОО внесіюст івавеКнОосе Вика сававаса виосавреаа спол С сірсаавіви асвносі вар воосочекає верес ВіннЯ ро раранваа СО

ЕПріНСТЩЕ кни квИ сопе рое Сіпрісвсся Клоставссареасснаю 350

ЕШСОСЯСЕВ НІНО креШОс ис сви нарсп сісовВЕВи СоканонЕОє ОСЯТО сівраствос іевісвавна сіаспсоєо вавссв інв сені ніс наведене 8 кеюікасся вевисківев саоснооса верес щиесісави всю 0 ссвасавсВ Мово сої всссісвио аасчоносв сссвнасеів сасстрсаво СЮ нідкВевса вискснрева сародарнх васвараєтх позисусза пен об каківссонс сини есавс весассірів поз нассю свиіенестсйоссссюв 75 наасосайня зсхосєа! виессве вссосіввнв ісвовіосві вніврівнає КО кОанЕсасе зважене кр ю вет рівсв рнпсносме неневін 0 КЯЗ ажншосвака сааваиссчов сианенисно позасяроесвиссвне висавеше 900 я сВсСВНИ Івевосавна срхотиане вемажевци асевнесви весен 60 зачевостс сашеюссві спарадивоєстюсачия ссавановов вроссвавов о 107О ссеновотоє ней нер СОВИ сме валова сазана вона ОКО аосівеєнев аа нен часосовре воовіснесн шва вЕна паусанцвє Я гаксевнака зсаастюва езосаювесі сосанимев амссвасви сюооне СОЮ сквевиса заоч свасиада всзвиіносарс авновазсвссюве 60 нев нне вази веневаєсне вк асесяна воаелесоснкаюся 32 внїНй 1 «а «кю 6 «2» ДАК «Я» Бовло кана «Ме 7 савоктреано онікс пен ееноке ВЕН савс сижвакн осцриннне ВО ініновЕ свв нані свосневні зисБмекевВ іреаєвн ссвесновою ОО зжакиснади крона неси віче века НМсВ кІВАЦВН НН нови осв нав ноКов асо осакванов насе саке ОС) ківезай ни жен нив звосваанасасревк аиасіес варанирави 00 вЕсЕВЕІНИ пастви и сопло сіре н існував ЗО ввсостеви спосо десисесиоссвевавсв сої сваваи сасавсвеос ОС2О сенс іКвеЗВнова сю НеСоє павосовіва сеоісвін давмсавно Я дО Жи деБНСвИсе сасспоссв ВеиОюгає вивнтодну аби ОСЗ4О сіскоовосв іш Илвссог осостсаре аасисвееа сеспоюсі спссіхоаає 0 нравенса писссноови спосаве сів васавочеви пранесвовалнонояє обо саврносмиє срівсосаве носа йсанвиссв сно спесрсксв о 720

Виоке іо моно Бажісосви асосстфщавн ісаснів кніниає УВО віраносвисв мімоосеєна кої евніс пастора серасвневі кезарівкай ВО авссавна саааросвоя вовновеєве Певнсврса сейссоє веїсавсше 900 сісасокИи исвесввеВ СТ НВаЄ оисволриеє попеогнова вніс вас 0960

Ко завоює сивурсссв сенкчаааасс вБмссаяав ссвааввоса веросваюва СОЮ сспсвинци веноссівос сов сне папка кована нсоВ піранесх ТОЩО зесівсоре свааноон сіоссссвос васаісвесе рив ніпина вапсащесм 1150 сканссправи всечасінсвя засне сосаново юомосвисне со ИЮ сіївоввев носієві крисавнаво парі всаво зеесиаасв наче 0 СЮ їссдіиаіне ВПС розевассзс ідевеясаки повною і еюси ОГБ2О ява ще «0 1 «а КИ «Зоо Бічох «213» Ножею зщрене кН Юх 18

Сів Уві сів без МВ СНИ БВЕСЯ У Ай сим Мі Сез бе РКО ЄНуУ АК і З ТО їх

Мет Ущісує ді загсу бує Ма яег СЦуУ Гук Трг Бевз ТВЕН Ле) 7 Ме 3

Ян ПЕ Ця в У амв в Ма ра пу ув Сі г ви СПА о М

СУ Ре у Рго СЛ АВ СНУ СЛю ВІ Пе Гук Але На Гу РВЕ зо 5 ВО

ОсівсмЯУ Аг УВІ БВ МЕ Те о АврогБе Зеє ТВ Авр у Аз Бус 7 та Ба мес ів се че а АЕС ОМ АВ Ве Лів Ук ек Гук Сук 55 о о5

Титов Ахр ее ет слу їжу Ре Авр Бує ТО СПУ СПА СЕ ТВ 100 юХ Ні ев Пи Уві бек зе ТВ був У то ет Узі Ре го з

Бем Ада Рео тує Бек ки бек Те ек Св Бе Те Аа АВ ев СУ їх 135 Не

Сукіжиа ха Ав Урі ВНОЇ Роз Ма Кн мах Тур 5 14 о 15 їв зе сих Вів без ТВхоех СНУ Ма БИ ТвВу Ре Рг5 Аа Уві ви Со 165 НУ: НЕД

Хекбек Лу беє ГугЖегіди бек бе уві Уаг Так Уві Ро Зеу бог 150 іх НН а рн Яту Ге сяв Пн Гук З Сл Ази Уві АБО НІХ бух Ру» БеЕ 155 м 2 дав Мн Суб Уві Аз був Те Марс ат бух Сук Су УС Сух о ГУ хо

Ре ра ств Рто аа Ра ра МН ма СНУ чо зна Уві Ре без Ре да 3 35 240

Го Ро у Рез Сук Ахр В хо Меї Це зет ге Пи Рез С Уа

Те Сув Уві Уві Уві зр Уже Ні сів Азо роя УЗ СНИ рве жИй 21 два рої Ук Уві леву У не Уві Ні Ака дів бує Бін був го їй зво ака

Аг МО СИ Ов Бе Аза бек ТВ Ре док узі мар веб У бев Те 290 53 щю

У У хв Ар орі ви Аа СЯ СУК СИ ут ук Ст ж У що що З З

Баг Ан Ел СУ За н РО Аа то Пе Сн Гук Тве Пе ех Бу ТВ 315 З 335

Б су Св Ре Аг По Рез Св У Тс Тв бем Ро Рго ех йге в

Ки ще що сів сл ме т ух Аза св Ущі еек ев Те Сея Бен Уві жк СХ 355 Б 305

Бпе Тук Ро Бер Ахр Пе іа абс Тто СЯ бе Ав Су СНИ Ро

Зо Кв Зко

Сни Аки Ав Гук Бех ТК Пе Ре Ре Мес ев Ахр бет Авр У ее

За Км 395 щю

Рее Ре ем Туг Зег ув ев Гог Уві Ахр ух Бех ати чи ОБ СВ за 4 МУ

СИ Азпоучі Ре Зекітух заг У Ме Мія спи Аз о Ніх ван Ніж ря чй Б

Тут Сів був Зет Ге Бех Бен ми Ру СПУ Гух 435 щ-0 «НК ТО «11» а «12» Бідок «13» Ноще карієвх «УНК» 19

Сів сна без У Спи зе сну Ада син Уа Бек ух Б СУ СНИ і З в 15

Жесісв бух Не Бех сук Бех ОТУТ ує Бек ВВЕ ТНК аа Гук

РІВ вже Б

Те вх тро Уві Ае ОвАа Руо Спу уз СН ев Сн ТД) Ме

Зх Зо 45 сІУ Де Пе Ту Ро СПУ кв ЗБ хо Те ат» РНе бас бо баг Ве

Сів спе єв Уа ве бе бек дів Ар ук ек Пе Те Те Аза Ту» по 7 75 ЩІ

З

Берна тв бек чеком бух Абе бог Ахо м 0 АБЕМЕС БУЄ тую Су»

ВХ Бо 5

Дів Ат НІХ СПУ МК бек Вег Аз ТУ Те СПК ев Азро Уві ру

Ню Ів ма «Нвону ВГ ВХ Уа! Тех Уві Бех Ав бек ів Її ле Су Руб Бех 115 НН ї3Х чай Ро ем А Ро сук Аги ех ПН бе Си бог ПА

НЕТ 135 140

Аід тов сі Су бен Уві ля зр гу ее б спе ри Ма Бк ма 13Х 130 іа їБО

Бог Те Авочн СНУ Аа бе тво СПУ Уві Ніх Те не Ру АВ, 165 г 195

Ук ісвсна бе бе сну це Ту бегісю ет ек Уві уві Тв Уві

НВ 155 НВ

Рез бек зе ха Ре СИ пе сне ЄВУ Тут Ну Сук Ако УВІ Азр Б 195 г 205

Гук Рго хег Ах гі уя УНР Ар бух Те У Сп Ахв Бук Су Су ка ЖІх ЗА

УМ КВ Сук Ре Рг сл ро Ав хо Ре Ма Аа СИХ Рез вер У ді ий І 235 4

РЕ ва вне Рго Ре Їду Ре ув Ар ТЕ Сем Ме Пе Же Ак ТВ а 55

Роси Уві Тв Сує У Уві Ма Лкр Уві бек Ве С» Ахр то СИМ

ОО 265 270

Уві сла Бве Лк тр бук У зр яЯу Уа СНО Уві я див Аде Блих

А ЗО Ка

Те у о а СИЧ Са На Ре Уха бег Ті Ре Ага Уа) Ущі бех 29 295 Мх

ЗО

Уміст УМ У НВ СЛо Акв Пр ген ак ЕК КВ Кук Туя 305 З 5 що

Сувіле Уві ме Ак же СИХ ем Рез АМекО Пе Си Ток ТНК Це 335 З 335 щег у М Бук Сну СБ Ре Аг ОН ТО СВ Уві Гук Тв їжа та

З 43 350

Ро ек Аг СЛ СП Мет ух Ав сп Уа херев Пк Су еи 355 Зо З

Мар руюсну Ре Тек то Зеє Ар пе МІВ Уві СО т то Сп бек Аа

З Зх зо су ів Рон ха лев Гу Бук Мн Зв то Кто Я ев Ас Ве 385 З зх здо зву зе РНе ріс ем Тур бег ув ем М Уві ларі ув ог МЕ 485 ще БУ фе св са Спо Ав У ріж бек ую бег Уві Ме Ніз Со дід тео а 425 що

Нв Аа ЕНя Гук Твг Са Бук век жене Ге век Ре пу Бух

У 30 з «ДМ» хо кої» ях «ВІ Тих «КІЗ Нотше бармевх «НК ДО

Сів УвСів Тер УВС БУ СВУ СНУ бен Уві Сів Ро СНУ СНУ

З в: ій 15

Же бен Ат ее СУ Ай Аа бет СНУ Ре ТП Ре бе Ту я в й ха

А МБ Вк Тко Пе Ах Св абз го У ук вк ем Сі тв Уві

Ка 35 4о 4 ет Ада Не Аж Без Аа ню арт Ту Буг бо Су вет УЗ Бу

З 58 БО

СИХ Атв Ре Тог Не бек мо Св Ав Ма Гу Ав Зег ен Буг Тем 7 З що (Не Ме Ах ех ев Ак ААУ СНУ Ако ТНК Аа Уві Тер Ту СУК Аз 85 ЗО п тв Сну СНУ АВ сну Гук АЗИ Гугазр Кує бук СНУ Це Авр Уві Тер

НВ 105 о спе Оу ТВ Пн Уві Те МНЕ Бек бек ма бек Тк Га СНУ Ве

МУ 120 125

Бек Уа РВЕ Ро ву Ан бто Су жає Ате Хе бік Бех Сп Беє Пе

НВ

Аа Авіа НУ сСуві су Уві ух АБИ Гук Ре чо Сх ко М ТВх 155 30 155 160

Уві Бег бкр Аха Бак сну Аа ев Ву бек пу УНЕ Ні ТВеЕРНе Р

ІБ Не ЕК

Ач ев Сів ер зе СНУ ев Буг ост р бек ет УЗ УВЕ ТВ 15 ІЗ Не арго ех мех Ава Бе се Ху С Сн т Ук Гн Сух ака УВІ Ак ї2Я 200 З05

Пі Був го ет хи ТВ Тл уві Акр ух Тв УЗ СНО ато ДУБ КТУХ оо ЗЕ о

Сук Уарспн Сух Бгто Рез су Був Ав те то Уві АВ СИХ РО бе 28 Ка 235 274а

Ук Ре ев Ре ру Р ух ро їж Ачо КВ ви Меє Не ех Аа жо 253

Твгето сів Уа ть Сук Мн уві У Ахо Ві бе ПН: СЕ Ар бе 26 щОЗ я с УВІ СЯ РОе ах Пр РУ Уві ар сну УАЕСЛО УВІ НІВ Ахп АВ за ВО пз

Сук тв був Ро Ат Са Спи ОВ Ре Ази чок ТВ РНе Атв Уді Уві за ОХ КК

Бех Ма ем ж УЗ ма Ні сив Акр бо бен АвВ СНУ Був СН Кук 05 КО ЗІЗ 333 і узСузізув Уві Бе ки Бу СПУ Бе Ро лід Рго Не яв ую Ту 325 33 ад

Пе Хек бух Не бух СНУ Сів Ре ев СИ рго спа Уві бує Зх Бен 340 35 З ко Рез ек Ак ОПОВ МЕТ Тл Ах Сни Уві бек тем Пи Сук 355 за Зах

Тех Уа був сте Ре Гек Ре ех ля Пе Аа Уві Св Те Ох бег 375 КО

Аа СНУ Спа Р СНИ Ази Аа Тут бух Пи тв ето Рі МЕРЕ со Ар

ЗА 390 За ОО

Хег АВ У Зет ВВЕ Не бен Буг бух ТВ Уа хо ув Бех зх що 15 був пен СН СНУ хв У ре Зек бує ех У МЕБКІ В йів 420 425 о

Геч Нв АхИ НІХ тує ТВгЄМа Бу ек оп Бег Бем бек РО СПУ Гух «33 що В «ЯК З «іх Я «и Буш «13 Ново» варнець

КІ

«кю в

Спа Уа єна бен УК ОНа Бек СЛУ АВ КНО Уві кл бук Рго СПУ АВ, і З ЕЕВ) ІЗ

Бех УВУ Уві бек Сх С Уві бе Су Бе Ле бе ТП СХ ви а Кк 3 бек Уві Аа Тр Узі Ак св іа ето Су Був СУ Бе СНО Тур МЕ 3 а0 45

Сі» слу Ре Ар Рвх сп Акр ну ув Те Не Ту Айа сно був Бе 5о з бо сну Ат Уві Тв еп ТвеЕсНе Аво Гн бе Ту Азв Пк АТ УЄ ва й 5 хо

Мессно бе бегЗеї ви Ате век См Ажр ве Аа Уа Тег Бус іух 85 90 Зх іа Те Те Тер ко Рів Ні рве Аха Ве Ттр СНУ Спа СУ Ту бен ню Не Мо

УЖ Не Уві чер чог Мія Же Сх хе СНУ кро у Маг Ре Р ев

Но ї2о ІВ

Аа ро су ее Ато бег Тв хе су Бех Те АН Ав Тв Сх Су 1 135 Не їее Ма Був а Тут Ре Р СИ в Ре уні Тву ві бек Урозв вег 135 15) І 160

СУ Ай ев бе бек СПУ Жан Ми ББе Без Аа Уві б Ся ек 155 НЕК 175

Хегспоі« Буре іев ее УВУ Бу Маг гго ет Бех Акв це 155 тоб

Би Сік тв Спа ГП ує ТЕ Су ха Уві Ахр Нів Бук Ро бет лов 125 юЮ я

Лі бує У зріле Уа сна чні стю С УМ С СУ Мо

АЮ ІВ Ку;

Рга Су Ру Ай Гео бо Уа АВ У Вуо бек У Ре оо Ве Ро ей 3 ВІВ за

Рг бук Ре бує Ах Пет ев Ме: Це ву Ат Те Рез КИв Уві тв 245 ЗБ 355

Сук УВУ УА Ахр Уві зерня Ов Ар ее Уві сна Бе Аза

Ой 25 я

Ятв Ту Ув Ахв Сх Уві Оу НІХ хв мів Бра Тк Був РКО АТ

СМ ОВсНВ не Аввояке ТК Не Ат» УЗ Уві хек жа) ев п Уа жо ОХ о

УЩНІх СПип Ар Вр аа СНУ ух На тугі ук Сук ух Уві мог

Зо БО) Зх БВ ка бус» бе те із Ре Пе со б Те Пе Бех бук ТІ дв

Зах Зо 355

СУ бів Рео Ак бін ко Со Ж) Тек Ге бео Ро Роз зе АХ СВ о ве з «Ми Мч Те бух хв Спа У Зек бе Тв Сую бен Уві бух Су Ре за 360 ЗБ

Туга Азв Це Аа Уа См Тур СО бе Аа СИХ Сни Ре СНО

ЗО КА ЗВО

Ака щі тугі жа ТЕ г чо то Мет со Аз» бет Ар Су ее Ре

За Ка 395 що

Ріта Ту г ік вм Те Уві Ахе ЕлаБег Ах Так опа Ох Су

М НО 415 ка Уві Ра Зек Су бек УЗ М я СИМ Ма бен Ні ап іх Тух

За 335 а

Твеспв Бук зе ід зег бе бер о СН у ув

А

«Нв «а см «12» Бик «1» Нет зарієав «ню» 3

Зів Уві «а Тез Уві СЛ Заг сНуУ СИ СПУ Ттр Уві Сів Чо Ну СПУ і 8 їв 153

Ніс Ат хо Бе ух А АТО У Ве ТВ Ре мог зе ух з а о дармМеЕ ги то Ущ Ага СК АМВ С сх Бо У Ви Кто Уві 35 «о аа ех СНУ Це Ах Ве У СПУ АБО ТВ ГУ ТУР Аве У Гуз

І 5 5 су Ахв БНе ТВу Це ат Ан Се али А ух хв бог Уві Тег Каев 53 70 3 о

СО Мі ляже Пн бе Аа А КУ Ахро Пн НМ тує Ту ХВ зо Б За

Аге СПУ Пе Буг су ер Не тує Ту Тек СЯ у ев зр Уа тр Су ню ів по

Вів сну Пі вх Уві ну Ха Бек ех ів ес Сну Гуз СНУ Рує ее

З ЦО о ма Бе ен АВ Ро Сухе ат Ве Я БК С бек Пи АВ юЮ І 14)

Аів ев сухі Уміло гу ре рао бро Уві Ву Ма 145 і50 155 180 дек трап о СЛУ Аа без Гб бу СНУ Уді Нів Тве Рве Рг АВ і НЕО їх

У ев опа зе сну їжи ур ве іл Еге уві Уві ТВу Уві 1 Це 190

Ето бБег бог Ав ве НУ Кп са Те Бук Те Сух Авп Уві Аво Но 195 Я ІЗ

Блю Ре ех Авв ГВе Був Уві Ах ж М УВІ Си Ат жа Су ух 213 715 20 ча Зір Єхх Ре Рта ух та АБО РО Уа Ав НУ Ру Зак УВІ

ТЯ зо 3 240

ВБе жо Бе Роз го був Ро Був оАво Ву бео МБ Не бех Ах рез М 5 об У Тк Су; Уа хі УагАхр У бек НІХ СИ хв есни о Та З

Уа спа ве Ах хв Гук Уві Ахр СТУ Уві Св Уві Бх Ахо Ав Тк 47 ва ЗК тв гук Ре Аке сИо Св спе Біне Ано Яег Бе вне ати ВЕ жи щег юю Ох З

Уві іеи ть УвЕ Маг не Спа дер Тез Сем Авв СТУ Бу Ов ук ук

Кв Зо З 32

Сувіує У ет ази ук Су Беж го Аа Ра Пе С ух ТвВЕ Це 325 330 ЗУ хаб ТВ був СНУ Св то бан Се то а Уві ТУ іх ав те

Бе ах 5

Гн бес Ага НВ ів Ме: кіля ваза со увібенкі ха Те су ев 355 ЗО Зо

У іжпУ Бе ук рію Зег хо Пе Міз Уві СИ Терно бе Ах

З 375 БЕ

Се сів Ре Сун ах Аби Тег бух ТНК ПТО Ре Ме ев Акреех 35 кю З 00

Ази сну Бе Ре Ре те ча Бе Сук ев Мн Уві Акро Зухе 5 АЕЕ

Бе що 315 ев СНУ ка Ма Ре ес сю ак Уа МБ Не Си Афя беч 420 А аа

Ні Аж ВІ: Кут ТВ ОБР Бк богів Зег ев зе чо сну Ду

ЗА ве ах «ід» 33 «ар» ах «б» ВІдок «аа». Цето щен» «НЕ

СП УВІ СТ Сен УЧ СПО БЕР КНУ СНУ СПУ бе Ха св бує Се СНУ

Н х Іо 15

Зегієв Ах Ге Бер ує Алі ее СПУ РВЕ ТК Ре ех Пух

ЗО 25 Б

Ме ЕНя Те УМ Аги Спи Ті ТР цу ув Сх Тов На тт Уві 35 я я

Мк А Пе Аврісв а Оу щи ТВе Те густо спе бек У Сх 5 а

СПУ Аги вве ТВ Ло Бег Ати СПВ Ар Ав Бук Ажп чех Сен о Туг Ге 53 а 75 що

Фів Ме Ак ет Тан Ак дів СПУ бер Бема Уа Гук Тег Сув АВ 85 За ах масу еру Гера г вер ТУЮ бує СНУ Пе А У р

КО Не по

СПУ Спа чу Тв ле УВЕ ТВ Уві я ер Ай Бек ПП буку Кр ше 126 135

ЗВ зе У РНе то ев а Безу ек ад ос Пе зе хни а Пе 1 135 о

Ан дій ев СПУ Сув ва Уві бує Ар тує РВЕ Ро СИХ Ро Уві Ву 143 15 135 180

Ма Бест Аа зе НУ Лів ев Пе бек іх У Нік Те не Ре 1655 гл ІБ

Ав ев св я СНУ бен Гук бе ви дек же Уа У

НО 155 15

Уві Рхо баг ет ви Ве СПУ Те сте Гу у ТВ Суб Ав Уві Дер 195 МЮ щ5

Ні бух р Бек Ав ТВ Бу Уві Ар ув ТР УСНО Ат Бук Су

І ЕХ й

Сук Уа стВЕ Ст то о Ст рто Ах Рто рт Уві АВ СНУ Ро Зет

Ко в 235 240

У Ріє хв Ріє Ро оз бак Без лих Ако Тк їжи Меї Не бок Ат 245 еВ 55

ТнеРаєсін УВі ТВк Ст УВІ УВЕ дя УА ех із БО Азов

БО за Ка

Св УвЕсСня РЕ Ахв Те Гук Уа АвоєяУ УВЕСИЧ ві Ні Аа АВ

Тех Ве Сук Кто Ан СО Се СЯ РВЕ Ава Беє Те пе АТ Уві Уві о 295 Мю

Жах Уві Ге УВУ НЕ СИ Аяо Тер зе АНУ КНУ бух СТ ут

ЗО КЕНЕ ІЗ 35

Ге Су ух Уві Заг Аха Бук СИХ дні ую Ма Рг Пе СЯ чує ТЕ

З ха 335 вк

Ме Зегї ух ТП ув сту (Ли го ато СЕ Рхо Св о'Ув Буг ВХ гео

КО 35 35

Во бо» ех Аг ОВЕ ОВ МЕС бух Аха СН Уа зер ев ПМ ух

За зез їж Уві Гук СТУ РЕ ух Ро ет АЗе ПЕ АВ УВЕ СНО Ттре бе

З 375 З

Аха су Св о «Пн ака да Гугл ТВ ВХ Ріо Ро Мері си Аве

Зі зда 39Х що

ЗегАкр ну МЕ Ре Ріє бец Гук бегі хі ви Гог Уві Акв Був ог

Кеоде що 15

Ат Тер ов не СНУ Аа У РНе Бек Сук заг УвЕ Меє Не СНИ Кіа

Я20 4235 а іх Ніх Аха НІХ Тух Те Са ех баг бен Зег і ем бе Ру сх бук 8 що 345 «м Я «ії» ме «шій» БІЛОК «РУ» Меп; зарієне «ХК» дВ сп УВЕСНВ Гея Уа Со Беру СПУ СНУ ж Уві Сб ан х СУ і я: 10 15 юегішоа ги бен зег ух Аіа Ав ет СПУ Ве Те Рне хе ТНК гук

ЗО ха хо

Авр Ме БЦ Корма! Ато Спа Сб ПР СНУ Су СНУ ев Се тром а 35 40 КЗ

Вега Пе хр бен Аа СНУ Ахо Ме Тує ук Бгто Се Хек Уві Гук

ЗО 5 Її

СУ Ат рве Пи Не ет Ат Сн Авр Ан бе Ай чер Бевз Гук ев 54 Та Тх хо

З

Св МЕ Ах чек Б вмслнх ау ор ЕЕ А ма Гек Гу Су АВ

ЯЗ що 95

МВСУ СУ АМКУ Тує Акв о Тук хе Тує Тук СТУ Ме Акр Ма Те що Ох по бі сиву Те вх У бе Уві бекє бек Зі жах ТВ Бу СПУ Ба дек Ма Ріє уз беж А реУ Слух ек Ат Мет Кг Мега. ех Те 1 135 в мів А іо СУ Су без Ух Ар Гу БЕ Рез «Ми Ру УТ 145 БО 155 192

Уві ех Ттроам зе СПУ АВ ев вт ве СНУ У Б Те тва ро 155 г 15

Дів жа ев Се вх мех Кен Тукбекієм Зог бег Уві Ма Ну їв її 1985

Ма Рго бек бек Ак СЛОВ ТВ СВ ВЕ Тує Се Сук жа Ма Ар 195 2 205

Ні бук бек Аа вт ув Ма Аква г УВС ув у Ср в І КІ

Сук Уч спи Ст Ро ро ту» Ро а Ро Ре Ущі Азв слу Рробех

УакРНе хв вне Бу Бу бує Рг сук Ахр ГК бле Ме Не Зех Агро

Ко 35

Чер сти У Твесує уві У У азв Уві Бех 5 СИН АС Ро 2 ія В:

Сле уві спе ре Аа Тер Бук Уді дару Уа Уві Не Ах Лів. 273 КО й

Тех Тк отв Ро тв СИМ Св Спа рію Ак бот ТП Рве Ате МН УВІ

М

ФК Ох Б

Зеє Уві їж ТВ У Уві НИХ СПА Ар тро Аз СНУ Бук СВ рух 305 1 ЗХ За

Гевсув Са МВ бок Ав Бу у ев Ре Ав Рез Ме СЯ без ТВ 325 З 338

Кежек ух Ми бух СПК СВ Рез ме Сни то сни ма! Бус Тв їжи

ЗО 35 350

Ро Рез сег Ас СНИ СВО Пі ух Аа ст Уві ет цем Пух

БА зо 35 їжа Уві бує СНУ Бе УК Рі ет Ахо Не Аа УВІ СПИ Бур Не щеК

З 375 Зк мису Сі бтаєсни Ав Аж Букі хв ТЕ Те ба то М г еч Аво

ЗКУ ЗО КА БІ ям АБО У Зсог РБо Бе жо Бук ех Бук бен Те У Ар ук ве «0 430 315

Ат росла спа СНУ Али Уві Квебек Су Беє УВА НІХ СПЕ В в: БЕ що із Ні АЖИ НІВ бук ТВ ЄМ ух ек бен же ем бог то СЯЄ ух 435 440 ВК «АМх» ЗХ кар» ЧАЇ «ій» Біок «У» Бпро варів «ЩЕ» З см уві сів Бе У СТИ Бах СПУ СЛУ ТУ Сем Уа сно Ре КНУ СТУ

Н в) Но їй

Хеб ев Ав Гек ех Сув Аа Аа бе СПУ ВВЕ Те Ре Бер Мет Гук з 25 30

Ази Мер те Ттв Уві мех Об еАде Пе ту був СНУ ев Св тов У ві аа я

Бег Аз Пе Авр Ту Уві СУ ко ТВ У Ту Бр Су кер уві Бук х) 55 ща

СПУ вта Ре тв Но аг АТ ОН М Аа ух два зе бе ГУК во а а 75 ща

Сів Ме: ана бегі ев Ат УВО Акр Пне аіЯ УВІ Ту Турсув АЇВ

Кк що Ух

Ас ену Авр Тує Ахробую век Буг Ту СНУ Мет Акр Уві Ттр у кю ож а сне СПУ ТВ Вк Уві Тк Уа Хек б АБ Зеє ТВК ук КНУ ХО ех яв ху; т3х

УВЕрБе Раз ви Ав Біо Сук бек ати Зег Ну Чех СНО Заг ТНК АВ 13 135 140 дів ен ну Сук іов Уві Гука Гук Ре Ро СРО Уві Пи Уві 135 150 155 ї50

Щек Ткроава Зег Сну Ва реле ее У НЕТ Бе бо а 65 І) Но

М Бсо сли есе Су бою Гук зе іже бек бот Уа Уві ТВК У іщо 155 ВО

Бо ес ех АкВ РНе У МП бле Крут ТЕ Сук ха Ма Аза Но 195 щю 05

Бук Ре бах ав Вт ід УВЕАсрітуа ПЕ У Сии Ав лук Сук мо іх 2 ча а ув хо РУ Сук Ре Аа то рю Уві АВ НУ Ро Бек Уві

Ки Б Б ве;

РЕвісв Рне бо то ух Рез ух Ар їв Ме Пе бек Ат ТВе

Роса Упі Тв Сук Уа Узі Ул Акр Уві еє НЕ СНО АБО РАХ ОВ

ЖоО аа ка

Ма сп Ре ха Трек Уа Акройу Уві Сб Уві Ніх Авя АВ ув

ЛВ ух хо А в СЛУ ОВ Ве ва ее Ве Ре Ат Уа Уа ог 2О0 КО жю

УВЕБерз тв ув Уа сб кв тові жо ази у ми Бус тує

Зо з ЗВ ЗО

Ста їде У Бек АВ т КУ бом Ре Ада Ро ПЕС Був ТК Ве

За 3ю Зах ек ід Неї ля СУ ца ро важ См Ох Уді КУ бом ко

КО Зах З рус ех Ат СПИ СВ Має тре Бук Аа Св Уді ех ем Пре ктух Бен

З6о 3 ан БуЮСНУ РЕ гук то вех Ар Не Ай м НЬТтр СЯ Бех Аа

Кк ТУ 5КО

СНУ Св Ро Спо Ав йон Гу жк Те ТК Рг Рез Месіва Акробех 385 З 55 КюЮ

Азвспу Яег Ре ре о тк вк ую ен ТВ Уві Ар бух че Ате 05 ща 15

Зв дів єв у Аа УЗ Ре бек Су бе Ма Мех Ні СНО ін Тех

Я Я Я)

НЕ АЕН Кук Яга Гузеу іє Зег си Зег Бо Су ув

НІ БО За «Ов «Ера з «вра Бшок «ВІ Нопю знцев»

«ню с спа Уа Сів без УВЄНа мет сну СП НЄ Уві УВЕСНАИ РО СНУ Аге і 5 ІЗ) 15

Бегіснаме ен сг сук АВ із хек СУ Ре Тік ре бер Берг ук 0 25 о

Су мен тд» М Ат сни А то СУ Був СНУ бе Спа Тер Ук 35 в з мів Уві Пе Тер Тут СНУ КПУ бог Бе Ек Бест Ав Ахраех У 3 БО іу5 СУ Аг РЦЄ ТВ Не есте Ар Ав ес був Аа ТВ Бе Ту 5 7 78 ко

Геж всем ка ек ев Ат лів сни йяр Ге Ав У тує Гук ук ща За 3 вів Аже ко бу СПУ СЕ РВЕ Ахо Гук ер су Са СПУ Пк Ка У ві

НО НО 1

Лін Уві бег ет Ан У Пе Бук СНУ Ре бех У РБе Раз Те АВ 5 120 125

РтоєЄуз бег Ат бег ТВеБСЕ СН Б Те А АТ СПУ Суб ев 150 135 10

Уж Ав У Ра та спо бо УВК агат Би) на ее Не 145 НК 155 150

Ав бе ТВ бек Сі У их Те бве ую Айвоу ві Кв Св зе бек 85 НК ут

СНУ ем Ту Заг Гек Зег бек У Уві Тк Уві бто бере Ам Ре ще їз 190

Се ТВ ОВУ Тв тех Тв ух аа ві Ав БИ Був ую Бег ха ТВ 155 20 МО хе Уч Ар ух Бк Уа Оце СУК Сук С Ма Сук то то що 815 а сук Рг Марго Кто УВІ АВ У Бр зег уві Ре ев Ра го Ро ак 3 23 ви)

Гук Різ Сук Акр ТЬг беб Мох Не есе Пе Ран спь У Тк Сук ах 30 5

Уч ВЕУ ер УМ а БО Аа ро СНа МВ Ка Ре Аж Кр зай за 70

Туга Ах сИХ УВ ОВ УФ НІ Ав Аа Бех ТІ дв РК АТВ СВ

СЛесЯа Ріє ха Яее Піх Ре дгк Уц Уві бек Ук жу Тк У щі жд аа ех щю

Ні СВ Ар Тор Ген Аа ОХ був а Гук Буж Сух Буя Уві бог Ав

Зх Б 315 30

Бк Су дев Рв» АН ую Пе сно у Ку Ме Бех був Геї же СИХ

Б З 335 сів Рко Ася СП Рез Св Уа тує Те Теж Ре бо бег Ат СОН

БЕЗ зай 35О

Ме Тева Авп то Ха беєбев ПУ Суб во ха Бу НУ Бе тує

ЗХ З 305

Ро Зесоавр Пе А У Об гр сте Аж СНУ СЮ Ре КВ. Ази тю 375 ЗБ

Ав бурі ТЕ ак Ро че бер іже ер Бе Ар Оу Бе вве Рок 355 39 За що іга Тур бек жа бе Тр УЗ Ахо бе Бех Аг тр спа Спа КНУ Аа о жІХ

У Ре бе Сук Бех Уа Ме НІХ СТВ Аа бе БНя дев НІХ Бус Те

4е 2 Яд 0 спі к ек іже яке ев зе Бе Ок лях 35 ве «А» дя «ії ча «ж НіОок «У» Ново варієвя «НКЮ

Сів У сна ев Уві Спо ЛУ Сі СПУ Уві Уві Ов бро Сх АВ і ю Ід 15

Зегріен Ага Бен ог Ст Аа ів ех СЛУ ВО Гага чер хар ух зо зу за

Су Ме іх Те Уа Ат в Ка Руєнсіу бук СПУ і са СН То Уві 38 БО 45

Аїх Уа Не Тур Гук Те СПУ Бек Ам бук Туг Тух Ада Ахр ом Уві 58 ЕВ

Ту слу йхв Бра ТвВе Пе бе Ати Мкр Аз зе ід ко Ме ех Ні 5 що ра: о їсхо Сів МерАхаетієв й Ав Сум Ако ТЕ Аа Уві Гук Гук ух що п5 ків ли во СУК СМ У Тух РМе Ар б тр СПУ НА Сну Тіт ієч Уві

НА З НН;

ТВеУвЕвох бех Аід же Вс був су Кро Бек Уа еВе то Бе

Різ Сук чер АНЕ ЗеК ТИ З СНО Б У Аа АВ Се СПУ Сук ем о 135 ОХ

У Е тв яв ту Ве то Са Кто Уві Те Уж Жах Тр Аква Зв су 155 15 155 150

Б ів о Щі зе сну МНК ТІ РО гро АВ У Без сів ее 165 То 175

СЛУ вна Кук ек без бебЗег У Уа Бе Ні рев ек Бе Аз РВЕ

Іо ів НА

СНУ Твг На Мн Тек Пи а Ах У вхр Ні бух Ро Зег Али Це 195 щюЮ КІ

Су ув аАхв хуя ПО ув СНИ Лев уз Сх У агоВистк Ро бто сук Ро ів Ре рто Уві Діву Бе ех У Не дв не Ро Бе

ДЯ А АВ 240

Гуз Різ ух Аяв ВХ бен Ме Пе ех Ага Те СЯ УцЕ П Сух ще БО ро

УВУ Уві Ако Уві чек Б ПУ Акробто С Уа сна РНе Ах Те зей т за

Туг УМ Ар су УС Уві Ніх ав ма Бук ПОГ ух Ру ауе ЄНИ

Й 280 КХ сьо рНе Ази Чек Те Рвеати У У бек Уві Те ТВО УНІ Уді а да З00

Ні сля хр хр з Аа СНУ Бу СНО Сук був Сук був У ді бе АЖО

ЗХ Зо ща Ка

ЗУ сНуУ ех Ре іа Рус По Спи бує Бу Де его ТВ б Су

Ко З 35

Сперк Ат Се Ре Ле Хі бує Те ев Рез Ро бек Аг СП» СН кет Кави У

Мен бух Аза ОБУ бер ва Пи Су ієв Уа бук ОБУ Ре Тут

КК ЗО 365

Ен чек Ав Не Лів Узі Но Тер Си Зег зви СПУ Св Рез Со Ак

ЗО Кя 350 їк

Аква Богів ТВО Те Ро Ре мМесісо Ар о Ар су ек Ре Те

Ки БІК; Б МЮ

Гей тує ей ух Гею ВІ ж Ахе Тл заг Ате Тв бів Св Акв

ЩА ща 5

Уві Реве Сухе Уа Ме Сл Ада ев НІ Ази ів ух ТВ; 20 чок З

Спа ук баг беовсек до Зег БеУ СТУ Сук 435 щЮ «а» 35 «Ер Я «Ж» Біох «13 Ново зарієне «УНК» ОВ сів Усна ем Ук спа зе Ну СПУ СНУ МН УВІ МИ РОКУ АгВ і Зх І 15

ЧЗегбев Ат бен зер суха Лів же СЛУ Бе Тве рве бер ек Пе 2 а КО

СУ Ме Ні Ттр Уві ака СВ ма Ро КНУ Сук сну Ден а Тер Уві 35 «В Зк ів Уві Пе Тур бук ОБУ Се Бех НН ук ТУуЄ те ів Алр ет Уді 58 а

ТК СНУ Агро ве Хе Пе бот ми Аква Зек ев Ада Вк їм Гує вх що 78 хо ід спа вжи Ака ех Тк Аге АТ СПО Ар ТВУ Ма ув Тує бук Сук 5) За ів Аз ТАКУ СЯ ре хв Бук Те Об СПУ Пк ев мі о ке о

Зне УвЕ бек ек АВ ог Гб СУ го Бех Ма Не ру ев

З ца 10 125

Рюсуювег АтВех Тезе Спо зе ТП Авіа ев СНУ уз гев

НЯ ГУ то

Уві бує аАкр Бут Ебе Ре СИМ Ро УВІ ТК У Бех Ттр Аза Бек СНУ із3 15а 155 120

АВ ев Тв чек СПУ жа Ніх ТВЕРНе Ро Ав Уві ем Сп чек бог 155 НИ 175

СПпуУТсен Тугзегісо бег бе Уві УТ Уві Рез ет бег Аха Не

НІ, 83 1

СУ ТОВ ТвВу Гук Пррсув йеа У Ві Ар НІ уз Ро Хе Аква В: 155 0 д

Бук У лорі ух Те УВС АТ Бук Сук Ст Уді СН Сук Ре то що щії 2

Сук ре ія то Рез Уві Аба ж Го ек Уві Лве Тех Ре то Рую й з 255 24О

Ї ух юю Гук хо ТВгі суч Мер Це бе Аги Те бо Січ У ТВХ Суз 245 2 255

УВУ Уві Акр Уві Бех Вих Ми АВ го и Уа Спа Ре Аа тр зо 70

ТУСУВМ Ар Су Уа сна УЧ НН Ака АВ був Пи бух Ру Ав СНО

Ка ЗВО ка слів Бе ак оо ТВЕН оАте Уві Уві бег У ев іх Уа

БІ Кк ЗО

З Єна Ар твієв АВ СОИХ СУК КО Гб Сує ву Уві мех Ав

ЗО їв ЗІЗ Зо

Ку у хо Ре дів бах Пе без Кб Пе бек Ку Бк бує СНУ ва 3 35

12А в си го Ат С Ро ся Ха ре ТЕ Сер тю Реу бер А Нео В СН 3 335 350 мм м уз Ав в Уагзог ев м Су ев Маг Туз СУ Ве Гук з 360 За

Рез 5ег Ар Не діва Маю Гера бекобкв СПУ Св ро Се Ако пе 375 ЗО дав Тегі дя ТВ Пре б Ро Ме ев го бе А Оу Заг не где

ЗХ ха 395 ю шо буром ін ев ТВХ Уві хр ів вет Яхти Тур і СПАКНУ ха 05 Ся ЯЗ жага зе сук ве уд МЕН У Аа ем Вів Ав Ніх Бу Та

НУ, БУ Б саун бог Бе Зег бою бох Ре КНУ Сук вк во «у» 9 «Бі з | 18 «Та» балок «13» МНопо заонх кю» 25

Ов УМ Овісв ма сте сну А СВ ХК ев ств Бо СПУ МВ.

І х іо 15

Бех Уві Уві Ме ух оув Хар Зег сих Бу Пк ев Бебі) без і: да в

Зах НЕ Ні то Уві Ат в Аа то СУ Бук СНУ бер Са Тер Мн ї5 З 45

СУ СНУ Ре спе в сич АВ СПУ ВХ ве Пе Рух Ав в уз ве

З аа 5 сис е ги Уа я Ме тест Абе п я Те Ахо Ме А Тут и За їх хо

Зі

Мене его Асв Зес ОО АВ гВЄ ін Ма ту ж ср

Ко що за

Же Пе Спр Ака у зн СПУ Сен ВВЕ Азов и кр СУ Спо ж ТЕ

НА це НЕ іси У ТВ УдЕ ще у «Ні М «іх «1» Біле «віл» Мопмо харлх «ДО спи Уж Спа ем Узі Се ве їу Аа сп ма! ев ук Рек СПУ НВ і 5 ів і15

Зег ісп же Пе Зог Су Гук сну Бег СУ Гук ех Ре Ті Аво Гук 2 ий ше

Таб сСпу Тер Уді Ат Ой Меч Во Су Бук СИ У ев Сів Тер Ме вт 45

СЯ Це Це Тер рю цу Ази век Аво Пн те РНе ех то Бе Ре зо 33 Я

СЯНУ Спа Уві є Пе Аа Ар бу ех Пе іх Кк А тує 54 ТО 78 ко

Берна їв зер хе хв бух Аа хек хр м Аа Ман Гук Гук Су» д5 За 95

Аа АТВ НП ТЕБЕ Ар гук Гек» бе р Уа Гтрспу не НЕ 116 са сну Твен У Ве Мар мех 115 120 «Це ЗІ ща «ІВ 153 «ЗІ ВОК «13 Ново зар і «Мн і

Си УВО Бе ка спе ме СПУ СПУ СНУ ев Уа ОВ Раз у Су

З 1. 5

Чек бео Ате Ге Бек Сук МН Аа Бе СНУ Ре Тве Ре хек Пе бе

КО иа о

Авіа Ме Не Пе Це Ага Єна лік СИХ Гея Аа Бев Ся Тер У зх ЕІ Б

Бек Вів Ме ааріва ів сну АВ Тут ус бро сп Бех У Уя

ЗО 35 5

Сиж Ат Бе ТВу Пе заграв Сн Ан ін бух Ази Бек ік Гу геВ 655 7 75 ко й Мч Аа беє Бео Ате А СНУ Ахр їх Аа Уа тує Бук Ста АВ. ка 9 ва ге сх СУ Ар ЧНУ Бук Лав ТУР Ар. Гук Тут СНУ Пе Ар Уві Тер

НИ 15 по

СПУ сИв НУ Тве Вк Ма! ТК Уа ех янск о «Ві» кої» 15 «0 БІоЖ «Ж Нопа харевх «ВХ

Ов УЧ Спи Тов Ма Са бе Ки Аа СВ Марін Гук ЧИ СНУ Аа і 5 Ю 15

Щек У бух У бегітує нн ці Бех Ре Не ео ТВО ев в ях за

Чек Уві Ахв Тр Уві Ага Сів Аза Рв» іх Гуз СТ» Тем Сх Тер Мех

Ка 35 во зв

СПУ СП РН Акр Рто СН АхО КНУ Су» Піх Ве ТУ АВ СВ Ук Ре а 5 5

ОізнУ агв Уві ВЕ Бе Па Ар т ех ТВ. Авр Тік АйОт ух ві та т що

Меси бе зег зебр бен Аг бек бів лавр ін Ма Уві Гук ГУК Ух

КХ о) вх

АНТ тю Ав Ве НІ РНе Ав ве о СУ Со СУ Пи ео що ра по

Уві Ме Уві Хе Берг «НІ» 3 «іі» БО «10 Биюж «ДІА» Нашо 5врівнх

НК 3

Со хв спи ген Уві СИ зе СНУ СПУ ЄЛЬ Тох Мав без ТК у і Х НО. г зегісч Ати ев же Сук АВ АТ бог СИХ Ра ТВ Ре ех Б ут

КЗ Ко 20

Ав Мер Туг Тер Уві ги Ві АВ ТВ су гену Тем си То Ух а ЗО За

Хег Су Не вар ТВ: УВЕ СИХ хв баг Гук Туг бо Дер Яог УМ Був

БО

«НУ Ат Ре ТІ Не Беха СН АВ Ма Су Ав Зег Ущі Тук Се ща 7 73 йо спе Меса Пе ей Ага С ази Пе Ан Уві Тує ук Св ві

Ко що 35

А.

ЕЕ СПУ Не Бут Сну АхроРНе Тук Гук Бук СТУ Тез вх ув тв ої ї0ю ї05 о

Несе ве уУВЕТвє Уве век по «Нм 3 «Мі» 125 «им лок «Їж» Мод варієде «НК З

СЕУ ОВ ев У ле зе сну СНУ СНУ Бе Уві Сб Рее СУ Оу

Ії в. 1 15

Зегісвомвіви бе Суб А АВ Чек сих Ре ТВу Ре бек ТР Ух 26 25 Зо

Ав Меє Ні Тез Узі те Ява ПО ТВЕ СЛУ Буз СЯж ев 6 Тем

С) 45 вет А ТЕ Ав ісв АНУ Ахо мо Тує Бук Рго Су Бех Уві ух ха Кк Б;

СНУ Ати Бе ТВ Пе бек ар СНИ аВкро я їх Аа зе ев Ге 65 7 75 во

Сів МерАжи бек ее Ате Аа СИХ Ах ТЕ лів Уа ек бут Аа 85 а 95 ек ОіжЖ су Аке сну Туг Аж Тут Ахо Тут Гу щу Це дер Уві то

Но ще Ма

КИ У те Те уд тку Ма ет Ме 115 ї20 «ВЦЕ а «іі» «Оу» лок «БЕ оп харівх «хх

За

Спи жа сія Те У ів вет Оу су бе ва 0 На Ре Ну Су

І 5 і) їх ет бен Ав Цез бек бух Ада Аа бек СПУ Бе Р РНе бек Тк Ту 20 а КІ

Ар Ме в тв Уві Ат сп СТВ ТВ СПУ Гук СУ ев сно Тур Уві 35 40 45

Зег Лів НЕ Ахо ев А СЛУ ко КВУ Ту Тух Ро СЯ х Же Уві Гук о.

СНУ Ази Реве т Пе ех Ага СН Ако Абу Аква бек ев гу іжв ві 7а й о

Сі Ме хи бегівцАтя АВ КПУ хр Полів Уві тує ТУ СУ Мій

КВ БВ ч

Ахв БК ОК Ар ОУ Тує Аза ук Аодх Гук Тут СПУ Не Ар М Ткр м В Є сова сну ВУ Тв Ук ТВ Уці Хе же

ТЕХ 12 кій» ЗВ «ів «і ВІЗОК «Я» охо кевеох «ЯК 36 сп У Ов ев Уві спи кет СПУ ОБ СМЖ ви Карі рез СПУ Су ! 5 У іх

Хвефеєумвієв аск ін Ма чек пу ее Те Ре бее бек ух лхв мету Перо у Аре Со Аа ГВС У ув СА Гео СЛ тр У зх що 45

Зег Ма Не ах ВЕ У СНУ АХО ПН Ук тує Бо СНУ бек Уа ух мі; 33 во

5В

Сх Ага рве Те Не бе Ага са Ази Аа хе Ахв З Бен Гук Те 05 та Її що :

Сів МегрАха бе бен Аге УВУ хр ТВ лів Уві Тує Ту Сук ЛІВ

Ка в) З

ВСЯ СПУ Дер туго БУК ек Гек Бут СИХ Ме Авр уд трі 10 Ю о сп Ну Тк Пк Уві м Увобек бег

Ц ізо «ВН «РЕ» 116 «БІЙ Відою «ДІ» Бквхю чимевх

НН

СН У СЛВ ве У Св Хе СИХ СИС» Уа Уж Сп Рго СНУ Ате

Н м 10 ІЗ

Зегіен Аг ік боксу А АцЕЯек сну Рі ін Ре бек Бех Туг зо З ЗО

СУ Має НІ тр Ух Ач СН АН РУо СУ Кк СПУ ев ів Тер уд

З 40 З

Дів Маї Пе Те Бук СУ СУ ХСН ув Туг Гук ів Ар Зег У ці

Зо Кв 5 їх сну Ах Ре Ті Не Бех Ат Ахройви Бек ув Аза Не Боец Ту 7 75 ко ісвсна ва ана Ба ати Ма ін аеро Мн АФфа Уві Гує Ту Сук що 5 ів хв Ав ж СПУ СИР Ар Гук Тер пк Св СНУ Пк бе Уві

І НО Ма

ТЕ Уві Зег заг

ПЕН

«АНІ ЗА «ії» в «Аа» Білок ха» Моте хиреця «Нюх ЗВ

Сіл Уві бів Тен У Спа У я СПУ У Уві Ов Роз Су Ате

Е 5 ІЗ 15

Заг Цев Ато бе бе С Аа Ма же Сх КВе ВЕ РО ех ес ту

Кс За

Клу Меє Ні Кері Аге Сла Аа РУ у ув СНУ Бем Сів ев ув її ЗО ча діву Не те Ту Ти іх бери Був Ту Бук Аа Ахо вет Ущі

В 55 53

Ту сну Ас Ре Тк Ме Хот Ав жор вв Хес ех Аа в ем Бк па 70 75 о

Те спа Ме Ахв зе Сеооати іа ЄЛо Ар вт лів У у Кук СУК

Ка що ща

Аа Аг Ар ав Сх туге Ав Гук Гру Са СО Ж Вг ем Уві но не по

Че ві заг Бе их кор: З «Ех Ме «Та Бо «ВЕУ» Коти» «каре «НН 3

Сл УаЕспи бе ув Сне бе СНУ СНУ СУ Уві уві СВ Ре сМу Ате 1 й їв із

Беріжи ак Бе ет Сух Ма дів БЕР СНУ Ре ТВ РНО без ет ТЯ

З ЗХ м

За сну Меї Ні тов Уві А весСівВ аа те СЛУ Бу су Без СЛ Тур Уві 35 що 45 ліз Уві ее тує СПУ єп уУ бета БУХ ух ТуЄ Аа Ако баг У

Бо

Гуз Су Аси РБе Те Пе Зег Арк АхроАка Хек Сук Ако Пи ев гук їй 7 7 що їви Сібтя Ахи ек во Ати із СНИ Ар АВ Уві ТуЄ Ту Сук 50 55

ДІВ АтВ Ар Бук СУ СБЛЕББе Ах г тр НУ СН Су ТВ ев Уа що Но о

Тк Ма Бе Кс «від» а «їз а «йо Ниву «21їх Нето харієзя

ККУ св бен ех Пе Ве і 5 «ДН» Зі «Рі а «Дій» Вишк «іх» Ното вармелх «ВО і вла ТуЄ Тан це Су 3 х кА» «із ї «1 ВОК кві» Нопю карі «а Я

ЗО

Я ТуєАкр Меє ЦО»

І З

«Нр 43 «1 5 «ВГ Вих «Я Ноптохарієвх «щюх Яі

Оійіди ех Уві Ах ; З «ДІ «11» 5 «АКЕ» ВІлОок «д1Я Ново вирієнх «НКЕх ЯЗ

Зет Гу Ав МСЕК Тут і З «Вк» й «й» 5 «кій» Вюж «13» Ното карієвя «щ» 45

Тв я Аво МеВ і 5 «а» Я «ж «Дід» Відок ках Неон заржов «ЮК Я

ТЕТУ ААУ МЕН каНю 47 «1» «ато БІЛОК кіля Новю вірмен

НК Я

Бер Гук Ар МЕТУ

І З

«дій ак «ДІЇ» х «ШІ» бівех «135 Нопю арт «яННЕ» Я

Заг Ту Су МО

Ї З

«НІ» чо «ії 5 «від» Бцює «ТУ» Що зарісн» кН А

Зер Гук СІ Ме 1 ї «у» 5 «1» 5 «ДР» Бишок «вій» Бмло карі «НКЮ ЗО зе Гу СНуУ МеСНІВ і ю. «8 «І «В Був «БУ» Нопже хар «Ох 5

СПУ Рів КНУ Ра КМ кр СЯ СНИ не Не Туг Ача СН Бу Ре Св і а в із

ЕК кам 5 «а «а Врох хе» Нор адйях «00

Це Пе тух Рв СПУ Аяа Кох Ак е Ахв Ре ех Ріо ех Ре ОВ і в Не 15

ЕН

«ід» 53 «1 В «Я» Бр «135 Ното засіває «НХх 53

Лів Пе Ав Ген Ада СИ Авр бе ут Бус Раз су зе Уві ув СПУ

Я У НО 15 «ЕНЕх «ВН г «1» Бін «8135 Ногто щеня «ан» З

Су ВВЕ Авр Бгто Сів Авр СЛУ БУХ ВЕ Не Тут Абе СВ Ку РВе СТИ 1 З НО 15

СИХ

А Я

«ДТ» 16 «да» Бідок «ВЕю Нонна харідх «ВО» ах сиж Пе Аво ть Уа Азр Пс ух Ро дво бе УВА Був Су і З тв 5 «805 ль я«АїЇх 15

- «ИМУх Бівок «135 Берхо карієс «Нюх Зв

Аве Аз ен амасну Лав ту Тує ую СЛУ Бек Уві ух СНУ і 5 1 і5 «са» 5 «В» їй «1» Бивж «21Я» Нопюе зах «УНХк» 57 дів Пе Ака бер дів Ле АВР СНУ Гує Гук Бо Су вет УВК Був Су і 5 Іо 15 «ДО ай «рев «Ж» Білок «13» Бо зар «НИ» ЗК ів аАхр ве Уві ле Ар вх Туг бук то СНУ зег Уві Туя КНУ н- НН 1х «ВН 9 «хів 17 «їй Білок «3» Нео рев «ВК ЛУ

Уа Не то» Бус ой СНУ ес Ня оо Буг Гук Аа Аа вет Ма Був і У юю 15 «дк ВО «іх ії «іо» ВОК хаїйх Мксхю карх «00

Уві йе о гук Те сук бе кп бен Буг Тут іа Ахрозег Уві Гу ї 5 І. Га

СПУ

«ЗО» ві «і» 1? «12» брюк «і» ЕБУпО ЗАрІЄВЬЗ «ах ві

Узі Пе Тур Кук СИХ СОУ чек Бук вв Тує Бу А еойяр бег УВЕ Бук і й їв і: су «ДМ» ВУ «М» З «їж» лож «ІМ» Непе харенх «НК» 62

Сі Авробе: бек Су ва РЕ Ано Гук 1 5 «РН» 83 «МНЕ» ТХ «ВА Був «ТУ» Нопхезарва «НЕ

ТНК Тв ех беє йар Гук бек Оу ви ко УМ

Ї 5 їв «Ну» «Ж» 4 «МІЖ ВНюК «Ле Нет харієвях

ХК Які су сну ах сНх ТуУгАхи Туг Аво тую ТУ СЯ Пе АКо Уві і З НВ пе «30 55 «1 8 «ше Бідок «135 Нето заріснь «НЮ» п5

Ток тр АБр РН НІХ РНе Авр БНЕ «їх 66 «МУ 1 «лій» Биок «Ж Гриво знурнце «00» об

Спж Не Тук СК Ав Ре Тух Те ух СУ Елі Ак Уві

Н в і «ЦІ «ії» 15 «ВІЙ» ТлоК «Ж1У»ж Мото зарієве «0» В

Сі СУ Акр СНУ Гук ви Бук Анр гек Гук СПУ Пе Ахр У

Ї З Не «Ву» ба «із Я «ЗЕ» Бинж «Ж» Нети зара «НКЮ» 55

СПУ АВС ух Аква гук хр Ту Бук СХ Пе кр Уві

Н 5 15 «Ну» 65 «Мі» і «ЗЕ» Бвюх «діжа УВО за це «НН» во

СУ СПУ Ахро тут Ахо Гук же Тут ТУуЄСЯУ Меї Ахв Ма! і 5 Ю в «п» 7 «ак» «ій» Білок «13» Ното зарієне «НК ЗО

Акрілв Оу Си Рбе кр гук

І і: «ДН і «1 «Вій» Біло «Я» Мою кархеня «НН К»

Ах Гук КНУ Ту Ре Ав ЖЕ і 5 «Її «12» Білок «кій» Мото харних «НЕ 7

Аевз ув СТУ Св Не Дер Тух «З 73 «11 х Вей «Ві» НК «іх» БВмжво зарівле «НК 73 квелоюка юс стано сирів сксвнрснв кирноссас бо вався вдіссарося каві Басавсісса воавіжарни кон зеев 390 іржнесвнє веааесснве всшоссв заст нетса пізснхноє збсівсесве БО аксони ке и Ккис висвевісе риса овес 550 яворранистезнистна вилився вена оассвам армоаеє ЗО секівнасві скоссвави вассааонін виаасазяс вовскВінос інсвосаь 300 жо меріссорсоас ів хавсно Несвамо даветресн іч ОО бо сівств ва аеНемисю саиновнисс вн асви хамон авсвовсюю Я свісевеі: всієосвева внамненса нарозокасв везавнасва соосірюаою СО пісаеоанев мес вс внесааарса пмеасравн осн сво 0 0Ю

Вашшевосс віоповносє вавсісвосє вісасаваов пспснаеав виро 060 «ау «і» а «а ДНЕ ро 7 вві юки Ж ежчх «В13жЖ Ното зварене «ВО» 78 насвесвие гассеВК Кене сін еВЕ сом чевава СВО я вісаснрос пвнокаютюв нечесні вас знаиноя вежицшиююа 5 Б ссгухк руку ув ж дув ому са ржиту ву Ферико ит ахорбути у увити ко декапажеюс сіла осі вав асви везвіссвай иозавсаве вико ОКО

ЗЕЕНСВНИ вааніваа звуВаєчеВм шщаснсв зовіаече сссароє ЯН давршацв сазеціна списано р ов маві есстіасіснрснна 300 крнассзави почоієза аерізене пезвеса суне сноссвова СО мів вав вода сівоє НУНМоВЕ вехл осів нама 042 ссовканану седаавічсв вів вачнн й ваєвосс кн квов ія н СО канзшетов сао ч саноаавоновеовесізса весен саюссінаси ОЗ сіенсаасв сависіасна квачовсвів вісі євосі веечавас ссвмсававе СЮ ства не совіспевай вирспевис винен аеви щі 5 «М Та «Хіт» БМ хаб» ДАК «У» МайнУИимовя «аа птща цевнеВк оса леє «кр ріюВ Коен ва поеци яю ва зкпестьея кн ьй ванесенх тв наве пасе іони: 120 песен ев ис спи ос сВове сосінаці меси нс засне КО вен еє кимювени се всВи? венісзився сциВНиас Зсінаааю я дрсвивнов зве пвезн теме вИВи памастовівсаанст веаавю МОЮ зем КУ рих ку п о ве Зк пенісвисв варисновая еЕОЗоВЕНО авасві ори всі вовес іє не 0850 рик фр ужих гКу кову стрів ЗК екор ую вк ие мВ КЕ я Нх чості а косарі нази клесваснв осісцяі в шосте СЯ аванс пЕсееВЕВЕи КиЕеааВЕ семи ка рен ше вщее 50 вина всс нисаенвів овсвеарево сасвосивое зеноспює сви еаве СЮ завкеска сесіракова зровласвю варшщесвса насво с осиванє БОЮ чессвсдев песірнисє воссиися вараренса псавенсвва о «і» 76 «а» о «о» ДНК «Зх Ното харієне «КМ» .

ЕН В расогсанВс осВеВСЕ сірі кссівивен весен СО веесрів ана вавосіюств свв озав найниассів неснтни 350 пиесчлсеникчвесвеКекх востпеисав св ев ага е сааксвае 15О нинтаріве свеавкий саме мімоза рвви санвінсисстіванвин 0530 зисскри и анро хареа сени Мас все твовайнни ово 20 сову орг сх Вт ут п Мф изутеу чик ую мусу БУ сіслайер искванввас саавоцвав зісмисвіз сивівисіис асовітвє ЛО невшноє свссаеа овес виВи став спосо ве ин СО кідещВисі сомовсар зовиоссава огасвеЯ рив аск спосо ЙО нехвнівасі сосвлейнви печсаснено сарезсавов панцоднсве сю ОО авиндовоесс вне ева саааисввас тсрававає всазвоста сросіносва 0 БОЮ пезеВі аониссікав ссновсє ведена аро евасах пошохнх ВУ «НЕ «МІ» В вої ї жи «іа АНК «3» Пот щен «ню записи іно Юсасичес чесосютев сосни поосвоює СВО пухкі іх ПРОВ У прозу и ки ве тук гук ву ще ьськ ку ще НН вичцесірся прісну сСа паросюсів Биарону оваасаасв і неванию ГО реву, пусте сорту Ук их ічиуці «ЗКЕегРуу св еру тугі с івесінсзна авосанонєв вісівсвсио сісствави зпівонно Бийсновов КО ная со К муха ; пу ріния оиен зер ае А овивеес сс неви савівасви: пешщсикосч сина ясне ССО приріст кову ту иві КсЕІКЕ ВОо уНн а ця З несаравіви певсівнсва еп Из во тесааВ СБ вена ЗО секр «зук(іку а У пф на се рух ук ухкюх Кок вх

Винснисе каиевасюва ие звисів вс сясю ВВС ОО сефтучххух ей ух друк ЕЕ усі рих их у жир сік а

Віспсесде саєтраівя вел иаан леми сома днке вдос Я духу вия печу ву сер сут ТОВ «Ки ах «І. ззіваенсі пісосароана просваанів садівнаане реа ве сссевави КО ків вровжноі свспранови масанеянио зсадсноств сопвосієвне ОМ звевсєсіна сети вдова висно ве вафнмнов апр анро сінсвавиє БОЮ пекнисаве весно вес ВіК ов авраномов аоздржвана ве «ЯН У5 «Я» БЖ «813» ДНЕ «1» Новхо занкає «ХК» 7 кщацетпюв насосні ес срср свісасоссвивни осно БО веієствса коса заноеве сауна деівісвсв нова 150 івестеари звоспвизса кіссаово сно Ві внене іашщевироє КО мернраєс сідасви о саміресзе кова оси свнаннас засіває жо арозовоідо воссікарна оп ивоем есівов сроваосісі веаваєвно 300 учсуститух пуск уУ (ючих ки ІзУкті ух йих сусту ух вик пустих мли сади ух ле, веНсвиох варене н сно внвйс вно Ке рі новес Вес че ОСЗ6О зісцоссвс сс ака доаки нава не уаае соплі іВосіВеНх Я давснсі весссаєвка кеостннів сарівжнано рен дасвес сстосввісв СЯ

Високо аеванкавівсвоврансан касарозани зеановлв спдеріаюсо 05 зврсасюсіва срстрарсав засвраєтає вариановся звастасвс іневавию 0 восевевки весанеіс песо вакаронев асчнвиений виг ож «ЯН 79 «їі о «5 ДНЕ арх Но ус ківі «еВ ББНпО зе Нк ха У кави ніча асавіс са вчоссюсосміса ссср восвдорює о зе зекіавєв овес и смарійвів зависаа пінонико ХО іпосіневиа висоаионея вісксвеве сесіваіашевнцоізаювввог 15 кеВ сце свдінвовн виоавоси сивап зе ясна С зисававіви виростав на Кривин Міра госавестст ясавасвник ОС вепісвисв камонаєсте вера нЗіє ваасаоре пеногиоВес оно 0 ЗБО віспосене сина на весен сацв вва всте сс мистец. ЯКО заржасисі ассараєз сросонанія сзкіревавв сховіаасное сосок ОО

Вківаеес вкоакад т сясавевсве васанваюих авансові схе нве СЮ

ВЕрасОстка сестра иовА пос мак вакавасзсв пВОБтСвс нива ЦЮ поосвєвих пострдов моосвісноа дкизесися зсавовиана В ви «вій» КО «1» вх «іл» ДНК «ЗЕ Ро зарнеце «ану» ВО

Камінна рзсісвеіе сов Сіесошісв сосна доснноснює 0 60 актові век прнікса вало св еати вагювасів родин ОО

Михлвсана просввенся дієтюоєаеяе сісстиаісі певне ус авсемшоюс МО невовоє спінеВеи сні оспре виасависв сарнинно яобававе 0 зесававіок аква ниа нове ви МНамоса кова нсі асаавено ОСМЮ нсспевесос авдовасвся зецеакой звасрінеки вдстновос віствове З60 знижене паклеари всивп нив сирне соснову СЮ вмавсисі моссвкаен кнесенавяв сертвнавив сренанерк товще к ЯКО сві хе ВЕОВнарірі свслранови Знсановако позневосів сарюєсаво ОМ

ВеЗсосідИ скоса осавасіе свнавснов аарнмнасюс сени 6

Фкераеаки вас песедісвсн вавасснсв позБевеиЗоН ВИ А «із в «172 ДНЕ з каже Моюо зарієнх «ВО» я киванніка висо орав есас стві ві сперавлена харовосвос 00 «есе вкрсстчси везе чвеаресвею аву кві еВиСВнава НК сешвссврв сбоссадесі всісвиаї вуйксвісся ясврриовасівневікова 180 кисавенса відвсаріве Кене асВ вас існоснісвр саван ови 90 осінававі Зесавірів Васі сВЕ сарі овіВ встаю пас нос 00 саввтиаси еВ ЕаИ саансвщся првсішснс сне сНК єв 0 ле сещетевів зви вав неувнасі весстини циооствс пеню це ЗБ ісосавце повосвиані аеЗеоває Віва жвась счесан евенівоє Я8О свввнванін свеариююа вийсавеи васаасвосі аспросви оановєю ОСМЮ зешчовсси ависзнавіз сракаварве завсіствов осінсизаве сасссвсво О0Ю киЕссцаясі спсоскікає вачвавсне пасинка и НАЦ щік «Ві ха «ЕТ «ах ДНК «ій» Нонвукарієне «ВО» 5 даазноінтівнсвоавіс есзпрсасс нів сао ковка паоаресаює Ю склосцев повосавісі мВ врсвеосасі іздестоа саровеВе 320 с нксоана сессвКеИ сепсайнє ос ксносВ водврессеє свжсвісоса іо висариєв прис аєі ни Віта скася васпсас ісвосмсав санасрвиав осіраннав мреаріри Масове савснвеїн Всіоносв ек васЕнсово ОВ савекено претнонаа сис и кікрсівеас сс свіснесси 360 ссзііха аисаниоза вісі восени нисссрхі квас ях пнссснвар вевоссвн насе ваае віровааси ссосіссав: пепічвсє СО савані ново веоя воосаеснаю насавсносі зни сувсВо и ОХ асвсевасв гассанаєма свававасас зазнає ссісроно сасосщюме 00 пика свесовєйс вача: заевасиоця же вах т 05 ЯЗ «арх «10 ДИ «13» Ното зарієве кю» 83 наван інаснови еиройесс сівби осно поавнавссвс 60 скломроя виростів какао «воверевсі ввиеВОМи дев ї120 сариссаве совно осіовісМ мнізовісов вовриносвс ірон 18 часпвриси дівеоаніви віз ссваса васйсасіє овесвови сяє ОС сикавези нроарина паснмисво саме всісассві пасе вню СО саиервассвВ аква сне пері виає самій сечо ссв о ОС360 сосен зисвепкаа ал вена ооо лине пи оссіосг вавічаєне писссввав вррОосваані прави ван візи анасе соснченис пошнасто КО сареакаоі іслсинанеа красароаав висввеВесі осли нсне санеВеос ОО зсясизаса варехааса сеасаавсис зав сс раані своя 00 кресівавсь сиоествс видри засво кови Ви 5 «Вій» 85 «і» 2 «Хо Бнюж «3 Мор аа «ау» КА

Акріви УЧ МТВ: сИй Зсег Ріо Ахр Ве Пен Аа Уа) Зех Рго слу

Е 5 Ю 15

Спи ги вів ТВ Пе дев сук ух бе Вега Хебіхе Бей туге то я БІ еп Аж Кл Аз Туга Аїд то Буга Сіл ух то СПУ СЕ

Б 45

РУ Різ ух Бе ву в ек Ттр АН бе Те ге См дес сну Уві а Ух 50

Рго АВ Ач Ре Бек слу беру бек СПУ Тім Авр Не Те без ГЕ по о зх хо

Те бере пен ов ЧА С Ах Уа а єв тує Тук су НІФЧОВ

ВЯ що 95

Гук Тук Азатьк Бех Тер Пів Ре СПУ Спа сну Те уз Уві Є Не

КО 105 о

Гухане Тв Уві АТа вій Ро бек Уві рве Це Ре Рхо Ре бек А) 115 ГО 125

ОВЕОів ев ух Чет СУ Тк іа Хег Уві Хв Сувівв сп Ав Ах 130 135 Не

Ре Ту Рез Ав См АВ уз УВО Тур у» Уві Акр ва АН еВ 145 150 55 16

Са екю» дза че сна Сів Зее Уа Ву СНО СВ Ар бох Бу Аж ів 176 А

Зег Ве Жук Бек ви его ЕЛк т жо Так ев зе бух Мі яр ГуЄ 15О 155 ї5а

Сврбха Нв та Уві Туя Ст Си Хар ВХ Но Св Су Бев век 198 2 205

Зебра Ті те аг Ре Аква Аев К СНВ Сух кеВ І Ка ке» аа «ів МІЯ «и ВіжЖок «а» Нойю «арієне «Нюх ща

АзНе На Ме ти спи Бек Рто бег Зег Ге зех Ма Яке УВІ СНХ і 5 Та 15

Аяр АН У Пе Ве в Сук Са із Зег бів хр Пе бе Аза Тут 2 о за

. ТЗ

Геи Аз ло ГУК СА Сів Гук Ре єн ву Ма о Б ух Бер Бе Це 3 І Бо

ТУ Ахв Ак зе Ази Кос ТВ СНУ Уві Рго Зву АТЕ РВе ЗЕ СЛУ

За б

Бех СНУ Зег СПУ По Ахо Ве Ве Ре Ти Пе очек Бек Бевз Св Ро о т щО

Сп Ар Це АБОБВЕ ТУ Гук Сбв-сВ Ахр АЗО Аха Ре Кр ві ка п Ка

Те ве ОРИСЯ У ЗВ у» Жде Пе уз Ате вх У АВ А

КО 5 по чо хе Ул Ве Не Рі Ракова ар Сни Св ев Був хе СХ

З 12О 175

Чі ій же Ма ув Сук хат ви Ах дай Ре Тує Ро Ат НЕ Ая 1 135 10

Гув'уві сів Торі» Уві Ак АК а ев ів 5ет СОУ Аа Бек сче 1345 БО 15 160

Спа ес уа ТОВ а дере бу Ар ех ТВО т ук Зег ев щЕЇ 164 ГО 178

Бех ПМ ев Тут і се ет ук Аа зи ТЯГ СНЯ Сун Ві жк Ух тує 150 155 190 зів Су ОВУ ТНК БІК ОА СВ Ж ба бок Бе го У ТВ уз Бе 195 2 ТИХ

Ре хи АХ СПУ СП СХ ів «ЦЮ ко іх 15; «ал» Біо «М» Нрив» варіть «НКЮ 85 а

Аве ча Ме бу Сі ем Бої са бетон о УТ ве РО Оу

Ї З 10 У:

Ов Рез Аве ех Пе Зес Су и Зак лох Ов бе без бою Нів бе а 25 в

Ав сих Тук БНя Ту ев оазв ПО ту бе СН дув Ро СПУ СПА Є 35 чо Ез

Тов ісв б ео Не жгтем сПу бег Аха Ате Мід Бех СПУ У Ру

КВ 5 КО

Авр Ат Ре ТЕ СПУ деку бегсну Тиг Ар РВео ТВх Пефев Пе

КО 78 о яек Атк Ма Яців НН кр УВУ УВІ Тутє Гук Сук МЕРОМ 90 95

Те ов бе бев ПРЕ СПУ КМУ СПУ Те бух Уві сно Не бук ам

НВ Не ЦО

ТВ Маг АВ АВ Рез лег Мара Пе РО Бгто го 5еу дер Се СВ 11У о 125

Ген і уз ха: ся Пра Бсе У У Су сві вх ха РВС ух

НКЗ їх І

Раз А сно А Тк УВЕСНВ то Бук Ма Ар Аза Ав бен С ве 13Х 15 155 150

Су Ака ек са о Зее УВК ТВ СН СНВ Аврозах хв хр зе НЕ 155 НЕ 175

Тека ев вет бе Кг ев ПВХ вч ех Гл Аа Акр Тук СВ бує

ТО 15 І:

Піх ід» Уві Бус ів тю Жах НИ С СНУ Без ее ес О їо8 АЮ а

УВГ Тве гук бе РЕ Ахп те сНуУ СЯ СУВ

З 15 хан В? «Піх «дв ВІДОК «3» Ноте харієня «Кр» 87

АеррРне Уа Мей сл Те Рг бен ст бе Бек Ві вх Рез СЛУ 13 15

СЯв Ро Ав бах Не Зег Су Бук бог ех Сів чех Гн змі Ні бег

Кк. фа КНУ ув ГВЕ Гу бе Ту тт Ре Бей ся бук Рто СНУ СН ВТО 4 45

Бгто ся бен ев Пе Ту ОВУ ВЕ Бех Ап мо Ре чег СПУ Уві Бро 5 5 во

Агов ре бен зе У ще СНУ ТВ Ар Рне Ту ва Бех Не 7 Кр о

Зегакв УМ СНа Ази СЯ Ако Уа су Ма Гук Гує Сух Мек Са бе щ3 90 35 пев ев Раз а ГП ре слу се слу Тк бух У СЯО ПЕ ух

КО ох 1юЮ

Ага ТВ УВІ Ав А ето бек УдЕ ЕВе Це Ре Ро Рез зог Ако СВ 5 120 125

СЯв во бух бен ту Те Ада зер Уві Уа Сух ен ен яв Аза Ре о 5 що

Ти ри аАчЕ спе дів ув УвЕсНа тр Где УвЕ Ахр дев Ма без сни 145 НО 155 150 я С Ж яв зок СВ СНО ер В сив Спо р зе бує Ах 165 ГО 175

Тв тУуг бе еи зер зе ве си Не Тебе Гу Ав Ахр уки іко їя5 що

Гл Не бук Уві Гук АЛ Су Се У СВК НИХ СЛ СЛУ Бе Зв бе 195 ю ща

Ро Уві Те ув Зеб ве Аза ага СПУ СН Сук 316 215 «81» ВК «і» МВ «аЕив лох «13» Нео хар «НК КК

Ар Це Ус МЕ ТВО СВо ок Руо ев зе Геврго Уві Тер Су і Кк Юю Не спек лід чех Не зе сСуз ати ек ек Ме зег ем бен Гук чех

В БІВ

Аз су Аля Ам Гук ен Ар гро Тубісв Сіл бух го СПУ Ся бет що Ях

Ре іх бе без Ле Тегі ви СИХ бе ак Ат» ів ох Сіж Ук не) 55 Бо дев та рве Зеги ес ск Бех ТЕ Акр Ре тн Ген бу це

ГО 7 7а яо

Бех Али У Сі ія Ар зв Масу Уві Те Бук Су МеєОів АТ ща 5

Га НА ТВефбев ту РІ СНУ СНУ СПУ ТВ же жі СВ Пе ув Ач ню 5 о

ХЕ Уа АНА Бах чек У не Це Рі РКО Ре Зер Аве СВК СВ

Я 120 125 іо сут Аа бер ую УВСтув іс ви Аха АК РВе тує

НК 135 148

Ро ме сі ув ув У ОК Тв Дух Уа! хр а ів ев у 145 о ІЗ І

У Ах бе Сів я За УВІ Те СВ СВ Ар ех Гуз Азроек ВЕ 165 179 175

Тукбекі ва бер ве Би Юні Таз Зек у АВ Аа Гуг СВ Гук ї1щО іщ3 рю

Нв іже уві ух Аа Сук СНИ УВІ БИ Св Су Бер зок зеррку 195 200 в ха тв; ек ве ав му СНУ СМ Сує 216 215 «ЗНУ КО «11 Б «АЙ» Бідок «ій» Номю варіевь «Нр Во зр Пе Ма! Мч ТВ Є Й Бек Бо Бе ех ем то Уа ТЕ Бгто СИХ і З б 15

СЯ Ріо Лів вес Не беру Аве ее Бека Зее бен їев НІХ бе за їй М

Ар СУ Тут іх Туг іже дер Гук ви Св бух РУ СПУ С ех

Рез Спа еп бен Пе Гуго ен пу Чек Аа Ат ів Зег су Узі Рео

За 55 ва дари епе зе сі бю СПУ ек СПУ ТВ Ахо Ве Тх бен ака Пе 53 З 75 що

БегАте ув АТО Ав ма пу У ту тує уз Мегів Ав

КЕ 90 ца ев Пп Ті дев Те ве СЛУ СЯ» іх Тв їду Уві Ов Пе уз Ав м цВ по їй

ТБ УШАВ ЕР Бе Уві Ре Пе рне рт Ріо ет Аз Кн КВ

Те ро 125 іх бу зе су Пе Або Уві Уві су Кер ев Аа Ре ТЖх про Но 180

Роз Аг СО АБ ух Уа СНО Те ух Уві Ар Аяв Аа б еа Св Зег

Ні 150 15 100

Су лап ех СВО Зег Уві ТВе с Сів Азв заг ілв аАхр зе

ІБї ю 175

Чек чек бев Бекетов Тв бем'бег Бу А Аква Кер Сов їхо ІЖ5 15 :

Ні ід Уві Кук Аза Сук С МВ МІК СВ СНУ Сей бек бе ка їх го Зах

Ма Те бук век Ре яв МО СНУ ОВ Сух ій 215 «а» й «Ді» 18 «ШЕ» Білою «З1Же Мопикхаріене «ад» 90

Арі Уві Мет єна ет Рто ев Брі ки то Ма Верес і х І 15

Сп бто іх Зак Це бе ує ез Зек ее пеки б Бе щех в: йх БІВ)

Азв У Гук Вів Ту ев Ахр тр ТУ Мер СВ Був то СЛУ Со Бех

Зх СІВХ 45

Бека бен ін Пе ге ід СНУ бек а Аг Ав я МУ Уві ра 5о 5 З.

Азв Ах ве Бех СПУ век СПУ ЗБК СНУ Тр Ар РНе нг Тв Аза Це йо т 75 що

Хег Аг УВЕСТЬ Ав Зх У СОУ УВЕТУуБ ТУК Суб Ме Сів ВІВ щ5 о ок ев со Ве Бе Те РВЕ СНУ СНУ СПУ Ве був Уві ств Неї ув ке кю Юх Не

ТвВк хар АВ АНОРТО Зее УВЕРрє Пе Ре Бу Ро бе» Акр СЛ СА 120 ща

Тони бук зе СПТУ Те Айва Бех Уві У Сук без ей Ах Аа КН гук

НУ НЕ БО

Рг Ах Св Аа ув МАСИВ Тер ук Мій АзроАва Ав Бео Сів ех 145 130 155 НО

Су Аз чер Св Є ке і Твена Киів ар ех Бу бар Баг ТВ ів а НЕБІ

Тусмер в ез чего Пи ев ТВ ви хв Бук Ав бжо Те С Туя

НИ і18Х цю

ВХ Бу ХВ ую а Сум СВ У В ЕН На СНУ без зн чег Рух іа мо 05

УЧ ТТН дже Ре Ах аг СЛУ СН Су»

МІ тії «а «а ІВ «ід лок «віЗ» Моно кармя ях дав це У Ме тв спи же ру без зерен вто Уві Бе сну

І 5 10 15

СВх Рез Ах Бек Не бех Сук Ахе Зег МУ С Зее Без ем Не ех в: 25 за о

Аве ТУ Ах Тур Тец АВ НІ Гуті сао бу РОН У ЄЦВ 35 аа ЯУ

Рева ев Бех Пе ек бе Це бек ев йти Аа че Му МВ рте

Ка 50

Ар Ас Ре Бе спу ех СТУ Бек СПУ КВ Ахр Ре Те ев Бук Пе по та 75 що век а САБО ав УСНУ У Гук Ту сує Ме сна АВ яУ о 98

Герб Бе Ве Ту Р Сім Ла ОХ Тік Ах Бере Ве Гу Атв ню 103 по

ТВ Уа АТ Аа Руробев Ух РВе ПЕ РВе Рг Рго бек кр СНО СИ іі5 о 125

Гев бух ес су Те Ак бок Уа ма сух Гев ев Ази Аа ЕВе Ту 130 НК Не

Різ Ати Спб Аа бух Узі ЄМО КВ) Бу Ум Ар Аа а Кен Сі зе 143 150 15 і150

Ох Аха Бех СПИ СНО Вог УВП Єна Св Ахо бек Гук Ар БЕК 'ЕНЕ 165 гюЮ 175

Тугбег ев бег Зее ТЕ бер Гб бе бе Бук Лів Ар Буг Св б уз 189 155 1

Ніз бух Хі Гук Аа Су СП У ві Тве НІХ ЄП Сх Гл Ве бат Ро 5 БК «5

УТ ух БЕК це ка те СпуУ СВЕСук

МІ щі «аб «Ех «ал Білок 13 Мото «меня с тю,

щі сИпч Це Уві мертва бес ет Сі» Пе ев ех ев бер вто Сх

Н кине 19 ї5 ма АБО АНА ТК бен вет Су ати Аза ж Си Зег У ер ек ег

КІ а 3

Тік дев Я Тер Гура он ує го СЛУ СВ АВ Рг Ага Це во) З

Це Тег СНУ Аій бе Аа АГ АВ СУ Ме Ро зо ех Ре ще а 35 5

С ж бек Су Зег пу Тіт АЗИ Ве ТЕ бен Тег Пе Хех их Гак СВ 05 о 75 хо

Гто 3: Ако не ліз Уа тує тує Су СВ КН Тек СНУ Ме БЕК РО кА о ча

Та ТП Рі ЄНВ СІК ТВ ув Уа Єна Пе Був ато ТК Ук АВ ню 5 о

Дів Руюзеє Уві рве Це Ріє Рі Ру мех Ако сти Сх ем їде бе

НУ 130 125

СПУ ТВе Аа хек УВУ Суєта бен хв Ахв РВе Туг Ро АТС

БЮ 135 ЗО щі УМ спи ув ув Уві Би АКА ев Спо Бех СНУ Ак ех 1 150 135 163

ОВЕН Беє У ЕВе м Сни ее о Тл р ше ГвВх Тут ет Тез тах о 178 ера ТКУ гг Тс вет ух А Ар Гек ни Буя Б Бк У

Іо 155 Не;

Те Аа Сук ВЕ Та На Св СИ» Гео беу Хо ро ма ГНЕ ух 195 ЗК А щек не Аза Аве СНУ СВ Суз но о 15 «о ся» 5 «діжі МИЮК «1 Нео зарітевх. «Я ОЗ зів Пе Уві Сем ТЕ СТВ Бек Ро СНУ ТВ Сен Бе ко Бе Рез пу і 5 ІЗ 15

СНИ Ат Ма Пи ви жег Сую Ах» Ма же СНИ Бех ві ет ет ет дО да БІ,

Нео АВ ТУ ук Спо С у го СПУ СТА Пн чо АТЕРВе Гео

Кі ча 5

Пе Тег А із Аз бе» Зет Агов ТВ СТУ Пе Ро АнроАхо Ріо Заг 50 5 в

СПУ бек Сму ек СПУ ТВ Ар не Ту їеи Пн Не Хе Ат Без сів. 53 та їх во

Ро сно зр рве лів Уа ВЕ Ту Су В Св Тук СПУ Зег бек чо 85 па ЗУ

Чертвг Вів СПУ Са СНУ Біт ув У СНа Не бух хв т УВІ АВ

Тю нк 10 ліву бех У не Пе рве Ре ко бек Аз ВХ Са ги бук бех 1 30 155

СЛУ Те вівт Уві Ма Сузієв си Ак Ав Ре ух 25 Ахр св 1 ї135 Ії аа т МН СО Тв ук У АВи Ак АН а С зе СПУ сьо ее

Її 135 ННЯ

Пи спи Чет УЗ ПЕК НО Об Ар бек бук кор Зек ВЕ Ту Зег Те її 1 175 зе Чех Бе Ге ТВ ев бер ув А Аер Гух СИ 5 іх бух Ма 15О 155 НЯ

Ту А Сує Спа Уві ТОК Нв ів СНУ ев бег ес чо УЗИН Хе 195 290 205

Зегт БНе АБИ Ага СНУ СЯ СУ ів 715 «ер Я «вії ІЗ «вів» Буюж «ЕХ» Мото зар «ХЕ спи Не Уві Хе Твена зер ро СЛУ г бен 5ег Сем бек бро

І: 5 15 13

Са АК АВ ТВі ко еру МЕ Аа ер со ег Уві Бех о до 25 ЗО

Ні Бе СНУ 13 Гук сни св тк Ре сну (Пи АВ Раз Аг Бо їв

Ки ЩО че

Не бут е Аа Бек хе ме Ма Те СН» Не Ре Авр Ат Ре хг 3 35 Об

СТУ Бек Су Бех СЛУ Тк Аза Бе Твен ТВ Пе Хек Букі га си 70 75 5

Рів ар РВЕ На УВІ ГУ ТУє Су сла Са Гук сту бек аг хо Бе Зх

Тел рве Б СЯ СНУ ТВО Ся Ма Ким Пе бхя АФ В Мі АВ цю ке не

Аіатрто е Уві РОє Це Ре Ро Ре обех Мар ів Сів Без ух бог 115 13 125

СК ТВЕА ее МН Уа Сухе ев ка дай РВЕ Тух Ро Ах Спа о 135 13

Хе

Ада ілю У Оо рі УМ АБО хи АТ он св Зег пу АВ БЕЇ 145 їхО 155 1

Со сив Зек Ул ТРЕСТ Си Акр бек Гук Ар ех Те Гук бек б ех 1855 гля їта

ЖегБег Гбк ем Пи дев бек був ДВ Ази Рус січ Слух Бе Гук Уві

ІК їх о

Те дів Є сна Ха в БО СЯ СНУ Бе зег я Р У Туя 155 -ю М

Мек Ре Ахи Аг Сх КИ ух

І 215 «ЖНЕ» 95 «Вії» 1 «ЛЯ» Ббуюжк «ЗХ» Ното арія «ух Зх

Арі Уа Мети сів чек Рез Ар ех Кі я жа ех Рез гу 1 5 10 15 сна Аг Аа ТВЕН ака Сус ук бер веретено туге 0 а Зо

Баєва лох ля Аз усіх а Бр ук СВ Че бук РРО СПУ КН

Гео з Бех ен бом Ме Тук 1троміа Хег Квт Аге Сб Зег сну Уві о їй об

Куна ке КНе сво у ек СНУ век Те ТО ее

З 7 Не ко

Пе бек Бек ем Сів Ав Спи дер уві Айва Ха тує Тур сув Нів Сів

Б ча ох

Тут А БЕР То ПК Ре У св СИ ТБ Тов УК ОТ Не цю Не о ща «НЕ а «ЕЙ БІ. «13» Нор вне

ХУНЖЕ» Зо

Ар Ве СВ Ме Тв: сна бек був бек Яег ем ек А жоК УТ і: ЕХ) 15

Ар Ави Ма ТВ Це ін Схе СНО Аза бек Св А5р Не Хет Аза ГТ Ух то їй 30 без ха То УК На СА Бе бо СУ ех Аа ета ув Меч Ка Не» в: я

Хуг Ахр Ав Зек Ахи ев п ВЕ СТуУ М Рго хех Аги Ре бег СНУ

Зо 5 50

Зеє СЯ бек СНУ ТБ дер Бе г бе Мн Пе ек ех во Сто й 7 У 50

Сунь Ар Пе ліВОТнЕ Тут Гук Ст СНВ Те Ар Ар Ам Ре Ре Три

Тв вне сну Сі СИХ ТВк Бук У СЯ Не ув А те іс НН «Нв ої «аїр» ІЗ «1 Беж «1 Новже зве «Кр у

Ар Це УВЕМч Пн вето ев ес бев Ріо Уді Те Рео Сх і 5 юю 15

Си Рез Аби ех Пе Бек ККУ Ат ет ех СВ Зегбе Гвх Ме ех во 25 Зо ще

Ар се Ту Ніх Бук Ме Ако Тв Ту Се Ов Був ую СЛУ Спа бе 3 БУ ЗУ

РеЗСИв со бе Пе губ іс СТУ че Ах Аме АВ ет Су Уві еко

З 5 о

Ав Ати Ре Те кпу ех Сну Зег КИ У Те ар Ве Тв вен бук Це 85 7 75 5 ех ми У СЯ АВ С Ар Уа СТУ Уві тує Буг Сух БМ СИ АВ 55 93 25

Ген сна Пе їжа ін РВе Ж СЛУ Се ТРУ Ма) Спи Пе уз вта що іх це «5 ОК «ім ЦЗ «таж лок «ДУ» Номвх харітя «ЗННКх а

Ав РНе Уві Ме Ме Ва КЕ Ре Без Зег ев Хе Уа БВХ Ре Сну і 3 НО 15

Са бро Аде бек Пе Хек Сук Тк баг бе Сх бе Том бев Біх бе 70 85 за вазах Су ТЕ УК ех Тує Бер Бе ев Сб ух Ро СНУ НВ Та 35 Б 48

Гопак тем Не БУКВ УВУ ха Ас Бе Бе бЯх Маг за 35 що

Авщуахе Не бе Су Зак Сп у Бех СПУ ТВх Ат РДЄ ТКе ев бе Не 55 7 а 5 зе АТЕ УН СЛеЕ АВ НН Бр УВІ СНУ УВЕ ТУЄ Бук СУК УЧ СВ ев

За За

Несе уз без Тву Бо слу СИХ СНУ хх Уві см Не ух й но Юх по

МЕ

«ід «і1з З «223 Бирнж «іже Ното заріеце «МюЮх о

Ази Ше Уві міч ГПсля бек го бен бе Беч Р У Те Р у і в: Ів ІЗ

Спа Ргтолів Бек Не бе Сук ах ЗегЗсесспе Бек Бен ем гує Же жо 25 Кщ зАвріяу Ана Аа Гжеїхе АБУ Бе ух бен Сх ух то СУ СА Зех 35 о за

Рго Ніз Цев ев Пе Буг Бев СЯуУ Заг Ах Ате дів бек СЯ» Ма Рто а дер Аг Ре Бех СНУ Заг Су Бог СНУ ТЕ Аяр Ре Пс ках ух Це 5 7а т во

Бек Ма СПИ А вро Уа Сх ма Тек Туссух Ме МІВ. х5 а З

Каса г лен Пи Бе СНУ СНУ КУ Зк у УВІ Ов Пе же до

Не 195 16 «В» ЩО «ар 1; «віл» БЕХ «ВІЗ Поп кармевх «Ки о

АвроНе Уві Мч Ту Сів зер бо Без зегісв бю Уві ко СИХ і в: То 15

Січ Рг Аа ет Пе бегТує в чег бее о бог іяк ем БЦя во

ЗВ ха шо Ко

Акрепу Те НА Тут ев Ако То) ГУ ен СВ бух Бо ХНУ СО 5ее 3 За 45 . осів ва ев Пе Ту бек КПУ Хег Ака Ат Ав бе Ов Уві рю 50 35 о дер Ате РНе зер Су хе СОУ ВК СНУ ТВг Ахр Ре Твг без Ап Не ой 70 Та ко

БегАте Уві спи АМЕЖИВ Азр УВУ Уві Гук Бур Ме: СН АВ 55 о ве

Без ів Ту ев Те РВЕ СУ СПУ НУ ТВ був УСНО Це бух тк

МО Х по «Ох КН «Між |і «215» лох «л1Х» Мото зара «КЕ 01

Ахріє У Ме ТВ Єна ек Рі тензоегі єв Ро Уві Пат Ро Су

Н З 10 Із спч рт Аа Зах Це Зак Сук Ах зе ек Ми є З емі вн БІ ЕЕ 23) а З

Арон тує іх Ту ев жо тр ух бец Св бу» о СПУ СЯ Жеж 38 0 45

Реве беч Пе Буєі св 'Єту Беє Аа Ас Аз бег СИх Уді бо 30 з во

Араме ра Баг у ев Бех БУ Акр БНе ТНК Гаче Аква Ле 7 73 ща жа У Сн аа св Ах УСНУ Уа Гук Гук Сух Ме св Лів

ЖІ ща З ісвбйя Тр іоз Пе ре біб Сі слу Троє 0 а СВ Пе Гук ме 105 15 о «ВН ЦО «Л)іїж 113 «1» Білок «Мі Нопю керієнк «Юм

Ар Пе Уві Ме Тнг Ов бог бро ев ек ев Ро УЗ Тве то Сх

Ї З тв 15

СИ РКО Ав сих Пе чеку ати ет СПУ Сів бегїео бо НіК зе 20 5 КІВ

Ахрсну Тут Ави Тут Бей Акро Тр ук ев ів бух Ру СИУ СВ ЗЕ 35 ЗО 45

Рго Як ва ха Пе Тег ев Су Жек Ада Ат Аза ех СПУ Ма ка х5 5 азроечЕ це зе су ет Су зе КНУ 1 Ар Ре Пн св був ЦЕ цо т їв ЩІ

ЗегаАтЕ УЖ СНО Ма ОТ АВ Уві су УВІ Бут Ту Су АВ СВ АВ хЗ 90 98

Тева Та Це Ре СТУ СВ СНУ ВХ Аге Бевз сів Пе ук А

Бе 195 1 «Ну» НО ккіїж ЦЮ «ій» Блок «а Нето зарівх «ЩЮх НІ

Сп ПеоУді Мес те ние яве его У Тк бем бек бе бек бо Су і 5 НУ І5

СВ АТВ МИ Тео ву Суб йти Айв Зег Са Чег УЗ Заг Хо бах о Ка За ре)

Нівісв Сі Брук Он Са ее Во СЛУ Ся 00 Або Ага Бевїєм в ВВ 45

Ле Тек ож ів ев Ав Аг а ВЕСНУ Не че Акр Аве Ре бек 50 5 оо

Ку чег СПУ г КУ ТЕ Аве ле їх бев ТВг Й Бек Бу МеВ ЦІ 05 Ме 5 що

ОСП Аврора Аз Уві Гук ТУ Су СВ Св Гм Су Бех ех Ро о з

Те па вне сп У Са СНУ ВГ бух Уві спе Пе уз ге цю НЕ «дів НК «ліз Щю «1» Білок ка1е Нопе варіюве «0» ЦЯ сла Пе суд бе Тек сНа бе РОЮ ТНК ому бек бе Бех ЕТО Су

І 5 їв 15

СВ Ат АВ Тбг іон бет ух Ати Афв Яег Си Зег Уві ес ер Бег то 25 з

Ні ва Аза зр ГУК Спа Са б то СПК СА ТМ чо Аге Реве ви аа 45

Не Жук іа ід Зв ве ТЕ Ав ТК у Не Бгто АврАгЕ РВЕ ех 5 За В су ен ж г СНУ Те Акр еВе Гн бе Ге Ме ох Ага бен СО 6 ТО 5 о сла Ав Б НВ аб Гуз СУ СНО Са ГУБ СНУ БегЗек бх

Хо ІН ЗУ

Тер ве Ре спе сла Лу Кн ле Уа спе Пед А

НК: НВ

Зі «ам 15 «Ті Цю аг» Бідох «аз Уж Мого карнх се ОХ се У Мем сна Бех го Сх Бе ев бе бе бек ВТО Су і Х в 15

Ов Аве А ТВе Бер ек ту»х Аке Аа ЧегО Звк Уві Ме бе ще ща Зх КВ

Шктси Су Пер гуси СН бух хо ну Спа Аа Р Аве ен без 35 Я ах

Пе тує СПУ дів ЗеЄ Бе Аг ІВ ТВ СНУ Не Ро Ар Аге Ре ет

І в 50

СЛУ Зег СКу Хе сну ТБ Ахро Рі Тк Гео Те Не Бех ух ев СНО 55 та 75 во)

Ре са йар де Дів Уві ТУЄ ук Сх Са Не Тех СИ У ее бе Ру 5 що

Тер вк ве У Спа СОУ Ве бук ми іш Не Є ев АкВ ню 5 «ВНІ» 106 «Їх Її «ДІМ» Білок «1» Ното хаупеня «ва НЕ

Кук чок век сив ері св ев сук бе бебАЮа би бук Акр Гук Гев і З ід 15 вів «І НІ «ех «вій» Білож що «ВЕЖ Ногов варене сх» сів АБоЗес єв Ав Пе бе во тугі ем АК : і 5 ОН «ВО» «орі» і1вб «102 Вуж «213» Мото зарієнв «НК ОВ

Ат бек бер си ех Тк То БО ех дерну Туг Енея Гук Це Акр 1 3 ІВ іх «10» цю «ії» 16 «ій Білок кві у» Пойо 5арюва «ях Цю

Був Сів Бере Ех Бек яв СУ Був КНЕ Бук івц Ту і й 16 іх «ВН 1 «мії» 16 «МЕ» Буюж «41» Ното зарієсте

НХР

Аме Зек Зак сна яек Се ва т УК зер леву Аза Ази Ту Гви Аее ! З ІЗ 15 «мо Ці «|в «вій Вик хі. Пе» карієвх «0, йти ех Вер Сів дерев ев их зе Аж у Кук БВ Тек іє Зло

Кх Е У в: 2 ї 1 а в 15 «лій» ІЗ «ка» В ца «12 ВИК «13» Нопиухарівх «З 11З тв ее ок Са зег яв ев Мік бе Аа СПУ Гук БВ Кугі ен бар і З 18 15 «а ГУ «ен» 16 «лій» Білок «1» Бовпо зарієвх

КО

Ат Бех СПУ Спр ет ев і кв Не Азр сну тує Аво Те ей Акр ї З Ю 15 «М Я «із З хх» Булож «У» Ноште зара «КК Я хр ан ве сНвВ Бек Уві бе бек Заг Бк Гей СНУ і 5 НО) «10» 115 «ів «ій» лок «ЛІ3» Наимю харзжн» «ек 1 тв Аіа еп ех Упр еег ек Мет ЕВ ем Аа

Н в 10 «КН» 16 «Чиї й «ой» Білок «ВІ Нелю кшхевя «НИ» ЗЕ

Аг Аа ер бе Уа Хег Зеє беє НІ бери Су

І З 16 «НУ» 317 о «її «ах їМлок «3» Нопв» кирісте «щи 115 !

Тто Ай Бех ТП ге ОН Зег «ВМ ПВ «І» Білок «АМУж Пише зареєвх «МИ 118 др. Аза ек Аха Бе НЕТ ВЕ і Х хай» 119 «Рі хід» Блок «Р хю Ното зар «ах 15

Тен су чес Ака АТ АВ Бе «діб» о «А Я «ЛЕК Біаю «ВІЗ» Нею кар «НК 10

Сб Уа бета тю Не хех

І 5 «іде «7 «19 лок «Я Ното «амепх «ЮА

Ск спж ех Аа лм Аа Ве,

Е Ю)

ох «АТ А «іх 7 «ЖЕК» лож «кліХ» Момо зарієня «кН 12

Тез бу мега тв Ав баг і 5 «10 123 «і «1 БІК. «2135 МНето карієне «щюЮ» 155

ІТееспу бес Ав ми ів «МО» 124 «Зх 7 «812 Білох «13» Ноомі карієня «ОО» 12

Гео біу беє Азп ми ЛІВ вег

І 5 «іх 123 «Ех 7 «ТАМ Тілок «513» МНоню зарієвта «КК» 135 сих Ай ее лин Аг АЙВА ТЄ «ВН ДВ «7 «ДТ ТМнОК «І» Зону хара «НК» 196

Аїе Аів ее Бек лий Ав ГВт

І 5 ов «ІНЬ 27 «І» 7 : «ВІЙ» лок : «а» Нопо харієв» «з 137

СИУ Аа Бек Зак Аг Аа НЕ і 5 «Ці ТИВ «вії» З «Рій» Биок «13 Нопю харієна «Ну» ТЯ

Пів Спо Кук Тук от Б ее Тер Тв

Н З

«ЦЕ ГО «МІ» З «Міла Білок кеїЖ» Кент кеВ «Об а

Слів А Аве Аа Ве рт бе і х «А 130 «і» в «іо» Білок «аж» Бизяо заріопя «НК

Меси дів ев сти Пе ев Тв «М 1 «Аж я «ах Бінж «ЕЕ ит варю ик ув сна Зет Пе Ов ев Рез ем ТВу 1 З ой «А «М» а : «1» Білок «кій» НЦощо бврієне «153

Ме ів бен іа Твріх ох х «М» 133 «ії «1 дДОх «л15» МПохеукаревя «ХЕ 133

Ммероів лів бев'єна ТВг бен ТЕ «Не 1 «орі» Кк «ді» лож «і3» Бумпо варієди «НЕ 14

МеВ Ав Ге вх ЄВх Бе ВЕ 1 З «НЕ 135 «Зі» 5 «1» Вища «й Мопю харитя «Ох 13 ме св нів о ее ВЕ х «Нр ІК «а З «10» ВІК : каі3» Мовою винепе «М 3

Са (іа Гук СИу зви ек Рез тв ТВ

З і З ! «й 7 «жо «ій» Бі или у - плрвугикує «213» Нео карі «нки 137

Сів Но тує СУ Хек чех Ру Кт ВХ

І Х

«ан 13 «вії» У ж ж ЕК «Вій» іМлок жу у уча пове деку ка «Ах МКНМо кар «НИК» 138 шк 7 лю іх: Ки КОХ з. зу

Сів Сів Тер Су ер Хе Ро Тр ТХ

І х «ЗНЮ 139 «ії 135 «ра» ДНК. «13» Ноптку зарієре «КМ ГУ севшисарс і ВИтвЕзвіс вявеванес вівса ро скрині осіваднсїє 60

Ксіася свв саоснсаві арок вся рн осв 100 «сздесвари прстковие ВО асиЧИ або енх афврнавіча ізвавеи 180 вес сЕ Кравреося кисвссВс Ксавновса внссварча зсвсїи Я спрдомшва псів вае вносрнвва зевесі айаснмвс павадавевв 00 вовка ВНС Се нрн СМЕИ ос ІВ Е скан 0 ЗО зосвсевнкв всссвсом енер косою ст ссанварозе рода рано ЗО нсадснвоссс око вкотеаакоас пеНнеоски зассенінає ев я ЯщО зх жи ххх схфу ки аку у мові уки коеф че уд хо ичнх сх Б часник Е Екс сне пост ссоуЗи СВК ВЕСНИ На ОЮ щесржКчосс арки еві квійасоюіи сосімевосваснсвусве ссаинесіяє БОЮ вествсвасн ичсисВя весописнас висаавев асизнтисаогінарсосвай бо івйвіш в анівсрсвос вівсссдися ссср и сало нссн прісне ОТО ню. ит Ве рук т му Ву ом ера пеифийави а; пеосссоза висесвавна сасосіоціи аепсссе вк сс ваве саопівсвіво СТ8О іона іванссвсви авпососояе восазиса жене тави евасвесвів кавсНема щесезаовс пааессисне павенров ісяасносне пнсею ОНЮ

Місвисвіосісаесино незсезвеве зкооіеваси всвянена свайінсваи 960 нісіссизси вавносісос авсосссвє паваанасси блсснаанс сизариносви НО хуя се ви ск зуКкККриє дми ук угигу Ффуту рик іук зву рих и вва 3. пессванзас пасчвоіа пасоюнесо сснссодои вечора савани НО сао ссср хвЕ свани ан нюЕсосвиси аеасвосие вивих ІЧ дисдн сиве десснонени сис едни поса че сові вва іс ианоо ГУД

ПЕН ВУД ше КИМ ЖК ЕН ву КТК Кт ик ЛЕ ох ЕД ву тоценос кіаснисяи вес васансаося вобосарса врсейцевію ССО ут жиууті - УК. їх ЗКУ тру духу ки моти ик жуки ле чевівсі сет моса тевностстю сарааюсаєі аовсвкавна касою 0 АЮ саке фи ва тра з сдіЧчесве ва НЕК «вій» 140 «кі» 1357 шує пк «Вії» ДНЕ «ка Уз Бр зВІенВ «НА 150 кавшісиро сне инавіс вино варис пиріаснае сів нене соБилиаєю по ісспневи сонна сасоевне вена са нові ден ссвосомееЕ 0100 асалеражміо щсіковніа прісвані айевке завкакаєос щас нев ЕКО кесвженівв окис своє сс визеааех скавкавсю ср Я мзіжкуі юки пухир уж ку туту у сте Е Кк Кк зр що туру ВУ саажичзси ресів сноновеаси шСтитніНі зеівізсади возсоаваао СЮ

МШдзрссвсе неваєст сів ни Маск овв посвановас сасвоювсо Зб шсїсісци сівнсвосла виресевев віспесосе песо сіосадивис 430 ут ухк сут у (пив уми рус ку Кт «ККУ ук пути куски и УТ, БК вевосовиз всисвЕсрне сне ос сінріоввх асівенеос сваасское Я

ВсЕЕЕК ні пев ано сво ецес зисевосні с весно занос саличсди висно оса вівоі св ів кни свои ЩІ хлди аю МА КК МСЕК ЕЕ ПЕКИ МЧИКАСКЕУ лм вва нина ккравеНе зааевечоки чини пасив БЕ) випнзисвоз авцлівіні сенвінссса сопівосеваев носа осіві песавесв 0750

Но ікивієцес СНеСоюсс ваинорснавВ васчСеСВ, знане всссаяе 80

ВІЄВОКЕКСВ В КТЕВТвКа КИ ВИТ ВВАЕВКСС зенісар савотодівє ВО

МрЕЗеВоси пвОбе В гр ссадо совно ссис Вова оквроа сИсаасввє 00 дернсеній КВВосве осітрвесвИ мокаесаро небесинні сереазиняи 966 гаснаоінсз присвя сацавесмос соносссссвіскавазавс свевоваа 0 НОО посазавтє зносссввка вебасанот в івсвесмве соссоссв вречевів 0 НО весавдавес вребавсосії еве рес прованс шеюсссяв спасе вою 140 нінвивісви леввоваєе вопосснеар засвоївоз возосасаоо освіт 120Ю вастюсввов ковенен сомів с ависісаесх іноасазичо спеніносво 12) сарввкнвся Ки МО сссВвнНе си ркавио пнсвепнаєсв асасвсне о 132О завис сссомово вивіаан Ас «а НН «рю 3 «12 ДНК «13» Ното зврішов о» 1 каннідснас ввів і вионранве чоківсвоо сіденое ссіранввсіє 050 ісстеовсар се сла сасоцсані ясобовасвівсжтнон ссросвани ОО сеазвиванав вче вис ивнЕ б жіасік занозовеас аонность 150 пессемва преассвен своє аввканаац совет сцен 40 саззівзаси вОосієвнанс списав вен еснЕ асінінова: врисеавнає 00 інвенокасе вона ктесвиніх раса песививоно сан 360) кеїкссве навик ач виоосеВісв кіспосеос ресор совка Я «еезкованв веаснисвоє осівевсте сівсбваве пебюнесс свавссвн ЯКО асквцисет вузасіювви Сосісївасс засевсріве неаоснесо висініюсів ЗО сеапссвчв наст ссіючосаво ллє івосссви смс СБК зсневесь асо сетанасиє ааоссовосп вечесайвні еваснавнов 0050 винаесвса МОП ВЕ сени сси совіркссве свокассіні вроВсиюаВ 720 вано ВИссоє завасссвав каовсєю си еВ лсссв рвсоєсінав 7КО

КИ

Вісаспси ові донна срниссю дезочосссе внесе ви сааснис ОБО

Бівевсвисе Гео оса рес веонаисеВе врода Нова СОЮ зеЕйссовів ве оесв осісассин нев оснра асо нав сенси 960

Ісав осі авесєва сазанокснс ссвисесссв сварааацс цією 020 восвайнвис ци огсечва ассновоніи інсасссівс ссоспіоссе виаенканайн ОКО асслаизасе виліз васег нос: вісаввинсе ассссве скаовсвеє ЕМО вінжнлехев пні Ко кокос квих васивстоя прассвенос овен СЮ

ЕВСІЄСВиСд роси Н сетсрієвне анесісзсси спшисварак сви всвя 300 саризннив песни с Кочом спеаиосе средства сбовсвеви ЗДО васпесрві серію поки Не «НЕ 153 «ії ча «21» док ех» Нотще сарізвх «КЕ а

Сік Уа св їжа ма Сп хе СПУ Су Су Мак уд сів Ро СИХ Ат і й га

Жегіви сн гене Сук Пи Ада бе СНУ Ве ТВ Но бу бах БВ за 25 за су Ме Ні Ттр Уа ме ів а та СНУ Буз СПж Кен На ув Уві 33 ЕН ах

Кг Це бе Тер реє зер су Аж Ам жь Бук ек Ав Азр оче У ха а сту Ат Не Сі Не Хек Ази кроки бета ГВт ге вх о: 75 що ев пи Мегдаа бег бер Ате Аа Св Ар Те Ав Уа Гук Гук Су не Зо за

Ай АТЕ СЯ СУ Мі весна СНУ РБе Пе Акр бен Пр сх ате СЛУ

З

1 НВ о

Ле тет УМ ТВ Уві бек ве Айв зе м Бузену Ру ес УМ Ре 15 ЗВ 5

Ре ги Ав РкеСух ех Ягве Пе Бех Су бек Ті Ліз Ах їли 130 5 1

Сиу Сук Тек уаг уз Ар Тур ре Ріо спи Рго уві Вк Уві бек Кур 15 150 155 і

Аква су Ма бен НЕ екю Уві Ні Пг Ре Бо Ада ув би 165 ТЯ 175 сни же Бе СУ ев Ту векі ви же не Уа УВІ ВІ Уві бо Бех ї5О 5 150 ех Ака вне СНУ ТВ св їх Ту ТВО Сх» Аза Уві Ахо ВІВ Був Ро

Не ще Зх

Хег аа Пи бе Уа АХо БУЄ У СВ Аге уз Су Су УВЕСТИ зо тіІ8 вав ув го го ув Бра Ада Ре то УЗ АВ СЛУ Рез чег У Ре гей «а дах я) це вто Рі хв Ре ТА А ТВ Те Ме Пе Бек Агя ТВ що СО 25 255

У ТВеЄСув Уві Уа Ул Аер Уві бех БО СО Азрв то се Уа ОВ

Б ТБх 57

Те ка Тр Гук Уві Ар Су УВО У Ніх Аки Ма Гу Тк дя

І АВ шва

Рто Ате Св СПО Спа пе вап бе ВЕ РБК Арк Уві Уа Зег У ев да га що

ПТ уві Уві Нік СП Ах Тер ел СМ ув СИН ТУ Був Су бух

ЗІЗ З 315 32

Те ма Бек дев у СНАУ Сен то Аа Ро пе СЕ СА ВХ Не хе гу

Кк 3 35

ТВеї ев СВУ Со Ріо Аг Сів чо Сп Уа Тут Пет ев Ро Ро бог

Бе зх КІ. ге Кн сви Меству Дух АЗИ ОВх Уві век ів ТП Сузіжн У) хя 355 350 365 сіЖ Ре Тух Рго Же Ар Пе й УВС О Тер Су Зег Аза ЄНУ СВ 37 5 З

Ре СМ Аза Гук Бук ТВЕСТВЕ Рго Ре Ме Гео ар Бек АВ у 355 БО) Зо БІК

Зег Ре де бе Гук бер Бук ен Пе Уа Акр ув бек Аге Ту Од в з 15

Сп СЯ» Акп Уві Рне бек ук ак УВЕ Ме НВ СН Аїв Баг НІХ Абв аа 45 Зо

Нік Тує Те Со Гу бег Те бог ве бог чо СОУ Був

Я 345 козі 14 «із о «зо Бе «іже МНопо зар «Ех ЯЗ

Сб ж ле бен увів бе СПУ СТУ ХУУ Бе Уві Сів РОБ Сї ї х Ю ІЗ

Заг БГев аг ев Хв сув Аа ів ек СИУ Ре ХК Ро ек ГЕ Ре 0 13 за

АБИ МЕНІ Ттр УА АВ СНИ АВ ТВО СТЄ бух МУ Сов СВ тр Уа що 45 щек йог Це хр У СИМ СНУ АЮ ТВ Гук Гух Бех СПУ Ваг Ук т 55 що ня

С» Ате Ре Ми Пе зе АН КИ хи Аа мк ка Бег ев Ук еВ 05 що ТУ ко

Св Ме Ах бегісв Ах АВ Аер ГБх Аа У ук Гук Су Пж

Ві що За

МмМЕСНУ Сн Ахр. Тер ог ко пав Ахо Ту бук ТУг СНУ Тен Ахроу ві ню їх Но

Пере ся Су Те ТВ УВЕ т не Уві Бех бе Вів Чек Гвх Був Су

Пх 120 123

Рго Бек Уві пе рт св Мі рт ух зер мя Зег ТвВеее сни Мег

Не 135 і

Же Ат ев су Сух Бех Уа у Ар Гук це Реосів Рех ві 145 150 135 ва

Ти Уві бек Тир Аха бек СЯ Абе ТЬе бек сну Уві Ні ТВ ВВе 155 Гю ІК

РизАіа Уві їси Сіл сх ок СЯ во ТугЧегіси бог бе У У їв 18Х юЮ

Тс УВ рі ее ве АРЕНУ ГВС Пи ТуУЄ ТК Суб Ав о Уді 195 що з

Ар Ні жа ро бек хв Бу МВ Аа ув Те Уа Спа Аге Горх

Ів іх КЕ

Сбукбукю Уа ССух ко Рек Су вто Мі Рто Ре Уа Аа СТУ рт 2Ій БВ 235 що ек ун Ре Сер бе Бр р ук та Був АБО Вк бе Моє Не Бег

Бо 25 255

АтеЕ Тер Сл Уві ТВЕЄСух Ук Уві Уа азв уні Зех Ніх СН кр зай 65 ри

Р сли ба сна Ве Би Тер Тег У Ар Су УВІ СПЕ Уві Ні Ай

В 28 255

Аа ух ТВ Бу Рію Ат СПБ ОЗІН СНО РБе дев чег ТВ РВЕ Ат Уві я 255 Зоо

Уві ет Уві без вх Уа Уа ЕН СН Аза тр ев Азов у Бе сне

М КН У мо

Текілк Су бух Уві ет Яка ух СПУ ев Ру Лія Ре Пе ЗЕ Їх 355 З. 335

Те Не бе Був Тебе СНУ СНИ Ро АТО Спи Ро Са Уа ВЕ

Бе Кези 350

Гей рго Рез Хар тя СПИ СТ МЕТИ уя йхо Св Уа! Хес Тані ТАЕ

Зо З уві УЗ КИ х Мбесук Буто зЗек лжко Не Ай Уві СН Тех сно 37 7 ЗО

Жах Ап у СКК Аза ка Гук Був Пи Ве ро Рую МОГ т ев 385 Б 395 щю

Акруєгаар У Бех РЕ Не бо Туг зер бух ви Те Уві Ащ ув 05 що щ5

Зег Аг Тр ОН сВ КНУ ою УЗ Не ее Сух ет жа) МОЄ НІВ СВІ о 5 о

За бли Не ее НН Ту вх с гу бесбко бе бен ву Его СНУ

З38 ща з

Гук «МО» Я «АБ о «іль Білок «Ві» Вол харіех «В» 4

Не со Уві Ов ев Уа Стик сту ПУ СПУ без Уа Спа Ріо ВУ Ну

І 5 о 15 зегіен ме Се бег ув Аіа Ав хе Су Ре Тім РНе Бех ПУ Ре 20 25 ЗО

Аер Ме Ні Тр У Ат СВ жа Рута Сік т жк СПУ Мем Спи Тов де 35 о 45

Зег зер Не Ахр Га ОЯи КНУ Ар ВЕ Бук Бук Рго СУ ет УВІ ра 50 ща БО

СПУ Атв вне Те Но бе Ат Са хв Ай Аге Аа лег бах Буг бе

Но 7 75 ко

СН Ме хо ЗегТ ев АК Ада СУ хе ема Ма Тує То СУТЬ 85 90 ча

Ат сх СВ Азр трек Ар А АЮ ГУК Бех Гук СПУ Бе Ар Уві юю не не

Хтв слу бів СНУ Те ТНК УЖ Ту Уа) бегзег діа Бех Тр Бу СИХ и о І

Вро ок Маг Ере бо ев Ада Рез Сук Заг Агро бБет Тт зех С Бег 1 135 о

Тр Аа Ас сну Сук ез Уві ук Аве Гук Ре Ро Спи Рто Уві

Нео Не 355 160

В Увебек Гера ее сту лів ев Ту ек сту Марію тв РНе 165 15 175

Рез Ай Уві Пец і зЗек бебі ев Кок ек і си бек хек Уді жа

НА 155 НЯ

Ж ув) Рез Зег Заг хи Бе СНУ Твг Са Тв Тук Те Сук Ази М ві

М, 20

Вр НЕ ук Ро мет Ам Пк т муці Ар ух ТВе У СВ Ага ех

НЯ

16 15 230

ЄСтувсув ОВ Сук Бео броюух Рез АВ Бе рго У АМС Ро 22 30 Тай ха ех уві Не без Бе Ра Рго бе Ро Був АВ ВІ ев Ме пе Зег ай хо 255

Ага Те Ро ла ві ТК ух У Уві Уа Ак Уві БЕН ОВ хр у; 255 27

Раз св Уч Спо Ріє Ак тр Гук У Азр Оу У Я УВІ БИ дев 275 ва 285 діа уз ТБ Сук ко АТ СИ СНО Спл ре лев бек ТВ Ро Аме У

МАО З Б

Уа бЗег У Бе Ви Уа Уа Б ів Аве Тур без Ах СУ Дууя СІВХ

ЗХ о 35 о

Тусіжест ух Ма бе кв ух Су Тео рю Ав Рхо Пе СП Сук 325 3 за

Те Не бе дв Ме бу СПУ Са Ру Ак сти Ро Сл Уві Гук ТНЕ

Бе за БАЗ

Гах рег Ро бек Ат СНО Со Ме Муз АВ СВ Уві бек Бе ТВ 355 Зо ла

Суз дак УдЕбуя СНЖ Ве Тус вх зе Ахо Ве дів УдЕЄНИ Тв СВ

І 375 зна ет зв ск Су РТ СМ хи Аква вух Сук Ге Є Рто Рез Мері ео

Зв щЮ 355 щю

Ахр ес лерспу ес Ре Ре їж Тут бек ух Гео ТВ Ме Азр Тв щ ЯН 1 вет Аги То Со Са п у ха Уа Не зе Суз чек Уві Ме ие Сни й 28 Б

КЕ

АХіаівв Ні Аа Ні Гук Те сне Б уя бек Тен бЗег Боем бек ЧО СНУ 335 я ж

Бук «НЕ 145 «іх ЦО «М Виюох «Ал» Кипо каревх «ню» 145 сів Уві ба бе ма Си Бе сну СНУ СПУ Уві Уві дів Ріо СНУ Ат

Е З Ів о

Загісв Ак Кео вет у ТВ із Хе Су РБЄ Тву Ве бек чек НК а а Зо

СИХ Месніе Ттр Уві Ат ЗНАЧ СНУ бух Ст Ба о Туб Хв

ТВе Пе Пе То Ре дер с ди Ав ех Тур ГУК АВ вич» Зег У і зо З 80

ОС СНУ Ат РЕ тів Це хег Ати Акроа Зекі уз ав Ву Те Ве гі та 75 що іа МерАзи сі жи Ат аа В ар у Аа Уа Гук Гук Св

Ка ЗО 3

Аза Ак СНІ СИХ Аа СВ Са СИХ РВе Пе ло св Тер сну хв у

НК нт ЗІ

Жререй У Бу ун ее Бе «ДК 15 «Зх А «8103 БЕК кий» Нотшоверювх «НЮ» Нео що си сі У оц хе слу ОБ ОБ ев Уа ОБ Рез ку у

З в ІЇ5

Заг Тео Ато бен бог ух ія Віз хе СПУ Ре ТВ РБе Бог ТВ Ре

КУ й 3

Арман Іа Тв Ул Ас Спо Ма ТС СНУ Гох СНУ Ге а гр 35 30 45

Бег Зег Це Ар СПЕ СНУ Аве ВК Тук Бук Бех СНУ Чек У бук

КЗ) 55 о

СТУ ати Ре ТУ Це бах Аве Ста зав АВ Ів ха бегіжи Гуг ід 7 їх Бо

Сів Меї Ав бек Сен ке Ада СЛУ Зк Те АВ Ха) Тує Гук ук ТЕ

ВХ БІВ 5

Зх Сну сти Кер тробег Ази вкр Аво Тут Ту Ту Ку без Арк ві

НЕ), 105 о

Тевспу Сів у Квт Тв Ме тв Уві Зв хх

М що «Ді» 147 «із РУ «вій Біок «13» Нео карктаз «НЮ 147 са Уа спів ув Оів Б СНУ СУКИ св уві СВ БоУ сих СХ і З 19 15

Мак іев лев ев іт Ада се СНУ Ве Ве лева Ге не о 83 КІ дар мес БІ Тк Уді лев со ма ро сх Бек сНу бев'ни То Пе їх в 5

Хеє кет Не Ар ТВ СН ПУ ха Пи ТГуг Тук Ро Се ех Уві дв зо 5 5 по

Су Ат Ре Тв НЕ бек Аг Сів Ав Ан АгЕ ев Зееісв Бут ев 03 70 73 ЗО

СИ Мер Ако бе бен йти АМКУ АВ Тк лів Уві Тує ук Сук ТВ 0 95

АТО У Сн Аво рр заг жо АяроАяо Гук Тує ук СНУ ев Ар У ві (о ПО По

Пе ях а СЛУ Тв ве У Те У бег бек

НУ

«а ЯА «іх 5 «ЯР» Биюк «дія» Мов зарієпя «Ех 145

Бех ів Су МЕСЕНХ

У х 4 -ї канНх» 139 «із З «жив» лож «Зх Ното варієле «300» 139

ТВЕР: Ази Ме Нв 5 «дій 15) «1» 5 «жк Биюж «ОК Ух Нео харієв» «МНН 150

Те Ре др Ме Бу

З

«1 15 хиії ж Б? «12 Білок

Ті каже Но хнепе «КК» 15

Пе пе р Ро А МУ Ах АКА Бук Буг Тук Аа хр обег УМ СИ і 5 ІК КУ о «Фі» 159 «і» 6 «й лох кій Поето харинх «ев 159

Заг Пе хар КВК ОП Ну Ав ВЕ ОГуг Гук ес Су ет У ук КУ і 5 ю ї5 «ВН 153 «ШІ о «Ром лок «вії» Поп карих «НО 153

Бех Пе Азов Пи сли СНУ АВ Ве Ту Гук Рто су ж жарту пу

Н Х І 15 «а» 154 «Мі» «аа» ЇМЯоК «У» Могор-карнх «Кк» 154 спи СУ АТ СНВ СИН ЗІ ре Цеойвр ев і З Не «05 155 «МЕ 15 «коро» Білок «іх» Нотшезареик «щКух 155

СЛУ ОВ АВ Грає Ар Ар Аво Бук Гук Гук й у деи АкроУ ві

Н З Ке 15 іще «іп 156 «і» 15 «аю Білок «Я» Ноні «увісля «ню 156

Лю СМ Ахр ром Ар АзвВ Акрог ук Бус Бук Су бен Ар У

І 5 Но; І «А» 157 «а» М «18 ДНК «5 Ното кщнене «ню 157 пасінесвка грасоствє тес но кН ек семан вара Са ВНасю 5 зісаснко ввисЕВвєв вазона с засн наа аа хвіса савеа 120

ЕпЕизаниссо сваветоюї винесе деснесван гне заасзои воесан 0 15О зижнезви и пазвіие ивасаеН НН са сспсзвсре ве ОС пацани бавовна с санове сацинав совсгасійсвосива 00 пронорацин рен спаде веіе вн исаося сііоцеВі сцессвося ЗО жук квіти су угіу ви фрукті и тив вих чн з краху и ие аз юна веацехаВс не іні ес ртнав асо У

МИТА ТЕ ШИ їх ие ЕШусЕУ жан «ссезвирире ссваввнєв віко ная и вайосвосстосвасвко бнопоссам БО зем а свизисВнвисвисвавна арен ресіжароав саоостнаюи ОС сінарсвани сарі нсез вавасвсана вКнаскосс всоварісвс совісдавис БЮ сарі ке серпа пва наасцевас вин вавин рі па «ар «іш ДНК «ніж» Беоваріева «НН» 158 шнанеа асесавчс ал сторо сервис ОСИ Во йо шсервса пиісіцеов варосієств за нінай казанвост а занря 12

Гахлисара просаивосВ шосисВи сто наїсЕ іш нане саносЕнНе 1О

Не кавЕВ НО сен оМ сарі исано висно Ка савсас всінанине ЧО аносевк ее перс рнааа ЕИвХеоН Всі вея гЕоааНеН возловє 390 венсокее сікеко жав вк нов занос ве свисінов Ва ЗО інсцессре своя весло иана ісівожасти сопло онов о звіваєпеєпсссвхава висо ана співи рн но васос нове ОС ЗКО кручаноєсь аронвавімк справно и пакарснивие аснреносмесаноєюВоє СК зисчсжіва сс данке веслвисто вилинноаси аамііасвсчоскав 0 восоцечов востичосіс пеоспісвся аавноснси аспирермив ні З «Нв 159 прі «Віл» ДНК кий» Бкнуквирієвя «НН 159 засне ка снасссвано вас сідюсвіса рессіднаса веовЕСсе о аж сзаекаашіса павесютв снавінно: пизадиссіз ацнем 190 ідествозаа арссаресов всоїосвсяи сорінаоі разі спассноче ЯКО півнкавівс сама и савірнснио ковісназев саванісве зсішавайію зкоскдини зоноіпавнв я виряіносівса лось асвомане ОО агпнсрвсе сви восова аБівканно зазскаснів сом вон ес ссання СЕ незвлнх сосснка ва осн и засни чн сіре пеня ОО сідав кізнорає Еванс варів ри ав ев ай с юрла 0 БО іскра сесароанах опе нван свокасвисв че касакове сожнвею 0 ансаврасосітрвсвонає сен вониао Мснаказнс весна свосінсвна 000 дісвесеи пиевесЕиае свое віЄ вка созвасамева пдавеЕ У? «а ню «Арх ія «м Біо «ета» Попто вареох «ад» 18 хр а Кк и й Мухи Же Же ух Х ся Ше М Же др Ех дар Не Сів Ме Тести беу Рг бе бе ев бек Аза яю МА Су зї4 дк і 5 НО ІЗ

Авр Аг Уар тн Пе Те Су Сіл Аве бер Аз Не ек Аха Ту ' 30 25 3

Тех око Тер Гук 5 Сх хх Респ у Сук Ав бо ле Бем бем Пе 3 за БІ

Тут Акр Ак ех Ахп Бе Си Кот Оу Уві рео Зег ме Ре Вех СТУ

ЗО 5а о ек спь Бек СЛУ Тер Ре Те РВе Тв Пе чек СПУ без ОВ Ро 55 а 5 що

С Азо Не Аа Те Буг Бу Су СНИ СА НІ др змі кв Ру я Зо «5

Ті Ре слу січ Тв ух У Се Це Сх Ах Тк Ул АВ Аа

Не 105 цо

Рез чек Уві Ре Це РВе то Ро ес Ази са бем Бу чек СУ

Го ах

ТВА бег уУв У Су ем ти Аа Аква Вве Гух Ро ан СВ Лія ца 135 1 хе УВС Ттр Се Уві Ач АБО Аве Спа Бе СПУ дав зе СИВ 145 15 155 іо се ет Уа Ве сСтле Св Аврозех бух Ар чек ТВ Гук бет Бе всех 153 Не 75 бек Пи ев ТВк бе бог ув ів Аер Тук Ов ух Нів Га Уа ту 150 155 кю іст ве ТВЕН Се спу кі Хег бек Ро Ма УВУ Гук бек а З 205

Ріє Але Аг СИ СИМ СУ

Іо х «мить 18 «ТЕ ЗІ8 клі БІЛОК «1» кує кс «УНК» 16

Ава Не Уві ме теє ТВЕР їжа бог Тем бог Уа ТК Ро Ку

Ів іх

Св ко Аа Зеу Не Бог Су Бук бог зе З бегіев Бе НІ ОеЕ о аа щі

Авр сну був Пе Бе тро Бус тев сна БУХ че СТУ СВ ую

І. 5

Фо спе ем їжі Пе гук СПУ У ді Берк ка Ат ре бек Су УдЕ Ро 5а 55 5

Авр.Аги не бе СПУ Хек СЯ У бок СПУ Ве дхв не Твен ух Пе «а 7 що о

Зег Аг У Ск Аів с АвВ УВУ У Тустукє Сух Ме ой Бег ха 0 вх

Те Зів сю Рбе Те Ре Сиу Ресну Тебе Ма Зі Пе бух ме о З по

Твє ув Аз Лід Ре сег Уа Бе Пе Ве Бо го бек хр КН Ся

НЕ Ід 125 св бух Зес сну Біг Ав Хек Уві Уві Сук їеч Ген ана Аза Не Гук 13а 135 146

Ре Ас Ов Ма їх УВЕСТИ Тир їук Уві Ако 5 Аз бен Сів бег 13 НЕ. 155 150

СУ Лев зве Ся Со ее Уа ТЕ СО Сів Авр Зег Бу Азов ог ВЕ 155 ЯКЕ 11

Тука ев хе ве ПЕ еп Те бен Бех Гу Абе А вр Тук СП ех 1о 155 150 то ніх Бе м Буг АТВ СУ Се УББ НН Спа СТУ Бе бек ет го

ОХ МО щ

Мат цув ве Ре Ази Аг ПКС Су мо Зх «0» 183 «Із З «ВІЛ Вин «212» Нопж зара иа ха їз

Ах Пе ом ТВі ТВЕР тем бе вм бе Уа ро Сну і х НО. 15

ЄНпорхо Афін бог Пе Зет Су Сук ек чек Спо бег бео Гео Бе бог

З а Ко

Ар КНУ Був Те Тева Рв Кто тує ев Но бук Ріст у Дів Бк кас «В Я

Во Сів ев без Пе БУ СИ М ві Бех Ав Ат Ре ех Су УВІ то ва

Ар Али Ре ес си бе СИ бе сх Те Аз Бе Бе То бле їй 73 7 ко

БегАтв УЗЕОЇВ ди хр У су Уа Єуу маг Сук Мік со Бех ях за ча

Те Ов ема Ре тв Ре Сп у бо СЛУ Тк ув Уві яр Пе бух Ам 16 Но о лея Тв Уві АВ На ре бег Уві рве Це РВЕ Ро Сто бетх Аквв 5 ще 125

Спок ух зе Яу Ве АМЄЧег Уві ні сух ев хо Аза Аза Бе

НЕ. 135 130

ТугРто АК Св АП ТА Уа са тер хх Уві Ар айви АП ев Се

: В

Ге 150 І55 о ет сЦу Аква Бек ой Сн бебі ТК СН Ой Акр бер ух яр ех 15 Гя 17а

Ж Тут Бех жо ек ак Ек Бо ГВт Тео ет ух Дів АЗОТ УуЮ СТВ

Іо 185 О

БукНіЗіуз Уві Тує Ма Су сіе Уа Те На Са СИу ев озег ст ех щю 205

Ріо Ущі ТВгісух Зег РВЕ Аж Атв СНУ СНИ СУ

Те 215 «МН 183 «231 108 «кій» Біжок «З» Ткчпо зарієда «ОО» 6 «хр Це Са М Ті в ес ко Меп загіи бер АЇВ ек уд Се

Н 2 тю 15

Ар Аги Ущі Те Пет Ст є ів Бери АзроЦе бБег Ах Тут

М я за

Без Ав то Ту НК СИ Сх брас у був Аа чо Був те ев Не 35 ча Я5

Туєдев Ав баг ля бе СПИ ГВИСЯУ Уві Бгто ех Ага гне Бе сНу ща БО зе х чегіу ВЕ Аа БЕ ВХ Ре Те Це бек СУ Сена рео

СО дер це Аз ТВО ук Тур су Сів Са На дяроаза Те го Боу

Го ща ом

ТВЕР ее СЛУ СНУ СЛУ ТП Був УВО ОВ Не Був Ав

Не 5

МІК

«вних «з В «ій ВОК «Я» Ваше мимелх «МК 164 хв Пе сі Мет Сів бек Рг зок лог Геч бог лів чек Уві Су і х В: гХ

АхрАтв УВП пе Те Суб Оу Аів Зевс А Ме кг Аа Гук -а Ко за

Та Аа бо бе На Сів бує ро у ев Аа ча г Гі ем ПЕ

С в

Тук Акраа Бе Акв еВ В ВЕСНУ Уві Рто бек Ате РЕЄ ЖЕ Оу о ях 5

Заг сну бек СНУ Твг зро РНе ву ле Пн Пе ет СЛУ бев С рко та 7 Во со Ар Ве лів УВК тує Гуру сна сів НІХ ко Ав ем бро ви но що 95

ТвВеРНе СТУ СПУ СТУ ТВУ Був Уві си Це був Аг

Ню ГК «Дій» 105 «і» ІЗ «ЛЕ» Білок «-іа Ноні харієих «КК 5

Аза Не УВЕ мете Са Пн Ро їжи ее бен Бак УЗ ТВ Ру СПУ ї 3 Ю 15

Сапа бо Ада чес Пе Бебісух бух ек зебра ес бор Ге Ех ех 3) Ка БІ

Ахвсму Сук Пи тек бен ВВе то Ту бец Бех Бго ЄЛУ СТИ то зх що ах мо

Рона тв Сей перу Оу МВ Же АВ Аг Ре бе Сну Уві рт 53 З давня ся СУ ех Се ке СБУ вве В ВВЕ ТІ Ци ув Не та 75 Б

ЖебамЕ а Кв Аа Ов Аж ж Оу У ук чек Сук Ме Ох ЕК що 0 95

Гей сувіго Бе Те Рв пу Рез я Пі уз Уві Ахр Пе бух Ат

Мо Та о

ЛЯ

«ак: о «кі» НП «81 Бик «А1Х Нопо зара «ню» 166

Сп Аме век са хр Не бе ва Гук бен Ак 1 5 3) «ВН» 17 «їх Ів «Дул Бихк «ліЗ» Новою хорієвх «МИХ» 187

Гук ес ог Св ме сп їх Ні Зх Ар У лук Ме Ту іди РВЕ

Н 5 І І5 «ЛО» Ба «Ех 16 «вій рік «МТА» НожеУ вщневх «ВХ 105

Гук бак ет бла ас бе їж ІЗ Зеєр лу Бук Пе тую бом Бе

І З 9 Не «3105 189

«ії «ре РІДОК «Ям Мене карієне

КО 169

Акр Ав яек ка бер сну

І 5 «і» ДО «7 «а» ВиюЖК «3» Ногпто зарієле «ж ГЛ

ЄИх Уві Мег Ада Лв РІВ Заг

Її 5 «ВН 1 «ТЕ у «1» Вік «13» Мово вивів «НК І

СУ Уді ех Ав Лю РВЕ ЗЕ «ЦЕ 173 «АТ» З «1» ЇЗлюж «ді3» Ното карепх «нн» 173

Сів Сб Би АзроАха Бев то Бе ПВ

З 5 «Вій» 173 ка» В «ВУ» Білок «Ж Нопк хареву «а ока СО ех ев сл ен Неон

Ме СНИ БЕХ ЕК жо вне

І й

Іі «й» 178 «ії» В «Ве ВЛОХ «1 Непю варене еко» г

Ме сна бе Бе ств Гео Бе в

З

«Не 175 «ЩЕів 157 «лі» Бик «віл» Ново харних «а 175

Тк ве ет Бук СН ех Ятр СНУ Бе Си зав сла А еи Це Ущі і 5 10 ІЗ

Аг Су Різ Ал СН КНУ ух Рез бек Бк х Уві бо Тр Бує ук щет СНО Тк Аква Був 5еє Перга ТУ ПяЯ СВх Аж ка ат Уа рве 3 ча 45 ів Ну Св Без ех Бук Ре ех то Аза си У Ада Авробег ха 55 50 су Пе грек пт Сух Пе Уві Аге зок Бе те Ре Аха Ате Ту 85 70 75 І;

ТугАїв Ав У Тве Пе ує Бук Бук ів мег вв Су УЦР й зо 5 дер тугісо Ме ту ов г Уа бе су хе Си бух Дей ет дя

Іо 105 цо

Пет Ств Во ГНЕ Пе Ахрое Туг ха Тер Пи іа Рг бер СНИ ї20 рах

Лувр ве ух хв Сжк СБх ів ев це СПУ Ме хо т хе Ате АВ 130 138 Що

Гук вет Ре дев Уві Пе Ар Ак Уа МеВ Се дв Аа Ахо. 145 15О ТУх 160

Тут Суб ід Рв Пе Ні ав» Он ану аа йха Ту ог Уві

ТРАВ Пи Ат бек Ре ТВ Уві Гу Азов ОВ 15О 155 хх хх ; ; зн в ни о | ж ку НК. НЯ - | АН: за ще хро як кова ; й ; ке -яе- і ї в дж й в щд: я

Усту їх її -

ЩІ з 0 --ей4- цк : дою. ї ос ш М -Щ-- г в о є є ше НЕ Ж звання

ЕК їх їх це ра сх . ї ї . . - в в їз Ко х вч їх Е ка ща г їх

Б юю В м - о і Е.

ЮвІИВт ю

Кк Кий -ї зів ї ж т

Е хх ДЕ. жо вамНУ вк, дея оз

Мо ЗаОБЬ "ее ! і. ів, «й й. ща й МОВ печі «ел К- я Еу

В З : я в А Я ї що БУ Кн КЗ

В - Б 5 (Я 5 Ж г

Ж 5 . їх я і

Ко ЕВ, тв щ . ФІГ. 2 .

М кА й

05 Б УЮ - АВ і т, м що й її УЖ, і; - АМО в У й й й шо Ав2 т вв ЇМ ю кй а АБ ше 5 ШИ Ф лі в як І ів Х й мо дв? ще | і // / ки я два м Ї зи б ді ч дл Її" во 1вс2 пе по на ві і бронх й ща і Я то 0

Тавнпіло до ЗТ Я) ММА

Не 5003 я Ж о Авена во зелен щ Ж за рноми ВО я- 3 / шо 003 /

ТЕ ! / 1004 / о БО й ї 10 то

П-ЗЗ (німи) як 1-12 ГП нгоумлі

ФІГ. 4

Ж Зх що З : ще же МКК

Я га! В з вита

КЕ БОЖКО док ще сш нн и нен и : Й щ

Ок ШИ ше сш інфііаниннимв о ВТУ х : хо що Ж пий Хе І

Кк: ши га ХХ со ваше кс З з ходових он яе . с. де о жмЕчи тре г и з и НК - а МЕ В х я: га НД ИН ННЯ хх о Со МАХ Е ї

НК не ес ше и БІ к 25 Ва як : ке нн и а НН о я ОО КО ї : М Мен нн и тек х Я ох, КУ ТС З КЗ Ве ще ї ся В З р ВК а НН х ко і ко МЕ яООЖх ря ЗЕ: щі ке ЛК ук о 5 Ко щх Ок а АБ ще х с не ВОК, як

З З яко Ку

Ж Я: Ж ди МА

Е М х -

З си

Х С

РУ че з Зк гуя ЯК ще Не 15 ЕЕ Ще 16 с джин - пу й вки

Анизшово БТ ТЯМИ дод

Фо ж:

Є

«Я Сл с З кН шк

Я м ШОК ах ї доку йо С с . Як се ще та у оня в з В . З

ХК В і ва я як

МОЖ с и Ж у - ОК СК Во Я й и У ЇХ дддодннинюве ву 5 ОН я щ КК Х

НО ИЙ Ж дини о НОЯ Ж хх кох ки Ки, х . КЗ и ж я Я

ЗНО МНННИЙ ОК х хх ее ення ЕЗ оо Я СЯ ну По м Нм їж З Е М дн А пк,

В Кт п в Б» ННЯ в ВНС х

Ж х ТОК оз ше й В ВО Бо ШЕ

СЯ х и ВХ Я ШК 2 З Мк : ОК С

Е х ж ВПЛИ ко тм, Бони з ї дих ПЕК 0 КК ОК с. ОХ Я

Е Б ох ж ЕК о Е Є М ща ОК

ПОМ Кк с Код ее МНН Мо з ща За ВК, Мою В й 5. о аа С Б сок. КУ ОК ОО С ї

Ох, я скмм Ж, Я ї Ка С КК ВН

ЗВННЯ З Ех Е х с Ж Мк ей и Я ща Я Не о Тур тес ЗШ оо а І ки жи си Б Б у о ше ді ї З. Ж М

Є со шк хх я ДИ, Ен хта Б З

КОМ НК

ВО ОО ее ме

ЕТ -

Ф ди док ух дк в

З З Ме Бк з ї Шо ІЗ х ; ПК ще СК г ре ВИК, м и и а 52

ОМ С: і шк зась хе В Ж ки

Я ії ж ОВ ТО ща ЩЕ. КВ, шо

Се НН ЗОН йох й й а. «ЕЕ і о ни ї І ще ЕВ - з і Зв піна З ох й З ско фев : Мч па чере я МА По дет М : ати дит, АХ еВ т до пд М ноя

ЕК пи ЕХ ж СБ Я й, ший !

УЖ ШМК Ки пи а Ще ух - її ще ве-ізЕх с в о НК М ШОВ

Код Код В т Кз Й т песни ИН Же ян я

БО ТО али о

СИ ЗКИЩІА ба

КОЗА Енн й ин й у ки ХК У ВЗ

ШО п Ва р нини

Ж ж фо жу

Ку ОМ х: У ву Б ан

Б ШУ ще т жк ої ка й ФІГ. 7

С ій я

Кен БУ : ДК що

ЗВ ПК ОВ, ПИ й СЗЗ: КАК пох

Я їх ДОБА її ї ОБ м. МЕЖ ПУКЩХ

ШИ Ж КАК ШИ ОТ х ШК ОО ВО

КОН с й І ШИШКА. Я ся МОЯ я М т

ЕЕ Еш. дже ше й и сюдай тим, СЯ ДАЖЕ ЩЕ : ї. Я кох с й т | я щк - шк Ж

КО МК, де х ох ШК, НИК

МВ ше вк З НН йо ее ПО ПЕ У, ; ї ПЛЕН М ї

Бо Танк ще НЕ ЗУ сій уп Ик ЕЕ Х

Ше ше. ун р С я ше ев ЯКО Шо х, «КАК ее Є х с ххх. о, Що зи ий знання КОП т СПЕКИ,

ЗОЖОКЬ оо ОКХ ВОНИ Б х я ФО ДН ПО з з х. ШИТО КК, гу х. ще? КЗ п ПИЩИК В ЛИПИ ИИ ас Же ДК пенні ще Не ШО од по р Я у БУ МЖК, Ох шк оящ. в: Ще вн З х. ом Бе ех ран КОВО кв оц ВЕК М, Же в ї і: ані МО Ко: ЩЕ Я Б сх НЕОЖЕ й МОЯ пав хе СКУ Б ве 8 Ой КЗ З ШО М

ОН ї КО Ж.О ше й Ве ЛЬ С СМ я а . ьо С У дви Кон: ВВ фе 0 ше а х Є і що Ж З о жу

З БИ ЗЕ я Б А Що ект, т З КК ЗЕ у йо шт ОО пох ВИ АНЯ й ОВ: НУ КУ. ШО о З ся ш-е м | шк о ОК 5 Я

БОНН соня Ж ВЗ Б 5 Се до х. Ко НЕ рен я ще Б3 шо Б с З КУ - ШОЕ о ЖЖ НН т щи. Б дж її с ЩЕ

ОО о а З "БЕ Мою в

Е ро Б Я ке т же х ї се Ж щу Що ОО сетей пр он ше З КИ й таж ЖІ г з. КК 5 ШК

Бе за Т ЖК ї УТ і в З же те ення ЩЕ ен КО Х

В. В

КО її З ще

КО МО СВ ЗОН ж М ОКО о Ж о ЕН Ох

МО ОКО Я дк СКК як | о М » о в В Мо п ; ко с і

ОВО ло КО ЕВ МК

КО ХХ Зх УМОВ УСС ЕМ ОВК Мои,

ОО я АК Ен ВВ ВН шоу о ЗВО КВ о ТЕ ВЕС ВО Сх т 0 Іі З о В ОЙ

БВ ЕВ З М ОВ СК и С що п Я ОО Кох шо Я ХЕ шо Й п шо "Доник ЕН КСВ З БУХ "Я УВК я ОО

Її фронті с : й у Ж нн в ЧО 000 с и

ОС ОО НЄ ЗО п. ще ЯКО - Я с щ

ХК ООН ПУ, Ж ОХ СОБКО ЗАЗх СО

ХХ Б ЕК і ОХ З ОО с: о ЗХ «ЗМ МО ж КОХ ОМ ПК о о. с. я

ОЕМ ХКЕНТии о ЗУ СК ке х ЗНОВ МК ооо М КО я З 5 0: но Кия ОН ниж ОХ хх МОЯ У Я о КО Я ОМ ЕОЗАВ КОХ 5 КО ВХ.

МБ ВС ПОБУ М. ОВО о

Ко ОО 0 и г Я З КОВО» о. СОВА сззавк: ИЙ с МКК В, СК ОО ПО

ООН КО ОО КІ ОХ ОХ КЕКВ

ОК ОО ХК Ка 5. ОО я ОО в с в й п. вон

А ОВ Не - в ООН

ХХХ ЗОМ ей ВН й кексу, т ФІГ. 9

А

"ЖК, че де Же я у Й

КУ 5. З ЩОБ З ї о Хо С КЗ БО НЯ пк, ТУЯ хх хх КО - Ко і В МН КО ХЕ в по ВК З нин УНК. с ООН ве ден ве ше Но СХ Живу, я З а г ке» щі М я, ке Ко КО я щ- КЕ, шОСЛЕ А вн ій й а Кс Ки дит КОЛ Я с бесшо Прак, пох кн ОО чех Ї ня ве а ше ЕК Ме АКООО пов НЕ йке що Ох ОЙ СОКИ У й ся ОК ОК КН ПА 5 Ко я

Ше ее щв а. я о. шЕ

Й ші - п ее. .: сс 5 З . ша и а кн Я ПИ ОК З ХО КУ ОБО ї ЗИ ОО ООН НВНСЯ КО КВ ОО ОО ат шо ВЗН ее ЗМ оо КЕ Ме

ОНА С м М о ОЗОН б і Б о хо шї зов ВХ ще т . ОВ Я Ох У СО - я пий мо ПИ 5 З У ОК ОО У о. я, Б ООН ЗИ : п г о. в ПД ексав» КО що с о й в. а їз хе Я я ТЕ МЕМ |і 5 Мох о 5 о. .

КО СН ВУ МК У ОО о 0 ке Еко а ОВУ ОКХ ОБ о. опи (У й м й ж Хе ОО ХХ я ОК З КЕ ПАХ сок АК з : ЕЕ Й і. Б не ЕК ОТ С . ЗХ ХХ С КВ МК Я їх хе У г Ох о і СУ ВО Ох З о 3. поз ще о 0. й БО 0: у ля Ко. вх ЕК ЗО ЗНУ ЗХ 5 СН Ох ЗУ ПДК КВ хх. ве ОКХ КВ й ЗХ ПО я ш о не о

ВХ ХОВНН я о МКК Я ОК я в. і. о

Ж Ву Б Х УНН о ОО ПК ЗО СО У о о

ОС ОКХ Ох. ПОН ЗОМ сх КВ КК ОХ

КК ПИЛОК и: ВУХ ж Ж ОЙ ПК ЕН с с пня 5 ; І

КЕ КВ КО У Й ОК ОВ Ох В о. шо і КОВО ОК с ох

В Я г КЕ с З СО .щ(.Ці - ЗБ ЕК ж Мо ВОНА о. що Б х КН о я З

ФІГ. 9В

ОН ОКУ МО АН ож жк уки ню АСК ЕТККаХ що ! т А ї що на . реа Ї зсваві нови ниаловнааорлаєюим ПЕЖО КІ БАКУ КАХ плете КОМІНеваю вукониек ХТРОМНОНТАВ ЕБЕВОЦЮУХХ з хх «тв КК. МУК УКХ ХК КА : :

КО УАІБ ЗККОКОХКК МЕМ ЗНУКО

МУСОУОВОВИ КА РОВУХ ї шо ок с ВОК УКХ

Ки ях ХІХАК МУЖА пики ву ТАНК Же ЕХУ

ХОДЖКІНА ТУ ЛО тя я я КВК що ши жа МС АВ ТВО В БОНН "пове теоре Фр ТОКеВ

Бавапелюня вика МК Я ї : р как іМИ ВМО ово Кк 7 - с ХУ КАМ: я щу ХХ

ОТО Ж КЕ МЕ К У й вен їх ОК УКВ

МЕД КУН МЖК У. КЕ ек Жан

МІШКАХ:

КА ЗУ ких У оштКИ

ВВЕ ЗАМ: ОТКТЕтКУ я

ХА КА / й