BR112016025352B1

BR112016025352B1 - Método de produção de uma biblioteca de pelo menos 105 clones de células de mamíferos contendo dna e método de triagem para um ligante que reconhece um alvo

Info

Publication number: BR112016025352B1
Application number: BR112016025352-3A
Authority: BR
Inventors: John McCafferty; Michael Dyson; Kothai Parthiban
Original assignee: Iontas Limited
Priority date: 2014-05-02
Filing date: 2015-05-01
Publication date: 2023-11-14
Also published as: DK3137602T3; EP3137602B1; WO2015166272A8; JP7061646B2; SG11201609123RA; JP2019023240A; JP2017518362A; PT3461893T; EP3741852A3; CA2947513A1; JP6440824B2; WO2015166272A2; US20200165596A1; EA034190B1; CN106574264A; US11912984B2; HRP20190187T1; US20200165597A1; EP3461893A1; EP3461893B1

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE CLONES DE CÉLULAS EUCARIÓTICAS CONTENDO DNA, PROCESSO, MÉTODO DE TRIAGEM PARA UMA BIBLIOTECA QUE RECONHECE UM ALVO, MÉTODO DE TRIAGEM DE UMA CÉLULA DE UM FENÓTIPO DESEJADO, BIBLIOTECA, BIBLIOTECA IN VITRO DE CLONES DE CÉLULAS EUCARIÓTIC AS, RECIPIENTE CONTENDO CÉLULAS EUCARIÓTICAS, MÉTODO PARA CONVERTER POPULAÇÕES DE ANTICORPO DE CADEIA SIMPLES EM IMUNOGLOBULINA OU FRAGMENTO FORMATO DE LIGAÇÃO AO A NTÍGENO E MÉTODO PARA DUAS FORMAÇÕES DE ELEMENTOS DE DNA REUNIDAS A presente invenção refere-se a métodos de produção de bibliotecas de células eucarióticas que codificam um repertório de moléculas de ligação ("ligantes"), em que os métodos usam uma nuclease específica de sítio para a clivagem direcionada de DNA celular para potencializar a integração específica de sítio de genes do ligante através de mecanismos endógenos de reparo celular. As populações de células eucarióticas são produzidas em que um repertório de genes que codificam ligantes são integrados ao locus desejado no DNA celular (por exemplo, um locus genômico) permitindo a expressão da molécula de ligação codificada criando, assim, uma população de células que expressam os diferentes ligantes.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] Esta invenção refere-se a métodos de produção das bibliotecas de células eucarióticas (por exemplo, mamífero) para triagem e/ou seleção das moléculas de ligação tais como anticorpos. As bibliotecas podem ser usadas para conter e exibir um repertório diverso de ligantes, permitindo que os ligantes sejam rastreados para selecionar um ou mais ligantes com uma propriedade desejada, tal como especificidade para uma molécula alvo. A invenção refere-se especialmente a métodos de introdução de DNA doador que codifica os ligantes em células eucarióticas para fornecer uma biblioteca de células em que um número desejado de moléculas de DNA doador é fielmente integrado num locus ou loci desejado nas células.

INTRODUÇÃO

[0002] As técnicas de engenharia de proteínas permitem a criação de grandes populações diversas das moléculas relacionadas (por exemplo, anticorpos, proteínas, peptídeos) a partir do qual as variantes individuais com propriedades de ligação ou catalíticas melhoradas ou inovadoras podem ser isoladas. A capacidade de construir grandes populações de células eucarióticas, em particular, células de mamífero, em que cada célula expressa um anticorpo em particular, o peptídeo ou a proteína projetada teriam grande valor na identificação dos ligantes com as propriedades desejadas.

[0003] O princípio básico da tecnologia de exibição baseia-se em ligar uma molécula de ligação com informações genéticas que codificam essa molécula. As propriedades de ligação da molécula de ligação são usadas para isolar o gene que a codifica. Esses mesmos princípios subjacentes aplicam-se a todas as formas de tecnologia de exibição incluindo, exposição bacteriófago, exposição bacteriana, exposição retroviral, exibição de baculovírus, exibição de ribossoma, exibição de levedura e exibição em eucariotas superiores, tais como células de mamífero [1, 2, 3, 4].

[0004] A tecnologia de exibição foi melhor exemplificada pela exibição de anticorpos em bacteriófagos filamentosos (exibição de fagos de anticorpos) que ao longo dos últimos 24 anos forneceu ferramentas importantes para a descoberta e projetando moléculas de ligação novas incluindo a geração de anticorpos terapêuticos humanos. Utilizando exibição de fagos as moléculas de anticorpo são apresentadas na superfície das partículas de bacteriófagos filamentosos por clonagem do gene que codifica um anticorpo ou fragmento de anticorpo na estrutura com o gene que codifica uma proteína de revestimento de fago. Os genes de anticorpo são, inicialmente, clonados em E. coli de modo a que cada bactéria codifica um único anticorpo. A geração do bacteriófago das bactérias utilizando métodos padrão resulta na geração das partículas de bacteriófagos que apresentam um fragmento de anticorpo na sua superfície e que encapsulam o gene de anticorpo de codificação dentro do bacteriófago. A coleta de bactérias ou bacteriófago derivados das mesmas é referida como uma "biblioteca de anticorpos". Usando a exibição de fago de anticorpo, os anticorpos e os seus genes associados podem ser enriquecidos dentro da população expondo-se o bacteriófago apresentando anticorpo para uma molécula alvo de interesse.

[0005] Para permitir que a recuperação da exibição de bacteriófago um ligante que reconhece um alvo de interesse, a molécula alvo precisa ser imobilizada na superfície de um vaso de seleção ou precisa ser recuperada da solução através dos reagentes secundários, por exemplo, a proteína alvo biotinilada, recuperados a partir da solução utilizando grânulos revestidos estreptavidina. Após a incubação da biblioteca do bacteriófago de exibição de ligante com a molécula alvo, os fagos não ligados são removidos. Isso envolve a lavagem da matriz para que o alvo (e bacteriófagos associados) esteja ligado para remover o bacteriófago não ligado. O bacteriófago ligado com o seu gene de anticorpo associado pode ser recuperado e/ou infectado em células bacterianas de hospedeiro. Utilizando a abordagem descrita acima torna-se possível enriquecer um subconjunto dos clones de bacteriófagos capazes de se ligar a uma molécula alvo de escolha. As bibliotecas de exibição de fagos foram mostradas para fornecer uma fonte rica da diversidade de anticorpos, fornecendo centenas de anticorpos únicos para um único alvo [5,6,7].

[0006] Historicamente, os sistemas de exibição para isolamento das especificidades de ligação de anticorpo novo foram baseados em sistemas procarióticos e em particular no indicador de cadeia simples Fvs (scFv) e, em menor extensão, como Fabs em bacteriófago. A exibição de ligantes na superfície de bactérias foi descrita, mas não foi amplamente utilizado e aplicações foram amplamente limitadas a exibição de peptídeos ou a exibição dos fragmentos de anticorpos pré-enriquecidos para ligantes através da imunização [8]. Apesar da energia de sistemas de exibição procarióticos incluindo exibição de fagos existem limitações. Após a seleção através da exibição de fagos ou ribossomas os genes que codificam para moléculas de ligação individuais são identificados através da introdução da população de gene selecionado em bactérias, plaqueamento das populações de bactérias, coleta de colônias, expressando as moléculas de ligação no sobrenadante ou periplasma e identificação dos clones positivos em ensaios de ligação, tais como enzima ou ensaios de imunossorvente ligado a fluorescência (ELISA). Embora as moléculas de ligação são identificadas essa abordagem não resolveu as informações na extensão da expressão e a afinidade de ligação dos clones resultantes. Assim, embora seja possível gerar potencialmente milhares de ligantes, a capacidade para pesquisar a saída é limitada pela necessidade de coleta de colônia, manuseamento de líquidos, etc., juntamente com as informações primárias limitadas em nível de expressão relativo e afinidade.

[0007] A exibição das moléculas de ligação na superfície das células eucarióticas tem o potencial para superar alguns desses problemas. Em conjunto com a citometria de fluxo, exibição de eucariótica permite a seleção de transferência rápida alta. Torna-se possível fazer um levantamento milhões dos clones celulares que expressam moléculas de ligação diferentes em sua superfície. A exibição de superfície de células foi melhor exemplificada para a exibição dos fragmentos de anticorpo formatados como scFvs na superfície das células de levedura. Uma modalidade comumente utilizada para a exibição de superfície de levedura faz uso das proteínas de aglutinina de levedura (Aga1p e Aga2p). Conforme descrito por Chao et al. [9], genes que codificam um repertório de scFvs são geneticamente fundidos com a subunidade de Aga2p de aglutinina de levedura. A subunidade de Aga2p então atribui-se à subunidade de Aga1p presente na parede celular através de ligações de dissulfureto. As células de levedura que expressam uma molécula de ligação específica de alvo podem ser identificadas por citometria de fluxo utilizando molécula alvo direta ou indiretamente marcada. Por exemplo, alvo de biotinilado pode ser adicionado às células e de ligação à superfície de célula pode ser detectada com estreptavidina-ficoeritrina. Dentro de uma população torna-se possível, usando as concentrações alvo limitantes, para distinguir esses clones que expressam moléculas de ligação de maior afinidade visto que esses clones de ligação capturarão mais moléculas-alvo e, por conseguinte, apresentam uma fluorescência brilhante. Tipicamente, cada uma das células de levedura vai exibir 10.000 a 100.000 cópias de uma única scFv na superfície da célula. Para controlar a variação na expressão de superfície de scFv em células diferentes Chao et al usou um anticorpo anti-etiqueta marcado de forma fluorescente para medir o nível de expressão de anticorpo na superfície de cada célula permitindo a normalização para a variação no nível de expressão. Por conseguinte, essa abordagem permite que as células de levedura que apresentem moléculas de ligação de alta afinidade a ser diferenciadas das células que expressam níveis elevados de um anticorpo de afinidade mais baixa. Assim, usando a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS), é possível separar os clones de células de acordo com a afinidade e/ou nível de expressão da molécula de ligação codificada.

[0008] Os sistemas eucarióticos também demonstraram ser mais eficazes do que os sistemas procariotas para a exibição dos fragmentos de anticorpos de multicadeias e em particular com fragmentos maiores tais como IgGs, FAbs completos ou fusões de scFv com os domínios de Fc (fusões scFv-Fc). Os métodos com base em grânulo ou com base em triagem conforme descrito acima para as células de levedura também podem ser usados para selecionar os anticorpos das bibliotecas de exibição baseadas em eucariotas superiores tais como células de mamíferos. A capacidade de formatar as bibliotecas de exibição e selecionar diretamente como IgGs, Fabs ou como fusões de scFv-Fc em células de mamíferos seriam uma vantagem adicional sobre exibição de levedura. A glicosilação, expressão e mecanismo de secreção das células bacterianas e de levedura é diferente de eucariotas superiores que dão origem a anticorpos com diferentes modificações pós-translacionais que as produzidas em células de mamífero. Uma vez que a fabricação de anticorpos para pesquisa, aplicação de diagnóstico e terapêutico é tipicamente levada a cabo em células de mamíferos, exibição em células de mamífero (ou outras células eucarióticas superiores, tais como de invertebrados, linhas de células de aves ou de plantas) pode dar uma melhor indicação dos problemas ou benefícios potenciais para a fabricação a jusante, por exemplo, a identificação de clones com as propriedades de expressão ideal. Além disso, os anticorpos descobertos no contexto de exibição em eucariotas superiores e, em particular, células de mamíferos podem ser aplicadas diretamente em ensaios de reporter com base em células sem purificação extensa e sem complicar o efeito dos contaminantes das células de bactérias e levedura. Além disso, as bibliotecas de ligantes podem ser expressas diretamente em células repórter eucarióticas tais como células de mamífero para identificar clones que afetam diretamente o fenótipo celular.

[0009] Apesar das vantagens acima prometidas por bibliotecas de exibição em eucariotas, permanecem problemas significativos com a criação das bibliotecas de ligantes em células eucarióticas, especialmente células eucariotas superiores. A introdução de um repertório de genes exógenos ("transgenes") para a expressão em eucariotas superiores é mais difícil do que em leveduras e bactérias. As células de eucariotas superiores são mais difíceis de manusear e se adaptar e as eficiências da transformação são mais baixas. Os tamanhos de biblioteca típicos obtidos são muito menores. Além disso, o DNA introduzido se integra aleatoriamente no genoma levando a variegação de efeito de posição. Além disso, o DNA doador introduzido em células de mamífero por métodos de transfecção ou eletroporação padrão integra como uma matriz linear com número de cópias variáveis do transgene transfectado. A introdução de DNA que codifica um repertório de genes de anticorpos, por conseguinte, tem o potencial de introduzir múltiplos genes de anticorpo em cada célula resultando na expressão de vários anticorpos diferentes por célula. Além disso, a presença de múltiplos genes de anticorpos irá reduzir a expressão relativa de qualquer anticorpo dado e vai levar ao isolamento de muitos genes de anticorpos de passageiros reduzindo a taxa de enriquecimento dos clones específicos.

[0010] Embora a exibição de uma biblioteca dos ligantes na superfície de eucariotas superiores é mais difícil, alguns exemplos descritos anteriormente. Em uma publicação antecipada usando exibição de mamífero de IgGs derivada da imunização humana, 3 ciclos de seleção (que envolve a transfecção transiente, triagem de células, recuperação de DNA e re-transfecção) foram necessários para alcançar um enriquecimento de 450 vezes das células específicas para o antígeno, com uma média de 7,6 vezes de enriquecimento por rodada [10]. Da mesma a expressão transiente das bibliotecas imunizadas expressas dentro dos vetores epissomicamente replicantes também foram descritos com anticorpos formatados como scFvs [11, 12] ou IgGs [13].

[0011] Um número de abordagens foi descrito para introduzir uma quantidade única ou limitada de genes de anticorpo em cada célula. Isso inclui a diluição de DNA ou mistura com o portador de DNA [13], mas esse é um método relativamente não controlado para gerenciar a quantidade de cópias de genes introduzidos e reduzindo a entrada de DNA terá um efeito prejudicial no tamanho de biblioteca. A introdução de genes de anticorpos através de vetores virais foi fornecida uma outra solução para controlar a introdução dos vários genes de anticorpo por célula. Uma biblioteca de exibição de superfície de célula foi gerada dessa maneira a partir de várias centenas de linfócitos B humanos gerados por imunização e adicionalmente enriquecido por triagem de fluxo de células B específicas de antígeno [14]. Os genes de anticorpos desse conjunto enriquecido foram formatados como scFvs, clonados em um sistema de expressão de alfavírus Sindbis e introduzido em células BHK usando uma baixa multiplicidade de infecção.

[0012] Breous-Nystrom et al. [15] usou infecção retroviral sequencial para introduzir um repertório limitado de genes de anticorpo V kappa 91 seguido por um repertório de genes de cadeia pesada dos 6 doadores saudáveis em uma linha celular pré-B de murino (1624-5). O retrovírus infeccioso foi gerado usando o sistema V-Pack com base em Vírus da Leucemia Murina de Moloney (Stratagene). A fim de tender em direção às inserções de cópia única, uma multiplicidade da infecção foi escolhida o que leva a infecção de cerca de 5% das células. Uma desvantagem importante dessas abordagens é que a integração no genoma é aleatória, levando a variação potencial no nível de transcrição com base na atividade transcricional do sítio de integração. Outra desvantagem em todos esses casos é que a integração dos genes de anticorpo é controlada por infecção ou transfecção limitada que tem impacto no tamanho da biblioteca.

[0013] A integração específica de sítio dos transgenes direcionados por recombinases foi anteriormente descrita. Recombinases são enzimas que catalisam reações de troca entre as moléculas de DNA contendo as sequências de reconhecimento específicos da enzima. Por exemplo, recombinase Cre (derivado a partir do sistema de recombinação específica de sítio de E. coli) ou recombinase Flp (utilizando um sistema de recombinação de Saccharomyces cerevisiae) age em seus locais de reconhecimento específicos 34bp loxP e sítio de recombinação 34bp Flp alvo (FRT), respectivamente [16]. Recombinases foi principalmente utilizada em engenharia celular para catalisar a integração específica de local. Um número de estudos do trabalho de Zhou Chen [17, 18, US7.884.054] descreveram a integração específica de sítio mediada por recombinase dos genes de anticorpo no genoma de células de mamífero utilizando recombinase Flp dentro do sistema "Flp-ln", (http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/manuals/flpins ystem_man.pdf). O sistema Flp-ln utiliza uma variedade de linhas de células que tenham tido um sítio FRT único introduzido em seu genoma. Ao expressar a recombinase Flp de enzima é possível a integração direta dos plasmídeos de expressão, incorporando um sítio de recombinação de FRT, para esse sítio de FRT pré-integrado em células alvo.

[0014] Usando o sistema Flp-ln Zhou et al. [17] introduzido um plasmídeo de expressão de anticorpo de entrada contendo um sítio FRT em linha de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) que incorpora um sítio de FRT (células de CHOF). O seu trabalho descreve a construção de uma biblioteca de exibição em que os 4 resíduos dentro de um anticorpo de ligante de anti-OX40 existente foram mutagenizados. A biblioteca foi pesquisada utilizando FACS para identificar anticorpos com afinidade anti-ligante na superfície de célula. O sucesso global na geração dos anticorpos melhorados foi limitado ao isolamento de um único anticorpo melhorado. O número de clones de células de mamíferos únicos alcançados não foi relatado.

[0015] Uma continuação da pesquisa por Li et al, em 2012 [18] utilizou linfócitos de um paciente de hepatite B para construir uma biblioteca de exibição de anticorpos. As bibliotecas separadas foram produzidas com os genes das cadeias pesadas e leves obtidos a partir de um doador que foi imunizado com HBsAg, relatados individualmente para serem bibliotecas de tamanho 1,02 x 106 e 1,78 x 105, respectivamente. Uma biblioteca secundária foi então produzida incluindo ambas as cadeias pesadas e leves que alegadamente têm um tamanho de 4,32 x 105. A análise de FACS relata indicaram que cerca de 40% dos anticorpos de comprimento total detectáveis exibidos de células na superfície de célula. A triagem de FACS dos anticorpos identificados de biblioteca que se ligam a HBsAg. De uma amostra de 8 membros da biblioteca selecionados que se ligam ao antígeno, seis foram encontrados como tendo o mesmo anticorpo, de modo que no total três clones originais de anti-HBsAg foram identificados.

[0016] O sucesso limitado desse trabalho pode ser devido ao fato do sistema Flp-In ser concebido para integração precisa de um número limitado de clones em vez de construção de biblioteca grande. Há, portanto, um conflito potencial entre alcançar a fidelidade da integração contra alcançar o tamanho de biblioteca máximo. O sistema Flp-ln utiliza uma recombinase Flp pOG44 mutante no plasmídeo que possui apenas 10% da atividade a 37 °C de recombinase Flp nativa [19]. Uma variante de recombinase Flp (Flpe) com uma melhor estabilidade térmica e maior atividade do que o tipo selvagem foi identificado [19, 20]. Isso foi adicionalmente melhorado pela otimização dos códons para criar Flpocodificado dentro do plasmídeo cCAGGS- Flpo (Cat. de Genebridges A203) de acordo com o manual Flp-ln, no entanto:

[0017] "Ao gerar linhas de células de expressão de Flp-ln™, é importante lembrar que está selecionando-se um evento de recombinação relativamente raro uma vez que quer-se a recombinação e a integração de construto de pcDNA™5/FRT ocorrer somente através do site de FRT e por um tempo limitado. Nesse caso, utilizando uma recombinase Flp altamente ineficiente é benéfico e pode diminuir a ocorrência de outros acontecimentos de recombinação indesejáveis...

[0018] ...Para aumentar a probabilidade de obtenção de integrantes individuais, será preciso diminuir a eficiência de transfecção, limitando a quantidade de DNA de plasmídeo que transferirá.

[0019] Isso é repetido por Buchholz et al., 1996 [19]:

[0020] "FLP pode ser particularmente útil para aplicações que não dependem de eficiência, mas dependem de regulação estrita".

[0021] Em experimentos de modelo e usando "instruções descritas no manual", Zhou et al. (2010) [17] de fato demonstrou-se que simples inserções de cópia ocorreram em >90% dos clones. Na construção de biblioteca, no entanto, quantidades relativamente altas de plasmídeo de expressão (2,5-3,2 pg por 106 células) e um excesso de doadores sobre plasmídeo de codificação de recombinase pOG44 foi usado [17, 18]. O sistema Flp-ln recomenda a utilização de uma proporção de pelo menos 9:1 em favor do plasmídeo de codificação de recombinase versus o plasmídeo de expressão. No entanto, quando se pretende aumentar o tamanho da biblioteca por transfecção de grandes quantidades de DNA, há o potencial de integração aleatória do plasmídeo de entrada [21]. Em todos os estudos não foi relatado a precisão da integração e o número de integrantes por célula em condições "de construção de biblioteca".

[0022] Na integração direcionada a nuclease dos genes uma nuclease específica do sítio é usada para clivar o DNA celular num sítio específico. Foi previamente mostrado que isso aumenta a taxa de recombinação homóloga em pelo menos 40.000 vezes e também permite que a reparação por mecanismos de junção de extremidades não homólogas. Esse melhoramento da integração específica de sítio não foi previamente utilizado ou contemplado para resolver os problemas associados à criação de bibliotecas de ligantes.

[0023] US20100212035 descreve métodos para a geração de roedores capazes de expressar o anticorpo exógeno por segmentação do locus de imunoglobulina de um embrião de mamífero, com uma meganuclease a integração direta de um DNA doador. O potencial para criar bibliotecas de variantes de meganucleases para criar novas especificidades de clivagem de DNa é descrito, mas não contempla-se a utilização de meganucleases para a geração de bibliotecas de ligantes.

[0024] WO 2013/190032 A1 descreve a integração de genes num locus específico (Fer1 L4) previamente modificado com o DNA exógeno (célula hospedeira SSI de "uma integração específica de local") para incorporar locais de recombinases, tais como locais de loxP e FRT para introdução de gene específico de sítio mediada por recombinase. Geração de biblioteca direcionada por nuclease não é descrita.

[0025] WO 2012/167192 A2 descreve o alvejamento dos genes a um sítio que pode, então, ser selecionado para a amplificação. Métodos direcionados a nuclease são empregados para o locus alvo. Geração de biblioteca direcionada por nuclease não é descrita.

[0026] US 2009/0263900A1 descreve moléculas de DNA que compreendem braços de homologia e a sua utilização em métodos de recombinação homóloga. Geração de biblioteca direcionada por nuclease não é descrita.

[0027] WO 2011/100058 descreve métodos para a integração de ácido nucleico em um genoma que evita a necessidade de braços de homologia longos e, em vez disso, depende de microhomologia ou "extremidades coesivas" do genoma e doador para ajudar a integração direta. Geração de biblioteca direcionada por nuclease não é descrita.

[0028] WO 20122/090804 descreve métodos para a integração de genes múltiplos ou múltiplas cópias do mesmo gene, utilizando diferentes nucleases de dedos de zinco (ZFNs) em ciclos sequenciais. Geração de biblioteca direcionada por nuclease não é descrita.

[0029] WO2014/039872 descreve métodos para projetar células de plantas, incorporando um "sítio de pouso" no qual o DNA do doador é integrado por recombinação homóloga ou união de extremidade não homóloga utilizando nucleases direcionada a local. As bibliotecas de cromossomos artificiais bacterianos (BAC) são usadas para a clonagem inicial de DNA doador As bibliotecas são mencionadas em relação a métodos de sequenciação lllumina. Geração de biblioteca direcionada por nuclease não é descrita.

[0030] WO2007/047859 A2 descreve métodos para a especificidade de engenharia de meganucleases e uso para alvejar loci genômica. Bibliotecas de meganucleases mutantes que podem conter meganucleases com nova especificidade de nuclease são descritos. Geração de biblioteca direcionada por nuclease não é descrita.

[0031] US2014/0113375 A1 descreve um sistema de expressão transiente para a geração de sequências homólogas de DNA de cadeia simples a uma sequência genômica alvo, que pode ser transportada para o núcleo para alterar as informações genéticas da sequência genômica alvo por meio das vias de reparação de DNA ou recombinação homóloga. Sugere-se que uma "biblioteca" de mutações pode ser criada por uma baixa fidelidade da transcrição reversa do DNA introduzido (não-biblioteca). A exibição de mamífero e seleção de moléculas com atividade de ligação não é descrita.

[0032] US20 12/0277120 descreve métodos e composições para a integração simultânea de uma pluralidade de ácidos nucleicos exógenos é numa única reação de transformação utilizando o mecanismo de recombinação homóloga em leveduras nativas, que a recombinação pode ainda ser melhorada através da indução de quebras de cadeia dupla de alvo no genoma das células hospedeira nos locais destinados de integração. Os métodos destinam-se a superar a necessidade de múltiplas rodadas de projeção para integrar vários conjuntos de DNA, por exemplo, para a construção de vias metabólicas funcionais em micróbios industriais, tais como leveduras. A exibição ou a expressão de bibliotecas de moléculas de ligação, não é descrita a utilização de eucariotas superiores e a seleção de moléculas com atividade de ligação.

[0033] Para compreender completamente o potencial para a exibição de anticorpos em células de mamíferos e de outros eucariotas superiores, há uma necessidade de um sistema para criar grandes bibliotecas que combinem integração precisa a um sítio pré-definido com uma eficiência que permite a construção de bibliotecas grandes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0034] Superou o problema da criação de grandes bibliotecas de ligantes que englobam um ou dois genes de ligante por célula usando integração direcionada de nuclease das populações de ligantes de codificação de genes. A invenção permite assim a preparação de populações de células eucarióticas, em que um repertório de aglomerante à codificação está integrado no locus fixo no genoma permitindo a expressão da molécula de ligação codificada, criando assim uma população de células que expressam os diferentes ligantes.

[0035] A presente invenção refere-se a métodos de produção de bibliotecas de células eucarióticas que codificam um repertório de moléculas de ligação ("ligantes"), em que os métodos usam uma nuclease específica de sítio para a clivagem direcionada de DNA celular para potencializar a integração específica de sítio de genes do ligante através de mecanismos endógenos de reparo celular.. As nucleases específicas de sítio permitir a introdução precisa de moléculas ligantes de DNA de doador de codificação para um ou mais loci definido no genoma eucariota ou outro DNA de célula eucariótica. A invenção fornece métodos da preparação de populações de células eucarióticas em que um repertório de genes que codificam ligantes são integrados ao locus desejado no DNA celular (por exemplo, um locus genômico) permitindo a expressão da molécula de ligação codificada criando, assim, uma população de células que expressam os diferentes ligantes.

[0036] A construção de bibliotecas de ligantes dentro de células eucarióticas de acordo com a presente invenção tem vantagens em relação a abordagens direcionadas para a recombinase de incorporação direcionada ao sítio de construções de expressão. A presente invenção utiliza a clivagem de DNA celular por nucleases específicas do sítio para resolver os problemas anteriormente associados à construção de grandes repertórios de genes ligantes em células eucarióticas e especialmente eucariotas superiores. A presente invenção permite a criação eficiente de grandes populações de clones de células que, cada uma, expressam ligantes individuais integrados num locus fixo no DNA celular. A partir dessas bibliotecas de clones celulares torna-se possível isolar genes que codificam novas proteínas e peptídeos de ligação ou modificadores da função.

[0037] Em vez de troca direcionada recombinase de DNA, a abordagem do presente invento utiliza a clivagem específica de sítio de DNA celular (por exemplo, genômico) seguido do uso de mecanismos de reparação naturais para integrar o DNA doador que codifica o ligante. A seguir à clivagem do DNA celular a uma sequência reconhecida pela nuclease específica de sítio ("sequência de reconhecimento"), quebras no DNA celular são reparadas usando mecanismos, tais como a união de extremidade homóloga ou não homóloga de recombinação (NHEJ). Criação de quebras de específicas a sítio no DNA celular aumenta a incorporação de DNA exógeno doador permitindo a construção de grandes populações de células com genes ligantes integrados num locus fixo.

[0038] Até à data, as nucleases específicas de local, tais como meganucleases, ZFNs, nucleases TALE e sistemas CRISPR/Cas foram direcionados para a criação eficiente de células com modificações para os genes endógenos ou para a introdução de genes repórter para o estudo da função das células. Existem também casos em que a segmentação genômico direcionado a nuclease foi usado para integrar genes que codificam anticorpos segregados simples para a produção de anticorpos (por purificação a partir de meio de cultura) [21, 22,].

[0039] A invenção simplifica a construção de grandes bibliotecas enquanto direciona a integração para um número único ou limitado de loci genético definido. A integração do DNA doador em um ou mais loci fixo normaliza a transcrição em comparação à integração aleatória dos números variáveis de transgenes, e permite a seleção de clones de anticorpo com base em translação e propriedades de estabilidade do próprio aglutinante. A integração fiel de DNA doador numa localização pré-determinada ou locais no DNA celular resulta em níveis relativamente uniformes de transcrição de ligantes na biblioteca, e alta eficiência de introdução de DNA doador, fazendo as populações de células criadas pelos métodos da invenção particularmente uteis como bibliotecas de exibição e para seleção dos ligantes.

[0040] Os métodos da invenção, assim, produzem bibliotecas de alta qualidade de ligantes em células eucarióticas, que podem ser rastreadas para identificar as células que expressam e que codificam um ligante específico para um alvo de interesse.

[0041] Em vários aspectos, o invento refere-se a novos e melhorados métodos para a preparação de bibliotecas de células eucarióticas, as próprias bibliotecas, isolamento de aglutinantes desejados, que codificam o ácido nucleico e células das bibliotecas, e uso das bibliotecas, tais como para a expressão e rastreio de moléculas de ligação e para a triagem para os efeitos de moléculas de ligação. Vários métodos serão descritos para a produção de bibliotecas in vitro e utilizando bibliotecas in vitro ou in vivo.

[0042] A invenção fornece um método de produzir uma biblioteca de clones de células eucarióticas que contêm DNA que codifica um repertório diverso de ligantes, o método compreendendo a utilização de uma nuclease específica de sítio para alvejar a clivagem do DNA de célula eucariótica para melhorar a integração específica de sítio dos genes ligantes no DNA celular através de mecanismos de reparo de DNA celulares endógenos.

[0043] Um método de produção de uma biblioteca de clones de células eucarióticas contendo DNA que codifica um reportório diversificado de ligantes pode compreender:

[0044] fornecimento de moléculas de DNA do doador que codificam os ligantes e as células eucarióticas,

[0045] introdução do DNA do doador nas células e fornecimento de uma nuclease específica de sítio nas células, em que as nuclease cliva o DNA celular para criar um sítio de integração em que o DNA do doador se torna integrado ao DNA celular, sendo que a integração ocorre através de mecanismos de reparo do DNA endógenos às células.

[0046] Para ligantes multiméricos que compreendem pelo menos uma primeira e segunda sub-unidade (isto é, cadeias de polipeptídeos distintas, tais como domínios VH e VL de anticorpo apresentados dentro de um formato Fab ou IgG), as múltiplas subunidades podem ser codificadas na mesma molécula de DNA doador. No entanto, pode ser desejável integrar as diferentes subunidades em loci separado, em que caso as subunidades podem ser fornecidas em moléculas de DNA doador separadas. Isso poderia ser integrado dentro do mesmo ciclo de integração direcionada a nuclease ou podem ser integrados sequencialmente usando a integração direcionada de nuclease para uma ou ambas etapas de integração.

[0047] Os métodos de produção de bibliotecas de clones de células eucariotas que codificam ligantes multiméricas podem compreender:

[0048] fornecimento de células eucarióticas contendo DNA que codifica a primeira subunidade e fornecimento de moléculas de DNA do doador que codifica a segunda subunidade do ligante,

[0049] introdução do DNA do doador nas células e fornecimento de uma nuclease específica de sítio nas células, em que as nuclease cliva uma sequência de reconhecimento no DNA celular para criar um sítio de integração em que o DNA do doador se torna integrado ao DNA celular, sendo que a integração ocorre através de mecanismos de reparo do DNA endógenos às células criando, assim, células recombinantes contendo DNA do doador integrado ao DNA celular. Essas células recombinantes irão conter DNA que codifica as primeira e segunda subunidades do ligante multimérico e podem ser cultivadas para expressar ambas as subunidades. Os ligantes multiméricos são obtidos por expressão e montagem das subunidades codificadas separadamente.

[0050] No exemplo acima, a integração direcionada de nuclease é utilizada para integrar DNA que codifica uma segunda subunidade em células que já contêm DNA que codifica uma primeira subunidade. A primeira subunidade pode ser previamente introduzida utilizando as técnicas da presente invenção ou qualquer outro método de integração de DNA adequada. Uma abordagem alternativa é a utilização de integração direcionada de nuclease num primeiro ciclo de introdução de DNA doador para integrar uma primeira subunidade, seguido pela introdução da segunda subunidade ou pela mesma abordagem ou qualquer outro método adequado. Se a abordagem direcionada de nuclease for utilizada em múltiplos ciclos de integração, diferentes nucleases específicas de sítio podem opcionalmente ser usadas para impulsionar a integração de DNA doador direcionado de nuclease em diferentes locais de reconhecimento. Um método de gerar a biblioteca pode compreender:

[0051] fornecimento das primeiras moléculas de DNA do doador que codificam a primeira subunidade e fornecimento de células eucarióticas,

[0052] introdução do primeiro DNA do doador nas células e fornecimento de uma nuclease específica de sítio nas células, em que as nuclease cliva uma sequência de reconhecimento no DNA celular para criar um sítio de integração em que o DNA do doador se torna integrado ao DNA celular, sendo que a integração ocorre através de mecanismos de reparo do DNA endógenos às células criando, assim, um primeiro conjunto de células recombinantes contendo DNA do doador integrado ao DNA celular,

[0053] cultura do primeiro conjunto de células recombinantes para produzir um primeiro conjunto de clones contendo DNA que codifica a primeira subunidade,

[0054] introdução de segundas moléculas de DNA do doador que codificam a segunda subunidade em células do primeiro conjunto de clones, em que o segundo DNA do doador é integrado ao DNA celular do primeiro conjunto de clones criando, assim, um segundo conjunto de células recombinantes contendo um primeiro e um segundo DNA do doador integrado ao DNA celular e,

[0055] cultura do segundo conjunto de células recombinantes para produzir um segundo conjunto de clones, sendo que esses clones contendo DNA que codifica a primeira e a segunda subunidades do ligante multimérico,

[0056] fornecendo, assim, uma biblioteca de clones de células eucarióticas contendo DNA do doador que codifica o repertório de ligantes multiméricos.

[0057] integração específica de sítio de DNA de doador no DNA celular cria células recombinantes, que podem ser cultivadas para produzir clones. As células recombinantes individuais, em que o DNA doador foi integrado são assim replicadas para gerar populações clonais de células - "clones" - cada clone sendo derivado de uma célula recombinante original. Assim, o método gera um número de clones que correspondem ao número de células nas quais o DNA doador foi integrado com sucesso. A coleção de clones de formar uma biblioteca que codifica para o repertório de ligantes (ou, em um estágio intermediário, em que as subunidades de ligante são integradas em rodadas separadas, os clones podem codificar um conjunto de subunidades de ligante). Os métodos da invenção podem, assim, fornecer uma biblioteca de clones de células eucarióticas que contêm DNA doador que codifica o repertório de ligantes.

[0058] Os métodos da invenção podem gerar bibliotecas de clones contendo DNA doador integrado num locus fixo ou em múltiplos loci fixos, no DNA celular. Por "fixo" pretende-se significar que o locus é o mesmo entre as células. As células utilizadas para a criação da biblioteca podem, portanto, conter uma sequência de reconhecimento da nuclease num sítio fixo, o que representa um sítio de estabelecimento universal no DNA celular em que o DNA doador pode integrar-se. A sequência de reconhecimento para a nuclease específica de sítio pode estar presente em um ou mais do que uma posição no DNA celular.

[0059] As bibliotecas produzidas de acordo com a presente invenção podem ser empregadas numa variedade de maneiras. Uma biblioteca pode ser cultivada para expressar os ligantes, produzindo assim um repertório diverso de ligantes. Uma biblioteca pode ser selecionada para uma célula de um fenótipo desejado, em que os resultados do fenótipo da expressão de um ligante por uma célula. A triagem de fenótipo é possível em que as células de biblioteca são cultivadas para expressar os ligantes, seguido de detectar se o fenótipo desejado será exibido em clones da biblioteca. As leituras celulares podem ser baseadas em alterações no comportamento celular, tais como alterações na expressão de genes de repórter endógenos ou exógenos, estado de diferenciação, proliferação, sobrevivência, tamanho de célula, metabolismo ou interações com outras células alteradas. Quando o fenótipo desejado for detectado, as células de um clone que exibe o fenótipo desejado pode então ser recuperado. Opcionalmente, o DNA que codifica o ligante é então isolado a partir do clone recuperado, fornecendo DNA que codifica um ligante que produz o fenótipo desejado quando expresso na célula.

[0060] Uma das principais finalidades para as quais foram utilizadas bibliotecas de células eucarióticas está nos métodos de rastreio de ligantes que reconhecem um alvo de interesse. Em tais métodos uma biblioteca é cultivada para expressar os ligantes e os ligantes são expostos ao alvo para permitir o reconhecimento do alvo através de um ou mais ligantes cognatos, se presente, e detectar se o alvo for reconhecido por um ligante cognato. Em tais métodos, os ligantes podem ser exibidos na superfície da célula e os clones da biblioteca que exibem ligantes com as propriedades desejadas podem ser isolados. Assim, as células que incorporam genes que codificam ligantes com características funcionais ou de ligação desejadas podem ser identificadas dentro da biblioteca. Os genes podem ser recuperados e utilizados para a produção do ligante ou utilizados para engenharia adicional para criar bibliotecas de derivados de ligantes para se obter ligantes com propriedades melhoradas.

[0061] O presente invento oferece vantagens sobre os métodos anteriores para a construção de bibliotecas em eucariotas superiores. Alguns estudos têm utilizado a infecção por lentivírus para introduzir genes de anticorpos em células repórter de mamífero [106]. Isso tem a vantagem de que as grandes bibliotecas podem ser geradas, mas não há nenhum controle sobre o sítio de integração e o número de cópia é controlado pela utilização de uma baixa multiplicidade de infecção (como discutido acima). Numa abordagem alternativa os genes de anticorpos foram introduzidos através de recombinação homóloga, sem o benefício de integração direcionada de nuclease e usando braços de homologia de 10 kb, mas a eficiência de alvejamento foi relativamente baixa significando que o tamanho do potencial biblioteca foi limitado [105]. Em contraste, o uso de nucleases direcionado para a sequência mantém os benefícios da integração direcionada para um ou alguns loci de escolha, enquanto permitindo a construção eficiente de grandes bibliotecas. A integração direcionada de nuclease tem a vantagem de que os transgenes são alvejados a um locus fixo ou loci fixo dentro do DNA celular. Isso significa que a atividade do promotor conduz a transcrição de genes em todos os clones de ligante será a mesma e a funcionalidade de cada ligante será um reflexo da sua potência inerente, eficiência e estabilidade de translação em vez de ser devido a variação relacionada com o sítio de integração. O alvejamento para um número único ou limitado de loci também permitirá um melhor controle de expressão, se necessário, por exemplo, usando promotores induzidos.

[0062] Várias características da invenção são ainda descritos abaixo. Note-se que os títulos utilizados ao longo deste relatório descritivo são para ajudar somente a navegação e não devem ser interpretados como definitiva, e que modalidades descritas nas secções diferentes podem ser combinadas conforme for apropriado.

DESCRIÇÃO DETALHADA Células Eucariontes

[0063] O potencial das populações de células eucarióticas que expressam um repertório diverso de ligantes é exemplificado e discutido nos Exemplos aqui apresentados em relação à expressão de repertórios de anticorpos na superfície de células de mamífero. Os benefícios da invenção não estão limitados a células de mamífero e incluem todos os eucariotas.

[0064] Levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae) tem um genoma menor do que as células de mamíferos e recombinação homóloga direcionada pelos braços de homologia (na ausência de clivagem direcionada de nucleases) é uma forma eficaz de introduzir DNA estranho em relação a eucariotas superiores. Assim, um benefício particular da integração direcionada de nuclease da presente invenção refere-se a integração de genes de ligante em células eucarióticas superiores com genomas maiores onde a recombinação homóloga na ausência de clivagem de nuclease é menos eficaz. A integração de interação de nuclease foi usada em células de levedura para resolver o problema da integração eficiente de vários genes em células de levedura individuais, por exemplo, por engenharia de vias metabólicas (US2012/0277120), mas esse trabalho não incorpora a introdução de bibliotecas de ligantes nem aborda os problemas da construção da biblioteca em eucariotas superiores.

[0065] Bibliotecas de células eucariotas, de acordo com o presente invento são de preferência células eucarióticas superiores, aqui definidas como células com um genoma maior que a de Saccharomyces cerevisiae que tem um tamanho de genoma de 12 x 106 pares de bases (bp). As células eucarióticas superiores podem, por exemplo, ter um tamanho de genoma de maior que 2 x 107 pares de bases. Isso inclui, por exemplo, células, mamíferos, aves, insetos ou plantas. De preferência as células são células de mamíferos, por exemplo, camundongo ou humano. As células podem ser células primárias ou linhas de células podem ser. As células de ovário de hamster chinês (CHO) são comumente utilizadas para o anticorpo e a expressão da proteína, mas qualquer linha celular estável alternativa pode ser utilizada na invenção. As células HEK293 que são utilizadas nos Exemplos aqui. Estão disponíveis métodos para a introdução eficiente de DNA estranho em células primárias permitindo que esses sejam utilizados (por exemplo, por eletroporação, onde a eficiência e viabilidades acima de 95% foram alcançadas http://www.maxcyte.com/technology/primary-cells-stem- cells.php).

[0066] As células T da linhagem de linfócitos (por exemplo, células T primárias ou de uma linha de células T) ou células de linhagem de linfócitos B estão entre os tipos de células preferenciais. De particular interesse são células T primárias ou linhas celulares de células T derivadas para utilização em bibliotecas de TCR, incluindo linhas de células a que carecem de expressão de TCR [23, 24, 25]. Exemplos de células de linhagem de linfócitos B incluem células B, células pré-B ou de células pró-B e linhas celulares derivadas a partir de qualquer um destes.

[0067] A construção de bibliotecas em células B primárias ou linhas de células B seria de valor particular para a construção de bibliotecas de anticorpos. Breous- Nystrom et al. [15] geraram as bibliotecas em uma linha de células pré-B de murino (1624-5). A linha celular derivada de células de frango B DT40 (ATCC CRL-21 1 1) tem a promessa especial para a construção de bibliotecas de ligantes. DT40 é uma linha de células pequenas com uma velocidade relativamente rápida de divisão celular. Repertórios de ligantes poderiam ser direcionados para loci específicos usando ZFNs, nucleases TALE ou CRISPR/Cas9 alvejado a sequências endógenas ou alvejando sítios de heterólogas pré- integradas que podem incluir sítios de reconhecimento meganuclease. As células DT40 expressam anticorpos e por isso, será vantajoso alvejar genes de anticorpos dentro do locus de anticorpo com ou sem ruptura dos domínios variáveis de anticorpos endógenos de frango. As células DT40 também foram utilizadas como a base de um sistema in vitro para a produção de IgMs de frango denominados o sistema de Biblioteca Diversificar Autonomamente - Autonomously Diversifying Library (sistema ADLib) que tira proveito da diversificação intrínseca que ocorre no locus do anticorpo de galinha. Como resultado dessa diversificação endógena é possível gerar novas especificidades. A abordagem direcionada a nuclease descrita aqui pode ser utilizada em combinação com ADLib combinar diversas bibliotecas de ligantes de fontes heterólogas (por exemplo, anticorpos humanos dos repertórios da região variável ou andaimes alternativos sinteticamente derivados) com o potencial para diversificação adicional com o locus de IgG de galinha. Benefícios similares podem ser aplicados a linhas de células B humanas, tais como Nalm6 [26].

[0068] Outras linhas de células da linhagem B de interesse incluem as linhas, tais como a linha de células de murino pré-B 1624-5 e a linha de células pró-B Ba/F3. Ba/F3 é dependente de IL-3 [27] e a sua utilização é discutida noutras partes deste documento. Finalmente, um número de linhas de células humanas poderiam ser utilizadas, incluindo aqueles listados na "Cancer Cell Line Encyclopaedia" [28] ou "COSMIC catalogue of somatic mutations in cancer" [29].

[0069] Tipicamente, a biblioteca será composta por um único tipo de células, produzido pela introdução de DNA doadora para uma população de células clonais eucarióticas, por exemplo, por introdução de DNA doadora em células de uma linha de células particular. A principal diferença significativa entre os diferentes clones de biblioteca será, então, devido à integração do DNA doador.

Sistemas virais eucarióticos

[0070] As vantagens do sistema na criação de bibliotecas de agentes ligantes em células eucarióticas podem ser aplicadas a sistemas de visualização virais baseados em torno de sistemas de expressão eucarióticos, por exemplo, exibição de baculovírus ou exibição de retroviral [1, 2, 3, 4]. Nessa abordagem cada célula irá codificar um ligante capaz de ser incorporado numa partícula viral. No caso de sistemas retrovirais do mRNA que codifica seria empacotado e o ligante codificado seriam apresentado na superfície da célula. No caso de sistemas de baculovírus, os genes que codificam o ligante teriam de ser encapsulados na partícula de baculovírus para manter a associação entre o gene e a proteína codificada. Isso pode ser conseguido usando células hospedeiras que transportam cópias epissomais do genoma de baculovírus. Alternativamente cópias integradas podem ser liberadas após a ação de uma nuclease específica (distinta da utilizada para impulsionar a integração específica do local). No caso de moléculas ligantes multiméricas alguns padrões podem ser codificados dentro do DNA celular com os genes para um ou mais parceiros de serem embalados dentro do vírus.

Nuclease específico de sítio

[0071] A invenção envolve uso de uma nuclease específica de sítio para clivagem direcionada de DNA celular na construção de uma biblioteca de células eucarióticas que contém DNA que codifica um repertório de ligantes, caracterizado pelo fato de que a clivagem de DNA mediada por nuclease potencializa a integração específica de sítio de genes do ligante através de mecanismos endógenos de reparo de DNA celular. A nuclease específica de sítio cliva o DNA celular na sequência de ligação específica a uma sequência de reconhecimento, criando assim um sítio de integração de DNA doador. A nuclease pode criar uma quebra de cadeia dupla ou uma única quebra de cadeia (um nick). As células utilizadas para a criação da biblioteca podem conter sequências endógenas reconhecidos pela nuclease específica de local ou a sequência de reconhecimento pode ser manipulada no DNA celular.

[0072] A nuclease específica de sítio pode ser exógena para as células, isto é, não de ocorrência natural em células do tipo escolhido.

[0073] A nuclease específica de sítio pode ser introduzida antes, após ou simultaneamente com a introdução do DNA doador que codifica o ligante. Pode ser conveniente para o DNA doador codificar a nuclease para além do ligante ou em separado do ácido nucleico que é co-transfectado ou de outro modo introduzido, ao mesmo tempo que o DNA doador. Os clones de uma biblioteca pode opcionalmente reter o ácido nucleico que codifica a nuclease específica de local ou tais ácidos nucleicos podem ser apenas transitoriamente transfectados para as células.

[0074] Qualquer nuclease específica de local adequado pode ser utilizado com a invenção. Pode ser uma enzima que ocorre naturalmente ou uma variante projetada. Há um número de nucleases conhecidos que são especialmente adequados, tais como os que reconhecem ou podem ser manipulados para reconhecer, as sequências que ocorrem apenas raramente em DNA celular. A clivagem da nuclease e a apenas um ou dois locais é vantajoso uma vez que isso deve assegurar que apenas uma ou duas moléculas de DNA doador sejam integrados por célula. Raridade da sequência reconhecida pela nuclease específica de sítio é mais provável se a sequência de reconhecimento for relativamente longa. A sequência especificamente reconhecida pela nuclease pode ser, por exemplo,uma sequência de pelo menos 10, 15, 20, 25 ou 30 nucleótidos.

[0075] Exemplos de nucleases adequadas incluem meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases TALE e nucleases guiada por ácidos nucleicos (por exemplo, guiada por RNA) , tais como o sistema CRISPR /Cas. Cada uma delas produz rupturas de filamentos duplos embora as formas modificadas sejam conhecidas que geram rupturas dos filamentos individuais.

[0076] Meganucleases (também conhecido como homing endonucleases) são nucleases que ocorrem em todos os reinos da vida e reconhecem sequências relativamente longas (12-40 bp). Dada a sequência de reconhecimento de tempo estão ausentes ou ocorrem com pouca frequência em genomas eucarióticos. Meganucleases são agrupados em 5 famílias com base na sequência/estrutura. (LAGLIDADG, GIY-YIG, HNH, caixa His-Cys e PD-(D/E)XK). A família mais bem estudada é a família LAGLIDADG que inclui a meganuclease l-Scel bem caracterizada a partir de Saccharomyces cerevisiae. I-Scel reconhece e cliva uma sequência de reconhecimento de 18 bp (5' TAGGGATAACAGGGTAAT) deixando um 4 bp 3' saliência. Outro exemplo utilizado é I-Cre1 que se origina a partir do cloroplasto da alga verde unicelular Chlamydomonas reinhardtii e reconhece uma sequência de 22 bp [30]. Um certo número de variantes modificadas foram criadas com sequências de reconhecimento alterados [31]. Meganucleases representam o primeiro exemplo do uso de nucleases específicas do local no genoma de engenharia [49, 50]. Tal como acontece com as abordagens baseadas em recombinase, a utilização de I-Sce1 e outros meganucleases requer inserção antes de um local de reconhecimento apropriada para ser alvo dentro do genoma ou a projeção de meganucleases reconhecem locais endógenos [30]. Por essa abordagem de alvejamento eficiência em células HEK293 (como julgado por "reparo" direcionado homólogo de um gene de GFP integrado com defeito) foi obtido em 10-20% das células através da utilização de I-Sce1 [32].

[0077] Uma classe preferida de meganucleases para utilização na presente invenção é as endonucleases LAGLIDADG. Incluindo l-Sce I, l-Chu I, l-Cre I, Csm I, Pl-Sce I, Pl-Tli I, Pl-Mtu I, l-Ceu I, l-Sce II, l-Sce III, HO, Pi- Civ I, Pl-Ctr I, Pl-Aae I, Pl-Bsu I, Pl-Dha I, Pl-Dra I, Pl- Mav I, Pl-Mch I, Pl-Mfu Pl-Mfl I, Pl-Mga I, Pl-Mgo I, Pl-Min I, Pl-Mka I, Pl-Mle I, Pl-Mma I, Pl-Msh I, Pl-Msm I, Pl-Mth I, Pl-Mtu Pl-Mxe I, Pl-Npu I, Pl-Pfu I, Pl-Rma I, Pl-Spb I, Pl-Ssp I, Pl-Fac I, Pl-Mja I, PI- Pho I, Pi-Tag I, Pl-Thy I, Pl-Tko I, l-Mso!, and Pl-Tsp I ; preferencialmente , l-Sce I, l-Cre I, l-Chu I, I-Dmo I, l-Csm I, Pl-Sce I, Pl-Pfu I, Pl- Tli I, Pl-Mtu I e l-Ceu I.

[0078] Nos últimos anos, um número de métodos foram desenvolvidos, que permitem a concepção de novas nucleases específicas de sequências pela fusão de domínios de ligação a DNA específico da sequência a nucleases não específicas para criar nucleases específica de sequências destinadas direcionadas através de domínios de ligação de DNA à medida. A especificidade de ligação pode ser direcionada por engenharia dos domínios de ligação, tais como domínios de dedo de zinco. Esses são pequenos domínios modulares, estabilizados por meio de íons de zinco, que estão envolvidos no reconhecimento molecular e são utilizados na natureza para reconhecer sequências de DNA. Matrizes de domínios de dedo de zinco foi manipulado para ter sequência de ligação específica e foram associados ao domínio de clivagem de DNA não específico da enzima de restrição do tipo II Fok1 para criar nucleases de dedos de zinco (ZFNs). ZFNs podem ser usadas para criar ruptura de cadeia dupla em locais específicos dentro do genoma. Fok1 é um dímero obrigatório e exige duas ZFNs para ligar na proximidade de efetuar a clivagem. A especificidade de nucleases modificados foi aumentada e a sua toxicidade reduzida, criando duas variantes diferentes Fok1 que são heterodímeros de engenharia para apenas formam uns com os outros [33]. Tais ZFNs heterodímero obrigatórios foram mostrados para alcançar a integração dirigida por homologia em 5-18% das células alvo sem a necessidade de uma seleção de drogas [21, 34, 35]. Incorporação de inserções até 8kb com frequências de >5% sendo demonstrado na ausência de seleção.

[0079] Recentemente foi demonstrado que andaimes 5' de cadeia simples criados por nucleases, tais como ZFNs ajuda a unidade de integração eficiente de transgenes para os sítios de clivagem [45]. Isso foi estendido para mostrar que a clivagem in vivo de DNA doador (por meio da inclusão de um local de reconhecimento da nuclease específica dentro do plasmídeo doador) melhora a eficiência da integração não homóloga. O mecanismo não é completamente claro, mas é possível que a exposição reduzida a nucleases celulares através de linearização in vivo pode ter contribuído para o realce [45]. É também possível que corresponda em andaimes 5'de DNA doador e aceitadora, gerados pelas impulsão de impulsão de nucleases. O exame das sequências nas junções no entanto mostrou a ocorrência de supressões. É possível que as junções perfeitamente combinadas continuem a agir como substrato para as nucleases direcionadas ao sítio até que a exclusão da sequência de reconhecimento ocorre. Para superar esse problema potencial, Maresca et al. [36] inverteram os sítios de reconhecimento de ZFNs esquerda e direita dentro do DNA doador de tal forma que a ligação de DNA doador dentro do locus genômico vai levar a duplicação de duas ZFNs de mão esquerda sobre um flanco da integração e duplicação de dois ZFNs de mão direita em outro flanco. O uso de nucleases heterodímero obrigatórios (como descrito para Fok1) significa que nenhuma destas sequências flanqueantes recém-criadas pode ser clivada pela nuclease alvo.

[0080] A capacidade de projetar domínios de ligação de DNA de especificidade definida foi ainda mais simplificada através da descoberta em bactérias de Xanathomonas de moléculas de efetores similar a ativador de Transcrição (TALE). Essas moléculas TALE consistem em matrizes de monômeros de 33-35 aminoácidos com cada monômero reconhecimento de uma única base dentro de uma sequência alvo [37]. Essa relação modular 1:1 fez com que seja relativamente fácil de projetar moléculas TALE projetadas para vincular qualquer alvo de DNA de interesse. Com a união destas TALEs modificadas ao Fok1 foi possível criar nucleases de TALE inovadoras específicas de sequência. As nucleases de TALE também conhecidas como TALENs, agora foram projetados para uma grande quantidade de sites e apresentam alta taxa de sucesso para a atividade de modificação genética eficiente [38]. Nos exemplos aqui que demonstram uma melhor integração do DNA doador através do uso de nucleases história. Outras variações e melhorias das tecnologias de nuclease TALE foram desenvolvidas e podem ser utilizadas para a geração de bibliotecas de ligantes através da integração direcionada de nuclease. Isso incluíram "mega-TALENs", em que um domínio de ligação de nuclease TALE é fundido a uma meganuclease [39] e "TALENs compactos", em que um domínio de reconhecimento de nuclease único é utilizado para efetuar a clivagem [40].

[0081] Nos últimos anos, foi descrito um outro sistema para direcionar quebras de cadeias duplas ou simples com sequências específicas no genoma. Esse sistema chamado sistema "Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR Associated (Cas)" é baseado em um mecanismo de defesa bacteriana [41]. O sistema CRISPR/Cas alveja o DNA para a clivagem através de um RNA de cadeia simples curta complementar (CRISPR RNA ou crRNA) unida a uma curta repetição palíndromo. No sistema "Tipo II" utilizado, o processamento do RNA de alvejamento é dependente da presença de um crRNA trans-ativação (tracrRNA) que tem a sequência complementar à repetição palindrômica. A hibridação do tracrRNA para a sequência de repetição palindrômica aciona o processamento. O RNA processado ativa o domínio Cas9 e direciona a sua atividade para a sequência complementar no DNA. O sistema foi simplificado para direcionar a clivagem de Cas9 a partir de um único RNA transcrito e foi dirigido para muitas sequências diferentes dentro do genoma [42, 43]. Essa abordagem de genoma de clivagem tem a vantagem de ser direcionada através de uma sequência de RNA curta tornando relativamente simples de projetar a especificidade de clivagem. Assim, há um número de diferentes maneiras de conseguir a clivagem específica do local de DNA genômico. Como descrito acima isso aumenta a taxa de integração de um plasmídeo doador através dos mecanismos de reparação de DNA celular endógeno.

[0082] Uso de meganucleases, ZFNs, nuclease TALE ou sistemas guiados de ácidos nucleicos, tais como os sistemas CRISPR/Cas9 permitirá o alvejamento de loci endógeno no genoma. Nos Exemplos aqui demonstra-se o alvo para o locus AAVS, mas loci alternativo poderá ser alvejado. Por exemplo, o gene de tipo I de colágeno local foi usado para a expressão de transgene eficaz [44].

[0083] Os locais de reconhecimento heterólogas alternativamente para nucleases direcionadas, incluindo meganucleases, ZFNs e nucleases TALE poderiam ser apresentados com antecedência para o alvejamento de biblioteca subsequente. Nos exemplos deste documento, descreve-se a utilização de uma nuclease TALE reconhecer uma sequência dentro do locus AAVS para introduzir, por recombinação homóloga, a sequência de reconhecimento de meganuclease de I-Sce1 e sítios de reconhecimento de nuclease TALE heterólogos dentro do locus AAVS. O alvejamento direcionado a nuclease pode ser utilizado para impulsionar a inserção das sequências alvo por recombinação homóloga ou NHEJ utilizando DNA vetor ou mesmo oligonucleotídeos de cadeia dupla [45]. Como uma alternativa, os métodos de segmentação não-específicos podem ser usados para introduzir sítios de alvejamento através do uso de integração direcionada a transposões [46] para introduzir sítios de reconhecimento para nucleases específicas de sítio. Os sistemas baseados em vírus, tais como lentivírus, aplicados em baixa titulação também podem ser usados para introduzir locais de segmentação. A transfecção de DNA em conjunto com a triagem da inserção de cópia única também foi utilizada para identificar os locais de integração únicos [17]. Tais abordagens não específicas seriam particularmente uteis no caso de células que não têm um sítio óbvio para alvo ou para genomas que não foram sequenciados ou para genomas para as quais não há nucleases TALE existentes, ZFNs ou sistemas Cas9/CRISPR estarem disponíveis. Uma vez que uma linha de células foi estabelecida após a inserção aleatória de um local de reconhecimento de nuclease, a linha celular pode ser utilizada subsequentemente para criar bibliotecas de ligantes em que todos os clones da biblioteca contêm o transgene no locus fixos utilizando integração direcionada de nuclease.

[0084] Nos exemplos apresentados, três plasmídeos diferentes são utilizados pares que abrangem dos nucleases TALE ou ZFNs em plasmídeos individuais com um plasmídeo separado para DNA doador. No caso de meganuclease a nuclease específica de sítio é codificada por um único gene e isso é introduzido em um plasmídeo com o DNA doador presente num segundo plasmídeo. Naturalmente, as combinações poderiam ser utilizadas incorporando dois ou mais desses elementos no mesmo plasmídeo e isso pode aumentar a eficiência do alvejamento através da redução da quantidade de números de plasmídeos a serem introduzidos. Além disso, pode ser possível pré-integrar a(s) nuclease(s) que também poderia(m) ser induzível(éis) para permitir o controle temporal da atividade de nuclease como foi demonstrado para transposases [46]. Finalmente, a nuclease pode ser introduzida como proteína recombinante ou complexo proteína:RNA (por exemplo, no caso de uma nuclease direcionada de RNA, tal como CRISPR:Cas9).

Locus

[0085] Uma sequência de reconhecimento para a nuclease específica de sítio pode estar presente no DNA genômico ou DNA epissomal que é herdado de maneira estável nas células. DNA doador pode, por conseguinte, ser integrado num locus genômico ou epissomal no DNA celular.

[0086] Na sua forma mais simples, um único gene que codifica um ligante (gene ligante) é orientado para um sítio único dentro do genoma eucariota. A identificação de uma célula demonstrando uma atividade de ligação específica ou o fenótipo celular irá permitir o isolamento direto do gene que codifica a propriedade desejada (por exemplo, por PCR a partir de mRNA ou DNA genômico). Isso é facilitado através da utilização de uma sequência de reconhecimento única para nuclease específica de sítio, que ocorre uma vez no DNA celular. As células utilizadas para a criação da biblioteca podem assim conter uma sequência de reconhecimento da nuclease em um único locus fixo, ou seja, um lugar geométrico idêntico em todas as células. As bibliotecas produzidas a partir de tais células contêm DNA doador integrado no locus fixo, isto é, que ocorre no mesmo locus no DNA celular de todos os clones na biblioteca.

[0087] Opcionalmente, as sequências de reconhecimento podem ocorrer várias vezes no DNA celular, de modo que as células foi mais do que um sítio de integração potencial para DNA doador. Isso seria uma situação típica para as células diplóides ou poliplóides, em que a sequência de reconhecimento é presente em posições correspondentes em um par de cromossomos, isto é, loci replicado. As bibliotecas produzidas a partir de tais células podem conter DNA doador integrados em loci fixos replicados. Por exemplo, as bibliotecas produzidas a partir de células diplóides podem ter de DNA doador integrados em loci fixos duplicados e bibliotecas produzidas a partir de células triplóides podem ter DNA doador integrado em loci fixos triplicados. Muitas células de mamífero adequadas são diplóides e os clones de bibliotecas de células de mamífero de acordo com a invenção pode ter DNA doador integrado em loci fixos duplicados.

[0088] A sequência reconhecida pela nuclease específica de local pode ocorrer em mais de um locus independente no DNA celular. DNA doador pode integrar, por conseguinte, em loci múltiplos independentes. As bibliotecas de células diplóides ou poliplóides podem compreender DNA doador integrado em loci múltiplos fixos independentes e/ou em loci fixos replicados.

[0089] Em células contendo sequências de reconhecimento em vários loci (se loci replicados ou independentes), cada locus representa um sítio de integração de potencial de uma molécula de DNA doador. A introdução de DNA doador nas células pode resultar em integração no número total das sequências de reconhecimento de nuclease presentes na célula ou o DNA doador pode integrar em alguns, mas não todos esses locais potenciais. Por exemplo, quando se produz uma biblioteca a partir de células diplóides que contêm sequências de reconhecimento no primeiro e segundo loci fixos (por exemplo, duplicar loci fixos), a biblioteca resultante pode compreender os clones em que o DNA doador está integrada no primeiro locus fixo, os clones em que o DNA doador é integrado no segundo locus fixo e em que os clones de DNA doador é integrado em ambas as primeira e segunda loci fixos.

[0090] Os métodos de produção de bibliotecas podem, portanto, envolver a clivagem da nuclease específica de sítio de múltiplos loci fixos numa célula e a integração de DNA doador nos múltiplos loci fixos. Como mencionado acima, nos casos em que existem múltiplas cópias da mesma sequência de reconhecimento (por exemplo, como ocorre quando o alvejamento de loci de endógeno em células diplóides ou poliplóides) é possível que os dois genes de ligante sejam integrados, particularmente quando um mecanismos de alvejamento eficiente for usado, com apenas um gene específico para o alvo. Isso pode ser resolvido durante a triagem posterior, uma vez que os genes de ligante foram isolados.

[0091] Em alguns casos, pode ser desejável a introdução de mais do que um ligante por célula. Por exemplo, ligantes bi-específicos podem ser gerados a partir de dois anticorpos diferentes se unindo e esses podem ter propriedades ausentes nos ligantes individuais [47]. Isso pode ser alcançado através da introdução de diferentes genes de anticorpos em ambos os alelos em loci fixos duplicados ou alvejando-se diferentes populações de anticorpos em loci fixos independentes utilizando os métodos aqui descritos. Além disso, um ligante pode-se ser composto de múltiplas cadeias (por exemplo, os domínios VH e VL de anticorpo apresentados dentro de um formato Fab ou IgG). Nesse caso, pode ser desejável integrar as diferentes sub-unidades em diferentes loci. Isso poderia ser integrado dentro do mesmo ciclo de integração direcionada a nuclease, os mesmos podem ser integrados sequencialmente usando a integração direcionada de nuclease para uma ou ambas etapas de integração.

Introdução de DNA doador

[0092] Numerosos métodos foram descritos para a introdução de DNA doador em células eucarióticas, incluindo transfecção, infecção ou eletroporação. A transfecção de grandes quantidades de células é possível por métodos padrão incluindo transfecção mediada por polietilenoimina, tal como aqui descrito. Em adição, os métodos estão disponíveis para eletroporação altamente eficiente de 1010 células em 5 minutos, por exemplo, http://www.maxcyte.com.

[0093] As bibliotecas combinatórias podem ser criadas em que os membros de pares de ligação multiméricos (por exemplo, genes, genes VH e VL de anticorpos) ou mesmo diferentes partes da mesma molécula ligante são introduzidos em diferentes plasmídeos. A introdução de moléculas de DNA doador separadas que codificam ligantes separados ou subunidades de ligante podem ser realizadas simultaneamente ou sequencialmente. Por exemplo, uma cadeia leve de anticorpo pode ser introduzida por transfecção ou infecção, as células crescidas e selecionadas, se necessário. Outros componentes poderiam ser, em seguida, introduzidos em uma etapa de infecção ou transfecção subsequente. Uma ou ambas as etapas pode envolver a integração direciona de nuclease para loci genômicos específicos.

Integração de DNA doador

[0094] O DNA doador é integrado no DNA celular, formando DNA recombinante possuindo uma sequência de DNA contígua no qual o DNA é inserido no sítio de integração. Na presente invenção, a integração é mediada pelos mecanismos de reparação de DNA naturais que são endógenos à célula. Assim, a integração pode ser deixada ocorrer simplesmente através da introdução do DNA doador em uma célula, permitindo que a nuclease específica de sítio criar um local de integração e permitindo que o DNA doador seja integrado. As células podem ser mantidas em cultura durante um tempo suficiente para o DNA ser integrado. Isso normalmente irá resultar numa população mista de células, incluindo (i) as células recombinantes em que o DNA doador integrou no sítio de integração criado pela nuclease específica de sítio e, opcionalmente, (ii) as células em que o DNA doador integrou em sítios que não seja o local de integração desejado e/ou, opcionalmente, (iii) as células que no qual o DNA doador foram integradas. As células recombinantes desejadas e as resultantes de clones da biblioteca podem assim ser fornecidas em uma população mista de outras células eucarióticas. Os métodos de seleção descritos aqui noutro local podem ser utilizado para enriquecer em células da biblioteca.

[0095] Os mecanismos de reparação de DNA endógeno em células eucarióticas incluem a extremidade não homóloga de recombinação homóloga que se une à (NHEJ) e união de extremidade direcionada a micro-homologia. A eficiência da modificação DNA por tais processos pode ser aumentada pela introdução de quebras de cadeia dupla (DSBs) no DNA e ganhos de eficiência de 40.000 vezes foram relatados usando endonucleases de corte raras (meganucleases), tais como I- Sce1 [48, 49, 50].

[0096] Ao contrário da recombinação específica de sítio envolvida em sistemas tais como o sistema Flp-ln [16], a presente invenção não requer recombinases exógenas ou sítios de reconhecimento de recombinase projetadas. Portanto, opcionalmente o presente invento não inclui uma fase de integração do DNA mediada pela recombinase na criação da biblioteca e/ou, opcionalmente, as células eucarióticas em que é introduzido o DNA doador falta um local de recombinação para uma recombinase específica do local. Os mecanismos e aspectos práticos da inserção direcionada de DNA doador no DNA celular por recombinases e nucleases são muito distintas. Como discutido por Jasin em 1996 [50]:

[0097] "... a reação catalisada pela recombinases específicas de sítio é bastante distinta da reparação celular de DSBs. Recombinases específicas de sítio, como antes, sinapse dois sítios de reconhecimento e criar quebras de cadeia simples dentro dos locais, formando assim intermediários Holliday. Os intermediários são resolvidos para produzir deleções, inversões e inserções (cointegrantes), todos os quais restauram os dois locais de reconhecimento. A reação é absolutamente precisa e, por conseguinte, reversível. As quebras nunca estão expostas para o mecanismo de reparação celular."

[0098] Em contraste, a nuclease sítio-específico age para criar quebras ou cortes dentro do DNA celular (por exemplo, genômico ou epissomal), que estão expostos para e reparados por mecanismos de reparação celular endógenos, tais como recombinação homóloga ou NHEJ. As abordagens baseadas em recombinase têm uma exigência absoluta para pré-integração de seus sítios de reconhecimento, de modo que esses métodos exigem projeção do sítio de integração de "hot spot" no DNA celular como uma etapa preliminar. Com a integração direcionada de nuclease é possível projetar nucleases ou direcionar através de RNA guia no caso de CRISPR:Cas9 reconhecer loci endógeno, isto é, sequências de ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente no DNA celular. Finalmente, a nível prático as abordagens direcionadas a nuclease são mais eficientes para integração direta dos transgenes nos níveis necessários para fazer grandes bibliotecas de ligantes.

[0099] O mecanismo de reparação do DNA pelo qual o DNA doador está integrado nos métodos da invenção pode ser pré-determinado ou enviesada em certa medida pelo projeto do DNA doador e/ou a escolha de nuclease específica de sítio.

[0100] A recombinação homóloga é um mecanismo natural usado pelas células para reparar quebras de cadeia dupla, usando sequência homóloga {por exemplo, a partir de outro alelo) como um modelo para a reparação. A recombinação homóloga tem sido utilizada em engenharia celular para introduzir inserções (incluindo os transgenes), deleções e mutações pontuais no genoma. A recombinação homóloga é promovida pelo fornecimento de braços de homologia no DNA doador. A abordagem original de engenharia para as células eucarióticas superiores tipicamente usou os braços de homologia de 5-10 kb dentro de um plasmídeo doador para aumentar a eficiência de integração direcionada de sítio de interesse. Apesar disso, a recombinação homóloga impulsionada puramente por braços de homologia de comprimento, é menos eficiente que recombinação direcionada por Flp e Cre particularmente em eucariotas superiores com grandes genomas. A recombinação homóloga é particularmente adequada para eucariotas tais como leveduras, que tem um tamanho de genoma de apenas 12,5 x 106 bp, onde é mais eficaz em comparação a eucariotas superiores com genomas maiores, por exemplo, células de mamífero com 3.000 x 106 bp.

[0101] A recombinação homóloga também pode ser direcionada através de [52] nicks no DNA genômico e isso também poderia servir como uma via para a integração direcionada de nuclease no DNA genômico. Duas vias distintas têm sido mostradas promover a recombinação homóloga no DNA submetido a nick. Um é essencialmente similar a reparar quebras na cadeia dupla, utilizando Rad51/Brca2, enquanto o outro é inibido por Rad51/Brca2 e preferencialmente utiliza o DNA de cadeia simples ou DNA doador de cadeia dupla de nicking [51].

[0102] A união de extremidade não homóloga (NHEJ) é um mecanismo alternativo para reparar as quebras de cadeia dupla no genoma onde as extremidades do DNA são diretamente religada, sem a necessidade de um modelo de homologia. A clivagem direcionada de nuclease de DNA genômico também pode reforçar a integração de transgene através dos mecanismos não baseados em homologia. Esta abordagem para a reparação do DNA é menos precisa e pode levar à inserções ou deleções. No entanto, NHEJ fornece um meio simples de integração de éxons em estrutura em íntron ou permite a integração das cassetes de promotor:gene no genoma. O uso de métodos não-homólogos permite o uso de vetores dadores que não possuem braços de homologia simplificando assim a construção de DNA doador.

[0103] Foi salientado que as regiões curtas de homologia terminais são usadas para reunir as extremidades de DNA e foi colocada a hipótese de que 4bp de micro-homologia pode ser utilizada para direcionar a reparação de quebras de cadeia dupla, referido como união de extremidade direcionada a micro-homologia[50].

DNA doador

[0104] O DNA doador será geralmente DNA circularizado e pode ser fornecido como um plasmídeo ou vetor. DNA linear é uma outra possibilidade. As moléculas de DNA doador pode compreender regiões que não se integram no DNA celular, a fim de uma ou mais sequências de DNA doador que se integram no DNA celular. O DNA é geralmente de cadeia dupla, embora o DNA de cadeia simples pode ser usado em alguns casos. O DNA doador contém um ou mais transgenes codificando um ligante, por exemplo, pode compreender cassete promotengene.

[0105] No formato mais simples de cadeia dupla, o DNA de plasmídeo circular pode ser utilizado para impulsionar a recombinação homóloga. Isso requer regiões de DNA que flanqueia os transgenes que são homólogas à sequência de DNA que flanqueia o local de clivagem no DNA genômico. O DNA linearizado de plasmídeo de cadeia dupla ou um produto de PCR ou os genes sintéticos podem ser utilizados para impulsionar ambas a recombinação homóloga e vias de reparação de NHEJ. Como uma alternativa ao DNA de cadeia dupla, é possível utilizar DNA de cadeia simples para impulsionar a recombinação homóloga [52]. Uma abordagem comum para gerar DNA de cadeia simples é a de incluir uma origem de cadeia simples de replicação a partir de um bacteriófago filamentoso no plasmídeo.

[0106] O vírus de DNA de cadeia simples, tais como vírus associado a adeno (AAV) foi usado para impulsionar a recombinação homóloga eficiente, em que a eficiência foi mostrada ser melhorado por diversas ordens de grandeza [53, 54]. Os sistemas tais como os sistemas de AAV podem ser usados em conjunto com a clivagem direcionada de nuclease para a construção de bibliotecas grandes de ligantes. Os benefícios de ambos os sistemas podem ser aplicados a segmentação de bibliotecas de ligantes. O limite de empacotamento de vetores de AAV é de 4,7 kb, mas a utilização de digestão de nuclease de DNA genômico alvo reduzirá isso permitindo transgene maior maior interpretada como sendo incorporada.

[0107] Uma molécula de DNA doadora pode codificar um único ligante ou ligantes múltiplos. Opcionalmente, múltiplas subunidades de um ligante podem ser codificadas por molécula de DNA doador. Em algumas modalidades, o DNA doador codifica uma subunidade de um aglutinante multimérico.

Promotores e elementos genéticos para seleção

[0108] A transcrição do ligante do DNA doador de codificação é normalmente conseguido através da colocação da sequência que codifica o ligante sob o controle de um promotor e, opcionalmente, um ou mais elementos potenciadores para a transcrição. Um promotor (e, opcionalmente, outros elementos de controle genético) podem ser incluídos na molécula de DNA doador em si. Alternativamente, a sequência que codifica o ligante pode carecer de um promotor no DNA doador, e em vez disso pode ser colocado em ligação operativa com um promotor no DNA celular, por exemplo, um promotor endógeno ou um promotor exógeno pré-integrado, como um resultado da sua inserção no sítio de integração criado pela nuclease específica de sítio.

[0109] DNA doador pode ainda compreender uma ou mais sequências de codificação adicional, tal como elementos genéticos que permitem a seleção das células que contêm ou expressam o DNA doador. Tal como acontece com a sequência que codifica o ligante, discutido acima, tais elementos podem ser associados a um promotor no DNA doador ou pode ser colocado sob o controle de um promotor, como resultado da integração do DNA doador num local fixo. Essa última disposição fornece um meio conveniente para selecionar especificamente para as células que tenham integrado o DNA doador no sítio desejado, uma vez que essa células devem expressar o elemento genético para seleção. Isso pode ser, por exemplo, um gene que confere resistência a um agente de seleção negativa tal como blasticidina ou puromicina. Uma ou mais etapas de seleção podem ser aplicadas para remover as células indesejadas, tais como células que não possuem o DNA doador ou que não tenham integrado o DNA doador na posição correta. Alternativamente, essas células podem ser permitidas a permanecer misturadas com clones da biblioteca.

[0110] A expressão de um ligante ancorado de membrana pode, em si, ser usada como uma forma de marcador selecionável. Por exemplo, se uma biblioteca de genes de anticorpos, formatada como IgG ou fusões scFv-Fc forem introduzidas, em seguida, as células que expressam o anticorpo podem ser selecionadas utilizando reagentes secundários que reconhecem a superfície expressa Fc utilizando os métodos aqui descritos. Após a transfecção inicial com DNA doador que codifica o transgene sob o controle de um promotor exógeno, a expressão transiente (e expressão na superfície celular) do ligante ocorrerá e será necessário esperar para expressão transitória para diminuir (para conseguir integração específica de, por exemplo, 1-2 genes de anticorpo/célula).

[0111] Como alternativa, uma construção que codifica um elemento de amarração de membrana (por exemplo, o domínio Fe do presente exemplo fundido com o domínio transmembranar do receptor do PDGF) pode ser pré-integrados antes da biblioteca de ligantes é introduzido. Se esse elemento de ancoragem de membrana carecer de um promotor ou for codificado dentro de um éxon que está fora da estrutura com o éxon anterior, então, a expressão de superfície será comprometida. A integração alvejada de uma molécula doadora de entrada pode então corrigir esse defeito (por exemplo, por alvejamento de um promotor ou um éxon "na estrutura" no íntron que está a montante do elemento de ancoragem de defeito). Se a estrutura "corrigir éxion" também codifica um ligante, em seguida, a fusão irá ser produzida entre o ligante e o elemento de ancoragem de membrana resultando em expressão de superfície de ambos. Assim, a integração alvejada corretamente irá resultar em expressão em estrutura do elemento de ancoragem de membrana por si só ou como parte de uma fusão com o ligante de entrada. Além disso, se a biblioteca de entrada de ligantes carecer de um elemento de ancoragem de membrana e esses forem integrados de forma incorreta, os mesmos não serão selecionados. Assim, a expressão do próprio ligante na superfície da célula pode ser utilizada para selecionar a população de células com integração correta alvo.

Número de clones e diversidade da biblioteca

[0112] As bibliotecas de exibição de levedura 107-1010 foram previamente construídas e demonstradas para produzir ligantes na ausência de imunização ou pré-seleção da população [9, 55, 56, 57]. Muitas das bibliotecas de apresentação de mamífero publicadas anteriormente utilizados genes de anticorpos derivados a partir de dadores imunizados ou mesmos linfócitos B específicos de antígeno enriquecidos, dadas as limitações de tamanho de biblioteca e a variabilidade ao usar células de eucariotas superiores. Graças à eficiência do alvejamento de genes descrito na presente invenção, grandes bibliotecas ingênuas podem ser construídas em eucariotas superiores, tais como células de mamífero, que correspondem aos descritos para eucariotas tais como leveduras mais simples.

[0113] Após integração de DNA doador no DNA celular, as células recombinantes resultantes são cultivadas para permitir a sua replicação, gerando de um clone de células a partir de cada célula recombinante produzidos inicialmente. Cada clone é assim derivado de uma célula original em que o DNA doador foi integrado num local de integração criado pela nuclease específica de sítio. Métodos de acordo com a presente invenção estão associados com uma elevada eficiência e elevada fidelidade de integração de DNA doador e uma biblioteca de acordo com a presente invenção podem conter, pelo menos, 100, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109 ou 1010 clones.

[0114] Usando integração direcionada de nuclease é possível atingir 10% ou mais de células de mamífero transfectadas. Também é prático a crescer e transformar >1010 células (por exemplo, a partir de 5 litros de células crescendo a 2 x106 células/ml). A transfecção de um número tão grande de células pode ser feita usando métodos padrão incluindo transfecção mediada por polietilenoimina, tal como aqui descrito. Em adição, os métodos estão disponíveis para eletroporação altamente eficiente de 1010 células em 5 minutos, por exemplo, http://www.maxcyte.com. Assim, utilizando a abordagem da presente invenção é possível criar bibliotecas em excesso de 109 clones.

[0115] Quando a população de moléculas de DNA doador, que é usada para criar a biblioteca contém múltiplas cópias da mesma sequência, dois ou mais clones podem ser obtidas que contêm DNA que codifica o mesmo ligante. Ele também pode ser o caso de que um clone pode conter DNA doador que codifica mais do que um ligante diferente, por exemplo, se houver mais do que uma sequência de reconhecimento para a nuclease específica de sítio, tal como descrito aqui noutro local. Assim, a diversidade da biblioteca, em termos do número de diferentes ligantes codificados ou expressos, pode ser diferente do número de clones obtidos.

[0116] Os clones na biblioteca de preferência contêm DNA doador que codifica o um ou dois membros do repertório de ligantes e/ou expressar de um modo preferido apenas um ou dois membros do repertório de ligantes. Um número limitado de diferentes ligantes por célula é uma vantagem quando se trata de identificar o clone e/ou DNA que codifica um ligante específico identificado na triagem da biblioteca contra um dado alvo. Este é mais simples quando clones codificar um único membro do repertório de ligantes. No entanto, é também fácil identificar o DNA que codifica para um ligante relevante pretendido, se um clone selecionado a partir de uma biblioteca codifica um pequeno número de diferentes agentes ligantes, por exemplo, um clone pode codificar dois membros do repertório de ligantes. Como discutido aqui noutro local, clones que codificam um ou dois ligantes são particularmente convenientes para gerar, marcando uma sequência de reconhecimento para a nuclease específica de sítio que ocorre uma vez por cada cópia cromossômica em um genoma diplóide, como células diplóides conter loci fixo duplicado, um de cada cópia cromossômica, e o DNA doador pode integrar num ou em ambos os loci fixos. Assim, os clones de cada biblioteca podem expressar apenas um ou dois membros do repertório de ligantes.

[0117] Ligantes exibidos na superfície das células da biblioteca podem ser idênticos a (tendo a mesma sequência de aminoácidos como) outros ligantes indicados na mesma célula. A biblioteca pode consistir em clones de células que exibem cada um único membro do repertório de ligantes, ou de clones que exibem uma pluralidade de membros do repertório de ligantes por célula. Alternativamente, uma biblioteca pode compreender alguns clones que exibem um único membro do repertório de agentes aglutinantes, e alguns clones que exibem uma pluralidade de membros (por exemplo, dois) do repertório de ligantes.

[0118] Consequentemente, uma biblioteca de acordo com a presente invenção pode compreender clones que codificam mais do que um membro do repertório de ligantes, em que o DNA doador está integrado em loci fixos duplicados ou múltiplos loci fixos independentes.

[0119] Como observado acima, é mais fácil para identificar o DNA que codifica para um ligante correspondente se o clone correspondente expressar apenas um ligante. Tipicamente, uma molécula de DNA doador vai codificar um único ligante. O ligante pode ser multimérico de modo a que uma molécula de DNA doador inclui múltiplos genes ou estruturas de leitura abertas correspondendo às várias subunidades do ligante multimérica.

[0120] Uma biblioteca de acordo com a presente invenção pode codificar, pelo menos, 100, 103, 104, 105 ou 106, 107, 108, 109 ou 1010 diferentes ligantes. Quando os ligantes são multiméricos, a diversidade pode ser fornecida por uma ou mais subunidades do ligante. Os ligantes multiméricos podem combinar uma ou mais subunidades variáveis com uma ou mais subunidades, em que as constantes subunidades são os mesmos (ou de diversidade mais limitada) através de todos os clones da biblioteca. Na geração de bibliotecas de ligantes multiméricas, diversidade combinatória é possível que um primeiro repertório de subunidades ligante pode emparelhar com qualquer um de um segundo repertório de subunidades para encadernação.

Ligantes

[0121] Um "ligante" de acordo com a presente invenção é uma molécula de ligação, o que representa um padrão de ligação específico para a outra molécula. Exemplos típicos de padrões de ligação específicos são antígeno- anticorpo e receptor-ligante.

[0122] O repertório de ligantes codificados por uma biblioteca geralmente partilham uma estrutura comum e têm uma ou mais regiões de diversidade. Por conseguinte, a biblioteca permite a seleção de um membro de uma classe estrutural desejado de moléculas, tais como um péptido ou uma molécula de anticorpo scFv. Por exemplo, os ligantes podem ser polipeptídeos que partilham uma estrutura comum e possuindo uma ou mais regiões da sequência de aminoácidos da diversidade.

[0123] Isso pode ser ilustrado considerando-se um repertório de moléculas de anticorpo. Isso pode ser moléculas de anticorpos de uma classe estrutural comum, por exemplo, IgG, Fab, scFv-Fc ou scFv, diferindo numa ou mais regiões da sua sequência. As moléculas de anticorpo possuem tipicamente variabilidade de sequências das suas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que são as regiões que participam principalmente no reconhecimento do antígeno. Um repertório de ligantes na presente invenção pode ser um repertório de moléculas de anticorpo que diferem em uma ou mais CDRs, por exemplo, pode haver diversidade de sequência em todas as seis CDR, ou em um ou mais particular CDRs, tais como a CDR3 de cadeia pesada e/ou CDR3 de cadeia leve.

[0124] As moléculas de anticorpos e outros agentes ligantes são descritos em mais detalhes noutra parte deste documento. O potencial da presente invenção, no entanto, se estende para além de exibição de anticorpos incluem a apresentação de bibliotecas de péptidos ou proteínas modificadas, incluindo receptores, ligantes, domínios de proteínas individuais e andaimes de proteínas alternativas [58, 59]. A integração específica de sítio dirigido de nuclease pode ser utilizada para criar bibliotecas de outros tipos de ligantes anteriormente desenvolvido usando outros sistemas de exibição. Muitos destes envolvem domínios de ligação monoméricos tais como DARPins e lipocalinas, afficorpos e adirons [58, 59, 152], exibir em eucariotas, em particular células de mamíferos, também abre a possibilidade de isolar e ligantes de engenharia ou alvos envolvendo mais complexos, alvos multiméricos. Por exemplo, os receptores de células T (TCR) são expressos nas células T e evoluíram para reconhecer peptídeo apresentado em complexo com moléculas MHC nas células apresentadoras de antígeno. As bibliotecas que codificam e expressam um repertório de TCR podem ser geradas, e podem ser pesquisadas para identificar a ligação a complexos de peptídeos MHC, conforme descrito adicionalmente aqui noutro local.

[0125] Para ligantes multiméricas, DNA doador que codifica o ligante pode ser fornecido como uma ou mais moléculas de DNA. Por exemplo, onde os domínios VH e VL de anticorpo individuais devem ser expressos separadamente, esses podem ser codificados em moléculas separadas de DNA doador. O DNA doador integra no DNA celular em múltiplos locais de integração, por exemplo, o gene ligante para VH de um locus e o gene de ligante para VL em um segundo locus. Os métodos de introdução de DNA doador que codifica as subunidades de ligante separado são descritos em mais detalhes noutra parte deste documento. Alternativamente, ambas as subunidades ou partes de um ligante multimérico podem ser codificadas na mesma molécula de DNA doador que se integra num local fixo.

[0126] Um ligante pode ser uma molécula de anticorpo ou uma proteína não-anticorpo que compreende um local de ligação ao antígeno. Um local de ligação ao antígeno pode ser fornecido por meio de arranjo de laços de peptídeos em estruturas de suporte de proteína não-anticorpo, tais como fibronectina ou citocromo B, etc., ou por resíduos de aminoácidos de randomização ou mutação de um circuito dentro de um andaime para conferir proteína de ligação a um alvo desejado [60, 61, 62]. Os andaimes de proteína para imitadores de anticorpos estão descritos em WO/0034784, em que os inventores descrevem proteínas (imitadores de anticorpos) que incluem um domínio de fibronectina de tipo III possuindo pelo menos um laço aleatório. Um andaime adequado no qual o enxerto de um ou mais circuitos de peptídeos, por exemplo, um conjunto de laços de CDR de VH de anticorpo, pode ser fornecido por qualquer membro do domínio da superfamília dos genes da imunoglobulina. O andaime pode ser uma proteína humana ou não humana.

[0127] O uso de sítios de ligação ao antígeno em andaimes de proteína não-anticorpo foi revisto anteriormente [63]. Típicas são proteínas que têm uma estrutura principal estável e uma ou mais alças variáveis, nas quais a sequência de aminoácidos da alça ou alças é específica ou randomicamente mutantes para criar um sítio de ligação de antígeno tendo ligação ao antígeno alvo. Tais proteínas incluem os domínios de ligação IgG de proteína A de S. aureus, transferrina, tetranetina, fibronectina (por exemplo, 10° domínio de fibronectina de tipo III) e lipocalinas. Outras abordagens incluem pequeno peptídeo restrito, por exemplo, com base em "knottin" e andaimes de ciclotídeos [64]. Dado o seu pequeno tamanho e complexidade particularmente em relação à formação correta de ligação de dissulfureto, pode haver vantagens para a utilização de células eucarióticas para a seleção de novos ligantes à base de tais suportes. Dadas as funções comuns destes péptidos na natureza, as bibliotecas de aglutinantes à base de tais suportes podem ser vantajosas na geração de pequenos ligantes de elevada afinidade com especial aplicação no bloqueio dos canais de íons e proteases.

[0128] Em adição às sequências de anticorpos e/ou um local de ligação ao antígeno, um ligante pode compreender outros aminoácidos, por exemplo, formando um peptídeo ou polipeptídeo, tal como um domínio dobrado, ou para conferir à molécula outra característica funcional em adição à capacidade de antígeno de ligante. Um ligante pode transportar um marcador detectável, ou pode ser conjugado com uma toxina ou uma porção de alvejamento ou enzima (por exemplo, através de uma ligação peptidil ou ligante). Por exemplo, um ligante pode compreender um sítio catalítico (por exemplo, num domínio de enzima), bem como um local de ligação ao antígeno, em que o local de ligação ao antígeno se liga ao antígeno e, assim, tem como alvo o local catalítico para o antígeno. O sítio catalítico pode inibir a função biológica do antígeno, por exemplo, por clivagem.

Moléculas de anticorpo

[0129] As moléculas de anticorpo são os ligantes preferidos. As moléculas de anticorpos podem ser anticorpos completos ou imunoglobulinas (Ig), que têm quatro cadeias polipeptídicas - duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. As cadeias pesadas e leves formar pares, tendo cada par um domínio VH-VL que contém um local de ligação ao antígeno. As cadeias pesadas e leve também compreendem regiões constantes: CL de cadeia leve e CH1, CH2, CH3 de cadeia pesada e, por vezes, CH4 (o quinto domínio

[0130] CH4 está presente no ser humano IgM e IgE). As duas cadeias pesadas estão unidas por pontes de dissulfureto a uma região de charneira flexível. Uma molécula de anticorpo pode compreender um domínio VH e/ou VL.

[0131] O formato nativo mais comum de uma molécula de anticorpo é uma IgG que é um heterotetrâmero que consiste em duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas. As cadeias pesadas e leves são constituídas por domínios modulares com uma estrutura secundária conservada que consiste de uma folha beta antiparalela cadeia de quatro e uma folha beta anti-paralela de cadeia tripla, estabilizada por uma única ligação dissulfureto. Antibody cadeias pesadas, cada uma tem um domínio N terminal variável (VH) e 3 domínios de imunoglobulina "constante" relativamente conservadas (CH1, CH2, CH3), enquanto que as cadeias leves têm um domínio N terminal variável (VL) e um domínio constante (CL). As pontes de dissulfeto estabilizam os domínios individuais e formam ligações covalentes para juntar as quatro cadeias em um complexo estável. VL e CL da cadeia leve associam-se com VH e CH1 da cadeia pesada e estes elementos podem ser expressos sozinhos para formar um fragmento Fab. Os domínios CH2 e CH3 (também chamado o "domínio de Fc") associado ao outro par CH2:CH3 a dar uma molécula em forma de Y tetramérica com os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nas pontas do "Y". Os domínios CH2 e CH3 são responsáveis pelas interações com células efetoras e componentes do complemento dentro do sistema imunológico. Os anticorpos recombinantes foram previamente expressos em formato IgG ou como Fab (que consiste em um dímero de VH:CH1 e um cadeia leve). Além disso, a construção artificial chamado um Fv de cadeia simples (scFv) pode ser utilizado que consiste em DNA que codifica os fragmentos de VH e VL fundidos geneticamente com o DNA que codifica para um ligante flexível.

[0132] Os ligantes podem ser moléculas de anticorpos humanos. Assim, quando estão presentes os domínios constantes são de preferência os domínios constantes humanos.

[0133] Os ligantes podem ser fragmentos de anticorpo ou molécula de anticorpo mais pequenos formatos, tais como moléculas de anticorpo de cadeia simples. Por exemplo, as moléculas de anticorpo podem ser moléculas de scFv, que consiste de um domínio VH e um domínio VL ligados por um peptídeo ligante. Na molécula de scFv, os domínios VH e VL formam um par de VH-VL em que as regiões determinantes de complementaridade de VH e VL se juntam para formar um local de ligação ao antígeno.

[0134] Outros fragmentos de anticorpos que compreendem um anticorpo local de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitados a, (i) o fragmento Fab que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) o fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iii) o fragmento Fv que consiste nos domínios VL e VH de um único anticorpo; (iv) o fragmento dAb [65, 66, 67], que consiste de um domínio VH ou VL; (v) regiões CDR isoladas; (vi) F(ab')2 , um fragmento bivalente que compreende dois fragmentos Fab ligados (vii) scFv, em que um domínio VH e um domínio VL estão ligados por um ligante peptídico que permite que os dois domínios se associem para formar um sítio de ligação de antígeno [68, 69]; (viii) dímeros biespecífico de cadeia simples Fv (PCT/US92/09965) e (ix) "diacorpos", fragmentos multivalentes ou multiespecíficos construídos por fusão de genes (WO94/13804; [70]). Fv, scFv ou diacorpo

[0135] As moléculas podem ser estabilizadas pela incorporação de pontes de dissulfureto que ligam os domínios VH e VL [71].

[0136] Várias outras moléculas de anticorpos incluindo um ou mais locais de ligação ao antígeno de anticorpos foram projetadas, incluindo, por exemplo, Fab2, Fab3, diacorpos, triacorpos, tetracorpos e minicorpos (pequenas proteínas imunes). As moléculas e os métodos para a sua construção e utilização de anticorpos têm sido descritos [72].

[0137] Outros exemplos de fragmentos de ligação são o Fab', o que difere dos fragmentos Fab pela adição de alguns resíduos no terminal carboxilo do domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região charneira do anticorpo, e Fab'-SH, onde é um fragmento Fab' em que os resíduos de cisteína dos domínios constantes possuem um grupo tiol livre.

[0138] Um dAb (anticorpo de domínio) é um fragmento de ligação a antígeno monomérico pequeno de um anticorpo, a região variável de uma cadeia pesada ou leve do anticorpo. VH dAbs ocorrem naturalmente em camelídeos (por exemplo, camel, lama) e pode ser produzido por imunização de um dos camelídeos com um antígeno alvo, o isolamento de células B específicas do antígeno e clonagem de genes de dAb diretamente a partir de células B individuais. dAb também são produzidos em cultura de células. O seu pequeno tamanho, boa solubilidade e estabilidade de temperatura torna-os particularmente fisiologicamente útil e adequado para a seleção e maturação de afinidade. Camelídeo VH dAbs estão sendo desenvolvidos para uso terapêutico, sob o nome "nanobodies™".

[0139] As moléculas de anticorpo sintético podem ser criadas através de expressão a partir de genes gerados por meio de oligonucleotídeos sintetizados e montados, dentro de vetores de expressão adequados, por exemplo, como descrito por Knappik et al. [73] ou Krebs et al. [74].

[0140] Anticorpos biespecíficos ou bifuncionais formam uma segunda geração de anticorpos monoclonais, em que duas diferentes regiões variáveis são combinadas na mesma molécula [75]. A sua utilização tem sido demonstrada tanto na área de diagnóstico e terapêutica no domínio da sua capacidade para recrutar novas funções efetoras ou alvejar várias moléculas na superfície de células tumorais. Onde anticorpos biespecíficos devem ser utilizados, esses podem ser anticorpos biespecíficos convencionais, que podem ser fabricados numa variedade de maneiras [76], por exemplo, preparados quimicamente ou a partir de hibridomas híbridos, ou podem ser quaisquer dos fragmentos de anticorpos biespecíficos mencionados acima. Esses anticorpos podem ser obtidos por métodos químicos [77, 78] ou métodos somáticos [79, 80], mas da mesma forma e, preferencialmente, por técnicas de engenharia genética, que permitem a heterodimerização a ser forçada e, assim, facilitar o processo de purificação do anticorpo procurado [81] . Exemplos de anticorpos biespecíficos incluem os da tecnologia BiTE™ em que os domínios de ligação de dois anticorpos com especificidade diferente podem ser utilizados diretamente e ligado por meio de peptídeos curtos flexíveis. Isto combina dois anticorpos em uma cadeia de polipeptídeo único curto. Diacorpos e scFv podem ser construídos sem uma região Fc, usando apenas domínios variáveis, reduzindo potencialmente os efeitos de uma reação anti-idiotípica.

[0141] Anticorpos biespecíficos podem ser construídos como IgG inteiro, como Fab'2 biespecífico, como Fab'PEG, como diacorpos ou como scFv biespecífico. Além disso, dois anticorpos biespecíficos podem ser ligados usando métodos de rotina conhecidos na técnica para formar anticorpos tetravalentes.

[0142] Os diacorpos biespecíficos, ao contrário dos anticorpos completos biespecíficos, podem também ser particularmente úteis. Diacorpos (e muitos outros polipeptídeos, tais como fragmentos de anticorpo) de especificidades apropriadas podem se facilmente selecionados. Se um braço do diacorpo tiver que ser mantido constante, por exemplo, com uma especificidade direcionada contra um anticorpo de intesse, então uma biblioteca pode ser feita onde o outro braço é variado e um anticorpo de especificidade apropriado é selecionado. Os anticorpos completos biespecíficos podem ser preparados por métodos de engenharia alternativos, tal como descrito em Ridgeway et al., 1996 [82].

[0143] Uma biblioteca de acordo com a invenção pode ser utilizada para selecionar uma molécula de anticorpo que se liga a um ou mais antígenos de interesse. Seleção das bibliotecas é descrito em detalhe abaixo. Após a seleção, a molécula de anticorpo pode, então, ser manipulada para um formato diferente e/ou conter funcionalidades adicionais. Por exemplo, a molécula de anticorpo selecionada pode ser convertida para um formato diferente, tal como um dos formatos de anticorpo acima descritos. As moléculas de anticorpo selecionadas e moléculas de anticorpo compreendendo CDRs de VH e/ou de VL das moléculas de anticorpo selecionadas, são um aspecto da presente invenção. As moléculas de anticorpo e o seu ácido nucleico de codificação podem ser fornecidos na forma isolada.

[0144] Os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos a partir de uma molécula de anticorpo por meio de métodos tais como a digestão por enzimas, por exemplo, pepsina ou papaína e/ou por clivagem das pontes dissulfureto por redução química. Numa outra forma, os fragmentos de anticorpo podem ser obtidos por técnicas de recombinação genética bem conhecidas pelos especialistas na técnica, ou então através de síntese peptídica por meio de, por exemplo, sintetizadores de peptídeos automáticos ou por síntese e expressão do ácido nucleico.

[0145] É possível tomar anticorpos monoclonais e outros anticorpos e utilizar técnicas de tecnologia de DNA recombinante para produzir outros anticorpos ou moléculas quiméricas que ligam o antígeno alvo. Tais técnicas podem envolver a introdução de DNA que codifica a região variável de imunoglobulina, ou CDRs, de um anticorpo para as regiões constantes, ou regiões constantes mais regiões de estrutura, de uma imunoglobulina diferente. Ver, por exemplo, EP-A- 184187, GB 2188638A ou EP-A-239400, e uma grande quantidade de literatura subsequente.

[0146] As moléculas de anticorpo podem ser selecionadas a partir de uma biblioteca e, em seguida, modificadas, por exemplo, a meia-vida in vivo de uma molécula de anticorpo pode ser aumentada por modificação química, por exemplo PEGilação ou por incorporação em um lipossoma.

Fontes de genes de ligante

[0147] A via tradicional para a geração de anticorpos monoclonais utiliza o sistema imune de animais de laboratório tais como camundongos e coelhos para gerar um conjunto de anticorpos de elevada afinidade, que são depois isolados através da utilização de tecnologia de hibridoma. A presente invenção fornece uma via alternativa para a identificação dos anticorpos que derivam de imunização. Os genes de VH e VL podem ser amplificados a partir de células B dos animais imunizados e clonados num vetor apropriado para introdução em bibliotecas eucarióticas seguido por seleção dessas bibliotecas. A exibição de fagos e apresentação de ribossoma permite bibliotecas muito grandes (>109 clones) a ser construídas permitindo o isolamento de anticorpos humanos sem imunização. A presente invenção também poderia ser utilizada em conjunção com esses métodos. Após ciclos de seleção de exibição em fagos, a população selecionada dos agentes ligantes pode ser introduzidos em células eucarióticas pela integração direcionada de nuclease, tal como aqui descrito. Isso permitiria a utilização inicial de muito grandes bibliotecas baseadas em outros sistemas (por exemplo, exibição de fagos) para enriquecer uma população de ligantes permitindo que seu rastreio eficiente utilizando células eucarióticas, conforme descrito acima. Assim, a invenção pode combinar as melhores características de ambos exibição de fagos e exibição eucariótica para dar um sistema de alto rendimento com a triagem quantitativa e classificação.

[0148] Usando exibição de fagos e exibição de levedura que foram demonstradas anteriormente que também é possível gerar ligantes sem recorrer a imunização, as bibliotecas fornecidas de tamanho suficiente de exibição são utilizadas. Por exemplo vários ligantes foram gerados a partir de uma biblioteca de anticorpos não-imune de >107 clones [83]. Isso por sua vez permite a geração de ligantes para alvos que são difíceis pelas vias tradicionais de imunização, por exemplo, a geração de anticorpos para "auto- antígenos" ou epitopos que são conservados entre espécies. Por exemplo, ligantes de reatividade cruzada de humano/camundongo podem ser enriquecidos pela seleção sequencial em humanos e então versões de camundongo do mesmo alvo. Uma vez que não é possível imunizar especificamente seres humanos para a maioria dos alvos de interesse, essa facilidade é particularmente importante para permitir a geração de anticorpos humanos que são preferidos para abordagens terapêuticas.

[0149] Em exemplos de exibição de mamífero até à data, em que os tamanhos da biblioteca e qualidade foram limitados, ligantes só foram gerados usando repertórios que foram pré-enriquecidos para ligantes, por exemplo, a partir da imunização ou engenharia de ligantes pré-existentes. A capacidade para fazer grandes bibliotecas em células eucarióticas e especialmente eucariotas superiores cria a possibilidade de isolar ligantes diretamente a partir desas bibliotecas começando com ligantes não-imunes ou ligantes que não tenham sido previamente selecionados dentro de outro sistema. Com a presente invenção, é possível gerar ligantes de fontes não-imunes. Isso, por sua vez, abre as possibilidades para o uso de genes para ligantes de várias fontes. Os genes ligantes poderiam vir de PCR de fontes naturais, tais como genes de anticorpo. Os genes de ligante também podem ser re-clonados a partir de bibliotecas existentes, tais como bibliotecas de exibição de fagos de anticorpos e clonadas num vetor doador adequado para integração direcionada de nuclease em células alvo. Os ligantes podem ser completa ou parcialmente sintéticos na origem. Além disso, vários tipos de ligantes são aqui descritos noutro local, por exemplo, genes de ligante podem codificar anticorpos ou podem codificar andaimes alternativos [58, 59], peptídeos ou proteínas modificadas ou domínios proteicos.

Exibição de ligante

[0150] Para fornecer um repertório de ligantes para a triagem contra um alvo de interesse, a biblioteca pode ser cultivada para expressar os ligantes em qualquer forma secretada solúvel ou na forma transmembranar. Para a visualização da superfície celular que é necessário para reter o aglutinante expresso na superfície da célula que o codifica. Os ligantes podem incluir, ou ser ligados a uma âncora de membrana, tal como um domínio transmembranar, para exibição extracelular do ligante na superfície da célula. Isso pode envolver a fusão direta do ligante para um sinal de localização da membrana, tal como uma sequência de reconhecimento para a GPI ou um domínio transmembranar, tais como o domínio transmembranar do receptor de PDGF [84]. A retenção de ligantes na superfície da célula, também pode ser realizado indiretamente por associação com a outra molécula retida de superfície celular expressa no interior da mesma célula. Essa molécula associada pode ser parte de um ligante heterodimérico, tal como cadeia pesada de anticorpo ancorado em associação com um padrão de cadeia leve que não está ancorado diretamente.

[0151] Embora a imobilização da superfície celular facilita a seleção do ligante, em muitas aplicações, é necessário preparar o ligante secretado isento de células. Será possível combinar a membrana de ancoragem e secreção solúvel usando um método de recaptura de anexação dos ligantes segregados para receptores da superfície celular. Uma abordagem é a de formatar a biblioteca de ligantes como moléculas segregadas que podem ser associadas a uma molécula de membrana ancoradas expressas na mesma célula, que pode funcionar para capturar um ligante segregado. Por exemplo, no caso de anticorpos ou moléculas de ligante fundidas com os domínios de Fe de anticorpo, uma membrana ancorada Fc pode "amostrar" as moléculas ligantes secretadas sendo expressas na mesma célula resultando na exibição de uma fração monomérica das moléculas de ligante a serem expressas enquanto que o restante é segregado na forma bivalente (US 8.551.715). Uma alternativa é a utilização de um domínio de ligação de IgG ancorada tais como a proteína A.

[0152] Outros métodos para a retenção de anticorpos segregados com as células que as produzem são revistos em Kumar et al. (2012) [85] e incluem encapsulamento de células dentro de microgotas, captura auxiliada de matriz, exibição de superfície de captura por afinidade (ACSD), tecnologia de secreção e captura (SECANT) e "captura a frio" [85]. Em exemplos dados para ACSD e SECANT [85], biotinilação é utilizada para facilitar a imobilização de estreptavidina ou um anticorpo de captura na superfície de célula. A molécula capturada por sua vez captura os anticorpos segregados. No exemplo de SECANT in vivo biotinilado da molécula segregada ocorre. Usando a técnica de anticorpo de "captura a frio" segregada pode ser detectada em células produtoras que utilizam anticorpos direcionada à molécula segregada. Foi proposto que isso devido à associação do anticorpo segregado com o glicocálice da célula [86]. Alternativamente, foi sugerido que o produto segregado seja preso por coloração de anticorpos na superfície das células antes de ser sujeita a endocitose [87]. Os métodos acima descritos foram utilizados para identificar clones de expressão elevada dentro de uma população, mas poderia, potencialmente, ser adaptado para a identificação de especificidade de ligação, desde que a associação tenha longevidade suficiente na superfície da célula.

[0153] Mesmo quando o aglutinante estiver diretamente preso à superfície da célula, é possível gerar um produto solúvel. Por exemplo, o gene que codifica o ligante selecionado pode ser recuperado e clonado num vetor de expressão que falta a sequência de membrana ancoradas. Em alternativa, e tal como demonstrado nos Exemplos, uma construção de expressão pode ser usada em que o domínio da transmembrana é codificado dentro de um éxon flanqueado por locais de recombinação, por exemplo, locais de reconhecimento para ROX Dre recombinase [88]. Neste exemplo, o éxon que codifica o domínio transmembranar pode ser removido por transfecção com um gene que codifica a recombinase Dre para alternar a expressão para uma forma segregada. Como aqui demonstrado, o anticorpo secretado foi produzido por esse método sem a necessidade de uma ação da recombinase. Isto é, presumivelmente como resultado de splicing alternativo [89],

[0154] Qualquer dos métodos acima referidos ou outros métodos adequados podem ser utilizados para assegurar que ligantes expressos por clones de uma biblioteca sejam exibidos na superfície das suas células de expressão.

[0155] A triagem para identificar os ligantes a um alvo de interesse

[0156] Como observado, a biblioteca de células eucarióticas pode ser utilizada num método de triagem para um ligante que reconhece um alvo. Tal método pode compreender:

[0157] fornecer uma biblioteca, tal como aqui descrito,

[0158] cultura de células da biblioteca para expressar os ligantes,

[0159] exposição dos ligantes ao alvo, permitindo o reconhecimento do alvo por um ou mais ligantes cognatos, se estiverem presentes, e

[0160] detecção se o alvo é reconhecido por um ligante cognato.

[0161] As seleções poderiam ser realizadas utilizando uma variedade de classes de molécula alvo, por exemplo, proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípidos, moléculas pequenas. O alvo pode ser fornecido na forma solúvel. O alvo pode ser marcado para facilitar a detecção, por exemplo, pode transportar um marcador fluorescente ou pode ser biotinilado. As células que expressam um ligante específico de alvo podem ser isoladas utilizando uma molécula alvo marcada, direta ou indiretamente, em que o ligante capta a molécula marcada. Por exemplo, as células que são ligadas, através da interação bindentarget, para um alvo marcado com fluorescência pode ser detectado e classificado por citometria de fluxo ou FACS para isolar as células desejadas. As seleções envolvendo citometria requerem moléculas alvo que são diretamente marcadas com fluorescência, ou marcadas com moléculas que podem ser detectadas com reagentes secundários, por exemplo, biotinilado alvo pode ser adicionado às células e a ligação à superfície da célula pode ser detectada com estreptavidina marcada fluorescentemente tal como estreptavidina ficoeritrina. Uma outra possibilidade consiste em imobilizar a molécula alvo ou reagentes secundários que se ligam ao alvo em uma superfície sólida, tais como esférulas magnéticas ou esferas de agarose, para permitir o enriquecimento de células que se ligam ao alvo. Por exemplo, as células que se ligam, por meio do ligante: interação alvo, para um biotinilado alvo pode ser isolado sobre um substrato revestido com estreptavidina, por exemplo, esferas revestidas com estreptavidina.

[0162] Nas bibliotecas de rastreio é preferível sobre-amostrar, ou seja, selecionar mais clones do que o número de clones independentes presentes dentro da biblioteca para assegurar uma representação eficaz da biblioteca. Identificação de ligantes a partir de bibliotecas muito grandes fornecidas pela presente invenção pode ser feita por triagem de fluxo, mas isso iria demorar vários dias, particularmente se sobre-amostrando da biblioteca. Como seleções iniciais alternativas podem basear-se na utilização de antígeno recuperável, por exemplo, antígeno biotinilado recuperado em contas magnéticas revestidas com estreptavidina. Assim as esferas magnéticas revestidas de estreptavidina podem ser utilizadas para capturar as células que se ligaram ao antígeno biotinilado. A seleção com esferas magnéticas pode ser usada como o único método de seleção ou isso pode ser feito em conjunto com a citometria de fluxo, em que a melhor resolução pode ser conseguida, por exemplo, a diferenciação entre um clone com os níveis de expressão mais elevados e um com uma afinidade superior [56, 57] .

[0163] A natureza in vitro de abordagens tecnologia de exibição torna é possível controlar a seleção de uma forma que não é possível através de imunização, por exemplo, selecionando um estado conformacional em particular de um alvo [90, 91]. Alvos poderiam ser marcados através de modificação química (fluoresceína, biotina) ou por fusão genética (por exemplo, proteína fundida com uma etiqueta de epitopo, tal como um marcador FLAG ou um outro domínio de proteína ou uma proteína inteira). A etiqueta pode ser ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA ou ácidos nucleicos não biológicos) em que a etiqueta é parte fundida com o ácido nucleico alvo ou pode ser quimicamente ligada a um outro tipo de molécula tal como uma proteína. Isso poderia ser através da conjugação química ou através de ligação enzimática [92]. O ácido nucleico também pode ser fundido com um alvo através de um processo de tradução tais como apresentação de ribossoma. O "marcador" pode ser outra modificação que ocorre dentro da célula (por exemplo, glicosilação, fosforilação, ubiqitinylation, alquilação, PASilação, SUMO-mento e outros descritos em Post-translational Database (db-PTM) em http://dbptm.mbc.nctu.edu.tw/statistics.php) que pode ser detectado por meio de reagentes secundários. Isso deu ligantes que se ligam a uma proteína alvo conhecida na base de uma modificação específica.

[0164] Os alvos podem ser detectados utilizando ligantes existentes que se ligam a essa molécula alvo, por exemplo, anticorpos específicos alvo. A utilização de ligantes existentes para a detecção terão a vantagem adicional de identificar ligantes dentro da biblioteca de ligantes que reconhecem um epitopo distinto do ligante utilizado para a detecção. Desta forma, pares de ligantes podem ser identificados para utilização em aplicações tais como ELISA de tipo sanduíche. Sempre que possível, uma molécula alvo purificada seria preferida. Alternativamente o alvo pode ser exibido na superfície de uma população de células alvo e os ligantes são exibidos na superfície das células da biblioteca, sendo que o método compreende a exposição de ligantes ao alvo colocando as células da biblioteca em contato com as células alvo. A recuperação das células que expressam o alvo (por exemplo, utilizando células que expressam alvo biotinilados) vai permitir o enriquecimento de células que expressam ligantes para as mesmas. Essa abordagem seria útil em que as interações de baixa afinidade estão envolvidas uma vez que existe o potencial para um efeito de avidez forte.

[0165] A molécula de alvo pode também ser alvos não purificados nativas ou recombinantes não purificados desde que uma molécula de detecção esteja disponível para identificar a ligação celular (como descrito acima). Em ligação de moléculas alvo na célula que expressa o ligante adição pode ser detectado indiretamente, por meio da associação da molécula alvo a uma outra molécula que está sendo detectada, por exemplo, um lisado de células contendo uma molécula marcada pode ser incubado com uma biblioteca de ligantes para identificar ligantes não só à molécula marcada, mas também aos seus ligantes de proteínas de padrões associados. Isso resultaria em um painel de anticorpos a esses padrões que podem ser utilizados para detectar ou identificar o padrão (por exemplo, utilizando espectrometria de massa). O fracionamento celular pode ser utilizado para enriquecer alvos a partir de localizações subcelulares particulares. Alternativamente a biotinilação diferencial das frações de superfície ou citoplasmáticas poderia ser usada em conjunto com os reagentes de detecção de estreptavidina para exibição eucariótica [93, 94]. A utilização de preparações de detergentes alvo solubilizado é uma abordagem particularmente útil para as proteínas de membrana íntegra como GPCRs e os canais de íons que de outra forma são difíceis de preparar. A presença de detergentes pode ter um efeito prejudicial nas células eucarióticas que exibem os ligantes que exigem a recuperação dos genes de ligante sem o crescimento adicional das células selecionadas.

[0166] Após detecção de reconhecimento do alvo por um ligante cognato, as células de um DNA que codifica o clone contendo o ligante cognato pode ser recuperado. O DNA que codifica o ligante pode então ser isolado (por exemplo, identificados ou amplificado) a partir do clone recuperado, obtendo-se assim o DNA que codifica um ligante que reconhece o alvo.

[0167] Ligantes e alvos exemplares são detalhados neste documento. Um exemplo clássico é uma biblioteca de moléculas de anticorpo, que podem ser rastreados para a ligação a um antígeno alvo de interesse. Outros exemplos incluem a triagem de uma biblioteca de TCRs contra MHC:complexo de peptíde alvo ou a triagem de uma biblioteca de MHC:complexos de peptídeo contra TCR alvo.

TCR:MHC e outras interacções de receptores

[0168] Os receptores de células T (TCR) são expressos nas células T e evoluíram para reconhecer peptídeo apresentado em complexo com moléculas MHC nas células apresentadoras de antígeno. Os TCR são heterodímeros consistindo em 95% dos casos de heterodimeros alfa e beta e em 5% dos casos de heterodímeros gama e delta. Ambas as unidades monoméricas têm um domínio de imunoglobulina de N- terminal que tem 3 regiões determinantes de complementaridade de variáveis (CDRs) envolvidas na condução interação com o alvo. TCR funcional está presente dentro de um complexo de outras sub-unidades e a sinalização é aumentada através de co-estimulação com moléculas CD4 e CD8 (específicas para moléculas de MHC de classe I e II respectivamente). Em células apresentadoras de antígeno, as proteínas são processadas e apresentadas na superfície celular em complexo com moléculas de MHC que são os próprios parte de um complexo proteico multimérico. Os peptídeos que reconhecem TCRs provenientes dos "próprios são removidos durante o desenvolvimento e o sistema está pronto para o reconhecimento de peptídeos exógenos apresentados em células apresentadoras de antígeno para efetuar uma resposta imune. O resultado do reconhecimento de um peptídeo:complexo de MHC depende da identidade da célula T e a afinidade que a interação.

[0169] Seria valiosa identificar os genes que codificam os TCRs ou complexos MHC:peptídeo que conduzem interações envolvidas em condições patológicas, por exemplo, como ocorre na doença auto-imune. No caso de doença auto- imune, a identificação de parceiros que interagem, por exemplo, um TCR que impulsiona uma condição patogênica poderia abrir o caminho para ou especificamente bloquear tais interações ou remover células citotóxicas de ofença. Seria desejável projetar TCRs para ligação alteradas, por exemplo, maior afinidade para alvos de interesse, por exemplo, nas células T de re-alvejamento no câncer ou acentuando o efeito de células T existentes [95]. Alternativamente, o comportamento de células T reguladoras ou supressoras pode ser alterado como uma modalidade terapêutica, por exemplo, para direcionar ou melhorar imunoterapia de câncer mediante a introdução de TCRs específicas em células T ou através da utilização de proteína de TCR expressos como entidades terapêuticas [96].

[0170] A exibição de bibliotecas de TCRs na superfície das células de levedura e células de mamíferos foram anteriormente demonstradas. No caso das células de levedura foi necessário manipular o TCR e apresentá-lo de um único formato de cadeia. Uma vez que a afinidade da interação entre o TCR e o peptídeo:complexo de MHC é baixo, o componente solúvel (por exemplo, peptídeo:MHC neste caso) é normalmente apresentado num formato multimérico. TCR especificidade foi projetado para peptídeos em complexo com classe I MHC [97] e classe II MHC [98]. TCR também têm sido expressos na superfície de células T de camundongo mutante (carecendo cadeias alfa e beta de TCR) e TCRs variantes com propriedades melhoradas de ligação foram isoladas [99]. Por exemplo, Chervin et al. TCRs introduzidos por infeção retroviral e um tamanho de biblioteca efetivo de 104 clones foram gerados [100]. Usando a integração direcionada de nuclease dos ligantes como proposto aqui, uma abordagem semelhante poderia ser levada para projetar asa células T. Assim como selecionar TCRs com propriedades de reconhecimento alterados, exibição bibliotecas podiam ser utilizadas para rastrear bibliotecas de peptídeos ou variantes de MHC para o reconhecimento por TCRs. Por exemplo, peptídeos:complexos de MHC foram exibidos em células de insetos e usados para TCRs de mapa de epitopo apresentados num formato multimérico [101].

[0171] Como referido, os métodos de triagem podem envolver exibir o repertório de ligantes na superfície de célula e sondagem com um alvo apresentado como uma molécula solúvel, que pode ser um alvo multimérico. Uma alternativa, que pode ser especialmente útil com alvos multiméricos, é para triagem diretamente para interações célula:célula, onde o ligante alvo e são apresentados na superfície de células diferentes. Por exemplo, se a ativação de um TCR de interesse conduziu a expressão de um gene repórter isto pode ser usado para identificar peptídeos ativadores ou ativação das moléculas de MHC apresentadas dentro de um peptídeos:biblioteca de MHC. Nesse exemplo particular, a célula repórter não codifica o membro da biblioteca, mas poderia ser utilizado para identificar a célula que não codifique. A abordagem poderia estender-se a uma abordagem de "biblioteca versus biblioteca". Por exemplo estendendo-se o exemplo descrito acima, uma biblioteca de TCR pode ser rastreada contra um peptídeo:biblioteca de MHC. Mais amplamente o exemplo de rastreio de uma biblioteca de ligantes apresentados em uma superfície celular utilizando um padrão de ligação na outra célula pode ser estendida a outros tipos de interações de células cel, por exemplo, a identificação de ligantes que inibem ou ativam a sinalização dentro de vias de Notch ou Wnt. Assim, a presente invenção poderia ser utilizada no sistema de célula alternativa com base em triagem incluindo sistemas de reconhecimento baseados em interações cellxell.

[0172] Como um exemplo, receptores de antígenos quiméricos ("CARS") representar uma fusão entre um domínio de ligação do anticorpo (geralmente formatado como um scFv) e um domínio de sinalização. Estes foram introduzidos em células T com a finalidade de re-orientar a células T in vivo para atacar as células tumorais através de reconhecimento do anticorpo e a ligação a antígenos específicos de tumores. Um número de diferentes fatores podem afetar o sucesso dessa estratégia, incluindo a combinação da especificidade do anticorpo, formato, afinidade de anticorpo, comprimento de ligante, módulo de sinalização fundido, nível de expressão em células T, sub-tipo de célula T e interação de CAR com outras moléculas de sinalização [102, 103]. A capacidade de criar grandes bibliotecas de CARs em células T primárias incorporando combinações ou individuais das variáveis acima permitiram uma busca funcional para a construção de CAR eficaz e ideal. Essa "busca" funcional pode ser realizada in vitro ou in vivo. Por exemplo, Alonso-Camino (2009) fundiram um scFv reconhecendo CEA para a cadeia Z de TCR:complexo de CD3 e introduziu essa construção genética numa linha de células de Jurkat humana [104]. Após a interação com CEA presente na utilização de células HeLa ou células tumorais que mostraram regulação positiva do marcador inicial de ativação de células T de CD69. Essa abordagem poderia ser utilizada para identificar construções de fusão de CAR com ativação apropriada ou propriedades inibidoras usando células cultivadas ou primárias.

[0173] Indo uma etapa adiante funcionalidade de construções de CAR pode ser avaliada in vivo. Por exemplo, uma biblioteca de CARs construídos em células T de camundongo primário poderia ser introduzido no tumor de camundongos portadores para identificar os clones de células T estimuladas a proliferar por meio do encontro com o tumor. Se necessário, essa biblioteca de células T pode ser pré- selecionada com base na especificidade de ligação ao antígeno utilizando os métodos descritos acima. Em ambos os casos a biblioteca de ligantes de entrada poderia ser usado para substituir uma molécula ligante existente (por exemplo, MHC ou TCR ou domínio variável de anticorpo).

Triagens de fenótipo

[0174] Descrito aqui estão vários métodos para seleção de ligantes que modificam sinalização celular e comportamento celular.

[0175] Uma biblioteca pode ser pesquisada para fenótipo celular alterado como resultado da ação do ligante sobre o seu alvo.

[0176] Anticorpos que modificam sinalização celular através da ligação a ligantes ou receptores têm um histórico comprovado no desenvolvimento de droga e a demanda por tais anticorpos terapêuticos continua a crescer. Tais anticorpos e outras classes de ligantes funcionais também têm potencial para controlar o comportamento de células in vivo e in vitro. A capacidade de controlar e direcionar o comportamento celular no entanto baseia-se na disponibilidade de ligantes naturais que controlam as vias de sinalização específicas. Infelizmente, muitos ligantes naturais, tais como aqueles que controlam a diferenciação de células estaminais (por exemplo, membros de FGF, TGF-beta, super- famílias Wnt e Notch) exibem frequentemente interações promíscuas e têm disponibilidade limitada devido aos seus perfis de expressão/fraca estabilidade. Com sua especificidade singular, os anticorpos têm grande potencial no controle do comportamento celular.

[0177] A identificação de anticorpos funcionais que alteram a sinalização celular tem sido, historicamente, relativamente trabalhosa, envolvendo escolher clones que expressam anticorpo, caracterizando de acordo com a sequência e propriedades de ligação, a conversão para sistemas de expressão de mamíferos e adicional a ensaios baseados em células funcionais. A abordagem de exibição eucariótica aqui descrita irá reduzir esse esforço, mas ainda existe uma exigência para a produção de anticorpo e a adição de uma cultura de células repórter separada. Portanto, uma alternativa preferida pode ser para diretamente pesquisar bibliotecas de ligantes expressas em células eucarióticas para o efeito de se ligar na sinalização celular ou comportamento das células usando a própria célula de produção de uma célula repórter. Após a introdução de genes de anticorpos, os clones na população resultante de células que mostram a alteração na expressão do gene repórter ou fenótipos alterados podem ser identificados.

[0178] Um número de publicações recentes têm descrito a construção de bibliotecas de anticorpos por clonagem de repertórios de genes de anticorpo em células repórter de [47, 105, 106]. Esses sistemas combinam expressão e pela comunicação de uma célula e tipicamente introduzem uma população de anticorpos selecionados contra um alvo pré- definido (por exemplo, utilizando exibição em fagos).

[0179] Uma população de genes de anticorpo pode ser introduzida em células repórter para produzir uma biblioteca por meio de métodos aqui descritos e os clones na população com uma alteração direcionada por anticorpo no fenótipo (por exemplo, a expressão de genes alterados ou sobrevivência) pode-se identificar. Para esta seleção direcionada fenotípica para o trabalho há um requisito para manter uma ligação entre o gene do anticorpo presente no interior da célula que expressa (genótipo) e a consequência de expressão de anticorpo (fenótipo). Isso foi conseguido anteriormente por meio de qualquer ancoragem o anticorpo à superfície da célula [47] tal como descrito para a exibição de anticorpos ou através da utilização de meio semi-sólido para reter anticorpos secretados na vizinhança das células que produzem [105]. Alternativamente, anticorpos e outros agentes ligantes podem ser retidos dentro da célula [107]. Ligantes retidos na superfície da célula ou no meio circundante podem interagir com um receptor endógeno ou exógeno na superfície da célula, causando a ativação do receptor. Isso por sua vez pode causar uma mudança na expressão de um gene repórter ou de uma alteração no fenótipo da célula. Em alternativa, o anticorpo pode bloquear o receptor ou ligante para reduzir a ativação do receptor. O gene que codifica o ligante que faz com que o comportamento celular modificado possa então ser recuperado para a produção ou projeção adicional.

[0180] Uma alternativa a essa abordagem "direcionada a alvo", é possível introduzir uma população de anticorpo "na'ive" que não foi pré-selecionada para um alvo particular [108]. O sistema de comunicação celular é usado para identificar os membros da população com comportamento alterado. Uma vez que não há nenhum conhecimento prévio do alvo, esta abordagem não-alvo tem um requisito particular para um grande repertório de anticorpos, uma vez que o pré- enriquecimento da população de anticorpos para o alvo não é possível. Essa abordagem irá beneficiar do uso de integração do transgene direcionada a nuclease, tal como descrito na presente invenção.

[0181] A abordagem de "seleção funcional" pode ser usada em outras aplicações que envolvem bibliotecas em células eucariotas, particularmente eucariotas superiores tais como células de mamíferos. O anticorpo pode ser fundida com um domínio de sinalização, tal que a ligação ao alvo provoca a ativação do receptor. Kawahara ei al, foram construídos os receptores quiméricos em que uma fluoresceína de alvejamento extra-celular de scFv foi fundido com um domínio espaçador (o domínio D2 do receptor de Epo) e vários domínios de receptor de citoquina intracelular incluindo receptor de thrombopoeitin (Tpo), receptor de eritropoietina (Epo), gp130, receptor de IL-2 e receptor de EGF [109, 110, 111]. Esses foram introduzidos numa linha de células proB dependente de IL-3 (BaF3) [27], em que os receptores quiméricos foram mostrados para expor a ativação dependente de antígeno do receptor quimérico levando ao crescimento independente de IL-3. Esta mesma abordagem foi usada em experiências modelo para demonstrar antígeno de quimiotaxia mediada por células BaF3 [110]. A abordagem foi prolongada para além de células de cultura estáveis para as células primárias exemplificadas pela sobrevivência e crescimento das células tronco hematopoiética responsivas a Tpo [112] ou células T primárias dependentes de IL2 em que a estimulação normal por Tpo e IL-2, respectivamente, foi substituído por estimulação direcionada a fluoresceina de receptores quiméricos scFv. Assim, um sistema baseado em quimeras de receptor de anticorpo quiméricas pode ser utilizado para direcionar a expressão do gene alvo dependente ou alterações fenotípicas em células repórter primárias ou estáveis. Esta capacidade poderia ser utilizada para identificar ligantes fundidos que impulsionam uma resposta de sinalização ou ligantes que inibem a resposta.

[0182] Numa modificação da abordagem acima domínios VH e VL separadas a partir de um anticorpo anti- lisozima foram fundidos com o domínio intracelular de Epo [113]. As células cresceram em resposta à adição de lisozima, indicando uma dimerização induzida por antígenos ou estabilização dos parceiros de fusão separadas VH e VL. Assim três componentes que interagem se reúnem para uma resposta óptima neste sistema.

[0183] Embora descrito aqui com referência a moléculas de anticorpo, os métodos acima também podem ser adaptadas e realizada com bibliotecas de outros ligantes.

[0184] A complementação de fragmento de proteína representa um sistema alternativo para o estudo e para a seleção de interações de proteína:proteína em células de mamíferos [114, 115]. Trata-se de restaurar a função de proteínas repórter de divisão através de interações proteína:proteína. As proteínas repórter que foram utilizadas incluem ubiquitina, DNAE intein, beta-galactosidase, di- hidrofolato redutase, GFP, luciferase de pirilampo, a beta-lactamase, protease de TEV. Por exemplo, um exemplo recente desta abordagem é a de híbrido 2 membranas de mamíferos (MaMTH) onde a associação de uma proteína isco: dividir a ubiquitina: fusão factor de transcrição com uma proteína parceira: ubiquitina dividida restaura reconhecimento ubiquitina e libera o fator de transcrição para efetuar gene repórter expressão [116]. Novamente ligantes que interferem com ou melhorar essa interação poderia ser identificados através de sinalização perturbado.

[0185] Recuperação e reformatação de ligantes e de DNA que codifica

[0186] A seguir à seleção de um aglutinante ou de clone de interesse a partir da biblioteca, uma etapa seguinte será comum para isolar (por exemplo, identificar ou amplificar) o DNA que codifica o ligante. Opcionalmente, pode ser desejável modificar o ácido nucleico que codifica o ligante, por exemplo, para reestruturar o ligante e/ou para inserir a sequência de codificação num vector diferente.

[0187] Quando o ligante é uma molécula de anticorpo, um método pode compreender o isolamento de DNA que codifica para a molécula de anticorpo a partir de células de um clone, amplificar o DNA que codifica pelo menos uma região variável de anticorpo, de um modo preferido ambos o domínio VH e VL, e o DNA da inserção num vetor para fornecer um vetor que codifica para a molécula de anticorpo. Uma molécula de anticorpo multimérico tendo um domínio constante pode ser convertida a uma única molécula de anticorpo de cadeia para expressão em uma forma secretada solúvel.

[0188] Os anticorpos podem ser apresentados em diferentes formatos, mas qualquer formato que um anticorpo é selecionado em, uma vez que o gene do anticorpo é isolado, é possível reconfigurar em um número de diferentes formatos. Uma vez que os domínios VH ou VL são isolados, podem ser re- clonados na expressão de vectores que abrangem os domínios de padrões requeridos (ver Exemplo 1, que mostra uma cassete de expressão de IgG promotor duplo).

[0189] Uma etapa de reformatação pode compreender reformatação de ligantes composto por um par de subunidades (por exemplo, moléculas de scFv), para um formato de ligante molecular diferente (por exemplo, Fab ou Ig) em que o emparelhamento original das subunidades é mantida. Tais métodos são descritos em mais detalhe aqui noutro local e pode ser utilizado para anticorpos monoclonais, reformatação de clone oligoclonais ou policlonal. O método pode ser utilizado para converter "em massa" uma população inteira de saída a partir de qualquer uma das tecnologias de exibição usuais, incluindo apresentação de fago, levedura ou ribossoma.

[0190] A exibição de scFv na superfície de células de mamíferos fundidos com domínios de Fc.

[0191] Embora muitas bibliotecas de exibição em fagos de anticorpos sejam formatadas para exibir scFvs, sistemas de exibição eucarióticos permitirão a apresentação em formato Fab ou IgG. Para aproveitar ao máximo o potencial para a expressão de IgG/Fab, especialmente quando se utiliza scFvs de outros sistemas de visualização, será necessário pegar domínios VH e VL ligados selecionados dentro de um sistema de expressão bacteriana e expressá-los dentro de um sistema eucariota fundido para apropriar domínios constantes. Aqui descrito é um método para converter as populações de scFv para a imunoglobulina (Ig) ou um fragmento, formato de ligação ao antígeno (Fab), de tal maneira que pares originais de cadeia VH e VL são mantidos. Na presente invenção, conversão é possível utilizando misturas de clones individuais, misturas oligoclonais ou populações inteiras formatadas como scFv, mantendo o emparelhamento original da cadeia VH e VLs. O método prossegue através da geração de um "mini-círculo" de DNA não-replicativo intermediário que traz em um novo fragmento de DNA "stuffer". O DNA circular é linearizado (por exemplo, por digestão de restrição ou PCR) que altera a posição relativa dos fragmentos originais VH e VL e coloca o DNA "stuffer" entre eles. Após linearização, o produto pode ser clonado num vetor de escolha, por exemplo, um vetor de expressão de mamífero. Desta forma, todos os elementos para além de VH e VL podem ser substituídos. Elementos para expressão bacteriana podem ser substituídos com elementos de expressão de mamífero e de fusão de parceiros alternativos. O processo de conversão completa requer apenas uma única etapa de transformação de bactérias E. coli para gerar uma população de colônias bacterianas de cada portador de um plasmídeo que codifica um anticorpo recombinante formatado único Ig ou Fab. Se estendendo para além da conversão de scFv de IgG/Fab, o método pode ser utilizado para formatar quaisquer dois elementos de DNA unidos para clonar num vetor de tal modo que após a re- formatação de cada elemento de DNA encontra-se rodeado por diferentes características de controle de DNA, mantendo o emparelhamento inicial. Um método anterior tem sido descrito, em que 2 etapas de clonagem sequenciais são utilizadas [117] para substituir esses elementos em contraste com o presente processo que procede através de um intermediário circular não replicativo intermediário.

[0192] Um método de reconfiguração de um ligante, ou uma população de ligantes, pode compreender a conversão de scFv de Ig ou um fragmento do mesmo, por exemplo, Fab. O método pode compreender a conversão de ácido nucleico que codifica scFv para DNA que codifica uma imunoglobulina (Ig) ou um fragmento do mesmo, tais como formato Fab, de tal modo que os pares de cadeia VH e VL originais são mantidos. De preferência, as receitas da conversão via DNA circular intermediário que pode ser um "mini-círculo" de DNA não replicativo. O método requer uma única transformação de E. coli para a produção direta de transformantes bacterianos que albergam plasmídeos que codificam DNA de Fab ou Ig.

[0193] O método pode ser utilizado para reformatação de clones monoclonais, oligoclonais ou policlonais. O método pode ser utilizado para converter "em massa" uma população inteira de saída a partir de qualquer uma das tecnologias de exibição usuais, incluindo apresentação de fago, levedura ou ribossoma.

[0194] Em termos mais gerais, este aspecto da invenção refere-se a um método que permite a reformatação de quaisquer dois elementos de DNA unidos a um vetor, caracterizado pelo fato de que os elementos de DNA são clonados sob controle de promotores separados ou são separados por elementos de controle alternativo, mas mantendo o emparelhamento de DNA original.

[0195] Exemplos 7 e 14 descrevem tais métodos em mais detalhes.

[0196] Isolamento e reestruturação opcional, de ligantes de codificação de DNA pode ser seguido pela introdução do referido DNA em outras células para criar uma biblioteca derivada como aqui descrito noutro local, ou DNA que codifica um ou mais ligantes particulares de interesse podem ser introduzidos numa célula hospedeira para a expressão. A célula hospedeira pode ser de um tipo diferente, em comparação com as células da biblioteca a partir da qual ela foi obtida. Geralmente, o DNA será fornecida num vetor. DNA introduzido na célula hospedeira pode integrar no DNA celular da célula hospedeira. As células hospedeiras que expressam a molécula de anticorpo solúvel segregado pode, então, ser selecionadas.

[0197] As células hospedeiras que codificam um ou mais ligantes podem ser fornecidas num meio de cultura e cultivadas para expressar um ou mais ligantes.

[0198] Bibliotecas de derivativos

[0199] Após a produção de uma biblioteca através do método da invenção, um ou mais clones de biblioteca podem ser selecionados e utilizados para produzir uma nova, biblioteca de segunda geração. Quando uma biblioteca tiver sido gerada através da introdução de DNA em células eucarióticas, tal como aqui descrito, a biblioteca pode ser cultivada para expressar os agentes de ligação, e um ou mais clones que expressam ligantes de interesse podem ser recuperados, por exemplo, por seleção de ligantes contra um alvo, tal como descrito aqui em em outro lugar. Estes clones podem ser subsequentemente utilizados para gerar uma biblioteca de derivativos contendo DNA que codifica um segunda repertório de ligantes.

[0200] Para gerar a biblioteca de derivativos, DNA doador de um ou mais clones recuperados é mutado para fornecer o segundo repertório de ligantes. As mutações podem ser adição, substituição ou deleção de um ou mais nucleotídeos. Quando o ligante é um polipeptídeo, a mutação será para alterar a sequência do ligante codificado por adição, substituição ou deleção de um ou mais aminoácidos. A mutação pode ser focalizada sobre uma ou mais regiões, tais como uma ou mais CDRs de uma molécula de anticorpo, fornecendo um repertório de ligantes de uma classe estrutural comum que diferem em uma ou mais regiões de diversidade, como aqui descrito noutro local.

[0201] Geração da biblioteca derivativa pode compreender o isolamento do DNA do doador de um ou mais clones recuperados, introdução de mutação no DNA para fornecer uma população derivativa de moléculas do DNA do doador que codifica um segundo repertório de ligantes e introdução da população derivativa de moléculas de DNA do doador em células para criar uma biblioteca derivativa de células que contêm DNA que codifica o segundo repertório de ligantes.

[0202] O isolamento do DNA doador pode envolver a obtenção e/ou a identificação do DNA do clone. Tais métodos podem incluir a amplificação de DNA que codifica um ligante de um clone recuperado, por exemplo, por PCR e a introdução de mutações. DNA pode ser sequenciado e DNA mutado sintetizado.

[0203] A mutação pode, alternativamente, ser introduzida no DNA doador, em que um ou mais clones recuperados através da indução de mutação do DNA dentro de clones. A biblioteca de derivativos pode assim ser criada a partir de um ou mais clones sem a necessidade de isolamento do DNA, por exemplo, através de mutação endógena em células aviárias DT40.

[0204] Exibição de anticorpos presta especialmente bem para a criação de bibliotecas de derivativos. Uma vez que os genes de anticorpos são isolados, é possível utilizar uma variedade de abordagens de mutagênese (por exemplo, PCR propensa a erros, mutagênese dirigida por oligonucleotídeos, rearranjo de cadeias) para criar bibliotecas de exibição de clones relacionados a partir da qual variantes melhoradas podem ser selecionadas. Por exemplo, com o DNA que codifica para a população do clone VH selecionado, mistura ou população oligoclonal pode ser sub- clonada num vetor que codifica para um formato de anticorpo adequado e que codifica um repertório adequadamente formatado de cadeias VL [118]. Alternativamente, e de novo utilizando o exemplo de VHs, o clone VH, oligomix ou população poderia ser introduzido numa população de células eucarióticas que codificam e expressam uma população de parceiros de cadeia leve formatados apropriadamente (por exemplo, uma cadeia de VL-CL para a associação com uma IgG ou Fab formatado de cadeia pesada). A população de VH pode surgir a partir de qualquer uma das fontes acima referidas, incluindo as células B de animais imunizados ou genes de scFv a partir de populações de fagos selecionados. No último exemplo, a clonagem de VHs selecionados em um repertório de cadeias leves poderiam combinar rearranjo de cadeias e re-formatação (por exemplo, em formato IgG), em uma etapa.

[0205] Uma vantagem particular de exibição em células eucarióticas é a capacidade de controlar a rigidez da etapa de seleção/triagem. Ao reduzir a concentração de antígeno, as células que expressam os maiores ligantes de afinidade podem ser distinguidas a partir de clones de afinidade mais baixos dentro da população. A visualização e quantificação do processo de maturação de afinidade utilizando citometria de fluxo é um dos principais benefícios da exibição eucariótica, pois dá uma indicação precoce de casos positivos percentuais em biblioteca na na'fve e permite uma comparação direta entre a afinidade dos clones selecionados e a população parental durante a classificação. Após separação, a afinidade dos clones individuais pode ser determinado pela pré-incubação com uma gama de concentrações de antígeno e análise de citometria de fluxo ou com um ensaio homogêneo de Fluorescência de Tempo Resolvido (TRF) ou utilizando ressonância de plasma de superfície (SPR) (Biacore).

[0206] Características e forma da biblioteca

[0207] A presente invenção permite a construção de bibliotecas de células eucarióticas que possuem muitas características vantajosas. A invenção fornece bibliotecas com qualquer uma ou mais das características seguintes:

[0208] Diversidade. Uma biblioteca pode codificar e/ou expressar, pelo menos, 100, 103, 104, 105 106, 107, 108 ou 109 diferentes ligantes.

[0209] Integração uniforme. Uma biblioteca pode consistir em clones contendo DNA doador integrado num local fixo, ou a um número limitado de loci fixos no DNA celular. Cada clone na biblioteca contém, por conseguinte, DNA dador no locus fixo ou, pelo menos, um dos loci fixos. De preferência, os clones contêm DNA doador integrado em um ou dois loci fixos no DNA celular. Tal como explicado aqui noutros local, o sítio de integração é o de uma sequência de reconhecimento para uma nuclease específica de sítio. Integração de DNA doador para a produção de DNA recombinante é descrita em pormenor aqui noutro local e pode gerar resultados diferentes, dependendo do número de sítios de integração. Quando existe um único local de integração potencial nas células utilizadas para gerar a biblioteca, a biblioteca será uma biblioteca de clones contendo DNA doador integrado no locus único fixo. Todos os clones da biblioteca, por conseguinte, contem os genes ligantes, na mesma posição no DNA celular. Alternativamente, onde existem vários sítios de integração potenciais, a biblioteca pode ser uma biblioteca de clones contendo DNA doador integrado em múltiplos e/ou diferentes loci fixos. De preferência, cada um dos clones de uma biblioteca contem DNA doador integrado num primeiro e/ou um segundo locus fixo. Por exemplo, uma biblioteca pode compreender os clones em que o DNA doador está integrado num primeiro locus fixo, clones em que DNA doador está integrado em um segundo locus fixo, e clones em que o DNA doadora está integrado em ambos o primeiro e o segundo loci fixo. Em modalidades preferidas, há apenas um ou dois loci fixos nos clones de uma biblioteca, embora seja possível a integração de DNA doador em loci múltiplos, se desejado para aplicações particulares. Portanto, em algumas bibliotecas cada clone pode conter DNA doador integrado em qualquer um ou mais de vários loci fixos, por exemplo, três, quatro, cinco ou seis loci fixo.

[0210] Para as bibliotecas que contêm subunidades de ligante integrados em sítios separados, os clones da biblioteca podem conter DNA que codifica para uma primeira subunidade de ligante integrada num primeiro locus fixo e o DNA que codifica uma segunda subunidade de ligante integrada em um segundo locus fixo, em que os clones expressam ligantes multiméricos que compreendem as primeira e segunda subunidades.

[0211] Transcrição uniforme. Níveis relativos de transcrição dos ligantes entre diferentes clones da biblioteca são mantidos dentro de limites controlados devido a DNA doador estando integrado em um número controlado de loci, e no mesmo locus nos diferentes clones (locus fixo). Transcrição de genes relativamente uniforme de ligante conduz a níveis comparáveis de expressão de ligantes em ou a partir de clones de uma biblioteca. Ligantes exibidos na superfície das células da biblioteca podem ser idênticos a (tendo a mesma sequência de aminoácidos como) outros ligantes indicados na mesma célula. A biblioteca pode consistir em clones de células que exibem cada um único membro do repertório de ligantes, ou de clones que exibem uma pluralidade de membros do repertório de ligantes por célula. Alternativamente, uma biblioteca pode compreender alguns clones que exibem um único membro do repertório de agentes aglutinantes, e alguns clones que exibem uma pluralidade de membros (por exemplo, dois) do repertório de ligantes. De preferência, os clones de uma biblioteca expressam um ou dois membros do repertório de ligantes.

[0212] Por exemplo, uma biblioteca de clones de células eucariotas, de acordo com a presente invenção pode expressar um repertório de pelo menos 103, 104, 105 106, 107, 108 or 109 diferentes ligantes, por exemplo, fragmentos de anticorpos IgG, Fab, scFv ou scFv-Fc, cada célula contém DNA doador integrado num locus fixo no DNA celular. O DNA doador codifica o ligante e pode ainda compreender um elemento genético para seleção de células nas quais o DNA dador está integrado no locus fixo. As células da biblioteca podem conter DNA que codifica para uma nuclease específica de sítio exógena.

[0213] Estas e outras características de bibliotecas de acordo com a presente invenção são ainda descritas aqui noutro local.

[0214] A presente invenção estende-se à biblioteca, quer na forma pura, como uma população de clones da biblioteca, na ausência de outras células eucarióticas, ou misturada com outras células eucarióticas. Outras células podem ser células eucarióticas do mesmo tipo (por exemplo, a mesma linha celular) ou células diferentes. Outras vantagens podem ser obtidas através da combinação de duas ou mais bibliotecas de acordo com a presente invenção, ou a combinação de uma biblioteca de acordo com a invenção com uma segunda biblioteca ou segunda população de células, quer para facilitar ou alargar a triagem ou para outras utilizações como são aqui descritas ou que serão evidentes para o versado na técnica.

[0215] Uma biblioteca de acordo com a invenção, um ou mais clones obtidos a partir da biblioteca, ou as células hospedeiras nas quais o DNA que codifica um ligante a partir da biblioteca foi introduzido, pode ser fornecido num meio de cultura de células. As células podem ser cultivadas e, em seguida, concentradas para formar um sedimento celular durante o transporte ou armazenamento conveniente.

[0216] Bibliotecas normalmente serão fornecidas in vitro. A biblioteca pode estar em um recipiente tal como um frasco de cultura de células contendo células da biblioteca suspensa em um meio de cultura, ou um recipiente que compreende um grânulo ou suspensão concentrada de células eucarióticas compreendendo a biblioteca. A biblioteca pode constituir, pelo menos, 75%, 80%, 85% ou 90% das células eucarióticas no recipiente.

[0217] Breve Descrição das Figuras

[0218] Modalidades da invenção serão agora descritas em mais pormenor, com referência aos desenhos anexos, que são os seguintes:

[0219] Figura 1. Vetor para a expressão de anticorpos IgG formatados

[0220] a. pDUAL D1.3, um vetor de expressão de promotor duplo para a secreção de IgG (em vetor de estrutura principal de "pCMV/myc/ER")

[0221] b. plNT3-D1.3, um vetor de expressão do promotor duplo para a secreção de IgG (em vetor de estrutura principal de "pSF-CMV-f1-Pac1")

[0222] c. vetor de estrutura principal c. pCMV/myc/ER. sítio EcoR1 precede o promotor CMV. BstB1 e

[0223] sítios BstZ171 flanqueiam os sítios SV40 poli A.

[0224] d. vetor de estrutura principal de d. pSF-CMV-f1-Pac1 vector backbone (Oxford Genetics)

[0225] e. gene sintético com a região do exon que codifica o PDGFR transmembranar (TM) e exon

[0226] causando a secreção (seg). setas sólidas representam sítios de recombinação Rox.

[0227] Figura 2. Sequência de pD1 (SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 & 5): uma cassete de expressão de anticorpo duplo promotor para expressão de superfície.

[0228] Características:

[0229] promotor pEF 13-1180

[0230] BM40 principal 1193-1249

[0231] D1.3 VL humanizado 1250-1578

[0232] Kapa C humano 1577-1891 BGH poli A 1916 2130

[0233] Promotor CMV 2146-2734

[0234] Camundongo VH principal com intron 32832 3414

[0235] D1.3 VH humanizado 3419-3769

[0236] IgG2 humana otimizada CH1-CH3

[0237] Figura 3. Construção de plasmídeo doador AAVS (pD2)

[0238] a. Representação do locus AAVS humano. Exon 1 e exon 2 do locus AAVS (que codifica a proteína fosfatase 1, subunidade regulatória 12C, PPP1 R12C) são separadas por um intron de 4428 bp. Splicing está no quadro "0", ou seja splicing ocorre entre 2 codons intactos de cada exon. Construtos TALENs e CRISPR/Cas9 estão disponíveis para clivar dentro deste intron. Blocos a tracejado representam as regiões à esquerda e à direita deste local de clivagem que são utilizados dentro de construtos de vetor para dirigir recombinação homóloga para esse locus (homologia de AAVS de ramo esquerdo "HA esquerda" e homologia AAVS de ramo direito ("HA direita") .

[0239] b. Representação do plasmídeo doador que codifica o anticorpo de pD2. Ramos de homologia esquerdo e direito são mostrados nas extremidades da representação de construto. Um gene sintético Blasticidina é precedido por um aceitador de splicing, que cria uma fusão "enquadrada" com exon AAVS 1. Também é mostrada a cassete de expressão de anticorpo constituída por uma cadeia leve D1.3 e uma cadeia pesada D1.3 IgG2 impulsionada por promotores pEF e CMV, respectivamente.

[0240] c. Sequência de construto doador pD1- huD1.3 (SEQ ID NO: 6, 7 & 8). Ramos de homologia AAVS são mostrados sublinhados e em negrito. Por brevidade cassete do anticorpo (anteriormente mostrado na Figura 2) não é mostrado em detalhe. Os locais de restrição utilizados no clone são mostrados em negrito. A sequência de estrutura principal de plasmídeo é mostrada acima para o gene de resistência à ampicilina.

[0241] Figura 4. Expressão de IgG na superfície da célula

[0242] a, c. Análise foi focada em células viáveis utilizando dispersão frontal e coloração no canal FL3 (a, c). Células positivas para a coloração no canal FL3 (representando as células não viáveis, que teve um aumento de 7-AAD) foram excluídas. Todas as células foram transfectadas com pD2-D1.3 na ausência (a, b) ou na presença (c.d) do AAVS TALENs e foram coradas com anticorpo anti-Fc.

[0243] Figura 5. Ligação do antígeno sobre a superfície celular. As células viáveis foram selecionadas com base de Dispersão Frontal e oclusão de 7AAD (a). As células foram incubadas com lisozima marcado por fluorescência de ovo de galinha (b).

[0244] Figura 6. Efeito de clivagem genômico TALEN-dirigido sobre a integração de gene de resistência à blasticidina. Figura mostra o número de colônias nas condições descritas.

[0245] Figura 7. Análise da integração do plasmídeo pD2-D1.3 doador para locus AAVS.

[0246] Seguindo a transfecção as células foram selecionadas em Blasticidina e o DNA genômico foi preparado.

[0247] As amostras 1-9 beneficiaram de adição de nucleases TALE AAVS-dirigidas, as amostras 10-11 eram provenientes de clones que derivam de células transfectadas na ausência de nuclease TALE. Análise do DNA genômico levada a cabo por PCR tal como descrito no texto. a. Verificação da extremidade 5' do sítio de integração. B. Verificação da extremidade 3' do sítio de integração.

[0248] Figura 8. Construção dos vetores de expressão scFv-Fc pD6

[0249] a. Anticorpos formatados como scFv são clonados nos sítios Nco1/Not1 para criar uma fusão "enquadrada" com a região Fc humana de IgG2.

[0250] b. Sequência de PD6 do sítios Nco1 a Pme1 (SEQ ID NO: 9, 10 & 11).

[0251] Figura 9. Seleção de ligantes da biblioteca de superfície celular scFv-Fc (a partir de populações de fagos selecionados). A análise de citometria de fluxo é mostrada de células com;

[0252] a-c. população integrada anti-CD229 SFV- Fc a partir de 2 ciclos de seleção de apresentação de fagos sobre CD229

[0253] d. f população integrada anti-β- galactosidase sFv-Fc a partir de 1 ciclo de seleção de apresentação de fagos em β-galactosidase (células β-galR1)

[0254] e. população integrada anti-β- galactosidase SFV-Fc a partir de 2 ciclos de seleção de apresentação de fagos em β-galactosidase

[0255] Amostra (a) mostra células não coradas e as outras foram coradas com anti-Fc-ficoeritrina humana (em FL2) e 100nM FITC antígeno/estreptavidina biotinilada apropriadamente (em FL1). As células foram analisadas após 13 dias (a, b, d, e). Exemplos c e células f mostram coradas após 20 dias e a região marcada mostra células coletadas por citometria de fluxo

[0256] h. β-galR1 células selecionadas por citometria de fluxo (Figura 6 f) foram cultivadas durante 22 dias e re-analisadas quanto à expressão de scFv-Fc e ligação ao antígeno (antígeno utilizando 100 nM), g. mostra o equivalente não corado.

[0257] j. mostra células não triadas β-galR1 a partir da população original (como em d) que tinham sido cultivadas durante 42 dias após a transfecção (j). As células não marcadas de cada população são apresentadas para comparação (g, i)

[0258] Figura 10. Exibição de mamíferos e de triagem de biblioteca de IgG formatada.

[0259] Uma população de anticorpos foi selecionada em β-galactosidase utilizando 1 ou 2 ciclos de apresentação em fagos, reformatados como IgG e orientadas por meio de integração dirigida de nuclease no locus AAVS de células HEK293. Os painéis a, b mostram células derivadas a partir da população de fagos ciclo 1, quer a, não triados (após 38 dias de crescimento) ou b, triados por citometria de fluxo e cultivadas durante 19 dias. Os painéis c, células d mostram derivados de população de fagos ciclo 2, quer c, não triados (após crescimento de 38 dias ou d, triados e cultivados durante 19 dias.

[0260] Figura 11. Construção de grande biblioteca de scFv-Fc naive e seleção de ligantes

[0261] Células da biblioteca de scFv-Fc na'fve foram coradas com 500nM de antígeno biotinilado e estreptavidina-FITC, juntamente com anticorpo anti-Fc marcada com ficoeritrina como antes. Região mostra células que foram selecionadas por triagem de fluxo. As amostras foram marcadas com biotinilado:

[0262] a. CD28

[0263] b. β-galactosidase

[0264] c. Tireoglobulina

[0265] d. EphB4

[0266] Figura 12. Vetor de segmentação para introduzir intron contendo sítios de "destino" para comparação de métodos de integração.

[0267] a. Plasmídeo de expressão de GFP intermediário (pD3)

[0268] b. Vetor de segmentação AAVS1_dirigido (pD4). "Landing site" incorpora elementos para

[0269] dirigir integração que são FRT, lox 2272, meganuclease I-Sce1 e GFP TALEN

[0270] Após integração de pD4 no locus AAVS, múltiplos locais de recombinação ou de clivagem da nuclease estão presentes dentro do genoma. O plasmídeo pD5 de entrada (fig 15) e deixou ramos de homologia direitos equivalentes à sequência presente em ambos os lados do landing site para conduzir a inserção anticorpo por recombinação homóloga.

[0271] Figura 13. Sequência de pD4 (SEQ ID NO: 12, 13, 14, 15, 16, 17 & 18.).

[0272] Características de sequência incluem:

[0273] Homologia esquerda de AAVS 19-822

[0274] Sítio FRT 832-879, Lox 2272 sítio 884- 917, I-Sce1 sítio de meganuclease 933-950

[0275] TALEN esquerdo de ligação de GFP 954- 968, TALEN direito de ligação de GFP 984-997

[0276] T2A 1041-1103

[0277] GFP 1104-1949

[0278] Promotor PGK 2178-2691

[0279] Puromicina delta timidina quinase 2706- 4307

[0280] loxP 4634-4667

[0281] Homologia direita de AAVS 4692-5528

[0282] Figura 14. Verificação da integração de "sítio de destino" intron em clone 6F.

[0283] Seguindo a transfecção as células foram selecionadas em puromicina e o DNA genômico foi preparado. Amostras 1 representam toda a população selecionada. Amostra 2 representa clone 6F, amostra 3 é um clone transfectado na ausência de TALENs e a amostra 4 é de células HEK293 de tipo selvagem. Os iniciadores e as condições descritas no texto foram utilizadas para verificar por PCR a correta integração na extremidade 5 'e 3' da inserção genômica. A banda principal (tamanho correto) é vista para o clone selecionado (6F), bem como a população selecionada.

[0284] Figura 15. Sequência do plasmídeo doador para a integração em sítios Flp/GFP TALEN (pD5) (SEQ ID NO: 19, 20 & 21). Características incluem:

[0285] AAVS HA 13-233

[0286] Sítio FRT 243-290

[0287] Lox2272 295-328

[0288] I-Sce1 344-361

[0289] Resistência a blasticidina 417-818

[0290] Poli A 832-1070

[0291] Figura 16. Sequência do construto da meganuclease I-Sce1 (SEQ ID NO: 22 & 23)

[0292] Figura 17. Análise de citometria de fluxo comparando integração nuclease-dirigida utilizando meganuclease I-Sce1 com recombinases.

[0293] As células do clone 6F foram co- transfectadas com PD5-D1.3 e os plasmídeos que codificam a nuclease/recombinase indicada. As células foram selecionadas com blasticidina e analisada 13 dias após a transfecção utilizando anticorpos anti-Fc humanos biotinilados e estreptavidina ficoeritrina.

[0294] Percentagem de células positivas estão indicadas (também resumidas na Tabela 5)

[0295] a. Não-transfectadas, b Doador apenas c. I-Sce1, d, eGFP TALEN, e. Cre, f. recombinase Flp (codificada pelo plasmídeo pOG44).

[0296] Figura 18. Integração nuclease-dirigida impulsiona recombinação homóloga e "união de extremidades não-homólogas" (NHEJ).

[0297] a. Representação da estrutura do plasmídeo pD5 utilizado para segmentar o múltiplo "sítio de destino" dentro do intron de "células clone 6F mostrando a posição de iniciador J48. O "sítio de destino" neste plasmídeo incorpora um local FRT, um sítio lox2272 e um sítio de meganuclease I-Sce1 (mas nenhum sítio GFP TALEN).

[0298] b. Representação do local de integração dentro do clone 6F (derivado de pD4) mostrando a posição de iniciador J44. "Sítio de destino" incorpora elementos para dirigir a integração que são FRT, lox 2272, I-Sce1 meganuclease e GFP TALEN.

[0299] c. Representação do sítio de integração do clone 6F após recombinação homóloga de pD5, mostrando a posição dos iniciadores J44 e J48.

[0300] d. Representação do sítio de integração de clone 6F após NHEJ ou de recombinação Flp de pD5, mostrando a posição dos iniciadores J44, J46 e iniciador J44 reverso. A seta com duas pontas indica o DNA "extra" derivado de plasmídeo incorporado por NHEJ ou a integração Flp- dirigida. Nota neste exemplo, o DNA de plasmídeo de entrada (pD5) tem ramos de homologia (que direcionam recombinação homóloga, mas não são necessários para NHEJ). Estas sequências são mantidas após integração por NHEJ, causando uma duplicação da sequência representada dentro dos ramos de homologia com um par proveniente do plasmídeo, neste caso, e o outro par representando as sequências genômicas endógenas. Para simplificar os ramos de homologia de plasmídeos codificados não são mostradas, apenas a sequência equivalente dentro do genoma.

[0301] e. Iniciadores 44 e 48 foram utilizados como iniciadores de PCR para as amostras i-iv, em que o DNA genômico a partir de células transfectadas com as seguintes nucleases/integrases foram utilizadas:

[0302] i. Sce1, ii. TALEN (GFP), iii. Flp (pOG44), iv. Doador somente. Marcadores de peso molecular foram "escada de 1 kb GeneRuler (New England Biolabs). Iniciadores J44 e J48 revelam que recombinação homóloga ocorreu produzindo uma banda de 1928bp (indicado pela seta) em amostras de nuclease clivada i e ii.

[0303] Iniciadores 44 e 46 foram utilizados para as amostras v-viii, onde foi utilizado o DNA genômico a partir das seguintes amostras. v. Sce1, vi. TALEN (GFP), vii. Flp (pOG44), viii. Doador somente.

[0304] Iniciadores J44 e J46 revelam que a clivagem do doador e DNA genômico por meganuclease I-Sce1 resultou em NHEJ (amostra v.), produzindo uma banda de 1800bp (indicado pela seta). Como seria de esperar uma banda de tamanho semelhante foi conseguida por integração mediada por Flp (vii). NHEJ não ocorreu com GFP TALEN uma vez que não havia nenhum local de clivagem no plasmídeo de entrada.

[0305] Figura 19. A secreção de anticorpos IgG no sobrenadante de cultura.

[0306] a. Gel corado com Coomassie da proteína A de IgG purificada a partir de sobrenadantes de cultura.

[0307] i. IgG purificada a partir do sobrenadante de células pD2-D1.3 sem transfecção do gene da recombinase Dre.

[0308] ii. IgG purificada a partir do sobrenadante de células pD2 D1.3 transfectadas com o gene da recombinase Dre. ELISA policlonal de anticorpos secretados. As células selecionadas a partir da experiência mostrada na figura 9H (originalmente a partir de células da população de anticorpos selecionados por 1 ciclo de apresentação de fagos) foram cultivadas durante 7 dias pós triagem e o sobrenadante de cultura recolhido. As placas de ELISA foram revestidas com β-galactosidase (10ug/ml) ou BSA (10ug/ml) durante a noite. Os sobrenadantes da cultura foram diluídos até 66% após a mistura com um volume de 33% de 6% de Marvel-PBS (isto é descrito acima, como a amostra "pura"). O sobrenadante foi também diluído 1/10 em PBS e misturado com 6% de MPBS da mesma maneira. Detecção do limite de fusão scFv-Fc foi realizada utilizando anticorpos anti-IgG humana-Eu (Perkin Elmer, Cat 1244-330).

[0309] Figura 20. Preparação de fragmentos de DNA para a conversão de populações selecionadas de scFv para o formato IgG, (a) Geração de inserto de DNA CL-pA-CMV-Sigp (conforme representado na Figura 21b). Amplificação por PCR do plasmídeo pD2 com os iniciadores 2595 e 2597 e purificado em gel. Faixa M, Generuler 1 kb ladder (Thermo, SM031D), faixa 1 inserto de DNA CL-pA-CMV-Sigp, (b) Geração de inserto de DNA de scFv foi como descrito no Exemplo 6. Faixa m, Generuler 1 kb ladder (Thermo, SM031 D), faixa 1 em branco, faixa 2 scFv purificado, faixa 3 população scFv produzida por β-galactosidase ciclo 1, faixa 4 população scFv produzida por β-galactosidase ciclo 2, faixa 5 população scFv produzida por CD229 ciclo 2, (c) purificação de NheI e XhoI DNA de "mini- círculo" digerido. As ligações entre DNA digerido por Ncol/Notl que codifica scFv (Figura 21, inserto a) e cadeia leve constante de codificação de DNA (CL), poli A (pA), promotor de CMV e peptídeo de sinal (Figura 21, inserto b) para formar DNA de "mini-círculo" (Figura 21 c) foram purificados por coluna de centrifugação, digerido com NheI e XhoI e purificados por gel de agarose a 1%. As faixas são m, Generuler 1 kb ladder (Thermo, SM031 D), faixa 1 produção de β-galactosidase ciclo 1, a faixa 2 produção de β- galactosidase ciclo 2, faixa 3 produção de CD229 ciclo 2. O produto linearizado de 2,6 kb, indicado pela seta, foi excisado e purificado.

[0310] Figura 21. Representação esquemática do processo de conversão do formato scFv para IgG. Um inserto de DNA (a) que codifica os domínios VH e VL de anticorpo está ligado com o fragmento de DNA (b) que codifica uma cadeia leve constante (CL), uma sequência de poliadenilação (pA) um promotor de citomegalovírus (CMV) e um peptídeo de sinal (SigP). A junção de moléculas de DNA a e b para criar um "mini-círculo" de DNA não replicativo c é facilitada através de uma ligação de "extremidade-pegajosa". Após a ligação, o "mini-círculo" c é linearizado com as enzimas de restrição Nhel e Xhol. Produto d linearizado é então purificado e ligado com o vetor digerido e. O vetor e inclui um promotor pEF e sequência SigP a montante do sítio NheI e codifica os domínios pesados constantes de anticorpo (CH) 1 a 3 a jusante do sítio XhoI. O produto de ligação de inserto d com vetor e resultará no plasmídeo f, que pode ser utilizado para transformar bactérias e crescimento com um marcador selecionável adequado iria permitir a produção e purificação de DNA plasmídico através de métodos padrão. Plasmídeo f purificado pode ser introduzido em células de mamíferos [134] para expressão heteróloga de anticorpos Ig. Alternativamente, o DNA que codifica CH1-3 no vetor e, pode ser substituído com DNA que codifica um único domínio CH1 de expressão de Fab. VH e VL anticorpo são variáveis de cadeia pesada e leve, respectivamente. DNA que codifica um promotor do fator de alongamento (pEF) uma cadeia leve constante de anticorpo (CL) e os domínios pesados constantes 1-3 (CH1 -3), uma sequência de poliadenilação (pA) um promotor de citomegalovírus (CMV) e um peptídeo de sinal (SigP) são retratados.

[0311] Figura 22. Exemplo adicional de preparação de fragmentos de DNA necessários para a conversão de scFv para insertos de IgG (a) scFv gerados como descrito no Exemplo 14 foram separados num gel de agarose TBE a 1%. Pistas 1 e 14 é uma escada de 500 bp de DNA a partir de 500 bp. Pistas 2 a 13 são PCRs scFv. (b) A purificação do "mini- círculo" linearizado d (Figura 21) foi realizado por separação num gel de agarose TBE a 1%. Da esquerda para a direita, a primeira pista é uma escada de DNA (escada 1 kb, Lifetech, 15615-024) e as pistas restantes "mini-círculo" linearizado d. (c) Como (b), exceto o promotor CMV é substituído por uma sequência de P2A e a escada de DNA empregue foi escada 1 kb Generuler (Thermo, SM031 D).

[0312] Figura 23. Integração nuclease-dirigida de genes ligantes utilizando sistemas de eletroporação de fluxo. Uma mistura 50:50 de plasmídeos pD6 que codificam um anticorpo anti-FGFR1 ou um anticorpo FGFR2 foi eletroporada utilizando um sistema de fluxo de eletroporação. Após 13 dias células de seleção de blasticidina foram marcadas com FGFR1- Fc marcada com Dyelight-633 (FGFR1-Dy633) ou FGFR2-Fc marcada com Dyelight 488 (FGFR2-Dy488). Dot blots (manchas pontuais) representam:

[0313] a. FGFR2-488 coloração única (amostra 1b da Tabela 7)

[0314] b. FGFR1-633 coloração única (amostra 1 b da Tabela 7)

[0315] c. Coloração dupla FGFR1-633/FGFR2-488 (amostra 1b a partir da Tabela 7)

[0316] d. Coloração dupla FGFR 1-633/FGFR2-488 (amostra 3 a partir da Tabela 7)

[0317] Figura 24. Recuperação de genes de anticorpos após separação de fluxo.

[0318] Uma população de anticorpos foi selecionada por um ciclo de exibição em fagos e uma biblioteca de apresentação de mamífero foi criada por eletroporação de fluxo utilizando o sistema MaxCyte. As células foram triadas utilizando tanto antígeno 1 nM ou 10 nM e mRNA isolado diretamente. Os genes do anticorpo foram recuperados através de PCR, clonados num vetor de expressão bacteriano e a proporção de positivos de ELISA determinados ("saída de 1 nM", "saída de 10 nM"). Este foi comparado com o ciclo original 1 de saída ("saída de fago R1"). Gráfico mostra o perfil de sinais ELISA obtidos com cada população.

[0319] Figura 25. vetor plNT20 para a expressão de Receptores de Células T.

[0320] a. Representação do plasmídeo de promotor duplo plNT20 mostrando ramos de homologia AAV, gene puromicina selecionável (com a região em torno do sítio de splice aceitador mostrado abaixo). Cadeia alfa (englobando variável alfa, CD3Z constante alfa de camundongo) é flanqueada por sítios de restrição Nhe1, Not1 e Acc65l e está sob o controle do promotor pEF. A cadeia beta (abrangendo variável beta, CD3Z constante beta de camundongo) é flanqueada por sítios Nco1, Xho1 e Hind3 e está sob o controle do promotor de CMV.

[0321] b. Sequência no aceitador de splice e o início do gene da puromicina (SEQ ID NO: 24 & 25)

[0322] c. Sequência do construto de clone do receptor da célula T de cadeia de c12/c2 alfa mostrando sítios de restrição Nhe1, Not1 e Acc65l (SEQ ID NO: 26 & 27).

[0323] d. Sequência do construto do clone do receptor de sequência de células T de cadeia c12/c2 beta mostrando Nco1. Sítios de restrição Xho1 e Hind 3 (SEQ ID NO: 28 & 29).

[0324] e. Sequência de receptor de células T do clone 4JFH do construto da cadeia alfa que mostra os sítios de restrição Nhe1/Not1 (SEQ ID NO: 30 & 31).

[0325] f. Sequência de receptor de células T do clone 4JFH do construto da cadeia beta mostrando

[0326] Sítios de restrição Nco1/Xho1 (SEQ ID NO: 32 & 33).

[0327] g. Estratégia e iniciador utilizado para mutar CDR3 de c12/c2 cadeia alfa TCR (SEQ ID NO: 34, 35, 36 & 37).

[0328] h. Estratégia e iniciador utilizados para mutar CDR3 da cadeia beta c12/c2 TCR (SEQ ID NO: 38, 39, 40 & 41).

[0329] (N= A, C, G, T; S= C OU G; W= A OU T)

[0330] Figura 26. O reconhecimento de peptídeo; complexos de MHC por receptores de células T introduzidas em células de mamífero através de integração dirigida por nuclease.

[0331] TCR1 é TCR é c12/c2 reconhecendo o peptídeo 1 (SLLMWITQV) sob a forma de complexo com ficoeritrina marcada com HLA-A2 (peptídeo 1). TCR2 é TCR 4JFH que reconhece o peptídeo 2

[0332] (ELAGIGILTV) sob a forma de complexo com HLA-A2 marcados com ficoeritrina (peptídeo 2). Amostra a e c TCR1 que expressa células expostas ao peptídeo 1 (a) ou o peptídeo 2 (c). Amostras b e d mostram TCR2 que expressa células expostas ao peptídeo 1 (a) ou peptídeo 2 (c).

[0333] As amostras e e f mostram células HEK293 não-transfectadas marcadas com peptídeo 1 (e) ou peptídeo 2 (f). g. Plasmídeo que codifica TCR1 foi misturado com 100 vezes em excesso do plasmídeo TCR2, introduzido pela integração nuclease dirigida em células HEK. 1,15% de células e foi marcada com o peptídeo 1. 1,15% das células foram positivas.

[0334] h. Plasmídeo que codifica TCR2 foi misturado com 100 vezes em excesso do plasmídeo TCR1, introduzido pela integração nuclease dirigida e foi marcada com o peptídeo 2. 0,62% de células foram marcadas. As células positivas recolhidas por separação de fluxo e mRNA recuperados para análise do enriquecimento de TCR específico.

[0335] As amostras de i-l ilustram a expressão de uma biblioteca de células T em células HEK293. Biblioteca TCR foi introduzida por eletroporação Maxcyte e selecionada por 11 dias em puromicina

[0336] I. Mostra células marcadas com uma APC anticorpo marcado anti-TCR (eixo y).

[0337] j. Mostra células marcadas com o peptídeo marcado com ficoeritrina 1: MHC (eixo x)

[0338] k. Mostra células não transfectadas marcadas com tanto TCR anti-anticorpo e peptídeo 1: MHC

[0339] I. Mostra células transfectadas de biblioteca TCR1 marcadas tanto com TCR anti-anticorpo quanto peptídeo 1:MHC

[0340] Amostras m-n ilustram a expressão de TCRs em células Jurkat. TCR1 foi entregue por eletroporação Amaxa e selecionado por 25 dias em puromicina. O plasmídeo foi transfectado na presença (m) ou na ausência (n) de nuclease TALE e foi incubado com um anticorpo marcado com uma cadeia anticorpo anti-TCR β marcada com APC. As amostras o-r ilustram a ativação do receptor de células T das mesmas células Jurkat TCR1 transfectadas. Todas as células são marcadas com anticorpo anti-CD69 (eixo y). Amostra o era não estimulada e p foi estimulada durante 24 horas com um anticorpo anti-CD3. As amostras q e r foram incubadas durante 24 horas com 2 ul e 6 ul, respectivamente, de MHC marcado por PE: peptídeo 1. Todas as células foram também expostas ao anticorpo CD28.

[0341] Figura 27. vetores plNT21 CAR1 e plNT21 CAR2 para introdução de bibliotecas de Receptor de Antígeno Quimérico (CAR) em células humanas.

[0342] Representação do plasmídeo promotor único plNT21 mostrando ramos de homologia AAVS, gene puromicina selecionável, promotor CMV dirigindo fusão de ligante para CD3Z, domínio sinalizador. Sítios Ncol e Not 1 são processados por clonagem do ligante.

[0343] a. plNT21 CAR1 funde o ligante aos domínios justamembranar, transmembranar e sinalizador do CD3Z.

[0344] b. plNT21 CAR2 funde o ligante à dobradiça CD8 e domínio transmembranar e domínios de ativação 4-1 BB e CD3Z

[0345] c. Seqüência de CD3Zem pINT 21_CAR1 (SEQ ID NO: 42, 43 & 44)

[0346] d. Seqüência de CD8, 4-1 BB e CD3Z em pINT 21_CAR2 (SEQ ID NO: 45 & 46) e. Sequência de FMC63 H-L (anticorpo anti CD19) (SEQ ID NO: 47 & 48)

[0347] Figura 28 Expressão de scFv e de andaime alternativo dentro do construto receptor de antígeno quimérico introduzido em células humanas por integração mediada por nucleases.

[0348] Células HEK foram transfectadas com os anticorpos anti-FGFR1 (b) ou adhiron loxl (c) e marcadas com FGFR1 e lox1 marcados respectivamente. Como controle os mesmos antígenos foram incubados com células HEK293 não transfectadas (a e c, respectivamente).

[0349] Populações de bibliotecas de apresentação de fagos selecionadas em mesotelina e CD229 foram introduzidas em células HEK por integração mediada por nuclease (f e h, respectivamente) e foram selecionadas em puromicina durante 11 dias. Estas células ou células HEK293 não transfectadas foram incubadas com mesotelina marcada (e, f) ou CD229 (g, h). e e h representam células HEK293 transfectadas.

[0350] Figura 29. Sequência de andaimes ligantes alternativos para a exibição de mamíferos

[0351] Bibliotecas de diferentes formatos de ligante pode ser facilmente introduzida por integração dirigida por nuclease utilizando vetor aqui descrito. Por exemplo construtos Adhiron foram preparados com sítios Nco1 e Not 1 flanqueadores para introdução em construtos CAR ou construtos de fusão Fc.

[0352] a. Sequência de ligação Adhiron_lox1A lox1 (SEQ ID NO: 49 & 50)

[0353] b. Sequência de ligação de Adhiron_lox1 B lox1(SEQ ID NO: 51 & 52)

[0354] (Alças de variáveis são mostradas em negrito e sublinhado na sequência de proteína).

[0355] c. Iniciadores mutagênicos potenciais para a construção de biblioteca de ligantes dentro de alça 1 (adhiron mut1) (SEQ ID NO: 53, 55 & 56) ou alça 2 (adhiron mut2) (SEQ ID NO: 54, 57 & 58),

[0356] Abaixo está uma representação da região abrangida pelos iniciadores (cadeia inferior), mostrando a tradução da proteína, n representa um número variável de códons NNS que dão origem a diferentes comprimentos de alça.

[0357] d. Seqüência de ligação knottin MCoTI-ll de ligação à tripsina com sítios Nco1 e Not1 flanqueadores permitindo expressão de knottin dentro de vetores aqui descritos. Sequência da primeira alça está sublinhada SEQ ID NO: 59 & 60).

[0358] e. Estratégia para a criação de biblioteca de knottin mutantes. Neste exemplo alça 1 passa a ter 10 aminoácidos aleatórios. Neste exemplo códons VNS são introduzidos (V = A, C ou G) fornecendo 24 códons que codificam 17 aminoácidos. Esta sequência pode ser introduzida em um clone que codifica MCoTI-ll, utilizando métodos convencionais (SEQ ID NO: 61, 62 & 63).

[0359] Figura 30. Sequências de exemplo para a inserção de gene de anticorpo mediada por Nuclease por ligação ou união de extremidades mediada por micro-homologias (MMEJ).

[0360] a. Sequência de PD7-Sce1 (nucleotídeos 1-120) (SEQ ID NO: 64, 65). A sequência é como pD6 (ver Figura 3c, 8), exceto ramo AAVS esquerdo entre EcoR1 e Nsi1 foi substituído pelo reconhecimento da meganuclease I-Sce1 (negrito). Além disso, o ramo AAVS direito entre Asc1 e Mlu1 foi substituído por um inserto codificado por iniciadores 2723 e 2734 (não mostrados).

[0361] b. Sequência de pD7-ObLiGaRe (nucleotídeos 1-120) (SEQ ID NO: 66, 67). A seqüência é como pD6 (ver Figura 3c, 8), exceto o ramo AAVS esquerdo entre EcoR1 e Nsi1 foi substituído pelos sítios de reconhecimento de ramos AAVS TALE esquerdo e direito. Além disso, o ramo AAVS direito entre Asc1 e Mlu1 foi substituído por um inserto codificado por iniciadores 2723 e 2734 (não mostrados).

[0362] Figura 31. Integração dirigida por nuclease de ligantes para o locus ROSA 26.

[0363] a. Mostra sequência de ramo de esquerdo até ao início do gene puromicina

[0364] mostrando os iniciadores e sítios de restrição mencionados no exemplo 22 (SEQ ID NO: 68).

[0365] b. Sequência de braço de homologia direito para integração dirigida por nuclease no locus ROSA 26 mostrando os iniciadores e os sítios de restrição mencionados no exemplo 22 (SEQ ID NO: 69).

[0366] Exemplos

[0367] Exemplo 1. Construção de vetores para a expressão de anticorpos igG formatados

[0368] Para efetuar seleções genéticas dos agentes aglutinantes (por exemplo, anticorpo, proteína ou peptídeo), é necessário introduzir um gene que codifica este ligante e para dirigir a expressão desse gene a partir de um promotor exógeno, ou por dirigir a integração do transgene a jusante de um promotor preexistente no DNA celular, por exemplo, um promotor endógeno. Anticorpos representam a classe mais utilizada de ligantes e que podem ser formatados para a expressão em diferentes formas. Nos exemplos abaixo, descreve-se a expressão de um formato único de gene onde um scFv é fundido com um domínio Fc (scFv-Fc). Nós também exemplificamos a expressão de anticorpos formatados como moléculas de IgG2 humanas. Para expressar os anticorpos de IgG ou Fab formatados em células produtoras tal como eucariotas superiores, é necessário expressar as cadeias pesada e leve separadas. Isto pode ser feito através da introdução de plasmídeos separados que codificam cada cadeia ou, introduzindo-os num único plasmídeo. Dentro de um único plasmídeo as 2 cadeias podem ser expressas a partir de um único mRNA multi-cistrônico. Expressão de proteínas distintas de uma única mensagem requer elementos, tais como sequência de Entrada Interna de Ribossomos (IRE) que permitem a tradução para iniciar em um local secundário a jusante. Em alternativa, os elementos de sequência que promovem paralisação/ re-iniciação da tradução, tais como sequências virais 2A podem ser utilizados [119].

[0369] Como alternativa, várias proteínas distintas podem ser expressas a partir de um único plasmídeo utilizando vários promotores. A Figura 1a e 1b mostram a organização de 2 cassetes de expressão semelhantes dentro de diferentes estruturas principais de vetor (pDUAL e plNT3), que foram desenvolvidas para a expressão de anticorpos IgG formatados secretados. Estas cassetes de expressão foram criadas utilizando uma combinação de síntese de genes e amplificação por reação em cadeia de polimerase de elementos normalizados, tais como promotores e sequências poli A. Primeiros plasmídeos separados foram criados dentro de pCMV/myc/ER (Figura 1c, Life Technologies) para a expressão do anticorpo de cadeia pesada (pBIOCAMI-NewNot) e cadeia leve (pBIOCAM2-pEF). Os elementos de pBIOCAM2-pEF (incluindo promotor pEF, gene da cadeia leve e sítio poli A) foram clonados em pBIOCAM1-NewNot) para criar pDUAL. Os exemplos apresentados incluem os domínios VH e VL de um anticorpo anti-lisozima humanizado chamado D1.3 [120] e são referidos como pDUAL-D1.3 e plNT3-D1.3. Os elementos de pDUAL D1.3 representados na Figura 1a estão presentes entre os sítios polyA EcoR1 e BGH da estrutura principal de plasmídeo a partir de pCMV/myc/ER (Figura 1c V82320 Life Technologies Cat).

[0370] De um modo semelhante cassetes separadas de cadeia leve e cadeia pesada foram introduzidas no pSF-pEF (Oxford Genetics OG43) e pSF-CMV-F1-Pac1 (Oxford Genetics OG111), respectivamente, para criar plNT1 e plNT2. Estes foram combinados por clonagem da cassete de cadeia leve (incluindo o promotor pEF, gene da cadeia leve e sítio poli A) a montante do promotor de CMV em plNT2, para criar plNT3. Os elementos de plNT3-D1.3 representados na Figura 1b são clonados entre o primeiro Bgl2 e o Sbf1 representados no plasmídeo pSF-CMV-F1-Pac1 (Figura 1d, Oxford Genetics OG111).

[0371] O promotor precoce imediato de citomegalovirus (promotor CMV) é um promotor forte e foi utilizado para dirigir a expressão de cadeias pesadas. pDUAL D1.3 também incorpora um líder tripartida de adenovírus 2 (TPL) e reforçou promotor tardio principal (enh MLP) imediatamente a jusante do promotor CMV [121]. Proteína de alongamento de fator-1 alfa é ubíqua e abundantemente expressa na maioria das células eucariotas e o seu promotor (promotor pEF) é comumente utilizado para dirigir a expressão do transgene [122]. Em pDUAL-D1.3 e plNT3-D1.3 o promotor pEF é utilizado para dirigir a expressão de cadeia leve de anticorpo. Os sítios de poliadenilação originários do hormônio de crescimento bovino (BGH poliA) estão presentes no final de cada cassete de expressão.

[0372] A secreção das cadeias leves e pesadas separadas no retículo endoplasmático (e em última análise, sobrenadante de cultura) é direcionada por 2 sequências líder diferentes. Secreção da cadeia leve é direcionada por uma sequência líder BM40 [123]. Isto é seguido por sítios Nhe1 e Not1 de clonagem que permitem a clonagem enquadrada dos genes VL, que estão por sua vez, fundidos com um gene C kapa humano. A secreção da cadeia pesada é direcionada por uma divisão líder por um intron proveniente de um gene de VH de camundongo (como encontrado em pCMV/myc/ER). O líder é seguido por sítios Nco1 e Xho1 permitindo clonagem enquadrada de genes de anticorpos VH seguido por um gene de IgG2 de códon otimizado. Os genes VL e VH do anticorpo humanizado D1.3 [120] foram clonados nos sítios Nhe1/Not1 e Nco1/Xho1 respectivamente dentro de pDUAL-D1.3 e plNT3-D1.3.

[0373] Versões ancoradas de membrana destes plasmídeos foram criadas para a exposição de mamífero. O plasmídeo pD1 foi criado por digestão de pDUAL-D1.3 com Bsu36l (que corta no domínio CH3 do gene da cadeia pesada de IgG2) e com BstZ171, que corta na estrutura principal após a região SV40 poli A da cassete de resistência à neomicina (Figura 1c) . Isto, portanto, remove a maior parte do domínio CH3 e toda a cassete de expressão de neomicina. O domínio CH3 é substituído por um inserto sintético com extremidades compatíveis Bsu36I e BstZ171 (representadas na Figura 1e). O inserto sintético foi desenhado para substituir o códon de parada na extremidade do domínio CH3 de anticorpo com um doador de splice e o intron que faz com que o splicing do terminal CH3 de um exon que codifica o domínio transmembranar do receptor humano PDGF [84] os primeiros 5 resíduos intracelulares, um códon de parada e um doador de splicing adicional. Isto é seguido por um aceitador de splice e o intron adicional seguido por um códon para o aminoácido único, em seguida, um códon de parada (Figura 1e). Os 2 introns sintéticos que flanqueiam o exon que codifica o domínio transmembranar foram desenhados com sítios de reconhecimento de ROX localizados dentro deles. Sítios ROX são reconhecidos por recombinase Dre causando recombinação entre o DNA contendo estes sítios [88]. A inclusão de 2 sítios ROX que flanqueiam o exon que codifica o domínio transmembranar cria o potencial para remover este exon pela transfecção de um gene que codifica a recombinase Rox. Este seria antecipado para criar um produto de anticorpo secretado.

[0374] A Figura 2 mostra a sequência do plasmídeo de expressão de promotor duplo de anticorpo resultante expressando um anticorpo humanizado anti-D1.3 lisozima (daqui em diante referido como pD1-D1.3 (SEQ ID NO: 1 ). Especificidade de ligação anti-lisozima é incorporada através da inclusão de sequências de VH e VL a partir de D1.3 [120] entre sítios Nco/Xho1 e Nhe1/Not1 de restrição, respectivamente. A sequência é mostrada a partir do sítio EcoR1 ao BstZ171. As sequências para além dos sítios EcoR1 e BstZ171 são da estrutura principal do vetor tal como representado na Figura 1c.

[0375] Exemplo 2. Construção do vetor (pD2) para segmentação de uma cassete do anticorpo para o locus AAVS

[0376] A clivagem dentro do genoma utilizando nucleases sítio específicas facilita a inserção de DNA heterólogo, através de recombinação homóloga ou união de extremidades não-homólogas (NHEJ). Células humanas HEK293 foram clivadas com nucleases visando o primeiro intron da proteína fosfatase 1, gene de subunidade reguladora 12C (PPP1R12C). Este locus foi identificado como um sítio de integração comum de vírus adeno-associado e é referido como o sítio AAVS (Figura 3a). O sítio AAVS é considerado um locus de "zona de segurança" para a inserção e expressão de genes heterólogos em células humanas [124].

[0377] A seguir à clivagem sítio específica dentro do genoma, é possível promover a integração de uma cassete de expressão de proteínas utilizando a recombinação homóloga. Para fazer isso, é necessário flanquear a cassete de expressão com as regiões homólogas às sequências encontradas em ambos os lados do local de clivagem genômico. Para dirigir a integração no locus AAVS, uma secção de 804 bp do locus AAVS 5' do sítio de clivagem pretendido, foi amplificado por PCR para criar um sítio EcoR1 e um Mfe 1 na extremidade 5' e 3', respectivamente. Este produto, que representa o ramo de homologia esquerdo para segmentar a cassete do anticorpo, foi clonado no sítio EcoR1 de pD1 a recriando o sítio EcoR1 na extremidade 5'. Para o ramo de homologia direito uma secção 836bp do locus AAVS, 3' do sítio de clivagem, foi amplificado por PCR para criar sítios Bstz171 em cada terminal e este foi clonado no Bstz171 de pD1. O construto está representado na Figura 3b e a sequência do construto resultante (pD2) é mostrado na Figura 3c.

[0378] Durante a clonagem sítios de restrição Nsi1 e Pad de ramo de homologia AAVS esquerdo também foram inseridos na extremidade 3'. Estes sítios foram posteriormente utilizados para clonar um intron sintético seguido por um gene blasticidina com um sítio poli A acompanhando. O gene blasticidina carece de um promotor, mas é precedido por um sítio aceitador de splice que cria uma fusão enquadrada com o exon a montante do locus AAVS (figura 3a, b). A integração no locus AAVS provoca a expressão do gene blasticidina sem promotor. A sequência deste construto final, chamou pD2, é mostrado na Figura 3c (.

[0379] A sequência da cassete do anticorpo, que engloba o promotor pEF, cadeia leve D1.3, região poli A, promotor CMV, cadeia pesada D1.3, sítios de splicing alternativos e sítio poli A, é mostrada na Figura 2. Para evitar a duplicação desta sequência está representada na Figura 3c como um bloco marcado "CASSETE DE EXPRESSÃO DE ANTICORPO D1.3".

[0380] Exemplo 3. Integração dirigida por AAVS TALEN de construto IgG para a expressão de anticorpo de superfície celular e da ligação ao antígeno

[0381] Células HEK293F (Life Technologies), crescidas em meio Freestyle foram transfectadas com DNA de pD2-D1.3 na presença ou ausência de um par de vetor TALEN dirigido por AAVS. Um par AAVS TALEN ( "AAVS original") foi anteriormente descrito [125] e reconhece a sequência: TALEN ESQUERDA: 5' (T)CCCCTCCACCCCACAGT (SEQ ID NO: 70)

[0382] Espaçador 5' GGGGCCACTAGGGAC (SEQ ID NO: 71)

[0383] TALEN Direita: complemento de 5' AG G ATTGGTG ACAG AAAA (SEQ ID NO: 72)

[0384] (ou seja, 5' TTTTCTGTCACCAATCCT (SEQ ID NO: 73)

[0385] Uma alternativa, par TALEN segmentado por AAVS mais eficiente foi identificado e utilizado em experimentos posteriores (pZT-AAVS1 L1 TALE-N e pZT-AAVS1 R1 TALE, Cat No GE601A-1 System Biosciences). Este par, que reconhece o mesmo sítio (mas não o primeiro resíduo "T" mostrado entre parêntesis acima), é referido como o par TALEN "AAVS-SBI".

[0386] As células foram semeadas a 0,5x106 células/ml e foram transfectadas no dia seguinte, a 106 células/ml utilizando DNA: imina de polietileno (Polyplus) adicionada numa proporção de 1:2 (w/w). As células foram transfectadas com 0,6 g/ml de pD2 e foram co-transfectadas tanto com pcDNA3.0 como um controle (0,6 μg / ml) ou os plasmídeos TALEN AAVS "originais" esquerdo e direito (0,3 μg/ml cada). pD3 que expressa EGFP a partir do promotor CMV (ver abaixo) foi incluído na experiência como controle de transfecção e mostrou 35% de eficiência de transfecção. As células foram selecionadas em cultura em suspensão utilizando meio Freestyle (Life Technology), suplementado com 5 ug/ml de blasticidina.

[0387] Para determinar se a expressão de anticorpo tinha ocorrido na superfície da célula, as células foram coradas com um anticorpo anti-Fc humano de acordo com o protocolo seguinte:

[0388] 1. 16 dias após a transfecção, 0,5-1 x 106 células a partir de populações selecionadas com blasticidina foram centrifugadas durante 2 minutos (200- 300xg) a 4°C.

[0389] 2. Lavar as células com 1 ml de tampão de lavagem (0,1% de BSA em PBS Gibco # 10010) e as células de centrifugação durante 2 minutos (200-300xg) a 4°C.

[0390] 3. Ressuspender as células em tampão de coloração 100μI (1% de BSA em PBS) e adicionar 5-10 ul de fluorocromo - anticorpos conjugados. Os anticorpos eram Fc de IgG anti-humano marcados com ficoeritrina (HP6017 clone, Cat. No. 409.304, BioLegend) ou controle de isotipo de camundongo IgG2a, K marcados com ficoeritrina (Cat. No. 400.214, BioLegend). Incubar durante> 30 minutos a 4°C no escuro.

[0391] 4. Lavar duas vezes com tampão de lavagem 1ml e ressuspender em tampão de lavagem 500 ul.

[0392] 5. Adicionar 5ul da solução de coloração de viabilidade celular (#00-6993-50 eBioscience) contendo 50 ug/ml de 7-amino-actinomicina D (7-AAD) para identificar as células mortas.

[0393] 6. As células foram analisadas num (Beckton Dickinson FACS II) citômetro de fluxo.

[0394] A Figura 4 mostra que houve uma população significativamente maior de células que expressam o anticorpo quando pD2-D1.3 é transfectado na presença do TALEN segmentado por AAVS com 86% positivos em comparação com apenas pD2-D1.3 1,5% positivos.

[0395] A funcionalidade da superfície expressa anticorpo anti-lisozima foi determinada por avaliação da ligação ao antígeno marcado. Ovo de galinha lisozima (Sigma: L6876) foi marcado utilizando sistema de conjugação Lightning-Link Rapid (DyLight 488, Innova Biosciences: 322-0010) como segue:

[0396] 1. Adicionar 10ul de reagente LL-Rapid Modifier para 100ul lisozima (200 ug dissolvida em PBS 100 ul) e misturar delicadamente.

[0397] 2. Adicionar a mistura à mistura Lightning-Link® Rapid e ressuspender delicadamente por pipetagem para cima e para baixo.

[0398] 3. Incubar a mistura durante 15-30 minutos no escuro à temperatura ambiente.

[0399] 4. Adicionar 10 ul de reagente de LL- Rapid Quencher à reação e agitar suavemente.

[0400] 5. Armazenar a 4°C. A concentração final de lisozimas-Dy488 é 1,6 Mg/μl.

[0401] 6. Utilizar 6ul lisozimas-Dy488 (~1 0ug) por coloração.

[0402] 7. A coloração, lavagem e citometria de fluxo foi como descrito acima.

[0403] A análise mostra que 86% das células transfectadas com ligação pD2-huD1.3 marcou HEL (tal como avaliado pela porta M1), em comparação com 0,29% de células não transfectadas (Figura 5).

[0404] Exemplo 4. Nucleases sítio específicas (TALENs direcionadas por AAVS) melhoram a integração de DNA doador

[0405] As células transfectadas foram também plaqueadas e selecionadas com blasticidina para determinar o número de células em que a expressão do gene sem promotor blasticidina foi ativada. 24 horas após a transfecção, as células foram colocadas em placa de Petri em 0,25 x 106 células/10cm (tratado com cultura de tecido) e foram cultivadas em soro fetal de bovino a 10% (10270-106, Gibco) e Meio mínimo essencial com aminoácidos não essenciais a 1% (MEM_NEAA # 11140-035 Life Technologies). 5ug/ml de blasticidina foram adicionadas depois de mais 24 horas e o meio foi mudado a cada 2 dias. Após 9 dias células que não receberam plasmídeo pD2 estavam todas mortas. Após 12 dias, as placas foram coradas com 2% de azul de metileno (50% em metanol). Densidade de colônia era demasiado elevada para uma quantificação precisa mas mostrou um aumento do número de colônias resistentes a blasticidina na presença do AAVS TALENS sugerindo a integração segmentada no locus AAVS. Uma quantidade reduzida de DNA foi introduzido para quantificação mais precisa.

[0406] As transfecções foram efetuadas tal como descrito anteriormente utilizando quer 50, 200 ou 400 ng de pD2-D1.3/106 células na presença ou ausência do AAVS TALENs (0.3ug/ml de cada TALEN onde presente, Tabela 1A). A quantidade total de DNA foi ajustada a 1,2 ug de DNA por 106 células com plasmídeo de controle pcDNA3.0. Após 24 horas da transfecção, 0,25x106 células foram plaqueadas numa placa de 10 centímetros e 7.5ug/ml de blasticidina foi adicionada depois de 24 horas de plaqueamento. 10 dias após seleção de blasticidina as colónias são coradas com 2% de azul de metileno (em 50% de metanol). Os resultados são mostrados na Figura 6 e resumidos na Tabela 1A. Isto mostra que a co- transfecção de DNA que codifica TALENs direcionados por AAVS aumenta o número de colônias resistentes a blasticidina obtidas por aproximadamente 10 vezes.

[0407] A comparação foi realizada entre "AAVS original" e os pares "AAVS SBI" TALEN segmentando o locus AAVS. Tabela 1 B mostra um aumento no número de colônias resistentes a blasticidina utilizando o par "AAVS SBI" TALEN.

[0408] Tabela 1. A quantificação das colônias resistentes a blasticidina a partir da transfecção de pD2- D1.3

[0409] Aqui comparamos o efeito da adição de nuclease TALEN utilizando a expressão do anticorpo da superfície da célula (Exemplo 3) ou a ativação de um gene de blasticidina sem promotor (Exemplo 4). O benefício de integração dirigida por nuclease é mais evidente quando se mede a expressão do anticorpo em relação ao efeito sobre as colônias resistentes a blasticidina. Uma explicação provável é que os níveis de expressão necessários para efetuar a sobrevivência na presença de blasticidina pode ser significativamente menor do que os níveis de expressão necessários para detectar a expressão IgG2 na superfície. Assim incorporação errada/splicing do gene de blasticidina sem promotor poderia levar a um baixo nível de expressão do gene resistente à blasticidina causando um fundo mais elevado de colônias resistentes a blasticidina, na ausência de expressão de anticorpo significativa.

[0410] Exemplo 5. Determinação da precisão da integração utilizando AAVS TALEN.

[0411] Para investigar a precisão de integração, as colônias foram colhidas a partir da experiência do Exemplo 4 Tabela 1A (de duplicata, placas não coradas), expandida e o DNA genômico a partir destas células foi utilizado como molde em PCR. Para a preparação de DNA genômico, células foram colhidas e foram re-suspensas em 700 μL de tampão de lise (10 mM de Tris.CI, pH = 8,0, EDTA 50 mM, NaCl 200 mM, SDS a 0,5%, suplementado com 0,5 mg/mL de proteinase K (adicionado antes de lise).

[0412] A ressuspensão de células em tampão de lise foi então transferida para um tubo de microcentrífuga e foi mantida a 60 °C durante cerca de 18 horas. No dia seguinte, 700 μL de isopropanol foram adicionados ao lisado a fim de precipitar o DNA genômico. O tubo de microcentrífuga foi centrifugado a 13.000 rpm durante 20 minutos. O pellet de DNA genômico foi então lavado com etanol a 70% e centrifugado a 13.000 rpm durante mais 10 minutos. Depois de girar, o sobrenadante foi cuidadosamente separado tomando cuidado para não tocar o pellet de DNA genômico. O pellet de DNA genômico foi, em seguida, ressuspenso em tampão de 100 mM de Tris (pH 8,0), e EDTA 1 mM e foi mantido a 60 °C durante 30 minutos mantendo a tampa aberta a fim de se livrar dos vestígios de etanol. A esta solução de 100 μL, RNAse A foi adicionada (concentração final de 20 μg/ml), e incubada a 60 °C durante cerca de uma hora. A concentração de DNA genômico foi medida usando o espectrofotômetro NanoDrop (Nanodrop).

[0413] Para identificar a integração correta, os iniciadores de PCR foram concebidos que hibridam no locus genômico de AAVS além dos braços de homologia esquerdo e direito. Estes foram emparelhados com iniciadores específicos de inserção. Na extremidade 5', os iniciadores foram:

[0414] AAVS-junção-braço-esquerdo-PCR-Forw (9625) 5' CCGGAACTCTGCCCTCTAAC (SEQ ID NO: 74) BSD_Junção PCR-rev (9626): 5' TAGCCACAGAATAGTCTTCGGAG (SEQ ID NO: 75)

[0415] Estes fornecem um produto de 1,1 kb, onde ocorre a integração correta. 8/9 clones resultantes da integração dirigida de AAVS resultou em uma banda de tamanho correto (Figura 7a, b). 2 clones resistentes à blasticidina sem TALENS não forneceram um produto (Figura 11a) indicativo da integração aleatória. Na extremidade 3', os iniciadores foram:

[0416] Doador_plasmídeo_seq_PDGFRTM-2 Forw 5' ACACGCAGGAGGCCATCGTGG (SEQ ID NO: 76) AAVS1_junção-braço- direito_PCR_rev 5' TCCTGGGATACCCCGAAGAG (SEQ ID NO: 77)

[0417] Estes fornecem um produto de 1,5 kb com a integração correta.

[0418] 7/9 clones resultantes da integração dirigida de AAVS forneceram uma banda de tamanho correto. 2 clones resistentes à blasticidina derivados sem TALENs não forneceram um produto (Figura 11 b). Assim, a maioria das células resistentes à blasticidina surgem da integração correta no locus de AAVS ao passo que as colônias resistentes à blasticidina resultantes na ausência de TALENs não são corretamente integradas.

[0419] Exemplo 6. Construção de uma biblioteca de apresentação de scFv a partir de uma população selecionada de exibição em fagos e seleção através da exibição de mamíferos

[0420] Anticorpos solúveis formatados scFv foram previamente expressos a partir do vetor de pBIOCAM5-3F onde a expressão é conduzida pelo promotor de CMV e o vetor proporciona um parceiro de fusão C-terminal, que consiste em Fc humano, His6 e 3xFLAG, para o gene do anticorpo [105, 126 ]. Este foi modificado para criar o vetor de pBIOCAM5newNot onde o sítio Not1 foi incorporado dentro da região Fc do anticorpo (como mostrado na Figura 8). Este foi utilizado como um ponto de partida para criar o vetor PD6 (Figura 8) para a expressão de fusões de scFv-Fc amarrados à superfície da célula. Os iniciadores (2598 e 2619) foram concebidos para permitir a amplificação do cassete de expressão CMV promotor- scFv-Fc de pBIOCAM5newNotPrimer 2598 hibridiza a montante do promotor de CMV e localiza um sítio de Pad (sublinhado) no final. TTTTTTTTAATTAA GATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTC (SEQ ID NO: 78)

[0421] O iniciador 2619 hibridiza perto do fim do domínio de Fe e introduz um sítio doador de slice e sítio de Pme1 (sublinhado) no início do íntron. 2619: TTTTTTGTTTAAACTT ACCTTG G ATCCCTTG CCG G GG CTCAG G CTCAG GG AC (SEQ ID NO: 79)

[0422] O produto de PCR resultante é compatível com os sítios Pac1 e Pme1 de pD2 (Figura 3).

[0423] A digestão de pD2 com Pac1 e Pme1 remove:pEF promotor-líder-cadeia leve-CMV promotor-líder- cadeia pesada

[0424] A clonagem do Pac1/Pme1 cortar o produto de PCR e insere: CMV promotor-líder-Nco1/Not1 sítio-humano Fc.

[0425] A clonagem desta forma posiciona o cassete scFv-Fc adequadamente para splicing para o domínio de transmembrana a jusante previamente descrito para a apresentação de IgG na superfície celular em pD2. O vetor final PD6 é mostrado na Figura 8 e a sequência de D6 a partir de Nco1 para os sítios de Pme1 é mostrada.

[0426] As seleções da exibição dos fagos foram realizadas utilizando a biblioteca de exibição de fagos McCafferty [7] utilizando beta-galactosidase (Rockland, Cat B000-17) e CD229 (Sistemas R e D, Cat 898-CD-050) como antígenos. Os métodos para a seleção e sub-clonagem foram essencialmente conforme descrito anteriormente [6, 7, 118, 127]. Os genes scFv de populações decorrentes de uma ou duas rodadas de seleção em beta-galactosidase e duas rodadas de seleção sobre CD229 foram recuperados por PCR. Os iniciadores M 13Leadseq hibridizam dentro da sequência líder bacteriana que precede o gene de scFv e hidridiza Notmycseq no marcador myc na sequência do gene de scFv no vetor de exibição em fagos [127]. M13Leadseq (SEQ ID NO: 80) AAA TTA TTA TTC GCA ATT CCT TTG GTT GTT CCT Notmycseq (SEQ ID NO: 81 ) GGC CCC ATT CAG ATC CTC TTC TGA GAT GAG

[0427] O produto de PCR foi digerido com Nco1 e Not1, o inserto digerido foi purificado em gel. O produto digerido foi ligado nos sítios Nco1 e Not 1 do plasmídeo de expressão bacteriana pSANG10-3F e anticorpo expresso e triado tal como descrito [127]. Após 2 rodadas de seleção em betagalactosidase e clones de CD229, 40/190 (21%) e 35/190 (18%) foram considerados positivos por ELISA.

[0428] 550ng de Nco/Not Inserto não cortado também foi ligado aos sítios Nco1 e Not 1 de pD6 (2,4 μg) para criar um construto que expressa uma fusão entre o scFv e a região de Fc da IgG2 humana. O DNA ligado foi transformado em células NEB5alpha eletrocompetentes (New England Biolabs, Cat C2989) que gerou um tamanho de biblioteca de 2-3 x107 clones de cada população. O DNA foi preparado e foi co- transfectado em células HEK293 100 mls cultivadas em meio Freestyle conforme descrito acima utilizando 0,3 μg de DNA dador (PD6-biblioteca) por 106 células. As células foram co- transfectadas com 0,5 μg cada um dos "AAVS-SBI" TALENs (pZT- AAVS1 L1 TALE-N e pZT-AAVS1 R1 TALE, Cat No GE601A-1 System Biosciences).

[0429] 24 horas após a transfecção, o volume da cultura bruta foi dobrada e 24 horas mais tarde, a blasticidina (10 μg/ml) foi adicionada. O meio foi refrescado a cada 3-4 dias e após 6 dias, a concentração de blasticidina foi aumentada para 20 μg/ml.

[0430] A fim de determinar o tamanho da biblioteca, 20.000 células foram transferidas para uma placa de Petri de 10cm (cultura de tecidos tratada), 24 horas após a transfecção e foram cultivadas em 10% de soro fetal de bovino (10270-106, Gibco) e 1% de de aminoácido não essencial de meio Essencial Mínimo (MEM_NEAA # 11140-035 Life Technologies). 10 μg/ml de blasticidina foram adicionadas depois de mais 24 horas e o meio foi mudado a cada 2 dias. Após 8 dias, as placas foram coradas com 2% de azul de metileno (50% em metanol). Os resultados são mostrados na Tabela 2. Isto demonstra que as bibliotecas de cerca de 3 x 106 clones (representando 3% das células transfectadas) foram obtidas para as 3 populações.

[0431] Tabela 2. Determinação do tamanho da biblioteca scFv-Fc.

[0432]

[0433] O protocolo para a identificação e triagem de fluxo de 10-20 x 106 células é mostrado abaixo. A análise inicial foi realizada 13 dias após a transfecção utilizando apenas 106 células/amostra e com volumes reduzidos de incubação (volumes de reagentes que são 1/10th dos mostrados).

[0434] A Figura 9 mostra que em 13 dias após a transfecção, pelo menos 43-46% de células expressam fusão de scFv-Fc na superfície da célula e isto pode ser detectado utilizando qualquer FITC ou anticorppos anti-Fc identificados com ficoeritrina A ligação de beta-galactosidase biotinilada é também detectada dentro desta população utilizando FITC estreptavidina marcada com ficoeritrina. Utilizando estreptavidina-FITC, 11,8% e 39% das células eram positivas tanto para a expressão do anticorpo como ligação à antígeno utilizando bibliotecas derivadas a partir de populações de saída resultantes de 1 ou 2 de seleção de exibição de fagos, respectivamente. Para CD229 derivada de 2 rodadas de exibição de fagos, 66% das células foram positivas para scFv-Fc e 24% destes foram positivos para a ligação de CD229 (15% do total da população).

[0435] Em 20 dias após a transfecção, as células foram marcadas de acordo com o protocolo a seguir (utilizando antígeno biotinilado/estreptavidina marcada com ficoeritrina e Fc antihumano marcado com FITC).

[0436] 1. Colheita, lavagem e ajuste de células em 15-20x106 células por amostra. Centrifugar as células em 250 g durante 4', RT, lavar as células com 1 ml de PBS+0m1%BSA (4°C), centrifugar as células a 250 g durante 4', RT, ressuspender em 1 ml de PBS+1%BSA

[0437] 2. Adicionar antígeno biotinilado a um cone final. 100 nM e incubar 30' a 4°C

[0438] 3. Lave as células 2 vezes em 1 ml de BSA a 0,1% por centrifugação a 1.500 rpm durante 5 minutos

[0439] 4. Adicione:

[0440] 10 μl de estreptavidina marcada com FITC (1 μg/ml, Sigma Cat S3762) e 20 μl Fc anti-humano marcado com ficoeritrina (200 μg/mL, BioLegend Cat. 409304),

[0441] ou:

[0442] 20 μl de estreptavidina marcada com ficoeritrina (200 μg/ml, BioLegend Cat 405203) e 20 μl de Fc anti-humano marcado com FITC (200 μg/ml, BioLegend Cat 409310) PBS+1%BSA a 1%, durante 15 a 4°C no escuro

[0443] 3. Lave as células duas vezes em 1 ml de BSA a 0,1% por centrifugação a 1.500 rpm durante 5 minutos

[0444] 6. Ressuspende-las em 500 μl de PBS+1%BSA frio

[0445] 7. Adicionar 20ul de 7AAD/frasco para a coloração de viabilidade

[0446] Para a triagem, as células foram selecionadas com base no tamanho da célula, granularidade, largura de pulso e a viabilidade (através de coloração com 7- AAD, dispersão frontal e lateral. Os resultados são mostrados na Figura 9c e f. No total, 10 milhões de células foram classificadas e 3,1% e 7% das células duplamente positivas foram recolhidas para bibliotecas derivadas a partir de populações de saída resultantes de 2 rodadas de seleção de CD229 (CD229 R2) e uma ronda de 1 seleção de β-galactosidase (β-galR1), respectivamente.

[0447] As células selecionadas a partir das células derivadas de β-galR1 foram cultivadas durante mais 20 dias e reanalisadas (Figura 9h). Isto demonstra que a maioria das células expressam agora scFv-Fc e ligam-se a β- galactosidase. Esta figura também mostra que a proporção de células positivas duplas dentro da população não selecionada não diminuiu 42 dias após a transfecção (Figura 9k).

[0448] O DNA genômico foi preparado a partir de 150,000-106 células ordenadas. O DNA genômico foi preparado utilizando o método descrito anteriormente ou utilizando um kit em minipreparo de DNA genômico de mamíferos GenElute (Sigma G1 N10).

[0449] Os genes de scFv foram amplificados por PCR a partir de DNA genômico utilizando os seguintes iniciadores:

[0450] 2623 (SEQ ID NO: 82)

[0451] TAAAGTAGGCGGTCTTGAGACG

[0452] 2624 (SEQ ID NO: 83)

[0453] G AAG GTG CTGTTG AACTGTTCC

[0454] As reações de PCR foram realizadas utilizando polimerase Phusion (NEB Cat M0532S) no tampão do fabricante contendo 0,3 uM de cada iniciador e DMSO a 3%. 100-1.000ng do DNA genômico foi utilizado como molde em uma reação de 50 ul. 30 ciclos foram realizados a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 25 segundos, 72°C durante 45 segundos. Isto resultou em um produto de 1,4 kb, que foi digerido com Nco1 e Not1. Uma banda de aproximadamente 750-800bp foi gerada e purificada em gel antes da clonagem em pSANG10. O DNA ligado foi transformado em células BL21 (células competentes Edge Bio Ultra BL21 (DE3), Cat. 45363). Desta forma, os fragmentos de scFv derivados a partir da população classificada podem ser expressos em bactérias tal como descrito anteriormente [7, 127].

[0455] Como uma alternativa para o isolamento do gene do anticorpo e que expressa em uma combinação vector alternativo/hospedeiro, é possível derivar anticorpo segregado diretamente a partir das células selecionadas após a clonagem de célula única ou utilizando uma população selecionada para gerar uma mistura de anticorpos policlonais. Para exemplificar, este sobrenadante da cultura foi feito a partir de células selecionadas (a partir de células βgalR1) após 7 dias em cultura. Mostrou-se como positivo em ELISA, utilizando placas revestidas com Pgalactosidase (ver Exemplo 13 e a Figura 19b).

[0456] Exemplo 7. Construção e seleção a partir de uma biblioteca de exibição de IgG a partir de uma população selecionada de exibição de fagos

[0457] Os fragmentos de DNA que codificam scFv, representando as saídas de exibição em fagos de anticorpos da rodada 1 e 2 de seleções contra β-galactosidase e CD229, foram gerados conforme descrito no Exemplo 6. As populações de scFv foram convertidas para o formato de IgG de acordo com o Exemplo 14 e conforme detalhado no método abaixo.

[0458] Um inserto de DNA que codifica o domínio constante de cadeia leve kappa humano (CL), sequência de poliadenilação (pA), promotor CMV e sinal de peptídeo de sinal a partir de cadeia VH murina (representada entre os sítios Not1 e Nco1 de pD2 mostrados na Figura 21b) foi amplificado por PCR a partir do plasmídeo pD2 com os iniciadores 2595 (GAGGGCTCTGGCAGCTAGC) (SEQ ID NO: 84) e

[0459] 2597 (TCGAGACTGTGACGAGGCTG) (SEQ ID NO: 85). As reações de PCR foram realizadas utilizando polimerase iniciadora a quente KOD (Novagen Cat 71086-4) em tampão do fabricante contendo 0,25 μM de cada iniciador. 10 ng de DNA de plasmídeo pD2 foram utilizados como modelo em uma reação de 50 ul. 25 ciclos foram realizados a 98°C durante 10 segundos, 55°C durante 25 segundos, 72°C durante 40 segundos. Isto resultou em um produto de 1,8 kb, o qual foi digerido com Nco1 e Not1 e purificado em gel (Figura 20a representada como inserto CL-pA-CMV-SigP na Figura 21 b).

[0460] Os fragmentos de DNA que codificam scFv, representando as saídas de exibição em fagos de anticorpos da rodada 1 e 2 de seleções contra β-galactosidase e CD229, foram gerados conforme descrito no Exemplo 6. A Figura 20b mostra populações de scFv selecionadas contra β-galactosidase e CD229 separados por eletroforese em gel de agarose a 1%.

[0461] As ligações entre o inserto de scFv e o inserto de CL_-pA-CMV-SigP foram realizadas por incubação de inserto scFv digerido por Ncol/Notl (1 μg) com inserto CL-pA- CMV-SigP digerido por Ncol/Notl (1 μg) com ligase de DNA T4 (1,5 μl, Roche, 10-481-220-001) no tampão do fabricante, em um volume total de 40 μl para formar o "mini-círculo" representado na Figura 21c. As ligações foram incubadas a 16°C durante 16 horas, purificadas por coluna de centrifugação, digeridas com NheI e XhoI e o produto de 2,6 kb (representado na Figura 21 d) purificado por separação eletroforética em gel de agarose a 1% (Figura 20c).

[0462] O inserto de DNA representado na Figura 21 d que codifica VL-CL-pA-CMV-SigP-VH (0,5 μg) foi ligado com NheI/XhoI digerido, vetor purificado em gel pD2 (0,7 μg) (Figura 21 e) com ligase de DNA T4 (1,5 μl, Roche, 10-481-220-001) no tampão do fabricante, em um volume total de 40 μl para produzir o vector de direcionamento representado na Figura 21 f. Este codifica populações de anticorpos formatados como IgGs, provenientes da primeira ou segunda rodadas de seleções de exibição de fago de anticorpo para β- galactosidase ou CD229. As ligações foram incubadas a 16°C durante 16 horas, purificadas por coluna de centrifugação e eluídas com água de grau HPLC.

[0463]

[0464] O DNA ligado foi transformado em células NEB5alpha eletrocompetentes (New England Biolabs, Cat C2989) que gerou um tamanho de biblioteca de 1-4 x105 clones para cada população. O DNA foi preparado e foi co-transfectado em células HEK293 100 mls cultivadas em meio Freestyle conforme descrito acima utilizando 0,3 μg de DNA dador (PD6- biblioteca) por 106 células. As células foram co- transfectadas com 0,5 μg cada um dos "AAVS-SBI" TALENs (pZT- AAVS1 L1 TALE-N e pZT-AAVS1 R1 TALE, Cat No GE601A-1 System Biosciences).

[0465] 24 horas após a transfecção, o volume da cultura bruta foi dobrada e 24 horas mais tarde, a blasticidina (10 μg/ml) foi adicionada. O meio foi refrescado a cada 3-4 dias e após 6 dias, a concentração de blasticidina foi aumentada para 20 μg/ml.

[0466] A fim de determinar o tamanho da biblioteca, 250.000 células foram transferidas para uma placa de Petri de 10cm (cultura de tecidos tratada), 24 horas após a transfecção e foram cultivadas em 10% de soro fetal de bovino (10270-106, Gibco) e 1% de de aminoácido não essencial de meio Essencial Mínimo (MEM_NEAA # 11140-035 Life Technologies). 10 μg/ml de blasticidina foram adicionadas depois de mais 24 horas e o meio foi mudado a cada 2 dias. Após 8 dias, as placas foram coradas com 2% de azul de metileno (50% em metanol). Os resultados são mostrados na Tabela 3. Isto demonstra que as bibliotecas entre 5 x 105 e 9 x 105 clones (representando 0,5% a 0,9% de células transfectadas) foram obtidas para as 3 populações.

[0467] Tabela 3. Determinação do tamanho das bibliotecas de exibição de mamíferos formatados como IgG.

[0468]

[0469] A maior parte da população de células transfectadas com as saídas a partir de 1 ou 2 rodads de seleção em β-galactosidase foi selecionada em meio contendo blasticidina conforme descrito anteriormente. Após 19 dias, 10-20 x 106 células foram marcadas e a seleção de fluidos foi realizada conforme descrita no exemplo 6. As células selecionadas foram cultivadas durante 17 dias e re-analisadas por citometria de fluxo (Figura 10). Isto mostrou que a maioria das células eram agora duplamente positiva para a expressão de IgG e a ligação da β-galactosidase.

[0470] O DNA genômico foi preparado a partir das células separadas e o DNA que codifica o inserto de IgG foi isolado por PCR. O inserto que condifica IgG foi amplificado utilizando polimerase KOD (Merck, cat. n° 71086-3), com a temperatura de recozimento de 60°C e empregando 30 ciclos. O fabricante forneceu tampão com DMSO a 5% que foi usado com 0,3 μM dos iniciadores 2597 (SEQ ID NO: 54) e 2598 (SEQ ID NO: 47). O produto de tamanho desejado foi purificado em gel. O produto purificado em gel foi em seguida utilizado para a PCR aninhada utilizando polimerase KOD (Merck, cat. n° 710863.) no tampão do fabricante com 5% de DMSO utilizando 0,3 μM de iniciador 2625 (SEQ ID NO: 55) em combinação com iniciador 1999 (SEQ ID NO: 56) (para amostra R1), ou 2595 (SEQ ID NO: 53) (para 4R1 e 5R1), utilizando a temperatura de recozimento de 60°C utilizando 30 ciclos. Estes produtos de PCR aninhada foram purificados em gel e submetidos a digestão dupla com Nhel-HF (NEB, cat. n° R3131S) e Xhol (NEB, cat. n° R0146S), a fim de ligá-los de forma semelhante com plNT3 duplamente digerido (Figura 1) para a expressão de ligantes formatados de IgG solúvel. As sequências de iniciadores são: 2597: AG GG GTTTT ATG CG ATG G AGTT (SEQ ID NO: 85) 2598: GTTACAG GTGTAG GTCTG G GTG (SEQ ID NO: 78) 2625: CCTTG GTG CTG G CACTCG A (SEQ ID NO: 86) 1999: AAAAAGCAGGCTACCATGAGGGCCTGGATCTTCTTTCTCC (SEQ ID NO: 87) 2595: GAGGGCTCTGGCAGCTAGC (SEQ ID NO: 84)

[0471] Exemplo 8. Construção e seleção de uma biblioteca de scFv naive

[0472] Schofield et al. [7] descreve a construção de uma biblioteca de exibição de fagos (biblioteca McCafferty") em que os genes de anticorpos dos linfócitos-B de um número de dadores humanos foram clonados primeiro em uma "biblioteca intermediária" antes de re-clonagem para a biblioteca final de exibição de fagos funcionais. Esta mesma biblioteca intermediária e a mesma metodologia foi utilizada para gerar uma nova biblioteca (biblioteca IONTAS) de 4 x 1010 clones. O DNA de plasmídeo foi preparado a partir desta biblioteca tendo o cuidado de assegurar uma representação suficiente da biblioteca dentro da inoculação bacteriana. Um número de reações de PCR foi definida usando um total de 2ug de modelo de DNA. O produto de PCR foi digerido com gel purificado em Nco1 e Not 1 e ligado conforme descrito no Exemplo 6. 9,3ug de pD6 e 0.93ug de inserto de PCR foram ligados durante a noite, a reação de ligação foi limpa usando extração de fenol clorofórmio e o DNA eletroporado em células DH5alpha, conforme descrito anteriormente [7]. Como resultado, uma biblioteca de 2,4 x 108 clones foi criada dentro do vetor de exibição de scFv-Fc. O DNA foi preparado a partir desta "biblioteca na'ive" clonada no PD6 e transfectado em 1 litro de células HEK293F (Life Technologies) que cresceram em meio Freestyle (conforme descrito acima). 0,3ug de DNA de pD6-biblioteca, 0,5ug de cada par de TALEN "AAVS-SBI". 24 horas após a transfecção, o volume de cultura foi duplicado e 48 horas após a transfecção, a seleção de Blasticidina foi iniciada conforme descrita acima. O tamanho da biblioteca foi determinada por plaqueamento de alíquotas da cultura 24 horas após a transformação e seleção em blasticidina conforme descrito acima. Uma biblioteca de 0,9 x 107 clones foi criada.

[0473] Um número de antígenos foi biotinilado utilizando o kit EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce Cat. n° 21327) de acordo com as instruções do fabricante. Os antígenos foram tireoglobulina bovina (Cat Calbiochem. 609310), quimera CD28-Fc humana (R and D Systems, Cat 342-CD- 200) e quimera EphB4-Fc de camundongo (R and D Systems, Cat. 446-B4-200). β-galactosidase Biotinilada (Rockland Cat. B000- 17) também foi usada.

[0474] As células transfectadas foram selecionadas em blasticidina em cultura líquida, tal como descrito acima, durante 17 dias. As células foram colhidas, lavadas e ajustadas a 15-20x106 células por amostra. As células foram preparadas conforme descrito e o antígeno biotinilado foi adicionado a uma concentração de 500 nM. Marcação e um fluxo de triagem conforme descrito acima. Usando células controle incubadas com apenas o anticorpo anti-Fc marcado com ficoeritrina uma "porta" foi criada que incluía 0,05% destas células. Usando a mesma porta para células marcadas entre 0,28-0,51% de células foi incluída (Figura 11). Estas foram recolhidas e cultivadas para permitir rodadas adicionais de triagem e amplificação de genes de scFv a partir da biblioteca naive.

[0475] Exemplo 9. Criação de uma linha de células com vários "sítios de desembarque" para comparar abordagens de nuclease e abordagens direcionadsa a recombinase para a integração genômica

[0476] Para permitir a comparação de métodos de integração baseados em clivagem genômica ou a integração mediada por recombinase de um vetor de direcionamento dirigido a AAVS (PD4) foi construído, o qual apresenta um íntron com múltiplos "sítios de desembarque" (Exemplo 3). Estes incluem um sítio de FRT reconhecido por Flp recombinase e um par de sítios lox2272/loxP reconhecidos pela recombinase Cre. Para permitir a clivagem direcionada, pD4 também inclui uma sequência de GFP para a qual um par de TALEN foi concebido [128] e um sítio l-Sce 1 meganuclease para permitir a integração dirigida a endonuclease. Um plasmídeo dador de entrada compatível foi construído (PD5), com sítios de reconhecimento apropriados de forma que a integração direcionada a nuclease ou recombinase causa a ativação de um gene de blasticidina pouco promotor e integração de um cassete de expressão de anticorpos.

[0477] A organização do plasmídeo e a sequência de PD4 é mostrada na Figura 12b. Um plasmídeo intermediário PD3 foi criado primeiro o qual engloba um gene GFP sob o controle do promotor CMV seguido por uma puromicina/gene Timidina quinase sob o controle do promotor PGK (Figura 12a). Este foi criado por digestão de pBIOCAM1-newNot com Sad (na extremidade do promotor do CMV) e BstB1 (entre o gene Neo e o sítio poli A, Figura 1a). Isto removeu o cassete de expressão de neomicina e permite a substituição com um inserto sintético que abrange um gene de Proteína Fluorescente Verde melhorada (EGFP) sob o controle do promotor de CMV. Este construto de GFP foi fundido no terminal C para os resíduos 422-461 de uma sequência PEST descarboxilase ornitina de camundongo mutante. Esta sequência PEST é incorporado no plasmídeo pZsGreen1-DR (Clontech) e tem demonstrado reduzir a semi-vida da GFP fundida em 1 hora. Um cassete que codifica um promotor PGK, fusão de gene Puromicina/Timidina quinase (Puro deltaTK) e cassete poliA foi excisado do plasmídeo pFLEXIBLE [129] utilizando Xmn1 e Fse1 e foi clonado em locais Sma1 e Fse1 presentes na inserção sintética inicial. O plasmídeo resultante (chamado PD3) codifica um gene GFP induzido por CMV e um gene de resistência à puromicina induzido a partir de um promotor de PGK.

[0478] Para criar o pD4 do vetor de induzimento final, o promotor de CMV foi removido e foram inseridos os braços de homologia de AAV. Uma seção 850 pb do locus AAVS foi amplificada por PCR para criar um braço de homologia esquerdo AAVS flanqueado por um EcoR1 na extremidade 5 'e um Mre1 na extremidade 3'. Este foi clonado no sítio EcoR1/Mre1 de PD3 removendo assim o promotor de CMV. Um sítio Nsi1 foi também incorporado na extremidade 3 'deste braço esquerdo de homologia de AAVS. Os sítios vizinhos Mre1 e Nsi1 foram utilizados para introduzir um fragmento sintético fundindo um íntron ao gene de EGFP, como mostrado na Figura 13. O íntron sintético que precede o gene EGFP incorpora: um sítio de reconhecimento FRT para Flp recombinase um sítio de recombinação lox 2272 um sítio de meganuclease I-Sce1 sítio de reconhecimento GFP TALEN uma sequência de estagnação ribossômica T2A [130]

[0479] O braço de homologia direito AAVS foi gerado por PCR para criar os sítios Hpa1 e BstZ171 nas extremidades 5 'e 3'. Este fragmento foi clonado nos sítios Hpa1 e BstZ171 de PD3. O plasmídeo resultante pD4, codifica um cassete de resistência à puromicina ("Puro deltaTK") e pode ser utilizado para introduzir "sítios de desembarque" no locus de AAVS incorporando vários sítios de nuclease e recombinase para comparação. A sequência de PD4 é mostrada na Figura 13 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 e SEQ ID NO: 7). Os braços de direcionamento esquerdo e direito de AAVS são mostrados em detalhes na Figura 3 e, portanto, são abreviados na Figura 13.

[0480] O íntron introduzido em PD4 contém uma série de sítios de reconhecimento de TALEN provenientes de GFP [128]. O par TALEN direcionado por eGFP (eGFP-TALEN-18- Esquerda e eGFP-TALEN-18-direita) reconhece a sequência mostrada abaixo (todas as sequências e iniciadores estão apresentadas na direção 5 'para 3') em que as maiúsculas representam o sítio de reconhecimento dos TALENs de esquerda e direita e as minúsculas mostram a sequência de espaçadores. O TALEN da mão direita reconhece o complemento da sequência apresentada. O primeiro par de bases é equivalente da posição minus16 da sequência em relação à sequência ATG de iniciação de GFP (mostrado sublinhado no espaçador).

[0481] TCCACCGGTCGCCAccatggtgagcaagggCGAGGAGCTGT TCA (SEQ ID NO: 88)

[0482] O plasmídeo PD4 também incorpora um sítio da meganuclease I-Sce1 e um sítio FRT reconhecido por Flp recombinase. Finalmente, PD4 incorpora Lox 2272 e loxP (que são mutuamente incompatíveis) flanqueando o e cassetes de expressão de puromicina. A incorporação destes mesmos 2 sítios de loxP que flanqueiam o plasmídeo dador (pD5 abaixo) proporciona uma oportunidade para substituir o cassete integrado (incluindo o cassete TK puro delta de PGK) substituindo-o com uma cassete de entrada que direciona a expressão de blasticidina e anticorpos através de troca de cassete mediada por recombinase.

[0483] Criação de uma linha de células por transfecção of pD4.

[0484] Células HEK293F foram ressuspensas em 106 células/ml e DNA: polietileno imina (Polyplus) adicionado em uma proporção de 1:2 (p/p). As células foram transfectadas com 0,6 μg/ml de pD4 e foram co-transfectadas com o par TALEN "AAVS original" ou pcDNA3.0 como controle (0,6 μg/ml). pD3 que expressa EGFP a partir do promotor de CMV foi incluído no experimento como um controle de transfecção e mostrou 35% de eficiência de transfecção. Após 24 horas, as células transfectadas foram transferidas para placas de petri 0,5 x 106 células/10 cm (cultura de tecidos tratados) e foram cultivadas em 10% de soro fetal bovino (10270-106, Gibco) e 1% de aminoácidos não essenciais de meio Essencial Mínimo (MEM_NEAA # 11140-035 Life Technologies). 5μg/ml de puromicina foram adicionadas depois de mais 24 horas e o meio foi mudado a cada 2 dias. Após 5 dias, as células não transfectadas ou células transfectadas com PD3 apenas estavam mortas. Após 12 dias, havia cerca de 200 colônias em células transfectadas com apenas PD4 e cerca de 400 colônias em células transfectadas com PD4 e o par AAVS TALEN.

[0485] A população resistente de puromicina decorrentes de transfecção com pD4 e o par AAVS TALEN foi analisada para a integração correta. Além disso, uma única colônia foi escolhida a partir desta população (clone 6F) e comparada com uma colônia a partir da população resistente à puromicina resultante de transfecção de PD4 na ausência do par AAVS TALEN. Para identificar a integração correta, os iniciadores de PCR foram concebidos que hibridam no locus genômico de AAVS além dos braços de homologia esquerdo e direito. Estes foram emparelhados com iniciadores específicos de inserção. Na extremidade 5', os iniciadores foram: AAVS1_HA-L_Nested_Forw1 GTGCCCTTGCTGTGCCGCCGGAACTCTGCCCTC (SEQ ID NO: 89) EGFP_Synthetic_gene_Rev_Assembly TTCACGTCGCCGTCCAGCTCGAC (SEQ ID NO: 90) Purotk_seq_fow2 TCCATACCGACGATCTGCGAC (SEQ ID NO: 91) AAVS1_Right_arm_Junction_PCR_Rev TCCTGGGATACCCCGAAGAG (SEQ ID NO: 77)

[0486] A Figura 14 mostra que o clone 6F e a população são corretas em ambas as extremidades esquerda e direita, mas o clone escolhido a partir da população direcionada por não AAVS é negativo. Assim, a análise de PCR indica que a precisão da integração do cassete de dador é maior quando direcionada por clivagem AAVS TALEN de DNA genômico.

[0487] pD4 introduz gene GFP em quadro menos promotor impulsionado a partir do promotor AAVS. A citometria de fluxo das populações resistentes à puromicina mostraram uma ausência de expressão de GFP.

[0488] Esta incapacidade de expressar poderia ser devido à combinação de uma meia-vida curta (a partir do elemento de sequência PEST descarboxilase de oritina murina) combinada com expressão reduzida resultante da utilização do promotor de T2A. Na verdade, verificou-se que a adição do elemento de T2A em frente de um elemento de blasticidina sem promotor (tal como descrito por pD2) reduziu o número de colônias resistentes à blasticidina por 4 vezes. Apesar da ausência de expressão GFP, a integração de múltiplos sítios de desembarque ainda oferecem uma oportunidade para a comparação da integração genômica direcionada por recombinase vs direcionada por clivagem de DNA.

[0489] Exemplo 10. Construção de um vetor para a inserção de um cassete de anticorpo (PD5) no sítio de "desembarque múltiplo"

[0490] Após a introdução do íntron do "sítio de desembarque múltimplo" no locus AAVS, é possível introduzir um cassete de anticorpo dirigido através de meios direcionados por nuclease ou direcionados por recombinase. Para isto, o plasmídeo dador pD5 foi criado onde o cassete de expressão é flanqueado por braços de homologia esquerdo e direito que são equivalentes às sequências que flanqueiam o local de clivagem de GFP TALEN introduzido em pD4. PD5 não incorporar por si só um sítio de reconhecimento intacto de GFP TALEN e a integração é direcionada através de recombinação homóloga. A integração dirigida por homologia do plasmídeo doador levará a introdução de um gene blasticidina que carece de um promotor, mas é precedido por um sítio receptor de splice que cria uma fusão em estrutura com o éxon a montante do locus de AAVS como descrito anteriormente. A integração no locus AAVS irá provocar a expressão do gene promotor blasticidina menos promotor. O cassete inserido também codifica cadeias pesadas e leves de anticorpo formatado de IgG sob o controle de promotores de CMV e pEF, respectivamente, conforme descrito acima. pD5 incorpora um sítio da meganuclease I-Sce1 que pode conduzir a clivagem do doador de entrada proporcionando uma oportunidade para NHEJ (ver Exemplo 12). Um sítio DRF também é incorporado no PD5 do plasmídeo dador que permite uma incorporação dirigida por recombinase do gene de blasticidina menos promotor e cassetes de expressão de anticorpo no mesmo locus. Conforme discutido acima, Cre recombinase vai agir sobre os sítios loxP no DNA doador e genômico para a troca de cassete mediada por recombinase direta.

[0491] A sequência de pD5 é mostrada na Figura 15. A sequência na extremidade 5'do sítio de GFP TALEN é a partir do locus AAVS. Uma seção 267 pb do locus AAVS a montante do sítio de clivagem TALEN foi gerada por PCR. Os iniciadores foram utilizados o que criou um sítio EcoR1 e um Mfe 1 na extremidade 5'e 3' e o produto foi clonado no sítio EcoR1 de PD1-D1.3. O sítio EcoR1 é recriado na extremidade 5'. Durante a clonagem do braço de homologia esquerdo, um Nsi1 e Pad foram também inseridos na extremidade 3'. Um braço de homologia direito, incorporando aproximadamente 700 pb equivalentes com a sequência 3' da GFP TALEN foi criado por conjunto de PCR. Os iniciadores de PCR introduzem sítios BstZ171 na extremidade 5' e 3' do fragmento reunido e este foi clonado no sítio BstZ171 de PD1-D1.3. Os iniciadores de PCR também introduziram um sítio Hpa1 na extremidade 5'.

[0492] Um fragmento de PCR englobando o íntron (que incorpora sítios de reconhecimento para GFP TALEN, l- Sce1endonuclease, Flp recombinase e a Cre recombinase), uma região receptora de splice, um gene de resistência à blasticidina e sítio poli A (descrito acima) foi criado com o sítio Nsi1 na extremidade 5' e um sítio Pad na extremidade 3'. Este foi clonado no sítio Nsi1 e Pad do plasmídeo acima descrito para criar PD5-D1.3 (sequência mostrada na Figura 15 e a estrutura do plasmídeo mostrada na Figura 18a).

[0493] Exemplo 11 Comparação de integração direcionada por nuclease e direcionada por Flp de um cassete de expressão de anticorpo

[0494] O sistema Flp-ln, que foi usado anteriormente para a integração mediada por recombinase de cassetes de expressão de anticorpo [18] utiliza uma recombinase Flp mutante (no plasmídeo pOG44) que possui apenas 10% da atividade a 37°C da recombinase Flp nativa [19]. Uma variante de recombinase Flp (Flpe) com uma melhor estabilidade térmica e atividade em 37 °C do que o tipo selvagem foi identificada [19, 20]. Este foi ainda melhorado pela otimização de códons para criar Flpo

[0495] [131] codificado dentro do plasmídeo cCAGGS-Flpo (Cat Genebridges. A203). O efeito de ambas as variantes de recombinase Flp (codificado dentro pOG44 e cCAGGS- Flpo) foi comparado. A recombinação dirigida pela Cre recombinase foi também examinada por células de co- transfecção com um plasmídeo que codifica a Cre recombinase [132] (pCAGGS-Cre, Cat Genebridges. A204). Em cada vetor, a recombinase é expressa sob o controle do promotor chickenA- actina e um potenciador precoce imediato de CMV. Uma sequência de localização nuclear de SV40 Grande T é utilizada para a localização nuclear [20]. Nos vetores originais (cCAGGS-Flpo e pCAGGS-Cre) a expressão da recombinase foi ligada a um gene de resistência à puromicina por um sítio de entrada ribossômico interno (IRES) que foi removido utilizando técnicas padronizadas de biologia molecular.

[0496] Um experimento foi realizado para comparar as eficiências da integração direcionada por clivagem genômica versus direcionada por recombinase de um cassete de anticorpo. O resultado foi avaliado em 2 maneiras:

[0497] 1. Medir o número de colônias resistentes à blasticidina-resultantes da integração de um gene de blasticidina menos promotor.

[0498] 2. Avaliar a extensão da expressão do anticorpo alcançada pelas diferentes abordagens.

[0499] Conforme descrito no Exemplo 9, os sítios de reconhecimento para a Cre recombinase (lox2272 e loxP) e da Flp recombinase (FRT) foram previamente integrados no locus de AAVS dentro do clone 6F. Em sítios de reconhecimento adicionais para um par de GFP TALEN e para a meganuclease I- Sce1 também estão presentes no mesmo íntron. O plasmídeo doador PD5-D1.3 transporta os mesmos sítios de reconhecimento (para além de GFP TALEN) dentro de um íntron a montante do gene blasticidina menos promotor. A integração correta conduzirá à ativação do gene de blasticidina. pD5-D1.3 também codifica um gene de anticorpo D1.3 formatado por IgG que será expresso na superfície da célula.

[0500] A co-transfecção de PD5-D1.3 com pOG44 ou pCAGGS- Flpo (que codifica 2 variantes da Flp recombinase) deve resultar na integração de todo o plasmídeo pD5 no sítio DRF de clone 6F. O plasmídeo doador de pD5-D1.3 também possui um sítio lox2272 dentro do íntron sintético a montante do gene blasticidina e um sítio loxP na extremidade da cassete de expressão de anticorpo. Sob a ação da Cre recombinase expressa a partir de pCAGGS-Cre, a troca de cassete mediada por recombinase deve resultar na integração dos cassetes de expressão de blasticidina e anticorpo nos sítios lox2722 e loxP dentro do clone 6F.

[0501] A eficiência de integração do vetor utilizando abordagens direcionadas para a recombinase com abordagens direcionadas para a clivagem genômica foi comparada utilizando um par de TALENs (eGFP-TALEN-18-Esquerda e eGFP-TALEN-18-direita) direcionadas no sentido de uma sequência de GFP (Reyon ef al., 2012). No caso de GFP TALENs o elemento entre os braços de homologia esquerdo e direito vai ser integrado após a clivagem genômica por TALENs.

[0502] Para permitir a comparação com a meganuclease I-Sce1 um gene otimizado por códon que codifica I-Sce1 foi construído (Figura 16). Este gene possui um marcador de epítopo HA N-terminal/sinal de localização nuclear (NLS) SV40 no terminal N e está flanqueado por sítios de Nco1 e Xba1 no terminal 5' e 3'. O gene foi clonado no vetor pSF-CMV-F1-Pac1 (Oxford Genetics OG111), onde a expressão induzida a partir do promotor de CMV.

[0503] As transfecções foram realizadas utilizando o clone 6F com um "sítio de desembarque múltiplo" integrado corretamente. As células foram suspensas em 106/ml e transfectadas com 50 ng de plasmídeo doador PD5-D1.3/106 células juntamente com plasmídeos que codificam enzima (Tabela 4A).

[0504] Após 24 horas, as células transfectadas foram transferidas para placas de petri 0,5 x 106 células/10 cm (cultura de tecidos tratados) e foram cultivadas em 10% de soro fetal bovino (10270-106, Gibco) e 1% de aminoácidos não essenciais de meio Essencial Mínimo (MEM_NEAA # 11140-035 Life Technologies). 5ug/ml de blasticidina foram adicionadas depois de mais 24 horas e o meio foi mudado a cada 2 dias. Após 12 dias as placas foram coradas com 2% de azul de metileno (50% em metanol) e os números de colônias foram contados (Tabela 2). Em uma comparação direta entre Flp recombinase, Cre recombinase e TALEN, o maior número de colônias foi obtido através da utilização de GFP TALEN onde houve um aumento de 9 vezes em comparação com o "doador apenas" (Tabela 4A). Parece também que a utilização do gene optimizado Flpo realmente resultou em uma redução do número de colônias resistentes à blasticidina em comparação com o "doador apenas" controle, presumivelmente através de toxicidade de Flp recombinase de atividade aumentada. Houve também um aumento no número de colônicas usando pCAGGS-Cre em comparação com o controle do doador apenas.

[0505] Um segundo experimento foi realizado comparando GFP TALEN com Flp aumentada (a partir de cCAGGS- Flpo) bem como a baixa atividade de enzima Flp codificada dentro de pOG44 pelo sistema Flp-In (tal como utilizado por Zhou et al. [17, 18, US7, 884,054]. Estes foram comparados com GFP TALEN e Cre recombinase (Tabela 4B). As células foram transfectadas com as quantidades de DNA mostradas por milhão de células. 0,25 x 106 células foram transferidas para placas e o número de colônias resistentes à blasticidina foi determinado conforme descrito acima. As células também foram selecionados pela resistência à blasticidina em cultura líquida durante 30 dias antes de se determinar a proporção de células que expressaram IgG de superfície (como descrito acima). A Tabela 4B mostra que a TALEN era superior às outras abordagens em termos de número de colônias resistentes. Mais uma vez, o uso de Flp otimizado dentro de cCAGGS- Flpo realmente causou uma redução no número de colônias resistentes à blasticidina em comparação com os controles de "doador apenas". A Cre recombinase novamente levou a um aumento na contagem de colônias de blasticidina comparado com o controle, ao passo que o gene de Flp dentro de pOG44 mostrou apenas um aumento marginal em comparação com o controle.

[0506] Tabela 4 Comparação das abordagens de integração direcionadas por nuclease TALE e direcionadas por recombinase

[0507] Com a adição de mais DNA doador (Tabela 4C), houve um aumento no número de colônias em níveis intermediários (2 μg/milhão de células) e um declínio em níveis mais elevados em toda a linha (6 μg/milhão de células). Nenhuma das outras amostras atingiram níveis de exibição de anticorpos observado com a integração direcionada por GFP TALEN.

[0508] As células também foram selecionadas pela resistência à blasticidina em cultura líquida e as células coradas para a expressão de anticorpo tal como descrito acima. A integração direcionada por TALE N forneceu uma proporção significativamente mais elevada de células de anticorpo-positivo em comparação com as outras abordagens. As células transfectadas com cCAGGS- Flpo e com altas concentrações de pCAGGS-Cre não eram saudáveis e não havia números suficientes para efetuar a citometria de fluxo.

[0509] A comparação foi estendida para l-Sce endonuclease incluída. Um gene sintético que codifica I-Sce1 foi sintetizado (Figura 16) e clonado no sítio Nco1/Xba 1 de pSF-CMV- f1-Pac1 (Oxford Genetics). As células foram suspensas em 106/ml e transfectadas para cada mL de células (106 células/ml) com 300 ng de plasmídeo doador pD5-D1.3 juntamente com plasmídeos que codificam enzimas (1 ug/106 células). No dia seguinte, 0,05 ml de células foram transferidas para placas e selecionadas em blasticidina e coradas, após 14 dias, conforme descrito.

[0510] A Tabela 5 mostra que o maior número de colônias resistentes à blasticidina veio de I-Sce1 meganuclease seguido pelo par eGFP TALEN. Ambos Cre e Flp recombinase (codificados dentro pOG44) forneceram números ligeiramente mais elevados do que o controle "doador apenas". Como antes da transfecção com plasmídeos que codificam Flpe efetivamente reduziu o número de colônias em comparação ao "dador apenas".

[0511] Tabela 5. Comparação de abordagens de integração direcionadas por meganuclease e direcionadas por recombinase

[0512] Após a transfecção, o volume de células foi selecionado pela resistência à blasticidina em cultura líquida e após 7 e 13 dias foram coradas com um anticorpo marcado por anti-Fc ficoeritrina conforme descrito acima. A Figura 17 (resumida na Tabela 5) mostra que a expressão de anticorpos significativamente mais elevada foi conseguida por células transfectadas com I-Sce1 endonuclease e eGFP TALEN (47% e 55%, respectivamente) em comparação com "doador apenas" (4,9%). Em contraste, o percentual de células positivas para o anticorpo, quando as células foram co- transfectadas com plasmídeos que codificam a Flp recombinase (pOG44) ou a Cre recombinase foram de 6,6 e 6,5%, respectivamente. A proporção de células positivas para o anticorpo continua a aumentar com a seleção contínua em blasticidina e atinge 85-90% de anticorpo positivo no caso de amostras de I-Sce1 e EGFP TALEN transfectadas quando testadas no dia 19. Assim, meganucleases proporcionam uma abordagem alternativa para efetuar a integração direcionada por nuclease de transgenes que condificam anticorpos.

[0513] Exemplo 12. A integração direcionada por nuclease de uma cassete de anticorpo pode ocorrer tanto por recombinação homóloga como NHEJ

[0514] A eficiência de integração de transgenes no DNA celular pode ser melhorada pela introdução de quebras de cadeia dupla (DSBs). Os mecanismos de reparação de DNA endógeno em células eucarióticas incluem a extremidade não homóloga de recombinação homóloga que se une à (NHEJ) e variantes destes. Todos proporcionar um meio para a introdução de genes que codificam ligantes dentro de uma biblioteca. A recombinação homóloga fornece uma participação precisa entre as regiões de homologia e o transgene inserido, mas requer o fornecimento de regiões de homologia no plasmídeo dador. O DNA por recombinação homóloga pode ser fornecido como DNA linear ou circular. Com NHEJ, as extremidades de DNA estão diretamente religadas, sem a necessidade de um modelo homólogo. Esta abordagem para a reparação do DNA é menos precisa e pode levar à inserções ou deleções. No entanto, NHEJ fornece um meio simples de integração de éxons em estrutura em íntron ou permite a integração das cassetes de genes promotores no genoma. O uso de métodos não-homólogos permite o uso de vetores dadores que não possuem braços de homologia simplificando assim a construção de DNA doador.

[0515] O clone 6F possui GFP TALEN e sítios de reconhecimento de I-Sce1 nuclease integrados no genoma e estes serão clivados quando estas nucleases são fornecidos. O vetor doador pD5 não tem um sítio de reconhecimento da nuclease GFP TALE, mas tem braços de homologia flanqueando o sítio de clivagem, e por isso, é esperado para integrar apenas por recombinação homóloga. A clivagem de DNA genômico na I-Sce1 meganuclease vizinha também levará a integração dos elementos PD5 por recombinação homóloga. No entanto, pD5 também possui um sítio I-Sce1 meganuclease que pode ser clivado in vivo quando I-Sce1 é fornecido. Isto criará um produto de DNA linear que potencialmente pode ser integrado por NHEJ. Como descrito anteriormente, pode ainda haver vantagens de eficiência utilizando na clivagem in vivo de DNA dador quando NHEJ é usado.

[0516] A Figura 18a representa o DNA dadora de PD5-D1.3 de entrada e a Figura 18b representa o locus genômico de células do clone 6F incorporando sítio de "desembarque múltiplo". A Figura 18c representa a consequência da recombinação homóloga entre pD5-D1.3 (Figura 18a) e o sítio de desembarque múltiplo do clone 6F (Figura 18b). A Figura 18d, em contraste, representa a consequência de NHEJ. Neste caso, o DNA extra a partir da espinha dorsal do plasmídeo de entrada é incorporado (representadp por uma seta dupla). A recombinação mediada por Flp no sítio de "desembarque múltiplo" levará a um produto semelhante. A fim de determinar qual a rota está sendo utilizada com as amostras descritas no Exemplo 11 (mostrado na Figura 17) o DNA genômico foi preparado a partir da população selecionada por blasticidina tal como descrito antes. Um iniciador de PCR inverso (J44) foi concebido, que hibridiza com o promotor de PGK integrada. Isto foi utilizado em conjunto com J48 que hibridiza no final da proteína IgG. Os iniciadores J44 e J48 foram concebidos para revelar a recombinação homóloga produzindo uma banda de 1928bp quando I-Sce1 é responsável pela integração (indicada pela seta na Figura 18e). (Potencialmente uma banda de 5131 pb poderia ser produzida por este par de iniciadores quando NHEJ ocorreu, mas este produto já não era visível nos PCRs genômicos deste experimento).

[0517] O iniciador J46 foi concebido para hibridizar dentro do gene β-lactamase dentro da espinha dorsal do vetor. Os iniciadores J44 e J46 são antecipados para produzir uma banda de 1800bp quando NHEJ ocorreu. Uma banda de tamanho semelhante é esperada onde Flp recombinase levou à integração mediada por recombinase. J44: AAAAG CG CCTCCCCTACCCG GTAG AAT (SEQ ID NO: 92) J46: GGCGACACGGAAATGTTGAATACTCAT (SEQ ID NO: 93) J48: CACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTG (SEQ ID NO: 94)

[0518] A Figura 18e revela claramente que a recombinação homóloga ocorre apenas com as amostras tratadas com GFP TALEN e I-Sce1 meganuclease ((i e ii em comparação com iii e iv). Em contraste, NHEJ só ocorre quando a clivagem é efetuada por I-Sce1 meganuclease (Figura 18e v.), mas não GFP TALEN (Figura 18e vi). Conforme esperado, uma banda de tamanho similar é encontrada na amostra tratada com Flp recombinase (Figura 18e vii). Assim, este experimento revela que a integração direcionada por nuclease de uma cassete de anticorpo pode ocorrer tanto por recombinação homóloga como NHEJ.

[0519] Exemplo 13. Geração de fragmentos de anticorpo segregados e ligados a membranas a partir da mesma célula

[0520] Conforme descrito acima, os vetores de exibição de mamíferos pD2 e PD5 foram construídos com um éxon que codifica um domínio transmembrana flanqueado por dois sítios de reconhecimento ROX reconhecidos pela Dre recombinase [88]. A fim de determinar se era possível converter de uma forma ligada à membrana para uma forma segregada, a população resistente à blasticidina resultante da transfecção com o par pD2-D1.3/AAVS TALEN foi re- transfectada com o plasmídeo que codifica Dre recombinase (pCAGGs- Dre). Isto foi baseado no plasmídeo pCAGGS-Dre-IRES puro [88], que direciona o gene da Dre recombinase partir de um promotor CAGGs (GeneBridges A205). O gene de resistência à puromicina foi removido utilizando técnicas padronizadas de biologia molecular. Após 22 dias de seleção de blasticidina, as células foram definidas em 0,5 x 106 células/ml e foram transfectadas, conforme descrito anteriormente com 0,5 pg pCAGGS-Dre por 106 células. Após 6 dias, os sobrenadantes foram recolhidos, o anticorpo foi purificado utilizando proteína A e as amostras foram corridas num gel de SDS-PAGE e coradas com azul de Coomassie. A Figura 19a mostra que o anticorpo segregado foi encontrado no sobrenadante, mesmo sem transfecção com o gene de Dre recombinase. Isto pode resultar do splicing alternativo em que o éxon que codifica o domínio transmembrana é ignorado. Alternativamente, o anticorpo no sobrenadante da cultura pode surgir a partir da clivagem do anticorpo ligado à membrana. A transfecção de Dre recombinase aumentou o nível de anticorpo secretado (Figura 19a).

[0521] A produção de fusão scFv-Fc secretada também foi demonstrada no ensaio descrito no exemplo 7 (Figura 9h). As populações scFv de anticorpos selecionadas por 1 rodada exibição de fagos em β-galactosidase foram introduzidas no vetor PD6 e integram no locus AAVS de células HEK293 utilizando o AAVS TALEN. As células de ligação ao antígeno foram selecionadas por triagem de fluxo e as células selecionadas foram cultivadas durante 7 dias pós-triagem sem uma mudança de meio para permitir que anticorpo acumulasse. As placas de ELISA foram revestidas com β-galactosidase (10ug/ml) ou BSA (10ug/ml) durante a noite. Os sobrenadantes da cultura a partir de culturas de 7 dias foram misturados com um volume de 50% de 6% de Marvel-PBS e a amostra testada em triplicata. Uma diluição de 1/10 também foi testada. A detecção do limite de fusão scFv-Fc foi realizada utilizando anticorpos anti-IgG humana-Eu (Perkin Elmer, Cat 1244-330). A Figura 19b mostra que a ligação ao anticorpo pode ser detectada diretamente a partir dos sobrenadantes de cultura puros ou com uma diluição de 1/10. Isto ilustra que a exibição de superfície e a secreção de anticorpos podem ser alcançadas nas mesmas células, sem etapas adicionais. Será possível derivar anticorpo segregado diretamente a partir das células selecionadas após a clonagem de célula única ou utilizando uma população selecionada, conforme mostrado neste documento, para gerar uma mistura de anticorpos policlonais.

[0522] Exemplo 14. Um método simples para a conversão de scFvs em IgG ou formato de Fab

[0523] Um novo método foi inventado para efetuar a conversão de anticorpos formatados como scFv para um formato de IgG tal como descrito no Exemplo 7. Esta conversão é um processo necessário durante os projetos de descoberta de fármacos de anticorpos empregando bibliotecas de exibição de fagos de anticorpos scFv em que um anticorpo formatado por IgG ou Fab é necessário como o formato final. Os métodos atuais são tediosos e envolvem clonagem individual das cadeias pesadas variáveis (VH) e leves variáveis (VL) em vetores de expressão adequados. Além disso, a conversão de uma população de scFvs "em massa" não é possível porque a ligação entre as cadeias VH e VL é perdida. Este é um problema, porque ambas as cadeias VH e VL contribuem para a especificidade de ligação de antígeno. A incapacidade atual para converter facilmente as populações de scFv para Ig ou formato Fab limita a capacidade para triar grandes números de anticorpos no formato final que vai ser utilizado na prática clínica. A capacidade de triar anticorpos recombinantes no formato Ig ou Fab para ligação ao alvo, as triagens relatores de células e as propriedades biofísicas e função, incluindo estado de agregação, é um passo necessário para escolher os fármacos de anticorpos candidatos como candidatos clínicos. Quanto maior o número de anticorpos utilizados nesta fase, em formato IgG ou Fab, maior será a probabilidade de selecionar o melhor candidato a fármaco de anticorpo.

[0524] É de scrito neste documento um método para converter as populações de anticorpo de cadeia simples (scFv) em imunoglobulina (Ig) ou formato Fab de forma que os emparelhamentos de cadeia leve variável (VL) e pesada variável (VH) originais sejam mantidos. O método permite a conversão de scFvs monoclonais, oligoclonais ou policlonais simultaneamente em formato Ig ou Fab. De preferência, o método prossegue através da geração de um DNA "mini-círculo" não replicativo. Preferencialmente, o processo de conversão completa requer apenas uma única etapa de transformação de bactérias, tais como E. coli, para gerar uma população de colônias bacterianas onde cada colônia é portadora de um plasmídeo que codifica um único anticorpo recombinante formatado por Ig ou Fab. Isto é distinto de métodos alternativos que necessitam de duas etapas separadas de clonagem e transformação [1 17].

[0525] Em termos mais gerais, este aspecto da invenção refere-se a um método de conversão de um construto genético com 3 elementos genéticos ligados A, B e C (representados pela VH, ligante e VL, respectivamente, no caso de um scFv) para um formato em que a ordem dos elementos que flanqueiam (A e C) são invertidos, em uma única etapa de clonagem. O elemento intermediário poderia ser retido, mas de forma mais útil, o método permite a substituição deste elemento intermediário por um novo elemento D (para resultar em C-D-A). No exemplo da conversão de um scFv em um IgG ou Fab, então, C é um domínio VL de anticorpo e A é um domínio VH. Neste exemplo, o elemento D encapsula um domínio constante de cadeia leve, sítio poli A, promotor e sequência líder fundida ao VH (elemento A). No processo, o produto (C D-A) é re-clonado permitindo que as sequências flanqueadoras também sejam alteradas. No exemplo de conversão de scFv para IgG, o elemento VL é precedido por uma sequência de promotor e líder e o VH é seguido por um domínio CH1-CH2-CH3, no caso de anticorpos formatados por IgG e por um domínio CHi no caso de anticorpos formatados por Fab. O método poderia ser aplicado de forma mais ampla, onde os elementos A e C (utilizando a nomenclatura acima) poderia representar outros elementos genéticos, por exemplo, na construção de proteínas com permutação de forma circular onde o N e C terminais originais são fundidos e novos terminais internos são modificados.

[0526] A Figura 21 ilustra esquematicamente o processo de conversão usando conversão scFv para IgG como um exemplo. Um inserto de DNA (a) que codifica os domínios VH e VL de anticorpo está ligado com o fragmento de DNA (b) que codifica uma cadeia leve constante (CL), uma sequência de poliadenilação (pA) um promotor de citomegalovírus (CMV) e um peptídeo de sinal (SigP). O fragmento de DNA (b) também poderia codificar qualquer promotor no lugar do promotor de CMV. Além disso, a cassete de pA-CMV poderia ser substituído por sítios internos de entrada ribossômica (IRES) [19] ou de um peptídio pequeno de "auto-clivagem" tipo 2A [130, 133]. A junção de moléculas de DNA (a) e (b) para criar um "mini- círculo" de DNA não replicativo (c) é facilitada através de uma ligação de "extremidade-pegajosa". Na Figura 21, os sítios Ncol e Notl são empregados porque estes foram utilizados na criação da biblioteca de exibição de fagos McCafferty [7], no entanto, quaisquer sítios de restrição apropriados pode, ser usados para criar o "mini-círculo" não replicativo c. Após a ligação, o "mini-círculo" c é linearizado com as enzimas de restrição Nhel e Xhol, os sítios de reconhecimento que flanqueiam o ligante entre os domínios VH e VL. NheI e XhoI foram escolhidos para ilustrar a presente invenção porque eles foram usados na criação da biblioteca de exibição de fagos McCafferty [7], no entanto, quaisquer sítios de restrição adequados poderiam ser utilizados.

[0527] O produto linearizado d é então purificado e ligado com o vetor digerido (e). O vector (e) inclui um CMV ou promotor pEF e sequência de sinal a montante do sítio NheI e codifica os domínios 1 a 3 pesados constantes (CH) a jusante do anticorpo do sítio XhoI. O vetor também poderia codificar uma origem bacteriana ou de replicação e marcador de resistência à antibiótico (não mostrado) para permitir a seleção e a replicação do DNA de plasmídeo resultante em bactérias. O produto de ligação de inserto (d) com vetor (e) resultará no plasmídeo f que podem ser utilizados para transformar bactérias e o crescimento com um marcador selecionável adequado permitiria a produção e purificação de DNA de plasmídio através de métodos padronizados. Plasmídeo f purificado pode ser introduzido em células de mamíferos [134] para expressão heteróloga de anticorpos Ig. Alternativamente, o DNA que codifica CH1-3 no vetor (e) poderia ser substituído com DNA que codifica um único domínio Cm de expressão de Fab.

[0528] Na descrição detalhada do método abaixo utilizado para ilustrar esta invenção, o inserto b contém um promotor de CMV ou um peptídeo P2A que permite a expressão de cadeias leves e pesadas de anticorpos separados a partir de um único RNA mensageiro (mRNA). O método não é óbvio e foi refinado depois de várias tentativas experimentais. Por exemplo, inicialmente, a linearização do DNA "mini-círculo" (c), foi tentada por PCR. No entanto, isso resultou na amplificação de produtos secundários de homo-dímero, resultando em um baixo rendimento do produto desejado (d). Em contraste, a digestão direta do DNA "mini-círculo" (c) proporcionou material suficiente (d) para permitir que o método seja implementado com sucesso. Em segundo lugar, em uma tentativa de impedir os produtos indesejados do homo- dímero, o inserto (a) foi inicialmente desfosforilado. No entanto, foi necessário um controle cuidadoso para evitar que a digestão da "extremidade", resultando em produto sem as desejadas "extremidades pegajosas" para a ligação. O método ideal não inclui a desfosforilação para maximizar a proporção do produto de ligação competente. Finalmente, um controle cuidadoso das proporções utilizadas na ligação de insertos de DNA (a) e (b) foi necessário para se maximizar o rendimento do DNA"mini-círculo" (c).

[0529] 1. Preparação de insertos scFv por PCR

[0530] A partir de um estoque de glicerol bacteriano, DNA de plasmídeo de ancoragem que codifica scFv foi raspado em 50ul de água. Diluir este 1 em 10. Utilizar 5ul deste para reação de PCR contendo iniciador de avanço pSANGlOpelB (CGCTGCCCAGCCGGCCATGG SEQ ID NO: 95) (2,5 μl, 5 μM), iniciador reverso 2097 (GATGGTGATGATGATGTGCGGATGCG SEQ ID NO: 96), (2,5 μl, 5 μM), tampão 10x KOD (kit de inicialização à quente KOD da Merck, 71086-4), dNTPs (5 μl, 2 mM), MgSO4 (2 μl, 25 mM), polimerase de inicialização à quente KOD 2,5 unidades) em um volume total de 50 μl. As condições de ciclagem foram de 94°C durante 2 min, depois 25 ciclos de 94°C em 30 seg, 54°C durante 30 segundos, em seguida 72°C durante 1 min. A limpeza do PCR foi realizada por coluna de centrifugação (Qiagen ou Fermentas) e as reações de PCR eluídas em 90 μl. A Figura 22a mostra 1μl de reação de PCR carregada sobre um gel de TBE agarose a 1%. O DNA purificado de scFv (80 μl, 8 μg) foi digerido através da adição de tampão 4 (New England Biolabs), BSA (0,1 mg/ml) e 40 unidades de Ncol-HF e Notl-HF em um volume total de 100 μl e incubado durante 2 horas a 37°C. Os insertos foram purificados com o kit de limpeza de PCR da Qiagen, eluídos em 30 μl e a concentração de DNA medida pela medição da absorvância a 260 nM com um espectrofotômetro nanoDrop (Thermo).

[0531] 2. Ligação de insertos de DNA (Figura 21 a e b)

[0532] A reação de ligação é realizada para produzir o DNA "mini-círculo" (Figura 21 c). A reação de ligação contém inserto b (125 ng), inserto scFv (Figura 21) (125 ng), 10x tampão de ligação (kit T4 DNA ligase da Roche, 1,5ul), T4 DNA ligase (1 unidade) em um volume total de 15 μl. Incubar 1-2 h a 21°C. Água (35 μl) foi adicionada à mistura de ligação e purificada com um kit de limpeza de PCR da Qiagen e eluída em 30 μl.

[0533] 3. A digestão do DNA "mini-círculo" (Figura 21c) com Xho1/Nhe1

[0534] A reação de ligação purificada (28 μl) é digerida pela adição de tampão 4 (New England Biolabs, 3,5 μl), BSA (0,1 mg/ml) e 10 unidades de Ncol-HF e Notl-HF em um volume total de 35 μl e incubada durante 2 horas a 37°C. Este é, em seguida, purificado por separação em uma de agarose TBE a 1% (Figura 22b). Alternativamente, a Figura 22c mostra uma "mini-círculo" linearizado que contém uma sequência de P2A no lugar de um promotor de CMV. A banda de DNA de 2,6 kb (Figura 22b) é excisada e purificada com kit de extração de gel Qiagen e eluída em 30 μl.

[0535] 4. A ligação de "mini-círculo" de DNA linearizado d com vetor de plNT3 (corte de Nhel/Xhol) e transformação de E. coli DH5α.

[0536] A ligação padrão foi preparada com vetor de corte de plNT3 (50 ng), d "mini-círculo" linearizado (20ng), tampão de ligase de 10x (Roche, 1,5 μl) e 1 unidade de ligase de DNA de T4 (NEB) em um volume final de 15 μl. A incubação foi a 21 °C durante 2 horas. A transformação de células quimicamente competentes de E. coli DH5alpha, a eficiência de subclonagem, (Invitrogen, cat. 18265017) foram de acordo com as instruções do fabricante. 80 μl de células DH5a quimicamente competentes foram adicionadas a uma mistura de ligação de 6 μl, colocadas em gelo durante 1 hora e submetidas à choque térmico a 42 °C por 1 minuto, geladas por 2 minutos e então transferidas para um tubo de polipropileno de 14 ml contendo 900 μl de meios SOC e incubadas a 37°C para 1 hora e plaqueadas em placas de LB amp.

Exemplo 15: Construção de grandes coleções de apresentação em células de mamífero através de integração direcionada por nuclease utilizando eletroporação de fluxo

[0537] A eletroporação é uma forma eficiente de introdução de DNA, RNA e proteína em células e sistemas de fluxo de eletroporação permitem a introdução eficiente de DNA em grandes números de células de mamíferos. Por exemplo, o "MaxCyte STX Scalable Transfection System" (MaxCyte) permite a eletroporação de1010 células dentro de 30 minutos, criando o potencial para transfecção de até 1011 células em um dia. As células e o DNA foram misturados e passados a partir de um reservatório para uma câmara de eletroporação, eletroporados, bombeados e o processo foi repetido com uma alíquota fresca de células e DNA. O mesmo método pode ser aplicado para a introdução de DNA, RNA, proteína ou misturas dos mesmos em células de cultura (por exemplo, células HEK293 humanas ou células Jurkat) ou células primárias, por exemplo, linfócitos humanos [135]. A eletroporação de fluxo foi utilizada para introduzir de forma eficiente o DNA, RNA e proteína em um grande número de células primárias e em cultura.

[0538] Aqui exemplificamos da utilização de um tal sistema para introduzir DNA dador, que codifica os genes de anticorpos, por co-transfecção com DNA que codifica um par de nucleases TALE direcionado para o locus AAVS humano de células HEK293 humanas e células Jurkat.

[0539] A distribuição das 2 especificidades de anticorpos diferentes foi determinada por citometria de fluxo utilizando o antígeno marcado de modo fluorescente. A geração de anticorpos que reconhecem os receptores do polipeptídeos FGF FGFR1 ou FGFR2 foi descrita anteriormente [105]. Os clones α-FGFR1_α e um-FGFR2_A (aí descrito) foram clonados em pD6 como descrito no exemplo 6. Além disso, uma população de anticorpos de scFv selecionados a partir da biblioteca de apresentação de fagos "McCafferty" [7], utilizando um ciclo de apresentação de fagos em β-galactosidase (β-gal) foram também clonados para este vetor (tal como descrito no exemplo 6).

[0540] As células HEK293 foram centrifugadas e re-suspensas em um volume final de 108 células/ml em tampão de eletroporação do fabricante (tampão de eletroporação Maxcyte, Thermo Fisher Scientific Cat. No. NC0856428)). Uma alíquota de 4 x 107 células (0,4 ml) foi adicionada à cuveta de eletroporação com 100 ig de DNA (isto é, 2,5 μg/106células). Os valores dos diferentes componentes utilizados são mostrados abaixo. Os anticorpos de codificação de DNA dador α-FGFR1_A e α-FGFR2_A foram fornecidos como uma mistura equimolar com a quantidade total por 106 células mostrada na Tabela 6 abaixo. O DNA que codifica AAVS-SBI TALENS (PZT-AAVS1 L1 e PZT-AAVS R1 Sistemas Cat Bioscience. No. GE601A-1) foi utilizado como uma mistura equimolar com a quantidade total por 106 células mostradas na Tabela 6 abaixo. Em amostras sem adição de TALENS, o DNA de entrada foi trazido a 2,5 μg /106 células utilizando o plasmídeo de controle pcDNA3.0.

[0541] A porcentagem de eficiência de transfecção foi calculada por meio de contagem do número de colônias de blasticidina alcançadas por uma dada entrada de células totais. A diferença de vezes comparada com controles negativos (isto é, sem DNA TALEN adicionado) é mostrada entre parêntesis. Finalmente, o número de colônias transformadas que pode ser obtido com a execução de um ciclo completo do sistema MaxCyte, envolvendo eletroporação de 1010 células é calculado na última coluna. Isto representa um único ciclo de aproximadamente 30 minutos, dando o potencial de executar vários ciclos por dia. Assim, a produção diária pode ser 5 a 10 vezes de mais elevada. Os grandes sistemas de fermentação e de cultura, tais como sistema de escala Wavebag (GE Healthcare) ou o sistema Celltainer (Celltainer Biotech) podem ser utilizados para gerar células para transfecção e podem ser utilizados para cultivar as bibliotecas resultantes. Tabela 6. Eletroporação de células HEK293

[0542] Este exemplo demonstra que é possível fazer bibliotecas muito grandes de células com cassetes de anticorpos integrados. A eficiência de transfecção varia de 2,7 a 6,1%. No caso da população selecionada de β- galactosidase (amostra 13), uma biblioteca de 5,5 x 108 clones pode ser criada em uma única sessão eletroporação de fluxo. Com mais de uma sessão por dia, uma biblioteca de 2-5 x 109 clones pode ser gerada.

[0543] Após 13 dias de seleção de blasticidina as células foram marcadas com anticorpo anti-Fc marcados com ficoeritrina (BioLegend, Cat. N ° 409304) tal como descrito anteriormente. Da população de anticorpo selecionada de β-galactosidase, 34-36% das células foram positivas para a expressão de Fc e 11-13% foram positivas para a ligação de antígeno Dyelight-633 marcado na concentração de 10 nM.

[0544] Onde foram utilizados clones de ligação FGFR, 98-99% das células foram positivas para a expressão Fc. A utilização de uma mistura de anticorpos α-FGFR1_A e α- FGFR2_A fornece uma oportunidade para examinar a proporção de células contendo múltiplos eventos de integração. Para uma célula individual com uma cassete corretamente integrada (por exemplo, α-FGFR1_A) há aproximadamente uma probabilidade de 50:50 que uma segunda integração será da especificidade alternativa (isto é, α-FGFR2_A). Se existem frequentes integrações múltiplas, em seguida, a porcentagem de clones duplamente positivos será elevada, no entanto, a proporção de clones duplamente positivos não foi encontrada para ser elevada, que ilustra a fidelidade do sistema de integração de biblioteca direcionada por nuclease para gerar um anticorpo/gene por célula. A capacidade dos anticorpos anti- FGFR apresentados na superfície para se ligar especificamente a um antígeno adequado foi confirmada. A expressão de antígeno foi a partir de um plasmídeo pTT3DestrCD4 (d3+ 4) - His10 [134] codificando o ectodomínio Fgfrl de rato(ENSMUSP00000063808). Este foi utilizado para transfectar células em suspensão HEK293 e segregar Fgfrl -rCd4 His10- purificadas por cromatografia de afinidade com metal imobilizado, como descrito anteriormente [134]. O ectidimínio Fgfr2 de rato foi amplificado por PCR a partir do clone IMAGE 9088089 utilizando os iniciadores: 2423 (TTTTTTCCATGGGCCGGCCCTCCTTCAGTTTAGTTGAG) (SEQ ID NO: 97) e 2437 (TTTTTTGCGGCCGCGGAAGCCGTGATCTCCTTCTCTCTC) (SEQ ID NO: 98), digerido com NcoI / NotI e clonado no plasmídeo de expressão pBIOCAM5 [126]. FGFR2-Fc foi expresso por transfecção transitória de células HEK293 conforme descrito anteriormente [134] e purificado por cromatografia de afinidade.

[0545] As populações transfectadas foram sondadas para dupla ligação utilizando ambos os antígenos marcados e a proporção de positivos duplos foi baixa. Nesta experiência o equilíbrio ideal do tamanho da biblioteca (2,7 x 108 clones / por sessão MaxCyte) com baixo percentual de positivos duplos (3,5%) foi encontrado utilizando 97 ng de DNA dador por 106 células (Figura 23).

[0546] Esta proporção de positivos duplos pode representar erros de incorporação de uma segunda cassete do anticorpo, mas, dada a eficiência da integração direcionada por nuclease da biblioteca também é possível que ambos os alelos (o locus AAVS neste exemplo) possam ser orientados com ligantes de entrada em um proporção de células. A presença dos dois genes de anticorpo diferentes dentro de uma célula em si mesmo não impede o isolamento de ligantes ou seus genes codificantes, mas isto pode ser contornado pela primeira modificação da célula alvo em um único locus para introduzir uma única nuclease local de direcionamento, por exemplo, um local de meganuclease Sce1 pré-integrado como demonstrado a seguir no exemplo 9.

Exemplo 16. A recuperação de genes que codificam ligantes de populações de biblioteca ordenadas.

[0547] As seleções de apresentação de fagos foram realizadas em β-galactosidase (como descrito no exemplo 6) e populações de anticorpo a partir de 1-2 ciclos de seleção foram clonadas no vetor pD6 e introduzidas no locus AAVS de células HEK293 como descrito no exemplo 6. β- galactosidase foi marcada por meio de utilização de Lightning Link Dyelight-633 (Innova Bioscience Cat. No 325-0010) de acordo com as instruções do fabricante. As populações de células transfectadas foram selecionadas durante 25 dias em blasticidina (10 μg / ml) e foram marcadas com 10 nM de β- galactosidase marcada por Dyelight-633 e anti-Fc marcado com ficoeritrina (Cat BioLegend No. 409304). As células foram incubadas com anticorpos durante 30 minutos a 4 ° C, lavadas duas vezes em PBS / BSA a 0,1%, re-suspensas em PBS / BSA a 0,1% e células duplamente positivas selecionadas utilizando um selecionador de fluxo.

[0548] As células selecionadas foram expandidas e uma segunda ronda de triagem foi realizada utilizando antígeno de 10 nM. As células foram cultivadas e tanto o DNA genômico ou mRNA foram isolados a partir de populações separadas selecionadas.

[0549] Onde ligantes que abrangem diferentes correntes (por exemplo, IgG de anticorpos formatados) estão presentes na mesma sequência genômica (por exemplo, por introdução no mesmo plasmídeo), mas são transcritos em diferentes mRNAs que podem ser otimizados para recuperar os genes distintos que codificam o ligante multimérico por amplificação a partir de DNA genômico. Como uma alternativa, aglutinantes, abrangendo várias cadeias de proteínas podem ser codificados no mesmo mRNA através da utilização de elementos de "sequência de entrada de ribossomo interno" (IRES) ou sequências, tais como sequências virais P2A ou T2A que promovam a clivagem estol/ proteína translacional [133, 136]. Neste caso e no caso de pastas de codificados em uma única cadeia de proteína, também irá ser possível isolar genes a partir de mRNA codificados.

[0550] O DNA genômico foi preparado usando o "kit de sangue e tecido DNeasy" (QIAGEN Cat. No. 69504). O mRNA foi preparado por meio de utilização de um "Mini Kit de RNA II isolado" (Bio-Bioline 52072). Para a amplificação a partir de DNA genômico, uma reação de PCR foi criada utilizando polimerase de fusão com a mistura "2xPhusion GC" de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores que flanqueiam os sítios de clonagem Nco1 e Not1, por exemplo, os iniciadores 2622 (GAACAGGAACACGGAAGGTC) (SEQ ID NO: 99) e 2623 (TAAAGTAGG CG GTCTTG AG ACG) (SEQ ID NO: 82) foram utilizados para amplificar a cassete de anticorpo (sees 98 °C 10, sees 58 ° C 20, sees 72 ° C 90 durante 35 ciclos.

[0551] Os genes que codificam genes de scFv selecionados foram amplificados a partir de mRNA. O RNA total foi isolado a partir das células separadas usando o "Isolate ARN II Mini Kit" (Bioline Cat. Bio-52072). O cDNA foi sintetizado a partir de RNA 2μg utilizando Superscript II de transcriptase reversa (Life Technologies, N ° Cat 180064022). Os genes de scFv selecionados foram então amplificados a partir do cDNA por PCR utilizando polimerase de DNA de KOD Hot Start (Merck Millipore Cat. No. 71086-3) utilizando iniciadores que flanqueiam os sítios de clonagem Nco1 e Not1. Neste caso, os iniciadores: 41679 ATGAGTTGGAGCTGTATCATCC (SEQ ID NO: 100) e 2621 L CATTCCACG G CGG CCG C (SEQ ID NO: 101) foram utilizados para amplificar a cassete de anticorpo (95 ° C durante 20 segundos, 60 ° C durante 10 segundos, 70 ° C durante 15 segundos, durante 25 ciclos). Os produtos de PCR foram digeridos com Nco1 e Not 1, antes da clonagem no sítio Nco1 / Not1 do vetor de expressão de anticorpo bacteriano pSANG10. A construção de pSANG10, métodos para expressão bacteriana e rastreio por ELISA são descritos em Martin et al 2006 [127].

[0552] ELISA de rastreio da população a partir de 1 rodada de seleção por apresentação em fagos revelaram que 0/90 dos clones foram positivos. Em contraste, quando esta mesma população foi ainda submetida à apresentação de mamífero e a população gene de scFv foi recuperada e separada, 27/90 clones (30%) foram positivos em ELISA. Isto ilustra que é possível proceder a apresentação de mamífero em uma biblioteca e recuperar uma população enriquecida de ligantes.

[0553] O exemplo 15 descreve a introdução da população selecionada por uma ronda de apresentação de fagos em β-galactosidase em células HEK utilizando eletroporação de fluxo. A população de células de mamífero foi selecionada da apresentação em blasticidina como anteriormente e foi submetida à triagem de fluxo utilizando 10 nM de β- galactosidase marcada. Após 9 dias de crescimento, 75% de células foram obtidas por citometria de fluxo a ser positiva para a ligação a 10 nM utilizando β -galactosidase) β- galactosidase. Estes foram ordenadas e expandidas ainda mais. Para ilustrar o potencial para conduzir a severidade, a marcação foi realizada utilizando 1 nM ou 10 nM concentrações de antígeno. 20,3% e 55,9%, respectivamente, das células foram classificadas a partir de cada população. Após a triagem, o mRNA foi selecionado imediatamente da população classificado sem cultura de células adicionais. Após a clonagem, a expressão em bactérias e ELISA de rastreio (como antes), verificou que a taxa de sucesso em ELISA aumentou com o aumento da severidade durante a classificação do fluxo. Os clones que apresentam maior nível de sinal vieram deste grupo e o número de clones positivos foi também melhorado (Figura 24). Isto ilustra a capacidade de conduzir severamente a seleção dentro das populações de apresentação, refletido no melhor desempenho dos anticorpos resultantes.

Exemplo 17. Incorporação de genes receptores de células T (TCRs) para produção de biblioteca de mamíferos por integração direcionada de nuclease

[0554] Os métodos aqui descritos têm aplicação para além de apresentação de anticorpos. Para demonstrar o potencial para o rastreio de bancos de receptores de células T, utilizando a integração direcionada de nuclease, construiu-se uma construção de vetor (plNT20) que permite a expressão de receptores de células-T.

[0555] O plNT20 (Figura 25a) é um vetor duplo promotor para direcionar o locus AAVS humano. Ele tem braços de homologia esquerdo e direito, tal como apresentado na figura 3. O braço de homologia esquerdo de AAVS é flanqueado por locais únicos de AsisI e Nsi1 e é seguido por um aceitador de splicing e um gene puromicina. A sequência entre a extremidade do braço de homologia esquerdo e o aceitador de splicing é o mesmo conforme anteriormente descrito e o gene da puromicina começa com um ATG em grelha com o exon a montante ((Figura 25B e como também mostrado para o gene blasticidina na Figura 3) . A integração direcionada de nuclease correta vai levar a splicing em grelha de um gene puromicina que é excisado para um exon a montante endógeno que se conduzida pelo promotor endógeno de AAVS permitindo a seleção de clones com integração correta. O gene de resistência à puromicina é seguido por um local de poliadenilação de SV40. O braço de homologia de AAVS correto é flanqueado por locais únicos BstZ171 e Sbf1.

[0556] plNT20 está configurado com um promotor pEF (de pSF-pEF, Oxford Cat Genetics. No. OG43), que permite que os genes de interesse sejam clonados em sítios Nhe1 / Kpn1. O local Nhe1 é precedido por uma sequência líder de secreção e o local Kpn1 é seguido pelo sinal de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino (bGH poli A) tal como anteriormente mostrado na Figura 2. A jusante, está um promotor CMV (a partir de pSF-CMV-f1-Pac1, Oxford Genética N ° Cat OG111) permitindo a clonagem por meio de Ncol e Not (como mostrado na Figura 2) ou Hind3. O local Nco1 é precedido por uma sequência líder de secreção e a cassete é seguida por um local de bGH polyA.

[0557] Para exemplificar a apresentação e enriquecimento de receptores de células T (TCRs), um TCR que reconhece um marcador de câncer descrito por Li et al. (2005) e mais tarde por Zhao et al. foi utilizado (2007) [137, 138]. Este TCR chamado c12c2 reconhece o peptídeo SLLMWITQV (SE ID NO: 102), apresentado em HLA-A2 com uma afinidade de 450 nM. Este peptídeo representa os resíduos 157-165 de NY-ESO-1 (NY- ESO-1 157-165). Esta é uma variante de afinidade amadurecida, de um anticorpo parental chamado 1 G4 com a afinidade de 32 μM.

[0558] Um segundo TCR foi utilizado, o que reconhece outro marcador de câncer. O MEL5 TCR parental reconhece o peptídeo MART-1 26-35 ("antígeno de Melanoma reconhecido por células T -1") apresentado em HLA-A2 com a sequência de peptídeo ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 103). Este TCR foi maturado por afinidade por apresentação de fagos para dar clone α24 / β17 com uma afinidade de 0,5 nM descrita in Madura et al. (2013) [139]. A estrutura do complexo entre o TCR e MHC: complexo de peptídeo foi resolvido (código pdb 4JFH) e o clone é a seguir denominado como "4JFH". O mesmo TCR parental também foi projetado com base no projeto por Pierce et al. (2014) [140] e a estrutura do complexo resolvido.

[0559] De acordo com Debets e colegas a fixação do domínio de CD3 Z, como mostrado, tende a causar associação do gene heterólogo mesmo na presença de TCRs humanos nativos [141, 142]. O elemento CD3 Z utilizado é composto de um domínio extracelular, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático completo. Em substituição da adição de domínios constantes humanos por domínios constantes de rato nos genes heterólogos, também tende a conduzir a sua associação sobre associação com domínios constantes humanos endógenos [143]. Finalmente, o uso de domínios constantes de rato oferece a opção de detectar as cadeias de TCR heterólogas contra um fundo de TCRs humanos. Estes elementos foram incorporados ao projeto da cassete de expressão TCR.

[0560] Dois genes sintéticos foram concebidos e sintetizados dando origem a construções de genes com a seguinte estrutura: TCR humano vα-rato um CD3 Z humano constante TCR humano vβ rato-β CD3 Z humano constante

[0561] A sequência do gene sintético que incorpora a cadeia e os construtos de cadeia β que incorporam os domínios variáveis de c12/c2 é mostrada na Figura 25c e d. Estesw são clonados nos sítios de Nhe1/Kpn1 e nos sítios de Nco1/Hind3 de pINT20 respectivamente. O construto que codifica esse TCR é chamado plNT20-c12 / c2. No primeiro exemplo, o gene sintético foi concebido para incorporar um domínio Vα Cα (flanqueado pelos locais de Nhe1 e Not1) e \domínio β (flanqueado por locais de Nco1 / Xho1 que codificam para o TCR c12 / c2). Estes elementos podem, então, ser substituídos por TCR alternativos utilizando estes locais de restrição.

[0562] Dois genes sintéticos adicionais foram feitos para codificar os domínios p Vα e Vβ de 4JFH [139] (Figura 25e e f). O construto que codifica esse TCR é chamado plNT20-4JFH.

[0563] Células HEK293 107 foram transfectadas utilizando 3μg de plNT20-c12 / c2 e plNT20-4JHF como DNA dador (300 ng de DNA dador por 106 células) nas proporções mostradas na Tabela 7. plNT20-c12/c2 é referido como TCR1 e plNT20-4JHF é referido como TCR2. 5 pg de cada de PZT-AAVS1 L1 e pZT- AAVS R1 TALENS foram adicionados à células de 107 (500 ng cada por 106 células) com a exceção da amostra 6, em que esta foi substituída por 10 pg de DNA de controle (pcDNA3.0). O DNA foi introduzido por transfecção de polietilenoimina, tal como descrito acima. Tabela 7

[0564] Após 12 dias de seleção de células (0,25μg / ml de puromicina) foram marcadas com antígeno alvo. O peptídeo: complexos de MHC reconhecidos pelo TCR descritos acima são apresentados como um pentâmero marcado com ficoeritrina (Proimmune). C12/C2 reconhece o peptídeo SLLMWITQV apresentado em HLA-A2 que representa o NY-ESO-1 157-165 (código de produto Proimmune 390). 4JHF (também conhecido como α24 / β17) reconhece o peptídeo ELAGIGILTV apresentado em HLA-A2 que representa MelanA/MART 26-35 (código de produto Proimmune 082). Em cada caso, o MHC: o complexo de peptídeo foi marcado com ficoeritrina e utilizado de acordo com as instruções do fabricante. A Figura 26 (a- d) mostra que cada TCR é específico para o MHC esperado: o complexo de peptídeo (a, d) e não se liga ao peptídeo não cognato no complexo (Figura 26b, c). O DNA que codifica cada TCR foi misturado com um excesso de 100 vezes de DNA que codifica o outro (amostras 1-2, Tabela 7). As células HEK293 foram transfectadas e selecionadas em puromicina. Triagem de células positivas de antígeno foi realizada depois de 14 dias de seleção de puromicina (Figura 26 g, h).

[0565] De modo a quantificar o nível de enriquecimento de saída dentro das populações de classificação por fluxo, os genes de TCR foram recuperados através de amplificação por PCR e as quantidades relativas de cada uma das espécies de TCR determinadas após clonagem. O RNA total foi isolado a partir da população classificada. A síntese de cDNA foi realizada como descrito no exemplo 16. Os iniciadores para amplificar ad cadeiad alfa e beta de TCR foram 1999/2782 e 41679/2789, respectivamente (Tabela 8). A amplificação por PCR empregou a polimerase KOD hot start utilizando o protocolo recomendado pelo fabricante (EMD Millipore, 71086, EMD Millipore). As condições de reação de PCR foram de 95 °C (2 minutos) e 25 ciclos de 95 °C (20s), 60 °C (10 s), 70 °C (15s), seguidos de 70 °C (5 minutos). As cadeias alfa e beta de TCR amplificadas foram digeridas com NheI / NotI ou NcoI / XhoI e subclonadas em vetores com locais compatíveis (neste caso, vetores de corte pBIOCAM1-Tr- N Nhel/Notl ou pBIOCAM2-Tr-N (Ncol/Xhol), respectivamente). PCR de clones individuais foram amplificados com um iniciador alfa de TCR específico de c2c12 (TCR1) ou iniciadores alfa de TCR específicos(2781) de 4JFH (TCR2) e iniciadores específicos de vetor para testar a identidade de clone de TCR. Após a classificação da amostra 1 (Tabela 7) onde uma razão de 1:100 de TCR1/TCR2, o plasmídeo dador foi empregado (Tabela 7) com enriquecimento para clones específicos de TCR1 utilizando peptídeos SLLMWITQV apresentados em HLA-A2 (códio de produto 390, Proimmune), a proporção de clones de TCR1, como determinado por PCR colônia, aumentou para 115/15 (73%). O enriquecimento por classificação da amostra 2, em que uma razão de 100:1 de TCR1/TCR2, o plasmídeo dador foi empregado (Tabela 7), com peptídeo ELAGIGILTV apresentado em HLA-A2 (código de produto 082 Proimmune) resultou em um aumento na proporção de clones de TCR2 para 4/15 (27%), determinado por PCR de colônia.

[0566] Para demonstrar seleção de biblioteca utilizando a integração direcionada de nuclease, uma biblioteca de genes mutantes com base em C12/C2 foi criada por clonagem de um repertório de genes que codificam as cadeias alfa de TCR mutantes, juntamente com um repertório de genes que codificam as cadeias beta de TCR mutantes. Tal biblioteca pode ser criada utilizando abordagens de mutagênese direcionada por oligonucleotídeos, por exemplo, os métodos baseados em mutagênese de Kunkel [144]. Como uma alternativa e a título de exemplo, uma abordagem de estrutura por PCR foi utilizada para criar uma cadeia alfa mutante de TCR (tal como um fragmento de Nhe1 / Kpn1) e uma cadeia beta mutante de TCR (tal como um fragmento de Kpnl / Hind 3, incluindo o promotor de CMV) que é clonada no local de Nhe1 / Hind 3 de plNT20. Isto foi feito utilizando os iniciadores mostrados na Tabela 8. (N= A, C, G, T. S= C OU G, W =A OU T) Tabela 8. Iniciadores utilizados na construção da biblioteca e a recuperação do clone

[0567] Um oligonucleotídeo mutante foi concebido (iniciador 2771), que randomizou 2 posições de amino ácidos dentro de CDR3 da cadeia alfa de c12/c2 e fornece a opção de tanto serina quanto de treonina em outra posição (iniciador 2771 é também representado pela cadeia inferior da Figura 25g). O iniciador 2771 foi utilizado em conjunto com o iniciador 2780 para criar repertório alfa de TCR mutante indo a partir do local de clonagem Nhe1 que incorpora a região de mutagênese de CDR3 com uma sequência invariante na extremidade. O iniciador 2781 é complementar à extremidade invariante 5' de iniciador 2771. PCR com iniciadores 2781 e 2783 forneceram o restante da cassete zeta de alfa-CD3 de TCR até o local de Kpn1. A estrutura de PCR dos fragmentos de PCR 2 é utilizada para criar o fragmento de zeta de alfa-CD3 de TCR, que pode ser clonado em plNT20 após digestão com Nhe1 e Kpn1.

[0568] Um segundo oligonucleotídeo mutante (iniciador 2770) foi designado, o que randomizou 2 posições de amino ácidos dentro de CDR3 da cadeia beta c12/c2 e fornece a opção de tanto valina quanto leucina em outra posição (iniciador 2770 representado pela cadeia inferior da Figura 25h). O iniciador 2770 foi utilizado em conjunto com o iniciador 2785 para criar um repertório de TCR beta mutante a partir do local de clonagem de Kpn1 incorporando a região CDR3 de mutagênese com uma sequência invariante na extremidade. O iniciador 2787 é complementar à extremidade invariante de 5' do iniciador 2700. PCR com iniciadores 2787 e 2788, sendo fornecido o restante da cassete zeta de beta- CD3 de TCR até o local de Hind 3. A estrutura de PCR destes 2 fragmentos de PCR é utilizada para criar uma fragmento de zeta de beta-CD3, que pode ser clonado em plNT20. Um repertório completo que incorpora mutações em ambas as CDR 3 de cadeias alfa e beta foi criado por clonagem do fragmento de Nhe1 / Kpn, o fragmento de Kpn1 / Hind3 em pINT20 digerido de Nhe1 / Hind3 plNT20. Após a ligação, a biblioteca foi clonada em células DH10B eletrocompetentes. O DNA de plasmídeo foi preparado e o DNA transfectado para as células HEK293 juntamente com vetores que codificam a nuclease TALE, tal como descrito anteriormente (uma mistura equimolar de PZT-AAVS1 L1 e PZT-AAVS R1 Systems Bioscience Cat. No. GE601A-1).

[0569] Seguindo a ligação das cadeias alfa e beta mutantes da biblioteca mutante de c12/c2 em pINT20, o DNA foi eletroporado em célula DH10B, o DNA plasmídeo foi preparado e a biblioteca foi co-transfectada com nuclease TALE direcionada ao locus AAVS. A transfecção foi realizada utilizando eletroporação MaxCyte. Crescimento e seleção foram como descrito acima. A quantificação do tamanho da biblioteca, por titulação de células transfectadas e seleção à base de placas em puromicina, indicaram que um tamanho de biblioteca de 5x 10 5 foi criado. Após seleção de puromicina durante 11 dias as células foram marcadas com um anticorpo marcado específico de APC-à cadeia β do TCR de rato (Life Technologies Cat H57-957). A Figura 26 i-j 38% dos clones na população expressam um receptor das células T. Desta população positiva de TCR, 13% também ligou-se ao peptídeo 1 (5% do total da população). Por esta abordagem, os clones com maior expressão ou peptídeo: atividade de ligação do MHC podem ser isoladas.

[0570] A partir da figura 26 pode-se ver que cada receptor da célula T reconheceu apenas o seu antígeno cognato. Além disso, quando uma mistura das duas especificidades diferentes é utilizada, é possível distinguir cada uma delas através do antígeno marcado. Esta abordagem também permite que os clones de TCR com afinidade melhorada (ou expressão) a serem distinguidos na biblioteca mutante de TCR através da identificação de um subconjunto da biblioteca que foi marcado para uma extensão maior do que os genes de receptores de células T do clone parental que foram também introduzidos em células Jurkat por eletroporação. As células HEK293 foram centrifugadas e re-suspensas em um volume final de 108 células/ml em tampão de eletroporação do fabricante (tampão de eletroporação Maxcyte, Thermo Fisher Scientific Cat. No NC0856428)). Uma alíquota de 4 x 107 células (0,4 ml) foi adicionada à cubeta de eletroporação OC400 com 40 μg de DNA (ou seja, 1 μg/106 células). O DNA consistiu de uma mistura de DNA de plasmídeo dador (biblioteca plNT20-C12 / C2 ou plNT20-4JHF ou plNT20-C12 / C2 TCR, 9,2 μg) e uma mistura equimolar de DNA (total de 30,8 μg) de DNA que codifica o AAVS-SBI TALENS (PZT-AAVS1 L1 e PZT-AAVS R1 Systems Bioscience Cat. No GE601A-1). Em amostras sem adição de TALENS, o DNA de entrada foi trazido a 1 μg/106 células utilizando o plasmídeo de controle pcDNA3.0. Um método alternativo de introdução de genes de receptores de células T em células Jurkat utilizou o 4D-Nucleofector (Lonza). Aqui, o protocolo de transfecção seguiu as instruções do fabricante do kit de acordo com a linha de células SE (Lonza, Cat. PBC1 -02250). Resumidamente, 2 μg de DNA, que consistem em uma mistura de DNA do plasmídeo dador (biblioteca plNT20-C12 / C2 ou plNT20-4JHF ou plNT20-C12 / C2 TCR, 0,46 μg) e uma mistura equimolar de DNA (1,54 μg total) de DNA que codifica a AAVS- SBI TALENS (PZT-AAVS1 L1 e PZT-AAVS R1 Systems Bioscience Cat No GE601A-1) foi transfectado por 106 células Jurkat. A configuração de código de pulso foi CL120 e um programa de tipo de célula foi específico para células Jurkat E6.1 (ATCC).

[0571] A Figura 26 demonstra que a expressão de TCR foi alcançada e o reconhecimento do peptídeo apropriado: molécula de MHC foi alcançado. Isto foi dependente da utilização de nucleases TALE (comparar as figuras 26m e 26n). Sinalização através do TCR introduzido também foi alcançada utilizando o peptídeo relevante: molécula de MHC.

[0572] Células Jurkat transfectadas pINT20- c12/c2 ou células Jurkat não transfectadas foram plaqueadas em uma placa de 96 poços a uma densidade de 1x106/ml, 200μI por poço. As células foram estimuladas tanto com 2μl quanto com 6μl por poço de pentâmero (Prolmmune) 1-MHC de peptídeo PE marcado ou 2μg/ml de CD3 anti-humano (BD Pharmingen, Cat 555329) na presença e ausência de CD28 anti-humano (BD Pharmigen Cat 555725) a 2μg/ml. Após uma incubação de 24 horas a 37 °C e 5% de CO2, a ativação de células Jurkat foi detectada por meio de investigação da expressão de CD69. As células foram coradas com 50μI PBS+1% BSA+0,5μI de CD69-APC anti-humano (Invitrogen, Cat. MHCD6905) por poço durante 45 minutos a 4 °C.

[0573] A Figura 26 (amostras o e p) demonstra a sobre-regulação de CD69 após estimulação com CD3. A figura também mostra o efeito da adição de 2μl (q) ou de 6μl (r) de peptide1: MHC. Uma população de células duplamente positivas que se ligam ao peptídeo: MHC e expressam CD69 é óbvia. Este exemplo mostra células incubadas na presença de CD28, mas o mesmo efeito foi observado na ausência de CD28 (não mostrado).

[0574] Este exemplo demonstra o potencial de integração direcionada por nuclease de bibliotecas de um tipo alternativo de ligante, isto é, receptores de células T. Nós demonstramos que é possível expressar e detectar a expressão de TCR na superfície celular utilizando anticorpos específicos. Também demonstramos que estes receptores de células T reconhecem especificamente os seus respectivos alvos. Temos também construída uma biblioteca mutante permitindo a seleção de ligantes melhorados. Finalmente temos demonstrado que a triagem da biblioteca com base na ativação da sinalização de TCR em células T é possível. Utilizamos aqui uma linha de células T humanas cultivadas. É também possível a introdução de DNA em células T primárias por eletroporação MaxCyte. Os métodos para o isolamento e preparação de linfócitos T primários são conhecidos dos peritos na arte (por exemplo, Cribbs et al., 2013, Oelke et al. 2003 [145, 146]. A exposição de linfócitos transfectados de TCR para o peptídeo multimérico: MHC pode então ser utilizada para conseguir a ativação, seja por exposição aos multímeros de peptídeo:MHC [146] ou a antígenos que apresentam células carregadas com o peptídeo apropriado [146, 147]. A ativação pode ser detectada, seja por meio da expressão de genes repórter ou por meio de sobre-regulação de genes endógenos, tais como CD69 [104, 148].

Exemplo 18. Apresentação de bancos de receptores de antigénios quiméricos em células de mamífero

[0575] A ativação de células T normalmente ocorre através da interação do receptor de células T (TCR) com o peptídeo específico: complexos de MHC. Isto, por sua vez, leva à sinalização direcionada através de CD3 e outras moléculas de sinalização de células T. Como uma alternativa para direcionar o reconhecimento direcionado pelo TCR, foi demonstrado que moléculas tais como Fvs de cadeia simples de ligação alternativa podem ser apresentadas em células T como fusões com moléculas de sinalização a jusante de forma a redirecionar a ativação da célula T para a molécula reconhecida pelo scFv (ou ligante alternativo). Desta forma, a ativação de células T não está limitada ao reconhecimento molecular direcionado ao peptídeo: complexos de MHC por TCR, mas pode ser direcionado a outras moléculas da superfície celular. Este formato alternativo, em que uma entidade de ligação de não-TCR é fundida a um componente de sinalização, é referido como um "receptor do antígeno quimérico" (CAR). No caso de células T, isto tem demonstrado ser um meio importante e valiosos de ativação das células T como um redirecionamento.

[0576] Para qualquer alvo dado, ainda não está claro o que o epitopo ou características de afinidade ideais devem ser para incorporação em uma CAR [103]. As características da concepção d CAR, tais como comprimento do ligante ou escolha de domínio de transmembrana, podem, por sua vez, afetar o que constitui um epitopo ideal. A combinação de densidade de antígenos sobre as células alvo e não alvo, juntamente com a escolha do domínio de sinalização, poderia afetar os requisitos de afinidade ideais. A capacidade de apresentar bibliotecas de receptores de antígenos quiméricos em células T fornece uma oportunidade para identificar especificidade de uma ligação ideal, formato de ligante, comprimento/sequência de ligante, de variantes de módulo de sinalização fundido, etc, quer de forma isolada ou em combinação. Aqui demonstramos o utilitário de integração direcionada de nuclease para a construção de bancos de receptores de antígenos quiméricos em células de mamífero. O vetor plNT21 (Figura 27a) é um vetor promotor de CMV único para a expressão conveniente e secreção de ligantes tais como scFvs flanqueados por locais de restrição Nco1/Not1 para permitir que na expressão em armação com uma sequência líder à montante e um parceiro de fusão à jusante (como mostrado anteriormente na Figura 8). A cassete de expressão CAR em plNT21 é flanqueada por braços de homologia de AAV tal como descrito anteriormente na Figura 3.

[0577] O vetor plNT21 -CAR1 (Figura 27a, c) faz a fusão de ligadores, tais como Fvs de cadeias únicas para o domínio de transmembrana e domínio intracelular de CD3Z (Figura 27c e tal como descrito para a expressão de TCR na Figura 25). Este formato é frequentemente referido como um receptor de antígeno quimérico de "primeira geração". Os domínios de sinalização de outras moléculas co-estimuladoras também têm sido utilizados para fornecer sinais adicionais e estes foram mostrados para dar uma melhor sinalização. Estes têm sido referidos como receptores de antígeno quimérico de segunda e terceira geração. Por exemplo, plNT21-CAR2 (Figura 27 b, d) faz a fusão do ligante (convenientemente clonado, neste caso como um fragmento de Nco1/Not1 a um domínio de segunda geração anteriormente descrito (WO 2012/079000 A1) que consiste de: Domínio de transmembrana e dobradiça de CD8 Domínio de sinalização 4-1 BB Domínio de sinalizaçãoCD3Z

[0578] A título de exemplo, um número de diferentes grupos de ligantes foram clonado nos locais Nco / Not1 de plNT20-CAR1 e plNT20-CAR2. CD19 tem sido previamente utilizado em um número de diferentes estudos para atingir referências de malignidades de células-B em Sadelain et. al. (2013) [103]. Um anticorpo anti-CD19 anteriormente descrito (WO 2012/079000 A1) (chamado FMC63) foi preparado como um gene de scFv sintético em qualquer uma configuração VH- ligante-VL ou de uma configuração VL-ligante-VH (FMC63 H-L ou FMC L-H respectivamente, a Figura 27E mostra a sequência de FMC63 H-L. FMC63 L-H foi configurado com os domínios variáveis na configuração VL-ligante-VH flanqueada por Nco1 e Not1 nas extreminadades 5 'e 3', respectivamente.

[0579] Como controles, os scFv com especificidades de ligação alternativas foram também clonados em plNT20. Estes incluem anti-FGFR1_A [105] e um anticorpo de controle de anti-desmina [7]. Além disso, Adhirons [152], que reconhecem lox1 (Figura 29 a, b) foram introduzidos como um exemplo de um formato alternativo de ligante configurado como uma fusão CAR (ver exemplo 19 para uma descrição).

[0580] Para demonstrar a criação de bibliotecas de ligantes apresentados em formato de CAR, as populações de anticorpos de scFv formatados selecionados em mesotelina e CD229 foram clonados. A mesotelina é uma glicoproteína de superfície celular, que é altamente expressa em vários cânceres, incluindo mesotelioma. Um número de formatos baseados em anticorpos estão em desenvolvimento e no ensaio clínico, incluindo CARs direcionadas à mesotelina [149]. CD229 representa outro antígeno associado a um tumor potencial que pode ser direcionado através de terapia em cânceres, tais como leucemia linfocítica crônica e mieloma múltiplo [150, 151].

[0581] Uma população de anticorpos que reconhecem tanto mesotelina quanto CD229 foi criada por seleção por meio de utilização de biblioteca de apresentação de fago "McCafferty" como descrito no exemplo 6 e ref 7). Duas rondas de seleção foram realizadas e os genes de codificação de scFv se recuperaram por meio de utilização dos iniciadores

[0582] M13leadseq e Notmycseq (exemplo 6). Os produtos foram cortados com Nco1 / Not 1, purificados em gel e clonados em plNT21-CAR2. Estes foram direcionados ao locus AAVS de células HEK293 por clivagem com nuclease taLE para gerar uma biblioteca de 4,8 x 105 para CD229 e 6,4 x 105 para mesotelina (o que representa um aumento de 30x e 53x na biblioteca em comparação com amostras transfectadas, na ausência de nuclease TALE).

[0583] plNT20-CAR1 e plNT20-CAR2 foram introduzidos em células HEK293 por transfecção de PEI. O DNA de plasmídeo dador (pINT20-CAR1 ou pINT20-CAR2), 6 μg foi misturado com uma mistura equimolar de DNA (total de 20 μg) de DNA que codifica os TALENs AAVS-SBI (pZT-AAVS1 L1 e pZT- AAVS R1 Systems Bioscience Cat No GE601A-1) em meio Freestyle 293 (Lifetech, Cat. 12338-026), PEI linear (52 μl, 1 mg / ml, Polysciences Inc.) e incubado à temperatura ambiente durante 10 minutos. A mistura é, em seguida, adicionada a 20 ml de suspensão de células HEK293 (1 x 106 células/ml) em 125 ml de um frasco de Erlenmeyer ventilado. plNT20-CAR1 e plNT20-CAR2 foram também introduzidos em células Jurkat por eletroporação. As células Jurkat foram centrifugadas e re- suspensas em um volume final de 108 células /ml em tampão de eletroporação do fabricante (Tampão de Eletroporação Maxcyte, Thermo Fisher Scientific Cat. No NC0856428)). Uma alíquota de 4 x 107 células (0,4 ml) foi adicionada à cuvete de eletroporação com 40μg de DNA (ou seja, 1 μg/106 células). O DNA consistiu de uma mistura de DNA de plasmídeo dador (plNT20-CAR1 e plNT20-CAR2, 9,2 μg) e uma mistura equimolar de DNA (30,8 pg total) de DNA que codifica o TALENS AAVS-SBI (PZT-AAVS1 L1 e PZT-AAVS R1 Systems Bioscience No Cat GE601A- 1). Em amostras sem adição de TALENS, o DNA de entrada foi trazido a 1 pg /106 células utilizando o plasmídeo de controle pcDNA3.0.

[0584] A marcação fluorescente dos vários antígenos foi realizada por meio de do kit de conjugação de Lightning-Link Rapid Dye-Light 633 (lnnova Biosciences, Cat. 325-0010). A preparação de FGFR1 e FGFR2 é descrita no exemplo 15. Lox1 e CD229 foram a partir dos Sistemas R e D (Cat. Nos. 1798-LX-050, e 898-CD050, respectivamente), CD19- Fc e mesotelina eram a partir de (AcroBiosystems Cat. No. CD9-H5259 e MSN-H526x respectivamente).

[0585] A Figura 28b ilustra a apresentação de anticorpo anti-FGFR1 direcionado por nuclease [105] dentro de um construto CAR de segunda geração (plNT21-CAR2-FGFR1_A). A Figura 28d ilustra também a apresentação de uma molécula de estrutura alternativa (um ref Adhiron [152]) na forma de uma fusão com um receptor de antígeno quimérico de segunda geração (plNT21-CAR2-lox1). As Figuras 28f e g também ilustram clones positivos dentro de uma biblioteca de scFvs selecionados em mesotelina ou CD229.

[0586] Neste exemplo CARs foram introduzidos em células HEK e células Jurkat, mas isto poderia igualmente ser feito através da introdução dos construtos em células primárias, tais como linfócitos T humanos (por exemplo, tal como descrito por Sadelain et al. (2013) [103], por exemplo, utilizando eletroporação [135]. Os construtos de expressão para expressão de CAR em linfócitos podem ser ainda otimizados, por exemplo, por meio de otimização de estabilidade de mRNA e tradução através de variação em regiões não traduzidas de 5' e 3', comprimento de poli A, etc, tal como anteriormente descrito [135]. A sinalização de construtos de CAR introduzidos em linfócitos T ou linhas de células de linfócito T, pode ser induzida por exposição de células que expressão antígeno alvo ou utilizando antígeno multimérico, por exemplo, antígeno imobilizado em uma superfície ou representado em grânulos. [104, 148].

Exemplo 19. A apresentação de bibliotecas de estruturas alternativas construídas em células de mamíferos através de integração direcionada por nuclease.

[0587] O método descrito para a construção de bibliotecas de ligantes pode ser empregado além da apresentação de anticorpos e receptores de célula T. Várias estruturas alternativas foram descritas, permitindo a construção de bibliotecas de variantes a partir das quais novas especificidades de ligação foram isoladas, por exemplo, Tiede et al. (2014) [152] e referências. No exemplo descrito por Tiede et al. (2014) foi utilizada uma estrutura versátil e estável, com base em uma sequência de consenso a partir de fitocistatinas derivadas de plantas. Esta estrutura é referida como um Adhiron e a Figura 29a mostra um gene sintético que codifica um Adhiron que foi selecionado para se ligar a lox1 (WO 2014125290 A1). A Figura 29 B mostra um ligante alternativo lox1 (lox1 B). Ambos foram sintetizados e clonados no local Nco1 / Not1 de plNT20_CAR2 para criar uma fusão com o parceiro a jusante.

[0588] Uma biblioteca pode ser construída por resíduos de randomização de alça (por exemplo, por mutagênese de Kunkel ou montagem por PCR como acima descrito no Exemplo 17). A título de exemplo, a Figura 29c mostra a concepção de oligonucleotídeos mutantes úteis para criar uma biblioteca de acordo com o mesmo método como descrito no exemplo 17. Neste caso, a distribuição aleatória é alcançada através da introdução de um número variável de resíduos de NNS, embora estratégias alternativas conhecidas dos peritos na arte possam ser utilizadas.

[0589] Como outro exemplo, as Figuras 29 d e e demonstram os meios para criar uma biblioteca de ligantes por integração direcionada de nuclease baseado em uma estrutura de knottin [156]. Knottins são peptídeos de cerca de 30 amino ácidos dos que são estabilizados por três ligações de dissulfureto, com uma inserida através de outras duas para criar uma estrutura de knottins. A Figura 29d mostra a ligação de tripsina de knottin MCoTI-II com um local de Nco1 em uma extremidade de 5' e um local de Not em uma extremidade de 3' que permite expressão in-frame com os vetores aqui descritos. Como um exemplo para a construção da biblioteca, os 6 aminoácidos do primeiro circuito (sublinhado na Figura 29d) podem sofrer mutações com número variável de aminoácidos. A Figura 29e ilustra uma estratégia mutagênica que substitui os 6 amino ácidos do circuito 1 com 10 amino ácidos randomizados por meio de utilização de códons de ENV (onde V=A, C ou G e S = C ou G).

[0590] O códon de ENV engloba 24 códons que codificam 17 amino ácido que excluem cisteínas. Esta estratégia é para fins ilustrativos e estratégias alternativas mutagênicas serão conhecidas pelos peritos na arte.

Exemplo 20. Introdução de bibliotecas de anticorpo direcionadas por nuclease por meio de utilização de CRISPR/Cas9

[0591] A integração direcionada à nuclease através de CRISPR / Cas9 foi demonstrada utilizando o "kit de vetor de nuclease de CRISPR Geneart" (Lifetech A21175). Neste sistema, um promotor de polimerase III de RNA U6 conduz a expressão de um CRIPSR RNA complementar (crRNA), o qual é ligado à trans-ativação de crRNA (tracrRNA). O crRNA e tracrRNA juntos formam um RNA guia que dirige a especificidade de clivagem de uma proteína Cas9 codificada no mesmo "vetor de nuclease de CRISPR GeneArt" (ver as instruções do fabricante). O vetor é fornecido como um plasmídeo linearizado em que um oligonucleotídeo de cadeia dupla curto com projeções apropriadas de 3' é clonado. A especificidade de clivagem é, em seguida, determinada pela sequência do segmento clonado. Duas sequências de alvejamento diferentes foram concebidas para direcionar a clivagem ao locus de AAV humano descrito acima.

[0592] As sequências foram: Inserto de DNA de cadeia dupla de CRISPR1: 5 'G GGG GG CCACTAG ACAG ATGTTTT L (SEQ ID NO: 115) 3 'GTG GTG G CCCCCG ATCCCTGTCCTAC (SEQ ID NO: 116) Inserto de DNA de cadeia dupla de CRISPR2: 5 'GTCACCAATCCTGTCCCTAGGTTTT (SEQ ID NO: 117) 3 'GTG G CCAGTG GTTAG L ACAG GG ATC (SEQ ID NO: 118)

[0593] A clivagem alvo de RNAs guia resultante dentro da mesma região do locus AAVS como as nucleases TALE descritas acima (com CRISPR2 estando na orientação inversa a partir de CRISPR1). Assim, os braços de homologia de AAV utilizados anteriormente para a integração direta da cassete de expressão podem ser utilizados para integração direcionada por estes RNAs guias de CRISPR.

[0594] O vetor linearizado e os oligonucleotídeos de cadeia dupla foram ligados e transformados em células DH10B eletrocompetentes. A clonagem do inserto correto foi confirmada por sequenciação e o DNA de plasmídeo foi preparado. O construto CRISPR2/Cas9 (englobando o oligonucleotídeo CRISPR2) foi transfectado juntamente com DNA dador que codifica uma biblioteca de β-galactosidase selecionada por um ciclo de seleção de e apresentação de fago (Exemplo 15). Estes foram transfectados em células HEK293 utilizando o sistema de eletroporação MaxCyte com a montagem de OC-400. 4 x 107 células foram transfectadas com 23.2 μg de DNA dador que representa uma população de genes de scFv selecionados por um ciclo de apresentação de fagos de β- galactosidase clonados em PD6. As células foram co- transfectadas com 77 pg de plasmídeo Cas9-CRISPR2 ou 77 μg de plasmídeo TALEN (38,5 μg cada de pZT- AAVS1 L1 e PZT-AAVS) ou 77μg de plasmídeo de controle Tabela 9

[0595] A titulação do número de transformantes formados por transfecção de Cas9/CRISPR2 (medindo colônias de resistência à blasticidina) revelou que 1053 colônias resistentes à blasticidina foram geradas a partir do plaqueamento de 10.000 células, o que equivale a uma eficiência de transfecção de 10,5% (Tabela 9). No caso de nuclease direcionada por TALE, uma eficiência de transfecção de 5.1% foi alcançada. Em contraste, na ausência do contruto de Cas9 / CRISPR2, apenas 0,36% de eficiência de transfecção foi alcançada.

[0596] Como uma alternativa à transfecção por meio de utilização de DNA de plasmídeo a introduzir a proteína Cas9 e RNA guia em células, é também possível introduzir diretamente um complexo que consiste em proteína nucleoproteína Cas9 (Toolgen, Inc.) e um RNA guia. O RNA guia foi preparado por Toolgen, Inc. utilizando transcrição in vitro a partir de um promotor de T7 como um único transcrito que inclui a sequência de TRACR (sublinhada) precedida pela sequência complementar para o DNA alvo (em negrito), como mostrado abaixo. CRISPR 1 RNA (SEQ ID NO: 1 19: 5' GGGGGGCCACUAGGGACAGGAUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAA UAAGGCU AGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU CRISPR 2 RNA (SEQ ID NO: 120): 5' GGGUCACCAAUCCUGUCCCUAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGC UAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

[0597] 6,6 μg de proteína CS9, 4.6μg de RNA e 10 μg de DNA dador (codifica o anticorpo anti-FGFR1 _A em PD6) foram introduzidos em 107 células HEK293 por eletroporação MaxCyte, como descrito acima. As eficiências de transfecção de 2,2% e 2,9% foram alcançadas por um RNA de CRISPR e CRISPR2, respectivamente, com 0,7% e 0,8% na ausência de Cas9 adicionado: complexo de proteína de RNA.

[0598] Estes RNAs guia do direcionam as mesmas sequências codificadas por CRISPR1 e CRISPR2. Como uma alternativa, crRNA e tracrRNA podem ser feitos por síntese química (por exemplo, GE Dharmacon).

Exemplo 21: Inserção de gene de anticorpo mediada por nuclease por meio de ligação ou mecanismos de recombinação de microhomologia (MMEJ)

[0599] Embora a recombinação homóloga (RH) seja útil para a inserção precisa de fragmentos grandes de DNA, isto exige a construção de grandes vetores de recombinação que incorporam longos braços de homologia. Isto pode fazer a construção de grandes bibliotecas mais difícil devido à reduzida eficiência de transformação de construtos de DNA maiores. Alternativamente, as reações de ligação simples podem ocorrer entre o DNA cromossômico e vetor de direcionamento, se uma sequência de reconhecimento de nuclease é incorporada no vetor de direcionamento. As reações de ligação podem ser tanto de "extremidades pegajosas" empregando, por exemplo, nucleases de dedos de zinco (Orlando et al., 2010) [45] ou TALENs(Cristea et al., 2013) [22], que podem fazer quebras de cadeia dupla (DSBs) que deixa 5' em suspensão ou "extremidade cegas", empregando a ribonucleoproteína de CRISP/Cas9. Um exemplo de integração de gene da nuclease por ligação utilizando meganuclease l-Scel foi mostrado pela construção de vetor pD7-Sce1. pD7 é derivado de pD6 (figura 8), mas os braços de homologia esquerdo e direito de AAVS foram substituídos por oligonucleotídeos curtos de cadeia dupla. O braço de homologia esquerdo de AAVS da série vetor de pD é flanqueado por enzimas de restrição EcoR1 e Nsi1 (ver Figura 3). Para converter pD6 para pD7-Sce1, este foi substituído por uma inserção de cadeia dupla de oligonucleotídeo formado por iniciadores 2778 e 2779 que codificam uma sequência de reconhecimento de meganuclease l-Scel com "extremidades pegajosas" compatível com as "extremidades pegajosas" formadas por EcoRI / Nsil. O braço de homologia de AAVS de mão direita é flanqueado por Asc1 e sítios de restrição Mlu1 (Figura 3). O braço de homologia direito foi substituído por uma inserção de cadeia dupla de oligonucleotídeos com "extremidades pegajosas" compatível com as "extremidades pegajosas" formadas por digestão de ASCL / MluI e é formado por iniciadores 2723 e 2724. Tabela 10 Iniciadores para construção de pD7 e plNT19

[0600] Os anticorpos que reconhecem Fgfr1 e FGFR2 (exemplo 15) foram clonados em pD7 para criar pD7-Scel anti-Fgfrl e pD7-Scel anti-FGFR2, respectivamente. Estes foram co-transfectados com o plasmídeo de expressão de I-Sce1 (exemplo 11, Figura 16) para o clone de linha de célula HEK293 6F (ver exemplo 11), que contém um local de reconhecimento de I-Sce1 integrado.

[0601] A ligação de DSBs no cromossomo e vetor de direcionamento gerados por nucleases de dedos de zinco ou nucleases TALE também podem ser alcançados. Ao inverter os sítios de reconhecimento de nucleases de dedos de zinco ou TALEN no vetor de direcionamento, isto pode garantir que o produto de inserção não seja um alvo para a clivagem de um método denominado "recombinação de ligação sincronizada Obrigatória" ou ObLiGaRe (Maresca et al., 2013) [153]. Os vetores PD7-ObLiGaRe podem ser gerados da mesma forma como descrito acima para a criação de PD7-Sce1. Neste caso, o braço de homologia esquerdo é substituído por um oligonucleotídeo que consiste em iniciadores 2808 e 2809 que codificam um local de reconhecimento TALEN invertido (mostrado em negrito) e a região de espaçador. O braço de homologia de mão direita é substituído com os iniciadores 2723 e 2809, tal como descrito acima.

[0602] Uma alternativa para reações de ligação simples entre DSBs no cromossomo e vetor de direcionamento, mediada por mecanismos de recombinação não homóloga (NHEJ) é o mecanismo de recombinação de microhomologia (MMEJ). MMEJ é um mecanismo de reparo de DSB que utiliza sequências microhomólogas entre 5 a 25 pb para o mecanismo de recombinação propenso a erros (McVey e Lee, 2008) [154]. Uma estratégia para a integração do gene preciso, foi concebida, onde a sequência genômica e o vetor de abordagem seletiva contém a mesma sequência de par de reconhecimento da nuclease TALE, mas de uma sequência do vetor espaçador diferente, em que as metades anterior e posterior são comutadas. A sequência genômica e vetor podem ser cortados pelo mesmo par TALEN e MMEJ ocorre através das extremidades de DNA microhomólogas. O vetor de direcionamento integrado resultante não é mais um alvo para nuclease TALE por causa da região de espaçador encurtada que não é ideal para a clivagem de nuclease TALE (Nakade et al., 2014) [155].

[0603] O vetor de direcionamento MMEJ AAV PD7- MMEJ podem ser gerados da mesma forma como descrito acima para a criação de pD7-Sce1. Neste caso, o braço de homologia esquerdo é substituído por um oligonucleotídeo que consiste em iniciadores 2768 e 2769 que codificam o sítio de reconhecimento TALEN (mostrado a negrito) e ligado à região espaçadora (sublinhada). O braço de homologia de mão direita é substituído com os iniciadores 2723 e 2809, tal como descrito acima.

Exemplo 22: Concepção de iniciadores para a criação de um único (CMV) promotor de cassete flanqueado por braços RQSA26 (plNT19-ROSA)

[0604] Este exemplo destina-se a demonstrar que os genes de anticorpo ou molécula de ligação alternativos podem ser integrados no genoma de células de mamífero por métodos de nuclease direcionada e os clones resultantes rastreados para uma função pretendida tanto por triagem fenotípica ou repórter. Um exemplo disto foi anteriormente demonstrado em que os genes de anticorpo foram integrados no cromossomo de células estaminais embrionárias de rato (ES) e colônias individuais ES triadas quanto à sua capacidade para manter pluripotência quando submetidas a condições de diferenciação [105]. Os genes de anticorpos recuperados a partir de colônias ES que mantiveram um fenótipo pluripotente foram mostrados para bloquear a via de sinalização de FGFR1/FGF4. Um problema com este método relatado anteriormente é que a recombinação homóloga pode resultar em tamanhos de bibliotecas pequenas, limitando assim a sua capacidade para triar diretamente para os clones raros presentes em grandes bibliotecas de moléculas de ligação. Os métodos de integração de genes mediados por nucleases para o anticorpo de ligação e a integração do gene de molécula são mais eficientes, resultando em maior geração de tamanho da biblioteca e, portanto, mais provável para gerar bibliotecas de células de mamífero capazes de identificar anticorpos funcionais por triagem celular fenotípica ou repórter.

[0605] O vetor de direcionamento dador plNT19 foi concebido para integrar genes de anticorpos dentro do locus ROSA26 de rato por métodos direcionados de nuclease para direcionar a triagem funcional. plNT19 é um único vetor promotor de CMV para a expressão de fusão de scFv-Fc. A cassete de expressão é ladeada por braços ROSA26 de rato. Uma vez que o exon a montante é não traduzido, o gene de puromicina é precedido por um aceitador de splicing e na parte inferior tem uma sequência de KOZAK que conduz no gene da puromicina.

[0606] O braço de homologia esquerdo AAVS e gene de resistência à puromicina de plNT18 foi substituído por uma cassete que codifica a homologia esquerda ROSA26, aceitador de splicing, sequência de consenso de KOZAK otimizada e gene de resistência à puromicina. O braço de homologia esquerdo ROSA26 foi inicialmente amplificado a partir pGATOR (Melidoni et al., 2013 (105)) como dois fragmentos foram extraídos de um local Notl interno. Os dois fragmentos, gerados por iniciadores J60 / 2716 e 2715/2706 foram combinados em uma montagem PCR com iniciadores J60 e 2706 e digeridos com Asisi e Nsil. O aceitador de splice foi amplificado a partir de pGATOR utilizando iniciadores 2709 e 2710 e a cassete de resistência à puromicina amplificados com iniciadores 2745 (que incluiu uma região homóloga ao aceitador de splice e consenso de KOZAK otimizado) e J59. A região de aceitador de splice e cassete de resistência à puromicina foram combinados em conjunto por PCR utilizando os iniciadores 2709 e J59 e digeridos com Nsi1 e Bgl2. A homologia braço esquerdo ROSA26 e cassetes de puromicina aceitadores de splice foram ligados com o vetor plNT18 (Asisi / Bgl2).

[0607] Para completar o vetor de direcionamento ROSA do braço de homologia ROSA26 de mão direita, a jusante da cassete CMV-scFv-Fc, foi introduzido para substituir o braço de homologia direito plNT18 AAVS. Isto foi realizado por PCR do braço de homologia direito ROSA, presente em pGATOR (Melidoni et al., 2013) utilizando iniciadores J61 e J62 para amplificar um fragmento com BstZ171 em uma extremidade e SbfI na outra. O iniciador 61 foi posicionado para excluir um local endógeno Sbf1 de 65 pb a partir de local de clivagem ROSA ZFN. A Figura 31 mostra as sequências de braços de homologia esquerdo e direito ROSA26. Tabela 11. Iniciadores para segmentação direcionada por nuclease do locus ROSA 26 de rato.

[0608] A integração de plNT19, que codifica o anticorpo ou moléculas de ligação alternativa, no ROSA26 locus de rato poderia ser alcançada por introdução direcionada por nuclease de bibliotecas de anticorpos, por meio de CRISPR/Cas9 como descrito no Exemplo 20. Aqui, a integração direcionada através de nucleasse CRISPR Cas9 pode ser demonstrada utilizando o "kit de vetor de nulcease Geneart CRISPR" (Lifetech A21175). Neste sistema, um promotor de polimerase III de RNA U6 conduz a expressão de um CRIPSR RNA complementar (crRNA), o qual é ligado à trans-ativação de crRNA (tracrRNA). O crRNA e tracrRNA juntos formam um RNA guia que dirige a especificidade de clivagem de uma proteína Cas9 codificada no mesmo "vetor de nuclease de CRISPR GeneArt" (ver as instruções do fabricante). O vetor é fornecido como um plasmídeo linearizado em que um oligonucleotídeo de cadeia dupla curto com projeções apropriadas de 3' é clonado. A especificidade de clivagem é, em seguida, determinada pela sequência do segmento clonado. Duas sequências de direcionamento diferentes foram concebidas para dirigir a clivagem para o ROSA26 de rato por iniciadores 2701/2702 e 2703/2704 (ver Tabela 10).

[0609] Como alternativa, as nucleases de dedos de zinco, que fazem a clivagem dentro do locus ROSA26 têm sido descritas [34]. Estas podem ser construídas em um vetor de expressão adequado, tal como descrito para meganuclease de Sce- I (figura 16, exemplo 11).

[0610] A integração mediada por nuclease do plasmídeo dador plNT19 iria dar origem a clones que expressam o anticorpo segregado que pode ligar-se ao receptor endógeno ou o ligando, resultando tanto em antagonismo [105,107] quanto agonismo [47,106,108] de vias de sinalização do receptor. Para permitir que a ligação entre o fenótipo celular e a atividade funcional do anticorpo segregado, as células podem ser plaqueadas a uma densidade baixa em meio semi-sólido para propagar colônias individuais e expressão do anticorpo pode ser iniciada através de um promotor indutível [105]. Alternativamente, um promotor constitutivo pode ser empregado para a expressão do gene do anticorpo. Os meios semi-sólidos iriam manter uma concentração local elevada do anticorpo expresso endogenamente, de modo que qualquer alteração fenotípica específica de uma colônia resultante a partir de uma célula individual seria causada pelo anticorpo original que expressa a partir de clone em particular. Se um repórter de resposta rápida, tais como Rex ou promotor Nanog fundido a um gene repórter, foi empregado, seria possível para a chapa de células a uma densidade baixa em meio semi- sólido, colheita e, em seguida, a tela por citometria de fluxo.

[0611] Alternativamente, o códon de paragem a jusante do gene do anticorpo em plNT19 poderia ser substituído por um domínio transmembranar para permitir junção do anticorpo à superfície celular. O códon de paragem a jusante do gene do anticorpo em plNT19 também poderia ser substituído por uma sequência de sinal de retenção no retículo endoplasmático (ER) para permitir a retenção de anticorpos no ER e potencial regulação negativa de um receptor alvo expresso endogenamente ou qualquer proteína secretada ou peptídeo. plNT19 é concebido especificamente para alvejar o locus rato ROSA26 e podem ser empregados para a triagem fenotípica de anticorpos ou moléculas de ligação alternativas em células ES de rato. No entanto, o anticorpo direcionado de nuclease ou métodos de integração de gene de molécula de ligante pode também ser aplicado a outras triagens funcionais, tais como os descritos utilizando a abordagem de lentivírus [47,106,107,108]. 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Claims

1. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE PELO MENOS 105 CLONES DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS CONTENDO DNA, que codifica um repertório diverso de ligantes que reconhecem alvos, em que os ligantes são exibidos na superfície dos clones de células de mamíferos, em que os ligantes compreendem ou estão ligados a âncoras de membrana, e em que a biblioteca contém DNA doador integrado em um local fixo ou em loci fixos duplicados, o método caracterizado por compreender: fornecimento de moléculas de DNA doador que codifica os ligantes, em que os ligantes são anticorpos, proteínas ou peptídeos, fornecimento de células de mamíferos com um tamanho de genoma maior que 2 x 107 pares de bases, introdução das moléculas do DNA doador nas células de mamíferos e fornecimento de uma nuclease específica de sítio nas células, em que a nuclease cliva uma sequência de reconhecimento no DNA celular para criar um sítio de integração no qual as moléculas do DNA doador se tornam integradas ao DNA celular, em que a dita integração ocorre através de mecanismos endógenos de reparo de DNA celular, criando assim células recombinantes contendo DNA doador integrado no DNA celular, e em que a nuclease é uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma nuclease TALE, ou em que a clivagem de DNA é dirigida pelo sistema CRISPR/Cas, e cultivar as células recombinantes para produzir clones, fornecendo assim a biblioteca de pelo menos 105 clones de células de mamíferos contendo DNA doador que codifica o repertório de ligantes, em que os ditos ligantes são exibidos na superfície dos ditos clones de células de mamíferos.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos ligantes serem moléculas de anticorpo, receptores de células T, e/ou em que os ligantes são multiméricos, compreendendo pelo menos uma primeira e uma segunda subunidade.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelas moléculas de anticorpo serem imunoglobulinas completas IgG, Fab, scFv-Fc or scFv.

4. MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE PELO MENOS 105 CLONES DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS CONTENDO DNA, que codifica um repertório diverso de ligantes multiméricos que reconhecem alvos, cada ligante compreendendo uma primeira e uma segunda subunidade, em que os ligantes são exibidos na superfície dos clones de células de mamíferos, em que os ligantes compreendem ou estão ligados a âncoras de membrana, e em que a biblioteca contém DNA doador integrado em um local fixo ou em loci fixos duplicados, o método caracterizado por compreender fornecimento de células de mamíferos com um tamanho de genoma maior que 2 x 107 pares de bases contendo DNA que codifica a primeira subunidade e fornecimento de moléculas de DNA doador que codifica a segunda subunidade do ligante, em que os ligantes são anticorpos, proteínas ou peptídeos, introdução das moléculas do DNA doador nas células e fornecimento de uma nuclease específica de sítio nas células, em que a nuclease cliva uma sequência de reconhecimento no DNA celular para criar um sítio de integração em que o DNA doador se torna integrado ao DNA celular, sendo que a integração ocorre através de mecanismos endógenos de reparo de DNA celular, criando assim células recombinantes que contêm DNA doador integrado no DNA celular, em que a nuclease é uma meganuclease, uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma nuclease TALE, ou em que a clivagem de DNA é dirigida pelo sistema CRISPR/Cas, e cultivar as células recombinantes para produzir clones contendo DNA que codifica a primeira e segunda subunidades do ligante multimérico, fornecendo assim uma biblioteca de pelo menos 105 clones de células de mamíferos contendo DNA doador que codifica o repertório de ligantes multiméricos, em que os ligantes são exibidos na superfície das suas células de expressão.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 4, caracterizado pelos ligantes multiméricos serem moléculas de anticorpo compreendendo um domínio variável de cadeia pesada (VH) e um domínio variável de cadeia leve (VL) como subunidades separadas.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelos ligantes multiméricos serem imunoglobulinas completas.

7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelas células serem células HEK293, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de linhagem de linfócitos T ou células de linhagem de linfócitos B.

8. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pela sequência de reconhecimento estar no DNA genômico das células.

9. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela sequência de reconhecimento para a nuclease específica de sítio ocorrer apenas uma ou duas vezes no DNA celular.

10. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela nuclease específica de sítio clivar o DNA celular para criar uma quebra de cadeia dupla servindo assim como um sítio de integração.

11. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo DNA doador compreender um elemento genético para a seleção de células nas quais o DNA doador é integrado.

12. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pela integração do DNA doador ao DNA celular colocar a expressão do ligante e/ou expressão de um elemento de seleção genética sob o controle de um promotor presente no DNA celular.

13. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por cada clone conter DNA doador integrado que codifica apenas um ou dois membros do repertório de ligantes.

14. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelas células serem diplóides e conterem uma sequência de reconhecimento para a nuclease específica de sítio em loci fixos duplicados no DNA celular.

15. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado por cada clone conter DNA doador integrado que codifica um único membro do repertório de ligantes.

16. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por cada uma das moléculas de DNA doador codificar um único ligante ou subunidade de ligante.

17. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo DNA doador ser proveniente de rodadas de seleção de exibição de fago.

18. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por compreender ainda: cultura da biblioteca de cones de células de mamíferos para expressar os ligantes, recuperar um ou mais clones de células de mamíferos expressando um ligante de interesse, e gerar uma biblioteca de derivativos a partir de um ou mais clones de células de mamíferos recuperados, em que a dita biblioteca de derivativos contém DNA que codifica um segundo repertório de ligantes.

19. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela geração da biblioteca de derivativos compreender isolar DNA doador de um ou mais clones recuperados expressando um ligante de interesse, introduzir uma mutação no DNA para proporcionar uma população derivativa de moléculas de DNA doador que codifica um segundo repertório de ligantes, e introduzir a dita população derivativa de moléculas de DNA doador nas células de mamíferos para criar a biblioteca de derivativos de células de mamíferos contendo DNA que codifica o segundo repertório de ligantes.

20. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pela geração da biblioteca de derivativos compreender introduzir uma mutação no DNA doador no um ou mais clones de células de mamíferos recuperados por indução da mutação do DNA nos clones de células de mamíferos.

21. MÉTODO DE TRIAGEM PARA UM LIGANTE QUE RECONHECE UM ALVO, caracterizado por compreender: produzir uma biblioteca pelo método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 20, cultivar as células da biblioteca para expressar os ligantes, expor os ligantes ao alvo, permitindo o reconhecimento do alvo por um ou mais ligantes cognatos, se presentes, e detectar se o alvo é reconhecido por um ligante cognato.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelos ligantes serem moléculas de anticorpo e o alvo ser um antígeno, ou pelos ligantes serem TCRs e o alvo ser um MHC:complexo de peptídeo.

23. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 22, caracterizado por compreender ainda detectar o reconhecimento do alvo por um ligante cognato e recuperar células de um clone contendo DNA que codifica o ligante cognato.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por compreender ainda isolar o DNA que codifica o ligante do clone recuperado, obtendo assim o DNA que codifica um ligante que reconhece o alvo.

25. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou 24, caracterizado por compreender introduzir mutação ou converter o DNA em DNA modificado que codifica um ligante reestruturado.

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo ligante ser um scFv e o método compreender a conversão de DNA que codifica o scFv em DNA que codifica uma Ig ou fragmento do mesmo, mantendo os pares de cadeias VH e VL variáveis originais.

27. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 26, caracterizado por compreender ainda a introdução do DNA em uma célula hospedeira e, opcionalmente, compreender ainda a cultura das células e a concentração das células para fornecer um pelete celular ou suspensão concentrada de células.

28. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 ou 27, caracterizado por compreender ainda cultivar as células para expressar o ligante, e purificar o ligante.