JP6858266B2 - T細胞レセプター、t細胞抗原及びそれらの機能的相互作用の同定及び特徴決定のための遺伝子操作された多成分システム - Google Patents
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Description
本発明は、少なくとも、遺伝子操作されたT細胞レセプター(TCR)提示細胞(eTPC)、遺伝子操作されたゲノム受容部位及びマッチする遺伝子ドナーベクターである3つの成分で構成される多成分システムの構築、組立て及び使用に関する。本発明は、TCR対タンパク質の同定及び特徴決定のための、全長TCR対を被分析物抗原に提示する安定な派生細胞(eTPC-t)の迅速で高スループットな作製に用いられる。具体的には、eTPCは、CD3複合体の全ての成分を構成的に発現するが、TCRα、β、γ及びδ鎖の内因性発現を欠く。eTPCはまた、分析ワークフローにおけるeTPCによる抗原自己提示の可能性のあるバックグランドを排除するために、主要抗原提示複合体の発現を欠く。加えて、eTPCは、少なくとも1つの遺伝子操作されたゲノム受容部位を含有する。この部位は、TCR対をコードし、マッチした遺伝子ドナーベクターにより送達される遺伝物質の迅速で安定な組込みに用いられる。eTPCはまた、TCR刺激の検出のための任意成分 TCR刺激応答エレメントを含んでいてもよい。多成分システムは、臨床免疫診断における分析システムとして用いてもよい。更に、本発明は、診断、医学、美容及び研究開発のためにT細胞抗原及び同族TCRを同定し、特徴付けるための多成分システムの使用に関する。
Tリンパ球(T細胞)による免疫監視機構は、全ての有顎脊椎動物の適応免疫における中心的な機能である。T細胞による免疫監視機構は、T細胞サブタイプにわたる豊富な機能的多様性を介して達成され、該T細胞サブタイプは、病原体感染及び腫瘍性細胞の排除に貢献し、侵入病原体、共生微生物、食物の分子成分のような共生非自己因子に対する適応免疫応答を組織化し、更には自己の免疫寛容を維持する。様々な外来及び自己因子に応答するために、T細胞は、これらの外来及び自己因子の分子構成成分を特異的に検出できなければならない。よって、T細胞は、個体が遭遇する自己及び非自己分子の大多数を、病原性生物及び病的な自己に対する有効な応答を開始するために十分な特異性を持って、健常な自己に対するそのような応答の開始を回避しながら検出できなければならない。この任務の非常に複雑な性質は、外来及び自己の分子の両方の実際的に無限の多様性を考慮した場合に明らかになり、病原性生物は、T細胞による検出を逃れるための進化圧力の下にある。
T細胞は、主として、T細胞レセプター(TCR)の発現により規定される。TCRは、T細胞適応免疫の標的と相互作用しそれを感知する役割を担うT細胞の成分である。一般的に言えば、TCRは、細胞表面で提示されるヘテロ二量体タンパク質複合体で構成される。2つのTCR鎖の各々は、共に免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)ドメインに属し、逆並行βシートを形成する可変(V)領域及び定常(C)領域である2つの細胞外ドメインで構成される。これらは、短い細胞質尾部に隣接するI型膜貫通ドメインにより細胞膜に係留されている。多様な分子構成成分に適応してそれを検出するT細胞の素質は、T細胞発生中に生じるTCR鎖におけるバリエーションから生じる。このバリエーションは、B細胞における抗体発生に類似の様式で体細胞組換えにより生じる。
T細胞プールは、幾つかの機能及び表現型が不均質な下位集団からなる。しかし、T細胞は、その表面で発現される体性再編成TCRアイソフォームに従ってαβ又はγδに大きく分類できる。2つのTCR鎖対アイソフォーム、すなわちTCRα(TRA)とTCRβ(TRB)との対、及びTCRガンマ(TRG)とTCRデルタ(TRD)との対が存在する。TRA:TRB対を発現するT細胞はαβT細胞と呼ばれ、TRG:TRD対を発現するT細胞は、しばしばγδT細胞と呼ばれる。
αβ及びγδ形のTCRは、共に多様なリガンド、すなわち「抗原」の認識を担い、各T細胞は、T細胞成熟中にαβ又はγδレセプター鎖を新たに生じる。これらの新たなTCR鎖対は、体細胞V(D)J組換えと呼ばれるプロセスにおいてレセプター配列多様性を生じることにより認識の多様性を達成し、体細胞V(D)J組換えの後に各T細胞は、別個に再編成された単一TCRのコピーを発現する。TRA及びTRG遺伝子座では、幾つかの分離した可変(V)及び機能的(J)遺伝子セグメントが組換えのために利用可能であり、定常(C)遺伝子セグメントに並置されるので、VJ組換えと呼ばれる。TRB及びTRD遺伝子座での組換えは、更に、多様性(D)遺伝子セグメントを含むので、VDJ組換えと呼ばれる。
組換えられた各TCRは、αβT細胞の場合にα及びβ鎖、又はγδT細胞の場合にγ及びδ鎖により形成されるリガンド結合部位の構造により決定される、ユニークなリガンド特異性の能力を有する。TCRの構造多様性は、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる、各鎖の3つの短いヘアピンループに主に限定される。3つのCDRは、レセプター鎖対の各鎖からもたらされ、これらの6つのCDRループはまとめて、TCR細胞外ドメインの膜から遠い末端に存在して、抗原結合部位を形成する。
各TCR鎖における配列多様性は、2つの形態で達成される。第一に、組換えのための遺伝子セグメントの無作為選択は、基本的な配列多様性をもたらす。例えば、TRB組換えは、47のユニークV、2のユニークD及び13のユニークJ生殖系列遺伝子セグメントの間で起こる。一般的に、V遺伝子セグメントは、CDR1及びCDR2ループの両方に貢献し、よって生殖系列にコードされている。配列多様性を生じるための第2の形態は、組み換えられるV、(D)及びJ遺伝子セグメントの間の接合部にて鋳型ヌクレオチドの無作為欠失及び非鋳型ヌクレオチドの付加により生じる超可変CDR3ループ内で起こる。
成熟αβ及びγδTCR鎖対は、ε、γ、δ及びζと呼ばれる幾つかのアクセサリーCD3サブユニットと一緒に複合体として細胞表面にて提示される。これらのサブユニットは、αβ又はγδTCRと一緒に3つの二量体(εγ、εδ、ζζ)として会合する。このTCR:CD3複合体は、αβ又はγδTCRと同族抗原との結合の際に細胞シグナル伝達応答を開始するためのユニットを形成する。TCR:CD3複合体として結合したCD3アクセサリーは、免疫レセプター活性化チロシンモチーフ(ITAM)と呼ばれるシグナル伝達モチーフに貢献する。
CD3ε、CD3γ及びCD3δは各々、単一のITAMに貢献するが、CD3ζホモ二量体は3つのITAMを含む。TCRと共に組み立てられる3つのCD3二量体(εγ、εδ、ζζ)は、よって、10のITAMに貢献する。同族抗原とのTCRライゲーションの際に、直列型チロシン残基のリン酸化は、重要な70kDaのζ鎖関連タンパク質(ζ-chain-associated protein of 70 kDa;ZAP-70)のようなSrcホモロジー2(Scr homology 2;SH2)ドメインを含むタンパク質のための対形成したドッキング部位を創出する。このようなタンパク質の動員は、T細胞活性化及び分化を最終的に担うTCR:CD3シグナル伝達複合体の形成を開始する。
αβT細胞は、一般的に、ヒトにおいて、対応するγδT細胞よりも豊富に存在する。αβT細胞の多くは、細胞表面でHLA複合体により提示されるペプチド抗原と相互作用する。ペプチド-HLA(pHLA)認識T細胞は、最初に記述され、最もよく特徴決定されている。αβT細胞のより稀な形も記述されている。粘膜関連インバリアントT(MAIT)細胞は、比較的限定されたα及びβ鎖多様性を有するとみられ、タンパク質断片よりもむしろ細菌代謝産物を認識する。インバリアントナチュラルキラーT細胞(invariant natural killer T-cell;iNK T細胞)及び生殖系列によりコードされるミコリル反応性T細胞(germline-encoded mycolyl-reactive T-cell;GEM T細胞)は、非HLA分子により交差提示される糖脂質の認識に限定される。iNK T細胞は、大部分が、CD1dにより提示される糖脂質と相互作用すると考えられるが、GEM T細胞細胞は、CD1bにより提示される糖脂質と相互作用する。更に別の形のT細胞は、CD1a及びCD1cに関連付けられた糖脂質と相互作用すると考えられるが、このような細胞は、まだ詳細に特徴決定されていない。
ほとんどのαβT細胞の重要な特徴は、HLA分子に関連したペプチド抗原の認識である。これらは、しばしば、「通常型」αβT細胞と呼ばれる。個体内で自己HLA分子は、自己及び外来タンパク質からのペプチドをT細胞に提示し、悪性病変及び外来病原体に対する適応免疫、共生生物、食物及び自己に向けての適応寛容のための必須の基礎を提供する。HLAタンパク質をコードするHLA遺伝子座は、ヒトゲノムのうちで最も遺伝子密度が高く、多型性の領域であり、ヒトにおいて12,000を超えるアレレが記載されている。HLA遺伝子座における多型の程度が高いことにより、個体間のペプチド抗原提示の多様性が確実になり、このことは、集団レベルでの免疫のために重要である。
2つの形の古典的HLA複合体、すなわちHLAクラスI(HLAI)及びHLAクラスII(HLAII)が存在する。3つの古典的HLAI遺伝子、すなわちHLA-A、HLA-B及びHLA-Cが存在する。これらの遺伝子は、インバリアントβ2ミクログロブリン(β2M)鎖と会合する膜貫通型α鎖をコードする。HLAIα鎖は、免疫グロブリンフォールド型の3つのドメイン、すなわちα1、α2及びα3で構成される。α3ドメインは、膜の近くにあり、大部分がインバリアントであるが、α1及びα2ドメインは一緒になって、多型の膜から遠くにある抗原結合窩を形成する。6つの古典的HLAII遺伝子、すなわちHLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRA及びHLA-DRB1が存在する。これらの遺伝子は、α鎖及びβ鎖を含む、対形成したDP、DQ及びDRヘテロ二量体HLA複合体をコードする。各鎖は、免疫グロブリンフォールド型の2つの主要な構造ドメインを有し、ここで、α2及びβ2ドメインは、HLAIα3ドメインのものに類似の、膜に近い大部分がインバリアントのモジュールを含む。HLAIIα2及びβ2ドメインは一緒になって、膜から遠くにある抗原結合窩を形成し、多型性が高い領域である。
HLAI及びHLAIIの抗原結合窩は、8つの逆平行βシートのプラットフォーム上に2つの逆平行αヘリックスを含む。この窩において、ペプチド抗原が結合し、伸ばされた立体構造で提示される。HLAI及びHLAIIにおけるペプチド接触残基は、ほとんどの配列多型の場所であり、これは、異なるHLAアレレにより提示される多様なペプチドレパートリーの分子的基礎を構成する。ペプチドは、抗原結合窩と広範囲で接触し、その結果、各HLAアレレは、提示されたペプチドに対する別個の配列制約及び優先性を課す。所定のペプチドは、よって、限定された数のHLAとだけ結合し、相互的に、各アレレは、所定のタンパク質からのペプチドコレクションの特定の画分だけを受け入れる。各個体に存在するHLAI及びHLAIIアレレのセットは、HLAハプロタイプと呼ばれる。HLAI及びHLAII遺伝子の多型並びに遺伝性のアレレの相互優性発現は、ヒト集団全体にわたるHLAハプロタイプの非常に大きい多様性を駆動し、これは、αβTCRの莫大な配列多様性と組み合わせた場合に、これらのHLA-抗原-TCR相互作用の分析の標準化のために大きな障害となる。
αβTCRは、HLA及びペプチド抗原(変化した自己)の両方の残基により形成される混合pHLA結合界面の一部としてペプチドを認識する。HLAI複合体は、ほぼ全ての有核細胞の表面に提示され、内因性タンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。T細胞は、よって、相互作用細胞のpHLAI複合体をサンプリングすることにより、HLAI提示細胞の内因性細胞性プロテオームを調べることができる。HLAIの結合は、相互作用T細胞によるTCR共レセプターCD8の発現を必要とするので、HLAIサンプリングは、CD8+αβT細胞に制限される。これとは対照的に、HLAII複合体の表面発現は、プロフェッショナルAPCに主に制限され、提示細胞にとって外因性のタンパク質に由来するペプチドを提示すると一般的に考えられている。相互作用T細胞は、よって、提示細胞が存在する細胞外微小環境のプロテオームを調べることができる。HLAIIの結合は、相互作用T細胞によるTCR共レセプターCD4の発現を必要とするので、HLAIIサンプリングは、CD4+αβT細胞に制限される。
上記のαβTCRの役割は、pHLA複合体の検出であり、TCR提示T細胞は、確立された免疫におけるそのT細胞の役割と密接な関係がある応答を高めることができる。個体において生じたαβTCRレパートリーは、特定のハプロタイプと関連して、多様性が実際に起こる前に遭遇する可能性が高い全ての外来抗原の巨大で予測できない多様性の理由であるはずである。この結果は、自己pHLAとの強い相互作用を回避するように特異的に教授されただけで特定されていないpHLA複合体を認識する能力を有して非常に多様で多数のαβTCRがある程度無作為化された様式で生じる背景に対して達成される。これは、胸腺選択と呼ばれるプロセスにおいてT細胞成熟中に注意深く調整される。
胸腺におけるT細胞成熟の第1の工程中に、十分な親和性をもって自己pHLA複合体と相互作用できないαβTCRを有するT細胞は、生存シグナルを奪われ、排除される。ポジティブ選択と呼ばれるこの工程により、正しいHLAに関連付けられて提示される外来又は変化したペプチドを少なくとも認識できる可能性があるTCRレパートリーを生存T細胞が確実に有することになる。その後、自己pHLAと強く相互作用し、よって自己免疫を駆動する能力を有するαβTCRは、ネガティブ選択のプロセスにより能動的に除去される。ポジティブ及びネガティブ選択のこの組合せは、末梢にある自己pHLAに対する低い親和性を有するαβTCRを有するT細胞だけをもたらす。これは、自己に制限されるが自己反応性ではないαβT細胞レパートリーを確立する。HLAハプロタイプに対するT細胞発生のこの高度に個別化された性質は、αβTCR-抗原-HLA相互作用の標準化された分析における困難を強調する。更に、これは、移植片拒絶及び移植片対宿主病の両方の基礎、並びに一個体において同定されるαβTCRが第2の個体において完全に異なる影響を有し得るという一般的な原理の基礎を形成し、このことは、実際の臨床において現れるTCRベース及びT細胞ベースの治療及び診断方策について明確な意味を有する。
αβT細胞の非HLA拘束又は「非通常型」の形は、非常に異なる分子抗原標的を有する。これらの非通常型αβT細胞は、古典的HLA複合体を結合させないが、CD1ファミリー又はMR1のような保存されたHLA様タンパク質を結合させる。CD1ファミリーは、抗原交差提示に関与する4つの形(CD1a、b、c及びd)を含む。これらの細胞表面複合体は、HLAIによく似たα鎖を有し、これがβ2Mとヘテロ二量体を形成する。α鎖の膜から遠い表面で提示される小さい疎水性ポケットは、病原体由来の脂質ベースの抗原のための結合部位を形成する。自然様NK T細胞(innate like NK T-cell;iNK T細胞)は、脂質/CD1ファミリー認識の最もよく理解された例であり、GEM T細胞は、別の顕著な例を表す。「I型」iNK T細胞は、CD1dに関連付けられた脂質α-GalCerと強く相互作用することが知られている。これらのiNK T細胞は、固定されたTCRα鎖(Vα10/Jα18)及び限定された数のβ鎖(制限されたvβ使用を有する)を有する非常に限定されたTCR多様性を示し、これらは、Toll様及びNod様レセプターのような自然の病原体関連分子パターン(PAMPS)認識レセプターになぞらえられている。これとは対照的に、「II型」NK T細胞は、より多様なTCRレパートリーを示し、より多様な形態のCD1d-脂質複合体結合を有するとみられる。GEM T細胞は、CD1bにより提示されるマイコバクテリア由来糖脂質を認識するが、CD1a、b及びcによる抗原提示並びにそれらのT細胞認識の分子的な詳細は、理解され始めたばかりである。
MAIT細胞は、インバリアントTCRα鎖(TRAJ33、TRAJ20又はTRAJ12とライゲーションされたTRAV1-2)を主に発現し、該鎖は、一連のTCRβ鎖と対形成できる。ペプチド又は脂質の代わりに、MAIT TCRは、HLAI様分子であるMR1により提示される病原体由来葉酸及びリボフラビンベースの代謝産物と結合できる。MAIT TCRについて観察されるTCRにおける限定されているが著しい多様性は、保存されたMR1に関連付けられた多様であるが相関する代謝産物の認識を可能にするとみられる。
非古典的HLA拘束αβT細胞TCRがどのようにして成熟中に胸腺において選択されるのか、よく理解されていない。しかし、上で概説したネガティブ及びポジティブ選択の基本的なプロセスが当てはまるようであり、胸腺内で特殊化した適所においてこのことが生じることを示唆するいくらかの証拠がある。
αβTCR発生及びpHLA結合の詳細な機械論的理解とは対照的に、抗原標的及びそれらのγδT細胞対応物の関係性については比較的ほとんど知られていない。このことは、循環T細胞区画中のそれらの量が比較的低いことが理由の一つである。しかし、γδT細胞は、厳密にHLA拘束されないと広く考えられており、抗体と同様に、より自由に表面抗原を認識するとみられる。加えて、より最近では、γδT細胞は、外来抗原との免疫系の主な相互作用部位である上皮組織の常在型T細胞区画を支配できることが認識されるようになってきている。更に、γδT細胞腫瘍免疫監視及び調節不全になった自己のその他の形の監視機構についての様々な機序が文献において明らかにされ始めている。自然様及び適応γδT細胞の両方の特異的抗原標的は、まだほとんど定義されていないが、PAMPの組織分布及び迅速な認識は、外来抗原に対する応答の初期及び適応免疫系がまだ成熟中の生命の初期の両方におけるγδT細胞の基本的な役割を示唆する。
γδT細胞の多様な機能は、異なるVγVδ遺伝子セグメント使用に基づくとみられ、γδT細胞が主にインバリアントTCRと一緒に、感染中の非常に初期にPAMPの自然様認識を媒介する2つの主なカテゴリーにおいて広く理解できる。PAMP以外に、これらのタイプのγδT細胞は、更に、細胞ストレス、感染及びおそらく腫瘍発生の非常に初期のサインを与え得るリン酸抗原を含む自己分子を認識すると考えられている。PAMP及びこのようないわゆる損傷関連分子パターン(danger associated molecular pattern;DAMPS)並びに多数の組織拘束自然様γδT細胞の認識は、これらの細胞が、予め活性化、ホーミング及びクローン増殖を必要とせず抗原負荷に対して迅速に応答するのに適していることを強く示唆する。
T細胞及びTCRとの関係において、抗原は、TCRと結合でき、T細胞内のシグナル伝達をもたらす任意の分子と定義できる。最もよく特徴決定されているT細胞抗原は、HLAI及びHLAII複合体において提示され、通常型αβT細胞と結合するペプチドである。しかし、近年、非通常型αβT細胞及びγδT細胞が抗原として広範囲の生体分子、例えば脂質、リポペプチド、糖ペプチド、糖脂質並びに一連の代謝産物及び異化産物を結合できることが明らかになってきた。更に、γδT細胞が、抗体様の様式で完全にフォールドされたタンパク質と直接結合できることが明らかになってきた。よって、T細胞抗原がHLAにより提示されるペプチドに主に拘束されるという視点は、過去20年間で、ほぼ全ての生体分子を含むように拡大されている。この概念を念頭に置いて、何を抗原提示細胞(APC)と考えることができるかを定義することが適切である。
抗原及び抗原提示細胞
初代T細胞の養子移入は、免疫不全患者にウイルス免疫を与えるために、ウイルス抗原に向かう、エクスビボで増殖させたT細胞をまず用いて、1990年代初期に臨床背景において初めて試験された。特定のがん抗原に対してエクスビボで増殖させた初代T細胞を用いる同様のアプローチが、そのすぐ後に悪性腫瘍の処置において試験された。現在でも課題であり続けるこれらの初期のアプローチにおけるある限界は、治療製品において組成を精細に最適化する必要性と対立する、T細胞の性質及び多様性についての理解の欠如である。現在、エクスビボで増殖させた初代T細胞の使用は、ウイルス抗原に対する特異性を有する初代T細胞を用いる一握りのイニシアティブ以外は、製薬業界においてほぼあきらめられている。
関連する観点において、臨床診断目的のために特定のTCR配列の量の検出を用いることに対する興味が増加している。特にディープシーケンシング法の台頭につれて、ある個体内の全体の、そして特定の関係におけるマッチするαβ対についての完全なTCR多様性を把握することが可能である。このことは、患者における疾患関連抗原に対する免疫応答の確立のための代理の読み出しとして、増殖したT細胞クローンの量を単に検出することにより特定の状態及び疾患状態を診断するための手段になる可能性がある。しかし、このような包括的なアプローチは、確立された臨床タイムポイントを有する非常に強い免疫応答に現在のところ限定されており、配列決定により同定された任意の特定のTCRの特異的抗原標的を同定することの根底にある困難に苦しんでいる。
適応免疫応答を活用する基本的な強さは、TCR-抗原相互作用の精巧な特異性が、各病原体、がん細胞又は自己免疫疾患に特異的に関連する抗原についての詳細な知識を必要とするという中心的な技術的困難と言い換えられる。更に、各抗原は、特異的抗原提示複合体又はそのアレレにより提示され得るので、抗原の発見は、関連する各HLA遺伝子及びアレレについて行わなければならない。強い適応免疫応答と関連し、保存されたエピトープ応答階層を一般的に示すHIV、インフルエンザ及びCMVのような幾つかの感染性疾患について、最も重要なエピトープが、幾つかの一般的なHLAと関連付けられてマッピングされている。同様に、がん、アレルギー及び自己免疫の分野において、関連T細胞抗原をマッピングする系統的な試みが増えてきている。しかし、これらは、困難な手順であり、異なる臨床状況と関連するT細胞抗原を系統的に表す努力は、効率的で確固とした迅速で適応性のあるプロトコールが存在しないことにより妨げられている。
特に、がん細胞は、困難で重要な態様である。なぜなら、悪性細胞の表面で提示されるペプチドのほとんどは自己抗原であるか又は自己抗原に非常に類似しているからである。よって、胸腺選択は、これらのペプチドを強く認識しうるTCRを削除するであろう。それと同時に、腫瘍は免疫認識を逃れるように発展する。このことは、確立された腫瘍に対する有力な免疫応答が比較的稀であり、標的を予測又は発見することが難しいことを意味する。しかし、これらの応答は存在し、そして重要なことには、通常、よりよい結果と関連している。このような応答の標的、腫瘍関連抗原(TAA)は、ほとんどの場合、自己からの区別可能な特徴を有し、がん発展中に過剰発現されるか、発展のこの段階では細胞型に存在しないか、又は遺伝子変異若しくは翻訳後改変、例えばリン酸化により特異的に変更されたタンパク質に由来する。
細胞療法の可能性及び確認された標的の欠如に鑑みて、見込のあるTCR抗原の同定は、いまだに、特に癌を処置するための努力におけるTCRに基づく免疫療法の最も急を要する障害の一つである。
全体として、TCRに基づく療法の発展はまだその初期段階であり、限定された成功しかしていない。とてつもない可能性があるが、診断的アプローチは、患者の疾患状態又は療法に対する応答を評価することを目的とする比較臨床研究においてほとんど実施されていない。天然型TCR鎖対の安定した捕捉と、高スループットにて細胞同士のコミュニケーションの機能的関係におけるTCR-抗原相互作用の系統的な分析とについて十分に発展していない技術は、TCRに基づく療法及び診断の発展のための主な障害である。
最近まで、細胞との関係での単離TCR配列の詳細な機能解析は、初代T細胞又は不死T細胞株への分析物TCR鎖対のトランスフェクションと、細胞活性化の伝統的なフローサイトメトリ分析による細胞応答の検出又は抗原負荷の際のトランスフェクションされた細胞から分泌される因子の検出という面倒なプロトコールにより制限されてきた。Guoらによる最近の発表において、単細胞からの対形成したTCR鎖の迅速なクローニング、発現及び機能的特徴決定が報告された(Molecular Therapy - Methods and clinical development (2016) 3:15054)。この研究では、分析物ヒトαβTCR対を、αβTCR発現が欠如したレポーター細胞株で発現させているが、これは、TCR刺激の際に活性化されるNur77プロモーターと連結した緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター系を含んでいた。この系は、レポーター細胞株ゲノムへの標準化されたTCR組込みの欠如のために、まだ非効率であり、APCエレメントによる細胞に結合した抗原負荷のための系統的な方法を提供しない。
本発明は上記の必要性に取り組むものである。詳細には、本発明は、TCR及びT細胞抗原の発見及び特徴決定に用いられる、遺伝子操作された多成分細胞システムの構築及び使用に関する。多成分システムは、少なくとも、遺伝子操作されたT細胞レセプター(TCR)提示細胞(eTPC)、遺伝子操作されたゲノム受容部位及びマッチする遺伝子ドナーベクターである3つの成分で構成される。本発明は、全長TCR対を被分析物抗原に提示する安定な派生細胞(eTPC-t)の迅速で高スループットな作製に用いられる。加えて、eTPCは、少なくとも1つの遺伝子操作されたゲノム受容部位を含有する。この部位は、TCR対をコードし、マッチした遺伝子ドナーベクターにより送達される遺伝物質の迅速で安定な組込みに用いられる。eTPCはまた、TCR刺激のインビトロ検出のための任意成分 TCR刺激応答エレメントを含んでいてもよい。多成分システムは、臨床免疫診断における分析システムの鍵となるTCR中心エレメントを編成するために用いてもよい。更に、本発明は、前記同定され特徴付けられたTCR対配列の、免疫療法剤及び免疫診断剤の製造のための使用に関する。
ベクタープールからTCR ORFを単一コピーで組み込む能力により、いわゆる「ショットガン組込み」(ドナーベクターが組み込まれた各細胞は、多様なTCR ORF集団をコードする可能性があるベクターのライブラリーから単一ORFのみを受容し得る)が可能となる。このことにより、ドナーベクターにコードされるTCR ORFライブラリーを、細胞表面に単一の所望の被分析物TCR対を発現するTPCライブラリー(本質的には、バクテリオファージ又は酵母ディスプレイシステムに似た細胞ベースアレイシステムである)へ変換することが可能になる。このアレイシステムは、単一被分析物TCR対がシークエンシングベースの同定のために回収することができる単一細胞において発現されることを確実にすることにより、特異的抗原に対するTCR配列の同定を容易にすることができ、及び/又はTCR配列のライブラリー内に含まれる抗原特異性を同定することができる。
eTPCは、本システムの他の全ての成分が関係する、多成分システムの基本成分である。したがって、eTPCは、天然型であるか又は操作された或る特徴を含み、この特徴により、eTPCは、被分析物eTPC-t集団を作製するための使用に適切とされる。
i.TCRα、β、δ及びγ鎖の内因性発現を欠き、
ii.細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、
iii.更なる成分(成分Bと呼ぶ)である、少なくとも1つの被分析物TCRα、β、δ又はγ鎖をコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする2つのORFの組込みのためのゲノム受容部位を含み、
ここで、i)は、前記発現を欠く天然に存在する細胞集団の選択により取得されてもよいし、該発現を欠くように遺伝子操作されてもよく、ii)は、前記発現を含む天然に存在する細胞集団の選択により取得されてもよいし、該発現を含むように遺伝子操作されていてもよく、iii)は、遺伝子工学の手段によりゲノムに導入されていてもよい。このような細胞が得られる種々の手段を詳述する方法を図31〜37に示す。
TCRα、β、δ及びγ鎖発現を欠くようにeTPCを遺伝子操作することは、標的付けられていない又は標的付けられた手段により達成され得る。細胞の標的付けられていない変異誘発は、細胞に化学的、放射線又はその他の変異原を提供し、次いで、標的TCRα、β、δ及びγ鎖の発現を欠く細胞を選択することにより達成できる。ゲノム遺伝子座の標的付けられた変異は、
i.ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ii.CRISPR/Cas9媒介ターゲティング、
iii.合成転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
による部位特異的変異誘発を含む(が、これらに限定されない)異なる手段により達成でき、ここで、前記部位特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子座でDNA修復エラー変異誘発を誘導し、その後、変異細胞を、TCRα、β、δ及びγ鎖の発現を欠く細胞の選択により取得する。
i.ジンクフィンガーヌクレアーゼ、
ii.CRISPR/Cas9媒介ターゲティング、
iii.合成転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)
による部位特異的変異誘発を含む(が、これらに限定されない)異なる手段により達成でき、ここで、前記部位特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子座でHDRによる部位特異的DNA修復を誘導する。この事象の後、一部の細胞は、組み込まれたHDRベクターを有し、以下:
iv.非破壊的表現型発現解析
v.破壊的表現型発現解析
vi.遺伝子解析
の任意の組合せにより選択及び/又は決定できる
ここで、iv及びviは、奏功するゲノム組込み事象の選択及び決定のための好ましい方法である。
或いは、ウイルスベクターを用いて、部位特異的又は非特異的様式で必要な成分を送達することができる。
eTPC成分Aは、必要に応じて、被分析物 抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物 抗原性分子(aAM)の少なくとも1つのファミリーの内因性表面発現を欠き、表面発現の欠如は、標的被分析物抗原のマッチさせた分析(matched analysis)における干渉を最小化するように選択される。
aAPXのファミリーは、以下のいずれであってもよい:
i.HLAクラスI
ii.HLAクラスII
iii.非HLA抗原提示複合体。
i.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
ii.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチドに由来するペプチド
iii.成分Aプロテオームの変更に由来するペプチド
iv.成分Aプロテオームの変更に由来するポリペプチド
v.成分Aメタボロームの変更に由来する代謝物
から選択される。
成分A eTPCは、必要に応じて、T細胞コレセプターを更に含んでよく、この特徴により、被分析物eTPCと被分析物APCとの強固な又は変化する形態のコミュニケーションが可能となり、整調可能なコミュニケーションは、特異的被分析物TCRsp及び/又は被分析物抗原の同定又は特徴決定に適切である。
eTPC 成分Aは、必要に応じて、CD28及び/又はCD45を発現してよく、ここで、CD28及びCD45は、シグナル伝達に対するポジティブフィードフォワード効果によりシグナル感受性に寄与する一方、シグナル伝達に対するネガティブフィードバック効果によりシグナル特異性にも寄与し得る。なぜならば、これらは、発現された被分析物TCRspによりシグナル伝達に関係するからである。
成分A eTPCは、必要に応じて、細胞表面接着分子成分の導入又は内因性細胞表面接着分子の除去を更に含んで、それぞれ、被分析物APCとのeTPCの結合及び免疫シナプスの形成を促進し、又はAPCが関与する分析ワークフロー内での堅固な結合及び有害な細胞クラスタリングの形成を回避してもよい。
成分Aに追加のORFとして導入され得るか又は成分Aから遺伝子除去され得る接着分子は、インテグリンファミリーの接着タンパク質から選択できる。
成分Cは、eTPC(成分A)のゲノム内に含まれる成分Bのゲノム受容部位とカップリングされている遺伝子ドナーベクターである。成分Cは、遺伝子ドナーベクターにコードされる、1又は2以上の被分析物TCR鎖をコードするORFのゲノム受容部位(成分B)への組み込みのために設計されている。ここで、この組込みは、標的eTPCによる被分析物TCR鎖の発現をもたらす。
対をなす遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位は組込みカップルとも記載される。
eTPC成分Aは:
i.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを含有する単一成分合成構築物
ii.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを有して設計された多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメント 成分Fと呼ぶ成分を更に含み、ここで、i及び/又はiiの活性化は、合成経路、天然型経路又はその組合せから選択される少なくとも1つのシグナル伝達経路に依存する。
iii.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを含有する単一成分合成構築物
iv.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを有して設計された多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメント 成分Fと呼ぶ成分を更に含んでいてもよく、ここで、i及び/又はiiの活性化は、合成経路、天然型経路又はその組合せから選択される少なくとも1つのシグナル変換経路に依存する。
天然型プロモーターと対立するものとしての合成プロモーターを有する合成TCR刺激応答エレメント(成分F)は、天然のTCR刺激応答を模擬する可能性が少なく、よって、天然のT細胞刺激とは距離がある近似を表す。しかし、合成プロモーターは、被分析物抗原に生産的に結合するTCRspを提示するeTPC-tの堅固な同定のためのレポーター応答の整調及び調節の関して非常な柔軟性を提供する。
合成プロモーターは、当初の天然のTCRシグナル伝達経路の下流に存在させ得るか又は該経路と置き換えることができる人工的合成シグナル伝達成分に連結することができる。この場合、CD3複合体は、人工的合成シグナル伝達経路及び応答ネットワークと部分的又は全体的にカップリングされることができる。このような人工的経路は、応答の微調整又は増強に関して、モジュール式で順応性が高いという利点を提供する。
TCRsp刺激と成分Fとをカップリングさせる正確な様式にかかわらず、所望の終端結果は検出可能なレポーターである。好適な実施形態において、蛍光検出(すなわち、FACS)及び/又は物理的選択方法(例えば、磁気活性化細胞選別(MACS))に従うレポーターが望ましい。或いは、レポーターは、分光光度、蛍光又は発光アッセイ(好ましくは非破壊的性質のもの)による検出のための、分泌されるものであるか又は細胞内分子であり得る。ここで、当該集団は、その後、レポーター分子の存否に基いて選択することができる。加えて、応答は、単一レポータータイプに制限されず、1又は2以上の異なるレポーターの組合せであり得る。
駆動因子-アクチベーター/リプレッサー:
a)合成プロモーター
b)コザック配列
c)転写因子
d)第1のターミネーター
増幅因子-レポーター
e)第2の合成プロモーター
f)コザック配列
g)レポーター
h)第2のターミネーター
を含んでなり、ここで、
a)は、被分析物抗原へのTCRspのライゲーションにより生じる当初の天然のシグナル伝達経路とカップリングされて設計されている合成プロモーター(駆動因子)を表す。最小駆動因子は、1又は2以上の転写因子結合部位及びコアプロモーターを含んでなり、ここで、コアプロモーターは、少なくとも、TATAボックス、開始エレメント(Inr)及び転写開始部位を含んでなり;b)は、転写因子の効率的翻訳開始のためのコザック配列を表し;c)は、第2の合成プロモーターのDNA配列に結合することができる合成又は天然の転写因子(アクチベーター又はリプレッサー)をコードするORFを表し;d)は、転写因子のmRNA転写物の効率的転写及びポリアデニル化のための転写ターミネーター及び任意付加要素の1又は2以上の非翻訳3'遺伝子エレメントを表す。これら遺伝子エレメントは、限定されないが、転写物を安定化又は脱安定化するエレメント及び独特な同定配列を含んでいてもよい;e)は、c)転写因子及びコアプロモーターの結合のための1又は2以上の認識部位をコードする第2の合成プロモーター(増幅因子)を表し、ここで、コアプロモーターは、少なくとも、TATAボックス、Inr及び転写開始部位を含んでなる;f)は、レポーターの効率的翻訳開始のためのコザック配列を表し;g)は、レポータータンパク質をコードするORFを表し;h)は、レポーターのmRNA転写物の効率的転写及びポリアデニル化のための転写ターミネーター及び任意付加要素の1又は2以上の非翻訳3'遺伝子エレメントを表す。これら遺伝子エレメントは、限定されないが、転写物を安定化又は脱安定化するエレメント及び独特な同定配列を含んでいてもよい。
a)合成プロモーター
b)コザック配列
c)レポーター
d)ターミネーター
を含んでなり、ここで
a)は、被分析物抗原へのTCRspのライゲーションにより生じる当初の天然のシグナル伝達経路とカップリングされて設計されている合成プロモーター(駆動因子)を表す。最小駆動因子は、1又は2以上の転写因子結合部位及びコアプロモーターを含んでなり、ここで、コアプロモーターは、少なくとも、TATAボックス、Inr及び転写開始部位を含んでなり;b)は、レポーターの効率的翻訳開始のためのコザック配列を表し;c)は、レポータータンパク質をコードするORFを表し;d)は、レポーターのmRNA転写物の効率的転写及びポリアデニル化のための転写ターミネーター及び任意付加要素の1又は2以上の非翻訳3'遺伝子エレメントを表す。これら遺伝子エレメントは、限定されないが、転写物を安定化又は脱安定化するエレメント及び独特な同定配列を含んでいてもよい。
多成分システム 成分Aは、1又は2以上の追加の組込みカップルを更に含んでなってもよい。
eTPC及び1つ又は2つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、分析又は調製ワークフロー内で使用するeTPC-tの製造に用いる。
eTPC-tは、2つの相補性TCR鎖を組み込んでTCRspを形成することにより製造されてもよいし、又は代替的に、各相補性鎖を逐次提供することにより二工程で製造してもよい(図3)。
遺伝子ドナーベクター及びゲノム受容部位は、多成分システムの組込みカップルサブシステムとして働く。遺伝子ドナーベクターは、先ず、標的ORFと組み合わされなければならず、ここで、基本ドナーベクターが当該標的ORFをコードするようになる。次いで、組立てられて準備が整ったドナーベクターは、標的ORFをゲノム受容部位と交換するために標的eTPCに導入され、よって、標的ORFが、標的細胞のカップリングされた受容部位に組み込まれる(図4)。
遺伝子ドナーベクターC及び/又はEへの1又は2以上のORFの組合せは、独特なORFのライブラリーを用いて、
i.複数のORFをコードするC'及び/又はE'ベクターの別個のライブラリーを得るための単一の別個の反応
ii.複数のORFをコードするC'及び/又はE'ベクターのプールされたライブラリーを得るための単一反応
として複数回行なってもよい。ここで、別個のライブラリーは、独特なTCR鎖をコードする独特なORFを有するeTPC-tの別個のライブラリーが得られるように、成分Aと複数回組み合わされてもよく、プールされたライブラリーは、各eTPC-tは元のベクタープールからのランダム化された1又は2以上の被分析物TCR鎖をコードするORFが組み込まれており、結果として、各eTPC-tが単一ランダムの独特なTCRspを発現する1又は2以上のプールされたeTPC-tのライブラリーが得られるように、成分Aと1回又は2回以上組み合わされてもよい。
ゲノム受容部位への予測可能なコピー数の1又は2以上のORFの効率的組込みは、被分析物eTPC集団が迅速に調製及び特徴決定され得る標準化eTPCの動作のために非常に有利である。よって、ゲノム受容部位及びカップリングされたドナーベクターはeTPCの機能に重要である。更に、eTPCを、成分B及びDが互いに隔離されてドナーベクター成分Cが成分Bで組み込まれず、その逆も同様であるようにすることが非常に望ましい。加えて、成分B及び/又は成分Dが、規定された単一の相補性TCR鎖対の導入が迅速で反復可能であり、単一対のみの正しい組込み及び送達の可能性が高いeTPC-tの作製方法に適することも望ましい。
i.リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
ii.部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
iii.部位特異的相同組換え用の天然型ゲノム部位
から選択され得、ここで、i)がRCME用に好適な形態のゲノム受容部位である。RMCE法は、各成分B及びDが隔離された特異性を有するように、個別のリコンビナーゼ酵素に特異的である選択された異種特異的部位を採用してよい。
ゲノム受容部位である成分B及び/又は成分Dは、以下の遺伝子エレメント:
i.異種特異的リコンビナーゼ部位
ii.相同性アーム
iii.真核生物プロモーター
iv.真核生物条件付き調節エレメント
v.真核生物ターミネーター
vi.選択マーカー
vii.スプライスアクセプター部位
viii.スプライスドナー部位
ix.非タンパク質コーディング遺伝子
x.インスレーター
xi.可動遺伝子エレメント
xii.メガヌクレアーゼ認識部位
xiii.内部リボソーム進入部位(IRES)
xiv.ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
xv.コザックコンセンサス配列
の少なくとも1つを含んでなる。
第1の配置は、RMCE組込みにより、1又は2以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする単一ORFを受け入れるためのものであり、ここで、該配置は
5'-[A] [B] [C] [D] [E] [F]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
B)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
C)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
D)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性コード化タンパク質マーカーであり、
E)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
F)は、エレメントv)真核生物ターミネーターである。
5'-[A] [B] [C] [D] [E] [F] [G] [H] [I]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
B)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
C)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
D)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性のコード化タンパク質マーカー1であり、
E)は、エレメントv)真核生物二方向転写ターミネーターであり、
F)は、エレメントvi)FACS及び/又はMACS適合性のコード化タンパク質マーカー2であり、
G)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
H)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
I)は、エレメントiii)構成性又は誘導性真核生物プロモーターであり、
更に、この第2の配置において、エレメントF、G及びIは、アンチセンス方向にコードされる。
i.異種特異的リコンビナーゼ部位
ii.相同性アーム
iii.真核生物プロモーター
iv.真核生物条件付き調節エレメント
v.真核生物ターミネーター
vi.選択マーカー
vii.スプライスアクセプター部位
viii.スプライスドナー部位
ix.非タンパク質コーディング遺伝子
x.インスレーター
xi.可動遺伝子エレメント
xii.メガヌクレアーゼ認識部位
xiii.内部リボソーム進入部位(IRES)
xiv.ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
xv.コザックコンセンサス配列
xvi.組込みの選択マーカー
xvii.抗生物質耐性カセット
xviii.細菌性複製起点
xix.酵母複製起点
xx.クローニング部位
の少なくとも1つで構成される。
第1の配置は、RMCE組込みによる、1又は2以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする単一ORFの送達のためのものであり、ここで、該配置は
5'-[A] [B] [C] [D] [E]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
B)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
C)は、エレメントxx)1又は2以上のTCR鎖及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードする単一ORFのクローニング部位であり、
D)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
E)は、非特異的配向でのエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)細菌性複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、複数のTCR鎖及び/又はエレメントxviを一緒に連結するために用いてよい。
5'-[A] [B] [C] [D] [E] [F]-3'
であり、ここで、
A)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位1であり、
B)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列であり、
C)は、1又は2以上のTCR鎖及び/又はエレメントxvi)組込みの選択マーカーをコードし、真核生物のターミネーターを有する2又は3以上のORFの導入のためのクローニング部位であり、
D)は、エレメントxv)コザックコンセンサス配列(アンチセンス方向)であり、
E)は、エレメントi)異種特異的リコンビナーゼ部位2であり、
F)は、非特異的配向でのエレメントxvii)抗生物質耐性カセット及びエレメントxviii)細菌複製起点であり、
更に、エレメントviii及び/又はxivを、複数のTCR鎖及び/又はエレメントxviを各ORF内で一緒に連結するために用いてよい。
上記多成分システムは、eTPC:Aシステムの分析又は調製ワークフロー内で被分析物抗原に対して被分析物TCRspを提示するように働く別異の形態の被分析物eTPC集団又はそのライブラリーを作製する複数の方法で使用してもよい。
作製されるeTPC-t集団は、特定の供給源から被分析物TCR鎖(これに対して候補抗原を分析する)を導く必要がある。
被分析物TCR鎖をコードする配列の供給源は、
i.初代T細胞からのTCR鎖ORF配列の対クローニング
ii.初代T細胞からのTCR鎖ORF配列の非対クローニング
iii.合成TCR鎖ORF配列
から誘導することができ、ここで、i)は、胸腺選択に起因して、一般に、自己のaAPX及び/又はaAPX積荷に対して交差反応性である可能性が高くない天然型TCRspの発見に好適であり;ii)は、候補TCR親和性反応剤を同定するために使用されてもよく;iii)は、TCR親和性反応剤の親和性成熟において用いられてもよい。
2つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、TCR鎖の相補対のORFと組み合わされた成分C'を提供することにより、eTPC-tを成分Aから一工程で作製するために用いてもよい。この被分析物TCR対は部位Bに組み込まれ、成分B'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR対を発現し、TCR対は細胞表面にTCRspとして提示される。第2の組込みカップルD/Eは非改変のままであり、下流の組込み工程に用い得る(図6)。
2つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、各々が相補性TCR鎖対の1つの鎖をコードする1つのORFと組み合わされた成分C'及びE'を提供することにより、eTPC-tを成分Aから一工程で作製するために用いられてもよい。両被分析物TCRは部位B又はDに組み込まれ、成分B'及びD'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR対を発現し、TCR対は細胞表面にTCRspとして提示される(図7)。
2つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、単一被分析物TCR鎖のORFと組み合わされた成分C'を提供することにより、eTPC-xを成分Aから一工程で作製するために用いてもよい。この被分析物TCR鎖は部位Bに組み込まれ、成分B'が作製される。得られる細胞株は提供されたTCR鎖を発現するが相補性鎖を欠いており、よって表面TCRを発現しない。第2の組込みカップルD/Eは非改変のままであり、下流の組込み工程に用い得る(図8)。
被分析物eTPC-x及び/又はeTPC-t集団をeTPCから作製する上記の例において、多成分システムは、既知の被分析物TCR鎖を規定された様式で提供して、規定されたTCRspを発現する被分析物eTPCの別個の集団を作製するために用いられる。この方法は、分析又は調製ワークフローに提供するeTCP-x及び/又はeTCP-tのライブラリーを構築するために複数回繰り返されてもよい。代替アプローチは、遺伝子ドナーベクターと組み合わされる被分析物TCR鎖のプールされたライブラリーを採用し、これらをショットガン様式で組み込んで、被分析物eTPC-tのプールされたライブラリー(各eTPC-tは元のベクタープールからのTCR ORFの単一ランダム対が組み込まれ、よって、各eTPC-tは単一ランダムTCRspを発現するが、まとまったプールとしては元のベクタープールに表される複数の種のTCRspをコードする)を取得することである。同じショットガン原理をeTPC-xのプールの作製に適用することができる。これは、候補TCRspの大きなライブラリーを被分析物抗原に対して分析するときに特に有用である。
2つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、被分析物TCR対のプールをコードする複数のORFのライブラリーと組み合わせた成分C'を提供することにより、eTPC-tプールを成分Aから一工程で作製するために用いてもよい。この対は各細胞内で部位Bに組み込まれ、成分B'が作製され、ここで、各eTPC-tは元のベクタープールからのTCR ORFの単一ランダム対が組み込まれ、よって、各eTPC-tは単一ランダムTCRspを発現するが、まとまったプールとしては元のベクタープールに表される複数の種のTCRspをコードする。得られる細胞プールは集団として複数の被分析物TCRspを発現する細胞集団を含む。第2の組込みカップルD/Eは非改変のままである(図11)。
2つの組込みカップルを含んでなる多成分システムは、eTPC-tプールを事前に得られたe-TPC-xから一工程で作製するために用いてもよい。ここで、部位BはB'に変換され、単一被分析物TCR鎖を含む。eTPC-tは、既に組み込まれた鎖に相補性である単一被分析物TCR鎖のプールをコードする複数のORFのライブラリーと組み合わされた成分E'を提供することにより作製される。各eTPC-tは、提供されたE'ライブラリーの単一ランダム化されたTCR鎖ORFが部位Dに組み込まれ、成分D'が作製されている。eTPC-tプール中の得られる各細胞は、eTPC-xから出発し、各単一相補性被分析物TCR鎖を選択することにより提供される被分析物TCR鎖を有し、その結果、プール中の各細胞はORFのランダム対をTCRspとして発現する。このアプローチは、相補性TCR鎖対中の固定された鎖に対する種々の単一鎖の効果を分析するときに用いられる(図13)。
eTPC-tのeTPC-xへの変換に好適な遺伝子組込みベクター 成分Y及び成分Zは、上記成分C及びEと同じ組込みベクター要件を含むが、TCR鎖ORFをコードせず、好ましくは組込みのマーカーをコードする。
eTPC-x又はそのライブラリーは、標的アッセイにおいてTCRsp誘導体を迅速にスクリーニングするために、eTPC-x中のB'又はD'に組み込まれたTCR鎖ORFと相補性であるTCR鎖ORFの一過性トランスフェクションに用いることができる。
本発明は、遺伝子操作された多成分システムの提供に関する。成分A及び1又は2以上の成分C'及び/又は1又は2以上の成分E'を用いて1又は2以上の被分析物eTPC-tを作製する。分析デバイスの編成のための被分析物eTPC-t集団を、まとめて、eTPC:抗原(eTPC:A)システム(図24)と呼ぶ。多成分システム内で、1若しくは2以上の成分C'及び/又は1若しくは2以上の成分E'が成分Aと組み合わされて、種々の形態の被分析物eTPC-tが作製される。次いで、これら被分析物eTPC-tが、分析eTPC:Aシステム内で1又は2以上の1又は2以上の被分析物抗原と組み合わされて、1又は2以上の出力が得られる。被分析物抗原は、被分析物抗原提示細胞(APC)により及び/又は可溶性若しくは不動化親和性反応剤として提供され、及び/又は非細胞ベースの粒子(NCBP)に提示される。
i.aAPX(被分析物抗原提示複合体)及び/又は
ii.aAM(被分析物抗原性分子)及び/又は
iii.aAPX:aAM(被分析物抗原性分子を提示する被分析物抗原提示複合体)及び/又は
iv.CM(非被分析物 積荷分子)及び/又は
v.aAPX:CM(積荷分子を提示する被分析物抗原提示複合体)
で表されてもよく、ここで、aAPXは、aAMを提示できる複合体であり、aAMは、TCRにより直接認識されるか又はaAPXに積載された場合にTCRにより認識される任意の分子であり、aAPX:aAMは、aAMを積載したaAPXであり、CMは、aAPXに積載され得るが、被分析物でなく、よって被分析物抗原提示細胞(APC)又はアッセイシステム自体に由来し得る積荷分子であり、aAPX:CMは、CMが積載されたaAPXである。
i.被分析物抗原提示細胞(APC)及び/又は
ii.可溶性又は不動化親和性反応剤及び/又は
iii.非細胞ベースの粒子(NCBP)
として表されてもよく、ここで、
被分析物抗原提示細胞(APC)は、eTPC-tに抗原を提示することができる任意のAPCと考えられ、親和性反応剤は、eTPC:AシステムにおいてeTPC-tの細胞表面でTCRspの結合及び/又は刺激を探索するための被分析物として作製される任意の反応剤と考えられる。この反応剤は、被分析物抗原性分子(aAM)、被分析物抗原提示複合体(aAPX)、又はaAMが積載されたaAPX(aAPX:aAM)であることが多い。aAPX:aAMの代表例は、TCRを染色するために用いられるpHLA-マルチマー反応剤(例えば、「テトラマー」)である。この点に関して、親和性反応剤は抗体又は類似物でもあり得る。非細胞ベースの粒子(NCBP)は、粒子が、eTPC:Aシステム内でeTPC-t表面でのTCRsp結合について評価されるべき被分析物抗原又はその他物質である限りにおいて、親和性反応剤に類似する様式で作用する。しかし、NCBPは、提示された被分析物抗原又は他の結合体の識別体として直接又は間接に作用する、遺伝子又は他の情報を更に運搬することが可能なより大きな物質として考えることもできる。NCBPの代表例は、ファージディスプレイ場面でのバクテリオファージであり、ここで、ファージは抗体フラグメント-抗原結合(FAB)をディスプレイし得る。陽性標識されたeTPC-tは、ファージと共に回収され、配列決定されて、eTPC-t表面のTCRspに特異的なFABが同定されてもよい。
i.aAPX(被分析物抗原提示複合体)及び/又は
ii.aAM(被分析物抗原性分子)及び/又は
iii.aAPX:aAM(被分析物抗原性分子を提示する被分析物抗原提示複合体)及び/又は
iv.CM(非被分析物積荷分子)及び/又は
v.aAPX:CM(積荷分子を提示する被分析物抗原提示複合体)
のいずれかであり、ここで、被分析物抗原は、として提供され、被分析物APCにより提示され、又は、可溶性及び/又は不動化親和性反応剤又はNCBPにより提示され、その結果、複合体形成は当該複合体の安定化を導き得、また、複合体形成は、eTPC-tの観察可能な標識、及び/又はあれば、被分析物eTPC内での成分Fによるシグナル伝達の誘導、及び/又は観察される可能性がある被分析物APC中の観察可能なシグナルを導く。
i.単一被分析物eTPC-tの入力、又は
ii.プールされた被分析物eTPC-tのライブラリーの入力
で構成され、以下:
iii.単一被分析物APCの入力、又は
iv.単一被分析物親和性反応剤の入力、又は
v.単一被分析物NCBPの入力、又は
vi.プールされた被分析物APCのライブラリーの入力、又は
vii.被分析物親和性反応剤のプールされたライブラリの入力、又は
viii.被分析物NCBPのプールされたライブラリの入力
の1つと組み合わされる。
被分析物APCと被分析物eTPC-tとの接触は、許容される細胞培養系又は緩衝液系で行われ、ここで、当該系は、被分析物eAPC及び被分析物TC細胞の両方、被分析物親和性反応剤又は被分析物NCBPの機能を許容する培地を含む。
可溶性被分析物親和性反応剤、不動化親和性反応剤及び/又は被分析物NCBPと被分析物eTPC-tとの接触は、許容される緩衝化系で行われ、ここで、当該系は、被分析物抗原及び被分析物eTPC-t細胞の両方の機能を許容する緩衝化培地を含む。
二部構成デバイスから得られる被分析物eTPC-tは、eTPC-tにより提示されるTCRspの特徴決定に用いてもよい。この特徴決定は、被分析物eTPC-tが不動化若しくは可溶性親和性反応剤又は非細胞ベースの粒子(NCBP)と接触してeTPC-tが標識されるような様式で行ってもよい(図15)。
e標識は、フローサイトメトリー、顕微鏡観察、分光分析若しくはルミノメトリーのような方法による標識の直接観察により、又は不動化親和性反応剤若しくはNCBPでの捕捉により検出されることが考えられる。類似する様式において、親和性反応剤又はNCBPは、含まれるならば、レポーターエレメント(成分F)を刺激してもよい。成分Fの刺激により、同定のためのeTPC-t及び/又は親和性反応剤又はNCBPの選択が可能となる(図16)。
二部構成デバイスから得られる被分析物被分析物eTPC-tは、被分析物抗原に対する、被分析物TCRspを発現する被分析物eTPC-tのシグナル応答の特徴決定に用いられ、ここで、このシグナル応答は、二値(binary)又は徐々に変化するもののいずれであってもよく、eeTPC-tに固有なもの(図15、16及び17)及び/又は含まれるならばAPCに固有なもの(図18)として測定され得る。このシグナルは、フローサイトメトリー、顕微鏡観察、分光分析若しくはルミノメトリー又は当業者に公知のその他の方法のような方法により検出されてもよい。
被分析物APCはまた、eTPC:Aシステム内でeTPC-tと接触させてもよい。一般に、応答は、eTPC-t内で報告されるシグナルにより測定される(図17)が、APC内で報告されるシグナルにより測定されてもよい(図18)。
eTPC:A組合せシステムから、入力の被分析物eTPC-t又は被分析物eTPC-tのライブラリーからの1又は2以上の被分析物eTPC-tを選択して、1又は2以上の被分析物eTPC-tを得る方法であって、発現したTCRspが1又は2以上の被分析物抗原と結合する方法は:
i.1又は2以上の被分析物eTPC-tを1又は2以上の被分析物抗原と組み合わせて、被分析物TCRspと被分析物抗原との接触をもたらすことと、以下の少なくとも1つ:
ii.形成される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
iii.標識された被分析物抗原からのシグナルを測定すること、及び/又は
iv.もしあるならば、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eTPC-tによるシグナル応答を測定すること、及び/又は
v.もしあるならば、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定することと、
vi.工程ii、iii、iv及び/又はvに基づく1又は2以上の被分析物eTPC-tの選択であって、選択が、ポジティブ及び/又はネガティブ測定により行われることと
を含み、ここで、i、iv及びvi又はi、v及びviは、好ましい構成を含む。
入力の被分析物抗原又は被分析物抗原のライブラリーから1又は2以上の被分析物抗原を選択して1又は2以上の被分析物抗原を得る方法であって、発現した被分析物抗原が、被分析物eTPC-tにより提示される1又は2以上の被分析物TCRspと結合する方法は:
i.1又は2以上の被分析物抗原を1又は2以上の被分析物eTPC-tとを組み合わせて、被分析物抗原により提示される被分析物抗原と1又は2以上の被分析物eTPC-tの被分析物TCRspとの接触をもたらすことと、
ii.形成する場合、1又は2以上の被分析物抗原と1又は2以上の被分析物TCRspとの間での複合体の形成を測定することと、及び/又は
iii.標識された被分析物抗原からのシグナルを測定することと、及び/又は
iv.誘導される場合、被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される1又は2以上の被分析物eTPC-tにおけるシグナル応答を測定することと、及び/又は
v.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定することと、
vi.工程ii、iii、iv及び/又はvからの1又は2以上の被分析物抗原の選択であって、選択が、ポジティブ及び/又はネガティブ測定により行われることと
を含み、ここで、i、iv及びvi又はi、v及びviは、好ましい構成を含む。
eTPC:A組合せシステムから、被分析物eTPC-t及び/又は被分析物APC及び/又は親和性反応剤及び/又はNCBPを、レポートされるシグナル応答に基いて選択する方法は:
i.天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
ii.eTPC-tが成分Fを含有する場合及び/又はAPCが等価な合成レポーターエレメントを含む場合、合成シグナル伝達応答を決定すること
も含んでよい。
APC及び/又はeTPC-tに固有である誘導された天然型又は合成のシグナル応答は、以下:
i.分泌された生体分子
ii.分泌された化学物質
iii.細胞内生体分子
iv.細胞内化学物質
v.表面発現された生体分子
vi.被分析物eTPC-tの被分析物APCに対する細胞毒性作用
vii.シグナル応答が被分析物APCにおいて誘導され、a〜eのいずれかの増減を検出することにより決定されるような被分析物eTPC-tの被分析物APCに対するパラクリン作用
viii.被分析物eTPC-tの増殖
ix.被分析物eTPC-tと被分析物APCとの間の免疫シナプス
の1又は2以上の増減を検出することにより測定され、ここで、前記検出されるシグナル応答は、eTPC:A組合せシステム及び/又は並行して組み立てられた組合せシステムの組立ての前の、被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tに固有の非誘導シグナル応答状態と比較され、ここで、被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tは、用いるeTPC:A組合せシステム内でシグナル応答を誘導しないことが知られている対照の被分析物抗原及び/又は被分析物TCR種及び/又は可溶性被分析物抗原を提示し得る。
eTPC:A組合せシステムから、被分析物eTPC-t及び/又は被分析物親和性反応剤及び/又は被分析物NCBPを、前記親和性反応剤又はNCBPによるeTPC-tの測定可能な標識に基いて選択する方法は:
i.親和性反応剤又はNCBPによるeTPC-tの標識を決定する
ことを含み、
ii.天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
iii.eTPC-tが成分Fを含有する場合、合成シグナル伝達応答を決定すること
も含んでよく、
ここで、eTPC-tの標識を検出することによりeTPC-t及び/又は親和性反応剤及び/又はNCBPを選択することは、親和性反応剤及び/又はNCBPに検出可能な標識を含ませることによる、親和性反応剤及び/又はNCBPによるeTPC-tの表面標識の検出を含んでよい。この検出可能な標識は、蛍光、発光、分光、化学、放射化学又は親和性部分であってよい。よって、eTPC-tのこの選択は、FACS、MACS又は等価な高スループットスクリーニング及び選択方法に基づいて行ってよい。
eTPC:A組合せシステム内で、1若しくは2以上の被分析物eTPC-t又は1若しくは2以上の被分析物APCにおけるシグナル応答の測定、又は被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により媒介され得るeTPC-tの標識は、一次システム出力の選択に重要であり(図24 工程v)、ここで、一次システム出力は、単一細胞若しくは細胞プール、及び/又は単一親和性反応剤若しくは親和性反応剤プール、及び/又は単一NCBP若しくはNCBPプールである。ここで、細胞又は反応剤の選択は、接触させた被分析物APC又は被分析物eTPC-t細胞のいずれか及び/又は両方において報告されるシグナル応答の存否に基いて、或いは親和性反応剤又はNCBPでのeTPC-tの測定可能な標識により行ってもよい。
本発明は、被分析物eTPC-tが得られる二部構成デバイスの提供に関する。次いで、これら被分析物eTPC-tを、上記のように、eTPC:Aシステムにより1又は2以上の被分析物抗原と組み合わせて、1又は2以上の出力を得る。被分析物抗原は、被分析物抗原提示細胞(APC)により及び/又は可溶性又は不動化反応剤として提供されるか、及び/又は非細胞ベースの粒子(NCBP)に提示される。システムは、1又は2以上のeTPC-t集団を用いる1又は2以上の被分析物抗原の選択で構成される(図24)。eTPC:Aシステムは、被分析物抗原と被分析物eTPC-t集団との物理的接触を可能にする形式で提供され、この接触により1又は2以上の被分析物抗原と1又は2以上の被分析物eTPC-tのTCRspとの間の複合体形成が可能となる。ここで、被分析物抗原は、以下:
i.aAPX及び/又は
ii.aAM及び/又は
iii.aAPX:aAM及び/又は
iv.CM及び/又は
v.aAPX:CM
のいずれかであり、ここで、被分析物抗原は、として提供され、被分析物APCにより提示され、又は、可溶性及び/又は不動化親和性反応剤又はNCBPにより提示され、その結果、複合体形成は当該複合体の安定化を導き得、また、複合体形成は、eTPC-tの標識、及び/又はあれば、被分析物eTPC内でのシグナル伝達の誘導、及び/又は報告されるか若しくは観察される可能性がある被分析物APCを導く。
eTPC:Aシステムからの一次出力は、選択された細胞集団及び/又は選択された親和性反応剤若しくは選択されたNCBPであり、ここで、選択は:
i.親和性反応剤若しくはNCBPによるeTPC-tの測定可能な標識、及び/又は
ii.eTPC-tにおいて検出されるシグナル応答、及び/又は
iii.eTPC-tにおける検出されるシグナル応答の欠如、及び/又は
iv.被分析物APCにおいて検出されるシグナル応答、及び/又は
v.被分析物APCにおいて検出されるシグナル応答の欠如
に基づいて行われ、ここで、一次出力は、単一細胞若しくは細胞プール及び/又は1又は2以上のeTPC-t結合親和性反応剤若しくはNCBP(eTPC-tに結合した親和性反応剤若しくはNCBP)として表すことができる。
システムからの一次eTPC-t出力は、選択された細胞であり、ここで、選択は報告されるシグナル応答の存否に基づいて行われ、これら細胞はeTPC-tを含んでよく、ここで、選択された細胞は、単一細胞、同じアイデンティティの細胞プール又は異なるアイデンティティの細胞プールを含んでよい(図24 工程v)。
システムからの一次被分析物親和性反応剤又はNCBP出力は、親和性反応剤又はNCBPが結合したか又はしていない選択された細胞である。ここで、選択は、標識又は被分析物eTPC-tにより報告されるシグナル応答の存否に基づいて行われ、選択された親和性反応剤又はNCBPは、同じアイデンティティの親和性反応剤プール又は異なるアイデンティティの親和性反応剤又はNCBPプールを含んでよい(図24 工程v)。
APC及び/又はeTPC-t型の一次出力は、eTPC:A組合せシステムが二元培養性質のものである場合(例えば図15〜18)、二元システムから、所望の被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-t集団を二部構成システムから選択することにより達成され得る。
eTPC-tの一次出力は、eTPC:A組合せシステムが、1又は2以上の被分析物eTPC-tと被分析物抗原との二元組成のものである場合(例えば、図19〜21)、eTPC:Aシステム内で、被分析物親和性反応剤若しくはNCBPで標識されるか又は被分析物親和性反応剤若しくはNCBP若しくは被分析物APCにより活性化される所望の被分析物eTPC-t集団を選択することにより達成され得る。
被分析物親和性反応剤又はNCBPの一次出力は、eTPC:A組合せシステムが1又は2以上の被分析物eTPC-tと被分析物親和性反応剤又はNCBPとの二元組成のものである場合(例えば、図21)、被分析物 親和性反応剤若しくはNCBPで標識されているか及び/又は被分析物 親和性反応剤若しくはNCBPにより誘導されたシグナルを有する所望の被分析物eTPC-t集団を、eTPC:Aシステムから選択することにより達成され得る。
APCの一次出力は、eTPC:A組合せシステムが、固定された被分析物eTPC-t及びプールされたライブラリー被分析物APCの性質のものである場合(例えば図22)、被分析物APCを、被分析物APC内での応答の検出又は応答の欠如に基いて選択することにより達成され得る。
一次出力たるAPC及び/又はeTPC-t細胞及び/又はeTPC結合親和性反応剤若しくはNCBPは、単一細胞選別により単一細胞を得てもよく、及び/又は細胞プール選別により細胞プールを得てもよい。
一次出力たるAPC及び/又はeTPC-t細胞は、単一細胞選別により単一細胞を得てもよく、必要に応じてその後、単一細胞を増殖させて、選択されたAPC又はeTPC-t細胞のモノクローナルプールを得てもよい。
一次出力たるAPC及び/又はeTPC-t細胞は、細胞プール選別により細胞プールを得てもよく、必要に応じてその後、細胞プールを増殖させて、選択されたAPC及び/又はeTPC-t細胞のプールを得てもよい。
測定されるシグナル応答又は安定な複合体形成に基づいて選択された被分析物APC及び/又は被分析物eTPC-tである一次出力を取得する上記の方法に続いて、eTPC:Aシステムからの終端出力を、選択されたAPC及び/又はeTPC一次出力の更なる加工処理により得てもよい。
本発明に関して、多成分システムからの終端出力は、被分析物APC又は被分析物eTPC-t又は被分析物親和性反応剤又はNCBPにより提示され、eTPC:A組合せシステムからの選択により多成分システムからの一次出力として得られる
i.aAPX及び/又は
ii.aAM及び/又は
iii.aAPX:aAM及び/又は
iv.CM及び/又は
v.aAPX:CM及び/又は
vi.TCRsp
のアイデンティティである。
APCは、選別された及び/又は増殖させたAPC細胞のゲノム又はトランスクリプトームについて遺伝子配列を得て:
i.aAPX及び/又は
ii.aAM及び/又は
iii.aAPX:aAM
iv.CM及び/又は
v.aAPX:CM及び/又は
のアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、得られるアイデンティティは、eTPC:Aシステムの終端出力を表す。
本発明に関して、遺伝子成分を有する被分析物NCBPは、選別された及び/又は拡大された被分析物NCBPのゲノム又はトランスクリプトームについて遺伝子配列を得て、被分析物NCBPのアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、得られるアイデンティティはeTPC:Aシステムの終端出力を表す。
eTPCは、選別及び/又は増殖されたeTPC-t細胞のゲノム又はトランスクリプトームについて遺伝子配列を得て、TCRspのアイデンティティを決定するように加工処理してよく、ここで、TCRspの得られるアイデンティティはeTPC:Aシステムの終端出力を表す。
本発明に関して、配列決定工程の前に
i.ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
ii.成分B'及び/又はD'のRNA転写物を抽出すること、及び/又は
iii.成分B'及び/又はD'のDNA及び/又はRNA転写産物をPCR及び/又はRT-PCRによりにより増幅すること
を行ってよい。
配列決定工程は、多成分システムの一次出力として得られるAPC又はeTPC-t又は被分析物NCBP又はそれらのプールに対して破壊的であってよい。
遺伝子によりコードされる被分析物分子の上記場面において、eTPC:Aシステムの終端出力は、成分B'及び/又はD'並びに/又は細胞ゲノム及び/若しくはトランスクリプトームから配列情報を得ることにより得てよい。しかし、幾つかの実施形態では、抗原情報は、遺伝子によりコードされない。翻訳後修飾される抗原、非遺伝子的手段によりeTPC:A組合せシステムに提供される抗原、被分析物APCプロテオソーム又は代謝物の誘導又は改変された状態から現れる抗原、eTPC:Aシステムに固有のCMは、遺伝子配列決定手段により合理的に同定されない場合がある。
aAM積荷又はCM積荷を選択し同定する方法であって、積荷が、多成分システムの一次出力として選択されて得られるAPCのaAPXに積載される代謝物及び/又はペプチドである方法は、
i.aAPX:aAM又はaAPX:CM又は積荷aM又は積荷CMを単離することと、
ii.積載された積荷を同定することと
を含み、ここで、同定される積載された積荷(CM又はaAM)は、二部構成デバイスの終端出力である。
単離aAM及び/若しくはCMを直接に又は単離aAPX:aAM若しくはaAPX:CM複合体から同定する方法は:
i.質量分析
ii.ペプチド配列決定分析
を含むことができ、ここで、含まれるaAM及び/又はCMのアイデンティティは、二部構成デバイスの終端出力である。
一次出力を得る上記の方法であって、一次出力が、測定されるシグナル応答に基づいて選択される被分析物eTPC-t細胞である方法の後に、eTPC-t一次出力を親和性分析に供して、同族被分析物抗原に対するTCRspの親和性を決定してよく、ここで、被分析物抗原は、以下:
i.aAPX及び/又は
ii.aAM及び/又は
iii.aAPX:aAM及び/又は
iv.CM及び/又は
v.aAPX:CM
のいずれかであり、ここで、被分析物抗原は、可溶性親和性反応剤として提供されるか又は被分析物APC若しくは被分析物NCBPにより提示され、被分析物TCRspの親和性は以下の方法:
i.選択された被分析物eTPC-tを、所定範囲の濃度の被分析物抗原で標識すること、
ii.工程aの染色された被分析物eTPC-tについてFACS分析を行うこと、
iii.所定の濃度範囲の被分析物抗原について被分析物被分析物eTPC-tの蛍光標識の強度を決定すること、
iv.TCRspの被分析物抗原に対する親和性を算出すること
により決定される。
i.被分析物TCR鎖の一方又は両方に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t、
ii.1又は2以上のCD3タンパク質に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t
iii.標識された参照物たる単一TCR鎖又は標識された参照物たるTCR鎖対を提示する細胞又は粒子
から選択される。
本発明は、その成分が1又は2以上の被分析物eTPC-tの製造に用いられる遺伝子操作された多成分システムの提供、製造されたeTPC-tのeTPC:A分析システムにおける使用(ここで、該システムは、被分析物eTPC-tにより提示されるTCRspの被分析物抗原特異性を決定するため、及び所望であれば、被分析物抗原に対する親和性を有するか又は有しないeTPC-tの選択に用いられる)に関する。
本システムは、TCR保有細胞の存在を検出するアッセイのコントロール及び較正に用いるため(実施例9参照)、又は選択された特異性TCR対の検出を目的とする親和性反応剤及び/若しくはNCBPの開発及び/若しくは製造におけるコントロールのためのTCR提示標準物質の迅速な作製に理想的に適切である。
過去20年間、HLAマルチマー反応剤は、T細胞研究の重要な一部であり、上記の例を通じて用いられているように、特定のTCRを提示するT細胞(及び他の細胞型)を標識するために用いられてきた。HLA分子のビオチン化及びストレプトアビジンでの多量体化に基づく四量体化反応剤として元々得られたこれら反応剤は、今や、多量体化の程度が異なる種々の形態を採る。多量体化は、一般に、HLAマルチマー反応剤の信頼できる機能の鍵であると考えられる。なぜならば、TCR-抗原-HLA相互作用は比較的弱く、よって、HLA-抗原分子のマルチマー状態は同族TCRとの相互作用を安定化するからである。代表的なアッセイは、HLAマルチマー反応剤と準備された末梢血標本との接触、及び標本内の標識されたT細胞のフローサイトメトリーを用いる検出を必要とする。
よって、上記のeTPC:Aシステムは、規定された特異性及び所望の抗原を有する親和性反応剤、NCBP又は他の検出反応剤による染色強度のTCRspを有する1又は2以上のeTPC-tを選択し特徴付けるために用いてもよい。
a)臨床標本における選択されたTCR特異性のT細胞の存在を決定する細胞数測定アッセイ;
b)治療用細胞製剤であるTCR発現初代T細胞の製造において、特異的TCRを有する細胞の存在を決定する細胞数測定アッセイ;
c)治療用細胞製剤である遺伝子操作されたTCR発現T細胞の製造において、特異的TCRを有する細胞の存在を決定する細胞数測定アッセイ;
d)特定のTCR対を検出するように設計された所与の親和性反応剤、NCBP又は他の反応剤の特異性及び/又は検出量を決定するアッセイ;
を含んでなってもよく、ここで、このアッセイは、標識又は非標識の反応剤を用いるフローサイトメトリーアッセイ又は静的結合であってもよい。
a)生存細胞
b)凍結保存細胞
c)化学的に固定された細胞
d)放射線照射細胞
として作製されてもよく、ここで、a)及びb)は組み合わされてもよく、b)及びc)は組み合わされてもよく、b)及びd)は組み合わされてもよい。
図面の説明
本発明を以下の非限定的図面において説明する。
ARH-77細胞のエレクトロポレーション
反応あたり、4×106細胞を、500μl RPMI 1640中、Gene Pulser XCELLTM(Bio-Rad)を使用するGlutamax-I(Life Technologies)を以下の設定で用いてエレクトロポレートした:方形波285V、パルス長12.5ms、1秒間隔で2パルス。
Cas9プラスミドV1.A.8に用いたDNA濃度は、組込み部位を標的するgRNAについて10μg/ml及び7.5μg/mlであった(HLA内因性遺伝子座における組込みについてはV2.I.10及びV2.J.1、標的AAVS1部位についてはV2.J.6)(表1)。
組込みベクターを濃度7.5μg/ulでエレクトロポレートした。
HLA遺伝子座におけるHDR組込みのためには、HLAクラスI V1.C.6及びV1.C.9プラスミドを用いた。AAVS1遺伝子座におけるHDR組込みのためには、HLAクラスI V1.F.8及びV1.F.10並びにHLAクラスII V1.I.5及びV1.I.7を用いた。
pp65 ORFのバリアントを事前に作製したHLAモノアレレ株に組み込んだ。GFPマーカーに連結した形態のpp65を含有するプラスミドV1.G.9及びV1.H.1をこの目的に用いた。
1つのRMCE部位を有するARH-77 HLA-ヌル株を作製するため、マーカーに隣接する異種特異的リコンビナーゼ部位を有するプラスミドを用いた。RFPについてはV4.B.2、BFPについてはV4.B.3を用いた。同プラスミドを同時エレクトロポレートして、2つのRMCE部位を含む安定な株を作製した。
RMCEを用いてモノアレレHLA株もまた作製し、ここでは、ベクターV4.D.2を、1つのRMCE部位を含有する細胞にエレクトロポレートした。
エレクトロポレーション後、細胞を、Glutamax-I+10% FBSを含む培養培地RPMI 1640中で2日間インキュベートした(37℃,5% CO2)後、分析した。
トランスフェクションの1日前、細胞を1.2〜1.4×106細胞/60mmディッシュの密度で90% DMEM+2mML-グルタミン+10% HI-FBS(Life Technologies)中に播種した。
翌日、65%コンフルーエントの細胞を、総量5μgのDNA及びjetPEI(登録商標)(Polyplusトランスフェクション試薬、Life Technologies)(N/P比6)でトランスフェクトした。培地を交換した後、トランスフェクションを行った。
HLAクラスI遺伝子の欠失のために、細胞を、0.42μgのCas9_GFPをコードするDNAベクター(V1.A.8)、HLA-A、B及びCを標的するgRNA(それぞれ、V2.A.1、V2.A.7及びV2.B.3)及び空ベクター(V1.C.2)でトランスフェクトした。
AAVS1遺伝子座におけるRMCE部位の組込みのために、細胞を0.5μgのV1.A.8;0.625μgのgRNA V2.J.6及び0.75μgの(RMCE部位によって挟まれる2つのマーカーをコードする)プラスミド(RFPについてはV4.B.2、BFPについてはV4.B.3)でトランスフェクトし、空ベクターV1.C.2を用いて5μgのDNAを満たした。
DNA及びjetPEI(登録商標)のストック溶液を、それぞれ滅菌1M NaCl及び150mM NaClに希釈した。各溶液の最終容量を総混合容量の50%とした。次いで、PEI溶液を希釈したDNAに加え、混合物を室温にて15分間インキュベートした。最後に、DNA/PEI混合物を60mmディッシュに、細胞フィルムを破壊しないように注意深く加えた。細胞を(37℃,5% CO2,95%相対湿度で)48時間インキュベートした後、GFP発現分析を行った。
RMCE組込みのために、細胞を、FLPをコードするDNAベクター(V4.I.8)0.6μg、2μgの成分C/Y、2μgの成分E/Z、DNA送達を追跡するためのマーカーをコードするDNA0.4μgでトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後に、GFP又はRFPポジティブのいずれかのDNA送達マーカーについてポジティブな細胞を、FACSにより選別した。トランスフェクションの4〜10日後に、成分D及びB選択マーカーによりコードされる蛍光タンパク質シグナルの減少を示す個々の細胞を、FACSにより選別した。ACL-987の作製については例外で、GFPポジティブを示す個々の細胞をFACSにより選別した。
一過性発現のために、細胞を、FLPをコードするDNAベクター(V4.I.8)、JG9-TCR-αバリアント(VP.7751.RC1.A1〜VP.7751.RC1.H8)、JG9-TCR-βWT鎖(V3.C.5)及びDNAベクタービヒクル(V1.C.2)でトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後、全ての細胞をHLA-A*02:01-NLVPテトラマー及び抗CD3抗体で染色した。RSUは、CD3ネガティブ集団に対する、CD3ポジティブ集団についてのHLA-A*02:01-NLVPテトラマーシグナルの平均蛍光強度(MFI)の比として算出し、各TCR鎖対バリアントの結合強度の指標であった。
Cas9-P2A-GFP(V1.A.8)又はGFP選択マーカーをコードするプラスミド(V1.A.4)をエレクトロポレートし又はトランスフェクトした細胞を、FACSJAzzTM細胞ソーター(BD Biosciences)を用いて、一過性GFP発現について選別した。
HEK 293細胞を、TrypLETM Express Trypsin(ThermoFisher Scientific)を用いて採集し、適切な容量のDPBS 1×(Life Technologies)中に再懸濁した後、20% HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含有するDMEM 1×培地中で細胞選別を行った。
ARH-77細胞を洗浄し、適切な容量のDPBS中に再懸濁した後、Glutamax-I並びに20% HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含むRPMI 1640中で選別を行った。
DNAは、QIAamp DNAミニキット(Qiagen)を用いて5×106細胞から抽出した。DNAは、1×TE(10mM Tris pH8.0及び0.1mM EDTA)中に貯蔵した。
所望の表現型特徴を有するモノクローンをスクリーニングし、分子レベルで評価し、これを、製造業者が推奨する成分及び容量を用いる20μlの反応剤中、Q5(登録商標) Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ(NBE)を用いるPCRにより行った。
HLA I ORFがHLA遺伝子座に組み込まれたかどうかを決定するため、プライマー9.C.4及び9.D.6を用いた;正しい右相同性アーム組換えは1kbアプリコンにより示された(表2)。
AAVS1遺伝子座におけるHLA組込みについて、4セットのプライマーを用いた:正しい左相同性アーム組換え(1.1kb)を評価する9.C.3及び9.C.8、右相同性アーム組換え(660bp)を評価する9.C.4及び9.D.1、内部構築物のCMVプロモーター(810bp)を増幅する1.C.5及び9.C.5、並びに内部構築物のSV40pAターミネーターについてのアプリコンを取得する1.C.2及び9.C.10(380bp)。HEK293及びARH-77 HLA-ヌル株におけるRMCE部位組込みの評価を、プライマーセット2及び4を用いて行った。
HEK293細胞におけるHLAクラスI欠失を確証するため、特異的HLAプライマーを以下のとおり用いた:HLA-Aを標的する4.A.3及び4.A.4、HLA-Bについての4.A.7及び4.B.1、並びにHLA-Cについての4.B.5及び8.A.1。最初に、PCR Master Mixを、全成分(Q5(登録商標)反応緩衝液、dNTP、Hot-Start Q5(登録商標) DNAポリメラーゼ、プライマーFwd及びRev、100ngのDNAテンプレート並びにH20)を用いて調製した。PCR反応は、C1000 TouchTM Thermal Cycler(Bio-Rad)を用いて行った。PCR産物は、1×TAE緩衝液中、1%アガロースゲルで、PowerPac Basic(Bio-Rad)を用いて泳動させ、10,000希釈のsybersafeで染色し、Fusion SL(Vilber Lourmat)を用いて分析した。
組み込まれたタンパク質又はマーカーを構成的に発現する細胞の集団を取得するために、細胞を、第1のGFP+選択の7〜15日後に選別した。
表面タンパク質を発現すると予測される細胞については、抗体染色を行なった後、選別を行った。HLAクラスI遺伝子については、PE-CyTM5マウス抗ヒトHLA-ABC抗体(BD Biosciences)を用いた。HLA-DR及びHLA-DPの染色は、Alexa Fluor(登録商標) 647マウス抗ヒトHLA-DR、DP、DQ(BD Biosciences)を用いて行った。
HEK 293由来細胞株の場合、細胞を、TrypLETM Express Trypsin(ThermoFisher Scientific)を用いて採集し、適切な容量のDPBS 1×(Life Technologies)中で洗浄した後、20% HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含有するDMEM 1×培地中で細胞選別を行った。
ARH-77由来細胞株を適切な容量のDPBS中で洗浄した後、Glutamax-I並びに20% HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含むRPMI 1640中で選別を行った。
HLAノックアウト又は組込みのために、細胞の選択を、それぞれHLA発現の喪失又は獲得に基いて行った。RMCE部位が組み込まれた細胞を、BFP及びRFPマーカーの発現に基いて選別し、pp65変異体が組み込まれたHLAモノクローンをGFP発現について選別した(表3)。
興味対象の遺伝子を発現する細胞のモノクローナル選別を、200μlの増殖培地を含む96ウェルプレート中で行った。サンプルあたり1〜2のプレートを選別した。直後に、残りの細胞のポリクローナル選別を、FACSチューブ中、細胞ソーターInfluxTM(BD Biosciences)において二方式選別設定を用いて行った。
増殖させたモノクローン集団の20,000細胞を、分析のためにマイクロタイタープレートに移し、細胞を250μlのDPBS 1×(Life Technologies)に再懸濁し、LRSFortessaTM(BD Biosciences)で分析した。
BFP及びRFP発現を、それぞれBV421用PMTs及びPE-Texas Red fluorophoreを用いて検出した。
選択モノクローンは通常の増殖培地で維持した。HEK239細胞はDMEM+2mML-グルタミン+10% HI-FBS(Life Technologies)中で増殖させ、ARH-7細胞は、Glutamax-I+10% HI-FBSを含むRPMI 1640中で増殖させた。
細胞のコンフルーエンスを、10〜12×106に達するまで毎日モニターした。DNAを5×106細胞から、QIAamp DNA Minikit(Qiagen)を用いて抽出した。残りの細胞を更に増殖させ、密度3×106細胞/mlで、70%増殖培地+20% HI-FBS+10% DMSO中に凍結保存した。
単一細胞選別又はポリクローン選別を、BDInflux装置を用いる標準的な細胞選別法により達成した。簡潔には、ACL細胞を、TrypLETM Express Trypsin(ThermoFisher Scientific)を用いて採集し、適切な容量のDPBS 1×(Life Technologies)中に再懸濁した後、20% HI-FBS及び抗Anti 100X(Life Technologies)を含有するDMEM 1×培地中で細胞選別を行った。
細胞を、HLA-マルチマー反応剤で氷上にて10分間染色した後、CD3及び/又はTCRab抗体で染色した。BDInflux装置による特異的細胞蛍光特性の検出を表3に示す。
モノクローナル作製のための単一細胞の選別のため、興味対象の表現型を表示する細胞を、200μlの増殖培地を含有する96ウェルプレートに配置した。サンプルあたり1〜2のプレートを選別した。ポリクローナル細胞選別を、培地を含有するFACSチューブ中、細胞ソーターInfluxTM(BD Biosciences)において二方式選別設定を用いて行った。
分子特徴決定のために、JG9-TCR-αバリアントの単一細胞を選別し、5μlのヌクレアーゼフリーの水を予め充填したPCRプレートに配置した。その後の加工処理まで、標本を急速凍結した(snap-frozen)。
DNAは、QIAamp DNAミニキット(Qiagen)を用いて5×106細胞から抽出した。DNAは、1×TE(10mM Tris pH8.0及び0.1mM EDTA)中に貯蔵した。
TRA-ORFの組込みを評価するために用いるプライマーを、TRA-Cセグメント(フォワードプライマー1.F.7)及びゲノム受入部位に予め存在する部分であるsv40pAターミネーター(リバースプライマー15.H.2)にアニールさせた。予測サイズ566bp。
TRB-ORFの組込みを評価するために用いるプライマーを、TRB-Cセグメント(フォワードプライマー1.F.9)及びゲノム受入部位に予め存在する部分であるsv40pAターミネーター(リバースプライマー15.H.2)にアニールさせた。予測サイズ610bp。PCR産物は、1×TAE緩衝液中、1%アガロースゲルで、PowerPac Basic(Bio-Rad)を用いて泳動させ、10,000希釈のsybersafeで染色し、Fusion SL(Vilber Lourmat)を用いて分析した。
選択したACL-851モノクローンのDNAを、興味対象のTCR_ORF Cセグメントを標的する特異的プライマー及びプローブを用いることにより分析した。
TCR-α ORFコピー数を評価するために用いるプライマー及びプローブ(フォワードプライマー1.F.7、リバースプライマー1.F.8及びプローブ1.G.1)をTRACセグメントにアニールさせた。
TCR-β ORFコピー数を評価するために用いるプライマー及びプローブ(フォワードプライマー1.F.9、リバースプライマー1.F.10及びプローブ1.G.2)をTRBCセグメントにアニールさせた。
全ての場合で、参照遺伝子(TRAC)を同時にスクリーニングして、プライマー10.A.9及び10.A.10並びにHEXと接合した蛍光プローブ10.B.6を用いて染色体のコピー数を決定した。組込みコピー数から、参照遺伝子(TRAC)について、HEK293細胞は参照遺伝子(TRAC)について三倍体であると考えられた。
デジタルドロップPCRの前に、DNAをMfeI(NEB)で消化し、直列組込みを分離した。反応セットアップ及びサイクル条件は、QX200TM Droplet Reader及びDroplet Generator及びC1000 TouchTM deep-well Thermal cycler(Bio-Rad)を用いるddPCRTM Supermix for Probes(No dUTP)(Bio-Rad)のプロトコルに従った。QuantaSoftTMソフトウェアを用いてデータを取得し、FAMの検出にはCh1を用い、HEXについてはCh2を用いた。
FACS選別した個々のeTPC-t細胞を、TCR-α及びTCR-βの各々についてV領域特異的プライマーコレクションを伴う二工程増幅プロセス、続いて、配列分析のためのTCR-α及びTCR-βアプリコンを生じるペア型ネステッドPCR反応に供した。この手順は、以前に記載されている(Hanら、Nat Biotechnol. 2014 32(7): 684-692)。以下の材料を、記載する手順で用いた:
eTPC-t及びAPC細胞を、RPMI+10%熱不活化胎仔ウシ血清(完全培地)中で、0.2×106〜1.5×106細胞/mlの間、37℃、90%相対湿度及び5%CO2にて慣例的に培養した。ペプチドNLVPMVATV及びVYALPLKMLは、Genescriptにより合成され、凍結乾燥された状態で受領した。ペプチドの一次ストックを10%DMSOに懸濁し、−80℃にて貯蔵した。作業ストックは、50μMにて完全培地(50×濃縮)に用時調製した。HLA-A*02:01(ACL-209)又はHLA-A*24:02(ACL-963)又はHLA-ヌル(ACL-128)を提示する以下のAPCを用いた。eTPC-t細胞株(ACL-1277、成分A)は、2つの独特なゲノム受容部位(成分B、D)を有し、HLAヌルとなるように遺伝子操作されており、天然型CD3発現を利用し、二成分 合成応答エレメント(成分F)を有した。加えて、ACL-1277は、成分B、DがB'/D'に変換されおり、pHLA:HLA-A*02:01-NLVPMVATVに特異的なTCRspをコードするTCRα/β ORFが組み込まれている(実施例8を参照)。
APC細胞の活発に増殖している培養物(0.5〜1.0×106細胞/ml)を懸濁し、サンプルを採取し、計数して細胞濃度を決定した。その後、1百万細胞を採集し、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS、Gibco)で1回洗浄した後、細胞濃度1〜2×106細胞/mlにて1μMのペプチドと又はペプチドなしで完全培地に懸濁した。細胞を2時間、標準培養条件で、24ウェル培養プレートにてインキュベートした。2時間後、細胞を採集し、遠心分離(400rcf、3分間)によりペレット化した後、DPBSで3×10mlで洗浄した。細胞を、その後、完全培地中に0.2×106細胞/mlにて懸濁した。
eTPC-t細胞の活発に増殖している培養物(0.5〜1.0×106細胞/ml)を懸濁し、サンプルを採取し、計数して細胞濃度を決定した。細胞を採集し、PBSで1回洗浄し、次いで、完全培地中に0.6×106細胞/mlの濃度にて懸濁した。
96ウェル丸底プレートの各ウェルに、50μlの完全培地、50μlのAPC、続いて50μlのeTPC-tを加えた。これは、1:3の比の約10,000のAPC及び30,000のeTPC-tであり、約0.27×106細胞/mlの全細胞濃度であった。次いで、細胞混合物を標準培養条件にて約24時間インキュベートした。
24時間のインキュベーション後、細胞を採集し、0.75mlのV底Micronicチューブに移植し、500μlのDPBSで1回洗浄し、その後、以下のように死細胞マーカー(DCM-APC-H7)で染色した。各ウェルに、25μlの染色溶液を加え、細胞を混合により懸濁し、次いで、15〜20分間インキュベートした。染色溶液は、100μl染色溶液あたり0.5μlのDCM-APC-H7で構成されていた。インキュベーション後、細胞を、500μlのDPBS+2%FCS(洗浄緩衝液)で2回洗浄した。次いで、細胞をeTPC-tに独特な表面マーカーについて染色した。各ウェルに、30μlの染色溶液を加え、細胞を混合により懸濁し、次いで、30〜45分間インキュベートした。染色溶液は、100μl染色溶液あたり2.5μlの抗myc-AF647で構成された(クローン9E10、Santa Cruz Biotech)。インキュベーション後、細胞を、500μlの洗浄緩衝液で2回洗浄し、次いで、200μlの洗浄緩衝液に懸濁し、次いで、FACSによりLSR-Fortessa(BD Biosciences)で分析した。
細胞調製
CMVウイルスに由来するNLVPペプチドに特異的なTCRを有するeTPC細胞株を採集し、50mlチューブにプールした。細胞を400gにて5分間ペレット化し、PBSで1回洗浄した。eTPCを3mlのPBSに再懸濁し、計数した。4百万細胞を固定のために各15mlチューブに分配した。
固定溶液を使用前に新たに、細胞固定液(10%パラホルムアルデヒド(PFA))及びリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)を含む)を最終濃度2% PFAに希釈することにより調製した。1mlの固定溶液を細胞ペレットに加え、数回のピペッティングにより細胞を混合した。未処理コントロールについては、固定溶液に代えて1mlのPBSを加えた。細胞を、室温にて5分間インキュベートした後、3mlのPBSを添加して洗浄し、400gにて5分間ペレット化した。次いで、細胞を500μlのPBSに再懸濁した後、染色のためmicronicチューブに移した。
細胞を先ずマルチマーで10分間室温にて染色した後、抗CD3抗体を加え、サンプルを更に4℃にて30分間インキュベートした。LSRFortessaで細胞を取得した。
CMVウイルスに由来するNLVPペプチドに特異的なTCRを有するeTPC細胞株を採集し、50mlチューブにプールした。細胞をPBSで1回洗浄し、400gにて5分間ペレット化させて沈降させた。次いで、細胞を5mlのPBSに再懸濁した後、フローサイトメーターで単一細胞として、300μlの染色緩衝液を含む5ml FACSチューブ中に選別した。
選別は細胞の散乱にのみ基いた。ゲーティング:SSC対FSC→散乱プロットからの生存細胞のゲーティング;生存細胞をFSC-W対FSCでプロットした
→選別する単一細胞のゲーティング。細胞を400gにて5分間ペレット化し、計数し、Alexa 647-CD58で30分間4℃にて染色し、洗浄した後、スパイクインアッセイで使用した。
CMVペプチド(NLVP)に関してポジティブな、健常血液ドナー由来の凍結PBMC(勾配分離を用いて事前に50mlチューブに単離)を解凍し、計数した後、スパイクイン実験に用いた。
スパイクインアッセイのために、micronicチューブにおいて、2×106のPBMCをeTPCなしで又は50 000のeTPCと共に混合した。細胞を先ずマルチマーで10分間室温にて染色した後、抗CD3及び抗CD8抗体を加え、サンプルを4℃にて更に30分間インキュベートした。LSRFortessaで細胞を取得した。
実施例1:標的化変異誘発によるAPX遺伝子ファミリーの欠失
本実施例では、遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)の形質を作製するために、抗原提示複合体(APX)のファミリーをコードする遺伝子の標的化変異誘発をどのように達成したかを記載する。前記形質はAPXファミリーの少なくとも1つのメンバーの表面発現の欠失である。
本実施例では、標的付けられたAPXは、HEK293細胞株における主要HLAクラスIファミリーの3つのメンバーHLA-A、HLA-B及びHLA-Cを含んでなっていた。HEK293細胞は、HLA-ABCの内因性表面発現を示すヒト胚性腎臓細胞に由来するものであった。細胞遺伝学的分析は、この細胞株が三倍体に近い核型を有し、したがってHEK293細胞が各HLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子の3つのアレレをコードしていることを証明した。
HLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子の標的化変異誘発は遺伝子操作されたCRISPR/Cas9システムを用いて行われ、該システムでは、Cas9ヌクレアーゼ活性は、合成ガイドRNA(gRNA)によりHLA-A、HLA-B及びHLA-C遺伝子座に標的付けられた。4〜5の独特なgRNAが、各HLA遺伝子遺伝子座について、保存されたヌクレオチド配列を標的するように設計され、標的付けられた部位は遺伝子コーディング配列の開始点に向けられた。なぜならば、このことがヌルアレレを生じさせる可能性がより高いからであった。標的付けられた遺伝子座で変異を誘導するgRNAの効率が決定され、最も効率的なgRNAが、HLA-A、HLA-B及びHLA-Cヌル(HLA-ABCnull)HEK293細胞株を生じさせるために選択された。
結論として、遺伝子改変されたHEK293細胞株(ACL-414、ACL-415及びACL-416を含む)は、HLA-ABCの表面発現を欠くことが証明され、したがって遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)の形質を有していた。
本実施例では、成分BをHLA-ABCnullモノクローン株ACL-414に安定に組み込んでeTPCの第2の形質を生じさせる方法を記載する。前記第2の形質は、少なくとも1つのORFの組込みのための少なくとも1つのゲノム受容部位を含み、ここで、ゲノム受容部位はリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物であった。
本実施例では、ゲノム組込み部位(成分B)は選択された遺伝子エレメントで構成される。2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3(これらは、選択マーカー青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟み込む)。FRT部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F3部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。異種特異的リコンビナーゼ部位の外側に非コーディングシス調節エレメントが位置することの利点は、それらがマッチした遺伝子ドナーベクター(成分C)に必要でないことである。したがって、遺伝子ドナーベクターの細胞送達後、コードされるORFの一過性発現は観察されない。このことから、奏功するRMCEの選択が、遺伝子ドナーベクターからのORFの細胞発現がおそらく成分Bへの正しい組込み後にのみ生じるような、より信頼できるものとなった。なぜならば、適切なシス調節エレメントが含まれているからである(実施例6を参照)。
成分Bの安定な組込みは、ゲノムセーフハーバー遺伝子座AAVS1での相同性指向組換え(HDR)のプロセスにより達成された。ACL-414細胞株を、AAVS1遺伝子座を標的する最適なgRNAをコードするプラスミド、Cas9-P2A-GFPをコードするプラスミド及びAAVS1左右相同性アームが隣接する成分B遺伝子エレメントをコードするプラスミドでトランスフェクトした。Cas9-P2A-GFPプラスミド取込みについてポジティブな細胞を、トランスフェクションの2日後にGFP蛍光に基いてFAC選別した(図28a)。GFP選別された細胞を7日間以上更に増殖させて、HDRが生じ、選択マーカーBFPの一過性発現を喪失するに十分な時間を許容させた。この増殖期間の後、細胞をFACS装置で分析し、個々のBFPポジティブ細胞を選別し、増殖させてモノクローン集団とした(図28c)。
結論として、遺伝子改変されたACL-469及びACL-470細胞株はHLA-ABCnullであり、単一コピーの、RMCE用に設計された合成ゲノム受容部位を含んでおり、したがってeTPCにおいて更に改変することができる2つの形質を含む細胞株の作製が証明された。
本実施例では、成分B及び成分DをHLA-ABCnullモノクローン株ACL-414に安定に組み込んでeTPCの第2の形質を生じさせる方法を記載する。前記第2の形質は、少なくとも1つのORFの組込みのための2つのゲノム受容部位を含み、ここで、ゲノム受容部位はリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物であった。
本実施例は、第2のゲノム受容部位(成分D)を追加したことを除き、実施例2に記載されたものと同じ方法及び成分を使用する。成分D遺伝子エレメントは、成分Bとは異なる2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15で構成された。これら部位は、選択マーカー赤色蛍光タンパク質(RFP)をコードするORFを挟むものであった。F14部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F15部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。実施例2のように、成分D遺伝子エレメントは、各々がAAVS1ゲノム遺伝子座に相同な>500bpの配列で構成されるAAVS1左右相同性アームに挟まれていた。
成分B及び成分Dを、成分Dエレメントをコードするプラスミドのトランスフェクションミックスへの追加を除き、実施例2に記載したようにAAVS1に組み込んだ。Cas9-P2A-GFPプラスミド取込みについてポジティブな細胞を、トランスフェクションの2日後にGFP蛍光に基いてFAC選別した(図28b)。GFP選別された細胞を7日間以上更に増殖させ、その後、細胞をFACS装置で分析し、個々のBFP及びRFPポジティブ細胞を選別し、増殖させて、モノクローン集団とした(図28d)。
結論として、遺伝子改変されたACL-472細胞株はHLA-ABCnullであり、単一コピーの、RMCE用に設計された合成ゲノム受容部位 成分B及び成分Dを含んでおり、したがってeTPCにおいて更に改変することができる複数の形質を含む細胞株の作製が証明された。
本実施例では、図32及び図34のワークフローの例を示す。ここでは、第1の標的基本細胞は適切なTCRspコンピテント基本細胞として同定され、続いて、TCRspコンピテント基本細胞は、ゲノムに、CD3の4つ全てのタンパク質CD3γ、δ、ε及びζをコードする単一ORFとしてCD3の発現をコードする遺伝物質が組み込まれることにより遺伝子操作される。4つのコードされるタンパク質は、自己切断ウイルスP2Aペプチドを介して連結され、その結果、転写物の翻訳の間に、各P2Aペプチドの作用により、4つの個々のタンパク質の分離及び放出が引き起こされる。翻訳及び分離が生じると、CD3タンパク質は、その後、遊離して、会合し、CD3複合体に組み立てられる。しかし、組立て及び細胞表面への輸送は、翻訳された相補性TCR鎖対の存在下でのみ生じる。
BD LSRFortessa装置と高スループットサンプラーとを用いてFAC分析を行った。BD Influx細胞ソーター又はBD FACSJazzソーターを用いてFAC選別を行った。PEI法による化学的トランスフェクションを用いてACL-5及び派生細胞のトランスフェクションを行った(NP比6、PEI反応あたりの最終DNA濃度200ng/μl及び3.33μgのトータルDNA/1百万細胞)。当業者に公知の標準手順を用いて細胞を染色した。CD3及びTCR-α-βに対する親和性を有する蛍光標識抗体はBDから購入した。抗CD3はFITC又はPE-CF5486と接合され、抗TCR-α-βはBV786又はAPCと接合されていた。aAPX:aAM可溶性反応剤はImmudexから購入した。特に、デクストラマーHLA-A*0201は、NLVPMVATVが積荷として積載されており、PEフルオロフォアに接合されており、A2-NLV-PEと呼ばれた。用いたプラスミドは、当業者に公知の標準方法を用いて取得した。
HEK293由来細胞ACL-5を標的基本細胞として選択し(図32、工程a)、抗TCR-α-β及び抗CD3で染色し、続いてFACS分析して、TCRsp及びCD3の表面発現の欠失を同定した(図32、工程b)。比較として、コントロール細胞を染色して分析した。図39に示すように、表面発現は検出されなかった(図32、工程c)。加えて、CD3発現の欠失はまた、標的基本細胞がTCR-γ-δ発現を欠くことを示し、TCR鎖相補対の発現の不在下ではCD3が表面に発現することができないことを示した。
その後、標的基本細胞を3つの一過性発現プラスミドで化学的にトランスフェクトした。第1のプラスミドは4つ全てのCD3タンパク質を、P2Aウイルスペプチドにより連結された単一ORFとしてコードしていた(V3.C.6)。第2及び第3のプラスミドはTCR鎖の相補対(pTCR)をコードし、ここで、各プラスミドはTCRα鎖又はTCRβ鎖のいずれかの一過性発現をコードしていた(図32、工程d)。2つの異なるTCRα-β対をトランスフェクトした。1つの対は、NLVPMVATVペプチドが積載されたHLA-A*02:01に特異的なTCRspをコードし(V3.C.3、V3.C.5、A2-NLVpos)、他方の対は、特異的でないTCRspをコードしていた(V3.C.2、V3.C.4、A2-NLVneg)。
2日間の増殖後、トランスフェクト細胞を、抗TCR-α-β及び抗CD3で染色し(図32、工程e)、加えて、A2-NLVpos TCRab対の同族抗原である可溶性aAPX:aM(dexA2-NLV-PE)を用いて細胞を染色した。染色細胞をその後FACSにより分析し、該細胞がCD3及びTCRspの表面発現についてコンピテントであることが示された(図40)。加えて、A2-NLVposをトランスフェクトした細胞はdexA2-NLV-PEへの結合を示した一方、A2-NLVnegをトランスフェクトした細胞はdexA2-NLV-PEへの結合を示さなかった(図40)。このことは、細胞がTCRspの発現に関してコンピテントであることを示した(図32、工程f)。その後、標的基本細胞を適切なTCRspコンピテント基本細胞として選択した。
次いで、TCRspコンピテント基本細胞をHLAクラスIファミリーのaAPXの標的化変異に供して、細胞を、HLAクラスIファミリーのaAPXの発現を欠くものとした。実施例1に示した手順を用いて変異細胞を得た。加えて、TCRspコンピテント基本細胞は、天然に、HLAクラスIIファミリーのaAPXの発現を欠いており、よって、得られたTCRspコンピテント基本細胞は、2つのファミリーのaAPXの発現を欠くものであった。
TCRspコンピテント基本細胞(2つのaAPXファミリーの発現を欠く)を、2つの一過性発現プラスミドで化学的にトランスフェクトした。第1のプラスミドは以前に記載したとおりのCD3をコードし(V3.C.6)、他方はTCRα(V3.C.2、V3.C.3)又はTCRβ(V3.C.4、V3.C.5)のいずれかをコードしていた。これは、図34、工程hの改変バージョンである。2日間の増殖後、トランスフェクト細胞を、抗TCR-α-β及び抗CD3で染色し(図34、工程i)、その後FACSにより分析し(図41)、該細胞がTCRsp及びCD3の表面発現を欠くことが同定され(図34、工程i)、CD3もTCRα又はTCRβも内因性に発現されないことが確証された。
CD3をTCRspコンピテント基本細胞に組み込んだ(図34、工程k)。組込みを達成するため、細胞を3つのプラスミドで一過性にトランスフェクトした。第1のプラスミドは第1の組込み因子Cas9-2A-GFPの発現をコードし(V1.A.8)、第2のプラスミドは第2の組込み因子(HLA-A遺伝子座に標的付けられたガイドRNA)の発現をコードしていた(V2.A.2)。第3のプラスミドは、HLA-A遺伝子座に標的付けられた部位特異的相同組換え用であり、ヒトEF1a-長プロモーター及びSV40pAターミネーターによるCD3の発現タンパク質を、P2Aウイルスペプチドにより連結された単一ORFとしてコードしていた(V4.I.7)。
トランスフェクションの2日後、細胞を採集し、GFP発現に基いて選別し、CD3をコードする配列がHLA-A遺伝子座に組み込まれたCas9発現細胞の割合を高めた(図42)。
選別された細胞を3日間増殖させた後、細胞を3つのプラスミドでコトランスフェクトした。第1のプラスミドGFPの発現をコードし、トランスフェクションコントロールとして用いた。第2及び第3のプラスミドは各々、pTCR(A2-NLVpos)のTCR-α(V3.C.3)鎖又はTCR-β鎖(V3.C.5)のいずれかをコードしていた(図34、工程l)。トランスフェクト細胞を2日間増殖させ、その後、抗CD3で染色した(図34、工程m)。次いで、細胞をCD3の表面発現について選択し(図34、工程n)、ここで、選択は、FAC選別によりポリクローナル集団として行った(図43)。
低温保存、PCR、ddPCR及びFACS分析によるゲノム及び表現型分析に利用可能な数になるまで単一細胞クローンを増殖させた。96の単一細胞選択物のうち、20が分析まで生存し、20クローンのうちの8つが正しいゲノム組込みに関してポジティブであり、デジタルドロップ分析によってもポジティブであった。この8つのポジティブモノクローンを、pTCR(A2-NLVneg)のTCR-α(V3.C.2)鎖又はTCR-β鎖(V3.C.4)のいずれかをコードする2つのプラスミド及びGFP発現をトランスフェクションコントロールとしてコードする第3のプラスミド(V1.A.4)でトランスフェクトした。次いで、細胞を抗CD3及び抗TCR-α-βで染色し、TCRsp及びCD3の表面発現について分析した(図34、工程n)。8つのうち2株が表面発現についてポジティブであった。1つの株は高率の発現を示し(図46)、その後、この株を確証基本細胞として選択した。
本実施例は、標準化様式でのeTPC-tの作製を記載する。ここで、親のeTPCは、別異の合成ゲノム受容部位 成分B及びDを含有する。遺伝子ドナーベクター成分C'及びE'は、HLA-A2アレレにおいて提示されるとき、ヒトサイトメガロウイルスポリペプチド65(HCMV pp65)に由来する抗原性ペプチドNLVPMVATV(NLVP)と結合することが知られている単一鎖のTCR対(JG9-TCR)を含むものであった。成分C'及びE'はRMCE用に設計され、親の成分C及びEに由来する。
本実施例は、TCRヌル、HLAヌル、CD4ヌル及びCD8ヌルであり、更に成分B及びDを含有する親eTPC細胞株ACL-488を使用する。成分Bは、コザック配列及び選択マーカー青色蛍光タンパク質(BFP)をコードするORFを挟む2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位FRT及びF3を含む。FRT部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F3部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。成分Dは、成分Bとは異なる2つの独特な異種特異的リコンビナーゼ部位F14及びF15を含む。これら部位は、コザック配列及び選択マーカー赤色蛍光タンパク質(RFP)をコードするORFを挟む。F14部位の5'側にはEF1aプロモーターがコードされ、F15部位の3'側にはSV40ポリアデニル化シグナルターミネーターがコードされていた。
本実施例は、各々が2つの異種特異的リコンビナーゼ部位FRT/F3(C')及びF14/F15(E')を含み、よってそれぞれ成分B及びDにマッチしている遺伝子ドナーベクター(成分C'及び成分E')を使用する。成分C'は、FRT/F3部位間に、コザック配列、開始コドン及びJG9-TCR-β鎖をコードするTCR ORFを更に含む。成分E'は、F14/F15部位間に、コザック配列、開始コドン及びJG9-TCR-α鎖をコードするTCR ORFを更に含む。
まとめると、eTPCは、RMCEベースの組込み法を用いて成分C'及びE'に送達されるTCR ORFを組み込む(その結果、成分B及びDが成分B'及びD'に変換される)ことにより、eTPC-tに変換された。このeTPC-tは細胞表面に機能的TCRspを発現した。更に、本実施例は、eTPC-t及び被分析物抗原の二元組成物が組み合わされて、eTPC-tが可溶性被分析物抗原(HLAマルチマー:HLA-A*02:01-NLVPMVATV)との複合体形成に基いて選択されるという単純なeTPC:Aシステムの動作を証明している。
本実施例はeTPC-tのeTPC-xへの変換を記載する。ここで、eTPC-xはTCR鎖ORFをコードする成分B'を有し、成分Dは相補性TCR鎖ORFの組込みに利用可能である。eTPC-xの成分DへのeTPC-tの成分D'の変換は、成分D'にマッチしている遺伝子ドナーベクター(成分Z)の使用により達成される。
本実施例では、実施例5で作製した親eTPC-t細胞株ACL-851を用いた。成分Zは、成分D'にマッチしている2つの異種特異的リコンビナーゼ部位F14/F15、コザック配列、開始コドン及び組込みの選択マーカーとして緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするORFで構成されるプラスミドベクターである。eTPC-tを成分Z及びRMCEリコンビナーゼ酵素をコードするベクターとエレクトロポレーションにより組み合わせた。その後、細胞を、CD3提示の喪失及びGFP組込みの選択マーカーの獲得について選択した。モノクローンACL-987をFACSにより表現型に関して特徴付けた。ACL-987はGFPを獲得し、CD3及びTCRabを喪失したことが観察され(図49b、d)、このことは、JG9-TCR-αのGFP ORFでの交換及び成分D'の成分Dへの変換が奏功し、よって、eTPC-xが作製されたことを示している。対照的に、親eTPC-tであるACL-851は、GFP発現を欠き、CD3及びTCRab表面発現を有する(図49a〜c)。
まとめると、本実施例は、成分D'のJG9-TCR-α TCR ORFを除去し、GFP組込みの選択マーカーと交換することによって代替の相補性TCR鎖ORFの更なる組込みカップリング事象のための成分Dを作製することによるeTPC-tのeTPC-xへの変換を証明する。この変換は、ゲノム組込みのためのRMCE法を用いて行われた。
本実施例は、64の単一JG9-TCR-αバリアントをコードするベクター(成分E)のプールを、単一工程として、親のeTPC-x細胞株(実施例4に記載する)に組み込んで、プールされたeTPC-tライブラリー(各細胞に元のベクタープールからのα鎖をコードする単一ランダムTCR ORFが組み込まれている結果、各eTPC-tがTCR ORFの単一ランダム対をTCRspとして発現する)を作製する方法を記載する。個々のeTPC-tが一緒に組み合わさって、プールされたeTPC-tのライブラリーを構成し、ここで、細胞プールは、おそらく、64のTCR-αと元の定まったTCRβ鎖との可能な対の全ての組合せを表わしている(図12概略図参照)。このような方法を、本明細書において、「ショットガン」組込みと呼ぶ。64のJG9-TCRαバリアントは、V及びJフラグメントの接合部にあるCDR3配列を改変することにより作製した。
本実施例では、JG9-TCR-β(成分B')及びCD3複合体を表面発現しない親eTPC-x細胞株ACL-987(実施例6参照)を用いた。成分Dは、実施例6に記載するように、選択マーカーGFPをコードする。本実施例では64のJG9-TCR-αバリアントフラグメントを成分Eドナーベクターにクローニングして、F14/F15部位に挟まれ成分Dにマッチする成分E'を作製した。その後、64のベクターを単一ベクタープールに組み合わせた。
eTPC-tプールを、RMCEベースのゲノム組込みにより作製した。ここでは、eTPC-x(ACL-987)と64の成分E'とRMCEリコンビナーゼベクターとをエレクトロポレーションにより組み合わせた。ポリクローンを、GFP発現に基づいて選択した。得られるポリクローンACL-988は、GFPポジティブ細胞のみで構成される親株とは異なり、GFPポジティブ及びGFPネガティブの両方の細胞集団で構成された(図50 a及びb)。しかし、GFPネガティブ集団のみが、強いCD3発現を定常的に示し、このことは、成分Dの成分D'への変換が奏功したこと、したがってeTPC-xがeTPC-tプールに変換されたことを示す(図50 c及びd)。更に、ACL-988 GFPネガティブ集団は、JG9-TCR特異的マルチマー反応剤(DEX HLA-A*02:01-NLVP)で染色したとき、2つの別異の強度を示した。このことは、この集団が、結合効率が異なるTCRバリアントを発現する細胞を含むことを示唆する。
ACL-988プールの個々の細胞を、HLA-マルチマーポジティブ集団及びHLA-マルチマーネガティブ集団から、単一細胞選別した。各単一細胞について、バリアントJG9-TCR-α ORFをコードする成分D'を増幅して配列決定し、上記の一過性発現RSU単位の結果と比較した(図50e)。事実、HLA-マルチマーポジティブである個々のACL-988細胞は、個々に試験したバリアントにおいて高いRSU結果を優勢に示すJG9-TCR-αバリアントをコードしていた(図51e、白抜き円)。更に、pHLA-マルチマーネガティブである個々のACL-988細胞は、低いRSU結果を優勢に示すJG9-TCR-αバリアントをコードした(図51e、白抜き三角)。
結論として、本実施例は、eTPC-x及びプールされたベクター(成分E')ライブラリーの、複数の異なるTCRspeを含有するTPC-tのプールされたライブラリーへの変換のための多成分システムの使用を証明する。これは、ショットガン組込みを用いて単一工程で達成された。更に、本実施例は、eTPC-tプールが被分析物抗原(可溶性親和性反応剤として)と、eTPC:Aシステムに組み合わされることを証明した。被分析物抗原(HLA-マルチマー)との複合体形成に基いて単一細胞プールを選択し、その後、成分D'にコードされるTCR鎖ORFを抽出してDNA配列を取得し得ることが示された。
本実施例では、2つの独特なゲノム受容部位(成分B、D)を有しHLAヌルであるように遺伝子操作され、天然型CD3発現を利用し、遺伝子操作されたゲノム二成分 合成応答エレメント(成分F)を有するeTPC細胞株(ACL-1277、成分A)を記載する。
応答エレメントは、駆動因子-アクチベーター及び増幅因子-レポート成分で構成され、これらの両ユニットは、合成プロモーターを利用するものであった。駆動因子は、NFAT-AP1-NFkBのための3セットの直列の転写因子結合部位(3×NF-AP-NB)をコードする天然型TCRシグナル伝達経路に応答性の合成プロモーターである。転写活性化の際、駆動因子は、増幅因子プロモーター内に同族DNA認識配列が直列で6回存在する、ヘルペスVP16活性化ドメイン、GAL4 DNA結合ドメイン並びにN末端及びC末端の2つの核局在化シグナル(NV16G4N)の融合により導かれる合成の設計された転写因子であるアクチベータータンパク質の発現を誘導する。両駆動因子及び増幅因子プロモーターは、それぞれの転写因子結合部位の直ぐ3'側の、HCMV IE1プロモーターからのコアプロモータ配列(B認識エレメント(BRE)、TATAボックス、イニシエーター(INR)及び転写開始部位)を利用した。増幅因子は、転写活性化の際、レポーター赤色蛍光タンパク質(RFP)の発現を駆動する。
次いで、eTPC-t細胞株を、HLA-A*02:01(ACL-209)若しくはHLA-A*24:02(ACL-963)を提示するか又はHLA-ヌル(ACL-128)であるAPCに対してチャレンジさせた。ここで、被分析物APCは、APCをペプチドNLVPMVATV若しくはVYALPLKMLでパルスするか又はしないことにより調製した。その後、eTPC-t及び被分析物APCを、10,000のAPCと24時間共培養した30,000のeTPC-tからなるeTPC:Aシステムに編成した。24時間後、当業者に公知の技法を用いて、細胞を採集し、洗浄し、集団を区別するためにeTPC-t及び被分析物APCに特異的なマーカーで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。eTPC-t(成分F)の強い活性化(RFP+発現>80%)は、既知の同族抗原pHLA複合体を提示する被分析物APC、すなわち、A*02:01-NLVPMATVを有するAPCでチャレンジしたeTPC-tでのみ観察された(図51a)。対照的に、非特異的被分析物APC(図51b、c、d)又はHLA若しくはペプチドを欠くコントロール被分析物APCで構成されるeTPC:A編成においては、静止状態のRFP発現のみが観察された。
結論として、機能的成分Fを含むeTPC細胞株が遺伝子操作された後、eTPC-tを作製するために使用された。eTPC-tとその同族標的T細胞抗原を提示する被分析物APCとの相互作用に際して、応答はRFP発現の増加として測定可能であった。逆に、非同族T細胞抗原及びHLAを提示するか又はHLAを提示しない被分析物APCと接触させたときには、eTPC-tはバックグランドを超えるRFP発現の測定可能な増加を示さなかった。更に、本実施例は、被分析物APC及び被分析物eTPC-tが別の二元組成物に編成され、eTPC-t応答(TCRspと被分析物抗原との間の協調的複合体が生じる)が被分析物APC及びeTPC-tの両方を同定するために用いられるeTPC:Aシステムを証明する。
本実施例では、インビトロFACSベースアッセイの標準物質としての使用のために、多成分システムを用いて作製され選択された後に、eTPC:Aシステムに編成されたeTPC-tの例を記載する。本実施例は、抗原性分子(AM)HCMV-pp65に由来するペプチドNLVPMVATVが積載されたHLA-A*02:01抗原提示複合体(APX)で構成される抗原(APX:AM)に特異的なTCRspを発現する、確証され選択されたeTPC-t(ACL-851、実施例5)の化学的固定及び低温保存を証明する。TCRspは、貯蔵から回復されたとき、pHLA-マルチマー(APX:AM)標識を維持した(図52a)。更に、これら細胞はヒト末梢血単核細胞(PBMC)調製物に対して「スパイクイン」であり得、同じ標本内で、フローサイトメトリーにより、HCMV-特異的初代T細胞と共に検出された(図52b)。eTPC-tをCD58抗体で予め染色した後、PBMCミックスにスパイクした後、テトラマー反応剤で染色した。CD58パラメーターを用いてeTPC-tとHLA-A*02:01に提示されるNLVPMVATVペプチドに特異的な初代T細胞とを区別した。このことは、特異的TCRsp鎖対を発現するeTPC-tは、抗原特異的T細胞を検出するフローサイトメトリーアッセイにおいて、TCR提示コントロール反応剤として使用できることを証明する。
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<170> BiSSAP 1.3
<210> 1 <223> HCMV Antigen
<210> 2 <223> Analyte Antigenic Peptide
<210> 3 <223> Analyte Antigenic Peptide
<210> 4 <223> pcDNA3.1_GFP vector V1.A.4
<210> 5 <223> pcDNA3.1_RFP vector V1.A.6
<210> 6 <223> SpCas9-2A-GFP vector V1.A.8
<210> 7 <223> pMA-SV40pA vector V1.C.2
<210> 8 <223> HLA-A 02:01 6xHis + Exon2/3-HA-L+R vector V1.C.6
<210> 9 <223> HLA-B 35:01 6xHis + Exon2/3-HA-L+R vector V1.C.9
<210> 10 <223> AAVS1-L_B07_6xH vector V1.F.10
<210> 11 <223> AAVS1-S_A24_6xH vector V1.F.8
<210> 12 <223> AAVS1-l_GFP_HCMVpp65 vector V1.G.10
<210> 13 <223> AAVS1-l_GFP_HCMVpp65 ANET vector V1.G.9
<210> 14 <223> AAVS1-l_GFP_HCMVpp65 AIN vector V1.H.1
<210> 15 <223> AAVS1_DRA_Flag-DRB1_6xHis vector V1.I.5
<210> 16 <223> AAVS1_DPA1_Flag-DPB1_6xHis vector V1.I.7
<210> 17 <223> HLA-A-sg-sp-opti1 vector V2.A.1
<210> 18 <223> HLA-B-sg-sp-3 vector V2.A.7
<210> 19 <223> HLA-C-sg-sp-4 vector V2.B.3
<210> 20 <223> HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_1 vector V2.I.10
<210> 21 <223> HLA-A-ex2-3_sg-sp-opti_2 vector V2.J.1
<210> 22 <223> AAVSI_sg-sp-opti_3 vector V2.J.6
<210> 23 <223> pMA-CS-JG9-TCRbeta vector V3.C.5
<210> 24 <223> AAVS_Efla-intron_F14_RFPnls_F15 vector V4.B.2
<210> 25 <223> AAVS_Efla-intron_FRT_BFPnls_F3 vector V4.B.3
<210> 26 <223> pMA_FRT_HLA-A*02:01-6xHis_F3 vector V4.D.2
<210> 27 <223> pMA-F14-GFP-F15 vector V4.H9
<210> 28 <223> CMVpro-Flp-sv40pA-V2 vector V4.I.8
<210> 29 <223> pMA-F14-TCR-JG9-alpha-F15 vector V7.A.3
<210> 30 <223> pMA-FRT-TCR-JG9-beta-F3 vector V7.A.4
<210> 31 <223> F14-TCRaF15 CDR3degen.64mix vector V8.F.8
<210> 32 <223> JG9-TRA CDR3 64 variants vectors backbone VP.7751.RC1-A1 to H8
<210> 33 <223> CDR3 sequence of a JG9-TRA 64 variant VP.7751.RC1_A1
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<210> 95 <223> CDR3 sequence of a JG9-TRA 64 variant VP.7751.RC1_H8
<210> 96 <223> pMA-sv40_OE_F1primer 1.C.2
<210> 97 <223> pMA-sv40_OE_R1 primer 1.C.3
<210> 98 <223> pMA-CMV_OE_R1 primer 1.C.5
<210> 99 <223> HLA-A-GT-Rg3 primer 4.A.3
<210> 100 <223> HLA-A-GT-Fg2 primer 4.A.4
<210> 101 <223> HLA-B-GT-Fg2 primer 4.A.7
<210> 102 <223> HLA-B-GT-Rg2 primer 4.B.1
<210> 103 <223> HLA-C-GT-Fg2 primer 4.B.5
<210> 104 <223> HLA-A-02_GT_Rg4 primer 4.I.9
<210> 105 <223> HLA-A-Exon3_HA-RE-BglII_F1 primer 6.I.9
<210> 106 <223> HLA-C-04-GT-Rg1 primer 8.A.1
<210> 107 <223> CMV-pA-HLA-Ex3_Probe_F1 primer 8.B.2
<210> 108 <223> CMV-pro_GT_R1 primer 9.C.3
<210> 109 <223> sv40pA_GT_F1 primer 9.C.4
<210> 110 <223> AAVS1_GT_F1 primer 9.C.5
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<210> 112 <223> AAVS1_GT_F4 primer 9.C.8
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<210> 114 <223> AAVS1_GT_R3 promer 9.D.1
<210> 115 <223> AAVS1_GT_R4 primer 9.D.2
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<210> 117 <223> sv40pA-GT-F2 primer 9.D.7
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<210> 119 <223> TRAC_TCRA-ex1_R1 primer 10.A.9
<210> 120 <223> TRAC_TCRA-promoter_F1 primer 10.A.10
<210> 121 <223> TRAC_probe (HEX) primer 10.B.6
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<210> 124 <223> TRBC2-GT-F1 primer 1.F.9
<210> 125 <223> tGFP-Cterm-Out_SQ_F1 primer 3.J.5
<210> 126 <223> TRAC-GT-F1 ddPCR primer/probe
<210> 127 <223> TRAC-GT-R1 ddPCR primer/probe 1.F.8
<210> 128 <223> TRAC-probe-FAM ddPCR primer/probe
<210> 129 <223> TRBC2-GT-F1 ddPCR primer/probe 1.F.9
<210> 130 <223> TRBC2-GT-R1 ddPCR primer/probe 1.F.10
<210> 131 <223> TRBC2-probe-FAM ddPCR primer/probe 1.G.2
<210> 132 <223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.9
<210> 133 <223> TRAC-TCRA-ex1-F1 ddPCR primer/probe 10.A.10
<210> 134 <223> TRAC-probe(HEX) ddPCR primer/probe 10.B.6
aAPX 被分析物抗原提示複合体
aAM 被分析物抗原性分子
APC 抗原提示細胞
APX 抗原提示複合体
BFP 青色蛍光タンパク質
CAR-T CAR T細胞
CM 積荷分子
CRISPR クラスター化した規則配置性短パリンドローム配列反復
gRNA Cas9ガイドRNA
CDR 相補性決定領域
C領域 定常領域
CMV サイトメガロウイルス
DAMPS 危険関連分子パターン
DC 樹状細胞
DNA デオキシリボ核酸
D領域 多様性領域
eTPC 遺伝子操作されたTCR提示細胞
eTPC:A 被分析物eTPC-tが被分析物抗原と組み合わされているeTPC:抗原システム
FACS 蛍光活性化細胞選別
GEM T細胞 生殖系列によりコードされるミコリル反応性T細胞
GFP 緑色蛍光タンパク質
HLAI HLAクラスI
HLAII HLAクラスII
HDR 相同性指向組換え
HLA ヒト白血球抗原
IgSF イムノグロブリンスーパーファミリー
iNK T細胞 インバリアントナチュラルキラーT細胞
J領域 連結領域
MACS 磁性活性化細胞選別
MAGE メラノーマ関連抗原
MAIT 粘膜関連インバリアントT
NCBP 非細胞ベース粒子
ORF オープンリーディングフレーム
PAMPS 病原体関連分子パターン
PCR ポリメラーゼ連鎖反応
RFP 赤色蛍光タンパク質
DNA リボ核酸
SH2 Src相同性2
T細胞 Tリンパ球
TCR T細胞レセプター
TRA TCRα
TRB TCRβ
TRD TCRδ
TALEN 転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ
TRG TRCγ
TAA 腫瘍関連抗原
V領域 可変領域
β2M β2-ミクログロブリン
ZAP-70 70kDaのζ-鎖関連タンパク質
相補TCR鎖の対:翻訳されたタンパク質がTCR提示細胞の表面でTCRspを形成できる2つのTCR鎖。
親和性:2又は3以上の分子又はタンパク質の間の相互作用の動的又は平衡パラメータ
親和性反応剤:被分析物に関して特異的親和性を有するように設計された任意の反応剤。TCRspに関する親和性について使用されることがおおい。
アレレ:所与の遺伝子のバリアント形態。
AM:被分析物抗原性分子。一般に、ゲノムDNA及び/又は特定の導入遺伝子配列から細胞により発現されるタンパク質であるが、代謝産物でもあり得る。AMは、細胞で発現され、フラグメントが次いで積荷としてAPXにより又はそれ自体で細胞表面で提示され得る。積荷としてであってもなくても、AMは、次いで、T細胞レセプター保有細胞又は関連する親和性反応剤の標的になり得る。
アンプリコン:PCRを含む様々な方法を用いる人工的増幅の源及び/又は生成物であるDNA又はRNA片。
被分析物抗原:可溶性反応剤、不動化反応剤の形態で提供されるか、NCBPにより提示されるか、細胞表面に提示される以下AM、APX、APX:CM、APX:AMの少なくとも1つを含んでなる抗原
被分析物APC:被分析物抗原を提示する被分析物細胞
抗体:B細胞と呼ばれる免疫系の専門細胞により発現され、2つの鎖を含む親和性分子。B細胞は、一般には自己タンパク質に結合しないが、宿主を脅かす病原体又は毒素に結合して中和することができる、非常に多くの非常に多様なレパートリーの抗体を発現する。天然の又は人工的に遺伝子操作された抗体は親和性反応剤として用いられることがおおい。
抗原:TCRが結合し得、T細胞内で伝達されるシグナルをもたらる任意の分子(抗原提示複合体により提示されることが多い)
APC:抗原提示細胞。細胞表面にAM、APX、APXを保有する細胞。
APX:抗原提示複合体。有核細胞により、ゲノムDNA及び/又は特定の導入遺伝子配列をコードする遺伝子/ORFから細胞表面で発現及び提示されるタンパク質。APXは、ペプチド又はその他の代謝物分子である積荷を提示する。
C領域:定常領域。T細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの1つ。c領域は、TCRの多様性を駆動するのではなく、免疫系における全般的機能を規定する別個のセグメントである。
CDR:相補性決定領域。標的結合機能のほとんどを行う、TCR及び抗体の、抗原に面する端部の短い配列。各抗体及びTCRは、6つのCDRを含み、これらは、一般に、多数の多様な標的分子の検出を可能にする、当該分子の最も可変な部分である。
CM:積荷子。抗原提示複合体、例えばHLA I又はHLA IIにより提示されるペプチド又は代謝物。CMは、ゲノムDNAから固有に細胞により発現されるか、培養培地に導入されるか又は特異的に導入された遺伝子配列から発現されることができる。
コピー数:細胞のゲノム内でコードされる規定された配列の存在総数。
細胞遺伝学的:染色体の構造及び機能に関する遺伝学、すなわち細胞の核型の決定。
細胞傷害性/細胞毒性:標的細胞を直接的で特異的に損傷する因子をT細胞が放出するプロセス。
D領域:多様性領域。T細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの1つ。各個が、これら領域の多くの異なるバリエーションを有し、そのことにより、各個体は非常に多種類の異なるTCRを有するT細胞で武装することが可能である。
DNA:デオキシリボ核酸。遺伝子及びタンパク質をコードする遺伝物質を形成する分子の化学名称。
内因性:細胞内に起源を発する物質。
真核生物条件付き調節エレメント:規定された条件下で誘導又は抑制され得る、プロモーターの活性に影響し得るDNA配列
真核生物プロモーター:RNAポリメラーゼ結合部位及び応答エレメントをコードするDNA配列。プロモーター領域の配列は、RNAポリメラーゼ及び転写因子の結合を制御し、したがって、プロモーターは、興味対象の遺伝子がどこでいつ発現されるかを決定する大きな役割を演じる。
真核生物ターミネーター/シグナルターミネーター:RNAポリメラーゼIIと結合して転写終結プロセスの誘引するタンパク質因子により認識されるDNA配列。これは、ポリAシグナルもコードする。
eTPC:抗原システム:eTPC:A。被分析物eTPC-tが被分析物抗原と組み合わされているシステム
FACS/フローサイトメトリー:蛍光活性化細胞選別。個々の細胞を特異的細胞表面及び細胞内マーカーの発現について分析できる分析技術。この技術の変法である細胞選別は、規定されたマーカーセットを有する細胞を、更なる分析のために回収することを可能にする。
APXのファミリー:抗原提示複合体を構成する機能的に関連するタンパク質をコードする幾つかの類似する遺伝子のセット。
蛍光(タンパク質)マーカー:特異的な消光及び発光の特徴を有し、顕微鏡観察、FACS及び関連技術により検出できる分子。
遺伝子ドナーベクター:遺伝物質をゲノム受容部位に送達するための遺伝子ベースのベクター。
異種特異的リコンビナーゼ部位:2つのDNA分子のクロスオーバーを促進するための、リコンビナーゼ酵素により認識されるDNA配列。
HLA I:ヒト白血球抗原クラスI。ヒトにおいて全ての有核細胞で発現される遺伝子。発現したHLA Iは、細胞表面に輸送されて、そこで、内部タンパク質の短いフラグメント、ペプチドを積荷としてT細胞レセプターに提示する。このように、これは、進行中の感染の可能性のある固有タンパク質のフラグメントを提示する。HLA Iは、加えて、培養培地に加えられるか、導入遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から生成されるか又は細胞により取り込まれたタンパク質から生成されるペプチドを積荷として提示できる。HLAクラスI遺伝子は多型であり、これは、異なる個体が、提示におけるバリエーションを導く同一遺伝子におけるバリエーションを有する可能性があることを意味する。HLAクラスIIと関連する。
HLA II:ヒト白血球抗原クラスII。ヒトにおいて適応免疫応答を調和し援助する特定細胞(例えば樹状細胞)で発現される遺伝子。HLAクラスIと関連する。HLAクラスIIタンパク質は、細胞表面に輸送され、そこで、外部タンパク質の短いフラグメント、ペプチドを積荷としてT細胞レセプターに提示する。このように、これは、進行中の感染の可能性のある固有タンパク質のフラグメントを提示する。加えて、HLA IIは、培養培地に加えられるか、導入遺伝子エレメントから発現されたタンパク質から生成されるか又は細胞により取り込まれたタンパク質から生成ペプチドを積荷として提示できる。HLAクラスII遺伝子は、多型であり、これは、異なる個体が、提示におけるバリエーションを導く同一遺伝子におけるバリエーションを有する可能性があることを意味する。
免疫監視:免疫系が感染、悪性病変又はその他の病原性である可能性のある変化を検出し、それにより活性化されるプロセス。
インスレーター:遺伝子が近傍の遺伝子の活性化又は抑制により影響されることを妨ぐDNA配列。インスレーターは、サイレント化された遺伝子から活発に転写される遺伝子へのヘテロクロマチンの広がりも妨ぐ。
組込み:細胞の染色体へのDNA配列の物理的ライゲーション。
組込みカップル:対をなす組込みベクター及びゲノム受容部位
内部リボソーム進入部位(IRES):転写されると、キャップ非依存様式で翻訳の開始を可能にするRNAエレメントをコードするDNA配列。
J領域:連結領域。T細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの1つ。各個体は、これらの領域の多数の異なるバリエーションを有して、各個体が非常に多種類の異なるTCRを有するT細胞で武装できるようにする。
核型:細胞の染色体組成。
コザック配列:翻訳の効率的な開始に必要な短い配列
マッチした(する):2つの成分が、相補成分間の相互作用を導き及び制限する遺伝子エレメントをコードするとき。
メガヌクレアーゼ認識部位:メガヌクレアーゼと一般に呼ばれるエンドデオキシリボヌクレアーゼにより認識されるDNA配列
代謝物:細胞の代謝経路により生成又は改変された分子
可動遺伝子エレメント:トランスポサーゼ酵素の活性を有するDNAの組込みを許容するDNA配列。
モノクローン細胞株:細胞複製の反復により単一始祖細胞から生成される規定された細胞群。
天然型:細胞に天然に生じる物質。
非コーディング遺伝子:機能的非コーディングRNA分子に転写されるタンパク質非コーディングDNA配列。
ORF:オープンリーディングフレーム。リボソームによるタンパク質(ポリペプチド)の合成のための翻訳フレームをコードする遺伝物質伸長部。
パラクリン:近傍細胞に直接作用する可溶性因子によるシグナル伝達。
ペプチド:6〜30アミノ酸長のアミノ酸の短い一続き。
表現型分析:細胞の観察可能な特徴の分析。
多型:同一遺伝子の異なるアレレの存在により、同一種の個体における異なる形態の存在。
ポリペプチド:三次元構造を形成する、一続きのペプチドからなるタンパク質。
プライマー:例えばPCRの間に、標的DNA配列の特異的認識を可能にする短いDNA配列。
一次出力:終端出力を誘導及び/又は決定することができるeETP-t細胞、被分析物APC細胞、NCBP又は他の被分析物抗原形態。
プロモーター:遺伝子発現の制御された開始のための調節DNAエレメント。
選択マーカー:人工的選択法に適切な形質を与えるDNA配列。
ショットガン組込み:ベクターのライブラリーが細胞集団に導入されるプロセスであって、このプロセスにより、任意の所与のベクターインサートの単一コピーのみが各単一細胞のゲノムに組み込まれ得る。組込みカップルを介する所与の細胞集団へのプールされたベクターの組込みを言うときに用いる。
スプライスドナー部位:イントロンの5'末端のDNA配列。
合成:人工的に生成又は細胞に導入された物質。
T細胞:Tリンパ球。その表面でT細胞レセプターを発現する白血球。自己と反応しないが、感染及び悪性疾患を認識し、同じ種のほとんどのメンバーからの移植片を拒絶する能力を有するように免疫系により選択される。
TCR:T細胞レセプター。Tリンパ球と呼ばれるリンパ球の亜集団により発現される親和性分子。ヒトでは、TCRは、ウイルス若しくは細菌感染又はガン性細胞からのフラグメントを含む、APX CM又はAPX AMにより提示される積荷を認識する。したがって、TCR認識は、適応免疫系の肝要な部分である。TCRは、細胞表面で対合した2つの鎖からなる。各細胞の表面で発現されるTCRは、様々な遺伝子(v、d、j及びc領域)の大きなプールからランダムに組み立てられ、よって各個が、異なるTCRの非常に大きく多様なレパートリーを発現するT細胞のプールを有する。
TCRsp:CD3と複合体化して表面タンパク質として発現される相補性TCR鎖対、又は可溶性反応剤、不動化反応剤の形態のタンパク質若しくはNCBPにより提示されるタンパク質として発現される相補性TCR鎖対。
終端出力:AM、APX、APX:CM、APX:AM、親和性反応剤又はTCRspの形態の被分析物抗原及びTCR配列。
TRB:TCRβをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする4つの異なる遺伝子座のうちの1つ。翻訳されたTCRβ鎖タンパク質は、代表的には、TCRα鎖タンパク質と対合して、α/βTCRspを形成する。
TRD:TCRδをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする4つの異なる遺伝子座のうちの1つ。翻訳されたTCRδ鎖タンパク質は、代表的には、翻訳されたTCRγ鎖タンパク質と対合して、γ/δTCRspを形成する。
TRG:TCRγをコードする遺伝子座。VDJ組換えTCR鎖を形成できる遺伝子をコードする4つの異なる遺伝子座のうちの1つ。翻訳されたTCRγ鎖タンパク質は、代表的には、転写されたTCRδ鎖タンパク質と対合して、γ/δTCRspを形成する。
V領域:可変領域。T細胞レセプターの組立てに用いられる遺伝子セグメントの1つ。各個が、これら領域の多くの異なるバリエーションを有し、そのことにより、各個体は非常に多種類の異なるTCRを有するT細胞で武装することが可能である。
本発明を下記の項目において更に規定する:
1.第1の成分が遺伝子操作されたTCR提示細胞(eTPC)(成分Aと呼ぶ)であり、第2の成分が被分析物TCR鎖をコードするORFの送達用遺伝子ドナーベクター(成分Cと呼ぶ)である多成分システム。
2.成分Aが
a.TCR鎖α、β、δ及びγの内因性発現を欠き、
b.細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、
c.少なくとも1つの被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする2つのORFの組込みのためのゲノム組込み部位である更なる成分(Bと呼ぶ)を含有する
項目1に記載の多成分システム。
3.成分Cが成分Bにマッチし、成分Cが
a.少なくとも1つの被分析物TCR鎖α、β、δ及び/又はγをコードする単一ORF、及び/又は
b.被分析物TCR鎖対をコードする2つのORF
を送達するために設計されており、a及び/又はbは、被分析物TCR鎖がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として成分A上に発現され得るように、組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、項目1又は2に記載の多成分システム。
4.eTPC(成分Aと呼ぶ)及び1又は2以上の被分析物TCR鎖をコードするORFの送達用遺伝子ドナーベクター(成分Cと呼ぶ)を含んでなり、成分Aが
a.TCR鎖α、β、δ及びγの内因性発現を欠き、
b.細胞がTCR鎖の相補対を発現するときのみという条件で細胞表面に提示されるCD3タンパク質を発現し、
c.少なくとも1つの被分析物TCR鎖α、β、δ又はγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする2つのORFの組込みのためのゲノム組込み部位である更なる成分(Bと呼ぶ)を含有し、
成分Cが成分Bにマッチする遺伝子ドナーベクターを含んでなり、成分Cが
a.少なくとも1つの被分析物TCR鎖α、β、δ及び/又はγをコードする単一ORF、及び/又は
b.被分析物TCR鎖対をコードする2つのORF
を送達するように設計されており、a及び/又はbは、被分析物TCR鎖がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として成分A上に発現され得るように、組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、項目1〜3のいずれか1項に記載の多成分システム。
5.成分Aが1つの被分析物TCR α、β、δ又はγ鎖をコードする単一ORFの組込みのためのゲノム組込み部位である更なる成分(成分Dと呼ぶ)を含んでなる、項目1〜4のいずれか1項に記載の多成分システム。
7.成分Aが
a.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを含有する単一成分合成構築物
b.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーターと少なくとも1つのレポーターとを有して設計された多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメントである成分(Fと呼ぶ)を更に含有し、a及び/又はbの活性化が合成経路、天然型経路又はそれらの組合せから選択される少なくとも1つのシグナル変換経路に依存する、項目1〜6のいずれか1項に記載の多成分システム。
8.ゲノム受容部位B及び/又はDを含み、ゲノム受容部位B及び/又はDが
a.リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
b.部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
c.部位特異的相同組換え用の天然型ゲノム部位
から選択される、項目1〜7のいずれか1項に記載の多成分システム。
9.成分Aが被分析物抗原提示複合体(aAPX)及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の少なくとも1つのファミリーの内因性表面発現を欠く、項目1〜8のいずれか1項に記載の多成分システム。
10.aAPXのファミリーが下記:
a.HLAクラスI
b.HLAクラスII
c.非HLA抗原提示複合体
のいずれかであってもよい、項目9に記載の多成分システム。
a.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
b.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチドに由来するペプチド
c.成分Aプロテオームの変更に由来するペプチド
d.成分Aプロテオームの変更に由来するポリペプチド
e.成分Aメタボロームの変更に由来する代謝物
から選択される、項目9又は10に記載の多成分システム。
12.成分AがCD4及び/又はCD8を発現する、項目1〜11のいずれか1項に記載の多成分システム。
13.成分Aが追加のTCRコレセプターを発現する、項目1〜12のいずれか1項に記載の多成分システム。
14.成分AがCD28及び/又はCD45を発現する、項目13に記載の多成分システム。
15.成分B及び/又はDを含み、成分B及び/又はDが以下の遺伝子エレメント
a.異種特異的リコンビナーゼ部位
b.相同性アーム
c.真核生物プロモーター
d.真核生物条件付き調節エレメント
e.真核生物ターミネーター
f.選択マーカー
g.スプライスアクセプター部位
h.スプライスドナー部位
i.非タンパク質コーディング遺伝子
j.インスレーター
k.可動遺伝子エレメント
l.メガヌクレアーゼ認識部位
m.内部リボソーム進入部位(IRES)
n.ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
o.コザックコンセンサス配列
の少なくとも1つを含んでなる、項目1〜14のいずれか1項に記載の多成分システム。
a.異種特異的リコンビナーゼ部位
b.相同性アーム
c.真核生物プロモーター
d.真核生物条件付き調節エレメント
e.真核生物ターミネーター
f.選択マーカー
g.組込みの選択マーカー
h.スプライスアクセプター部位
i.スプライスドナー部位
j.非タンパク質コーディング遺伝子
k.インスレーター
l.可動遺伝子エレメント
m.メガヌクレアーゼ認識部位
n.内部リボソーム進入部位(IRES)
o.ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
p.抗生物質耐性カセット
q.細菌性複製起点
r.酵母複製起点
s.クローニング部位
t.コザックコンセンサス配列
の少なくとも1つを含んでなる、項目1〜15のいずれか1項に記載の多成分システム。
17.成分B及び/又はDを含み、成分B及び/又はDが単一ORFのRMCE組込み用であり、下記:
a.真核生物プロモーター
b.一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
c.コザックコンセンサス配列
d.選択マーカー
e.真核生物ターミネーター
を含んでなる、項目1〜16のいずれか1項に記載の多成分システム。
18.成分B及び/又はDを含み、成分B及び/又はDが2又は3以上のORFのRMCE組込み用であり、以下の遺伝子エレメント:
a.真核生物プロモーター
b.一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
c.2又は3以上のコザックコンセンサス配列
d.選択マーカー
e.真核生物ターミネーター
f.第2の真核生物プロモーター
g.第2の選択マーカー
h.第2の真核生物ターミネーター
を含んでなる、項目1〜17のいずれか1項に記載の多成分システム。
19.成分C及び/又はEが存在し、単一ORFのRMCE組込み用であり、以下の遺伝子エレメント:
a.一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
b.コザックコンセンサス配列
c.抗生物質耐性カセット
d.細菌性複製起点
e.1又は2以上のTCR鎖をコードする単一ORF及び/又は組込みの選択マーカーの導入のためのクローニング部位
を含んでなる、項目1〜18のいずれか1項に記載の多成分システム。
20.成分C及び/又はEが存在し、2又は3以上のORFのRMCE組込み用であり、以下:
a.一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
b.2又は3以上のコザックコンセンサス配列
c.抗生物質耐性カセット
d.細菌性複製起点
e.1又は2以上のTCR鎖及び/又は組込みの選択マーカーをコードする2又は3以上のORFを真核生物のターミネーターと共に導入するためのクローニング部位
を含んでなる、項目1〜19のいずれか1項に記載の多成分システム。
22.組合せは、成分C'及び/又はE'のライブラリーが得られるよう複数回行われる、項目21に記載の多成分システム。
23.被分析物TCR鎖をコードする配列が
a.初代T細胞からのTCR鎖ORF配列の対クローニング
b.初代T細胞からのTCR鎖ORF配列の非対クローニング
c.合成TCR鎖ORF配列
に由来する、項目21又は22に記載の多成分システム。
24.eTPC-tが成分Aの表面にTCRspを発現するように、1又は2以上の成分C'及び/又はE'が、成分C'及び/又はE'にコードされる2つの相補性被分析物TCR鎖を成分B及び/又はDに組み込んで細胞(eTPC-tと呼ぶ)を得るために、成分Aと組み合わされており、ここで、成分B及び/又はDは成分B'及び/又はD'となる、項目21〜23のいずれか1項に記載の多成分システム。
25.1つの成分C'又はE'が、成分C'又はE'にコードされる1つの被分析物TCR鎖を成分B又はDに組み込んで細胞(eTPC-xと呼ぶ)を得るために、成分Aと組み合わされており、ここで、成分B又はDは、eTPC-xが表面に単一TCR鎖を発現するような成分B'又はD'となる、項目21〜23のいずれか1項に記載の多成分システム。
27.a.成分Aを少なくとも1つの成分C'及び/又はE'と組み合わせること、ここで、1又は2以上の成分C'及び/又はE'は一対又は二対以上の相補性被分析物TCR鎖をコードし、及び組込み因子と組み合わせること、並びに下記:
b.ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
c.TCRsp及び/又は1又は2以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
d.1又は2以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも1つを含んでなる、項目24に規定するeTPC-tの製造方法。
28.b及びdを含む項目27に記載の方法。
29.1又は2以上の成分C'及び/又はE'が項目27の工程aにおける単一TCR鎖の相補対をコードする、項目27又は28に記載の方法。
31.ライブラリーを得るために、1又は2以上の成分C'及び/又はE'が項目27の工程aにおける2又は3以上の独特なTCR鎖の相補対の混合プールをコードし、ここで、ライブラリーはeTPC-tの混合集団を含んでなり、各eTPC-tは項目27の工程aに用いるプールに由来する単一TCRspを発現する、項目27又は28に記載の方法。
32.a.成分Aを1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上の成分E'と組み合わせること、ここで、1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上のE'は被分析物TCR鎖をコードし、及び組込み因子と組み合わせること、並びに下記:
b.ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
c.1又は2以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも1つを含んでなる、項目25に規定するeTPC-xの製造方法。
33.b及びcを含む項目32に記載の方法。
34.1つの成分C'又は1つの成分E'が項目32の工程aにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、項目32又は33に記載の方法。
35.離散的及び規定されたeTPC-xのライブラリーを得るために複数回行われ、各回の項目32の工程aが、独特なeTPC-xが得られるように、独特な被分析物TCR鎖を用いて行われる、項目34に記載の方法。
37.a.eTPC-xを1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上の成分E'と組み合わせること、ここで、1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上のE'は、eTPC-x中の組み込まれた被分析物TCR鎖に相補性である被分析物TCR鎖をコードし、及び組込み因子と組み合わせること、並びに下記:
b.ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
c.TCRsp及び/又は1又は2以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
d.1又は2以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも1つを含んでなる、項目26に規定するeTPC-tの製造方法。
38.b及びdを含む項目37に記載の方法。
39.1つの成分C'又は1つの成分E'が項目37の工程aにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、項目37又は38に記載の方法。
40.離散的及び規定されたeTPC-tのライブラリーを得るために複数回行われ、各回の項目37の工程aが、TCRspを発現する独特なeTPC-tが得られるように、独特な被分析物TCR鎖を用いて行われる、項目39に記載の方法。
42.下記の特徴決定:
a.発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する特異性、及び/又は
b.発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する親和性、及び/又は
c.発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対するシグナル応答
(ここで、被分析物抗原は、aAPX:aAM及び/又はaAM及び/又はaAPX及び/又はaAPX:CM及び/又は親和性反応剤から選択され、被分析物抗原は、少なくとも下記:可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により又は細胞表面(被分析物APC)に提示される不動化反応剤の形態であり、aAPX:CMは積荷分子(CM)に積載されるaAPXであり、aAPX:aAMはaAMにCMとして積載されるaAPXである)に用いるための、項目1〜26のいずれか1項に記載の多成分システムから得られるeTPC-t。
43.入力の被分析物eTPC-t又は被分析物eTPC-tのライブラリーから1又は2以上の被分析物eTPC-tを選択して、1又は2以上の被分析物抗原に結合する1又は2以上の被分析物eTPC-tを取得するための方法であって、
a.1又は2以上の被分析物eTPC-tを1又は2以上の被分析物抗原と組み合わせて、被分析物eTPC-tにより提示される被分析物TCRspと被分析物抗原との間での接触を生じさせること、並びに下記:
b.形成される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
c.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物eTPC-tによるシグナル応答を測定すること、及び/又は
d.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定すること、及び
e.工程b及び/又は工程cに基いて1又は2以上のeTPC-tを選択すること、ここで、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によるなされる
(ここで、被分析物抗原は、aAPX:aAM及び/又はaAM及び/又はaAPX及び/又はaAPX:CM及び/又は親和性反応剤から選択され、被分析物抗原は、少なくとも下記:可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により又は細胞表面(被分析物APC)に提示される不動化反応剤の形態であり、aAPX:CMは積荷分子(CM)に積載されるaAPXであり、aAPX:aAMはaAMにCMとして積載されるaAPXである)の少なくとも1つを含んでなる方法。
44.選択工程が単一細胞選別及び/又はプールへの細胞選別により行われる、項目43に記載の方法。
45.選別が選別された単一細胞の拡大に先行する、項目44に記載の方法。
47.選別された及び/又は拡大された細胞の成分B'及び/又は成分D'を配列決定する工程を更に含んでなる、項目44〜46のいずれか1項に記載の方法。
48.配列決定工程が
a.ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
b.成分B'及び/又は成分D'のRNA転写物を抽出すること、及び/又は
c.成分B'及び/又は成分D'のDNA及び/又はRNA転写物をPCR及び/又はRT-PCRにより増幅すること
に後続する、項目47に記載の方法。
49.配列決定工程が細胞に対して破壊的であり、得られる配列決定情報が項目43工程eにおいて選択される被分析物eTPC-tを製造するために用いられる、項目47又は48に記載の方法。
50.選択された被分析物eTPC-tが親和性分析に付されて、TCRspの被分析物抗原に対する親和性が決定され、下記
a.選択された被分析物eTPC-tを、或る範囲の濃度の被分析物抗原で標識すること、
b.工程aの染色された被分析物eTPC-tについてFACS分析を行うこと、
c.被分析物抗原の濃度範囲にわたって被分析物eTPC-t蛍光標識の強度を決定すること
d.TCRspの被分析物抗原に対する親和性を算出すること、
を更に含んでなる、項目43、44、45、46、49のいずれか1項に記載の方法。
52.標識された参照物が
a.被分析物TCR鎖の一方又は両方に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t
b.1又は2以上のCD3タンパク質に対する親和性反応剤で標識された被分析物eTPC-t
c.標識された参照物単一TCR鎖又は標識された参照物TCR鎖対を提示する細胞又は粒子
から選択される、項目51に記載の方法。
53.選択された被分析物eTPC-tがシグナル応答の特徴決定に付され、下記
a.天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
b.eTPC-tが成分Fを含有する場合、合成シグナル伝達応答を決定すること
を更に含んでなる項目43、44、45、46、49のいずれか1項に記載の方法。
54.誘導されたシグナル応答が、非誘導シグナル応答状態と比較した下記:
a.分泌された生体分子
b.分泌された化学物質
c.細胞内生体分子
d.細胞内化学物質
e.表面発現された生体分子
f.eTPC-tのAPCに対する細胞毒性作用
g.eTPC-tのAPCに対するパラクリン作用(シグナル応答がAPCにおいて誘導され、a〜eのいずれかの増減を検出することにより決定される)
h.eTPC-tの増幅
i.eTPC-tとAPCとの間での免疫学的シナプス形成
の1又は2以上の増減を検出することにより決定される、項目53に記載の方法。
55.入力の被分析物抗原又は被分析物抗原のライブラリーから1又は2以上の被分析物抗原を選択して、安定な複合体を形成し、及び/又は被分析物TCRspを発現する1又は2以上の被分析物eTPC-tの発現した被分析物抗原に対するシグナル応答を誘導する1又は2以上の被分析物抗原及び/又は被分析物抗原の配列を取得する方法であって、
a.1又は2以上の被分析物抗原を1又は2以上の被分析物eTPC-tと組み合わせて、被分析物抗原と1又は2以上の被分析物eTPC-tの被分析物TCRspとの間の接触を生じさせること、及び
b.形成する場合、1又は2以上の被分析物抗原と1又は2以上の被分析物TCRspとの間での複合体の形成を測定すること、及び/又は
c.誘導される場合、被分析物TCRspと被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される1又は2以上の被分析物eTPC-tにおけるシグナル応答を測定すること、及び/又は
d.誘導される場合、1又は2以上の被分析物TCRspと1又は2以上の被分析物抗原との間での複合体形成により誘導される被分析物APCによるシグナル応答を測定すること、及び
e.工程b、c及び/又はdから1又は2以上の被分析物抗原を選択すること、ここで、選択はポジティブ及び/又はネガティブ測定によるなされる
(ここで、被分析物抗原は、aAPX:aAM及び/又はaAM及び/又はaAPX及び/又はaAPX:CM及び/又は親和性反応剤から選択され、被分析物抗原は、少なくとも下記:可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により又は細胞表面(被分析物APC)に提示される不動化反応剤の形態であり、aAPX:CMは積荷分子(CM)に積載されるaAPXであり、aAPX:aAMはaAMにCMとして積載されるaAPXである)を含んでなる方法。
57.選別が選別された単一細胞の拡大に先行する、項目56に記載の方法。
58.選別が選別された細胞プールの拡大に先行する、項目56に記載の方法。
59.選別された及び/又は拡大された細胞の被分析物抗原を配列決定する工程を更に含んでなる、項目55〜58のいずれか1項に記載の方法。
60.配列決定工程が下記
a.ゲノムDNAを抽出すること、及び/又は
b.被分析物抗原のRNA転写物を抽出すること、及び/又は
c.被分析物抗原のDNA及び/又はRNA転写物をPCR及び/又はRT-PCRにより増幅すること、
に後続する、項目59に記載の方法。
a.天然型シグナル伝達応答を決定すること、及び/又は
b.被分析物eTPC-tが成分Fを含有する場合、合成シグナル伝達応答を決定すること
を更に含んでなる項目55、56、57、58のいずれか1項に記載の方法。
62.誘導されたシグナル応答が非誘導シグナル応答状態と比較した下記:
a.分泌された生体分子
b.分泌された化学物質
c.細胞内生体分子
d.細胞内化学物質
e.表面発現された生体分子
f.被分析物eTPC-tの被分析物APCに対する細胞毒性作用
g.シグナル応答が被分析物APCにおいて誘導され、a〜eのいずれかの増減を検出することにより決定されるような、被分析物eTPC-tの被分析物APCに対するパラクリン作用
h.被分析物eTPC-tの増幅
i.被分析物eTPC-tと被分析物APCとの間での免疫学的シナプス
の1又は2以上の増減を検出することにより決定される、項目61に記載の方法。
63.積荷が、項目55〜62に規定する方法により選択され得られた被分析物APCのaAPXに積載された代謝物及び/又はペプチドであり、下記:
a.aAPX:aAM若しくはaAPX:CM又は積荷aM若しくは積荷CMを単離すること、及び
b.積載された積荷を同定すること
を含んでなる、aAM積荷又はCM積荷を選択し同定する方法。
64.工程bが単離されたaAPX:aAM又はaAPX:CMを下記:
a.質量分析
b.ペプチド配列決定分析
の1以上に付することを含んでなる、項目63に記載の方法。
65.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目43〜54に規定する方法により選択されたTCR鎖対配列又はTCR鎖対配列のライブラリー。
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目55〜64に規定する方法により選択された抗原性分子及び/又は前記抗原性分子をコードするORF、又はそのライブラリー。
67.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目55〜62に規定する方法により選択された抗原性分子を積荷として積載した抗原提示複合体及び/又は前記複合体をコードするORF、又はそのライブラリー。
68.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目55〜62に規定する方法により選択されたAPC、又はAPCのライブラリー。
69.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目43〜54に規定する方法により選択されたeTPC-t、又はeTPC-tのライブラリー。
70.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目1〜-26のいずれかに記載のシステム。
71.下記:
a.診断
b.医学
c.美容
d.研究開発
の少なくとも1つに用いるための、項目55〜62に規定する方法により選択された被分析物抗原を提示するNCBP又は被分析物抗原を提示するNCBPのライブラリー。
Claims (38)
- 第1の成分が、遺伝子操作されたTCR-提示細胞(eTPC)(成分Aと呼ぶ)であり、成分Aが機能的形態の被分析物抗原提示複合体(aAPX)の少なくとも1つのファミリー及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の内因性表面発現を欠き、TCR鎖α、β、δ及びγの内因性発現を欠き、CD3タンパク質を発現し、各々が少なくとも1つの被分析物TCR鎖α、β、δ若しくはγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする2つのORFの組込みのためのゲノム受容部位である2つの異なる更なる単一成分(B及びDと呼ぶ)を含み、ゲノム受容部位B及びDが各々、
a.リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物
b.部位特異的相同組換えのために設計された合成構築物
から選択され、
第2の成分が被分析物TCR鎖をコードするORFの送達のための遺伝子ドナーベクター(成分Cと呼ぶ)であり、成分Cは
c.少なくとも1つの被分析物TCR鎖α、β、δ及び/又はγをコードする単一ORF、及び/又は
d.被分析物TCR鎖対をコードする2つのORF
を成分Bに送達するように設計されており、
c及び/又はdは、組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、
被分析物TCR鎖がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)として成分A上に発現され得る、多成分システム。 - aAPXのファミリーが下記:
a.HLAクラスI
b.HLAクラスII
c.非HLA抗原提示複合体
から選択される、請求項1に記載の多成分システム。 - 更なる成分(Eと呼ぶ)が遺伝子ドナーベクターであり、成分Eが、1つの被分析物TCR鎖α、β、δ又はγ(第1のTCR鎖)をコードする第1のORFを成分Dに送達するよう設計されており、ここで、第1のTCR鎖は、成分Bに組み込まれるORFにコードされる被分析物TCR鎖と相補的に対合することができ、第1のORFは、成分Bに組み込まれるORFと共に、成分A上にTCRspを形成するように発現されることができ、成分Eが組込みの選択マーカーをコードしていてもいなくてもよい、請求項1又は2に記載の多成分システム。
- 成分Aが以下
a.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーター並びに少なくとも1つのレポーターを含有する単一成分合成構築物
b.少なくとも1つの天然型プロモーター及び/又は少なくとも1つの合成プロモーター並びに少なくとも1つのレポーターを有して設計されている多成分合成構築物
から選択される合成ゲノムTCR刺激応答エレメントである成分(Fと呼ぶ)を更に含有し、
a及び/又はbの活性化が合成経路、天然型経路又はそれらの組合せから選択される少なくとも1つのシグナル変換経路に依存性である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の多成分システム。 - ゲノム受容部位B及び/又はDを含み、ゲノム受容部位B及び/又はDがリコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)のために設計された合成構築物である、請求項1に記載の多成分システム。
- aAMが下記
a.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチド又はポリペプチドの複合体
b.被分析物抗原性分子ORFから翻訳されるポリペプチドに由来するペプチド
c.遺伝子操作されたTCR-提示細胞(成分A)のプロテオームの変更に由来するペプチド
d.遺伝子操作されたTCR-提示細胞(成分A)のプロテオームの変更に由来するポリペプチド
e.遺伝子操作されたTCR-提示細胞(成分A)のメタボロームの変更に由来する代謝物
から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の多成分システム。 - 成分AがCD4及び/又はCD8を発現する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の多成分システム。
- 成分Aが追加のTCRコレセプターを発現する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の多成分システム。
- 成分AがCD28及び/又はCD45を発現する、請求項8に記載の多成分システム。
- 成分B及び/又はDを含み、成分B及び/又はDが、以下の遺伝子エレメント:
a.異種特異的リコンビナーゼ部位
b.相同性アーム
c.真核生物プロモーター
d.真核生物条件付き調節エレメント
e.真核生物ターミネーター
f.選択マーカー
g.スプライスアクセプター部位
h.スプライスドナー部位
i.非タンパク質コーディング遺伝子
j.インスレーター
k.可動遺伝子エレメント
l.メガヌクレアーゼ認識部位
m.内部リボソーム進入部位(IRES)
n.ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
o.コザックコンセンサス配列
の少なくとも1つを含んでなる、請求項2〜9のいずれか1項に記載の多成分システム。 - 成分C及び/又はEを含み、成分C及び/又はEが以下の遺伝子エレメント:
a.異種特異的リコンビナーゼ部位
b.相同性アーム
c.真核生物プロモーター
d.真核生物条件付き調節エレメント
e.真核生物ターミネーター
f.選択マーカー
g.組込みの選択マーカー
h.スプライスアクセプター部位
i.スプライスドナー部位
j.非タンパク質コーディング遺伝子
k.インスレーター
l.可動遺伝子エレメント
m.メガヌクレアーゼ認識部位
n.内部リボソーム進入部位(IRES)
o.ウイルス性自己切断ペプチドエレメント
p.抗生物質耐性カセット
q.細菌性複製起点
r.酵母複製起点
s.クローニング部位
t.コザックコンセンサス配列
の少なくとも1つを含んでなる、請求項1〜10のいずれか1項に記載の多成分システム。 - 成分B及び/又はDを含み、成分B及び/又はDが、単一ORFのRMCE組込みのためであり、
下記:
a.真核生物プロモーター
b.一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
c.コザックコンセンサス配列
d.選択マーカー
e.真核生物ターミネーター
を含んでなる、請求項1〜11のいずれか1項に記載の多成分システム。 - 成分C及び/又はEが存在し、単一ORFのRMCE組込みのためであり、以下の遺伝子エレメント:
a.一対の異種特異的リコンビナーゼ部位
b.コザックコンセンサス配列
c.抗生物質耐性カセット
d.細菌性複製起点
e.1又は2以上のTCR鎖をコードする単一ORF及び/又は組込みの選択マーカーの導入のためのクローニング部位
を含んでなる、請求項1〜12のいずれか1項に記載の多成分システム。 - 成分C及び/又はEを含み、成分C及び/又はEは、少なくとも1つの被分析物TCR鎖をコードする少なくとも1つのORFを含む遺伝子ドナーベクター(成分C'及び/又はE')である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の多成分システム。
- 成分C'及び/又はE'のライブラリーを含む、請求項14に記載の多成分システム。
- 被分析物TCR鎖をコードする配列が、
a.初代T細胞からのTCR鎖ORF配列の対クローニング
b.初代T細胞からのTCR鎖ORF配列の非対クローニング
c.合成TCR鎖ORF配列
に由来する、請求項14又は15に記載の多成分システム。 - 1又は2以上の成分C'及び/又はE'は、成分C'及び/又はE'にコードされる2つの相補性被分析物TCR鎖を成分B及び/又はD中に組み込んで細胞(eTPC-tと呼ぶ)が得られるように、成分Aと組み合わされており、ここで、成分B及び/又はDは、成分Aの表面にTCRspを発現するような成分B'及び/又はD'となる、請求項14〜16のいずれか1項に記載の多成分システム。
- 1つの成分C'又はE'は、成分C'又はE'にコードされる1つの被分析物TCR鎖を成分B又はDに組み込んで細胞(eTPC-xと呼ぶ)が得られるように、成分Aと組み合わされており、ここで、成分B又はDは、eTPC-xが単一TCR鎖を発現するような成分B'又はD'となる、請求項14〜17のいずれか1項に記載の多成分システム。
- 1つの成分C'又はE'は、成分C'又はE'にコードされる1つの被分析物TCR鎖であって、eTPC-xに発現されるTCR鎖に相補性である被分析物TCR鎖をeTPC-xの成分B又はDに組み込んでeTPC-tが得られるように、eTPC-xと組み合わされており、ここで、成分B又はDは、TCRspをeTPC-tの表面に発現するような成分B'又はD'となる、請求項15〜18のいずれか1項に記載の多成分システム。
- a.成分Aを少なくとも1つの成分C'及び/又はE'と組み合わせること、ここで、1又は2以上の成分C'及び/又はE'は一対又は二対以上の相補性被分析物TCR鎖をコードし、及び、組込み因子と組み合わせること、及び下記
b.ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
c.TCRsp及び/又は1又は2以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
d.1又は2以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも1つを含んでなる、請求項17に規定するeTPC-tを製造するための方法。 - b、c及びdを含む請求項20に記載の方法。
- 1又は2以上の成分C'及び/又はE'が工程aで単一TCR鎖の相補対をコードする、請求項20又は21に記載の方法。
- 方法が複数回行われ、各回の工程aは別異のeTPC-tが得られるように別異の単一TCR鎖の相補対を用いて行われて、離散的及び規定されたeTPC-tのライブラリーが得られる、請求項22に記載の方法。
- 1又は2以上の成分C'及び/又はE'が、各eTPC-tが請求項23の工程aで用いるプールに由来する単一TCRspを発現するeTPC-tの混合集団を含んでなるライブラリーが得られるように、請求項22の工程aにおいて2又は3以上の別異のTCR鎖の相補対の混合プールをコードする、請求項22又は23に記載の方法。
- a.成分Aを、1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上の成分E'と組み合わせること、ここで、1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上のE'は被分析物TCR鎖をコードし、及び、組込み因子と組み合わせること、並びに、
b.ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
c.1又は2以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも1つを含んでなる、請求項18に規定されるeTPC-xを製造する方法。 - b及びcを含む請求項25に記載の方法。
- 1つの成分C'又は1つの成分E'が工程aにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、請求項25又は26に記載の方法。
- 方法が複数回行われ、各回の工程aは別異のeTPC-xが得られるように別異の被分析物TCR鎖を用いて行われて、離散的及び規定されたeTPC-xのライブラリーが得られる、請求項25に記載の方法。
- 1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上の成分E'が、各eTPC-xが工程aで用いるプールに由来する単一被分析物TCR鎖を発現するeTPC-xの混合集団を含んでなるライブラリーが得られるように、工程aにおける2又は3以上の単一被分析物TCR鎖の混合プールをコードする、請求項25又は26に記載の方法。
- a.eTPC-xと1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上の成分E'とを組み合わせること、ここで、1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上のE'は、eTPC-xに組み込まれた被分析物TCR鎖に対して相補的である被分析物TCR鎖をコードし、及び、組込み因子と組み合わせること、並びに
b.ゲノム受容部位選択マーカーの喪失について選択すること
c.TCRsp及び/又は1又は2以上のCD3タンパク質の表面発現の獲得について選択すること
d.1又は2以上の組込みの選択マーカーの獲得について選択すること
の少なくとも1つを含んでなる請求項17に規定するeTPC-tを製造する方法。 - b、c及びdを含む請求項30に記載の方法。
- 1つの成分C'又は1つの成分E'が工程aにおける単一被分析物TCR鎖をコードする、請求項30又は31に記載の方法。
- 方法が複数回行われ、各回の工程aは、TCRspを発現する別異のeTPC-tが得られるように、別異の被分析物TCR鎖を用いて行われて、離散的及び規定されたeTPC-tのライブラリーが得られる、請求項31に記載の方法。
- 1若しくは2以上の成分C'又は1若しくは2以上の成分E'が、各eTPC-tが工程aで用いるプールに由来する単一TCRspを発現するeTPC-tの混合集団を含んでなるライブラリーが得られるように、工程aにおける2又は3以上の単一被分析物TCR鎖の混合プールをコードする、請求項30又は31に記載の方法。
- 被分析物抗原が、aAPX:aAM及び/又はaAM及び/又はaAPX及び/又はaAPX:CM及び/又は親和性反応剤から選択され、被分析物抗原が、少なくとも、可溶性反応剤、非細胞ベースの粒子(NCBP)により又は細胞(被分析物APC)の表面に提示される不動化された反応剤の形態であり、aAPX:CMは積荷分子(CM)が積載されているaAPXであり、aAPX:aAMはCMとしてaAMが積載されているaAPXである、以下の特徴決定:
a.発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する特異性、及び/又は
b.発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対する親和性、及び/又は
c.発現した被分析物TCRspの被分析物抗原に対するシグナル応答
のためのeTPC:抗原(eTPC:A)分析装置に用いる、請求項1〜19のいずれか1項に記載の多成分システムから得られるeTPC-t。 - 少なくとも1つの被分析物eTPC-tを製造するための、請求項1〜19のいずれか1項に記載の多成分システム。
- 機能的形態の被分析物抗原提示複合体(aAPX)の少なくとも1つのファミリー及び/又は被分析物抗原性分子(aAM)の内因性表面発現を欠き、
a.2つのゲノム受容部位(B及びDと呼ぶ)を含み、その各々が少なくとも1つの被分析物TCR鎖α、β、δ若しくはγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする2つのORFを含んでなってもよく
b.CD3タンパク質を発現し
c.B及びDに含まれるもの以外のTCR鎖を発現せず
ここで、ゲノム受容部位B及びDは各々
a.リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
b.部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
から選択され、
被分析物TCR鎖がCD3と複合体化したTCR表面タンパク質(TCRsp)としてeTPC上に発現され得る
ことを特徴とする被分析物eTPC。 - a.2つのゲノム受容部位(B及びDと呼ぶ)を含み、その各々が少なくとも1つの被分析物TCR鎖α、β、δ若しくはγをコードする単一ORF及び/又は被分析物TCR鎖対をコードする2つのORFを含んでなってもよく
b.CD3タンパク質を発現し
c.B及びDに含まれるもの以外のTCR鎖を発現せず
ここで、ゲノム受容部位B及びDは各々
a.リコンビナーゼ媒介カセット交換(RMCE)用に設計された合成構築物
b.部位特異的相同組換え用に設計された合成構築物
から選択される
ことを特徴とする、請求項1〜19のいずれか1項に規定される多成分システムから得ることができる被分析物eTPC。
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