CN1856571A - 连接目标序列的方法 - Google Patents

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Abstract

多重重叠－延伸RT－PCR提供了在单一反应中连接两个或者更多杂聚蛋白结构域或者亚基编码核苷酸序列的有效方法。特别地，来自例如免疫球蛋白、T细胞受体或者B细胞受体的可变区编码序列的连接通过使用本发明的方法而被简化。这产生了更为有效的制备可变区编码序列文库的方法。使用来自分离的单一细胞的模板进行多重重叠－延伸RT－PCR的能力使得能够以高通量形式产生关联对文库。

Description

连接目标序列的方法
本发明的技术领域
[0001]本发明涉及的是多重分子扩增步骤，它能够将与扩增有关的目标核苷酸序列连接起来，特别是聚合酶链式反应(多重PCR)。该方法特别有利地用于产生来自免疫球蛋白、T细胞受体或者B细胞受体可变区编码序列的关联对(cognate pair)文库以及组合文库。
发明背景
[0002]哺乳动物中存在的参与免疫应答的抗原结合蛋白是表现出广泛多样结合特异性的多克隆大集合。这种多样性是通过编码这些结合蛋白可变区的基因序列的重排产生的。这些可变区结合蛋白包括可溶性的和膜结合形式的B细胞受体(也称为免疫球蛋白或者抗体)以及膜结合的T细胞受体(TcR)。就免疫球蛋白而言，在抗原通过B细胞抗原受体借助被称为亲和成熟的过程(该过程涉及了这些可变基因体细胞超变的循环)被识别之后，免疫球蛋白的亲和性增强。
[0003]值得注意的是，已经对免疫球蛋白或者其片段例如Fab片段、Fv片段和单链Fv(scFv)分子进行克隆和重组表达。但是所有其他的可变区结合蛋白原则上也可以使用与对于抗体相同的概念进行克隆和表达。
[0004]具有所需结合特异性的抗体的已知分离方式经常涉及来自被免疫宿主的杂交瘤的制备，接下来对特异克隆进行筛选，或者涉及在大肠杆菌中制备由免疫球蛋白可变区结构域组成的组合表达库，接下来使用例如噬菌体展示的技术对组合表达库进行富集。
[0005]用于制备治疗性抗体的杂交瘤技术在使用中一个主要的限制是没有适宜作为人B淋巴细胞融合伴侣的人淋巴瘤。异源杂交瘤(即人B细胞与小鼠淋巴瘤的融合)极为不稳定，因此几乎不能产生用于生产目的的适宜细胞系。通过用EB病毒感染无限增殖化的人B细胞表现出类似的不稳定性。缺乏稳定可靠的制备用于治疗的人抗体的细胞学方法可以使用分子生物学中更为最近的进展得到补偿。
[0006]使用组合文库和噬菌体展示可以产生大的抗体克隆集合，可能的多样性超过了1010。从这个集合中可以就与特异靶标结合进行筛选，这样产生亚文库。可以使用该亚文库制备多克隆或者单克隆抗体。可以从淋巴细胞、浆细胞、杂交瘤或者任何其他表达免疫球蛋白的细胞群中扩增出构成文库的可变区编码序列(例如免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区编码序列)。制备组合文库的当前技术包括从细胞群中分别分离可变区编码序列。这样，例如免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区的编码序列的原始配对就会丢失。但是在组合文库中所述的序列随机配对，且这些可变序列的原始组合仅仅会随机出现。因此，为了分离负责所需结合特异性的可变区编码序列，需要相当大量的筛选。这通常与表达所需特异性的克隆的富集方法，例如核糖体展示或者噬菌体展示联合进行。即使是这样，所获得的多样性对于分离产生与那些在原来细胞中发现的结合蛋白具有类似高度亲和性的结合蛋白的可变区编码序列对，可能仍然不够大。而且，通常用于筛选组合文库的富集步骤引入了很大的偏倚性(bias)，例如偏好大肠杆菌中非常低毒性的多肽、有效的折叠、缓慢的关闭速率(off-rate)或者其他系统依赖的参数，这进一步降低了文库的多样性。此外，来源于这种组合文库的克隆更易于产生出与自身抗原发生交叉反应的结合蛋白，因为与原始对(此后称为关联对(cognate pair))相反，他们从未经历过体内针对自身抗原的负选择，对于B和T淋巴细胞受体发育过程中的特定阶段就有负选择出现。因此克隆可变区编码序列的原始配对就是合意的方法。而且，在关联对文库中出现表达所需结合特异性的克隆的频率要比在通常的组合文库中出现所需特异性的频率高很多，特别是如果起始材料细胞来自具有高频率编码特异结合对的细胞的供体，如具有免疫性或者免疫后的供体。由此，关联对文库不需要与组合文库具有相同的大小：具有104到105个克隆的关联对文库或者具有102到103个克隆的关联对文库(克隆来自具有正在发生的相关免疫应答的供体)，对于获得代表广泛多样所需结合特异性的结合蛋白可能已经足够了。
[0007]为了产生关联对文库，需要来自相同细胞的可变区编码序列的连接。目前已对两种不同的获得可变区编码序列的关联配对的方法进行了描述。
[0008]细胞内PCR方法将一群细胞固定并且使其通透化，之后来自免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区编码序列在细胞内连接。这一连接可以通过重叠-延伸RT-PCR(WO 93/03151)或者重组(Chapal，N.et al.1997 BioTechniques 23，518-524)进行。在这些出版物中描述的扩增过程，是由下面三个或四个步骤组成的过程：i)使用恒定区引物进行逆转录产生免疫球蛋白cDNA，ii)使用含有重叠-延伸设计或者重组位点的引物组对重链和轻链可变区编码序列进行PCR扩增，iii)重组连接，如果选择了该方法的话，iv)产物进行嵌套PCR产生克隆用的限制性位点。由于细胞被通透化，所以扩增产物很有可能漏到细胞之外，这样会使重链可变区和轻链可变区编码序列混杂，导致同源配对性的丧失。因此，该步骤包含在每一次反应之后的漂洗步骤，使得这个过程耗费劳动，降低了反应的效率。
[0009]更为一般地，细胞内PCR的效率极为低下，导致低的敏感性。因此细胞内PCR连接技术从未有过广泛的使用，而且原始研究实际上从未以能够被用于证实在细胞内连接的确存在的方式被可靠地重复出来。但是这对于避免重链可变区和轻链可变区编码序列的混杂以及由此引起的关联对的破坏来讲是至关重要的。
[0010]在WO 01/92291中描述了不同的细胞内方法。该方法基于RNA反式拼接，在细胞内获得VH和VL编码mRNA的连接。该方法需要驱动细胞内反式拼接的DNA构建体。
[0011]单细胞PCR是一种获得重链可变区和轻链可变区编码序列关联配对的不同方法(参见例如Coronella，J.A.et al.2000Nucleic Acids Res.28，E85；Wang，X.，et al.2000 J.Immunol.Methods 20，217-225)。在这些出版物中，通过使细胞的密度稀释至每个反应1个细胞，来分散一群表达免疫球蛋白的细胞，从而避免了克隆过程中重链可变区和轻链可变区编码序列的混杂。基本上该过程被描述为由三到四个步骤组成的过程：i)使用寡聚dT引物、随机六聚引物或者恒定区引物进行逆转录产生cDNA，ii)将cDNA产物分级进入几个管，使用含有用于克隆的限制性位点的引物组对各自的可变链编码序列进行PCR扩增(在分开的管中)，iii)产物进行嵌套PCR产生用于克隆的限制性位点(可选择)以及iv)通过克隆到适宜的载体中将不同管中的重链可变区和轻链可变区编码序列连接起来，这本身是一个多步骤的过程。
[0012]人类有两种类型的轻链：λ和κ。这表明对于每个单一细胞产生的cDNA，必须进行至少三个独立的PCR反应，之后进行分析并将适宜的片段克隆到单个载体中得到关联配对。这样所描述的单细胞PCR需要大量的操作以产生关联配对文库。尽管为了获得代表所需广泛多样结合特异性的结合蛋白，关联对文库不需要与组合文库具有相同的大小，但是用所描述的单细胞PCR方法制备一个具有如104到105个克隆的文库还是一项耗费劳动的任务。而且大量的操作大大增加了污染和人为错误的风险。
[0013]为了获得与在免疫应答中通常观察到的亲和性相当的高度亲和的结合蛋白，可变区序列的关联配对与它们的扩增相联合是非常有利的。为了制备具有大量多样性的文库，需要有一种可以适合于进行高通量形式的且污染和混杂的风险最小的克隆技术。
[0014]同样需要降低克隆的步骤，以制备适合于高通量的形式的组合文库。
成果公开
[0015]本发明提供了使用多重分子扩增步骤，例如多重重叠-延伸RT-PCR或者多重RT-PCR之后通过连接方法或者重组方法连接，来连接两个或者更多目标核苷酸序列如可变区编码序列的有效方法。该方法适用于在单一细胞上进行，这样使关联对的克隆以高通量的方式进行。
附图描述
[0016]图1列举了不同类型的重叠-延伸尾巴(tail)。粗线条对应的是引物中基因特异的部分，常规的线条对应的是重叠的尾巴。竖直线条表示了互补区域。引物有助于两个目标核苷酸序列的连接。图1(I)显示的是类型I的两种重叠-延伸尾巴，其中只有延伸尾巴完全或者部分地重叠；图1(II)显示了类型II的重叠-延伸尾巴，其中第一个引物延伸尾巴的5′核苷酸与相邻引物的基因特异部分互补；图1(III)显示了类型III重叠-延伸尾巴，其中整个的重叠-延伸尾巴都与相邻引物的基因特异区域互补。
[0017]图2是一幅示意图，图示了用于连接免疫球蛋白可变区编码序列的多重重叠-延伸引物混合物的概况。用管状结构表示了待连接的编码轻链(LC)和重链可变区(VH)的cDNA，并且表明了它们有义链的5′和3′端以及扩增产物的预期大小。用于扩增编码序列的多重重叠-延伸引物组用箭头指示。具有虚线5′凸出的弯曲的箭尾表示了克隆尾巴。重叠-延伸尾巴用粗体表示。尾巴中的限制性位点与尾巴一同命名。多重重叠-延伸引物混合物中的引物总数是16，分布如下：外引物包含一个Cκ和一个CH1引物，重叠-延伸引物包含6个VL和8个VH引物。CH1引物在重链恒定结构域1的5′端退火。多重重叠-延伸RT-PCR产生的产物预计大约1070bp，由整个κ轻链(由恒定区、连接基因和可变基因(Cκ+JL+VL)构成)和重链可变区(由可变基因、多样性片段和连接基因(VH+D+JH)构成)构成。5′和3′表明了开放阅读框的方向。只有一小部分的CH1区域编码序列被这个多重重叠-延伸引物混合物扩增，因为CH1引物的退火位置靠近重链的J-区域。
[0018]图3是一系列的图片，显示了可获得的产物的不同连接方向，取决于连接尾巴上装配了何种引物。实心黑块表示了重叠区域。5′和3′表明了开放阅读框的方向。图3A表示了产物的头对头定向。图3B表示了尾对尾的定向。图3C表示了头对尾的定向，前面是轻链编码序列。图3D表示了头对尾的定向，前面是重链编码序列。
[0019]图4示意了免疫球蛋白表达载体pLL113，其中编码序列是头对尾的定向。载体包含以下元件：bla＝使氨苄青霉素抗性基因表达的启动子；Amp＝编码氨苄青霉素抗性的基因；pUC ori＝pUC复制起点；AdMLP＝腺病毒主要晚期启动子；Human IgG1＝编码免疫球蛋白同型G1重链的序列；hGH pA＝人生长激素polyA信号序列；bGH polyA＝牛生长激素polyA序列。Human Kappa LC＝编码免疫球蛋白κ轻链的序列。FRT＝Flp识别靶标位点。Hygromycin＝编码潮霉素抗性的基因。SV40 polyA＝猿猴病毒40 polyA信号序列。
[0020]图5A是一个电泳凝胶，显示了两步多重重叠-延伸RT-PCR之后进行半嵌套PCR的结果。扩增产物来自从单一CHO Flp-In pLL113细胞中分离的cDNA。泳道1-12是样品泳道，箭头表明了1076bp的正确的嵌套多重重叠-延伸RT-PCR产物；M1是100bp的梯度。W是用作阴性对照模板的水。C是来自细胞系HB-8501的阳性cDNA对照模板。在另一张图中描绘了相同的泳道的W、C和100bpDNA梯度，对比较小，目的是解析出单个的DNA片段。图5B是图5A中凝胶的草图，表明了凝胶上的相关片段。
[0021]图6是一系列的电泳凝胶的照片和图片，表示了没有额外PCR扩增的单步多重重叠-延伸RT-PCR反应结果。在每一幅图中M1是100bp的梯度，M2是500bp的梯度。图6A是电泳凝胶，显示了来自对应于100、10、1或者0个细胞的裂解物的扩增产物。箭头指示重叠-延伸产物。图6B是对图6A中凝胶的草图描绘。图6C是电泳凝胶，证实了在图6A的100个和1个细胞的泳道中存在重叠-延伸产物。图6D是电泳凝胶，显示了使用NheI和NcoI的限制性酶分别切割图6C中1个细胞的泳道中的重叠-延伸产物。
[0022]图7是电泳凝胶，显示了单步多重重叠-延伸RT-PCR之后进行半嵌套PCR扩增的结果。M1是100bp的梯度，M2是500bp的梯度。多重重叠-延伸引物混合物中含有CH1，CH2，CH3，CH4或者CH5作为多重重叠-延伸RT-PCR反应中的外引物。使用对应于100、10、1或者0个细胞的细胞裂解物进行反应。重叠-延伸产物的大小用箭头表明。
[0023]图8是电泳凝胶，显示了单步多重重叠-延伸RT-PCR之后进行半嵌套PCR扩增的结果，使用了富集的人B淋巴细胞作为模板。M1是100bp的梯度。泳道5和6显示了重叠-延伸产物预期大小的条带。
[0024]图9A是一幅示意图，显示了用于制备表达IgG1-λ的细胞系的哺乳动物表达载体(Em465/01P582/Em465/01P581)，其中编码序列是头对头的定向。载体包含以下元件：Amp＝编码氨苄青霉素抗性的基因；pUC ori＝pUC复制起点；AdMLP＝腺病毒主要晚期启动子；EFP＝延伸因子启动子；AP leader＝碱性磷酸酶前导序列；VH＝重链可变区编码序列；IgG1 HC＝编码免疫球蛋白同型G1重链恒定区的序列；rBGpolyA＝家兔β球蛋白polyA信号序列；bGH polyA＝牛生长激素polyA序列；IgK leader＝编码小鼠κ前导序列的序列；IgL(1b或者1c)＝编码免疫球蛋白λ轻链家族1b或者1c的序列；FRT＝Flp识别靶标位点；Hygromycin＝编码潮霉素抗性的基因；SV40 polyA＝猿猴病毒40 polyA信号序列。图9B和9C是溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶，分别使用来自细胞系CHO Flp-In/Em464/01P581和CHOFlp-In/Em464/01P582的PCR产物上样。泳道1到4对应于分别使用总RNA模板浓度为50pg，5pg，0.5pg或者0pg进行多重重叠-延伸RT-PCR反应。M是100bp的梯度(New England Biolabs，NewEngland，USA)。箭头表示了重叠-延伸PCR产物。
[0025]图10是一个流程图，表示了所用的步骤，目的是产生关联抗体表达文库，可以从该表达文库中表达单克隆或者多克隆抗体。
[0026]图11是大肠杆菌载体JSK301的示意图，该载体用于通过在载体上所示的NotI/XhoI限制性位点处插入包含关联可变区编码序列的重叠-延伸片段，制备Fab载体文库。载体包含以下的元件：Amp andAmp pro＝氨苄青霉素抗性基因及其启动子；pUC19 Ori＝复制起点；Human CH1＝编码人免疫球蛋白γ1重链结构域1的序列；Stuffer＝无关的序列插入物，在重叠-延伸片段插入后被切除。tac P and lac Z＝细菌启动子，可以在NheI和AscI限制性位点处被切除。
[0027]图12是一幅示意图，显示了关联Fab表达载体文库的制备。步骤I显示了通过XhoI-NotI消化将可变区编码序列关联对(VH1-VL1到VHx-VLx)插入大肠杆菌JSK301载体中。步骤II显示了通过AscI-NheI消化将细菌启动子和前导序列盒(pelB前导序列-Ptac-启动子，引导VHx的表达，以及P lac启动子-pelB前导序列，引导VLx的表达)插入。
[0028]图13显示了使用单步多重重叠-延伸RT-PCR以及之后的额外PCR扩增使组成G蛋白的α、β和γ亚基连接。给出了每个编码区域以及连接产物的大小。在扩增中通过引物尾巴引入的限制位点在终产物中予以表明。
[0029]图14显示了对(A)从供体血液中纯化的PBMC、(B)磁性分选的非标记CD19阴性细胞级分以及(C)磁性分选的CD19+细胞级分的分析性FACS染色的点状图。对于每一个级分显示了一个散射(scatter)图线、一个CD19/CD38图线和一个CD38/CD45图线。
[0030]图15显示了图9C的CD19+级分，它曾经储存于液氮中，融化并且使用抗CD19、抗CD38和抗CD45进行染色。显示了对应于图9C的点图线。
[0031]图16显示了用于分选CD19+细胞级分的阈值(gate)。使用了基于CD38和CD45的散射阈值和荧光阈值分离CD38high(CD38hi)和CD45intermediate(CD45in)细胞。
[0032]图17是电泳凝胶，显示了对供体TT03进行成功的多重重叠-延伸RT-PCR反应(行A，8个96孔板上的孔1-12)。样品已经上样于琼脂糖凝胶的两行(A和B)中，每一行48个样品。重叠-延伸片段的预期大小是大约1070bp。用箭头标记出推测的重叠-延伸片段。
[0033]图18显示了来自平板G060的周质提取物的ELISA分析。使用山羊(gt)抗人κ包被ELISA板，被捕获的Fab片段使用HRP偶联的山羊抗人Fab特异的抗体进行检测。
[0034]图19显示了来自平板G060的周质提取物的ELISA分析。使用10ug/ml卵清蛋白(SigmaA-5503)包被ELISA板，被捕获的Fab片段使用HRP偶联的山羊抗人Fab特异的抗体进行检测。
[0035]图20显示了来自平板G060的周质提取物的ELISA分析。使用破伤风类毒素包被ELISA板，被捕获的Fab片段使用HRP偶联的山羊抗人Fab特异的抗体进行检测。
[0036]图21显示了来自平板G060的周质提取物的一步竞争ELISA分析。ELISA板使用破伤风类毒素(TT)包被，在每一个孔中加入10-7M的可溶性TT，目的是与细菌上清中的Fab片段竞争结合固定化的TT。被捕获的Fab片段用HRP偶联的山羊抗人Fab特异的抗体进行检测。
[0037]图22显示了来自G060板的TT抗原结合克隆的可变重链蛋白序列的序列比对。用不同的阴影代表不同程度的序列同源性：100％、80％和60％被分别用黑色、灰色和浅灰色表示。CDR1位于比对位置的34到41。CDR2位于比对位置的55到73。CDR3位于比对位置的107到127。早熟终止密码子用星号表示。比对分成8幅不同的图(a-h)，从左至右排列成两排。上面一排是图22a到d，下面一排是图22e到h。
[0038]图23显示了来自G060平板的TT抗原结合克隆的可变轻链蛋白序列的序列比对。用不同的阴影代表不同程度的序列同源性：100％、80％和60％被分别用黑色、灰色和浅灰色表示。CDR1位于比对位置的26到42。CDR2位于比对位置的58到64。CDR3位于比对位置的97到106。早熟终止密码子用星号表示。比对分成8幅不同的图(a-h)，从左至右排列成两排。上面一排是图23a到d，下面一排是图23e到h。
[0039]图24显示了竞争ELISA检测，测定了从平板G060中选出的克隆的表观亲和性。浓度从100nM到25pM的可溶性TT稀释液(四倍稀释)加入到Fab片段中，这样与Fab片段竞争结合固定化TT。在给定可溶性TT浓度下观察到的结合与没有向反应中加入可溶性TT时观察到的结合之比作为反应的程度。
[0040]图25显示了双系统发生点矩阵图线，显示了抗体重链和轻链可变结构域序列之间的基因内和基因间的关系。VH和VL的系统发生树在点矩阵中配对，以显示特定V基因的实际配对。A)使用噬菌体展示从组合文库中得到的TT结合克隆。B)使用本发明从关联对文库中得到的TT结合克隆。
发明详述
[0041]本发明的目的是提供两个或者更多不相邻目标核苷酸序列的扩增和连接方法，使这种序列的克隆适合于高通量的模式。这主要通过降低扩增和连接待克隆的序列所需要的步骤的数目来实现。
[0042]本发明的一个方面是连接多个不相邻的核苷酸序列的方法，包含在多重分子扩增步骤中，使用来自分离的单个细胞、等基因细胞群或者具有遗传多样性的细胞群的模板扩增目标核苷酸序列并实现扩增出的序列的随后连接。如果模板是分离的单个细胞或者等基因细胞群，连接产生的核酸片段包含以关联方式互相连接的目标核苷酸序列。如果模板是具有遗传多样性的细胞群，连接产生了片段文库，其中每一个片段包含随机连接的目标核酸序列。这也被称为组合文库。
[0043]在本发明的一个实施方案中，这个多重分子扩增步骤是多重PCR扩增，优选地先进行逆转录步骤。在一个优选的实施方案中，逆转录、扩增和连接在单一步骤中进行，使用多重重叠-延伸RT-PCR或者分成两步进行，使用多重RT-PCR，之后通过连接方法或者重组方法连接。
[0044]本发明的另一个实施方案涉及的是包含连接的可变区编码序列，特别是重链可变区和轻链的编码序列或者T细胞受体(TcR)α链和β链编码序列的关联对文库的制备。该过程涉及从至少一个适宜的供体获得含有淋巴细胞的细胞级分，可选地从这个级分中富集某一个淋巴细胞群，例如B淋巴细胞或者T淋巴细胞，这取决于是需要来自免疫球蛋白还是来自TcR的可变区编码序列。含有淋巴细胞的细胞级分或者富集后的细胞级分分配到一系列容器中，每一个容器中一个细胞。对该一系列单细胞进行逆转录(RT)步骤或者其它cDNA制备步骤，使用来自单细胞群的核酸作为模板。RT步骤之后是多重分子扩增步骤以及根据本发明的一种方法从每一个细胞产生的可变区编码序列对的连接。
[0045]本发明公开的克隆技术省略了费力和低效的克隆过程，而且降低了在多次克隆步骤中污染和多样性丢失的风险。
[0046]本发明的另一个方面涉及的是通过多重分子扩增以及连接过程产生的关联对文库。可以对使用本发明的方法制备的关联对的起始文库(亲本文库)进行筛选，这样产生了编码靶标特异性结合蛋白可变结构域或者全长结合蛋白的关联对的亚文库。
[0047]在本发明的另一个实施方案中，本发明的文库和亚文库可以在重组单克隆或者多克隆蛋白的表达中使用，其中存在于供体中的原始结合亲和性和特异性被保留下来。
定义
[0048]术语“关联对”描述的是包含在单个细胞中或者来自单个细胞的非相邻目标核酸的原始配对。在优选的实施方案中，关联对包含两个可变区编码序列，这两个序列共同编码一个结合蛋白可变结构域，所述基因序列来自同一个细胞。这样，当作为完整的结合蛋白或者作为其稳定片段表达时，它们保持了原来从这个细胞表达的结合蛋白的结合亲和性和特异性。关联对可以例如包含抗体可变重链编码序列与来自同一个细胞的可变轻链编码序列，或者T细胞受体的α链编码序列与来自同一个细胞的β链编码序列。关联对文库是这种关联对的集合。
[0049]术语“热起始聚合酶”描述的是在用于逆转录的温度下无活性或者具有非常低活性的聚合酶。这种聚合酶需要通过高温(90到95摄氏度)激活才能有功能。这对于单步RT-PCR步骤而言是一个优势，因为这阻止了聚合酶对逆转录反应的干扰。
[0050]术语“等基因细胞群”描述的是遗传上相同的细胞群。特别地，通过对分离的单个细胞进行克隆扩充得到的等基因细胞群是本发明感兴趣的。
[0051]术语“分离的单个细胞”描述的是已经在物理上与细胞群分开的细胞，对应于“单一容器中的单个细胞”。当在多个容器中逐个分散一群细胞时，得到的就是一群分离的单个细胞。正如在标题为“模板来源”部分中所说明的，容器与单个细胞的比例不一定要达到100％才能称之为单细胞群，
[0052]来自与扩增相关的“连接”的术语描述了扩增后的编码目标核酸序列的核酸序列连接成单一片段的过程。与关联对相关，片段包含来自相同细胞的编码可变结构域的核酸序列，例如抗体重链可变区与抗体轻链可变区的编码序列。连接可以与扩增一起进行或者在扩增之后立即进行连接步骤。对于片段的形式或者功能性没有要求，它可以是线性的、环形的、单链或者双链的。连接也不一定是永久的，如果需要的话，可以从片段中分离出目标核酸序列中的一个，例如可以从关联对片段中分离出一个可变区编码序列。但是只要组成关联对的原始可变区没有混杂有其他可变区，它们就仍然被当做是关联对，尽管它们没有一起连接成为一个单一片段。连接优选是核苷酸磷酸二酯键连接。但是也可以通过不同的化学交联步骤得到连接。
[0053]术语“多重分子扩增”描述的是在同一个反应中同时扩增两个或者更多靶标序列。适宜的扩增方法包括聚合酶链式反应(PCR)(U.S.4,683,202)，连接酶链式反应(LCR)，(Wu and Wallace，1989，Genomics 4，560-9)，链置换扩增(SDA)技术(Walker et al.，1992，Nucl.Acids Res.20，1691-6)，自动维持序列扩增(Guatelli et al.，1990，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.，87，1874-8)以及基于核酸的序列扩增(NASBA)(Compton J.，1991，Nature 350，91-2)。后两种扩增方法涉及基于等温转录的等温反应，产生单链RNA(ssRNA)和双链DNA(dsDNA)。
[0054]术语“多重PCR”描述了一种PCR的变体，其中两个或者更多的靶标序列通过在同一个反应中包括一组以上的引物而被同时扩增，例如一组引物适用于扩增重链可变区而另一组引物适用于在同一个PCR反应中扩增κ链可变区。此外还可以用适用于λ链可变区扩增的引物组与这些引物组联合。
[0055]术语“多重RT-PCR”描述了多重PCR反应，在这个反应之前是逆转录(RT)步骤。多重RT-PCR可以用两步过程进行，在多重PCR之前有一个独立的RT步骤，或者以一步过程进行，其中用于RT和多重PCR的所有组分混和在一个试管中。
[0056]术语“多重重叠-延伸PCR”以及“多重重叠-延伸RT-PCR”意味着使用多重重叠-延伸引物混合物进行多重PCR或者多重RT-PCR以扩增靶标序列，这样使靶标序列的扩增和连接同时进行。
[0057]术语“多个容器”描述了使单个细胞与细胞群物理分离的任何物体(或者物体的集合)。这可以是试管、多孔板(例如96孔、384孔、微量滴定板或者其他多孔板)、阵列、微阵列、微芯片、凝胶或者凝胶基质。优选地，所述物体适宜于PCR扩增。
[0058]如这里所使用的，术语“多克隆蛋白”或者“多克隆性”指的是蛋白质组合物，包含不同的但是同源的蛋白质分子，优选地选自免疫球蛋白超家族。因此，每一个蛋白质分子与组合物中的其他分子都是同源的，但是还含有一个或者更多的可变多肽序列片段，其特征为多克隆蛋白质各成员之间氨基酸序列的差异。这种多克隆蛋白质的已知示例包括抗体或者免疫球蛋白分子、T细胞受体和B细胞受体。多克隆蛋白质可以由确定的蛋白质分子亚组组成，其由共同的特征(例如对于所需的靶标具有共同的结合活性)确定，例如对所需靶标抗原表现出结合特异性的多克隆抗体。
[0059]正如在这里所使用的，术语“遗传多样的细胞群”指的是细胞群，该细胞群中单个细胞在基因组水平上互不相同。这种遗传多样性的细胞群是例如来自供体的细胞群或者这种细胞的级分(例如含有B淋巴细胞或者T淋巴细胞的细胞级分)。
[0060]术语“引物组”与术语“引物对”可以互换使用，它描述的是两个或者更多引物，这些引物一起能够起动目标核苷酸序列(即关联对的一个成员)的扩增。可以设计本发明的引物组使其起动含有可变区编码序列的核苷酸序列家族的扩增。不同家族的示例有抗体κ轻链、λ轻链、重链可变区以及α、β、γ或者δT细胞受体可变区。用于含有可变区编码序列的核苷酸序列家族扩增的引物组通常包含多个引物，其中一些引物可以是简并引物。
[0061]术语“序列一致性”表示为百分比，它表明了两个序列中就最短序列的长度而言核酸序列一致性的程度。它可以计算如下：(Nref-Ndif)×100/Nref，其中Nref是较短序列中的残基数目，Ndif是两个序列之间按照Nref的长度进行最佳比对匹配后不相同残基的总数。因此，DNA序列AGTCAGTC和序列T AATCAATCGG(Ndif＝2且Nref＝8)的序列一致性是75％(下划线显示了最佳的比对，斜体表示8个残基中有两个不相同的残基)。
[0062]在提到连接时，术语“随机地”或者“随机的”指的是并非来自同一个细胞但是在遗传多样的细胞群中横向连接的核苷酸序列的连接。如果目标核苷酸序列是可变区编码序列，这会产生连接序列的组合文库。另一方面，如果目标核苷酸序列编码非多样性杂聚蛋白，则随机连接的序列看起来类似于来自单个细胞的连接的序列。
[0063]就逆转录而言，术语“来自分离的单个细胞的模板”指的是这种分离的细胞内的核酸。核酸可以例如是RNA、mRNA、DNA或者基因组DNA的形式。核酸可以从细胞中分离出来或者仍然与细胞的其他物质在一起，细胞是完整无缺的形式或者是裂解的形式。
扩增和连接方法
[0064]本发明的一个特点是使用了一种变异的PCR降低了扩增目标核苷酸序列所需的试管的数目，在这种变异的PCR中，通过在同一个反应中包含一组以上的引物(例如扩增可变区域编码序列所需的所有引物)，两个或者更多的靶标序列在同一个试管中被同时扩增。一般地，这种方法被称为多重聚合酶链式反应(多重PCR)。
[0065]多重PCR扩增以及逆转录和随后的多重PCR(多重RT-PCR)是诊断领域众所周知的技术，如用于DNA突变、删除以及多态性分析，用于mRNA水平的定量测定以及鉴定病毒、细菌和寄生虫(综述参见Markoulatos，P.et al.2002.J.Clin.Lab.Anal.16，47-51)。但是使用由四个以上的引物(包含Vκ和/或Vλ引物组以及VH引物组)组成的多重引物混合物在同一个容器中扩增免疫球蛋白轻链可变区编码序列和免疫球蛋白重链可变区编码序列，只有非常少的实例(Chapal，N.et al.1997.BioTechniques 23，518-524.；Liu，A.H.et al.1992.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，7610-7614；Embleton，M.J.et al.1992.Nucleic Acids Res.20，3831-3837)。原因可能是适用于抗原结合蛋白可变结构域编码序列扩增的引物对一般包含多个简并引物，目的是捕获这些可变区编码序列的多样性。这样，在对可变区编码序列进行多重PCR扩增时，PCR反应的复杂性大大增加了。
[0066]本发明的另一个特点是由多重PCR扩增的两个或者更多靶标序列在扩增过程后马上连接。特别地，可变区编码序列的关联对由这个过程连接。
[0067]本发明的一个实施方案利用了多重引物混合物可以设计成在重叠-延伸PCR步骤中起作用这个特点，使目标核苷酸序列被同时扩增和连接。这个多重重叠-延伸PCR技术降低了分离和连接目标核苷酸序列，特别是已连接的可变区的关联对，所需的反应数目。
[0068]本发明的其他实施方案通过连接方法或者重组方法得到连接，作为多重重叠-延伸PCR的一种替代连接方式。在这些步骤中，连接与多重PCR扩增不是同时进行的，而是作为扩增之后立即进行的一个步骤。但是连接仍然可以在进行多重PCR的试管中进行。
[0069]为了进行多重重叠-延伸PCR，需要有两个或者更多的引物组(多重引物混合物)，其中每组中至少一个引物带有重叠-延伸尾巴。重叠-延伸尾巴使扩增过程中每个引物组产生的产物连接起来。这种引物混合物被称为多重重叠-延伸引物混合物。多重重叠-延伸PCR与通常的重叠-延伸PCR不同之处在于待连接的序列在同一个试管中同时产生，这样在扩增过程中使靶标序列立即连接，而没有任何中间纯化。而且，通常的重叠-延伸PCR需要用外引物或者嵌套引物进行单独的连接PCR反应，目的是产生连接产物(Horton，R.M.et al.1989.Gene77，61-68)。这样的额外扩增步骤在本发明的多重重叠-延伸PCR中是可选择的。
[0070]本发明的另一个特点是多重PCR或者多重重叠-延伸PCR扩增之前的逆转录(RT)步骤，使用的模板来自分离的单个细胞或者等基因细胞群。
[0071]本发明的另一个特点是使用来自分离的单个细胞或者等基因细胞群的核苷酸序列作为模板用于多重PCR扩增。优选地，在多重PCR之前将来自单个细胞的RNA逆转录为cDNA。对于一些目标核酸序列的扩增，可以使用基因组DNA作为mRNA之外的另一种选择。通过使用分离的单个细胞或者来自分离的单个细胞进行克隆扩充后得到的等基因细胞群作为模板来源，就可以用来自细胞群中不同细胞的核苷酸序列避免编码目标杂聚蛋白的核苷酸序列的混杂。如果希望获得目标序列的原始组合，则这是非常重要的。特别是对于制备可变区编码序列关联对而言，使用分离的单个细胞或者等基因细胞群作为模板来源是一个重要的特征。
[0072]多重重叠-延伸PCR是一项很少用的技术。WO 99/16904公开了在单一反应中连接来自基因组序列的外显子，这样不需要使用逆转录就可产生cDNA。根据描述，对于要连接的每个外显子这个方法使用一个引物组(包含两个引物)，这样形成了多重重叠-延伸引物混合物。每个单个引物组都能够通过互补重叠-延伸尾巴与相邻的引物组发生重叠。通过使用多重重叠-延伸引物混合物进行重叠-延伸PCR反应，之后进行嵌套PCR(这被描述为一个必需的步骤)，从基因组DNA模板产生cDNA。
[0073]如WO 99/16904中所描述的，由基因组DNA的外显子制备cDNA是与杂聚蛋白编码序列的克隆不相同的领域。首先，杂聚蛋白(heteromeric protein)一般是从不同的基因表达的，而WO 99/16904中描述的外显子连接涉及的是来自单一基因的外显子的连接。此外，本发明有助于连接后的目标核酸序列文库的制备，特别是组合文库和可变区关联对的文库的制备，这是与连接来自单一基因的一系列外显子产生单一非可变cDNA完全不同的情况。而且，本发明使用了来自单个细胞的核酸，特别是RNA形式的核酸，不需要从其他细胞成分中分离出来就可以用作模板。
[0074]几乎没有出版物中描述了关于可变区编码序列连接的多重重叠-延伸RT-PCR。
[0075]多重重叠-延伸RT-PCR最简单的形式是从杂交瘤细胞系中分离scFv编码序列(Thirion，S.et al.1996.Eur.J.CancerPrev.5，507-511以及Mullinax，R.L et al.1992.BioTechniques12，864-869)。Thirion和Mullinax描述的方法用杂交瘤细胞系提取的总RNA和寡聚dT引物进行mRNA的逆转录，之后进行单独的连接步骤。使用总计4个引物，包含两个分别用于扩增重链可变区和轻链可变区的编码序列的引物对，进行连接步骤。VL正向引物和VH或者CH反向引物含有互补的重叠-延伸尾巴，使重链可变区和轻链可变区编码序列的扩增和连接同时进行。这些方法没有使用嵌套PCR增加连接方法的敏感性。
[0076]关于可变区编码序列连接的另一个多重重叠-延伸RT-PCR的实例在前面提到的WO 93/03151中予以描述，其提供了克隆来自相同细胞的重链可变区和轻链可变区编码序列的方法而不需要在克隆前分离单个细胞。WO 93/03151中描述的方法在RT步骤和多重重叠-延伸PCR步骤之间需要漂洗。而且，WO 93/03151的特殊目的之一是解决了需要分离单个细胞以获得可变区编码序列关联对的问题。
[0077]这些已知的多重重叠-延伸RT-PCR技术中没有一项可以在来自分离的单个细胞的模板上起作用。而且没有一项方法能够通过单一步骤RT-PCR反应进行。
[0078]本发明的一个实施方案包括了多个非相邻的目标核苷酸序列的连接。该方法包含在多重PCR或者多重RT-PCR扩增步骤中使用来自分离的单个细胞或者等基因细胞群的模板扩增目标核苷酸序列并且实现扩增的目标核苷酸序列的连接。而且，该方法包含了对连接后的产物进行一次额外扩增的选择性步骤。
[0079]本发明的另一个实施方案包括包含连接后的可变区编码序列的关联对文库的制备。该方法包含从供体获得含有淋巴细胞的细胞级分，从这个级分中可选地富集某一个淋巴细胞群。然后，通过在多个容器中分配来自含有淋巴细胞的细胞级分或者富集后的细胞级分的细胞，得到分离的单细胞群。分离的单细胞群中含有的可变区编码序列进行多重分子扩增(多重RT-PCR扩增)，实现可变区编码序列对的连接(其中单个的对来自分离的单细胞群中的单个细胞)。而且，该技术包含两个可选的步骤：第一步将单细胞群中每个分离的单个细胞扩充为等基因细胞群，然后进行多重RT-PCR扩增。这样得到具有多样性等基因细胞群的多个容器(一个容器中一个等基因细胞群)。第二个选择性步骤包括对连接后的可变区编码序列进行额外的扩增。
[0080]在本发明的优选实施方案中，所述的包含免疫球蛋白轻链可变区编码序列的关联对文库的单个成员与来自同一个细胞的免疫球蛋白重链可变区编码序列相连，或者T细胞受体结合结构域编码序列的关联对文库的单个成员由与α链可变区相连的β链可变区构成或者由与δ链可变区相连的γ链可变区构成，其中相连的可变区来自同一个细胞。
[0081]本发明的多重RT-PCR扩增可以作为两个步骤的过程进行，其中逆转录(RT)和多重PCR扩增(或者是多重分子扩增)分别进行，或者作为单一步骤的过程进行，其中RT和多重PCR扩增步骤使用同样的引物在一个试管中进行。
[0082]逆转录(RT)使用含有逆转录酶活性的酶进行，从来自分离的单细胞的总RNA、mRNA或者靶标特异RNA产生cDNA。可以用于逆转录的引物有，例如寡聚dT引物、随机六聚体引物、随机十聚体引物、其他随机引物或者对于目标序列特异的引物。
[0083]两步多重RT-PCR扩增步骤使RT步骤产生的cDNA被分配到一个以上的容器中，这样在进行扩增之前储存了模板级分。此外，cDNA向一个以上试管中的分配使得可以对来自同一个模板的核酸进行一个以上的多重PCR扩增。尽管这导致了独立反应数量的升高，但这打开了降低多重引物混合物复杂性的可能性，如果这是所期望的话。这个两步的方法可以例如用于在一个试管中扩增和连接重链可变区和κ轻链可变区编码序列以及使用相同的模板在不同的试管中扩增和连接重链可变区和λ轻链可变区编码序列。单个细胞通常只表达一种轻链。但是同时进行反应而不是在进行另一个反应之前等待一个反应的结果通常是更为容易的。而且，κ和λ的扩增作为内部阴性对照，因为预计只有κ或者λ才能从单个细胞中扩增。
[0084]在单步多重RT-PCR步骤中，在同一个容器中进行逆转录和多重PCR扩增。所有在单步中进行逆转录和多重PCR必需的组分在一开始就加入到容器中并且进行反应。一般地，一旦反应开始，就无须加入额外的组分。单步多重RT-PCR扩增的优势是它进一步减少了产生本发明的连接的核苷酸序列所需的步骤数目。在需要在多个容器中进行相同反应以及在单细胞阵列上进行多重RT-PCR时这是非常有用的。通过使用多重引物混合物中存在的反向引物进行单步多重RT-PCR，该反向引物在多重PCR扩增中需要作为逆转录的引物。一般地，单步多重RT-PCR所需的组合物包含核酸模板、具有逆转录酶活性的酶、具有DNA聚合酶活性的酶、脱氧核苷三磷酸混合物(包含dATP，dCTP，dGTP和dTTP的dNTP混合物)以及多重引物混合物。核酸模板优选是来自分离的单个细胞的总RNA或者mRNA，模板或者是纯化的形式或者是细胞裂解物的形式或者仍然在完好无缺的细胞内。一般地，反应混合物的精确组成需要对每一个用于本发明的多重引物混合物进行一些优化。这适用于两步和单步的多重RT-PCR步骤。
[0085]在本发明的其他实施方案中，使用基因组DNA而不是RNA作为模板可能是适宜的。在这些情况下省略了逆转录步骤，而本发明的其它步骤根据本申请全文所述的进行。
[0086]对于一些单步多重RT-PCR反应而言，在反应中加入额外的组分可能是有利的。例如，在RT步骤之后加入聚合酶。其他组分可以是例如dNTP混合物或者可能具有不同引物组成的多重引物混合物。然后这可以被认为是单管(one-tube)多重RT-PCR，一般认为它与单步多重RT-PCR具有相同的优点，因为它也限制了为获得所需的连接产物而必需的试管数目。
[0087]多重RT-PCR扩增出的目标核苷酸序列可以通过使用不同的多重引物混合物用几种方法互相连接，例如多重重叠-延伸RT-PCR、连接方法或者重组方法。优选地，多重RT-PCR扩增和连接方法是单步或者两步方法。但是连接过程可能还可以以多步骤的过程进行，使用例如填充片段以PCR、连接方法或者重组方法连接目标核酸序列。这种填充片段可能含有顺式元件、启动子元件或者相关的编码序列或者识别序列。在优选的实施方案中，连接过程与多重RT-PCR扩增在同一个容器中进行。
[0088]在本发明的一个实施方案中，与多重PCR扩增一起进行多个非相邻的目标核苷酸序列的连接，使用多重重叠-延伸引物混合物。这使目标序列被同时扩增和连接。一般地，多重重叠-延伸PCR所需的组合物包含核酸模板，具有DNA聚合酶活性的酶、脱氧核苷三磷酸混合物(包含dATP，dCTP，dGTP和dTTP的dNTP混合物)以及多重重叠-延伸引物混合物。
[0089]在本发明的一个特定实施方案中，通过多重重叠-延伸RT-PCR，使用来自分离的单个细胞或者等基因细胞群的模板对多个非相邻的目标核苷酸序列进行连接。而且，该方法包含对连接产物进行额外分子扩增的选择性步骤。优选地，多重重叠-延伸RT-PCR以单步或者单管反应进行。
[0090]本发明的多重重叠-延伸引物混合物包含至少两个引物组，该引物组能够起动至少两个可变区编码序列的扩增和连接，例如免疫球蛋白重链可变区家族序列与κ或者λ轻链可变区家族序列的扩增和连接，或者来自T细胞受体家族α、β、γ或者δ的序列的扩增和连接。
[0091]在本发明的另一个实施方案中，通过连接方法将多重RT-PCR扩增出来的多个目标核苷酸序列连接起来。为了达到这个目的，设计用于多重RT-PCR的多重引物混合物，使扩增出来的靶标序列能够被适当的限制性酶切割，并且可以通过DNA连接方法进行共价连接(引物设计在“引物混合物和设计”部分中予以描述)。在使用这种多重引物混合物进行多重RT-PCR之后，形成靶标序列相容末端所需的限制性酶与连接酶一起加入到混合物中。虽然可以进行纯化，但是在这个步骤之前不必要对PCR产物进行纯化。限制性切割和连接联合进行的反应温度大概在0到40摄氏度之间。但是如果来自多重PCR反应的聚合酶仍然存在于混合物中，则孵育温度优选在室温以下，最优选的温度在4到16摄氏度之间。
[0092]在本发明的另一个实施方案中，通过重组方法将多重RT-PCR扩增出来的多个目标核苷酸序列连接起来。在这种方法中，扩增出的靶标序列可以使用相同的重组位点连接起来。然后加入促进重组的重组酶进行连接。一些适宜的重组酶系统有具有各种FRT位点的Flp重组酶系统、具有各种lox位点的Cre重组酶、在attP位点和attB位点之间进行重组的整合酶ΦC31、β-重组酶-六系统以及Gin-gix系统。已经在两个核苷酸序列(VH与VL连接)上示例了通过重组进行的连接(Chapal，N.et al.1997 BioTechniques 23，518-524)，在这里引用作为参考。
[0093]在一个本发明的优选实施方案中，目标核苷酸序列包含可变区编码序列，连接产生了可变区编码序列的关联对。除了可变区以外，这种关联对可能还包含一个或者更多恒定区编码序列。
[0094]在本发明的一个更为优选的实施方案中，目标核苷酸序列包含免疫球蛋白可变区编码序列，连接产生了轻链可变区和重链可变区编码序列的关联对。除了可变区以外，这种关联对可能还包含一个或者更多恒定区编码序列。而且，这种关联对可以从来自由含有淋巴细胞的细胞级分(例如全血细胞、单核细胞或者白细胞)富集的B淋巴细胞谱系的细胞的模板中分离出来。
[0095]在本发明同样优选的实施方案中，目标核苷酸序列包含TcR可变区编码序列，连接产生了α链可变区和β链可变区编码序列的关联对或者γ链可变区和δ链可变区编码序列的关联对。除了可变区以外，这种关联对可能还包含一个或者更多恒定区编码序列。而且，这种关联对可以从来自由含有淋巴细胞的细胞级分(例如全血细胞、单核细胞或者白细胞)富集的T淋巴细胞谱系的细胞的模板中分离出来。
[0096]本发明的另一方面是使用遗传多样性细胞群作为模板来源的多重RT-PCR。细胞与细胞之间主要的杂聚蛋白编码序列没有变化，结合蛋白的可变区编码序列不是如此。因此在使用本发明克隆这种非可变杂聚蛋白编码序列时，没有必要进行单个细胞的初步分离。
[0097]在本发明的该实施方案中，多个非相邻的目标核苷酸序列通过以下的方法被随机连接，该方法包含：使用来自遗传多样细胞群的模板对目标核苷酸序列进行多重RT-PCR扩增，然后连接扩增后的目标核苷酸序列。而且该方法包含对连接后的产物进行额外扩增的选择性步骤。如同单细胞方法一样，连接可以使用用于扩增的多重重叠-延伸引物混合物进行或者通过连接方法或重组方法进行。优选地来自细胞群的模板不严格局限于细胞内部。细胞群可以例如被裂解。
[0098]将随机连接过程应用于表达可变结合蛋白的细胞群，使可变区编码序列组合文库的制备简单化。优选地，细胞群包含的细胞表达可变区结合蛋白，例如B淋巴细胞、T淋巴细胞、杂交瘤细胞、浆细胞或者这些细胞的混合物。
[0099]以上提到的实施方案中的细胞群可以例如被通透化或者被裂解，不需要额外的纯化，或者模板核酸可以通过标准步骤从细胞中分离出来。优选单步多重RT-PCR步骤。但是两步方法也可以用于该实施方案中。
[00100]本发明还提供了包含连接的免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区编码序列对的组合文库。
[00101]提高多重RT-PCR-连接过程特异性、敏感性和产量的有效方法是对多重RT-PCR得到的连接后的核苷酸序列进行额外的分子扩增，之后通过连接方法或者重组方法进行连接或者使用多重重叠-延伸RT-PCR进行连接。这个额外的扩增优选地使用PCR扩增进行，使用适用于扩增连接的目标核酸序列的引物混合物。使用的引物混合物可以是多重引物混合物或者多重重叠-延伸引物混合物的外引物，即与连接后的可变区编码序列有义链最外面的5′端和3′端退火的引物，这样使整个连接产物被扩增。外引物还可以描述为多重重叠-延伸引物混合物中不含有重叠-延伸尾巴的引物。或者可以使用嵌套或者半嵌套引物组进行连接的核苷酸序列的额外扩增。这种嵌套PCR特别用于提高该方法的特异性以及提高连接产物的量。对于本发明，半嵌套式PCR(如在标题为“引物混合物和设计”的部分中描述的)被认为与嵌套式PCR同样有用。因此，尽管对于本发明不是必须的，但是合意的是对多重重叠-延伸RT-PCR的连接产物或者由连接方法或者重组方法连接的产物进行额外的PCR扩增，优选使用嵌套或者半嵌套PCR。
[00102]额外的扩增可以使用多重重叠-延伸RT-PCR反应产物或者连接产物或者重组产物的一个级分或者全部，或者这些产物中任何一个的一个级分，或者使用来自这些反应中任何一个的经过部分纯化(例如对连接产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后将对应于连接后的可变区编码序列预期大小的片段切下来)的连接产物直接进行。对于通过多重重叠-延伸RT-PCR连接的产物，优选地直接在多重重叠-延伸RT-PCR反应的一个级分上进行额外的扩增，因为这会有助于在第一个反应中没有被连接的单个靶标序列的连接。
目标序列
[00103]本发明的目标核苷酸序列可以选自编码不同亚基或者结构域的序列，这些亚基或者结构域在表达后形成蛋白质或者蛋白质的一部分。这些由至少两个不同的亚基组成的蛋白质被称为杂聚蛋白。杂聚蛋白在所有的种中都是常见的。这些蛋白质所属的一些类型有例如酶、抑制剂、结构蛋白、毒素、通道蛋白、G蛋白、受体蛋白、免疫球蛋白超家族蛋白、转运蛋白等等。编码这些杂聚蛋白的核苷酸序列是不相邻的，意味着例如它们来自不同的基因或者不同的mRNA分子。但是如本发明中所使用的，不相邻还可以表示编码同一个蛋白质的结构域的核苷酸序列，其中结构域被非目标核苷酸序列分割开。
[00104]在本发明的一个实施方案中，目标核苷酸序列含有来自免疫球蛋白超家族例如免疫球蛋白(抗体)、B细胞受体和T细胞受体(TcR′s)的可变区编码序列。来自免疫球蛋白的可变区编码序列是特别感兴趣。这种可变区编码序列包含全长的抗体以及Fab′s、Fv′s、scFv′s以及可变区编码序列片段的组合，例如互补决定区(CDR′s)、连接基因或者V基因或者这些的组合。一般地本发明可以应用于任意组合的可变区编码序列及其片段。本申请例示了整个轻链与重链可变结构域的连接。但是本发明还允许只有重链和轻链的可变结构域的连接，产生Fv或者scFv编码序列，或者整个轻链与重链可变区+恒定区结构域CH1+部分的铰链区连接，产生Fab、Fab′或者F(ab)2。而且，可以向可变重链中添加重链恒定区结构域的任何区域，产生截短的抗体编码序列或者全长的抗体编码序列。
[00105]在本发明的另一个实施方案中，可变区编码序列包含一种类型的免疫球蛋白轻链(κ或者λ)编码序列以及一个免疫球蛋白重链可变区编码序列。
[00106]来自T细胞受体(TcR′s)的可变区编码序列也是感兴趣的。这些TcR编码序列包含全长的α和β链或者γ和δ链以及可溶性TcR的编码序列或者只有这些结构域的可变结构域或者它们的单链融合蛋白(例如单链αβ或者单链的γδ)的编码序列。
模板来源
[00107]本发明的一个特点是将来自分离的单个细胞、等基因细胞群或者没有被分开到单个容器中的遗传多样细胞群的核苷酸序列连接起来的能力。本发明中使用的细胞可以是例如细菌、酵母、真菌、昆虫细胞、植物细胞或者哺乳动物细胞或者这些细胞的级分。来自哺乳动物的血液细胞是可以用于本发明的细胞级分的一个实例。
[00108]本发明的优选特点是使用分离的单个细胞或者等基因细胞群作为模板来源，原因是目标核酸序列的混杂特别是可变区编码序列的混杂被避免了。如果希望获得原始的配对例如可变区编码序列的原始配对，则这一点是非常重要的。
[00109]本发明的另一个优选的特点是从包含淋巴细胞例如B淋巴细胞、T淋巴细胞、浆细胞和/或各种不同发育阶段的这些细胞谱系的细胞级分中获得单个细胞或者单细胞群。其他表达来自免疫球蛋白超家族的结合蛋白的细胞群也可以被用于获得单个细胞。细胞系例如杂交瘤细胞、B淋巴细胞或者T淋巴细胞谱系或者病毒无限增殖化细胞系或者来自供体的参与免疫应答的细胞也可以用于本发明。来自供体的含有淋巴细胞的细胞级分可以从富含这些细胞的天然组织或者液体例如血液、骨髓、淋巴结、脾脏组织、扁桃体组织或者肿瘤内和周围的浸润或者炎症组织浸润获得。用于本发明的适宜的细胞供体可以选自完全含有获得性免疫系统的脊椎动物。供体可以是从未接受免疫接种的或者对所需的靶标是过度免疫的。分离对所需靶标具有结合特异性的抗原结合蛋白时，优选具有过度免疫性的供体。这些具有过度免疫性的供体可以是使用靶标或者靶标的片段进行了免疫接种的供体，或者可以是恢复期的患者、或者是未处于健康状态、对靶标具有天然免疫应答的个体，例如自体免疫患者、癌症患者、具有感染性疾病的患者如HIV患者、甲、乙或丙型肝炎患者、SARS患者等等或者具有慢性疾病的患者。
[00110]在使用重组蛋白用于治疗时，它们优选地来自与将要被治疗的个体属于相同物种的序列(例如人类的序列用于人类的治疗)。首先，因为来自外源序列(即非人类)的重组蛋白会被免疫系统识别，导致牵涉多克隆抗蛋白质抗体的免疫应答。这些抗蛋白质抗体可以通过占据活性位点阻断药物的作用，它们会加速药物的清除，有可能诱导不良反应，如重复接触后的超敏反应。
[00111]但是在重组蛋白来自具有物种特性的序列时也可以看到免疫原性。这种免疫原性可以例如被与体内观察到的那些修饰不同的翻译后修饰所诱导。可变区编码序列组合文库也可能产生免疫原性，原因是它们由体外产生的可变区编码序列的随机对组成。控制体内抗体重链和轻链编码序列对(或者T细胞受体)形成的规律还没有被完全理解。因此，即使组成对的两个序列都完全是人类序列，一些体外形成的对仍可能被免疫系统识别为外源的。另一方面，从关联文库得到的结合蛋白不会产生所述的异常组合，因此与来自组合文库的结合蛋白相比，它们具有较低的潜在免疫原性。这并不意味着来自组合文库的产物不适宜用于治疗，只是需要对以上提及的它们的副反应进行更大程度的监控。
[00112]对于本发明中的使用，细胞供体应当优选与将要用从本发明的连接核苷酸序列得到的产物进行治疗的物种属于同一物种。优选地，细胞供体是家养动物、宠物、人或者转基因动物。携带人免疫球蛋白基因座的转基因动物在美国专利No.6,111,166和Kuroiwa，Y.等人Nature Biotechnology；2002；20：889-893中有所描述。这样的转基因动物能够产生人免疫球蛋白。这样，对这种转基因动物进行通常的免疫接种技术，可以产生针对特定靶标的完全人抗体。这使编码结合蛋白(这些结合蛋白对更为困难的靶标例如某些人抗原具有特异性，对于所述某些人抗原没有或者只存在有限的天然人抗体应答)的文库的制备成为可能。这样的转基因动物同样可以开发产生人T细胞受体。
[00113]在本发明的另一个实施方案中，含有淋巴细胞的细胞级分由从供体获得的全血、骨髓、单核细胞或者白细胞组成。单核细胞可以从血液、骨髓、淋巴结、脾脏、癌症细胞周围的浸润物以及炎性浸润物中分离。单核细胞可以通过密度离心技术如Ficoll梯度进行分离。如果单核细胞从包含组织的样品中分离，在进行梯度离心之前将组织打碎。可以使用例如机械方法如研磨、电穿孔和/或化学方法如酶处理等进行组织打碎。可以使用白细胞提取法直接从供体进行白细胞的分离。例如含有淋巴细胞的骨髓或者组织的粗制备物也可以用于本发明。这些制备物需要进行打碎，例如根据以上的描述进行打碎，以促进单细胞的分配。
[00114]本发明的另一个特点是就某种淋巴细胞群例如来自B淋巴细胞或者T淋巴细胞谱系的细胞而言，对含有淋巴细胞的细胞级分如全血、单核细胞、白细胞或者骨髓进行富集。可以通过例如使用磁珠细胞分选或者荧光激发细胞分选(FACS)进行B淋巴细胞的富集，利用了谱系特异的细胞表面标记蛋白如CD19或者其他B细胞谱系特异标记。可以通过例如使用细胞表面标记如CD3或者其他T细胞谱系特异的标记进行T淋巴细胞的富集。
[00115]本发明的优选特点是对富集后的B淋巴细胞进行进一步分选，目的是在向多个容器中分配单个细胞之前获得浆细胞。一般通过FACS分选分离浆细胞，使用表面标记例如CD38，可能与CD45联合使用。也可以使用其他浆细胞特异的表面标记或者其组合，例如CD138，CD20，CD21，CD40，CD9，HLA-DR或者CD62L，对于标记的精确选择取决于浆细胞的来源，如扁桃体、血液或者骨髓。浆细胞还可以从来自任何以上来源的、未富集的含有淋巴细胞的细胞群中获得。从血液中分离的浆细胞有时被称为早期浆细胞或者成浆细胞。在本发明中这些细胞也被称为浆细胞，尽管它们与骨髓内的浆细胞相比是CD19阳性的。对免疫球蛋白编码序列的关联对的分离，使用浆细胞是较好的，因为这些细胞中有更高比例的细胞产生抗原特异抗体(这些抗体反映了对所需抗原的获得性免疫)，且大多数细胞发生了体细胞高变，因此编码高亲和性的抗体。而且与其他B淋巴细胞群相比，浆细胞中的mRNA水平升高，这样在使用单个浆细胞时逆转录步骤更为有效。作为浆细胞分离的代替，也可以使用细胞表面标记如CD22，从含有淋巴细胞的细胞级分中分离记忆B细胞。
[00116]本发明的另一个特点是在向多个容器中分配细胞之前，根据抗原特异性选择被富集的B淋巴细胞。通过富集的B淋巴细胞与所需的抗原接触使抗原结合在暴露于表面的免疫球蛋白上，之后分离结合物，从而分离抗原特异的B淋巴细胞。这可以通过例如使用所需的抗原包被磁珠之后进行磁珠细胞分选、通过FACS、通过使用抗原包被层析柱之后进行亲和层析、通过滤膜筛选或者本领域内已知的其他方法进行。如果需要的话，可以根据抗原特异性对浆细胞以及B淋巴细胞、未富集的单核细胞、白细胞、全血、骨髓或者组织制备物进行分离。
[00117]本发明的另一个特点是使用表面标记CD45R0和/或CD27分选富集的T淋巴细胞(例如CD3阳性细胞)，获得记忆T细胞级分。也可以使用MHC-肽复合体筛选T淋巴细胞的MHC-抗原特异性(例如Callan，M.F.et al.1998.J.Exp.Med.187，1395-1402；Novak，E.J.et al.1999.J.Clin.Invest 104，R63-R67)。
[00118]本发明的另一个特点是以上描述的任何分离的细胞级分(例如B淋巴细胞、浆细胞、记忆细胞或者T淋巴细胞)的无限增殖化。可以在细胞分配之前使用EB病毒(Traggiai，E.，et al.，2004.Nat Med 10，871-875)进行无限增殖化。或者可以在逆转录之前对分离的单个细胞进行无限增殖化和扩充。Traggiai等人，Nat Med.2004Aug；10(8)：871-5。
[00119]本发明的另一个特点是所需细胞(例如杂交瘤细胞、B淋巴细胞或者T淋巴细胞谱系的细胞系、全血细胞、骨髓细胞、单核细胞、白细胞、B淋巴细胞、浆细胞、抗原特异的B淋巴细胞、记忆B细胞、T淋巴细胞、抗原/MHC特异的T淋巴细胞或者记忆T细胞)群的细胞向多个容器中进行逐一分配，目的是获得分离的单细胞群。这种单细胞的分离指的是细胞从细胞群中进行物理分离，使单个容器中含有单个细胞，或者对微阵列、芯片或者凝胶基质进行荷载使其产生单个细胞。这些细胞可以通过有限稀释直接分配到大量的容器(例如单个容器的阵列)中。本发明中使用的单个容器优选是适用于PCR的容器(例如PCR管以及96孔或者384孔的PCR平板或者更大的容器阵列)。但是也可以使用其他的容器。当向大量的单个容器(例如384孔的平板)中分配单个细胞时，得到的是单个细胞群。这种分配可以通过例如将某一体积分配到单个容器中，该体积中平均包含的细胞浓度为1、0.5或者0.3个细胞，这样得到平均含有单个细胞或者更少细胞的容器。由于通过有限稀释对细胞进行分配是一个统计事件，一部分容器将会是空的，大部分的容器会含有一个细胞，少部分的容器会含有两个或者更多的细胞。当两个或者更多的细胞存在于一个容器中，则可能在该容器的细胞中出现一些可变区编码序列的混杂。但是由于这种混杂是次要事件，所以它不会影响本发明的整体有用性。而且，不具有所需结合亲和性和特异性的可变区编码序列的组合在筛选过程中很有可能不被选中因此被除去。因此，混杂的次要事件不会显著影响本发明的最终文库。
[00120]通过有限稀释进行细胞分配的替代方法使用例如细胞分选仪如FACS仪器或者能够设定程序准确地将单个细胞分配到单个容器中的自动仪器。这些替代方法是优选的，原因是它们消耗更少的劳动，对于均一地将单个细胞分配到单个容器中更为有效。
[00121]以上描述的富集、分选和分离步骤的实施使得大部分细胞保持完好无损。在富集和分选过程中细胞的破裂可能导致可变区编码序列的混杂。但是预计这不是问题，因为破裂的频率预计很低。在向单个容器中分配之前对细胞进行漂洗和可能的RNA酶处理会除去任何在该过程中已经泄露的RNA。
[00122]而且，在考虑以上对如何分配细胞以获得单个容器群中的单细胞群的描述时，每一个容器中必需含有单个细胞并不被认为是绝对必需的特征。相反，它表明大多数容器中含有单个细胞，例如含有两个或者更多细胞的容器的数目占所分配细胞总数的25％以下，或者更好地在10％以下。
[00123]本发明的另一个特点是逆转录的进行，使用的模板来自在多个容器中被分配为单一细胞的细胞。
[00124]对于逆转录(RT)，根据本发明，认为将要作为RT模板来源的单细胞内的核酸来自单个细胞，尽管没有必要将它们从该单个细胞的其他成分中分离出来。
[00125]当对单个细胞向单个容器中进行了最终分配后，可以在逆转之前对单个细胞进行增殖以获得等基因细胞群。这个过程产生了更多的可以被用作模板的mRNA，如果要扩增和连接的是稀有的靶标，则这一点可能就很重要。但是就靶标基因而言，在增殖过程中细胞应当保持遗传一致性。只要用于逆转录的模板没有降解，分离的细胞或者等基因细胞群可以保存完好或者裂解。优选对细胞进行裂解，目的是使接下来的逆转录和PCR扩增变得容易。
[00126]在本发明的一个不同的实施方案中，公开的多重重叠-延伸RT-PCR方法或者多重RT-PCR之后通过连结方法或者重组方法进行连接，还可以用于来自没有被分配到单一容器中的遗传多样细胞群的模板，所述细胞群在一起作为一个细胞库。该方法可以用于产生组合文库。这种方法不需要单个细胞的分配。但是，可以在这一方法中使用的细胞与在单细胞方法中描述的那些细胞是相同的，例如一群分选后的B淋巴细胞或者T淋巴细胞。在对这样的细胞群进行单步多重重叠-延伸RT-PCR或者单步多重RT-PCR之后通过连接方法或者重组方法进行连接时，优选地在反应之前裂解细胞，如果需要的话可以从裂解物中分离总RNA或者mRNA。
[00127]本发明中单步多重重叠-延伸RT-PCR的敏感性允许使用非常小量的模板。如实施例2和3所示，可以用对应于单个细胞裂解物的模板量进行单步多重重叠-延伸RT-PCR。
引物混合物和设计
[00128]本发明的引物混合物包含至少四个引物，它们两两成对形成引物组，能够扩增至少两个不同的目标靶标序列。两个或者更多的这种引物组组成了多重引物混合物。优选地，多重引物混合物包含至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或者20，30，40，50，60，70，80，90 100，110，120，130，140或者150个引物组(引物对)。特别对于可变区编码序列的扩增，多重引物混合物中的单个引物组可以由多于两个的引物组成。优选地，一个引物组包含至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，45，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150，160，170，180，190，200，220，240，260，280或者300个引物。优选地，在多重引物混合物中引物的总数至少是5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20，25，30，35，45，50，60，70，80，90，100，125，150或者200，最多是225，250，275，300，325，350，375或者400个引物。
[00129]本发明的所有引物包含基因特异的区域，优选地所有的引物还在引物5′末端带有引物尾巴，即与基因特异引物部分的3′端融合的5′非编码序列。这样的引物尾巴大约有6-50核苷酸长，但是如果需要的话也可以更长一些。扩增以后，引物尾巴(primer tail)被加在靶标序列上。
[00130]本发明的引物尾巴是例如，克隆尾巴和连接尾巴，如适用于通过连接方法进行连接的尾巴，适用于通过重组方法进行连接的尾巴或者重叠-延伸尾巴。
[00131]克隆尾巴可以为6到20个核苷酸长或者更长并且包含限制位点和/或重组位点，它们对连接产物向适当载体中的插入是有用的。
[00132]为了通过连接方法进行连接，对多重引物混合物的引物组进行设计使第一引物组的一部分(正向或者反向引物)装配有含有限制位点的连接尾巴，该限制位点在切割后会与位于第二引物组一部分的连接尾巴中的限制位点相容。为了连接多于两个的靶标序列，第二引物组的第二部分装配有限制位点，该限制位点切割后能与第三引物组的一部分中的限制位点相容。位于第二引物组中的所述第二限制位点应该与第一引物组中的限制位点不相容。可以通过这样设计引物来连接相当多的靶标序列。应该选择在靶标序列中出现频率低或者不出现的限制位点。而且，相容性限制位点优选地应该是不同的，使得连接位点不能被所使用的特定限制酶切割。这使得反应向靶标序列1与靶标序列2的连接方向进行，原因是相同靶标序列之间的连接可以被限制性酶切割。适宜的限制位点对有，例如SpeI和XbaI(或者NheI或AvrII可以代替这两个中的一个或者全部)、NcoI和BspHI、EcoRI和MfeI或者PstI和NsiI。对于连接，SpeI可以例如位于靶标序列1中，XbaI可以位于靶标序列2中，NcoI可以位于靶标序列的另一端，BspHI位于靶标序列3中，依此类推。为了进一步简化这个过程，如果限制酶在相同的缓冲液中都起作用则是一个优势。
[00133]为了通过重组方法进行连接，多重引物混合物的引物组可以例如按照Chapal(1997 BioTechniques 23，518-524)的文章中所示例的进行设计，该文章在这里被引用作为参考。
[00134]为了使目标核苷酸序列的连接与多重PCR扩增在同一个步骤中进行、向多重引物混合物的每一个引物组的至少一个引物中加入适合于重叠-延伸PCR的尾巴，这样产生多重重叠-延伸引物混合物。
[00135]重叠-延伸尾巴通常更长，长度从8到75个核苷酸，可能含有限制位点或者重组位点，使得接下来可以插入调控元件如启动子、核糖体结合位点、终止序列或者连接体序列(如scFv中的连接体序列)。如果需要终止密码子的话，重叠-延伸尾巴还可以含有终止密码子。一般地有三种类型的重叠-延伸尾巴，如图1中所示。在类型I中，两个引物组中只有重叠-延伸尾巴互相重叠。两个重叠-延伸尾巴中不必所有的核苷酸都互相互补。在本发明的一方面中，互补的核苷酸占据了重叠-延伸尾巴的60到85％。在类型II的重叠-延伸尾巴中，5′核苷酸中的4到6个核苷酸与相邻靶标序列的基因特异区域互补。在类型III的重叠-延伸尾巴中，整个的重叠区与相邻的靶标序列互补。如果以后要在连接的靶标序列之间插入调控元件等，则优选类型I和类型II的重叠-延伸尾巴。如果要通过确定的连接体(如scFv中的)连接靶标序列，则优选类型II的重叠-延伸尾巴。如果靶标序列要按照阅读框进行连接，则优选类型III的重叠-延伸尾巴。
[00136]重叠-延伸尾巴的设计取决于序列的特性，如长度、相对GC含量(GC％)、是否存在限制位点、回文序列、熔解温度、它们所要连接的基因特异的部分等等。重叠-延伸尾巴的长度应该在8到75个核苷酸之间，优选地长度在15到40个核苷酸之间。更为优选在22到28个核苷酸之间。使用非常长的重叠-延伸尾巴(50到75个核苷酸)可能对由每个引物组产生的产物的连接有利。但是在使用非常长的重叠-延伸尾巴时，重叠-延伸尾巴的长度和基因特异区的长度的比例很可能需要进行调整。GC％的偏好取决于重叠-延伸尾巴的长度。因为较短的尾巴具有较短的互补区域，所以它们需要比更长的尾巴具有更高的GC％以加强相互作用。应当同样遵守引物设计的其他原则，例如应当尽可能减少使引物二聚体化和发夹的形成。引物也不能引发错误的反应。而且，已知Taq DNA聚合酶通常在新合成的DNA链的3′端加上腺嘌呤(A)，通过使重叠-延伸尾巴容纳3′非模板的A添加，使其适合于重叠-延伸尾巴的设计。
[00137]携带连接尾巴(例如重叠-延伸尾巴、适合于通过连接方法进行连接的尾巴或者适合于通过重组方法进行连接的尾巴)的引物的选择确定了靶标序列连接的顺序和方向。是引物组中的正向引物还是反向引物还是很可能正向和反向引物都配备有连接尾巴，这对于本发明不是重要的。但是，还是必须对此给予一些考虑，因为在最终产物中靶标序列的顺序和方向可能对于例如调控元件(如启动子和终止序列)的插入或者对于靶标序列按照阅读框的连接是重要的。
[00138]为了连接两个目标核苷酸序列，可以在用于每一个靶标序列PCR扩增的每一引物组的反向或者正向引物上加上连接尾巴。本发明示例了向每组引物的VH和VL正向引物中添加重叠-延伸尾巴和适于通过连接方法进行连接的尾巴(例如分别如图2和实施例9所示)。这使得产物的连接方向是5′到5′(头对头和双向)。但是连接尾巴也可以加在每个引物组的反向引物(例如在第一组的Cκ和/或Cλ或者在第二组中的CH或者JH)上。这使得产物的连接方向是3′到3′(尾对尾和双向)。第三种选择是在第一个引物组的反向引物(例如Cκ和/或Cλ引物)和第二引物组的正向引物(例如VH引物)上加上连接尾巴，反之亦然。这产生了3′到5′的定向(头对尾和单向)。图3示意了可以产生的可能方向，这取决于每个引物组中哪个引物装备有连接尾巴。
[00139]在连接两个以上的目标核苷酸序列时，一些引物组需要在正向和反向引物上都具有连接尾巴，这样使一个尾巴与前一个引物组的一个尾巴互补，另一个尾巴与接下来的引物组中的一个尾巴互补。这个原则适于所有扩增靶标序列(将要在两个其他靶标序列之间被连接)的引物组。
[00140]基因特异引物部分的设计应当遵守已知的引物设计原则，例如使引物的二聚体化、发夹形成以及非特异退火最小。而且，在可能的情况下应当避免3′的碱基出现多个G或者C核苷酸。引物组中基因特异区域的熔解温度(Tm)优选地应当互相相等，相差正负5摄氏度。在本发明中，合意的Tm值在45摄氏度到75摄氏度之间，对于大多数应用，大约60摄氏度是最佳的。有利的是，可以在根据本任务而设计的计算机程序的辅助下进行初始的引物设计。但是引物设计一般需要实验室的检测和常规的优化。这可以通过例如对使用该引物组得到的扩增产物的大小、限制片段长度多态性(RFLP)和测序进行分析而进行。引物中简并位置的使用在扩增具有可变区域的序列或者在寻找属于特定蛋白质类型的新的家族成员时是有用的方法。简并位置的数目可能也需要进行优化。
[00141]本发明包含改进的引物组，它们可以一起用于高度多重化的形式中。de Haard(de Haard，H.J.et al.1999.J.Biol.Chem.274，18218-18230)描述的引物组作为起始点使用，通过修整引物的3′端降低非特异相互作用以及添加重叠-延伸尾巴或者适合于通过连接方法进行连接的尾巴，对引物组进行调整。
[00142]本发明的一个特点是引物混合物由至少两个引物组组成，该引物组能够引起至少两个目标核苷酸序列的扩增，促进它们的连接。本发明的引物混合物能够引起至少两个来自杂聚蛋白质(例如属于酶、抑制剂、结构蛋白、毒素、通道蛋白、G-蛋白、受体蛋白、免疫球蛋白超家族蛋白、转运蛋白等等)的亚单位或者结构域的扩增。
[00143]本发明的另一个特点是包含引物组的重叠-延伸引物混合物，其中每个引物组的至少一个引物组成员包含一个能够与第二个引物组的一个引物组成员的重叠-延伸尾巴发生杂交的重叠-延伸尾巴。
[00144]重叠-延伸尾巴通过使每一个产生自引物组的产物装备上与相邻产物互补的尾巴，使得在多重重叠-延伸PCR扩增中目标核苷酸的即刻连接成为可能。但是这并不意味着连接必须在这个第一轮PCR扩增中出现。根据反应的设置，可以在使用第一轮PCR(多重PCR扩增)的外引物进行的额外扩增中进行大部分的实际连接。
[00145]本发明的另一个特点是引物组，该引物组被设计为扩增含有可变区编码序列的核苷酸序列家族。这些家族的实例有κ轻链(如在人中的VKI-VI)，λ轻链(如在人中的VL1-10)以及来自免疫球蛋白的可变重链(例如人中的VH1-7和小鼠中的VH1-15)，以及α，β，γ或者δTcR可变区。用于扩增含有可变区编码序列的核苷酸序列家族的引物组通常包含多个引物，其中一些引物可以是简并引物。例如使用引物组〔包含与κ链(VLκ引物)或者κ前导序列(VLκL引物)和/或λ链(VLλ引物)或者λ前导序列(VLλL引物)(正向引物)以及恒定区κ(Cκ引物)和/或λ引物(Cλ引物)(反向引物)或者大量这种引物的5′端互补的大量引物〕对免疫球蛋白轻链可变区编码序列家族进行扩增。或者可以使用轻链连接区引物(JLκ和/或JLλ引物)作为反向引物而不使用恒定区引物。或者正向引物与在可变轻链前导序列之前的UTR区域退火。同样，可以使用一个引物组(使用各种不同的引物组合)扩增免疫球蛋白重链可变区编码序列家族。例如与重链可变区5′端互补的引物(VH引物)或者与该区前导序列互补的引物(VHL引物)(正向引物)以及大量重链连接区引物(JH引物)或者重链恒定区引物(反向引物)。CH引物可以是同型特异的并且原则上可以使用任何的CH引物(例如CH1，CH2，CH3，或CH4)，以及可以产生全长重链的CH引物。或者正向引物与在可变重链前导序列之前的UTR区域退火。
[00146]如果对于可变区引物观察到交叉杂交，则使用与前导序列而不是与可变区5′端退火的正向引物是特别有用的。因为蛋白质在细胞内加工的过程中前导序列可以被切掉，所以可以从最终的蛋白质中除去由于交叉杂交造成的突变。实施例9描述了抗体可变重链和κ轻链前导序列引物的设计。起动的位点在前导编码序列3′端(C末端)内使引物比以前的抗体前导序列引物有优势，原因是这导致扩增后的序列在细菌和真核表达载体之间的穿梭，使前导序列在两个系统中都起作用。实施例9中描述的设计系统可以很容易地用于抗体λ轻链，TcRα、β、γ或者δ链。
[00147]本发明的一个特点是与可变区编码序列之前的前导编码序列的3′端退火的引物及其在可变区编码序列扩增中的应用。
[00148]本发明的优选特点是使用与SEQ ID NO 86到92的基因特异区具有至少90％序列一致性(优选至少95％的一致性)的引物，它们对应于在重链前导编码序列的C端退火的引物(VHL引物)。这些SEQ ID NO中基因特异的序列对应于所述序列的第18号碱基到3′末端(还请参见表11)。
[00149]本发明另一个优选的特点是使用与SEQ ID NO 93到98的基因特异区具有至少90％序列一致性(优选至少95％的一致性)的引物，他们对应于在κ轻链前导编码序列的C端退火的引物(VLκL引物)。这些SEQ ID NO中基因特异的序列对应于所述序列的第25号碱基到3′末端(还请参见表11)。
[00150]在本发明的一个实施方案中，用于多重重叠-延伸PCR以及也可能用于逆转录步骤的多重重叠-延伸引物混合物包含：a)至少一个与免疫球蛋白轻链区编码序列有义链互补的CL或者JL引物；b)至少一个与免疫球蛋白轻链可变区编码序列反义链互补的，并且能够与a)中的引物形成引物组的VL5′引物或者VL前导序列引物；c)至少一个与免疫球蛋白恒定重链结构域编码序列的有义链互补或者与重链连接区有义链互补的CH或者JH引物，以及d)至少一个与免疫球蛋白重链可变区编码序列反义链互补的，并且能够与c)中的引物形成引物组的VH5′引物或者VH前导序列引物。
[00151]本发明的引物组可以是例如VLκ+Cκ，VLλ+Cλ，VLκ+JL κ，VLλ+JLλ，VLκL+Cκ，VLλL+Cλ，VLκL+JLκ，VLλL+JLλ，VH+JH，VH+CH，VHL+JH或者VHL+CH或者这些引物组的组合，它们能够扩增编码可变区的靶标序列。
[00152]在本发明的另一个实施方案中，CL(JL)引物和VL(VLL)引物适合于扩增包含κ轻链可变区或者λ轻链可变区的序列。
[00153]在本发明的一个优选实施方案中，CL(JL)引物和VL(VLL)引物适合于扩增κ轻链可变区和λ轻链可变区的编码序列。
[00154]在本发明的一个更加优选的实施方案中，用于轻链扩增的正向引物VLL引物与SEQ ID 93到98的基因特异区域具有至少90％的序列一致性(优选至少95％的一致性)，用于重链扩增的正向引物VHL引物与SEQ ID 86到92的基因特异区域具有至少90％的序列一致性(优选至少95％的一致性)。
[00155]在本发明的另一个实施方案中，携带免疫球蛋白VL/VLL和VH/VHL引物连接尾巴，优选是互补重叠-延伸尾巴的形式。这产生了以头-头方式连接的可变区编码序列。对于以头-尾方式连接的可变区编码序列，CL/JL和VH/VHL引物含有连接尾巴或者VL/VLL和CH/JH引物含有连接尾巴，优选是互补重叠-延伸尾巴的形式。对于以尾-尾方式连接的可变区编码序列，CL/JL和CH/JH引物含有连接尾巴，优选是互补重叠-延伸尾巴的形式(图3)。
[00156]优选地，本发明的多重引物混合物，包括多重重叠-延伸引物混合物包含两个引物组。这样，一个多重引物混合物包含至少四个不同的引物。在本发明的另一个方面中，多重引物混合物包含四个以上的不同引物。本发明的多重引物混合物用于在单一容器中靶标序列的扩增。例如在同一个容器中κ、λ和重链可变区都被扩增。本发明的一个多重引物混合物包含16个不同的简并引物，分布如下：八个VH引物、一个CH1引物，六个VLκ引物和一个Cκ引物(图2)。另一个引物组包含19个简并引物，分布如下：八个VH引物、四个JH引物，六个VLκ引物和一个Cκ引物。第三个引物组包含22个简并引物，分布如下：八个VH引物、一个CH1引物，11个VLλ引物和两个Cλ引物。第四个引物组包含27个简并引物，分布如下：八个VH引物、一个CH1引物，六个VLκ引物，一个Cκ引物，11个VLλ引物和两个Cλ引物。
[00157]本发明还包含引物，该引物用于对由多重RT-PCR以及此后通过连接方法或者重组方法连接或者多重重叠-延伸RT-PCR得到的连接产物进行额外PCR。这个额外PCR扩增可以使用适用于扩增连接的靶标序列的引物混合物。这样的引物混合物可能包含多重引物混合物或者多重重叠-延伸引物混合物的外引物，即与连接的核苷酸序列有义链的最外侧5′端和3′端退火的引物，这样使整个连接的产物被扩增。可以用作本发明中外引物的引物的实例是Cκ/Jκ和/或Cλ/Jλ引物，其与JH或者CH引物形成引物组。这个过程一般用于增加从多重RT-PCR以及此后通过连接方法或者重组方法得到或者多重重叠-延伸RT-PCR得到的连接产物的量。
[00158]或者，与初次多重RT-PCR或者多重重叠-延伸RT-PCR反应中使用的外引物相比为嵌套的引物组可以用于对连接后的核苷酸序列进行额外的扩增。在本发明中，这种引物组被称为嵌套引物组。嵌套引物的设计一般遵守的规则与前面描述的基因特异引物的引物设计规则相同，所不同的是它们从多重RT-PCR或者多重重叠-延伸RT-PCR中使用的外引物的退火位置的3′端引发。所以由嵌套PCR产生的产物比从多重RT-PCR以及此后通过连接方法或者重组方法或者多重重叠-延伸RT-PCR得到的连接产物要短。除了增加连接产物的量，嵌套PCR还增加了整体特异性，特别是提高多重重叠-延伸RT-PCR技术的特异性。但是应当注意在进行额外扩增时不是所有的前面描述的多重引物混合物/多重重叠-延伸引物混合物都适于与嵌套引物组合在一起。在这种情况下多重引物混合物/多重重叠-延伸引物混合物中的外引物可以用于额外扩增或者可以进行半嵌套PCR，后面将对此进行描述。
[00159]在本发明的一个实施方案中，JL和JH引物的混合物用作嵌套引物，用于连接后的免疫球蛋白可变区编码序列的额外扩增。
[00160]本发明的嵌套引物还可以包含来自第一个多重引物混合物/多重重叠-延伸引物混合物的反向(或者正向)外引物以及另一个在第一个多重引物混合物/多重重叠-延伸引物混合物的正向(或者反向)退火位置外引物3′侧引发的嵌套引物。使用这种引物组进行额外的PCR扩增，这一般被称为半嵌套PCR。如果在一个特异区域(例如对于可变区序列)中设计嵌套引物(V和J引物)很困难(因为这样的引物会在互补决定区(CDRs)中退火)，则可以例如使用半嵌套PCR。而且，在需要保持连接序列的一端不发生变化(例如用于克隆目的)时，可以使用半嵌套PCR。
[00161]本发明的一个特点是在额外扩增反应中使恒定区轻链编码序列保持完好。与初次反应(多重RT-PCR或者多重重叠-延伸RT-PCR反应)中使用的外引物相比，额外扩增中使用的CL(反向)引物只有轻微修饰。修饰包含在用于初次扩增的CL引物的3′端添加几个碱基。另外，可以在嵌套的CL引物上加上不同的克隆尾巴。与在初次反应中使用的恒定区重链特异的外引物相比，在额外扩增中使用的正向引物是完全嵌套的。在额外扩增中，初次反应中的外引物和轻微修饰的嵌套CL引物组合以及完全嵌套的正向引物，使特异性增加，这与使用完全嵌套的引物组进行的嵌套PCR可以得到的特异性相当。
[00162]在本发明的优选实施方案中，使用JH引物和修饰的CL引物进行嵌套PCR，其中与多重引物混合物/多重重叠-延伸引物混合物中的第一个CL引物相比，在3′端加上了两个到十个基因特异的碱基对。
多重重叠-延伸PCR的优化
[00163]可以使用几个参数对两步和单步的多重重叠-延伸PCR步骤的参数进行优化(参见例如Henegariu，O.et al.1997.BioTechniques 23，504-511；Markoulatos，P.et al.2002.J.Clin.Lab.Anal.16，47-51)。一般地，相同的优化参数可以应用于多重RT-PCR，尽管对于这种反应而言外引物和内引物之间的比例不很重要。
a.引物浓度
[00164]携带重叠-延伸尾巴的引物(例如VH和VL引物)的浓度优选地低于没有重叠-延伸尾巴的外引物(例如JH和κ引物)的浓度。
[00165]如果靶标序列中一个序列的扩增效率低于其他序列，例如由于更高GC％导致的低效率，则有可能均衡扩增效率。对于低效率扩增的引物组，可以使用更高的浓度，或者降低另一个引物组的浓度，从而可以实现上述扩增效率的均衡。例如，编码重链可变区的序列一般具有更高的GC％，所以比轻链可变区的扩增效率低。这促进使用比VH引物浓度更低的VL引物。
[00166]另外在使用大量引物时，引物的总浓度可能是一个问题。通过滴定实验确定上限。对于来自Applied Biosystems的″AmpliTaqGold″PCR系统，上限是1.1uM总寡核苷酸浓度。而对于其他的系统，总寡核苷酸浓度可以高达2.4uM。这样的寡核苷酸总浓度上限影响了单个引物的最高浓度。如果单个引物浓度过低，有可能导致弱的PCR敏感性。
[00167]还发现寡核苷酸引物的质量对于多重重叠-延伸PCR很重要。HPLC纯化的寡核苷酸引物产生最好的结果。
b.PCR循环条件：
[00168]优选地，循环条件如下：
变性：10-30秒 94摄氏度
退火：30-60秒 50-70摄氏度，比引物的Tm大约低5摄氏度
延伸：1分钟×EPL 65-72摄氏度，EPL是kb表示的预期产物长度。
循环数：30-80
最终延伸：10分钟65-72摄氏度
[00169]对于单步多重重叠-延伸RT-PCR，在以上概述的扩增循环之前，在循环程序中加入以下的步骤：
逆转录：42-60摄氏度30分钟。在逆转录单独进行时也使用这些条件。
聚合酶激活：95摄氏度10-15分钟。在单步RT-PCR中最好使用热起始聚合酶。
根据生产商进行激活。
[00170]可以对所有这些参数进行优化。特别是退火温度很重要。因此，开始时要分别检测组成最终引物混合物的每一个引物组，目的是找到最佳的退火温度和时间以及延伸和变性时间。这会为这些参数可以对多重重叠-延伸引物混合物进行优化的范围提供一个很好的概念。
[00171]PCR灵敏度差的问题，例如由于低的引物浓度或者低的模板浓度所造成的低PCR灵敏度可以通过使用大量热循环数目解决。大量热循环数目由35到80个循环组成，优选大约40个循环。
[00172]另外，更长的延伸时间可以改善多重重叠-延伸PCR过程。与一般的1分钟延伸时间相比，长的延伸时间由1.5到4分钟×EPL组成。
c.辅助物的使用
[00173]多重PCR反应可以通过使用PCR添加剂例如DMSO、甘油、甲酰胺或者甜菜碱而显著改善，添加剂使DNA松弛，使模板变性更容易。
d.dNTP和氯化镁
[00174]脱氧核苷三磷酸(dNTP)的质量和浓度对于多重重叠-延伸PCR来说是重要的。最佳的dNTP浓度是每一种dNTP(dATP，dCTP，dGTP和dTTP)200到400uM之间，在此浓度以上扩增被迅速抑制。更低的dNTP浓度(每种dNTP 100uM)足以使PCR扩增进行。dNTP储液对融解/冻结循环敏感。三到五次这种循环后多重PCR经常进行得不好。为了避免这种问题，可以将dNTP分装成小份在-20摄氏度保存。
[00175]对Mg2+的浓度进行优化是至关重要的，因为大多数DNA聚合酶是依赖于镁的酶。除了DNA聚合酶之外，模板DNA、引物和dNTP也与Mg2+结合。因此，最佳的Mg2+浓度取决于dNTP的浓度，模板DNA和样品缓冲液的组成。如果引物和/或模板DNA缓冲液含有螯合剂例如EDTA或者EGTA，表观的Mg2+最佳浓度会被改变。过量的Mg2+浓度使DNA双链稳定，防止DNA完全变性，这会降低产量。过量的Mg2+也可以稳定引物与不正确模板位点之间形成的虚假退火，这样降低了特异性。另一方面，不足量的Mg2+浓度降低了产物的量。
[00176]dNTP和氯化镁之间的良好平衡是200-400uM dNTP(每一种)与1.5-3mM的氯化镁。
e PCR缓冲液的浓度
[00177]一般地基于氯化钾的缓冲液对于多重重叠-延伸PCR足够；但是基于其他组分例如硫酸铵、硫酸镁、Tris-HCl或者这些物质组合的缓冲液也可以进行优化用于多重重叠-延伸PCR。参与较长产物扩增的引物对在低盐浓度(例如20到50mM氯化钾)下作用更好，而参与较短产物扩增的引物对在高盐浓度(例如80到100mM氯化钾)下作用更好。将缓冲液浓度提高到2×而不是1×，可以提高多重反应的效率。
f DNA聚合酶
[00178]本发明使用Taq聚合酶作为示例。除此以外也可以使用其他类型的耐热DNA聚合酶，包括例如Pfu，Phusion，Pwo，Tgo，Tth，Vent，Deep-vent。具有或者没有3′到5′外切核酸酶活性的聚合酶可以单独使用或者相互联合使用。
载体和文库
[00179]根据本发明的目标核苷酸序列的连接产生包含连接后的目标核苷酸序列的核苷酸片段。另外，这种连接后的目标核酸序列文库通过本发明的方法制备，特别是可变区编码序列的文库。
[00180]本发明的一个特点是通过本发明方法制备的、含有连接后的目标核苷酸序列的片段或者连接后的目标核苷酸序列文库向适宜载体中的插入。文库可以是组合文库或者可变区编码序列关联对文库。由外引物、嵌套引物或者半嵌套引物产生的限制位点优选地设计为与所选择的载体的适当限制位点相匹配。如果半嵌套、嵌套引物或者外异物中的一个配备有适宜的重组位点且所选择的载体也含有一个重组位点，则连接后的目标核酸序列也可以通过重组插入到载体中。
[00181]原则上对于可以用作通过本发明的一种多重RT-PCR-连接方法产生的产物的载体没有限制。所选择的载体可以是适宜在细胞中扩增和表达的适宜载体，包括例如细菌、酵母、其他真菌、昆虫细胞、植物细胞或者哺乳动物细胞。这些载体可以用于促进进一步的克隆步骤、载体系统之间的穿梭、插入到载体中的产物的展示、插入产物的表达和/或向宿主基因组中的整合。
[00182]克隆和穿梭载体优选是细菌载体。但是，在克隆和穿梭步骤中也可以应用其他类型的载体。
[00183]展示载体可以是例如来自fd、M13或者f1丝状噬菌体的噬菌体载体或者噬菌粒载体。这些载体能够促进蛋白质在丝状噬菌体表面的展示，所述蛋白质包括例如结合蛋白质或者其片段。适宜在核糖体、DNA、酵母细胞或者哺乳动物细胞展示的展示载体也是本领域内已知的。这些包含例如病毒载体或者编码嵌合蛋白的载体。
[00184]对于所有提到的物种都有表达载体，要选择的载体完全决定于要表达的蛋白质。一些表达载体还能够通过随机整合或者利用适当的重组位点进行位点特异整合，整合到宿主的基因组中。当引入到适当的宿主细胞中时，可以设计表达载体使其提供额外的编码序列，当连接产物按照阅读框插入到这些序列中时，这些编码序列能够使更大的蛋白，例如全长的单克隆抗体表达。按照阅读框的这种插入还可以促进嵌合蛋白的表达，所述嵌合蛋白促进在丝状噬菌体或者细胞表面的展示。在噬菌体展示系统中，连接的目标核苷酸序列可以按照阅读框插入到编码外壳蛋白，例如pIII或者pVIII(Barbas，C.F.etal.1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，7978-7982；Kang，A.S.et al.1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88，4363-4366)的序列中。
[00185]在本发明的一个实施方案中，单个的目标核苷酸序列连接片段包含与轻链可变区编码序列相连的免疫球蛋白重链可变区编码序列。优选地，这些连接后的序列插入到含有编码一个或者更多免疫球蛋白恒定结构域的序列的载体中。对插入进行工程化，使连接后的重链可变区和/或轻链可变区编码序列按照阅读框插入到恒定区编码序列中。这样的插入可以例如产生Fab表达载体，全长的抗体表达载体或者编码全长抗体的片段的表达载体。优选地这样的载体是适宜用于筛选的表达载体(例如大肠杆菌、噬菌粒或者哺乳动物载体)，并且恒定区重链编码序列选自人免疫球蛋白类型IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，IgD，或者IgE，这样使Fab或者全长的重组抗体表达。除了恒定重链编码序列以外，载体可能还含有选自人λ或者κ链的恒定轻链编码序列。当连接的核苷酸序列只编码免疫球蛋白可变区编码序列(Fv)时，这是合适的。
[00186]在本发明的另一个实施方案中，单个的连接核苷酸序列片段包含与β链可变区编码序列相连的TcRα链可变区编码序列或者包含与δ链可变区编码序列相连的γ链可变区编码序列。优选地，这些连接的序列插入到含有一个或者更多TcR恒定结构域编码序列的载体中。对插入进行工程化，使插入的连接后的可变区编码序列与相应的TcR恒定区编码序列按阅读框融合。在另一个实施方案中，这样的载体是包含编码亮氨酸拉链(与TcR恒定区按阅读框融合)序列的嵌合表达载体。已经证明这种构建体提高了可溶性TcR的稳定性(Willcox，B.E.et al.1999.Protein Sci 8，2418-2423)。
[00187]可以通过两种不同的方法将本发明的关联对文库引入到载体中。在第一种方法中，将单一的关联对逐个插入到适宜的载体中。这样的载体文库可以分别保存或者汇集在一起。在第二种方法中，在载体插入之前，汇集所有的关联对，之后批量地插入到适宜的载体中，产生载体的汇集文库(在图12中予以阐明)。这种载体文库包含多种多样的可变区编码序列对。
[00188]本发明的一方面是连接后的可变区编码序列的关联对文库。优选地，文库中的单个关联对包含与重链可变区编码序列相连的免疫球蛋白轻链可变区编码序列。
[00189]另一个优选的关联对文库包含连接的TcR区编码序列，其中每一个TcR区编码序列包含与β链可变区编码序列相连的α链可变区编码序列和/或与δ链可变区编码序列相连的TcRγ链可变区编码序列。
[00190]本发明的一个实施方案是连接后的可变区编码序列(编码针对某一靶标的所需结合特异性)关联对的亚文库。优选地这些关联对包含连接后的免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区编码序列、TcR的α链可变区和β链可变区编码序列和/或TcRγ链可变区和δ链可变区编码序列。
[00191]另一个实施方案是亚文库，选自如整个发明中描述的可变区编码序列关联对的亲本文库。
[00192]本发明的优选实施方案是编码全长免疫球蛋白(选自人免疫球蛋白类型IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、或者IgM)关联对的文库或者亚文库。
[00193]本发明的另一个优选特点是文库或者亚文库，编码可溶和稳定的TcR关联对。
[00194]本发明的特点是所述文库的多样性，所述文库包含至少5，10，20，50，100，1000，104，105或者106个不同的关联对。
[00195]在本发明的另一个实施方案中，所述的连接后的可变区编码序列的关联对文库可以通过包含这里描述的步骤的方法得到。该文库还被称为亲本文库。
筛选和选择
[00196]使用本发明的一种方法从供体中分离连接后的可变区编码序列对的亲本文库，其预计代表了结合蛋白的多样性，其中的一些蛋白是无关的，即不与所需的靶标结合，特别是对于组合文库而言。因此，本发明包含了对针对某一个靶标的结合多样性亚组的编码亚文库进行富集和筛选。
[00197]对于关联对文库，文库的多样性预计代表了供体物质中存在的多样性，只有少数的随机连接可变区。因此在筛选由关联对组成的文库中靶标特异的结合亲和性之前，不一定需要富集步骤。
[00198]在本发明的另一个实施方案中，产生连接后的可变区编码序列对的文库的方法还包含了通过选择连接后可变区序列对亚组(所述亚组编码具有所需靶标特异性的结合蛋白)建立亚文库。这种对连接的可变区编码序列的选择也被称为靶标特异关联对文库。
[00199]在本发明的优选实施方案中，可变区编码序列的靶标特异关联对文库被转移到哺乳动物表达载体上。
[00200]免疫学检测法一般适宜对靶标特异的免疫球蛋白可变区编码序列进行选择。这些检测法是本领域内众所周知的，包括例如ELISPOTS，ELISA、膜检测法(例如Western印迹)、膜上的阵列或者FACS。检测法可以使用产生自免疫球蛋白可变区编码序列的多肽直接进行。或者免疫检测法可以与富集方法联合进行或在其后进行，例如噬菌体展示、核糖体展示、细菌表面展示、酵母展示、真核病毒展示、RNA展示或者共价展示(在FitzGerald，K.，2000.Drug Discov.Today 5，253-258中有综述)。如图10中所阐明的，可以对关联Fab表达文库和关联全长抗体表达文库进行筛选，这样产生阳性克隆的亚文库。这种筛选检测和富集步骤也适于Fv或者scFv片段或者连接的可变区的组合文库。
[00201]在本发明的优选实施方案中，使用高通量的筛选检测法进行可变区编码序列的靶标特异关联对或者组合对的亚文库的选择。高通量的筛选检测法可以是，但是不止限于，使用半自动化或者全自动化仪器进行的ELISA检测。它还可以是膜检测，其中细菌被机械地挑取并用格栅法印到琼脂平板上面的适当的膜上，产生表达抗原结合分子的菌落阵列。分子通过膜分泌到下方的另一个抗原包被的膜上，抗原包被的膜可以独立制备，用于鉴定分泌针对所需靶标的抗原结合分子的克隆(de Wildt，R.M.，et al.2000.Nat.Biotechnol.18，989-994)。
[00202]在通过适当的技术选择了抗原结合克隆的关联对或者组合对亚文库后，就可能通过对连接的免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区编码序列进行DNA测序，进行进一步的分析。首先这种DNA测序可以提供关于文库多样性的信息，例如胚系来源、家族分布以及CDR区内部的成熟。这种分析可以对代表广泛多样性的克隆进行选择，去掉重复的克隆。第二，DNA测序可以发现在分离过程中引入的突变。
[00203]在分析可变区编码序列时，在评价一个突变是否可以接受时需要考虑三种类型的突变：i)最常见类型的突变来自家族内的交叉引发(cross-priming)，其中V基因的引物在一个特定的V基因家族中引发了错误的亚组。这种被引入的改变主要是在一个特定位置天然存在的密码子被替代。由于在V基因家族内部的高度序列同源性，这些改变通常可以被当做保守和可以接受的改变；ii)较不常见的突变是通过家族间的交叉引发诱导的(例如VH3家族的引物引发VH1家族的编码序列)并且诱导更为显著的结构改变，有时没有天然的对应物。这种改变有可能通过产生新的表位影响可变区的免疫原性。使用标准的分子生物学技术可以容易地鉴定出这种改变并且对其进行修复，或者可以将该克隆从文库中清除；iii)由Taq DNA聚合酶产生的错误在恒定区编码序列中很容易发现并且可以容易地去除。但是，由Taq引入的突变当然也会在可变区编码序列中存在，在那里它们与天然存在的体细胞突变无法区分，因为体细胞突变也是由于可变区编码序列中的随机突变造成的。考虑到这些突变是非系统突变并且仅仅以独特的方式影响特定的对，所以对这些突变不予理睬是合理的。
[00204]可以使用进一步的序列分析确定关联对文库的混杂程度性，如表20中对VH群H4所示例的。
[00205]如实施例9中所描述的，使用可以在可变区编码序列前导序列中退火的引物，而不是在可变区5′区退火的引物，可以在表达文库中避免i)和ii)中所描述的突变。
[00206]在本发明的另一个实施方案中，靶标特异的亚文库和可能进行了序列分析的连接免疫球蛋白轻链可变区和重链可变区编码序列对被转移到哺乳动物表达载体中。这种转移可以向前面部分中描述的任何载体中进行，使全长的重组抗体被表达。如果使用哺乳动物关联全长抗体表达文库进行筛选，可能就不需要这样的转移。
[00207]在本发明的另一个实施方案中，从富集了T淋巴细胞的含有淋巴细胞的细胞级分产生亲本文库。可以对组成亲本文库的连接后的可变区编码序列对进行选择，从中选出编码连接后可变区序列(由编码具有所需靶标特异性的结合蛋白的α及β和/或γ及δ链组成)对亚组的序列，产生关联对或者组合对的亚文库。接下来可以使用标准的方法学例如使用四聚体MHC-肽复合体染色的方法(例如Callan，M.F.et al.1998.J.Exp.Med.187，1395-1402；Novak，E.J.etal.1999.J.Clin.Invest 104，R63-R67)，通过测量以IL-2释放形式的细胞应答或者通过更为精密复杂的方法如酵母或者逆转录病毒展示技术，从转染细胞的混合物中鉴定出抗原特异的T细胞受体。
宿主细胞和表达
[00208]本发明的文库可以转移到适于表达和生产蛋白质的载体中，所述蛋白质由连接的目标核酸序列编码，特别是由含有结合蛋白或者其片段的可变区编码。这些载体在“载体和文库”部分中有所描述，提供了例如属于所选种的全长抗体、Fab片段、Fv片段、scFv、膜结合或者可溶性tcR或者TcR片段的表达。
[00209]本发明的一个特点是连接后可变区编码序列关联对的载体文库或者亚文库或者编码连接后可变区编码序列关联对的单个克隆引入到宿主细胞中，用于扩增和/或表达。宿主细胞可以选自细菌、酵母、其他真菌、昆虫细胞、植物细胞或者哺乳动物细胞。对于表达的目的，优选的哺乳动物细胞有中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、BHK细胞、骨髓瘤细胞(例如Sp2/0细胞，NSO)、NIH 3T3、成纤维细胞或者无限增殖人细胞例如HeLa细胞、HEK293细胞或者PER.C6。
[00210]载体向宿主细胞的引入可以通过多种本领域技术人员已知的转化或者转染方法完成，包括磷酸钙沉淀、电穿孔、显微注射、脂质体融合、红细胞外壳融合(RBC ghost fusion)、原生质体融合、病毒感染等等。单克隆全长抗体、Fab片段、Fv片段和scFv片段的制备是众所周知的。
[00211]用于治疗的重组多克隆抗体的制备是相当新的领域。在PCT申请WO 2004/061104中已经描述了重组多克隆生产技术。简而言之，该技术涉及的是适于作为生产细胞系的细胞库的制备。对于该技术接下来的描述是针对关联对文库的，但是也同样适于组合文库。在细胞库中的单个细胞能够例如从关联对文库中表达重组多克隆结合蛋白的不同成员。为了保证单个细胞表达多克隆结合蛋白的单一关联对而不是几个关联对，编码关联对的核酸序列引入到每个单个细胞基因组中的单个位点特异性位点。这是细胞库的一个重要特点，因为这防止了从每一个细胞中表达的重链和轻链的混杂，但是还因为它产生的细胞互相之间除了单个关联对的可变区中有小的差异以外基本上都是相同的。这个特点可以使细胞库在生产所需的时间段中进行无偏倚的生长。为了保证单一位点特异的整合，应该使用只有一个整合位点的宿主细胞系，这些通常是商业化的，例如含有单一FRT位点的Invitrogen的CHO Flp-In细胞。该细胞系的适当载体含有一个对应的FRT位点并且通过Flp重组酶引入到基因组中。还有一些其他已知的可以与它们的对应重组位点联合使用的重组酶，例如Cre、β重组酶、Gin、Pin、PinB、PinD、R/RS、λ整合酶或者噬菌体ΦC31整合酶。另外，适当的载体含有选择标记，可以对位点特异的整合子进行选择。
[00212]可以通过几个不同的转染和生产策略实现多克隆生产细胞系的制备以及来自这样的细胞系的重组多克隆蛋白质的制备。
[00213]一种方式是使用混和成为单一组合物的载体文库，用于转染每个细胞具有单一整合位点的宿主细胞系。该方法被称为批量转染(bulk transfection)或者成批转染。一般地，前面描述的载体和宿主细胞设计可以保证在正确选择时可以得到能够进行无偏倚生长的多克隆细胞系。在开始重组多克隆蛋白生产之前可以制备冷冻的多克隆细胞系的储备物。
[00214]另一种方式是将一个载体文库分成几个级分，使一个组合物中含有大致5到50个该文库的单个载体，用于转染。优选地，文库的一个级分由10到20个单个载体组成。然后将每个组合物转染到一等份的宿主细胞中。该方法被称为半批量转染(semi-bulktransfection)。转染的份数取决于文库的大小和每一个级分中单个载体的数目。如果文库例如由100个不同的关联对组成，分成含有20个不同成员的级分，则需要用组合物文库(由原始文库的不同级分组成)转染5份宿主细胞。对每份宿主细胞筛选位点特异的整合。优选地，每份分别进行选择。但是也可以在选择之前汇集小份。可以对等份的克隆多样性进行分析，只有那些具有足够多样性的等份才会被用于制备多克隆关联对文库储备物。为了获得所需的多克隆细胞系用于生产，在制备冻存储备物之前可以在从储备物中取出小份后或者在短期的增殖和适应时间之后立即将小份混和。可以选择将细胞小份在整个制备过程中分开保存，将每一个小份的产物组合在一起得到多克隆蛋白质组合物，而不是在制备之前汇集细胞的小份。
[00215]第三种方式是高通量的方法，使用组成关联对文库的单个载体分别转染宿主细胞。该方法被称为单独转染(individualtransfection)。优选地，对单独转染的宿主细胞分别选择位点特异的整合。选择后产生的单个细胞克隆可以分析其增殖时间，优选地具有相似生长速率的克隆被用于制备多克隆关联对文库储备物。在制备储备物之前可以在从储备物中取出小份后或者在短期的增殖和适应时间之后立即将单个细胞克隆混和，得到所需的多克隆细胞系。该方法可以除去在转染、整合和筛选中任何可能的残留序列偏倚。或者在进行选择之前混合单个转染的宿主细胞，这可以控制由于转染造成的序列偏倚。
[00216]在以上概述的生产策略中共同的特点是所有组成重组多克隆蛋白的单个关联对可以在一个或者有限数目的生物反应器中制备，唯一的区别在于选择在什么阶段制备由多克隆生产细胞系组成的细胞库。
[00217]本发明的一个实施方案是包含可变区编码序列连接对关联文库或者亚文库的宿主细胞群。
[00218]在另一个实施方案中，宿主细胞群包含从分离的单细胞群(由淋巴细胞组成)得到的文库，使用本发明的多重RT-PCR扩增之后通过连接方法或者重组方法进行连接或者本发明的多重重叠-延伸RT-PCR技术，以连接关联对。
[00219]本发明的另一个实施方案是包含可变区编码序列连结对的组合文库或者亚文库的宿主细胞群。
[00220]根据本发明的宿主细胞群包含对应于文库多样性的多样性细胞群(细胞已经被所述的文库转化/转染)。优选地，细胞群的每一个细胞只由整个关联对文库的一个关联对组成，没有一个关联对文库的单个成员超过表达自宿主细胞群的个体成员总数的50％、更为优选25％，或者最优选10％。
[00221]在本发明的一个优选实施方案中，宿主细胞群是哺乳动物细胞。
[00222]如上描述的宿主细胞群可以用于表达重组多克隆结合蛋白，因为细胞群的单个细胞由具有各种多样性的可变区编码序列组成。
[00223]本发明的一个实施方案是表达自包含载体文库的宿主细胞的重组多克隆蛋白，所述载体编码连接后的可变区编码序列多样性关联对，其中这样的文库可以通过本发明的方法获得。通常本发明的重组多克隆蛋白包含至少2，5，10，20，50，100，1000，104，105或者106个由不同关联对组成的蛋白质。
[00224]本发明的优选实施方案是表达自宿主细胞群的重组多克隆免疫球蛋白，该宿主细胞群包含编码重链可变区和轻链可变区编码序列多样性关联对的载体文库。
[00225]本发明的另一个优选的实施方案是表达自包含载体文库的宿主细胞群的重组多克隆TcR，这些载体编码与β链可变区编码序列相连的TcRα链可变区和/或与δ链可变区编码序列相连的TcRγ链可变区序列的多样性关联对。
[00226]本发明的另一个实施方案是适于进行单克隆蛋白质生产的宿主细胞。特别地，单克隆抗体包含轻链可变区与重链可变区形成的关联对或者是包含α可变区与β可变区或者δ可变区与γ可变区形成的关联对的单克隆TcR。优选地，这样的单克隆生产细胞系不是杂交瘤细胞系。
[00227]这种单克隆抗体或者TcR可以通过在连接多个非相邻目标核苷酸序列的方法中加入以下的步骤而产生：a)向载体中插入所述的连接后的核苷酸序列；b)将所述的载体引入宿主细胞中；c)在适于表达的条件下培养所述的宿主细胞；以及d)获得表达自插入所述宿主细胞的载体的蛋白质产物。优选地，引入宿主细胞的载体编码可变区编码序列的单个关联对。
本发明的应用
[00228]本发明的一项主要应用是可变区编码序列关联对通过高通量方法的连接，特别是免疫球蛋白重链和轻链可变区编码序列或者TcRα和β链或者γ和δ链可变区编码序列的连接，用于制备关联对的文库。除了产生关联对文库之外，也可以使用本发明的多重RT-PCR以及随后通过连接方法或者重组方法或者多重重叠-延伸RT-PCR技术的连接，在遗传多样性细胞群、来自这种细胞群的细胞裂解物或者从这种细胞群中纯化的RNA上进行上述的技术，制备组合文库。文库、亚文库或者来自这些文库中一个文库的单一克隆有助于多克隆或者单克隆蛋白质的表达。特别地可以从本发明的文库中获得单克隆或者多克隆抗体。
[00229]重组单克隆抗体在诊断、治疗和预防中的使用是众所周知的。通过本发明制备的重组单克隆和多克隆抗体与通过现有技术制备的抗体产物具有相同的应用。特别地，可以通过本发明的方法制备包含与至少一种药物上可以接受的赋形剂联合的多克隆重组免疫球蛋白作为活性成分的药物组合物。更为优选的是药物组合物，其中多克隆重组免疫球蛋白包含可变区编码序列的关联对。这些多克隆重组免疫球蛋白药物组合物可以用作药物。组合物中的多克隆重组免疫球蛋白对于事先确定的疾病靶标可以是特异的，或者与该靶标具有反应性，这样组合物可以用于治疗、缓解或者阻止哺乳动物例如人、家养动物或者宠物中的疾病例如癌症、感染、炎性疾病、过敏、哮喘和其他呼吸疾病、自体免疫疾病、免疫机能失常、心血管疾病、中枢神经系统疾病、代谢和内分泌疾病、移植排斥或者不需要的妊娠。
[00230]本发明的另一项应用不能使用常规的单克隆组合抗体技术获得。在保护性抗原表征得很少或者是完全未知的情况下，例如在刚刚出现的感染性疾病中，不可能筛选能够提供针对该疾病保护的单克隆抗体。
[00231]但是，有可能使用本发明从已经具有确立的保护性抗体应答的供体例如恢复期患者中获得表达抗体的细胞，并且使用来自这些个体的起始材料制备免疫球蛋白重链和轻链可变区编码序列的关联对文库。
[00232]在例如病毒是已知的但是保护性抗原未知的情况下，可以制备针对病毒上的抗原结构具有宽泛反应性的关联抗体基因对的亚文库。如果从这种亚文库中制备重组多克隆抗体，则抗体可能含有保护性抗体。
[00233]在抗原完全未知的情况下，产生自关联对文库(来自例如恢复期患者)的重组多克隆抗体，可以与当今正在使用的超敏免疫球蛋白以相同的方式使用。这样做的原因是关联对保证产生的重组多克隆抗体与恢复期患者的抗体免疫应答非常相似。
[00234]本发明中描述的用于连接可变区关联对的技术的另一项应用是用于诊断和分析的目的。当向患者给服药物时，针对该药物的免疫应答的可能性总是存在。这种免疫原性可以通过常规的技术进行分析，例如使用来自用药物处理的个体的血清或者血浆进行的药物特异的结合分析。或者，本发明的方法可以用于通过分离可变重链和轻链编码序列关联对，反映给服药物后不久患者的免疫应答。然后可以筛选表达自这种文库的抗体对于药物或者药物组分的反应性。如果在血浆或者血清中存在的药物干扰常规方法，则这种方法是非常有用的。这些药物可以是例如抗体。使用常规的方法，对于与使用抗体治疗有关的抗药物免疫应答(例如抗独特型、抗构架区或者抗Fc免疫应答)的确定在用于治疗的抗体从血液中被完全清除之前是不能进行的。使用本发明，可以在治疗几周之后从使用该药物进行治疗的个体中分离出编码这种抗药物的抗体的序列并且进行分析。因此，这是一个用于一般评价药物是否(特别是基于抗体的药物)都具有免疫原性的替代方法。
[00235]本发明的另一项应用是疫苗和免疫程序的验证和比较。在疫苗的开发过程中这是非常有用的，因为除了现在进行的对抗体结合特异性和血清滴度的比较之外，有可能对响应新型候选疫苗而产生的抗体应答的序列多样性进行评价和比较。另外，本发明可以在疫苗在人群中的效力监测中用于分析、监测和比较抗体应答。
[00236]本发明还在含有可变区的结合蛋白领域以外找到了应用。对于本领域内的一个技术人员而言调整本发明中公开的技术，用于连接两个或者更多编码非结合蛋白的杂聚蛋白的转录核苷酸序列，仅仅是一个优化的问题。这种编码来自杂聚蛋白的结构域或者亚基的序列的连接在分离这些蛋白编码序列时可能是一个优势，因为这会显著降低步骤的数目。而且，有可能通过仅仅使用一个多重引物混合物/多重重叠-延伸引物混合物分离例如这些蛋白的拼接变异体、突变或者新家族的成员。
[00237]编码单一蛋白中不同结构域的序列的连接也是一种可能性。这种技术会使与多结构域蛋白质中某些结构域重要性相关的研究变得简单，原因是这会使中间结构域的删除变得简单。
[00238]嵌合蛋白或者偶联蛋白的制备也是本发明可以应用的一个领域。即使要连接的蛋白质具有不同的来源，例如人和小鼠蛋白质的嵌合体，也可以通过在逆转录之前混和细胞来应用本发明。这种细胞混合物可以由来自每一个物种的细胞群组成或者由来自每一个物种的单一细胞组成。
                          实施例
实施例1：两步多重重叠-延伸RT-PCR
[00239]在该实施例中，使用来自分离的单个细胞的模板进行逆转录(RT)，产生的cDNA用作一次以上的多重重叠-延伸PCR的模板。
a.细胞
[00240]使用Flp-In技术(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)制备表达IgG1-κ的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
[00241]以Flp-In表达载体pcDNA5/FRT为基础构建IgG-κ哺乳动物表达质粒载体pLL113(图4)。使用Lipofectamin2000(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，根据生产商的说明，使用含有抗体编码基因的pLL113和可提供Flp重组酶瞬时表达的pOG44对CHO-Flp-In细胞进行共转染。通过免疫检测，根据IgG-κ的产生对转化子进行筛选和证实。选择出的细胞系命名为CHO Flp-In pLL113，并且在添加了2mM L-谷氨酰胺、10％FCS和900潮霉素B的Ham′s F-12培养基(维持培养基)中维持。
[00242]使用胰蛋白酶收获CHO Flp-In pLL113细胞，用维持培养基漂洗三次。在最后一次漂洗后，细胞重悬于原来体积的维持培养基中。使用Casy-1 System(Sch_rfe System GmbH，Reutlingen，Germany)测定细胞浓度，用维持培养基稀释至1个细胞/5微升的浓度。
b.逆转录
[00243]将平均含有一个细胞的CHO Flp-In pLL113细胞悬液，分配到96孔PCR平板(Thermo-Fast 96，围边的(skirted)AB-0800，ABgene，Epsom，Surrey，UK)的单一孔中。
[00244]通过使用Qiagen One-Step RT-PCR实验方案(QiagenOneStep RT-PCR Kit，Cat#；210210，Hilden，Germany)中的逆转录酶(RT)步骤从分配的细胞中合成cDNA。
[00245]每一个孔含有以下的试剂，总体积是20微升：
1×One Step RT-PCR缓冲液，
每种dNTP终浓度是1mM，
5pmol Oligo poly-dT(18)，
26U RNA 酶抑制剂(RNasin，Promega，Madison USA，cat.NoN2111)，
2微升One Step RT-PCR酶混合物，和
5微升CHO Flp-In pLL113细胞悬液。
[00246]在55摄氏度孵育反应混合物30分钟以进行RT反应。
接下来在94摄氏度孵育反应混合物10分钟以使逆转录酶失活。
c.多重重叠-延伸PCR
[00247]使用步骤b)产生的cDNA产物的一个级分作为模板用于多重重叠-延伸PCR。反应在96孔平板中进行。
[00248]每一个孔含有以下的试剂，总体积是40微升：
1×One Step RT-PCR缓冲液，
每种dNTP终浓度是500μM，
多重重叠-延伸引物混合物浓度如表1中所示，
26U RNA酶抑制剂(RNasin，Promega，Madison USA，cat.NoN2111)，
2微升One Step RT-PCR酶混合物，和
1微升cDNA模板(来源于单一细胞(步骤b))。
[00249]所使用的多重重叠-延伸引物混合物包含表1中所示的引物。
表1
  引物名称 浓度   SEQ IDNO              引物序列(5’到3’方向)
VH 每种20nM   12345678   agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCARTagcctatactattgattaggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGTagcctatactattgattaggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGTagcctatactattgattaggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAGagcctatactattgattaggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGTagcctatactattgattaggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGTagcctatactattgattaggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGTagcctatactattgattaggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC
  CH   100nM   9   GACSGATGGGCCCTTGGTGG
VL 每种20nM   101112131415   cgcctaatcaatagtataggctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCTcgcctaatcaatagtataggctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCTcgcctaatcaatagtataggctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCTcgcctaatcaatagtataggctagccGATATTGTGATGACCCACACTcgcctaatcaatagtataggctagccGAAACGACACTCACGCAGTcgcctaatcaatagtataggctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT
  CLκ   100nM   16   atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTG
W＝A/T，S＝G/C，R＝A/G。大写序列相应于基因特异区
[00250]使用96孔的MWG Primus HT热循环仪(MWG Biotech AG，Ebersberg，Germany)进行反应，使用以下的循环条件：
变性30秒 95摄氏度
退火30秒 50摄氏度
延伸5分钟 72摄氏度
共50个循环
最终的延伸10分钟 72摄氏度
d.嵌套PCR
[00251]使用多重重叠-延伸产物作为模板进行嵌套PCR。反应在96孔平板中进行。
[00252]每个孔含有总体积为50微升的以下试剂：
1×BioTaq缓冲液，
终浓度各为400μM的每种dNTP，
2mM MgCl2，
嵌套PCR引物混合物，
1.25U BIOTAQ DNA聚合酶(Cat.No BIO-21040，Bioline，UK.)，以及
1微升多重重叠-延伸PCR产物(步骤c).
[00253]使用的引物在表2中示出。
表2
  引物名称   浓度   SEQID NO 引物序列(5’到3’方向)
JH 每种100nM   17181920   atattctcGAGACGGTGACCAGGGTGatattctcGAGACGGTGACCATTGTatattctcGAGACGGTGACCAGGGTTCatattctcGAGACGGTGACCGTGGT
  CLκ   100nM   21   accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
大写序列相应于基因特异区
[00254]使用96孔的MWG Primus HT热循环仪(MWG Biotech AG，Ebersberg，Germany)进行反应，使用以下的循环条件：
变性30秒 95摄氏度
退火30秒 50摄氏度
延伸90秒 72摄氏度
共25个循环
最终的延伸10分钟 72摄氏度
[00255]使用1％琼脂糖凝胶电泳对嵌套PCR产物进行分析，使用溴化乙锭进行检测(图5)。重叠-延伸产物的预期大小是1076bp。在泳道1，5，6，7，8和12中可以观察到这样的产物，由箭头表示(图5A)。在所示的实验中，阴性对照被污染，在样品中也出现了类似的污染。图5B绘制显示了图5A中与本实验有关的片段。
[00256]本实验阐明了一种使用来自单个细胞的模板进行两步多重重叠-延伸PCR的方式。而且表明使用从分离的单个细胞产生的cDNA进行大约20次多重重叠-延伸PCR是可能的。
实施例2：单步多重重叠-延伸RT-PCR
[00257]在该实施例中，逆转录和多重重叠-延伸PCR在单一步骤中进行，使用来自裂解的细胞的模板，裂解的细胞的浓度对应于100、10或者1个细胞。
a.细胞
[00258]产生抗破伤风IgGl-κ抗体的人杂交瘤细胞系HB-8501从美国模式培养物保藏所获得，在含有10％胎牛血清的Iscove′sModified Dulbecco′s培养基(Vitacell，Kiev，Ukraine，cat.No30-2005)中培养。在进行多重重叠-延伸RT-PCR之前，收获细胞，计数并且在-80摄氏度下在培养基中冷冻保存，浓度为200细胞/微升。
b.单步多重重叠-延伸RT-PCR
[00259]使用Qiagen One-Step RT-PCR试剂盒(Qiagen cat.No210212，Hilden，Germany)，基本根据生产商的建议进行多重重叠-延伸RT-PCR。融化细胞裂解物并且用水稀释后加入到PCR管中，产生的裂解物浓度对应于每5微升100、10和1个细胞。
[00260]每个PCR管含有总体积为50微升的以下试剂：
1×One-Step RT-PCR缓冲液，
终浓度各为400μM的每种dNTP，
多重重叠-延伸引物混合物，浓度如表3中所示，
2微升One-step RT-PCR酶混合物，
50U RNA酶抑制剂(RNasin，Promega，Madison USA，cat.NoN2515)，以及
5微升稀释的细胞裂解物。
[00261]使用的多重重叠-延伸引物混合物在表3中示出。
表3
  引物名称   浓度   SEQ IDNO   引物序列(5’到3’方向)
VH 每种40nM   222324252627282930   gctagcattattattaccatggccCAGRTGCAGCTGGTGCARTgctagcattattattaccatggccSAGGTCCAGCTGGTRCAGTgctagcattattattaccatggccCAGRTCACCTTGAAGGAGTgctagcattattattaccatggccSAGGTGCAGCTGGTGGAGtattggcgcgccatggccsaggtgCAGCTGGTGGAGgctagcattattattaccatggccCAGGTGCAGCTACAGCAGTgctagcattattattaccatggccCAGSTGCAGCTGCAGGAGTgctagcattattattaccatggccGARGTGCAGCTGGTGCAGTgctagcattattattaccatggccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC
JH 每种200nM   31323334   atattctcGAGACGGTGACCAGGGTGatattctcGAGACGGTGACCATTGTCCatattctcGAGACGGTGACCAGGGTTCatattctcGAGACGGTGACCGTGGTCC
  引物名称   浓度   SEQ IDNO   引物序列(5’到3’方向)
VL 每种40nM   353637383940   ccatggtaataataatgctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCTccatggtaataataatgctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCTccatggtaataataatgctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCTccatggtaataataatgctagccGATATTGTGATGACCCACACTccatggtaataataatgctagccGAAACGACACTCACGCAGTccatggtaataataatgctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT
  CLκ   200nM   16   atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTG
[00262]使用以下的循环条件进行反应：
逆转录：30分钟 55摄氏度
聚合酶激活：15分钟 95摄氏度(使逆转录酶失活，激活Taq聚合酶)
[00263]PCR反应：
变性30秒 94摄氏度
退火30秒 44摄氏度
延伸3分钟 72摄氏度
共50个循环
最终的延伸10分钟 72摄氏度
[00264]使用1.5％琼脂糖凝胶电泳分析10微升的反应产物，使用溴化乙锭检测(图6A)。
[00265]片段的预期大小(精确的大小取决于可变区的长度)：
VH：410bp
LC：680bp
重叠-延伸片段：1070bp
[00266]对于所有的细胞裂解物稀释度都观察到了不连续的DNA片段，其迁移对应于重链可变区(VH)以及轻链可变区和恒定区(LC)的长度。在100和10个细胞的裂解物中观察到强度较弱的片段，其迁移对应于推测的重叠-延伸片段。一个细胞的裂解物样品中的重叠-延伸片段不易识别，尽管可以在原来的凝胶上看见它(参见图6A中所示照片中的箭头以及图6B中所示的草图)。
c.重叠-延伸片段的鉴定
[00267]从根据以上描述的重复实验中，证实了重叠-延伸条带的存在。从对应于1个细胞的泳道和对应于100个细胞的泳道中于大概1070bp处切下琼脂糖凝胶，用Qiaex II(Qiagen cat.No20051，Hilden，Germany)纯化DNA，用20微升的水洗脱。
[00268]对1微升的洗脱物进行PCR(Biotaq kit，Bioline，UKcat.No BIO-21040)，根据生产商的说明，使用在推测的重叠-延伸片段侧翼的引物(对应于SEQ ID NO 32到35的JH引物和对应于SEQID NO：17的CLκ引物，每个引物的浓度是0.5μM)进行。循环参数是：
变性30秒 95摄氏度
退火30秒 55摄氏度
延伸1分钟 72摄氏度
共30个循环
[00269]使用1％琼脂糖凝胶电泳对10微升的每个反应产物进行分析，使用溴化乙锭进行检测。从1和100个细胞中都可以看见几个片段，包括一个具有预期重叠-延伸片段的迁移的片段(图6C中的箭头)。根据以上的描述，从对应于一个细胞的凝胶泳道中切下1kb的片段，使用Qiaex II进行纯化。纯化的片段用限制酶NheI和NcoI消化(分别)，反应产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，使用溴化乙锭进行检测(图6D)。这些限制位点存在于VH和LC之间的重叠区中，消化后的预期大小分别是大约410和680bp(图2)。NheI消化是部分的，因为在原来的大小处仍然存在很大一部分。
实施例3：组合的单步多重重叠-延伸RT-PCR和嵌套PCR
[00270]在该实施例中，逆转录和多重重叠-延伸PCR反应在单一步骤中进行，之后是半嵌套PCR扩增，使用来自裂解的细胞的模板，浓度对应于100、10或者1个细胞。
a.单步多重重叠-延伸RT-PCR
[00271]根据实施例2所述进行多重重叠-延伸RT-PCR，使用HB-8501细胞裂解物和多重重叠-延伸引物混合物，包含的引物如表4所示。
表4
  引物名称   浓度   SEQID NO   引物序列(5’到3’方向)
VH 每种40nM   4142434445464748   tattggcgcgccatggccCAGRTGCAGCTGGTGCARTtattggcgcgccatggccSAGGTCCAGCTGGTRCAGTtattggcgcgccatggccCAGRTCACCTTGAAGGAGTtattggcgcgccatggccSAGGTGCAGCTGGTGGAGtattggcgcgccatggccCAGGTGCAGCTACAGCAGtattggcgcgccatggccCAGSTGCAGCTGCAGGAGTtattggcgcgccatggccGARGTGCAGCTGGTGCAGTtattggcgcgccatggccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC
CH1-5 200nMof oneof theseprimers   4950515253   AAGTAGTCCTTGACCAGGCAGCCTGAGTTCCACGACACCGTCAAGAGGTGCTCTTGGAGGAGGAGTTTTGTCACAAGATTTGGGGTTGCAGATGTAGGTCTGGGTGC
VL 每种20nM   545556575859   gccatggcgcgccaatagctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCTgccatggcgcgccaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCTgccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCTgccatggcgcgccaatagctagccGATATTGTGATGACCCACACTgccatggcgcgccaatagctagccGAAACGACACTCACGCAGTgccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT
  CLκ   200nM   60   atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAA
W＝A/T，S＝G/C，R＝A/G.大写序列相应于基因特异区
[00272]但是应当注意，对于每一个多重重叠-延伸引物混合物，只使用了CH1-5引物中的一个，产生5个不同的多重重叠-延伸引物混合物。
[00273]剩余的参数如实施例2中对于多重重叠-延伸RT-PCR反应所描述的，只有退火温度变为50摄氏度。对于每一个重链恒定区反向引物(分别对应于SEQ ID NO：49到53的CH1，CH2，CH3，CH4，CH5)进行一次反应，使用对应于100、10、1和0个细胞的裂解物。
b.半嵌套PCR
[00274]1微升的多重重叠-延伸RT-PCR反应产物进行半嵌套PCR(Biotaq kit，Bioline，UK cat.No BIO-21040)，基本按照生产商的建议进行。反应的总体积是50微升。使用的引物如表5中所示。
表5
  引物名称   浓度   SEQ IDNO 引物序列(5’到3’方向)
JH 每种200nM   61626364   ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCCggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCCggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCCggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC
  CLκ   200nM   21   accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
大写序列相应于基因特异区
[00275]循环条件如下：
变性30秒 95摄氏度
退火30秒 50摄氏度
延伸1.5分钟 72摄氏度
共25个循环
最终延伸5分钟 72摄氏度
[00276]使用1.5％琼脂糖凝胶电泳对10微升的每个反应产物进行分析，使用溴化乙锭进行检测(图7)。
[00277]来自对应于一个细胞裂解物、在第一个反应中使用了CH4引物的半嵌套PCR的推测重叠-延伸片段(参见图7的箭头)，从琼脂糖凝胶上切下来，使用Qiaex II试剂盒(Qiagen cat.No.20051，Hilden，Germany)纯化，用Invitrogen TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen cat.No 45-0641，Carlsbad，CA，USA)插入到pCR2.1-TOPO中。对8个克隆的插入物进行测序，其中7个看起来由这样的重链可变区组成，即所述重链可变区与轻链可变区和恒定区通过预期的重叠区连接。
[00278]总之，组合的多重重叠-延伸RT-PCR以及半嵌套PCR反应的敏感性非常令人满意，5个恒定区引物中有4个能够从对应于单个细胞的裂解物中扩增出显著量的重叠-延伸产物。
实施例4：使用富集的人B淋巴细胞作为模板来源进行组合的单步多重重叠-延伸RT-PCR和嵌套PCR
[00279]在该实施例中，逆转录和多重重叠-延伸PCR反应在单一步骤中进行，之后是半嵌套PCR扩增，使用分离的单个人B淋巴细胞作为模板来源。
a.B细胞的分离
[00280]用破伤风类毒素免疫人类男性供体。免疫6天后收集供体120毫升血液样本，使用Lymphoprep(Axis-Shield，Oslo Norway，prod.No 1001967)，根据生产商的说明分离外周血单核细胞(PBMC)。利用磁性珠细胞分选来富集CD19阳性的细胞群。用缀合FITC的抗CD19抗体(Becton Dickinson，NJ，USA，cat.No 345776)对PBMC进行染色。使用缀合抗FITC的磁性微珠和柱纯化，根据生产商的说明(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany，cat.No 130-042-401)进行磁性珠细胞分选。用含有2nM EDTA和0.5％BSA的PBS将细胞稀释到每毫升200个细胞。5微升稀释的细胞分配到PCR管中，得到每管大约有单个细胞。将管储存于-80摄氏度直至使用。
b.多重重叠-延伸RT-PCR和半嵌套PCR
[00281]多重重叠-延伸RT-PCR和半嵌套PCR的条件如在实施例3中所述。但是反应仅仅使用由对应于SEQ ID NO：51的引物CH3组成的多重重叠-延伸引物混合物来进行。对来自组合的多重重叠-延伸RT-PCR和半嵌套PCR反应的16个样品进行分析，即各从每个半嵌套PCR反应产物中取10微升进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用溴化乙锭检测(图8)。
[00282]从图8可以看出，16个泳道中有两个(泳道5和6)含有预期迁移的片段(大约1kb)。且泳道2在预期迁移的位置含有强度较弱的片段。将泳道5和6的1kb片段从琼脂糖凝胶中切下来，使用Qiaex II试剂盒(Qiagen cat.No 20051)进行纯化，使用Invitrogen TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen cat.No 45-0641，Carlsbad，CA，USA)将片段插入到pCR2.1-TOPO中。
来自每个分离的片段的两个克隆具有正确大小的插入物。限制酶消化(NcoI和NheI，分别进行)显示了预期大小的片段(410bp和680bp)，表明在重链可变区与轻链可变和恒定区的编码序列之间有正确的连接。
[00283]对来自泳道5中的片段的两个克隆进行测序，显示它们是相同的，表明连接的VH和LC是关联对。
实施例5：使用Vλ特异性引物进行组合的单步多重重叠-延伸RT-PCR和嵌套PCR
[00284]在该实施例中，使用Vλ特异性引物以单一步骤进行逆转录和多重重叠-延伸PCR反应，之后是半嵌套PCR反应。从表达λ基因家族1b和1e以及同样重链可变区的两个不同细胞系中提取总RNA，并作为模板。
a.细胞
[00285]使用Flp-In技术(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)制备两个表达IgG1-λ的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
[00286]基于Flp-In表达载体pcDNA5/FRT构建代表两个λ基因家族的IgG1-λ哺乳动物表达载体pEm465/01P581和pEm465/01P582(图9A)。使用Fugene 6(Roche，Mannheim，Germany)，根据生产商的说明，用以上提到的含有抗体编码基因的质粒和可提供Flp重组酶的瞬时表达的pOG44共转染CHO-Flp-In细胞。筛选转染子是否有插入。选择出的细胞系被称为CHO Flp-In/Em464/01P581和CHOFlp-In/Em464/01P582，维持在添加2mM L-谷氨酰胺、10％FCS和900微克/毫升潮霉素B的Ham′s F-12培养基(维持培养基)中。
[00287]使用胰蛋白酶收获细胞系，用维持培养基漂洗3次。大约107个细胞用于总RNA的纯化，根据生产商的说明使用Nucleo SpinL试剂盒(Macherey-Nagel，Düren，Germany)。经OD260测量确定最终的RNA浓度。
b.单步多重重叠-延伸RT-PCR
[00288]使用50pg、5pg或者0.5pg总RNA作为模板的多重重叠-延伸RT-PCR基本按照实施例3中的描述进行，使用包含表6中所示引物的多重重叠-延伸引物混合物以及以下说明的循环条件。
逆转录：30分钟55摄氏度
聚合酶激活：15分钟95摄氏度(使逆转录酶失活，激活Taq聚合酶)
PCR反应：
变性30秒 95摄氏度
退火30秒 50摄氏度
延伸5分钟 72摄氏度
共35个循环
最终的延伸10分钟 72摄氏度
表6
 引物名称   浓度   SEQ IDNO   引物序列(5’到3’方向)3’
VH 每种40nM   12345678   agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCARTagcctatactattgattaggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGTagcctatactattgattaggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGTagcctatactattgattaggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAGagcctatactattgattaggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGTagcctatactattgattaggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGTagcctatactattgattaggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGTagcctatactattgattaggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC
 CH   100nM   9   GACSGATGGGCCCTTGGTGG
Vλ 每种100nM   6566676869707172737475   cgcctaatcaatagtataggctagccCAGTCTGTGCTGACTCAGCCAcgcctaatcaatagtataggctagccCAGTCTGTGYTGACGCAGCcgcctaatcaatagtataggctagccCAGTCTGTCGTGACGCAGCcgcctaatcaatagtataggctagccCARTCTGCCCTGACTCAGCCTcgcctaatcaatagtataggctagccTCCTATGWGCTGACTCAGCCAcgcctaatcaatagtataggctagccTCTTCTGAGCTGACTCAGGACcgcctaatcaatagtataggctagccCACGTTATACTGACTCAACCGcgcctaatcaatagtataggctagccCAGGCTGTGCTGACTCAGCcgcctaatcaatagtataggctagccAATTTTATGCTGACTCAGCCCCAcgcctaatcaatagtataggctagccCAGRCTGTGGTGACYCAGGAcgcctaatcaatagtataggctagccCWGCCTGTGCTGACTCAGC
Cλ2/Cλ7 100nM   7677   gccgcttattaTGAACATTCTGTAGGGGCCAgccgcttattaAGAGCATTCTGCAGGGGCCA
Y＝C/T，W＝A/T，S＝G/C，R＝A/G.大写序列相应于基因特异区
c.半嵌套PCR
[00289]使用1微升的多重重叠-延伸RT-PCR反应产物，基本按照生产商的建议进行半嵌套PCR(Biotaq kit，Bioline，UK cat.NoBIO-21040)。反应的总体积是20微升。使用的引物在表7中显示。
表7
  引物名称   浓度   SEQ IDNO   引物序列(5’到3’方向)3’
JH 每种200nM   616263   ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCCggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCCggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC
  64   ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC
CLλ 200nM   7879   atatatatgcggccgcttattaTGAACATTCTGTAGGGGCCACTGatatatatgcggccgcttattaAGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG
大写序列相应于基因特异区
[00290]循环条件如下：
变性30秒 95摄氏度
退火30秒 50摄氏度
延伸1.5分钟 72摄氏度
共25个循环
最终的延伸5分钟 72摄氏度
[00291]取10微升嵌套产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，使用溴化乙锭检测(图9B和9C)。箭头显示了重叠-延伸产物，具有大约1kb的预期迁移特性。
[00292]本实验阐明，表6中显示的λ多重重叠-延伸引物混合物可以用于单步多重重叠-延伸RT-PCR，与所用的模板无关。而且，在0.5pg总RNA时产生了特异的重叠-延伸PCR产物。这一敏感性提示可以从单个细胞中扩增出关联连接的重链可变区和轻链可变区的编码序列。
实施例6：抗体编码序列的破伤风特异性关联对的亚文库的制备
[00293]在本实施例中，使用破伤风类毒素(TT)作为靶抗原示例了在图10中显示的流程图中概述的步骤。
a.供体
[00294]以前曾经用破伤风疫苗免疫的供体使用破伤风疫苗(Statens Serum Institut，Denmark)进行加强免疫。破伤风疫苗加强免疫后6天从供体上抽取大约200毫升的血液样本，收集到含有抗凝剂的管中。
[00295]要求供体通常是健康的并且没有隐蔽或者慢性的感染。他们不应该患有自体免疫疾病或者接受任何免疫抑制性药物治疗，并且他们在最近3个月内不应当有任何的疫苗接种。而且，在进行TT疫苗加强免疫时，供体在最近一个月内必须不能有任何严重的感染。
b.外周血单核细胞(PBMC)的制备
[00296]使用Lymphoprep(Axis-Shield PoC AS，Norway，prod.No 1001967)，根据生产商的建议从血液样本中分离PBMC。简而言之，血液用PBS进行1∶1稀释，将悬液以2∶1的比例铺于Lymphoprep上。于25摄氏度、800g将小管离心20分钟，然后收集白色的中间相条带。用含有2mM EDTA的PBS漂洗细胞。
c.B细胞的富集
[00297]使用以下的步骤用磁性珠细胞分选法富集PBMC中的B细胞谱系(CD19+细胞)
[00298]使用抗-CD19-FITC(Becton Dickenson，NJ，USA，cat.No 345776)染色分离的PBMC。所有步骤在4摄氏度下于暗处进行。以每1×106个细胞使用10微升抗-CD19-FITC〔使用M-缓冲液(PBS，pH7.2，0.5％BSA，2mM EDTA)，对于每1×106个细胞体积为100微升〕进行染色。PBMC中的B细胞谱系会被染色。细胞孵育20分钟，之后用M-缓冲液进行两次漂洗。抗-CD19-FITC染色的细胞使用缀合抗FITC的微珠进行磁性标记，每1×106个细胞使用10微升抗FITC磁性珠(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany，cat.No 130-042-401)，体积是每1×106个细胞使用100微升M-缓冲液。孵育15分钟后用M-缓冲液漂洗一次。细胞用脱气的M-缓冲液重悬。
[00299]使用脱气的M-缓冲液根据生产商的说明预先处理MACSLS柱(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany，cat.No130-042-401)。将用抗-CD19-FITC染色并且用抗FITC-磁性珠标记的细胞悬液加到柱上，使其流过。染色并标记的细胞(CD19+)会被保留在围绕柱的磁场中，而没有被染色的细胞(CD19-)会流过柱。使用脱气的M-缓冲液漂洗柱。去除磁场并收集CD19+细胞。
d.浆细胞的分选
[00300]将MACS柱的洗脱物离心并且用FACS缓冲液(PBS，pH7.2，2％BSA)重悬，浓度是1×106个细胞/60微升FACS缓冲液。加入抗-CD19-FITC(Becton Dickenson，NJ，USA，cat.No 345776)(10微升/106个细胞)、抗-CD38-PE(Becton Dickenson，NJ，USA，cat.No 555460)(10微升/106个细胞)和抗-CD45-PerCP(BectonDickenson，NJ，USA，cat.No 345809)(20微升/106个细胞)。4摄氏度于暗处孵育20分钟，之后漂洗两次，用FACS缓冲液重悬。
使用荧光激发细胞分选(FACS)对细胞进行分选，使用以下的门控参数：
1.前向散射和侧向散射，目的是保留包括成浆细胞(plasmablaster)和浆细胞在内的淋巴细胞和单核细胞，以及避免死细胞和具有非常高侧向散射的细胞，其可能是团聚体或者粒细胞。
2.CD19阳性并且CD38表达水平提高(CD38hi)的细胞。这主要只是对CD38的门控，因为PBMC已经在针对CD19表达的MACS柱上进行了富集，但是这会暴露出任何污染物。
3.CD45阳性细胞。所有的淋巴细胞都表达CD45。但是，与早期淋巴细胞分化阶段相比，浆细胞下调它们的CD45表达。因此对CD45进行门控时可以得到不连续的对应于浆细胞的细胞群。
[00301]经过FACS分选的细胞直接以单个细胞收集在每孔含有5微升PBS(添加5U RNA酶抑制剂(RNasin，Promega，Madison USA，cat.No N2515))的96孔平板的单个孔内。这时可以将细胞冷冻以用于后面的RT-PCR，或者立即进行RT-PCR。
e.免疫球蛋白可变区编码序列的关联对的连接
[00302]多重重叠-延伸RT-PCR技术应用于单个细胞，这样获得了转录后的抗破伤风类毒素重链可变区和轻链可变区的编码序列的关联连接。
e-1.单步多重重叠-延伸RT-PCR
[00303]使用Qiagen One-Step RT-PCR试剂盒(Qiagen cat.No210212，Hilden，Germany)进行多重重叠-延伸RT-PCR，基本根据生产商的建议。将每孔含有单个细胞的冷冻的96孔平板从冰箱中取出，在孔中没有冰晶时立即向每一个样品(单个细胞)中加入15微升的RT-PCR反应混合物。
[00304]RT-PCR反应混合物含有总体积是20微升的以下试剂：
1×One-Step RT-PCR缓冲液，
终浓度各是400μM的每种dNTP，
多重重叠-延伸引物混合物，浓度如表8中所示，
0.8微升One-step RT-PCR酶混合物，以及
20U RNA酶抑制剂(RNasin，Promega，Madison USA，cat.NoN2515)。
[00305]多重重叠-延伸引物混合物的组成在表8中示出。
表8
 引物名称   浓度   SEQ IDNO 引物序列(5’到3’方向)
VH 每种40nM   4142434445464748   tattggcgcgccatggccCAGRTGCAGCTGGTGCARTtattggcgcgccatggccSAGGTCCAGCTGGTRCAGTtattggcgcgccatggccCAGRTCACCTTGAAGGAGTtattggcgcgccatggccSAGGTGCAGCTGGTGGAGtattggcgcgccatggccCAGGTGCAGCTACAGCAGtattggcgcgccatggccCAGSTGCAGCTGCAGGAGTtattggcgcgccatggccGARGTGCAGCTGGTGCAGTtattggcgcgccatggccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC
 CH(IgG)   200nM   9   GACSGATGGGCCCTTGGTGG
VL 每种40nM   545556575859   gccatggcgcgccaatagctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCTgccatggcgcgccaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCTgccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCTgccatggcgcgccaatagctagccGATATTGTGATGACCCACACTgccatggcgcgccaatagctagccGAAACGACACTCACGCAGTgccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT
 CLκ   200nM   60   atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAA
W＝A/T，S＝G/C，R＝A/G.大写序列相应于基因特异区
[00306]循环条件如下：
逆转录：30分钟 55摄氏度
聚合酶激活：15分钟 95摄氏度(使逆转录酶失活，激活Taq聚合酶)
[00307]PCR反应：
变性30秒 94摄氏度
退火30秒 52摄氏度
延伸5分钟 72摄氏度
共35个循环
最终的延伸10分钟 72摄氏度
e-2.额外的扩增
[00308]来自每个样品的1微升多重重叠-延伸RT-PCR反应产物进行半嵌套PCR(Biotaq kit，Bioline，UK cat.No BIO-21040)，基本按照生产商的建议，使用96孔平板进行。每个反应的总体积是50微升，含有终浓度如下的各物质：1×Biotaq缓冲液，200μM每种dNTP，2mM氯化镁，1.25U Bio Taq聚合酶和表9中显示的引物。
[00309]循环条件如下：
变性30秒 95摄氏度
退火30秒 55摄氏度
延伸1.5分钟 72摄氏度
共30个循环
最终的延伸5分钟 72摄氏度
表9
  引物名称 浓度   SEQ IDNO 引物序列(5’到3’方向)
JH 200nMof each   61626364   ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCCggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCCggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCCggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC
  CLκ  200nM   21   accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
大写序列相应于基因特异区
[00310]对有限的样品组取10微升进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，使用溴化乙锭显示，目的是证实多重重叠-延伸RT-PCR成功进行。
[00311]片段的预期大小(精确大小取决于可变区的长度)是：
VH：～410bp
LC：～680bp
重叠-延伸片段：～1070bp
[00312]来自同一个供体的、在96孔平板上反应的所有样品取2微升混于一个管中。汇集的样品使用XhoI和NotI消化。消化后的重叠-延伸片段使用制备型的1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化；重叠-延伸片段从琼脂糖凝胶上切下来，使用Qiaex II试剂盒(Qiagen cat.No20051，Hilden，Germany)纯化。如果不需要的话，没有必要在这个阶段汇集关联对。那样的话，要对每个单个反应进行限制切割，然后将产物逐个克隆到以下描述的载体中。
f.关联Fab表达文库
[00313]通过连接向大肠杆菌载体JSK301(图11)中插入XhoI/NotI消化的重叠-延伸片段，制备Fab载体文库。通过电穿孔使用Fab载体文库转化大肠杆菌(TOP10)，转化子在含有100微克/毫升羧苄青霉素的2×YT琼脂上进行筛选。从琼脂平板上直接挑取菌落以提取质粒DNA。质粒制备物来自每个供体最小数目的菌落，对应于3×的最初分选出的单个浆细胞的总数，目的是保持多样性。产生的质粒制备物使用AscI和NheI消化，然后插入来自phh3的原核启动子和前导序列盒(Den，W.等人，1999.J.Immunol.Methods 222，45-57)，接下来进行连结，以制备Fab表达文库。文库的制备过程在图12中概述。大肠杆菌(TG1)用电穿孔转化，产生的Fab表达文库和转化子在含有100微克/毫升羧苄青霉素的2×YT琼脂上进行筛选。在Den等人，J Immunol Methods.1999 Jan 1；222(1-2)：45-57中描述的步骤期间，每个供体保持分离的状态。但是如果可能需要的话，它们可以在任何阶段被混和。
g.克隆的筛选
[00314]通过抗原特异性ELISA检测就TT抗原的结合对表达Fab的克隆进行筛选
g-1.母平板的制备和Fab的表达
[00315]TG1细胞的筛选出的单菌落，每个都含有来自由步骤(f)产生的文库中的关联Fab表达载体，将单个菌落挑到96孔板的单孔中，孔内含有2×YT/100微克/毫升Amp/1％葡萄糖。菌落于37摄氏度在轻微振荡下生长过夜。这些平板被称为母平板，加入甘油至终浓度为15％后储存于-80摄氏度。
[00316]在储存母平板之前，使用母平板和96针移样器(replicator)接种一个或者多个含有2×YT/100微克/毫升Amp/1％葡萄糖的384孔平板。密封这些平板并在37摄氏度下振荡2-3小时。
[00317]加入等体积的2×YT/100微克/毫升Amp/0.2mM IPTG，使IPTG的终浓度为0.1mM，以诱导Fab的表达。密封平板并在30摄氏度下振荡过夜。第二天，用ELISA就TT抗原结合特异性对含有Fab的上清液进行分析。
g-2.ELISA分析
[00318]384孔的ELISA平板(Nunc，Roskilde，Denmark，cat.No265196)用在PBS中稀释至终浓度为1微克/毫升的破伤风类毒素(TT)抗原在4摄氏度包被过夜，每孔25微升。加入2％M-PBS-T(2％脱脂奶粉，PBS中，0.05％Tween 20)于室温封闭孔中多余的结合位点1小时。用PBS-T(PBS，0.05％Tween 20)漂洗孔两次。
[00319]来自g-1的含有Fab的细菌上清液用2％M-PBS-T作1∶2稀释，转移到BLISA孔中，每个样品再做一个平行。室温下孵育1小时。孔用PBS-T漂洗4次。向孔中加入用2％M-PBS-T作1∶10000稀释的山羊抗人Fab/HRP(Sigma，St.Louis，MO，USA，cat.No A0293)。室温下孵育1小时。孔用PBS-T漂洗4次。加入TMB Plus(KemEnTec，Copenhagen，Denmark，cat.No 4390L)底物，孵育5-15分钟。加入等体积的1M硫酸终止反应。在ELISA读板仪(Multiscan Ascent，Labsystems，Franklin，USA)中于450nm读取反应进行的程度。
[00320]接下来从原来的母平板中找回对应于TT抗原结合性克隆的原始细菌克隆。从分离的抗原阳性Fab克隆中制备质粒DNA，产生TT抗原结合性克隆的关联Fab表达亚文库。
[00321]还可以通过抗轻链ELISA检测对克隆进行分析，目的是获得抗原结合性克隆的数目与Fab表达性克隆的数目之间的关系。而且，这种分析提供了克隆中κ和λ轻链表现度(representation)的信息。
h.关联抗体表达文库
[00322]为了促进全长人抗体的表达，必须将来自细菌Fab表达载体的关联可变区转移到含有来自一种人类免疫球蛋白同种型的恒定结构域的哺乳动物表达载体中。这样的转移可以一个克隆一个克隆进行或者整个地进行。以下描述了如何进行成批的转移。
[00323]分两步进行成批转移。首先，汇集单独分离的抗原结合性Fab克隆的质粒制备物。通过使用AscI和NheI消化汇集的Fab表达亚文库，并随后在文库中插入哺乳动物的启动子和前导序列盒并进行连接，从而将含有原核启动子和前导序列的盒子交换为哺乳动物启动子和前导序列盒，其由人碱性磷酸酶前导序列(AP Leader)、人延伸因子1-α启动子(EFP)、腺病毒主要晚期启动子(AdMLP)、IgK前导序列组成。用得到的交换了启动子的Fab表达文库经电穿孔转化大肠杆菌(TOP 10)，转化子在含有100微克/毫升羧苄青霉素的2×YT琼脂上进行筛选。从琼脂平板上直接挑取菌落以制备质粒DNA。质粒制备物来自每个供体最少数目的菌落，对应于大约3×的原始文库中克隆总数，目的是保持多样性。
[00324]第二，通过使用XhoI和NotI消化质粒制备物，分离来自交换了启动子的Fab表达载体的关联可变区。分离的片段通过连接而插入到哺乳动物表达载体中，得到关联抗体表达文库。使用的载体与图9A中的载体基本相同，区别在于这里的IgL对应的是κ轻链编码序列。以上使用的哺乳动物表达载体是以位点特异性Flp-In系统(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA，Cat No K6010-01)为基础的。用得到的关联抗体表达文库经电穿孔转化大肠杆菌(TOP10)，转化子用含有100微克/毫升羧苄青霉素的2×YT琼脂进行筛选。从琼脂平板上直接挑取菌落以制备质粒DNA。质粒制备物还是来自每个供体最少数目的菌落，对应于大约3×的原始文库中克隆总数，目的是保持多样性。得到的关联抗体表达文库的质粒制备物可以用于转染哺乳动物宿主细胞，例如来自Invitrogen Flp-In系统(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA，USA，Cat No K6010-01)的CHO细胞，目的是通过Flp重组酶介导的整合而产生稳定的哺乳动物表达细胞系。这种细胞系可以用于生产重组多克隆抗体。
实施例7：通过高密度膜检测进行筛选
[00325]通过高密度膜检测来筛选来自实施例6f的表达Fab的克隆。
a.母平板的制备
[00326]母平板根据实施例6的步骤(g-1)中的描述进行制备。
b.PVDF膜的制备
[00327]使用在PBS中稀释至终浓度为1微克/毫升的TT抗原，根据生产商的说明，于4摄氏度包被PVDF膜(Amersham，Uppsala，Sweden，cat.No RPN2020F)过夜。在2％M-PBS(2％脱脂奶粉，PBS中)中封闭膜上多余的结合位点1小时。膜用PBS漂洗三次。用2×YT浸泡膜几分钟。
c.克隆合并
[00328]使用96针移样器将母平板上的克隆转移到一个或者多个每孔含有20μl 2×YT的384孔平板中，以实现克隆向384孔平板中的合并。
[00329]使用384针移样器将细菌转移到一个或者多个置于2×YT/Carb/1％葡萄糖琼脂平板上的尼龙膜(Amersham，Uppsala，Sweden，cat.No RPN2020B)上，平行转移两次。平板在37摄氏度孵育4-6小时。
d.Fab诱导
[00330]将步骤b中制备的PVDF膜置于2×YT/Carb/0.1mM IPTG琼脂平板上。将具有正在生长的细菌菌落的尼龙膜放在位于含有IPTG的琼脂平板上的PVDF膜的上面(每个PVDF膜用一张尼龙膜)。含有IPTG的琼脂平板在30摄氏度孵育过夜，以促进IPTG诱导的Fab从菌落中的表达。Fab分子通过尼龙膜扩散到PVDF膜上，结合TT抗原的Fab会被保留在PVDF膜上。
e.检测
[00331]去掉尼龙膜，PVDF膜用PBS-T(PBS，0.05％Tween 20)漂洗2次，各5分钟。膜在2％M-PBS中孵育30分钟。PVDF膜用PBS-T漂洗2次，各5分钟，之后与用2％M-PBS作1∶10000稀释的山羊抗人IgG/HRP(Sigma，St.Louis，MO，USA，cat.No A0293)孵育1小时。PVDF膜用PBS-T漂洗3次，各5分钟。最后，根据生产商的说明，PVDF膜与SuperSignal West Femto化学发光底物(Pierce，Rockford，Il，USA，cat.No 34095)孵育5分钟。去掉多余的底物，PVDF膜置于CCD相机下以检测在PVDF膜上Fab片段结合TT抗原的位置处产生的化学发光信号。
[00332]阳性的TT抗原结合性克隆在图像上会呈现出小点。接下来从原始母平板上找到原来的细菌克隆。从分离的抗原阳性Fab克隆中制备质粒DNA，产生TT抗原结合性克隆的关联Fab表达亚文库。
f.抗原结合性克隆和Fab表达性克隆之间的相关性
[00333]取下步骤e中的尼龙膜，置于另一个系列的根据步骤b中的过程用抗轻链抗体或者抗Fab抗体包被的PVDF膜上。然后重复步骤d和步骤e。
[00334]Fab阳性克隆在图像上会呈现出小点，可以作出TT抗原结合性克隆数目与Fab表达性克隆数目之间的相关性。
实施例8：描述编码杂聚蛋白质的序列的分离的示例性实施例
[00335]本实施例阐明了三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)如何可以在使用本发明的多重重叠-延伸RT-PCR技术的单一步骤中分离出来。G-蛋白亚基家族是一个大的家族，仅在人类中有大约16个不同的α亚基、5个β亚基和12个γ亚基。对于本实施例，选择了亚基GαS(GenBank登录号X04408)，亚基Gβ1(GenBank登录号AF501822)和亚基Gγ1(GenBank登录号BC029367)。连接过程在图13中予以说明，其中步骤1是多重重叠-延伸RT-PCR步骤，步骤2是连接的产物的额外扩增。
a.细胞
[00336]人肝细胞群来自外科手术废弃的样品。将肝细胞打散并且裂解，根据生产商的说明使用RNAL试剂盒(Macherey-Nagel，Düren，Germany，cat.No 740 962.20)从裂解物中分离总RNA。
b.多重重叠-延伸RT-PCR
[00337]基本上根据生产商的建议使用Qiagen One-StepRT-PCR试剂盒(Qiagen cat.No 210212，Hilden，Germany)进行多重重叠-延伸RT-PCR。
[00338]每个PCR管中含有总体积为50微升的以下试剂：
1×One Step RT-PCR缓冲液，
终浓度各为400μM的每种dNTP，
多重重叠-延伸引物混合物，浓度如表10所示，
2微升One step RT-PCR酶混合物，
1U/微升RNA酶抑制剂(RNasin，Promega，Madison USA，cat.No N2515)，以及
50ng总RNA。
[00339]所使用的多重重叠-延伸引物混合物包含的引物如表10所示。
表10
  引物名称   浓度   SEQID NO               引物序列(5’到3’方向)
  α1   400nM   80   atatatatgcggccgcttaATGGGCTGCCTCGGGAA
  α2   80nM   81   gccatggcgcgccaatagctagccTTAGAGCAGCTCGTACTGACGAA
  β1   80nM   82   tattggcgcgccatggccATGAGTGAGCTTGACCAGTTACG
  β2   80nM   83   ggtacctaataataatcgatcgcTTAGTTCCAGATCTTGAGGAAGCT
  γ1   80nM   84   cgatcgattattattaggtaccccATGCCAGTAATCAATATTGAGGAC
  γ2   400nM   85   ggaggcgctcgagTTATGAAATCACACAGCCTCCTTTG
大写序列相应于基因特异区
[00340]循环条件如下：
逆转录：30分钟 42摄氏度
聚合酶激活：15分钟 95摄氏度(使逆转录酶失活，激活Taq聚合酶)
[00341]PCR反应：
变性30秒 94摄氏度
退火30秒 49摄氏度
延伸3分钟 72摄氏度
共45个循环
最终的延伸10分钟 72摄氏度
c.扩增PCR
[00342]1微升的多重重叠-延伸RT-PCR反应产物进行一次额外的PCR扩增步骤(Biotaq kit，Bioline，UK cat.No BIO-21040)，基本上按照生产商的建议进行。使用的引物α1和γ2在表10中示出，对应于SEQ ID NO 80和85。反应的总体积是50微升。
[00343]循环条件如下：
变性30秒 95摄氏度
退火30秒 53摄氏度
延伸3分钟 72摄氏度
共25个循环
最终的延伸10分钟 72摄氏度
[00344]反应产物中取5微升用1％琼脂糖凝胶电泳进行分析，使用溴化乙锭检测。产物的大小预期是2215bp。但是可能存在其他的未连接的亚基片段。这些片段的预期大小是Gα：1228bp，Gβ：1064bp以及Gγ：262bp。
d.克隆
[00345]剩余的反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用溴化乙锭检测，将2215bp的重叠-延伸片段从琼脂糖凝胶上切下来，使用QiaexII试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany，cat.No 20051)纯化，使用Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen cat.No 45-0641，Carlsbad，CA，USA)插入pCR2.1-TOPO中。
[00346]此外，可以在每个亚基编码序列的上游插入启动子序列或者核糖体结合位点，目的是促进它们从载体中的表达。重叠-延伸序列中存在的限制位点适用于这种插入。
e.一般考虑
[00347]如上面描述的，编码组成杂聚蛋白的亚基的序列的连接可以用于大部分其中单个亚基序列已知的杂聚蛋白。而且，在使用能够扩增出某个特定家族中的几个成员(例如所有的G蛋白α、β和γ亚基)的多重重叠-延伸引物混合物时，可以鉴定和连接来自一种细胞类型的任意亚基组合，而不需要首先分析哪种细胞类型表达哪个家族成员。例如，以上的实施例可如此进行，即使用来自分离的单个肝细胞的模板，使用能够扩增并且连接所有16个Gα亚基和5个Gβ亚基和12个Gγ亚基的多重重叠-延伸引物混合物，由此确定每个细胞中表达哪种亚基组合，并同时分离出该亚基组合的编码序列。此外，使用简并引物甚至还可以鉴定出某个特定家族的新成员。
[00348]在使用本发明的多重重叠-延伸RT-PCR技术连接杂聚蛋白的亚基时应当考虑连接产物的整体大小，因为DNA聚合酶能够扩增的碱基对的数目有限制。来自New England Biolabs，MA，USA的DeepVent聚合酶是一种能够产生非常长(长度可达14000bp)的引物延伸的DNA聚合酶。理论上，14000bp可以编码平均分子量为510kDa的蛋白质。因此，使用本发明的方法应当可以分离非常大的杂聚蛋白的编码序列。使用DNA聚合酶混合物甚至可能进一步提高延伸能力。
实施例9：前导引物的设计
[00349]在该实施例中，设计多重引物组，其中引物引发的位置在人抗体重链和κ轻链家族的前导区的编码序列中。
[00350]在使用与可变区家族的N端编码序列退火的引物时，可能会观察到一定程度的交叉杂交。一个特定基因家族序列的引物可以与另一个基因家族的cDNA杂交，这在很多情况下导致新序列的产生。在治疗中使用时，从这些序列产生的蛋白质具有潜在的免疫原性。一般地，这些新型序列可以用PCR进行校正，或者从文库中除去。
[00350]另外一个解决问题的办法是定位在抗体可变区前导肽区域的编码序列中的引发位点。由于交叉引发产生的杂种序列会在抗体的细胞内加工过程中被去除，在抗体的细胞内加工过程中含有潜在免疫原性序列的肽前导序列会被切除，因此不会在分泌的抗体产物中出现。前面用于抗体克隆的前导引物组，已经被定位在前导区编码序列的5′端，其使得能够直接进行真核表达(Campbell M.J.等人，1992Mol Immunol.29，193-203)。遗憾地是，真核的前导肽几乎不适于进行原核的加工。
[00352]在细菌中操作核酸序列的简单性使其对于开发克隆系统是具有吸引力的，在所述克隆系统中序列可能在细菌载体和其他宿主生物体的载体之间穿梭。因此，在本实施例中设计了多重引物组，其中引发的位置在前导区编码序列中，这使得在真核和原核表达系统中抗体或者抗体片段都能进行有功能的表达。
[00353]对于任何前导肽C末端区域的信号肽酶切割的序列要求似乎对于原核和真核系统来说非常相似(Nielsen H.等人，1997Protein Eng.10，1-6.)。而且，可以得出的结论是前导肽C末端区域的突变可能对于N末端区域的构象具有很小的影响，反之亦然。因此，预计C末端序列可以在物种间转移而不会有功能的丧失。
[00354]本实施例中引物设计的基本理念是将引发位点置于前导肽C末端区域的最后6个密码子。引发位点上游的前导区编码序列的剩余部分(大约50个核苷酸)应当由与宿主物种相匹配的适当的表达载体提供。例如适宜在革兰氏阴性细菌中表达的载体可以被设计成具有部分或者全长的PelB前导序列。对于在真核生物中表达抗体，适宜用具有部分天然抗体重链前导区编码序列和部分可变κ链前导区编码序列的载体。不论表达系统如何，前导区的最后6个氨基酸都来自包含在插入到载体中的核酸片段之中的内源抗体前导区编码序列。
[00355]设计以下的引物序列，用于多重重叠-延伸RT-PCR(表11)。但是重叠尾巴(小写字母)可以很容易地重新设计，以在通过连接方法或者重组过程进行的连接中起作用。
表11
  引物名称   SEQ IDNO 引物序列(5’到3’方向)
VHL   86878889909192   tattcccagcggccgccGCCACAGGTGCCCACTCtattcccagcggccgccCCTTCMTGGGTCTTGTCtattcccagcggccgccTTARAAGGTGTCCAGTGTtattcccagcggccgccCCCAGATGGGTCCTGtattcccagcggccgccCTCCAAGGAGTCTGTTCtattcccagcggccgccCCATGGGGTGTCCTGTCAtattcccagcggccgccGCAACAGGTGCCCACT
  CH(IgG)   9   GACSGATGGGCCCTTGGTGG
VLκL   939495969798   ggcggccgctgggaatagctagcgYTCCCAGGTGCCAGATGggcggccgctgggaatagctagcgGTCCCTGGATCCAGTGggcggccgctgggaatagctagcgCTCCCAGATACCACCGGAggcggccgctgggaatagctagcgATCTCTGGTGCCTACggcggccgctgggaatagctagcgATCTCTGATACCAGGGCAggcggccgctgggaatagctagcgGTTCCAGCCTCCAGGGGT
  CLκ   99   atatatatggcgcgccTTAACACTCTCCCCTGTTGAA
M＝A/T，R＝A/G，Y＝C/T，S＝G/C.大写序列相应于基因特异区
[00356]应当注意，与前面的实施例中描述的引物相比，在该引物设计中的限制位点被略微改动。因此，重链和轻链可变区编码序列之间的重叠序列包含了一个NotI限制位点和一个NheI限制位点，在恒定区κ引物(CLκ)中前面的NotI位点已经被AscI位点替换。在设计额外PCR扩增的引物时，后面的改动当然是应当遵守的。而且，图11所示克隆载体中的NotI位点应当变为AscI位点，而在启动子单元中的AscI位点应当变为NotI位点。
[00357]前导区切割的功能性已经使用由Danish TechnicalUniversity的CBS提供的SignalP进行了计算机检测。
[00358]对于可变重链进行检测的嵌合前导肽由具有下列组成的核酸序列编码：截短的PelB序列、C末端NotI位点(SEQ ID NO 100：ATG AAA TAT CTT CTA CCA ACA GCG GCA GCT GGA TTA TTG GCG GCC GCC)以及与NotI位点相连的、编码天然VHL家族成员的6个C末端氨基酸的SEQ ID NO 86到92之一的基因特异部分。使用SignalP程序，所有的七个序列都显示了在革兰氏阴性细菌中的信号肽切割。
[00359]对于可变轻链进行检测的嵌合前导肽由具有下列组成的核酸序列编码：截短的PelB序列、C末端NheI位点(SEQ ID NO 101：ATG AAA TAT TTG CTA CCA ACA GCG GCA GCT GGA TTA TTG TTA CTA GCG)以及与NheI位点相连的、编码天然VLκL家族成员的6个C末端氨基酸的SEQ ID NO 93到98之一的基因特异部分。使用SignalP程序，所有的六个序列都显示了在革兰氏阴性细菌中的信号肽切割。
[00360]SEQ ID NO 100和101的序列适于构建与图11中图解说明的载体类似的细菌表达载体，其中图11中图解的AscI位点被SEQID NO 100替代，NheI位点被SEQ ID NO 101替代。而且，图11中图解的NotI位点需要被AscI位点替代。
[00361]哺乳动物表达载体(图9)同样可以重新设计，以使得在可变区编码片段从刚刚描述的细菌载体中转移到哺乳动物细胞中以后在那里表达。
实施例10：一管多重RT-PCR以及通过连接方法进行连接
[00362]本实施例阐明了包含连接的重链可变区和轻链可变区编码序列的关联对如何使用连接而不是重叠-延伸PCR在单管反应中产生，以达到连接的目的。
a.多重RT-PCR
[00363]使用有限稀释法将内部制备的、表达具有针对破伤风类毒素特异性的Fab分子的细胞系进行分配，以获得单个PCR管中有单个细胞。
[00364]除了单个细胞以外，每个PCR管中含有总体积为20微升的以下试剂：
1×Phusion HF缓冲液，
终浓度各为200μM的每种dNTP，
多重引物混合物，浓度如表12所示。
0.8U Phusion聚合酶(FinnZymes Cat.No F-530-L)，
1微升Sensiscript逆转录酶(Qiagen Cat.No 205213)，
20U RNA酶抑制剂
表12
  引物名称 浓度   SEQ IDNO 引物序列(5’到3’方向)’
VH 每种200nM   102103104105106107108109   tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCARTtgttgttctagatgaaggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGTtgttgttctagatgaaggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGTtgttgttctagatgaaggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAGtgttgttctagatgaaggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGTtgttgttctagatgaaggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGTtgttgttctagatgaaggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGTtgttgttctagatgaaggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC
JH 每种200nM   61626364   ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCCggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCCggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCCggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC
VL 每种200nM   110111112113114115   aacaacactagtgataggctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCTaacaacactagtgataggctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCTaacaacactagtgataggctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCTaacaacactagtgataggctagccGATATTGTGATGACCCACACTaacaacactagtgataggctagccGAAACGACACTCACGCAGTaacaacactagtgataggctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT
  CLκ   200nM   16   atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTG
W＝A/T，R＝A/G，S＝G/C.大写序列相应于基因特异区
[00365]循环条件如下：
逆转录：30分钟 37摄氏度
变性30秒 98摄氏度
变性10秒 98摄氏度
退火30秒 55摄氏度
延伸30秒 72摄氏度
上述最后三个步骤共进行40个循环
最终的延伸5分钟 72摄氏度
b.通过连接方法进行连接
[00366]为了通过连接方法进行连接，直接向多重RT-PCR的反应产物中加入限制性酶和连接酶。或者在该添加之前纯化多重RT-PCR以去除混合物中的聚合酶。
[00367]向每个管中加入总体积为40微升的以下试剂：
1×NEBII缓冲液，
1mM ATP，
50U XbaI(New England Biolabs Cat.No R0145L)，
25U SpeI(New England Biolabs Cat.No R0133S)，
100微克/毫升BSA，
400U T4 DNA连接酶(New England Biolabs Cat.No M0202S)
[00368]反应在16摄氏度孵育过夜。
[00369]通过凝胶电泳并切下来大约1000bp的条带，而将连接的重链和轻链可变区编码序列从反应中纯化出来。
[00370]在本方法的另一种形式中，在多重引物组中使用CH引物而不是JH引物进行多重RT-PCR反应。该引物可以装备克隆尾巴，其可以使重链可变区按照阅读框插入到表达载体中，或者用表5中的引物进行半嵌套PCR。
实施例11：具有针对破伤风类毒素特异性的重组多克隆免疫球蛋白的制备
[00371]在该实施例中，从用破伤风类毒素(TT)免疫的单个供体(TT03)中获得的结果用于阐明图10的流程图中概述的步骤。
a.供体
[00372]以前已经用破伤风疫苗免疫的八个供体使用破伤风疫苗(Statens Serum Institut，Denmark)进行加强免疫。分别给8个供体编号TT01到TT08。破伤风疫苗加强免疫后6天从供体上抽取大约200毫升的血液样本，收集到含有抗凝剂的管中。
[00373]供体健康并且没有慢性感染、自体免疫疾病或者接受任何免疫抑制性药物治疗，并且他们在最近3个月内没有任何的疫苗接种。
a-1.监测供体的质量
[00374]在免疫接种时对供体进行事先采血。十四天后进行另一次采血，以测定血清滴度。所有的供体的反应都是TT滴度增加。还设立ELISPOT检测以测量TT特异性浆细胞的频率。对于ELISPOT可以使用不同的细胞级分，例如第六天的主要血液(major bleed)、PBMC级分、磁性分选的级分或者FACS分选的级分。可以使用ELISPOT对供体材料进行评价，确定最佳的反应者，然后他们可继续进行分选步骤和多重重叠-延伸RT-PCR。对于供体TT03，使用CD19+细胞级分进行ELISPOT(参见c部分)。根据Lakew的描述(Lakew，M.等人，1997.J.Immunol.Methods 203，193-198)，但略有改动，进行ELISPOT检测。PBMC级分中TT特异性浆细胞的频率计算为0.021％。
b.外周血单核细胞(PBMC)的制备
[00375]使用Lymphoprep(Axis-Shield PoC AS，Norway，prod.No 1001967)，根据生产商的建议从血液样本中分离PBMC。简而言之，血液用PBS进行1∶1稀释，将悬液以2∶1的比例铺在Lymphoprep上。于25摄氏度、800g将小管离心20分钟，然后收集白色的中间相条带。用含有2mM EDTA的PBS漂洗细胞。
[00376]从取自供体TT03的200毫升全血中得到了大约2×108个PBMC。
c.B细胞的富集
[00377]使用以下的步骤用磁性珠细胞分选法富集PBMC中的B细胞谱系(CD19+细胞)
[00378]使用抗-CD19-FITC(Becton Dickenson，NJ，USA，cat.No 345776)染色分离的PBMC。所有步骤在4摄氏度下于暗处进行。使用10微升抗-CD19-FITC/1×106个细胞〔使用M-缓冲液(PBS，pH 7.2，0.5％BSA，2mM EDTA)，对于每1×106个细胞体积为100微升〕进行染色。PBMC中的B细胞谱系会被染色。细胞孵育20分钟，之后用M-缓冲液进行两次漂洗。抗-CD19-FITC染色的细胞使用缀合抗FITC的微珠进行磁性标记，每1×106个细胞使用10微升抗FITC磁珠(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany，cat.No 130-042-401)，体积是每1×106个细胞使用100微升M-缓冲液。孵育15分钟后用M-缓冲液漂洗一次。细胞用脱气的M-缓冲液重悬。
[00379]使用脱气的M-缓冲液根据生产商的说明预先处理MACSLS柱(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany，cat.No130-042-401)。将用抗-CD 19-FITC染色并且用抗FITC-磁性珠标记的细胞悬液加到柱上，使其流过。染色并标记的细胞(CD 19+)被保留在围绕柱的磁场中，而没有被染色的细胞(CD19-)流过柱。使用脱气的M-缓冲液漂洗柱。去除磁场并收集CD19+细胞。
[00380]使用抗-CD19-FITC、抗-CD38-PE和抗-CD45-PerCP对来自TT03的起始材料(PBMC)、未标记的级分和CD19标记的级分进行分析性染色。这表明磁性细胞分选产生两个与PBMC级分相比不同的级分。CD19阴性细胞在B图中显示，CD19阳性细胞在C图中显示。在PBMC级分中，11％的细胞是CD19+，对于TT03，CD19阳性细胞的纯化程度达到R1的99.5％(图14C中的散射阈值(scatter gate))。
[00381]如图14C中所见，抗CD38/抗CD45图显示了相当于R1的1.1％的独特的CD38hi、CD45in细胞群(R2)。该细胞群含有浆细胞，并在后面的分选步骤中收集。这表明，在PBMC级分中0.12％的细胞对应的是浆细胞。
[00382]CD19阳性细胞级分在FCS(Invitrogen，Cat.No.16000-044)+10％DMSO(Sigma，Cat.No.D2650)中冷冻以用于下面的分选。对已经被冷冻的MACS纯化后的细胞进行与图14中所见类似的分析以确保细胞完好无损(图15)。在图15中观察到的染色样式与图14中观察到的相同，尽管观察到稍微更宽的染色强度。通过分选收集的细胞是R1和R2的亚组。这对应于MACS纯化的细胞的大约1.1％。
d.浆细胞的分选
[00383]将冷冻的MACS柱洗脱物融化，离心，并且用FACS缓冲液(PBS，pH 7.2，2％BSA)重悬，浓度为1×106个细胞/60微升FACS缓冲液。加入抗-CD19-FITC(Becton Dickenson，NJ，USA，cat.No345776)(10微升/106细胞)、抗-CD38-PE(Becton Dickenson，NJ，USA，cat.No 555460)(10微升/106细胞)和抗-CD45-PerCP(BectonDickenson，NJ，USA，cat.No 345809)(20微升/106细胞)，将混合物在4摄氏度下于暗处孵育20分钟，之后漂洗两次，用FACS缓冲液重悬。
[00384]使用荧光激活细胞分选(FACS)对细胞进行分选，使用以下的门控参数：
1.前向散射和侧向散射，目的是保留包括成浆细胞和浆细胞在内的淋巴细胞和单核细胞，以及避免死细胞和具有非常高的侧向散射的细胞，其可能是团聚体或者粒细胞。
2.CD19阳性并且CD38表达水平提高(CD38hi)的细胞。这主要只是对CD38的门控，因为PBMC已经在针对CD19表达的MACS柱上进行了富集，但是这会暴露出任何污染物。
3.CD45中间阳性细胞。所有的淋巴细胞都表达CD45。但是，与早期淋巴细胞分化阶段相比，浆细胞下调它们的CD45表达。因此对CD45进行门控时可以得到不连续的对应于浆细胞的细胞群。
[00385]经过FACS分选的来自供体TT03的细胞被收集为两个门P2和P1的亚组(分别是图16A和16B)。细胞是CD38hi(FL2-A)、CD45in(FL3-A)和CD19+，后者是由于MACS纯化而产生的。简而言之，细胞成批收集、计数并且用含有10％FCS(Invitrogen Cat.No.16000-044)、100单位/毫升的青霉素-链霉素(Invitrogen，cat.No.15140-122)、2mM L-谷氨酰胺(cat No.25030-024)的RPMI(Invitrogen，Cat No.21875-034)稀释。然后将细胞分配到50块96孔PCR平板(ABgene，cat.No.AB-0800)中，每孔5微升培养基中含有一个细胞。密封平板并且立即冷冻，储存以用于后面的RT-PCR分析。
e.免疫球蛋白可变区编码序列的关联对的连接
[00386]多重重叠-延伸RT-PCR技术应用于来自供体TT03的单个细胞，这样获得了转录后的抗破伤风类毒素重链可变区和轻链可变区的编码序列的关联连接。
e-1.单步多重重叠-延伸RT-PCR
[00387]使用Qiagen One-Step RT-PCR试剂盒(Qiagen cat.No210212，Hilden，Germany)进行多重重叠-延伸RT-PCR，基本根据生产商的建议。将50块每孔含有大约单个细胞的冷冻的96孔平板从冰箱中取出，在孔中没有冰晶时立即向每个孔中加入15微升的RT-PCR反应混合物。
[00388]RT-PCR反应混合物含有总体积是20微升的以下试剂：
1×One-Step RT-PCR缓冲液，
终浓度各是400μM的每种dNTP，
多重重叠-延伸引物混合物，浓度如表13中所示，
0.8微升One-step RT-PCR酶混合物，以及
20U RNA酶抑制剂(RNasin，Promega，Madison USA，cat.NoN2515)。
[00389]多重重叠-延伸引物混合物的组成在表13中示出。
表13
  引物名称 浓度   SEQ IDNO 引物序列(5’到3’方向)
VH 每种40nM   116117118119120   tattcccatggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCARTtattcccatggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGTtattcccatggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGTtattcccatggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAGtattcccatggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGT
  121122123   tattcccatggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGTtattcccatggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGTtattcccatggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC
  CH(IgG)   200nM   9   GACSGATGGGCCCTTGGTGG
VL 每种40nM   124125126127128129   ggcgcgccatgggaatagctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCTggcgcgccatgggaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCTggcgcgccatgggaatagctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCTggcgcgccatgggaatagctagccGATATTGTGATGACCCACACTggcgcgccatgggaatagctagccGAAACGACACTCACGCAGTggcgcgccatgggaatagctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT
  CLκ   200nM   130   atatatatgcggccgcTTAACACTCTCCCCTGTTGAA
W＝A/T，S＝G/C，R＝A/G.大写序列相应于基因特异区
[00390]循环条件如下：
逆转录：30分钟55摄氏度
聚合酶激活：15分钟  95摄氏度(使逆转录酶失活，激活Taq聚合酶)
PCR反应：
变性30秒94摄氏度
退火30秒52摄氏度
延伸5分钟72摄氏度
共35个循环
最终的延伸10分钟72摄氏度
e-2.额外的扩增
[00391]来自每个样品的1微升多重重叠-延伸RT-PCR反应产物进行半嵌套PCR(Biotaq kit，Bioline，UK cat.No BIO-21040)，基本按照生产商的建议，使用96孔PCR平板(ABgene，cat.No.AB-0800)进行。每个反应的总体积是50微升，含有终浓度如下的各物质：1×Biotaq缓冲液，200μM每种dNTP，2mM氯化镁，1.25U Bio Taq聚合酶和表14中显示的引物。
表14
  引物名称 浓度   SEQID NO 引物序列(5’到3’方向)3’
JH 每种200nM   61626364   ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCCggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCCggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCCggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC
  CLκ   200nM   21   accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT
    大写序列相应于基因特异区
[00392]循环条件如下：
变性30秒95摄氏度
退火30秒55摄氏度
延伸1.5分钟72摄氏度
共30个循环
最终的延伸5分钟72摄氏度
[00393]对A行中的孔1-12的样品取10微升进行1.5％琼脂糖凝胶电泳分析，使用溴化乙锭显示，目的是证实多重重叠-延伸RT-PCR成功进行。预期的重叠-延伸片段大小大约是1070bp(精确大小取决于可变区的长度)。图17显示了来自8块96孔板的样品。从50块96孔板来看，成功的重叠-延伸RT-PCR片段的平均数目估计是每块板8个。因此，成功的重叠-延伸RT-PCR片段的总数估计是大约400个。
[00394]从来自同一个供体的、在96孔板上进行的所有反应中取10微升，合并于单个管中。接下来取一份具有200微升汇集的PCR产物的等分试样使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen cat.No.28106，Hilden，Germany)，根据生产商的步骤进行纯化，洗脱使用60微升的EB缓冲液。纯化的重叠PCR产物的汇集物使用XhoI和NotI消化，接下来使用制备型1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化；从琼脂糖凝胶中切下重叠-延伸片段，并使用Qiaex II试剂盒(Qiagen cat.No20051，Hilden，Germany)纯化。
f.关联Fab表达文库
[00395]通过两步连接过程制备Fab表达文库。开始将以上描述的消化后的重叠-延伸片段汇集物连接到XhoI/NotI消化的大肠杆菌载体JSK301(图11)中。接下来将连接反应的产物根据生产商的说明转化入电感受态的大肠杆菌细胞(XL1-Blue电穿孔感受态，Stratagen，cat.No.200228，La Jolla，USA)。转化后的大肠杆菌细胞涂布于含有100微克/毫升羧苄青霉素的2×YT琼脂上。使用对应于来自许多独立菌落的大约1010-1011个细胞(超过重叠PCR产物总数至少5倍)的生物量作为起始材料，使用Qiagen Plasmid preparationMaxi试剂盒(Qiagen cat.No.12163，Hilden，Germany)进行质粒制备。为了使经克隆的关联连接的VH和VL编码序列能够表达Fab，在第二个连接步骤中插入了原核启动子和前导序列盒。使用的双向启动子片段(SEQ ID NO 321)是通过AscI/NheI消化从亲本JSK301中提取的。纯化的质粒汇集物同样使用AscI/NheI限制性核酸内切酶消化，并根据前面的描述使用凝胶纯化。接下来将纯化的片段进行连接，并且转化入电感受态的大肠杆菌细胞(TG1，Stratagene，cat.No.200123，La Jolla，USA)，转化后的大肠杆菌细胞涂布于含有100微克/毫升羧苄青霉素和1％葡萄糖(glycose)的2×YT琼脂上。Fab表达文库的制备过程在图12中概述。
g.克隆的筛选
[00396]通过抗原特异性ELISA检测就TT抗原的结合对表达Fab的克隆进行筛选。
g-1.母平板的制备和Fab的表达
[00397]TG1细胞的筛选出的单菌落，每个都携带来自根据部分(f)中的描述产生的文库中的关联Fab表达载体，将单个菌落挑到96孔板的单孔中，孔内含有2×YT/100微克/毫升Carb/1％葡萄糖。平板于37摄氏度在轻微振荡下孵育过夜。使用96针移样器，将四个96孔平板合并在一个384孔平板的孔中，其孔含有2×YT/100微克/毫升Carb/1％葡萄糖。384孔的平板在37摄氏度孵育一天。这些平板被称为母平板，加入甘油至终浓度为15％后储存于-80摄氏度。
[00398]使用母平板和96针移样器接种含有2×YT/100微克/毫升Carb/1％葡萄糖的384孔DeepWell平板。密封这些平板并在37摄氏度下振荡孵育2-3小时。
[00399]加入等体积的2×YT/100μg/ml Carb/0.2mM IPTG，使IPTG的终浓度为0.1mM，以诱导Fab的表达。密封平板并在30摄氏度下振荡过夜。第二天，用ELISA就TT抗原结合特异性对含有Fab的上清液进行分析。
g-2.ELISA分析
[00400]384孔的ELISA平板(Corning Inc.，Corning，NY，USA，cat.No 3700)用在PBS中稀释至终浓度为1微克/毫升的破伤风类毒素(TT)抗原在4摄氏度包被过夜，每孔25微升。加入2％M-PBS-T(2％脱脂奶粉，PBS中，0.05％Tween 20)于室温封闭孔中多余的结合位点1小时。用PBS-T(PBS，0.05％Tween 20)漂洗孔两次。
[00401]来自部分(g-1)的含有Fab的细菌上清液用2％M-PBS-T作1∶2稀释，转移到ELISA孔中，每个样品再做一个平行。室温下孵育1小时。孔用PBS-T漂洗4次。向孔中加入用2％M-PBS-T作1∶10000稀释的山羊抗人Fab/HRP(Sigma，St.Louis，MO，USA，cat.NoA0293)。室温下孵育1小时。孔用PBS-T漂洗4次。加入TMB Plus(KemEnTec，Copenhagen，Denmark，cat.No 4390L)底物，孵育5-15分钟。加入等体积的1M硫酸终止反应。用分光光度计(MultiscanAscent，Labsystems，Franklin，USA)于450nm进行分析。
[00402]接下来从原来的母平板中找回对应于TT抗原结合性克隆的原始细菌克隆。从分离的抗原阳性Fab克隆中制备质粒DNA，产生TT抗原结合性克隆的关联Fab表达亚文库。
[00403]克隆的一个亚组进一步使用抗κELISA检测进行分析，目的是获得抗原结合性克隆的数目与Fab表达性克隆的数目之间的关系。抗κ检测一般如与TT检测相同的方式进行，区别在于孔用采用碳酸盐缓冲液(pH9.6)作1∶1000稀释的山羊抗人κ抗体(Caltag，California，USA，Cat.No H16000)包被。
g-3.筛选结果
[00404]根据g-2中描述的步骤，使用ELISA检测就与抗κ抗体和TT的反应性对来自四个384孔平板的克隆进行筛选。得到的结果总结于表15到19。抗κELISA的结果提供了有关在指定克隆中Fab片段表达的信息，而TT ELISA的结果提供了有关Fab片段功能性的信息。
      表15 ELISA筛选，抗κ包被(总计1440克隆)
  板编号   2×背景   3×背景   4×背景
  G050   105   79   73
  G051   93   79   68
  G052   120   96   73
  G053   164   141   125
  总计   482   395   339
  ％Fab阳性克隆nes)   34％   27％   24％
[00405]在所分析的1440个单独克隆中，482个或者34％表现出抗κ反应性，其反应水平超过背景反应性水平的两倍，395个克隆或者27％的克隆表现出的反应性高于3倍背景等等。
[00406]用ELISA对相同的克隆分析其TT抗原反应性，结果在下面的表16中给出：
表16  ELISA筛选，TT包被(总计1440克隆)
  板编号   2×背景   3×背景   4×背景
  G050   26   19   17
  G051   24   18   15
  G052   34   31   24
  G053   46   36   30
  总计   130   104   86
  ％TT阳性克隆   9.0％   7.2％   6.1％
[00407]从这个表格中可以看出9.0％的克隆与TT的反应性是背景的两倍(背景水平定义为通过具有不相关特异性的Fab片段的反应性而得到的信号)，104个克隆以3倍背景水平进行反应(7.2％)等等。
[00408]Fab阳性的克隆中(共482个克隆)，大约27％的克隆(130/482)与TT的反应性是背景水平的两倍。在其他背景水平下，这个水平没有显著改变。
[00409]对6个384孔平板就具有TT反应性的克隆进行筛选。与抗原产生反应性的克隆的数目在表17中给出。没有对这些平板进行抗κELISA。
表17  ELISA筛选，TT包被(总计2160克隆)
  板编号   2×背景   3×背景   4×背景
  G054   82   65   52
  G055   30   24   21
  G056   25   23   21
  G057   30   28   26
  G058   24   21   19
  G059   18   14   13
  总计   209   175   151
  ％TT阳性克隆   9.7％   8.1％   7,0％
[00410]在平板G054-G059中TT阳性克隆的百分比与平板G050-G053中阳性克隆的百分比(表16)相当。
[00411]从所有就抗TT进行筛选的克隆中获得的结果(表16和17)总结于表18中。
表18  所有筛选的克隆，TT反应性克隆
  板   2×背景   3×背景   4×背景
  G050-G053   130   104   86
  G054-G059   209   175   151
  总计   339   279   237
  占总的百分比(3600)   9.4％   7.8％   6.6％
[00412]总之，总共339个克隆显示了与TT的反应性，它们的反应性水平至少是背景水平的2倍(表18)。这对应于所有经筛选的克隆的9.4％。
[00413]所有表现出与TT的反应性为2倍背景水平的阳性克隆从母平板接种于96孔的平板上，如前面所述。第二天，4000rpm离心15分钟以收集细菌，沉淀用0.8mM EDTA、0.4×PBS、0.8M NaCl重悬，在冰上孵育15分钟。通过离心收集周质提取物，进一步分析克隆的反应性。这里我们显示了一个这样的平板(G060)与抗κ(图18)、卵清蛋白(无关抗原)(图19)、TT(图20)的反应性结果，以及使用溶液中的10-7M浓度的TT抗原进行一步竞争检测的结果(图21)。使用同样的周质提取物在相同稀释度下进行这些ELISA检测。
[00414]大多数克隆表达Fab片段(90/96)(图13)，没有克隆与卵清蛋白反应(图19)。与固定化的TT的反应性被溶液中的TT降低或者完全抑制(图21)，表明这些克隆与TT有特异的反应。G060平板中的克隆的反应性在表19中予以总结。
表19  G060板总结(总计96个克隆)
  背景水平   抗κ阳性   TT阳性
  2×   94％(90/96)   74％(71/96)
  3×   91％(87/96)   72％(69/96)
  4×   84％(81/96)   69％(66/96)
H.多样性分析和克隆核准
[00415]从47个来自关联的TT抗原结合性Fab表达亚文库的克隆(来自平板G060)中分离质粒并进行序列分析。可变重链编码序列使用与P tac启动子退火的引物LSN-HCP：AGGAAACAGGAGATATACAT(SEQ ID No 131)进行测序；轻链编码序列使用与P lac启动子退火的引物LSN-LCP：TCGCCAAGGAGACAGTCATA(SEQ ID No 132)进行测序。使用Vector NTI软件(Informax，Frederick，MD，USA)对序列数据进行分析。对得到的重链序列数据进行整理，得到从上游AscI限制位点的5′1个碱基到下游XhoI限制位点的3′的序列。对轻链序列数据进行整理，得到从上游NheI限制位点的第2个5′碱基到最后一个编码可变链C末端赖氨酸的密码子“AAA”的3′的序列。进行整理的目的是有利于进一步的分析例如每个DNA序列的翻译。
[00416]通过将可变重链和轻链编码序列与V-base种系可变区序列数据库(MRC Centre for Protein Engineering，Cambridge，UK)比较，对可变重链和轻链编码序列就种系基因使用进行分析。这样对于每一个序列确定出最为密切相关的种系等位基因，显示出来自12个不同的可变重链种系等位基因(属于VH家族的VH1到VH5)以及8个不同的可变κ轻链种系等位基因(属于VKI、VKIII和VKIV)的V基因库(表20)。
[00417]另外，将可变基因序列翻译为蛋白质序列，使用AlignX软件(Informax，Frederick，MD，USA)对蛋白质序列进行比对，如图22和图23中的描绘。基于蛋白质序列的比对，可变链序列可以根据V(D)J重排事件划分为几个组，用H标示可变重链序列，用L标示可变κ链序列，之后是一个唯一的数字。在每一个重排组中，序列根据CDR1、2和3区域内的成熟基因型(表20中的M-类型)进行分类，按字母顺序用小写字母表示。7个克隆具有早熟终止密码子，其中6个克隆是琥珀突变(TAG)(克隆ID g060：b12，d08，f06，c12，f03，c04)，1个克隆是乳白突变(TGA)(克隆ID g060：h12)。这些密码子很有可能被大肠杆菌抑制从而产生有功能的Fab片段。这些克隆中四个是含有相似克隆的组的成员，使它们成为冗余克隆。需要对其他克隆进行分析以替换剩下的3个具有早熟终止密码子的克隆，因为它们是它们的组中唯一的成员。或者可以通过标准的分子生物学技术如PCR对序列进行校正，用一个适当的密码子替换终止密码子。
[00418]对于可变重链和可变κ基因，47个经分析的V区序列可以被分为20个独特的V(D)J重排组(在表20中标示的“组”)。重排组中的四个可以进一步被分为1到4个成熟类型(a到d)，得到27个独特的抗体编码序列(表12)。一般地，特异的重链重排组与特异的轻链重排组组合(例如H1与L1，H12与L24等等)。而且，成熟类型在可变重链和可变轻链编码序列形成的对之内是匹配的(例如H4c与L13c匹配)。这种在重排组和突变类型中配对的严紧性表明可变区编码序列的关联配对。
[00419]但是重链重排组H4是一个例外。H4与两个不同的轻链L28和L13配对。L13对于H4是独特的，H4包含成熟类型a、b和c，其与L13的成熟类型相匹配。另一方面，还发现L28与重链组H2的单一成员配对。7个H4a重链序列中有两个与重链L13a配对，7个H4a重链序列中有5个与L28a配对。总之，这些观察结果提示在单个孔中存在多重重叠-延伸RT-PCR事件，其中两个产生TT特异性抗体的浆细胞的基因型组合是H2-L28与H4a-L13a。由于实验是建立在浆细胞的有限稀释的基础之上，所以预期轻链和重链基因配对的罕见混杂事件例如H2和H4a与L28是会出现的。
[00420]在来自相同组和相同成熟类型的可变重链和可变轻链编码序列的单个关联对之中的序列同一性至少是90％，优选至少是95％。例如来自组H1成熟类型a的g060g03和g060a01。克隆g060g03对应于核酸SEQ ID对168:215，其中可变重链编码序列对应于SEQ ID NO168，可变轻链编码序列对应于SEQ ID NO 215。克隆g060a01对应于核酸SEQ ID对133:180。当SEQ ID NO 168与SEQ ID NO 133(可变重链)进行比对时，369个碱基中有4个是不相同的，对于可变轻链(SEQ ID NO 215和180)327个碱基中有8个是不相同的，这对应于两个关联对(g060g03和g060a01)之间的序列同一性是98.3％。但是在观察不同组之间的序列同一性时，预计序列同一性不会高，原因是这是一个多克隆亚文库，需要有多样性。在这个特定的示例中，关联对之间最低的同一性是大约40％(例如g060b11和g060h11的序列同一性是39.5％)。
[00421]本发明的一个实施方案是免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区编码序列的关联对的亚文库，其中可以从所述的文库中得到的免疫球蛋白能够与破伤风毒素反应或者与其结合。
[00422]本发明的另一个实施方案是免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区编码序列的关联对的这种亚文库，包含的单个关联对与单个SEQ ID对具有至少90％的序列同一致，所述的单个SEQ ID对选自由以下SEQ ID对组成的组：135:182，168:215，146:193，151:198，173:220，152:199，164:211，148:195，137:184，169:216，138:185，143:190，161:208，166:213，157:204，139:186，134:181，150:197，156:203，158:205，170:217，178:225，141:188或者144:191。
表20
                          VH                        Vkappa
  克隆ID   类别   M-型   家族   种系  Seq nucl.  Seq prot.   类别   M-型  家族   种系  Seq nucl.  Seq prot.
  g060a03   H1   b   VH1   DP-14  42135  136229   L1   b  VKI   DPK9  89182  183276
  g060g03   H1   a   VH1   DP-14  75168  169262   L1   a  VKI   DPK9  122215  216309
  g060a01   H1   a   VH1   DP-14  13340  134227   L1   a  VKI   DPK9  87180  181274
  g060b12   H11   a   VH3   DP-77  52145  146239   L10   a  VKIII   DPK22  99192  193286
  g060c03   H11   a   VH3   DP-77  53146  147240   L10   a  VKIII   DPK22  100193  194287
  g060d08   H11   a   VH3   DP-77  61154  155248   L10   a  VKIII   DPK22  108201  202295
  g060f06   H11   a   VH3   DP-77  69162  163256   L10   a  VKIII   DPK22  116209  210303
  g060d04   H12   a   VH1   DP-10  58151  152245   L24   a  VKI   DPK4  105198  199292
  g06h02   H12   a   VH1   DP-10  82175  176269   L24   a  VKI   DPK4  129222  223316
  g060h10   H12   a   VH1   DP-10  84177  178271   L24   a  VKI   DPK4  131224  225318
  g060g11   H12   b   VH1   DP-10  80173  174267   L24   b  VKI   DPK4  127220  221314
  g060d05   H12   c   VH1   DP-10  59152  153246   L24   c  VKI   DPK4  106199  200293
  g060f09   H12   d   VH1   DP-10  71164  165258   L24   d  VKI   DPK4  118211  212305
  g060c07   H15   a   VH5   DP-73  55148  149242   L16   a  VKIII   DPK22  102195  196289
  g060d11   H15   a   VH5   DP-73  62155  156249   L16   a  VKIII   DPK22  109202  203296
  g060g02   H15   a   VH5   DP-73  74167  168261   L16   a  VKII   DPK22  121214  215308
  g060a09   H16   -   VH1   DP-73  44137  138231   L4   -  VKI   DPK9  91184  185278
  g060g04   H17   a   VH4   DP-66  76169  170263   L3   a  VKI   DPK9  123216  217310
  g060h04   H17   a   VH4   DP-66  83176  177270   L3   a  VKI   DPK9  130223  224317
  g060a10   H18   a   VH2   VII-5  45138  139232   L21   a  VKI   L12a  92185  186279
  g060h12   H18   a   VH2   VII-5  86179  180273   L21   a  VKI   L12a  133226  227320
  g060b09   H19   a   VH2   VII-5  50143  144237   L23   a  VKI   DPK8  97190  191284
  g060f10   H19   a   VH2   VII-5  72165  166259   L23   a  VKI   DPK8  119212  213306
  g060f05   H2*   -   VH1   DP-88  68161  162255   L28*   a  VKIV   DPK24  115208  209302
  g060f11   H21   a   VH3   DP-32  73166  167260   L31   a  VKI   DPK9  120213  214307
  g060g12   H21   a   VH3   DP-32  81174  175268   L31   a  VKI   DPK9  128221  222315
                           VH                            Vkappa
  克隆ID   类别   M-型   家族   种系  Seq nucl.  Seq prot.   类别   M-型  家族   种系   Seq nucl.  Seq prot.
  g060f01   H10   -   VH3   COS-8  64157  158251   L7   -  VKI   DPK8   111204  205298
  g060a11   H23   a   VH3   DP-77  46139  140233   L5   a  VKI   DPK9   93186  187280
  g060c12   H23   b   VH3   DP-77  56149  150243   L5   b  VKI   DPK9   103196  197290
  g060f03   H24   -   VH3   DP-38  66159  160253   L20   -  VKI   DPK8   113206  207300
  g060a02   H3   -   VH3   DP-77  41134  135228   L9   -  VKI   O16   88181  182275
  g060d03   H4   a   VH1   DP-88  57150  151244   L13   a  VKIII   DPK22   104197  198291
  g060f08   H4   a   VH1   DP-88  70163  164257   L13   a  VKIII   DPK22   117210  211304
  g060b05   H4*   a   VH1   DP-88  47140  141234   L28*   a  VKIV   DPK24   94187  188281
  g060b07   H4*   a   VH1   DP-88  49142  143236   L28*   a  VKIV   DPK24   96189  190283
  g060f04   H4*   a   VH1   DP-88  67160  161254   L28*   a  VKIV   DPK24   114207  208301
  g060g10   H4*   a   VH1   DP-88  79172  173266   L28*   a  VKIV   DPK24   126219  220313
  g060d07   H4*   a   VH1   DP-88  60153  154247   L28*   a  VKIV   DPK24   107200  201294
  g060e05   H4   c   VH1   DP-88  63156  157250   L13   c  VKIII   DPK22   110203  204297
  g060f02   H4   b   VH1   DP-88  65158  159252   L13   b  VKIII   DPK22   112205  206299
  g060g09   H4   c   VH1   DP-88  78171  172265   L13   c  VKIII   DPK22   125218  219312
  g060c04   H6   -   VH1   DP-88  54147  148241   L12   -  VKIII   DPK22   101194  195288
  g060g07   H20   -   VH4   DP-71  77170  171264   L8   a  VKI   DPK9   124217  218311
  g060h11   H7   -   VH2   VII-5  85178  179272   L18   -  VKI   L12a   132225  226319
  g060b06   H8   a   VH3   DP-46  48141  142235   L17   a  VKI   DPK1   95188  189282
  g060a04   H8   a   VH3   DP-46  43136  137230   L17   a  VKI   DPK1   90183  184277
  g060b10   H9   -   VH1   DP-14  51144  145238   L30   -  VKI   DPK1   98191  192285
星号表示涉及混杂的V编码序列。Seq prot.表示来自序列表的相应于蛋白质序列的SEQ ID号，Seq nucl.表示序列表中相应于核酸序列的SEQ ID号。
i.表观亲和性
[00423]设立竞争检测的目的是确定从平板G060中选择的克隆的表观亲和性或者IC50。
[00424]简而言之，在50毫升的培养基中表达Fab片段，如下：0.5毫升过夜培养物加入到50毫升2×YT/100微克/毫升Carb/0.1％葡萄糖中，37摄氏度振荡大约2小时。加入IPTG至终浓度为0.1mM，继续在30摄氏度振荡过夜。第二天，4000rpm离心15分钟以收集细菌，沉淀重悬于1毫升0.8mM EDTA、0.4×PBS、0.8M NaCl中，在冰上孵育15分钟。离心收集周质提取物，并于-20摄氏度储存。
[00425]如下进行竞争检测：以根据滴定估计的适当稀释度将周质提取物加入到一系列管中。来自噬菌体展示的Fab片段mp584(来自表达抗TT抗体的人杂交瘤细胞系HB8501)作为阳性对照。在第一个管中以100nM浓度加入可溶性TT，接下来在后面的管中进行4倍连续稀释，总共得到TT的7个稀释度(从100nM到25pM)。反应在室温下孵育大约45分钟。样品转移到使用1微克/毫升TT包被并且根据前面的描述进行封闭的ELISA平板上。平板在室温下孵育1小时，之后使用PBS-T漂洗4次，加入1∶10000稀释的山羊抗人Fab/HRP，孵育1小时。加入TMB Plus底物(KemEnTech，Denmark，cat.No 4390A)并孵育大约10分钟，用1M硫酸终止反应。平板在450nm读取数据。数据作图如图24中所示。
[00426]被分析的克隆的表观亲和性在表21中给出。
               表21
  克隆   表观亲和性
  g060a10   0.50nM
  g060b06   0.60nM
  g060b12   1.2nM
  g060c04   0.55nM
  g060d04   1.1nM
  g060f01   1.2nM
  g060g04   0.9nM
  g060g07   0.35nM
  g060h11   3.0nM
  mp584(pos.cont.)   6.0nM
[00427]如表21中所示，Fab片段的表观亲和性在低nM水平或者高pM水平的范围内。而且，所有关联配对的Fab片段比噬菌体展示来源的Fab片段具有更高的表观亲和性。
j.总结
[00428]在供体TT03中，在外周血单核细胞级分中TT特异性浆细胞的频率经计算为0.022％。从TT03制备了大约400个关联对。使用ELISA筛选了来自用关联对文库转化的细胞的3600个克隆，其中339个克隆在ELISA筛选中显示了对TT的反应性。对这些克隆中的47个分析了其克隆多样性。在这47个克隆中，27个经证实类似于独特的非混杂的可变区编码序列。这些克隆中有三个含有早熟终止密码子，在转移到哺乳动物表达载体中之前需要进行校正。根据实施例1中部分h的描述进行向哺乳动物表达载体的转移。对选择出的克隆测量表观亲和性，其范围在低nM水平至高pM水平。
k.展望
[00429]破伤风毒素是已知最具毒性的物质之一，其致死剂量为几个纳克。该毒素由破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生，它是一种也存在于高达25％的人的消化道内的土壤细菌。破伤风免疫接种计划在西方已有效地消除了这种疾病，但是每年在主要的西方国家仍然有100-200个病例，病死率是50％。在发展中国家，病例要多得多。在受到污染的穿入性伤口中细菌的生长可以导致毒素的释放，最终导致强直、痉挛、呼吸停止和死亡。
[00430]从人类血液供体中分离出的对破伤风类毒素具有高滴度抗体应答的超免疫免疫球蛋白，可以用于预防破伤风，或者如果着手早的话可以治疗已经出现的破伤风，也可以与主动免疫接种联合使用。但是由于人类产品的缺乏，在发展中国家中使用马的超免疫抗破伤风类毒素。针对破伤风类毒素的重组单克隆或者多克隆抗体具有替代超免疫球蛋白产品用于治疗性和/或预防性用途的潜力。文献中已经描述了来自传统的杂交瘤技术的重组单克隆抗体可以有效地对抗TT(Chin，J.等人，2003.Biologicals 31，45-53)。有趣的是，将两种单克隆抗体混和时观察到了增效作用。因此，能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆抗破伤风类毒素抗体，在对具有破伤风发病风险的患者进行治疗或者预防性保护方面可能是非常有效的。
[00431]本发明的一个实施方案是能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆免疫球蛋白或者其片段。
[00432]本发明的一个优选实施方案是能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆免疫球蛋白，它由免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区的关联对组成。
[00433]本发明的另一个实施方案是通过根据本发明的方法得到的能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆免疫球蛋白。
[00434]本发明的另一个实施方案是能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆免疫球蛋白，它包含的免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区的单个关联对，与选自以下SEQ ID对中的单个SEQ ID对具有至少90％的序列同一性：229:276，262:309，240:287，245:292，267:314，246:293，258:305，242:289，231:278，263:310，232:279，237:284，255:302，260:307，251:298，233:280，228:275，244:291，250:297，252:299，264:311，272:319，235:282或者238:285。
[00435]本发明的另一个实施方案是药物组合物，它包含能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆抗体作为用于治疗或者预防破伤风的活性成分。优选地，重组多克隆抗体与药物上可以接受的赋形剂联合。
[00436]本发明的另一个实施方案是能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆免疫球蛋白作为对具有破伤风发病风险的患者进行治疗或者预防性保护的药物的用途。
[00437]另一个实施方案是对具有破伤风发病风险的患者进行预防或者治疗的方法，其通过向需要进行预防或者治疗的患者施用包含能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆抗体的组合物来进行。
实施例12：比较从两个供体得到的结果
[00438]在下面的实施例中，将从供体TT08得到的结果与在实施例11中从供体TT03得到的结果进行比较。结果总结在表22中。
表22
  TT03   TT08
PBMC级分中的TT特异性浆细胞(ELISPOT)   0.021％   0.011％
PBMC中的CD19+细胞(FACS)   11％   5％
PBMC级分中的浆细胞(FACS CD38hi，CD54in)   0.12％   0.08％
连接的VH和VL序列的估计数目   400   400
筛选Fab表达的克隆数   1400   2000
Fab阳性克隆数(2×背景)   482   558
筛选TT特异性的克隆数   3600   3400
TT特异性克隆的数目(2×背景)   339   188
从TT特异性克隆分析的序列数   47   102
VH种系等位基因   12(VH1-5)   NA
VL种系等位基因   8(VKI，III，IV)   NA
独特关联对的数目   27   40
表观亲和性范围   0.35-3.0nM   NA
NA＝未分析
[00439]这清楚地阐明具有相似质量的文库可以从两个用TT免疫的不同供体中分离出来。
[00440]在从供体TT08得到的文库中独特的关联对数目更高的原因很可能是由于对更多的序列进行了分析。
实施例13：比较来自实施例11的关联对文库与由同一个供体产生的组合噬菌体展示文库
[00441]在本实施例中，从前面用于制备关联对文库的供体制备组合噬菌体展示文库，目的是比较关联对文库和组合文库之间的文库多样性、亲和性和特异性。
a.组合噬菌体文库的构建
[00442]从供体TT03的细胞的CD19+级分(与实施例11c中得到的细胞级分相同)中制备噬菌体展示文库。
[00443]使用NucleoSpin RNA L试剂盒(Machery-Nagel cat.no.740 962.20)从大约5×106个CD19+细胞中制备总RNA。接下来在oligo(dT)-引发的反应中，使用ThermoScript逆转录酶(Invitrogen cat.no.11146-016)合成cDNA。
[00444]使用HotMasterTaq DNA聚合酶(Eppendorf cat.no.0032 002.692)和引物来PCR扩增VH和κ链，基本上与de Haard等人(J.Biol.Chem.274，18218-18230；1999)所描述的一致，只是在5′端的限制酶识别序列有所改变。
[00445]通过向Em351噬菌体展示载体(改变自Den，W.等人，1999 J.Immunol.Methods 222，45-57中描述的phh3)中相继插入κ和VH PCR产物，制备组合噬菌体展示文库。
[00446]最终的文库通过电穿孔转移到TG1大肠杆菌菌株(Stratagene)中。组合文库的大小为含有3×106个独立的克隆，具有高的插入频率。
b.组合文库的淘选
[00447]根据标准步骤制备展示Fab的噬菌体颗粒(例如Antibody Engineering，A Practical Approach 1996，ed.McCafferty，Hoogenboom和Chiswell)。
[00448]对在用PBS稀释至1微克/毫升并且固定在MaxiSorp免疫管(Nunc cat.no.444202)中的破伤风类毒素(TT；SSI批号89-2)进行淘选。一小时孵育期和几次漂洗步骤之后，用100mM TEA(三乙胺)洗脱结合的噬菌体颗粒。
[00449]中和噬菌体颗粒洗脱物，用于侵染对数生长的TG1细胞，得到对TT特异性进行富集的展示Fab的噬菌体颗粒。按照以上概述的一般步骤使用洗脱的噬菌体进行第二轮淘选。
[00450]同时，按照以上概述的步骤对破伤风毒素分子的C片段(Sigma cat.no.T3694)进行三轮淘选。
[00451]在以上描述的两组淘选中的每一次淘选之后，从未选择的文库中筛选结合破伤风类毒素以及C片段的单菌落。
c.比较组合噬菌体颗粒克隆和关联对克隆的特异性和亲和性
[00452]从未选择的文库中以及在每轮淘选(对完整的破伤风类毒素(TT)和破伤风类毒素C片段分别进行淘选)之后挑取单菌落。通过ELISA检测分析展示Fab的噬菌体颗粒的反应性。表现出TT和/或C片段反应性(至少2倍背景反应性以及至少4倍背景反应性)的Fab阳性克隆的数目在下面的表23和表25中给出。所有的结果表示为特异性克隆的数目/Fab阳性克隆的数目。
表23：对TT选择并用TT特异性ELISA分析的克隆
  富集   2×背景   4×背景
  未选择的克隆   -   13/app.5000
  1轮淘选后   61/99   59/93
  2轮淘选后   165/169   163/166
表24：对TT选择并用C-片段特异性ELISA分析的克隆
  富集  2×背景  4×背景
  未选择的克隆  0/13  0/13
  1轮淘选后  0/85  0/85
  2轮淘选后  0/85  0/85
表25：对C-片段选择并用C-片段特异性ELISA分析的克隆
  富集   2×背景   4×背景
  1轮淘选后   1/35   0/35
  2轮淘选后   12/47   9/47
  3轮淘洗后   64/126   26/126
[00453]针对TT进行噬菌体展示文库的淘选，发现增加淘选轮数时，TT特异的克隆的数目增加，在未选择的文库中只鉴定了几个克隆。在未选择的文库中或者在两轮针对TT进行的文库淘选之后没有发现有克隆与破伤风类毒素的C片段发生反应。为了从组合噬菌体展示文库中得到具有C片段特异性的Fab片段，需要对该文库进行特异地针对C片段的淘选。
[00454]为进行比较，13个来自实施例11的TT特异性克隆进行C片段特异性ELISA，其中7个显示的反应性高于背景反应性的2倍。因此具有针对破伤风毒素C片段的特异性的Fab片段可以从获自经TT免疫接种的个体的关联对文库中表达。
[00455]这清楚地阐明了使用淘选来鉴定对某种特定抗原具有特异性的克隆的缺点。如果重要的抗原片段或者表位是未知的，那么在淘选过程中它们可能会被弃掉，这样最终导致效率较低的产物。
[00456]另外，根据实施例11i的检测中的描述，测量了组合克隆的表观亲和性。对在针对TT进行两轮淘选之后得到的10个组合克隆进行分析，表观结合亲和性在1-15nM之间。
[00457]为了比较，对9个来自关联对文库的克隆(表21)进行分析，其中有4个的亲和性在pM的范围内。
[00458]这表明，作为开始由供体免疫系统选择出的可变区的配对，与作为一个对已经经历的体细胞高变相联合，比起这些可变区的随机组合可能产生更高的表观结合亲和性。
d.比较TT特异性组合噬菌体颗粒克隆和关联对克隆的序列
[00459]从两个文库产生的大量序列数据妨碍了原始序列直接进行比较。为了显示在噬菌体展示文库和关联对文库中VH和VL序列之间的差异，对VH和VL序列作出系统发生树，对用点阵表示。在点阵(图25)中系统发生信息的配对揭示了在两个文库中VH和VL序列对非常不同的分布特性。在噬菌体展示文库中VH和VL序列对分散出现(图25A)表明VH和VL基因之间几乎没有系统进化的联系，这与该文库中V基因的随机配对是相一致的。相反，来自关联对文库的VH和VL序列对显示了成簇的分布(图25B)，表明对于关联对所预期的V基因的共同进化。而且，关联对文库中V基因的遗传多样性与组合文库中V基因的遗传多样性相比要高得多，表明分离同源配对的V基因的方法的偏倚性较小。
实施例14：组合的单步多重重叠-延伸RT-PCR以及嵌套PCR，使用T细胞作为模板来源
[00460]在本实施例中，描述了单步多重重叠-延伸RT-PCR如何在来自人类供体的T淋巴细胞上进行。
a.获得含有淋巴细胞的细胞级分
[00461]从接触了所需抗原(例如经免疫接种、天然感染、恶性肿瘤，通过自体免疫反应或者其他疾病)的人类供体中获得血液样品。根据生产商的说明使用Lymphoprep(Axis-Shield，Oslo Norway，prod.No 1001967)分离外周血单核细胞(PBMC)。
[00462]在本实施例中，通过对PBMC级分的进一步刺激产生抗原特异性T细胞。但是，多重重叠-延伸RT-PCR也可以直接在来自PBMC级分的单个细胞上或者在富集了T细胞的细胞级分(例如通过FACS分选CD3阳性细胞)上进行。
b.产生抗原特异性T细胞
[00463]PBMC细胞级分用含有相关细胞因子例如IL2的适当培养基重悬。然后向培养基中加入所需的抗原，抗原被PBMC级分中存在的抗原呈递细胞(APC)呈递给T淋巴细胞。或者，事先处理APC饲养细胞以使它们呈递所需抗原，可以将这些APC饲养细胞加入到PBMC级分中。这种APC饲养细胞可以是暴露于所需抗原(所需抗原可以是例如肽、蛋白质或者其他分子形式)的APC，或者是被微生物感染的APC或者被转染而表达和呈递抗原的细胞，或者是与其他抗原性细胞(例如以原代组织或者细胞系的形式的癌细胞)共同培养的APC。从文献中已知许多不同类型的APC饲养细胞，包括转化的细胞系、B细胞系、树状细胞等。
[00464]培养PBMC级分大约3-5周，其间与细胞因子一起加入新鲜的抗原呈递细胞，例如每周添加一次。这使T淋巴细胞增殖、激活和成熟。在培养末期，细胞培养物将主要是抗原特异性T细胞。这些细胞是CD4+还是CD8+取决于疾病、抗原、APC细胞以及在刺激过程中使用的细胞因子混合物。
[00465]例如可以使用CTL检测、增殖检测以及荷载了所需抗原的MHC四聚体(Altman，J.D.等人，1996.Science 274，94-96)来测试抗原特异性。
[00466]抗原特异性T细胞通过有限稀释或者使用FACS分配到PCR管中，目的是得到每个容器中有单个细胞。容器可以在-80摄氏度下储存直至使用。
b.单步多重重叠-延伸RT-PCR
[00467]使用Qiagen One-Step RT-PCR试剂盒(Qiagen cat.No210212，Hilden，Germany)，基本上按照生产商的建议进行多重重叠-延伸RT-PCR。细胞融化之后再向PCR管中加入PCR反应混合物。
[00468]最初根据实施例11e-1中的描述设置PCR反应混合物和循环条件。但是，对于新的引物组预计可能需要一定的优化。
[00469]多重重叠-延伸引物混合物包含的引物在表26中显示。
表26
引物名称 浓度   SEQ IDNO 引物序列(5’到3’方向)
Vα 每种10nM   322323324325326327328329330331332333334335336337338339340341342343344   tattggcgcgccatggccGCCCAGTCTGTGACCCAGCtattggcgcgccatggccGCCCAGAAGATAACTCAAtattggcgcgccatggccGATGCTAAGACCACCCAGtattggcgcgccatggccGCCCAGACAGTCACTCAGtattggcgcgccatggccAAACAGGAGGTGACACAGAtattggcgcgccatggccGGAGACTCGGTTACCCAGAtattggcgcgccatggccGGAGATTCAGTGACCCAGAtattggcgcgccatggccAGCAATTCAGTCAAGCAGAtattggcgcgccatggccGGACAAAACATTGACCAGtattggcgcgccatggccAAAAATGAAGTGGAGCAGAtattggcgcgccatggccGAAGACCAGGTGACGCAGAtattggcgcgccatggccGGAATACAAGTGGAGCAGAtattggcgcgccatggccCTACATACACTGGAGCAGAtattggcgcgccatggccGAAGACAAGGTGGTACAAAtattggcgcgccatggccGAAAACCAGGTGGAGCACAtattggcgcgccatggccCAGGAGAATGTGGAGCAGtattggcgcgccatggccGGAGAGAGTGTGGGGCTGtattggcgcgccatggccGGAGAGGATGTGGAGCAGAtattggcgcgccatggccAGCCAAAAGATAGAACAGAtattggcgcgccatggccAGTCAACAGGGAGAAGAGtattggcgcgccatggccCAACAACCAGTGCAGAGTtattggcgcgccatggccAGCCAAGAACTGGAGCAGAtattggcgcgccatggccGGTCAACAGCTGAATCAGA
  引物名称 浓度   SEQ IDNO 引物序列(5’到3’方向)
  345346347348349350   tattggcgcgccatggccACCCAGCTGCTGGAGCAGAtattggcgcgccatggccCAGCAGCAGGTGAAACAAtattggcgcgccatggccATACTGAACGTGGAACAAtattggcgcgccatggccGACCAGCAAGTTAAGCAAtattggcgcgccatggccGGACAACAGGTAATGCAAtattggcgcgccatggccAAGGACCAAGTGTTtCAG
  Cα   200nM   351   TAGGCAGACAGACTTGTCACT
Vβ 每种10nM   352353354355356357358359360361362363364365366367368369370371372373374   gccatggcgcgccaatagctagccGGTGAAGAAGTCGCCCAGAgccatggcgcgccaatagctagccGATGCCATGGTCATCCAGAgccatggcgcgccaatagctagccGAAGCCCAAGTGACCCAGAgccatggcgcgccaatagctagccCATGCCAAAGTCACACAGAgccatggcgcgccaatagctagccGACACAGCCGTTTCCCAGAgccatggcgcgccaatagctagccGAAACGGGAGTTACGCAGAgccatggcgcgccaatagctagccGAACCTGAAGTCACCCAGAgccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGACATCTACCAGAgccatggcgcgccaatagctagccATATCTGGAGTCTCCCACAgccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGGAATCACCCAGAgccatggcgcgccaatagctagccAATGCTGGTGTCACTCAGAgccatggcgcgccaatagctagccAGTGCTGTCGTCTCTCAAgccatggcgcgccaatagctagccGACGCTGGAGTCACACAAgccatggcgcgccaatagctagccGATGGTGGAATCACTCAGTgccatggcgcgccaatagctagccACTGCTGGGATCACCCAGgccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGGAGTTGCCCAGTgccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGGAGTGGTTCAGTgccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGGAGTTACTCAGTgccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGTAGTTACACAAgccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGGAGTTATCCAGTgccatggcgcgccaatagctagccGGTGCTGGAGTCTCCCAGgccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGATGTTACCCAGAgccatggcgcgccaatagctagccTCTCAGACTATTCATCAAT
  Cβ   200nM   375   CAGGCACACCAGTGTGGCCTT
c.半嵌套PCR
[00470]同样建议根据实施例11e-2中的描述进行半嵌套PCR，预计可能需要一些优化。
[00471]使用的引物在表27中示出。
表27
  引物名称 浓度   SEQIDNO 引物序列(5’到3’方向)
  Cα   200nM   376   caccttagagctcTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACAC
  Cβ   200nM   377   gacattatgCAtGATCTCTGCTTCTGATGGCTC
[00472]为了证实多重重叠-延伸RT-PCR成功进行，对半嵌套PCR反应的样品中的一部分进行分析，每个半嵌套PCR反应产物取10微升进行1％琼脂糖凝胶电泳，使用溴化乙锭进行检查。重叠-延伸片段的预计大小是大约850bp(精确的大小取决于可变区的长度)。
[00473]从所有进行的来自同一个供体的反应产物中取出大约10微升，在一个试管中合并。接下来从汇集的PCR产物中取出一份等分试样，用QIAquick PCR纯化试剂盒，根据生产商的步骤(Qiagen cat.No.28106，Hilden，Germany)进行纯化。纯化的重叠PCR产物的汇集物可以使用适当的限制酶消化，然后纯化并且插入到适宜的载体中。
[00474]在本实验中，设计在半嵌套PCR中使用的恒定区引物(SEQ ID NO 376和377)用于将半嵌套PCR产物亚克隆到适宜的载体中。Cβ引物的设计依赖于将β链恒定区肽上第21位的Ser改变成Met，从而可以将一个NsiI位点引入核酸序列中：
       NsiI
tcc cac→ atg cat
Ser His  Met His
[00475]这个转换应该是相对安全的，因为Ser21暴露在结构域靠近膜一端的环结构中的β链恒定区上。因此这个相对保守的改变不大可能扰乱整体结构域的结构。
[00476]Cα引物的设计依赖于改变α链恒定区肽上第15-17位的核苷酸，从而可以将一个SacI位点引入核酸序列中：
                 SacI
aaa tcc agt→aa g agc tct
Lys Ser Ser  Lys Ser Ser
[00477]因此，适宜的载体含有TcRα和β链的恒定区的剩余部分，并且含有关于限制位点的适当修饰。这些改变可以使用标准的PCR和亚克隆技术进行。
e.额外的考虑
[00478]在多重重叠-延伸PCR扩增中，大量的可变区引物可能以抑制的方式相互作用。为了避免这一点，可变区引物可以分为亚组并以适当的组合分开使用。
其他实施方案
[00479]所有在本说明书中引用的出版物和专利申请在这里引用作为参考，如同特别并且单独地指明引用每一个单个的出版物或者专利申请作为参考。尽管前述的发明已经通过图解和实施例进行了一些详细的描述，目的是为了理解的清楚，但对于本领域内普通技术人员而言，显然可以依照本发明的教导对其进行某些改变和修饰，而不偏离所附权利要求书的精神和范围。
                               序列表
<110>Symphogen A/S
<120>连接目标序列的方法
<130>15881PCT00
<160>377
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>1
agcctatact attgattagg cgcgcccagr tgcagctggt gcart                    45
<210>2
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>2
agcctatact attgattagg cgcgccsagg tccagctggt rcagt                    45
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>3
agcctatact attgattagg cgcgcccagr tcaccttgaa ggagt                    45
<210>4
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>4
agcctatact attgattagg cgcgccsagg tgcagctggt ggag                     44
<210>5
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>5
agcctatact attgattagg cgcgcccagg tgcagctaca gcagt                    45
<210>6
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>6
agcctatact attgattagg cgcgcccags tgcagctgca ggagt                    45
<210>7
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>7
agcctatact attgattagg cgcgccgarg tgcagctggt gcagt                    45
<210>8
<211>46
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>8
agcctatact attgattagg cgcgcccagg tacagctgca gcagtc                   46
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>9
gacsgatggg cccttggtgg                                                20
<210>10
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>10
cgcctaatca atagtatagg ctagccgaca tccagwtgac ccagtct                  47
<210>11
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>11
cgcctaatca atagtatagg ctagccgatg ttgtgatgac tcagtct                  47
<210>12
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>12
cgcctaatca atagtatagg ctagccgaaa ttgtgwtgac rcagtct                  47
<210>13
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>13
cgcctaatca atagtatagg ctagccgata ttgtgatgac ccacact                  47
<210>14
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>14
cgcctaatca atagtatagg ctagccgaaa cgacactcac gcagt                    45
<210>15
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>15
cgcctaatca atagtatagg ctagccgaaa ttgtgctgac tcagtct                  47
<210>16
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>16
atatatatgc ggccgcttat taacactctc ccctgttg                            38
<210>17
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>17
atattctcga gacggtgacc agggtg                                         26
<210>18
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>18
atattctcga gacggtgacc attgt                                          25
<210>19
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>19
atattctcga gacggtgacc agggttc                                        27
<210>20
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>20
atattctcga gacggtgacc gtggt                                          25
<210>21
<211>51
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>21
accgcctcca ccggcggccg cttattaaca ctctcccctg ttgaagctct t             51
<210>22
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>22
gctagcatta ttattaccat ggcccagrtg cagctggtgc art                      43
<210>23
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>23
gctagcatta ttattaccat ggccsaggtc cagctggtrc agt                      43
<210>24
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>24
gctagcatta ttattaccat ggcccagrtc accttgaagg agt                      43
<210>25
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>25
gctagcatta ttattaccat ggccsaggtg cagctggtgg ag                       42
<210>26
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>26
tattggcgcg ccatggccsa ggtgcagctg gtggag                              36
<210>27
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>27
gctagcatta ttattaccat ggcccaggtg cagctacagc agt                      43
<210>28
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>28
gctagcatta ttattaccat ggcccagstg cagctgcagg agt                      43
<210>29
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>29
gctagcatta ttattaccat ggccgargtg cagctggtgc agt                      43
<210>30
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>30
gctagcatta ttattaccat ggcccaggta cagctgcagc agtc                     44
<210>31
<211>26
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>31
atattctcga gacggtgacc agggtg                                         26
<210>32
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>32
atattctcga gacggtgacc attgtcc                                        27
<210>33
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>33
atattctcga gacggtgacc agggttc                                        27
<210>34
<211>27
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>34
atattctcga gacggtgacc gtggtcc                                        27
<210>35
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>35
ccatggtaat aataatgcta gccgacatcc agwtgaccca gtct                     44
<210>36
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>36
ccatggtaat aataatgcta gccgatgttg tgatgactca gtct                     44
<210>37
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>37
ccatggtaat aataatgcta gccgaaattg tgwtgacrca gtct                     44
<210>38
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>38
ccatggtaat aataatgcta gccgatattg tgatgaccca cact                     44
<210>39
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>39
ccatggtaat aataatgcta gccgaaacga cactcacgca gt                       42
<210>40
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>40
ccatggtaat aataatgcta gccgaaattg tgctgactca gtct                     44
<210>41
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>41
tattggcgcg ccatggccca grtgcagctg gtgcart                             37
<210>42
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>42
tattggcgcg ccatggccsa ggtccagctg gtrcagt                             37
<210>43
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>43
tattggcgcg ccatggccca grtcaccttg aaggagt                             37
<210>44
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>44
tattggcgcg ccatggccsa ggtgcagctg gtggag                              36
<210>45
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>45
tattggcgcg ccatggccca ggtgcagcta cagcag                              36
<210>46
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>46
tattggcgcg ccatggccca gstgcagctg caggagt                             37
<210>47
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>47
tattggcgcg ccatggccga rgtgcagctg gtgcagt                             37
<210>48
<211>38
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>48
tattggcgcg ccatggccca ggtacagctg cagcagtc                            38
<210>49
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>49
aagtagtcct tgaccaggca gcc                                            23
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>50
tgagttccac gacaccgtca                                                20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>51
agaggtgctc ttggaggagg                                                20
<210>52
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>52
agttttgtca caagatttgg g                                              21
<210>53
<211>23
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>53
gttgcagatg taggtctggg tgc                                            23
<210>54
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>54
gccatggcgc gccaatagct agccgacatc cagwtgaccc agtct                    45
<210>55
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>55
gccatggcgc gccaatagct agccgatgtt gtgatgactc agtct                    45
<210>56
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>56
gccatggcgc gccaatagct agccgaaatt gtgwtgacrc agtct                    45
<210>57
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>57
gccatggcgc gccaatagct agccgatatt gtgatgaccc acact                    45
<210>58
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>58
gccatggcgc gccaatagct agccgaaacg acactcacgc agt                      43
<210>59
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>59
gccatggcgc gccaatagct agccgaaatt gtgctgactc agtct                    45
<210>60
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>60
atatatatgc ggccgcttat taacactctc ccctgttgaa                          40
<210>61
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>61
ggaggcgctc gagacggtga ccagggtgcc                                     30
<210>62
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>62
ggaggcgctc gagacggtga ccattgtccc                                     30
<210>63
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>63
ggaggcgctc gagacggtga ccagggttcc                                     30
<210>64
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>64
ggaggcgctc gagacggtga ccgtggtccc                                     30
<210>65
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>65
cgcctaatca atagtatagg ctagcccagt ctgtgctgac tcagcca                  47
<210>66
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>66
cgcctaatca atagtatagg ctagcccagt ctgtgytgac gcagc                    45
<210>67
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>67
cgcctaatca atagtatagg ctagcccagt ctgtcgtgac gcagc                    45
<210>68
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>68
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<210>69
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>69
cgcctaatca atagtatagg ctagcctcct atgwgctgac tcagcca                  47
<210>70
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>70
cgcctaatca atagtatagg ctagcctctt ctgagctgac tcaggac                  47
<210>71
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>71
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>72
cgcctaatca atagtatagg ctagcccagg ctgtgctgac tcagc                    45
<210>73
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>73
cgcctaatca atagtatagg ctagccaatt ttatgctgac tcagcccca                49
<210>74
<211>46
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>74
cgcctaatca atagtatagg ctagcccagr ctgtggtgac ycagga                   46
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<211>45
<212>DNA
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<220>
<223>引物序列
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cgcctaatca atagtatagg ctagcccwgc ctgtgctgac tcagc                    45
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<212>DNA
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<223>引物序列
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<210>77
<211>31
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<220>
<223>引物序列
<400>77
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<211>45
<212>DNA
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<223>引物序列
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<210>79
<211>45
<212>DNA
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<220>
<223>引物序列
<400>79
atatatatgc ggccgcttat taagagcatt ctgcaggggc cactg                    45
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>80
atatatatgc ggccgcttaa tgggctgcct cgggaa                              36
<210>81
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>81
gccatggcgc gccaatagct agccttagag cagctcgtac tgacgaa                  47
<210>82
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>82
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<210>83
<211>47
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>83
ggtacctaat aataatcgat cgcttagttc cagatcttga ggaagct                  47
<210>84
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>84
cgatcgatta ttattaggta ccccatgcca gtaatcaata ttgaggac                 48
<210>85
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<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
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ggaggcgctc gagttatgaa atcacacagc ctcctttg                            38
<210>86
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(34)
<223>基因特异区域
<400>86
tattcccagc ggccgccgcc acaggtgccc actc                                34
<210>87
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(34)
<223>基因特异区域
<400>87
tattcccagc ggccgcccct tcmtgggtct tgtc                                34
<210>88
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(35)
<223>基因特异区域
<400>88
tattcccagc ggccgcctta raaggtgtcc agtgt                               35
<210>89
<211>32
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(32)
<223>基因特异区域
<400>89
tattcccagc ggccgccccc agatgggtcc tg                                  32
<210>90
<211>34
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(34)
<223>基因特异区域
<400>90
tattcccagc ggccgccctc caaggagtct gttc                                34
<210>91
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(35)
<223>基因特异区域
<400>91
tattcccagc ggccgcccca tggggtgtcc tgtca                               35
<210>92
<211>33
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(18)..(33)
<223>基因特异区域
<400>92
tattcccagc ggccgccgca acaggtgccc act                                 33
<210>93
<211>41
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(41)
<223>基因特异区域
<400>93
ggcggccgct gggaatagct agcgytccca ggtgccagat g                        41
<210>94
<211>40
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(40)
<223>基因特异区域
<400>94
ggcggccgct gggaatagct agcggtccct ggatccagtg                          40
<210>95
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(42)
<223>基因特异区域
<400>95
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<210>96
<211>39
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(39)
<223>基因特异区域
<400>96
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<210>97
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(42)
<400>97
ggcggccgct gggaatagct agcgatctct gataccaggg ca                       42
<210>98
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(42)
<223>基因特异区域
<400>98
ggcggccgct gggaatagct agcggttcca gcctccaggg gt                       42
<210>99
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>99
atatatatgg cgcgccttaa cactctcccc tgttgaa                             37
<210>100
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>载体序列
<400>100
atgaaatatc ttctaccaac agcggcagct ggattattgg cggccgcc                  48
<210>101
<211>48
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>载体序列
<400>101
atgaaatatt tgctaccaac agcggcagct ggattattgt tactagcg                  48
<210>102
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>102
tgttgttcta gatgaaggcg cgcccagrtg cagctggtgc art                       43
<210>103
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>103
tgttgttcta gatgaaggcg cgccsaggtc cagctggtrc agt                       43
<210>104
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>104
tgttgttcta gatgaaggcg cgcccagrtc accttgaagg agt                       43
<210>105
<211>42
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>105
tgttgttcta gatgaaggcg cgccsaggtg cagctggtgg ag                        42
<210>106
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>106
tgttgttcta gatgaaggcg cgcccaggtg cagctacagc agt                       43
<210>107
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>107
tgttgttcta gatgaaggcg cgcccagstg cagctgcagg agt                       43
<210>108
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>108
tgttgttcta gatgaaggcg cgccgargtg cagctggtgc agt                       43
<210>109
<211>44
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>109
tgttgttcta gatgaaggcg cgcccaggta cagctgcagc agtc                      44
<210>110
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>110
aacaacacta gtgataggct agccgacatc cagwtgaccc agtct                     45
<210>111
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>111
aacaacacta gtgataggct agccgatgtt gtgatgactc agtct                     45
<210>112
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>112
aacaacacta gtgataggct agccgaaatt gtgwtgacrc agtct                     45
<210>113
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>113
aacaacacta gtgataggct agccgatatt gtgatgaccc acact                     45
<210>114
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>114
aacaacacta gtgataggct agccgaaacg acactcacgc agt                       43
<210>115
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>115
aacaacacta gtgataggct agccgaaatt gtgctgactc agtct                     45
<210>116
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>116
tattcccatg gcgcgcccag rtgcagctgg tgcart                               36
<210>117
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>117
tattcccatg gcgcgccsag gtccagctgg trcagt                               36
<210>118
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>118
tattcccatg gcgcgcccag rtcaccttga aggagt                               36
<210>119
<211>35
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>119
tattcccatg gcgcgccsag gtgcagctgg tggag                                35
<210>120
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>120
tattcccatg gcgcgcccag gtgcagctac agcagt                               36
<210>121
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>121
tattcccatg gcgcgcccag stgcagctgc aggagt                               36
<210>122
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>122
tattcccatg gcgcgccgar gtgcagctgg tgcagt                               36
<210>123
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>123
tattcccatg gcgcgcccag gtacagctgc agcagtc                              37
<210>124
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>124
ggcgcgccat gggaatagct agccgacatc cagwtgaccc agtct                     45
<210>125
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>125
ggcgcgccat gggaatagct agccgatgtt gtgatgactc agtct                     45
<210>126
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>126
ggcgcgccat gggaatagct agccgaaatt gtgwtgacrc agtct                     45
<210>127
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>127
ggcgcgccat gggaatagct agccgatatt gtgatgaccc acact                     45
<210>128
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>128
ggcgcgccat gggaatagct agccgaaacg acactcacgc agt                       43
<210>129
<211>45
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>129
ggcgcgccat gggaatagct agccgaaatt gtgctgactc agtct                     45
<210>130
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>130
atatatatgc ggccgcttaa cactctcccc tgttgaa                              37
<210>131
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>载体序列
<400>131
aggaaacagg agatatacat                                                 20
<210>132
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>载体序列
<400>132
tcgccaagga gacagtcata                                                 20
<210>133
<211>369
<212>DNA
<213>智人
<400>133
gggcgcgccc aggtgcagct ggtgcaatct ggacctgaag tgaagaagcc tggggcctca     60
gtgagggtct cctgcaaggc ctctggttac tcctttaaga actatggtat ccactgggtg    120
cgacaggccc ctggacaggg gcttgagtgg atggggtgga tcagcgctga caatggtgac    180
acaaccactg cactgaacct ccggggcaga gtctccatga ccacagacac atccacaaac    240
acagtctaca tggaggtgaa gagcctaaga tctgacgaca cggccatata tttctgtgcg    300
cgagattttt atagtgggag ttaccggtcc tttgactgct ggggccaggg caccctggtc    360
accgtctcg                                                            369
<210>134
<211>378
<212>DNA
<213>智人
<400>134
gggcgcgccc aggtgcagct acagcagtct gggggaggcc tggtcaagcc tggggggtcc     60
ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagta gctatagcat gaactgggtc    120
cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcatcca ttagtagtag tagtagttac    180
atatactacg cagactcagt gaagggccga ttcaccatct ccagagacaa cgccaagaac    240
tcactgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca cggctgtgta ttactgtgcg    300
agacgccctg gttgggctgc tactcgggcg gcgggtgctt ttgatatctg gggccaaggg    360
acaatggtca ccgtctcg                                                  378
<210>135
<211>357
<212>DNA
<213>智人
<400>135
gggcgcgccc aggtgcagct ggtgcaatct ggacctgaac tgaagaagcc tggggcctca     60
gtgaggatct cctgcaaggc ctctgagaaa tgtgatatcc actgggtgcg acaggcccct    120
ggacaggggc ttgagtggat gggatggatc agcgctgacg atggtgggac aaccactgcg    180
ctgaacctcc ggggcagagt ctccatgacc acagacagag ccacaaacac agtatacatg    240
gaactgaaga gcctaagatc tgacgacacg gccatttatt tctgtgcgcg agatttttat    300
agtgggactt accggtcctt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcg       357
<210>136
<211>396
<212>DNA
<213>智人
<400>136
gggcgcgcca aggtgcagct ggtggagtct gggggaggcg tggtccagcc tgggacgtcc     60
ctcagactct cctgtgtagt ctctggattc accttcagaa cctatggtat gaactgggtc    120
cgccaggctc caggcaaggg gctggagtgg ctggcatttc tatcatctga tgggagcgat    180
gaattctacg cggactccgt gaagggccga ttcaccgtct ccagggacaa ttccaagagc    240
actctctttc tgaaaatgaa cagtctgaga cctgatgaca cggctgtcta ttactgtgcg    300
agggatcgtg gggcccaaat tacacttttt ggagcccctc ttataaggcc ttcgtccttt    360
gactcctggg gccagggcac cctggtcacc gtctcg                              396
<210>137
<211>362
<212>DNA
<213>智人
<400>137
gggcgcgccc aggtgcagct gcaggagtct ggacctgagg tgaagaagcc tggggcctca     60
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<212>DNA
<213>智人
<400>223
ctagccgatg ttgtgatgac tcagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga    60
gtcagcatca cttgccgggc aagtcggagc gttaagacct atttaaattg gtatcagcag    120
aaaccaggga aagcccctaa gctcctggtc tatggttcgt ccagtttgga aagtggggtc    180
ccatcaagat tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg    240
caacctgagg attttgcaac ttactgctgt caacagagtt tcggtacccc ctacactttt    300
ggccagggga ccaagctgga catcaaa                                        327
<210>224
<211>330
<212>DNA
<213>智人
<400>224
ctagccgaca tccagttgac ccagtctcct tcctctctgt ctgcatctgt gggagacaga     60
gtcaccatca cttgccgggc gagtcagggc attagcaatt ttttagcctg gtatcagcag    120
aaaccaggga aagttcctga gctccttatc tatggtgcat ccaccttgca atcaggggtc    180
ccatctcggt tcagtggcag tggatctggg acagagttca ctctcaccat caacagcctg    240
cagcctgaag atgttgcgac ttattactgt caaaagtatg atagtggcct gagattcact    300
ttcggccctg ggaccaaagt ggatatcaaa                                     330
<210>225
<211>327
<212>DNA
<213>智人
<400>225
ctagccgaca tccagatgac ccagtcttct tccaccctgt ctgcatctgt aggagacaga     60
gtcaccatca cttgccgggc cagtcagaat attaatatct ggttggcctg gtatcagcag    120
aaagcaggga aagcccccaa actcctgatc tataaggcgt ctactttaga aaggggggtc    180
ccctcaaggt tcagcggcag tggatctggg acagagttca ctctcaccat caccggcctg    240
cgccctgacg atttcggaag ttattattgc caacactatg atggtaattc actaacgttc    300
ggccaaggga ccagggtgga tatccaa                                        327
<210>226
<211>330
<212>DNA
<213>智人
<400>226
ctagccgaca tccagttgac ccagtctcct tccaccctgt ctgcatctgt aggcgacaga     60
gtcaccatca cttgccgggc cagtcagagt attggtagct ggttggcctg gtatcaacag    120
aaaccaggga aagcccctaa actcctgatc tataaggcgt ctactttaca aagtgagacc    180
ccttcaaggt tccgcggcag tggatctggg accgaattca ctctcaccat cagcagcctg    240
cagcctgatg attttgcaac ttactactgc caacagttta atagtttttc tccgtggacg    300
ttcggccaag ggaccaaggc ggaattcaaa                                     330
<210>227
<211>123
<212>PRT
<213>智人
<400>227
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe
            20                  25                  30
Lys Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Asp Asn Gly Asp Thr Thr Thr Ala
    50                  55                  60
Leu Asn Leu Arg Gly Arg Val Ser Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn
65                  70                  75                  80
Thr Val Tyr Met Glu Val Lys Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile
                85                  90                  95
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Phe Tyr Ser Gly Ser Tyr Arg Ser Phe Asp
            100                 105                 110
Cys Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>228
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>228
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
            20                  25                  30
Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Val Ser Ser lle Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65                  70                  75                  80
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Pro Gly Trp Ala Ala Thr Arg Ala Ala Gly
            100                 105                 110
Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
       115                 120                 125
<210>229
<211>119
<212>PRT
<213>智人
<400>229
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ala Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Glu Lys Cys Asp
            20                  25                  30
Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Trp Ile Ser Ala Asp Asp Gly Gly Thr Thr Thr Ala Leu Asn Leu Arg
    50                  55                  60
Gly Arg Val Ser Met Thr Thr Asp Arg Ala Thr Asn Thr Val Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Lys Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Phe Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Phe Tyr Ser Gly Thr Tyr Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115
<210>230
<211>132
<212>PRT
<213>智人
<400>230
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly Thr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe
            20                  25                  30
Arg Thr Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Leu Ala Phe Leu Ser Ser Asp Gly Ser Asp Glu Phe Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser
65                  70                  75                  80
Thr Leu Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Arg Pro Asp Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Ala Gln Ile Thr Leu Phe Gly Ala
            100                 105                 110
Pro Leu Ile Arg Pro Ser Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
        115                 120                 125
Val Thr Val Ser
    130
<210>231
<211>121
<212>PRT
<213>智人
<400>231
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
            20                  25                  30
Asn Ser Tyr Gly Ile Ala Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly His Thr Asn Tyr Ala
    50                  55                  60
Glu Lys Val Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ala Thr Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ala Cys Met Glu Leu Thr Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr His Phe Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Trp Ser Pro Ser Arg
        115                 120
<210>232
<211>122
<212>PRT
<213>智人
<400>232
Gly Arg Ala Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu
            20                  25                  30
Tyr Thr Thr Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Arg Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr
    50                  55                  60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Ala Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Gln Val Val Leu Lys Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Met Gly Val Val Leu Pro Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>233
<211>117
<212>PRT
<213>智人
<400>233
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Pro Leu
            20                  25                  30
Asn Arg Tyr Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Leu Ser Ser Ile Ser Ser Thr Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65                  70                  75                  80
Ser Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Leu
                85                  90                  95
Tyr Phe Cys Ala Ser Gly Asn Thr His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser
        115
<210>234
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>234
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Leu Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Pro Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Ile Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met
65                  70                  75                  80
Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>235
<211>132
<212>PRT
<213>智人
<400>235
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly Thr Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Thr Phe
            20                  25                  30
Arg Thr Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Val Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Leu Ala Phe Val Ser Ser Asp Gly Ser Asp Glu Phe Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser
65                  70                  75                  80
Thr Leu Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Ala Gln Ile Thr Leu Phe Gly Ala
            100                 105                 110
Pro Leu Ile Arg Pro Ser Ser Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu
        115                 120                 125
Val Thr Val Ser
    130
<210>236
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>236
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Thr Ser Phe Gly Thr Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ala Thr Asn Thr Val Tyr Met
65                  70                  75                  80
Asp Leu Ser Asp Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Lys Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>237
<211>122
<212>PRT
<213>智人
<400>237
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu
            20                  25                  30
Gly Thr Thr Gly Val Asn Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Leu Ile Ser Trp Asp Gly Gly Lys His Tyr
    50                  55                  60
Ser Pro Ser Leu Asn Ser Arg Ile Thr Leu Thr Lys Asp Ala Ser Arg
65                  70                  75                  80
Glu Gln Val Val Val Pro Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr
                85                  90                  95
Gly Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Val Gly Thr His Gly Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>238
<211>131
<212>PRT
<213>智人
<400>238
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ala Thr Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe
            20                  25                  30
Asn Asp Tyr Cys Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Gly Asn Asn Ala Asp Thr Phe Tyr Ala
    50                  55                  60
Pro Lys Leu Gln Gly Arg Val Thr Met Ser Thr Asp Thr Ser Thr Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg Gly Arg Ile Thr Leu Phe Gly Glu Val
            100                 105                 110
Ile Leu Arg Ala Gly Trp Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser
    130
<210>239
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>239
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Phe Gly Ser His Tyr Ile Ser Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
65                  70                  75                  80
Ala Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Gly Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Tyr Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>240
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>240
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Phe Gly Ser His Tyr Ile Ser Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
65                  70                  75                  80
Ala Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Gly Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Tyr Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>241
<211>130
<212>PRT
<213>智人
<400>241
Gly Arg Ala Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ser Ser Gly Gly Pro Pro
            20                  25                  30
Lys Ser Tyr Thr Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Leu Ile Phe Gly Pro Pro Asn Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Lys Phe Gln Asp Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn
65                  70                  75                  80
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Met
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Val Thr Ala Pro Asp Asp Thr Gly Thr Ile Leu Ala Arg
            100                 105                 110
His Asn Arg Tyr Tyr Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser
    130
<210>242
<211>130
<212>PRT
<213>智人
<400>242
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Gly Phe
            20                  25                  30
Thr Val Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn
    50                  55                  60
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser
65                  70                  75                  80
Thr Thr Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Leu Asp Ser Tyr Asp Val Phe Thr Gly Tyr
            100                 105                 110
Asn Leu Gly Gly Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser
    130
<210>243
<211>117
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>Xaa相应于终止密码子
<400>243
Gly Arg Ala Lys Val Xaa Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Val Ser Gly Phe Pro Leu
            20                  25                  30
Asn Arg Tyr Ile Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Leu Ser Ser Ile Ser Ser Thr Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
65                  70                  75                  80
Ser Leu Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Leu
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Ser Gly Asn Thr His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser
        115
<210>244
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>244
Gly Arg Ala Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met
65                  70                  75                  80
Asp Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>245
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>245
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Thr Tyr Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Ala Ser Arg Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Val Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu
            100                 105                 110
Asn Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>246
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>246
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Thr Tyr Ser Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ile Phe Ala Thr Arg Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Tyr Met Glu Leu Arg Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Phe Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu
            100                 105                 110
Asn Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>247
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>247
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Pro Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Ile Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met
65                  70                  75                  80
Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>248
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>248
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Phe Gly Ser His Tyr Ile Ser Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
65                  70                  75                  80
Ala Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Gly Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Tyr Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>249
<211>130
<212>PRT
<213>智人
<400>249
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Gly Phe
            20                  25                  30
Thr Val Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn
    50                  55                  60
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser
65                  70                  75                  80
Thr Thr Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Leu Asp Ser Tyr Asp Val Phe Thr Gly Tyr
            100                 105                 110
Asn Leu Gly Gly Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser
    130
<210>250
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>250
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Ser Asn Phe Arg Thr Ala Glu Tyr Ala Arg Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ile Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Val
                85                  90                  95
Ser Ala Pro Arg Asp Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>251
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>251
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln
1               5                   10                  15
Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe
            20                  25                  30
Arg Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Val Ile Ser Phe Asn Gly Asp Gln Ile Phe Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Met Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ser Lys Asn
65                  70                  75                  80
Thr Leu His Leu Arg Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Arg Leu Leu Phe Cys Ser Gly Gly Arg Cys
            100                 105                 110
Asp Met Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>252
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>252
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly His Gly Pro Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Thr Asn Phe Gly Thr Ala Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg ValSer Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Phe Tyr Met
65                 70                  75                  80
Asp Leu Asn Asn Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Ser Ala Pro Arg Asp Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>253
<211>116
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa相应于终止密码子
<400>253
Gly Arg Ala Xaa Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
            20                  25                  30
Ser Asn Ala Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Val Gly His Val Lys Ser Met Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp
    50                  55                  60
Tyr Ala Ala Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr
                85                  90                  95
Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Thr His Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
            100                 105                 110
Val Thr Val Ser
        115
<210>254
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>254
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Pro Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Ile Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met
65                  70                  75                  80
Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>255
<211>131
<212>PRT
<213>智人
<400>255
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Met Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Gln Ala Ser Gly Gly Thr Phe
            20                  25                  30
Ser Asn Tyr Gly Ile Asn Trp Val Arg His Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Gly Ile Val Pro Ile Tyr Gly Pro Pro Lys Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Ser Ser Asp Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Leu Ser Arg Thr Val Phe Gly Ser Gly Thr Tyr
            100                 105                 110
Arg Pro Gly Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Ile Gly Thr Thr Val
        115                 120                 125
Thr Val Ser
    130
<210>256
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>Xaa相应于终止密码子
<400>256
Gly Arg Ala Xaa Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Phe Gly Ser His Tyr Ile Ser Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn
65                  70                  75                  80
Ala Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Gly Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Tyr Met
            100                 105                 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>257
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>257
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met
65                  70                  75                  80
Asp Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>258
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>258
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Glu Gly Gly Thr Phe
            20                  25                  30
Ser Thr Tyr Val Ile Ser Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Gly Ile Val Pro Ile Phe Asn Thr Pro Asn Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser
65                  70                  75                  80
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Gly Ser Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Gly Gly Thr Arg Ser Tyr Tyr Ala Leu
            100                 105                 110
Gly Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>259
<211>122
<212>PRT
<213>智人
<400>259
Gly Arg Ala Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
            20                  25                  30
Gly Thr Thr Gly Val Asn Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Leu Glu Trp Leu Ala Leu Ile Ser Trp Gly Gly Gly Lys His Tyr
    50                  55                  60
Ser Pro Ser Leu Asn Ser Arg Ile Thr Leu Thr Lys Asp Ala Ser Arg
65                  70                  75                  80
Glu Gln Val Val Val Leu Thr Met Ala Asn Met Asp Pro Val Asp Thr
                85                  90                  95
Gly Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Val Gly Thr His Gly Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>260
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>260
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Arg
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe
            20                  25                  30
Asp Glu Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Val Ala Phe Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Thr Asn Ala Lys Asn
65                  70                  75                  80
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Arg Thr Lys Leu Gly Met Ser Tyr Phe
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>261
<211>130
<212>PRT
<213>智人
<400>261
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Gln Ala Ser Gly Tyr Gly Phe
            20                  25                  30
Thr Val Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Leu Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Asn
    50                  55                  60
Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser
65                  70                  75                  80
Thr Thr Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg His Leu Asp Ser Tyr Asp Val Phe Thr Gly Tyr
            100                 105                 110
Asn Leu Gly Gly Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Met Val Thr
        115                 120                 125
Val Ser
    130
<210>262
<211>123
<212>PRT
<213>智人
<400>262
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ala Ser Val Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Leu
            20                  25                  30
Lys Asn Tyr Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Trp Ile Ser Ala Asp Asn Gly Asp Thr Thr Thr Ala
    50                  55                  60
Leu Asn Leu Arg Gly Arg Val Ser Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Asn
65                  70                  75                  80
Thr Val Tyr Met Glu Val Lys Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Ile
                85                  90                  95
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Phe Tyr Ser Gly Ser Tyr Arg Ser Phe Asp
            100                 105                 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>263
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>263
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Val
            20                  25                  30
Ser Gly Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ile Gly Ser Thr Asn Tyr
    50                  55                  60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Ser Leu Ser Val Asp Thr Ala Lys
65                  70                  75                  80
Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Ile Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Arg Arg Thr Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser
            100                 105                 110
Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>264
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>264
Gly Arg Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Ser Glu Thr Leu Pro Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Thr Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Gln Asn Ser Val Asn Thr Asn Tyr Asn Pro
    50                  55                  60
Ser Leu Lys Ser Arg Val Ile Ile Ser Val Asp Thr Ser Asn Asn Gln
65                  70                  75                  80
Phe Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
                85                  90                  95
Tyr Cys Ala Arg Val Ser Gly Trp Gly Pro Arg Gly Gly Ile Tyr Phe
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>265
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>265
Gly Arg Ala Lys Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ser Ser Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Ser Asn Phe His Thr Ala Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ile Tyr Met
65                  70                  75                  80
Glu Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Val
                85                  90                  95
Ser Ala Pro Arg Asp Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>266
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>266
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Thr Ser Val Arg Val Ser Arg Lys Thr Pro Gly Gly Tyr Val
            20                  25                  30
Phe Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met Gly
        35                  40                  45
Gly Ile Ile Thr Asn Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Arg Lys Phe Gln
    50                  55                  60
Gly Arg Ile Thr Val Thr Ala Asp Lys Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met
65                  70                  75                  80
Asp Leu Ser Asn Leu Ala Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Ala Pro Arg Gly Thr Ser Thr Ile Ala Ala Arg Phe Asn Arg Tyr
            100                 105                 110
Phe Phe Asp Ser Trp Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>267
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>267
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Thr Tyr Ile Phe Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ile Phe Ala Thr Arg Asp Tyr Pro
    50                  55                  60
Lys Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu
            100                 105                 110
Asn Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>268
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>268
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Arg
1               5                   10                  15
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe
            20                  25                  30
Asp Glu Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
        35                  40                  45
Lys Trp Val Ala Phe Ile Asn Trp Asn Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala
    50                  55                  60
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Ser Asn Ala Lys Asn
65                  70                  75                  80
Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Phe
                85                  90                  95
Tyr Cys Cys Ala Arg Asp Pro Arg Thr Lys Leu Gly Met Ser Tyr Phe
            100                 105                 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>269
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>269
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Thr Tyr Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Ala Ser Arg Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Tyr Met Glu Pro Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu
            100                 105                 110
Asn Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>270
<211>126
<212>PRT
<213>智人
<400>270
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Val
            20                  25                  30
Ser Gly Gly Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ile Gly Ser Thr Asn Tyr
    50                  55                  60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Ser Leu Ser Val Asp Thr Ala Lys
65                  70                  75                  80
Ser Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ala Arg Arg Thr Tyr Ser Gly Tyr Asp Ser
            100                 105                 110
Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120                 125
<210>271
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>271
Gly Arg Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
1               5                   10                  15
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe
            20                  25                  30
Ser Thr Tyr Ala Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
        35                  40                  45
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Ala Ser Arg Asp Tyr Ala
    50                  55                  60
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val
                85                  90                  95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Leu Gly Gly Thr Arg Leu Tyr Tyr Ala Leu
            100                 105                 110
Asn Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>272
<211>123
<212>PRT
<213>智人
<400>272
Gly Arg Ala Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Val Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ala Leu
            20                  25                  30
Gly Thr Thr Gly Val Ala Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Leu Glu Trp Leu Gly Leu Ile Asp Trp Asn Asp Asp Arg Arg Tyr
    50                  55                  60
Arg Pro Ser Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Thr Gln Asp Met Ser Arg
65                  70                  75                  80
Asn Gln Val Val Leu Arg Leu Thr Asn Leu Asp Pro Leu Asp Thr Gly
                85                  90                  95
Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Val Val Pro Ala Thr Arg Ala Phe Asp
            100                 105                 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>273
<211>122
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(52)..(52)
<223>Xaa相应于终止密码子
<400>273
Gly Arg Ala Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys
1               5                   10                  15
Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Ser Gly Phe Ser Leu
            20                  25                  30
Tyr Thr Thr Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
        35                  40                  45
Ala Leu Glu Xaa Leu Ala Arg Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Glu Arg Tyr
    50                  55                  60
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Ala Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Gln Val Val Leu Lys Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
                85                  90                  95
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Met Gly Val Val Leu Pro Phe Asp Tyr
            100                 105                 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
        115                 120
<210>274
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>274
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Cys Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>275
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>275
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp PheThr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala
                85                  90                  95
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>276
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>276
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Ile Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Gly Thr
                85                  90                  95
Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Val Glu Ile Lys
            100                  105
<210>277
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>277
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Gly Pro
                85                  90                  95
Val Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>278
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>278
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Ser
            20                  25                  30
Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ile
        35                  40                  45
Leu Ile Phe Gly Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Ile Cys Gln Gln Ser Lys Ser Pro
                85                  90                  95
Pro Tyr Asn Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210>279
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>279
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Glu Thr Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Phe
                85                  90                  95
Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Phe Lys
            100                 105                 110
<210>280
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>280
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn
            20                  25                  30
Ile Asn Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Tyr Ser His
                 85                  90                  95
Val Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
           100                  105
<210>281
<211>115
<212>PRT
<213>智人
<400>281
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
        35                  40                  45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
    50                  55                  60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
            100                 105                 110
Glu Ile Lys
        115
<210>282
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>282
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Thr
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Gln Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Gly Pro
                85                  90                  95
Val Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>283
<211>115
<212>PRT
<213>智人
<400>283
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
        35                  40                  45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
    50                  55                  60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
            100                 105                 110
Glu Ile Lys
        115
<210>284
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>284
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly
            20                  25                  30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Ser Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Trp Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Arg Tyr
                85                  90                  95
Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>285
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>285
Leu Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser
            20                  25                  30
Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Pro Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Phe Thr Phe Thr Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Cys Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Pro Pro Val Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys
            100                 105
<210>286
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(93)..(93)
<223>Xaa相应于终止密码子
<400>286
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gln Ser Val Phe
            20                  25                  30
Gly Asp Phe Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Xaa Tyr Gly Asp
                85                  90                  95
Ser Val Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gly Ile Lys
            100                  105                110
<210>287
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>287
Leu Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gln Ser Val Phe
            20                  25                  30
Gly Asp Phe Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Asp
                85                  90                  95
Ser Val Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>288
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(45)..(45)
<223>Xaa相应于终止密码子
<400>288
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Gln Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn
            20                  25                  30
Arg Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Xaa Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Arg Asp Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys His Gln Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Pro Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>289
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>289
Leu Ala Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
            20                  25                  30
Thr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile His Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>290
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>290
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Thr Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Phe
            20                  25                  30
Ile Asn Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Tyr Ser Gln
                85                  90                  95
Val Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>291
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>291
Leu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn
            20                  25                  30
Ser Asp Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Met Ser Gly Ala Thr Ser Arg Ala Thr Asp Val Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Asp Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>292
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>292
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Phe Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Gly
                85                  90                  95
Leu Arg Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
         100                 105                 110
<210>293
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>293
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Phe Leu Ala Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Gly
                85                  90                  95
Leu Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>294
<211>115
<212>PRT
<213>智人
<400>294
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
        35                  40                  45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
    50                  55                  60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Leu Gly Gln Gly Thr Lys Val
            100                 105                 110
Glu Ile Lys
        115
<210>295
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>Xaa相应于终止密码子
<400>295
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Xaa Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gln Ser Val Phe
            20                  25                  30
Gly Asp Phe Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile Tyr Val Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Asp
                85                  90                  95
Ser Val Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
            100                 105                 110
<210>296
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>296
Leu Ala Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
            20                  25                  30
Thr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile His Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>297
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>297
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Asn
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ala
                85                  90                  95
Ser Asp Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>298
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>298
Leu Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ile
            20                  25                  30
Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Glu Val
        35                  40                  45
Leu Ile Phe Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Ile Arg Tyr
                85                  90                  95
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys
          100                 105
<210>299
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>299
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Val Ser Gly Ala Thr Asn Arg Ala Thr Asp Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Glu Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Arg
            100                 105                 110
<210>300
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>300
Leu Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Pro Phe Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Leu Ser
            20                  25                  30
Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Val Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asp Thr Tyr
                85                  90                  95
Pro Leu Thr Leu Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>301
<211>115
<212>PRT
<213>智人
<400>301
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
        35                  40                  45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
    50                  55                  60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
            100                 105                 110
Glu Ile Lys
        115
<210>302
<211>115
<212>PRT
<213>智人
<400>302
Leu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
        35                  40                  45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
    50                  55                  60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val
            100                 105                 110
Glu Ile Lys
        115
<210>303
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>303
Leu Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ala Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys Gly Ala Ser Gln Ser Val Phe
            20                  25                  30
Gly Asp Phe Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Pro Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ala Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Asp
                85                  90                  95
Ser Val Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>304
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>304
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn
            20                  25                  30
Ser Asp Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Met Ser Gly Ala Thr Ser Arg Ala Thr Asp Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Asp Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>305
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>305
Leu Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Lys Val Pro Arg Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Tyr Ser Asn Ala
                85                  90                  95
Leu Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val His Ile Lys
            100                 105                 110
<210>306
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>306
Leu Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly
            20                  25                  30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Ser Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Trp Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Arg Tyr
                85                  90                  95
Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>307
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>307
Leu Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser
            20                  25                  30
Asn His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Val Gly Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Pro
                85                  90                  95
Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>308
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>308
Leu Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser
            20                  25                  30
Thr Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Ile His Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Ser
                85                  90                  95
Ser Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>309
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>309
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr
                85                  90                  95
Ser Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Val Gly Ile Lys
            100                 105
<210>310
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>310
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Lys
            20                  25                  30
Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Val Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Gly Thr
                85                  90                  95
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Thr Lys
            100                 105
<210>311
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>311
Leu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Ser Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn
            20                  25                  30
Lys Phe Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Thr Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Met
                85                  90                  95
Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>312
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>312
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
1               5                   10                  15
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Tyr
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ala Pro Arg
        35                  40                  45
Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg
    50                  55                  60
Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
65                  70                  75                  80
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Gly Ala
                85                  90                  95
Ser Asp Asn Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105                 110
<210>313
<211>115
<212>PRT
<213>智人
<400>313
Leu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser
1               5                   10                  15
Leu Gly Glu Lys Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu
            20                  25                  30
Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
        35                  40                  45
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
    50                  55                  60
Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
65                  70                  75                  80
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Pro Met Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
            100                 105                 110
Glu Ile Lys
        115
<210>314
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>314
Leu Ala Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Phe Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Val Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Asn Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asp Ser Gly
                85                  90                  95
Leu Ile Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
          100                 105                 110
<210>315
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>315
Leu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser
            20                  25                  30
Asn His Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Arg Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Val Gly Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Pro
                85                  90                  95
Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
            100                 105
<210>316
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>316
Leu Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Gly
                85                  90                  95
Leu Arg Phe Thr Phe Gly Pro Gly Ala Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105                 110
<210>317
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>317
Leu Ala Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Arg Ser Val Lys
            20                  25                  30
Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Val Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Cys Cys Gln Gln Ser Phe Gly Thr
                85                  90                  95
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Asp Ile Lys
            100                 105
<210>318
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>318
Leu Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser
            20                  25                  30
Asn Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Glu Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asp Ser Gly
                85                  90                  95
Leu Arg Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys
            100                 105                 110
<210>319
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>319
Leu Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Thr Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn
            20                  25                  30
Ile Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Thr Gly Leu
65                  70                  75                  80
Arg Pro Asp Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Gly Asn
                85                  90                  95
Ser Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Asp Ile Gln
            100                 105
<210>320
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>320
Leu Ala Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser
1               5                   10                  15
Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly
            20                  25                  30
Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Gln Ser Glu Thr Pro Ser Arg Phe
    50                  55                  60
Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65                  70                  75                  80
Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Phe
                85                  90                  95
Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Ala Glu Phe Lys
            100                 105                 110
<210>321
<211>402
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>载体序列
<400>321
gctagcgctg gttgggcagc gagtaataac aatccagcgg ctgccgtagg caataggtat     60
ttcattatga ctgtctcctt ggcgactagc tagtttagaa ttaattcgtg aaattgttat    120
ccgctcacaa ttccacacaa catacgagcc ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc    180
taatgagtga gctaactcac attaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagatctta    240
ctccccatcc ccctgttgac aattaatcat cggctcgtat gatgtgtgga attgtgagcg    300
gataacaatt tcacacagga aacaggagat atacatatga aatacctgct gccgaccgct    360
gctgctggtc tgctgctcct cgctgcccag ccggggcgcg cc                       402
<210>322
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>322
tattggcgcg ccatggccgc ccagtctgtg acccagc                             37
<210>323
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>323
tattggcgcg ccatggccgc ccagaagata actcaa                              36
<210>324
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>324
tattggcgcg ccatggccga tgctaagacc acccag                              36
<210>325
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>325
tattggcgcg ccatggccgc ccagacagtc actcag                              36
<210>326
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>326
tattggcgcg ccatggccaa acaggaggtg acacaga                             37
<210>327
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>327
tattggcgcg ccatggccgg agactcggtt acccaga                             37
<210>328
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>328
tattggcgcg ccatggccgg agattcagtg acccaga                             37
<210>329
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>329
tattggcgcg ccatggccag caattcagtc aagcaga                             37
<210>330
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>330
tattggcgcg ccatggccgg acaaaacatt gaccag                              36
<210>331
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>331
tattggcgcg ccatggccaa aaatgaagtg gagcaga                             37
<210>332
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>332
tattggcgcg ccatggccga agaccaggtg acgcaga                             37
<210>333
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>333
tattggcgcg ccatggccgg aatacaagtg gagcaga                             37
<210>334
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>334
tattggcgcg ccatggccct acatacactg gagcaga                             37
<210>335
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>335
tattggcgcg ccatggccga agacaaggtg gtacaaa                             37
<210>336
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>336
tattggcgcg ccatggccga aaaccaggtg gagcaca                             37
<210>337
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>337
tattggcgcg ccatggccca ggagaatgtg gagcag                              36
<210>338
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>338
tattggcgcg ccatggccgg agagagtgtg gggctg                              36
<210>339
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>339
tattggcgcg ccatggccgg agaggatgtg gagcaga                             37
<210>340
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>340
tattggcgcg ccatggccag ccaaaagata gaacaga                             37
<210>341
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>341
tattggcgcg ccatggccag tcaacaggga gaagag                              36
<210>342
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>342
tattggcgcg ccatggccca acaaccagtg cagagt                              36
<210>343
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>343
tattggcgcg ccatggccag ccaagaactg gagcaga                             37
<210>344
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>344
tattggcgcg ccatggccgg tcaacagctg aatcaga                             37
<210>345
<211>37
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>345
tattggcgcg ccatggccac ccagctgctg gagcaga                             37
<210>346
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>346
tattggcgcg ccatggccca gcagcaggtg aaacaa                              36
<210>347
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>347
tattggcgcg ccatggccat actgaacgtg gaacaa                              36
<210>348
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>348
tattggcgcg ccatggccga ccagcaagtt aagcaa                              36
<210>349
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>349
tattggcgcg ccatggccgg acaacaggta atgcaa                              36
<210>350
<211>36
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>350
tattggcgcg ccatggccaa ggaccaagtg tttcag                              36
<210>351
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>351
taggcagaca gacttgtcac t                                              21
<210>352
<211>43
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>引物序列
<400>352
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gacattatgc atgatctctg cttctgatgg ctc                                 33

Claims (58)

1.连接多个非相邻目标核苷酸序列的方法，所述的方法包含：a)在多重分子扩增步骤中使用来自分离的单个细胞或者等基因细胞群的模板，扩增目标核苷酸序列；以及b)实现步骤a)中扩增出的目标核苷酸序列的连接。
2.根据权利要求1的方法，其中目标核苷酸序列包含可变区编码序列，且连接产生可变区编码序列的关联对。
3.根据权利要求1或者2的方法，其中目标核苷酸序列包含免疫球蛋白可变区编码序列，且连接产生了轻链可变区编码序列与重链可变区编码序列的关联对。
4.根据权利要求1或者2的方法，其中目标核苷酸序列包含T细胞受体可变区编码序列，且连接产生了由α链可变区编码序列与β链可变区编码序列组成的关联对或者由γ链可变区编码序列与δ链可变区编码序列组成的关联对。
5.随机连接多个非相邻目标核苷酸序列的方法，所述的方法包含：a)在多重分子扩增步骤中使用来自遗传多样性细胞群的模板，扩增目标核苷酸序列；以及b)实现步骤a)中扩增出的目标核苷酸序列的连接。
6.根据权利要求5的方法，所述的细胞群是被裂解的。
7.根据权利要求5或者6的方法，其中所述的目标核苷酸序列包含可变区编码序列，且连接产生可变区编码序列对的组合文库。
8.根据权利要求7的方法，其中所述的目标核苷酸序列包含免疫球蛋白可变区编码序列，且连接产生了轻链可变区编码序列与重链可变区编码序列对的组合文库。
9.根据权利要求7的方法，其中所述的目标核苷酸序列包含T细胞受体可变区编码序列，且连接产生α链可变区与β链可变区编码序列对的组合文库。
10.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中所述的多重分子扩增步骤是多重RT-PCR扩增。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的多重RT-PCR扩增是两步过程，包括在多重PCR扩增之前的独立的逆转录(RT)。
12.根据权利要求10的方法，其中所述的多重RT-PCR扩增以单一步骤进行，包含最初将进行逆转录(RT)和多重PCR扩增所需的所有组分加入到单个容器中。
13.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中所述的目标核苷酸序列的连接与多重分子扩增在同一个容器中进行。
14.根据权利要求10到13中任何一项的方法，其中使用多重重叠-延伸引物混合物，所述的目标核苷酸序列的连接与多重PCR扩增被一同实现。
15.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中所述的目标核苷酸序列的连接通过连接方法实现。
16.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中使用适用于扩增连接后目标核酸序列的引物混合物进行额外的分子扩增。
17.根据权利要求14的方法，其中的多重重叠-延伸引物混合物包含了引物组，其中每个引物组中的至少一个引物组成员包含能够与第二引物组中的引物组成员的重叠-延伸尾巴杂交的重叠-延伸尾巴。
18.根据权利要求14或者17的方法，其中的多重重叠-延伸引物混合物包含：a)至少一个与免疫球蛋白轻链区编码序列有义链互补的CL或者JL引物；b)至少一个与免疫球蛋白轻链可变区编码序列反义链或者轻链可变区前导序列反义链互补并且能够与步骤a)中的引物形成引物组的VL 5′引物或者VLL引物；c)至少一个与免疫球蛋白恒定重链结构域编码序列的有义链互补或者与重链连接区编码序列有义链互补的CH或者JH引物，以及d)至少一个与免疫球蛋白重链可变区编码序列反义链或者重链可变区前导序列反义链互补并且能够与步骤c)中的引物形成引物组的VH 5′引物或者VHL引物。
19.根据权利要求18的方法，其中步骤b)的引物是VLL引物，与SEQ ID 93到98的基因特异区域有至少90％的序列一致性，步骤d)的引物是VHL引物，与SEQ ID 86到92的基因特异区域有至少90％的序列一致性。
20.根据前面权利要求中任何一项的方法，其中从含有淋巴细胞的细胞级分获得所述单个细胞、等基因细胞群或者遗传上不同的细胞群。
21.产生关联对文库的方法，所述关联对包含连接的可变区编码序列，所述的方法包含a)提供来自供体的含有淋巴细胞的细胞级分；b)可选地从所述细胞级分中富集某个淋巴细胞群；c)获得分离的单细胞群体，包含将细胞从所述的细胞级分中逐个分配到多个容器中；以及d)根据权利要求1到4或者10到20中任何一项的方法，扩增所述的分离的单细胞群体中含有的可变区编码序列以及实现其连接，这些取决于权利要求1到4中的任何一项。
22.根据权利要求21的方法，其中在进行扩增和连接(步骤d)以前，单细胞群体中的单个分离的单细胞被扩充为等基因细胞群。
23.根据权利要求20到22任何一项的方法，其中含有淋巴细胞的细胞级分组成全血、骨髓、单核细胞或者白细胞。
24.根据权利要求20到23任何一项的方法，其中含有淋巴细胞的细胞级分富集了B淋巴细胞谱系的细胞。
25.根据权利要求20到24任何一项的方法，其中含有淋巴细胞的细胞级分或者B淋巴细胞谱系富集了浆细胞。
26.根据权利要求20到25任何一项的方法，其中来自含有淋巴细胞的细胞级分、B淋巴细胞谱系或者浆细胞的细胞对抗原特异性进行富集。
27.根据权利要求20到23任何一项的方法，其中含有淋巴细胞的细胞级分对T淋巴细胞谱系的细胞进行富集。
28.根据权利要求20到23任何一项的方法，其中抗原特异的T细胞通过刺激含有淋巴细胞的细胞级分产生。
29.根据前面权利要求中任何一项的方法，还包含将连接后的核苷酸序列或者关联对文库插入到载体中。
30.根据权利要求29的方法，其中所述的载体选自克隆载体、穿梭载体、展示载体或者表达载体。
31.根据权利要求29或者30的方法，其中连接后的核苷酸序列或者关联对文库的单个成员包含免疫球蛋白重链可变区编码序列与轻链可变区编码序列，且所述的序列按照阅读框插入到载体中，所述载体中已经含有编码一个或者更多免疫球蛋白恒定结构域或者其片段的序列。
32.根据权利要求29或者30的方法，其中连接后的核苷酸序列或者关联对文库的单个成员包含T细胞受体α链可变区编码序列与β链可变区编码序列，且所述的序列按照阅读框插入到载体中，所述载体中已经含有编码一个或者更多T细胞受体恒定结构域或者其片段的序列。
33.根据权利要求21到32中任何一项的方法，还包含通过选择连接后的编码具有所需靶标特异性的结合蛋白的可变区序列的关联对的亚组建立亚文库，产生可变区编码序列的靶标特异性关联对的文库。
34.根据权利要求31到33中任何一项的方法，还包含将所述的关联对或者可变区编码序列的靶标特异性关联对文库转移到哺乳动物表达载体中。
35.根据权利要求34的方法，其中的哺乳动物表达载体编码一个或者更多恒定区结构域，所述恒定区结构域选自人类免疫球蛋白类型IgA1，IgA2，IgD，IgE，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，κ轻链或者λ轻链或者选自人T细胞受体α，β，δ和/或γ链。
36.根据权利要求29到35中任一项的方法，还包含以下的步骤：a)将编码连接后的核苷酸序列片段的载体引入宿主细胞中；b)在适于表达的条件下培养所述的宿主细胞；以及c)获得插入到所述宿主细胞的载体表达的蛋白质产物。
37.根据权利要求36的方法，其中所述的蛋白质产物是包含轻链可变区连接重链可变区的关联对的单克隆抗体。
38.根据权利要求36的方法，其中所述的多肽产物是单克隆T细胞受体，所述的单克隆T细胞受体包含α链可变区连接β链可变区的关联对。
39.由连接的可变区编码序列组成的关联对的文库。
40.根据权利要求39的文库，其中通过根据权利要求21或者任何其从属权利要求的方法获得所述的可变区编码序列关联对。
41.根据权利要求39或者40的文库，其中所述的关联对的单个成员包含免疫球蛋白轻链可变区编码序列与重链可变区编码序列。
42.根据权利要求41的文库，其中所述的单个成员编码全长的抗体，所述抗体选自人免疫球蛋白类型IgA1，IgA2，IgD，IgE，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4或者IgM。
43.根据权利要求39或者40的文库，其中所述的关联对的单个成员包含TcRα链可变区编码序列与β链可变区编码序列或者γ链可变区编码序列与δ链可变区编码序列。
44.根据权利要求40的文库，其中所述的单个成员编码全长的TcR。
45.可变区编码序列的关联对的亚文库，所述编码序列编码表现出针对某个靶标的所需结合特异性的蛋白。
46.亚文库，其编码表现出针对某个靶标的所需结合特异性的蛋白，该亚文库选自根据权利要求39到44中任一项的文库。
47.连接的免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区编码序列的关联对的亚文库，其中可以从所述文库表达的免疫球蛋白能够与破伤风毒素反应或者与其结合。
48.包含根据权利要求39到47中任何一项的文库或者亚文库的宿主细胞群。
49.根据权利要求48的宿主细胞群，其中的细胞是哺乳动物细胞。
50.表达自根据权利要求48或者49的宿主细胞的重组多克隆蛋白。
51.能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆免疫球蛋白或者其片段。
52.根据权利要求51的重组多克隆免疫球蛋白，其中的单个成员是关联对。
53.根据权利要求51或者52的重组多克隆免疫球蛋白，包含至少两个单个的关联对，所述关联对包含免疫球蛋白重链可变区与轻链可变区编码序列，所述关联对与选自以下SEQ ID对的单个SEQ ID对具有至少90％的序列一致性：229:276，262:309，240:287，245:292，267:314，246:293，258:305，242:289，231:278，263:310，232:279，237:284，255:302，260:307，251:298，233:280，228:275，244:291，250:297，252:299，264:311，272:319，235:282或者238:285。
54.能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆免疫球蛋白或者其片段，其中的互补决定区(CDR1，CDR2和CDR3)来自一个或者更多的权利要求53中的SEQ ID对。
55.包含根据权利要求50的多克隆重组免疫球蛋白作为活性成分的药物组合物，还含有至少一种药物上可以接受的赋形剂。
56.包含能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆抗体作为活性成分的药物组合物，可选地还含有药物上可以接受的赋形剂。
57.根据权利要求55或者56的药物组合物，用作药物。
58.预防或者治疗处于破伤风风险的患者的方法，向有此需要的患者给服包含能够与破伤风毒素反应或者与其结合的重组多克隆抗体的组合物。
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