CN106574264A - 在真核细胞中表达的蛋白质变体文库的制备及用于选择结合分子的用途 - Google Patents

在真核细胞中表达的蛋白质变体文库的制备及用于选择结合分子的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及产生编码结合分子(“结合物”)组库的真核细胞文库的方法，其中所述方法使用位点特异性核酸酶来靶向裂解细胞DNA，以通过内源性细胞修复机制增强结合物基因的位点特异性整合。产生真核细胞群，其中编码结合物的基因组库被整合到细胞DNA中的期望基因座(例如，基因组的基因座)以允许表达所编码的结合分子，从而产生表达不同结合物的细胞群。

Description

在真核细胞中表达的蛋白质变体文库的制备及用于选择结合 分子的用途
发明领域
本发明涉及产生用于筛选和/或选择结合分子如抗体的真核(例如，哺乳动物)细胞文库的方法。文库可用于含有和展示多样性结合物组库(repertoire)以允许筛选结合物，从而选择具有所需性质(诸如对靶分子的特异性)的一种或多种结合物。本发明尤其涉及将编码结合物的供体DNA引入真核细胞中以提供其中所需数量的供体DNA分子被精确地整合在细胞中的一个或多个期望基因座处的细胞文库。
引言
蛋白质工程技术允许产生大型多样性相关分子(例如，抗体、蛋白质，肽)群，从所述相关分子群可分离出具有新颖或改进的结合或催化性质的个别变体。构建其中每一细胞表达个别抗体、肽或者工程化蛋白质的大型真核细胞(尤其是哺乳动物细胞)群的能力将在鉴定具有所需性质的结合物方面具有很大价值。
展示技术的基本原理依赖于结合分子与编码此结合分子的遗传信息的关联。结合分子的结合性质用于分离编码其的基因。此相同的基本原理适用于所有形式的展示技术，包括噬菌体展示、细菌展示、逆转录病毒展示、杆状病毒展示、核糖体展示、酵母展示，以及在高等真核生物如哺乳动物细胞上的展示[1,2,3,4]。
展示技术已经通过抗体在丝状噬菌体上的展示(抗体噬菌体展示)最佳地例示，抗体的噬菌体展示在过去的24年中已经提供了重要的工具来用于新颖结合分子的发现和工程化，包括生成人治疗性抗体。使用噬菌体展示时，通过与编码噬菌体外壳蛋白的基因框内(in-frame)克隆编码抗体或者抗体片段的基因，使抗体分子呈现在丝状噬菌体颗粒的表面上。首先将抗体基因克隆到大肠杆菌(E.coli)内，使得每一细菌编码单类抗体。使用标准方法从细菌生成噬菌体导致生成在其表面上展示抗体片段并且将该编码抗体的基因包封在噬菌体中的噬菌体颗粒。细菌或者来源于其的噬菌体的集合被称为“抗体文库”。使用抗体噬菌体展示时，通过使呈现抗体的噬菌体暴露于所关注的靶分子，可使抗体及其相关基因富集在群中。
为了允许回收展示识别所关注靶标的结合物的噬菌体，需要将靶分子固定到选择容器的表面上或者需要通过二级试剂从溶液中回收靶分子，例如使用链霉亲和素包覆的珠粒从溶液中回收生物素化的靶蛋白。在将展示结合物的噬菌体文库与靶分子一起温育后，去除未结合的噬菌体。此举涉及洗涤靶标(及相关噬菌体)所附接的基质以去除未结合的噬菌体。可将结合噬菌体及其相关抗体基因回收和/或感染到宿主细菌细胞中。通过使用上文概述的方法，变得有可能富集能够结合所选靶分子的噬菌体克隆的亚群。噬菌体展示文库已经显示为提供丰富的抗体多样性来源，从而提供针对单个靶标的成百上千个独特抗体[5,6,7]。
历史上，用于分离新颖抗体结合特异性的展示系统已经基于原核系统并且尤其基于单链Fvs(scFv)以及更少程度地Fab在噬菌体上的展示。结合物在细菌表面上的展示已经被描述但是尚未广泛使用，并且其应用很大程度上限于肽的展示，或者通过免疫法针对结合物预富集的抗体片段的展示[8]。不管包括噬菌体展示的原核展示系统的能力如何，都存在限制。在通过噬菌体或者核糖体展示进行选择之后，通过以下步骤鉴定编码个别结合分子的基因：将所选基因群体引入细菌内；平皿接种细菌群落；挑取菌落；使结合分子表达进入上清液或者胞外质；以及在结合测定法(诸如酶或荧光联免疫吸附测定法(ELISA))中鉴定阳性克隆。虽然鉴定了结合分子，但是此方法未解析关于表达程度以及所得克隆的结合亲和力的信息。因此虽然有可能生成成千上万的结合物，但是筛选产出物的能力受限于需要菌落挑取、液体处理等，再加上关于相对表达水平和亲和力的原始信息有限。
结合分子在真核细胞表面上展示有潜力克服这些问题中的一些。结合流式细胞术，真核展示使得能够进行快速、高通量的选择。变得有可能调查在其表面上表达不同结合分子的数百万个细胞克隆。细胞表面展示已经最佳地由格式化为scFv的抗体片段在酵母细胞表面上的展示例示。酵母表面展示的常用模式(modality)利用酵母凝集素蛋白(Aga1p和Aga2p)。如由Chao等人[9]所描述，将编码scFv组库(repertoire)的基因与酵母凝集素Aga2p亚基进行基因融合。然后将Aga2p亚基通过二硫键连接到细胞壁中存在的Aga1p亚基。表达靶标特异性结合分子的酵母细胞可以通过流式细胞术，使用直接或间接标记的靶分子来鉴定。例如，可将生物素化的靶标加入细胞中，并且可用链霉亲和素-藻红蛋白来检测该生物素化的靶标与细胞表面的结合。在群体中，变得有可能使用有限的靶标浓度来辨别表达出具有更高亲和力的结合分子的那些克隆，这是因为这些克隆将捕获更多的靶分子并且将因此表现出更亮的荧光。通常，每个酵母细胞将在细胞表面上展示单一scFv的10,000至100,000个拷贝。为了控制不同细胞中scFv表面表达的变化，Chao等人使用荧光标记的抗标签抗体来测量每个细胞表面上的抗体表达水平，从而允许使表达水平变化归一化。此方法因此允许使展示具有高亲和力的结合分子的酵母细胞与表达高水平的具有较低亲和力的抗体的那些细胞区分开来。因此通过使用荧光活化细胞分选(FACS)，有可能根据所编码的结合分子的亲和力和/或表达水平来分离细胞克隆。
还已经证明，真核系统比原核系统更有效地用于展示多链抗体片段，并且尤其是较大的片段，诸如全IgG、FAb、或者scFv与Fc结构域的融合体(scFv-Fc融合体)。如上所述用于酵母细胞的基于珠粒或者基于流式分选的方法还可用于从基于高等真核生物如哺乳动物细胞的展示文库中选择抗体。格式化展示文库并且直接选择作为哺乳动物细胞中的IgG、Fab或者作为scFv-Fc融合体的能力是相对于酵母展示的另一优点。细菌和酵母细胞的糖基化、表达和分泌机制不同于高等真核生物，这产生了具有与在哺乳动物细胞中产生的那些抗体不同的翻译后修饰的抗体。因为用于研究、诊断和治疗应用的抗体的制造通常是在哺乳动物细胞中进行，所以在哺乳动物细胞(或者其它高等真核细胞，如无脊椎动物、鸟类或者植物细胞系)上展示可提供关于下游制造的潜在问题或益处的更好指示，例如鉴定具有最佳表达性质的克隆。此外，在高等真核生物，并且尤其是哺乳动物细胞上展示的情境中发现的抗体可直接应用于基于细胞的报告基因测定，而无需广泛的纯化并且没有来自于细菌和酵母细胞的污染物的复杂化影响。此外，结合物文库可直接在真核报告细胞如哺乳动物细胞中表达以鉴定直接影响细胞表型的克隆。
虽然真核展示文库允许实现上述优点，但是仍然存在关于在真核细胞，尤其是高等真核细胞中生成结合物文库的重大问题。引入外源基因(“转基因”)组库以在高等真核生物中表达比在酵母和细菌中表达更困难。高等真核生物的细胞更难处理和放大试验并且转化效率更低。所实现的典型文库大小要小得多。此外，引入的DNA随机地整合在基因组内，从而导致位置效应斑驳(position effect variegation)。此外，通过标准转染或者电穿孔方法引入哺乳动物细胞内的供体DNA作为线性阵列与不同拷贝数的经转染转基因整合。编码抗体基因组库的DNA的引入因此有可能将多种抗体基因引入每一细胞中以致每个细胞表达多种不同抗体。此外，多种抗体基因的存在将减少任何给定抗体的相对表达并且将导致分离出许多过客抗体基因(passenger antibody gene)，从而降低了特定克隆的富集率。
虽然结合物文库在高等真核生物表面上的展示更加困难，但是先前已经描述了一些例子。在一个先前的出版物中，使用哺乳动物展示来源于人免疫的IgG，需要进行3轮选择(涉及瞬时转染、细胞分选、DNA回收和再转染)来实现抗原特异性细胞的450倍富集，平均每轮7.6倍富集[10]。类似地，从在另外型复制载体中表达的免疫文库进行瞬时表达还已经被描述为具有格式化为scFv[11,12]或IgG[13]的抗体。
已经描述了用于将单一或者有限数量的抗体基因引入每一细胞中的许多方法。这包括稀释DNA或者与载体DNA混合[13]，但是这是一种相对不受控制的管理引入基因拷贝数的方法，并且减少DNA输入将对文库大小具有不利影响。通过病毒载体引入抗体基因已经提供了控制每一细胞中引入多种抗体基因的另一解决方案。已经用这种方法从通过免疫生成的几百个人B淋巴细胞产生了细胞表面展示文库，并且通过流式分选抗原特异性B细胞而进一步富集[14]。将来源于此富集集合的抗体基因格式化成scFv，克隆到辛德毕斯病毒(Sindbis alphavirus)表达系统中，以及使用低多重性感染引入BHK细胞内。
Breous-Nystrom等人[15]使用连续逆转录病毒感染将91Vκ抗体基因的有限组库，然后是来源于6名健康供体的重链基因组库引入鼠源前B细胞系(1624-5)中。使用基于莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)的V-Pack系统(Stratagene)生成感染性逆转录病毒。为了偏向单拷贝插入，选择导致感染约5％的细胞的多重性感染。这些方法的主要缺陷是基因组内的整合是随机的，从而导致基于整合位点的转录活性的转录水平可能发生变化。这些情况的另一个缺陷是抗体基因的整合受控于影响文库大小的有限感染或转染。
先前已经描述了由重组酶引导的转基因的位点特异性整合。重组酶是催化含有酶特异性识别序列的DNA分子之间的交换反应的酶。例如，Cre重组酶(来源于大肠杆菌的位点特异性重组系统)或者Flp重组酶(利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的重组系统)分别作用于其特异性34bp loxP识别位点和34bp Flp重组靶(FRT)位点[16]。重组酶已经主要在细胞工程学中用于催化位点特异性整合。Chen Zhou的工作中进行的大量研究[17,18,US7,884,054]已经描述了使用“Flp-ln”系统中的Flp重组酶进行重组酶介导的抗体基因到哺乳动物细胞基因组内的位点特异性整合，(http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/flpinsystem_man.pdf)。此Flp-ln系统利用先前已有一个单一FRT位点引入其基因组内的多种细胞系。通过表达酶——Flp重组酶，有可能引导表达质粒的整合，从而将FRT重组位点并入靶细胞中的此预整合的FRT位点。
通过使用Flp-ln系统，Zhou等人[17]将含有FRT位点的外来抗体表达质粒引入含有FRT位点的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(CHOF细胞)中。他们的工作描述了展示文库的构建，其中在现有抗OX40配体抗体内的4个残基被诱变。使用FACS筛选文库以鉴定细胞表面上具有抗配体亲和力的抗体。产生改进抗体的总体成功限于分离单类改进抗体。未报道实现的独特哺乳动物细胞克隆的数量。
Li等人在2012年的后续论文[18]利用来自乙型肝炎患者的淋巴细胞构建抗体展示文库。使用从已经用HBsAg免疫的供体获得的重链和轻链基因产生单独的文库，所述文库个别地被报道为大小分别为1.02×106和1.78×105的文库。然后产生包括重链和轻链两者的次级文库，据报道次级文库大小为4.32×105。据报道，FACS分析指示在约40％的细胞在细胞表面上展示可检测到全长抗体。对文库进行FACS筛选鉴定了与HBsAg结合的抗体。在与抗原结合的8个所选文库成员的样品中，发现六个具有相同的抗体，因此总共鉴定出三个独特的抗HBsAg克隆。
此工作的相当有限的成功可能是由于以下事实：Flp-ln系统被设计用于有限数量克隆的精确整合，而非构建大型文库。因此，在实现整合保真度和实现最大的文库大小之间存在潜在冲突。Flp-ln系统利用质粒pOG44中的突变Flp重组酶，其在37℃下仅具有天然Flp重组酶的10％的活性[19]。已经鉴定出比野生型具有更好热稳定性和更高活性的Flp重组酶(Flpe)变体[19,20]。这通过密码子优化产生在质粒cCAGGS-Flpo(Genebridges，目录号A203)内编码的Flp0而得以进一步改善，然而根据Flp-ln手册：
“当生成Flp-lnTM表达细胞系时，重要的是要记住，您正在选择相对罕见的重组事件，因为您希望仅通过FRT位点和在有限时间内进行对您的pcDNATM5/FRT构建体的重组和整合。在这种情况下，使用非常低效的Flp重组酶是有益的，并且可以减少其它不期望的重组事件的发生……
……为了增加获得单类整合体的可能性，您将需要通过限制您所转染的质粒DNA的量来降低转染效率”
这由Buchholz等人在1996年[19]附和：
“FLP可能对不依赖于效率而依赖于严谨调控的应用特别有用。”
在模型实验中和使用“手册中描述的说明书”时，Zhou等人(2010年)[17]确证单拷贝插入发生在＞90％的克隆中。然而在文库构建中，使用相对高量的表达质粒(2.5-3.2μg/106个细胞)和超过pOG44重组酶编码质粒的过量供体[17,18]。Flp-ln系统推荐有利地使用至少9:1的重组酶编码质粒与表达质粒的比例。然而，当寻求通过转染较大量的DNA来增加文库大小时，存在随机整合外来质粒的可能性[21]。在所有研究中，未报告在“文库构建”条件下的整合准确度和每个细胞的整合体数量。
在核酸酶定向的基因整合中，位点特异性核酸酶用于在特定位置裂解细胞DNA。先前已经显示，这将同源重组速率提高了至少40,000倍，并且还允许通过非同源性末端接合机制进行修复。位点特异性整合的这种增强先前尚未被使用或设想用于解决与产生结合物文库相关的问题。
US20100212035描述了通过用大范围核酸酶靶向哺乳动物胚胎的免疫球蛋白基因座以定向供体DNA的整合，从而产生能够表达外源抗体的啮齿动物的方法。描述了生成大范围核酸酶的变体文库以产生新的DNA裂解特异性的可能性，但是其未设想使用大范围核酸酶来产生结合物文库。
WO 2013/190032 A1描述了将基因整合到预先用外源DNA(“位点特异性整合”SSI宿主细胞)修饰的特定基因座(Fer1L4)中以并入重组酶位点(诸如loxP位点和FRT位点)，以供用于重组酶介导的位点特异性基因引入。没有描述核酸酶定向的文库生成。
WO 2012/167192 A2描述了将基因靶向到可随后选择用于扩增的基因座。采用核酸酶定向的方法来靶向所述基因座。没有描述核酸酶定向的文库生成。
US 2009/0263900A1描述了包含同源臂的DNA分子及其在同源重组方法中的用途。没有描述核酸酶定向的文库生成。
WO 2011/100058描述了将核酸整合到基因组中的方法，此方法避免了对长同源臂的需要并且替代地依赖于基因组和供体上的微同源或“粘性末端”来帮助定向整合。没有描述核酸酶定向的文库生成。
WO 20122/090804描述了在连续轮中使用不同的锌指核酸酶(ZFN)来整合多个基因或者相同基因的多个拷贝的方法。没有描述核酸酶定向的文库生成。
WO2014/039872描述了用于工程化植物细胞，以将“着陆位点”并入通过使用定点核酸酶进行同源重组或非同源末端接合而整合的供体DNA内的方法。细菌人工染色体(BAC)文库用于供体DNA的初始克隆。文库是关于Illumina测序法叙述的。没有描述核酸酶定向的文库生成。
W02007/047859 A2描述了用于工程化大范围核酸酶的特异性并将它们用于靶向基因组基因座的方法。描述了可能含有具有新的核酸酶特异性的大范围核酸酶的突变大范围核酸酶的文库。没有描述核酸酶定向的文库生成。
US2014/0113375 A1描述了用于生成与靶基因组序列同源的单链DNA序列的瞬时表达系统，所述瞬时表达系统可以被转运到细胞核以通过DNA修复途径或同源重组来改变靶基因组序列的遗传信息。建议可通过所引入(非文库)DNA的低保真逆转录生成突变的“文库”。没有描述具有结合活性的分子的哺乳动物展示和选择。
US2012/0277120描述了在酵母中使用天然同源重组机制以单一转化反应同时整合多种外源核酸的方法和组合物，所述重组可以通过诱导宿主细胞基因组中在预期整合位点处靶向双链断裂而进一步增强。所述方法旨在克服以下需要：进行多轮工程化以整合多个DNA组件例如以供用于在工业微生物如酵母中构建功能性代谢途径。没有描述结合分子文库的展示或表达，高等真核生物的使用，以及具有结合活性的分子的选择。
为了完全实现在哺乳动物细胞和其它高等真核生物上进行抗体展示的潜能，需要一种生成大型文库的系统，所述系统将精确整合到预定位点中与允许构建大型文库的效率组合在一起。
发明概要
我们已经通过使用对编码结合物的基因群体进行核酸酶定向整合来克服了生成每个细胞包含一个或两个结合物基因的大型结合物文库的问题。本发明由此允许制备真核细胞群，其中结合物编码组库被整合到基因组中的固定基因座内，以允许表达所编码的结合分子，从而生成表达不同结合物的细胞群。
本发明涉及产生编码结合分子(“结合物”)组库的真核细胞文库的方法，其中所述方法使用位点特异性核酸酶靶向裂解细胞DNA，以通过内源性细胞修复机制来增强结合物基因的位点特异性整合。位点特异性核酸酶允许将编码结合物分子的供体DNA精确引入真核基因组或其它真核细胞DNA内的一个或多个限定基因座内。本发明提供了制备真核细胞群的方法，其中将编码结合物的基因组库整合到细胞DNA中的期望基因座(例如，基因组的基因座)内，以允许表达所编码的结合分子，从而生成表达不同结合物的细胞群。
关于表达构建体的定点并入，根据本发明在真核细胞内构建结合物文库相对于重组酶酶定向方法具有优势。本发明使用通过位点特异性核酸酶进行的细胞DNA裂解来解决先前与在真核细胞，尤其是高等真核生物中构建结合物基因的大型组库相关的问题。本发明允许有效地生成大型细胞克隆群体，其中每个细胞克隆表达整合在细胞DNA中的固定基因座处的个别结合物。使用这些细胞克隆文库，变得有可能分离出编码新颖结合或者功能修饰蛋白和肽的基因。
替代重组酶定向的DNA交换，本发明的方法利用细胞(例如基因组)DNA的位点特异性裂解，然后使用天然修复机制来整合编码结合物的供体DNA。在由位点特异性核酸酶识别的序列(“识别序列”)处裂解细胞DNA之后，使用诸如同源重组或非同源末端接合(NHEJ)的机制修复细胞DNA中的断裂。在细胞DNA中产生位点特异性断裂增强了外源供体DNA的整合，从而允许构建具有整合在固定基因座处的结合物基因的大型细胞群。
迄今为止，位点特异性核酸酶，诸如大范围核酸酶、ZFN、TALE核酸酶和CRISPR/Cas系统，已经针对用于有效生成具有内源基因修饰的细胞或用于引入报告基因以供研究细胞功能。还存在其中核酸酶定向的基因组靶向已经用于整合编码所分泌的单类抗体的基因以用于抗体产生(通过从培养基中纯化)的例子[21,22,]。
本发明简化了大型文库的构建，同时指导向单一或限定数量的确定遗传基因座的整合。与随机整合可变数量的转基因相比，在一个或多个固定基因座处整合供体DNA使转录标准化，并且允许基于结合物本身的翻译和稳定性性质来选择抗体克隆。供体DNA在细胞DNA中的一个或多个预定位置处的准确整合产生了文库中结合物的相对均匀的转录水平，并且供体DNA引入的高效率使得通过本发明方法产生的细胞群体尤其可用作用于展示和选择结合物的文库。本发明方法由此在真核细胞中产生了结合物的高质量文库，所述文库可经筛选以鉴定编码和表达针对所关注靶标的特异性结合物的细胞。
在各个方面，本发明涉及制备真核细胞文库，文库本身，从文库分离所需结合物、编码核酸和细胞的新的和改进的方法，以及所述文库例如用于表达和筛选结合分子以及用于筛选结合分子的作用的用途。将描述用于在体外产生文库和在体外或体内使用文库的各种方法。
本发明提供了一种产生含有编码多样性结合物组库的DNA的真核细胞克隆文库的方法，所述方法包括使用位点特异性核酸酶靶向裂解真核细胞DNA，以通过内源性细胞DNA修复机制增强结合物基因向细胞DNA中的位点特异性整合。
一种产生含有编码多样性结合物组库的DNA的真核细胞克隆文库的方法可包括：
提供编码结合物的供体DNA分子以及真核细胞，
将供体DNA引入细胞中，并在细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA以产生整合位点，在所述整合位点处供体DNA变成整合到细胞DNA中，所述整合通过细胞内源的DNA修复机制发生。
对于包含至少第一亚基和第二亚基(即，单独的多肽链，如在Fab或IgG形式中存在的抗体VH和VL结构域)的多聚体结合物，所述多个亚基可编码在供体DNA的相同分子上。然而，可能希望将不同的亚基整合到单独的基因座中，在这种情况下所述亚基可提供在单独的供体DNA分子上。这些亚基可以在相同的核酸酶定向整合循环中整合，或者它们可以使用针对一个或两个整合步骤的核酸酶定向整合来顺序地整合。
产生编码多聚体结合物的真核细胞克隆的文库的方法可包括：
提供含有编码第一亚基的DNA的真核细胞，以及提供编码第二结合物亚基的供体DNA分子，
将供体DNA引入细胞中，并在细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，整合通过细胞内源的DNA修复机制发生，从而产生含有整合在细胞DNA中的供体DNA的重组细胞。这些重组细胞将含有编码多聚体结合物的第一亚基和第二亚基的DNA，并且可以经培养以表达这两个亚基。多聚体结合物通过表达和装配单独编码的亚基而获得。
在上述实例中，核酸酶定向整合用于将编码第二亚基的DNA整合到已经含有编码第一亚基的DNA的细胞中。可以使用本发明的技术或任何其它合适的DNA整合方法预先引入第一亚基。一种替代方法是在引入供体DNA的第一循环中使用核酸酶定向整合来整合第一亚基，然后通过相同的方法或任何其它合适的方法引入第二亚基。如果将核酸酶定向方法用于多个整合循环中，则可以任选地使用不同的位点特异性核酸酶来驱动供体DNA在不同识别位点处的核酸酶定向整合。一种生成文库的方法可包括：
提供编码第一亚基的第一供体DNA分子，以及提供真核细胞，
将第一供体DNA引入细胞中，并在细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，整合通过细胞内源的DNA修复机制发生，从而产生含有整合在细胞DNA中的第一供体DNA的第一组重组细胞，
培养第一组重组细胞以产生含有编码第一亚基的DNA的第一组克隆，
将编码第二亚基的第二供体DNA分子引入第一组克隆的细胞中，其中所述第二供体DNA整合到所述第一组克隆的细胞DNA中，从而生成含有整合到所述细胞DNA中的第一供体DNA和第二供体DNA的第二组重组细胞，以及
培养第二组重组细胞以产生第二组克隆，这些克隆含有编码多聚体结合物的第一亚基和第二亚基的DNA，
从而提供含有编码多聚体结合物组库的供体DNA的真核细胞克隆文库。
供体DNA位点特异性整合到细胞DNA中而生成重组细胞，所述重组细胞可经培养以产生克隆。供体DNA已经整合到其中的个别重组细胞由此经复制而产生细胞的克隆群体——“克隆”——每个克隆来源于一个原始重组细胞。因此，所述方法产生了数量对应于供体DNA被成功整合到其中的细胞的数量的克隆。克隆的集合形成了编码结合物组库的文库(或者，在各结合物亚基以不同轮次整合的中间阶段处，克隆可编码一组结合物亚基)。本发明的方法可由此提供含有编码结合物组库的供体DNA的真核细胞克隆文库。
本发明的方法可以产生含有整合在细胞DNA中的一个或多个固定基因座处的供体DNA的克隆文库。“固定”是指细胞之间的基因座是相同的。用于生成文库的细胞可因此在固定基因座处含有核酸酶识别序列，所述固定基因座表示细胞DNA中供体DNA可整合的通用着陆点。位点特异性核酸酶的识别序列可以存在于细胞DNA中的一个或多个位置处。
根据本发明产生的文库可以多种方式使用。文库可经培养以表达结合物，从而产生多样性结合物组库。可从文库中筛选具有所需表型的细胞，其中所述表型由细胞表达结合物产生。可以进行表型筛选，其中培养文库细胞以表达结合物，然后检测在文库的克隆中是否表现出期望的表型。细胞读出(read-out)可以基于细胞行为的变化，例如变化的内源或外源报告基因表达、分化状态、增殖、存活率、细胞大小、代谢，或者变化的与其它细胞的相互作用。当检测到所需的表型时，则可以回收表现出期望表型的克隆的细胞。任选地，然后从回收的克隆中分离编码结合物的DNA，以提供编码当在细胞中表达时产生期望表型的结合物的DNA。
已经使用的真核细胞文库的关键目的在于筛选识别所关注靶标的结合物的方法。在此类方法中，培养文库以表达结合物，以及将结合物暴露于靶标以允许由一种或多种同源结合物(如果存在的话)识别靶标，以及检测靶是否被同源结合物识别。在此类方法中，结合物可以展示在细胞表面上，并且可以分离文库中展示具有期望性质的结合物的那些克隆。因此，可以在文库内鉴定并入了编码具有所需功能或结合特征的结合物的基因的细胞。可以回收基因并将其用于产生结合物或用于进一步工程化以生成结合物的衍生文库，从而获得具有改善性质的结合物。
本发明提供相对于先前用于在高等真核生物中构建文库的方法的优势。一些研究已经使用慢病毒感染来将抗体基因引入哺乳动物报告细胞内[106]。这具有以下优点：可以生成大型文库，但不存在对整合位点的控制，并且通过使用低感染复数(如上所述)来控制拷贝数。在一种替代方法中通过同源重组引入抗体基因，没有核酸酶定向整合的益处并且使用10kb的同源臂，但是靶向效率相对较低，这意味着潜在的文库大小受限[105]。相比之下，使用序列定向的核酸酶保留了靶向整合到所选择的一个或几个基因座的益处，同时允许有效构建大型文库。核酸酶定向整合具有以下优点：转基因靶向到细胞DNA内的一个或多个固定基因座处。这意味着，驱动所有克隆中的结合物基因转录的启动子活性将为相同的，并且每种结合物的功能将反映其固有效力、翻译效率和稳定性，而不是由于与整合位点相关的变化。如果需要的话，例如使用诱导型启动子，靶向至单个或有限数量的基因座也将能够更好地控制表达。
下文进一步描述了本发明的各种特征。应注意，贯穿本说明书使用的标题仅用于辅助浏览，并且不应被解释为限定性的，并且在不同部分中描述的实施方案可以视情况组合。
具体实施方式
真核细胞
在本文的实施例中关于在哺乳动物细胞表面上表达抗体组库例示和论述了真核细胞群表达多样性结合物组库的潜能。本发明的益处不限于哺乳动物细胞并且包括所有真核生物。
酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))具有比哺乳动物细胞更小的基因组，并且相较于高等真核生物，用同源臂定向的同源重组(在不存在核酸酶定向的裂解的情况下)是引入外源DNA的有效方式。因此，本发明的核酸酶定向整合的具体益处涉及将结合物基因整合到具有较大基因组的高等真核细胞中，其中同源重组在不存在核酸酶裂解的情况下不太有效。已经在酵母细胞中使用核酸酶定向整合来解决以下问题：将多个基因有效整合到个别酵母细胞中，例如以用于代谢途径的工程化(US2012/0277120)，但是此工作不包括引入结合物文库，也未解决在高等真核生物中构建文库的问题。
根据本发明的真核细胞文库优选地是高等真核细胞，在本文中定义为所具有的基因组大于酿酒酵母的基因组的细胞，酿酒酵母具有12×106个碱基对(bp)的基因组大小。高等真核细胞可例如具有大于2×107个碱基对的基因组大小。此高等真核细胞包括例如哺乳动物、鸟类、昆虫或者植物细胞。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞，例如小鼠或人细胞。所述细胞可以是原代细胞或可以是细胞系。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞常用于抗体和蛋白质表达，但是任何替代的稳定细胞系可用于本发明。HEK293细胞用于本文的实施例中。所述方法可用于将外源DNA有效引入原代细胞，从而允许使用这些细胞(例如，通过电穿孔，其中已经实现了高达95％的效率和存活率http://www.maxcyte.com/technology/primary-cells-stem-cells.php)。
T淋巴谱系细胞(例如，原代T细胞或T细胞系)或B淋巴谱系细胞是优选的细胞类型。特别受关注的是用于TCR文库的原代T细胞或T细胞衍生的细胞系，包括缺乏TCR表达的细胞系[23,24,25]。B淋巴谱系细胞的实例包括B细胞、前B细胞或祖B细胞以及衍生自任何这些细胞的细胞系。
在原代B细胞或B细胞系中构建文库对于构建抗体文库特别有价值。Breous-Nystrom等人[15]已经在鼠前B细胞系(1624-5)中生成了文库。鸡B细胞衍生的细胞系DT40(ATCC CRL-2111)尤其有希望用于构建结合物文库。DT40是具有相对快速的细胞分裂速率的小细胞系。可以使用靶向内源序列的ZFN，TALE核酸酶或CRISPR/Cas9或通过靶向可包括大范围核酸酶识别位点的预整合异源位点来使结合物组库靶向特定基因座。DT40细胞表达抗体，因此其将有利地在打断或不打断内源鸡抗体可变结构域的情况下靶向抗体基因座内的抗体基因。DT40细胞还已经被用作用于产生被称为自主多样化文库系统(AutonomouslyDiversifying Library；ADLib系统)的鸡IgM的体外系统的基础，其利用在鸡抗体基因座处存在的固有多样化。作为此内源性多样化的结果，有可能产生新的特异性。本文描述的核酸酶定向方法可以与ADLib结合使用，以组合来自异源来源(例如，人抗体可变区组库或合成来源的替代骨架)的多样性结合物文库与用鸡IgG基因座进一步多样化的潜能。类似的益处可应用于人B细胞系，诸如Nalm6[26]。
其它所关注的B谱系细胞系包括诸如鼠前B细胞系1624-5和祖B细胞系Ba/F3的细胞系。Ba/F3依赖于IL-3[27]，并且其使用在本文其它地方论述。最后，可以使用大量人细胞系，包括在《癌细胞百科全书(Cancer Cell Encyclopaedia)》”[28]或《癌症中体细胞突变的COSMIC目录(COSMIC catalog of somatic mutations in cancer)》”[29]中列出的那些细胞系。
通常，文库将由单一类型的细胞组成，通过将供体DNA引入克隆真核细胞群中而产生，例如通过将供体DNA引入特定细胞系的细胞中。不同文库克隆之间的主要显著差异则将是由于供体DNA的整合。
真核病毒系统
所述系统在真核细胞中生成结合物文库的优点可应用于基于真核表达系统的病毒展示系统，例如杆状病毒展示或逆转录病毒展示[1,2,3,4]。在此方法中，每个细胞将编码一种能够被并入到病毒颗粒中的结合物。在逆转录病毒系统的情况下，所述编码mRNA被包被并且所编码的结合物会呈现在细胞表面上。在杆状病毒系统的情况下，编码结合物的基因需要被包封在杆状病毒颗粒中以保持基因和所编码的蛋白质之间的关联。这可以使用携带杆状病毒基因组的另外拷贝的宿主细胞来实现。或者，所整合的拷贝可以在特异性核酸酶(不同于用于驱动位点特异性整合的核酸酶)作用后释放。在多聚体结合物分子的情况下，一些配偶体可被编码在细胞DNA内，其中一个或多个配偶体的基因被包被在病毒内。
位点特异性核酸酶
本发明涉及位点特异性核酸酶在含有编码结合物组库的DNA的真核细胞文库的构建中用于靶向裂解细胞DNA的用途，其中核酸酶介导的DNA裂解通过内源性细胞DNA修复机制增强结合物基因的位点特异性整合。位点特异性核酸酶在与识别序列特异性结合后裂解细胞DNA，从而产生供体DNA的整合位点。核酸酶可以产生双链断裂或单链断裂(缺口)。用于生成文库的细胞可以含有由位点特异性核酸酶识别的内源性序列，或者可将识别序列工程化到细胞DNA中。
位点特异性核酸酶可以是细胞外源的，即不是天然存在于所选类型的细胞中。
可以在引入编码结合物的供体DNA之前、之后或同时引入位点特异性核酸酶。这可便于使供体DNA除了编码结合物外，还编码核酸酶，或者在与供体DNA同时共转染或以其它方式引入的个别核酸上。文库的克隆可以任选地保留编码位点特异性核酸酶的核酸，或者可以将此类核酸仅瞬时转染到细胞中。
任何合适的位点特异性核酸酶均可以用于本发明。其可为天然存在的酶或工程化的变体。存在大量特别合适的已知核酸酶，诸如识别或可被工程化以识别在细胞DNA中仅罕见存在的序列的那些核酸酶。在仅一个或两个位点处进行核酸酶裂解是有利的，这是因为此举应当确保每个细胞仅整合一个或两个供体DNA分子。如果识别序列相对较长，则更有可能用位点特异性核酸酶识别序列的罕见性。由核酸酶特异性识别的序列可以是例如至少10、15、20、25或30个核苷酸的序列。
合适的核酸酶的实例包括大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、TALE核酸酶，以及核酸引导的(例如，RNA引导的)核酸酶(诸如CRISPR/Cas系统)。这些核酸酶中的每一种产生双链断裂，但是已知它们的工程化形式产生单链断裂。
大范围核酸酶(也称为归巢核酸内切酶)是跨所有生命领域存在并且识别相对较长序列(12-40bp)的核酸酶。假设所述较长的识别序列不存在或者相对罕见地存在于真核基因组中。基于序列/结构，大范围核酸酶被分为5个家族。(LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒和PD-(D/E)XK)。研究最多的家族是LAGLIDADG家族，其包括来自酿酒酵母的良好表征的I-Scel大范围核酸酶。I-Scel识别并裂解18bp的识别序列(5'TAGGGATAACAGGGTAAT)，留下4bp的3'突出端。另一个常用的实例是I-Cre1，其源自单细胞绿藻莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体，并且识别22bp的序列[30]。已经产生了识别序列发生改变的大量工程化的变体[31]。大范围核酸酶代表在基因组工程中使用位点特异性核酸酶的第一个实例[49,50]。与基于重组酶的方法一样，使用I-Sce1和其它大范围核酸酶需要事先插入靶向在大范围核酸酶的基因组或工程化中以识别内源性位点的合适识别位点[30]。通过此方法，经由使用I-Sce1在10-20％的细胞中实现了在HEK293细胞中的靶向效率(如通过同源性定向“修复”所整合的缺陷型GFP基因所判断的)[32]。
用于本发明的大范围核酸酶的优选类别是LAGLIDADG内切核酸酶。这些核酸酶包括I-Sce I、I-Chu I、I-Cre I、Csm I、Pl-Sce I、Pl-Tli I、Pl-Mtu I、l-Ceu I、l-Sce II、l-Sce III、HO、Pi-Civ I、Pl-Ctr I、Pl-Aae I、Pl-Bsu I、Pl-Dha I、Pl-Dra I、Pl-Mav I、Pl-Mch I、Pl-Mfu Pl-Mfl I、Pl-Mga I、Pl-Mgo I、Pl-Min I、Pl-Mka I、PI-MIe I、Pl-MmaI、Pl-Msh I、Pl-Msm I、Pl-Mth I、Pl-Mtu Pl-Mxe I、Pl-Npu I、Pl-Pfu I、Pl-Rma I、Pl-Spb I、Pl-Ssp I、Pl-Fac I、Pl-Mja I、PI-Pho I、Pi-Tag I、Pl-Thy I、Pl-Tko I、I-Msol，以及Pl-Tsp I；优选地l-Sce I、l-Cre I、l-Chu I、I-Dmo I、l-Csm I、Pl-Sce I、Pl-Pfu I、Pl-Tli I、Pl-Mtu I，以及l-Ceu I。
近年来，已经开发了许多允许设计新颖序列特异性核酸酶的方法，所述方法通过将序列特异性DNA结合结构域融合至非特异性核酸酶来形成所设计的经由定制的DNA结合结构域定向的序列特异性核酸酶。结合特异性可以由工程化的结合结构域(诸如，锌指结构域)来定向。这些结构域是由锌离子稳定的小模块结构域，其参与分子识别并且本质上用于识别DNA序列。锌指结构域的阵列已经工程化而用于序列特异性结合，并且已经与II型限制酶Fok1的非特异性DNA裂解结构域连接以产生锌指核酸酶(ZFN)。ZFN可用于产生基因组内特异位点处的双链断裂。Fok1是专性二聚体并且需要两个ZFN非常接近地结合以实现裂解。通过产生经工程化而仅与彼此形成异源二聚体的两种不同的Fok1变体，工程化的核酸酶的特异性已被增强并且它们的毒性降低[33]。此类专性异源二聚体ZFN已经显示为在5-18％的靶细胞中实现同源性定向整合，而不需要药物选择[21,34,35]。在不存在选择的情况下，已经证明以＞5％的频率并入了高达8kb的插入物。
最近已经表明，由核酸酶如ZFN产生的单链5'突出端帮助驱动转基因有效整合至裂解位点[45]。此已被延伸成表明供体DNA的体内裂解(通过在供体质粒内纳入特异性核酸酶识别位点)增强了非同源性整合的效率。所述机制不完全清楚，但有可能是通过体内线性化减少暴露于细胞核酸酶可有助于所述增强[45]。还可能的是，由核酸酶产生的供体DNA和受体DNA的5'突出端的匹配驱动了连接。然而，对接合处序列进行的检查表明存在缺失。有可能的是，完全匹配的接合继续作为位点定向核酸酶的底物，直到识别序列发生缺失。为了克服此潜在问题，Maresca等人[36]已经将供体DNA内的左ZFN和右ZFN的识别位点逆转，使得供体DNA连接到基因组基因座将导致在整合的一个侧翼上两个左手ZFN复制并且在另一侧翼处两个右手ZFN复制。使用专性异源二聚体核酸酶(如关于Fok1所描述)意味着这些新产生的侧翼序列都无法由靶向核酸酶裂解。
工程化具有限定特异性的DNA结合结构域的能力已经因为在黄单胞菌属(Xanathomonas)细菌中发现转录激活因子样效应物(TALE)分子而进一步简化。这些TALE分子由33-35个氨基酸的单体阵列组成，其中每个单体识别靶序列内的单个碱基[37]。此模块化的1:1关系已经使得相对易于设计工程化的TALE分子来结合所关注的任何DNA靶标。通过将这些设计的TALE偶联到Fok1，已经有可能产生新颖的序列特异性TALE核酸酶。TALE核酸酶，也被称为TALEN，现在已经被设计用于大量位点，并且表现出关于有效基因修饰活性的高成功率[38]。在本文的实施例中，我们证明通过使用TALE核酸酶增强了供体DNA的整合。已经开发了TALE核酸酶技术的其它变型和改进，并且可以用于通过核酸酶定向整合生成结合物文库。这些技术包括其中TALE核酸酶结合结构域融合到大范围核酸酶的“巨TALEN”[39]和其中使用单类TALE核酸酶识别结构域来实现裂解的“紧凑型TALEN”[40]。
近年来，已经描述了用于将双链或单链断裂定向到基因组中的特定序列的另一种系统。这种称为“规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeat,CRISPR)并且CRISPR关联(Cas)系统”的系统是基于细菌防御机制[41]。CRISPR/Cas系统通过邻接到短回文重复序列的短、互补单链RNA(CRISPR RNA或crRNA)来靶向DNA以供裂解。在通常使用的“II型”系统中，靶向RNA的加工依赖于具有与回文重复序列互补的序列的反式激活crRNA(tracrRNA)的存在。tracrRNA与回文重复序列的杂交触发了加工。所加工的RNA激活了Cas9结构域并将其活性定向至DNA内的互补序列。所述系统已经被简化为从单一RNA转录物进行定向Cas9裂解，并且已经定向至基因组内的许多不同序列[42,43]。这种用于基因组裂解的方法具有以下优点：经由短RNA序列而定向，使得工程化裂解特异性相对较简单。因此，存在多种不同的方式来实现基因组DNA的位点特异性裂解。如上所述，这通过内源性细胞DNA修复机制增强了供体质粒整合率。
使用大范围核酸酶、ZFN、TALE核酸酶或核酸引导系统(诸如CRISPR/Cas9系统)，将能够靶向基因组内的内源性基因座。在本文的实施例中，我们已经证明了靶向AAVS基因座，但是也可以靶向替代的基因座。例如，I型胶原蛋白基因座已被用于有效的转基因表达[44]。
或者，可以预先引入靶向核酸酶(包括大范围核酸酶、ZFN和TALE核酸酶)的异源识别位点，以用于随后的文库靶向。在本文的实施例中，我们描述了使用TALE核酸酶识别AAVS基因座内的序列，以通过同源重组在AAVS基因座内引入I-Sce1大范围核酸酶识别序列和异源TALE核酸酶识别位点。核酸酶定向靶向可以用于通过使用载体DNA或甚至双链寡核苷酸的同源重组或者NHEJ来驱动靶序列的插入[45]。作为替代，非特异性靶向方法可用于通过使用转座子定向整合[46]引入靶向位点，来引入位点特异性核酸酶的识别位点。以低滴度应用的基于病毒的系统(诸如慢病毒)也可用于引入靶向位点。DNA转染结合单拷贝插入物筛选也已被用于鉴定独特的整合位点[17]。此类非特异性方法尤其可用于以下情况：细胞不具有明显的靶向位点，或基因组尚未测序，或没有现有的TALE核酸酶、ZFN或Cas9/CRISPR系统可用于基因组。一旦已经在随机插入核酸酶识别位点后建立了细胞系，则随后可以使用所述细胞系来生成结合物文库，其中文库中的所有克隆都含有使用核酸酶定向整合在固定基因座处的转基因。
在所提供的实施例中，使用三种不同的质粒，所述质粒包括其上具有一对TALE核酸酶或者ZFN的个别质粒以及用于供体DNA的一个单独质粒。在大范围核酸酶的情况下，位点特异性核酸酶由单个基因编码，并且此基因将被引入到一个质粒上，而供体DNA存在于第二质粒上。当然，可以使用在相同质粒上含有这些元件中的两个或更多个的组合，并且此举可以通过减少待引入质粒的数量来增强靶向效率。此外，也许有可能预先整合一种或多种核酸酶，所述核酸酶还可经诱导以允许瞬时控制核酸酶活性，如关于转座酶已证明的[46]。最后，可以将核酸酶作为重组蛋白或蛋白:RNA复合物(例如在RNA定向核酸酶，诸如CRISPR:Cas9的情况下)引入。
基因座
位点特异性核酸酶的识别序列可以存在于基因组DNA或者在细胞中稳定遗传的附加体DNA中。供体DNA可因此整合在细胞DNA中的基因组基因座或附加体基因座处。
在其最简单的形式中，编码结合物(结合物基因)的单一基因靶向真核基因组内的单个位点。鉴定表现出特定结合活性或细胞表型的细胞将允许直接分离编码所需特性的基因(例如，通过从mRNA或基因组DNA进行PCR)。此举通过使用位点特异性核酸酶的独特识别序列来促进，所述独特识别序列在细胞DNA中仅出现一次。用于生成文库的细胞可由此在单一固定基因座(即，所有细胞中的一个相同基因座)处含有核酸酶识别序列。从此类细胞产生的文库将含有整合在固定基因座处的供体DNA，即所述供体DNA存在于文库中所有克隆的细胞DNA中的相同位点处。
任选地，识别序列可以在细胞DNA中存在多次，使得细胞具有多于一个潜在的供体DNA整合位点。这是二倍体或多倍体细胞的典型情况，其中识别序列存在于一对染色体中的相应位置(即，重复基因座)处。从此类细胞产生的文库可以含有整合在重复的固定基因座处的供体DNA。例如从二倍体细胞产生的文库可以具有整合在两个重复的固定基因座处的供体DNA，并且从三倍体细胞产生的文库可以具有整合在三个重复的固定基因座处的供体DNA。许多合适的哺乳动物细胞是二倍体，并且根据本发明的哺乳动物细胞文库中的克隆可以具有整合在两个重复的固定基因座处的供体DNA。
由位点特异性核酸酶识别的序列可存在于细胞DNA中的多于一个独立基因座处。供体DNA可因此整合在多个独立基因座处。二倍体或多倍体细胞的文库可包含整合在多个独立的固定基因座处和/或重复的固定基因座处的供体DNA。
在多个基因座(无论是重复的还是独立的基因座)处含有识别序列的细胞中，每个基因座表示一个供体DNA分子的潜在整合位点。将供体DNA引入细胞可导致整合于细胞中存在的全部数目的核酸酶识别序列处，或者供体DNA可整合于这些潜在位点中的一些而非所有中。例如，当从在第一固定基因座和第二固定基因座(例如，两个重复的固定基因座)处含有识别序列的二倍体细胞产生文库时，所得文库可包含其中供体DNA整合于第一固定基因座处的克隆，其中供体DNA整合于第二固定基因座处的克隆，以及其中供体DNA整合于第一固定基因座和第二固定基因座两者处的克隆。
产生文库的方法可因此涉及用位点特异性核酸酶裂解细胞中的多个固定基因座，以及将供体DNA整合于多个固定基因座处。如上所述，在存在相同识别序列的多个拷贝(例如，如当靶向二倍体细胞或多倍体细胞中的内源基因座时所发生的情况)的情况下，有可能两种结合物基因将整合，尤其当使用有效的靶向机制时，其中仅一个基因特异于靶标。在随后的筛选期间，一旦已经分离出结合物基因，这就可以解决。
在一些情况下，可能需要每个细胞引入多于一种结合物。例如，双特异性结合物可以由两种不同抗体一起产生，并且这些抗体可以具有个别结合物中不存在的特性[47]。这可以通过将不同的抗体基因引入两个重复的固定基因座处的两个等位基因中或者通过使用本文所述的方法将不同的抗体群体靶向到独立的固定基因座中来实现。此外，结合物可本身由多个链(例如，在Fab或IgG形式中存在的抗体VH和VL结构域)组成。在这种情况下，可能需要将不同的亚基整合到不同的基因座中。这些亚基可以在相同的核酸酶定向整合循环中整合，可以将核酸酶定向整合用于一个或两个整合步骤来顺序地整合它们。
供体DNA的引入
已经描述了许多用于将供体DNA引入真核细胞中的方法，包括转染、感染或电穿孔。有可能用标准方法，包括如本文所述的聚乙烯亚胺介导的转染，来转染大量细胞。此外，方法可用于在5分钟内高效电穿孔1010个细胞，例如http://www.maxcyte.com。
可以产生组合文库，其中多聚体结合对的成员(例如，抗体基因中的VH基因和VL基因)或者甚至相同结合物分子的不同部分被引入到不同质粒上。编码单独结合物或结合物亚基的单独供体DNA分子的引入可以同时或顺序地进行。例如，可以通过转染和感染引入抗体轻链，使细胞生长并且如果必要的话进行选择。然后可以在后续的感染或转染步骤中引入其它部件。所述一个或两个步骤可涉及至特异基因组基因座的核酸酶定向整合。
供体DNA的整合
将供体DNA整合到细胞DNA中，从而形成具有连续DNA序列的重组DNA，其中所述供体DNA插入于整合位点处。在本发明中，整合由细胞内源的天然DNA修复机制介导。因此，可以通过以下步骤来允许整合发生：将供体DNA引入细胞中，允许位点特异性核酸酶产生整合位点，以及允许供体DNA整合。细胞可以保持培养达足够时间以使DNA整合。这将通常产生混合的细胞群，包括(i)供体DNA已经整合到用位点特异性核酸酶产生的整合位点处的重组细胞，以及任选地(ii)其中供体DNA已经整合在除了期望整合位点以外的位点处的细胞，和/或任选地(iii)其中尚未整合供体DNA的细胞。因此可以在其它真核细胞的混合群体中提供所需重组细胞和所得文库中的克隆。在本文其它地方描述的选择方法可用于富集文库中的细胞。
真核细胞中的内源性DNA修复机制包括同源重组、非同源末端接合(NHEJ)以及微同源介导的末端接合。通过在DNA中引入双链断裂(DSB)可以提高通过此类方法进行DNA修饰的效率，并且已经报道使用稀切内切核酸酶(rare cutting endonuclease)(大范围核酸酶)(诸如I-Sce1)实现了40,000倍的效率增益[48,49,50]。
与系统(诸如Flp-In系统)中所涉及的位点特异性重组[16]不同，本发明不需要外源重组酶识别位点或工程化重组酶识别位点。因此，任选地本发明在文库产生中不包括重组酶介导的DNA整合步骤，和/或任选地供体DNA引入其中的真核细胞缺乏位点特异性重组酶的重组位点。用重组酶和核酸酶将供体DNA定向插入细胞DNA中的机制和实践性是非常独特的。如由Jasin 1996所论述[50]：
“……由位点特异性重组酶催化的反应与DSB的细胞修复非常不同。位点特异性重组酶，诸如cre，在两个识别位点处形成突触，并产生位点内的单链断裂，从而形成Holliday中间体。中间体分解而产生缺失、倒位和插入(共合体)，所有这些修复了所述两个识别位点。反应是绝对精确的，并且因此是可逆的。断裂从未暴露于细胞修复机制。”
相比之下，位点特异性核酸酶作用以在细胞DNA(例如基因组或附加体)内产生断裂或缺口，所述断裂或缺口暴露于内源性细胞修复机制(诸如同源重组或NHEJ)并由其修复。基于重组酶的方法具有预先整合重组酶识别位点的绝对需求，因此此类方法需要把将“热点”整合位点工程化到细胞DNA中作为初步步骤。通过使用核酸酶定向整合，有可能在CRISPR:Cas9的情况下经由引导RNA来工程化核酸酶或定向，以识别内源基因座，即天然存在于细胞DNA中的核酸序列。最后，在实践水平上，核酸酶定向方法更有效地以制备大型结合物文库所需的水平定向整合转基因。
在本发明的方法中整合供体DNA所用的DNA修复机制可以通过设计供体DNA和/或选择位点特异性核酸酶而在一定程度上预先确定或偏向。
同源重组是由细胞使用同源序列(例如，来自另一个等位基因)作为修复模板来修复双链断裂所用的天然机制。同源重组已经在细胞工程中用于将插入物(包括转基因)、缺失和点突变引入基因组中。通过在供体DNA上提供同源臂来促进同源重组。工程化高等真核细胞的原始方法通常在供体质粒内使用5-10kb的同源臂来增大靶向整合到所关注位点的效率。尽管如此，完全由长同源臂驱动的同源重组比Flp和Cre定向重组效率低，尤其是在具有大基因组的高等真核生物中。同源重组尤其适用于真核生物如酵母，酵母具有仅为12.5×106bp的基因组大小，其中酵母比具有更大基因组的高等真核生物(例如，3000×106bp的哺乳动物细胞)更有效。
同源重组还可以经由[52]基因组DNA中的缺口来定向，并且这也可以用作核酸酶定向整合到基因组DNA中的途径。已经示出了用于促进缺口DNA处的同源重组的两种不同途径。一种途径基本上类似于双链断裂修复，利用Rad51/Brca2，而另一种途径由Rad51/Brca2抑制并且优先使用单链DNA或缺口的双链供体DNA[51]。
非同源末端接合(NHEJ)是一种修复基因组中双链断裂的替代机制，其中DNA的末端直接重新连接而不需要同源模板。基因组DNA的核酸酶定向裂解还可以通过基于非同源的机制来增强转基因整合。这种DNA修复方法不太准确，并且可能导致插入或缺失。尽管如此，NHEJ提供了将外显子同框整合到内含子中或允许将启动子:基因盒整合到基因组中的简单手段。使用非同源性方法允许使用缺乏同源臂的供体载体，从而简化了供体DNA的构建。
已经指出，末端同源的短区用于重新接合DNA末端，并且假设4bp的微同源序列可用于在双链断裂处定向修复，被称为微同源序列定向的末端接合[50]。
供体DNA
供体DNA通常是环化的DNA，并且可以作为质粒或载体提供。线性DNA是另一种可能。除了整合到细胞DNA中的一个或多个供体DNA序列之外，供体DNA分子还可以包含不整合到细胞DNA中的区域。DNA通常是双链的，但是在一些情况下也可以使用单链DNA。供体DNA含有编码结合物的一种或多种转基因，例如供体DNA可以包含启动子:基因盒。
在最简单形式的双链中，环状质粒DNA可用于驱动同源重组。这需要位于与基因组DNA中裂解位点侧翼的DNA序列同源的转基因侧翼的DNA区域。线性化的双链质粒DNA或PCR产物或合成基因可用于驱动同源重组和NHEJ修复途径两者。作为双链DNA的替代，有可能使用单链DNA来驱动同源重组[52]。产生单链DNA的常用方法是使来自丝状噬菌体的单链复制起点包含在质粒中。
单链DNA病毒如腺相关病毒(AAV)已被用于驱动有效的同源重组，其中效率已表现为改进了若干数量级[53,54]。系统如AAV系统可以与核酸酶定向裂解结合用于构建大型结合物文库。所述两种系统的益处都可以应用于结合物文库的靶向。AAV载体的包装限度为4.7kb，但是使用核酸酶消化靶基因组DNA将减少此限度，从而允许并入更大的转基因构建体。
供体DNA的分子可以编码单一结合物或多个结合物。任选地，每个供体DNA分子可以编码结合物的多个亚基。在一些实施方案中，供体DNA编码多聚体结合物的亚基。
启动子以及供选择的遗传元件
从编码供体DNA转录出结合物通常将通过以下步骤实现：使编码结合物的序列处于启动子和任选的一个或多个转录增强子元件的控制下。启动子(和任选的其它遗传控制元件)可包含在供体DNA分子本身中。或者，编码结合物的序列可能在供体DNA上缺乏启动子，并且替代地作为其在由位点特异性核酸酶产生的整合位点处插入的结果，可安置为与细胞DNA上的启动子(例如内源性启动子或预先整合的外源启动子)可操作连接。
供体DNA还可包含一个或多个其它编码序列，诸如使得能够选择含有或表达供体DNA的细胞的遗传元件。如上文所论述的编码结合物的序列一样，此类因子可以与供体DNA上的启动子相关联，或者可以作为将供体DNA整合在固定基因座处的结果而置于启动子的控制下。后一种布置提供了便利的手段来特异性地选择已经在所需位点处整合了供体DNA的那些细胞，因为这些细胞应当表达遗传元件以供选择。此遗传因子可以是例如赋予对阴性选择试剂如杀稻瘟素和嘌呤霉素的抗性的基因。可以应用一个或多个选择步骤来去除不需要的细胞，诸如缺乏供体DNA或尚未在正确位置处整合供体DNA的细胞。或者，可允许这些细胞保持与文库的克隆混合。
膜锚定结合物的表达本身可以用作选择性标记形式。例如，如果引入格式化成IgG或scFv-Fc融合体的抗体基因的文库，则可以使用本文所述的方法，使用识别表面表达的Fc的二级试剂来选择表达抗体的细胞。当在外源启动子控制下用编码转基因的供体DNA进行初次转染后，将发生结合物的瞬时表达(以及细胞表面表达)，并且有必要等待瞬时表达减弱(以实现例如1-2个抗体基因/细胞的靶向整合)。
作为替代，在引入结合物文库之前，可预先整合编码膜栓系(tethering)元件(例如，融合到PDGF受体跨膜结构域的本实施例的Fc结构域)的构建体。如果此膜栓系元件缺乏启动子或编码先前外显子框外的外显子中，则表面表达将受损。然后，靶向整合外来供体分子可以校正此缺陷(例如，通过将启动子或“框内”外显子靶向到缺陷栓系元件上游的内含子中)。如果框“校正外显子”还编码结合物，则将产生结合物和膜栓系元件之间的融合，从而导致结合物和膜栓系元件两者的表面表达。因此，正确靶向整合将导致膜栓系元件单独或作为与外来结合物的融合体的一部分的框内表达。此外，如果外来结合物文库缺乏膜栓系元件并且这些外来结合物文库被不正确地整合，则它们将不被选择。因此，结合物本身在细胞表面上的表达可用于选择具有正确靶向整合的细胞群。
克隆数目和文库多样性
先前已经构建了107-1010的酵母展示文库，并且所述酵母展示文库表现为在不存在群体的免疫接种或预选择的情况下产生结合物[9,55,56,57]。考虑到当利用来自高等真核生物的细胞时文库大小和可变性有限，许多先前公布的哺乳动物展示文库使用来源于经免疫的供体或甚至富集的抗原特异性B淋巴细胞的抗体基因。由于本发明中描述的基因靶向的效率，可在高等真核生物如哺乳动物细胞中构建大型原始文库，所述高等真核生物与关于简单真核生物如酵母描述的那些匹配。
在将供体DNA整合到细胞DNA中后，培养所得重组细胞以允许其复制，从而自每个初始产生的重组细胞产生细胞的克隆。因此每个克隆来源于一个其中供体DNA整合到由位点特异性核酸酶产生的整合位点处的原始细胞。根据本发明的方法与供体DNA整合的高效率和高保真度相关，并且根据本发明的文库可以含有至少100、103、104、105、106、107、108、109或1010个克隆。
通过使用核酸酶定向整合，有可能靶向10％或更多经转染的哺乳动物细胞。实际上还生长和转化了＞1010个细胞(例如从5升细胞以2×106个细胞/毫升的速度生长)。可使用标准方法，包括如本文所述的聚乙烯亚胺介导的转染，来实行对此类大量细胞的转染。此外，方法可用于在5分钟内高效电穿孔1010个细胞，例如http://www.maxcyte.com。因此，通过使用本发明的方法，有可能生成超过109个克隆的文库。
当用于生成文库的供体DNA分子群体含有相同序列的多个拷贝时，可以获得含有编码相同结合物的DNA的两个或更多个克隆。还可能的情况是，克隆可含有编码多于一种不同结合物的供体DNA，例如如果存在多于一种位点特异性核酸酶的识别序列，如本文在其它地方所详述的。因此，就所编码或所表达的不同结合物的数目而言，文库的多样性可以不同于所获得克隆的数目。
文库中的克隆优选地含有编码结合物组库的一个或两个成员的供体DNA，和/或优选仅表达结合物组库的一个或两个成员。当针对给定靶筛选文库时，就鉴定编码所鉴定的特定结合物的克隆和/或DNA而言，每个细胞中不同结合物的数目有限为有利的。当克隆编码结合物组库的单个成员时，此举为最简单的。然而，如果选自文库的克隆编码少量不同的结合物，例如克隆可编码结合物组库的两个成员，则也可以直接鉴定所需结合物的相关编码DNA。如在本文其它地方所论述的，编码一种或两种结合物的克隆尤其便于通过以下方式来生成：选择在二倍体基因组中的每一染色体拷贝中出现一次的位点特异性核酸酶的识别序列，这是因为二倍体细胞含有分别在每一染色体拷贝上的两个重复的固定基因座，并且供体DNA可以整合在所述固定基因座中的一个或两个处。因此，文库中的克隆可以各自表达结合物组库的仅一个或两个成员。
展示在文库中细胞表面上的结合物可以与展示在相同细胞上的其它结合物相同(具有相同的氨基酸序列)。所述文库可由每个细胞展示结合物组库中的单个成员的克隆组成，或者可由每个细胞展示结合物组库的多个成员的克隆组成。或者，文库可以包含展示结合物组库的单个成员的一些克隆，以及展示结合物组库的多个成员(例如，两个成员)的一些克隆。
因此，根据本发明的文库可以包含编码结合物组库的多于一个成员的克隆，其中供体DNA整合在两个重复的固定基因座或多个独立的固定基因座处。
如上所述，如果相应的克隆仅表达一种结合物，则最容易鉴定结合物的相应编码DNA。通常，供体DNA分子将编码单一结合物。结合物可以是多聚体，使得供体DNA分子包含对应于多聚体结合物的各种亚基的多个基因或开放阅读框。
根据本发明的文库可以编码至少100、103、104、105或106、107、108、109或1010个不同的结合物。在结合物是多聚体的情况下，多样性可以由结合物的一个或多个亚基提供。多聚体结合物可以将一个或多个可变亚基与一个或多个恒定亚基组合，其中恒定亚基在文库的所有克隆中是相同的(或具有更有限的多样性)。在生成多聚体结合物文库的过程中，组合多样性是可能的，其中第一结合物亚基组库可以与任意第二结合物亚基组库配对。
结合物
根据本发明的“结合物”是结合分子，表示另一分子的特异性结合配偶体。特异性结合配偶体的典型实例是抗体-抗原和受体-配体。
由文库编码的结合物的组库通常将共享共同结构并具有一个或多个多样性区域。文库因此使得能够选择所需结构类型分子的成员，诸如肽或scFv抗体分子。例如，结合物可为共享共同的结构并具有一个或多个胺基酸序列多样性区域的多肽。
这可以通过考虑抗体分子的组库来说明。这些抗体分子可以是其序列的一个或多个区域不同的共同结构类型抗体分子，例如IgG、Fab、scFv-Fc或者scFv。抗体分子通常在它们的互补性决定区(CDR)中具有序列变异性，CDR是抗原识别中主要涉及的区域。本发明中的结合物组库可以是具有一个或多个不同CDR的抗体分子的组库，例如可能在所有六个CDR中存在序列多样性，或者在一个或多个特定CDR(诸如重链CDR3和/或轻链CDR3)中存在序列多样性。
抗体分子和其它结合物更详细地描述于本文其它地方。然而，本发明的潜能超越抗体展示而包括肽或工程化蛋白(包括受体、配体、个别蛋白结构域和替代性蛋白骨架)的文库的展示[58,59]。核酸酶定向的位点特异性整合可用于制备使用其它展示系统预先工程化的其它类型结合物的文库。这些结合物中的许多涉及单体结合结构域，诸如DARPin和脂质运载蛋白(lipocalin)，亲和体(affibody)和adhiron[58,59,152]。在真核生物，尤其是哺乳动物细胞上的展示还开拓了分离和工程化结合物或靶标(包括更复杂的复合物、多聚体靶标)的可能性。例如，T细胞受体(TCR)在T细胞上表达，并且已经进化用于识别在抗原递呈细胞上递呈为与MHC分子复合的肽。可以生成编码和表达TCR组库的文库，并且可以筛选所述文库以鉴定与MHC肽复合物的结合，如在本文其它地方所进一步描述的。
对于多聚体结合物，编码结合物的供体DNA可以作为一个或多个DNA分子提供。例如，当个别抗体VH和VL结构域将单独表达时，这些结构域可以编码在供体DNA的单独分子上。供体DNA整合到细胞DNA中的多个整合位点处，例如VH的结合物基因在一个基因座处，而VL的结合基因在第二基因座处。引入编码单独的结合物亚基的供体DNA的方法在本文其它地方更详细地描述。或者，多聚体结合物的两种亚基或部分可以编码在整合于固定基因座处的相同供体DNA分子上。
结合物可以是包含抗原结合位点的抗体分子或非抗体蛋白质。可以通过在非抗体蛋白质骨架(例如纤连蛋白或细胞色素B等)上排列肽环，或通过随机化或突变蛋白质骨架内环上的氨基酸残基以赋予至期望靶的结合，来提供抗原结合位点[60,61,62]。抗体模拟物的蛋白质骨架公开于WO/0034784中，其中发明人描述了包含具有至少一个随机化的环的纤连蛋白III型结构域的蛋白质(抗体模拟物)。其中移植入一个或多个肽环(例如一组抗体VH CDR环)的合适骨架可以通过免疫球蛋白基因超家族的任何结构域成员提供。所述骨架可以是人或非人蛋白。
先前已经综述了抗原结合位点在非抗体蛋白骨架中的使用[63]。典型的是具有稳定主链和一个或多个可变环的蛋白质，其中一个或多个环的氨基酸序列经特异性或随机突变而产生用于结合靶抗原的抗原结合位点。此类蛋白质包括来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的蛋白质A的IgG结合结构域，转铁蛋白，四连接素，纤连蛋白(例如第10纤连蛋白III型结构域)和脂质运载蛋白。其它方法包括例如基于“扭结菌素(knottin)”和环肽类骨架的小型限制性肽[64]。考虑到它们的小尺寸和复杂性，特别是关于二硫键的正确形成，使用真核细胞来基于这些骨架选择新颖的结合物可能是有利的。考虑到这些肽本质上的共同功能，基于这些骨架的结合物文库可有利于生成具有阻断离子通道和蛋白酶的特别应用的小型高亲和力结合物。
除了抗体序列和/或抗原结合位点之外，结合物可包含其它氨基酸，例如形成肽或多肽(诸如折叠结构域)，或者赋予分子除了结合抗原的能力以外的另一功能特征。结合物可携带可检测标记，或可与毒素或靶部分或酶缀合(例如，通过肽键或接头)。例如，结合物可包含催化位点(例如，在酶结构域中)以及抗原结合位点，其中抗原结合位点结合抗原，因而将催化位点靶向于抗原。催化位点可抑制抗原的生物功能，例如通过裂解。
抗体分子
抗体分子是优选的结合物。抗体分子可以是完整抗体或免疫球蛋白(Ig)，其具有四条多肽链——两条相同的重链和两条相同的轻链。重链和轻链形配对，每对具有含有抗原结合位点的VH-VL结构域对。重链和轻链还包含恒定区：轻链CL和重链CH1、CH2、CH3以及有时CH4(第五结构域CH4存在于人IgM和IgE中)。两条重链通过二硫桥在柔性铰链区处连接。抗体分子可包含VH和/或VL结构域。
抗体分子的最常见天然形式是IgG，IgG是由两条相同重链和两条相同轻链组成的异四聚体。重链和轻链由具有保守二级结构的模块结构域组成，所述保守二级结构由通过单个二硫键稳定的四链反向平行β-折叠和三链反向平行β-折叠组成。抗体重链各自具有N末端可变结构域(VH)和3个相对保守的“恒定”免疫球蛋白结构域(CH1、CH2、CH3)，而轻链具有一个N末端可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。二硫键稳定了个别结构域并形成共价键来接合稳定复合物中的四条链。轻链的VL和CL与重链的VH和CH1缔合并且这些元件可以单独表达表达以形成Fab片段。CH2和CH3结构域(也称为“Fc结构域”)与另一个CH2:CH3对缔合以产生在“Y”末端处具有来自重链和轻链的可变结构域的四聚Y型分子。CH2和CH3结构域负责与免疫系统内的效应细胞和补体成分相互作用。重组抗体先前已以IgG形式或作为Fab(由VH:CH1和轻链的二聚体组成)表达。此外，可以使用称为单链Fv(scFv)的人工构建体，所述人工构建体由编码VH和VL片段的DNA与编码柔性接头的DNA基因融合而组成。
结合物可为人抗体分子。因此，在存在恒定结构域的情况下，这些恒定结构域优选地为人恒定结构域。
结合物可以是抗体片段或较小的抗体分子形式，诸如单链抗体分子。例如，抗体分子可以是scFv分子，由通过接头肽接合的VH结构域和VL结构域组成。在scFv分子中，VH和VL结构域形成VH-VL对，其中VH和VL的互补决定区结合在一起而形成抗原结合位点。
包含抗体抗原结合位点的其它抗体片段包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单个抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段[65,66,67]，其由VH或VL结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab')2片段——包含2个相连的Fab片段的二价片段；(vii)scFv，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头相连，所述肽接头使两个结构域缔合而形成抗原结合位点[68,69]；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)；以及(ix)“双价抗体(diabody)”——通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；[70])。Fv、scFv或双价抗体分子可通过并入连接VH结构域和VL结构域的二硫桥来稳定[71]。
已经工程化出包含一个或多个抗体抗原结合位点的各种其它抗体分子，包括例如Fab2、Fab3、双价抗体，三价抗体、四价抗体和微抗体(小型免疫蛋白)。抗体分子及其构建和使用方法已有描述[72]。
结合片段的其它实例为：Fab'，其通过在重链CH1结构域的羧基末端添加几个残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而不同于Fab片段；以及Fab'-SH，Fab'-SH是其中恒定结构域中的一个或多个半胱氨酸残基带有游离硫醇基的Fab'片段。
dAb(结构域抗体)是抗体的小单体抗原结合片段，即抗体重链或轻链的可变区。VHdAb天然存在于骆驼科动物(例如，阿拉伯驼、美洲驼)中并可通过用靶抗原免疫骆驼科动物、分离抗原特异性B细胞以及直接从各个B细胞克隆dAb基因来产生。dAb也可在细胞培养基中生产。它们的小尺寸、良好的溶解性和温度稳定性使得它们在生理上尤其有用并适于进行选择和亲和力成熟。骆驼科VH dAb正被开发以名称“nanobodiesTM(纳米抗体TM)”用于治疗用途。
可以通过从经由合成并组装在合适的表达载体中的寡核苷酸产生的基因表达来产生合成抗体分子，例如如Knappik等人[73]或Krebs等人[74]所描述的。
双特异性或双功能抗体形成第二代单克隆抗体，其中两个不同的可变区组合在同一分子中[75]。它们的用途已经因其募集新的效应功能或靶向肿瘤细胞表面上的若干分子的能力而在诊断领域和治疗领域中得到证实。在使用双特异性抗体的情况下，这些双特异性抗体可以是常规的双特异性抗体，其可以多种方式制备[76]，例如化学地制备或通过杂交-杂交瘤制备，或者可以是上述双特异性抗体片段中的任意一种。这些抗体可以通过化学方法[77,78]或体细胞方法[79,80]获得，但是也优选地通过允许被迫异源二聚化并由此促进所寻求抗体的纯化过程的遗传工程技术获得[81]。双特异性抗体的实例包括BiTETM技术中的那些抗体，在所述技术中中可以使用具有不同特异性的两种抗体的结合结构域，并且所述结合结构域通过短的柔性肽直接连接。此举将两种抗体组合在单个短多肽链上。双价抗体和scFv可仅使用可变结构域而构建为不含Fc区，这潜在地减少了抗独特型反应的影响。
双特异性抗体可构建为整个IgG，双特异性Fab'2，Fab'PEG，双价抗体或双特异性scFv。此外，两种双特异性抗体可使用本领域中已知的常规方法进行连接，以形成四价抗体。
双特异性双抗体，与双特异性完整抗体相反，也是特别有用的。可轻易地选择出具有适当的结合特异性的双价抗体(以及许多其它多肽，诸如抗体片段)。如果双价抗体的一个臂保持恒定，例如具有针对所关注抗原的特异性，则可制备其中另一臂可变的文库，并选择出具有适当特异性的抗体。双特异性全抗体可通过替代的工程方法制备，如在Ridgeway等人，1996年中描述的[82]。
根据本发明的文库可用于选择结合一种或多种所关注抗原的抗体分子。从文库进行选择在下文中详细描述。选择后，则可以将抗体分子工程化为不同的形式和/或含有另外特征。例如，所选择的抗体分子可以被转化为不同的形式，例如上述抗体形式中的一种。所选抗体分子和包含所选抗体分子的VH和/或VL CDR的抗体分子是本发明的一个方面。抗体分子及其编码核酸可以分离形式提供。
抗体片段可以通过诸如用酶(例如，胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)消化和/或通过化学还原裂解二硫桥的方法从抗体分子开始获得。以另一种方式，抗体片段可以通过本领域中的技术人员熟知的基因重组技术，或通过利用例如自动肽合成仪的肽合成，或通过核酸合成和表达获得。
可以采用单克隆抗体和其它抗体并使用重组DNA技术来产生结合靶抗原的其它抗体或嵌合分子。此类技术可涉及将编码抗体的免疫球蛋白可变区或CDR的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区，或者恒定区加骨架区。参见例如EP-A-184187，GB 2188638A或EPA-239400，以及大量后续文献。
抗体分子可从文库选择以及随后进行修饰，例如可以通过化学修饰(例如PEG化)或通过并入脂质体中来延长抗体分子的体内半衰期。
合物基因的来源
产生单克隆抗体的传统途径利用实验动物(如小鼠和兔)的免疫系统来产生高亲和力抗体集合，然后通过使用杂交瘤技术分离高亲和力抗体。本发明提供了一种鉴定由免疫产生的抗体的替代途径。VH和VL基因可以用经免疫的动物的B细胞扩增，并克隆到合适的载体中以引入真核文库中，然后从这些文库中选择。噬菌体展示和核糖体展示允许构建非常大的文库(＞109个克隆)，使得能够在不进行免疫的情况下分离出人抗体。本发明也可以与此类方法结合使用。在多轮噬菌体展示选择后，可以通过如本文所述的核酸酶定向整合将所选结合物群体引入真核细胞中。这将允许最初使用基于其它系统(例如，噬菌体展示)的非常大的文库来富集结合物群体，同时允许使用如上所述的真核细胞对它们进行有效筛选。因此，本发明可以组合噬菌体展示和真核展示两者的最佳特征以提供具有定量筛选和分选的高通量系统。
通过使用噬菌体展示和酵母展示，先前已经证明，也可能在不依靠免疫的情况下产生结合物，前提条件是使用足够大小的展示文库。例如，从＞107个克隆的非免疫性抗体文库产生多个结合物[83]。此举继而允许产生通过传统免疫途径难以获得的针对靶的结合物，例如产生针对“自体抗原”或在物种之间保守的表位的抗体。例如，可以通过对相同靶标的人，然后对小鼠形式进行顺序选择来富集人/小鼠交叉反应性结合物。由于不可能针对大部分所关注靶标对人进行特异性免疫，所以这种手段在允许产生对于治疗方法而言优选的人抗体方面尤其重要。
迄今为止，在哺乳动物展示的实例中，在文库大小和质量有限的情况下，结合物仅使用针对结合物预先富集的组库来产生，例如通过免疫或通过工程化预先存在的结合物。在真核细胞，并且尤其是高等真核生物中制备大型文库的能力产生了从这些文库直接分离结合物的可能性，这些文库用非免疫性结合物或先前尚未在另一系统中选择的结合物建立。通过使用本发明，可以从非免疫性来源产生结合物。此举继而开创了使用来自多种来源的结合物基因的可能性。结合物基因可以通过对天然来源如抗体基因进行PCR获得。也可以从现有文库(诸如抗体的噬菌体展示文库)重新克隆结合物基因，并克隆到合适的供体载体中以供核酸酶定向整合到靶细胞中。结合物在来源上可以是完全或部分合成的。此外，在本文其它地方描述了各种类型的结合物，例如，结合物基因可以编码抗体或可以编码替代性骨架[58,59]、肽或工程化蛋白质或蛋白质结构域。
结合物展示
为了提供结合物组库以供针对所关注的靶标进行筛选，可以培养文库来以可溶性分泌形式或跨膜形式表达结合物。对于细胞表面展示，需要在编码结合物的细胞表面上保留所表达的结合物。结合物可以包含或连接至膜锚定点(诸如跨膜结构域)，以用于在细胞表面上进行细胞外结合物展示。此举可涉及将结合物直接融合到膜定位信号(诸如GPI识别序列)或跨膜结构域(诸如PDGF受体的跨膜结构域)[84]。在细胞表面上保留结合物还可以通过与在相同细胞内表达的另一细胞表面保留的分子缔合来间接地完成。此经缔合的分子可以本身为异二聚体结合物的一部分，诸如与非直接束缚的轻链配偶体缔合的经束缚抗体重链。
虽然细胞表面固定促进了结合物选择，但在许多应用中，需要制备不含细胞的分泌结合物。将有可能使用将所分泌结合物附着到细胞表面受体上的再捕获方法，来组合膜束缚和可溶性分泌。一种方法是将结合物文库格式化为可与在相同细胞内表达的膜锚定分子缔合的分泌分子，所述膜锚定分子可用于捕获分泌的结合物。例如，在抗体或结合物分子融合至抗体Fc结构域的情况下，膜束缚的Fc可对在相同细胞中表达的所分泌结合物分子进行“采样”，从而导致展示所表达的结合物分子的单体部分，而剩余部分则以二价形式分泌(US8,551,715)。替代方法是使用束缚的IgG结合结构域，例如蛋白质A。
用于使分泌的抗体与产生它们的细胞一起保留的其它方法在Kumar等人(2012年)[85]中综述，并且包括将细胞包封在微滴中，基质辅助捕获，亲和力捕获表面展示(affinity capture surface display,ACSD)，分泌和捕获技术(secretion and capturetechnology,SECANT)和“冷捕获”[85]。在给出的关于ACSD和SECANT的实例[85]中，使用生物素化来促进链霉亲和素或捕获抗体在细胞表面上的固定。被捕获的分子继而捕获分泌的抗体。在SECANT的实例中，发生了所分泌分子的体内生物素化。通过使用“冷捕获”技术，可以使用针对所分泌分子的抗体在分泌细胞(producer cell)上检测所分泌的抗体。已经提出这是由于所分泌的抗体与细胞的多糖-蛋白质复合物(glycocalyx)缔合[86]。另选地，已经提出分泌的产物通过在被胞吞之前在细胞表面上染色抗体而被捕获[87]。上述方法已经用于鉴定群体内的高表达克隆，但是可潜在地适用于鉴定结合特异性，前提条件是细胞表面处的缔合具有足够的持久性。
甚至当结合物被直接束缚到细胞表面时，也有可能产生可溶性产物。例如，可将编码所选结合物的基因回收并克隆到没有膜锚定序列的表达载体中。替代地，并且如实施例中所证明的，可以使用表达构建体，其中跨膜结构域被编码在侧翼有重组位点(例如，Dre重组酶[88]的ROX识别位点)的外显子内。在此实例中，编码跨膜结构域的外显子可以通过用编码Dre重组酶的基因转染而去除，从而将表达转换为分泌形式。如本文所证明的，通过此方法产生了所分泌的抗体，而不需要重组酶作用。这据推测是由于选择性剪接[89]。
上述方法或其它合适的方法中的任何一种可以用来确保用文库中的克隆表达的结合物展示在结合物表达细胞的表面上。
筛选以鉴定针对所关注靶的结合物
如上所述，真核细胞文库可在用于筛选识别靶标的结合物的方法中使用。此类方法可包括：
提供如本文所述的文库，
培养所述文库的细胞以表达结合物，
将结合物暴露于靶标，从而允许用一种或多种同源结合物(如果存在的话)识别靶标，以及
检测靶标是否被同源结合物识别。
可以使用各种靶标分子类别(例如，蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、小分子)进行选择。靶标可以可溶形式提供。可标记靶标以帮助检测，例如，靶标可带有荧光标记或靶可以是生物素化的。可以使用直接或间接标记的靶标分子来分离表达靶标特异性结合物的细胞，其中所述结合物捕获被标记的分子。例如，通过结合物:靶相互作用而结合至经荧光标记的靶标的细胞可以通过流式细胞术或者FACS进行检测和分选，以分离出所需细胞。涉及细胞计数的选择需要直接荧光标记的靶分子或用可以用二级试剂检测出的分子标记的靶分子，例如可将生物素化的靶标加入细胞中，并且生物素化的靶标与细胞表面的结合可以用荧光标记的链霉亲和素如链霉亲和素-藻红蛋白检测出。另一种可能性是将靶分子或者结合至靶标分子的二级试剂固定在固体表面(例如磁珠或琼脂糖珠粒)上，以允许富集结合靶标的细胞。例如，可以在包被有链霉亲和素的基底(例如，链霉亲和素包被的珠粒)上分离通过结合物:靶相互作用而结合到生物素化的靶的细胞。
在筛选文库的过程中，优选地过采样(over-sample)，即筛选比文库内存在的独立克隆的数目更多的克隆，来确保有效表示文库。从本发明提供的非常大的文库中鉴定结合物可以通过流式分选进行，但这将需要若干天，特别是如果对文库过采样的话。替代地，初始选择可以基于可回收抗原的使用，例如回收在包被有链霉亲和素的磁珠上的生物素化抗原。因此，包被有链霉亲和素的磁珠可用于捕获已结合至生物素化抗原的细胞。用磁珠进行选择可以用作唯一的选择方法，或者其可以与可以实现更好分辨率的流式细胞术结合进行，以例如区分具有较高表达水平的克隆与具有较高亲和力的克隆[56,57]。
展示技术方法的体外性质使得有可能通过免疫无法实现的方式来控制选择，例如，对靶的特定构象状态进行选择[90,91]。可以通过化学修饰(荧光素、生物素)或通过基因融合(例如，与表位标签(诸如FLAG标签)或另一蛋白质结构域或完整蛋白质融合的蛋白质)来标记靶标。所述标签可以是核酸(例如，DNA、RNA或非生物核酸)，其中标签与靶核酸部分融合或可以化学连接至另一类型的分子如蛋白质。这可以通过化学缀合或通过酶连接实现[92]。核酸也可以通过翻译过程如核糖体展示而与靶标融合。“标签”可以是在细胞内存在的另一种修饰(例如，糖基化、磷酸化、泛素化(ubiqitinylation)、烷基化、PAS化，SUMO化和在http://dbptm.mbc.nctu.edu.tw/statistics.php处的翻译后数据库(db-PTM)中描述的其它修饰)，标签可以通过二级试剂检测出。这将得到基于特定修饰结合未知靶蛋白的结合物。
可以使用与靶分子结合的现有结合物(例如靶标特异性抗体)来检测靶标。使用现有结合物进行检测将具有以下另外优点：从结合物文库内鉴定识别不同于用于检测的结合物的表位的结合物。以这种方式，可以鉴定配对结合物以用于诸如夹心ELISA的应用中。在可能的情况下，经纯化的靶分子为优选的。或者，靶标可以展示在靶细胞群的表面上，并且结合物展示在文库细胞的表面上，所述方法包括通过使文库细胞与靶细胞接触来将结合物暴露于靶标。回收表达靶标的细胞(例如，使用表达靶标的生物素化细胞)将允许富集表达针对靶标的结合物的细胞。在因为存在强亲合力(avidity)效应的可能性而涉及低亲和力相互作用的情况下，此方法为可用的。
靶分子还可以是未纯化的重组体或未纯化的天然靶标，前提条件是检测分子可用于鉴定细胞结合(如上所述)。此外，可通过将靶分子与正被检测的另一分子缔合来间接地检测靶分子与表达结合物的细胞的结合，例如可将含有标记分子的细胞裂解液与结合物文库一起温育以鉴定不仅针对所述标记分子的结合物，而且针对标记分子的相关配偶体蛋白的结合物。这将产生一组针对这些配偶体的抗体，所述抗体可用于检测或鉴定配偶体(例如，使用质谱分析法)。细胞分级分离可用于从特定亚细胞位置富集靶标。或者，对表面或者细胞质级分的差异生物素化可以与链霉亲和素检测试剂结合以用于真核展示[93,94]。使用经去垢剂溶解的靶制剂对于完整的膜蛋白(诸如GPCR和离子通道)是特别有用的方法，所述完整的膜蛋白以其它方式难以制备。去垢剂的存在可能对展示结合物的真核细胞具有不利影响，需要回收结合物基因，所选细胞无另外生长。
在用同源结合物检测到靶标识别后，可以回收含有编码同源结合物的DNA的克隆的细胞。然后可以从回收的克隆中分离(例如，鉴定或扩增)编码结合物的DNA，从而获得编码识别靶的结合物的DNA。
示例性结合物和靶标在本文的其它地方详述。经典实例是抗体分子文库，可筛选抗体分子文库中与所关注的靶抗原的结合。其它实例包括针对靶MHC:肽复合物筛选TCR文库，或针对靶TCR筛选MHC:肽复合物的文库。
TCR:MHC和其它受体的相互作用
T细胞受体(TCR)在T细胞上表达并且已经进化用于识别以在抗原递呈细胞上与MHC分子的复合物形式的肽。TCR是由95％例的α和β异源二聚体和5％例的γ和δ异源二聚体组成的异源二聚体。两种单体单元都具有N末端免疫球蛋白结构域，所述N末端免疫球蛋白结构域具有参与驱动与靶标相互作用的3个可变的互补决定区(CDR)。功能性TCR存在于其它亚基的复合物中，并且通过用CD4和CD8分子(分别特异于I类和II类MHC分子)协同刺激(co-stimulation)来增强信号传导。在抗原递呈细胞上，蛋白质经加工并在细胞表面上以与MHC分子的复合物的形式存在，MHC分子本身为多聚体蛋白质复合物的组成部分。在培育(development)期间去除识别源自“自身”的肽的TCR，并且所述系统准备好用于识别在抗原递呈细胞上存在的外源肽以实现免疫应答。肽:MHC复合物的识别结果取决于T细胞的鉴定和肽:MHC相互作用的亲和力。
鉴定编码TCR或MHC:肽复合物的基因将为有价值的，所述TCR或MHC:肽复合物驱动病理状态中所涉及的相互作用，例如如在自身免疫性疾病中存在的。在自身免疫性疾病的情况下，鉴定相互作用配偶体(例如，驱动病理状态的TCR)可以为特异性阻断此类相互作用或去除损伤性的(offending)细胞毒性细胞做好准备。期望工程化TCR以实现改变的结合，例如对所关注靶络合物的更高亲和力，例如在癌症中重新靶向T细胞或增强现有T细胞的功效[95]。或者，可将调控或抑制性T细胞的状态改变为治疗形态，例如以用于通过将特异性TCR引入T细胞中或通过使用表达的TCR蛋白作为治疗实体来指导或增强癌症的免疫治疗[96]。
先前已经举例说明了TCR文库在酵母细胞和哺乳动物细胞表面上的展示。在酵母细胞的情况下，需要工程化TCR，使TCR以单链形式存在。由于TCR与肽:MHC复合物之间的相互作用亲和力较低，所以可溶性组分(例如，在这种情况下为肽:MHC)往往以多聚体形式存在。TCR特异性已被工程化为针对与MHC I型[97]和MHC II型[98]复合的肽。TCR还已经在突变小鼠T细胞(没有TCR α和β链)的表面上表达，并且已经分离出具有改善结合特性的TCR变体[99]。例如Chervin等人通过逆转录病毒感染引入TCR，并产生了104个克隆的有效文库大小[100]。通过使用如在此提出的结合物的核酸酶定向整合，可以采取类似的方法来工程化T细胞。除了选择具有改变的识别特性的TCR以外，展示文库还可以用于筛选肽或MHC变体的文库以供TCR识别。例如肽:MHC复合物已经展示在昆虫细胞上，并且用于表位映射以多聚体形式存在的TCR[101]。
如上所述，筛选方法可以涉及在细胞表面上展示结合物组库，以及用作为可溶性分子存在的靶进行探测，所述可溶性分子可以是多聚体靶标。可尤其用于多聚体靶的替代方法是直接筛选细胞间的相互作用，其中结合物和靶标存在于不同细胞的表面上。例如，如果激活所关注的TCR导致报告基因表达，则这可以用于鉴定肽:MHC文库内存在的激活肽或激活MHC分子。在此特定实例中，报告细胞不编码文库成员，但可用于鉴定编码文库成员的细胞。所述方法可潜在地扩展到“文库对照文库”方法。例如，扩展上述实例，可以针对肽:MHC文库筛选TCR文库。更广泛地，使用另一细胞上的结合配偶体筛选存在于一个细胞表面上的结合物文库的实例可以扩展至其它类型的细胞间相互作用，例如，鉴定抑制或激活Notch或Wnt途径中的信号传导的结合物。因此，本发明可用于替代的基于细胞的筛选系统，包括基于细胞间相互作用的识别系统。
作为实例，嵌合抗原受体(“CARS”)表示抗体结合结构域(通常格式化为scFv)和信号传导结构域之间的融合体。这些CARS已被引入到T细胞中，目的是使T细胞在体内重定向为通过抗体识别和与肿瘤特异性抗原结合来攻击肿瘤细胞。大量不同的因素可以影响此策略的成功，包括抗体特异性、形式、抗体亲和力、接头长度、融合的信号传导模块，在T细胞中的表达水平，T细胞亚型，以及CAR与其它信号传导分子的相互作用的组合[102,103]。在并入个别上述变量或者上述变量的组合的原代T细胞中生成大型CAR文库的能力将允许功能性检索有效和最佳的CAR构建。这种功能性“检索”可以在体外或体内进行。例如，Alonso-Camino(2009年)已经将识别CEA的scFv与TCR:CD3复合物的ζ链融合，并将此基因构建体引入人Jurkat细胞系[104]。在与存在于HeLa细胞或肿瘤细胞上的CEA相互作用时，所述细胞系表现为上调早期T细胞活化标记物CD69。此方法可用于使用经培养的细胞或原代细胞来鉴定具有适当激活或抑制特性的CAR融合构建体。
可进一步在体内评估CAR构建体的功能性。例如，可将在原代小鼠T细胞中构建的CAR文库引入荷瘤小鼠体内以鉴定通过与肿瘤相遇而刺激增殖的T细胞克隆。如果必要的话，此T细胞文库可以使用上述方法基于抗原结合特异性来预选。在任一情况下，引入的结合物文库可用于替代现有的结合物分子(例如，MHC和TCR，或者抗体可变结构域)。
表型筛选
在此描述了用于选择改变细胞信号传导和细胞行为的结合物的各种方法。
可从文库中筛选由于结合物对其靶标的作用而改变的细胞表型。
通过与配体或受体结合来改变细胞信号传导的抗体已经在药物开发中有可靠的跟踪记录，并且对此类治疗性抗体的需求持续增长。此类抗体和其它类型的功能性结合物也具有在体内和体外控制细胞状态的潜能。然而，控制和指导细胞行为的能力依赖于控制特定信号传导途径的天然配体的可用性。不幸的是，许多天然配体(诸如控制干细胞分化的那些)(例如，FGF、TGF-β、Wnt和Notch超家族的成员)往往表现出混杂的相互作用并且由于其不良的表达/稳定性特性而具有有限的可用性。由于其灵敏的特异性，抗体在控制细胞状态行为具有巨大的潜能。
改变细胞信号传导的功能性抗体的鉴定在历史上是相对艰巨的，涉及挑取克隆，表达抗体，根据序列和结合特性鉴定，转化到哺乳动物表达系统中，以及加入到基于功能细胞的测定中。本文所述的真核展示方法将减少这种努力，但仍然需要产生抗体并加入单独的报告细胞培养中。因此，优选的替代方案可以是通过使用生产细胞本身作为报告细胞，来直接筛选在真核细胞中表达的结合物文库中结合对细胞信号传导或细胞行为的影响。在引入抗体基因后，可以鉴定在所得细胞群中表现出报告基因表达变化或改变的表型的克隆。
大量近期出版物已经描述了通过将抗体基因组库克隆到报告细胞中来构建抗体文库[47,105,106]。这些系统在一个细胞内组合表达和报告，并且通常引入针对预定靶(例如，使用噬菌体展示)选择的抗体群体。
可以通过本文所述的方法将抗体基因群体引入报告细胞中以生成文库，并且可以鉴定群体内具有抗体引导的表型变化(例如，改变的基因表达或存活率)的克隆。为了使此表型定向选择起作用，需要保留在表达细胞内存在的抗体基因(基因型)与抗体表达结果(表型)之间的关联。这之前已经通过如针对抗体展示所描述地将抗体束缚到细胞表面上[47]，或者通过使用半固体培养基在生产细胞附近保留分泌的抗体[105]而实现。或者，抗体和其它结合物可保留在细胞内[107]。保留在细胞表面上或周围培养基中的结合物可与细胞表面上的内源或外源受体相互作用，从而受体被激活。这继而可引起报告基因表达的变化或细胞表型的变化。作为替代，抗体可以阻断受体或配体以减少受体激活。然后可以回收编码引起细胞行为改变的结合物的基因以用于生产或进一步工程化。
作为此“靶标定向”方法的替代，可以引入尚未针对特定靶预选的“天然”抗体群体[108]。细胞报告系统用于鉴定具有改变行为的群体的成员。由于没有关于靶标的先验知识，所以此类非靶向方法特别需要大型抗体组库，因为不可能预富集针对靶标的抗体群体。此方法将受益于使用如本发明所述的核酸酶定向的转基因整合。
“功能选择”方法可用于涉及真核细胞，尤其是高等真核生物如哺乳动物细胞中的文库的其它应用。可将抗体融合到信号传导结构域，使得与靶标的结合导致受体被激活。Kawahara等人已经构建了嵌合受体，其中细胞外scFv靶向荧光素被融合到间隔结构域(Epo受体的D2结构域)和各种细胞内细胞因子受体结构域(包括促血小板生成素(thrombopoeitin)(Tpo)受体，促红细胞生成素(Epo)受体，gp130，IL-2受体和EGF受体)[109,110,11]。将这些嵌合受体引入IL-3依赖性祖B细胞系(BaF3)[27]，其中嵌合受体显示为表现出嵌合受体的抗原依赖性激活，从而导致非IL-3依赖性生长。在模型实验中使用这种相同的方法来证明BaF3细胞的抗原介导的化学吸引(chemoattraction)[110]。此方法从稳定培养细胞扩展到原代细胞，所述原代细胞通过Tpo应答性造血(haematopoeitic)干细胞[112]或IL2依赖性原代T细胞的存活率和生长所例示，其中scFv嵌合受体的荧光素定向刺激替代了分别用Tpo和IL-2的正常刺激。因此，基于嵌合的抗体-受体嵌合体的系统可用于驱动原代或稳定报告细胞中的靶依赖性基因表达或表型变化。此能力可用于鉴定驱动信号传导应答的经融合结合物或抑制应答的结合物。
在上述方法的改进形式中，将来自抗溶菌酶抗体的单独VH和VL结构域与Epo胞内结构域融合[113]。细胞响应于溶菌酶的添加而生长，这指示单独VH和VL融合配偶体的抗原诱导的二聚化或稳定化。因此，三种相互作用组分联合在一起以在此系统中实现最佳应答。
虽然本文中参考抗体分子进行了描述，但是上述方法也可用其它结合物的文库修改和执行。
蛋白质片段互补表示用于研究和选择哺乳动物细胞中蛋白质间相互作用的替代系统[114,115]。此系统涉及通过蛋白质间相互作用来修复脱落报告蛋白的功能。已使用的报告蛋白包括泛素、DNAE内含肽、β-半乳糖苷酶、二氢叶酸还原酶、GFP、萤火虫荧光素酶、β-内酰胺酶、TEV蛋白酶。例如，这种方法的最近实例是哺乳动物膜双杂交(MaMTH)方法，其中诱饵蛋白:脱落泛素:转录因子融合体与配偶体蛋白:脱落泛素的缔合修复了泛素识别并释放出转录因子来实行报告基因表达[116]。另外，干扰或增强这种相互作用的结合物可以通过干扰信号传导来鉴定。
结合物和编码DNA的回收与重新格式化
在从文库中选择所关注的结合物或克隆后，常用的下一步骤是分离(例如，鉴定或扩增)编码结合物的DNA。任选地，可能需要修饰编码结合物的核酸，例如以重构结合物和/或将编码序列插入到不同的载体中。
在结合物是抗体分子的情况下，方法可包括从克隆的细胞中分离编码抗体分子的DNA；扩增编码至少一个抗体可变区，优选VH和VL结构域两者的DNA；以及将DNA插入载体中以提供编码所述抗体分子的载体。可以将具有恒定结构域的多聚体抗体分子转化为单链抗体分子，以用于以可溶性分泌形式表达。
抗体可以不同形式提供，但是无论选择任何形式的抗体，一旦分离抗体基因，就有可能以大量不同的形式重构抗体。一旦分离了VH或VL结构域，就可以将它们重新克隆到包含所需配偶体结构域的表达载体中(参见说明双启动子IgG表达盒的实施例1)。
重新格式化步骤可以包括将由一对亚基组成的结合物(例如，scFv分子)重新格式化成不同的分子结合物形式(例如Ig或Fab)，其中维持所述亚基的原始配对。此类方法在本文其它地方更详细地描述，并且可用于单克隆、寡克隆或者多克隆纯系的重新格式化。所述方法可用于将来自包括噬菌体、酵母或核糖体展示的常用展示技术中的任何一种的全部输出群体“整体地”转化。
scFv在与Fc结构域融合的哺乳动物细胞表面上的展示。
虽然许多抗体噬菌体展示文库被格式化成展示scFv，但真核展示系统将允许以Fab或IgG形式呈现。为了充分利用IgG/Fab表达的潜能，尤其是当使用来自其它展示系统的scFv时，需要获得在细菌表达系统内所选连接的VH和VL结构域，并将它们在与适当的恒定结构域融合的真核系统内表达。本文描述了用于以保持原始VH和VL链配对的方式将scFv群体转化为免疫球蛋白(Ig)或片段，抗原结合(Fab)形式的方法。在本发明中，通过使用格式化为scFv的个别克隆、寡克隆混合物或全部群体，同时保留VH和VL链的原始配对，可以进行转化。所述方法通过生成引入新的“填充(stuffer)”DNA片段的中间非复制型“微环”DNA来进行。环状DNA是线性化的(例如通过限制性酶切消化或者PCR)，这改变了原始VH和VL片段的相对位置并将“填充”DNA置于它们之间。线性化后，可以将产物克隆到所选载体(例如，哺乳动物表达载体)中。以这种方式，可以替换除VH和VL之外的所有元件。用于细菌表达的元件可以用用于哺乳动物表达和与替代配偶体融合的元件替代。完全转化过程仅需要大肠杆菌细菌的单一转化步骤以产生细菌菌落群，每个细菌菌落携带编码Ig或Fab形式的独特重组抗体的质粒。扩展到scFv转化为IgG/Fab以外，所述方法可以用于重新格式化任何两种接合的DNA元件以克隆到载体中，使得在重新格式化后，每个DNA元件被不同的DNA控制特征物包围，同时保持原始配对。已经描述了先前方法，其中与通过中间非复制型环状中间体进行的本发明方法相比，此先前方法使用2个连续的克隆步骤[117]来代替这些元件。
重构结合物或结合物群体的方法可以包括将scFv转化为Ig或其片段(例如，Fab)。所述方法可以包括将编码scFv的核酸转化为编码免疫球蛋白(Ig)或其片段(诸如Fab形式)的DNA，使得原始可变VH和VL链配对被保持。优选地，转化通过环状DNA中间体进行，所述环状DNA中间体可以是非复制型“微环”DNA。该方法需要大肠杆菌的单一转化以直接产生携带编码Ig或Fab DNA的质粒的细菌转化体。
所述方法可用于单克隆、寡克隆或者多克隆克隆的重新格式化。所述方法可能用于将来自包括噬菌体、酵母或核糖体展示的常用展示技术中的任何一种的全部输出群体“整体地”转化。
更一般地，本发明的这个方面涉及允许将任何两种接合的DNA元件重新格式化到载体中的方法，其中DNA元件在单独启动子的控制下克隆或者用替代的控制元件分离出，但保持原始DNA配对。
实施例7和实施例14进一步详细地描述了此类方法。
分离以及任选重构编码结合物的DNA，可随后将此DNA引入其它细胞以生成如本文其它地方所述的衍生文库，或可将编码所关注的一种或多种特定结合物的DNA引入宿主细胞中进行表达。宿主细胞可以是与宿主细胞所获取自的文库中的细胞相比不同的类型。通常，DNA将在载体中提供。引入宿主细胞的DNA可以整合到宿主细胞的细胞DNA中。然后可以选择表达分泌的可溶性抗体分子的宿主细胞。
编码一种或多种结合物的宿主细胞可以在培养基中提供并经培养以表达一种或多种结合物。
衍生文库
在通过本发明的方法产生文库之后，可以选择一个或多个文库克隆并用于产生另一个第二代文库。当已经通过如本文所述将DNA引入真核细胞而产生文库时，可以培养所述文库以表达结合物，并且可以例如通过如在本文其它地方所述针对靶选择结合物来回收表达所关注的结合物的一个或多个克隆。这些克隆可随后用于生成含有编码第二结合物组库的DNA的衍生文库。
为了生成衍生文库，将一个或多个回收的克隆的供体DNA进行突变以提供第二结合物组库。突变可以是一个或多个核苷酸的添加、取代或缺失。在结合物是多肽的情况下，突变将通过一个或多个氨基酸的添加、取代或缺失来改变所编码结合物的序列。突变可以集中在一个或多个区域，诸如抗体分子的一个或多个CDR，从而提供一个或多个多样性区域不同、具有共同结构类型的结合物的组库，如本文其它地方所述。
生成衍生文库可包括：从一个或多个回收的克隆分离供体DNA；向DNA中引入突变以提供编码第二结合物组库的供体DNA分子的衍生群体；以及将供体DNA分子的衍生物群体引入细胞中以生成含有编码第二结合物组库的DNA的细胞的衍生文库。
供体DNA的分离可涉及获得和/或鉴定来自克隆的DNA。此类方法可包括例如通过PCR从回收的克隆扩增编码结合物的DNA，以及引入突变。可以对DNA进行测序并合成突变的DNA。
或者，可通过诱导克隆内的DNA突变来将突变引入一个或多个回收的克隆中的供体DNA中。由此可以从一个或多个克隆产生衍生文库，而不需要分离DNA，例如通过鸟类DT40细胞中的内源性突变。
抗体展示本身特别适用于生成衍生文库。一旦分离了抗体基因，就有可能使用多种诱变方法(例如，易错PCR、寡核苷酸定向诱变，链改组)来生成相关克隆的展示文库，可从所述展示文库中选择改进的变体。例如，通过使用链改组，可将编码所选VH克隆群体、寡克隆混合物或群体的DNA亚克隆入编码合适抗体形式并且编码VL链的适当格式化组库的载体中[118]。替代地并且此外使用VH的实例，可以将VH克隆、寡克隆混合物或群体引入真核细胞群中，所述真核细胞编码和表达适当格式化的轻链配偶体(例如，用于与形式为IgG或Fab的重链缔合的VL-CL链)的群体。VH群体可以来自上述来源中的任何一种，所述来源包括经免疫的动物的B细胞或者来自所选噬菌体群体的scFv基因。在后一实例中，将所选的VH克隆到轻链组库中可在一个步骤中组合链改组和重新格式化(例如，重新格式化成IgG形式)。
在真核细胞上展示的特定优点是控制选择/筛选步骤的严格性的能力。通过降低抗原浓度，可以将表达最高亲和力结合物的细胞与群体内的低亲和力克隆区分开。使用流式细胞术的亲和力成熟过程的可视化和定量化是真核展示的主要益处，因为其给出了对原始文库中阳性百分比的先行指示并且允许在分选期间在所选克隆的亲和力和亲本群体之间进行直接比较。分选后，可以通过与一系列抗原浓度预温育并用流式细胞术或用均相时间分辨荧光(TRF)测定或使用表面等离子体共振(SPR)(Biacore公司)进行分析来测定个别克隆的亲和力。
文库的特征和形式
本发明使得能够构建具有许多有利特征的真核细胞文库。本发明提供具有以下特征中的任意一个或多个特征的文库：
多样性。文库可以编码和/或表达至少100、103、104、105、106、107、108或109种不同的结合物。
均匀整合。文库可以由含有整合在细胞DNA中的一个固定基因座或有限数目的固定基因座处的供体DNA的克隆组成。因此文库中的每个克隆在一个固定基因座或多个固定基因座中的至少一个固定基因座处含有供体DNA。优选地，克隆含有整合在细胞DNA中的一个或两个固定基因座处的供体DNA。如在本文其它地方所解释的，整合位点位于位点特异性核酸酶的识别序列上。整合供体DNA以产生重组DNA在本文其它地方详述并且可以根据整合位点的数目产生不同的结果。在用于生成文库的细胞中存在单一潜在整合位点的情况下，文库将是含有整合在单一固定基因座处的供体DNA的克隆的文库。文库中的所有克隆因此在细胞DNA中的相同位置处含有结合物基因。或者，在存在多个潜在整合位点的情况下，文库可以是含有整合在多个和/或不同固定基因座处的供体DNA的克隆的文库。优选地，文库中的每个克隆含有整合在第一固定基因座和/或第二固定基因座处的供体DNA。例如，文库可包含其中供体DNA整合在第一固定基因座处的克隆，其中供体DNA整合在第二固定基因座处的克隆，以及其中供体DNA整合在第一固定基因座和第二固定基因座两者处的克隆。在优选的实施方案中，文库中的克隆中仅存在一个或两个固定基因座，但是对于特定应用，如果需要的话，可以在多个基因座处整合供体DNA。因此，在一些文库中，每个克隆可以含有整合在若干固定基因座中的任意一个或多个固定基因座(例如，三个、四个、五个或六个固定基因座)处的供体DNA。
对于含有整合在单独位点处的多个结合物亚基的文库，文库中的克隆可含有编码整合在第一固定基因座处的第一结合物亚基的DNA和编码整合在第二固定基因座处的第二结合物亚基的DNA，其中克隆表达包含所述第一亚基和第二亚基的多聚体结合物。
均匀转录。由于供体DNA整合在受控数目的基因座处并且整合在不同克隆中的相同基因座(固定基因座)处，所以文库中不同克隆之间的结合物的相对转录水平保持在受控限度内。结合物基因的相对均匀转录导致在文库中的克隆上或者从文库中的克隆进行结合物的相当大水平的表达。在文库中细胞表面上展示的结合物可以与在相同细胞上展示的其它结合物相同(具有相同的氨基酸序列)。文库可由细胞克隆组成，每个克隆展示结合物组库的单个成员；或者由展示每个细胞的结合物组库的多个成员的克隆组成。或者，文库可以包含一些展示结合物组库的单个成员的克隆，以及一些展示结合物组库的多个成员(例如，两个成员)的克隆。优选地，文库中的克隆表达结合物组库的一个或两个成员。
例如，根据本发明的真核细胞克隆文库可以表达至少103、104、105、106、107、108或109种不同结合物(例如IgG、Fab、scFv或scFv-Fc抗体片段)的组库，每个细胞含有整合在细胞DNA中固定基因座处的供体DNA。供体DNA编码结合物并且可进一步包含用于选择供体DNA整合在其中的固定基因座处的细胞的遗传元件。文库中的细胞可以含有编码外源位点特异性核酸酶的DNA。
根据本发明的文库的这些和其它特征在本文其它地方进一步描述。
本发明扩展至以纯系形式、作为不存在其它真核细胞的文库克隆群体的文库，或与其它真核细胞混合的文库。其它细胞可以是相同类型(例如，相同的细胞系)的真核细胞或不同的细胞。通过将根据本发明的两个或更多个文库组合或者将根据本发明的一个文库与第二文库或第二细胞群组合以促进或扩展筛选，或用于如本文所述或者对于本领域的技术人员将显而易见的其它用途，可获得其它优点。
可以在细胞培养基中提供根据本发明的文库，从所述文库获得的一个或多个克隆，或已经引入来自所述文库的编码结合物的DNA的宿主细胞。所述细胞可经培养以及然后浓缩，以形成便于运输或储藏的细胞沉淀。
文库通常在体外提供。文库可以在含有悬浮在培养基中的文库细胞的容器(例如细胞培养烧瓶)中，或者在包含文库的真核细胞的沉淀或浓缩悬液的容器中。文库可以占容器中真核细胞的至少75％、80％、85％或90％。
附图简述
现将参考附图来更详细地描述本发明的实施方案，附图如下：
图1.用于表达IgG形式抗体的载体
a.pDUAL D1.3，用于IgG分泌的双启动子表达载体(在“pCMV/myc/ER”载体骨架中)
b.plNT3-D1.3，用于IgG分泌的双启动子表达载体(在“pSF-CMV-f1-Pac1”载体骨架中)
c.pCMV/myc/ER载体骨架。ECoR1位点在CMV启动子前面。BstB1位点和BstZ171位点在SV40多聚腺苷酸位点的侧翼。
d.pSF-CMV-f1-Pac1载体骨架(Oxford Genetics)
e.具有编码PDGFR跨膜区的外显子(TM)和引起分泌的外显子(sec)的合成基因。实心箭头表示Rox重组位点。
图2.pD1的序列(SEQ ID NO:1、2、3、4和5)：用于表面表达的双启动子抗体表达盒。
特征物：
pEF启动子13-1180
BM40前导序列1193-1249
人源化D1.3VL 1250-1578
人Cκ1577-1891BGH多聚腺苷酸1916-2130
CMV启动子2146-2734
含有内含子32832-3414的小鼠VH前导序列
人源化D1.3 VH 3419-3769
优化的人IgG2 CH1-CH3
图3.AAVS供体质粒(pD2)的构建体
a.人AAVS基因座的图示。AAVS基因座(编码蛋白磷酸酶1，调节亚基12C，PPP1R12C)的外显子1和外显子2由4428bp的内含子分隔。剪接在框架“0”中，即剪接在来自每个外显子的2个完整密码子之间发生。TALEN和CRISPR/Cas9构建体可用于在此内含子内裂解。线下方的阴影区表示此裂解位点左右的区域，所述左右的区域在载体构建体内用于驱动同源重组进入此基因座(AAVS左同源臂“左HA”和AAVS右同源臂(“右HA”)。
b.编码供体质粒pD2的抗体的图示。左同源臂和右同源臂示出于构建体图示的末端处。合成的杀稻瘟菌素基因前面是剪接受体，所述剪接受体产生与AAVS外显子1的“框内”融合。还示出了由分别由pEF启动子和CMV启动子驱动的D1.3轻链和D1.3IgG2重链组成的抗体表达盒。
c.供体构建体pD1-huD1.3的序列(SEQ ID NO:6、7和8)。AAVS同源臂示出为加下划线和加粗的。为简洁起见，未详细示出抗体盒(先前在图2中示出)。在克隆中使用的限制性位点示出为加粗的。示出了质粒骨架直到氨苄青霉素抗性基因的序列。
图4.IgG在细胞表面上的表达
a,c.在FL3通道中使用前向散射和染色对活细胞进行分析(a，c)。排除对FL3通道中染色阳性的细胞(表示摄取7-AAD的死亡细胞)。在不存在(a，b)或存在(c，d)AAVS TALEN的情况下用pD2-D1.3转染所有细胞，并用抗-Fc抗体染色。
图5.细胞表面上抗原的抗体结合。基于对7AAD的前向散射和遮蔽选择存活细胞(a)。将细胞与荧光标记的鸡卵溶菌酶一起温育(b)。
图6.TALEN定向的基因组裂解对杀稻瘟菌素抗性基因整合的影响。本图示出了在所述条件下的菌落数。
图7.对pD2-D1.3供体质粒整合入AAVS基因座的分析。
转染后，用杀稻瘟菌素选择细胞并制备基因组DNA。样品1-9受益于添加AAVS引导的TALE核酸酶，样品10-11来自在不存在TALE核酸酶的情况下由转染的细胞产生的克隆。通过PCR进行的基因组DNA分析如文字所述。a.从整合位点的5'末端验证。B.从整合位点的3'末端验证。
图8.scFv-Fc表达载体pD6的构建
a.将格式化为scFv的抗体克隆到Nco1/Not1位点中以产生与IgG2的人Fc区的“框内”融合。
b.pD6的从Nco1位点到Pme1位点的序列(SEQ ID NO:9、10和11)。
图9.从细胞表面scFv-Fc文库(来自所选的噬菌体群体)选择结合物。对细胞的流式细胞术分析显示具有：
a-c.通过对CD229进行2轮噬菌体展示选择获得的整合的抗CD229sFv-Fc群体
d.f通过针对β-半乳糖苷酶进行1轮噬菌体展示选择获得的经整合的抗β-半乳糖苷酶sFv-Fc群体(β-galR 1细胞)
e.通过针对β半乳糖苷酶进行2轮噬菌体展示选择获得的经整合的抗β-半乳糖苷酶sFv-Fc群体
样品(a)示出未染色的细胞，并且其余样品用人抗Fc-藻红蛋白(在FL2中)和100nM合适的生物素化抗原/链霉亲和素FITC(在FL1中)染色。13天后分析细胞(a，b，d，e)。实施例c和f示出染色20天后的细胞，并且标记区域示出通过流式细胞术收集的细胞
h.通过流式细胞术选择的β-galR1细胞(图6f)生长22天，并重新分析scFv-Fc表达和抗原结合(使用100nM抗原)，g.示出未染色的等效物。
j.示出来自原始群体(如在d中所示)、在转染(j)后已经生长42天的未分选的β-galR1细胞。示出了每个群体中的未标记细胞以用于比较(g，i)
图10.IgG形式文库的哺乳动物展示和分选。
使用1或2轮噬菌体展示针对β-半乳糖苷酶选择抗体群体，将所述抗体群体重新格式化为IgG，以及通过核酸酶定向整合而靶向到HEK293细胞的AAVS基因座中。图a、图b示出源自第1轮噬菌体展示的细胞群体，其中a是未分选的(在生长38天后)或者b是通过流式细胞术分选并生长19天的。图c、d示出来源于第2轮噬菌体展示的细胞群体，其中c是未分选的(在生长38天后，或者d是分选并生长19天后的。
图11.构建大型原始scFv-Fc文库，并且结合物的选择如前所述，通过如前所述用500nM生物素化抗原和链霉亲和素-FITC以及藻红蛋白标记的抗Fc抗体染色来从原始scFv-Fc文库中选择结合物细胞。区域示出通过流式分选选择的细胞。样品通过用以下生物素化的物质进行标记：
a.CD28
b.β-半乳糖苷酶
c.甲状腺球蛋白
d.EphB4
图12.靶向载体以引入含有“多个着陆”位点的内含子，以用于与整合方法进行比较。
a.中间GFP表达质粒(pD3)
b.AAVS1_定向靶向载体(pD4)。“着陆位点”包含用于引导整合的元件，所述元件为FRT、lox 2272、I-Sce1大范围核酸酶和GFP TALEN
在将pD4整合入AAVS基因座后，在基因组内存在多个重组或核酸酶裂解位点。引入的pD5质粒(图15)具有与存在于“着陆位点”任一侧的序列等效的左同源臂和右同源臂，以通过同源重组驱动抗体插入。
图13.pD4的序列(SEQ ID NO:12、13、14、15、16、17和18)。
序列特征物包括：
AAVS左同源19-822
FRT位点832-879，Lox 2272位点884-917，I-Sce1大范围核酸酶位点933-950
GFP左TALEN结合954-968，GFP右TALEN结合984-997
T2A 1041-1103
GFP 1104-1949
PGK启动子2178-2691
嘌呤霉素δ胸苷激酶2706-4307
loxP 4634-4667
AAVS右同源4692-5528
图14.对克隆6F中整合“多个着陆位点”内含子的验证。
转染后，用嘌呤霉素选择细胞并制备基因组DNA。样品1表示全部的所选群体。样品2表示克隆6F，样品3是在不存在TALEN的情况下转染的克隆，而样品4是野生型HEK293细胞。以文字描述的引物和条件用于通过PCR验证在基因组插入的5'末端和3'末端处的正确整合。观察到所选克隆(6F)以及所选群体的主要(正确大小)条带。
图15.用于整合进Flp/GFP TALEN位点的供体质粒(pD5)的序列(SEQ ID NO:19、20和21)。特征物包括：
AAVS HA 13-233
FRT位点243-290
Lox2272 295-328
I-Sce1 344-361
杀稻瘟菌素抗性基因417-818
多聚腺苷酸832-1070
图16.I-Sce1大范围核酸酶构建体的序列(SEQ ID NO:22和23)
图17.流式细胞术分析，用于比较使用I-Sce1大范围核酸酶与使用重组酶进行的核酸酶定向整合。
将克隆6F的细胞用pD5-D1.3和编码所指示的核酸酶/重组酶的质粒共转染。在使用生物素化的抗人Fc抗体和链霉亲和素藻红蛋白转染3天后，用杀稻瘟菌素选择细胞并分析细胞。指示出了阳性细胞的百分比(也汇总于表5中)，a是未转染的，b仅为供体，c是I-Sce1，d是eGFP TALEN，e是Cre，f是Flp重组酶(由pOG44质粒编码)。
图18.核酸酶定向整合驱动同源重组和“非同源末端接合”(NHEJ)。
a.用于靶向“克隆6F细胞的内含子中的多个“着陆位点”的质粒pD5的结构图示，示出了引物J48的位置。此质粒中的“着陆位点”包括FRT位点，lox2272位点和I-Sce1大范围核酸酶位点(但不含GFP TALEN位点)。
b.克隆6F内的整合位点(来源于pD4)的图示，示出了引物J44的位置。“着陆位点”包含用于指导整合的元件，所述元件为FRT、lox2272、I-Sce1大范围核酸酶和GFP TALEN。
c.pD5的同源重组后克隆6F的整合位点的图示，示出了引物J44和J48的位置。
d.pD5的NHEJ或Flp重组后克隆6F的整合位点的图示，示出了引物J44、J46和反向引物J44的位置。双向箭头表示通过NHEJ或Flop定向的整合并入“额外的”质粒来源的DNA。应注意的是，在此实例中，引入的质粒DNA(pD5)具有同源臂(其指导同源重组，但对于NHEJ不是必需的)。这些序列在用NHEJ整合后保留，导致同源臂内表示的序列复制，其中一对在这种情况下来自质粒，另一对表示内源基因组序列。为了简单起见，未示出质粒编码的同源臂，仅示出了它们在基因组内的等效序列。
e.引物44和48用作样品i-iv的PCR引物，其中使用来自用以下核酸酶/整合酶转染的细胞的基因组DNA：
i.Sce1，ii.TALEN(GFP)，iii.Flp(pOG44)，iv.仅供体。分子量标准是“GeneRuler1kb梯形条带(New England Biolabs)。引物J44和J48显示经核酸酶裂解的样品i和ii中已发生同源重组，产生了1928bp的条带(由箭头指示)。
引物44和46用于样品v-viii，其中使用来自以下样品的基因组DNA。v.Sce1，vi.TALEN(GFP)，vii.Flp(pOG44)，viii.仅供体。
引物J44和J46显示用I-Sce1大范围核酸酶裂解供体和基因组DNA已经导致NHEJ(样品v.)，产生了1800bp的条带(由箭头指示)。如预期的，通过Flp介导的整合(vii)获得了相似大小的条带。使用GFP TALEN时未发生NHEJ，这是因为在引入的质粒中没有裂解位点。
图19.将IgG抗体分泌到培养上清液中。
a.用蛋白A从培养上清液中纯化出的IgG的经考马斯染色的凝胶。
i.从未用Dre重组酶基因转染的pD2-D1.3细胞的上清液中纯化出的IgG。
ii.从用Dre重组酶基因转染的pD2-D1.3细胞的上清液中纯化出的IgG。对所分泌抗体进行多克隆ELISA。从图9H所示的实验中分选出的细胞(最初来自通过1轮噬菌体展示选出的抗体群体细胞)在分选后生长7天，然后收集培养上清液。用β-半乳糖苷酶(10ug/ml)或BSA(10ug/ml)包被ELISA板过夜。在与33％体积的6％Marvel-PBS混合后，将培养上清液稀释至66％(这在上文描述为“纯”样品)。还将上清液在PBS中稀释1/10，然后以相同的方式与6％MBPS混合。使用抗人IgG-Eu(Perkin Elmer，目录号1244-330)进行对结合的scFv-Fc融合体的检测。
图20.用于将所选scFv群转化为IgG形式的DNA片段的制备。(a)生成CL-pA-CMV-Sigp DNA插入物(如图21b所示)。用引物2595和2597从质粒pD2进行PCR扩增，然后进行凝胶纯化。泳道m，Generuler 1kb梯形条带(Thermo，SM031D)，泳道1是CL-pA-CMV-Sigp DNA插入物。(b)如实施例6中所描述scFv DNA插入物的生成。泳道m，Generuler 1kb梯形条带(Thermo，SM031D)，泳道1是空白对照，泳道2是经纯化的scFv，泳道3β-半乳糖苷酶的第1轮输出scFv群体，泳道4是β-半乳糖苷酶的第2轮输出scFv群体，泳道5是CD229的第2轮输出scFv群体。(c)经Nhel和Xhol消化的“微环”DNA的纯化。将在经Ncol/Notl消化的编码scFv的DNA(图21，插入物a)与编码用于形成“微环”DNA(图21c)的恒定轻(CL)链、多聚腺苷酸(pA)、CMV启动子和信号肽(图21，插入物b)的DNA之间的连接用离心柱纯化，用Nhel和Xhol消化，然后用1％琼脂糖凝胶纯化。泳道m，Generuler 1kb梯形条带(Thermo，SM031D)，泳道1是β-半乳糖苷酶第1轮输出，泳道2是β-半乳糖苷酶第2输出，泳道3是CD229第2轮输出。在如箭头所指示的2.6kb处切开线性化产物，然后进行纯化。
图21.从scFv到IgG形式的转化过程的示意图。将编码抗体VH结构域和VL结构域的DNA插入物(a)与编码恒定轻(CL)链、多腺苷酸化序列(pA)巨细胞病毒(CMV)启动子和信号肽(SigP)的DNA片段(b)连接。通过“粘性末端”连接来促进DNA分子a和b接合产生非复制型DNA“微环”。连接后，用限制酶Nhel和Xhol线性化“微环”c。然后纯化线性化产物d，并与经消化的载体e连接。载体e包含位于Nhel位点上游的pEF启动子和SigP序列，并且编码Xhol位点下游的抗体恒定重(CH)结构域1至3。插入物d与载体e连接的产物将产生质粒f，质粒f可用于转化细菌并与合适的选择性标记进行生长，这将允许通过标准方法生产和纯化质粒DNA。可以将经纯化的质粒f引入哺乳动物细胞中[134]以用于异源Ig抗体表达。或者，编码载体e中CH1-3的DNA可以用编码单一CH1结构域的DNA替代，以用于Fab表达。VH和VL分别是抗体可变重链和轻链。示出了编码延长因子启动子(pEF)抗体恒定轻链(CL)和恒定重结构域1至3(CH1-3)、聚腺苷酸化序列(pA)巨细胞病毒(CMV)启动子和信号肽(SigP)的DNA。
图22.将scFv转化为IgG所需的DNA片段的另外制备实施例，(a)将如实施例14中所述产生的scFv插入物在1％琼脂糖TBE凝胶上分离。泳道1和泳道14是在500bp处开始的500bp DNA梯形条带。泳道2至13是scFv PCR。(b)通过在1％琼脂糖TBE凝胶上分离进行线性化“微环”d(图21)的纯化。从左到右，第一泳道是DNA梯形条带(1kb梯形条带，LifeTech，15615-024)，剩余泳道是线性化“微环”d。(c)与(b)相同，区别为CMV启动子由P2A序列取代，并且所采用的DNA梯形条带是Generuler 1kb梯形条带(Thermo，SM031D)。
图23.使用流式电穿孔系统进行的结合物基因的核酸酶定向整合。
使用流式电穿孔系统将编码抗FGFR1或FGFR2抗体的50:50混合pD6质粒电穿孔。13天后，用Dyelight-633标记的FGFR1-Fc(FGFR1-Dy 633)或用Dylight 488标记的FGFR2-Fc(FGFR2-Dy 488)标记杀稻瘟菌素选出的细胞。斑点印迹表示：
a.单染色FGFR2-488(来自表7的样品1b)
b.单染色FGFR1-633(来自表7的样品1b)
c.双重染色FGFR1-633/FGFR2-488(来自表7的样品1b)
d.双重染色FGFR1-633/FGFR2-488(来自表7的样品3)
图24.流式分选后抗体基因的回收。
通过一轮噬菌体展示选择抗体群体，并通过使用Maxcyte系统的流式电穿孔建立哺乳动物展示文库。使用1nM或10nM抗原分选细胞，并直接分离mRNA。通过PCR回收抗体基因，克隆到细菌表达载体中，并测定ELISA阳性的比例(“1nM输出”，“10nM输出”)。将此与原始第1轮输出(“R1噬菌体输出”)进行比较。曲线图示出了用每个群体获得的ELISA信号的分布图。每个群体的ELISA信号
图25.用于表达T细胞受体的plNT20载体。
a.双启动子质粒plNT20的图示，示出了AAVS同源臂、嘌呤霉素选择性基因(具有下文所示的剪接受体位点周围的区域)。α链(包括可变α，小鼠α恒定CD3ζ)的侧翼为Nhe1、Not1和Acc65l限制性位点，并处于pEF启动子的控制下。β链(包括可变β，小鼠β恒定CD3ζ)的侧翼为Nco1、Xho1和hind3位点，并处于CMV启动子的控制之下。
b.剪接受体处的序列和嘌呤霉素基因起始处(SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:25)
c.T细胞受体克隆c12/c2α链构建体的序列，示出了Nhe1、Not1和Acc65l限制性位点(SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:27)。
d.T细胞受体克隆c12/c2β链构建体的序列，示出了Nco1、Xho1和Hind3限制性位点(SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:29)。
e.T细胞受体克隆4JFHα链构建体的序列，示出了Nhe1/Not1限制性位点(SEQ IDNO:30和SEQ ID NO:31)。
f.T细胞受体克隆4JFHβ链构建体的序列，示出了Nco1/Xho1限制性位点(SEQ IDNO:32和SEQ ID NO:33)。
g.用于突变c12/c2 TCR α链的CDR3的策略和引物(SEQ ID NO:34、35、36和37)。
h.用于突变c12/c2 TCR β链的CDR3的策略和引物(SEQ ID NO:38、39、40和41)。
(N＝A，C，G，T；S＝C或G；W＝A或T)
图26.用通过核酸酶定向整合引入哺乳动物细胞中的T细胞受体来识别肽；MHC复合物。
TCR1是与藻红蛋白标记的HLA-A2的复合物形式的TCR c12/c2识别肽1(SLLMWITQV)(肽1)。TCR2是与藻红蛋白标记的HLA-A2的复合物形式的TCR 4JFH识别肽2(ELAGIGILTV)(肽2)。样品a和c显示表达暴露于肽1(a)或肽2(c)的TCR1的细胞。样品b和d显示表达暴露于肽1(a)或肽2(c)的TCR2的细胞。
样品e和f显示用肽1(e)或肽2(f)标记的未转染的HEK293细胞。
g.将编码TCR1的质粒与100倍过量的TCR2质粒混合，然后通过核酸酶定向整合引入HEK细胞中。其中1.15％的细胞被用肽1标记。1.15％的细胞是阳性的。
h.将编码TCR2的质粒与100倍过量的TCR1质粒混合，然后通过核酸酶定向整合引入并用肽2标记。0.62％的细胞被标记。通过流式分选收集阳性细胞并回收mRNA以分析特异性TCR富集。
样品i-l说明了HEK293细胞中T细胞文库的表达。通过Maxcyte电穿孔引入TCR文库，并在嘌呤霉素中选择11天。
I.示出用APC标记的抗TCR抗体标记的细胞(y轴)。
j.示出用藻红蛋白标记的肽1:MHC标记的细胞(x轴)
k.示出用抗TCR抗体和肽1:MHC标记的未转染细胞
l.示出用抗TCR抗体和肽1:MHC两者标记、经TCR1文库转染的细胞样品m-n说明TCR在Jurkat细胞中的表达。通过Amaxa电穿孔递送TCR1，并在嘌呤霉素中选择25天。在存在(m)或不存在(n)TALE核酸酶的情况下转染质粒，并与APC标记的抗TCRβ链抗体一起温育。样品o-r说明相同经TCR1转染的Jurkat细胞中的T细胞受体激活。所有细胞用抗CD69抗体标记(y轴)。样品o未经刺激，而样品p用抗CD3抗体刺激24小时。将样品q和r分别与2ul和6ul PE标记的MHC:肽1一起温育24小时。还将所有细胞暴露于CD28抗体。
图27.用于将嵌合抗原受体(CAR)文库引入人细胞的plNT21 CAR1和plNT21 CAR2载体。
单启动子质粒plNT21的图示，示出了AAVS同源臂、嘌呤霉素选择性基因、驱动结合物融合到CD3ζ信号传导结构域的CMV启动子。
Nco1和Not1位点适用于克隆结合物。
a.plNT21 CAR1将结合物融合到CD3ζ的近膜、跨膜和信号传导结构域。
b.plNT21 CAR2将结合物融合至CD8铰链和跨膜结构域、4-1BB激活结构域和CD3ζ激活结构域
c.plNT21_CAR1中的CD3ζ的序列(SEQ ID NO:42、43和44)
d.plNT21_CAR2中CD8、4-1BB和CD3ζ的序列(SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46)
e.FMC63H-L(抗CD19抗体)的序列(SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:48)
图28是通过核酸酶介导的整合而引入人细胞中的嵌合抗原受体构建体内scFv和替代骨架的表达。
HEK细胞用抗-FGFR1抗体(b)或lox1adhiron(c)转染，并分别用经标记的FGFR1和lox1标记。作为对照，将相同的抗原与未转染的HEK293细胞一起温育(分别为a和c)。
将来自针对间皮素和CD229选择的噬菌体展示文库的群体通过核酸酶介导的整合引入HEK细胞(分别为f和h)，然后在嘌呤霉素中选择11天。将这些细胞或未转染的HEK293细胞与经标记的间皮素(e，f)或经标记的CD229(g，h)一起温育。e和h表示未转染的HEK293细胞。
图29.用于不同结合物形式的哺乳动物展示文库的替代性结合物骨架的序列可使用本文所述的载体、通过核酸酶定向整合而容易地引入。例如，制备具有侧翼Nco1和Not 1位点的Adhiron构建体，以用于引入到CAR构建体或Fc融合构建体中。
a.lox1结合Adhiron_lox1A的序列(SEQ ID NO:49和SEQ ID NO:50)
b.lox1结合Adhiron_lox1B的序列(SEQ ID NO:51和SEQ ID NO:52)
(可变环在蛋白质序列上示出为加粗和加下划线)。
c.用于构建环1(adhiron mut1)(SEQ ID NO:53、55和56)或环2(adhiron mut2)(SEQ ID NO:54、57和58)内的结合物文库的潜在诱变引物，
下面是被引物(下链)覆盖的区域的图示，示出了蛋白质翻译。n表示导致不同环长度的NNS密码子的可变数目。
d.具有允许在本文所述载体内进行Knottin表达的侧翼Nco1和Not1位点的胰蛋白酶结合knottin MCoTI-ll的序列。第一环的序列是加下划线的SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60)。
e.用于建立Knottin突变体文库的策略。在此实例中，环1被10个随机氨基酸取代。在此实例中，引入VNS密码子(V＝A、C或G)，从而提供编码17个氨基酸的24个密码子。可以使用标准方法将此序列引入编码MCoTI-ll的克隆中(SEQ ID NO:61、62和63)。
图30.用于通过连接或微同源序列介导的末端接合(MMEJ)进行核酸酶介导的抗体基因插入的示例性序列。
a.pD7-Sce1(核苷酸1-120)的序列(SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65)。所述序列如同pD6(参见图3c、图8)，例外是EcoR1和Nsi1之间的AAVS左臂已用I-Sce1大范围核酸酶识别(粗体)替代。此外，Asc1和Mlu1之间的AAVS右臂已经用由引物2723和2734(未示出)编码的插入物取代。
b.pD7-ObLiGaRe(核苷酸1-120)的序列(SEQ ID NO:66、67)。所述序列如同pD6(参见图3c、图8)，例外是EcoR1和Nsi1之间的AAVS左臂已用AAVS TALE右臂和左臂识别位点替代。此外，Asc1和Mlu1之间的AAVS右臂已经用由引物2723和2734(未示出)编码的插入物取代。
图31.核酸酶定向的结合物到ROSA 26基因座中的整合。
a.示出了左同源臂直至嘌呤霉素基因起始处的序列，示出了实施例22中提及的引物和限制性位点(SEQ ID NO:68)。
b.用于到ROSA 26基因座中的核酸酶定向整合的右同源臂的序列，示出了实施例22中提及的引物和限制性位点(SEQ ID NO:69)。
实施例
实施例1.用于表达IgG格式化抗体的载体的构建
为了实现对结合物(例如，抗体、蛋白质或肽)的遗传选择，必需用外源启动子或通过将转基因定向整合到预先存在于细胞DNA中的启动子(例如，内源启动子)下游，来引入编码这种结合物的基因并驱动这种基因表达。抗体表示最常用的结合物类型，并且它们可经格式化以用于以不同形式表达。在下文的实施例中，我们描述了其中scFv与Fc结构域融合(scFv-Fc)的单基因形式的表达。我们还例示了格式化为人IgG2分子的抗体的表达。为了在分泌细胞如高等真核生物中表达IgG或FA格式化的抗体，需要表达个别的重链和轻链。此举可以通过引入编码每条链的单独质粒或通过将各链引入单个质粒上来完成。在单个质粒内，可以从多顺反子单mRNA表达2条链。从单个信使RNA表达不同蛋白质需要诸如内部核糖体进入(IRE)序列的元件，所述元件使得翻译能够在次级下游位置启动。或者，可以使用促进翻译停止/重新启动的序列元件，诸如病毒2A序列[119]。
或者，可以使用多种启动子从单个质粒表达多种不同的蛋白质。图1a和图1b示出了在不同载体骨架(pDUAL和pINT3)内的2个相似表达盒的构成，所述表达盒被开发用于表达所分泌的IgG格式化抗体。这些表达盒使用标准元件(例如，启动子和多聚腺苷酸序列)的基因合成和聚合酶链式反应扩增而建立。在pCMV/myc/ER(图1c，Life Technologies)内建立用于表达抗体重链(pBIOCAM1-NewNot)和轻链(pBIOCAM2-pEF)的第一单独质粒。将来自pBIOCAM2-pEF的元件(包括pEF启动子、轻链基因和多聚腺苷酸位点)克隆到pBIOCAM1-NewNot)中以产生pDUAL。所示出的实例包含来自称为D1.3[120]的人源化抗溶菌酶抗体的VH结构域和VL结构域，并且被称为pDUAL-D1.3和plNT3-D1.3。图1a中所示的pDUAL D1.3的元件存在于来自pCMV/myc/ER(Life Technologies，目录号V82320，图1c)的质粒骨架的EcoR1和BGH多聚腺苷酸位点之间。
以类似的方式，将单独的轻链盒和重链盒分别引入pSF-pEF(Oxford Genetics，OG43)和pSF-CMV-F1-Pac1(Oxford Genetics，OG111)中以产生plNT1和plNT2。通过在plNT2中CMV启动子上游克隆轻链盒(包含pEF启动子、轻链基因和多聚腺苷酸位点)来组合这些元件，以产生plNT3。将图1b中所示的plNT3-D1.3的元件克隆到质粒pSF-CMV-F1-Pac1(图1d，Oxford Genetics，OG111)内示出的第一Bgl2和Sbf1之间。
巨细胞病毒的立即早期启动子(CMV启动子)是强启动子并且用于驱动重链的表达。pDUAL D1.3还包含紧接CMV启动子的下游的腺病毒2三联体前导序列(TPL)和增强的主要晚期启动子(enh MLP)[121]。延长因子-1α蛋白在大多数真核细胞中普遍和丰富地表达，并且其启动子(pEF启动子)通常用于驱动转基因表达[122]。在pDUAL-D1.3和plNT3-D1.3中，pEF启动子用于驱动抗体轻链表达。源于牛生长激素的多聚腺苷酸化位点(BGH多聚腺苷酸)存在于每个表达盒的末端。
单独的重链和轻链在内质网(和最终培养上清液)中的分泌由2种不同的前导序列指导。轻链分泌由BM40前导序列指导[123]。前导序列之后是Nhe1和Not1克隆位点，所述克隆位点允许框内克隆VL基因，所述VL基因继而融合至人Cκ基因。重链的分泌由用源自小鼠VH基因的内含子(如在pCMV/myc/ER中发现的)断裂的前导序列指导。前导序列后面是Nco1位点和Xho1位点，所述位点允许框内克隆抗体VH基因，Nco1位点和Xho1位点后面是密码子优化的IgG2基因。将人源化D1.3抗体[120]的VL基因和VH基因分别克隆到pDUAL-D1.3和plNT3-D1.3中的Nhe1/Not1位点和Nco1/Xho1位点中。
建立这些质粒的膜锚定形式以用于哺乳动物展示。质粒pD1是通过用Bsu36I(其在IgG2重链基因的CH3结构域中切割)和用BstZ171(其在新霉素抗性盒的SV40多聚腺苷酸区域之后的骨架中切割)消化pDUAL-D1.3而产生的(图1c)。这由此去除了CH3结构域的大部分和整个新霉素表达盒。CH3结构域被具有相容的Bsu36I和BstZ171末端的合成插入物取代(如图1e所示)。设计合成插入物以用剪接供体和内含子取代抗体CH3结构域末端的终止密码子，这导致CH3末端剪接至编码人PDGF受体跨膜结构域[84]前5个胞内残基的外显子、终止密码子和另外的剪接供体。这之后是另外的内含子和剪接受体，接着是单个氨基酸的密码子，然后是终止密码子(图1e)。在编码跨膜结构域的外显子侧翼的2个合成内含子设计为具有位于其内的ROX识别位点。用Dre重组酶识别ROX位点，以导致含有这些位点的DNA之间的重组[88]。在编码跨膜结构域的外显子侧翼并入2个ROX位点创造了通过转染编码Rox重组酶的基因来去除此外显子的可能性。预期这将产生分泌的抗体产物。
图2示出了所得到的表达人源化D1.3抗溶菌酶抗体的双启动子抗体表达质粒的序列(以下称为pD1-D1.3(SEQ ID NO:1)。抗溶菌酶结合特异性通过在Nco/Xho1限制性位点和Nhe1/Not1限制性位点之间分别纳入来自D1.3[120]的VH序列和VL序列并入。示出了从ECoR1位点到BstZ171的序列。ECoR1和BstZ171位点以外的序列来自如图1c所示的载体骨架。
实施例2.用于将抗体盒靶向AAVS基因座的载体(pD2)的构建
使用位点特异性核酸酶在基因组内裂解，以通过同源重组或非同源末端接合(NHEJ)来促进异源DNA的插入。用靶向蛋白磷酸酶1调节亚基12C(PPP1R12C)基因的第一内含子的核酸酶裂解人HEK293细胞。此基因座被鉴定为腺相关病毒的共同整合位点，并且称为AAVS位点(图3a)。AAVS位点被认为是用于在人细胞中插入和表达异源基因的“安全港”基因座[124]。
在基因组内的位点特异性裂解后，可以使用同源重组来促进蛋白质表达盒的整合。为此，需要使表达盒与在基因组裂解位点的任一侧上发现的序列同源的区域侧接。为了定向整合到AAVS基因座中，将AAVS基因座的5'到预期裂解位点的804bp区段PCR扩增，以分别在5'末端和3'末端产生EcoR1和Mfe1位点。将代表用于靶向抗体盒的左同源臂的此产物克隆到pD1的EcoR1位点中，以在5'末端重新产生EcoR1位点。关于右同源臂，将AAVS基因座中在裂解位点3'末端的836bp部分进行PCR扩增以在每个末端产生Bstz171位点，并将此右同源臂克隆到pD1的Bstz 171中。所述构建体在图3b中示出，并且所得构建体(pD2)的序列在图3c中示出。
在AAVS的克隆过程中，还在3'末端处插入了左同源臂Nsi1和Pac1限制性位点。这些位点随后用于克隆合成内含子，合成内含子之后是带有多聚腺苷酸位点的杀稻瘟菌素基因。杀稻瘟菌素基因没有启动子，但其前面是剪接受体位点，剪接受体位点造成与来自AAVS基因座的上游外显子的框内融合(图3a，图3b)。整合到AAVS基因座中导致无启动子的杀稻瘟菌素基因被表达。称为pD2的此最终构建体的序列示出于图3c中(。
包含pEF启动子、D1.3轻链、多聚腺苷酸区、CMV启动子、D1.3重链，可变剪接位点和多聚腺苷酸位点的抗体盒的序列示出于图2中。为了避免重复，此序列在图3c中被表示为标记为“D1.3抗体表达盒”的方框。
实施例3.用于细胞表面抗体表达和抗原结合的IgG构建体的AAVS TALEN定向的整 合
在存在或不存在AAVS定向的TALEN载体对的情况下，用pD2-D1.3DNA转染在Freestyle培养基中生长的HEK293F细胞(Life Technologies)。AAVS TALEN对(“AAVS原始”)先前已描述[125]，并且其识别以下序列：
LEFT TALEN：5’(T)CCCCTCCACCCCACAGT(SEQ ID NO:70)
间隔区：5’GGGGCCACTAGGGAC(SEQ ID NO:71)
右TALEN：5'AGGATTGGTGACAGAAAA的互补序列(SEQ ID NO:72)
(即，5’TTTTCTGTCACCAATCCT(SEQ ID NO:73)
鉴定替代的、更有效的AAVS靶向TALEN对，并在随后的实验中使用(pZT-AAVS1 L1TALE-N和pZT-AAVS1 R1 TALE，目录号GE601A-1，System Biosciences)。识别相同位点(但不是上文括号中所示的第一个“T”残基)的此对被称为“AAVS-SBI”TALEN对。
将细胞以0.5×106个细胞/毫升接种，并且第二天使用以1:2(w/w)的比率添加的DNA:聚乙烯亚胺(PolyPlus)，以106个细胞/毫升进行转染。用0.6μg/ml的pD2转染细胞，并用作为对照的pcDNA3.0(0.6μg/ml)或组合的左和右“原始AAVS”TALEN质粒(各自为0.3μg/ml)共转染。表达来自CMV启动子(见下文)的EGFP的pD3作为转染对照包括在实验中并且表现出35％的转染效率。使用补充有5ug/ml杀稻瘟菌素的Freestyle培养基(LifeTechnology)在悬浮培养中选择细胞。
为了判定是否在细胞表面上发生了抗体表达，根据以下方案用抗人Fc抗体对细胞染色：
1.转染后16天，将来自用杀稻瘟菌素选择出的群体的0.5-1×106个细胞在4℃下离心2分钟(200-300xg)。
2.用1ml洗涤缓冲液(含0.1％BSA的PBS溶液，Gibco#10010)洗涤细胞，并在4℃下离心细胞2分钟(200-300xg)。
3.将细胞重悬在100μl染色缓冲液(含1％BSA的PBS溶液)中，并加入5-10μl荧光染料缀合的抗体。抗体是藻红蛋白标记的抗人IgG Fc(克隆HP6017，目录号409304，Biolegend)或藻红蛋白标记的小鼠IgG2a,κ同种型对照(目录号400214，Biolegend)。在4℃下于黑暗中温育>30分钟。
4.用1ml洗涤缓冲液洗涤两次并重悬于500μl洗涤缓冲液中。
5.加入含有50ug/ml的7-氨基-放线菌素D(7-AAD)的5ul细胞活力染色溶液(#00-6993-50，eBioscience)以鉴定死细胞。
6.在(Becton Dickinson，FACS II)流式细胞仪上分析细胞。
图4示出相较于单独转染pD2-D1.3时具有的1.5％阳性，当在AAVS靶向TALEN存在下转染pD2-D1.3时具有86％阳性，存在显著更高的抗体表达细胞群体。
通过评估与标记抗原的结合来测定表面表达的抗溶菌酶抗体的功能性。使用Lightning-Link Rapid缀合系统(Dylight 488，Innova Biosciences：322-0010)如下标记鸡蛋溶菌酶(Sigma：L6876)
1.向100ul溶菌酶(200ug溶解于100ul PBS中)中加入10ul LL-Rapid Modifier试剂，并轻轻混合。
2.将混合物加入Rapid混合物中，通过上下吹打轻轻重悬。
3.将混合物在室温下于黑暗中温育15-30分钟。
4.向反应中加入10ul LL-Rapid Quencher试剂，并轻轻混合。
5.储藏于4℃。溶菌酶-Dy488的最终浓度为1.6μg/μl。
6.每次染色使用6ul溶菌酶-Dy488(约10ug)。
7.染色、洗涤和流式细胞术如上所述。
分析显示，与未转染细胞中0.29％相比，用结合有经标记的HEL的pD2-huD1.3转染的细胞中86％(如通过M1设门所判断的)(图5)。
实施例4.位点特异性核酸酶(AAVS定向的TALEN)增强供体DNA整合
还将转染的细胞涂布在平板上(plated out)并用杀稻瘟菌素进行选择以测定其中无启动子杀稻瘟菌素基因的表达被激活的细胞的数目。在转染后24小时，将细胞以0.25×106个细胞/10cm皮氏培养皿(经组织培养处理)接种，并在10％胎牛血清(10270-106，Gibco)和1％最小必需培养基非必需氨基酸(MEM_NEAA#11140-035，Life Technologies)上生长。再过24小时后加入5ug/ml杀稻瘟菌素，并且每隔2天更换培养基。9天后，未接受pD2质粒的细胞全部死亡。12天后，用2％亚甲基蓝(在50％甲醇中)染色平板。菌落密度对于精确定量而言太高，但在AAVS TALEN存在下表现出增加的杀稻瘟菌素抗性菌落数目，这表明靶向整合到AAVS基因座中。引入减少量的DNA以进行更精确的定量。
在存在或不存在AAVS TALEN的情况下(在存在的情况下，每种TALEN为0.3ug/ml，表1A)，使用50、200或400ng pD2-D1.3/106个细胞来如前所述地进行转染。用对照质粒pcDNA3.0将总DNA输入量调节至1.2ug DNA/106个细胞。转染24小时后，将0.25×106个细胞接种在10cm培养皿中，并在接种24小时后加入7.5ug/ml杀稻瘟菌素。进行杀稻瘟菌素选择后10天时，菌落用2％亚甲基蓝(在50％甲醇中)染色。结果示于图6中并汇总于表1A中。这表明，编码AAVS定向的TALEN的DNA的共转染使所获得的杀稻瘟菌素抗性菌落的数目增大了约10倍。
在“AAVS原始”和靶向AAVS基因座的“AAVS SBI”TALEN对之间进行比较。表1B显示使用“AAVS SBI”TALEN对的杀稻瘟菌素抗性菌落的数目增加。
表1.用pD2-D1.3转染的杀稻瘟菌素抗性菌落的定量
A.
B.
在这里，我们比较了使用细胞表面抗体表达(实施例3)或激活无启动子杀稻瘟菌素基因(实施例4)加入TALEN核酸酶的效果。当相较于对杀稻瘟菌素抗性菌落的影响来测量抗体表达时，核酸酶定向整合的益处更明显。一种可能的解释是，在杀稻瘟菌素存在下实现存活所需的表达水平可显著小于检测表面上IgG2表达所需的表达水平。因此，无启动子杀稻瘟菌素基因的错掺/剪接可导致杀稻瘟菌素抗性基因的低水平表达，从而在不存在显著的抗体表达的情况下导致更高本底水平的杀稻瘟菌素抗性菌落。
实施例5.使用AAVS TALEN测定整合精确度。
为了研究整合的精确度，从实施例4/表1A(来自一式两份、未染色的平板)的实验中挑取菌落，扩增，并将来自这些细胞的基因组DNA用作PCR中的模板。为了制备基因组DNA，收获细胞并将其重悬于700μL裂解缓冲液(10mM Tris.Cl，pH＝8.0，50mM EDTA，200mMNaCl，0.5％SDS，补充有0.5mg/mL蛋白酶K(在裂解前加入)。然后将裂解缓冲液中的细胞重悬液转移到微量离心管中并在60℃下保持约18小时。第二天，向裂解物中加入700μL异丙醇以沉淀基因组DNA。将微量离心管在13,000rpm下旋转20分钟。然后用70％乙醇洗涤基因组DNA沉淀，并以13,000rpm再离心10分钟。离心后，小心分离上清液，留心不要接触基因组DNA沉淀。然后将基因组DNA沉淀重悬于含有10mM Tris(pH 8.0)和1mM EDTA的100μL缓冲液中，并在60℃保持30分钟，保持盖子打开以去除痕量的乙醇。向该100μL溶液中加入RNA酶A(最终浓度为20μg/mL)，在60℃下温育约1小时。使用nanodrop分光光度计(Nanodrop)测量基因组DNA浓度。
为了鉴定正确的整合，设计了杂交于AAVS基因组基因座中左同源臂和右同源臂之外的位置的PCR引物。这些PCR引物与插入物特异性引物配对。在5’末端处，引物为：
AAVS-左-臂-接合-PCR-Forw(9625)5’CCGGAACTCTGCCCTCTAAC(SEQ ID NO:74)，BSD_接合PCR-rev(9626)：5’TAGCCACAGAATAGTCTTCGGAG(SEQ ID NO:75)
在发生正确整合的情况下，这些引物产生1.1kb的产物。由AAVS定向整合产生的9个克隆中的8个产生正确大小的条带(图7a，图7b)。在不存在TALEN的情况下获得的2种杀稻瘟菌素抗性克隆未产生产物(图11a)，指示随机整合。在3’末端处，引物为：
供体_质粒_seq_PDGFRTM-2正向5’ACACGCAGGAGGCCATCGTGG(SEQ ID NO:76)，AAVS1_右臂_接合_PCR_反向5’TCCTGGGATACCCCGAAGAG(SEQ ID NO:77)
在发生正确整合的情况下，这些引物产生1.5kb的产物。由AAVS定向整合产生的9个克隆中的7个产生正确大小的条带。在不存在TALEN的情况下获得的2种杀稻瘟菌素抗性克隆未产生产物(图11b)。因此，大多数杀稻瘟菌素抗性细胞因正确整合到AAVS基因座中而产生，而在不存在TALEN的情况下产生的杀稻瘟菌素抗性菌落未正确整合。
实施例6.由来自噬菌体展示和通过哺乳动物展示选择的选定群体构建scFv展示 文库
scFv格式化的可溶性抗体先前已从载体pBIOCAM5-3F表达，其中表达由CMV启动子驱动，并且载体向抗体基因提供由人Fc、His6和3xFLAG组成的C末端融合配偶体[105，126]。对其进行修饰以产生载体pBIOCAM5newNot，其中Not1位点包埋在抗体的Fc区内(如图8所示)。将其用作起始点以产生载体pD6(图8)而用于表达束缚于细胞表面的scFv-Fc融合体。设计引物(2598和2619)以允许来自pBIOCAM5newNotPrimer 2598的CMV启动子-scFv-Fc表达盒的扩增在CMV启动子的上游杂交，并在末端放置Pac1位点(加下划线)。
2598：TTTTTTTTAATTAA GATTATTGACTAGTTATTAATAG TAATCAATTACGGGGTC(SEQ IDNO:78)
引物2619在Fc结构域的末端附近杂交，并在内含子的起始处引入剪接供体位点和Pme1位点(加下划线)。
2619：TTTTTTGTTTAAACTTACCTTGGATCCCTTGCCGGGGCTCAGGCTCAGGGAC(SEQ ID NO:79)
所得PCR产物与pD2的Pac1和Pme1位点相容(图3)。
用Pac1和Pme1消化pD2去除了：pEF启动子-前导序列-轻链-CMV启动子-前导序列-重链
Pac1/Pme1切割的PCR产物插入物的克隆：CMV启动子-前导序列-Nco1/Not1位点-人Fc。
以这种方式克隆将scFv-Fc盒适当定位以剪接到先前针对pD2中细胞表面上的IgG递呈描述的下游跨膜结构域。最终的载体pD6如图8所示，示出了从Nco1到Pme1位点的D6序列。
使用β-半乳糖苷酶(Rockland，目录号B000-17)和CD229(R and D Systems，目录号898-CD-050)作为抗原，使用McCafferty噬菌体展示文库[7]进行噬菌体展示选择。选择和亚克隆的方法基本上如前所述[6,7,118,127]。通过PCR回收来自通过针对β-半乳糖苷酶的一轮或两轮选择以及针对CD229的两轮选择所产生的群体的scFv基因。引物M13Leadseq在scFv基因之前的细菌前导序列内杂交，而Notmycseq在噬菌体展示载体中scFv基因后面的myc标签中杂交[127]。
M13Leadseq(SEQ ID NO:80)
AAA TTA TTA TTC GCA ATT CCT TTG GTT GTT CCT
Notmycseq(SEQ ID NO:81)
GGC CCC ATT CAG ATC CTC TTC TGA GAT GAG
将PCR产物用Nco1和Not1消化，将经消化的插入物进行凝胶纯化。将消化产物连接到细菌表达质粒pSANG10-3F的Nco1和Not1位点，并如所述进行抗体表达和筛选[127]。在针对β-半乳糖苷酶和CD229进行2轮选择后，通过ELISA发现40/190(21％)和35/190(18％)克隆是阳性的。
将550ng Nco/Not切割插入物也连接到pD6(2.4μg)的Nco1和Not1位点内，以产生表达scFv与人IgG2的Fc区之间的融合体的构建体。将经连接的DNA转化到电感受态NEB5α细胞(New England Biolabs，目录号C2989)中，这为每个群体产生了2-3×107个克隆的文库大小。制备DNA，并使用0.3μg供体DNA(pD6-文库)/106个细胞共转染到在如上所述的Freestyle培养基中生长的100ml HEK293细胞中。将细胞用每种“AAVS-SBI”TALEN(pZT-AAVS1 L1 TALE-N和pZT-AAVS1 R1 TALE，目录号GE601A-1，System Biosciences公司)各0.5μg共转染。
在转染后24小时，将大批培养基的体积加倍，24小时后加入杀稻瘟菌素(10μg/ml)。每隔3-4天更新培养基，6天后将杀稻瘟菌素浓度增加至20μg/ml。
为了测定文库大小，在转染后24小时将20,000个细胞接种在10cm皮氏培养皿(经组织培养处理)中，并在10％胎牛血清(10270-106，Gibco)和1％最小必需培养基必需氨基酸(MEM_NEAA#11140-035，Life Technologies)中生长。再过24小时后加入10μg/ml杀稻瘟菌素，每隔2天更换培养基。8天后，将平板用2％亚甲基蓝(在50％甲醇中)染色。结果示于表2中。这表明对于3种群体获得了含约3×106个克隆(代表3％的转染细胞)的文库。
表2.scFv-Fc文库大小的测定。
用于标记和流式分选10-20×106个细胞的方案如下所示。转染后13天时，使用仅106个细胞/样品和减少的温育体积(试剂体积为所显示的那些的1/10)进行初始分析。
图9显示，在转染后13天时，至少43-46％的细胞在细胞表面表达scFv-Fc融合体，并且这可以使用FITC或藻红蛋白标记的抗Fc抗体来检测。使用FITC或藻红蛋白标记的链霉亲和素还在这个群体内检测到了生物素化的β-半乳糖苷酶的结合。使用链霉亲和素-FITC时，使用来自通过1轮或2轮噬菌体展示选择产生的输出群体的文库，分别11.8％和39％的细胞对进行抗体表达和抗原结合是阳性的。对于来源于2轮噬菌体展示的CD229，66％的细胞对scFv-Fc是阳性的，并且24％的这些细胞对于CD229结合是阳性的(占总群体的15％)。
在转染后20天时，根据以下方案标记细胞(使用生物素化抗原/藻红蛋白标记的链霉亲和素和FITC标记的抗人Fc)。
1.收获，洗涤以及调整细胞为每个样品中含15-20×106个细胞。在室温下于250g重力下离心沉降细胞4分钟，用1mlPBS+0.1％BSA(4℃)洗涤细胞，在室温下于250g重力下离心沉降细胞4分钟，重悬于1ml PBS+1％BSA中
2.加入生物素化抗原以达到100nM的最终浓度，在4℃下温育30分钟
3.用1ml的0.1％BSA洗涤细胞2次，然后以1500rpm离心5分钟
4.加入以下物质中的任意一种：
10μl FITC标记的链霉亲和素(1μg/ml，Sigma，目录号S3762)和20μl藻红蛋白标记的抗人Fc(200μg/ml，BioLegend，目录号409304)，
或者：
20μl藻红蛋白标记的链霉亲和素(200μg/ml，Biolegend，目录号405203)和20μlFITC标记的抗人Fc(200μg/ml，Biolegend，产品目录号409310)PBS+1％BSA，在黑暗中于4℃下15
5.用1ml的0.1％BSA洗涤细胞2次，然后以1500rpm离心5分钟
6.将细胞沉淀重悬于500μl冰冷PBS+1％BSA中
7.每个小瓶中加入20ul 7AAD进行活力染色
为了进行分选，基于细胞大小、粒度、脉冲宽度和活力来门控细胞(通过7-AAD染色，前向散射和侧向散射。结果示于图9c和图9f中。总共1000万个细胞被分选，并且分别从来自2轮CD229(CD229R2)选择和1轮β-半乳糖苷酶选择(β-galR1)的输出群体的文库中收集了3.1％和7％的双阳性细胞。
使来源于β-galR1的细胞的选定细胞再生长20天，然后再次分析(图9h)。这表明大多数细胞现在表达scFv-Fc并结合β-半乳糖苷酶。该图还显示，未经选择的群体中双阳性细胞的比例在转染后42天时没有减少(图9k)。
从150,000-106个分选出的细胞制备基因组DNA。使用前述方法或使用GenElute哺乳动物基因组DNA小量制备试剂盒(Sigma G1N10)来制备基因组DNA。
使用以下引物从基因组DNA进行scFv基因的PCR扩增：
2623(SEQ ID NO:82)
TAAAGTAGGCGGTCTTGAGACG
2624(SEQ ID NO:83)
GAAGGTGCTGTTGAACTGTTCC
使用Phusion聚合酶(NEB，目录号M0532S)在含有0.3uM每种引物和3％DMSO的制造商缓冲液中进行PCR反应。在50ul反应中使用100-1000ng的基因组DNA作为模板。在30个循环的98℃进行10秒，55℃进行25秒，72℃进行45秒。这得到了1.4kB的产物，用Nco1和Not1消化此产物。产生大约750-800bp的条带，并在克隆到pSANG10中之前进行凝胶纯化。将连接的DNA转化到BL21细胞(Edge Bio Ultra BL21(DE3)感受态细胞，目录号45363)中。以这种方式，来源于经分选群体的scFv片段可以如前所述在细菌中表达[7,127]。
作为分离抗体基因并在替代载体/宿主组合中表达的替代方案，可以在单细胞克隆后或使用经分选群体产生多克隆抗体混合物，来直接从所选细胞得到分泌的抗体。为了举例说明，培养7天后从所分选的细胞(来自βgalR1细胞)获取培养上清液。此培养上清液在使用用β半乳糖苷酶包被的平板的ELISA中显示为阳性(参见实施例13和图19b)。
实施例7.从来自噬菌体展示的选定群体的IgG展示文库进行构建和选择
如实施例6所述产生编码scFv的DNA片段，所述scFv表示针对β-半乳糖苷酶和CD229进行选择的第1轮和第2轮抗体噬菌体展示输出。根据实施例14并如以下方法中所详述，将scFv群体转化为IgG形式。
用引物2595(GAGGGCTCTGGCAGCTAGC)(SEQ ID NO:84)和2597(TCGAGACTGTGACGAGGCTG)(SEQ ID NO:85)从质粒pD2进行对编码人κ轻链恒定结构域(CL)，聚腺苷酸化序列(pA)，CMV启动子和来自鼠VH链(表示在图21b所示的pD2的Not1位点和Nco1位点之间)的信号肽的DNA插入物的PCR扩增。使用KOD热启动聚合酶(Novagen，目录号71086-4)在含有0.25μM的每种引物的制造商缓冲液中进行PCR反应。在50ul反应中使用10ng pD2质粒DNA作为模板。25个循环的98℃进行10秒，55℃进行25秒，72℃进行40秒。这产生了1.8kB的产物，将此产物用Nco1和Not1消化并凝胶纯化(图20a，在图21b中表示为CL-pA-CMV-SigP插入物)。
如实施例6所述产生编码scFv的DNA片段，所述scFv表示针对β-半乳糖苷酶和CD229进行选择的第1轮和第2轮抗体噬菌体展示输出。图20b显示了通过1％琼脂糖凝胶电泳分离的针对β-半乳糖苷酶和CD229选择的scFv群体。
通过将用Ncol/Notl消化的scFv插入物(1μg)与用Ncol/Notl消化的CL-pA-CMV-SigP插入物(1μg)与T4DNA连接酶(1.5μl，Roche，10-481-220-001)一起在总体积为40μl的制造商缓冲液中温育来进行scFv插入物和CL-pA-CMV-SigP插入物之间的连接，从而形成图21c所示的“微环”。将连接物在16℃温育16小时，通过离心柱纯化，用Nhel和Xhol消化，然后通过在1％琼脂糖凝胶上电泳分离(图20c)纯化得到2.6kb产物(在图21d中示出)。
将图21d所示编码VL-CL-pA-CMV-SigP-VH的DNA插入物(0.5μg)与经NheI/XhoI消化和凝胶纯化的载体pD2(0.7μg)(图21e)以及T4DNA连接酶(1.5μl，Roche，10-481-220-001)一起在总体积为40μl的制造商缓冲液中连接，以生成图21f所示的靶向载体。此靶向载体编码格式化为IgG的抗体群体，所述抗体群体来源于针对β-半乳糖苷酶或CD229的第一轮或第二轮抗体噬菌体展示选择。将连接物在16℃下温育16小时，通过离心柱纯化并用HPLC级水洗脱。
将连接的DNA转化到电感受态NEB5α细胞(New England Biolabs，目录号C2989)中，对于每个群体产生1-4×105个克隆的文库大小。制备DNA，并使用0.3μg供体DNA(pD6-文库)/106个细胞共转染到在如上所述的Freestyle培养基中生长的100ml HEK293细胞中。将细胞用每种“AAVS-SBI”TALEN(pZT-AAVS1 L1 TALE-N和pZT-AAVS1 R1 TALE，目录号GE601A-1，System Biosciences)各0.5μg共转染。
在转染后24小时，将大批培养基的体积加倍，并且24小时后加入杀稻瘟菌素(10μg/ml)。每隔3-4天更新培养基，并在6天后将杀稻瘟菌素浓度增加至20μg/ml。
为了测定文库大小，在转染后24小时将250,000个细胞接种在10cm皮氏培养皿(经组织培养处理)中，并在10％胎牛血清(10270-106，Gibco公司)和1％最小必需培养基必需氨基酸(MEM_NEAA#11140-035，Life Technologies)中生长。再过24小时后加入10μg/ml杀稻瘟菌素，每隔2天更换培养基。8天后，将平板用2％亚甲基蓝(在50％甲醇中)染色。结果示于表3。这表明对于3种群体获得了含在5×105与9×105之间个克隆(代表0.5％至0.9％的转染细胞)的文库。
表3.格式化为IgG的哺乳动物展示文库的大小测定。
如前所述，将用针对β-半乳糖苷酶的1轮或2轮选择的输出物转染的细胞群体的大部分在含有杀稻瘟菌素的培养基中进行选择。19天后，如实施例6所述标记10-20×106个细胞并进行流式分选。使分选出的细胞生长17天，然后用流式细胞术重新分析(图10)。这表明大多数细胞现在是对于IgG表达和与β-半乳糖苷酶结合双重阳性的。
从分选出的细胞制备基因组DNA，并通过PCR分离编码IgG插入物的DNA。使用KOD聚合酶(Merck，目录号71086-3)扩增编码IgG的插入物，其中退火温度为60℃，并使用30个循环。使用含有5％DMSO的制造商提供的缓冲液，以及0.3μM的引物2597(SEQ ID NO:54)和2598(SEQ ID NO:47)。将所需大小的产物进行凝胶纯化。然后将凝胶纯化产物用于使用KOD聚合酶(Merck，目录号71086-3)在含有5％DMSO的制造商缓冲液中进行的嵌套PCR，所述嵌套PCR中使用0.3μM的引物2625(SEQ ID NO:55)与引物1999(SEQ ID NO:56)(对于R1样品)或2595(SEQ ID NO:53)(对于4R1和5R1)组合，使用60℃退火温度，采用30个循环。将这些嵌套PCR产物进行凝胶纯化，并用Nhel-HF(NEB，目录号R3131S)和Xhol(NEB，目录号R0146S)进行双重消化，以便将它们与经类似双重消化的plNT3(图1)连接以用于表达可溶性IgG格式化的结合物。引物序列为：
2597：AGGGGTTTTATGCGATGGAGTT(SEQ ID NO:85)
2598：GTTACAGGTGTAGGTCTGGGTG(SEQ ID NO:78)
2625：CCTTGGTGCTGGCACTCGA(SEQ ID NO:86)
1999：AAAAAGCAGGCTACCATGAGGGCCTGGATCTTCTT TCTCC(SEQ ID NO:87)
2595：GAGGGCTCTGGCAGCTAGC(SEQ ID NO:84)
实施例8.从原始scFv文库进行构建和选择
Schofield等人[7]描述了噬菌体展示文库(McCafferty文库)的构建，其中首先将来自多个人供体的B淋巴细胞的抗体基因克隆到“中间文库”中，然后再克隆到最终的功能性噬菌体展示文库中。使用相同的中间文库和相同的方法来产生含4×1010个克隆的新文库(IONTAS文库)。从此文库制备质粒DNA，注意确保文库在细菌接种中的充分表现。使用总共2ug的DNA模板建立多个PCR反应。如实施例6所述，将PCR产物用Nco1和Not1消化，凝胶纯化以及连接。将9.3ug的pD6和0.93ug的PCR插入物连接过夜，使用苯酚氯仿提取来清除连接反应物，并如前所述将DNA电穿孔到DH5α细胞中[7]。因而，在scFv-Fc展示载体内产生了含2.4×108个克隆的文库。从克隆于pD6中的该“原始文库”制备DNA，并转染到在Freestyle培养基(如上所述)中生长的1升HEK293F细胞(Life Technologies)中。0.3ug的pD6-文库DNA，0.5ug的每种“AAVS-SBI”TALEN对。在转染后24小时，将培养物体积加倍，并在转染后48小时，如上所述开始进行杀稻瘟菌素选择。通过在转化后24小时将培养物等分试样涂布平皿并针对如上所述的杀稻瘟菌素进行选择，来测定文库大小。产生了含0.9×107个克隆的文库。
使用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin试剂盒(Pierce，目录号21327)，根据制造商的说明书将大量抗原生物素化。抗原是牛甲状腺球蛋白(Calbiochem，目录号609310)，人CD28-Fc嵌合体(R and D Systems，目录号342-CD-200)和小鼠EphB4-Fc嵌合体(R and DSystems，目录号446-B4-200)。还使用生物素化的β-半乳糖苷酶(Rockland，目录号B000-17)。
将经转染的细胞在如上所述的液体培养基中的杀稻瘟菌素中选择17天。将细胞收获，洗涤并调整至每个样品中含15-20×106个细胞。如所描述地制备细胞，并加入生物素化的抗原至500nM的浓度。如上所述进行标记和流式分选。使用仅与藻红蛋白标记的抗Fc抗体温育的对照细胞，来产生包含0.05％的这些细胞的“门”。对于经标记的细胞使用相同的门，所述门包括0.28％与0.51％之间的细胞(图11)。将这些细胞收集并使其生长，以允许对来自原始文库的scFv基因进行另外轮的分选和扩增。
实施例9.创建具有多重“着陆位点”的细胞系，以比较用于基因组整合的核酸酶定 向方法和重组酶定向方法
为了允许基于基因组裂解介导的整合或重组酶介导的整合进行整合方法比较，构建AAVS定向的靶向载体(pD4)，此靶向载体引入了具有多个"着陆位点"的内含子(实施例3)。这些着陆位点包括由Flp重组酶识别的FRT位点和由Cre重组酶识别的一对lox2272/loxP位点。为了允许靶向裂解，pD4还包含来自已经为其设计了TALEN对[128]的GFP的序列和允许内切核酸酶定向整合的I-Sce 1大范围核酸酶位点。构建具有适当识别位点的相容的引入供体质粒(pD5)，使得核酸酶或重组酶定向整合导致无启动子杀稻瘟菌素基因被激活并整合抗体表达盒。
质粒的构成和pD4的序列示出于图12b中。首先产生中间质粒pD3，其包含在CMV启动子控制下的GFP基因，之后是在PGK启动子控制下的嘌呤霉素/胸苷激酶基因融合体(图12a)。此为通过用Sac1(在CMV启动子的末端)和BstB1(在Neo基因和多聚腺苷酸位点之间，图1a)消化pBIOCAM1-newNot而产生。此举去除了新霉素表达盒，并允许用包含在CMV启动子控制下的增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因的合成插入物进行替换。此GFP构建体在C末端融合到突变的小鼠鸟氨酸脱羧酶PEST序列的残基422-461。将此PEST序列并入质粒pZsGreen1-DR(Clontech)中并且已经表现为使融合的GFP的半衰期缩短至1小时。使用Xmn1和Fse1从质粒pFLEXIBLE[129]切下编码PGK启动子的盒，嘌呤霉素/胸苷激酶基因融合体(puroΔΤΚ)和多聚腺苷酸盒，并克隆到原始合成插入物中存在的Sma1和Fse1位点中。所得质粒(称为pD3)编码CMV驱动的GFP基因和由PGK启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因。
为了产生最终的靶向载体pD4，去除CMV启动子并插入AAVS同源臂。PCR扩增AAVS基因座的850bp片段以产生在5'末端侧接EcoR1并在3'末端侧接Mre1的AAVS左同源臂。将其克隆到pD3的ECoR1/Mre1位点，从而去除CMV启动子。还在此AAVS左同源臂的3'端并入Nsi1位点。相邻的Mre1和Nsi1位点用于将融合内含子的合成片段引入EGFP基因中，如图13所示。EGFP基因之前的合成内含子包含：
Flp重组酶的FRT识别位点
lox 2272重组位点
I-Sce1大范围核酸酶位点
GFP TALEN识别位点
T2A核糖体停靠序列[130]
通过PCR产生AAVS右同源臂以在5'和3'末端产生Hpa1和BstZ171位点。将此片段克隆到pD3的Hpa1和BstZ171位点。所得质粒pD4编码嘌呤霉素抗性盒(“PuroΔTK”)，并可用于将“着陆位点”引入AAVS基因座，从而并入各种核酸酶和重组酶位点以进行比较。pD4的序列示出于图13中(SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6以及SEQ ID NO:7)。AAVS左靶向臂和右靶向臂在图3中详细示出，因此在图13中简写。
引入pD4的内含子含有源自GFP的TALEN识别位点[128]。eGFP定向的TALEN对(eGFP-TALEN-18-左和eGFP-TALEN-18-右)识别以下所示的序列(所有序列和引物以5'至3'方向呈现)，其中大写字母代表左TALEN和右TALEN的识别位点，并且小写字母表示间隔区序列。右侧TALEN识别所示序列的互补序列。第一个碱基对等效于相对于GFP的起始ATG序列的序列中的负16位置(在间隔区中加下划线示出)。
TCCACCGGTCGCCAccatggtgagcaagggCGAGGAGCTGTTCA(SEQ ID NO:88)
质粒pD4还并入并入了I-Sce1大范围核酸酶位点和由Flp重组酶识别的FRT位点。最后，pD4并入侧接GFP和嘌呤霉素表达盒的lox2272和loxP(它们是互不相容的)。在供体质粒(下文的pD5)侧翼并入这2个相同的loxP位点提供了替代已整合的盒(包括PGK puroΔTK盒)的机会，从而通过重组酶介导的盒交换用驱动杀稻瘟菌素和抗体表达的引入盒替代此已整合的盒。
通过pD4的转染产生细胞系
将HEK293F细胞以106个细胞/毫升重悬，并以1:2(w/w)的比例加入DNA:聚乙烯亚胺(PolyPlus)。将细胞用0.6μg/ml的pD4转染，并用“原始AAVS”TALEN对或pcDNA3.0作为对照(0.6μg/ml)共转染。表达来自CMV启动子的EGFP的pD3作为转染对照包括在实验中，并表现出35％的转染效率。24小时后，将经转染的细胞以0.5×106个细胞/10cm皮氏培养皿(经组织培养处理)接种，并在10％胎牛血清(10270-106，Gibco)和1％最小必需培养基非必需氨基酸(MEM_NEAA#11140-035，Life Technologies)中生长。再过24小时后加入5μg/ml嘌呤霉素，然后每隔2天更换培养基。5天后，未转染的细胞或仅用pD3转染的细胞死亡。12天后，在仅用pD4转染的细胞上有约200个菌落，而在用pD4和AAVS TALEN对转染的细胞上约有400个菌落。
对用pD4和AAVS TALEN对转染产生的嘌呤霉素抗性群体针对正确整合进行分析。此外，从此群体(克隆6F)中挑取单个菌落，并与来自在不存在AAVS TALEN对的情况下由pD4转染产生的嘌呤霉素抗性群体的菌落进行比较。为了鉴定正确的整合，设计在AAVS基因组基因座中左同源臂和右同源臂之外处杂交的PCR引物。这些PCR引物与插入物特异性引物配对。在5'末端，引物是：
AAVS1_HA-L_Nested_Forw1GTGCCCTTGCTGTGCCGCCG GAACTCTGCCCTC
(SEQ ID NO:89)
EGFP_合成_基因_Rev_组件TTCACGTCGCCGTCCAGCTCGAC(SEQ ID NO:90)
Purotk_seq_fow2 TCCATACCGACGATCTGCGAC(SEQ ID NO:91)
AAVS1_右_臂_接合_PCR_Rev TCCTGGGATACCCCGAAGAG(SEQ ID NO:77)
图14示出克隆6F和群体在左端和右端都是正确的，但是从非AAVS定向群体挑取的克隆是阴性的。因此，PCR分析表明当通过基因组DNA的AAVS TALEN裂解定向时，供体盒的整合精确度更高。
pD4引入由AAVS启动子驱动的无启动子的、框内GFP基因。嘌呤霉素抗性群体的流式细胞术显示不存在GFP表达。这种表达失败可能是由于短半衰期(来自鼠鸟氨酸脱羧酶PEST序列元件)与因为使用T2A启动子导致的减少表达的组合。事实上已经发现，在无启动子杀稻瘟菌素元件前面(如对于pD2所述)加入T2A元件使杀稻瘟菌素抗性菌落的数目减少4倍。尽管没有GFP表达，但是多重着陆位点的整合仍然提供了对重组酶定向的基因组整合与DNA裂解定向的基因组整合进行比较的机会。
实施例10.构建用于将抗体盒(pD5)插入“多重着陆”位点的载体
在将“多重着陆位点”内含子引入AAVS基因座后，可以通过核酸酶定向或重组酶定向的方式引入抗体盒。为此，建立供体质粒pD5，其中表达盒侧接左同源臂和右同源臂，所述左同源臂和右同源臂等同于引入到pD4中的侧接GFP TALEN裂解位点的序列。pD5本身不包含完整的GFP TALEN识别位点，并且通过同源重组来驱动整合。供体质粒的同源定向整合将导致引入没有启动子的杀稻瘟菌素基因，但是此基因之前是剪接受体位点，此剪接受体位点产生与来自如前所述的AAVS基因座的上游外显子的框内融合。整合入所述AAVS基因座将导致无启动子的杀稻瘟菌素基因的表达。如上所述，插入的盒还分别在pEF启动子和CMV启动子的控制下编码IgG格式化的抗体重链和轻链。pD5并入I-Sce1大范围核酸酶位点，所述位点可以导致对引入供体的裂解，从而提供NHEJ机会(参见实施例12)。还将FRT位点并入供体质粒pD5中，以允许在相同基因座处进行重组酶定向的对无启动子的杀稻瘟菌素基因和抗体表达盒的整合。如上所述，Cre重组酶将作用于供体和基因组DNA中的loxP位点，以定向重组酶介导的盒交换。
pD5的序列示出于图15中。GFP TALEN位点5'端的序列来自AAVS基因座。通过PCR产生在TALEN裂解位点上游的AAVS基因座的267bp片段。使用在5'端和3'端建立EcoR1和Mfe1位点的引物，并将产物克隆到pD1-D1.3的ECoR1位点中。在5'端重新建立EcoR1位点。在克隆左同源臂期间，还将Nsi1和Pac1插入3'端。通过PCR装配产生右同源臂，所述右同源臂并入了GFP TALEN的3'端序列的大约700bp等效序列。PCR引物在经组装片段的5'端和3'端引入BstZ171位点，然后将所述组装片段克隆到pD1-D1.3的BstZ171位点。PCR引物还在5'端引入Hpa1位点。
产生包含内含子(其并入GFP TALEN、I-Sce1内切核酸酶、Flp重组酶和Cre重组酶的识别位点)、剪接受体区、杀稻瘟菌素抗性基因和多聚腺苷酸位点(如上所述)的PCR片段，其中Nsi1位点在5'端，而Pac1位点在3’端。将此PCR片段克隆到上述质粒的Nsi1和Pac1位点以产生pD5-D1.3(序列示于图15，并且质粒结构示于图18a)。
实施例11.抗体表达盒的核酸酶定向整合和Flp定向整合的比较
先前已用于重组酶介导的抗体表达盒整合的Flp-ln系统[18]使用仅具有天然Flp重组酶在37℃下的活性的10％活性的突变Flp重组酶(在质粒pOG44中)[19]。已经鉴定出了在37℃下比野生型具有更好的热稳定性和活性的Flp重组酶(Flpe)的变体[19,20]。此变体通过密码子优化进一步改善，以产生在质粒cCAGGS-Flpo(Genebridges，目录号A203)内编码的Flpo[131]。比较Flp重组酶的两种变体(编码在pOG44和cCAGGS-Flpo中)的功效。还通过用编码Cre重组酶[132]的质粒(pCAGGS-Cre，Genebridges，产品目录号A204)共转染细胞来检查由Cre重组酶定向的重组。在每个载体中，重组酶在鸡-β-肌动蛋白启动子和CMV立即早期增强子的控制下表达。SV40大T核定位序列用于核定位[20]。在原始载体(cCAGGS-Flpo和pCAGGS-Cre)中，通过使用标准分子生物学技术去除的内部核糖体进入位点(IRES)将重组酶表达与嘌呤霉素抗性基因关联。
进行实验以比较基因组裂解定向的抗体盒整合与重组酶定向的抗体盒整合的效率。结果以两种方式评估：
1.测量由无启动子杀稻瘟菌素基因整合产生的杀稻瘟菌素抗性菌落的数目
2.评估通过不同方法实现的抗体表达程度。
如实施例9所述，将Cre重组酶的识别位点(lox2272和loxP)和Flp重组酶的识别位点(FRT)预先整合到克隆6F内的AAVS基因座中。此外，GFP TALEN对的识别位点和大范围核酸酶I-Sce1的识别位点也存在于相同的内含子中。供体质粒pD5-D1.3在无启动子杀稻瘟菌素基因上游的内含子中携带相同的识别位点(除了GFP TALEN外)。正确的整合将导致杀稻瘟菌素基因被激活。pD5-D1.3还编码将在细胞表面上表达的IgG格式化的D1.3抗体基因。
pD5-D1.3与pOG44或pCAGGS-Flpo(编码Flp重组酶的2个变体)的共转染应导致整个pD5质粒整合到克隆6F的FRT位点中。供体质粒pD5-D1.3也在杀稻瘟菌素基因上游的合成内含子中具有lox2272位点，以及在抗体表达盒的末端具有loxP位点。在从pCAGGS-Cre表达的Cre重组酶的作用下，重组酶介导的盒交换应导致杀稻瘟菌素和抗体表达盒整合到克隆6F内的lox2722和loxP位点中。
使用针对来自GFP的序列的一对TALEN(eGFP-TALEN-18-左和eGFP-TALEN-18-右)比较使用重组酶定向方法与使用基因组裂解定向方法进行载体整合的效率(Reyon等人，2012年)。在GFP TALEN的情况下，左同源臂和右同源臂之间的元件将在用TALEN进行基因组裂解后整合。
为了允许与I-Sce1大范围核酸酶比较，构建了编码I-Sce1的经密码子优化的基因(图16)。此基因在N末端具有N末端HA表位标签/SV40核定位信号(NLS)，并且在5'末端和3'末端侧接有Nco1位点和Xba1位点。将此基因克隆到载体pSF-CMV-F1-Pac1(OxfordGenetics，OG111)中，其中表达由CMV启动子驱动。
使用具有正确整合的“多重着陆位点”的克隆6F进行转染。将细胞以106个细胞/ml悬浮并用50ng pD5-D1.3供体质粒/106个细胞与酶编码质粒一起转染(表4A)。
24小时后，将经转染的细胞以0.5×106个细胞/10cm皮氏培养皿(经组织培养处理)接种，并在10％胎牛血清(10270-106，Gibco)和1％最小非必需培养基必需氨基酸(MEM_NEAA#11140-035，Life Technologies)中生长。再过24小时后加入5ug/ml杀稻瘟菌素，并且每隔2天更换培养基。12天后，将平板用2％亚甲基蓝(在50％甲醇中)染色并计数菌落数目(表2)。在Flp重组酶、Cre重组酶和TALEN之间的直接比较中，通过使用GFP TALEN获得了最大数目的菌落，其中其与“仅供体”相比具有9倍的增加(表4A)。还可以看出，与“仅供体”对照相比，使用优化的Flpo基因实际上导致杀稻瘟菌素抗性菌落的数目减少，推测这是由于增强活性的Flp重组酶的毒性。与仅供体的对照相比，使用pCAGGS-Cre也增加了菌落数目。
进行第二个实验，比较GFP TALEN与增强的Flp(来自cCAGGS-Flpo)以及来自Flp-ln系统的pOG44内编码的低活性Flp酶(如Zhou等人所用[17，18，US7,884,054]。将这些酶与GFP TALEN和Cre重组酶进行比较(表4B)。用每百万细胞所示量的DNA转染细胞。将0.25×106个细胞涂布到平皿上，并如上所述测定杀稻瘟菌素抗性菌落的数目。在测定表达表面IgG的细胞的比例(如上所述)之前，还在液体培养物中针对杀稻瘟菌素抗性选择细胞30天。表4B显示，在抗性菌落数目方面，TALEN优于其它方法。又，与“仅供体”对照相比，在cCAGGS-Flpo中使用优化的Flp实际上导致杀稻瘟菌素抗性菌落数目减少。Cre重组酶又导致杀稻瘟菌素菌落计数与对照相比增加，而pOG44中的Flp基因与对照相比仅表现出边际增加。
表4.TALE核酸酶定向的整合方法和重组酶定向的整合方法的比较。
A.
B.
C.
随着更多供体DNA的添加(表4C)，中间层次(2μg/百万个细胞)的菌落数目增加，并且在整体上较高层次的菌落数目(6μg/百万个细胞)下降。没有其它样品实现了用GFPTALEN定向整合时所看到的抗体展示水平。
还在液体培养物中针对杀稻瘟菌素抗性选择细胞，并如上所述对细胞染色以进行抗体表达。与其它方法相比，TALEN定向整合产生显著更高比例的抗体阳性细胞。用cCAGGS-Flpo和高浓度的pCAGGS-Cre转染的细胞不健康，并且没有足够的数目来进行流式细胞术。
将比较扩展到包括I-Sce核酸内切酶。合成编码I-Sce1的合成基因(图16)，并克隆到pSF-CMV-f1-Pac1(Oxford Genetics)的Nco1/Xba1位点中。将细胞以106个细胞/ml悬浮，并用300ng pD5-D1.3供体质粒以及编码酶的质粒(1ug/106个细胞)转染每ml细胞(106个细胞/ml)。第二天，将0.05ml细胞接种并在杀稻瘟菌素中选择，然后如所述在14天后染色。表5显示最高数目的杀稻瘟菌素抗性菌落来自I-Sce1大范围核酸酶，随后是eGFP TALEN对。Cre和Flp重组酶(在pOG44内编码)给出略高于“仅供体”对照的数目。如前所述，与"仅供体"相比，用编码Flpe的质粒转染实际上减少了菌落数目。
表5.大范围核酸酶定向的整合方法和重组酶定向的整合方法的比较。
转染后，在液体培养基中针对杀稻瘟菌素抗性选择大部分细胞，并且在7天后和13天后如上所述用抗Fc藻红蛋白标记的抗体染色。图17(汇总在表5中)显示与“仅供体”(4.9％)相比，用I-Sce1内切核酸酶和eGFP TALEN转染的细胞实现了显著更高的抗体表达(分别为47％和55％)。相比之下，当用编码Flp重组酶的质粒(pOG44)或编码Cre重组酶的质粒共转染细胞时，抗体阳性细胞的百分比分别为6.6％和6.5％。随着在杀稻瘟菌素中继续选择，抗体阳性细胞的比例继续增加，并且当在第19天测定时，在I-Sce1和EGFP TALEN转染样品的情况下实现了85-90％的抗体阳性。因此，大范围核酸酶提供了实现编码抗体的转基因的核酸酶定向整合的替代方法。
实施例12.抗体盒的核酸酶定向整合可以通过同源重组和NHEJ两者发生
转基因到细胞DNA中的整合效率可以通过引入双链断裂(DSB)来增强。真核细胞中的内源性DNA修复机制包括同源重组，非同源末端接合(NHEJ)，以及这些的变型。所有这些提供了在文库内引入编码结合物的基因的手段。同源重组提供了同源区和插入的转基因之间的精确接合，但需要在供体质粒中提供同源区。用于同源重组的DNA可以作为线性或环状DNA提供。通过使用NHEJ，DNA的末端直接重新连接，而不需要同源模板。这种DNA修复方法不太准确，可能导致插入或缺失。尽管如此，NHEJ提供了将外显子框内整合到内含子中或允许将启动子:基因盒整合到基因组中的简单手段。使用非同源性方法允许使用缺乏同源臂的供体载体，从而简化了供体DNA的构建。
克隆6F具有整合到基因组中的GFP TALEN和I-Sce1核酸酶识别位点，并且当提供这些核酸酶时这些核酸酶识别位点将被裂解。供体载体pD5不具有GFP TALE核酸酶识别位点，但具有位于裂解位点侧翼的同源臂，因此预期仅通过同源重组整合。在相邻的I-Sce1大范围核酸酶处裂解基因组DNA还将通过同源重组导致pD5元件的整合。然而，pD5还具有I-Sce1大范围核酸酶位点，当提供I-Sce1时I-Sce1大范围核酸酶位点可在体内被裂解。这将产生线性DNA产物，所述线性DNA产物可通过NHEJ潜在地整合。如前所述，当使用NHEJ时，使用供体DNA的体内裂解甚至可以具有效率优势。
图18a示出引入的pD5-D1.3供体DNA，而图18b示出并入“多重着陆”位点的克隆6F细胞的基因组基因座。图18c示出pD5-D1.3(图18a)与克隆6F的多重着陆位点(图18b)之间同源重组的结果。图18d与此对比表示NHEJ的结果。在这种情况下，并入来自引入质粒的骨架的另外DNA(用双箭头表示)。Flp介导的在“多重着陆”位点处的重组将导致类似的产物。为了确定哪种途径用于实施例11中所述的样品(在图17中示出)，如前所述从经杀稻瘟菌素选择的群体制备基因组DNA。设计了与整合的PGK启动子杂交的反向PCR引物(J44)。将此反向PCR引物与在IgG蛋白末端杂交的J48结合使用。设计引物J44和J48以揭示当I-Sce1负责整合时产生1928bp条带(在图18e中用箭头指示)的同源重组。(潜在地，当NHEJ已经发生时，可以通过此引物对产生5131bp的条带，但是此较长的产物在本实验的基因组PCR中不可见。)
引物J46设计为在载体骨架内的β-内酰胺酶基因内杂交。当NHEJ已经发生时，预计引物J44和J46产生1800bp的条带。在Flp重组酶已导致重组酶介导的整合的情况下，预期类似大小的条带。
J44：AAAAGCGCCTCCCCTACCCGGTAGAAT(SEQ ID NO:92)
J46：GGCGACACGGAAAT GTT GAAT ACT CAT(SEQ ID NO:93)
J48：CACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTG(SEQ ID NO:94)
图18e清楚地显示，同源重组仅发生在用GFP TALEN和I-Sce1大范围核酸酶处理的样品中((i和ii与iii和iv比较)。相比之下，NHEJ仅在用I-Sce1大范围核酸酶(图18e v.)而不是GFP TALEN(图18e vi)进行裂解时发生。如所预期的，在用Flp重组酶处理的样品中发现了类似大小的条带(图18e vii)。因而此实验揭示抗体盒的核酸酶定向整合可以通过同源重组和NHEJ两者发生。
实施例13.从相同细胞产生分泌的和膜结合的抗体片段
如上所述，用编码跨膜结构域的外显子构建哺乳动物展示载体pD2和pD5，所述跨膜结构域侧接有由Dre重组酶识别的两个ROX识别位点[88]。为了判定是否可能从膜结合形式转换为分泌形式，将用pD2-D1.3/AAVS TALEN对转染产生的杀稻瘟菌素抗性群体用编码Dre重组酶的质粒(pCAGGs-Dre)重新转染。这是基于质粒pCAGGs-Dre-IRES puro[88]，所述质粒pCAGGs-Dre-IRES puro驱动来自CAGGs启动子(GeneBridges，A205)的Dre重组酶基因。使用标准分子生物学技术去除嘌呤霉素抗性基因。在22天的杀稻瘟菌素选择后，将细胞设置为0.5×106个细胞/ml，并如前所述用0.5μg pCAGGs-Dre/106个细胞进行转染。6天后收集上清液，使用蛋白质A纯化抗体，然后将样品在SDS-PAGE凝胶上电泳跑样并用考马斯蓝染色。图19a显示即使没有用Dre重组酶基因转染，在上清液中也发现了分泌的抗体。这可能是由于其中编码跨膜结构域的外显子被跳过的可变剪接。或者，培养上清液中的抗体可来自对膜结合抗体的裂解。Dre重组酶的转染增大了所分泌抗体的水平(图19a)。
在实施例7(图9h)中描述的实验中也证实了分泌的scFv-Fc融合体的产生。将通过针对β-半乳糖苷酶的1轮噬菌体展示选择的抗体scFv群体引入pD6载体中并使用AAVSTALEN整合到HEK293细胞的AAVS基因座中。通过流式分选来分选抗原结合细胞，并且使选出的细胞在分选后，在没有培养基的变化的情况下生长7天，以允许抗体积聚。将ELISA板用β-半乳糖苷酶(10ug/ml)或BSA(10ug/ml)包被过夜。将来自7天培养物的培养上清液与50％体积的6％Marvel-PBS，以及一式三份测试的样品混合。还测试了1/10的稀释物。使用抗人IgG-Eu(Perkin Elmer，目录号1244-330)进行对结合的scFv-Fc融合体的检测。图19b显示可以直接从纯的培养上清液或用1/10稀释物来直接检测抗体结合。这说明，可以在相同的细胞内实现表面展示和抗体分泌两者，而无需另外的步骤。可以在单细胞克隆后从选出的细胞直接获得分泌的抗体，或使用如本文所示的所分选群体来产生多克隆抗体混合物。
实施例14.将scFv转化为IgG或Fab形式的简单方法
发明了一种新颖的方法来实行如实施例7中所述的格式化为scFv的抗体向IgG形式的转化。这种转化是在采用scFv抗体噬菌体展示文库进行抗体药物开发项目期间必需的过程，其中需要IgG或Fab格式化的抗体作为最终形式。目前的方法是繁重的，并且涉及将可变重链(VH)和可变轻链(VL)个别地克隆到合适的表达载体中。此外，“全部”转化scFv群体是不可能的，因为VH链和VL链之间的连接丧失。这是成问题的，因为VH链和VL链两者都有助于抗原结合特异性。目前不能容易地将scFv群体转化为Ig或Fab形式限制了筛选大量将在临床中使用的最终形式抗体的能力。筛选Ig或Fab形式的重组抗体以用于靶结合、细胞报告物筛选和包括聚集状态的生物物理学性质和功能的能力是选择候选抗体药物作为临床候选物的必要步骤。在此阶段测试的IgG或Fab形式抗体的数目越多，则选出最佳抗体药物候选物的概率越大。本文描述了用于以保持原始可变重链(VH)和可变轻链(VL)配对的方式将单链抗体(scFv)群体转化为免疫球蛋白(Ig)或Fab形式的方法。所述方法允许将单克隆、寡克隆或多克隆scFv同时转化为Ig或Fab形式。优选地，所述方法通过生成非复制型"微环"DNA来进行。优选地，完全转化过程需要细菌(诸如大肠杆菌)的单一转化以产生细菌菌落群，每个细菌菌落含有编码独特Ig或Fab格式化的重组抗体的质粒。这不同于需要两个单独的克隆和转化步骤的替代方法[117]。
更广泛地，本发明的此方面涉及以单克隆步骤将具有3个连接的遗传元件A、B和C(在scFv的情况下分别用VH、接头和VL表示)的基因构建体转化为其中侧翼元件(A和C)的次序被颠倒的形式的方法。可以保留中间元件，但最有用的是所述方法允许用新元件D代替该中间元件(以产生C-D-A)。在将scFv转化为IgG或Fab的实例中，则C是抗体VL结构域，而A是VH结构域。在此实例中，元件D包封与VH(因子A)融合的轻链恒定结构域、多聚腺苷酸位点、启动子和前导序列。在此过程中，重新克隆产物(C-D-A)，以使得侧翼序列也被改变。在scFv至IgG转化实例中，VL元件前面是启动子和前导序列，并且VH在IgG格式化的抗体的情况下后接CH1-CH2-CH3结构域，而在Fab格式化的抗体的情况下后接CH1结构域。所述方法可以更广泛地应用，其中元件A和C(使用上述命名法)可以代表其它遗传元件，例如在具有循环置换的蛋白质的构造中，其中原始N和C末端被融合并且新颖的内部末端被工程化。
图21示意性地示出了使用scFv至IgG转化的转化过程作为实例。将编码抗体VH结构域和VL结构域的DNA插入物(a)与编码恒定轻(CL)链、多聚腺苷酸化序列(pA)，巨细胞病毒(CMV)启动子和信号肽(SigP)的DNA片段(b)连接。DNA片段(b)还可以编码任何启动子来代替CMV启动子。又，pA-CMV盒可以用内部核糖体进入位点(IRES)[119]或2A型“自裂解”小肽[130,133]替代。通过“粘性末端”连接促进DNA分子(a)和(b)的接合以产生非复制型DNA“微环”(c)。在图21中，使用Ncol和Notl位点，因为它们用于产生McCafferty噬菌体展示文库[7]，然而任何合适的限制性位点可用于产生非复制型的“微环”c。连接后，将“微环”c用限制性酶Nhel和Xhol线性化，限制性酶Nhel和Xhol的识别位点位于VH结构域和VL结构域之间的接头的侧翼。选择Nhel和Xhol来说明本发明，因为它们用于产生McCafferty噬菌体展示文库[7]，然而可以使用任何合适的限制性位点。
然后纯化线性化产物d，并与消化的载体(e)连接。载体(e)包括CMV或pEF启动子以及Nhel位点上游的信号序列，并编码Xhol位点下游的抗体恒定重(CH)结构域1至3。载体还编码细菌来源或复制物以及抗生素抗性标记(未示出)，以使得能够在细菌中进行对所得质粒DNA的选择和复制。插入物(d)与载体(e)连接的产物将产生质粒f，质粒f可用于转化细菌并用合适的选择性标记进行生长，从而允许通过标准方法生产和纯化质粒DNA。可以将纯化的质粒f引入哺乳动物细胞[134]中以用于异源Ig抗体表达。或者，编码载体(e)中CH1-3的DNA可以用编码用于Fab表达的单个CH1结构域的DNA替代。
在下文用于说明本发明的详细方法描述中，插入物b含有能够从单个信使RNA(mRNA)表达分离的抗体轻链和重链的CMV启动子或P2A肽。所述方法是不明显的，并且在若干次实验尝试后被改进。例如，通过PCR尝试初始线性化DNA“微环”(c)。然而，这导致了同二聚体副产物的扩增，从而导致所需产物(d)的低产率。相比之下，直接消化DNA“微环”(c)提供了足够的材料(d)来允许所述方法被成功地实施。其次，为了防止产生不希望的同二聚体产物，插入物(a)最初被去磷酸化。然而，这需要仔细控制以防止“末端”消化而导致产物缺乏用于连接的所需“粘性末端”。最佳方法不包括脱磷酸化以使连接感受态产物的比例最大化。最后，需要仔细控制在DNA插入物(a)和(b)的连接中使用的比例，以最大化DNA“微环”(c)的产量。
1.制备PCR scFv插入物
从细菌甘油原种贮存液(bacterial glycerol stock)，携带编码scFv的质粒DNA刮入50ul水中。将其稀释为1/10。使用5ul此稀释物用于含有正向引物pSANG10pelB(CGCTGCCCAGCCGGCCATGG SEQ ID NO:95)(2.5μl，5μM)、反向引物2097(GATGGTGATGATGATGTGCGGATGCG SEQ ID NO:96)(2.5μl，5μM)、10x KOD缓冲液(购自Merck的KOD热启动试剂盒，71086-4)、dNTP(5μl，2mM)、MgSO4(2μl，25mM)、KOD热启动聚合酶，总体积为50μl的PCR反应。循环条件为94℃2分钟，然后25个循环的94℃30秒，54℃30秒，然后72℃1分钟。用离心柱(Qiagen或Fermentas)进行PCR纯化，并在90μl中洗脱PCR反应物。图22a显示加载在1％琼脂糖TBE凝胶上的1μl PCR反应物。通过加入总体积为100μl的缓冲液4(New England Biolabs)、BSA(0.1mg/ml)和40单位Ncol-HF和Notl-HF来消化经纯化的scFvDNA(80μl，8μg)，然后在37℃温育2小时。将插入物用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化，以30μl洗脱，然后通过用纳米分光光度计(Thermo)测量260nM处的吸光度来测量DNA浓度。
2.DNA插入物的连接(图21a和图21b)
进行连接反应以产生DNA“微环”(图21c)。连接反应物含有插入物b(125ng)、scFv插入物a(图21)(125ng)、10x连接缓冲液(Roche T4DNA连接酶试剂盒，1.5ul)、T4DNA连接酶(1单位)，总体积为15μl。在21℃下温育1-2小时。将水(35μl)加入到连接混合物中，并用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化，并以30μl洗脱。
3.用Xho1/Nhe1消化DNA“微环”(图21c)
通过加入总体积为35μl的缓冲液4(New England Biolabs，3.5μl)、BSA(0.1mg/ml)和10单位Ncol-HF和Notl-HF来消化经纯化的连接反应物(28μl)，然后在37℃温育2小时。然后通过在1％琼脂糖TBE上分离来纯化(图22b)。或者，图22c示出含有P2A序列代替CMV启动子的线性化“微环”。切下2.6kb的DNA条带(图22b)，并用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化，然后以30μl洗脱。
4.用plNT3(Xhol/Nhel切割)载体连接线性化的DNA“微环”d，
以及转化大肠杆菌DH5α。
用最终体积15μl的pINT3切割载体(50ng)、线性化“微环”d(20ng)、10x连接酶缓冲液(Roche，1.5μl)和1单位T4 DNA连接酶(NEB)建立标准连接物。在21℃温育2小时。根据制造商的说明书转化亚克隆效率的大肠杆菌DH5α化学感受态细胞(Invitrogen公司，产品目录号18265017)。将80μl化学感受态DH5a细胞加入到6μl连接混合物中，置于冰上1小时，在42℃下热激1分钟，冰2分钟，然后转移到含有900μl SOC培养基的14ml聚丙烯管中，在37℃温育1小时，并接种在LB amp平板上。
实施例15：通过使用流式电穿孔的核酸酶定向整合在哺乳动物细胞中构建大型展 示文库
电穿孔是将DNA、RNA和蛋白质引入细胞的有效方式，并且电穿孔流系统允许将DNA有效引入大量哺乳动物细胞中。例如，“MaxCyte STX可扩展转染系统”(Maxcyte)允许在30分钟内电穿孔1010个细胞，产生在一天内转染高达1011个细胞的可能性。将细胞和DNA混合并从贮器传送到电穿孔室，经电穿孔，泵出，并用新鲜的细胞和DNA的等分试样重复所述过程。相同的方法可以应用于将DNA、RNA、蛋白质或其混合物引入培养细胞(例如，人HEK293细胞或Jurkat细胞)或原代细胞(例如人淋巴细胞)[135]。流式电穿孔已经用于有效地将DNA、RNA和蛋白质引入大量的原代细胞和培养细胞中。
在此我们例示了使用此类系统通过与编码靶向人HEK293细胞和Jurkat细胞的人AAVS基因座的一对TALE核酸酶的DNA共转染来引入供体DNA、编码抗体的基因。
通过使用荧光标记的抗原，通过流式细胞术测定2种不同抗体特异性的分布。之前已经描述了识别FGF受体FGFR1或FGFR2的抗体的产生[105]。如实施例6所述将克隆α-FGFR1_A和α-FGFR2_A(如本文所述)克隆到pD6中。另外，使用针对β-半乳糖苷酶(β-gal)的一轮噬菌体展示从“McCafferty”噬菌体展示文库[7]选择的scFv抗体群体也被克隆到此载体中(如实施例6所述)。
将HEK293细胞离心并在制造商的电穿孔缓冲液(Maxcyte电穿孔缓冲液，ThermoFisher Scientific，目录号NC0856428)中以108个细胞/ml的最终体积重悬。将4×107个细胞(0.4ml)的等分试样加入含有100μg DNA(即，2.5μg/106个细胞)的电穿孔小杯中。所使用的不同组分的量如下所示。提供编码抗体α-FGFR1_A和α-FGFR2_A的供体DNA作为等摩尔混合物，每106个细胞的总量如下表6所示。使用编码AAVS-SBI TALEN(pZT-AAVS1 L1系统和pZT-AAVS R1系统，Bioscience，目录号GE601A-1)的DNA作为等摩尔混合物，每106个细胞的总量如下表6所示。在没有添加TALEN的样品中，使用对照质粒pcDNA3.0使输入DNA达到2.5μg/106个细胞。
通过计数对于给定的总细胞输入实现的杀稻瘟菌素菌落的数目来计算转染效率百分比。与阴性对照相比的倍数差异(即，没有添加TALEN DNA)示出于括号中。最终，在最后一行中计算通过运行Maxcyte系统的完整循环可实现的转化菌落的数目，所述全循环涉及电穿孔1010个细胞。这代表约30分钟的单个循环，提供了在一天中运行多个循环的潜能。因此，日输出量可高出5-10倍。大规模发酵和培养系统如Wavebag系统(GE Healthcare)或Celltainer系统(Celltainer Biotech)可用于产生细胞以供转染，并可用于培养所得的文库。
表6.HEK293细胞的电穿孔
此实施例表明，可以用整合的抗体盒制备非常大型的细胞文库。转染效率在2.7％至6.1％的范围内。在经β-半乳糖苷酶选择群体(样品13)的情况下，可以在单一流式电穿孔时期中产生含5.5×108个克隆的文库。在一天中使用多于一个流式电穿孔时期的情况下，可以产生含2-5×109个克隆的文库。
13天杀稻瘟菌素选择(10μg/ml)后，如前所述用藻红蛋白标记的抗Fc抗体(Biolegend，目录号409304)标记细胞。在针对β-半乳糖苷酶选择的抗体群体中，34-36％的细胞对Fc表达是阳性的，11-13％对结合10nM浓度的Dyelight-633-标记抗原是阳性的。
在使用FGFR结合克隆的情况下，98-99％的细胞对Fc表达是阳性的。使用α-FGFR1_A和α-FGFR2_A抗体的混合物提供了检查含有多重整合事件的细胞的比例的机会。对于具有正确整合的盒(例如，α-FGFR1_A)的单个细胞，存在约50:50的第二次整合将具有替代特异性(即，α-FGFR2_A)的概率。如果存在频繁的多重整合，则双阳性克隆的比例将为高的，然而，未发现双阳性克隆的比例高，这说明了核酸酶定向的文库整合系统在生成一种抗体基因/每细胞方面的保真度。证实了表面展示的抗FGFR抗体特异性结合其适当抗原的能力。抗原的表达来自编码小鼠Fgfr1胞外域(ENSMUSP00000063808)的质粒pTT3DestrCD4(d3+4)-His10[134]。这用于转染HEK293悬浮细胞和通过固定化金属亲和层析纯化的分泌的Fgfr1-rCd4-His10，如前所述[134]。从IMAGE克隆9088089使用以下引物PCR扩增小鼠Fgfr2胞外域：
2423(TTTTTTCCATGGGCCGGCCCTCCTTCAGTTTAGTTGAG)(SEQ ID NO:97)
和
2437(TTTTTTGCGGCCGCGGAAGCCGTGATCTCCTTCTCTCTC)(SEQ ID NO:98)，
用Ncol/Notl消化并克隆到表达质粒pBIOCAM5中[126]。Fgfr2-Fc通过如先前所述的HEK293细胞的瞬时转染来表达[134]并通过亲和层析纯化。
使用两种标记的抗原探测转染的群体的双重结合，并且双阳性的比例低。在此实验中，使用197ng供体DNA/106个细胞时，发现了文库大小(2.7×108个克隆/每Maxcyte时期)与低百分比的双阳性(3.5％)的最佳平衡(图23)。
此双阳性比例可以代表第二抗体盒的错误并入，但是鉴于所述文库的核酸酶定向整合的效率，也有可能是两个等位基因(在此实施例中为AAVS基因座)可靶向于一定比例的细胞中的引入结合物。细胞内存在两种不同抗体基因本身不会妨碍结合物或其编码基因的分离，但此存在可以通过首先在单个基因座修饰靶细胞以引入单个核酸酶靶向位点(例如，预先整合的Sce1大范围核酸酶位点，如实施例9所示)来阻遏。
实施例16.从所分选的文库群体中回收编码结合物的基因。
对β-半乳糖苷酶(如实施例6所述)进行噬菌体展示选择，并且将来自1-2轮选择的抗体群体克隆到载体pD6中，并如实施例6所述引入HEK293细胞的AAVS基因座中。根据制造商的说明书使用Lightning Link Dyelight-633(Innova Bioscience，目录号325-0010)标记β-半乳糖苷酶。将经转染的细胞群在杀稻瘟菌素(10μg/ml)中选择25天，并用10nMDyelight-633标记的β-半乳糖苷酶和藻红蛋白标记的抗Fc(Biolegend，目录号409304)标记。将细胞与抗体一起在4℃温育30分钟，以PBS/0.1％BSA洗涤两次，重悬于PBS/0.1％BSA中，并使用流式分选仪分选双阳性细胞。
扩增所分选的细胞，并使用10nM抗原进行第二轮分选。使细胞生长，并从经分选、选择的群体中分离基因组DNA或mRNA。
在包含不同链的结合物(例如IgG格式的抗体)存在于相同的基因组序列上(例如通过在相同质粒上引入)但是转录成不同的mRNA中的情况下，通过从基因组DNA扩增可最佳地回收编码多聚体结合物的单独基因。作为替代，通过使用“内部核糖体进入序列”(IRES)元件或序列(诸如促进翻译停止/蛋白质裂解的病毒P2A或T2A序列)，可以在相同的mRNA上编码包含多个蛋白质链的结合物[133,136]。在这种情况下以及在结合物编码在单个蛋白质链上的情况下，也可以从mRNA中分离编码的基因。
使用“DNeasy血液和组织试剂盒”(QIAGEN，目录号69504)制备基因组DNA。使用“Isolate II RNA mini试剂盒”(Bioline Bio-52072)制备mRNA。为了从基因组DNA扩增，根据制造商的说明书使用Phusion聚合酶与“2xPusion GC”混合物建立PCR反应。侧接Nco1和Not1克隆位点的引物，例如引物2622(GAACAGGAACACGGAAGGTC)(SEQ ID NO:99)和2623(TAAAGTAGGCGGTCTTGAGACG)(SEQ ID NO:82)，用于扩增抗体盒(98℃10秒，58℃20秒，72℃90秒的35个循环。
从mRNA扩增编码所选scFv基因的基因。使用“Isolate II RNA mini试剂盒”(Bioline，目录号Bio-52072)从分选的细胞中分离总RNA。使用Superscript II逆转录酶(Life Technologies，目录号180064-022)从2μg RNA合成cDNA。然后使用KOD Hot StartDNA聚合酶(Merck Millipore，目录号71086-3)，使用侧接Nco1克隆位点和Not1克隆位点的引物，通过PCR从cDNA扩增所选择的scFv基因。在这种情况下，引物：
41679 ATGAGTTGGAGCTGTATCATCC(SEQ ID NO:100)和
2621 GCATTCCACGGCGGCCGC(SEQ ID NO:101)
用于扩增抗体盒(95℃20秒，60℃10秒，70℃15秒，25个循环)。将PCR产物用Nco1和Not1消化，然后克隆到细菌抗体表达载体pSANG10的Nco/Not1位点中。pSANG10的构建，用于细菌表达的方法和通过ELISA进行的筛选描述于Martin等人2006[127]中。
来自通过噬菌体展示进行的1轮选择的群体的ELISA筛选显示0/90的克隆是阳性的。相比之下，当此相同群体进一步经受哺乳动物展示并回收和筛选scFv基因群体时，27/90个克隆(30％)在ELISA中为阳性的。这说明可以在文库上进行哺乳动物展示并回收富集的结合物群体。
实施例15描述了使用流式电穿孔将通过针对β-半乳糖苷酶的1轮噬菌体展示选择的群体引入到HEK细胞中。如前所述将哺乳动物展示细胞群在杀稻瘟菌素中选择，并使用10nM标记的β-半乳糖苷酶进行流式分选。生长9天后，通过流式细胞术发现75％的细胞对于使用10nMβ-半乳糖苷酶进行β-半乳糖苷酶结合呈阳性)。这些细胞将被进一步分选和扩展。为了说明驱动严格性的潜能，使用1nM或10nM抗原浓度进行标记。分别从每个群体中分选20.3％和55.9％的细胞。分选后，立即从分选的群体制备mRNA，而不进行另外的细胞培养。在克隆、细菌中表达和ELISA筛选(如前所述)后，发现在流式分选期间ELISA成功率随着严格性的增加而增大。展示最高信号水平的克隆来自此组，并且阳性克隆的数目也得到改善(图24)。这说明了在展示群体内驱动选择严格性的能力，反映为所得抗体的更好性能。
实施例17.通过核酸酶定向整合并入T细胞受体(TCR)基因以用于哺乳动物文库产 生。
本文所述的方法具有超出抗体展示的应用。为了证明使用核酸酶定向整合来筛选T细胞受体文库的潜能，构建了允许T细胞受体表达的载体构建体(plNT20)。
plNT20(图25a)是用于靶向人AAVS基因座的双启动子载体。其具有左同源臂和右同源臂，如图3所示。左AAVS同源臂侧接独特的AsiSI和Nsi1位点，其后是剪接受体和嘌呤霉素基因。左同源臂末端和剪接受体之间的序列与前述相同，并且嘌呤霉素基因以与上游外显子在框内的ATG开始((图25B，也如图3中关于杀稻瘟菌素基因所示)。正确的核酸酶定向整合将导致对嘌呤霉素基因的框内剪接，嘌呤霉素基因被剪接到内源性上游外显子，该内源性上游外显子本身由内源性AAVS启动子驱动，从而允许选择具有正确整合的克隆。嘌呤霉素抗性基因后面是SV40多聚腺苷酸化位点。右AAVS同源臂侧接独特的BstZ171和Sbf1位点。
plNT20配置为具有pEF启动子(来自pSF-pEF，Oxford Genetics，目录号OG43)，所述pEF启动子允许将所关注的基因克隆到Nhe1/Kpn1位点中。Nhel位点前面是分泌前导序列，并且Kpn1位点后面是牛生长激素的多聚腺苷酸化信号(bGH多聚腺苷酸)，如先前在图2中所示。下游是允许通过Nco和Not(如图2所示)或Hind3进行克隆的CMV启动子(来自pSF-CMV-f1-Pac1，Oxford Genetics，目录号OG111)。Nco1位点之前是分泌前导序列，而盒后面是bGH多聚腺苷酸位点。
为了例示T细胞受体(TCR)的展示和富集，使用识别由Li等人(2005)描述并且稍后由Zhao等人(2007)描述的癌症标记的TCR。[137,138]。称为c12c2的这种TCR以450nM的亲和力识别呈现在HLA-A2上的肽SLLMWITQV(SE ID NO:102)。此肽表示来自NY-ESO-1的残基157-165(NY-ESO-1 157-165)。此肽是称为1G4、具有32μM的亲和力的亲本抗体的亲和力成熟变体。
使用识别另一种癌症标记的第二TCR。亲本MEL5 TCR识别在HLA-A2上呈现的具有肽序列ELAGIGILTV(SEQ ID NO:103)的肽MART-1 26-35(“由T细胞-1识别的黑素瘤抗原”)。此TCR通过噬菌体展示进行亲和力成熟以产生克隆α24/β17，具有0.5nM亲和力，描述于Madura等人(2013)[139]。已经解析了TCR和MHC:肽复合物之间的复合物的结构(pdb代码4JFH)，并且该克隆在下文中命名为“4JFH”。相同的亲本TCR还已经基于Pierce等人的设计(2014)[140]和所解析的复合物结构进行了工程化。
根据Debets和其同事，甚至在天然人TCR的存在下，如所示附着CD3ζ结构域也倾向于引起异源基因的缔合[141,142]。所用的CD3ζ元件由胞外结构域、跨膜结构域和完整的细胞质结构域组成。此外，用异源基因中的小鼠恒定结构域替代人恒定结构域也倾向于驱动小鼠恒定结构域缔合，而不是与内源人恒定结构域缔合[143]。最终，使用小鼠恒定结构域提供了针对人TCR本底检测异源TCR链的选项。将这些元件并入TCR表达盒的设计中。
设计和合成两种合成基因，以产生具有以下结构的基因构建体：
人TCR Vα-小鼠α恒定-人CD3ζ
人TCR Vβ-小鼠β恒定-人CD3ζ
并入α链构建体和并入了c12/c2的可变结构域的β链构建体的合成基因的序列示出于图25c和图25d中。将这些构建体分别克隆到plNT20的Nhe1/Kpn1位点和Nco1/Hind3位点。编码此TCR的构建体称为plNT20-c12/c2。在第一种情况下，合成基因被设计为并入VαCα结构域(侧翼为Nhe1和Not1位点)和Vβ结构域(侧翼为编码TCR c12/c2的Nco1/Xho1位点)。然后可以使用这些限制位点用替代TCR取代这些元件。
制备编码4JFH[139]的Vα和Vβ结构域的两种另外合成基因(图25e和图25f)。编码此TCR的构建体称为plNT20-4JFH。
使用3μg表7中所示比例的plNT20-c12/c2和plNT20-4JHF作为供体DNA(300ng供体DNA/每106个细胞)转染107个HEK293细胞。plNT20-c12/c2被称为TCR1，而plNT20-4JHF被称为TCR2。将各自5μg的pZT-AAVS1 L1和pZT-AAVS R1 TALEN添加到107个细胞(500ng/106个细胞)，例外是在样品6中此添加用10μg对照DNA(pcDNA3.0)代替。如上所述，通过聚乙烯亚胺转染引入DNA。
表7
选择12天后(0.25μg/ml嘌呤霉素)，用靶抗原标记细胞。由上述TCR识别的肽:MHC复合物呈现为藻红蛋白标记的五聚体(Prolmmune)。c12/c2识别呈现在HLA-A2上表示NY-ESO-1 157-165的肽SLLMWITQV(Proimmune，代码390)。4JHF(也称为α24/β17)识别在HLA-A2上呈现的代表MelanA/MART 26-35的肽ELAGIGILTV(Proimmune产品编号082)。在每种情况下，MHC:肽复合物都用藻红蛋白标记并根据制造商的说明书使用。图26(a-d)显示每种TCR对于预期的MHC:肽复合物是特异性的(a，d)，并且不能结合复合物中的非同源肽(图26b，图26c)。将编码每种TCR的DNA与100倍过量的编码另一种TCR的DNA混合(样品1-2，表7)。转染HEK293细胞并在嘌呤霉素中选择。在嘌呤霉素选择14天后进行抗原阳性细胞的分选(图26g，图26h)。
为了定量流式分选输出群体内的富集水平，通过PCR扩增回收TCR基因，并在克隆后测定每种TCR种类的相对量。从分选的群体中分离总RNA。如实施例16所述进行cDNA合成。扩增TCRα和β链的引物分别是1999/2782和41679/2789(表8)。PCR扩增使用制造商推荐的方案(EMD Millipore，71086，EMD Millipore)，采用KOD热启动聚合酶。PCR反应条件为95℃(2分钟)和25个循环的95℃(20s)，60℃(10s)，70℃(15s)，然后70℃(5分钟)。经扩增的TCRα和β链用Nhel/Notl或Ncol/Xhol消化并亚克隆入具有相容位点的载体(在这种情况下分别为pBIOCAM1-Tr-N Nhel/Notl或pBIOCAM2-Tr-N(Ncol/Xhol)切割载体)。使用c2c12(TCR1)特异性TCRα引物(2781)或4JFH(TCR2)特异性TCRα引物(4JFH-Va-F)和载体特异性引物扩增个别克隆的PCR以测定TCR克隆同一性。在分选其中采用1:100的TCR1/TCR2供体质粒比率的样品1(表7)后，使用呈现于HLA-A2上的肽SLLMWITQV(Proimmune，代码390)富集的TCR1特异性克隆如通过菌落PCR测定的，增多到11/15(73％)。通过分选其中采用100:1 TCR1/TCR2供体质粒的样品2(表7)，使用呈现在HLA-A2上的肽ELAGIGILTV(Proimmune产品代码082)进行的富集导致TCR2克隆的比例增大至4/15(27％)，如通过菌落PCR所测定的。
为了表现使用核酸酶定向整合的文库选择，通过克隆编码突变的TCRα链的基因组库和编码突变的TCRβ链的基因组库来生成基于c12/c2的突变体文库。此类文库可以使用寡核苷酸定向诱变方法生成，例如基于Kunkel诱变[144]的方法。作为替代和举例来说，使用PCR装配方法生成突变的TCRα链(作为Nhe1/Kpn1片段)和突变的TCRβ链(作为Kpn/Hind3片段，包含CMV启动子)，所述链被克隆到pNT20的Nhe1/Hind 3位点。使用表8中所示的引物进行此举。
(N＝A，C，G，T，S＝C或G，W＝A或T)
表8.用于文库构建和克隆回收的引物
设计突变寡核苷酸(引物2771)，其在c12/c2α链的CDR3内随机化2个氨基酸位置，并在另一个位置提供丝氨酸或苏氨酸选项(引物2771也由图25g的下链表示)。引物2771与引物2780一起使用以从Nhe1克隆位点产生突变TCRα组库，所述NheI克隆位点并入了末端具有不变序列的CDR3诱变区域。引物2781与引物2771的不变5'端互补。使用引物2781和2783的PCR提供TCRα-CD3ζ盒的剩余部分直到Kpn1位点。2个PCR片段的PCR装配用于生成TCRα-CD3ζ片段，所述TCRα-CD3ζ片段可以在用Nhe1和Kpn1消化后克隆到plNT20中。
设计第二突变寡核苷酸(引物2770)，其在c12/c2β链的CDR3内随机化2个氨基酸位置，并在另一位置提供缬氨酸或亮氨酸选项(引物2770由图25h中的下链表示)。引物2770与引物2785一起使用以从Kpn1克隆位点产生突变的TCRβ库，所述Kpn1克隆位点并入了在末端具有不变序列的CDR3诱变区域。引物2787与引物2700的不变5'端互补。使用引物2787和2788的PCR提供了TCRβ-CD3ξ盒的其余部分直至Hind3位点。这2个PCR片段的PCR装配用于生成TCRβ-CD3ζ片段，所述TCRβ-CD3ζ片段可以克隆到plNT20中。通过将Nhe1/Kpn片段、Kpn1/Hind3片段克隆到经Nhe1/Hind3消化的plNT20中，生成在α链和β链的CDR3处均并入突变的完整组库。连接后，将文库克隆到电感受态DH10B细胞中。制备质粒DNA，并将DNA与如前所述编码TALE核酸酶的载体(pZT-AAVS1 L1和pZT-AAVS R1系统的等摩尔混合物，Bioscience，目录号GE601A-1)一起转染到HEK293细胞中。
在将c12/c2突变体文库的突变α和β链连接到plNT20中后，将DNA电穿孔到DH10B细胞中，制备质粒DNA，并用靶向AAVS基因座的TALE核酸酶共转染文库。使用Maxcyte电穿孔进行转染。如上所述地生长和选择。通过滴定经转染的细胞并在嘌呤霉素中进行基于平板的选择来定量文库大小，表明产生了5×105的文库大小。在进行嘌呤霉素选择11天后，用对小鼠TCR的β链特异的APC标记抗体(Life Technologie，目录号H57-957)标记细胞。图26i-j显示群体中38％的克隆表达T细胞受体。在这个TCR阳性群体中，13％还结合肽1(占总群体的5％)。通过此方法，可以分离具有改善的表达或肽:MHC结合活性的克隆。
从图26可以看出，每个T细胞受体仅识别其同源抗原。此外，当使用两种不同特异性的混合物时，可以通过标记的抗原来区分它们中的每一种。此方法还允许通过鉴定比亲本克隆更大程度标记的突变TCR文库子集来区分突变TCR文库中具有改进亲和力(或表达)的TCR克隆。
通过电穿孔将T细胞受体基因也引入Jurkat细胞内。将Jurkat细胞离心并在制造商的电穿孔缓冲液(Maxcyte电穿孔缓冲液，Thermo Fisher Scientific，目录号NC0856428)中以108个细胞/ml的最终体积重悬。将等分试样的4×107个细胞(0.4ml)加入到含有40μgDNA(即1μg/106个细胞)的OC400电穿孔小杯中。DNA由供体质粒DNA(plNT20-c12/c2或plNT20-4JHF或plNT20-c12/c2 TCR文库，9.2μg)和编码AAVS-SBI TALEN的DNA(pZT-AAVS1 L1和pZT-AAVS R1 Systems Bioscience，目录号系GE601A-1)的等摩尔DNA混合物(共30.8μg)组成。在没有添加TALEN的样品中，使用对照质粒pcDNA3.0使输入DNA达到1μg/106个细胞。将T细胞受体基因引入Jurkat细胞的替代方法使用了4D-Nucleofector(Lonza)。在此，转染方案遵循根据SE细胞系试剂盒(Lonza，目录号PBC1-02250)的制造商说明书。简言之，每106个Jurkat细胞转染2μgDNA，所述2μgDNA由供体质粒DNA(plNT20-c12/c2或plNT20-4JHF或plNT20-c12/c2 TCR文库，0.46μg)和编码AAVS-SBI TALEN(pZT-AAVS1 L1和pZT-AAVS R1，Systems Bioscience，目录号GE601A-1)的DNA的等摩尔DNA混合物(总共1.54μg)组成。脉冲代码设置为CL120并且细胞类型程序特异于Jurkat E6.1(ATCC)细胞。
图26表明实现了TCR表达，并且实现了对合适的肽:MHC分子的识别。这依赖于TALE核酸酶的使用(比较图26m和图26n)。使用相关的肽:MHC分子还实现了通过引入的TCR进行信号传导。
将经plNT20-c12/c2转染的Jurkat细胞或未转染的Jurkat细胞以1×106个细胞/ml，200μl/孔的密度接种在96孔板中。在存在和不存在2μg/ml抗人CD28(BD Pharmingen，目录号555725)的情况下，以2μl或6μl每孔PE标记的肽1-MHC五聚体(Prolmmune)或2μg/ml抗人CD3(BD Pharmingen，目录号555329)刺激细胞。在37℃和5％CO2下温育24小时后，通过研究CD69表达来检测Jurkat细胞的激活。在4℃下用50μl PBS+1％BSA+0.5μl抗人CD69-APC(Invitrogen，目录号MHCD6905)每孔细胞染色45分钟。
图26(样品o和p)证明了用CD3刺激后CD69上调。所述图式还显示了添加2μl(q)或6μl(r)的肽1:MHC的效果。结合肽:MHC并表达CD69的双阳性细胞群是明显的。此实施例示出在CD28存在下温育的细胞，但在不存在CD28的情况下也能观察到相同的效果(未示出)。
该实施例证明了对替代类型的结合物(即T细胞受体)的文库进行核酸酶定向整合的潜能。我们证明了可以在细胞表面上表达TCR并使用特异性抗体检测TCR表达。我们还证明了这些T细胞受体特异性识别它们各自的靶标。我们还已经构建了允许选择改良的结合物的突变体文库。最后，我们已经证明基于T细胞中TCR信号传导激活的文库筛选是可能的。在此我们使用培养的人T细胞系。也可以通过Maxcyte电穿孔将DNA引入原代T细胞。用于分离和制备原代T淋巴细胞的方法是本领域中的技术人员已知的(例如，Cribbs等人，2013，Oelke等人2003[145,146]。经TCR转染的淋巴细胞暴露于多聚体肽:MHC然后可以用于通过暴露于肽:MHC多聚体[146]或负载有合适的肽的抗原递呈细胞[146,147]来实现激活。可以通过报告基因的表达或通过内源基因如CD69的上调来检测活化[104,148]。
实施例18.哺乳动物细胞上嵌合抗原受体文库的展示
T细胞的激活通常通过T细胞受体(TCR)与特异性肽:MHC复合物的相互作用发生。这继而导致通过CD3和其它T细胞信号传导分子定向的信号传导。作为由TCR定向的靶标识别的替代方案，已经显示可以将T细胞激活重定向至由scFv(或替代性结合物)识别的分子的方式，将替代的结合分子如单链Fvs作为与下游信号分子的融合物呈现在T细胞上。以这种方式，T细胞激活不再限于通过TCR针对肽:MHC复合物进行分子识别，而是可以针对其它细胞表面分子。其中非TCR结合实体与信号传导组分融合的此替代形式被称为“嵌合抗原受体”(CAR)。在T细胞的情况下，这已被证明是重新定向T细胞激活的重要和有价值的手段。
对于任何给定的靶标，仍然不清楚哪些最佳表位或亲和特征应当并入CAR中[103]。CAR设计的特征，诸如接头长度或跨膜结构域的选择，可继而影响什么构成最佳表位。靶细胞和非靶细胞上的抗原密度与信号传导结构域选择的组合可影响最佳亲和力要求。在T细胞上呈现嵌合抗原受体文库的能力提供了单独或组合地鉴定最佳结合特异性、结合物形式、接头长度/序列、融合信号传导模块的变体等的机会。在此，我们说明了核酸酶定向整合对于在哺乳动物细胞中构造嵌合抗原受体文库的效用。载体plNT21(图27a)是单CMV启动子载体，用于方便表达和分泌结合物(例如侧接有Nco1/Not1限制性位点的scFv)，以允许与上游前导序列和下游融合配偶体(如早先在图8中示出)进行框内表达。plNT21中的CAR表达盒侧接如早先在图3中所述的AAVS同源臂。
载体plNT21-CAR1(图27a，图27c)将结合物(诸如单链Fvs)融合至CD3ζ的跨膜结构域和胞内结构域(图27c，并且如所描述用于图25中的TCR表达)。此形式往往称为“第一代”嵌合抗原受体。来自其它共刺激分子的信号结构域也已经用于提供另外的信号，并且这些信号传导结构域已经表现出改善的信号传导。这些被称为第二和第三代嵌合抗原受体。例如，plNT21-CAR2(图27b，图27d)将结合物(在这种情况下方便地作为Nco1/Not1片段克隆融合到先前描述的第二代结构域(WO2012/079000A1中，所述第二代结构域由以下项组成：
来自CD8的铰链和跨膜结构域
4-1BB信号传导结构域
CD3ζ信号传导结构域
作为实例，将大量不同的结合物群克隆到plNT20-CAR1和plNT20-CAR2的Nco/Not1位点中。CD19先前已经用于许多不同的研究中，以靶向参考文献Sadelain等人(2013)[103]中的B细胞恶性肿瘤。将前述的抗CD19抗体(WO 2012/079000A1)(称为FMC63)制备为VH-接头-VL构型或VL-接头-VH构型(分别为FMC63H-L或FMC L-H的合成scFv基因，图27E示出FMC63H-L的序列。FMC63L-H被配置为具有VL-接头-VH构型的可变结构域，其在5'末端和3'末端分别侧接Nco1和Not1。
作为对照，具有替代结合特异性的scFv也被克隆到plNT20中。这些scFv包括抗FGFR1_A[105]和抗结蛋白对照抗体[7]。此外，引入识别lox1(图29a，图29b)的Adhirons[152]作为配置为CAR融合体(参见实施例19的描述)的结合物的替代形式的实例。
为了证明以CAR形式存在的结合物文库的生成，克隆针对间皮素和CD229选择的scFv格式的抗体群体。间皮素是在许多癌症(包括间皮瘤)中高度表达的细胞表面糖蛋白。许多基于抗体的形式正在开发和临床试验中，包括针对间皮素的CAR[149]。CD229表示另一种潜在的肿瘤相关抗原，其可以通过免疫治疗在诸如慢性淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤等癌症中被靶向[150,151]。
使用如实施例6和参考文献7)中所述的“McCafferty”噬菌体展示文库，通过选择生成识别间皮素或CD229的抗体群体。进行两轮选择，并使用引物M13leadseq和Notmycseq(实施例6)回收scFv编码基因。将产物用Nco1/Not1切割，凝胶纯化并克隆到plNT21-CAR2中。通过TALE核酸酶裂解将这些基因引入HEK293细胞的AAVS基因座，以产生针对CD229为4.8×105和针对间皮素为6.4×105的文库(代表与不存在TALE核酸酶的情况下转染的样品相比，文库增大30倍和53倍)。
通过PEI转染将plNT20-CAR1和plNT20-CAR2引入HEK293细胞。在此将供体质粒DNA(plNT20-CAR1或plNT20-CAR2，6μg与编码AAVS-SBI TALEN的DNA(pZT-AAVS1 L1和pZT-AAVSR1，Systems Bioscience，目录号GE601A-1)的等摩尔DNA混合物在Freestyle 293培养基(Lifetech，目录号12338-026)中混合，加入线性PEI(52μl，1mg/ml，Polysciences Inc.)并在室温下温育10分钟。然后将混合物加入到在125ml通风锥形瓶中的20ml HEK293悬浮细胞(1×106个细胞/ml)中。还通过电穿孔将plNT20-CAR1和plNT20-CAR2引入Jurkat细胞中。将Jurkat细胞离心并在制造商的电穿孔缓冲液(Maxcyte电穿孔缓冲液，Thermo FisherScientific，目录号NC0856428)中以108个细胞/ml的最终体积重悬。将等分试样的4×107个细胞(0.4ml)加入到含有40μgDNA(即1μg/106个细胞)的OC400电穿孔比色皿中。DNA由供体质粒DNA(plNT20-CAR1和plNT20-CAR2，9.2μg)和编码AAVS-SBI TALEN的DNA(pZT-AAVS1 L1和pZT-AAVS R1，Systems Bioscience，目录号GE601A-1)的等摩尔DNA混合物(共30.8μg)组成。在没有添加TALEN的样品中，使用对照质粒pcDNA3.0将输入DNA变为1μg/106个细胞
使用Lightning-Link Rapid Dye-Light 633缀合试剂盒(Innova Biosciences，目录号325-0010)进行各种抗原的荧光标记。FGFR1和FGFR2的制备描述于实施例15中。Lox1和CD229购自R and D Systems(分别为目录号1798-LX-050和898-CD050)，CD19-Fc和间皮素来自(AcroBiosystems，目录号分别为CD9-H5259和MSN-H526x)。
图28b示出了核酸酶定向的抗FGFR1抗体[105]在第二代CAR构建体(plNT21-CAR2-FGFR1_A)内的展示。图28d还示出了作为与第二代嵌合抗原受体(plNT21-CAR2-lox1)的融合物的替代骨架分子(Adhiron ref[152])的展示。图28f和图28g还说明了针对间皮素或CD229选择的scFv文库内的阳性克隆。
在此实施例中，将CAR引入HEK细胞和Jurkat细胞中，但这也可以通过将构建体引入原代细胞如人T淋巴细胞来完成(例如，如Sadelain等人(2013)[103]所述，例如使用电穿孔[135]。可以进一步优化用于在淋巴细胞中表达CAR的表达构建体，例如通过经由5'和3'非翻译区、多聚腺苷酸长度等的变化来优化mRNA稳定性和翻译，如先前已经描述的[135]。引入原代T淋巴细胞或T淋巴细胞细胞系的CAR构建体的信号传导可以通过暴露于表达靶抗原或使用多聚体抗原(例如，固定在表面上或存在于珠粒上的抗原)[104,148]的细胞来诱导。
实施例19.经由核酸酶定向整合在哺乳动物细胞中构建的替代骨架的文库的展示
除了展示抗体和T细胞受体外，所述方法还可用于构建结合物文库。已经描述了大量替代骨架，以允许构建已经从中分离出新颖的结合特异性的变体文库，例如Tiede等人(2014)[152]及其中的参考文献。在Tiede等人(2014)描述的实例中，使用基于来自植物来源的植物生长抑制素的共有序列的稳定多功能骨架。此骨架称为Adhiron，并且图29a示出编码选择结合至lox1的Adhiron的合成基因(WO2014125290A1)。图29B示出了替代的lox1结合物(loxlB)。两者都被合成并克隆到plNT20_CAR2的Nco1/Not1位点中以生成与下游配偶体的融合体。
可以通过随机化环残基(例如通过如上文实施例17中所述的Kunkel诱变或PCR装配)构建文库。举例来说，图29c示出了用于按照与实施例17中所述相同的方法生成文库的突变寡核苷酸的设计。在这种情况下，通过引入可变数目的NNS残基来实现随机化，但是可以使用本领域技术人员已知的替代策略。
作为另一个实例，图29d和图29e说明了通过基于Knottin骨架[156]进行核酸酶定向整合来生成结合物文库的方法。Knottins是含有约30个氨基酸的肽，其通过三个二硫键稳定，其中一个穿过另两个以产生“打结”结构。图29d显示胰蛋白酶结合Knotin MCoTI-ll，其具有在5'端的Nco1位点和在3'端的Not位点，以允许用本文所述的载体进行框内表达。作为文库构建的实例，第一环的6个氨基酸(图29d中加下划线的)可以用可变数目的氨基酸突变。图29e示出了使用密码子VNS(其中V＝A，C或G并且S＝C或G)，用10个随机化氨基酸取代环1的6个氨基酸的诱变策略。
VNS密码子包括编码17种氨基酸(不包括半胱氨酸)的24个密码子。此策略用于说明性目的，并且替代性诱变策略将是本领域技术人员已知的。
实施例20.使用CRISPR/Cas9进行抗体文库的核酸酶定向引入
使用“Geneart CRISPR核酸酶载体试剂盒”(Lifetech A21175)说明通过CRISPR/Cas9进行的核酸酶定向整合。在此系统中，U6RNA聚合酶III启动子驱动与反式激活性crRNA(tracrRNA)连接的靶互补性CRIPSR RNA(crRNA)的表达。crRNA和tracrRNA一起构成指导RNA，其指导在相同的“GeneArt CRISPR核酸酶载体”(参见制造商的说明书)上编码的Cas9蛋白的裂解特异性。载体作为线性化质粒提供，其中向此载体中克隆具有合适的3'突出端的短双链寡核苷酸。然后通过所克隆区段的序列测定裂解特异性。设计两种不同的靶向序列以将裂解定向到上述人AAVS基因座。
所述序列为：
CRISPR1双链DNA插入物：
5’GGGGCCACTAGGGACAGGATGTTTT(SEQ ID NO:115)
3’GTGGCCCCCGGTGATCCCTGTCCTAC(SEQ ID NO:116)
CRISPR2双链DNA插入物：
5’GTCACCAATCCTGTCCCTAGGTTTT(SEQ ID NO:117)
3’GTGGCCAGTGGTTAGGACAGGGATC(SEQ ID NO:118)
所得到的指导RNA与上述TALE核酸酶靶向AAVS基因座的相同区域内的裂解(其中CRISPR2与CRISPR1反向)。因此，先前用于定向整合表达盒的AAVS同源臂可以用于进行由这些CRISPR指导的RNA定向的整合。将线性化载体和双链寡核苷酸连接并转化到电感受态DH10B细胞中。通过测序确认正确插入物的克隆，并制备质粒DNA。将Cas9/CRISPR2构建体(包含CRISPR2寡核苷酸)与编码通过1轮噬菌体展示选择(实施例15)选出的β-半乳糖苷酶文库的供体DNA一起转染。使用具有OC-400组件的Maxcyte电穿孔系统将这些物质转染到HEK293细胞中。用代表scFv基因群体的23.2μg供体DNA转染4×107个细胞，所述scFv基因通过针对克隆到pD6中的β-半乳糖苷酶的一轮噬菌体展示来选择。用77μg的Cas9-CRISPR质粒或77μg TALEN质粒(各38.5ng的pZT-AAVS1 L1和pZT-AAVS)或77μg对照质粒共转染细胞
表9
通过Cas9/CRISPR2转染形成的转化体的数目的滴定(通过测量杀稻瘟菌素抗性菌落)显示从接种的10,000个细胞产生了1053个杀稻瘟菌素抗性菌落，相当于10.5％的转染效率(表9)。在TALE核酸酶定向的情况下，实现了5.1％的转染效率。相比之下，在不存在Cas9/CRISPR2构建体的情况下，仅实现了0.36％的转染效率。
作为使用质粒DNA转染以将Cas9蛋白和指导RNA引入细胞的替代，也可以直接引入由Cas9蛋白(Toolgen,Inc.)和指导RNA组成的核蛋白复合物。由Toolgen,Inc.使用体外转录以T7启动子制备指导RNA以作为单一转录本，所述指导RNA包含在与靶DNA互补的序列(粗体)之前的TRACR序列(加下划线)，如下所示。
CRISPR 1 RNA(SEQ ID NO:119:
5’
GGGGGGCCACUAGGGACAGGAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCU
AGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
CRISPR 2RNA(SEQ ID NO:120):
5’
GGGUCACCAAUCCUGUCCCUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGC
UAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU
通过如上所述的Maxcyte电穿孔将6.6μg Cs9蛋白，4.6μg RNA和10μg供体DNA(编码pD6中的抗FGFR1_A抗体)引入107个HEK293细胞中。CRISPR1和CRISPR2RNA分别实现了2.2％和2.9％的转染效率，而在不添加Cas9:RNA蛋白复合物的情况下分别实现了0.7％和0.8％的转染效率。
这些指导RNA靶向由CRISPR1和CRISPR2编码的相同序列。作为替代，crRNA和tracrRNA可以通过化学合成制备(例如，GE Dharmacon)。
实施例21：通过连接或微同源介导的末端接合(MMEJ)进行核酸酶介导的抗体基因 插入。
虽然同源重组(HR)可用于大DNA片段的精确插入，但这需要构建并入长同源臂的大靶向载体。由于较大DNA构建体的转化效率降低，这可能使得大型文库的构建更困难。或者，如果核酸酶识别序列并入靶向载体中，则可在染色体DNA和靶向载体之间发生简单的连接反应。连接反应可以是采用例如锌指核酸酶(Orlando等人，2010)[45]或TALEN(Cristea等人，2013)[22]的“粘性末端”，其可以产生双链断裂(DSB)而留下离开5'突出端；或者其为使用CRISP/Cas9核糖核蛋白的“平末端”。通过构造载体pD7-Sce1显示了通过使用I-Scel大范围核酸酶连接进行核酸酶基因整合的实例。pD7衍生自pD6(图8)，但左AAVS同源臂和右AAVS同源臂被短双链寡核苷酸取代。pD载体系列的左AAVS同源臂侧接EcoR1和Nsi1限制酶(参见图3)。为了将pD6转化为pD7-Sce1，将其用由编码I-SceI大范围核酸酶识别序列的引物2778和2779形成的双链寡核苷酸插入物取代，其中双链寡核苷酸插入物的“粘性末端”与由EcoRI/NsiI形成的“粘性末端”相容。右AAVS同源臂侧接Asc1和Mlu1限制性位点(图3)。右同源臂用双链寡核苷酸插入物取代，所述双链寡核苷酸的"粘性末端"与通过AscI/MluI消化形成的"粘性末端"相容并且由引物2723和2724形成。
表10.用于pD7和plNT19构建的引物
将识别Fgfr1和Fgfr2(实施例15)的抗体克隆到pD7中以分别生成pD7-Scel抗-Fgfr1和pD7-Scel抗-Fgfr2。将这些用I-Sce1表达质粒(实施例11，图16)共转染到含有整合的I-Sce1识别位点的HEK293克隆6F细胞系(参见实施例11)中。
还可以实现由锌指核酸酶或TALE核酸酶产生的染色体和靶向载体中的DSB的连接。通过反向靶向载体上的锌指核酸酶或TALEN识别位点，这可以确保插入的产物不再是称为“专性连接门控重组”或ObLiGaRe(Maresca等人，2013)[153]的方法中的裂解靶标。pD7-ObLiGaRe载体可以与上述用于生成pD7-Sce1相同的方式产生。在这种情况下，左同源臂被由编码反向TALEN识别位点(以粗体显示)和间隔区的引物2808和2809组成的寡核苷酸取代。如上所述，用引物2723和2809取代右侧同源臂。
由非同源末端接合(NHEJ)介导的染色体和靶向载体中的DSB之间的简单连接反应的一种替代是微同源序列介导的末端接合(MMEJ)。MMEJ是一种DSB修复机制，其使用5至25bp之间的微同源序列用于易错末端接合(McVey和Lee，2008)[154]。已经设计了一种精确基因整合的策略，其中基因组序列和靶向载体含有相同的TALE核酸酶对识别序列，但是不同的载体间隔序列，其中前半部分和后半部分交换。基因组序列和载体可以用相同的TALEN对切割，并且MMEJ经由微同源DNA末端发生。所得整合的靶向载体不再是TALE核酸酶的靶，因为缩短的间隔区对于TALE核酸酶裂解不是最佳的(Nakade等人，2014)[155]。
MMEJ AAVS靶向载体pD7-MMEJ可以与上述用于生成pD7-Sce1相同的方式产生。在这种情况下，左同源臂被由编码所述TALEN识别位点(以粗体显示)和切换的间隔区(加下划线)的引物2768和2769组成的寡核苷酸取代。如上所述，用引物2723和2809取代右侧同源臂。
实施例22：设计用于产生侧接RQSA26臂的单(CMV)启动子盒(plNT19-ROSA)
此实施例旨在表明抗体或替代性结合分子基因可以通过核酸酶定向方法整合到哺乳动物细胞的基因组中，并且通过报告分子或表型筛选来对所得克隆进行所需功能的筛选。先前说明了这样的实例，其中将抗体基因整合到小鼠胚胎干(ES)细胞的染色体中，并筛选个别ES菌落在经历分化条件时保持多能性的能力[105]。从保持多能表型的ES菌落中回收的抗体基因显示为阻断FGFR1/FGF4信号传导途径。此先前报道的方法的问题是同源重组可导致小的文库大小，因此限制其直接筛选存在于大型结合分子文库中的罕见克隆的能力。用于抗体和结合分子基因整合的核酸酶介导的基因整合方法更有效，导致生成更大的文库大小，并且因此更可能生成能够通过表型或报告细胞筛选来鉴定功能抗体的哺乳动物细胞文库。
供体靶向载体plNT19被设计为通过核酸酶定向的方法将抗体基因整合到小鼠ROSA26基因座中以用于直接功能筛选。plNT19是用于scFv-Fc融合表达的单CMV启动子载体。表达盒侧接小鼠ROSA26臂。由于上游外显子是未翻译的，所以嘌呤霉素基因之前有剪接受体，并且下游具有导向嘌呤霉素基因的KOZAK序列。
plNT18的AAVS左同源臂和嘌呤霉素抗性基因被编码ROSA26左同源序列、剪接受体，优化的KOZAK共有序列和嘌呤霉素抗性基因的盒替代。最初从pGATOR(Melidoni等人，2013(105))扩增ROSA26左同源臂作为敲除了内部Notl位点的两个片段。由引物J60/2716和2715/2706生成的两个片段在装配PCR中与引物J60和2706组合，并用AsiSI和Nsil消化。使用引物2709和2710从pGATOR扩增剪接受体，并用引物2745(其包含与剪接受体同源的区域和优化的Kozak共有序列)和J59扩增嘌呤霉素抗性盒。剪接受体区和嘌呤霉素抗性盒在装配PCR中使用引物2709和J59组合，并用Nsi1和Bgl2消化。将ROSA26左臂同源序列和剪接受体-嘌呤霉素盒与plNT18(AsiS1/Bgl2)载体连接。
为了完成ROSA靶向载体，引入CMV-scFv-Fc盒下游的右侧ROSA26同源臂，以取代plNT18AAVS右同源臂。这通过使用引物J61和J62对存在于pGATOR(Melidoni等人，2013)中的ROSA右同源臂的PCR进行，以扩增在一端具有BstZ171而在另一端具有Sbf1的片段。将引物61定位以从ROSA ZFN裂解位点向上65bp处排除内源性Sbf1位点。图31示出ROSA26左同源臂和右同源臂的序列。
表11.用于小鼠ROSA 26基因座的核酸酶定向靶向的引物
将编码抗体或替代结合分子的plNT19整合到小鼠ROSA26基因座中可以通过如实施例20中所述使用CRISPR/Cas9进行抗体文库的核酸酶定向引入来实现。在此处，可使用“Geneart CRISPR核酸酶载体试剂盒”(Lifetech A21175)说明通过CRISPR/Cas9进行的核酸酶定向整合。在此系统中，U6RNA聚合酶III启动子驱动与反式激活性crRNA(tracrRNA)连接的靶互补性CRIPSR RNA(crRNA)的表达。crRNA和tracrRNA一起构成指导RNA，其指导在相同的“GeneArt CRISPR核酸酶载体”(参见制造商的说明书)上编码的Cas9蛋白的裂解特异性。载体作为线性化质粒提供，其中向此载体中克隆具有合适的3'突出端的短双链寡核苷酸。然后通过所克隆区段的序列测定裂解特异性。设计2种不同的靶向序列以定向裂解由引物2701/2702和2703/2704(参见表10)编码的小鼠ROSA26。
作为替代，已描述了在ROSA26基因座内裂解的锌指核酸酶[34]。这些可以在如针对Sce-I大范围核酸酶所描述的合适的表达载体(图16，实施例11)中构建。
供体质粒plNT19的核酸酶介导的整合将产生表达可结合内源性受体或配体的分泌抗体的克隆，导致受体信号传导途径的拮抗作用[105,107]或激动作用[47,106,108]。为了能够在细胞表型和分泌的抗体的功能活性之间进行关联，可以将细胞以低密度接种在半固体培养基中，使得个别菌落增殖并且抗体表达可以通过诱导型启动子启动[105]。或者，可以使用组成型启动子用于抗体基因表达。半固体培养基将保持内源性表达抗体的升高的局部浓度，使得特异于由个别细胞产生的菌落的任何表型变化将由从此特定克隆表达的独特抗体引起。如果使用快速应答报告分子，诸如与报告基因融合的Rex或Nanog启动子，则可以在半固体培养基中以低密度接种细胞，收获，然后通过流式细胞术筛选。或者，plNT19中抗体基因下游的终止密码子可以被跨膜结构域替代，以使抗体能够束缚到细胞表面。plNT19中抗体基因下游的终止密码子也可以被内质网(ER)保留信号序列取代，以使得能够保留ER中的抗体和潜在地下调内源性表达的靶受体或任何分泌的蛋白质或肽。plNT19被特异性设计为靶向小鼠ROSA26基因座，并且可用于在小鼠ES细胞中进行抗体或替代结合分子的表型筛选。然而，核酸酶定向的抗体或结合分子基因整合方法也可以应用于其它功能筛选，如使用慢病毒方法描述的那些[47，106，107，108]。
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Claims (87)

1.一种产生含有编码多样性结合物组库的DNA的真核细胞克隆文库的方法，其包括
提供编码所述结合物的供体DNA分子，以及真核细胞，
将所述供体DNA引入所述细胞中，并在所述细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处所述供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，所述整合通过所述细胞内源的DNA修复机制发生，从而产生含有整合在所述细胞DNA中的供体DNA的重组细胞，以及
培养所述重组细胞以产生克隆，
从而提供含有编码所述结合物组库的供体DNA的真核细胞克隆文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结合物是抗体分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述抗体分子是全长免疫球蛋白、IgG、Fab、scFv-Fc或者scFv。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述结合物为多聚体的，包含至少第一亚基和第二亚基。
5.一种产生含有编码多样性多聚体结合物组库的DNA的真核细胞克隆文库的方法，每种结合物包含第一亚基和第二亚基，其中所述方法包括
提供含有编码所述第一亚基的DNA的真核细胞，以及提供编码所述第二结合物亚基的供体DNA分子；
将所述供体DNA引入所述细胞中，并在所述细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处所述供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，所述整合通过所述细胞内源的DNA修复机制发生，从而产生含有整合在所述细胞DNA中的供体DNA的重组细胞，以及
培养所述重组细胞以产生含有编码所述多聚体结合物的所述第一亚基和所述第二亚基的DNA的克隆，
从而提供含有编码所述多聚体结合物组库的供体DNA的真核细胞克隆文库。
6.一种产生含有编码多样性多聚体结合物组库的DNA的真核细胞克隆文库的方法，每种结合物包含至少第一亚基和第二亚基，其中所述方法包括
提供编码所述第一亚基的第一供体DNA分子，以及提供真核细胞，
将所述第一供体DNA引入所述细胞中，并在所述细胞内提供位点特异性核酸酶，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处所述供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，所述整合通过所述细胞内源的DNA修复机制发生，从而产生含有整合在所述细胞DNA中的第一供体DNA的第一组重组细胞，
培养所述第一组重组细胞以产生含有编码所述第一亚基的DNA的第一组克隆，
将编码所述第二亚基的第二供体DNA分子引入所述第一组克隆的细胞中，其中所述第二供体DNA整合到所述第一组克隆的细胞DNA中，从而生成含有整合到所述细胞DNA中的第一供体DNA和第二供体DNA的第二组重组细胞，以及
培养所述第二组重组细胞以产生第二组克隆，这些克隆含有编码所述多聚体结合物的所述第一亚基和所述第二亚基的DNA，
从而提供含有编码所述多聚体结合物组库的供体DNA的真核细胞克隆文库。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第二供体DNA分子通过包括在所述细胞内提供位点特异性核酸酶的方法而被整合，其中所述核酸酶裂解细胞DNA中的识别序列以产生整合位点，在所述整合位点处所述供体DNA变成整合到所述细胞DNA中，所述整合通过所述细胞内源的DNA修复机制发生。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合物组库是共享共同结构并且具有一个或多个氨基酸序列多样性区域的多个多肽。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合物组库是一个或多个互补决定区不同的抗体分子的组库。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中所述多聚体结合物是包含重链可变(VH)结构域和轻链可变(VL)结构域作为单独亚基的抗体分子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多聚体结合物是完整的免疫球蛋白。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述多聚体结合物是IgG。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述多聚体结合物是Fab。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述第一亚基包含所述VH结构域并且其中所述第二亚基包含所述VL结构域。
15.根据权利要求10至13中任一项所述的方法，其中所述第一亚基包含所述VL结构域并且其中所述第二亚基包含所述VH结构域。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的方法，其中所述抗体分子还包含一个或多个另外的亚基，所述另外的亚基可被引入到所述相同的供体DNA上作为所述第一亚基或者第二亚基，或者其可被整合在所述细胞DNA中的单独位点处。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是高等真核细胞，具有大于2×107个碱基对的基因组大小。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物、鸟类、昆虫或者植物细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物的。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞是HEK293细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，T淋巴细胞谱系细胞或者B淋巴细胞谱系细胞，或者在《癌细胞系百科全书》或者《癌症中体细胞突变的COSMIC目录》中列出的所述细胞系中的任何一种。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是原代T细胞或者T细胞系。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述细胞是原代B细胞、B细胞系、前B细胞系或者祖B细胞系。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述细胞是鼠前B细胞系1624-5，IL-3依赖性祖B细胞系Ba/F3或者鸡DT40B细胞。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述识别序列在所述细胞的基因组DNA中。
25.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述识别序列在所述细胞中的附加体DNA中。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶的所述识别序列在所述细胞DNA中仅出现一次或两次。
27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶裂解细胞DNA以产生充当整合位点的双链断裂。
28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是大范围核酸酶。
29.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是锌指核酸酶(ZFN)。
30.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是TALE核酸酶。
31.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述核酸酶是核酸引导的核酸酶。
32.根据权利要求31所述的方法，其中DNA裂解由所述CRISPR/Cas系统定向。
33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述供体DNA通过同源重组被整合到所述细胞DNA中。
34.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述供体DNA通过非同源末端接合或者微同源定向的末端接合整合到所述基因组DNA中。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述供体DNA包含用于选择所述供体DNA所整合入的细胞的遗传元件。
36.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述供体DNA整合到所述细胞DNA中将所述结合物的表达和/或遗传选择元件的表达置于所述细胞DNA中存在的启动子的控制下。
37.根据权利要求1至34中任一项所述的方法，其中所述供体DNA包含可操作地连接至启动子的编码所述结合物的序列。
38.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述文库含有至少100、103、104、105或者106个克隆，每个克隆来源于通过供体DNA的整合而产生的个别重组细胞。
39.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述文库编码至少100、103、104、105或者106个不同的结合物。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个克隆含有编码所述结合物组库中的仅一个或者两个成员的经整合供体DNA。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述真核细胞是二倍体并且在所述细胞DNA中的两个重复的固定基因座处含有所述位点特异性核酸酶的识别序列。
42.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中每个克隆含有编码所述结合物组库中的单一成员的经整合供体DNA。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述供体DNA分子各自编码单一结合物或者结合物亚基。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合物展示在所述细胞表面上。
45.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合物从所述细胞分泌。
46.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包括
培养所述文库以表达所述结合物，
回收表达所关注的结合物的一个或多个克隆，以及
从所述一个或多个回收的克隆生成衍生文库，其中所述衍生文库含有编码第二结合物组库的DNA。
47.根据权利要求46所述的方法，其中产生所述衍生文库包括从所述一个或多个回收的克隆中分离供体DNA，将突变引入所述DNA中以提供编码第二结合物组库的供体DNA分子的衍生群体，以及将所述供体DNA分子的衍生群体引入细胞中以生成含有编码所述第二结合物组库的DNA的细胞的衍生文库。
48.根据权利要求46所述的方法，其中产生所述衍生文库包括通过诱导所述克隆内所述DNA的突变而将突变引入所述一个或多个回收的克隆中的所述供体DNA内。
49.一种生成多样性结合物组库的方法，其包括通过根据权利要求1至48中任一项的方法生成文库，以及培养所述文库细胞以表达所述结合物。
50.一种筛选具有期望表型的细胞的方法，其中所述表型通过由所述细胞表达结合物产生，所述方法包括
通过根据权利要求1至48中任一项所述的方法产生文库，
培养所述文库的细胞以表达所述结合物，以及
检测是否表现出所述期望表型。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述表型是报告基因在表达所述结合物的细胞中的表达。
52.根据权利要求50或权利要求51所述的方法，其还包括回收表达产生所述期望表型的结合物的克隆的细胞。
53.根据权利要求52所述的方法，其还包括从所述回收的克隆中分离编码所述结合物的DNA，从而获得编码产生所述期望表型的结合物的DNA。
54.一种筛选识别靶标的结合物的方法，其包括
通过根据权利要求1至48中任一项所述的方法生成文库，
培养所述文库的细胞以表达所述结合物；
将所述结合物暴露于所述靶标，从而允许一种或多种同源结合物(如果存在的话)识别所述靶标；以及
检测所述靶标是否被同源结合物识别。
55.根据权利要求50或权利要求54所述的方法，其中所述靶标以可溶形式提供。
56.根据权利要求50或权利要求54所述的方法，其中所述靶标展示在靶细胞群体的所述表面上并且所述结合物展示在所述文库细胞的所述表面上，所述方法包括通过使所述文库细胞与所述靶细胞接触将所述结合物暴露于所述靶标。
57.根据权利要求50至56中任一项所述的方法，其中所述结合物是抗体分子，而所述靶标是抗原。
58.根据权利要求50至56中任一项所述的方法，其中所述结合物是TCR，而所述靶标是MHC:肽复合物。
59.根据权利要求54至58中任一项所述的方法，其还包括用同源结合物检测靶标识别，以及回收含有编码所述同源结合物的DNA的克隆的细胞。
60.根据权利要求59所述的方法，其还包括从所述回收的克隆中分离编码所述结合物的DNA，从而获得编码识别所述靶标的结合物的DNA。
61.根据权利要求53或权利要求60所述的方法，其包括引入突变或者将所述DNA转化成编码重构结合物的经修饰的DNA。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述结合物是scFv并且所述方法包括将编码所述scFv的DNA转化成编码Ig或其片段的DNA，同时保持所述原始可变VH和VL链配对。
63.根据权利要求53、60、61或62所述的方法，其还包括将所述DNA引入宿主细胞中。
64.根据权利要求52、59或63所述的方法，其还包括培养所述细胞并且浓缩所述细胞以提供细胞沉淀或者浓缩的细胞悬液。
65.根据权利要求52、59或63所述的方法，其还包括培养所述细胞以表达所述结合物，以及纯化所述结合物。
66.一种根据权利要求1至48中任一项所述的方法产生的文库。
67.一种表达至少103、104、105、106、107、108或者109个不同结合物的多样性组库的真核细胞克隆的体外文库，每个细胞含有重组DNA，其中编码结合物或者结合物亚基的供体DNA整合在所述细胞DNA中的至少第一和/或第二固定基因座处。
68.根据权利要求67所述的文库，其中所述克隆还含有如下DNA：所述DNA包含用于选择表达所述所编码结合物的细胞的遗传元件。
69.根据权利要求67或权利要求68所述的文库，其中所述结合物是抗体分子。
70.根据权利要求69所述的文库，其中所述抗体分子是全长免疫球蛋白、IgG、Fab、scFv或者scFv-Fc。
71.一种含有真核细胞的容器，所述真核细胞包含根据权利要求66至70中任一项所述的文库。
72.根据权利要求71所述的容器，其中所述文库构成所述容器中的所述真核细胞的至少75％、80％、85％或者90％。
73.根据权利要求71或权利要求72所述的容器，其中所述容器是含有悬浮在培养基中的所述文库的细胞的细胞培养烧瓶。
74.根据权利要求71或权利要求72所述的容器，其包括包含所述文库的真核细胞的沉淀或者浓缩悬液。
75.用于靶向裂解细胞DNA的位点特异性核酸酶在构建含有编码结合物组库的DNA的真核细胞的文库中的用途，其中核酸酶介导的DNA裂解通过内源性细胞DNA修复机制增强结合物基因的位点特异性整合。
76.根据权利要求66至70中的任一项的文库作为用于选择针对期望靶标的结合物的展示文库的用途。
77.根据权利要求66至70中任一项所述的文库用于筛选展示期望的细胞表型的细胞的用途，其中所述表型由细胞表达结合物而产生。
78.一种以使原始可变重(VH)和可变轻(VL)链保持配对的方式将单链抗体(scFv)群体转化成免疫球蛋白(Ig)或片段、抗原结合(Fab)形式的方法。
79.根据权利要求78用于将scFv转化成Ig或者Fab的方法，其通过非复制型“微环”DNA进行。
80.根据权利要求78用于将scFv转化成Ig或者Fab的方法，其需要大肠杆菌的单一转化以用于直接产生携带编码Ig或者Fab DNA的质粒的细菌转化体。
81.根据权利要求78至80中任一项所述的用于将scFv转化成Ig或者Fab的方法，其可用于单克隆、寡克隆或者多克隆克隆的重新格式化。
82.根据权利要求78至80所述的用于将scFv转化成Ig或者Fab的方法，其可用于将来自包括噬菌体、酵母或者核糖体展示的所述常用展示技术中任何一种的全部输出群体“整体地”转化。
83.一种允许将任何两个接合的DNA元件重新格式化成载体的方法，其中所述DNA元件在单独启动子的控制下被克隆，或者由替代的控制元件分离，但保持原始的DNA配对。
84.根据权利要求83所述的用于两个接合的DNA元件重新格式化的方法，其通过非复制型“微环”DNA进行。
85.根据权利要求83所述的用于两个接合的DNA元件重新格式化的方法，其需要大肠杆菌的单一转化以用于直接产生携带编码DNA元件的质粒的细菌转化体，所述DNA元件在单独启动子的控制下或者由替代的控制元件分离。
86.根据权利要求83至85中任一项所述的用于两个接合的DNA元件重新格式化的方法，其可用于单克隆、寡克隆或者多克隆克隆的重新格式化。
87.根据权利要求83至85所述的用于两个接合的DNA元件重新格式化的方法，其可用于将来自包括噬菌体、酵母或者核糖体展示的所述常用展示技术中任何一种的全部输出群体“整体地”转化。
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