JP2022537203A

JP2022537203A - ＣｒｅｍＲＮＡを使用した標的指向性組込みによるタンパク質発現細胞の作製のための方法

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Publication number: JP2022537203A
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Inventors: シモンアウスレンダー
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Abstract

本明細書では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、組換え認識配列がすべて異なる、哺乳動物細胞を提供する工程；ｂ）ａ）で提供された細胞に、３つの異なる組換え認識配列および１から８つの発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸を含む組成物を導入する工程であって、第１のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、第１の組換え認識配列と、１つまたは複数の発現カセットと、１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分と、第３の組換え認識配列の第１のコピーとを含み、第２のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、第３の組換え認識配列の第２のコピーと、１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分と、１つまたは複数の発現カセットと、第２の組換え認識配列とを含み、第１および第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え認識配列が、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列の第１～第３の組換え認識配列と一致しており、１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分および３’末端部分が、まとまると、１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程；ｃ）ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡを導入する工程；ならびにｄ）第２の選択マーカーを発現しかつポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程を含み、それにより、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞が生産され、ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡが、本方法においてＣｒｅリコンビナーゼの唯一の供給源である、方法が報告されている。TIFF2022537203000007.tif96170

Description

本発明は、細胞株作製およびポリペプチド生産の分野に関する。より正確には、哺乳動物細胞のゲノムへ組み込まれている発現カセットをもたらす、ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡを使用するカセット交換反応に媒介されたリコンビナーゼによって得られた組換え哺乳動物細胞が、本明細書において報告される。

例えば抗体などの、分泌されるグリコシル化されたポリペプチドは、通常、安定発現または一過性発現のいずれかとして真核細胞において組換え発現されることにより生産される。

目的の外因性ポリペプチドを発現する組換え細胞を作製するための１つの戦略は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のランダムな組込みとそれに続く分泌工程および単離工程を含む。しかしながら、この手法にはいくつかの欠点がある。第一に、細胞それ自体のゲノム中へのヌクレオチド配列の機能的組込みは、珍しい事象であるだけでなく、ヌクレオチド配列が組み込まれる場所についてのランダム性を考慮に入れると、これらの珍しい事象の結果、遺伝子発現および細胞増殖に様々な表現型が生じる。「位置効果変異」として公知のこのような変異は、真核細胞ゲノムに存在する複雑な遺伝子制御ネットワークならびに組込みおよび遺伝子発現のための特定のゲノム遺伝子座に対する接近容易性に、少なくともある程度は起因する。第二に、一般に、ランダム組込み戦略は、細胞のゲノム中に組み込まれたヌクレオチド配列コピーの数をコントロールしない。実際に、高産生細胞を得るために遺伝子増幅法がしばしば使用される。しかし、このような遺伝子増幅は、例えば不安定な細胞増殖および／または生産物発現などの望ましくない細胞表現型を招く可能性もある。第三に、ランダム組込みプロセスにつきものの組込み遺伝子座不均一性が原因となって、目的のポリペプチドについて望ましい発現レベルを示している組換え細胞を単離するためにトランスフェクション後に何千個もの細胞をスクリーニングすることには、時間がかかり、大きな労働力を要する。そのような細胞を単離した後でさえ、目的のポリペプチドの安定な発現は保証されておらず、安定な市販用生産細胞を得るには、さらなるスクリーニングが必要とされる場合がある。第四に、ランダム組込みによって得られた細胞から生産されるポリペプチドは、高度の配列差異を示し、これは、高レベルのポリペプチド発現を選択するために使用される選択剤の変異原性にいくらか起因する可能性がある。最後に、生産しようとするポリペプチドの複雑性が高いほど、すなわち、目的のポリペプチドを細胞内で形成するのに必要とされる種々のポリペプチドまたはポリペプチド鎖の数が多いほど、互いに異なるポリペプチドまたはポリペプチド鎖の発現比率をコントロールすることが、より重要になる。発現比率のコントロールは、目的のポリペプチドの効率的な発現、正確な組立て、および高い発現収率での成功裡な分泌を可能にするために必要とされる。

リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）による標的指向性組込みは、真核生物宿主ゲノムのあらかじめ定められた部位に特異的かつ効率的に外来ＤＮＡを導くための方法である（Ｔｕｒａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０７（２０１１）１９３～２２１（非特許文献1））。

ＷＯ２００６／００７８５０（特許文献1）では、抗ＲｈＤ組換えポリクローナル抗体および個々の宿主細胞のゲノム中への部位特異的組込みを用いる製造方法が開示されている。

Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｙ．ら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９（２０１３）１３０７～１３１５（非特許文献2））は、ｐｈｉＣ３１インテグラーゼ技術とＣＲＥ－Ｌｏｘ技術を組み合わせて用いて、標的指向性細胞株開発のために信頼のおける宿主を限定的なゲノムスクリーニングによって迅速に同定したことを報告した。

ＷＯ２０１３／００６１４２（特許文献2）では、そのゲノム中にドナーカセットを安定的に組み入れた、遺伝的に変更された真核細胞のほぼ均質な集団を開示しており、ドナーカセットは、ターゲティング核酸部位および選択マーカータンパク質コード配列を含む単離された核酸断片に作動可能に連結された強力なポリアデニル化部位を含み、単離された核酸断片は、第１の組換え部位および第２の異なる組換え部位に挟まれている。

ＷＯ２０１８／１６２５１７（特許文献3）では、ｉ）発現カセット配列およびｉｉ）様々な発現ベクター間での発現カセットの分布に応じて、発現収率および生産物の質に大きな差異が認められたことが開示されている。

Ｔａｄａｕｃｈｉ，Ｔ．らは、抗体の発現を困難にするものを体系的に調査するために、調節された標的指向性組込み細胞株発生アプローチを利用することを開示している（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３５（２０１９）Ｎｏ．２，１－１１（非特許文献3））。

ＷＯ２０１７／１８４８３１（特許文献4）は、真核細胞における組換えタンパク質の部位特異的組込みおよび発現、特に、発現増強遺伝子座を使用することによる、真核細胞、特にチャイニーズハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓｇｒｉｓｅｕｓ）細胞株における二重特異性抗体を含む抗体の発現を改善するための方法を開示しているとされる。この文献におけるデータは匿名化された方法で提示されているため、実際に行われたことを結論付けることはできない。Ｃｒｅリコンビナーゼが使用されたとき、それは追加のプラスミドにコトランスフェクトされたが、このプラスミドの組成や起源については説明されていない。

Ｇｕｒｕｍｕｒｔｈｙ，Ｃ．Ｂ．およびＫｅｎｔＬｌｏｙｄ，Ｋ．Ｃ．は、生物医学研究のためのマウスモデルを開示した（Ｄｉｓ．Ｍｏｄ．Ｍｅｃｈ．１２（２０１９）（非特許文献4））。彼らは、胚性幹細胞における相同組換えによる従来の遺伝子ターゲティングが、接合子における対立遺伝子特異的操作を可能にするより洗練された方法にどのように取って代わったかについて論じている。

Ｂａｈｒ，Ｓ．らは、チャイニーズハムスター卵巣細胞における標的指向性組込みを使用したプラットフォーム発現システムの発生を開示した（ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＸＶＩ，２０１８（非特許文献5））。

ＷＯ２００６／００７８５０ＷＯ２０１３／００６１４２ＷＯ２０１８／１６２５１７ＷＯ２０１７／１８４８３１

Ｔｕｒａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０７（２０１１）１９３～２２１Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｙ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２９（２０１３）１３０７～１３１５Ｔａｄａｕｃｈｉ，Ｔ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．３５（２０１９）Ｎｏ．２，１－１１Ｇｕｒｕｍｕｒｔｈｙ，Ｃ．Ｂ．およびＫｅｎｔＬｌｏｙｄ，Ｋ．Ｃ．、Ｄｉｓ．Ｍｏｄ．Ｍｅｃｈ．１２（２０１９）Ｂａｈｒ，Ｓ．ら、ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＸＶＩ，２０１８

異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法および前記組換え哺乳動物細胞を用いて異種ポリペプチドを生産するための方法が、本明細書において報告される。

本発明は、少なくとも部分的に、例えばＣｒｅリコンビナーゼＤＮＡ（ＣｒｅＤＮＡ）の代わりにＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡ（ＣｒｅｍＲＮＡ）が使用される場合に、標的指向性組込みによって得られるクローンの数を改善することができるという知見に基づいている。より詳細には、選択期間後にＣｒｅｍＲＮＡ作製組換え細胞プールにおけるクローンの絶対数が、ＣＲＥプラスミド作製組換え細胞プールにおけるよりも大きいことが発見された。よって、例えばプラスミドをコードするＣｒｅリコンビナーゼ（Ｃｒｅプラスミド）の代わりにＣｒｅｍＲＮＡを使用することにより、クローン数および異質性が増加した組換え細胞プールを得ることができる。この理論に拘束されることなく、それにより、高力価で良好な製品品質を有する組換え細胞クローンを発見する可能性が高まると想定される。さらに、Ｃｒｅプラスミド作製細胞プールと比較して、ＣｒｅｍＲＮＡ作製プールからの組換え細胞クローンの数の増加は安定していることが発見された。

リコンビナーゼ反応のために導入されたＣｒｅｍＲＮＡは、単離されたＣｒｅｍＲＮＡであり、本発明の方法におけるＣｒｅリコンビナーゼの唯一の供給源であることを指摘する必要がある。

本発明の１つの独立した態様は、ポリペプチドを生産するための方法であって、
ａ）ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含む哺乳動物細胞を、任意でポリペプチドの発現に適した条件下で、培養する工程と、
ｂ）細胞または培養培地からポリペプチドを回収する工程と
を含み、
ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸が、ｍＲＮＡを使用したＣｒｅリコンビナーゼ媒介カセット交換により、哺乳動物細胞のゲノムに安定して組み込まれる、
方法である。

本発明の別の独立した態様は、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、組換え認識配列がすべて異なる、哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞に、３つの異なる組換え認識配列および１から８つの発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
－第１の組換え認識配列と、
－１つまたは複数の発現カセットと、
－１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分と、
－第３の組換え認識配列の第１のコピーと、
を含み、かつ、
第２のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
－第３の組換え認識配列の第２のコピーと、
－１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分と、
－１つまたは複数の発現カセットと、
－第２の組換え認識配列と、
を含み、
第１のデオキシリボ核酸および第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え認識配列が、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列の第１～第３の組換え認識配列と一致しており、
１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分および３’末端部分が、まとまると、１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、
２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程；
ｃ）ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡを
ｉ）ｂ）の第１および第２のデオキシリボ核酸と同時に、または
ｉｉ）その後で逐次的に
のいずれかで導入する工程であって、
Ｃｒｅリコンビナーゼが、第１および第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識する（かつ、任意で、リコンビナーゼが、２のリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、
ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡを導入する工程；ならびに
ｄ）第２の選択マーカーを発現しポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程
を含み、それによって、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞が生産される、
方法である。

本発明の別の態様は、組換え哺乳動物細胞の数を増加させるためのＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡの使用であって、前記細胞が、標的指向性組込みにより前記細胞のゲノム中の単一の部位に安定して組み込まれた目的の（異種）ポリペプチドをコードする（異種および／またはトランスジェニック）デオキシリボ核酸（の厳密に一つのコピー）を含む、使用である。一実施態様では、組換え細胞はまた、培養培地中での培養時に、目的のポリペプチドを培養培地中に分泌する。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、哺乳動物細胞および／または導入されたＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡは、デオキシリボ核酸をコードするＣｒｅリコンビナーゼを含まない。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡは、単離されたＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ＣｒｅｍＲＮＡは、配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ＣｒｅｍＲＮＡは、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＮもしくはＣ末端または両方に核局在化配列をさらに含むポリペプチドをコードする。一実施態様では、ＣｒｅｍＲＮＡは、配列番号１２のアミノ酸配列を含み、ＮもしくはＣ末端または互いに独立して両方に１から５の核局在化配列をさらに含むポリペプチドをコードする。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ＣｒｅｍＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントを含む。本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、配列番号１３のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントは、５’もしくは３’末端または両方に核局在化配列をコードするさらなる核酸をさらに含む。すべての態様の一実施態様では、ＣｒｅｍＲＮＡは、配列番号１３のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントを含み、５’もしくは３’末端または互いに独立して両方に核局在化配列をコードする１から５の核酸をさらに含む。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、デオキシリボ核酸の厳密に１つのコピーが、単一の部位または遺伝子座で、哺乳動物細胞のゲノム内に安定して組み込まれる。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、１から８つの発現カセットを含む。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、少なくとも４つの発現カセットを含み、ここで、
－第１の組換え認識配列は、最も５’側（すなわち、第１）の発現カセットに対して５’側に位置しており、
－第２の組換え認識配列は、最も３’側の発現カセット（すなわち、最後の発現カセット）に対して３’側に位置しており、
－第３の組換え認識配列は、
－第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列との間、かつ
－発現カセットのうちの２つの間
に位置しており、
組換え認識配列はすべて異なる。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、第３の組換え認識配列は、第２の発現カセットと第３の発現カセットとの間、または第３の発現カセットと第４の発現カセットとの間、または第４の発現カセットと第５の発現カセットとの間に位置している。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む。

本発明のすべての態様および実施態様の一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、当該選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部が、３’側に一部が位置しており、前記発現カセットの、５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの、３’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含み、開始コドンはコード配列に作動可能に連結される。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列に対して、
ｉ）５’側、または
ｉｉ）３’側、または
ｉｉｉ）一部が５’側、一部が３’側
のいずれかに位置している。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、選択マーカーをコードする発現カセットの、５’側に位置する部分は、開始コドンに作動可能に連結されたプロモーター配列を含み、プロモーター配列は、上流側で、それぞれ、第２、第３、または第４の発現カセットと隣接し（すなわち、第２、第３、または第４の発現カセットに対して下流の位置にあり）、開始コドンは、下流側で第３の組換え認識配列と隣接し（すなわち、第３の組換え認識配列に対して上流の位置にあり）；かつ、選択マーカーをコードする発現カセットの、３’側に位置する部分は、開始コドンを欠く選択マーカーをコードする核酸を含み、上流側で第３の組換え認識配列と隣接し、下流側で第３、第４、または第５の発現カセットと隣接している。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、開始コドンは転写開始コドンである。一実施態様では、開始コドンはＡＴＧである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、第１のデオキシリボ核酸は第１のベクターに組み込まれ、第２のデオキシリボ核酸は第２のベクターに組み込まれる。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、発現カセットのそれぞれは、５’から３’の方向に、プロモーターと、コード配列と、ポリアデニル化シグナル配列と、任意で、それに続くターミネーター配列とを含む。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンＡを有するまたは有しないヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーターはｈＧＴターミネーターである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンＡを有するヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はｂＧＨポリアデニル化シグナル配列であり、かつターミネーターはｈＧＴターミネーターであり；ただし例外として選択マーカーの発現カセットでは、プロモーターがＳＶ４０プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列であり、かつターミネーターが存在しない。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。一実施態様において、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞である。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、二価の単一特異性抗体、二価の二重特異性抗体、少なくとも１つのドメイン交換を含む二価の二重特異性抗体、および少なくとも１つのドメイン交換を含む三価の二重特異性抗体からなるポリペプチドの群より選択される。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、第１の軽鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、第１の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、第２の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の重鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含む、第１の軽鎖、および
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含む、第２の軽鎖
を含み、
第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインが第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインが第２の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、ＣＬドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、第１の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、第２の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の軽鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインとを含む、第１の軽鎖、および
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含む、第２の軽鎖
を含み、
第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインが第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインが第２の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、第１の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の軽鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、第２の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の重鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含む、第１の軽鎖、および
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含む、第２の軽鎖
を含み、
第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインが第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインが第２の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、第１の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＬドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、第２の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の軽鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインとを含む、第１の軽鎖、および
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含む、第２の軽鎖
を含み、
第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインが第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインが第２の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ多量体ポリペプチドであって、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、第１の軽鎖可変ドメインとを含む、第１の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、第２の重鎖可変ドメインとを含む、第２の重鎖、および
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含む、第１の軽鎖
を含み、
第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインが第１の結合部位を形成し、第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインが第２の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、ヘテロ四量体ポリペプチドであって、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、ペプチドリンカーと、第２の重鎖可変ドメインと、ＣＬドメインとを含む、第１の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含む、第２の重鎖、
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の軽鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインとを含む、第１の軽鎖、および
－Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含む、第２の軽鎖
を含み、
第２の重鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖可変ドメインが第１の結合部位を形成し、第１の重鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖可変ドメインが第２の結合部位を形成する、
ヘテロ四量体ポリペプチドである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは治療用抗体である。好ましい実施態様において、治療用抗体は、二重特異性（治療用）抗体である。一態様において、二重特異性（治療用）抗体はＴＣＢである。

すべての態様および実施態様の一実施態様では、ポリペプチドは、二重特異性（治療用）抗体（ＴＣＢ）であって、
－第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片と、
－第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第１の抗原に特異的に結合し、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）と可変重鎖ドメイン（ＶＨ）とが互いに置き換えられるようにドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片と、
－第１のＦｃ領域ポリペプチドおよび第２のＦｃ領域ポリペプチドを含む、Ｆｃ領域と
を含み、
第１および第２のＦａｂ断片がそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端が、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合しており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端が、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合し、第３のＦａｂ断片の重鎖定常ドメイン１のＣ末端が、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合している、
二重特異性（治療用）抗体（ＴＣＢ）である。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、抗ＣＤ３／ＣＤ２０二重特異性抗体である。一態様において、抗ＣＤ３／ＣＤ２０二重特異性抗体はＴＣＢであり、ＣＤ２０は第２の抗原である。特定の実施態様では、抗ＣＤ３／ＣＤ２０抗体はＲＧ６０２６である。

本発明のデオキシリボ核酸の個々の発現カセットは、逐次的に配置される。１つの発現カセットの終わりとその後の次の発現カセットの開始との間の距離は、ほんの数ヌクレオチドであり、これはクローニング手順に必要であった、すなわちクローニング手順の結果であった。

発明の態様の詳細な説明
異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法および前記組換え哺乳動物細胞を用いて異種ポリペプチドを生産するための方法が、本明細書において報告される。

本発明は、少なくとも部分的に、例えばＣｒｅＤＮＡ（Ｃｒｅプラスミド）を用いる場合と比較してＣｒｅリコンビナーゼＣｒｅｍＲＮＡが唯一の供給源として使用される場合に、標的指向性組込みによって得られるクローンの数を改善することができるという知見に基づいている。より詳細には、選択期間後にＣＲＥｍＲＮＡ作製組換え細胞プールにおけるクローンの絶対数が、ＣＲＥプラスミド作製組換え細胞プールにおけるよりも大きいことが発見された（実施例６、ならびに図２、３、および４を参照のこと）。よって、ＣＲＥプラスミドの代わりにＣＲＥｍＲＮＡを使用することにより、より大きなサイズと異質性を有する組換え細胞プールが生産される。この理論に拘束されることなく、それにより、高力価で良好な製品品質を有する組換え細胞クローンを同定する可能性が高まると想定される。さらに、ＣＲＥプラスミド作製細胞プールと比較して、ＣＲＥｍＲＮＡ作製プールからの組換え細胞クローンの数の増加は安定している。

Ｉ．定義
本発明を実行するための有用な方法および技術は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（ｅｄ．），ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＶｏｌｕｍｅｓＩｔｏＩＩＩ（１９９７）；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｎ．Ｄ．，ａｎｄＨａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｄ．，ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＶｏｌｕｍｅｓＩａｎｄＩＩ（１９８５），ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．（ｅｄ．），ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ－ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓＬｉｍｉｔｅｄ（１９８６）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔａｌ．，ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣＨＳＬＰｒｅｓｓ（１９９２）；Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．，ＦｒｏｍＧｅｎｅｓｔｏＣｌｏｎｅｓ；Ｎ．Ｙ．，ＶＣＨＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８７）；Ｃｅｌｉｓ，Ｊ．，ｅｄ．，ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（１９９８）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．，ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，ＡｌａｎＲ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）に記載されている。

組換えＤＮＡ技術の使用は、核酸の誘導体生成を可能にする。このような誘導体は、例えば、置換、変更、交換、欠失または挿入によって、個々のまたはいくつかのヌクレオチド位置で修飾することができる。修飾または誘導体化は、例えば、部位特異的変異誘発によって行うことができる。このような修飾は、当業者によって容易に行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（１９９９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＵＳＡ、Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ａｎｄＨｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ－ａｐｒａｃｔｉｃａｌａｐｐｒｏａｃｈ（１９８５）ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）。

本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数形を含む。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のこのような細胞および当業者に公知のその均等物などを含む。同様に、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたはより多く」および「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用することができる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」という用語は、相互交換可能に使用することができることにも留意されたい。

「約」という用語は、その後に続く数値の±２０％の範囲を表す。一実施態様において、約という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を表す。一実施態様において、約という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を表す。

「Ｃｒｅリコンビナーゼ」という用語は、ＬｏｘＰ部位間のトポイソメラーゼＩ様のメカニズムを使用して部位特異的なリコンビナーゼを触媒するチロシンリコンビナーゼを表す。酵素の分子量は約３８ｋＤａであり、酵素は３４３のアミノ酸残基からなる。酵素はインテグラーゼファミリーのメンバーである。Ｃｒｅリコンビナーゼは、アミノ酸配列：
ＭＳＮＬＬＴＶＨＱＮＬＰＡＬＰＶＤＡＴＳＤＥＶＲＫＮＬＭＤＭＦＲＤＲＱＡＦＳＥＨＴＷＫＭＬＬＳＶＣＲＳＷＡＡＷＣＫＬＮＮＲＫＷＦＰＡＥＰＥＤＶＲＤＹＬＬＹＬＱＡＲＧＬＡＶＫＴＩＱＱＨＬＧＱＬＮＭＬＨＲＲＳＧＬＰＲＰＳＤＳＮＡＶＳＬＶＭＲＲＩＲＫＥＮＶＤＡＧＥＲＡＫＱＡＬＡＦＥＲＴＤＦＤＱＶＲＳＬＭＥＮＳＤＲＣＱＤＩＲＮＬＡＦＬＧＩＡＹＮＴＬＬＲＩＡＥＩＡＲＩＲＶＫＤＩＳＲＴＤＧＧＲＭＬＩＨＩＧＲＴＫＴＬＶＳＴＡＧＶＥＫＡＬＳＬＧＶＴＫＬＶＥＲＷＩＳＶＳＧＶＡＤＤＰＮＮＹＬＦＣＲＶＲＫＮＧＶＡＡＰＳＡＴＳＱＬＳＴＲＡＬＥＧＩＦＥＡＴＨＲＬＩＹＧＡＫＤＤＳＧＱＲＹＬＡＷＳＧＨＳＡＲＶＧＡＡＲＤＭＡＲＡＧＶＳＩＰＥＩＭＱＡＧＧＷＴＮＶＮＩＶＭＮＹＩＲＮＬＤＳＥＴＧＡＭＶＲＬＬＥＤＧＤ
（配列番号１２）
を有し、
ＣｒｅｍＲＮＡは、配列：
ＡＵＧＡＧＣＡＡＣＣＵＧＣＵＧＡＣＣＧＵＧＣＡＣＣＡＧＡＡＣＣＵＧＣＣＣＧＣＣＣＵＧＣＣＣＧＵＧＧＡＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＧＧＵＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＵＧＡＵＧＧＡＣＡＵＧＵＵＣＡＧＧＧＡＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＵＵＣＡＧＣＧＡＧＣＡＣＡＣＣＵＧＧＡＡＧＡＵＧＣＵＧＣＵＧＡＧＣＧＵＧＵＧＣＡＧＧＡＧＣＵＧＧＧＣＣＧＣＣＵＧＧＵＧＣＡＡＧＣＵＧＡＡＣＡＡＣＡＧＧＡＡＧＵＧＧＵＵＣＣＣＣＧＣＣＧＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＣＧＵＧＡＧＧＧＡＣＵＡＣＣＵＧＣＵＧＵＡＣＣＵＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＧＧＣＣＵＧＧＣＣＧＵＧＡＡＧＡＣＣＡＵＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＵＧＧＧＣＣＡＧＣＵＧＡＡＣＡＵＧＣＵＧＣＡＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＧＧＣＣＵＧＣＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＧＣＣＧＵＧＡＧＣＣＵＧＧＵＧＡＵＧＡＧＧＡＧＧＡＵＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＣＧＵＧＧＡＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＧＧＧＣＣＡＡＧＣＡＧＧＣＣＣＵＧＧＣＣＵＵＣＧＡＧＡＧＧＡＣＣＧＡＣＵＵＣＧＡＣＣＡＧＧＵＧＡＧＧＡＧＣＣＵＧＡＵＧＧＡＧＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＧＧＵＧＣＣＡＧＧＡＣＡＵＣＡＧＧＡＡＣＣＵＧＧＣＣＵＵＣＣＵＧＧＧＣＡＵＣＧＣＣＵＡＣＡＡＣＡＣＣＣＵＧＣＵＧＡＧＧＡＵＣＧＣＣＧＡＧＡＵＣＧＣＣＡＧＧＡＵＣＡＧＧＧＵＧＡＡＧＧＡＣＡＵＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＧＧＣＡＧＧＡＵＧＣＵＧＡＵＣＣＡＣＡＵＣＧＧＣＡＧＧＡＣＣＡＡＧＡＣＣＣＵＧＧＵＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧＣＧＵＧＧＡＧＡＡＧＧＣＣＣＵＧＡＧＣＣＵＧＧＧＣＧＵＧＡＣＣＡＡＧＣＵＧＧＵＧＧＡＧＡＧＧＵＧＧＡＵＣＡＧＣＧＵＧＡＧＣＧＧＣＧＵＧＧＣＣＧＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＣＵＡＣＣＵＧＵＵＣＵＧＣＡＧＧＧＵＧＡＧＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＧＵＧＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＵＧＡＧＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＣＵＧＧＡＧＧＧＣＡＵＣＵＵＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＵＧＡＵＣＵＡＣＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＧＧＵＡＣＣＵＧＧＣＣＵＧＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣＡＧＧＧＵＧＧＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＵＧＧＣＣＡＧＧＧＣＣＧＧＣＧＵＧＡＧＣＡＵＣＣＣＣＧＡＧＡＵＣＡＵＧＣＡＧＧＣＣＧＧＣＧＧＣＵＧＧＡＣＣＡＡＣＧＵＧＡＡＣＡＵＣＧＵＧＡＵＧＡＡＣＵＡＣＡＵＣＡＧＧＡＡＣＣＵＧＧＡＣＡＧＣＧＡＧＡＣＣＧＧＣＧＣＣＡＵＧＧＵＧＡＧＧＣＵＧＣＵＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＧＡＣ
（配列番号１３）
またはそのコドン最適化バリアントを含む。

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」という用語も包含する。

用語「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、そのような細胞の子孫を含めて、１つまたは複数の外因性核酸が導入され、かつその後の遺伝子修飾のための開始点になることが目的とされる細胞を、包含する。したがって、用語「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む細胞を包含し、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する、少なくとも１つの第１の組換え認識配列および少なくとも１つの第２の組換え認識配列（これらのリコンビナーゼ認識配列は異なる）を含む。一実施態様では、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、宿主細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む細胞であり、この外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列はすべて異なる。

「核局在化配列」という用語は、本明細書で使用される場合、正に帯電したアミノ酸残基アルギニンまたは／およびリジンの複数のコピーを含むアミノ酸配列を表す。前記配列を含むポリペプチドは、細胞核への移入のために細胞によって同定される。例示的な核局在化配列は、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２５；ＳＶ４０ラージＴ抗原）、ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号２６、ＳＶ４０核質）、ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号２７；シノラブディス・エレガンスＥＧＬ－１３）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号２８、ヒトｃ－ｍｙｃ）、ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号２９、Ｅ．ｃｏｌｉｔｅｒｍｉｎｕｓｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｓｕｂｓｔａｎｃｅｐｒｏｔｅｉｎ）である。他の核局在化配列は、当業者によって容易に同定され得る。

本明細書において使用される場合、「組換え細胞」という用語は、最終的な遺伝子修飾後の細胞、例えば、目的のポリペプチドを発現し、前記目的のポリペプチドの任意の規模での生産のために使用できる細胞などを表す。例えば、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）に供され、それによって目的のポリペプチドのコード配列が宿主細胞のゲノム中に導入された「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」は、「組換え細胞」である。この細胞は、さらなるＲＭＣＥ反応を実施することが依然としてできるが、そうすることは目的ではない。

「ＬｏｘＰ部位」という用語は、末端の二つのパリンドローム１３ｂｐ配列（それぞれ、ＡＴＡＡＣＴＴＣＧＴＡＴＡ（配列番号１４）およびＴＡＴＡＣＧＡＡＧＴＴＡＴ（配列番号１５）と、中央の８ｂｐコア（対称ではない）スペーサー配列とからなる長さが３４ｂｐのヌクレオチド配列を表す。コアスペーサー配列は、ＬｏｘＰ部位の配向を決定する。互いに関するＬｏｘＰ部位の相対的な配向および位置に応じて、介在するＤＮＡは、切除されるか（ＬｏｘＰ部位は同じ方向に配向されている）か、または反転される（ＬｏｘＰ部位は反対方向に配向されている）。「フロックス」という用語は、二つのＬｏｘＰ部位間に位置するＤＮＡ配列を表す。二つのフロックス配列、つまり、ゲノム中の標的フロックス配列およびドナー核酸中のフロックス配列が存在する場合、両方の配列は互いに交換することができる。これは、「リコンビナーゼ媒介カセット交換」と呼ばれる。

例示的なＬｏｘＰ部位を以下の表に示す。

「外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞」および「組換え細胞」はどちらも、「形質転換細胞」である。この用語は、継代の回数に関わらず、初代形質転換細胞も、それに由来する子孫も含む。後代は、例えば、核酸含有量が親細胞と完全に同一でなくてもよいが、変異を含有していてもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同じ機能または生物活性を有している変異子孫は、包含される。

「単離された」組成物は、自然環境の構成成分から分離されたものである。いくつかの実施態様では、組成物は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動、ＣＥ－ＳＤＳ）またはクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、またはイオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって、９５％または９９％超の純度と決定されるまで精製される。例えば抗体純度の評価法の総説としては、例えばＦｌａｔｍａｎ，Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ｂ８４８（２００７）７９－８７を参照のこと。

「単離された」核酸は、その天然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸には、通常核酸分子を含有する細胞内に含有される核酸分子が含まれるが、核酸分子は、染色体外、または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。

「単離された」ポリヌクレオチドまたは抗体は、自然環境の構成成分から分離された、ポリペプチド分子または抗体分子を指す。

用語「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入される、細胞ゲノム内の核酸配列を意味する。特定の実施態様において、組込み部位は、細胞ゲノム中の隣り合う２つのヌクレオチドの間にある。特定の実施態様では、組込み部位は、ヌクレオチド配列のストレッチを含む。特定の実施態様において、組込み部位は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内に位置している。特定の実施態様において、組込み部位は、哺乳動物細胞の内因性遺伝子内にある。

相互交換可能に使用することができる「ベクター」または「プラスミド」という用語は、本明細書で使用される場合、連結された別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクターと、ベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターとを含む。ある種のベクターは、作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。

「結合する」という用語は、その標的への結合部位の結合を表す。例えば、それぞれの抗原への、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメインを含む抗体結合部位の結合である。この結合は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して測定することができる。すなわち、「（抗原への）結合」という用語は、インビトロアッセイにおいて、抗原への抗体の結合を表す。一実施態様では、結合は、抗体が表面に結合しており、かつ抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により測定される結合アッセイにおいて決定される。結合とは、例えば、１０^－８Ｍ以下、いくつかの実施態様において１０^－１３～１０^－８Ｍ、いくつかの実施態様において１０^－１３～１０^－９Ｍの結合親和性（Ｋ_Ｄ）を意味する。用語「結合する」は、用語「特異的に結合する」も含む。

例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイの１つの可能な実施態様では、抗原を表面に結合させ、抗体の結合、すなわちその結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。結合の親和性は、用語ｋ_ａ（会合定数：複合体を形成するための会合の速度定数）、ｋ_ｄ（解離定数、複合体の解離のための速度定数）、およびＫ_Ｄ（ｋ_ｄ／ｋ_ａ）によって定義される。あるいは、ＳＰＲセンサーグラムの結合シグナルを、共鳴シグナルの高さおよび解離挙動に関して、参照の応答シグナルと直接比較することができる。

「結合部位」という用語は、標的への結合特異性を示す任意のタンパク質性エンティティを表す。これは、例えば、受容体、受容体リガンド、アンチカリン、アフィボディ、抗体などであり得る。よって、本明細書で使用される場合の「結合部位」という用語は、第２のポリペプチドに特異的に結合することができるかまたは第２のポリペプチドにより特異的に結合され得るポリペプチドを表す。

本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、ある遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、または特異的に排除されることを可能にする遺伝子を表す。例えば、限定ではないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、それぞれの選択剤の存在下で積極的に選択されることを可能にすることができ（選択的培養条件）、形質転換されていない宿主細胞は、選択的培養条件下で増殖または生存することができない。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にすることができるのに対し、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞を選択的に排除することを可能にし得る。選択マーカーは、薬剤耐性を付与し、または宿主細胞の代謝的もしくは異化的欠陥を補い得る。原核細胞では、とりわけ、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、またはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子が使用され得る。真核細胞の選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシンおよびＧ４１８ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびマイコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。さらなるマーカー遺伝子は、国際公開第９２／０８７９６号および国際公開第９４／２８１４３号に記載されている。

対応する選択剤の存在下での選択を容易にすることを超えて、選択マーカーは、別法として、普通は細胞に存在しない分子、例えば、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅであってよい。例えば、コードされるポリペプチドが発する蛍光の検出または不在にそれぞれ基づいて、そのような分子を発現する細胞を、この遺伝子を内部に持たない細胞と区別することができる。

本明細書で使用される場合、「作動可能に連結される」という用語は、２つ以上の構成要素の並置を指し、構成要素は、意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーがコード配列の転写を調節するように作用する場合、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。特定の実施態様では、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は、単一の染色体上で近接し、隣接している。特定の実施態様では、例えば、分泌リーダーおよびポリペプチドなどの２つのタンパク質をコードする領域を結合する必要がある場合、配列は、連続して隣接し、同じリーディングフレーム内に存在する。特定の実施態様では、作動可能に連結されたプロモーターは、コード配列の上流に位置し、それに隣接し得る。特定の実施態様では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの構成要素は隣接していなくても、作動可能に連結され得る。エンハンサーは、コード配列の転写を増加させる場合、エンハンサーは、コード配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されたエンハンサーは、コード配列の上流、その中、または下流に位置し得、またコード配列のプロモーターから相当な距離を置いて位置し得る。作動可能な連結は、当技術分野で公知の組換え法によって、例えば、ＰＣＲ法を使用して、および／または都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成され得る。都合の良い制限部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来の方法に従って使用し得る。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が、５’末端に非依存的な方法により内部位置でＯＲＦの翻訳を開始できる場合、ＩＲＥＳは、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されている。

本明細書において使用される場合、用語「隣接する」は、第１のヌクレオチド配列が第２のヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端のいずれか、または両末端に位置していることを意味する。隣接するヌクレオチド配列は、第２のヌクレオチド配列に隣接するか、または第２のヌクレオチド配列から画定された距離にあり得る。隣接するヌクレオチド配列の長さに、具体的な制限はない。例えば、隣接配列は、数塩基対または数千塩基対であり得る。

デオキシリボ核酸は、コード鎖および非コード鎖を含む。用語「５’」および「３’」は、本明細書において使用される場合、コード鎖上の位置を指す。

本明細書において使用される場合、用語「外因性」は、あるヌクレオチド配列が特定の細胞に由来せず、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法によって前記細胞に導入されることを示す。したがって、外因性ヌクレオチド配列は人工配列であり、この人工物は、例えば、起源が異なる部分配列の組合せ（例えば、ＳＶ４０プロモーターを有するリコンビナーゼ認識配列と緑色蛍光性タンパク質のコード配列との組合せは、人工核酸である）から、または配列（例えば、膜結合型受容体の細胞外ドメインのみをコードする配列もしくはｃＤＮＡ）の部分的な欠失もしくは核酸塩基の変異から、生じ得る。用語「内因性」は、細胞に由来するヌクレオチド配列を意味する。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成が同一である「内因性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば組換えＤＮＡ技術によって細胞に導入されている。

抗体
ヒト免疫グロブリン軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に示されている。

「重鎖」という用語は、本明細書ではその元の意味で使用される。すなわち、抗体を形成する４本のポリペプチド鎖のうちのより大きな２本のポリペプチド鎖を表す（例えば、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ａｎｄＧａｌｌｙＪ．Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１１６（１９６２）２０７－２２７を参照のこと）。この文脈における「より大きな」という用語は、分子量、長さ、およびアミノ酸の数のいずれかを指すことができる。「重鎖」という用語は、そこに存在する個々の抗体ドメインの配列および数とは無関係である。重鎖は、それぞれのポリペプチドの文書利用に基づいてのみ割り当てられる。

本明細書において使用される場合、重鎖および軽鎖のすべての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ら，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔ，ｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔナンバリングシステム（６４７－６６０ページを参照のこと）は、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用され、Ｋａｂａｔ，ｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔＥＵインデックスナンバリングシステム（６６１－７２３ページを参照のこと）は、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３であって、本明細書ではこの場合、「ＫａｂａｔＥＵインデックスによるナンバリング」と称することによってさらに明確にしている）に使用される。

本明細書での「抗体」という用語は、最も広義に使用され、完全長抗体、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体－抗体断片－融合体、ならびにこれらの組み合わせを含む様々な抗体構造を包含するが、これらに限定されない。

「天然抗体」という用語は、さまざまな構造を有する天然に生じる免疫グロブリン分子を表す。例えば、ネイティブＩｇＧ抗体は、２本の同一の軽鎖と２本の同一の重鎖がジスルフィド結合したものを含む、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラメリック糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に向けて、各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）を有し、その後に３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）が続き、それによって、第１の重鎖定常ドメインと第２の重鎖定常ドメインとの間にヒンジ領域が位置している。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向けて、各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、その後に軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）が続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの一つに割り当てられてもよい。

「完全長抗体」という用語は、天然抗体の構造に実質的に類似した構造を有する抗体を表す。完全長抗体は、Ｎ末端からＣ末端の方向に可変領域および定常ドメインをそれぞれ含む２つ以上の完全長抗体軽鎖と、Ｎ末端からＣ末端の方向に可変領域、第１の定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の定常ドメイン、および第３の定常ドメインとをそれぞれ含む２つの抗体重鎖とを含む。天然抗体とは対照的に、完全長抗体は、例えば、１つまたは複数の追加のｓｃＦｖｓ、または重鎖もしくは軽鎖Ｆａｂ断片、または完全長抗体の異なる鎖の末端のうちの１つまたは複数にコンジュゲートしたｓｃＦａｂ（ただし、各末端には１つの断片のみ）などの、さらなる免疫グロブリンドメインを含み得る。これらのコンジュゲートもまた、完全長抗体という用語により包含される。

「抗体結合部位」という用語は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインのペアを表す。抗原への適切な結合を確実にするためには、これらの可変ドメインは、同族の可変ドメインであり、すなわち一緒に属している。抗体結合部位は、少なくとも３つのＨＶＲ（例えば、ＶＨＨの場合）または３～６つのＨＶＲ（例えば、天然に存在する、すなわち、ＶＨ／ＶＬペアを有する従来の抗体の場合）を含む。一般に、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基が、結合部位を形成している。これらの残基は通常、抗体重鎖可変ドメインと対応する抗体軽鎖可変ドメインのペアに含有される。抗体の抗原結合部位は、「超可変領域」または「ＨＶＲ」からのアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」領域は、本明細書で定義される超可変領域残基以外の可変ドメイン領域である。したがって、抗体の軽鎖および重鎖の可変ドメインは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、領域ＦＲ１、ＨＶＲ１、ＦＲ２、ＨＶＲ２、ＦＲ３、ＨＶＲ３、およびＦＲ４を含む。特に、重鎖可変ドメインのＨＶＲ３領域は、抗原結合に最も寄与し、抗体の結合特異性を定義する領域である。「機能的結合部位」は、その標的に特異的に結合することができる。「特異的に結合する」という用語は、インビトロアッセイにおいて、標的への結合部位の結合を表し、一実施態様では、結合アッセイにおいてである。そのような結合アッセイは、結合イベントが検出され得る限り、任意のアッセイであり得る。例えば、抗体を表面に結合させ、抗体への抗原の結合が表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、結合アッセイである。あるいは、ブリッジングＥＬＩＳＡを使用することができる。

本明細書で用いられる「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変である、アミノ酸残基ストレッチを含む抗体可変ドメインの領域（「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」）および／または構造的に既定されるループ（「超可変ループ」）を形成する抗体可変ドメインの領域および／または抗原に接触する残基（「抗原コンタクト（ａｎｔｉｇｅｎｃｏｎｔａｃｔ）」を含有する抗体可変ドメインの領域のそれぞれを指す。一般的に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、重鎖可変ドメインＶＨに３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、軽鎖可変ドメインＶＬに３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）である。

ＨＶＲには、次のものが含まれる：
（ａ）アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）、および９６～１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７）９０１－９１７）；
（ｂ）アミノ酸残基２４～３４（Ｌ１）、５０～５６（Ｌ２）、８９～９７（Ｌ３）、３１～３５ｂ（Ｈ１）、５０～６５（Ｈ２）、および９５～１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈｅｄ．ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１－３２４２．）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ～３６（Ｌ１）、４６～５５（Ｌ２）、８９～９６（Ｌ３）、３０～３５ｂ（Ｈ１）、４７～５８（Ｈ２）、および９３～１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６））、ならびに
（ｄ）アミノ酸残基４６～５６（Ｌ２）、４７～５６（Ｌ２）、４８～５６（Ｌ２）、４９～５６（Ｌ２）、２６～３５（Ｈ１）、２６～３５ｂ（Ｈ１）、４９～６５（Ｈ２）、９３～１０２（Ｈ３）、および９４～１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、および／または（ｃ）の組合せ。

別段の指示がない限り、ＨＶＲ残基および可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、上記のＫａｂａｔらに従ってナンバリングされている。

抗体の「クラス」は、定常ドメインまたは定常領域、好ましくは重鎖が持つＦｃ領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラスがあり、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に更に分ける場合がある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

「重鎖定常領域」という用語は、定常ドメインを含有する免疫グロブリン重鎖の領域、すなわち、天然免疫グロブリンの場合、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを表し、完全長免疫グロブリンの場合、第１の定常ドメイン、ヒンジ領域、第２の定常ドメイン、および第３の定常ドメインを表す。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域は、Ａｌａ１１８から重鎖のカルボキシ末端に延びる（ＫａｂａｔＥＵインデックスによるナンバリング）。しかしながら、定常領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、存在していなくてもよい（ＫａｂａｔＥＵインデックスによるナンバリング）。「定常領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合的に連結し得る２つの重鎖定常領域を含む二量体を表す。

「重鎖Ｆｃ領域」という用語は、少なくともヒンジ領域の一部（中間および下部ヒンジ領域）、第２の定常ドメイン、例えばＣＨ２ドメイン、および第３の定常ドメイン、例えばＣＨ３ドメインを含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を表す。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ａｓｐ２２１またはＣｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端に延びる（ＫａｂａｔＥＵインデックスによるナンバリング）。したがって、Ｆｃ領域は定常領域よりも小さいが、Ｃ末端部分はそれと同一である。しかしながら、重鎖Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、存在していなくてもよい（ＫａｂａｔＥＵインデックスによるナンバリング）。「Ｆｃ領域」という用語は、鎖間ジスルフィド結合を形成するヒンジ領域システイン残基を介して互いに共有結合的に連結し得る２つの重鎖Ｆｃ領域を含む二量体を表す。

抗体の定常領域、より正確にはＦｃ領域（および同様の定常領域）は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化およびＦｃ受容体結合に直接関与する。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における画定された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０、Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ２８８（１９８０）３３８－３４４、Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ８６（１９９５）３１９－３２４、およびＥＰ０３０７４３４において記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて画定される。

本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、同一であり、および／または同じエピトープに結合するが、例えば、自然発生変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得るバリアント抗体は例外であり、かかるバリアントは一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように解釈すべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されないさまざまな技術によって作製されてもよい。

本願内で使用される場合の「価」という用語は、抗体における特定数の結合部位の存在を表す。このように、「二価」、「四価」および「六価」という用語は、抗体中、それぞれ二つの結合部位、四つの結合部位および六つの結合部位の存在を表す。

「単一特異性抗体」は、単一の結合特異性を有する、すなわち１つの抗原に特異的に結合する抗体を表す。単一特異性抗体を、完全長抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２）またはそれらの組合せ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）として調製することができる。単一特異性抗体は、一価である必要はない。すなわち、単一特異性抗体は、１つの抗原に特異的に結合する２つ以上の結合部位を含んでもよい。例えば、天然型の抗体は、単一特異性であるが二価である。

「多重特異性抗体」は、同じ抗原または２つの異なる抗原上の少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体を表す。多重特異性抗体を、完全長抗体もしくは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）_２二重特異性抗体）またはそれらの組合せ（例えば、完全長抗体と追加のｓｃＦｖまたはＦａｂ断片）として調製することができる。多重特異性抗体は、少なくとも二価である。すなわち、２つの抗原結合部位を含む。また、多重特異性抗体は、少なくとも二重特異性である。したがって、二価の二重特異性抗体は、多重特異性抗体の最も単純な形態である。２つ、３つまたはより多く（例えば、４つ）の機能的な抗原結合部位を有する操作された抗体が報告されている（例えば、ＵＳ２００２／０００４５８７Ａ１を参照）。

特定の実施態様において、抗体は、多重特異性抗体、例えば、少なくとも二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原またはエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様において、結合特異性の一方は、第１の抗原に対するものであり、他方は、異なる第２の抗原に対するものである。特定の実施態様において、多重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させることもできる。

多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体－抗体断片融合体として調製され得る。

多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ３０５（１９８３）５３７－５４０、国際公開第９３／０８８２９号およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、ＥＭＢＯＪ．１０（１９９１）３６５５－３６５９参照）および「ノブインホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書を参照）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するために静電気的ステアリング効果を操作すること（ＷＯ２００９／０８９００４）；２つまたはそれ以上の抗体または断片を架橋結合すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９（１９８５）８１－８３参照）；二重特異性抗体を作製するためにロイシンジッパーを使用すること（例えばＫｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７－１５５３参照）；二重特異性抗体断片を作製するために「特異的な」技術を使用すること（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０（１９９３）６４４４－６４４８参照）；一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えばＧｒｕｂｅｒ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（１９９４）５３６８－５３７４参照）；ならびに例えばＴｕｔｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）６０－６９に記載のように三重特異性抗体を調製することによって作製され得る。

抗体または断片は、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、ＷＯ２０１０／１１２１９３、，ＷＯ２０１０／１１５５８９、ＷＯ２０１０／１３６１７２、ＷＯ２０１０／１４５７９２、またはＷＯ２０１０／１４５７９３に記載される多重特異性抗体でもあり得る。

抗体またはその断片は、国際公開第２０１２／１６３５２０号に開示されている多重特異性抗体でもあり得る。

二重特異性抗体は、一般に、同じ抗原上の２つの異なる重複しないエピトープまたは異なる抗原上の２つのエピトープに特異的に結合する抗体分子である。

異なる二重特異性抗体フォーマットが知られている。

例示的な二重特異性抗体フォーマットは、以下の通りである。
－ドメイン交換を有する完全長抗体：
第１のＦａｂ断片および第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
第１のＦａｂ断片において、
ａ）ＣＨ１およびＣＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨおよびＶＬドメインのみが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含む）；または
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに置き換えられ、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに置き換えられている（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＬドメインを含む）；
第２のＦａｂ断片が、ＶＬおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
ドメイン交換された抗体は、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖およびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖を含み得、両方のＣＨ３ドメインは、第１の重鎖および改変された第２の重鎖のヘテロ二量体化をサポートするために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的になるように操作されており、このことは、例えばＷＯ９６／２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、ＥＰ１８７０４５９、ＷＯ２００７／１１０２０５、ＷＯ２００７／１４７９０１、ＷＯ２００９／０８９００４、ＷＯ２０１０／１２９３０４、ＷＯ２０１１／９０７５４、ＷＯ２０１１／１４３５４５、ＷＯ２０１２／０５８７６８、ＷＯ２０１３／１５７９５４、またはＷＯ２０１３／０９６２９１（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている；
－ドメイン交換および追加の重鎖Ｃ末端結合部位を有する完全長抗体：
多重特異性ＩｇＧ抗体であって、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体と、
ｂ）さらなるＦａｂ断面が、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合し、さらなるＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、１つのさらなるＦａｂ断片と
を含み、
第２の抗原に特異的に結合するさらなるＦａｂ断片が、ｉ）ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）が互いに置き換えられか、もしくはｂ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１）が互いに置き換えられるように、ドメインクロスオーバーを含むか、またはｉｉ）一本鎖Ｆａｂ断片である；
－１アーム一本鎖フォーマット（＝１アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ノブ変異あり）
－重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ホール変異あり）；
－２アーム一本鎖フォーマット（＝２アーム一本鎖抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－軽鎖／重鎖１の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ホール変異あり）
－軽鎖／重鎖２の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ノブ変異あり）；
－一般的な軽鎖二重特異性フォーマット（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：
第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ホール変異あり）
－重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ＣＨ３、ノブ変異あり）。

この文脈における「非重複」という用語は、二重特異性Ｆａｂの第１のパラトープ内に含まれるアミノ酸残基が第２のパラトープ内に含まれず、二重特異性Ｆａｂの第２のパラトープ内に含まれるアミノ酸が第１のパラトープ内に含まれないことを示す。

「ノブ・イントゥー・ホール」二量体化モジュールおよび抗体操作におけるその使用は、ＣａｒｔｅｒＰ．；ＲｉｄｇｗａｙＪ．Ｂ．Ｂ．；ＰｒｅｓｔａＬ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ２，Ｎｕｍｂｅｒ１，Ｆｅｂｒｕａｒｙ１９９６，ｐｐ．７３－７３（１）に記載されている。

抗体の重鎖のＣＨ３ドメインを、「ノブ・イントゥー・ホール」技術によって改変することができる。例えば、ＷＯ９６／０２７０１１、Ｒｉｄｇｗａｙ，Ｊ．Ｂ．ら、ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．９（１９９６）６１７－６２１、およびＭｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（１９９８）６７７－６８１に、いくつかの例を伴って詳細に記載されている。この方法では、２つのＣＨ３ドメインの相互作用表面を改変して、これら２つのＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化を増加させ、それによってそれらを含むポリペプチドのヘテロ二量体化を増加させる。（２つの重鎖の）２つのＣＨ３ドメインのそれぞれは「ノブ」であることができ、他方は「ホール」である。ジスルフィドブリッジの導入はさらに、ヘテロ二量体を安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１；Ａｔｗｅｌｌ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０（１９９７）２６－３５）、収率を増加させる。

（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｗは、「ノブ変異」または「変異ノブ」として表され、（抗体重鎖の）ＣＨ３ドメインの変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、「ホール変異」または「変異ホール」として表される（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）。ＣＨ３ドメイン間の追加の鎖間ジスルフィド架橋（Ｍｅｒｃｈａｎｔ，Ａ．Ｍ．ら、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８）６７７－６８１）も、例えば、「ノブ変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＳ３５４Ｃ変異を導入（「ノブ－ｃｙｓ－変異」または「変異ノブ－ｃｙｓ」と表記）すること、および「ホール変異」を有する重鎖のＣＨ３ドメインにＹ３４９Ｃ変異を導入（「ホール－ｃｙｓ－変異」または「変異ホール－ｃｙｓ」と表記）することにより、使用できる（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによるナンバリング）。

「ドメインクロスオーバー」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体重鎖ＶＨ－ＣＨ１断片とその対応する同族の抗体軽鎖とのペアにおいて、すなわち抗体Ｆａｂ（断片－抗原結合）において、少なくとも１つの重鎖ドメインが、対応する軽鎖ドメインによって置換されている、もしくはその逆、という点について、ドメイン配列が天然型の抗体の配列から逸脱していることを表す。ドメインクロスオーバーは、一般的に３種類あり、（ｉ）ＣＨ１およびＣＬドメインのクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列（またはＶＨ－ＣＬ－ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ドメイン配列を有する完全長抗体重鎖）がもたらされるもの、（ｉｉ）ＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバーであって、軽鎖中のドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＬドメイン配列がもたらされ、重鎖断片中のドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＨ１ドメイン配列がもたらされるもの、ならびに（ｉｉｉ）完全な軽鎖（ＶＬ－ＣＬ）および完全なＶＨ－ＣＨ１重鎖断片のドメインクロスオーバー（「Ｆａｂクロスオーバー」）であって、ドメインクロスオーバーによってＶＨ－ＣＨ１ドメイン配列を有する軽鎖がもたらされ、ドメインクロスオーバーによってＶＬ－ＣＬドメイン配列を有する重鎖断片がもたらされるもの（上述のすべてのドメイン配列は、Ｎ末端からＣ末端への方向で示されている）がある。

本明細書で使用される場合、対応する重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインに関して「互いに置き換えられた」という用語は、上述のドメインクロスオーバーを指す。そのため、ＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、用語は、項目（ｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバー、ならびに結果として生じる重鎖および軽鎖ドメイン配列を指す。したがって、ＶＨおよびＶＬが「互いに置き換えられた」場合、用語は、項目（ｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指し、またＣＨ１およびＣＬドメインが「互いに置き換えられ」、かつＶＨおよびＶＬドメインが「互いに置き換えられた」場合、用語は、項目（ｉｉｉ）の下で言及されたドメインクロスオーバーを指す。ドメインクロスオーバーを含む二重特異性抗体は、例えば、ＷＯ２００９／０８０２５１、ＷＯ２００９／０８０２５２、ＷＯ２００９／０８０２５３、ＷＯ２００９／０８０２５４、およびＳｃｈａｅｆｅｒ，Ｗ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ１０８（２０１１）１１１８７－１１１９２において報告されている。そのような抗体は、通常、ドメイン交換された抗体またはＣｒｏｓｓＭａｂと呼ばれている。

多重特異性抗体はまた、一実施態様では、上記の項目（ｉ）で述べたＣＨ１およびＣＬドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目（ｉｉ）で述べたＶＨおよびＶＬドメインのドメインクロスオーバー、または上記の項目（ｉｉｉ）で述べたＶＨ－ＣＨ１およびＶＬ－ＶＬドメインのドメインクロスオーバーのいずれかを含む、少なくとも１つのＦａｂ断片を含む。ドメインクロスオーバーを伴う多重特異性抗体の場合、同じ抗原に特異的に結合するＦａｂは、同じドメイン配列であるように構築される。そのため、ドメインクロスオーバーを伴う２つ以上のＦａｂが、多重特異性抗体に含まれる場合、前記Ｆａｂは、同じ抗原に特異的に結合する。

「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基、およびヒトＦＲからのアミノ酸残基を含む抗体を指す。ある特定の実施態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むものであり、それにおいて、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに相当し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに相当する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。

「組換え抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、組換え手段により調製、発現、作製、または単離された全ての抗体（キメラ、ヒト化、およびヒト）、例えば組換え細胞を表す。これには、ＮＳ０、ＨＥＫ、ＢＨＫ、またはＣＨＯ細胞などの組換え細胞から単離された抗体が含まれる。

本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含む、インタクトな抗体以外の分子を指し、すなわちそれは、機能的な断片である。抗体断片の例としては、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性Ｆａｂ、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂ）が挙げられる。

ＩＩ．組成物および方法
通常、例えば治療用ポリペプチドのような目的のポリペプチドの組換え大量生産のためには、前記ポリペプチドを安定に発現し分泌する細胞が必要とされる。この細胞は、「組換え細胞」または「組換え生産細胞」と呼ばれ、このような細胞を作製するために使用される方法は「細胞株開発」と呼ばれる。細胞株開発方法の第１の工程において、例えばＣＨＯ細胞などの適切な宿主細胞に、前記目的のポリペプチドの発現に適した核酸配列をトランスフェクトする。第２の工程において、目的のポリペプチドを安定に発現する細胞を、目的のポリペプチドをコードする核酸と共にコトランスフェクトしておいた選択マーカーの共発現に基づいて選択する。

ポリペプチドをコードする核酸、すなわちコード配列は、構造遺伝子と呼ばれる。このような構造遺伝子は単純な情報であり、その発現には追加の制御エレメントが必要とされる。したがって、普通は、構造遺伝子は発現カセットに組み込まれる。発現カセットが哺乳動物細胞において機能的となるために必要とされる最小限の制御エレメントは、構造遺伝子の上流、すなわち５’側に位置する、前記哺乳動物細胞において機能的なプロモーター、および構造遺伝子の下流、すなわち３’側に位置する、前記哺乳動物細胞において機能的なポリアデニル化シグナル配列である。プロモーター配列、構造遺伝子配列、およびポリアデニル化シグナル配列は、作動可能に連結された形態で並べられる。

目的のポリペプチドが、互いに異なる（単量体）ポリペプチドから構成されるヘテロ多量体ポリペプチドであるならば、１つの発現カセットだけでなく、含まれる構造遺伝子が異なる多数の発現カセット、すなわち、ヘテロ多量体ポリペプチドの異なる（単量体）ポリペプチドのそれぞれについて少なくとも１つの発現カセットが必要とされる。例えば、完全長抗体は、軽鎖の２個のコピーおよび重鎖の２個のコピーを含むヘテロ多量体ポリペプチドである。したがって、完全長抗体は、２つの異なるポリペプチドから構成される。したがって、完全長抗体の発現のためには２つの発現カセット、すなわち軽鎖のための１個および重鎖のための１個が必要とされる。例えば、完全長抗体が二重特異性抗体である、すなわち抗体が、２つの異なる抗原に特異的に結合する２つの異なる結合部位を含む場合、軽鎖同士も互いに異なり、重鎖同士も互いに異なる。したがって、このような二重特異性完全長抗体は、４つの異なるポリペプチドから構成され、４つの発現カセットが必要とされる。

目的のポリペプチドのための発現カセットは、いわゆる「発現ベクター」に順に組み込まれる。「発現ベクター」は、細菌細胞中で前記ベクターを増幅し、かつ含まれる構造遺伝子を哺乳動物細胞中で発現させるのに必要とされるすべてのエレメントを提供する核酸である。典型的には、発現ベクターは、例えば大腸菌（E. coli）の場合、複製開始点および原核生物選択マーカー、さらには真核生物選択マーカー、ならびに目的の構造遺伝子の発現に必要とされる発現カセットを含む、原核生物プラスミド増殖単位を含む。「発現ベクター」は、哺乳動物細胞に発現カセットを導入するための輸送運搬体である。

以前のパラグラフで概説したように、発現しようとするポリペプチドが複雑であるほど、必要とされる異なる発現カセットの数もまた多くなる。本質的に、発現カセットの数と共に、宿主細胞のゲノム中に組み込まれる核酸のサイズも大きくなる。同時に、発現ベクターのサイズも大きくなる。しかし、ベクターのサイズの実用的な上限は約１５ｋｂｐの範囲にあり、それを上回ると、操作および処理の効率が著しく落ちる。この問題は、２つ以上の発現ベクターを用いることによって対処することができる。それによって、発現カセットを、発現カセットの一部のみをそれぞれ含む異なる発現ベクター間で分け合うことができる。

従来の細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的のポリペプチド（ＳＯＩ）のための発現カセットを有するベクターのランダム組込み（ＲＩ）に依拠している。一般に、ランダム手法によってベクターがトランスフェクトされる場合、いくつかのベクターまたはその断片が細胞ゲノム中に組み込まれる。したがって、ＲＩに基づくトランスフェクションプロセスは、予測不可能である。

このようにして、異なる発現ベクター間で発現カセットを分け合うことでサイズの問題に対処することにより、新たな問題―組み込まれる発現カセットの不揃いな数およびその空間的分布―が生じる。

通常、構造遺伝子の発現用の発現カセットが細胞ゲノム中により多く組み込まれるほど、発現される各ポリペプチドの量は多くなる。組み込まれた発現カセットの数のほかに、組込みの部位および遺伝子座も発現収率に影響を与える。例えば、発現カセットが、細胞ゲノム中の転写活性が低い部位に組み込まれる場合、コードされたポリペプチドはごく少量しか発現されない。しかし、同じ発現カセットが、細胞ゲノム中の転写活性が高い部位に組み込まれる場合、コードされたポリペプチドは多量に発現される。

ヘテロ多量体ポリペプチドの互いに異なるポリペプチドのための発現カセットが、同じ頻度で、かつ同程度の転写活性を有する遺伝子座にすべて組み込まれる限り、この発現の違いが問題を引き起こしてはいない。このような状況下では、多量体ポリペプチドに含まれるすべてのポリペプチドが同量で発現され、多量体ポリペプチドが正確に組み立てられる。

しかし、このシナリオが起こる可能性は非常に低く、２つより多いポリペプチドで構成される分子に対してこのシナリオを保証することはできない。例えば、ＷＯ２０１８／１６２５１７では、ｉ）発現カセット配列およびｉｉ）異なる発現ベクター間での発現カセットの分布に応じて、発現収率および生産物の質の大きな差異がＲＩによって観察されたことが開示されている。この理論に縛られるわけではないが、この観察結果は、異なる発現ベクターに由来する異なる発現カセットが、細胞中で異なる頻度で異なる遺伝子座に組み込まれ、その結果、ヘテロ多量体ポリペプチドに含まれる様々なポリペプチドが差次的に、すなわち適切ではない様々な比率で発現されるという事実に起因する。その結果、単量体ポリペプチドの一部が、相対的に多い量で存在し、それ以外が相対的に少ない量で存在する。ヘテロ多量体ポリペプチドに含まれる単量体がこのように不均衡であることが原因で、不完全な組立て、間違った組立て、および分泌速度の低下が起こる。前述のどれも、正確に折り畳まれたヘテロ多量体ポリペプチドの発現収率の低下、および生産物に関係する副産物の割合の上昇を招く。

従来のＲＩＣＬＤとは違って、標的指向性組込み（ＴＩ）ＣＬＤは、細胞ゲノム中のあらかじめ定められた「ホットスポット」に、様々な発現カセットを含む導入遺伝子を導入する。また、この導入は、所定の比率の発現カセットを用いる。その結果、この理論に縛られるわけではないが、ヘテロ多量体ポリペプチドに含まれる様々なポリペプチドのすべてが、同じ（または少なくとも同程度であり、少ししか違わない）速度かつ適切な比率で発現される。その結果、正確に組み立てられたヘテロ多量体ポリペプチドの量は増加するはずであり、生産物に関係する副産物の割合は低下するはずである。

また、所定のコピー数および所定の組込み部位が与えられたとすると、ＴＩによって得られる組換え細胞は、ＲＩによって得られる細胞と比べて、優れた安定性を有しているはずである。さらに、選択マーカーは、適切なＴＩを有する細胞を選択するためだけに使用され、高レベルの導入遺伝子発現を示す細胞を選択するためには使用されないことから、メトトレキサート（ＭＴＸ）またはメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）のような選択剤の変異誘発性が原因の一部である配列バリアント（ＳＶ）が生じる可能性を最小限にするために、変異誘発性の低いマーカーを適用してよい。

しかしながら、今日、ＣｒｅｍＲＮＡが例えばＣｒｅＤＮＡの代わりに使用される場合、標的指向性組込みによって得られたクローンの数は改善できることが分かっている。より詳細には、選択期間後にＣｒｅｍＲＮＡ作製組換え細胞プールにおけるクローンの絶対数が、Ｃｒｅプラスミド作製組換え細胞プールにおけるよりも大きいことが発見された。よって、ＣｒｅＤＮＡ（プラスミド）の代わりにＣｒｅｍＲＮＡを使用することにより、より大きなサイズと異質性を有する組換え細胞プールが生産される。この理論に拘束されることなく、それにより、高力価で良好な製品品質を有する組換え細胞クローンを発見する可能性が高まると想定される。さらに、ＣｒｅＤＮＡ（プラスミド）作製細胞プールと比較して、ＣｒｅｍＲＮＡ作製プールからの組換え細胞クローンの数の増加は安定している。

導入遺伝子の画定された組込みには、ＴＩ方法論が使用される。本発明は、２プラスミドリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）反応を用いて、ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を作製する新規の方法を提供する。改良点は、特に、画定された配列中の同じ遺伝子座における画定された組込み、ならびにそれによるポリペプチドの高発現および生産物に関係する副産物の形成の減少である。

本開示の主題は、ポリペプチドの安定な大量生産のために組換え哺乳動物細胞を生産するための方法だけでなく、ポリペプチドの生産力が高い組換え哺乳動物細胞もまた、提供する。

本明細書において使用される２プラスミドＲＭＣＥ戦略は、同じＴＩ遺伝子座に複数の発現カセットを挿入することを可能にする。

ＩＩ．ａ本発明の方法
本発明の一態様は、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞を作製するための方法、および前記組換え哺乳動物細胞を用いて異種ポリペプチドを生産するための方法である。

本発明は、少なくとも部分的に、例えばＣｒｅＤＮＡの代わりにＣｒｅｍＲＮＡが使用される場合、目的のタンパク質をコードする異種核酸でトランスフェクトされており、かつ前記異種核酸をそれらのゲノムへ安定して組み込んだ、標的指向性組込みによって得られた組換え哺乳動物細胞クローンの数、すなわち哺乳動物細胞の数が、改善され得るという知見に基づいている。より詳細には、選択期間後にリコンビナーゼの供給源としてＣｒｅｍＲＮＡのみを使用して作成された組換え細胞プール内のクローンの絶対数は、リコンビナーゼの供給源としてＣｒｅプラスミドを使用した組換え細胞プールにおけるものよりも多い。よって、ＣｒｅＤＮＡ（Ｃｒｅプラスミド）の代わりにＣｒｅｍＲＮＡを使用することにより、より大きなサイズと異質性を有する組換え細胞プールが生産される。これは、実施例６ならびに図２、３、および４に示される。この理論に拘束されることなく、それにより、高力価で良好な製品品質を有する組換え細胞クローンを発見する可能性が高まると想定される。さらに、本発明は、少なくとも部分的に、Ｃｒｅプラスミド作製細胞プールと比較して、ＣｒｅｍＲＮＡ作製プールからの組換え細胞クローンの数の増加は安定しているという知見に基づいている。

本発明の一態様は、異種ポリペプチドを発現する組換え哺乳動物細胞である。異種ポリペプチドの発現を実現するために、特定かつ所定の配列中に異なる発現カセットを含む組換え核酸が、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれた。

本発明の一態様は、組換え哺乳動物細胞の数を増加させるためのＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡの使用であって、前記細胞が、標的指向性組込みにより前記細胞のゲノム中の単一の部位に安定して組み込まれた目的の（異種）ポリペプチドをコードする（異種および／またはトランスジェニック）デオキシリボ核酸（の厳密に一つのコピー）を含む、使用である。一実施態様では、組換え細胞はまた、培養培地中で培養すると、目的のポリペプチドを培養培地中に分泌する。

本発明は、組換えＣＨＯ細胞などの組換え哺乳動物細胞を生産するために二重リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）を使用することができ、その際、所定かつ特定の発現カセット配列がゲノム中に組み込まれ、その結果として、異種ポリペプチドの効率的な発現および生産がもたらされるという知見に、少なくともある程度は基づいている。この組込みは、標的指向性組込みによって哺乳動物細胞のゲノムの特定の部位に引き起こされる。

標的指向性組込みでは、部位特異的組換えは、ドナーの核酸をＴＩ宿主細胞のゲノム中の特定の遺伝子座に導入するのに用いられる。これは、ゲノムに組み込まれた部位の配列がドナー核酸と交換される酵素プロセスである。このような核酸交換を実行するのに使用される一システムは、Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムである。交換を触媒する酵素はＣｒｅリコンビナーゼである。交換される配列は、ゲノム中およびドナー核酸中の二つのｌｏｘ部位の位置によって定義される。これらのｌｏｘ部位は、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識される。他に必要とされるものはなく、すなわちＡＴＰも必要とされない。元来、Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムはバクテリオファージＰ１で発見された。

Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムは、哺乳動物、植物、細菌、および酵母など、さまざまな種類の細胞で機能する。

ＲＭＣＥの効率は、他の要因の中でも、フロックスＤＮＡの長さによって決定される。フロックス配列の長さを増加させると、ＲＭＣＥ効率は減少する。

さらに、ＲＭＣＥの効率は、Ｃｒｅリコンビナーゼの起源の選択に依拠する。Ｃｒｅリコンビナーゼの不十分な発現は、非平行な組換えをもたらし、これは、ＲＭＣＥが抗体生産核酸の導入に使用される場合に有害である。

交換反応は酵素反応であるため、第１の交換反応が起こった後、酵素が依然として存在／活性である限り、ｌｏｘ部位が交換後にそれらの機能を保持するため、さらなる交換反応が可能である。よって、活性Ｃｒｅリコンビナーゼを含む細胞とそれらのゲノム中のｌｏｘＰ部位は、意図されたものだけでなく、意図されていない組換え事象が発生する傾向がある。

よって、Ｃｒｅ－ｌｏｘシステムの活性を適時制御して、一次的な意図された交換反応が生じた後、二次的な意図されていないさらなる交換反応を防止することが必要である。

これは、リコンビナーゼの唯一の供給源としてＣｒｅｍＲＮＡを使用する本発明の方法によって実現された。

Ｃｒｅリコンビナーゼの唯一の供給源としてＣｒｅＤＮＡをＣｒｅｍＲＮＡで置き換えることにより、ランダムな組込みとそれによるＣｒｅリコンビナーゼの持続活性の可能性が排除された。また、これは、ＣｒｅＤＮＡも組み込んだクローンのスクリーニングを実施する必要がないため、ワークロードの削減をもたらす。

ＣｒｅＤＮＡをＣｒｅｍＲＮＡに置き換えることにより、プールの増加と力価に関する単一クローンの品質を得ることができる。

ＣｒｅＤＮＡをＣｒｅｍＲＮＡに置き換えることにより、プールの増加と導入遺伝子発現に関する安定性を得ることができる。

例えば、ＴＩ後の生存率の回復に関しては、常に欠点はないが、ＣｒｅｍＲＮＡを使用すると改善が見られることがある（図２を参照のこと）。交換効率／プール品質に関しては、常に欠点はないが、ＣｒｅｍＲＮＡを使用すると改善が見られることがある（図３および４を参照のこと）。

複合抗体フォーマットの生産のためのＣＨＯプールは、リコンビナーゼの唯一の供給源としてＣＲＥプラスミドまたはＣＲＥｍＲＮＡのいずれかを用いて作製された。選択期間、すなわち、選択剤の存在下での培養の前後に、ＣＨＯプール内のクローンをＦＡＣＳによって分析した。

選択期間後、ＣＲＥｍＲＮＡ作製ＣＨＯプールにおける交換効率／プール品質は、ＣＲＥプラスミド作製ＣＨＯプールにおけるよりも高いことがわかった（図３および４を参照のこと）。よって、ＣＲＥＤＮＡの代わりにＣＲＥｍＲＮＡを使用することにより、より大きなサイズと異質性を有するＣＨＯプールが生産される。それにより、高力価で良好な製品品質を有するＣＨＯクローンを発見する可能性は高くなる。

さらにＣｒｅｍＲＮＡを使用して得られたクローンにおける生存率の回復は改善される（図２を参照のこと）。

さらに、ＣＲＥｍＲＮＡ作製ＣＨＯプールからのクローンは、ＣＲＥプラスミド作製ＣＨＯプールからのクローンと比較してより安定していることが予想される。

本発明を以下に要約する。

本発明の独立した１つの態様は、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、
ａ）哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なる、哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞に、２つのデオキシリボ核酸を含む組成物を導入する工程であって、当該２つのデオキシリボ核酸が、３つの異なる組換え認識配列および１～８つの発現カセットを含み、
第１のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
－第１の組換え認識配列と、
－１つまたは複数の発現カセットと、
－１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分と、
－第３の組換え認識配列の第１のコピーと、
を含み、かつ
第２のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
－第３の組換え認識配列の第２のコピーと、
－１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分と、
－１つまたは複数の発現カセットと、
－第２の組換え認識配列と、
を含み、
第１および第２のデオキシリボ核酸の第１～第３の組換え認識配列が、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列の第１～第３の組換え認識配列と一致しており、
前述の１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分および３’末端部分が、まとまると、前述の１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成する、
２つのデオキシリボ核酸を含む組成物を細胞に導入する工程；
ｃ）ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡを
ｉ）ｂ）の第１および第２のデオキシリボ核酸と同時に、または
ｉｉ）その後で逐次的に
のいずれかで導入する工程であって、
Ｃｒｅリコンビナーゼが、第１および第２のデオキシリボ核酸の組換え認識配列を認識する（かつ、任意で、１つまたは複数のリコンビナーゼが、２つのリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、
Ｃｒｅリコンビナーゼを導入する工程；ならびに、
ｄ）第２の選択マーカーを発現しポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程
を含み、
それによって、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつヒトＦｃＲｎを分泌する組換え哺乳動物細胞が生産される、
方法である。

ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸の哺乳動物細胞のゲノムへの安定した組込みは、発現カセットの特定の配列が維持される限り、当業者に知られる任意の方法によってなされ得る。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、少なくとも４つの発現カセットを含み、ここで、
－第１の組換え認識配列は、最も５’側（すなわち、第１）の発現カセットの５’側に位置しており、
－第２の組換え認識配列は、最も３’側の発現カセットの３’側に位置しており、
－第３の組換え認識配列は、
－第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列との間、かつ
－発現カセットのうちの２つの間
に位置しており、
組換え認識配列はすべて異なる。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、第３の組換え認識配列は、第４の発現カセットと第５の発現カセットとの間に位置している。

本発明のすべての態様および実施態様の一実施態様では、ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸は、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部が、３’側に一部が位置しており、前記発現カセットの、５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの、３’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含み、開始コドンはコード配列に作動可能に連結される。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、選択マーカーをコードする発現カセットは、第３の組換え認識配列の５’側に一部が、３’側に一部が位置しており、前記発現カセットの、５’側に位置する部分は、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの、３’側に位置する部分は、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含む。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ＣｒｅｍＲＮＡと第１のベクターおよび第２のベクターの混合物との間の重量比は、１：３から２：１の範囲にある。好ましい一実施態様では、ＣｒｅｍＲＮＡと第１のベクターおよび第２のベクターの混合物との間の重量比は、約１：５である。

ターミネーター配列は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる非常に長いＲＮＡ転写物の生成、すなわち、本発明のデオキシリボ核酸および本発明の方法で使用されるデオキシリボ核酸における次の発現カセットへのリードスルーを防止する。つまり、目的の１つの構造遺伝子の発現は、それ自体のプロモーターによって制御される。

よって、ポリアデニル化シグナルおよびターミネーター配列の組み合わせにより、効率的な転写終結が実現される。つまり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのリードスルーは、二重の終結シグナルの存在によって防止される。ターミネーター配列は、複雑な分解を開始し、ＤＮＡテンプレートからのＲＮＡポリメラーゼの解離を促進する。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はｂＧＨポリアデニル化シグナル配列であり、かつターミネーター配列はｈＧＴターミネーターであり；ただし例外として選択マーカーの発現カセットでは、プロモーターがＳＶ４０プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列部位がＳＶ４０ポリＡ部位であり、かつターミネーター配列が存在しない。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、哺乳動物細胞はＣＨＯ細胞である。一実施態様では、ＣＨＯ細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞である。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、二価の単一特異性抗体、少なくとも１つのドメイン交換を含む二価の二重特異性抗体、および少なくとも１つのドメイン交換を含む三価の二重特異性抗体からなるポリペプチドの群より選択される。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは治療用抗体である。好ましい実施態様において、多重特異性抗体は、二重特異性（治療用）抗体である。一態様において、二重特異性（治療用）抗体はＴＣＢである。

本発明のすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ポリペプチドは、二重特異性（治療用）抗体（ＴＣＢ）であって、
－第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片と、
－第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第１の抗原に特異的に結合し、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）と可変重鎖ドメイン（ＶＨ）とが互いに置き換えられるようにドメインクロスオーバーを含む、第３のＦａｂ断片と、
－第１のＦｃ領域ポリペプチドおよび第２のＦｃ領域ポリペプチドを含む、Ｆｃ領域と
を含み、
第１および第２のＦａｂ断片がそれぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端が、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片の重鎖定常ドメイン１のＣ末端が、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている。

本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、リコンビナーゼ認識配列は、Ｌ３、２Ｌ、およびＬｏｘＦａｓである。一実施態様では、Ｌ３は配列番号０１の配列を有し、２Ｌは配列番号０２の配列を有し、ＬｏｘＦａｓは配列番号０３の配列を有する。一実施態様では、第１のリコンビナーゼ認識配列はＬ３であり、第２のリコンビナーゼ認識配列は２Ｌであり、第３のリコンビナーゼ認識配列はＬｏｘＦａｓである。

本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列は、ｂＧＨポリＡ部位であり、ターミネーター配列は、ｈＧＴターミネーターである。

本発明のこれまでのすべての態様および実施形態のうちの一実施態様では、プロモーターは、イントロンＡを含むヒトＣＭＶプロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列はｂＧＨポリＡ部位であり、かつターミネーター配列はｈＧＴターミネーターであり；ただし例外として選択マーカーの発現カセットでは、プロモーターがＳＶ４０プロモーターであり、ポリアデニル化シグナル配列部位がＳＶ４０ポリＡ部位であり、かつターミネーター配列が存在しない。

本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号０４の配列を有する。一実施態様では、ヒトＣＭＶプロモーターは、配列番号０６の配列を有する。

本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ｂＧＨポリアデニル化シグナル配列は、配列番号０８である。

本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ｈＧＴターミネーターは、配列番号０９の配列を有する。

本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ＳＶ４０プロモーターは、配列番号１０の配列を有する。

本発明のこれまでのすべての態様および実施態様のうちの一実施態様では、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列は、配列番号０７である。

ＩＩ．ｂリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）
標的指向性組込みにより、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた部位に外因性ヌクレオチド配列が組み込まれることが可能になる。特定の実施態様では、標的指向性組込みは、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を認識するリコンビナーゼによって媒介される。特定の実施態様では、標的指向性組込みは、相同組換えによって媒介される。

「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列であり、リコンビナーゼ媒介性組換え事象に必要かつ十分である。ＲＲＳは、組換え事象がヌクレオチド配列内で発生する位置を定義するために使用され得る。

特定の実施態様では、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰＬ３配列、ＬｏｘＰ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ａｔｔＢ配列、φＣ３１ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ａｔｔＢ配列からなる群より選択される。複数のＲＲＳが存在しなければならない場合、同一でないＲＲＳが選択される限りにおいて、各配列の選択は他方に依存する。

特定の実施態様では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。

ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である特定の実施態様において、細胞は、組換えを行うためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＦＲＴ部位である特定の実施態様において、細胞は、組換えを行うためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＢｘｂ１ａｔｔＰ部位またはＢｘｂ１ａｔｔＢ部位である特定の実施態様において、細胞は、組換えを行うためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。ＲＲＳがφＣ３１ａｔｔＰ部位またはφＣ３１ａｔｔＢ部位である特定の実施態様では、細胞は、組換えを行うためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。これらのリコンビナーゼは、これらの酵素のコード配列を含む発現ベクターを用いて細胞中に導入することができる。

Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換え系は、多くの生物学的実験系で広く使用されている。Ｃｒｅは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。ＣｒｅはバクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内および分子間組換えの両方を媒介できる。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐの逆方向反復に挟まれた８ｂｐの非パリンドロームコア領域で構成されている。Ｃｒｅリコンビナーゼは１３ｂｐの反復に結合し、それによって８ｂｐのコア領域内の組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介性組換えは高効率で起こり、他の宿主因子を必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Ｃｒｅ媒介性組換えにより、２つのＬｏｘＰ配列の間に位置するＤＮＡ配列が共有結合で閉じた円として切り出される。２つのＬｏｘＰ配列が同じヌクレオチド配列上で逆方向の位置に配置されている場合、Ｃｒｅ媒介性組換えにより、２つの配列の間に位置するＤＮＡ配列の方向が反転する。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上にあり、１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅ媒介性組換えにより、環状ＤＮＡ配列の組込みをもたらす。

特定の実施態様では、ＬｏｘＰ配列は、野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施態様では、ＬｏｘＰ配列は、変異体ＬｏｘＰ配列である。変異体ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ媒介性組込みまたは置換の効率を高めるために開発された。特定の実施態様では、変異体ＬｏｘＰ配列は、ＬｏｘＰＬ３配列、ＬｏｘＰ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、およびＬｏｘ６６配列からなる群から選択される。例えば、Ｌｏｘ７１配列では、左側の１３ｂｐの反復で５ｂｐが変異している。Ｌｏｘ６６配列では、右側の１３ｂｐの反復で５ｂｐが変異している。野生型と変異体の両方のＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ依存性組換えを媒介し得る。

「一致するＲＲＳ」という用語は、２つのＲＲＳ間で組換えが起こることを示す。特定の実施態様では、２つの一致ＲＲＳは同一である。特定の実施態様では、両方のＲＲＳは野生型ＬｏｘＰ配列である。特定の実施態様では、両方のＲＲＳは変異体ＬｏｘＰ配列である。特定の実施態様では、両方のＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列である。特定の実施態様では、両方のＲＲＳは変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施態様では、２つの一致するＲＲＳは異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、第１の一致するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ａｔｔＰ配列であり、第２の一致するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ａｔｔＢ配列である。特定の実施態様では、第１の一致するＲＲＳはφＣ３１ａｔｔＢ配列であり、第２の一致するＲＲＳはφＣ３１ａｔｔＢ配列である。

ＩＩ．ｃＴＩに適した例示的哺乳動物細胞
前述したような、外因性核酸（「ランディング部位」）を含む、ＴＩに適した任意の公知または今後得られる哺乳動物細胞を、本発明において使用することができる。

これまでのセクションに基づく、外因性核酸（ランディング部位）を含むＣＨＯ細胞を用いて、本発明を例示する。これは、本発明を例示するためにのみ提示されており、いかなる方法であっても限定として解釈されるべきではない。本発明の真の範囲は、特許請求の範囲で設定される。

１つの好ましい実施態様において、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。

本発明において使用するために適している、そのゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む例示的哺乳動物細胞は、Ｃｒｅリコンビナーゼの媒介によるＤＮＡ組換えのための３つの異種特異的ｌｏｘＰ部位を含むランディング部位（＝哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列）を内部に持つ、ＣＨＯ細胞である。これらの異種特異的ｌｏｘＰ部位は、Ｌ３、ＬｏｘＦａｓ、および２Ｌであり（例えば、Ｌａｎｚａら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｊ．７（２０１２）８９８～９０８；Ｗｏｎｇら、ＮｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓＲｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７を参照されたい）、その際、Ｌ３および２Ｌはランディング部位の５’末端および３’末端にそれぞれ隣接しており、ＬｏｘＦａｓはＬ３部位と２Ｌ部位の間に位置している。ランディング部位は、ＩＲＥＳを介した選択マーカーの発現を蛍光性ＧＦＰタンパク質の発現に結び付けて、ポジティブ選択によってランディング部位を安定化することならびにトランスフェクションおよびＣｒｅ組換え後に部位が存在しないものを選択すること（ネガティブ選択）を可能にする、バイシストロン性単位をさらに含む。緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）は、ＲＭＣＥ反応をモニターするのに役立つ。例示的なＧＦＰは、配列番号１１の配列を有する。

先のパラグラフで概説したようにランディング部位がこのように編成されていることによって、２つのベクター、いわゆる、Ｌ３部位およびＬｏｘＦａｓ部位を有するフロントベクターならびにＬｏｘＦａｓ部位および２Ｌ部位を内部に持つバックベクターを同時に組み込むことが可能になる。ランディング部位に存在するものとは異なる、選択マーカー遺伝子の機能的エレメントは、両方のベクター間に分配されている：プロモーターおよび開始コドンはフロントベクター上に位置しているのに対し、コード領域およびポリＡシグナルはバックベクター上に位置している。両方のベクターに由来する前記核酸がＣｒｅを媒介として正確に組み込まれた場合にのみ、各選択剤に対する耐性が誘導される。

通常、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞であって、外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１の組換え認識配列および第２の組換え認識配列、ならびに第１の組換え認識配列と第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、かつ組換え認識配列がすべて異なる、外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞である。前記外因性ヌクレオチド配列は、「ランディング部位」と呼ばれる。

本開示の主題では、外因性ヌクレオチド配列のＴＩに適した哺乳動物細胞を使用する。特定の実施態様において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の組込み部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む。ＴＩに適したこのような哺乳動物細胞は、ＴＩ宿主細胞と表記することもできる。

特定の実施態様において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、ランディング部位を含む、ハムスター細胞、ヒト細胞、ラット細胞、またはマウス細胞である。特定の実施態様において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、ランディング部位を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＣＨＯＫ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＣＨＯＤＧ４４細胞、ＣＨＯＤＵＫＸＢ－１１細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ細胞、またはＣＨＯＫ１Ｍ細胞である。

特定の実施態様において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含み、外因性ヌクレオチド配列は、１つまたは複数の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。特定の実施態様では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰＬ３配列、ＬｏｘＰ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ａｔｔＢ配列、φＣ３１ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。

特定の実施態様において、外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第２のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含み、かつ第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳおよび／または第２のＲＲＳとは異なる。特定の実施態様では、外因性ヌクレオチド配列は、第２の選択マーカーをさらに含み、第１および第２の選択マーカーは異なる。特定の実施態様において、外因性ヌクレオチド配列は、第３の選択マーカーおよび配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）もさらに含み、ＩＲＥＳは第３の選択マーカーに作動可能に連結されている。第３の選択マーカーは、第１または第２の選択マーカーとは異なり得る。

選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。また、選択マーカーは、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）、高感度ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光性タンパク質（ＹＦＰ）、高感度ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光性タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ６、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅからなる群から選択される蛍光性タンパク質であってもよい。

特定の実施態様において、外因性ヌクレオチド配列は、第１のＲＲＳ、第２のＲＲＳ、および第３のＲＲＳ、ならびに第１のＲＲＳと第３のＲＲＳの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。

外因性ヌクレオチド配列は、特定の細胞に由来しないが、ＤＮＡ送達法、例えば、トランスフェクション法、エレクトロポレーション法、または形質転換法などによって前記細胞に導入することができるヌクレオチド配列である。特定の実施態様において、ＴＩに適した哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞のゲノム中の１つまたは複数の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む。特定の実施態様において、外因性ヌクレオチド配列は、哺乳動物細胞のゲノムの特定の遺伝子座内の１つまたは複数の組込み部位に組み込まれる。

特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、ＲＲＳは、リコンビナーゼによって認識され得る。特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含み、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施態様では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳまたは第２のＲＲＳとは異なる。特定の好ましい実施態様では、３つのＲＲＳはすべて互いに異なる。特定の実施態様では、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰＬ３配列、ＬｏｘＰ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ａｔｔＢ配列、φＣ３１ａｔｔＰ配列、およびφＣ３１ａｔｔＢ配列からなる群より互いに独立して選択される。

特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、第１、第２および第３のＲＲＳ、ならびに少なくとも１つの選択マーカーを含む。特定の実施態様では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施態様において、２つのＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーに隣接する。すなわち、第１のＲＲＳが選択マーカーの５’側（上流）に位置し、第２のＲＲＳが選択マーカーの３’側（下流）に位置している。特定の実施態様において、第１のＲＲＳは、選択マーカーの５’末端の隣に存在し、かつ第２のＲＲＳは、選択マーカーの３’末端の隣に存在する。

特定の実施態様では、選択マーカーは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接するＲＲＳは異なる。特定の好ましい実施態様において、第１の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰＬ３配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ２Ｌ配列である。特定の実施態様では、ＬｏｘＰＬ３配列は、選択マーカーの５’側に位置し、ＬｏｘＰ２Ｌ配列は、選択マーカーの３’側に位置する。特定の実施態様では、第１の隣接するＲＲＳは、野生型ＦＲＴ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、変異体ＦＲＴ配列である。特定の実施態様では、第１の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、Ｂｘｂ１ａｔｔＢ配列である。特定の実施態様では、第１の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ａｔｔＰ配列であり、第２の隣接するＲＲＳは、φＣ３１ａｔｔＢ配列である。特定の実施態様では、２つのＲＲＳは同じ方向に配置される。特定の実施態様では、２つのＲＲＳはいずれもフォワードまたはリバース方向に存在する。特定の実施態様では、２つのＲＲＳは反対方向に配置される。

特定の実施態様において、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳが隣接する、第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカーを含み、第１の選択マーカーは第２の選択マーカーとは異なる。特定の実施態様において、２つの選択マーカーのどちらも、相互に独立して、グルタミン合成酵素選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、およびピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカーおよびＨＹＧ選択マーカーを含む。特定の実施態様において、第１の選択マーカーは、アミノグリコシド系ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、およびＧ４１８ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミン合成酵素（ＧＳ）、アスパラギン合成酵素、トリプトファン合成酵素（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラスチシジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、ゼオシン、およびミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２の選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、およびＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅ蛍光性タンパク質からなる群から選択される。特定の実施態様において、第１の選択マーカーはグルタミン合成酵素選択マーカーであり、第２の選択マーカーはＧＦＰ蛍光性タンパク質である。特定の実施態様では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは異なる。

特定の実施態様では、選択マーカーは、プロモーター配列に作動可能に連結されている。特定の実施態様では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結されている。特定の実施態様において、選択マーカーは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに作動可能に連結されている。

特定の実施態様では、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含む。特定の実施態様では、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとの間に位置する。特定の実施態様では、第１のＲＲＳと第２のＲＲＳとは同一であり、第３のＲＲＳは、第１のＲＲＳまたは第２のＲＲＳとは異なる。特定の好ましい実施態様では、３つのＲＲＳはすべて互いに異なる。

ＩＩ．ｄ本発明を実施するために適した例示的ベクター
上記に概説した「単一ベクターＲＭＣＥ」のほかに、２つの核酸を同時に標的指向性組込みするために、新規な「２ベクターＲＭＣＥ」を実施することができる。

「２ベクターＲＭＣＥ」戦略は、本発明のベクターの組合せを用いる本発明の方法において実施される。例えば、限定ではないが、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列は３つのＲＲＳを含み、例えば、第３のＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１のＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２のＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）の間に存在し、一方で、第１のベクターは、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列上の第１のＲＲＳおよび第３のＲＲＳに一致する２つのＲＲＳを含み、第２のベクターは、組み込まれている外因性ヌクレオチド配列上の第３のＲＲＳおよび第２のＲＲＳに一致する２つのＲＲＳを含む場合の配置であり得る。２ベクターＲＭＣＥ戦略の例を図１に示す。このような２ベクターＲＭＣＥ戦略により、ＴＩに適した哺乳動物細胞のゲノムにおけるＴＩ後に本発明の発現カセット構成が得られるように、各配列の各ＲＲＳペアの間に適切な数のＳＯＩを組み入れることによって複数のＳＯＩを導入することが可能になる。

２プラスミドＲＭＣＥ戦略では、３つのＲＲＳ部位を使用して、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行することを含む（図１）。したがって、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を用いるＴＩに適した哺乳動物細胞のランディング部位は、第１のＲＲＳ部位（ＲＲＳ１）に対しても第２のＲＲＳ部位（ＲＲＳ２）に対してもクロスオーバー活性を有していない第３のＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含む。標的とされる２つの発現プラスミドは、効率的な標的指向性のために同じ隣接ＲＲＳ部位を必要とし、一方の発現プラスミド（前方）はＲＲＳ１およびＲＲＳ３に隣接し、他方（後方）はＲＲＳ３およびＲＲＳ２に隣接する。また、２プラスミドＲＭＣＥでは、２つの選択マーカーも必要とされる。１つの選択マーカー発現カセットは、２つの部分に分割された。フロントプラスミドは、プロモーターと、それに続く開始コドンおよびＲＲＳ３配列を含む。バックプラスミドは、開始コドン（ＡＴＧ）を欠き、選択マーカーコード領域のＮ末端に融合されたＲＲＳ３配列を有する。融合タンパク質のインフレーム翻訳、すなわち作動可能な連結を確実にするために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列の間に付加的なヌクレオチドを挿入する必要がある場合がある。両方のプラスミドが正確に挿入された場合にのみ、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、したがって、各選択剤に対する耐性が細胞に与えられる。図１は、２プラスミドＲＭＣＥ戦略を示す模式図である。

単一ベクターＲＭＣＥと２ベクターＲＭＣＥのどちらも、ドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡ配列と組込み部位が存在する哺乳動物細胞ゲノム中のＤＮＡ配列とを正確に交換することにより、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた部位に１つまたは複数のドナーＤＮＡ分子を一方向性に組み込むことを可能にする。これらのＤＮＡ配列は、ｉ）少なくとも１つの選択マーカー、もしくはある種の２ベクターＲＭＣＥの場合のような「分割された選択マーカー」、および／またはｉｉ）少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、に隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを特徴とする。

ＲＭＣＥは、リコンビナーゼによって触媒される、標的ゲノム遺伝子座内の２つの異種特異的ＲＲＳとドナーＤＮＡ分子の間の二重組換えクロスオーバーイベントを伴う。ＲＭＣＥは、フロントベクターおよびバックベクターに由来する組み合わせられたＤＮＡ配列のコピーを、哺乳動物細胞ゲノムのあらかじめ定められた遺伝子座に導入するように設計されている。ただ１回の乗換え事象を伴う組換えとは違って、ＲＭＣＥは、原核生物ベクターの配列が哺乳動物細胞ゲノム中に導入されず、したがって、宿主の免疫または防御機構の望まれない誘発を減らし、かつ／または防ぐように、実行することができる。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡ配列を用いて繰り返すことができる。

特定の実施態様において、標的指向性組込みは、２回のＲＭＣＥによって実現され、その際、２つの異なるＤＮＡ配列が両方とも、ＴＩに適した哺乳動物細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および／または２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施態様において、標的指向性組込みは、複数回のＲＭＣＥによって実現され、その際、複数のベクターに由来するＤＮＡ配列がすべて、ＴＩに適した哺乳動物細胞のゲノムのあらかじめ定められた部位に組み込まれ、各ＤＮＡ配列は、ヘテロ多量体ポリペプチドの一部分および／または２つの異種特異的ＲＲＳが隣接する少なくとも１つの選択マーカーもしくはその一部分をコードする、少なくとも１つの発現カセットを含む。特定の実施態様において、選択マーカーは、一部が第１のベクターにおいてコードされ、一部が第２のベクターにおいてコードされてよく、その結果、二重ＲＭＣＥによって両方が正確に組み込まれた場合にのみ、その選択マーカーの発現が可能になる。このようなシステムの例を図１に示す。

特定の実施態様において、リコンビナーゼに媒介された組換えによる標的指向性組込みにより、原核生物ベクターに由来する配列を含まずに、宿主細胞ゲノムの１つまたは複数のあらかじめ定められた組込み部位に、選択マーカーおよび／または多量体ポリペプチドの様々な発現カセットが組み込まれる。

記載され、かつ特許請求される様々な実施態様に加えて、本開示の主題は、本明細書に開示され、特許請求される特徴の他の組合せを有する他の実施態様も対象とする。したがって、本明細書に提示される特定の特徴は、本開示の主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、本開示の主題の範囲内において他の様式で互いに組み合わせられ得る。本開示の主題の特定の実施態様の前述の説明は、例示および説明目的のために提示されている。網羅的であるように、または本開示の主題を開示される実施態様に限定することを意図するものではない。

本開示の主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、本開示の主題の組成物および方法に様々な修正および変形を加えることができることは、当業者には明らかである。したがって、本開示の主題が添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内の修正および変形を含むことを意図する。

様々な刊行物、特許、および特許出願が本明細書に引用されており、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。

２つの独立したＲＭＣＥを同時に実行するために、３つのＲＲＳ部位の使用を伴う２プラスミドＲＭＣＥ戦略のスキーム。ＣｒｅＤＮＡおよびＣｒｅｍＲＮＡでのＴＩ後の生存率回復。ＣｒｅＤＮＡ／プラスミドでのＴＩ後の交換効率／プール品質；外面積サイズ：６８７ＡＵ；中面積サイズ：１３２ＡＵ；内面積サイズ：２７ＡＵ。ＣｒｅｍＲＮＡでのＴＩ後の交換効率／プール品質；外面積サイズ：８１２ＡＵ；中面積サイズ：１１４ＡＵ；内面積サイズ：３２ＡＵ。

配列の説明
配列番号０１：Ｌ３リコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０２：２Ｌリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０３：ＬｏｘＦａｓリコンビナーゼ認識配列の例示的配列
配列番号０４～０６：ヒトＣＭＶプロモーターの例示的なバリアント
配列番号０７：例示的なＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列
配列番号０８：例示的なｂＧＨポリアデニル化シグナル配列
配列番号０９：例示的なｈＧＴ終結配列
配列番号１０：例示的なＳＶ４０プロモーター配列
配列番号１１：例示的なＧＦＰ核酸配列
配列番号１２：Ｃｒｅリコンビナーゼアミノ酸配列
配列番号１３：最小限のＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡ
配列番号１４：ｌｏｘ部位パリンドローム配列１
配列番号１５：ｌｏｘ部位パリンドローム配列２
配列番号１６：コア配列ｌｏｘ部位野生型
配列番号１７：コア配列ｌｏｘ部位変異体Ｌ３
配列番号１８：コア配列ｌｏｘ部位変異体２Ｌ
配列番号１９：コア配列ｌｏｘ部位変異体ＬｏｘＦａｓ
配列番号２０：コア配列ｌｏｘ部位変異型Ｌｏｘ５１１
配列番号２１：コア配列ｌｏｘ部位変異体Ｌｏｘ５１７１
配列番号２２：コア配列ｌｏｘ部位変異体Ｌｏｘ２２７２
配列番号２３：コア配列ｌｏｘ部位変異体Ｍ２
配列番号２４：コア配列ｌｏｘ部位変異体Ｍ３
配列番号２５：例示的な核局在化配列
配列番号２６：例示的な核局在化配列
配列番号２７：例示的な核局在化配列
配列番号２８：例示的な核局在化配列
配列番号２９：例示的な核局在化配列

実施例：
実施例１
一般的技術
１）組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ３ｄｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。

２）ＤＮＡ配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅＧｍｂＨ（Ｖａｔｅｒｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。

３）ＤＮＡおよびタンパク質配列解析ならびに配列データ管理
ＥＭＢＯＳＳ（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ）ソフトウェアパッケージおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＶｅｃｔｏｒＮＴＩバージョン１１．５を、配列の作成、マッピング、解析、注釈付け、および図解に使用した。

４）遺伝子とオリゴヌクレオチドの合成
所望の遺伝子分節を、ＧｅｎｅａｒｔＧｍｂＨ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において化学合成により調製した。合成された遺伝子断片を、伝播／増幅のために大腸菌プラスミド中にクローニングした。サブクローニングされた遺伝子断片のＤＮＡ配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。代替的に、短い合成ＤＮＡ断片を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドをアニーリングすることにより、またはＰＣＲを介して構築した。それぞれのオリゴヌクレオチドを、ｍｅｔａｂｉｏｎＧｍｂＨ（Ｐｌａｎｅｇｇ－Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により調製した。

５）試薬
すべての市販の化学物質、抗体、およびキットは、別途記載されていない限り、製造業者のプロトコールに従って提供されるとおりに使用された。

６）ＴＩ宿主細胞株の培養
ＴＩＣＨＯ宿主細胞を、８５％の湿度および５％のＣＯ_２の加湿インキュベーター内で３７℃で培養した。３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢおよび４μｇ／ｍｌの第２の選択マーカーを含有する独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地で、それらを培養した。細胞を３日または４日ごとに０．３×１０Ｅ６細胞／ｍｌの濃度で総量３０ｍｌに分割した。培養には、１２５ｍｌの非バッフルエルレンマイヤー振盪フラスコを使用した。振盪振幅５ｃｍ、１５０ｒｐｍで細胞を振盪した。ＣｅｄｅｘＨｉＲｅｓＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて細胞数を決定した。細胞は、６０日齢に達するまで、培養を続けた。

７）クローニング
一般
Ｒ部位でのクローニングは、目的の遺伝子（ＧＯＩ）の隣のＤＮＡ配列に依存し、これは、次の断片にある配列と同じである。同様に、断片の組立ては、等しい配列の重なりと、それに続くＤＮＡリガーゼによる組み立てられたＤＮＡのニックの封鎖によって可能である。したがって、正しいＲ部位を有する特定の予備ベクターの単一の遺伝子のクローニングが必要であるこれらの予備ベクターの首尾よいクローニングの後、Ｒ部位に隣接する目的の遺伝子は、Ｒ部位のすぐ隣を切断する酵素による制限消化を介して切断される。最後の工程は、すべてのＤＮＡ断片を一工程で組み立てることである。より詳細には、５’エキソヌクレアーゼは、重なる領域の５’末端（Ｒ部位）を除去する。その後、Ｒ部位のアニーリングを行うことができ、ＤＮＡポリメラーゼは、３ ’末端を拡張して配列のギャップを充填する。最後に、ＤＮＡリガーゼは、ヌクレオチド間のニックを封鎖する。エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびリガーゼのような異なる酵素を含有するアセンブリマスター混合物の添加と、後に続く５０℃での反応混合物のインキュベーションは、１つのプラスミドへの単一の断片のアセンブリにつながる。その後、コンピテント大腸菌細胞をプラスミドで形質転換する。

いくつかのベクターについては、制限酵素を介するクローニング戦略を使用した。適切な制限酵素を選択することにより、所望の目的の遺伝子を切断し、その後、ライゲーションによって異なるベクターへ挿入することができる。したがって、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）で切断する酵素を使用し、スマートな方法で選択することで、正しいアレイ内の断片のライゲーションを行うことができる。ベクターおよび断片が以前に同じ制限酵素で切断されている場合、断片とベクターの粘着末端は完全に適合し、その後ＤＮＡリガーゼによってライゲーションすることができる。ライゲーションの後、コンピテント大腸菌細胞を新しく作製したプラスミドで形質転換する。

制限消化を介したクローニング
制限酵素でのプラスミドの消化について、以下の成分を一緒に氷上にピペットで移した。

表：制限消化反応混合物

１回の消化でより多くの酵素を使用した場合、各酵素１μｌを使用し、ＰＣＲグレードの水を多かれ少なかれ添加して容量を調整した。すべての酵素は、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓのＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（１００％活性）での使用に適格であり、同じインキュベーション温度（すべて３７℃）であるという前提条件で選択された。

インキュベーションは、サーモミキサーまたはサーマルサイクラーを使用して行い、サンプルを一定温度（３７℃）でインキュベートできるようにした。インキュベーション中にサンプルは撹拌しなかった。インキュベーション時間を６０分に設定した。その後、サンプルをローディング染料と直接混合し、アガロース電気泳動ゲルにロードするかまたはさらなる使用のために４℃で／氷上で保管した。

１％のアガロースゲルをゲル電気泳動用に調製した。そのため、１．５ｇの多目的アガロースを１２５エルレンマイヤー振盪フラスコに量り入れ、１５０ｍｌのＴＡＥバッファーで満たした。アガロースが完全に溶解するまで、混合物をマイクロ波オーブン内で加熱した。０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムをアガロース溶液に添加した。その後、ゲルを型に流し込んだ。アガロースをセットした後、型を電気泳動チャンバ内に置き、チャンバをＴＡＥバッファーで満たした。その後、サンプルをロードした。最初のポケット（左から）に、適切なＤＮＡ分子量マーカーをロードし、続いてサンプルをロードした。ゲルを＜１３０Ｖでおよそ６０分間操作した。電気泳動後、ゲルをチャンバから除去し、ＵＶ－Ｉｍａｇｅｒで分析した。

ターゲットのバンドを切断し、１．５ｍｌのＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移した。ゲルの精製には、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔを製造業者の指示に従って使用した。ＤＮＡ断片をさらなる使用のために－２０℃で保管した。

ライゲーション用の断片は、インサートとベクター断片の長さ、およびそれらの相互の相関関係に応じて、１：２、１：３、または１：５のインサートに対するベクターのモル比で、一緒にピペットで移した。ベクターに挿入されるべき断片が短い場合は、１：５の比を使用した。インサートが長い場合は、ベクターとの相関関係で使用されるインサートの量は少なくなった。５０Ｎｇの量のベクターを各ライゲーションに使用し、特定の量のインサートをＮＥＢｉｏＣａｌｃｕｌａｔｏｒで計算した。ライゲーションには、ＮＥＢのＴ４ＤＮＡライゲーションキットを使用した。ライゲーション混合物の例を、以下の表に示す。

表：ライゲーション反応混合物

すべての成分を一緒に氷上にピペットで移し、ＤＮＡと水の混合から初め、バッファーを添加し、そして酵素を添加した。反応物を上下にピペッティングすることにより穏やかに混合し、短時間マイクロ遠心分離し、次に室温で１０分間インキュベートした。インキュベーションの後、Ｔ４リガーゼを６５℃で１０分間熱不活性化した。サンプルを氷上で冷やした。最終工程では、１０ベータコンピテント大腸菌細胞を、２μｌのライゲーションプラスミドで形質転換した（以下を参照のこと）。

Ｒ部位アセンブリを介したクローニング
アセンブリのために、両端にＲ部位を有するすべてのＤＮＡ断片を氷上でピペットした。４つを超える断片を組み立てる場合は、製造業者が推奨するように、すべての断片の等モル比（０．０５ｎｇ）を使用した。反応混合物の２分の１をＮＥＢｕｉｌｄｅｒＨｉＦｉＤＮＡＡｓｓｅｍｂｌｙＭａｓｔｅｒＭｉｘによって具体化した。総反応量は４０μｌであり、それはＰＣＲ用清浄水を満たすことによって達成した。以下の表では、例示的なピペットスキームを示す。

表：アセンブリ反応混合物

反応混合物のセットアップ後、チューブをサーモサイクラー内で６０分間５０℃で一定してインキュベートした。首尾よいアセンブリの後、１０ベータコンピテント大腸菌細菌を２μｌの組み立てられたプラスミドＤＮＡで形質転換した（以下を参照のこと）。

１０ベータコンピテント大腸菌細胞の形質転換
形質転換のために、１０ベータコンピテント大腸菌細胞を氷上で解凍した。その後、２μｌのプラスミドＤＮＡを細胞懸濁液中に直接ピペットした。チューブをはじき、３０分間氷上に置いた。その後、細胞を４２℃の温かいサーマルブロックに入れ、厳密に３０秒間熱ショックを与えた。その直後に、細胞を氷上で２分間冷却した。９５０μｌのＮＥＢ１０ベータ増殖培地を細胞懸濁液に添加した。細胞を振盪しながら３７℃で１時間インキュベートした。その後、５０～１００μｌを予熱した（３７℃）ＬＢ－Ａｍｐ寒天プレート上にピペットし、使い捨てスパチュラで広げた。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。アンピシリンに対する耐性遺伝子を持った、プラスミドの取り込みに成功したバクテリアのみが、このプレート上で増殖できる。単一コロニーを翌日採取し、後に続くプラスミド調製のためにＬＢ－Ａｍｐ培地で培養した。

細菌培養
大腸菌の培養は、ＬＢ培地（ＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉの略）で行い、１ｍｌ／Ｌ１００ｍｇ／ｍｌアンピシリンをスパイクして、０．１ｍｇ／ｍｌのアンピシリン濃度にした。異なるプラスミド調製量について、以下の量に単一の細菌コロニーを接種した。

表：大腸菌培養量

ミニプレップのために、９６ウェル、深さ２ｍｌのウェルプレートを、１ウェルあたり１．５ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地で満たした。コロニーを採取し、つまようじを培地に押し込んだ。すべてのコロニーを採取して、プレートを粘着性のある空気多孔質膜で閉じた。プレートを、２３時間、２００ｒｐｍの振盪速度で、３７℃のインキュベーター内でインキュベートした。

ミニプレップのために、１５ｍｌのチューブ（通風リッドを有する）を３．６ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地で満たし、細菌コロニーを等しく接種した。つまようじは除去しなかったが、インキュベーション中にチューブに残した。９６ウェルプレートと同様に、チューブを、３７℃、２００ｒｐｍで２３時間インキュベートした。

マキシプレップのために、２００ｍｌのＬＢ－Ａｍｐ培地をオートクレーブ処理したガラスの１Ｌエルレンマイヤーフラスコに満たし、約５時間経過した１ｍｌの細菌の日用培養物を接種した。エルレンマイヤーフラスコをペーパープラグで閉じ、３７℃、２００ｒｐｍで１６時間インキュベートした。

プラスミドの調製
ミニプレップのために、５０μｌの細菌懸濁液を深さ１ｍｌのウェルプレートに移した。その後、細菌細胞をプレート内で、３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清を除去し、細菌ペレットを有するプレートをＥｐＭｏｔｉｏｎ内に置いた。およそ９０分後、操作を行い、溶出したプラスミドＤＮＡをさらなる使用のためにＥｐＭｏｔｉｏｎから除去することができた。

ミニプレップのために、１５ｍｌのチューブをインキュベーターから取り出し、３．６ｍｌの細菌培養物を二つの２ｍｌのエッペンドルフチューブに分割した。チューブを卓上マイクロ遠心機で、６，８００ｘｇ、室温で３分間遠心分離した。その後、ミニプレップを、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔを用いて実施した。プラスミドＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。

マキシプレップを、製造業者の指示に従って、Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ＮａｇｅｌＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（商標登録）ＸｔｒａＭａｘｉＥＦＫｉｔを使用して実施した。ＤＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐで測定した。

エタノール沈殿
ＤＮＡ溶液の容量を２．５倍容量のエタノール１００％と混合した。混合物を－２０℃で１０分間インキュベートした。その後、ＤＮＡを３０分間、１４，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。上清を慎重に除去し、ペレットを７０％エタノールで洗浄した。再度、チューブを５分間、１４，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離した。ピペットによって上清を慎重に除去し、ペレットを乾燥させた。エタノールが蒸発した後、適量のエンドトキシン非含有水を添加した。ＤＮＡを４℃で一晩水に再溶解する時間を与えた。少量のアリコートを取り、ＮａｎｏｄｒｏｐデバイスでＤＮＡ濃度を測定した。

実施例２
プラスミド作製
発現カセットの組成
抗体鎖の発現には、以下の機能的要素を含む転写単位を使用した：
－イントロンＡを含む、ヒトサイトメガロウイルス由来の前初期エンハンサーおよびプロモーター、
－ヒト重鎖免疫グロブリン５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）、
－マウス免疫グロブリン重鎖シグナル配列、
－それぞれの抗体鎖をコードする核酸、
－ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（ＢＧＨｐＡ）、および
－任意で、ヒトガストリンターミネーター（ｈＧＴ）。

発現される所望の遺伝子を含む発現ユニット／カセットに加えて、塩基性／標準的な哺乳動物発現プラスミドは、
－大腸菌におけるこのプラスミドの複製を可能にするベクターｐＵＣ１８からの複製起点、および
－大腸菌にアンピシリン耐性を付与するベータ－ラクタマーゼ遺伝子
を含む。

前方および後方ベクタークローニング
２プラスミド抗体コンストラクトを構築するために、抗体ＨＣおよびＬＣ断片を、Ｌ３およびＬｏｘＦＡＳ配列を含む前方ベクターバックボーン、ならびにＬｏｘＦＡＳおよび２Ｌ配列ならびにｐａｃ選択可能マーカーを含む後方ベクターにクローニングした。すべてのＲＭＣＥプロセスに、ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ，Ｅ．Ｔ．，ｅｔａｌ．，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３３（２００５）ｅ１４７；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４（１９９７）１４６０２－１４６０７）を使用した。

遺伝子合成により、それぞれの抗体鎖をコードするｃＤＮＡを作製した（Ｇｅｎｅａｒｔ，ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）。３７℃で１時間、遺伝子合成物およびバックボーンベクターをＨｉｎｄＩＩＩ－ＨＦおよびＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ）で消化し、アガロースゲル電気泳動によって分離した。挿入断片およびバックボーンのＤＮＡ断片をアガロースゲルから切り取り、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。製造業者のプロトコールに従ってＲａｐｉｄＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、３：１の挿入断片／バックボーン比で、精製した挿入断片およびバックボーン断片をライゲーションした。次いで、４２℃で３０秒間の熱ショックによってライゲーションアプローチをコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、３７℃で１時間インキュベートした後、選択用のアンピシリンを含む寒天プレートに播種した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。

翌日、クローンを採取し、ミニプレップまたはマキシプレップのために振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。これは、ＥｐＭｏｔｉｏｎ（登録商標）５０７５（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、またはそれぞれＱＩＡｐｒｅｐスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ）／ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄＸｔｒａマキシＥＦキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ＆Ｎａｇｅｌ）を用いて、実施した。すべてのコンストラクトを配列決定して、いかなる不適切な変異も存在しないように徹底した（ＳｅｑｕｉＳｅｒｖｅＧｍｂＨ）。

第２のクローニング工程において、第１のクローニングの場合と同じ条件を用いて、あらかじめクローニングしたベクターをＫｐｎＩ－ＨＦ／ＳａｌＩ－ＨＦおよびＳａｌＩ－ＨＦ／ＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。ＴＩバックボーンベクターをＫｐｎＩ－ＨＦおよびＭｆｅＩ－ＨＦで消化した。分離および抽出を、前述したようにして実施した。製造業者のプロトコールに従ってＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、１：１：１のインサート／インサート／バックボーン比で、精製したインサートおよびバックボーンのライゲーションを４℃で一晩実施し、６５℃で１０分間、不活性化した。前述したようにして、下記のクローニング工程を実施した。

クローニングされたプラスミドを、ＴＩトランスフェクションおよびプール作製のために使用した。

実施例３
培養、トランスフェクション、選択、および単一細胞クローニング
ＴＩ宿主細胞を、独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中、１５０ｒｐｍの一定の撹拌速度、標準的な加湿条件下（９５％ｒＨ、３７℃、および５％ＣＯ_２）で、使い捨て１２５ｍｌベント型振盪フラスコ内にて増殖させた。３～４日ごとに、細胞を、選択マーカー１および選択マーカー２を有効濃度で含む化学的に定義された培地に、３×１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で播種した。培養物の密度と生存率を、ＣｅｄｅｘＨｉＲｅｓ細胞カウンタ（Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎｎ－ＬａＲｏｃｈｅＬｔｄ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で測定した。

安定したトランスフェクションのために、等モル量の前方ベクターおよび後方ベクターを混合した。５μｇの混合物あたり１μｇのＣｒｅ発現プラスミドを添加した。すなわち、２５μｇの前方ベクターおよび後方ベクター混合物に、５μｇのＣｒｅ発現プラスミドまたはＣｒｅｍＲＮＡを添加した。

トランスフェクションの２日前に、ＴＩ宿主細胞を、４×１０Ｅ５細胞／ｍｌの密度で、新鮮な培地に播種した。トランスフェクションは、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＶ（Ｌｏｎｚａ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、製造元のプロトコールに従ってＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒデバイスで実施した。３×１０Ｅ７細胞を総量３０μｇの核酸で、すなわち、３０μｇのプラスミド（５μｇのＣｒｅプラスミドならびに２５μｇの前方ベクターおよび後方ベクター混合物）または５μｇのＣｒｅｍＲＮＡならびに２５μｇの前方ベクターおよび後方ベクター混合物のいずれかで、トランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を、選択剤を含まない３０ｍｌの培地に播種した。

播種後５日目に、細胞を遠心分離し、組換え細胞の選択のために、ピューロマイシン（選択剤１）および１－（２’－デオキシ－２’－フルオロ－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシル－５－ヨード）ウラシル（ＦＩＡＵ；選択剤２）を有効濃度で含む８０ｍＬの化学的に定義された培地に、６×１０Ｅ５細胞／ｍｌの濃度で移した。この日から、細胞を、分割することなく、３７℃、１５０ｒｐｍ、５％ＣＯ２、および８５％の湿度でインキュベートした。培養物の細胞密度および生存率を定期的にモニターした。培養物の生存率が再び増加し始めたとき、選択剤１および２の濃度を、以前に使用した量の約半分に減少させた。より詳細には、細胞の回収を促進するために、生存率が４０％より高く、かつ生細胞濃度（ＶＣＤ）が０．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬより高い場合は選択圧を下げた。したがって、４×１０Ｅ５細胞／ｍｌを遠心分離し、選択培地ＩＩ（化学限定培地、１／２選択マーカー１および２）４０ｍｌに再懸濁した。これらの細胞を以前と同じ条件で、かつこの場合も分割せずに、インキュベートした。

選択を開始してから１０日後、細胞内ＧＦＰおよび細胞表面に結合した細胞外異種ポリペプチドの発現を測定するフローサイトメトリによって、Ｃｒｅ媒介性カセット交換の成功を確認した。ヒト抗体の軽鎖および重鎖に対するＡＰＣ抗体（アロフィコシアニン標識Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ）を、ＦＡＣＳ染色用に使用した。フローサイトメトリは、ＢＤＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメータ（ＢＤ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施した。１試料あたり１０，０００イベントを測定した。生細胞を、側方散乱（ＳＳＣ）に対する前方散乱（ＦＳＣ）のプロットでゲートした。生細胞ゲートは、トランスフェクトされていないＴＩ宿主細胞で定義され、ＦｌｏｗＪｏ７．６．５ＥＮソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ、Ｏｌｔｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、すべての試料に適用された。ＧＦＰの蛍光を、ＦＩＴＣチャネル（４８８ｎｍでの励起、５３０ｎｍでの検出）で定量化した。異種ポリペプチドを、ＡＰＣチャネル（６４５ｎｍでの励起、６６０ｎｍでの検出）で測定した。ＣＨＯ親細胞、すなわちＴＩ宿主細胞の作製に使用された細胞を、ＧＦＰおよび［［Ｘ］］発現に対するネガティブコントロールとして使用した。選択開始から１４日後、生存率は９０％を超え、選択は完了したと見なされた。

選択後、安定的にトランスフェクトされた細胞のプールを、限界希釈による単一細胞クローニングに供した。この目的のために、細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＧｒｅｅｎ^ＴＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色し、３８４ウェルプレートに０．６細胞／ウェルで播種した。単一細胞クローニングおよびその後のすべての培養工程では、選択剤２を培地から除外した。１つの細胞のみを含むウェルを、明視野および蛍光ベースのプレートイメージングによって同定した。１つの細胞を含むウェルのみを、さらに検討した。プレーティング後約３週間で、コンフルエントなウェルからコロニーを採取し、９６ウェルプレートでさらに培養した。

９６ウェルプレートで４日後、培養培地中の抗体力価を、抗ヒトＩｇＧサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。簡単に説明すると、抗体を、ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ^ＴＭ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に結合した抗ヒトＦｃ抗体で細胞培養液から捕捉し、捕捉抗体とは異なるエピトープに結合する抗ヒトＦｃ抗体がＰＯＤコンジュゲートで検出した。二次抗体を、ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質（ＰＯＤ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いた化学発光によって定量した。

実施例４
ＦＡＣＳスクリーニング
ＦＡＣＳ解析を実施して、トランスフェクション効率およびトランスフェクションのＲＭＣＥ効率を調べた。トランスフェクトされたアプローチの４×１０Ｅ５細胞を遠心分離し（１２００ｒｐｍ、４分）、１ｍＬＰＢＳで２回洗浄した。ＰＢＳを用いる洗浄工程の後、沈殿物を４００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＦＡＣＳチューブ（セルストレーナーキャップ付きのＦａｌｃｏｎ（登録商標）丸底チューブ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に移した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いて測定を実施し、ソフトウェアＦｌｏｗＪｏを用いてデータを解析した。

実施例５
フェッドバッチ培養
フェッドバッチ生産培養は、独自の化学的に定義された培地を含む振盪フラスコまたはＡｍｂｒ１５容器（ＳａｒｔｏｒｉｕｓＳｔｅｄｉｍ）で実施した。細胞を０日目に１×１０Ｅ６細胞／ｍｌで播種し、３日目に温度を変化させた。３、７、および１０日目に、培養物に独自のフィード培地を加えた。ＣｅｄｅｘＨｉＲｅｓ機器（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して、０、３、７、１０、および１４日目に、培養物中の細胞の生細胞数（ＶＣＣ）および生存率パーセントを測定した。グルコース、ラクテート、および製品力価の濃度を、ＣｏｂａｓＡｎａｌｙｚｅｒ（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ、マンハイム、ドイツ）を使用して、３，５，７，１０，１２、および１４日目に測定した。フェッドバッチ開始後１４日目に、遠心分離（１０分、１０００ｒｐｍおよび１０分、４０００ｒｐｍ）によって上清を採取し、濾過（０．２２μｍ）によって清澄化した。ＵＶ検出を伴うプロテインＡ親和性クロマトグラフィーを使用して、１４日目の力価を測定した。製品品質をＣａｌｉｐｅｒのＬａｂＣｈｉｐ（ＣａｌｉｐｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）によって決定した。

実施例６
ＣＲＥｍＲＮＡ標的指向性組込みは、ＣＨＯプールにおける陽性クローンの数の増加をもたらす
複合抗体フォーマットの生産のためのＣＨＯプールを、ＣＲＥプラスミドまたはＣＲＥｍＲＮＡのいずれかを用いて作製した。選択期間の前後に、ＣＨＯプールにおけるクローンの絶対数を、クローンに特異的なタグを使用して測定した。このクローンに特異的なタグは、標的指向性組込み技術の一部であり、プールサイズおよび異質性の同定を可能するディープシークエンシングを使用して読み取られる。選択期間の後、ＣＲＥｍＲＮＡ作製ＣＨＯプールにおけるクローンの絶対数は、ＣＲＥプラスミド作製ＣＨＯプールにおけるよりも有意に大きい。よって、ＣＲＥプラスミドの代わりにＣＲＥｍＲＮＡを使用することによって、より大きなサイズで異質性が高いＣＨＯプールが生産され、それにより、より高い力価と製品品質を有するＣＨＯクローンを発見する可能性が高くなる。さらに、ＣＲＥｍＲＮＡ作製ＣＨＯプールからのクローン数の増加は、ＣＲＥプラスミド作製ＣＨＯプールからのクローンと比較して、安定している。

Claims

ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞を生産するための方法であって、
ａ）前記哺乳動物細胞のゲノムの遺伝子座内の単一の部位に組み込まれている外因性ヌクレオチド配列を含む哺乳動物細胞を提供する工程であって、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１の選択マーカーに隣接する第１および第２の組換え認識配列、ならびに前記第１の組換え認識配列と前記第２の組換え認識配列の間に位置する第３の組換え認識配列を含み、前記組換え認識配列がすべて異なり、前記哺乳動物細胞が、ＤＮＡをコードするＣｒｅリコンビナーゼを含まない、哺乳動物細胞を提供する工程；
ｂ）ａ）で提供された細胞に、３つの異なる組換え認識配列および１から８つの発現カセットを含む２つのデオキシリボ核酸の組成物を導入する工程であって、
第１のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
－第１の組換え認識配列と、
－１つまたは複数の発現カセットと、
－１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの５’末端部分と、
－第３の組換え認識配列の第１のコピーと、
を含み、かつ、
第２のデオキシリボ核酸が、５’から３’の方向に、
－前記第３の組換え認識配列の第２のコピーと、
－前記１つの第２の選択マーカーをコードする発現カセットの３’末端部分と、
－１つまたは複数の発現カセットと、
－第２の組換え認識配列と、
を含み、
前記第１および第２のデオキシリボ核酸の前記第１～第３の組換え認識配列が、組み込まれている前記外因性ヌクレオチド配列の前記第１～第３の組換え認識配列と一致しており、
前記１つの第２の選択マーカーをコードする前記発現カセットの５’末端部分および３’末端部分が、まとまると、前記１つの第２の選択マーカーの機能的発現カセットを形成し、
前記デオキシリボ核酸が、ＤＮＡをコードするＣｒｅリコンビナーゼを含まない、
２つのデオキシリボ核酸の組成物を細胞に導入する工程；
ｃ）ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡを、Ｃｒｅリコンビナーゼの唯一の供給源として
ｉ）ｂ）の前記第１および第２のデオキシリボ核酸と同時に、または
ｉｉ）その後で逐次的に
のいずれかで導入する工程であって、
前記Ｃｒｅリコンビナーゼが、前記第１および第２のデオキシリボ核酸の前記組換え認識配列を認識する（かつ、任意で、前記１つまたは複数のリコンビナーゼが、２つのリコンビナーゼ媒介カセット交換を行う）、
ＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡを導入する工程；ならびに、
ｄ）前記第２の選択マーカーを発現しかつ前記ポリペプチドを分泌する細胞を選択する工程
を含み、それによって、前記ポリペプチドをコードするデオキシリボ核酸を含みかつ前記ポリペプチドを分泌する組換え哺乳動物細胞が生産される、方法。
前記ＣｒｅｍＲＮＡが、配列番号１２のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
前記ＣｒｅｍＲＮＡが、配列番号１３のヌクレオチド配列またはそのコドン使用最適化バリアントを含む、請求項１に記載の方法。
前記デオキシリボ核酸の厳密に１つのコピーが、単一の部位または遺伝子座で、前記哺乳動物細胞のゲノム内に安定して組み込まれる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、少なくとも４つの発現カセットを含み、ここで、
－第１の組換え認識配列が、最も５’側の（すなわち、第１の）発現カセットの５’側に位置しており、
－第２の組換え認識配列が、最も３’側の発現カセットの３’側に位置しており、
－第３の組換え認識配列が、
－前記第１の組換え認識配列と前記第２の組換え認識配列との間、かつ
－前記発現カセットのうちの２つの間
に位置しており、
前記組換え認識配列がすべて異なる、
請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリペプチドをコードする前記デオキシリボ核酸が、選択マーカーをコードするさらなる発現カセットを含み、前記選択マーカーをコードする前記発現カセットは、前記第３の組換え認識配列の５’側に一部が、３’側に一部が位置しており、前記発現カセットの、前記５’側に位置する部分が、プロモーターおよび開始コドンを含み、前記発現カセットの、前記３’側に位置する部分が、開始コドンのないコード配列およびポリＡシグナルを含み、前記開始コドンが、前記コード配列に作動可能に連結される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
ＣｒｅｍＲＮＡと第１および第２のベクターの混合物との間の重量比が、１：３から２：１の範囲にある、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
ＣｒｅｍＲＮＡと第１および第２のベクターの混合物との間の重量比が、約１：５である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
前記発現カセットのそれぞれが、５’から３’の方向に、プロモーターと、コード配列と、ポリアデニル化シグナル配列と、任意で続いてターミネーター配列とを含み、前記プロモーターが、イントロンＡを有するヒトＣＭＶプロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列がｂＧＨポリアデニル化シグナル配列であり、かつ前記ターミネーターがｈＧＴターミネーターであり、ただし例外として前記選択マーカーの前記発現カセットでは、前記プロモーターがＳＶ４０プロモーターであり、前記ポリアデニル化シグナル配列がＳＶ４０ポリアデニル化シグナル配列であり、かつ前記ターミネーターが存在しない、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリペプチドが、第１の抗体重鎖と、第２の抗体重鎖と、第１の抗体軽鎖と、第２の抗体軽鎖とを含むヘテロ四量体であり、前記デオキシリボ核酸が、４つの発現カセットを含み、
－前記第１の重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、第１の軽鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、
－前記第２の重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、
－前記第１の軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の重鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含み、
－前記第２の軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含み、
前記第１の重鎖可変ドメインおよび前記第２の軽鎖可変ドメインが、第１の結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変ドメインおよび前記第１の軽鎖可変ドメインが、第２の結合部位を形成する、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリペプチドが、第１の抗体重鎖と、第２の抗体重鎖と、第１の抗体軽鎖と、第２の抗体軽鎖とを含むヘテロ四量体であり、前記デオキシリボ核酸が、４つの発現カセットを含み、
－前記第１の重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、
－前記第２の重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の軽鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、
－前記第１の軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の重鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含み、
－前記第２の軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含み、
前記第１の重鎖可変ドメインおよび前記第２の軽鎖可変ドメインが、第１の結合部位を形成し、前記第２の重鎖可変ドメインおよび前記第１の軽鎖可変ドメインが、第２の結合部位を形成する、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
前記ポリペプチドが、第１の抗体重鎖と、第２の抗体重鎖と、第１の抗体軽鎖と、第２の抗体軽鎖とを含むヘテロ四量体であり、前記デオキシリボ核酸が、４つの発現カセットを含み、
－前記第１の重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインと、ペプチドリンカーと、第２の重鎖可変ドメインと、ＣＬドメインとを含み、
－前記第２の重鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の重鎖可変ドメインと、ＣＨ１ドメインと、ヒンジ領域と、ＣＨ２ドメインと、ＣＨ３ドメインとを含み、
－前記第１の軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第１の軽鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインとを含み、
－前記第２の軽鎖が、Ｎ末端からＣ末端に向けて、第２の軽鎖可変ドメインとＣＬドメインとを含み、
前記第２の重鎖可変ドメインおよび前記第１の軽鎖可変ドメインが、第１の結合部位を形成し、前記第１の重鎖可変ドメインおよび前記第２の軽鎖可変ドメインが、第２の結合部位を形成する、
請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
第１のリコンビナーゼ認識配列がＬ３であり、第２のリコンビナーゼ認識配列が２Ｌであり、第３のリコンビナーゼ認識配列がＬｏｘＦａｓである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
組換え哺乳動物細胞の数を増加させるためのＣｒｅリコンビナーゼｍＲＮＡの使用であって、前記細胞が、標的指向性組込みによって前記細胞のゲノム内の単一の部位に安定して組み込まれた目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードするデオキシリボ核酸を含む、使用。
前記組換え細胞がさらに、培養培地中での培養時に、前記目的のポリペプチドを前記培養培地中に分泌する、請求項１６に記載の使用。