CN109996813B - 用于鉴定和表征t细胞受体、t细胞抗原及其功能性相互作用的工程化的多组件系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多组件系统，其中第一组件是工程化的TCR‑呈递细胞(eTPC)，命名为组件A，其中组件A缺乏分析物抗原呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)的至少一个家族的内源表面表达，并且第二组件是遗传供体载体，命名为组件C，用于递送编码分析物TCR链的ORF。

Description

用于鉴定和表征T细胞受体、T细胞抗原及其功能性相互作用 的工程化的多组件系统
发明领域
本发明涉及多组件系统的构建、组装和使用，所述多组件系统包含至少三种组件，所述组件是工程化的T细胞受体(TCR)呈递细胞(eTPC)，工程化的基因组接收位点和匹配的遗传供体载体。本发明用于快速、高通量地产生呈递全长TCR对(eTPC-t)的稳定的衍生细胞用于鉴定和表征TCR对蛋白质以分析抗原。具体而言，eTPC组成型表达CD3复合体的所有组件，但缺乏TCRα、β、γ和δ链的内源表达。eTPC还缺乏主要抗原呈递复合体的表达，以至于消除eTPC在分析工作流程中自身呈递抗原的潜在背景。另外，eTPC含有至少一个工程化的基因组接收位点。该位点用于通过匹配的遗传供体载体递送的编码TCR对的遗传物质的快速、稳定整合。eTPC还可以包括用于检测TCR刺激的任选组件，TCR刺激响应元件。多组件系统可用作临床免疫诊断学中的分析系统。此外，本发明涉及使用多组件系统鉴定和表征用于诊断、医学、化妆品以及研究和开发的T细胞抗原和同源TCR。
本发明的介绍
T淋巴细胞(T细胞)的免疫监视是所有下颚脊椎动物适应性免疫的核心功能。通过T细胞亚型间丰富功能多样性实现T细胞的免疫监视，其用于消除病原体感染和肿瘤细胞并协调对入侵病原体、共生微生物、共生非自身因子如食品的分子成分的适应性免疫应答，甚至保持自身的免疫耐受性。为了应答各种外来和自身因子，T细胞必须能够特异性地检测这些外来和自身因子的分子成分。因此，T细胞必须能够检测个体遇到的大面积的自身和非自身分子，具有足够的特异性以引起对抗致病性器官和患病自身的有效反应，同时避免引起这种针对健康自身的反应。当考虑到外来和自身分子几乎无限的多样性时，这项任务的高度复杂本性变得清晰，并且病原生物正处于逃避T细胞检测的进化压力下。
T细胞受体(TCR)
T细胞主要由T细胞受体(TCR)的表达来定义。TCR是T细胞的组成部分，其负责与T细胞适应性免疫的靶标相互作用并且感测它。一般而言，TCR由呈递在细胞表面上的异二聚体蛋白质复合体组成。两条TCR链中的每一条由两个细胞外结构域组成，即可变(V)-区和恒定(C)-区，两者都是免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，形成反平行β-片层。它们通过I型跨膜结构域锚定在细胞膜中，所述I型跨膜结构域邻接短的细胞质尾部。适应和检测不同分子成分的T细胞的质量来自T细胞发生过程中产生的TCR链的变异。这种变异是通过体细胞重组以与B细胞中抗体发生相似的方式产生的。
TCR链多样性
T细胞池由几个功能和表型异质的亚群组成。然而，根据它们在其表面表达的体细胞重排的TCR形式，T细胞可广义地分类为αβ或γδ。存在两种TCR链对形式；TCRα(TRA)和TCRβ(TRB)对；以及TRCγ(TRG)和TCRδ(TRD)对。表达TRA:TRB对的T细胞称为αβT细胞，而表达TRG:TRD对的T细胞通常称为γδT细胞。
αβ和γδ形式的TCR负责不同的配体或'抗原'的识别，并且每个T细胞在T细胞成熟期间从头产生αβ或γδ受体链。这些从头产生的TCR链对通过在称为体细胞V(D)J重组的过程中通过产生受体序列多样性来实现识别的多样性，其中每个T细胞表达单个明显重排的TCR的拷贝。在TRA和TRG基因座处，许多离散的可变(V)和功能性(J)基因区段可用于重组并与恒定的(C)基因区段并置，因此称为VJ重组。在TRB和TRD基因座的重组另外包括多样性(D)基因区段，并且被称为VDJ重组。
每个重组TCR拥有唯一配体特异性的潜力，其通过在αβT细胞的情况下由α和β链形成的配体结合位点的结构或在γδT细胞的情况下由γ和δ链形成的配体结合位点的结构决定。TCR的结构多样性主要局限于每条链上的三个短发夹环，称为互补决定区(CDR)。从受体链对的每条链贡献三个CDR，并且这六个CDR环共同位于TCR细胞外结构域的膜-远端以形成抗原结合位点。
每种TCR链中的序列多样性以两种模式实现。首先，用于重组的基因区段的随机选择提供了碱基序列多样性。例如，TRB重组发生在47个唯一的V，2个唯一的D和13个唯一的J种系基因区段之间。通常，V基因区段贡献CDR1和CDR2环两者，因此是种系编码的。产生序列多样性的第二种模式发生在高变CDR3环内，其通过在重组V，(D)和J基因区段之间的连接处随机缺失模板核苷酸和添加非模板核苷酸而产生。
TCR:CD3复合体
成熟的αβ和γδTCR链对呈递在具有许多辅助CD3亚基(表示为ε、γ、δ和ζ)的复合体的细胞表面。这些亚基与αβ或γδTCR结合为三个二聚体(εγ、εδ、ζζ)。该TCR:CD3复合体形成了在αβ或γδTCR与同源抗原接合时启动细胞信号传导反应的单元。缔合为TCR:CD3复合体的CD3辅助物贡献了被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号基序。CD3ε、CD3γ和CD3δ各自贡献单个ITAM，而CD3ζ同二聚体含有3个ITAM。因此，与TCR组装的三个CD3二聚体(εγ、εδ、ζζ)贡献10个ITAM。在TCR与同源抗原连接后，串联酪氨酸残基的磷酸化为含有Src同源性2(SH2)结构域的蛋白质(例如70kDa的关键ζ链相关蛋白(ZAP-70))产生成对的停靠位点。这些蛋白质的再次募集启动TCR:CD3信号传导复合体的形成，其最终负责T细胞活化和分化。
αβT细胞
αβT细胞通常在人类中比其γδT细胞对应物更丰富。大多数αβT细胞与细胞表面上由HLA复合体呈递的肽抗原相互作用。这些肽-HLA(pHLA)识别T细胞是第一个被描述的并且是迄今为止被最佳表征的。还描述了更罕见形式的αβT细胞。粘膜相关的不变T(MAIT)细胞似乎具有相对有限的α和β链多样性，并且识别细菌代谢物而不是蛋白质片段。不变的自然杀伤T细胞(iNK T细胞)和种系编码的分枝酰基反应性T细胞(GEM T细胞)限于识别由非HLA分子交叉呈递的糖脂。iNK T细胞主要被认为与CD1d呈递的糖脂相互作用，而GEM T细胞与CD1b呈递的糖脂相互作用。认为其他形式的T细胞在CD1a和CD1c的背景下与糖脂相互作用，然而，这些细胞尚未以显著的细节表征。
常规αβT细胞
大多数αβT细胞的关键特征是在HLA分子的背景下识别肽抗原。这些通常被称为“常规”αβT细胞。在个体内，自身HLA分子将自身和外来蛋白质的肽呈递给T细胞，为针对恶性肿瘤和外来病原体的适应性免疫，对共生生物、食品和自身的适应性耐受提供必要的基础。编码HLA蛋白的HLA基因座是人类基因组中最基因密集和多态的区域，并且在人类中描述了超过12,000个等位基因。HLA基因座中的高度多态性确保了个体之间肽抗原呈递的多样性，这对于群水平的免疫是重要的。
HLA I类和I I类
有两种形式的经典HLA复合体：HLA I类(HLAI)和HLA II类(HLAII)。有三种经典的HLAI基因：HLA-A，HLA-B，HLA-C。这些基因编码跨膜α链，其与不变的β2-微球蛋白(β2M)链缔合。HLAIα链由具有免疫球蛋白折叠的三个结构域组成：α1，α2和α3。α3结构域是近膜的并且大部分是不变的，而α1和α2结构域一起形成多态性膜-远端抗原结合裂隙。有六种经典的HLAII基因：HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA和HLA-DRB1。这些基因编码包含α链和β链的配对DP、DQ和DR异二聚体HLA复合体。每条链具有两个具有免疫球蛋白折叠的主要结构结构域，其中α2和β2结构域包含与HLAIα3结构域类似的近膜和大部分不变的模块。HLAIIα2和β2结构域一起形成膜远端抗原结合裂隙并且是高多态性的区域。
HLAI和HLAII的抗原结合裂隙在八个反平行β-片层的平台上包含两个反平行的α-螺旋。在该裂隙中，肽抗原结合并以延伸的构象存在。HLAI和HLAII中的肽接触残基是大多数序列多态性的位置，其构成由不同HLA等位基因呈递的多种肽库的分子基础。该肽与抗原结合裂隙广泛接触并且结果是每个HLA等位基因对所呈递的肽施加不同的序列限制和偏好。因此，给定的肽仅结合有限数量的HLA，并且相应地每个等位基因仅适应来自给定蛋白质的肽集合的特定部分。存在于每个个体中的一组HLAI和HLAII等位基因称为HLA单倍型。HLAI和HLAII基因的多态性以及遗传等位基因的共显性表达驱动了人群中HLA单倍型的非常大的多样性，当与αβTCR的巨大序列多样性相偶联时，呈递出对这些HLA抗原-TCR相互作用的分析的标准化的高度障碍。
HLAI和HLAII的αβTCR接合
αβTCR识别肽作为由HLA和肽抗原(改变的自身)的残基形成的混合pHLA结合界面的一部分。HLAI复合体呈递在几乎所有有核细胞的表面上，并且通常被认为是呈递源自内源蛋白质的肽。因此，T细胞可以通过对相互作用细胞的pHLAI复合体进行取样来询问HLAI呈递细胞的内源性细胞蛋白质组。HLAI的接合需要通过相互作用的T细胞表达TCR共受体CD8，因此HLAI采样限于CD8+αβT细胞。相反，HLAII复合体的表面呈递主要限于专职APC，并且通常被认为呈递源自呈递细胞外源的蛋白质的肽。因此，相互作用的T细胞可以询问呈递细胞所在的细胞外微环境的蛋白质组。HLAII的接合需要通过相互作用的T细胞表达TCR共受体CD4，因此HLAII采样限于CD4+αβT细胞。
αβTCR的胸腺选择
如上所述的αβTCR的作用是检测pHLA复合体，使得TCR呈递T细胞可以提高与该T细胞在建立免疫中的角色密切相关的反应。应该认为，在个体内产生的αβTCR库必须考虑在特定单倍型背景下和实际发生之前可能遇到的所有外来抗原的巨大和不可预见的多样性。该结果是在这样的背景上实现的，其中以准随机方式产生极其多样化和众多的αβTCR，具有识别未指定的pHLA复合体的潜力，同时仅被特别指示以避免与自身pHLA的强烈相互作用。这是在称为胸腺选择的过程中在T细胞成熟期间精心策划的。
在胸腺中T细胞成熟的第一步期间，携带不能与具有足够亲和力的自身pHLA复合体相互作用的αβTCR的T细胞被剥夺了存活信号并被消除。称为阳性选择的该步骤确保存活的T细胞携带TCR库，其至少潜在地能够识别在正确的HLA背景下呈递的外源或改变的肽。随后，通过阴性选择过程主动去除与自身pHLA强烈相互作用并因此具有驱动自身免疫能力的潜力的αβTCR。这种阳性和阴性选择的组合仅导致携带αβTCR的T细胞对自身pHLA的亲和力低，从而填充外周。这建立了αβT细胞库，其是自限制的但不是自身反应性的。这种针对HLA单倍型的T细胞发生的高度个性化的性质强调了标准化分析αβTCR-抗原-HLA相互作用中的挑战。此外，它形成了移植物排斥和移植物抗宿主疾病的基础，以及在一个个体中识别的αβTCR在第二个体中可能具有完全不同的作用的一般原则，这对临床实践中出现的基于TCR和T细胞的治疗和诊断策略具有明显的影响。
非常规αβT细胞
非HLA限制性或“非常规”形式的αβT细胞具有非常不同的分子抗原靶标。这些非常规αβT细胞不接合经典HLA复合体，而是接合保守的HLA样蛋白，例如CD1家族或MR1。CD1家族包括参与抗原交叉呈递的四种形式(CD1a，b，c和d)。这些细胞表面复合体具有类似HLAI的α-链，其与β2-M形成异二聚体。在α链的膜远端表面处呈递的小疏水口袋形成病原体衍生的基于脂质的抗原的结合位点。先天样NK T细胞(iNK T细胞)形成了最佳理解的脂质/CD1家族识别的例子，而GEM T细胞代表另一个突出的例子。已知在CD1d的背景下'I型'iNK T细胞与脂质α-GalCer强烈相互作用。这些iNK T细胞显示非常有限的TCR多样性，具有固定的TCRα链(Vα10/Jα18)和有限数量的β链(具有受限的vβ使用)，并且它们被比作与先天病原体相关的分子模式(PAMPS)识别受体，如Toll样和Nod样受体。相反，'II型'NK T细胞呈递更多样化的TCR库，并且似乎具有更多样化的CD1d-脂质复合体接合模式。GEM T细胞识别由CD1b呈递的分枝杆菌衍生的糖脂，然而，CD1a，b和c的抗原呈递的分子细节以及它们的T细胞识别才刚刚开始被理解。
MAIT细胞主要表达不变的TCRα链(TRAV1-2与TRAJ33，TRAJ20或TRAJ12连接)，其能够与一系列TCRβ链配对。而不是肽或脂质MAIT TCR可以结合由HLAI样分子MR1呈递的病原体衍生的基于叶酸和核黄素的代谢物。在MAIT TCR上观察到的有限但显著的TCR多样性似乎能够在保守的MR1背景下识别多样但相关的代谢物。
尚不清楚如何在成熟期间在胸腺中选择非经典的HLA限制性αβT细胞TCR。然而，似乎上面概述的阴性和阳性选择的基本过程仍然适用，并且一些证据表明这发生在胸腺内的特化微环境中。
γδT细胞
与αβTCR发生和pHLA接合的详细机制理解相比，关于γδT细胞对应物的抗原靶标和背景知之甚少。这部分是由于它们在循环T细胞区室中的相对低的丰度。然而，广泛认为γδT细胞不是严格受HLA限制的，并且与抗体不同，它似乎更自由地识别表面抗原。另外，最近已经认识到γδT细胞可以支配上皮组织的驻留T细胞区室，上皮组织是免疫系统与外来抗原的主要相互作用位点。此外，文献中开始出现γδT细胞肿瘤免疫监视和其他形式的失调自我监测的各种机制。先天样和适应性γδT细胞的特异性抗原靶点仍然定义不明确，但PAMP的组织分布和快速识别表明当适应性免疫系统仍在成熟时，γδT细胞在对外来抗原的反应早期以及生命早期中起基本作用。
γδT细胞的多种功能似乎基于不同的VγVδ基因区段使用，并且可以在两个主要类别中广泛理解，其中具有大部分不变的TCR的γδT细胞在感染期间很早期介导PAMP的先天样的识别。除了PAMP之外，这些类型的γδT细胞还被认为识别自身分子，包括可以提供细胞应激、感染和潜在肿瘤发展的非常早期特征的磷酸抗原。识别PAMP和所谓的危险相关分子模式(DAMPS)以及大量组织限制的先天样γδT细胞强烈表明这些细胞适合快速响应抗原攻击而无需事先激活、归巢和克隆扩张。
第二种形式的γδT细胞被认为在性质上更具适应性，具有高度多样化的γδTCR库和直接外周循环和接近淋巴组织的能力。已经描述了这种针对普通人病原体如CMV的抗原特异性γδT细胞，它们似乎形成记忆反应。然而，还观察到γδT细胞在活化后仅显示相对有限的克隆增殖，并且关于TCR多样性的程度和γδT细胞在外周循环或组织中的特异性反应的数据很少。此外，虽然一般认为γδTCR不与pHLA复合体相互作用，因此在这种背景下不与肽抗原接合，只有少数γδT细胞的抗原靶标已经被表征，并且对潜在的分子框架仅有很差的了解。
外周γδT细胞的低频率和研究人组织驻留T细胞的困难限制了对T细胞参与适应性免疫应答是如何重要及多样类型的了解。这一新兴研究领域需要更可靠的技术来捕获和表征稀有γδT细胞，分离其TCR对，并识别其同源抗原。
抗原和抗原呈递细胞
在T细胞和TCR的背景下，抗原可以定义为可以与TCR接合并导致信号在T细胞内转导的任何分子。最充分表征的T细胞抗原是呈递在HLAI和HLAII复合体中的肽，并且其被常规αβT细胞接合。然而，近年来很明显，非常规αβT细胞和γδT细胞能够作为抗原接合大范围的生物分子，包括脂质、脂肽、糖肽、糖脂和一系列代谢物和分解代谢物。此外，已经发现γδT细胞可能能够以类似抗体的方式直接接合完全折叠的蛋白质。因此，在过去二十年中，T细胞抗原在很大程度上局限于HLA呈递的肽的观点已经扩展到包括几乎任何生物分子。考虑到这一概念，定义什么可以被认为是抗原呈递细胞(APC)是相关的。
如以上部分中所定义，HLAI和HLAII具有跨细胞类型的完全不同的表达谱。广泛接受的是，几乎所有有核细胞都在细胞表面上呈递HLAI复合体，因此能够呈递用于T细胞取样的肽抗原。相反，HLAII具有受限的表达谱，并且至少在稳态条件下仅在具有抗原呈递中的专家作用的细胞表面上表达，包括树突细胞(DC)，巨噬细胞和B细胞。这些专家细胞类型通常被称为专职APC。出于本文件的目的，术语APC用于描述能够呈递抗原以供αβ或γδT细胞取样的任何有核细胞。此类抗原不限于在特定抗原呈递复合体(如HLA和HLA样分子)中作为“货物”呈递的那些，而是也可包括能够与携带αβ或γδTCR的细胞接合的任何细胞表面呈递的部分。
TCR的治疗用途
原代T细胞的过继转移首先在20世纪90年代早期的临床环境中进行试验，首先是离体扩增的T细胞向病毒抗原极化以在免疫受损患者中赋予病毒免疫。在用于治疗恶性肿瘤的试验后不久，使用针对特定癌抗原离体扩增的原代T细胞的类似方法。这些早期方法的一个局限仍然是当今的挑战，即缺乏对T细胞的性质和多样性的理解，与在治疗产品中精细优化其组成的需要相冲突。目前，除了少数使用对病毒抗原具有特异性的原代T细胞的举措之外，制药工业已大量放弃使用离体扩增的原代T细胞。
近年来，可靠地将遗传物质引入原代人细胞的能力已经出现了各种实验性遗传修饰的T细胞治疗剂。此类治疗性细胞产物旨在控制T细胞应答的能力并将T细胞特异性重定向至疾病相关抗原靶标，例如恶性细胞唯一表达的抗原。这些在很大程度上依赖于将嵌合抗原受体(CAR)转移到受体T细胞中，而不是实际的TCR链对。CAR代表靶向部分(最常见的是靶向恶性细胞的表面表达蛋白的单链抗体元件)，其移植到信号传导受体元件，例如CD3复合体的ζ-链，以产生模拟CD3-TCR功能的合成的嵌合受体。迄今为止，这些所谓的CAR T细胞(CAR-T)产品在临床试验中取得了不同的成功，尽管它们的潜力不易转化超过具有固有的唯一分子靶标的肿瘤(如B细胞恶性肿瘤)。或者，将全长TCR链对ORF转移到T细胞中是新出现的兴趣。此类TCR工程化的T细胞疗法目前受限于具有挑战性的制造方法，并且像CAR-T产品一样，缺乏有效的抗原靶标和靶向构建体。迄今为止，这已经集中在使用αβTCR识别HLAI在恶性细胞上呈递的肽抗原，并且该方法的基本挑战是需要恶性细胞特异的抗原。
已经认为由于TCR-pHLA相互作用具有相对低的亲和力，因此天然TCR可能对于TCR工程化的T细胞疗法而言不是最佳的。已经设计了几种方法来体外亲和力成熟TCR，其方式与单链抗体亲和力成熟非常相似。这些TCR亲和力成熟方法通常也使用单链形式，其中一条链的V区与另一条链的V区融合以制备单一多肽构建体。然后可以将这种单一多肽用于适应抗体工程化工作流程的噬菌体或酵母展示系统，并通过基于靶标结合的轮次选择。就产生功能性TCR链对而言，在这种单链TCR方法中存在两个固有限制。首先，选择是基于对靶标的结合亲和力。然而，已经充分证明TCR亲和力并不总是与TCR信号转导输出的强度或能力相关。其次，基于亲和力的单链构建体的选择一旦被重构为全长受体，并不总是转化为等同的亲和力。
在治疗背景下，亲和力成熟的TCR对存在另外的且关键的限制。也就是说，考虑到它们的序列已被改变，根据定义，所得构建体不再受到胸腺选择，其中从所述库中缺失了对自身抗原强烈反应的TCR。因此，这些修饰的TCR具有自身反应的固有风险，使用现有方法很难在体外排除。出于同样的原因，任何用于治疗应用的选定或工程化的TCR都需要个性化。如果TCR是人工工程化的或天然TCR应用于个体，则必须基于HLA单倍型和呈递的每个特定个体的肽库排除交叉反应性以避免潜在的灾难性自身免疫。这是因为胸腺选择是在所有可用的HLA分子的背景上进行的，所述HLA分子仅对给定的个体具有特异性。这种交叉反应的可能性尚不清楚。然而，TCR库识别与外源相同物种的其他个体的pHLA复合体的能力是适应性免疫的基本特性，并且支持移植物排斥和移植物抗宿主病。最近使用成熟的TCR链针对癌症特异性黑素瘤相关抗原(MAGE)的临床试验突出了绕过胸腺选择的潜在问题。当携带成熟TCR的自体T细胞被输注回两名癌症患者时，这些患者迅速发展为致命性心脏病。随后的研究确定MAGE特异性成熟的TCR与来自心脏蛋白质titin的HLAI呈递的肽交叉反应。这有力地表明交叉反应性在TCR的治疗用途中是明显的可能性。
利用TCR用于治疗目的的不同途径是以与抗体治疗物质非常相同的方式用作亲和试剂。已经试验了单链TCR分子，用于将缀合的药物物质递送至特异性HLA抗原表达细胞群。这种方法通常被认为比CAR-T或TCR工程化的T细胞治疗剂更安全，因为可以简单地撤回药物的给药。然而，难以预测的交叉反应和脱靶效应的可能性仍然是这种情况下的潜在限制。
临床诊断中的TCR库检测
在一个相关的方面，出现了将特定TCR序列的丰度检测用于临床诊断目的的兴趣。特别是随着深度测序方法的兴起，有可能在全局范围内捕获个体内完整的TCR多样性，并在特定背景下捕获匹配的αβ对。这可能仅仅是通过检测扩增的T细胞克隆的丰度来诊断特定病症和疾病状态的手段，作为对患者中疾病相关抗原建立的免疫应答的代理读数。然而，这种全局性方法目前仅限于具有确定的临床时间点的非常强的免疫应答，并且在识别通过测序鉴定的任何特定TCR的特异性抗原靶标方面存在潜在的困难。
T细胞抗原的治疗和诊断用途
控制适应性免疫应答的基本优势转化为核心技术挑战，因为TCR-抗原相互作用的精确特异性需要对与每种病原体，癌细胞或自身免疫疾病特异性相关的抗原的详细知识。此外，每种抗原可以由特异性抗原呈递复合体或其等位基因呈递，使得对每种相关HLA基因和等位基因进行抗原发现。对于与强适应性免疫反应相关并且通常显示保守的表位反应等级的几种感染性疾病如HIV，流感和CMV，最重要的表位已经在一些常见HLA的背景下进行了作图。类似地，癌症、过敏和自身免疫领域已经看到增加和系统地努力来绘制相关的T细胞抗原。然而，这些是具有挑战性的程序，并且系统地描述与不同临床背景相关的T细胞抗原的努力受到缺乏有效、稳健、快速和可扩展的方案的阻碍。
具体地，癌细胞代表了具有挑战性和重要的方面，因为呈递在恶性细胞表面上的大多数肽是自身抗原或非常类似于自身抗原。因此，胸腺选择将缺失可以强烈识别这些肽的TCR，同时肿瘤已经进化以逃避免疫识别。这意味着针对已建立的肿瘤的有效免疫应答相对较少，并且难以预测或发现靶标。然而，这些反应确实存在，而且重要的是，通常与更好的结果相关。这种反应的靶标，肿瘤相关抗原(TAA)，在大多数情况下将具有与自身区分的特征，并且来自在癌症发展期间过度表达的蛋白质，否则在该发育阶段不存在于细胞类型或通过基因突变或翻译后修饰(如磷酸化)进行特异性改变。
当可获得时，对这些表位的知识使得有可能询问相关的T细胞反应以用于基本发现、诊断目的，并且例如作为疫苗功效的测试。重要的是，它们还为过敏和自身免疫中的T细胞耐受提供高度特异性的靶标，并且至关重要的是，指向特异性免疫疗法和针对恶性细胞的有价值靶标。恶性肿瘤代表了特别有价值的靶标，因为细胞免疫疗法的前景和T细胞操作的进展因缺乏经验证的靶标TAA而减慢，这些TAA超出了癌症类型的特异标记恰好可用的少数病例。
鉴于细胞疗法的潜力和缺乏有效靶标，有希望的TCR抗原的识别仍然是基于TCR的免疫疗法的最紧迫的瓶颈之一，特别是在治疗癌症的努力中。
TCR和T细胞抗原分析的技术方面
总体而言，基于TCR的疗法的开发仍处于早期阶段，并且成功有限。虽然具有巨大潜力，但诊断方法很少被用于旨在评估患者疾病状态或对疗法反应的对照临床研究中。用于可靠捕获天然TCR链对的不发达技术，以及在高通量和细胞-细胞通讯的功能背景下对TCR-抗原相互作用的系统分析，已经成为基于TCR的疗法和诊断的开发的主要障碍。
深度测序方法已经导致对健康和疾病中T细胞受体多样性的提高的理解。然而，这些方法通常集中于跨越CDR3区域的短延伸，主要是TCRβ链。大多数研究忽略了TCRα链的贡献，并且很少有人试图分析成对的αβ链以及被确定为感兴趣的TCR的抗原特异性。最近使用单细胞包封和遗传条形码的工作流程使得天然TCRαβ或γδ链对的配对和全长序列的分析成为可能，然而，这样的工作流程仍然是实验性的。
可以在生物物理或功能模式中根据抗原特异性分析分离的TCR链对。生物物理分析需要重组产生TCR以及可溶形式的分析物抗原。在HLA限制性TCR的情况下，这将需要产生所有单独的TCR以及同源的pHLA复合体。这在技术上具有高度挑战性，速度慢且通量极低。此外，这种分析仅提供相互作用亲和力，其与可预测方式的功能特征不充分相关。
直到最近，在细胞背景下的分离的TCR序列的详细功能分析仅限于将分析物TCR链对转染到原代T细胞或永生T细胞系中，以及通过细胞活化的传统流式细胞术分析来检测细胞反应，或在抗原攻击后从转染细胞中检测分泌因子的繁琐方案。在Guo等人最近的出版物中，报道了来自单细胞的成对TCR链的快速克隆、表达和功能表征(Molecular Therapy-Methods and clinical development(2016)3：15054)。在该研究中，分析物人αβTCR对在缺乏αβTCR表达的报告细胞系中表达，并且其含有与TCR刺激后激活的Nur77启动子连接的绿色荧光蛋白(GFP)报告系统。由于缺乏标准化的TCR整合到报道细胞系基因组中，该系统仍然是低效的，并且没有提供APC元件对细胞结合的抗原攻击的系统方式。
与用于识别针对已知T细胞抗原的TCR的工作流程类似，在健康和疾病中新的T细胞抗原的从头发现仍然是非常具有挑战性的。大多数方法本质上保持生物物理学，并且旨在产生可以在免疫方案中测试的候选抗原，或通过识别如上所述的同源TCR。在T细胞抗原发现领域存在很少标准化或没有标准化，并且该领域主要限于学术研究。
随着对TCR及其同源物在治疗和诊断用途中的不断增加的兴趣，以及捕获大量天然TCRαβ和γδ链对的手段的出现，仍然缺乏可靠的高通量和标准化技术用于TCR-抗原相互作用的系统分析。重要的是，在细胞-细胞通讯的天然背景下缺乏用于TCR链对的功能分析的标准化系统，其中TCR和抗原都由活细胞呈递。此外，在细胞-细胞通信的相关背景下，可能缺乏可以实现TCR候选物选择和/或TCR链对亲和突变的系统。
如所描述的，目前缺乏用于高通量产生在天然细胞背景下表达的具有TCR对的细胞的标准化技术。非常希望拥有一种系统，其中可以将全长TCR对作为单拷贝插入TCR呈递细胞的基因组中，使得所述TCR在天然CD3细胞表面复合体中呈递用于分析和选择。CD3复合体呈递的TCR对确保亲和力分析反映了实际的天然TCR组成，而单链TCR和其他非天然TCR展示技术则不然。此外，在活细胞上CD3复合体中呈递TCR对是TCR对功能分析的绝对要求。功能分析，指TCR信号输出的分析，在TCR选择和工程化工作流程中至关重要，其中信号输出是在细胞治疗背景下通常最重要的参数，并且与具有同源抗原/HLA的TCR的亲和力不具有良好的相关性，如在其他展示平台内确定的。
发明详述
本发明致力于满足上述需求。特别地，本发明涉及多组件系统的构建和使用，用于发现和表征TCR和T细胞抗原。所述多组件系统包含至少三种组件，即工程化的T细胞受体(TCR)呈递细胞(eTPC)，工程化的基因组接收位点和匹配的遗传供体载体。本发明用于快速、高通量产生稳定的衍生细胞，其呈递全长TCR对(eTPC-t)。另外，eTPC含有至少一个工程化的基因组接收位点。该位点用于通过匹配的遗传供体载体递送的编码TCR对的遗传物质的快速、稳定整合。eTPC还可以包括用于体外检测TCR刺激的任选组件，TCR刺激响应元件。多组件系统可用于编辑临床免疫诊断学中分析系统的关键TCR中心元件。此外，本发明涉及所述鉴定和表征的TCR对序列用于产生免疫治疗剂和免疫诊断剂的用途。
本发明使得高度标准化的系统能够以系统化的方式组装各种分析物eTPC形式。这种标准化和系统化是通过TCR链ORF与匹配的供体载体/基因组接收位点子系统的高度定义和可控的基因组整合来实现的。相比于以前的依赖于使用非指导的基因组整合和/或病毒方法的随机整合的系统，这种可控且可预测的系统为产生在其细胞表面表达分析TCR的分析eTPC群的过程提供了显著的效率，减少了这种过程的周期时间和成本。此外，该系统的设计部分是为了确保整合的TCR ORF的可控拷贝数，通常是每个链单拷贝，这允许对整合的表面表达的TCR的表达水平的严格控制。这是分析TCR对集合的相对亲和力或信号传导输出的重要方面。此外，来自载体池的单拷贝整合TCR ORF的能力允许所谓的“鸟枪整合”，其中与供体载体整合的每个细胞可以仅从载体池中接收单个ORF，可能编码不同群的TCR ORF。这使得能够将在供体载体中编码的TCR ORF库转化到eTPC库中，其在细胞表面上表达单个所需分析物TCR对；基本上代表基于细胞的阵列系统，类似于噬菌体或酵母展示系统。这种阵列系统可以促进针对特定抗原的TCR序列识别，和/或通过确保在单个细胞中表达单个分析物TCR对来鉴定TCR序列库中包含的抗原特异性，所述单个细胞可以被回收用于基于测序的鉴定。
eTPC的另一个关键方面是缺乏抗原呈递复合体的表达。通常，eTPC必须被工程化以至少缺乏HLA I类的表达。这是重要的特征，因为它消除了eTPC-t和eTPC-t表达的TCR自身呈递抗原的可能性。这将降低在利用添加外源游离抗原的工作流程中检测抗原特异性应答的假阳性率。此外，这允许混合培养分析工作流程，其中呈递特定HLA的分析物APC细胞可以与eTPC-t预混合，并且外源抗原直接添加到混合培养系统，而没有eTPC-t自我呈递分析物抗原的可能性。这极大地提高了eTPC-t产品的灵活性和效率。
本发明涉及提供工程化的多组件系统，其组件用于制备一种或多种分析物eTPC-t。然后将这些分析物eTPC-t与一种或多种分析物TCR(统称为eTPC:抗原系统，eTPC:A)组合以获得一种或多种输出。分析物抗原由分析物抗原呈递细胞提供和/或作为可溶性或固定化分析物抗原提供和/或在非基于细胞的颗粒(NCBP)上呈递。
多组件系统的最小形式包含第一组件eTPC，称为组件A，并且第二组件是遗传供体载体，称为组件C(图1)。
eTPC表示多组件系统的基本组件，系统的所有其他组件与之相关。因此，eTPC含有某些特征，这些特征是天然的或工程化的，使eTPC适合用于创建分析物eTPC-t群及其用途。
eTPC，组件A
i.缺乏TCR链α，β，δ和γ的内源性表达，和
ii.表达CD3蛋白，其仅在细胞表达互补的TCR链对时有条件地呈递于细胞表面和
iii.含有另一个称为B的组件，是基因组接收位点，用于整合编码α，β，δ或γ的至少一个分析物TCR链的单个ORF，和/或编码一对分析物TCR链的两个ORF，
其中i)可以通过选择缺乏所述表达的天然存在的细胞群获得，或者可以被工程化以缺乏这种表达，和ii)可以通过选择包含所述表达的天然存在的细胞群获得，或者可以被工程化以包含这种表达；iii)可以借助基因工程引入基因组。详细说明获得这种细胞的不同手段的方法示于图31至37中。
可以通过本领域公知的方法实现缺乏来自天然存在的细胞群的TCR链α、β、δ和/或γ的eTPC细胞候选物的选择。可以通过用特异性针对TCR链α、β、δ和γ的亲和试剂染色靶细胞，并且选择细胞TCR链α、β、δ和γ直接实现它。
缺乏TCR链α、β、δ和γ表达的eTPC工程化可以通过非靶向和靶向手段来实现。通过向细胞提供化学、放射学或其他诱变剂，然后选择缺乏表达靶标TCR链α、β、δ和γ表达的细胞，可以实现细胞的非靶向诱变。基因组基因座的靶向突变可以经由不同手段实现，包括但不限于经由以下的定点诱变
i.锌指核酸酶
ii.CRISPR/Cas9介导的靶向
iii.合成转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)
其中所述定点核酸酶在靶基因座处诱导位点特异性DNA修复错误诱变，之后通过选择缺乏TCR链α、β、δ和γ表达的细胞获得突变细胞。
CD3和组件B和/或D的整合选择是本领域技术人员公知的，但可以包括同源定向重组(HDR)和/或随机整合方法，其中HDR可以通过在发生HDR的基因组位点靶向突变来促进，并且可通过不同手段实现，包括但不限于定点突变，其经由
i.锌指核酸酶
ii.CRISPR/Cas9介导的靶向
iii.合成转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)
其中所述定点核酸酶通过HDR在靶基因座诱导位点特异性DNA修复。在这样的事件之后，一部分细胞将掺入HDR载体，可以通过以下的任何组合来选择和/或确定，
iv.非破坏性的表型表达分析
v.破坏性的表型表达分析
vi.遗传分析
其中iv和vi是选择和确定成功的基因组整合事件的优选方法。
或者，病毒载体可用于以定向或非定向方式递送所需组件。
考虑到eTPC组件A被设计用于与分析工作流中的分析物抗原结合，在优选的方面，eTPC含有使干扰这种分析的eTPC呈递因子最小化的特征。
eTPC组件A任选地缺乏至少一种家族的分析物抗原呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)的内源表面表达，其中选择缺乏表面表达以使靶分析物抗原的匹配分析中的干扰最小化。
aAPX的家族可以是以下任何一种
i.HLA I类
ii.HLA II类
iii.非HLA抗原呈递复合体。
aAM选自
i.从分析物抗原分子ORF翻译的多肽或多肽复合体
ii.衍生自从分析物抗原分子ORF翻译的多肽的肽
iii.衍生自改变组件A蛋白质组的肽
iv.衍生自改变组件A蛋白质组的多肽
v.衍生自改变组件A代谢物组的代谢物。
组件A eTPC可任选地包括T细胞共受体，其中这些特征允许分析物eTPC与分析物APC的稳健或不同形式的通讯，其中可调谐通讯与特定分析物TCRsp和/或分析物抗原的识别或表征相关。
在本文背景下，eTPC组件A可任选地表达CD4和/或CD8，其中CD4或CD8的表达将eTPC分别限制为与HLAII和HLAI型的APX衔接。
eTPC组件A可任选地表达CD28和/或CD45，其中CD28和CD45通过对信号传导的正向前馈效应而对信号敏感性有贡献，而它们也可通过对信号传导的负反馈效应促成信号特异性，因为它涉及通过表达的分析物TCRsp的信号传导。
组件A，eTPC，可任选另外包括引入的细胞表面粘附分子组件，或内源性细胞表面粘附分子的消融，以分别促进eTPC与分析物APC的接合和免疫突触的形成，或避免在涉及APC的分析工作流程中聚簇的有害细胞的紧密结合和形成。
可以作为额外ORF引入组件A或从A遗传消除的这种粘附分子可以选自粘附蛋白的整联蛋白家族。
最小多组件的第二组件是遗传供体载体，组件C，其用于整合至少一个编码至少一个分析物TCR链的ORF(图1)。
组件C是遗传供体载体，其与包含在eTPC，组件A的基因组内的基因组接收位点件B偶联。组件C被设计用于将编码在遗传供体载体中编码的分析物TCR链的一个或多个ORF整合到基因组接收位点B，其中整合导致靶标eTPC表达分析物TCR链。
配对的遗传供体载体和基因组接收位点被描述为整合对。
在使用eTPC:A系统的分析工作流程中，eTPC被设计为响应同源抗原的刺激。因此，期望具有针对从表达的TCRsp的刺激发出信号反应的标准化的报道分子读数。
eTPC组件A还含有称为组件F的组件，其是选自以下的合成基因组TCR-刺激反应元件
i.单组件合成构建体，其含有至少一种天然启动子和/或至少一种合成启动子和至少一种报道分子
ii.一种多组件合成构建体，其设计有至少一种天然启动子和/或至少一种合成启动子和至少一种报道分子
其中i和/或ii的激活依赖于选自合成途径、天然途径或其组合的至少一种信号转导途径。
设计eTPC以测定呈递的TCRsp与分析物抗原的接合。可以通过诱导响应TCRsp接合的合成报道元件来实现接合的读出。因此，eTPC可以进一步含有称为F的组件，其是选自以下的合成基因组TCR刺激反应元件
iii.单组件合成构建体，其含有至少一种天然启动子和/或至少一种合成启动子和至少一种报道分子
iv.一种多组件合成构建体，其设计有至少一种天然启动子和/或至少一种合成启动子和至少一种报道分子
其中i和/或ii的激活依赖于选自合成途径、天然途径或其组合的至少一种信号转导途径。
合成的TCR刺激反应元件(组件F)，合成为与天然启动子相反，不太可能模拟天然TCR刺激反应，因此代表了对天然T细胞刺激的更远的近似。然而，合成启动子为调谐和调节报道分子响应提供了更大的灵活性，以稳健地鉴定呈递有效地与分析物抗原接合的TCRsp的eTPC-t。
单组件合成构建体为信号报道分子响应的扩增或调节提供有限的空间，但是更直接地实现和预测结果。多组件构建体具有构建复杂响应网络的几乎无限空间的优点，然而，这带来了更难以实现和预测的成本。网络还提供实例以启动第二响应报道分子的反馈循环、抑制和激活。
合成启动子可以与人工合成的信号传导组件连接，所述人工合成信号传导组件可以是初始天然TCR信号传导途径的下游或替代它。在这种情况下，CD3复合物可以部分或全部与人工合成信号传导途径和响应网络偶联。这种人工路径提供了非常模块化和适应性的优点，用于更大的微调或增加的响应多样性。
优选的实施方案使用具有合成启动子和至少部分合成信号传导途径的多组件合成构建体。这提供了最稳健的手段来确保有限的静息状态信号反应，但是当分析物抗原与TCRsp的连接发生时具有高偶联的报道分子信号。
无论TCRsp刺激与组件F偶联的确切结构如何，期望的最终结果是可检测的报道分子。在优选的实施方案中，需要适合荧光检测(即FACS)和/或物理选择方法，例如磁性活化细胞分选(MACS)的报道分子。或者，报道分子可以是分泌的或细胞内分子，用于通过光谱、荧光或发光测定法检测，优选非破坏性质的，其中随后可以基于报道分子的存在或不存在选择群体。此外，响应不限于单一报道分子类型，而可以是一种或多种不同报道分子的组合。
在一个背景下，具有合成启动子和部分合成信号传导途径(驱动子-激活子/阻遏子+扩增子-报道分子)的多组件合成构建体将包括：
驱动子激活子/阻遏子：
a)合成启动子
b)Kozak序列
c)转录因子，
d)第一终止子
扩增子-报道分子
e)第二合成启动子
f)Kozak序列
g)报道分子
h)第二终止子
其中；a)代表合成启动子(驱动子)，其被设计为与TCRsp连接到分析物抗原产生的初始天然信号传导途径偶联。最小驱动子包含一个或多个转录因子结合位点和核心启动子，其中核心启动子至少包含TATA盒，启动子元件(Inr)和转录起始位点；b)代表Kozak序列以便转录因子的有效翻译起始；c)代表编码合成或天然转录因子(激活子或阻遏子)的ORF，其可以结合第二合成启动子的DNA序列；d)代表用于转录因子mRNA转录物和任选的一个或多个非翻译的3'遗传元件的有效转录和多腺苷酸化的转录终止子。这些遗传元件可包括但不限于转录物稳定或去稳定化元件，以及独特的标识序列；e)代表第二合成启动子(扩增子)，其编码一个或多个识别位点以结合c)转录因子和核心启动子，其中核心启动子至少包含TATA盒，Inr和转录起始位点；f)代表用于有效翻译启动子的Kozak序列；g)代表编码报告蛋白的ORF；h)代表用于报道分子mRNA转录物和任选的一种或多种非翻译的3'遗传元件的有效转录和多腺苷酸化的转录终止子。这些遗传元件可包括但不限于转录物稳定或去稳定化元件，以及独特的标识序列。
重要的是要认识到偶联到扩增子-报道分子范例的驱动子-激活子/阻遏子可以扩展成包括额外的驱动子-激活子/阻遏子和扩增子-报道分子对和/或额外的扩增子-报道分子单元。此外，对于阴性选择方法和/或阴性反馈回路，可以用阻遏子替换激活子以关闭扩增子-报道分子单元和/或驱动子-激活子/阻遏子单元。
在第二背景下，具有合成启动子的单组件合成构建体(驱动子-报道分子)将包括：
a)合成启动子
b)Kozak序列
c)报道分子
d)终止子
其中；
a)代表合成启动子(驱动子)，其被设计为与TCRsp连接到分析物抗原产生的初始天然信号传导途径偶联。最小驱动子包含一个或多个转录因子结合位点和核心启动子，其中核心启动子至少包含TATA盒，Inr和转录起始位点；b)代表用于报道分子的有效翻译启动的Kozak序列；c)代表编码报道分子蛋白的ORF；d)代表用于报告mRNA转录物和任选的一种或多种非翻译的3'遗传元件的有效转录和多腺苷酸化的转录终止子。这些遗传元件可包括但不限于转录物稳定或去稳定化元件，以及独特的标识序列。
在多组件系统的扩展形式中，组件AeTPC可以进一步含有第二基因组接收位点(称为组件D)，其与第二基因组供体载体(称为组件E)偶联，组件E也被添加到系统中(图2)。详细说明获得这种细胞的不同方法的方法示于图37至38中。
多组件系统组件A可以进一步包括一个或多个另外的整合对。
包含eTPC和一个或两个整合对的多组件系统用于制备在分析或制备工作流程中使用的的eTPC-t。
eTPC-t可以通过整合两个互补的TCR链以形成TCRsp来制备，或者可以通过两个步骤通过顺序提供每个互补链来制备(图3)。
遗传供体载体和基因组接收位点作为多组件系统的整合对子系统运行。遗传供体载体必须首先与靶ORF组合，使得碱基供体载体现在编码那些靶ORF。然后将组装的引发的供体载体引入靶eTPC以将靶ORF交换到基因组接收位点，从而将靶ORF整合到靶细胞的偶联接收位点(图4)。
包含遗传供体载体组件C和/或E的多组件系统可以与编码至少一种分析物TCR链的至少一种ORF组合以获得组件C'和/或E'，其中所述组合定义为将遗传物质连接到正确的编码框架中，并以正确的方向连接遗传供体载体。
一个或多个ORF到遗传供体载体C和/或E的组合可以用独特ORF的库按下述进行多次，
i.单个离散反应以获得编码多个ORF的C'和/或E'载体的离散库
ii.单一反应以获得编码多个ORF的C'和/或E'载体的汇集库
其中离散库可以与组件A组合多次以获得具有编码独特TCR链的独特ORF的eTPC-t的离散库，或者可以将组合库与组件A组合一次或多次以获得一个或多个eTPC-t的汇集库，其中每个eTPC-t整合随机化的一个或多个编码源自原始载体池的分析物TCR链的ORF，使得每个eTPC-t表达单个随机独特的TCRsp。
将可预测的一个或多个ORF的拷贝数有效整合到基因组接收位点对于标准化eTPC的操作是非常有利的，其中可以快速制备和表征分析物eTPC群。因此，基因组接收位点和偶联的供体载体对eTPC的功能至关重要。此外，强烈希望具有eTPC，其中组件B和D彼此绝缘，使得供体载体组件C不能在组件B中整合，反之亦然。此外，还希望组件B和/或组件D适合于制备eTPC-t的方法，其中单对互补TCR链的引入是快速、可重复的，具有正确整合和递送单个对的高可能性。
基因组接收位点可以选自以下
i.设计用于重组酶介导的盒式交换(RMCE)的合成构建体
ii.设计用于定点同源重组的合成构建体
其中i)是RMCE的基因组接收位点的优选形式。RMCE方法可以采用对个体重组酶特异的经选择的异源特异性位点，使得每种组件B和D拥有绝缘的特异性。
基因组接收位点，组件B和/或组件D包含至少一种下列遗传元件
i.异种特异性重组酶位点
ii.同源臂
iii.真核启动子
iv.真核条件调控元件
v.真核终止子
vi.选择标记
vii.剪接受体位点
viii.剪接供体位点
ix.非蛋白质编码基因
x.绝缘子
xi.移动遗传元件
xii.大范围核酸酶识别位点
xiii.内部核糖体进入位点(IRES)
xiv.病毒自切割肽元件
xv.kozak共有序列。
优选的基因组接收位点将包括使用来自先前所述元件列表的以下选定元件的两种不同排列。
第一种排列是经由RMCE整合来接收编码一个或多个TCR链的单个ORF和/或整合的选择标记，其中该排列是
5'-[A][B][C][D][E][F]-3'
其中，
A)是元件iii)组成型或诱导型真核启动子
B)是元件i)异种特异性重组酶位点1
C)是元件xv)Kozak共有序列
D)是元件vi)FACS和/或MACS兼容的编码蛋白质标记
E)是元件i)异种特异性重组酶位点2
F)是元件v)真核终止子。
第二种排列是经由RMCE整合来接收两个编码一个或多个TCR链的ORF和/或整合的选择标记，其中所述排列是
5'-[A][B][C][D][E][F][G][H][I]-3'
其中，
A)是元件iii)组成型或诱导型真核启动子
B)是元件i)异种特异性重组酶位点1
C)是元件xv)Kozak共有序列
D)是元件vi)FACS和/或MACS兼容的编码蛋白质标记1
E)是元件v)真核双向转录终止子
F)是元件vi)FACS和/或MACS兼容的编码蛋白质标记2
G)是元件xv)Kozak共有序列
H)是元件i)异种特异性重组酶位点2
I)是元件iii)组成型或诱导型真核启动子；
此外，在该第二种排列中，元件F，G和I以反义方向编码。
组件C和/或E包含至少一种下列遗传元件
i.异种特异性重组酶位点
ii.同源臂
iii.真核启动子
iv.真核条件调控元件
v.真核终止子
vi.选择标记
vii.剪接受体位点
viii.剪接供体位点
ix.非蛋白质编码基因
x.绝缘子
xi.移动遗传元件
xii.大范围核酸酶识别位点
xiii.内部核糖体进入位点(IRES)
xiv.病毒自切割肽元件
xv.kozak共有序列
xvi.整合的选择标记
xvii.抗生素抗性盒
xviii.细菌复制起点
xix.酵母复制起点
xx.克隆位点
优选的遗传供体载，组件C和/或组件E将包含两种不同的可能排列，使用来自先前所述元件列表的以下选择的元件。
第一种排列是经由RMCE整合递送编码一个或多个TCR链和/或整合的选择标记的单个ORF，其中所述排列是
5'-[A][B][C][D][E]-3'
其中，
A)是元件i)异种特异性重组酶位点1
B)是元件xv)Kozak共有序列
C)是元件xx)单个ORF的克隆位点，其编码一个或多个TCR链和/或元件xvi)整合的选择标记
D)是元件i)异种特异性重组酶位点2
E)是元件xvii)抗生素抗性盒和元件xviii)细菌复制起点，没有特定的方向
此外，元件viii和/或xiv可用于将多个TCR链和/或元件xvi连接在一起。
第二种排列是经由RMCE整合递送两个编码一个或多个TCR链和/或整合的选择标记的ORF，其中所述排列是
5'-[A][B][C][D][E][F]-3'
其中，
A)是元件i)异种特异性重组酶位点1
B)是元件xv)Kozak共有序列
C)是元件xx)用于引入两个或更多个ORF的克隆位点，具有真核生物终止子，编码一个或多个TCR链和/或元件xvi)整合的选择标记
D)是元件xv)Kozak共有序列(反义方向)
E)是元件i)异种特异性重组酶位点2
F)是元件xvii)抗生素抗性盒和元件xviii)细菌复制起点，没有特定的方向
此外，元件viii和/或xiv可用于在每个ORF内将多个TCR链和/或元件xvi连接在一起。
制备分析物TPC-t群体
上述多组件系统可以以多种方式用于制备不同形式的分析物eTPC群或其库，其用作将分析物TCRsp呈递给eTPC:A系统的分析或制备工作流程中的分析物抗原。
产生的eTPC-t群体需要从某些来源获得分析物TCR链，用于分析候选抗原。
分析物TCR链编码序列的来源可以衍生自
i.来自原代T细胞的TCR链ORF序列的配对克隆
ii.来自原代T细胞的TCR链ORF序列的未配对克隆
iii.合成的TCR链ORF序列
其中i)是优选用于发现由于胸腺选择而不太可能通常与自身aAPX和/或aAPX货物交叉反应的天然TCRsp；ii)可用于鉴定候选TCR亲和试剂；iii)可用于TCR亲和试剂的亲和力成熟。
可以使用包含单个整合对的多组件系统在一个步骤中从组件A制备eTPC-t，通过提供与TCR链的互补对的ORF组合的组件C'，使得该分析物TCR对整合到位点B，以产生B'。所得细胞系表达所提供的TCR对，并作为TCRsp在细胞表面呈递(图5)。
可以使用包含两个整合对的多组件系统在一个步骤中从组件A制备eTPC-t，通过提供与TCR链的互补对的ORF组合的组件C'，使得该分析物TCR对整合到位点B，以产生B'。所得细胞系表达所提供的TCR对，并作为TCRsp在细胞表面呈递。第二整合对D/E保持不变并且可用于下游整合步骤(图6)。
可以使用包含两个整合对的多组件系统在一个步骤中从组件A制备eTPC-t，通过提供各自与一个编码互补TCR链对的一个链的ORF组合的组件C'和E’，使得分析物TCR链都整合到位点B或D，以产生B'和D’。所得细胞系表达所提供的TCR对，并作为TCRsp在细胞表面呈递(图7)。
可以使用包含两个整合对的多组件系统在一个步骤中从组件A制备eTPC-x，通过提供与单个分析物TCR链的ORF组合的组件C'，使得该分析物TCR链整合到位点B，以产生B'。得到的细胞系表达所提供的TCR链，但缺乏互补链并因此不表达任何表面TCR。第二整合对D/E保持不变，可用于下游整合步骤(图8)。
可以使用包含两个整合对的多组件系统在两个步骤中从组件A制备eTPC-t，通过首先提供组件C'与单个分析物TCR链的ORF组合，使得该分析物TCR链被整合到位点B，以产生B'。所得细胞系表达所提供的TCR链，但缺少互补链，因此不表达任何表面TCR(eTPC-x中间体)。第二整合对D/E保持不变。在第二步中提供E'，其中载体与ORF组合，用于第二单分析物TCR链，其与先前整合的TCR链互补，使得该第二互补分析物TCR链整合至位点D，以产生D’。所得细胞系表达所提供的互补分析物TCR链对，并作为TCRsp在细胞表面呈递(图9)。
在上述从eTPC制备分析物eTPC-x和/或eTPC-t群体的实例中，多组件系统用于以限定的方式提供已知的分析物TCR链以制备表达定义的TCRsp的分析物eTPC的离散群体。这样的过程可以重复多次以构建eTCP-x和/或eTCP-t的库以提供分析或制备工作流程。另一种方法是将分析物TCR链的汇集文库与遗传供体载体组合，并以鸟枪方式整合这些库以获得分析物eTPC-t的汇集文库，其中每个eTPC-t整合来自原始载体池的单个随机对的TCRORF，因此每个eTPC-t表达单个随机TCRsp，但共同地，池编码在原始载体池中表示的多个种类的TCRsp。可以应用相同的鸟枪原理来创建eTPC-x池。当分析针对分析物抗原的候选TCRsp的大型库时，这尤其有用。
可以使用包含一个整合对的多组件系统在一个步骤中从组件A制备eTPC-t池，通过提供与编码分析物TCR对的池的多个ORF的文库组合的组件C'，使得一对整合到每个细胞内的B位点，以产生B'，并且其中每个eTPC-t整合来自原始载体池的单个随机对的TCR ORF，因此每个eTPC-t表达单个随机TCRsp，但是共同地，池编码在原始载体池中表示的多个种类的TCRsp。所得的细胞池含有一组共同表达多种分析物TCRsp的细胞(图10)。
可以使用包含两个整合对的多组件系统在一个步骤中从组件A制备eTPC-t池，通过提供与编码分析物TCR对的池的多个ORF的库组合的组件C'，从而将一对整合到每个细胞内的位点B，以产生B'，并且其中每个eTPC整合来自原始载体池的单个随机对TCR ORF，因此每个eTPC-t表达单个随机TCRsp，但共同地，池编码在原始载体池中表示的多个种类的TCRsp。所得细胞池包含一组共同表达多种分析物TCRsp的细胞。第二整合对D/E保持不变(图11)。
可以使用包含两个整合对的多组件系统在一步中从组件A制备eTPC-t池，通过提供与编码单个分析物TCR链库的多个ORF库组合的组件C'，使得每个eTPC将在组件C'编码的单个随机化TCR链ORF整合到位点B，以产生B'。同时，提供与多个ORF库组合的组件E'，所述ORF编码与C'中提供的第一库互补的单个分析物TCR链的池，使得每个eTPC-t将组件E'中编码的单个随机化互补TCR链ORF整合到位点D，以产生D'。eTPC-t池中的每个所得细胞具有单对随机化互补TCR链ORF，使得池中的每个细胞表达随机化的TCRsp。这样的汇集库将含有来自组件C'和E'中进行的组中的所提供的互补TCR链的所有可能组合(图12)。
可以使用包含两个整合对的多组件系统在一步中从先前获得的e-TPC-x制备eTPC-t池，其中位点B已转化为B'并含有单一分析物TCR链。通过提供与多个ORF库组合的组件E'来制备eTPC-t，所述ORF编码与已经整合的链互补的单个分析物TCR链库，使得每个eTPC-t将所提供的E'库的单个随机化TCR链ORF整合到位点D，以产生D'。eTPC-t池中的每个所得细胞具有由起始eTPC-x提供的分析物TCR链，以及一组每个单个互补分析物TCR链，使得池中的每个细胞表达随机对的ORF作为TCRsp。当分析改变单链对互补TCR链对中固定链的影响时，使用这种方法(图13)。
eTPC-x可以由包含两个整合对的eTPC-t制备，通过提供其他整合载体之一，组件Y或Z，其编码整合标记或不编码ORF。组件Y或Z与eTPC-t的组合将交换任一位点以获得表达eTPC-x的单个TCR链(图14)。
用于将eTPC-t转化为eTPC-x的优选遗传整合载体，组件Y和组件Z将包含与上述组件C和E相同的整合载体要求，但不编码任何TCR链ORF，并且优选编码整合标记。
eTPC-x或其库可用于瞬时转染TCR链ORF，其与eTPC-x中B'或D'处的整合的TCR链ORF互补，以在靶标检测中快速筛选TCRsp衍生物。
将分析物eTPC-t与分析物抗原接触
本发明涉及提供工程化的多组件系统。组件A和一种或多种组件C'和/或一种或多种组件E'用于组装一种或多种分析物eTPC-t。分析物eTPC-t群体用于编辑分析装置，其统称为eTPC:抗原(eTPC:A)系统(图24)。在多组件体系内，一种或多种组件C'和/或一种或多种组件E'与组件A组合以产生各种形式的分析物eTPC-t。然后将这些分析物eTPC-t与分析eTPC:A系统中的一种或多种分析物抗原组合以获得一种或多种输出。分析物抗原由分析物抗原呈递细胞(APC)提供和/或作为可溶性或固定化亲和试剂提供和/或在非基于细胞的颗粒(NCBP)上呈递。
分析物抗原代表TCR可以推定接合eTPC:A系统的任何实体，并且可以表示为；
i.aAPX(分析物抗原呈递复合体)和/或
ii.aAM(分析物抗原分子)和/或
iii.aAPX:aAM(分析物抗原呈递复合体，呈递分析物抗原分子)和/或
iv.CM(非分析物货物分子)和/或
v.aAPX:CM(分析物抗原呈递复合体，呈递货物分子)
其中aAPX代表能够呈递aAM的复合体；aAM是任何被TCR直接识别或装载到aAPX中的分子；aAPX:aAM是带有装载的aAM的aAPX；CM是货物分子，可以装载在aAPX中，但不是分析物，因此可以衍生自分析物抗原呈递细胞(APC)或分析系统本身；aAPX:CM是装载了CM的aAPx。
这些形式的分析物抗原可以在eTPC:A系统内以不同模式呈现给eTPC，表示为；
i.分析物抗原呈递细胞(APC)和/或
ii.可溶性或固定化亲和试剂和/或
iii.非基于细胞的颗粒(NCBP)，
其中分析物抗原呈递细胞(APC)被认为是能够将抗原呈递给eTPC-t的任何APC；亲和试剂被认为是制备为分析物的任何试剂，以在eTPC:A系统中探测eTPC-t细胞表面的TCRsp结合和/或刺激。这样的试剂将通常代表分析物抗原分子(aAM)，分析物抗原呈递复合体(aAPX)，或装载有aAM的aAPX(aAPX:aAM)。aAPX:aAM的典型实例是用于染色TCR的pHLA-多聚体试剂(例如'四聚体')。在该背景中的亲和试剂也可以代表抗体或类似实体；非基于细胞的颗粒(NCBP)以与亲和试剂类似的方式起作用，因为颗粒呈现分析物抗原或将在eTPC:A系统内的eTPC-t表面评估TCRsp接合的其他实体。然而，NCBP被认为是更大的实体，其可以进一步携带遗传信息或其他信息，所述遗传信息或其他信息直接或通过代理，作为所呈递的分析物抗原或其他结合实体的标识符。NCBP的典型实例是噬菌体展示方案中的噬菌体，其中噬菌体可以展示抗体片段抗原结合(FAB)。可以将阳性标记的eTPC-t与噬菌体一起回收，并测序以鉴定对eTPC-t表面的TCRsp特异的FAB。
分析eTPC:A系统由一组一种或多种分析物抗原和一种或多种eTPC-t群体组成(图24)。使用如上所述的多组件系统制备分析物eTPC-t群(图1至14)。eTPC:A系统以允许分析物抗原和分析物eTPC-t群体之间的物理接触的形式提供，其中这种接触允许一种或多种分析物抗原与一种或多种分析物eTPC-t的TCRsp之间的复合体形成，其中分析物抗原是下列任何一种
i.aAPX(分析物抗原呈递复合体)和/或
ii.aAM(分析物抗原分子)和/或
iii.aAPX:aAM(分析物抗原呈递复合体，呈递分析物抗原分子)和/或
iv.CM(非分析物货物分子)和/或
v.aAPX:CM(呈递货物分子的分析物抗原呈递复合体)
其中分析物抗原或者由分析物APC提供，或者由可溶性和/或固定化亲和试剂或NCBP呈递，使得复合体形成可以导致这种复合体的稳定化，并且其中这种复合体形成导致ePC-t的可观察到的标记和/或(如果包括的话)经由组件F在分析物eTPC内的信号传导的诱导，和/或在分析物APC中可观察到的信号，其可被测量。
在本文背景中，eTPC:A系统包括：
i.单个分析物eTPC-t的输入；或
ii.汇集的分析物eTPC-t库的输入
并组合以下之一：
iii.单个分析物APC的输入；或
iv.单个分析物亲和试剂的输入；或
v.单个分析物NCBP的输入；或
vi.汇集的分析物APC库的输入；或
vii.汇集的分析物亲和试剂库的输入；或
viii.汇集的分析物NCBP库的输入。
缓冲系统中接触
分析物APC和分析物eTPC-t之间的接触在允许的细胞培养物或缓冲系统中进行，其中所述系统包含允许分析物APC和分析物eTPC-t细胞的功能的介质。
可溶性分析物亲和，固定的亲和试剂和/或分析物NCBP和分析物eTPC-t之间的接触，在允许的缓冲的系统中执行，其中所述系统包括允许分析物抗原和分析物eTPC-t细胞都发挥功能的缓冲介质。
用亲和试剂或NCBP标记eTPC-t
从两部分装置获得的分析物eTPC-t可用于eTPC-t呈递的TCRsp的表征。这种表征可以以分析物eTPC-t与固定的或可溶的亲和试剂或非基于细胞的颗粒(NCBP)接触的方式进行，以此方式标记eTPC-t(图15)。
标记可以被认为是通过诸如流式细胞术、显微术、光谱法或发光测定法的方法或可替代地借助利用固定的亲和试剂或NCBP的捕获，通过直接观察标记来检测。以类似的方式，亲和试剂或NCBP可以刺激报告元件，即组件F，如果包括的话。组件F的刺激将允许为了鉴定而选择eTPC-t和/或亲和试剂或NCBP(图16)。
信号反应定义
从两部分装置获得的分析物eTPC-t用于表达分析物TCRsp的分析物eTPC-t对分析物抗原的信号反应的表征，其中这样的信号的响应可以是二元或逐渐的，并且可测量为eTPC-t固有的(图15，16和17)和/或APC(如果包括的化，图18)固有的。可通过诸如流式细胞术、显微术、光谱测定法或发光测定法或本领域技术人员已知的其他方法的方法检测此类信号。
通过信号反应与APC接触
还可以在eTPC:A系统内使分析物APC与eTPC-t接触。通常，响应将通过eTPC-t内的报告信号来测量(图17)，但也可以通过APC内的报告信号来测量(图18)。
一般方法-选择eTPC-t
从组合的eTPC:A系统中选择来自输入分析物eTPC-t或分析物eTPC-t库的一种或多种分析物eTPC-t，以获得一种或多种分析物eTPC-t的方法，其中表达的TCRsp结合一种或多种分析物抗原，所述方法包括
i.将一种或多种分析物eTPC-t与一种或多种分析物抗原组合，导致分析物TCRsp与分析物抗原之间的接触，并且至少一种
ii.测量一种或多种分析物TCRsp与一种或多种分析物抗原之间的复合体的形成(如果有的话)和/或
iii.测量来自标记的分析物抗原的信号和/或
iv.测量由一种或多种分析物TCRsp与一种或分析物抗原之间的复合体形成诱导的分析物eTPC-t的信号反应(如果有的话)和/或
v.测量由一种或多种分析物TCRsp与一种或多种分析物抗原之间的复合体形成诱导的分析物APC的信号反应(如果有的话)和
vi.基于步骤ii，iii，iv和/或v选择一种或多种分析物eTPC-t，其中通过阳性和/或阴性测量进行选择
其中i，iv和vi或i，v和vi包括优选的排列。
一般方法-选择分析物抗原
用于从输入分析物抗原或分析物抗原库中选择一种或多种分析物抗原以获得一种或多种分析物抗原的方法，其中表达的分析物抗原与分析物eTPC-t呈递的一种或多种分析物TCRsp结合，所述方法包括
i.将一种或多种分析物抗原与一种或多种分析物eTPC-t组合，导致由分析物抗原呈递的分析物抗原与一种或多种分析物eTPC-t的分析物TCRsp之间的接触和
ii.测量一种或多种分析物抗原与一种或多种分析物TCRsp之间的复合体的形成(如果有的话)和/或
iii.测量来自标记的分析物抗原的信号和/或
iv.测量在分析物TCRsp与分析物抗原之间的复合体形成诱导的一种或多种分析物eTPC-t中的信号反应(如果有的话)和/或
v.通过由一种或多种分析物TCRsp与一种或多种分析物抗原的复合体形成诱导的分析物APC测量信号反应(如果有的话)和
vi.从步骤ii，iii，iv和/或v中选择一种或多种分析物抗原，其中通过阳性和/或阴性测量进行选择
其中i，iv和vi或i，v和vi包括优选的排列。
一般方法-通过信号传导选择
基于报告的信号反应从组合的eTPC:A系统中选择分析物eTPC-t和/或分析物APC和/或亲和试剂和/或NCBP的方法包括
i.确定天然信号传导响应和/或
ii.如果eTPC-t包含组件F，和/或如果分析物APC包含等效的合成报告元件，则确定合成的信号传导响应。
通过检测以下一种或多种的增加或减少来测量APC和/或eTPC-t固有的诱导的天然或合成的信号传导响应
i.分泌的生物分子
ii.分泌的化学物质
iii.细胞内生物分子
iv.细胞内化学物质
v.表面表达的生物分子
vi.分析物eTPC-t对分析物APC的细胞毒作用
vii.分析物eTPC-t对分析物APC的旁分泌作用，使得在分析物APC中诱导信号反应，并通过检测a至e的增加或减少中任何一个来确定
viii.分析物eTPC-t的增殖
ix.分析物eTPC-t和分析物APC之间的免疫突触
其中所述检测到的信号反应与分析物APC和/或分析物eTPC-t固有的非诱导信号反应状态进行比较，然后组装所述组合的eTPC:A系统和/或平行组装的组合系统，其中分析物APC和/或分析物eTPC-t可以呈递对照分析物抗原和/或分析物TCR种类和/或可溶性分析物抗原，其已知在使用中的组合的eTPC:A系统内不诱导信号反应。
通过标记和/或信号反应进行选择的方法
基于所述亲和试剂或NCBP对eTPC-t的可测量标记，从组合的eTPC:A系统中选择分析物eTPC-t和/或分析物亲和试剂和/或分析物NCBP的方法包括：
i.通过亲和试剂或NCBP确定eTPC-t的标记，并且也可以包括
ii.确定天然信号传导响应和/或
iii.如果eTPC-t含有这样的组件F，则确定合成的信号传导响应。
其中通过检测eTPC-t的标记来选择eTPC-t和/或亲和试剂和/或NCBP可以包括经由在亲和试剂和/或NCBP上包括可检测标记通过亲和试剂和/或NCBP来检测eTPC-t的表面标记。这种可检测标记可以是荧光、发光、光谱、化学、放射化学或亲和部分。因此，可以基于FACS、MACS或等效的高通量筛选和选择方法进行eTPC-t的这种选择。
概述
在组合的eTPC:A系统中，测量一个或多个分析物eTPC-t或一个或多个分析物APC或eTPC-t的标记中的信号反应，对于选择初级系统输出是至关重要的(图24步骤v)，该信号反应可以通过分析物抗原与分析物抗原之间的复合体的形成来介导，其中初级系统输出是单细胞或细胞池，和/或单个亲和试剂或亲和试剂库和/或单个NCBP或NCBP池。其中细胞或试剂的选择可以在接触的分析物APC或分析物eTPC-t细胞中的任一个和/或两者中的报告的信号反应的存在或不存在时进行，或者通过用亲和试剂或NCBP对eTPC-t的可测量标记来进行。
从eTPC:A系统获得初级系统输出
本发明涉及提供衍生分析物eTPC-t的两部分装置。然后通过如前所述的eTPC:A系统将这些分析物eTPC-t与一种或多种分析物抗原组合以获得一种或多种输出。分析物抗原由分析物抗原呈递细胞(APC)和/或作为可溶性或固定化的分析物抗原提供和/或呈现在非基于细胞的颗粒(NCBP)上。该系统由一种或多种分析物抗原与一种或多种eTPC-t群体的选择组成(图24)。eTPC:A系统以允许分析物抗原和分析物eTPC-t群之间的物理接触的形式提供，其中这种接触允许一种或多种分析物抗原和一种或多种分析物eTPC-t之间的复合体形成，其中分析物抗原是以下任何一种
i.aAPX和/或
ii.aAM和/或
iii.aAPX:aAM和/或
iv.CM和/或
v.aAPX:CM
并且其中分析物抗原或者被提供为由分析物APC呈递，或者由可溶性和/或固定化分析物亲和试剂或分析物NCBP呈递，使得复合体形成可以导致这种复合体的稳定化并且其中可以报导并测量导致eTPC-t的标记和/或分析物eTPC(如果包括)和/或分析物APC内的信号传导的诱导。
以上描述了报告和/或eTPC-t标记的诱导信号反应的模式，并且恰好是这些报告的响应和/或标记是在获得编辑为eTPC:A系统的两部分装置的初级输出时需要测量的。
来自eTPC:A系统的初级输出是选择的细胞群和/或选择的亲和试剂或选择的NCBP，其中选择是基于；
i.通过亲和试剂或NCBP的可测量的标记eTPC-t和/或
ii.在eTPC-t中检测到的信号反应和/或
iii.在eTPC-t中缺乏检测到的信号反应和/或
iv.在分析物APC中检测到的信号反应和/或
v.在分析物APC中缺乏检测到的信号反应；
其中初级输出可以表示为单个细胞，或细胞池和/或一个或多个eTPC-t相关亲和力试剂或NCBP。
可以基于接触细胞中的响应来选择来自组合的eTPC:A系统的分析物亲和试剂、NCBP或分析物APC和/或分析物eTPC-t。也就是说，可以基于接触的分析物eTPC-t中报告的响应或其缺乏来选择分析物APC。相反，可以在接触分析物抗原中的报告的响应或缺乏它的情况下选择分析物eTPC-t，或者在分析物抗原是分析物亲和试剂或NCBP、分析物亲和试剂或NCBP的情况下可以从eTPC-t响应中选择分析物亲和试剂或NCBP。
来自系统的初级APC输出是所选择的细胞，其中基于分析物APC或eTPC-t中的报告的信号反应的存在或不存在进行选择，并且这些细胞可以包含APC和/或eTPC-t中的一种或多种，其中所选择的细胞可以包含单个细胞，相同身份的细胞库，不同身份的细胞池(图24步骤v)。
来自系统的初级eTPC-t输出是选择的细胞，其中基于报告的信号反应的存在或不存在进行选择，并且这些细胞包括eTPC-t，其中所选择的细胞可以包括单个细胞，具有相同身份的细胞池，不同身份的细胞池(图24步骤v)。
来自系统的初级分析物亲和试剂或NCBP输出是具有或不具有相关亲和试剂或NCBP的选择的细胞，其中基于分析物eTPC-t的标记或报告的信号反应的存在或不存在进行选择，其中选择的亲和试剂或NCBP可包含单一亲和试剂或NCBP，相同身份的亲和试剂或NCBP池，不同身份的亲和试剂或NCBP池(图24步骤v)。
在组合的eTPC:A系统中分析物APC和/或分析物eTPC-t中报告的信号可用于选择分析物细胞群或分析物亲和试剂或NCBP以提供初级输出。
APC和/或eTPC-t类型的初级输出可以在其中组合的eTPC:A系统具有二元培养性质(例如图15至18)的情况下通过从二元系统选择所需的分析物APC和/或分析物eTPC来实现。
eTPC-t的初级输出可以在其中组合的eTPC:A系统具有一种或多种分析物eTPC-t与分析物抗原(例如图19至21)的二元组成的情况下通过选择期望的分析物eTPC-t群体实现，所述eTPC-t群体用分析物亲和试剂或NCBP标记，或由eTPC:A系统内的分析物亲和试剂或NCBP或分析物APC激活。
分析物亲和试剂或NCBP的初级输出可以在其中组合的eTPC:A系统是一种或多种分析物eTPC-t与分析物亲和试剂或NCBP的二元组合物(例如图21)的情况下通过选择期望的分析物eTPC-t群体实现，所述eTPC-t群体用来自eTPC:A系统的分析物亲和试剂或NCBP标记，或被其信号诱导。
APC的初级输出可以在其中组合的eTPC:A系统是固定的分析物eTPC-t和汇集库分析物APC(例如图22)的情况下通过基于对响应的检测或者缺乏响应在分析物APC中选择分析物APC来实现。
有几种不同的模式可以获得初级输出，其中每种模式都需要分选步骤。可以通过荧光激活细胞分选(FACS)和/或磁激活细胞分选(MACS)和/或不同的亲和激活细胞分选方法来实现分选。
初级输出APC和/或eTPC-t细胞，和/或eTPC相关亲和试剂或NCBP可以通过单细胞分选获得，以获得单个细胞和/或通过对池的细胞分选以获得细胞池。
初级输出APC和/或eTPC-t细胞可以通过单细胞分选获得，以获得单个细胞，并且任选地随后长出单个细胞以获得所选择的APC或eTPC-t细胞的单克隆池。
初级输出APC和/或eTPC-t细胞可以通过对池的细胞分选获得细胞池，并且任选地随后长出细胞库以获得所选择的APC和/或eTPC-t细胞池。
从eTPC:A系统获得终端系统输出
在上述获得初级输出的方法之后，其中初级输出是选择的分析物APC和/或分析物eTPC-t，其基于测量的信号反应或稳定的复合体形成而选择，使得来自eTPC:A系统的终端输出可以通过进一步处理所选择的APC和/或eTPC初级输出来获得。
在本发明背景下，来自多组件系统的终端输出是以下的身份
i.aAPX和/或
ii.aAM和/或
iii.aAPX:aAM和/或
iv.CM和/或
v.aAPX:CM和/或
vi.TCRsp
由分析物APC或分析物eTPC-t或分析物亲和试剂或分析物NCBP呈递，并通过从组合的eTPC:A系统中选择而获得作为多组件系统的初级输出。
在eTPC:A系统内，通常情况是由分析物APC和分析物eTPC-t呈递的分析物分子是遗传编码的。还可能的情形是分析物NCBP具有遗传编码的身份，例如，在噬菌体展示的NCBP的情况下。因此，为了识别由分析物APC或分析物eTPC-t呈递的分析物分子，可以进行所制备的分析物APC、eTPC-t和分析物NCBP的基因测序。
可以处理APC，以便获得分选的和/或扩增的APC细胞的基因组或转录组的基因序列，以确定以下的身份
i.aAPX和/或
ii.aAM和/或
iii.aAPX:AAM
iv.CM和/或
v.aAPX:CM和/或
其中所获得的身份代表来自eTPC:A系统的终端输出。
在本发明的背景中，可以处理拥有遗传组件的分析物NCBP，使得获得分选的和/或扩增的分析物NCBP的基因组或转录组的遗传序列以确定分析物NCBP的身份，其中所获得的身份代表来自eTPC:A系统的终端输出。
可以处理eTPC-t，使得获得分选的和/或扩增的eTPC-t细胞的组件B'和/或组件D'的基因序列，以确定TCRsp的身份，其中获得的TCRsp的身份代表来自eTPC:A系统的终端输出。
可以处理eTPC，使得获得分选的和/或扩增的eTPC-t细胞的基因组或转录组的遗传序列，以确定TCRsp的身份，其中获得的TCRsp的身份代表来自eTPC:A系统的终端输出。
无论是否经过特定处理，遗传测序可以通过一系列模式实现，也可以通过排列遗传材料来实现。
在本发明的背景中，测序步骤之前可以是
i.提取基因组DNA和/或
ii.提取组件B'和/或D'RNA转录物和/或
iii.通过PCR和/或RT-PCR扩增组件B'和/或D'的DNA和/或RNA转录物。
测序步骤可能对作为来自多组件系统的初级输出所获得的APC或eTPC-t或分析物NCBp或其池具有破坏性。
如果希望从eTPC:A系统获得初级输出，其中测序步骤对初级输出eTPC-t具有破坏性，则可以使用作为两部分装置的终端输出所获得的序列信息来制备等效输出eTPC-t作为分析物eTPC-t。
在上述遗传编码的分析物分子的情景中，eTPC:A系统的终端输出可以通过从组件B'和/或D'和/或从细胞基因组和/或转录组获得序列信息来获得。然而，在一些实施方案中，抗原信息不会被遗传编码。经过翻译后修饰的抗原，通过非遗传方式提供给组合的eTPC:A系统的抗原，从分析物APC蛋白质组或代谢物的诱导或修饰状态中出现的抗原，eTPC:A系统固有的CM，以及亲和试剂或没有遗传元件的NCBP可能无法通过基因测序手段合理地识别。
在可以通过非遗传方式提供给eTPC:A系统的aAM的重要情况中，存在两种不同的模式，APC可以通过这两种模式将提供的aAM呈递为aAPX:aAM复合体。在第一种情景下，aAM以可直接结合aAPX并在细胞表面形成aAPX:aAM复合体的形式提供。这种aAM的实例是HLA复合体的肽抗原。在第二种情景下，提供的aAM的形式可以由分析物APC接收并处理，使得它作为货物装载在aAPX中并在细胞表面形成aAPX:aAM复合体。
一种选择和识别aAM货物或CM货物的方法，其中货物是代谢物和/或肽，其被装载到作为多组件系统的初级输出所选择和获得的APC的aAPX中，包括
i.隔离aAPX:aAM或aAPX:CM或货物aM或货物CM和
ii.识别装载的货物
其中所识别的装载货物(CM或aM)代表两部分装置的终端输出。
通常存在两种模式，通过这两种模式可以从所选择的APC中识别货物分子。首先，从aAPX:aAM或aAPX:CM强制释放货物导致可用于随后识别的aAM或CM的隔离。这方面的一个例子是酸洗APC以从HLA复合体中释放肽aAM。其次，aAPX:aAM或aAPX:CM的捕获，例如，通过释放复合体和免疫亲和分离方法，导致aAPX:aAM或aAPX:CM复合体的分离，使得可以识别aAM或CM。
直接或从分离的aAPX:aAM或aAPX:CM复合体中识别分离的aAM和/或CM的方法可包括
i.质谱分析
ii.肽测序分析
其中包含aAM和/或CM身份是来自两部分装置的终端输出。
使用两部分装置作为eTPC:A系统测定TCRsp对分析物抗原的亲和力
在上述获得初级输出的方法之后，其中初级输出是基于测量的信号反应所选择的分析物eTPC-t细胞，可以对eTPC-t初级输出进行亲和力分析以确定TCRsp对同源分析物抗原的亲和力，其中分析物抗原是以下任何一种
i.aAPX和/或
ii.aAM和/或
iii.aAPX:aAM和/或
iv.CM和/或
v.aAPX:CM
并且其中分析物抗原作为可溶性试剂提供或由分析物APC或分析物NCBP呈递，使得分析物TCRsp的亲和力根据以下方法测定
i.使用分析物抗原在浓度范围内标记所选择的分析物eTPC-t
ii.对步骤a的染色分析物eTPC-t进行FACS分析
iii.确定分析物eTPC-t在分析物抗原浓度范围内的荧光标记强度
iv.计算TCRsp对分析物抗原的亲和力
分析物TCRsp的亲和力也可以通过前述方法确定，但其中也可以包括标记的参照，使得使用分析物抗原荧光强度与参照荧光强度的比率来计算亲和力，其中标记的参照选自
i.用分析物TCR链之一或两个分析物TCR链的亲和试剂标记的分析物eTPC-t
ii.用一种或多种CD3蛋白的亲和试剂标记的分析物eTPC-t
iii.呈递标记的参照单一TCR链或标记的参照TCR链对的细胞或颗粒。
使用eTPC-t作为测定标准
本发明涉及提供工程化的多组件系统，其组件用于制备一种或多种分析物eTPC-t，以及所制备的eTPC-t在eTPC:A分析系统中的用途，其是用于确定分析物eTPC-t呈递的TCRsp的分析物抗原特异性，并且如果需要，用于对分析物抗原具有或不具有亲和力的eTPC-t的选择。
该系统非常适合快速产生TCR呈递标准，用于控制和校准检测携带TCR的细胞存在的测定(参见实施例9)，或用于制造旨在检测所选特异性的TCR对的亲和试剂和/或NCBP中的开发和/或控制。
在过去的二十年中，HLA多聚体试剂已经成为T细胞研究的关键部分，用于标记呈递特定TCR的T细胞(和其他细胞类型)，如在整个上述实施例中所采用的。最初设计为基于HLA分子的生物素化和用链霉抗生物素多聚化的四聚化试剂，这些试剂现在采用不同程度的多聚化的各种形式。多聚化通常被认为是HLA多聚体试剂可靠功能的关键，因为TCR-抗原-HLA相互作用相对较弱，因此HLA-抗原分子的多聚体状态稳定了与同源TCR的相互作用。典型的测定需要HLA多聚体试剂与制备的外周血样本的接触，以及通过使用流式细胞术检测样本内的标记的T细胞。
考虑到这些试剂相对复杂的性质，与抗体试剂的稳健生产和使用不同，它们在临床诊断中的应用很少。融入常规临床诊断的关键挑战是使用相对复杂和不稳定的试剂在复杂生物样本中的低频T细胞分析物的背景下控制假阳性和假阴性信号检测的手段。在降解的HLA-多聚体试剂的情况下经常观察到假阳性，这可能导致与T细胞的更高的非特异性结合。试剂降解也可以消除特定的TCR结合，导致假阴性读数。相关的挑战是任何给定的抗原特异性T细胞群可能仅代表患者样本中的一小部分细胞的问题，因此如果从流式细胞术测定检测，则HLA多聚体标记经常接近实际限制。因此，通常不清楚给定标本中缺乏观察到的T细胞标记是否代表真阴性或假阴性结果。这种模糊性因试剂本身相对不稳定的性质以及它们对正确样本制备的敏感性而进一步放大。
为了克服HLA多聚体试剂分析的不可靠性，需要稳健且高度定义的分析标准。可以生产各种形式的重组TC，其可以在流式细胞术兼容的微珠上功能化。然而，这种生产是不可靠的，并且大量生产某些对通常是不切实际的。不是重组蛋白TCR标准试剂，而是eTPC-t代表可以表达任何人TCR的重组细胞标准试剂，并且可以在简单的哺乳动物细胞培养系统中快速大量生产。此外，eTPC-t中的TCR呈递在细胞表面的天然CD3复合体环境中，因此可靠地反映了分析物原代T细胞群(或其他细胞群)内TCR的相同构象。为可靠的分析标准使用eTPC-t的一个关键方面是eTPC-t试剂的稳定性和实际分布，因为活细胞培养对临床诊断用途甚至常规研究用途都是非常不切实际的。
如上所述的eTPC:A系统因此可用于通过带有所需抗原的亲和试剂，NCBP或其他检测试剂来选择和表征具有定义的特异性和染色强度的一种或多种携带TCRsp的eTPC-t。
选择的eTPC-t或用独立选择的TCR对产生的eTPC-t可用作标准试剂，用于在设计用来检测特定TCR对的存在的测定中控制抗原携带亲和试剂，NCBP或其他检测试剂。这种测定可包括，
a)用于测定临床标本中所选TCR特异性的T细胞存在的细胞计数测定法；
b)用于在制备表达TCR的原代T细胞的细胞治疗产品中测定携带特异性TCR的细胞的存在的细胞计数测定法；
c)用于在制备表达TCR的工程化的T细胞的细胞治疗产品中测定携带特异性TCR的细胞的存在的细胞计数测定法；
d)用于测定给定亲和试剂，NCBP或设计用于检测特定TCR对的其他试剂的特异性和/或检测质量的测定法；
其中；这种测定可以代表使用标记或未标记试剂的流式细胞术测定或静态结合。
用于此类测定的eTPC-t可以制备成
a)活细胞
b)冷冻保存的细胞
c)化学固定的细胞
d)经辐照的细胞
其中；a)和b)可以组合；b)和c)可以组合；b)和d)可以组合。
附图说明
在以下非限制性附图中说明本发明。
图1-单个整合对多组件系统的组件描述。
包含四个组件的多组件细胞系统(MCS)的示例。第一组件A是eTPC系本身，具有该细胞所有所需的工程化的特征。eTPC A含有第二组件B，其是用于一对互补分析物TCR链ORF整合的基因组整合位点。包含在eTPC中的第三组件A是在TCR连接时诱导的合成报道构建体F。一种另外的独立组件C代表遗传供体载体，用于将ORF定点整合到位点B中，其中箭头表示偶联的特异性。
图2-双整合对多组件系统的组件描述
包含六个组件的多组件细胞系统(MCS)的示例。第一组件A是eTPC系本身，具有该细胞所有所需的工程化的特征。eTPC A含有另外三个组件，其中两个是B和D，它们是用于分析物TCR链整合的基因组整合位点。包含在eTPC中的第三组件A是在TCR连接时诱导的合成报道构建体。另外两个独立组件C和E分别代表遗传供体载体，用于将ORF定点整合到位点B和D中，其中箭头表示偶联的特异性。每个配对的整合位点/供体载体对可以被格式化以整合单个ORF或一对ORF以通过不同手段引入分析物TCR链对表达。
图3-呈递eTPC的不同分析物TCRsp的编辑
用于制备分析物eTPC群的多组件细胞系统(MCS)的操作始于eTPC，并使用供体载体产生表达分析物TCRsp或单个分析物TCR链的细胞。呈递TCRsp的eTPC被称为eTPC-t，并且可以通过向eTPC引入两个互补的TCR链编码ORF来产生(步骤i)。表达单个分析物TCR链的eTPC称为eTPC-x，并且可以通过将编码单个TCR链的ORF引入eTPC来产生(步骤ii)。或者，可以从eTPC-x产生eTPC-t，其中将编码第二互补TCR链的ORF引入现有的eTPC-x(步骤iii)。在某些情况下，可以通过去除单个分析物TCR链从eTPC-t创建eTPC-x(步骤iv)。
图4-遗传供体载体和基因组接收位点整合对的操作
遗传供体载体和基因组接收位点形成整合对，其中在遗传供体载体内编码的一个或多个ORF可以特异性地整合到其偶联的基因组接收位点。整合对的操作中的步骤1是将一个或多个靶ORF引入供体载体。初始供体载体被标记为X，并通过引入靶ORF而被修饰为引发的供体载体X'。步骤2需要将引发的供体载体X'与带有基因组接收位点Y的细胞组合。将引发的供体载体编码的ORF引入接收位点导致产生带有整合位点Y'的细胞。
图5-具有一步和一载体形式的eTPC系统的编辑
eTPC A含有不同的基因组接收位点。遗传供体载体C与D偶联。供体载体C编码TCR链对。eTPC A还含有TCR信号反应元件F。eTPC A与供体载体C组合。所得细胞的插入物C交换到B基因组接收位点以产生位点C'并递送TCR链对的两个ORF。该细胞能够在表面呈递TCRsp，因此被称为eTPC-t。
图6-使用一个载体和一个未使用的接收位点在一步中编辑eTPC-t
eTPC A含有不同的基因组接收位点B和D。遗传供体载体C'与D偶联。供体载体C'编码TCR链对。eTPC A还含有TCR信号反应元件F。eTPC A与供体载体C'组合。所得细胞的插入物C'与B基因组接收位点交换以产生位点B'并递送两个用于TCR链对的ORF。基因组接收位点D保持未使用。该细胞能够在表面呈递TCRsp，从而称为eTPC-t。
图7-使用两个载体和两个整合对在一步中编辑eTPC-t
eTPC A含有不同的基因组接收位点B和D。eTPC A还含有TCR信号反应元件F。不同的遗传供体载体C'和E'分别独立地与B和D偶联。供体载体C'编码单个TCR链，供体载体E'编码第二交互TCR链。eTPC A与供体载体C'和E'组合。所得的细胞的插入物C与B基因组接收位点交换以产生位点B'并递送第一TCR链的ORF。另外，所得细胞系的插入物E'与D基因组接收位点交换以产生位点D'并递送第二TCR链的ORF。该细胞能够在表面呈递TCRsp，因此被称为eTPC-t。
图8-使用一个载体和一个未使用的接收位点在一步中编辑eTPC-x
eTPC A含有不同的基因组接收位点B和D。遗传供体载体C'与D偶联。供体载体C'编码单个TCR链。eTPC A还含有TCR信号反应元件F。eTPC A与供体载体C'组合。所得细胞的插入物C'与B基因组接收位点交换以产生位点B'并递送单个TCR链ORF。基因组接收位点D仍未使用。该细胞仅表达单个TCR链，因此称为eTPC-x。
图9-使用两个载体在两步中编辑eTPC-t
eTPC A含有不同的基因组接收位点B和D。eTPC A还含有TCR信号反应元件F。不同的遗传供体载体C'和E'分别独立地与B和D偶联。供体载体C'编码单个TCR链，供体载体E'编码第二交互TCR链。在步骤1中，将eTPC A与供体载体C'组合。所得细胞的插入物C'与B基因组接收位点交换以产生位点B'并递送第一TCR链的ORF。该细胞仅表达单个TCR链，因此称为eTPC-x。基因组接收位点D仍然未使用。在步骤2中，eTPC-x与供体载体E'组合。所得细胞的插入物E'交换到D基因组接收位点以产生位点D'并递送第二互补TCR链的ORF。该细胞能够在表面呈递TCRsp，因此被称为eTPC-t。
图10-来自eTPC的eTPC-t池与配对分析物TCR链在单个重复载体中的鸟枪编辑以表达来自所选TCR链对库的离散TCR链对
eTPC A含有基因组接收位点B。遗传供体载体C'与B偶联。供体载体C'i，C'ii和C'iii编码不同的TCR链对，构成离散TCR链对的混合载体文库。eTPC A还含有TCR信号反应元件F。eTPC A与供体载体C'i，C'ii和C'iii同时组合。在多个独立实例中所得细胞库的插入物C交换到B基因接收位点以产生位点B'i，B'ii和B'iii，为初始载体库中含有的每个离散TCR链对递送两个ORF。该eTPC-t细胞池包含三个不同细胞克隆的混合群体，每个细胞克隆表达不同的TCR链对，表示为TCRsp i，ii和iii，形成eTPC-t汇集的文库。
图11-来自eTPC的eTPC-t池与配对分析物TCR链在单个重复载体中的鸟枪编辑，以表达来自所选TCR链对库和未使用的接收位点的离散TCR链对
eTPC A含有不同的基因组接收位点B和D。遗传供体载体C'与B偶联。供体载体C'i，C'ii和C'iii编码不同的TCR链对，并构成离散TCR链对的混合载体库。eTPC A还含有TCR信号反应元件F。eTPC A与供体载体C'i，C'ii和C'iii同时组合。在多个独立实例中，所得细胞库的插入物C与B基因组接收位点交换以产生位点B'i，B'ii和B'iii，为初始载体库中包含的每个离散TCR链对递送两个ORF。该eTPC-t细胞库包含三个不同细胞克隆的混合群体，每个细胞克隆表达不同的TCR链对，称为TCRsp i，ii和iii，形成eTPC-t汇集文库。基因组接收位点D仍未使用。
图12-来自eTPC的eTPC-t池与两个载体的鸟枪编辑，以表达来自所选单个TCR链库的配对TCR链对的随机组合
eTPC A含有不同的基因组接收位点B和D。不同的遗传供体载体C'和E'分别独立地与B和D偶联。供体载体C'i和C'ii各自编码单个TCR链，并且供体载体E'i和E'ii各自编码交互单个TCR链。eTPC A还含有TCR信号反应元件F。eTPC A同时与供体载体C'i，C'ii，E'i和E'ii组合。在多个独立实例中，所得细胞库的插入物C'i或C'ii与B基因接收位点交换以产生位点B'i和B'ii，每个位点为TCR链递送单个ORF。在多个独立实例中，所得细胞库进一步使插入物Ei或Eii与D基因组接收位点交换以产生位点E'i和E'ii，每个位点递送与位点C'i和C'ii处的那些交互的TCR链的单个ORF。所得的eTPC-t细胞库包含四个不同细胞群的混合群，每个细胞群在表面上表达离散的随机化TCRsp，其由初始载体库中含有的每个交互TCR链之一组成。
图13-来自eTPC-x的eTPC-t池与未配对的分析物TCR链的鸟枪编辑，以表达来自所选单个TCR链库的成对TCR链对的随机组合
eTPC-x含有交换的基因组接收位点B'，其表达单个TCR链和不同的基因组接收位点D。不同的遗传供体载体E'i和E'ii分别与D偶联。供体载体E'i和E'ii各自编码单个TCR链。eTPC-x还含有TCR信号反应元件F。eTPC-x同时与供体载体E'i和E'ii组合。所得细胞库具有插入物E'i或E'ii，在多个独立实例中，其与D基因组接收位点交换以产生位点Ei和E'ii，每个位点为TCR链递送单个ORF。得到的eTPC-t细胞库包含2个在表面上表达离散的TCRsp的不同细胞群的混合群，其由从与初始载体文库中包含的每个TCR链中的一个配对的B'表达的TCR链组成。
图14-将eTPC-t回复为eTPC-x
上图中描绘的细胞能够在表面呈递TCRsp，因此称为eTPC-t。该eTPC-t具有由TCRORF占据的基因组接收位点B和D，使它们呈B'和D'形式。携带基因组接收位点标记的遗传供体载体，与称为Y和Z的位点B'或D'偶联。向eTPC-t添加Y或Z将交换由B'或D'编码的TCR链的基因组接收位点标记。所得细胞仅表达单个TCR链，因此称为eTPC-x。
图15-组合的分析物eTPC:A系统的操作，显示可能的分析物亲和试剂或NCBP结合的eTPC-t输出状态
分析物eTPC-t含有位点B'和D'，每个位点与一个编码表面上交互TCRsp的ORF整合。当分析物eTPC-t和分析物亲和试剂或NCBP接触时，可以实现不同的eTPC-t标记状态；在这个例子中，一个是阴性的，三个是阳性的。阴性状态是输入eTPC-t的静止状态，分析物亲和试剂或NCBP没有可检测的结合，表示分析物亲和试剂或NCBP不能与eTPC-t呈递的TCRsp形成稳定的复合体。三个阳性状态显示分析物亲和试剂或NCBP的结合程度的假设范围，如细胞的较暗阴影所示。这表明分析物亲和试剂或NCBP分析物与eTPC-t群体表达的TCRsp的分级结合。
图16-组合的分析物eTPC:A系统的操作，显示响应分析物亲和试剂或NCBP的可能的信号报告的eTPC-t输出状态
分析物eTPC-t含有位点B'和D'，每个位点与一个编码表面上交互TCRsp的ORF整合。eTPC-t还含有TCR信号反应元件F。当分析物eTPC-t和分析物亲和试剂或NCBP接触时，可以实现不同的eTPC-t响应状态，在该实例中为一个阴性和三个阳性。阴性状态是eTPC-t的静息状态，在F元件处没有信号强度，表示分析物亲和试剂或NCBP不能形成复合体并刺激eTPC-t呈递的TCRsp。三个阳性状态显示来自F的增加的信号强度。状态F'+、F'+和F'+++分别表示低、中和高信号强度。表示为六边形的F的基因产物累积以报告每个细胞状态的信号强度，如细胞的较暗阴影所示。这表明eTPC-t群体表达的分析物TCRsp对分析物亲和试剂或NCBP的分级响应导致对F元件的信号转导。
图17-组合的分析物eTPC:A系统的操作，显示响应分析物APC可能的信号报告的eTPC-t输出状态
分析物eTPC-t含有位点B'和D'，每个位点与一个编码表面上交互TCRsp的ORF整合。eTPC-t还含有TCR信号反应元件F。当分析物eTPC-t和分析物APC群接触时，可以实现不同的eTPC-t响应状态，在该实例中为一个阴性和三个阳性。阴性状态是eTPC-t的静息状态，在F元件处没有信号强度，表示分析物APC呈递的aAPX:aAM/CM或aAM刺激eTPC-t呈递的TCRsp的失败。三个阳性状态显示来自F的信号强度增加。状态F'+、F'+和F'+++分别表示低、中和高信号强度。表示为六边形的F的基因产物累积以报告每个细胞状态的信号强度，如细胞的较暗阴影所示。这表明由eTPC-t群体表达的分析物TCRsp对由分析物APC呈递的分析物aAPX：aAM/CM或aAM的分级响应。
图18-组合的分析物eTPC:A系统的操作，显示可能的分析物APC输出状态
分析物eTPC-t含有位点B'和D'，每个位点与一个编码表面上交互TCRsp的ORF整合。eTPC-t还含有TCR信号反应元件F。当分析物eTPC-t和分析物APC群接触时，可以实现不同的APC响应状态，在该实例中为一个阴性和三个阳性。阴性状态是分析物APC的静息状态，表示TCRsp链对刺激分析物APC呈递的aAPX:aAM/CM或aAM复合体的失败。三个阳性状态显示来自接触的aAPX:aAM/CM或aAM的信号强度增加。报告的每个细胞状态的信号强度用*、**、***表示，并且还用细胞的较暗阴影表示。这表明分析物aAPX:aAM/CM或aAM对分析物eTPC-t呈递的分析物TCRsp链对的分级响应。
图19-组合的eTPC:A的操作以识别与eTPC-t池中的分析物亲和试剂或NCBP结合的TCRsp链对
eTPC-t库含有带位点B'i，ii或iii和D'i，ii或iii的细胞，其中每个eTPC-t与编码一对互补TCR链的一对ORF整合，因此在群体中每个细胞群组在表面上表达离散TCRsp。使分析物亲和试剂或NCBP与分析物eTPC-t池接触。在本实例中，仅从B'i/D'i(TCRsp i)表达的一对TCR链对分析物亲和试剂或NCBP是特异性的，使得仅携带TCRsp i的eTPC-t的细胞群(etTPC-t*)能够可检测地结合分析物抗原或NCBP(*)。可以基于亲和试剂或NCBP标记从池中选择与分析物亲和试剂或NCBP-结合的eTPC-t*。随后，通过对B'和D'的表达转录物的逆转录酶PCR直接或间接测序B'和D'DNA，可以鉴定所选和分离的eTPC-t*的分析物TCRsp编码ORF。
图20-组合的eTPC:系统的操作，以通过用分析物亲和试剂或NCBP刺激诱导信号报告响应来识别来自eTPC-t池的TCRsp链对
eTPC-t池含有带位点B'i，ii或iii和D'i，ii或iii的细胞，其中每个eTPC-t与编码互补的TCR链对的一对ORF整合，因此在群体中每个细胞群组在表面上表达离散TCRsp。eTPC-t还含有TCR信号反应元件F。分析物抗原或NCBP与分析物eTPC-t池接触。在本实例中，只有从B'i/D'i(TCRsp i)表达的TCR链对对于分析物亲和试剂或NCBP是特异性的，使得仅携带TCRsp i的eTPC-t(eTPC-t*)的细胞群能够通过元件F(*)诱导信号报告响应。与分析物亲和试剂或NCBP-结合的eTPC-t*可以基于亲和试剂或NCBP标记从eTPC-t池中选择。随后，通过B'和D'的表达转录物的逆转录酶PCR直接或间接测序B'和D'DNA，可以鉴定所选和分离的eTPC-t*的分析物的TCRsp编码ORF。
图21-组合的eTPC:A系统的操作以通过用分析物APC刺激诱导信号报告响应来识别来自eTPC-t池的TCRsp链对
eTPC-t池含有带位点B'i，ii或iii和D'i，ii或iii的细胞，其中每个eTPC-t与编码交互TCR链对的一对ORF整合，因此在群体中每个细胞群组在表面上表达离散的TCRsp。eTPC-t还含有TCR信号反应元件F。分析物APC在表面上表达aAPX:aAM/CM或aAM。在本实例中，只有由B'i/D'i(TCRsp i)表达的TRC链对aAPX:aAM/CM或由分析物APC呈递的aAM是特异的，因此当eTPC-t池和分析物APC群体接触时，只有携带TCRsp i的eTPC-t(eTPC-t*)的细胞群通过状态F'报告TCRsp接合。可以基于信号报告响应从池中选择由分析物APC刺激的eTPC-t*。随后，选择和分离的eTPC-t*的分析物TCRsp编码ORF可以通过B'和D'的表达转录物的逆转录酶PCR直接或间接测序B'和D'DNA来鉴定。
图22-组合的eTPC:A系统的操作，以通过诱导以APC为中心的信号报告响应来识别分析物APC呈递的分析物抗原
分析物APC池含有在其表面上表达不同aAPX:aAM/CM或aAM的细胞。分析物eTPC-t含有交换的基因组接收位点B'和D'，驱动表面上TCRsp的表达。在本实例中，只有复合体aAPX:aAM/CM或aAM i对分析物eTPC-t呈递的TCRsp是特异的，这样当分析物APC池和分析物eTPC-t群体接触时，只有表达aAPX：aAM/CM i的细胞群的响应(*)。该响应可以是对eTPC-t接合的固有信号反应，例如表面表型、转录物丰度或细胞死亡的变化。可以选择响应分析物APC以确定已被分析物eTPC-t呈递的分析物TCRsp接触的aAPX:aAM/CM或aAM。
图23-组合的eTPC:A系统的操作以通过eTPC-t捕获亲和试剂或NCBP试剂从这些实体池中鉴定亲和试剂或NCBP
分析物eTPC-t含有交换的基因组接收位点B'和D'，驱动表面上TCRsp的表达。使亲和试剂或NCBP池与分析物eTPC-t接触，其允许分析物eTPC-t呈递的分析物亲和试剂或对TCRsp特异的NCBP的结合。在本说明书中，TCRsp仅特异性结合亲和试剂或NCBP i，因此分析物eTPC-t仅用亲和试剂或NCBP i标记。因此，可以通过与eTPC-t的结合从池中选择亲和试剂或NCBP，以鉴定对分析物eTPC-t呈递的分析物TCRsp特异的那些亲和试剂或NCBP。
图24-用于组合的eTPC:A系统的组装的eTPC-t的多组件系统的操作
总体系统，其中工程化的多组件细胞系统(MCS)包括将制备的分析物工程化的TCR-呈递细胞(eTPC)与各种分析物抗原接触成组合的eTPC：A系统。主要输出源自组合的eTPC:A系统，并终端输出源自这些主要输出。总体系统的操作包括两个阶段，制备阶段和分析阶段。
在阶段1的一个方面，制备分析物抗原。这种分析物抗原以各种形式的抗原部分表达抗原；分析物抗原呈递复合体(aAPX)；分析物抗原分子(aAM)；装有aAM货物的aAPX(aAPX:aAM)；货物分子(CM)；装有CM的aAPX(aAPX:CM)；其中分析物抗原代表待测试对分析物eTPC-t的亲和力或信号诱导的那些(步骤i)，并且其中分析物抗原可以采取以下至少一种形式：可溶性试剂，固定化试剂，由非基于细胞的颗粒(NCBP)呈递或呈递在细胞表面(APC)上。在阶段1的另一个方面，多组件系统用于制备在细胞表面表达分析物TCR链对(TCRsp)的细胞(步骤ii)。在细胞表面呈递TCRsp的eTPC称为eTPC-t，其中eTPC-t呈递TCRsp至分析抗原以测试针对分析物抗原的亲和力或信号诱导。eTPC-t和分析物抗原的接触是由于组合的eTPC：A系统的组装(步骤iii)。
总体系统的阶段2是eTPC-t与在阶段1中制备的分析物抗原的接触，导致组合的eTPC：A系统的组装(步骤iii)。接触的分析物抗原将分析物部分呈递给分析物eTPC-t并且潜在地结合eTPC-t以与呈递的TCRsp形成稳定的复合体。在组合的eTPC:A系统中，分析物抗原或分析物eTPC-t的输出可以改变它们的信号状态，或者可以直接识别稳定的复合体(用*表示，并且用较暗的阴影表示)使得可以识别那些响应或稳定复合的种类(步骤iv)。基于eTPC:A系统内的改变的信号状态，如果适用，可以选择特异性分析物抗原在eTPC-t中诱导响应的能力，或与TCRsp形成稳定复合体的能力，或eTPC-t在分析物抗原中诱导应答的能力。类似地，可以选择分析物eTPC-t来诱导接触的分析物抗原中的响应，或者选择那些分析物在eTPC-t中诱导信号反应，或者选择分析物抗原与TCRsp形成稳定的复合体的能力。基于该响应性或稳定复合体的选择产生组合的eTPC:A系统的主要输出(步骤v)。通过获得来自步骤v的分析物细胞和/或分析物抗原，可以将所呈递的分析物aAPX，aAM，aAPX:aAM，CM，aAPX:CM和/或TCRsp识别为系统操作的终端输出(步骤vi)。
图25-在HEK239细胞系中选择具有HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座的靶向诱变的细胞
a)与HEK293对照细胞(虚线直方图)相比，用编码Cas9-P2A-GFP的质粒和靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座的gRNA(灰色直方图)转染48小时后两个独立细胞群中的GFP荧光信号。在GFP子集门内具有GFP信号的细胞被分选为多克隆群。b)当用PE-Cy5抗HLA-ABC缀合的抗体(灰色直方图)标记时，在两个分选的多克隆群上观察到细胞表面HLA-ABC信号。显示出低PE-Cy5抗HLA-ABC信号并在分选门内显示的单细胞被分选以建立单克隆。未标记的HEK293细胞(虚线直方图)和PE-Cy5抗-HLA-ABC标记的HEK293细胞(全黑线直方图)用作对照。
图26-HLA-ABCnull单克隆的表型分析：用PE-Cy5抗-HLA-ABC缀合的抗体对单克隆人群进行染色，并通过流式细胞术(灰色直方图)进行分析。未标记的HEK293细胞(虚线直方图)和PE-Cy5抗-HLA-ABC标记的HEK293细胞(全黑线直方图)用作对照。所有三种单克隆系均显示与未标记的对照匹配的荧光信号，证明每个系缺乏HLA-ABC表面表达。
图27-缺乏表面HLA-ABC表达的一组单克隆的遗传表征，证明在靶向HLA等位基因中的基因组缺失。用跨越特定HLA等位基因的gRNA基因组靶位点的引物产生PCR扩增子，并通过电泳确定它们的大小。野生型HLA-A扩增子的预期大小为1067bp，HLA-B扩增子为717bp，并且HLA-C扩增子为1221bp。
图28-具有或不具有合成组件D的合成组件B的靶向基因组整合的细胞的选择
a)用编码Cas9-P2A-GFP的质粒，靶向AAVS1基因座的gRNA和侧翼为AAVS1左右同源臂的组件B遗传元件转染48小时后的GFP荧光信号(灰色直方图)。HEK293细胞用作GFP阴性对照(虚线直方图)。在GFP+门内具有GFP信号的细胞被分类为多克隆群。b)用编码Cas9-P2A-GFP的质粒，靶向AAVS1基因座的gRNA和侧翼都为AAVS1左右同源臂的组件B和D转染48小时后的GFP荧光信号(灰色直方图)。HEK293细胞用作GFP阴性对照(虚线直方图)。在GFP+门内具有GFP信号的细胞被分选为多克隆群。c)维持的BFP但在D1分选的多克隆群中未观察到可检测的RFP信号。在象限Q3中显示高BFP信号的单细胞被分选以建立含有合成组件B单克隆的eTPC。d)在D2分选的多克隆群中观察到维持的BFP和RFP信号。在象限Q2中显示高BFP和RFP信号的单细胞被分选以建立含有合成组件B和合成组件D的eTPC单克隆。
图29-eTPC单克隆的表型分析
a和b)显示维持的BFP表达的单克隆群表明合成组件B的整合。c)显示维持的BFP和RFP表达的单克隆群表明合成组件B和合成组件D的整合。
图30-用于在AAVS1基因座中整合组件B或组件B和D的一组单克隆的遗传表征。
a)用在组件B和/或D内引发的引物产生PCR扩增子，并通过电泳确定大小。阳性扩增子的预期大小为380bp，表明组件B和/或D的稳定整合。b)用在AAVS1基因组序列上引发的引物产生PCR扩增子，所述基因组序列远离由同源臂编码的区域和由组件B和/或D编码的SV40pA终止子并通过电泳确定大小。阳性扩增子的预期大小为660bp，表明组件B和/或D的整合发生在AAVS1位点。
图31说明了靶基础细胞的识别和根据本发明的方法以获得eTPC或其变体
一种从靶基础细胞工程化并获得eTPC和/或eTPC+F的方法，其中该方法包括：
·步骤a选择靶基础细胞
·步骤b识别和选择TCRsp感受态基础细胞，定义为靶基础细胞，其能够在细胞表面表达一对互补的TCR链作为与CD3复合的蛋白质(TCRsp)
·步骤c是识别并选择确认的基础细胞，定义为包含基因组编码的CD3的TCRsp感受态基础细胞，无论是天然的还是基因工程化的，但当细胞被提供有编码TCR链的互补对的核酸时，在表面上有条件地表达
·步骤d是工程化并选择推定的eTPC，定义为确认的基础细胞，其被工程化为包含基因组整合的组件B和/或组件D，但其中尚未确定确切的拷贝数和位置
·步骤e是确认并选择eTPC，其被定义为已被确认为仅具有每个组件B和/或D的单个拷贝的推定eTPC。任选地，组件B和/或组件D被测试并且能够整合至少一个在组件C'和/或E'内编码的ORF
·步骤f是工程化并选择推定的eTPC+F，定义为eTPC，其被工程化为包含基因组整合的组件F，但其中未测试该细胞以确认该细胞可通过组件F引发信号反应
·步骤g是确认并选择eTPC+F，定义为推定的eTPC+F，其已被测试确认能够通过用互补的TCR链对的同源抗原刺激经由组件F引发信号反应。任选地，确定组件F的基因组位置和拷贝数。
可以直接从靶基础创建eTPC+F而无需先创建eTPC，其中该方法包括步骤a至c，并且还包括：
·步骤h工程化并选择推定的基础细胞+F，其被定义为已确认的基础细胞，其被工程化为包含基因组整合的组件F，但其中细胞尚未经过测试以确认细胞可以通过组件F引发信号反应
·步骤i是确认并选择A基础细胞+F，定义为推定的基础细胞+F，其已被测试确认能够通过组件F通过用TCR链的互补对的同源抗原刺激来引发信号反应。任选地，确定组件F的基因组位置和拷贝数
·步骤j是工程化并选择推定的eTPC+F，定义为基础细胞+F，其被工程化为包含基因组整合的组件B和/或组件D，但其中尚未确定确切的拷贝数和位置
·步骤g确认并选择eTPC+F，其定义为已确认每个组件B和/或D仅具有单个拷贝的推定eTPC+F。任选地，组件B和/或组件D被测试并且能够在组件C'和/或E'内整合至少一个编码的ORF。
图32-识别和选择TCRsp感受态基础细胞的方法
一种识别和选择能够表达与细胞表面上的CD3(TCRsp)复合的一对TCR链的靶基础细胞(被称为TCRsp感受态基础细胞)的方法，作为eTPC工程化中的第一过程，
·步骤a选择靶基础细胞
·步骤b用TCRsp和CD3特异性亲和试剂染色
·步骤c识别细胞是否缺乏TCRsp和CD3的表面表达
·步骤d用编码一对互补TCR链(pTCR)和CD3蛋白表达的核酸转染细胞
·步骤e用TCRsp和CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤f识别具有TCRsp和CD3表面表达的细胞，以确认细胞能够进行TCRsp表达
·步骤g选择在步骤f中鉴定的细胞作为TCRsp感受态基础细胞
图33-从TCRsp感受态基础细胞中鉴定和选择确认的基础细胞的第一种方法
第一种方法，通过该方法可以鉴定和选择TCRsp感受态基础细胞作为确认的基础细胞，其中确认的基础细胞是能够进行TCRsp并且还基因组编码CD3表达的细胞。
其中该方法包括
·步骤g选择TCRsp感受态基础细胞(来自图31)
·步骤h用编码一对互补TCR链(pTCR)表达的核酸转染细胞
·步骤i用CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤j鉴定具有CD3表面表达的细胞，确认当提供编码TCPsp的核酸时细胞能够表达CD3
·步骤k选择步骤j中定义的鉴定的细胞作为确认的基础细胞。
图34-从TCRsp感受态基础细胞中鉴定，工程化和选择确认的基础细胞的第二种方法
第二种方法，通过该方法可以鉴定，工程化并选择TCRsp感受态基础细胞作为确认的基础细胞，其中确认的基础细胞是能够进行TCRsp并且还基因组编码CD3表达的细胞。
其中该方法包括
·步骤g选择TCRsp感受态基础细胞(来自图31)
·步骤h用编码一对互补TCR链(pTCR)表达的核酸转染细胞，并独立地用编码CD3表达的核酸转染
·步骤i用TCRsp和/或CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤j鉴定在两种独立转染中缺乏TCRsp和/或CD3表达的细胞
·步骤k将编码CD3表达的核酸整合到细胞的基因组中
·步骤1用编码一对互补TCR链(pTCR)表达的核酸转染细胞
·步骤m用TCRsp和/或CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤n选择在细胞表面上表达TCRsp和CD3的细胞
·步骤o选择步骤n的工程化细胞作为确认的基础细胞。
图35-从TCRsp感受态基础细胞中鉴定，工程化和选择确认的基础细胞的第三种方法
第三种方法，通过该方法可以鉴定，工程化并选择TCRsp感受态基础细胞作为确认的基础细胞，其中确认的基础细胞是能够进行TCRsp并且还基因组编码CD3表达的细胞。
其中该方法包括
·步骤g选择TCRsp感受态基础细胞(来自图31)
·步骤h用编码CD3表达的核酸转染细胞
·步骤i用TCRsp和CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤j鉴定具有TCRsp和CD3表面表达的细胞
·步骤k将编码CD3表达的核酸整合到细胞的基因组中
·步骤1用TCRsp和/或CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤m选择在细胞表面上表达TCRsp和/或CD3的细胞
·步骤n靶向突变TCR基因组基因座
·步骤o用TCRsp和/或CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤p选择在细胞表面缺乏TCRsp和/或CD3表达的细胞
·步骤q用编码互补TCR链(TCRc1)对的单链表达的核酸转染细胞
·步骤r用TCRsp和/或CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤s选择在细胞表面缺乏TCRsp和/或CD3表达的细胞
·步骤t是用编码互补TCR链(TCRc2)对的单链的表达的核酸转染细胞，TCRc2是步骤q中的TCRc1的同源对
·步骤u用TCRsp和/或CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤v选择在细胞表面缺乏TCRsp和/或CD3表达的细胞
·步骤w选择步骤v的工程化细胞作为确认的基础细胞。
图36-从靶基础细胞鉴定，工程化和选择已确认的基本细胞的方法
一种方法，通过该方法可以鉴定，工程化和选择靶基础细胞作为确认的基础细胞，并且其中确认的基础细胞是能够进行TCRsp并且还基因组编码CD3表达的细胞。选择确认的基本单元是工程化eTPC的第二个过程。
该方法包括
·步骤a选择靶基础细胞
·步骤b用TCRsp和CD3特异性亲和试剂染色
·步骤c鉴定TCRsp和CD3的表面表达
·步骤d选择步骤c中确定的TCRsp感受态基础细胞
·步骤e靶向突变TCR基因组基因座
·步骤f用TCRsp和CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤g选择在表面上缺乏TCRsp和CD3表达的细胞
·步骤h用编码互补TCR链(TCRc1)对的单链表达的核酸转染细胞
·步骤i用TCRsp和CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤j选择在细胞表面缺乏TCRsp和CD3表达的细胞
·步骤k用编码互补TCR链(TCRc2)对的单链表达的核酸转染细胞，TCRc2是步骤q中TCRc1的同源对
·步骤1用TCRsp和CD3特异性亲和试剂对细胞染色
·步骤m选择在细胞表面缺乏TCRsp和CD3表达的细胞
·步骤n选择步骤v的工程化细胞作为确认的基础细胞。
图37-从确认的基础细胞工程化和选择eTPC或eTPC+F的方法
一种工程化和选择eTPC的方法，其中确认的基础细胞被工程化以包含基因组整合的组件B和/或组件D以获得推定的eTPC，并且其中确认推定的eTPC仅具有单个拷贝的B和/或组件D。任选地，测试组件B和/或组件D，并发现其能够整合至少一种在组件C'和/或E'内编码的ORF。
该方法包括
·步骤a使用图32至36中定义的任何方法选择确认的基础细胞
·步骤b将组件B和/或组件B整合到细胞的基因组中
·步骤c通过选择组件B和/或组件D选择标记的表达来选择具有整合的组件B和/或C的细胞
·步骤d根据步骤c获得推定的eTPC
·步骤e确认基因组内组件B和/或D的位置，并且基因组中只存在一个拷贝
·步骤f任选地用组件C'和/或E'结合整合因子转染细胞
·步骤g任选地用TCRsp和/或CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤h任选地鉴定具有TCRsp和/或CD3表面表达的细胞
·步骤i任选地鉴定组件B和/或D选择标记的丢失
·步骤j任选地鉴定组件C'和/或组件E'整合选择标记的获得
·步骤k将推定的eTPC确认为eTPC，其中确认由步骤e和/或步骤f，i，j和/或g和h中的任何一个确定。
从步骤d到步骤k的虚线箭头表示通过在步骤e中定义的最小确认，推定的eTPC被确认为eTPC。从步骤e到f的虚线箭头表示该过程是可任选的，并且概述步骤h，i和j的虚线框表示必须进行h，i或j中的至少一个。从虚线框到步骤k的虚线表示eTPC的进一步确认和表征，如步骤h，i和/或j中所确定的。
该方法还可以用以下步骤替换步骤a，步骤d和步骤k以获得eTPC+F
·步骤a使用图38中定义的替换方法选择A基础细胞+F
·步骤d根据步骤c获得推定的eTPC+F
·步骤k确认推定的eTPC+F作为eTPC+F，其中确认由步骤e和/或步骤f，i，j和/或g和h中的任何一个确定。
图38-从已确定的基础细胞中工程化并选择eTPC+F或eTPC的方法
一种工程化和选择eTPC+F的方法，其中eTPC被工程化为含有基因组整合的组件F以获得推定的eTPC+F，并且其中然后测试推定的eTPC+F以确认细胞和组件F是否能够通过用互补的TCR链对的同源抗原刺激，通过组件F引发信号反应。任选地，确定组件F的基因组位置和拷贝数，其中
该方法包括
·步骤a使用图37中定义的方法选择eTPC
·步骤b将组件F整合到细胞的基因组中
·步骤c通过选择组件F整合选择标记的表达来选择具有整合组件F的细胞
·步骤d根据步骤c获得推定的eTPC+F
·步骤e任选地确认基因组内的组件F位置和细胞基因组内存在的拷贝数
·步骤f用组件C'和/或E'结合整合因子转染细胞
·步骤g任选地用TCRsp和/或CD3特异性亲和试剂染色细胞
·步骤h任选地选择表面表达TCRsp和/或CD3的细胞
·步骤i选择组件B和/或D选择标记的丢失
·步骤j选择组件C'和/或组件E'整合选择标记的获得
·步骤k用针对TCRsp的同源抗原刺激所选细胞的TCRsp，如步骤h，i和/或j中的至少一个所选择的
·步骤1检测由步骤k刺激诱导的信号反应，其中反应是由组件F报告的
·步骤m将推定的eTPC+F确认为eTPC+F，其中确认由步骤l确定，并且任选地步骤e
从步骤d到步骤m的虚线箭头表示通过在步骤1中定义的最小确认，将推定的eTPC+F确认为eTPC+F。概述步骤h，i和j的虚线框表示必须进行h，i或j中的至少一个以便为步骤k选择细胞。
该方法还可以用以下步骤替换步骤a，d，f和m
·步骤a使用图32至36中定义的任何方法选择确认的基础细胞
·步骤d根据步骤c获得推定的基础细胞+F
·步骤f瞬时转染编码互补TCR链对表达的核酸
·步骤m确认推定的基础细胞+F作为基础细胞+F，其中确认由步骤l确定，并且任选地步骤e。
图39-靶基础细胞的FACS分析，其中细胞已经用抗TCR-α-β和抗CD3染色。
该图清楚地表明靶基础细胞缺乏CD3和TCRsp的表面表达。染色(黑线，灰色填充)和未染色(虚线，未填充)之间的荧光强度没有显著差异。
图40-靶基础细胞的FACS分析
用编码瞬时表达CD3和pTCR的质粒转染细胞，随后用抗TCR-α-β和抗CD3和dexA2-NLV-PE(可溶性抗原(aAPX：aM))染色。使用两种不同的pTCR，已知第一种pTCR(A)不能与dexA2-NLV-PE结合，而已知第二种pTCR(B)与dexA2-NLV-PE结合为同源抗原。作为对照，用不编码表达的质粒(命名为空载体对照(C))转染靶基础细胞。所有图都具有抗CD3荧光强度作为y轴，左图将x轴作为抗TCR-α-β荧光强度，右图将x轴作为dexA2-NLV-PE荧光强度。每个图中右上角的值是CD3+TCRsp+或CD3+dexA2-NLV-PE+阳性细胞的百分比。
这些图清楚地证明，当靶基础细胞被提供编码CD3和TCRsp表达的核酸时，其能够表达CD3和TCRsp。此外，由pTCR编码的已知与dexA2-NLV-PE(B)结合的TCRsp表现出与可溶性抗原的明显结合，表明TCRsp保留其生物学功能。相反，已知不能结合dexA2-NLV-PE的TCRsp(B)没有表现出结合。
图41-鉴定TCRsp感受态基础细胞的CD3和TCRsp表面表达的缺乏
鉴定TCRsp感受态基础细胞的CD3和TCRsp表面表达的缺乏，该细胞已经用编码表达TCR-α(A)，TCR-β(B)或空载体对照(C)的质粒转染。与空载体对照相比，用TCRα或TCRβ质粒转染的细胞的荧光强度没有观察到显著差异，表明缺乏任何互补TCR链的内源表达。此外，没有表现出CD3的表面表达，进一步证实细胞不表达内源性CD3或任何TCR链。
图42-将TCRsp感受态基础细胞瞬时转染以整合CD3
瞬时转染TCRsp感受态基础细胞以将CD3整合到基因组中。TCRsp感受态基础细胞已经用两种质粒转染，这两种质粒编码两种整合因子Cas9-2A-GFP和引导RNA的表达，以及用第三种质粒转染，该质粒在定点的同源重组质粒中编码CD3，靶向HLA-A基因座。已经进行了对照转染，其中编码无表达的空载体作为比较。通过细胞分选选择表现出GFP表达并随后含有整合细胞群的细胞。
图43-用于第一次选择的分选细胞的瞬时转染
来自图42的分选细胞的瞬时转染。已经用三种质粒转染(B)分选的细胞，第一种编码GFP的表达并用作转染对照。第二和第三质粒各自编码TCR-α(V3.C.3)链或TCR-β链。进行对照转染，其中细胞未提供TCRsp编码质粒(A)。用抗CD3染色细胞，选择并分选表现出CD3表面表达的细胞。
图44-用于第二次选择的分选细胞的瞬时转染
来自图43的分选细胞的瞬时转染。已经用三种质粒转染(B)分选的细胞，第一种编码GFP的表达并用作转染对照。第二和第三质粒各自编码TCR-α(V3.C.3)链或TCR-β链。进行对照转染，其中细胞未提供TCRsp编码质粒(A)。用抗CD3染色细胞，选择并分选表现出CD3表面表达的细胞。
图45-用于第三次选择的分选细胞的瞬时转染
来自图44的分选细胞的瞬时转染。已经用三种质粒转染(B)分选的细胞，第一种编码GFP的表达并用作转染对照。第二和第三质粒各自编码TCR-α(V3.C.3)链或TCR-β链。进行对照转染，其中细胞未提供TCRsp编码质粒(A)。用抗CD3染色细胞，选择96个表现出高CD3表面表达的细胞并分选用于单克隆(CD3单克隆选择框)，将剩余的CD3+细胞分选为用于冷藏的池。
图46-eTPC表征
鉴定和选择来自图45的单克隆，其已经表现出CD3和TCRsp表面表达。用编码互补TCRsp的两种质粒和编码GFP表达的第三种质粒(A)瞬时转染细胞。进行对照转染(B)，其中仅使用GFP质粒转染细胞。对GFP+细胞门控的两个转染的FAC分析清楚地表明，单克隆在提供编码TCRsp表达的遗传物质时有条件地表现出CD3表达。随后选择单克隆作为确认的基础细胞。
图47-含有组件D和/或B的单克隆的遗传表征
提供了两个表，总结了实施例2和3中产生的细胞的遗传表征，分别含有组件B或组件B和D。
图48：来自亲本eTPC的eTPC-t产生的证明
选择对HLA-A*02:01中呈递的HCMV抗原具有已知特异性的模型TCRα/β对(JG9-TCR)用于整合至eTPC亲本系。将JG9-TCR-αORF克隆到组件E'背景中，并将JG9-TCR-β克隆到C'背景中。将组件C'和E'质粒和编码flp重组酶的构建体转染到eTPC系ACL-488中，通过RMCE创建eTPC-t，所述ACL-488包含两个基因组整合位点B和D，分别编码报告基因BFP和RFP。转染后10天，由组件B和D选择标记编码的BFP和RFP信号减少的单个细胞被分选为单个细胞。所得单克隆eTPC-t ACL-851与亲本eTPC平行分析，并给出了一个实例。
a)和b)通过流式细胞术分析亲本eTPC细胞系ACL-488和实施例单克隆的BFP和RFP信号。该图显示了BFP与RFP的活的单细胞，显示eTPC细胞系对于组件B和D(a)中存在的选择标记是阳性的，并且所产生的单克隆已经失去了这些标记，如预期用于B/C和D/E(b)之间的整合对事件。百分比值表示a)中双阳性细胞和b)中双阴性细胞的百分比。
c)至f)eTPC ACL-488和单克隆eTPC-t ACL-851用针对JG9-TCR特异性的CD3的抗体和TCRα/β(TCRab)和HLA多聚体试剂(Dex HLA-A*02:01-NLVP)染色并通过流式细胞术分析并对活的单细胞进行门控。亲本eTPC系显示细胞表面上的CD3或TCR没有阳性染色(c)，并且对于用HLA多聚体试剂(d)染色也是阴性的。相反，所得单克隆对细胞表面上的CD3和TCR均显示阳性染色(e)，并且显示出对表达的JG9-TCR特异的多聚体试剂的阳性染色。百分比值表示在c)和e)中CD3/TCRab双阳性细胞的百分比，以及在d)和f)中CD3/HLA-多聚体双阳性细胞的百分比。
g)从单克隆eTPC-t ACL-851制备基因组DNA，并用对组件D'编码的JG9-TCR-α链或组件B'编码的JG9-TCR-β链特异的引物进行PCR。通过琼脂糖凝胶分离PCR产物并观察预期的条带大小。h)从单克隆eTPC-t ACL-851制备基因组DNA，并用对组件D'编码的JG9-TCR-α链或对组件B’编码的JG9-TCR-β链特异性的引物和探针进行数字滴PCR。包括用于TCRα恒定区(TRAC)的内含子的参照扩增子引物/探针对。该表显示了对TCRα和TCRβ的参照比率。接近0.33的比率表明每个TCRα和β链的单拷贝存在于eTPC-t系ACL-851中，其是三倍体系。
图49-从eTPC-t的eTPC-x回复的阐明
分别在位点D'和B'处表达TCRα和β链的亲本eTPC-t细胞系ACL-851通过用编码GFP的供体载体(组件Z)交换组件D'而回复到eTPC-x系。组件Z含有位于GFP ORF侧翼的重组酶异种特异性F14/F15位点，因此与组件D'相容。用组件Z以及编码flp重组酶的构建体转染eTPC-t系ACL-851。转染后7天，将对GFP信号呈阳性的单个细胞分选并作为单克隆生长。通过流式细胞术与亲本eTPC-t平行分析所得单克隆eTPC-x系，并给出单个实例。a)和b)通过流式细胞术分析源自亲本eTPC-t ACL-851的单克隆eTPC-x ACL-987以及亲本系的GFP表达。图显示了门控活的单细胞的SSC与GFP参数。亲本细胞系没有GFP表达(a)，而单克隆ACL-987如预期的那样获得了GFP(b)，表明TCRαORF对GPF ORF的交换。c)和d)来自亲本ACL-851的单克隆eTPC-x ACL-987以及亲本eTPC-t ACL-851用CD3和TCRab的抗体染色，并通过流式细胞术分析。图显示在活的单细胞上门控的CD3与TCRab参数。亲本细胞显示CD3和TCRab均为阳性染色(c)，而衍生的单克隆显示两者均为阴性染色(d)；确认衍生的eTPC-x系中TCRαORF的丢失。
图50-鸟枪整合到eTPC-x以创建eTPC-t池的证明
从表达组件B'中的单个TCRβ链的eTPC-x亲本系产生eTPC-t库。eTPC-x系在可用位点D表达GFP作为报告子。构建了64个变体TCRα链的池，包括亲本链。亲本TCR链代表对在HLA-A*02:01中呈递的HCMV抗原具有已知特异性的JG9-TCR。将组件E池与编码flp重组酶的构建体一起转染到亲本eTPC-x ACL-987中。通过在转染后10天分选GFP阳性细胞来选择多克隆系。随后基于GFP的阴性染色和HLA多聚体试剂(DEX HLA-A*02:01-NLVP)的阳性或阴性染色对所得ACL-988多克隆eTPC-t进行分选。对回收的单个细胞进行测序以鉴定编码的TCR-α链，并在使用对亲本TCR链对特异的HLA多聚体试剂染色方面,与对与天然TCR-β链配对的每个TCR-α链变体的平行分析进行比较。
a)和b)通过流式细胞术分析亲本eTPC-x ACL-987系和所得多克隆eTPC-t ACL-988系的GFP表达。图显示活的单细胞的SSC与GFP参数。亲本细胞系显示GFP的阳性信号，表明完整的组件D(a)。衍生的多克隆系显示GFP的半阳性和半阴性(b)，表明多克隆群中的一半细胞可能在D处用GFP ORF交换TCRαORF以形成组件D'。
c)和d)亲本eTPC-x ACL-987系和所得多克隆eTPC-t ACL-988系用CD3抗体和对亲本JG9-TCR(DEX HLA-A*02:01-NLVP)具有特异性的HLA多聚体染色，并通过流式细胞术分析。图显示活的单细胞的CD3与HLA多聚体参数。亲本细胞系对于CD3和HLA多聚体染色都是阴性的(c)。d)的左图显示门控的GFP阴性事件和右侧是GFP阳性事件。仅组件D转化为D'的GFP阴性事件显示CD3阳性染色，其中子集显示HLA多聚体的阳性染色。对来自门控HLA多聚体阴性和阳性门的单细胞进行分选，并对组件D'的整合ORF进行测序以确定TCRαORF的身份。
e)将所有64种JG9-TCR-α变体克隆到表达构建体中，所述构建体允许每种变体独立地转染到亲本eTPC-x(ACL-987)。测定各自针对HLA-A*02:01-NLVP四聚体试剂的相对染色单位(RSU)。RSU计算为CD3阳性群体的HLA-A*02:01-NLVP四聚体信号的平均荧光强度(MFI)与CD3阴性群体的比率，并且表示每个TCR链对变体与HLA多聚体试剂的结合强度。图e)中绘制的每个点代表每个64种变体的观察到的RSU。空心圆与从GFP阴性/HLA多聚体阳性门回收的测序细胞相关。空心三角形与从GFP阴性/HLA多聚体阴性门回收的测序细胞相关。
图51-组件F的功能证明
携带组件F(ACL-1277)的eTPC-t细胞系，其中组件B'和D'的TCR链编码对HLA-A*02:01中呈递的HMCV抗原肽NLVPMVATV特异的TCR对。组件F报告子是RFP。在存在和不存在模型肽抗原的情况下，使该eTPC-t与具有不同HLA特征的各种APC系接触24小时，并通过流式细胞术分析接触培养物。流式细胞术直方图显示针对通过APC未呈递的特异性表面标记染色抗体鉴定的活的单个T细胞的RFP信号的事件计数。a)和b)用NLVPMVATV(a)或VYALPLKML(b)肽脉冲仅表达HLA-A*02:01(ACL-209)的APC细胞，随后与eTPC-t共培养24小时。c)和d)用NLVPMVATV(c)或VYALPLKML(d)肽脉冲仅表达HLA-A*24:02(ACL-963)的APC细胞，随后与eTPC-t共培养24小时。e)仅表达HLA-A*02:01(ACL-209)的APC细胞不经肽脉冲，随后与eTPC-t共培养24小时。f)用NLVPMVATV脉冲在细胞表面上不表达HLA的APC细胞(ACL-128)，随后与eTPC-t共培养24小时。仅在存在用NLVPMVATV脉冲的表达HLA-A*02:01的细胞的情况下，eTPC-t ACL-1277中的RFP信号显著增加，代表表达的TCR的已知靶标。直方图门和值反映RFP阳性门和RFP阴性门中事件的百分比。这表明组件F对eTPC-t表达的TCRsp与同源HLA/抗原(aAPX：aAM)接合的特异性反应。
图52-使用eTPC作为TCR标准
将表达对来自HLA-A*02:01(ACL-852)中呈递的CMV的NLVPMVATV肽特异的TCR的eTPC-t细胞系与缺乏TCR表达的eTPC(ACL-442)进行比较。收获细胞并保持未固定，或用PFA固定。a)eTPC-t和eTPC细胞用对eTPC-t(ACL-852)呈递的TCR特异的HLA多聚体试剂染色，并通过流式细胞术分析。门控单细胞显示为直方图。ACL-442显示在上图中，而ACL-852显示在下图中。仅有ACL-852细胞显示用HLA多聚体试剂染色，其中未固定(左图)显示对固定(右图)细胞的等效染色。b)用抗CD58抗体染色eTPC-t细胞，然后加入分离的PBMC中。不含eTPC-t的PBMC池和具有掺入eTPC-t的PBMC池，然后用针对eTPC-t呈递的TCR特异的HLA多聚体试剂染色(ACL-852，CMV-HLA-A*02:01-NLVPM-pp65)。左图显示单独的PBMC，右图PBMC和eTPC-t，门控单细胞和CD58对HLA多聚体参数。具有特异性标记的PBMC(CD8T细胞)可以在两个样本中被视为多聚体阳性细胞，其中eTPC-t可以容易地被视为CD58/HLA多聚体双阳性细胞(右图)。
材料和方法
ARH-77细胞的电穿孔
每次反应，使用Gene Pulser XcellTM(Bio-Rad)在具有Glutamax-I(LifeTechnologies)的500μl RPMI 1640中利用以下设置电穿孔4×106个细胞：方波285V，脉冲长度12.5ms和2次脉冲，间隔1秒。
用于Cas9质粒V1.A.8的DNA浓度为10ug/ml和用于靶向整合位点的gRNA的DNA浓度为7.5ug/ml(V2.I.10和V2.J.1用于HLA内源性位点中整合和V2.J.6用于靶向AAVS1位点)(表1)。整合载体以7.5ug/μl的浓度进行电穿孔。
对于HLA基因座中的HDR整合，使用HLA I类V1.C.6和V1.C.9质粒。对于AAVS1基因座中的HDR整合，HLA I类V1.F.8和V1.F.10以及HLA II类V1.I.5和V1.I.7。将pp65ORF的变体整合到先前产生的HLA单等位基因系中。含有与GFP标记连接的pp65形式的质粒V1.G.9和V1.H.1用于此目的。为了产生具有一个RMCE位点的ARH-77HLA-无效系，使用具有位于标记侧翼的异种特异性重组酶位点的质粒，对于RFP使用V4.B.2，以及对于BFP使用V4.B.3。将相同的质粒共电穿孔以产生含有两个RMCE位点的稳定系。还使用RMCE产生单等位基因HLA系，其中将载体V4.D.2电穿孔到含有一个RMCE位点的细胞中。电穿孔后，在分析之前，将细胞在含有Glutamax-1+10％FBS(37℃，5％CO2)的培养基RPMI 1640中温育两天。
转染HEK293细胞
在转染前一天，将细胞以1.2-1.4×106个细胞/60mm培养皿的密度接种在90％DMEM+2mML-谷氨酰胺+10％HI-FBS(Life Technologies)中。接下来的一天，用总量为5ug的DNA和
Figure BDA0002049708940000691
(Polyplus转染试剂，Life Technologies)以N/P比率6转染具有65％汇合的细胞。在转染前更换培养基。
为了缺失HLA I类基因，用0.42ug编码Cas9_GFP(V1.A.8)的DNA载体，靶向HLA-A、B和C的gRNA(分别为V2.A.1、V2.A.7和V2.B.3)和空载体(V1.C.2)转染细胞。
为了整合AAVS1基因座中的RMCE位点，用0.5μg的V1.A.8；使用0.625ug gRNAV2.J.6和0.75ug编码两个侧翼为RMCE位点的标记的质粒(对于RFP为V4.B.2，对于BFP为V4.B.3)转染细胞，空载体V1.C.2用于完成5ug DNA。
将DNA和
Figure BDA0002049708940000692
的储备溶液分别在无菌1M NaCl和150mM NaCl中稀释。每种溶液的最终体积相当于总混合体积的50％。然后将PEI溶液加入稀释的DNA中，并将混合物在室温下温育15min。最后将DNA/PEI混合物加入到60-mm培养皿中，注意不要破坏细胞膜。
在GFP表达分析之前，将细胞在(37℃，5％CO2，55％相对湿度)下温育48小时。
在配对的整合对之间的RMCE
对于RMCE整合，用0.6μg编码FLP的DNA载体(V4.I.8)，2μg组件C/Y，2μg组件E/Z，0.4μg编码追踪DNA递送的标记物的DNA转染细胞。转染后2天，通过FACS分选DNA递送标记阳性或GFP或RFP阳性的细胞。转染后4-10天，通过FACS分选显示减少的由组件D和B选择标记编码的荧光蛋白信号的单个细胞。例外是产生ACL-987，其中显示GFP阳性的单个细胞通过FACS分选。
Figure BDA0002049708940000701
Figure BDA0002049708940000711
TCR链对的瞬时表达以表征它们的相对染色单位(RSU)
对于瞬时表达，用编码FLP，(V4.I.8)，JG9-TCR-α变体(VP.7751.RC1.A1至VP.7751.RC1.H8)，JG9-TCR-βWT链(V3.C.5)的DNA载体和DNA载体运载体(V1.C.2)转染细胞。转染后2天，所有细胞用HLA-A*02:01-NLVP四聚体和抗CD3抗体染色。RSU计算为CD3阳性群体的HLA-A*02:01-NLVP四聚体信号的平均荧光强度(MFI)与CD3阴性群体的比率，并且指示每个TCR链对变体的结合强度。
荧光激活的细胞分选(FACS)
使用Cas9-P2A-GFP(V1.A.8)或使用编码GFP选择标记(V1.A.4)的质粒电穿孔或转染的细胞用FACSJAzzTM细胞分选仪(BD Biosciences)分选瞬时GFP表达。
用TrypLETM Express胰蛋白酶(ThermoFisher Scientific)收获HEK293细胞，并在细胞分选之前，在含有20％HI-FBS和Anti-Anti100X(Life Technologies)的DMEM 1X培养基中重悬于适当体积的DPBS 1X(Life Technologies)中。
洗涤ARH-77细胞并重悬于适当体积的DPBS中，然后在具有20％HI-FBS和Anti-Anti 100X(Life Technologies)的Glutamax-I的RPMI 1640中分选。
基因组DNA提取用于遗传表征
使用QIAamp DNA Minikit(Qiagen)从5×106个细胞中提取DNA。将DNA储存在1xTE(10mM Tris pH8.0和0.1mM EDTA)中。
确认在正确的基因组位置的整合
筛选具有所需表型特征的单克隆并在分子水平上进行评估，这通过PCR，使用
Figure BDA0002049708940000722
HotStart High-Fidelity DNA聚合酶(NBE)在20ul反应物中进行，使用制造商推荐的组件和体积。
为了确定HLA I ORF是否整合到HLA基因座中，使用引物9.C.4和9.D.6；通过1kb扩增子指示正确的右侧同源臂重组(表2)。
对于AAVS1基因座中的HLA整合，使用四组引物：9.C.3和9.C.8以评估正确的左同源臂重组(1.1kb)，9.C.4和9.D.1以评估右侧同源臂重组(660bp)，1.C.5和9.C.5以扩增内部构建体的CMV启动子(810bp)，以及1.C.2和9.C.10以获得内部构建体的SV40pA终止子的扩增子(380bp)。使用引物组2和4完成HEK293和ARH-77HLA-无效系中的RMCE位点整合的评估。
为了证实HEK293细胞中HLA I类缺失，如下使用特异性HLA引物：4.A.3和4.A.4靶向HLA-A，4.A.7和4.B.1针对HLA-B，以及4.B.5和8.A.1针对HLA-C。最初，用所有组件(
Figure BDA0002049708940000723
反应缓冲液，dNTPs，热启动
Figure BDA0002049708940000724
DNA聚合酶，引物Fwd和Rev，100ng DNA模板和H2O)制备PCRMaster混合物。使用C1000TouchTM热循环仪(Bio-Rad)进行PCR反应。使用PowerPac Basic(Bio-Rad)在1XTAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶上运行PCR产物，用10,000倍稀释的sybersafe染色并用Fusion SL(Vilber Lourmat)分析。
Figure BDA0002049708940000721
Figure BDA0002049708940000731
分选具有稳定表达目的组件的多克隆和单克隆细胞
为了获得组成型表达整合蛋白质或标记的细胞群，在第一次GFP+选择后7至15天分选细胞。
对于预期表达表面蛋白质的细胞，在分选之前进行抗体染色。对于HLA I类基因，使用PE-CyTM 5小鼠抗人HLA-ABC抗体(BD Biosciences)。用
Figure BDA0002049708940000741
647小鼠抗人HLA-DR，DP，DQ(BD Biosciences)进行HLA-DR和HLA-DP的染色。
在HEK 293衍生细胞系的情况下，用TrypLETM ExpressTrypsin(ThermoFisherScientific)收获细胞，并在合适体积的DPBS 1X(Life Technologies)中洗涤，然后在含有20％HI-FBS和Anti-Anti 100X(Life Technologies)的DMEM 1X培养基中进行细胞分选。
将ARH-77衍生的细胞系在足量体积的DPBS中洗涤，然后在含有20％HI-FBS和Anti-Anti 100X(Life Technologies)的Glutamax-I的RPMI 1640中分选。
对于HLA敲除或整合，分别基于HLA表达的丢失或获得来进行细胞的选择。基于BFP和RFP标记的表达对具有整合的RMCE位点的细胞进行分选，并且对具有整合的pp65突变体的HLA单克隆进行GFP表达分选(表3)。
在含有200ul生长培养基的96孔板中进行表达目的基因的细胞的单克隆分选。每个样品分选一到两个平板。在FACS管中，使用细胞分选仪InfluxTM(BD Biosciences)中的双向分选设置后立即进行剩余细胞的多克隆分选。
单克隆群的表型筛选
将长出的单克隆群的20,000个细胞样品转移到微量滴定板中进行分析，将细胞重悬于250μl的DPBS1X(Life Tech-nologies)中并在LRSFortessaTM(BD Biosciences)上分析。
分别使用针对BV421和PE-Texas Red荧光团的PMT来检测BFP和RFP表达。
Figure BDA0002049708940000751
对于具有表面表达的蛋白质，首先使用PE-CyTM 5小鼠抗人HLA-ABC抗体(BDBiosciences)或Alexa
Figure BDA0002049708940000752
647小鼠抗人HLA-DR，DP，DQ(BD Biosciences)对细胞进行染色。使用在100ul染色缓冲液(DPBS+2％FBS)中稀释的推荐抗体体积制备染色溶液。将细胞在4℃下温育1小时，然后用500ul染色缓冲液洗涤两次，然后进行分析。
将经选择的单克隆保持在正常生长培养基中。HEK239细胞在DMEM+2mML-谷氨酰胺+10％HI-FBS(Life Technologies)中生长，并且ARH-7细胞在具有Glutamax-1+10％HI-FBS的RPMI 1640中生长。
每天监测细胞的汇合，直到它们达到10-12x106。使用QIAamp DNA Minikit(Qiagen)从5×106个细胞中提取DNA。将剩余的细胞进一步扩增并以3×106个细胞/ml的密度在70％生长培养基+20％HI-FBS+10％DMSO中冷冻保存。
eTPC-t细胞的分选
使用BDInflux仪器通过标准细胞分选方法实现单细胞分选或多克隆分选。简而言之，用TrypLETM Express胰蛋白酶(ThermoFisher Scientific)收获ACL细胞，并在细胞分选之前，在含有20％HI-FBS和Anti-Anti 100X的DMEM 1X培养基中重悬于适当体积的DPBS 1X(Life Technologies)中。
细胞用HLA-多聚体试剂在冰上染色10min，然后用CD3和/或TCRab抗体染色。通过BDInflux仪器检测特定细胞荧光特性在表3中定义。
对用于单克隆生成的单细胞进行分选，将展示出目的表型的细胞沉积到含有200ul生长培养基的96孔板中。每个样品分选一到两个平板。使用细胞分选器InfluxTM(BDBio-sciences)中的双向分选设置将多克隆细胞分选物导入含有培养基的FACS管中。
将用于其JG9-TCR-α变体的分子表征的单细胞分选物分选至预装有5μL无核酸酶水的PCR板。将样本快速冷冻直至后续处理。
基因组DNA提取用于遗传表征
使用QIAamp DNA Minikit(Qiagen)从5×106个细胞中提取DNA。将DNA储存在1xTE(10mM Tris pH8.0和0.1mM EDTA)中。
用于评估TRA-ORF和TRB-ORF向组件B或D的RMCE-整合的PCR反应。
用于评估TRA-ORF整合的引物，与TRA-C区段(正向引物1.F.7)和sv40pA终止子(反向引物15.H.2)退火，这是基因组接收位点的预先存在的部分。预期大小566bp。
用于评估TRB-ORF整合的引物，与TRB-C区段(正向引物1.F.9)和sv40pA终止子(反向引物15.H.2)退火，这是基因组接收位点的预先存在的部分。预期大小610bp PCR产物在1XTAE缓冲液中的1X琼脂糖凝胶上运行，使用用10,000倍稀释的sybersafe染色的PowerPacBasic(Bio-Rad)，并用Fusion SL(Vilber Lourmat)分析。
Figure BDA0002049708940000771
Figure BDA0002049708940000772
ddPCR反应以评估DNA递送后基因组中TRA-ORF和TRB-ORF的拷贝数。
通过使用特异性引物和靶向目的TCR_ORF C区段的探针分析选择的ACL-851单克隆的DNA
用于评估TCR-αORF拷贝数的引物和探针，与TRAC区段退火(正向引物1.F.7，反向引物1.F.8和探针1.G.1)
用于评估TCR-βORF拷贝数的引物和探针，与TRBC区段退火(正向引物1.F.9，反向引物1.F.10和探针1.G.2)
在所有情况下，使用引物10.A.9和10.A.10以及与HEX缀合的荧光探针10.B.6，同时筛选参照基因(TRAC)的染色体以确定拷贝数。整合拷贝数认为对于参照基因(TRAC)，HEK293细胞是三倍体。
在Droplet Digital PCR之前，用MfeI(NEB)消化DNA以分离串联整合。根据ddPCRTM Supermix for Probes(无dUTP)(Bio-Rad)的方案，使用QX200TM液滴读数器和液滴发生器以及C1000Touch TM深孔热循环仪(Bio-Rad)，遵循反应设置和循环条件。使用QuantaSoft TM软件获得数据，使用Ch1检测FAM并使用Ch2检测HEX。
Figure BDA0002049708940000781
Figure BDA0002049708940000782
Figure BDA0002049708940000791
从单个T细胞测序TCRα和β链
对个体FACS分选的eTPC-t细胞进行两步扩增过程，该过程需要针对每个TCR-α和TCR-β进行V区特异性引物收集，然后通过成对的嵌套PCR反应产生TCR-α和TCR-β扩增子用于序列分析。该程序如前所述(Han等人，Nat Biotech-nol.2014 32(7)：684-692)。在所述程序中使用以下材料：
表9：单细胞RT-PCR和嵌套PCR试剂
Figure BDA0002049708940000801
功能组件F的说明
eTPC-t和APC细胞常规培养于RPMI+10％热灭活的胎牛血清(完全培养基)中，浓度为0.2×10^6-1.5×10^6个细胞/ml，温度为37℃，相对湿度90％和5％的CO2。通过Genescript合成肽NLVPMVATV和VYALPLKML，并接受冻干。将肽主要储液悬浮于10％DMSO中并在-80℃下分选。在完全培养基中以50μM(50倍浓缩)给药时制备工作储液。使用以下呈递HLA-A*02:01(ACL-209)或HLA-A*24:02(ACL-963)或HLA-null(ACL-128)的APC。eTPC-t细胞系(ACL-1277，组件A)被工程化为具有两个独特的基因组接收位点(组件B，D)，工程化为HLANull，利用天然CD3表达，并带有双组件，合成响应元件(组件F)。此外，ACL-1277具有组件B，D转化为B'/D'，利用编码对pHLA：HLA-A*02:01-NLVPMVATV特异的TCRsp的TCRα/βORF的整合(参见实施例8)。
抗原脉冲程序
将活跃生长的APC细胞培养物(0.5-1.0×10^6个细胞/ml)悬浮，取样并计数以确定细胞浓度。随后，收获1百万个细胞，用Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水(DPBS，Gib-co)洗涤一次，然后以1至2×10^6个细胞/ml的细胞浓度在1μM肽或无肽的完全培养基中悬浮。将细胞在标准培养条件下在24孔培养板中温育2小时。2小时后，收获细胞，离心(400rcf，3min)沉淀，然后用DPBS洗涤3×10ml。随后将细胞以0.2×10^6个细胞/ml悬浮于完全培养基中。
eTPC-t收获
将eTPC-t细胞的活跃生长培养物(0.5-1.0×10^6个细胞/ml)悬浮，取样并计数以确定细胞浓度。收获细胞，用PBS洗涤一次，然后以0.6×10^6细胞/ml的浓度悬浮于完全培养基中。
在eTPC:A系统中接触eTPC-t和APC
向96孔圆底板的每个孔中加入50μl完全培养基，50μl的APC，然后加入50μl的eTPC-t。这相当于约10,000APC和30,000eTPC-t，比例为1：3，总细胞浓度约为0.27×10^6个细胞/ml。然后将细胞混合物在标准培养条件下温育约24小时。
染色和分析
温育24小时后，收获细胞，并移植到0.75ml V-底Micronic管中，用500μl的DPBS洗涤一次，随后用死细胞标记(DCM-APC-H7)染色如下；向每个孔中加入25μl染色溶液，通过混合将细胞悬浮，然后温育15-20min。染色溶液由每100μl染色溶液0.5μl DCM-APC-H7组成。温育后，用500μl DPBS+2％FCS(洗涤缓冲液)洗涤细胞两次。然后对细胞染色eTPC-t特有的表面标记；向每个孔中加入30μl染色溶液，通过混合悬浮细胞，然后温育30-45min。染色溶液包含每100μl染色溶液(克隆9E10，Santa Cruz Biotech)2.5μl抗myc-AF647。温育后，用500μl洗涤缓冲液洗涤细胞两次，然后悬浮于200μl洗涤缓冲液中，然后通过FACS在LSRFor-tessa(BD Biosciences)上分析。
eTPC作为标准的使用
细胞制备
收获具有TCR的eTPC细胞系，其特异于来自CMV病毒的NLVP肽，并汇集到50ml管中。将细胞以400g沉淀5min并用PBS洗涤一次。将eTPC重悬于3ml PBS中，并计数。将四百万个细胞分配到每个15ml管中用于固定。
固定
通过用磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释细胞固定物(含有10％多聚甲醛(PFA))至最终浓度为2％PFA，在使用前新鲜制备固定溶液。向细胞沉淀中加入1ml固定溶液，通过移液将细胞混合数次。对于未处理的对照，加入1ml PBS代替固定溶液。将细胞在室温下温育5min，然后加入3ml PBS洗涤，并以400g沉淀5min。然后将细胞重悬于500μl的PBS中，然后转移到微量管中进行染色。
染色
首先将细胞在室温下用多聚体染色10min，然后加入抗CD3抗体，并将样品在4℃再温育30min。在LSRFortessa上获得细胞。
加标分析
收获具有特异于来自CMV病毒的NLVP肽的TCR的eTPC细胞系，并汇集到50ml管中。用PBS洗涤细胞一次，并以400g沉淀5min。然后将细胞重新悬浮于5ml PBS中，然后在流式细胞仪上分选，作为单细胞流入到含有300ul染色缓冲液的5ml FACS管中。
分选仅基于细胞的分散。门控：SSC对FSC->门控来自散点图中的活细胞；将活细胞标绘为FSC-W对FSC->对分选的单细胞门控。将细胞以400g沉淀5min，计数，用Alexa 647-CD58在4℃染色30min，洗涤，然后用于加标测定。
将来自健康献血者的冷冻PBMC(先前在50ml管上使用Ficoll梯度分离进行了分离，并且对CMV肽(NLVP)为阳性)解冻，计数然后用于实验中的加标。
对于测定中的标，将2×106个PBMC在没有eTPC或具有50000个eTPC的微管中混合。首先将细胞在室温下用多聚体染色10min，然后加入抗CD3和抗CD8抗体，并将样品在4℃下再温育30min。在Fortessa上获得细胞。
实施例
实施例1：通过靶向诱变缺失APX基因家族
本文描述了如何实现抗原呈递复合体(APX)编码基因家族的靶定向诱变以产生工程化的TCR呈递细胞(eTPC)的状。所述性状是APX家族中至少一个成员缺乏表面表达。
在该实施例中，靶向的APX包含HEK293细胞系中的主要HLA I类家族的三个成员，HLA-A、HLA-B和HLA-C。HEK293细胞来源于人胚胎肾细胞，其显示出HLA-ABC的内源性表面表达。细胞遗传学分析表明，细胞系具有近三倍体核型，因此HEK293细胞编码每个HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的三个等位基因。
使用工程化的CRISPR/Cas9系统进行HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的靶向诱变，其中通过合成的指导RNA(gRNA)将Cas9核酸酶活性靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座。设计4至5个唯一的gRNA以靶向每个HLA基因座的保守核苷酸序列，并且靶位点偏向基因编码序列的起始，因为这更可能产生无效等位基因。确定gRNA在其靶基因座上诱导突变的效率，并选择最有效的gRNA以产生HLA-A、HLA-B和HLA-C无效(HLA-ABCnull)HEK293细胞系。
如方法中所述，将编码靶向HLA-A、HLA-B和HLA-C基因座的最佳gRNA的质粒与编码Cas9-P2A-GFP的质粒一起转染到HEK293细胞中。在转染后2天，基于GFP荧光对Cas9-P2A-GFP质粒摄取呈阳性的细胞进行FAC分选(图25a)。将GFP分选的细胞进一步扩增超过5天以允许足够时间发生基因编辑事件，并且在有害突变的情况下，丧失剩余内源HLAI蛋白的表达。在该生长期后，用pan-HLA-ABC抗体染色细胞，导致在其表面上具有降低的表达HLA-ABC的细胞的识别(图25b)。pan-HLA-ABC抗体染色的缺失暗示每个HLA-A、HLA-B和HLA-C等位基因都被突变。对单个HLA-ABC阴性细胞进行分选和扩增以代表单克隆的收集。
通过缺乏HLA-ABC的表面表达证实HLA-ABCnull单克隆。已证实单克隆的子集缺乏HLA-ABC的表面表达，其中三个实例单克隆，ACL-414，ACL-415和ACL-416如图26所示。缺乏HLAI表面表达的单克隆的进一步遗传表征通过确定细胞系在HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的所有等位基因中具有潜在的基因突变来进行(图27)。通过PCR用跨越gRNA基因靶位点的引物进行遗传表征，用于检测扩增子大小变化和/或用作测序的模板。图27显示了HLA-ABCnull单克隆的选择，其与建立细胞系的扩增子大小相比(例如ACL-414)，在较短的PCR扩增子检测到的HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的等位基因中含有遗传缺失。
总之，遗传修饰的HEK293细胞系，包括ACL-414，ACL-415和ACL-416，被证明缺乏HLA-ABC的表面表达，因此拥有工程化的TCR呈递细胞(eTPC)的性状。
实施例2：含有组件B的HLA-ABCnull的产生
本文描述了组件B如何稳定整合到HLA-ABCnull单克隆系ACL-414中以产生eTPC的第二性状。所述第二性状包含至少一个基因组接收位点，用于整合至少一个ORF，其中基因组接收位点是设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体。
在该实施例中，基因组整合位点，组件B，由经选择的遗传元件组成。两个唯一的异种特异性重组酶位点，FRT和F3，其侧翼是编码选择标记蓝色荧光蛋白(BFP)的ORF。编码的FRT位点的5'是EF1a启动子，并且F3位点的3'是SV40多腺苷酸化信号终止子。将非编码顺式调控元件定位在异种特异性重组酶位点外部的益处是在匹配的遗传供体载体C组件中不需要它们。因此，在遗传供体载体的细胞递送后，没有观察到编码的ORF的瞬时表达。这使得成功的RMCE的选择更可靠，因为来自遗传供体载体的ORF的细胞表达很可能仅在正确整合到组件B中时发生，因为它现在包含适当的顺式调节元件(参见实施例6)。
为了促进组件B稳定基因组整合到基因组安全港基因座AAVS1中，构建了质粒，其中组件B的DNA元件以AAVS1左右同源臂为侧翼。每个臂包含>500bp的与AAVS1基因组基因座同源的序列。
通过基因组安全港基因座AAVS1的同源定向重组(HDR)过程实现组件B的稳定整合。用编码靶向AAVS1基因座的最佳gRNA的质粒，编码Cas9-P2A-GFP的质粒和编码侧翼为AAVS1左右同源臂的组件B遗传元件的质粒转染ACL-414细胞系。Cas9-P2A-GFP质粒摄取阳性的细胞在转染后2天基于GFP荧光进行FAC分选(图28a)。将GFP分选的细胞进一步扩增超过7天，允许足够时间发生HDR并且丧失选择标记BFP的瞬时表达。在该生长期后，在FACS仪上分析细胞，并且分选并扩增单个BFP阳性细胞以代表单克隆的集合(图28c)。
基于其维持的BFP表达且为了将组件B单一整合到期望的AAVS1基因位置，选择单个单克隆系。细胞系ACL-469和ACL-470代表具有主要BFP表达的单克隆(图29a和b)。对从单克隆ACL-469和ACL-470中提取的DNA进行遗传表征，并证明它们的基因组整合了组件B，并且组件B已整合到AAVS1位点(图30)。通过检测利用对组件B特异的引物的预期大小的PCR扩增子来确定基因组整合(图30a)。确认组件B整合到AAVS1位点是通过检测具有预期大小的PCR扩增子来确定的，该扩增子利用针对AAVS1基因组序列设计的引物和对组件B编码的SV40pA终止子唯一的引物，所述AAVS1基因组序列远离由同源臂编码的区域(图30b)。通过数字滴PCR确定组件B的拷贝数，其中测量组件B和参照基因DNA分子的数量并计算比率(表1)。单克隆ACL-469和ACL-470含有1个组件B分子与3个参照基因分子的比率。当考虑到建立的HEK293细胞系具有接近三倍体的核型时，这证明了组件B在ACL-469和ACL-470细胞系中的单一整合。
总之，基因修饰的ACL-469和ACL-470细胞系是HLA-ABCnull并且包含为RMCE设计的合成基因组接收位点的单拷贝，因此证明了包含可以被进一步修饰成eTPC的两个性状的细胞系的产生。
实施例3：含有组件B和组件D的HLA-ABCnull细胞的产生
本文描述了组件B和组件D如何稳定整合到HLA-ABCnull单克隆系ACL-414中以产生eTPC的第二性状。所述第二性状含有两个基因组接收位点，用于整合至少一个ORF，其中基因组接收位点是设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体。
该实施例使用与实施例2中所述相同的方法和组件，但添加了第二基因组接收位点，组件D。组件D遗传元件由两个唯一的异种特异性重组酶位点F14和F15组成，它们与组件B不同。这些位点位于编码选择标记红色荧光蛋白(RFP)的ORF的侧翼。编码的F14位点的5'是EF1a启动子，F15位点的3'是SV40多腺苷酸化信号终止子。如实施例2中，组件D遗传元件侧接AAVS1左右同源臂，每个同源臂包含>500bp的与AAVS1基因组基因座同源的序列。
如实施例2中所述，将组件B和组件D整合到AAVS1中，但是将编码组件D元件的质粒添加到转染混合物中。在转染后2天，基于GFP荧光对Cas9-P2A-GFP质粒摄取呈阳性的细胞进行FAC分选(图28b)。将GFP分选的细胞进一步扩增超过7天，之后，在FACS仪上分析细胞，并且分选并扩增单个BFP和RFP阳性细胞以代表单克隆的集合(图28d)。
基于其维持的BFP和RFP表达以及为了组件B的单一整合和组件D的单一整合到不同的AAVS1等位基因中，选择单个单克隆系。细胞系ACL-472是代表性的单克隆，具有维持的BFP和RFP表达(图29c)。如实施例2中所述，对从单克隆ACL-472提取的DNA进行遗传表征，并证明它们的基因组整合了组件B和组件D，并且两种组分都整合到AAVS1位点(图30)。通过数字滴PCR确定组件B和D的拷贝数，其中测量组件B，D和参照基因DNA分子的数目并计算比率。单克隆ACL-472含有2种组件B和D分子与3种参照基因分子的比例(表2)。当考虑到建立的HEK293细胞系具有接近三倍体核型时，这证明了组件B的单一整合和组件D单一整合到ACL-472细胞系中。
总之，遗传修饰的ACL-472细胞系是HLA-ABCnull并且包含为RMCE设计的合成基因组接收位点组件B和组件D的单拷贝，因此证明了包含可以被进一步修饰成eTPC的多个性状的细胞系的创建。
实施例4：将CD3整合到缺乏TCR和CD3的aAPX-细胞中
本文提供了图32和图34的工作流程的示例，其中首先将靶基础细胞鉴定为合适的TCRsp感受态基础细胞，然后通过将其整合到基因组遗传材料来工程化TCRsp感受态基础细胞，所述基因组遗传材料编码CD3表达作为编码CD3的所有四种蛋白质(即CD3γ，δ，ε和ζ)的单一ORF的表达。四种编码的蛋白质通过自切割的病毒P2A肽连接，使得在转录物的翻译过程中，每种P2A肽的作用引起4种单独蛋白质的分离和释放。一旦发生翻译和分离，CD3蛋白随后自由地缔合并组装成CD3复合体。然而，组装和输出到细胞表面仅在存在翻译的互补TCR链对的情况下发生。
使用具有高通量采样器的BD LSRFortessa仪器进行FAC分析。使用BD Influx细胞分选仪或BD FACSJazz分选仪进行FAC分选。通过PEI方法使用化学转染进行ACL-5和衍生细胞的转染，NP比率为6，每个PEI反应的最终DNA浓度为200ng/μl，每1百万个细胞的总DNA为3.33μg。使用本领域技术人员已知的标准程序染色细胞。具有对CD3和TCR-α-β的亲和力的荧光标记的抗体购自BD，其中抗CD3与FITC或PE-CF5486缀合，并且抗TCR-α-β与BV786或APC缀合。aAPX:aAM可溶性试剂购自Immudex，特别是装载有NLVPMVATV作为货物的四聚体HLA-A*0201，与PE荧光团缀合，命名为A2-NLV-PE。使用的质粒使用本领域技术人员已知的标准方法获得。
TCRsp感受态基础细胞的鉴定和选择
选择HEK293衍生细胞ACL-5作为靶基础细胞(图32，步骤a)并用抗TCR-α-β和抗CD3染色，然后进行FACS分析以鉴定TCRsp和CD3的表面表达的缺乏(图32，步骤b)。作为比较，还分析了对照细胞染色。没有检测到表面表达(图32，步骤c)，如图39所示。此外，缺乏CD3表达也表明靶基础细胞也缺乏TCR-γ-δ表达，因为在没有表达互补的TCR链对时，CD3不能在表面上表达。
随后用三种瞬时表达质粒化学转染靶基础细胞，第一种质粒将所有四种CD3蛋白编码为由P2A病毒肽(V3.C.6)连接的单个ORF。第二和第三质粒编码互补的TCR链对(pTCR)，其中每个质粒编码TCRα链或TCRβ链的瞬时表达(图32，步骤d)。转染两种不同的TCRal-pha-β对，一对编码对载有NLVPMVATV肽(V3.C.3，V3.C.5，A2-NLVpos)的HLA-A*02:01特异性的TCRsp，另一对编码非特异性的TCRsp(V3.C.2，V3.C.4，A2-NLVneg)。
在长出2天后，用抗TCR-α-β和抗CD3染色转染的细胞(图32，步骤e)，此外，还使用可溶性aAPX:aM(dexA2-NLV-PE)染色细胞，其是A2-NLVpos TCRab对的同源抗原。随后通过FACS分析染色的细胞，并显示其能够胜任CD3和TCRsp的表面表达(图40)。此外，用A2-NLVpos转染的细胞表现出与dexA2-NLV-PE的结合，而用A2-NLVneg转染的细胞不表现出与dexA2-NLV-PE结合(图40)。这表明细胞能够胜任表达TCRsp(图32，步骤f)，随后选择靶基础细胞作为合适的TCRsp感受态基础细胞。
然后使TCRsp感受态基础细胞经历aAPX的HLA I类家族的靶向突变，以使细胞缺乏aAPX的HLA I类家族的表达。使用实施例1的示例中的程序获得突变细胞。此外，TCRsp感受态基础细胞也天然缺乏aAPX的HLA II类家族的表达，因此获得的TCRsp感受态基础细胞缺乏aAPX的两个家族的表达。
确认的基础细胞的鉴定、工程化和选择
TCRsp感受态基础细胞(缺乏两个aAPX家族的表达)用两种瞬时表达质粒进行化学转染，第一种编码如前所述CD3(V3.C.6)和TCRα(V3.C.2，V3.C.3)或TCRβ(V3.C.4，V3.C.5)，它是图34步骤h的修改版本。在长出2天后，用抗TCR-α-β和抗CD3染色转染的细胞(图34，步骤i)，随后通过FACS分析(图41)并鉴定缺乏TCRsp和CD3的表面表达(图34，步骤i)，确认CD3和TCRα或TCRβ均未内源表达。
将CD3整合到TCRsp感受态基础细胞中(图34，步骤k)。为了实现整合，将细胞瞬时转染三种质粒，第一种编码第一整合因子Cas9-2A-GFP(V1.A.8)的表达，第二种编码第二整合因子——一种靶向HLA-A基因座(V2.A.2)的引导RNA的表达。第三种质粒用于定点同源重组，靶向HLA-A基因座并通过人EF1a-长启动子和SV40pA终止子编码CD3蛋白的表达，作为由P2A病毒肽(V4.I.7)连接的单个ORF。
在转染后2天，收获细胞并基于GFP表达分选以富集表达Cas9的细胞，其中一部分具有在HLA-A基因座处整合的CD3编码序列(图42)。
将分选的细胞长出3天，然后用三种质粒共转染细胞，第一种编码GFP的表达并用作转染对照。第二和第三质粒各自编码pTCR(A2-NLV阳)的TCR-α(V3.C.3)链或TCR-β链(V3.C.5)(图34，步骤1)。转染的细胞长出2天，随后用抗-抗CD3染色(图34，步骤m)。然后选择细胞的CD3的表面表达(图34，步骤n)，其中通过FAC分选进行选择作为多克隆群体(图43)。
将分选的细胞长出11天，然后如前所述(图44)进行另一轮转染(图34，步骤1)，染色(图34，步骤m)和选择(图34，步骤n)。分选的细胞长出，随后转染并第三次染色。然后选择染色的细胞用于TCRsp表达，并通过单细胞分选选择96个单细胞用于单克隆(图45)。相应地选择剩余的染色细胞，多克隆分选并在-80℃冷冻保存。
单细胞克隆长出，直到可获得通过PCR、ddPCR和FACS分析的足够数量用于冷冻保存、基因组和表型分析。在96个单细胞分类中，20个存活的用于分析，并且20个克隆中的8个对于正确的基因组整合是阳性的并且通过数字滴分析也是阳性的。用两种质粒转染8个阳性单克隆，这两种质粒编码pTCR(A2-NLV阴)的TCR-α(V3.C.2)链或TCR-β链(V3.C.4)并且编码GFP表达的又一第三质粒作为转染对照(V1.A.4)。然后用抗CD3和抗TCR-α-β染色细胞并分析TCRsp和CD3的表面表达(图34，步骤n)。8个细胞系中的两个为表面表达阳性，一个系显示出高表达百分比(图46)，随后选择其作为确认的基础细胞。
实施例5：一步产生eTPC-t的阐明
本实施例描述了以标准化方式产生eTPC-t，其中亲本eTPC含有不同的合成基因组接收位点组件B和D。遗传供体载体组件C'和E'包含TCR对的单链(JG9-TCR)，其已知与在HLA-A2等位基因中存在的源自人巨细胞病毒多肽65(HCMV pp65)的抗原肽NLVPMVATV(NLVP)接合。组件C'和E'是为RMCE设计的，并衍生自亲本组件C和E。
该实施例使用亲本eTPC细胞系ACL-488，其为TCR无效，HLA无效，CD4无效和CD8无效，并且还包含组件B和D。组件B包含两个独特的异种特异性重组酶位点，FRT和F3，其侧翼为Kozak序列和编码选择标记蓝色荧光蛋白(BFP)的ORF。编码的FRT位点的5'是EF1a启动子，并且F3位点的3'是SV40聚腺苷酸化信号终止子。组件D包含两个独特的异种特异性重组酶位点F14和F15，它们与组件B不同。这些位点位于Kozak序列和编码选择标记红色荧光蛋白(RFP)的ORF的侧翼。编码的F14位点的5'是EF1a启动子，并且F15位点的3'是SV40多腺苷酸化信号终止子。
该实施例使用遗传供体载体，组件C'和组件E'，每个包含两个异种特异性重组酶位点，FRT/F3(C')和F14/F15(E')，因此分别与组件B和D匹配。组件C'还包括在FRT/F3位点之间的Kozak序列、起始密码子和编码JG9-TCR-β链的TCR ORF。组件E'在F14/F15位点之间还包含Kozak序列、起始密码子和编码JG9-TCR-α链的TCR ORF。
通过RMCE通过电穿孔ACL-488(eTPC)产生eTPC-t。电穿孔后4至10天，通过FACS分选显示由组件D和B选择标记编码的荧光蛋白信号BFP和RFP减少的单个细胞。单个单克隆长出，然后进行表型评估。所得单克隆ACL-851是BFP和RFP阴性的(图48a和b)。ACL-851也显示TCR和CD3表面表达，而亲本细胞系则没有(图48c和e)。此外，引入的JG9-TCR显示用HLA-A*02:01-NLVP四聚体的特异性染色，表明它是eTPC-t表面上的功能性TCRsp(图48d至f)。通过PCR确认ACL-851含有由整合到基因组中的组件B'和组件D'编码的TCRsp(图48g和h)。
总之，通过使用基于RMCE的整合方法将eTPC转化为eTPC-t，以整合在组件C'和E'中递送的TCR ORF，使得组件B和D转化为组件B'和D'，并且由该eTPC-t在细胞表面上表达功能性TCRsp。此外，这个实例证明了简单eTPC:T系统的操作，其中eTPC-t和分析物抗原的二元组合物被组合，并且基于可溶性分析物抗原(HLA多聚体：HLA-A*02:01-NLVPMVATV)之间的复合体形成而选择eTPC-t。
实施例6：eTPC-t转化为eTPC-x的证明
本实施例描述了eTPC-t向eTPC-x的转化，其中eTPC-x具有编码TCR链ORF的组件B'，和可用于互补的TCR链ORF整合的组件D。通过使用与组件D'匹配的遗传供体载体(组件Z)，实现eTPC-t的组件D'向eTPC-x的组件D的转化。
在该实施例中，使用实施例5中产生的亲本eTPC-t细胞系ACL-851。组件Z是由两个异种特异性重组酶位点组成的质粒载体，与组件D'匹配的F14/F15，Kozak序列，起始密码子和编码作为整合选择标记的绿色荧光蛋白(GFP)的ORF。通过电穿孔将eTPC-t与组件Z和编码RMCE重组酶的载体组合，随后针对CD3呈递的丢失选择细胞并获得整合的GFP选择标记。通过FACS来表型表征单克隆ACL-987，并且观察到ACL-987已经获得GFP并且丢失了CD3和TCRab(图49b，d)，表明JG9-TCR-α与GFP ORF的成功交换以及组件D'向组件D的转化，从而产生eTPC-x。相比之下，亲本eTPC-t，ACL-851缺乏GFP表达并且具有CD3和TCRab表面表达(图49a至c)。
总之，该实施例证明了eTPC-t向eTPC-x的转化，在组件D'处除去了JG9-TCR-αTCRORF，以交换整合的GFP选择标记，从而产生组件D，用于备选互补TCR链ORF的进一步整合对事件。使用用于基因组整合的RMCE方法进行该转化。
实施例7：鸟枪整合到eTPC-x中以产生eTPC-t池的证明
本实施例描述了如何将编码64个单个JG9-TCR-α变体(作为组件E')的载体池作为单个步骤整合到亲本eTPC-x细胞系(在实施例6中描述)中以产生汇集的eTPC-t库，其中每个单独的细胞整合了来自原始载体池的编码α链的单个随机TCR ORF，使得每个eTPC-t表达单个随机对的TCR ORF作为TCRsp。将各个eTPC-t组合在一起包含汇集的eTPC-t库，其中所述细胞池潜在地代表64个TCR-α与恒定原始TCRβ链配对的所有可能组合(参见图12示意图)。这种方法现在称为“鸟枪”整合。通过修饰落在V和J片段连接处的CDR3序列，已经产生了64个JG9-TCR-α变体。
在该实施例中，使用具有非表面表达的JG9-TCR-β(组件B')和CD3复合体的亲本eTPC-x细胞系ACL-987(参见实施例6)。组件D编码GFP，一种选择标记，如实施例6中所述。在该实施例中，将64个JG9-TCR-α变体片段克隆到组件E供体载体中，产生组件E'，侧翼为F14/F15位点，匹配组件D。随后将64个载体组合成单个载体库。
通过基于RMCE的基因组整合产生eTPC-t池，其中通过电穿孔组合eTPC-x(ACL-987)和64个组件E'和RMCE重组酶载体。基于GFP表达选择多克隆。所得多克隆，ACL-988，不同于仅由GFP阳性细胞组成的亲本系(图50a和b)，由GFP阳性和GFP阴性细胞群组成。然而，只有GFP阴性群体显示出始终强的CD3表达，表明组件D成功转化为组件D'，并因此eTPC-x已转化为eTPC-t池(图50c和d)。此外，ACL-988GFP阴性群体在用JG9-TCR特异性多聚体试剂(DEX HLA-A*02:01-NLVP)染色时显示出两种不同的强度，表明该群体包含表达具有不同结合效率的TCR变体的细胞。
并行地，将所有64个JG9-TCR-α变体克隆到允许瞬时转染至亲本eTPC-x(ACL-987)的表达构建体中并针对在上述汇集的表达eTPC-t的变体JG9-TCR中呈递的每个TCR对，测定HLA-A*02:01-NLVP多聚体试剂对比参照的相对染色单位(RSU)。RSU计算为CD3阳性群体的HLA多聚体信号的平均荧光强度(MFI)与CD3阴性群体的比率，并且指示每个TCR链对变体的结合强度。在用每种JG9-TCR-α变体独立转染亲本ACL-987系后，用针对CD3的抗体和用HLA-多聚体试剂染色细胞，并通过流式细胞术分析。图51e中绘制的每个点代表为每64种变体观察到的RSU。
来自ACL-988池的单个细胞是从HLA-多聚体阳性群体和HLA-多聚体阴性群体分选的单细胞。对编码每个单细胞的变体JG9-TCR-αORF的组件D'进行扩增和测序，并与上面描述的瞬时表达RSU单位的结果进行比较(图50e)。实际上，单独的ACL-988细胞是HLA-多聚体阳性编码的JG9-TCR-α变体(其主要显示出高RSU)，导致单独测试的变体(图51e，空心圆圈)。此外，个体ACL-988细胞是pHLA-多聚体阴性编码的JG9-TCR-α变体，其主要显示出低RSU结果(图51e，空心三角形)。
总之，该实施例证明了使用多组件系统将eTPC-x和汇集的载体库(组件E')转化成含有多种不同TCRsp的eTPC-t的汇集库中。这是使用鸟枪整合在一个步骤中实现的。此外，该实施例证明eTPC-t池与分析物抗原(作为可溶性亲和试剂)组合到eTPC:A系统，其中证明可以基于用分析物抗原(HLA-多聚体)形成复合体来选择池中的单个细胞，并且其中提取在组件D'中编码的随后的TCR链ORF并获得DNA序列。
实施例8：组件F的功能阐明
本文描述了eTPC细胞系(ACL-1277，组件A)，其利用两个独特的基因组接收位点(组件B，D)工程化，工程化为HLA Null，利用天然CD3表达，并含有工程化基因组双组件，合成响应元素(组件F)。
响应元件包括驱动子-激活子组件和扩增子-报道组件，其中两个单元都使用合成启动子。驱动子是响应天然TCR信号传导途径的合成启动子，编码NFAT-AP1-NFkB(3xNF-AP-NB)的三组串联转录因子结合位点。在转录激活后，驱动子诱导激活子蛋白的表达，这是一种合成设计的转录因子，通过融合Herpes VP16激活结构域、GAL4DNA结合结构域和N端和C端的两个核定位信号(NV16G4N)而得到，同源DNA识别序列在扩增子启动子中串联6次存在。驱动子和扩增子启动子均利用来自HCMV IE1启动子的核心启动子序列(B识别元件(BRE)，TATA盒，起始区(INR)和转录起始位点)，紧邻各转录因子结合位点的3'。转录激活后的扩增子驱动报道分子红色荧光蛋白(RFP)的表达。
在该实施例中，如前面实施例5中所述，将eTPC细胞系转化为eTPC-t细胞系，其中组件B'和E'处的TCR链ORF编码对HLA-肽复合体(HLA)特异的TCR对，HLA-A*02:01-NLVPMVATV。
eTPC-t细胞系然后针对呈递HLA-A*02:01(ACL-209)或HLA-A*24:02(ACL-963)的APC攻击或者为HLA-null(ACL-128)。其中分析物APC通过用肽NLVPMVATV或VYALPLKML或无肽的分析物抗原脉冲APC来制备。随后，将eTPC-t和分析物APC编辑到eTPC:A系统中，该系统由30,000个eTPC-t与10,000个APC共培养24小时组成。24小时后，收获细胞，洗涤，用对eTPC-t和分析物APC特异的标记物染色以区分群体，并使用本领域技术人员已知的技术通过流式细胞术分析。eTPC-t的强烈激活，组件F(RFP+表达>80％)仅在用呈递已知的同源抗原pHLA复合体的分析物APC(即具有A*02:01-NLVPMATV的APC(图51a))攻击的eTPC-t中观察到。相反，在由非特异性分析物APC(图51b，c，d)或缺乏HLA或肽的对照分析物APC组成的eTPC:A编辑中仅观察到静息状态RFP表达。
总之，工程化含有功能组件F的eTPC细胞系，随后用于产生eTPC-t。在eTPC-t与呈递其同源靶T细胞抗原的分析物APC相互作用后，可以测量随着RFP表达增加的响应。相反，当与呈现非同源T细胞抗原和HLA或没有HLA的分析物APC接触时，eTPC-t没有表现出高于背景的RFP表达的可测量的增加。此外，该实施例证明了eTPC:A系统，其中分析物APC和分析物eTPC-t以离散的二元组合物形式编辑，并且eTPC-t响应用于鉴定分析物APC和eTPC-t，其中在TCRsp和分析物抗原之间发生共同操作的复合体。
实施例9：使用eTPC-t作为携带TCR的流式细胞术标准品
本文描述了使用多组件系统创建和选择的eTPC-t和随后编辑的eTPC:A系统的示例，用作基于体外FACS的测定标准。本实施例证明了确认和选择的eTPC-t(ACL-851，实施例5)的化学固定和冷冻保存，所述eTPC-t表达对抗原特异性的TCRsp(APX:AM)，其由装载有抗原分子(AM)——来自HCMV-pp65的肽NLVPMVATV的HLA-A*02:01抗原呈递复合体(APX)组成。当从储存中召回时，TCRsp维持pHLA-多聚体(APX:AM)标记(图52a)。此外，这些细胞可以“掺入”人外周血单核细胞(PBMC)制剂中，并通过流式细胞术与同一样本中的HCMV特异性原代T细胞一起检测(图52b)。eTPC-t在掺入PBMC混合物之前用CD58抗体预染色，随后用四聚体试剂染色。CD58参数用于区分eTPC-t与HLA-A*02:01中呈递的NLVPMVATV肽特异性的原代T细胞。这表明表达特异性TCRsp链对的eTPC-t可在检测抗原特异性T细胞的流式细胞术测定中用作TCR呈递对照试剂。
序列表
<110>Genovie AB
<120>用于鉴定和表征T细胞受体、T细胞抗原及其功能性相互作用的工程化的多组件系统
<130>ANO9
<160>134
<170>BiSSAP 1.3
<210>1 223HCMV抗原
<210>2<223>分析物抗原肽
<210>3 223分析物抗原肽
<210>4<223>pcDNA3.1_GFP载体V1.A.4
<210>5<223>pcDNA3.1_RFP载体V1.A.6
<210>6<223>SpCas9-2A-GFP载体V1.A.8
<210>7<223>pMA-SV40pA载体V1.C.2
<210>8<223>HLA-A 02:01 6xHis+外显子2/3-HA-L+R载体V1.C.6
<210>9<223>HLA-B 35:01 6xHis+外显子2/3-HA-L+R载体V1.C.9
<210>10<223>AAVS1-L_B07_6xH载体V1.F.10
<210>11<223>AAVS1-S_A24_6xH载体V1.F.8
<210>12<223>AAVS1-l_GFP_HCMVpp65载体V1.G.10
<210>13<223>AAVS1-l_GFP_HCMVpp65ANET载体V1.G.9
<210>14<223>AAVS1-l_GFP_HCMVpp65AIN载体V1.H.1
<210>15<223>AAVS1_DRA_Flag-DRB1_6xHis载体V1.I.5
<210>16<223>AAVS1_DPA1_Flag-DPB1_6xHis载体V1.I.7
<210>17<223>HLA-A-sg-sp-opti1载体V2.A.1
<210>18<223>HLA-B-sg-sp-3载体V2.A.7
<210>19<223>HLA-C-sg-sp-4载体V2.B.3
<210>20<223>HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_1载体V2.I.10
<210>21<223>HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_2载体V2.J.1
<210>22<223>AAVSI_sg-sp-opti_3载体V2.J.6
<210>23<223>pMA-CS-JG9-TCRbeta载体V3.C.5
<210>24<223>AAVS_Efla-内含子_F14_RFPnls_F15载体V4.B.2
<210>25<223>AAVS_Efla-内含子_FRT_BFPnls_F3载体V4.B.3
<210>26<223>pMA_FRT_HLA-A*02:01-6xHis_F3载体V4.D.2
<210>27<223>pMA-F14-GFP-F15载体V4.H9
<210>28<223>CMVpro-Flp-sv40pA-V2载体V4.I.8
<210>29<223>pMA-F14-TCR-JG9-alpha-F15载体V7.A.3
<210>30<223>pMA-FRT-TCR-JG9-beta-F3载体V7.A.4
<210>31<223>F14-TCRaF15CDR3degen.64mix载体V8.F.8
<210>32<223>JG9-TRA CDR3 64变体载体骨架VP.7751.RC1-A1到H8
<210>33<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A1的CDR3序列
<210>34<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A2的CDR3序列
<210>35<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A3的CDR3序列
<210>36<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A4的CDR3序列
<210>37<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A5的CDR3序列
<210>38<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A6的CDR3序列
<210>39<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A7的CDR3序列
<210>40<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_A8的CDR3序列
<210>41<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B1的CDR3序列
<210>42<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B2的CDR3序列
<210>43<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B3的CDR3序列
<210>44<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B4的CDR3序列
<210>45<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B5的CDR3序列
<210>46<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B6的CDR3序列
<210>47<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B7的CDR3序列
<210>48<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_B8的CDR3序列
<210>49<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C1的CDR3序列
<210>50<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C2的CDR3序列
<210>51<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C3的CDR3序列
<210>52<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C4的CDR3序列
<210>53<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C5的CDR3序列
<210>54<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C6的CDR3序列
<210>55<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_C7的CDR3序列
<210>56<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D1的CDR3序列
<210>57<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D2的CDR3序列
<210>58<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D3的CDR3序列
<210>59<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D4的CDR3序列
<210>60<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D5的CDR3序列
<210>61<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D6的CDR3序列
<210>62<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D7的CDR3序列
<210>63<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_D8的CDR3序列
<210>64<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E1的CDR3序列
<210>65<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E2的CDR3序列
<210>66<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E3的CDR3序列
<210>67<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E4的CDR3序列
<210>68<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E5的CDR3序列
<210>69<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E6的CDR3序列
<210>70<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E7的CDR3序列
<210>71<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_E8的CDR3序列
<210>72<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F1的CDR3序列
<210>73<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F2的CDR3序列
<210>74<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F3的CDR3序列
<210>75<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F4的CDR3序列
<210>76<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F5的CDR3序列
<210>77<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F6的CDR3序列
<210>78<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F7的CDR3序列
<210>79<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_F8的CDR3序列
<210>80<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G1的CDR3序列
<210>81<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G2的CDR3序列
<210>82<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G3的CDR3序列
<210>83<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G4的CDR3序列
<210>84<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G5的CDR3序列
<210>85<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G6的CDR3序列
<210>86<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G7的CDR3序列
<210>87<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_G8的CDR3序列
<210>88<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H1的CDR3序列
<210>89<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H2的CDR3序列
<210>90<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H3的CDR3序列
<210>91<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H4的CDR3序列
<210>92<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H5的CDR3序列
<210>93<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H6的CDR3序列
<210>94<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H7的CDR3序列
<210>95<223>JG9-TRA 64变体VP.7751.RC1_H8的CDR3序列
<210>96<223>pMA-sv40_OE_F1引物1.C.2
<210>97<223>pMA-sv40_OE_R1引物1.C.3
<210>98<223>pMA-CMV_OE_R1引物1.C.5
<210>99<223>HLA-A-GT-Rg3引物4.A.3
<210>100<223>HLA-A-GT-Fg2引物4.A.4
<210>101<223>HLA-B-GT-Fg2引物4.A.7
<210>102<223>HLA-B-GT-Rg2引物4.B.1
<210>103<223>HLA-C-GT-Fg2引物4.B.5
<210>104<223>HLA-A-02_GT_Rg4引物4.I.9
<210>105<223>HLA-A-外显子3_HA-RE-BglII_F1引物6.I.9
<210>106<223>HLA-C-04-GT-Rg1引物8.A.1
<210>107<223>CMV-pA-HLA-Ex3_探针_F1引物8.B.2
<210>108<223>CMV-pro_GT_R1引物9.C.3
<210>109<223>sv40pA_GT_F1引物9.C.4
<210>110<223>AAVS1_GT_F1引物9.C.5
<210>111<223>AAVS1_GT_F3引物9.C.7
<210>112<223>AAVS1_GT_F4引物9.C.8
<210>113<223>AAVS1_GT_R2引物9.C.10
<210>114<223>AAVS1_GT_R3引物9.D.1
<210>115<223>AAVS1_GT_R4引物9.D.2
<210>116<223>HLA-A-内含子4_GT_R1引物9.D.6
<210>117<223>sv40pA-GT-F2引物9.D.7
<210>118<223>sv40pA-AAVS1-探针-FAM-F1引物9.J.2
<210>119<223>TRAC_TCRA-ex1_R1引物10.A.9
<210>120<223>TRAC_TCRA-启动子_F1引物10.A.10
<210>121<223>TRAC_探针(HEX)引物10.B.6
<210>122<223>TRAC-GT-F1引物1.F.7
<210>123<223>sv40pA GT-R1引物15.H.2
<210>124<223>TRBC2-GT-F1引物1.F.9
<210>125<223>tGFP-Cterm-Out_SQ_F1引物3.J.5
<210>126<223>TRAC-GT-F1ddPCR引物/探针
<210>127<223>TRAC-GT-R1ddPCR引物/探针1.F.8
<210>128<223>TRAC-探针-FAM ddPCR引物/探针
<210>129<223>TRBC2-GT-F1ddPCR引物/探针1.F.9
<210>130<223>TRBC2-GT-R1ddPCR引物/探针1.F.10
<210>131<223>TRBC2-探针-FAM ddPCR引物/探针1.G.2
<210>132<223>TRAC-TCRA-ex1-F1ddPCR引物/探针10.A.9
<210>133<223>TRAC-TCRA-ex1-F1ddPCR引物/探针10.A.10
<210>134<223>TRAC-探针(HEX)ddPCR引物/探针10.B.6
缩略语表
aAPX 分析物抗原呈递复合体
aAM 分析物抗原分子
APC 抗原呈递细胞
APX 抗原呈递复合体
BFP 蓝色荧光蛋白
CAR-T CAR T细胞
CM 货物分子
CRISPR 聚簇的规则间隔短回文重复
gRNA Cas9指导RNA
CAR 嵌合抗原受体
CDR 互补决定区
C-区 恒定区
CMV 巨细胞病毒
DAMPS 危险相关的分子模式
DC 树突细胞
DNA 脱氧核糖核酸
D-区 多样性区域
eTPC 工程化的TCR呈递细胞
eTPC:A eTPC:抗原系统，其中分析物eTPC-t与分析物抗原组合
eTPC-t 工程化的TCR呈递细胞，其呈递全长TCR对
FACS 荧光激活细胞分选
GEM T细胞 种系编码的分枝酰基反应性T细胞
GFP 绿色荧光蛋白
HLAI HLA I类
HLAII HLA II类
HDR 同源性定向重组
HLA 人白细胞抗原
IgSF 免疫球蛋白超家族
IRES 内部核糖体进入位点
iNK T细胞 不变的自然杀伤T细胞
J区 连接区域
MACS 磁激活细胞分选
MAGE 黑色素瘤相关抗原
MAIT 粘膜相关不变T
NCBP 非基于细胞的颗粒
ORF 开放阅读框架
PAMPS 病原体相关分子模式
PCR 聚合酶链式反应
RMCE 重组酶介导的盒式交换
RFP 红色荧光蛋白
DNA 核糖核酸
SH2 Src同源性2
T细胞 T淋巴细胞
TC TCR或TCR模拟亲和试剂呈递细胞
TCR T细胞受体
TRA TCRα
TRB TCRβ
TRD TCRδ
TCRsp 与CD3复合的TCR表面蛋白
TALEN 转录激活因子样效应核酸酶
TRG TRCγ
TAA 肿瘤相关抗原
V-区 可变区
β2M β2微球蛋白
ZAP-70 70kDa的ζ链相关蛋白
定义
一对互补的TCR链：两条TCR链，其中翻译的蛋白质能够在TCR呈递细胞的表面上形成TCRsp。
亲和力：两个或更多个分子或蛋白质之间相互作用的动力学或平衡参数
亲和试剂：设计为对分析物具有特异亲和力的任何试剂。通常在对TCRsp的亲和力的背景中使用
等位基因：给定基因的变体形式
AM：分析物抗原分子。通常，蛋白质也可以是由细胞从其基因组DNA和/或特定引入的基因序列表达的代谢物。AM在细胞中表达，并且片段然后可以通过APX作为货物或单独呈递在细胞表面上。无论是否作为货物，AM都可以是携带T细胞受体的细胞或相关亲和试剂的靶标。
扩增子：一种DNA或RNA，是使用包括PCR在内的各种方法进行人工扩增的来源和/或产物。
分析物：在组合系统中被识别和/或测量和/或查询的目的实体
分析物抗原：包括以下中至少一个的抗原，AM，APX，APX:CM，APX:AM，以可溶性试剂、固定化试剂的形式提供，由NCBP呈递，呈递在细胞表面上。
分析物APC：呈递分析物抗原的分析物细胞。
抗体：亲和分子，由免疫系统的称为B细胞的特化细胞表达，并且含有两条链。B细胞表达非常大且非常多样的抗体库，其通常不结合自身蛋白质但可结合并中和会威胁宿主的病原体或毒素。天然或人工工程化的抗体通常用作亲和试剂。
抗原：任何可能被TCR接合并导致信号在T细胞内转导的分子，通常由抗原呈递复合体呈递
APC：抗原呈递细胞。在细胞表面上携带AM，APX，APX的细胞
APX：抗原呈递复合体。通过来自基因/编码ORF的基因组DNA和/或特异引入的基因序列的有核细胞在细胞表面上表达和呈递的蛋白质。APX呈递货物，或是肽或是其他代谢物分子。
C-区：恒定区。用于组装T细胞受体的基因片段之一。c-区是唯一的区段，而不是驱动TCR的多样性，定义其在免疫系统中的一般功能。
货物装载机制：在来自蛋白质或细胞中发现的其他呈递分子的APX上产生和装载货物分子的细胞蛋白质组。
CDR：互补决定区。TCR的抗原端的短序列和执行大部分靶结合功能的抗体。每个抗体和TCR含有6个CDR，并且它们通常是分子中变化最大的部分，允许检测大量不同的靶分子。
CM：货物分子。由诸如HLA I或HLA II的抗原呈递复合体呈递的肽或代谢物。CM可以由细胞内在地从基因组DNA表达，引入培养基或由特异性引入的基因序列表达。
拷贝数：在细胞基因组内编码的限定序列的整数出现
细胞遗传学的：与染色体的结构和功能相关的遗传研究，即确定细胞的核型
细胞毒性的/细胞毒性：T细胞释放直接且特异性损伤靶细胞的因子的过程。
D-区：多样性区域。用于组装T细胞受体的基因区段之一。每个个体都具有这些区域的大量不同变体，使得每个个体可以对T细胞配备非常多种不同TCR。
DNA：脱氧核糖核酸。形成编码基因和蛋白质的遗传物质的分子的化学名称。
内源性：源自细胞内的物质。
工程化的细胞：基因组通过基因修饰被工程化的细胞。
真核条件调控元件：可以影响启动子活性的DNA序列，其可以在限定的条件下被诱导或抑制。
真核启动子：编码RNA聚合酶结合位点和响应元件的DNA序列，启动子区域的序列控制RNA聚合酶和转录因子的结合，因此启动子在确定目的基因何时何地将表达方面发挥作用。
真核终止子/信号终止子：被蛋白质因子识别的DNA序列，其与RNA聚合酶II相关并且触发转录的终止过程。它还编码poly-A信号。
eTPC:抗原系统：eTPC:A，其中分析物eTPC-t与分析物抗原组合的系统。
FACS/流式细胞术：荧光激活细胞分选。分析技术，通过该技术可以分析单个细胞的特定细胞表面和细胞内标记的表达。该技术的变型，即细胞分选，允许取回携带一组限定标记的细胞用于进一步分析。
APX家族：一组编码功能相关蛋白的几个相似基因，其构成抗原呈递复合体
荧光(蛋白质)标记：具有特定消光和发射特征并且可通过显微镜、FACS和相关技术检测的分子。
遗传供体载体：用于将遗传物质递送至基因组接收位点的基于遗传的载体
基因组接收位点：基因组内的位点，用于遗传供体载体内编码的供体遗传物质的靶向整合。
异种特异性重组酶位点：被重组酶识别以促进两个DNA分子的交换的DNA序列
HLA I：人类白细胞抗原I类。在人类中在所有有核细胞中表达并输出到细胞表面的基因，在所述细胞表面其向T细胞受体呈递作为货物的内部蛋白质的短片段，肽。因此，它呈递潜在持续感染的片段以及内在蛋白质。HLA I还可以呈递作为货物的肽，所述肽被添加到培养基中，由从引入的遗传元件表达的蛋白质产生或由细胞摄取的蛋白质产生。HLA I类基因是多态的，意味着不同的个体可能在同一基因中具有变异，导致呈递的变异。与HLA II类相关。
HLA II：人类白细胞抗原II类。在人体中在特定细胞中表达的基因，其协调并帮助对示例树突细胞的适应性免疫应答。与HLA I类相关。HLA II类蛋白质被输出到细胞表面，在那里它们向T细胞受体呈递作为货物的外部蛋白质的短片段，肽。因此，它呈递潜在持续感染的片段以及内在蛋白质。HLA II可以另外呈递作为货物的肽，其被添加到培养基中，由从引入的遗传元件表达的蛋白质产生或由细胞摄取的蛋白质产生。HLA II类基因具有多态性，意味着不同的个体可能在同一基因中具有变异，导致呈递的变异。
同源臂：一段DNA，与补体同源臂具有几乎相同的序列身份，并因此通过细胞过程——同源定向修复——促进两个DNA分子的交换。
免疫监视：免疫系统检测到并被感染、恶性肿瘤或其他潜在致病性改变所激活的过程。
绝缘子：DNA序列，其防止基因受到附近基因的激活或抑制的影响。绝缘子还防止异染色质从沉默基因扩散到活跃转录的基因。
整合：DNA序列物理连接到细胞染色体中
整合对：成对的遗传供体载体和基因组接收位点
内部核糖体进入位点(IRES)：DNA序列，其一旦转录就编码允许以与帽无关的方式启动翻译的RNA元件
J区：连接区。用于组装T细胞受体的基因区段之一。每个个体都具有这些区域的大量不同变体，使得每个个体可以为T细胞配备非常多种不同TCR。
核型：细胞的染色体组成
Kozak序列：有效启动翻译所需的短序列
主要HLA I类：包含HLA-A、HLA-B和HLA-C基因的APX家族
匹配的：当两个组件编码指导和限制互补组件之间相互作用的遗传元件时
大范围核酸酶识别位点：被内切-脱氧核糖核酸酶(通常称为大范围核酸酶)识别的DNA序列
代谢物：通过细胞的代谢途径产生或改变的分子
移动遗传元件：可以允许DNA与转座酶的活性整合的DNA序列
单克隆细胞系：通过重复细胞复制从单个祖细胞产生的一组确定的细胞
原生：天然存在于细胞中的实体
非编码基因：转录为功能性非编码RNA分子的非蛋白质编码DNA序列
ORF：开放阅读框。编码用于通过核糖体合成蛋白质(多肽)的翻译框架的遗传物质段
旁分泌：通过直接作用于邻近细胞的可溶性因子的信号传导。
PCR：聚合酶链反应，其中特异性靶DNA分子被指数扩增
肽：长度在6到30个氨基酸之间的氨基酸短链
表型分析：细胞的可观察特征的分析。
多态性：通过相同基因的不同等位基因的存在，在相同物种的个体以不同形式存在。
多肽：由一段肽组成的蛋白质，形成三维结构。
引物：短DNA序列，其允许特异性识别目标DNA序列，例如在PCR期间。
初级输出：eETP-t细胞，分析物APC细胞，NCBP或其他分析物抗原形式，从中可以导出和/或确定终端输出。
启动子：用于基因表达的受控启动的调节DNA元件
选择标记：赋予适合人工选择方法的性状的DNA序列
鸟枪整合：将载体库引入细胞群的过程，由此只有任何给定载体插入物的单个拷贝可以整合到每个单细胞的基因组中。用于指通过整合对将汇集的载体整合到给定的细胞群
剪接受体位点：内含子AM，APX CM或亲和试剂3'末端的DNA序列，用于与表面上具有TCRsp的细胞，或基于TCRsp的试剂相互作用
剪接供体位点：内含子5'末端的DNA序列
合成：人工生成并引入细胞的实体
T细胞：T淋巴细胞。在其表面上表达T细胞受体的白细胞。被免疫系统选择为不与自身反应，但具有识别感染和恶性肿瘤，以及拒绝来自同一物种的大多数成员的移植物的潜能。
TCR：T细胞受体。由称为T淋巴细胞的淋巴细胞亚群表达的亲和分子。在人类中，TCR识别由APX CM或APX AM呈递的货物，包括来自病毒或细菌感染或癌细胞的片段。因此，TCR识别是适应性免疫系统的组成部分。TCR由两条在细胞表面配对的链组成。在每个细胞表面上表达的TCR是从大量不同基因(v，d，j和c区域)池中随机组装的，因此每个个体都有T细胞池，表达不同的TCR的非常大且多样化的库。
TCRsp：一对互补的TCR链，其表达与CD3复合的表面蛋白或一对互补的TCR链，以可溶性试剂、固定化试剂或NCBP存在的形式表达为蛋白质。
终端输出：分析物抗原和TCR序列，形式为AM，APX，APX:CM，APX:AM，亲和试剂或TCRsp
TRA：TCRα编码基因座。可形成VDJ重组TCR链的四种不同基因座编码基因之一。翻译的TCRα链蛋白通常与翻译的TCRβ链蛋白配对以形成α/βTCRsp。
TRB：TCRβ编码基因座。可形成VDJ重组TCR链的四种不同基因座编码基因之一。翻译的TCRβ链蛋白通常与TCRα链蛋白配对以形成α/βTCRsp。
TRD：TCRδ编码基因座。可形成VDJ重组TCR链的四种不同基因座编码基因之一。翻译的TCRδ链蛋白通常与翻译的TCRγ链蛋白配对以形成γ/δTCRsp。
TRG：TCRγ编码基因座。可形成VDJ重组TCR链的四种不同基因座编码基因之一。翻译的TCRγ链蛋白通常与翻译TCRδ链蛋白配对以形成γ/δTCRsp。
V-区：可变区域。用于组装T细胞受体的基因区段之一。每个个体都具有这些区域的大量不同变异，使得每个个体可以为T细胞配备非常多种不同TCR。
在以下项目中进一步限定本发明：
1.一种多组件系统，其中第一组件是工程化的TCR呈递细胞(eTPC)，称为组件A，第二组件是遗传供体载体，称为组件C，用于递送编码TCR链的ORF。
2.根据项1的多组件系统，其中组件A
a.缺乏TCR链α、β、δ和γ的内源表达和
b.表达CD3蛋白，其仅在细胞表达互补的TCR链对时有条件地在细胞表面呈递和
c.含有称为B的另一组件，其是一个基因组整合位点，用于整合编码至少一个分析物TCR链α、β、δ和γ的单个ORF和/或两个编码一对分析物TCR链的ORF。
3.根据项1或2的多组件系统，其中组件C与组件B匹配，并且其中组件C设计用于递送
a.单个编码至少一个TCR链α、β、δ和/或γ的ORF和/或
b.两个编码分析物TCR链对的ORF
并且其中a和/或b任选地编码整合的选择标记，使得分析物TCR链可以表达为TCR表面蛋白与组件A上的CD3(TCRsp)复合。
4.根据前述项目中任一项的多组件系统，其由eTPC，称为组件A和遗传供体载体，称为组件C组成，用于递送一个或多个编码分析物TCR链的ORF，其中
组件A
a.缺乏TCR链α、β、δ和γ的内源表达和
b.表达CD3蛋白，其仅在细胞表达互补的TCR链对时有条件地在细胞表面呈递和
c.含有被称为B的另一组件，一个基因组整合位点，用于整合编码至少一个分析物TCR链α、β、δ或γ的单个ORF和/或两个编码分析物TCR链对的ORF，
并且组件C包含与组件B匹配的遗传供体载体，并且其中组件C被设计为递送
a.单个编码至少一个TCR链α、β、δ和/或γ的ORF和/或
b.两个编码分析物TCR链对的ORF，
并且其中a和/或b任选地编码整合的选择标记，使得所述分析物TCR链可以表达为TCR表面蛋白与组件A上CD3(TCRsp)复合。
5.根据前述项目中任一项的多组件系统，其中组件A包含另一组件，称为D，用于整合单个编码一个TCRα、β、δ或γ链的ORF的基因组整合位点。
6.根据项5的多组件系统，其中另一组件称为E，是与D匹配的遗传载体，其中组件E被设计成递送编码一个分析物TCR链α，β，δ或γ的单个ORF，使得当编码α，β，δ或γ的互补配对分析物TCR链的ORF整合到组件B中时，表达为组件A上的TCRsp并且任选地其中组件E编码整合的选择标记。
7.根据前述项目中任一项的多组件系统，其中组件A还含有称为F的组件，一种选自以下的合成基因组TCR-刺激反应元件
a.单组件合成构建体，其含有至少一种天然启动子和/或至少一种合成启动子和至少一种报道分子
b.一种多组件合成构建体，其设计有至少一种天然启动子和/或至少一种合成启动子和至少一种报道分子。
和其中a和/或b的激活依赖于选自合成途径、天然途径或其组合的至少一种信号转导途径。
8.根据前述项目中任一项的多组件系统，其中包括基因组接收位点B和/或D，并且其选自
a.设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体
b.设计用于定点同源重组的合成构建体
c.用于定点同源重组的天然基因组位点。
9.根据前述任一项的多组件系统，其中组件A缺乏分析物抗原呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)的至少一个家族的内源表面表达。
10.根据项9的多组件系统，其中aAPX的家族可以是以下任何一种
a.HLA I类
b.HLA II类
c.非HLA抗原呈递复合体。
11.根据项9或10的多组件系统，其中aAM选自
a.从分析物抗原分子ORF翻译的多肽或多肽复合体
b.衍生自分析物抗原分子ORF翻译的多肽的肽
c.衍生自改变组件A蛋白质组的肽
d.衍生自改变组件A蛋白质组的多肽
e.衍生自改变组件A代谢物组的代谢物。
12.根据前述任一项的多组件体系，其中组件A表达CD4和/或CD8。
13.根据前述任一项的多组件系统，其中组件A表达另外的TCR共受体。
14.根据项13的多组件系统，其中组件A表达CD28和/或CD45。
15.根据前述项目中任一项的多组件系统，其中包含组件B和/或D并且包含至少一种下列遗传元件
a.异种特异性重组酶位点
b.同源臂
c.真核启动子
d.真核条件调控元件
e.真核终止子
f.选择标记
g.剪接受体位点
h.剪接供体位点
i.非蛋白质编码基因
j.绝缘子
k.移动遗传元件
l.大范围核酸酶识别位点
m.内部核糖体进入位点(IRES)
n.病毒自切割肽元件
o.kozak共有序列。
16.根据前述任一项的多组件系统，其中包含组件C和/或E，并且包含至少一种以下遗传元件
a.异种特异性重组酶位点
b.同源臂
c.真核启动子
d.真核条件调控元件
e.真核终止子
f.选择标记
g.整合的选择标记
h.剪接受体位点
i.剪接供体位点
j.非蛋白质编码基因
k.绝缘子
l.移动遗传元件
m.大范围核酸酶识别位点
n.内部核糖体进入位点(IRES)
o.病毒自切割肽元件
p.抗生素抗性盒
q.细菌复制起点
r.酵母复制起点
s.克隆位点
t.Kozak共有序列。
17.根据前述项目中任一项的多组件系统，其中包含组件B和/或D并且用于单个ORF的RMCE整合，并且包含：
a.真核启动子
b.一对异种特异性重组酶位点
c.Kozak共有序列
d.选择标记
e.真核终止子。
18.根据前述项目中任一项的多组件系统，其中包含组件B和/或D，并且用于两个或更多个ORF的RMCE整合包含以下遗传元件：
a.真核启动子
b.一对异种特异性重组酶位点
c.两个或更多Kozak共有序列
d.选择标记
e.真核终止子
f.第二真核启动子
g.第二选择标记
h.第二真核生物终止子。
19.根据前述任一项的多组件系统，其中存在组件C和/或E用于单个ORF的RMCE整合，并包含以下遗传元件：
a.一对异种特异性重组酶位点
b.Kozak共有序列
c.抗生素抗性盒
d.细菌复制起点
e.用于引入单个编码一种或多种TCR链和/或整合选择标记的ORF的克隆位点。
20.根据前述任一项的多组件系统，其中存在组件C和/或E，用于两个或更多个ORF的RMCE整合，并包括以下：
a.一对异种特异性重组酶位点
b.两个或更多Kozak共有序列
c.抗生素抗性盒
d.细菌复制起点
e.用于引入两个或更多个ORF的克隆位点，其具有真核终止子，编码一种或多种TCR链和/或整合的选择标记。
21.根据前述项目中任一项的多组件系统，其中组件C和/或E被包括并与至少一种编码至少一种分析物TCR链的ORF组合以获得组件C'和/或E'。
22.根据项21的多组件系统，其中所述组合多次形成以获得组件C'和/或E'的库。
23.根据项21或22中任一项的多组件系统，其中分析物TCR链编码序列源自
a.来自原代T细胞的TCR链ORF序列的配对克隆
b.来自原代T细胞的TCR链ORF序列的未配对克隆
c.合成TCR链ORF序列。
24.根据项21-23中任一项的多组件系统，其中一种或多种组件C'和/或E'与组件A组合，以将在组件C'和/或E'中编码的两个互补分析物TCR链整合到组件B和/或D中，以获得称为eTPC-t的细胞，其中组件B和/或D成为组件B'和/或D'，使得其在组件A的表面上表达TCRsp。
25.根据项21-23中任一项的多组件系统，其中一种组件C'或E'与组件A组合，以将一个在组件C'或E'中编码的分析物TCR链整合到组件B或D中，以获得称为eTPC-x的细胞，其中组件B或D成为组件B'或D'，使得eTPC-x表达单个TCR链。
26.根据项25中任一项的多组件系统，其中组件C'或E'中的一个与eTPC-x组合，以将与在eTPC-x中表达的TCR链互补的组件C'或E'中编码的一个分析物TCR链整合到在eTPC-x中的组件B或D中，获得eTPC-t，其中组件B或D成为组件B'或D'，使得它在eTPC-t的表面上表达TCRsp。
27.根据项24中所定义的制备eTPC-t的方法，该方法包括
a.将组件A与组件C'和/或E'中的至少一种组合，其中一种或多种组件C'和/或E'编码一种或多种互补分析物TCR链对，并与整合因子组合以及至少一种
b.选择基因组接收位点选择标记的丢失
c.选择TCRsp和/或一个或多个CD3蛋白的表面表达的获得
d.选择一个或多个整合选择标记的获得。
28.根据项27的方法，其中包括b和d。
29.根据项27或28的方法，其中所述一个或多个组件C'和/或E'编码在项27的步骤a中TCR链的单个互补对。
30.根据项29的方法，其中所述方法进行多次，其中每次项27的步骤a使用TCR链的独特的单个互补对进行，使得获得独特的eTPC-t，以获得离散和定义的eTPC-t库。
31.根据项27或28的方法，其中所述一个或多个组件C'和/或E'编码在项27的步骤a中的两个或更多个独特互补TCR链对的混合池，以获得库，其中所述库包括eTPC-t的混合群，其中每个eTPC-t表达从在项27的步骤a中使用的池中衍生的单个TCRsp。
32.一种用于制备如项25中所定义的TPC-x的方法，所述方法包括：
a.将组件A与一种或多种组件C'或一种或多种组件E'组合，其中一种或多种组件C'或一种或多种组件E'编码分析物TCR链，并与整合因子组合和至少一种
b.选择基因组接收位点选择标记的损失
c.选择一个或多个整合选择标记的获得。
33.根据项32的方法，其中包括b和c。
34.根据项32或33的方法，其中一种组件C'或一种组件E'编码在项32的步骤a中的单个分析物TCR链。
35.根据项34的方法，其中所述方法进行多次，其中每次使用独特的分析物TCR链执行项32的步骤a，使得获得唯一的eTPC-x，以获得离散和定义的TPC-x的库。
36.根据项32或33的方法，其中一种或多种组件C'或一种或多种组件E'编码在项32的步骤a中的两个或更多个单个分析物TCR链的混合池，以获得库，其中所述库包括eTPC-x的混合群，其中每个eTPC-x表达源自在项32的步骤a中使用的池中的单个分析物TCR链。
37.根据项26中所定义的制备eTPC-t的方法，所述方法包括
a.将eTPC-x与一种或多种组件C'或一种或多种组件E'组合，其中一种或多种组件C'或一种或多种E'编码与eTPC-x中整合的分析物TCR链互补的分析物TCR链，并与整合因子组合和至少一种
b.选择基因组接收位点选择标记的丢失
c.选择TCRsp和/或一种或多种CD3蛋白的表面表达的获得
d.选择一个或多个整合选择标记的获得。
38.根据项37的方法，其中包括b和d。
39.根据项37或38的方法，其中一种组件C'或一种组件E'编码在项37的步骤a中的单一分析物TCR链。
40.根据项39的方法，其中所述方法进行多次，其中每次使用独特的分析物TCR链进行项37的步骤a，使得获得表达TCRsp的独特的eTPC-t，以获得离散和限定的eTPC-t的库。
41.根据项37或38的方法，其中所述一种或多种组件C’或一种或多种组件E’编码在项37的步骤a中两个或更多个单个分析物TCR链的混合池，以获得库，其中所述库包含eTPC-t的混合群，其中每个eTPC-t表达源自在项37的步骤a中使用的池中的单个TCRsp。
42.一种eTPC-t，其从根据前述任一项的多组件系统获得，用于表征
a.表达的分析物TCRsp对分析物抗原的特异性和/或
b.表达的分析物TCRsp对分析物抗原的亲和力和/或
c.表达的分析物TCRsp对分析物抗原的信号反应，
其中分析物抗原选自aAPX:aAM和/或aAM和/或aAPX和/或aAPX:CM和/或亲和试剂，其中分析物抗原为至少下列形式：可溶试剂，固定化试剂，由非基于细胞的颗粒(NCBP)呈递，呈递在细胞表面(分析物APC)，其中aAPX:CM是装载有货物分子(CM)的aAPX，并且其中aAPX:aAM是aAPX，其载有aAM作为CM。
43.一种从输入分析物eTPC-t或分析物eTPC-t库中选择一种或多种分析物eTPC-t，以获得结合一种或多种分析物抗原的一种或多种分析物eTPC-t的方法，其中所述方法包括
a.将一种或多种分析物eTPC-t与一种或多种分析物抗原组合，导致分析物eTPC-t呈递的分析物TCRsp与分析物抗原之间接触和至少一种
b.测量一种或多种分析物TCRsp与一种或多种分析物抗原之间的复合体的形成(如果有的话)和/或
c.测量由一种或多种分析物TCRsp与一种或多种分析物抗原之间形成复合体诱导的分析物eTPC-t的信号反应(如果有的话)和/或
d.测量由一种或多种分析物TCRsp与由一种或多种分析物抗原之间形成复合体诱导的分析物APC的信号反应(如果有的话)，
e.从基于步骤b和/或步骤c中选择一个或多个eTPC-t，其中通过阳性和/或阴性测量进行选择
其中分析物抗原选自aAPX:aAM和/或aAM和/或aAPX和/或aAPX:CM和/或亲和试剂，其中分析物抗原是以下列中的至少一种形式：可溶性试剂，固定化试剂，由非基于细胞的颗粒(NCBP)提供，呈递在细胞(分析物APC)表面上，其中aAPX:CM是装载有货物分子(CM)的aAPX，并且其中aAPX:aAM是aAPX，其载有aAM作为CM。
44.根据项43所述的方法，其中所述选择步骤e通过对细胞池进行单细胞分选和/或细胞分选来进行。
45.根据项44的方法，其中所述分选之后是分选的单细胞的扩增。
46.根据项44的方法，其中所述分选之后是扩增分选的细胞池。
47.根据项44至46中任一项的方法，还包括对分选的和/或扩增的细胞的组件B'和/或组件D'进行测序的步骤。
48.根据项47的方法，其中测序步骤之前是以下
a.提取基因组DNA和/或
b.提取组件B'和/或组件D'RNA转录物和/或
c.通过PCR和/或RT-PCR扩增组件B'和/或组件D'的DNA和/或RNA转录物。
49.根据项47或48的方法，其中测序步骤对细胞是破坏性的，并且其中获得的测序信息用于制备在项43的步骤e中选择的分析物eTPC-t。
50.根据项43，44，45，46，49中任一项的方法，其中对所选择的分析物eTPC-t进行亲和力分析以确定TCRsp对分析物抗原的亲和力，其中该方法还包括
a.用浓度范围的分析物抗原标记所选择的分析物eTPC-t
b.对步骤a的染色分析物eTPC-t进行FACS分析
c.确定分析物eTPC-t在分析物抗原浓度范围内的荧光标记强度
d.计算TCRsp对分析物抗原的亲和力。
51.根据项50中任一项的方法，其中步骤b至c用标记的参照进行，并且步骤d使用分析物抗原荧光强度与参照荧光强度的比率计算亲和力。
52.根据项51的方法，其中标记的参照选自
a.用分析物TCR链之一或两个分析物TCR链的亲和试剂标记的分析物eTPC-t
b.用一种或多种CD3蛋白的亲和试剂标记的分析物eTPC-t
c.呈递标记的参照单一TCR链或标记的参照TCR链对的细胞或颗粒。
53.根据项43，44，45，46，49中任一项的方法，其中对所选分析物eTPC-t进行信号反应的表征，其中该方法还包括
a.确定天然信号反应和/或
b.如果eTPC-t含有组件F，则确定合成信号反应。
54.根据项53的方法，其中通过检测与非诱导信号反应状态相比，以下一个或多个中的增加或减少来确定诱导的信号反应
a.分泌的生物分子
b.分泌的化学物质
c.细胞内生物分子
d.细胞内化学物质
e.表面表达的生物分子
f.eTPC-t对APC的细胞毒作用
g.eTPC-t对APC的旁分泌作用，使得在APC中诱导信号反应，并通过检测a-e中任一种的增加或减少来确定
h.eTPC-t的增殖
i.eTPC-t和APC之间的免疫突触形成。
55.一种从输入分析物抗原或分析物抗原库中选择一种或多种分析物抗原以获得一种或多种分析物抗原和/或分析物抗原序列的方法，其形成稳定的复合体和/或诱导表达分析物TCRsp的一种或多种分析物eTPC-t对表达的分析物抗原的信号反应，其中该方法包括
a.将一种或多种分析物抗原与一种或多种分析物eTPC-t组合，导致分析物抗原与一种或多种分析物eTPC-t的分析物TCRsp之间的接触和
b.测量一种或多种分析物抗原与一种或多种分析物TCRsp之间的复合体的形成(如果有的话)和/或
c.测量在分析物TCRsp与分析物抗原之间形成复合体诱导的一种或多种分析物eTPC-t中的信号反应(如果有的话)和/或
d.通过在一种或多种分析物TCRsp与一种或多种分析物抗原之间形成复合体诱导的分析物APC测量信号反应(如果有的话)和
e.从步骤b，c和/或d中选择一种或多种分析物抗原，其中通过阳性和/或阴性测量进行选择
其中分析物抗原选自aAPX:aAM和/或aAM和/或aAPX和/或aAPX:CM和/或亲和试剂，其中分析物抗原是至少以下形式：可溶性试剂，固定试剂，由非基于细胞的颗粒(NCBP)呈递，呈递在细胞表面(分析物APC)上，其中aAPX:CM是载有货物分子(CM)的aAPX，其中aAPX:aAM是aAPX，其载有aAM作为CM。
56.根据项55的方法，其中选择步骤e是通过单细胞分选和/或细胞分选至池进行。
57.根据项56的方法，其中分选之后是分选的单细胞的扩增。
58.根据项56的方法，其中分选之后是扩增分选的细胞池。
59.根据项55至58中任一项的方法，还包括对分选和/或扩增的细胞的分析物抗原进行测序的步骤。
60.根据项59的方法，其中测序步骤之前是以下
a.提取基因组DNA和/或
b.提取分析物抗原RNA转录物和/或
c.通过PCR和/或RT-PCR扩增分析物抗原的DNA和/或RNA转录物。
61.根据项55，56，57，58中任一项的方法，其中基于分析物eTPC-t的信号反应和/或分析物APC的信号反应对所选分析物抗原进行选择，其中该方法还包括
a.确定天然信号传导响应和/或
b.如果分析物eTPC-t含有组件F，确定合成的信号传导响应。
62.根据项61的方法，其中通过检测与非诱导信号反应状态相比，以下一种或多种的增加或减少来确定诱导的信号反应
a.分泌的生物分子
b.分泌的化学物质
c.细胞内生物分子
d.细胞内化学物质
e.表面表达的生物分子
f.分析物eTPC-t对分析物APC的细胞毒作用
g.分析物eTPC-t对分析物APC的旁分泌作用，使得在分析物APC中诱导信号反应，并通过检测a到e的任一项的增加或减少来确定
h.分析物eTPC-t的增殖
i.分析物eTPC-t和分析物APC之间的免疫突触。
63.一种选择和识别aAM货物或CM货物的方法，其中所述货物是代谢物和/或肽，其装载在通过项55-62中限定的方法选择并获得的分析物APC的aAPX中，其中所述方法包括
a.隔离aAPX:aAM或aAPX:CM或货物aM或货物CM和
b.识别装载的货物。
64.根据项63的方法，其中步骤b包括使分离的aAPX:aAM或aAPX:CM经受一个或多个
a.质谱分析
b.肽测序分析。
65.通过项43至54中定义的方法选择的一对TCR链序列或TCR链序列对的库，用于以下至少之一
a.诊断
b.医学
c.化妆品
d.研究与开发。
66.编码所述抗原性分子的抗原性分子和/或ORF，或通过项55至64中定义的方法选择的库，用于以下至少之一
a.诊断
b.医学
c.化妆品
d.研究与开发。
67.一种抗原呈递复合体，其装载有作为货物的抗原分子和/或编码所述复合体的ORF，或其通过如在项55至62中所定义的方法选择的库，用于以下至少之一
a.诊断
b.医学
c.化妆品
d.研究与开发。
68.通过项55至62中定义的方法选择的APC或APC库，用于以下至少之一
a.诊断
b.医学
c.化妆品
d.研究与开发。
68.通过项43至54中定义的方法选择的eTPC-t或eTPC-t库，用于以下至少之一
a.诊断
b.医学
c.化妆品
d.研究与开发。
70.根据项1-26中任一个的系统，用于以下至少之一
a.诊断
b.医学
c.化妆品
d.研究与开发。
71.呈递分析物抗原的NCBP或呈递通过项55至62中定义的方法选择的分析物抗原的NCBP库，用于以下至少之一
a.诊断
b.医学
c.化妆品
d.研究与开发。
Figure IDA0002049710010000011
Figure IDA0002049710010000021
Figure IDA0002049710010000031
Figure IDA0002049710010000041
Figure IDA0002049710010000051
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Figure IDA0002049710010000071
Figure IDA0002049710010000081
Figure IDA0002049710010000091
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Figure IDA0002049710010000221
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Figure IDA0002049710010000501
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Figure IDA0002049710010000571
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Claims (40)

1.一种多组件系统，其中
第一组件是工程化的TCR-呈递细胞(eTPC)，称为组件A，其中组件A缺乏功能形式的分析物抗原呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)中的至少一个家族的内源性表面表达，缺乏TCR链α，β，δ和γ的内源性表达，并表达CD3蛋白，和含有两个另外的单个组件，称为B和D，B和D不同且各自分别是基因组接收位点，用于整合编码至少一个分析物TCR链α，β，δ或γ的单个ORF，和/或编码分析物TCR链对的两个ORF，并且其中基因组接收位点B和D各自选自
a.设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体
b.设计用于定点同源重组的合成构建体；
和
第二组件是基因供体载体，称为组件C，用于递送编码分析物TCR链的ORF，其中组件C与组件B匹配，并且其中组件C设计用于递送至组件B
c.单个编码至少一个分析物TCR链α，β，δ和/或γ的ORF，或
d.两个编码分析物TCR链对的ORF，
并且其中c和d任选地编码整合的选择标记，使得分析物TCR链能表达为与组件A上CD3复合的TCR表面蛋白(TCRsp)。
2.根据权利要求1的多组件系统，其中aAPX家族选自
a.HLA I类
b.HLA II类
c.非HLA抗原呈递复合体。
3.根据权利要求1的多组件系统，其中称为E的另一组件是遗传载体，其中组件E被设计用于递送编码一种分析物TCR链α，β，δ或γ的第一ORF至组件D，使得被整合到组件B的、编码第二分析物TCR链的ORF能够与第一分析物TCR链α，β，δ或γ互补配对，表达这两种ORF以形成在组件A上的TCRsp，并且任选地，其中组件E编码整合选择标记。
4.根据前述权利要求中任一项的多组件系统，其中组件A还含有称为F的组件，其是一种合成的基因组TCR-刺激响应元件，选自：
a.单组件合成构建体，其含有至少一种天然启动子和/或至少一种合成启动子和至少一种报道分子
b.多组件合成构建体，其设计为具有至少一种天然启动子和/或至少一种合成启动子和至少一种报道分子，
并且其中a和/或b的活化依赖于选自合成途径、天然途径或其组合的至少一种信号转导途径。
5.根据权利要求1的多组件系统，其中包括基因组接收位点B和D，并且它们两者均是设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体。
6.根据权利要求1所述的多组件系统，其中aAM选自
a.从分析物抗原分子ORF翻译的多肽或多肽复合体
b.衍生自从分析物抗原分子ORF翻译的多肽的肽
c.衍生自改变工程化的TCR-呈递细胞(组件A)蛋白质组的肽
d.衍生自改变工程化的TCR-呈递细胞(组件A)蛋白质组的多肽
e.衍生自改变工程化的TCR-呈递细胞(组件A)代谢物组的代谢物。
7.根据权利要求1所述的多组件系统，其中组件A表达CD4和/或CD8。
8.根据权利要求7所述的多组件系统，其中组件A表达另外的TCR共同受体。
9.根据权利要求8的多组件系统，其中组件A表达CD28和/或CD45。
10.根据权利要求2所述的多组件系统，其中组件B和/或D被包括并且包含至少一种下列遗传元件
a.异种特异性重组酶位点
b.同源臂
c.真核启动子
d.真核条件调控元件
e.真核终止子
f.选择标记
g.剪接受体位点
h.剪接供体位点
i.非蛋白质编码基因
j.绝缘子
k.移动遗传元件
l.大范围核酸酶识别位点
m.内部核糖体进入位点(IRES)
n.病毒自切割肽元件
o.kozak共有序列。
11.根据权利要求1的多组件系统，其中组件C包含至少一种下列遗传元件
a.异种特异性重组酶位点
b.同源臂
c.真核启动子
d.真核条件调控元件
e.真核终止子
f.选择标记
g.整合选择标记
h.剪接受体位点
i.剪接供体位点
j.非蛋白质编码基因
k.绝缘子
l.移动遗传元件
m.大范围核酸酶识别位点
n.内部核糖体进入位点(IRES)
o.病毒自切割肽元件
p.抗生素抗性盒
q.细菌复制起点
r.酵母复制起点
s.克隆位点
t.kozak共有序列。
12.根据权利要求3的多组件系统，其中组件E包含至少一种下列遗传元件
a.异种特异性重组酶位点
b.同源臂
c.真核启动子
d.真核条件调控元件
e.真核终止子
f.选择标记
g.整合选择标记
h.剪接受体位点
i.剪接供体位点
j.非蛋白质编码基因
k.绝缘子
l.移动遗传元件
m.大范围核酸酶识别位点
n.内部核糖体进入位点(IRES)
o.病毒自切割肽元件
p.抗生素抗性盒
q.细菌复制起点
r.酵母复制起点
s.克隆位点
t.kozak共有序列。
13.根据权利要求1的多组件系统，其中组件B和/或D用于单个ORF的RMCE整合，并包含：
a.真核启动子
b.一对异种特异性重组酶位点
c.Kozak共有序列
d.选择标记
e.真核终止子。
14.根据权利要求1的多组件系统，其中组件C用于单个ORF的RMCE整合，并包含以下遗传元件：
a.一对异种特异性重组酶位点
b.Kozak共有序列
c.抗生素抗性盒
d.细菌复制起点
e.用于引入编码一个或多个TCR链和/或整合选择标记的单个ORF的克隆位点。
15.根据权利要求3的多组件系统，其中组件E用于单个ORF的RMCE整合，并包含以下遗传元件：
a.一对异种特异性重组酶位点
b.Kozak共有序列
c.抗生素抗性盒
d.细菌复制起点
e.用于引入编码一个或多个TCR链和/或整合选择标记的单个ORF的克隆位点。
16.根据权利要求1的多组件系统，其中组件C是遗传供体载体，其包含至少一种编码至少一种分析物TCR链的ORF，该载体称为组件C'。
17.根据权利要求3的多组件系统，其中组件E是遗传供体载体，其包含至少一种编码至少一种分析物TCR链的ORF，该载体称为组件E'。
18.根据权利要求16的多组件系统，其包含组件C'的库。
19.根据权利要求17的多组件系统，其包含组件E'的库。
20.根据权利要求16的多组件系统，其中所述分析物TCR链编码序列衍生自
a.来自原代T细胞的TCR链ORF序列的配对克隆
b.来自原代T细胞的TCR链ORF序列的未配对克隆
c.合成的TCR链ORF序列。
21.根据权利要求17的多组件系统，其中所述分析物TCR链编码序列衍生自
a.来自原代T细胞的TCR链ORF序列的配对克隆
b.来自原代T细胞的TCR链ORF序列的未配对克隆
c.合成的TCR链ORF序列。
22.根据权利要求16-21中任一项的多组件系统，其中一种或多种组件C'和/或E'能够与组件A组合，以将在组件C'和/或E'中编码的两个互补分析物TCR链整合到组件B和/或D中，以获得称为eTPC-t的细胞，其中组件B和/或D变成组件B'和/或D'，使得它在组件A的表面上表达TCRsp。
23.根据权利要求16-21中任一项的多组件系统，其中组件C'或E'之一能够与组件A组合，以将在组件C'或E'中编码的一种分析物TCR链整合到组件B或D中，以获得称为eTPC-x的细胞，其中组件B或D变成组件B'或D'，使得eTPC-x表达单个TCR链。
24.根据权利要求18-21中任一项的多组件系统，其中组件C'或E'之一能够与eTPC-x组合，以将在组件C'或E'中编码的与在eTPC-x中表达的TCR链互补的一个分析物TCR链整合到eTPC-x的组件B或D中，以获得eTPC-t，其中组件B或D成为组件B'或D'，使得它在eTPC-t的表面上表达TCRsp。
25.制备如权利要求22中定义的eTPC-t的方法，所述方法包括：
a.将组件A与组件C'和/或E'中的至少一种组合，其中一种或多种组件C'和/或E'编码一种或多种互补分析物TCR链对，并与整合因子组合和至少一个
b.选择基因组接收位点选择标记的丢失
c.选择TCRsp和/或一个或多个CD3蛋白的表面表达的获得
d.选择一个或多个整合选择标记的获得。
26.根据权利要求25的方法，其中所述一个或多个组件C'和/或E'编码在步骤a中的单个互补TCR链对。
27.根据权利要求26的方法，其中所述方法进行多次，其中每次步骤a使用不同的单个互补TCR链对进行，使得获得不同的eTPC-t，以获得离散和定义的eTPC-t库。
28.根据权利要求26的方法，其中在权利要求26的步骤a中所述一种或多种组件C’和/或E’编码两个或更多个不同的互补TCR链对的混合池，以获得库，其中所述库包含eTPC-t的混合群，其中每个eTPC-t表达源自在权利要求27的步骤a中使用的池的单个TCRsp。
29.制备如权利要求23中定义的eTPC-x的方法，该方法包括：
a.将组件A与一种或多种组件C'或一种或多种组件E'组合，其中一种或多种组件C'或一种或多种E'编码分析物TCR链，并与整合因子组合以及至少一个
b.选择基因组接收位点选择标记的丢失
c.选择一个或多个整合选择标记的获得。
30.根据权利要求29的方法，其中一种组件C’或一种组件E’编码在步骤a中的单个分析物TCR链。
31.根据权利要求29的方法，其中所述方法进行多次，其中每次步骤a使用不同的分析物TCR链进行，使得获得不同的eTPC-x，以获得离散和定义的eTPC-x库。
32.根据权利要求29的方法，其中在步骤a中一种或多种组件C'或一种或多种组件E'编码两个或更多个单个分析物TCR链的混合池，以获得库，其中所述库包含eTPC-x混合群，其中每个eTPC-x表达源自在步骤a中使用的池的单个分析物TCR链。
33.制备如权利要求22中定义的eTPC-t的方法，所述方法包括：
a.将eTPC-x与一种或多种组件C'或一种或多种组件E'组合，其中一种或多种组件C'或一种或多种E'编码与eTPC-x中的整合的分析物TCR链互补的分析物TCR链，并与整合因子组合以及至少一个
b.选择基因组接收位点选择标记的丢失
c.选择TCRsp和/或一个或多个CD3蛋白的表面表达的获得
d.选择一个或多个整合选择标记的获得。
34.根据权利要求33的方法，其中在步骤a中一种组件C'或一种组件E'编码单个分析物TCR链。
35.根据权利要求33的方法，其中所述方法进行多次，其中每次步骤a使用不同的分析物TCR链进行，从而获得表达TCRsp的不同的eTPC-t，以获得离散的和定义的eTPC-t的库。
36.根据权利要求33的方法，其中在步骤a中一种或多种组件C'或一种或多种组件E'编码两个或更多个单一分析物TCR链的混合池，以获得库，其中所述库包含eTPC-t的混合群，其中每个eTPC-t表达源自在步骤a中使用的池的单个TCRsp。
37.一种eTPC-t，其从根据权利要求1-24任一项的多组件系统获得，用于eTPC:抗原分析装置中以表征
a.表达的分析物TCRsp对分析物抗原的特异性，和/或
b.表达的分析物TCRsp对分析物抗原的亲和力，和/或
c.表达的分析物TCRsp对分析物抗原的信号反应，
其中分析物抗原选自aAPX:aAM和/或aAM和/或aAPX和/或aAPX:CM和/或亲和试剂，其中分析物抗原是至少以下形式：可溶性试剂，固定化试剂，由非基于细胞的颗粒(NCBP)呈递，呈递在分析物APC的细胞表面上，其中aAPX:CM是载有货物分子(CM)的aAPX，且其中aAPX:aAM是aAPX，其载有aAM作为CM。
38.根据权利要求1的多组件系统，用于产生至少一种分析物eTPC-t。
39.一种分析物eTPC，其特征在于它缺乏分析物抗原呈递复合体(aAPX)和/或分析物抗原分子(aAM)中的至少一个家族的内源性表面表达，以及它
a.含有2个基因组接收位点，称为B和D，每个位点包含编码至少一个分析物TCR链α，β，δ或γ的单个ORF，或编码一对分析物TCR链的两个ORF
b.表达CD3蛋白
c.不表达除B和D中包含的TCR链以外的任何其他TCR链，
并且其中基因组接收位点B和D各自选自
a.设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体
b.设计用于定点同源重组的合成构建体。
40.一种分析物eTPC，其从如权利要求1-24中任一项所定义的多组件系统中获得，其特征在于它
a.含有2个基因组接收位点，称为B和D，每个位点包含编码至少一个分析物TCR链α，β，δ或γ的单个ORF，或编码一对分析物TCR链的两个ORF，
b.表达CD3蛋白，
c.不表达除B和D中包含的TCR链以外的任何其他TCR链，
并且其中基因组接收位点B和D各自选自
a.设计用于重组酶介导的盒交换(RMCE)的合成构建体，
b.设计用于定点同源重组的合成构建体。
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