JP2014527825A

JP2014527825A - ＴａｑＭａｎプローブと組み合わせたマルチプレックスＰＣＲにより単一の抗体産生細胞からＦａｂ断片を得るための方法

Info

Publication number: JP2014527825A
Application number: JP2014531226A
Authority: JP
Inventors: ハンス‐ヴィリクレル; アレキサンダーリフケ; ヴァレリアリフケ; カイラートマディン; クリスティアンヴァイルケ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-09-21
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2014-10-23
Also published as: RU2014113678A; CN103814047A; HK1198169A1; WO2013041617A1; CA2844838A1; KR20140064857A; EP2758428A1; BR112014004566A2; MX2014003326A; US20150024434A1

Abstract

単一細胞から同族のIgG重鎖および軽鎖をコードする核酸（ヒトIgGアイソタイプ）を増幅および定量するための、マルチプレックスワンチューブリアルタイム逆転写遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応の方法が、本明細書において報告される。

Description

マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とPCR産物の迅速なスクリーニングを可能にするためのTaqManプローブとの組み合わせにより単一の抗体産生細胞から抗体を得るための方法が、本明細書において報告される。それぞれの抗体のFab断片を、インビトロ翻訳により得ることができ、Fab断片の結合特性を決定することができる。

発明の背景
ハイブリドーマ技術の確立以来（Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985)（非特許文献1）；およびBoerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95（非特許文献2））、モノクローナル免疫グロブリンは、科学研究、人の健康管理、および診断法において中心的な役割を果たすようになっている。したがって、モノクローナル免疫グロブリン、特に治療用の免疫グロブリンの生成は、集中的な研究が行われる分野である。この点において、ハイブリドーマ技術およびファージディスプレイ技術（Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388（非特許文献3）；Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597（非特許文献4））は、中でも、モノクローナル免疫グロブリンの生成のために一般に用いられる2つの技術である。ハイブリドーマ技術においては、安定なクローンを得ることが困難であり、したがって、限られた数のB細胞のみが、融合、増殖、およびその後の特徴づけに成功するため、抗体の多様性が減少する。同様に、ファージまたは酵母ディスプレイベースのコンビナトリアルライブラリーアプローチの欠点は、免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな対合である。本来の重鎖および軽鎖の対合の解離、ならびに同族でない対合により、高親和性の重鎖および軽鎖の対を同定するために、多数の免疫グロブリン産生細胞のスクリーニングが必要となる。さらに、そのような同族でない対は、ヒト抗原に対して望ましくない交差反応性を示す可能性がある。最後に、コンビナトリアルライブラリーの選択およびスクリーニングにより同定された標的特異的免疫グロブリンの遺伝的多様性は、一般に、固有の選択バイアスのために限定される。

免疫グロブリン産生細胞からの免疫グロブリンの生成は、当技術分野において公知である方法に従って行うことができる。そのような方法は、例えば、ハイブリドーマ技術である。他の方法は、免疫グロブリンの核酸配列の同定に基づく。通常、可変領域の配列を同定することで十分であり、または、CDR領域のみもしくはCDR3領域のみでさえ十分である。例えば、mRNAを、免疫グロブリン産生細胞のプールから単離し、免疫グロブリンのCDR領域をコードするcDNAライブラリーの構築のために用いる。次いで、このcDNAライブラリーを、NS0またはCHOなどの適当な宿主細胞中にトランスフェクトし、特異的な免疫グロブリンの産生についてスクリーニングする。

国際公開公報第2008/104184号（特許文献1）は、同族の抗体をクローニングする方法を報告している。単一のヒトB細胞からのモノクローナル抗体の効率的な生成についてが、Tillerら（Tiller, T., et al., J. Immunol. Meth. 329 (2007) 112-124（非特許文献5））により報告されている。Braeuningerら（Braeuninger, A., et al., Blood 93 (1999) 2679-2687（非特許文献6））は、T細胞に富むB細胞リンパ腫由来の単一のB細胞の分子解析を報告している。ネステッド（RT-）PCRプライマーの系統的な設計および試験が、Rohatgiら（Rohatgi, S., et al, J. Immunol. Meth. 339 (2008) 205-219（非特許文献7））により報告されている。国際公開公報第02/13862号（特許文献2）において、B細胞媒介性病態を改変するための方法および組成物が報告されている。Haurumら（Meijer, P.J. and Haurum, J.S., J. Mol. Biol. 358 (2006) 764-772（非特許文献8））は、一段階RTマルチプレックスオーバーラップ伸長PCRを報告している。StollarらおよびJunghansらは、単一細胞PCR反応による配列解析を報告している（Wang, X. and Stollar, B.D., J. Immunol. Meth. 244 (2000) 217-225（非特許文献9）；Coronella, J.A. and Junghans, R.P., Nucl. Acids Res. 28 (2000) E85（非特許文献10））。Jiang, X.およびNakano, H.ら（Biotechnol. Prog. 22 (2006) 979-988（非特許文献11））は、インビトロ転写および翻訳のための直鎖発現エレメントの構築を報告している。

国際公開公報第2008/104184号国際公開公報第02/13862号

Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95 Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388 Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597 Tiller, T., et al., J. Immunol. Meth. 329 (2007) 112-124 Braeuninger, A., et al., Blood 93 (1999) 2679-2687 Rohatgi, S., et al, J. Immunol. Meth. 339 (2008) 205-219 Meijer, P.J. and Haurum, J.S., J. Mol. Biol. 358 (2006) 764-772 Wang, X. and Stollar, B.D., J. Immunol. Meth. 244 (2000) 217-225 Coronella, J.A. and Junghans, R.P., Nucl. Acids Res. 28 (2000) E85 Jiang, X. and Nakano, H., et al., Biotechnol. Prog. 22 (2006) 979-988

マルチプレックスワンチューブリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応において、逆転写および遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応に必要とされるプライマーとリアルタイム定量に必要とされるプローブとを組み合わせることにより、同族のVHおよびVLをコードする核酸を得るために一般的に用いられる多段階アプローチを（例えば、より迅速かつロバストであるように）改善できることが見出された。

1つの局面として、以下の段階を含む、単一のB細胞または形質芽球または形質細胞から、同族のIgG重鎖および軽鎖をコードする核酸（ヒトIgGアイソタイプ）を増幅および定量するための、マルチプレックスワンチューブリアルタイム逆転写遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応の方法が、本明細書において報告される：
‐第1および第2の5'プライマーならびに第1および第2の3'プライマーならびに第1および第2のTaqManプローブを用いて、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応を一段階で行う段階。

1つの態様において、第1の5'プライマーは、重鎖リーダーペプチドまたは第1の重鎖フレームワーク領域をコードする核酸配列に相補的である。1つの態様において、第2の5'プライマーは、軽鎖リーダーペプチドまたは第1の軽鎖フレームワーク領域をコードする核酸配列に相補的である。1つの態様において、第1の3'プライマーは、重鎖CH1ドメインのC末端アミノ酸残基をコードする核酸配列に相補的である。1つの態様において、第2の3'プライマーは、軽鎖定常ドメインのC末端アミノ酸残基をコードする核酸配列に相補的である。1つの態様において、第1のTaqManプローブは、重鎖CH1ドメインのN末端アミノ酸残基をコードする核酸に相補的である。1つの態様において、第2のTaqManプローブは、軽鎖定常ドメインのN末端アミノ酸残基をコードする核酸に相補的である。

1つの局面として、ヒト免疫グロブリンG断片をコードする核酸のインビトロ翻訳を含む、モノクローナル抗体を得るための方法もまた、本明細書において報告され、ここで該核酸は、本明細書において報告されるような、同族のIgG重鎖および軽鎖をコードする核酸を増幅および定量するためのマルチプレックスワンチューブリアルタイム逆転写遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応の方法を用いて、単一の免疫グロブリン産生性のヒトB細胞、形質芽球、もしくは形質細胞、またはヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む動物のB細胞のmRNAから得られたcDNA断片の特異的増幅により得られる。

1つの局面において、Fab PCR産物は続いて、大腸菌（E.coli）溶解物を使用してインビトロで、mRNAへと転写され翻訳される。

本明細書において報告される方法により、提供される多数のB細胞を、それらの産生される免疫グロブリンの抗原結合特性に関して特徴づけることが可能である。したがって、免疫グロブリンの多様性の消失が生じない。解析されるB細胞は、インビボでの成熟過程後に得られる成熟B細胞であるため、それらの産生される免疫グロブリンが他の抗原と交差反応性を示す可能性は非常に低い。

さらなる態様において、本明細書において報告される方法は、プライマーが、5'プライマーに関しては翻訳開始コドンATGをコードするオーバーハング、および／または3'プライマーに関しては翻訳停止コドンTTAをコードするオーバーハングを提供することを特徴とする。またさらなる態様において、本明細書において報告される方法は、以下の追加の段階を含むことを特徴とする：
‐単一細胞を提供し、この細胞のmRNAを得る段階。

本明細書において報告されるさらなる局面は、以下の段階を含む、免疫グロブリンFab断片を産生するための方法である：
‐単一の免疫グロブリン産生細胞を提供する段階、
‐本明細書において報告されるような、同族のIgG重鎖および軽鎖をコードする核酸を増幅および定量するためのマルチプレックスワンチューブリアルタイム逆転写遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応により、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードし、任意で軽鎖定常ドメインの一部および重鎖C_H1ドメインの一部もコードする核酸を、該細胞から得る段階、
‐得られた核酸を含む直鎖発現マトリクスを生成する段階、
‐インビトロで該核酸を翻訳し、それにより免疫グロブリンFab断片を産生する段階。

本明細書において報告される別の局面は、以下の段階を含む、免疫グロブリンを産生するための方法である：
‐単一の免疫グロブリン産生細胞を提供する段階、
‐本明細書において報告されるような、同族のIgG重鎖および軽鎖をコードする核酸を増幅および定量するためのマルチプレックスワンチューブリアルタイム逆転写遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応により、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードする核酸を、該細胞から得る段階、
‐前段階において得られた核酸の各々を、それぞれの免疫グロブリン軽鎖または重鎖の定常ドメインのうちのコードされていないC末端定常ドメインアミノ酸残基をコードする核酸と、機能的に連結する段階、
‐前段階において得られた核酸を、真核細胞または原核細胞にトランスフェクトする段階、
‐1つの態様において免疫グロブリンの発現に適した条件の下で、トランスフェクトされた細胞を培養する段階、
‐免疫グロブリンを該細胞または該培養培地から回収し、それにより免疫グロブリンを産生する段階。

本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、免疫グロブリンは、クラスGの免疫グロブリン（IgG）である。

本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、各々のプライマーは、SEQ ID NO: 05、SEQ ID NO: 06、SEQ ID NO: 07、SEQ ID NO: 08、SEQ ID NO: 09、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12を含む群から互いに独立して選択される。

本明細書において報告されるすべての方法の1つの態様において、ポリメラーゼ連鎖反応は、SEQ ID NO: 05、SEQ ID NO: 06、SEQ ID NO: 07、SEQ ID NO: 08、SEQ ID NO: 09、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12を含む群から互いに独立して選択されるプライマーの対を用いて行われる。

ヒト免疫グロブリンG重鎖遺伝子座（A）、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（B）、およびヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座（C）の染色体上の局在。

発明の説明
1つの局面として、以下の段階を含む、単一のB細胞または形質芽球または形質細胞から、同族のIgG重鎖および軽鎖をコードする核酸（ヒトIgGアイソタイプ）を増幅および定量するための、マルチプレックスワンチューブリアルタイム逆転写遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応の方法が、本明細書において報告される：
‐第1および第2の5'プライマーならびに第1および第2の3'プライマーならびに第1および第2のTaqManプローブを用いて、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応を一段階で行う段階。

そのようなアプローチは、特定の欠点を有する現在用いられる二段階の方法を改善するための、他の可能性のある手段として、特に有用である。例えば、感度を増大させるための高いプライマー濃度は、プライマー間の二量体形成を誘導する可能性があるためおよび／または非特異的結合を誘導するために適さず、あるいは、増幅サイクル数を増加させることは、非特異的配列の増幅を生じ得る。

ヒト汎B細胞マーカーであるCD19でコーティングした磁気マイクロビーズを使用することにより（例えば、Bertrand, F.E., III, et al., Blood 90 (1997) 736-744を参照されたい）、B細胞を末梢血から単離することができる。限界希釈アプローチにより、単一細胞を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に置くことができる。これらの細胞のmRNAを抽出することができる。

本明細書において報告される方法において、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応を、ワンチューブポリメラーゼ連鎖反応において重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする核酸を同時に増幅するために用いる。重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインの別個の反応における増幅とは対照的に、このアプローチは、感度の増大および増幅される配列の量の増大を提供する。ポリメラーゼ連鎖反応における遺伝子特異的プライマーの使用は、前記方法の特異性および精度を向上させる。

ヒトIgGの場合のより複雑な遺伝子構造は、必要とされる感度および精度のためにプライマー設計、配置、およびポリメラーゼ連鎖反応について異なる戦略を必要とする。

したがって、増幅される重鎖および軽鎖をコードする領域の連関無しでまたは有りで実行され得るマルチプレックスリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応が、本明細書において報告される。得られた核酸のインビトロ翻訳については、コードされるドメインが、鎖間ジスルフィド結合の形成に適したシステイン残基を含むことが有益である。

本発明を実行するために有用である、当業者に公知の方法および技術は、例えば、Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I〜III (1997), Wiley and Sons；Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)；Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855；米国特許第5,202,238号および米国特許第5,204,244号において報告されている。

「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる1つまたは複数のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。認識されている免疫グロブリン遺伝子は、異なる定常領域遺伝子および無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。免疫グロブリンは、例えば、Fv、Fab、およびF(ab)₂、ならびに一本鎖（scFv）またはダイアボディ（diabody）を含む様々な形式で存在してもよい。免疫グロブリンは概して、2個のいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および2個のいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む。重鎖および軽鎖ポリペプチドの各々は、結合パートナー、一般的には抗原と相互作用することができる結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般的にポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含有する。重鎖および軽鎖ポリペプチドの各々は、定常領域（一般的にカルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、（i）食細胞などのFcγ受容体（FcγR）を有する細胞への、または（ii）ブランベル（Brambell）受容体としても公知である新生児型Fc受容体（FcRn）を有する細胞への、抗体の結合を媒介する。重鎖の定常領域はまた、成分（C1q）などの古典的補体系の因子を含むいくつかの因子への結合も媒介する。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、さらには、様々なセグメント、すなわち、4個のフレームワーク領域（FR）および3個の超可変領域（CDR）を含む。

「キメラ免疫グロブリン」という用語は、第1の非ヒト種由来の可変ドメイン、すなわち結合領域と、第2の異なる供給源または種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む免疫グロブリン、好ましくはモノクローナル免疫グロブリンを意味する。キメラ免疫グロブリンは、一般的に、組み換えDNA技術により調製される。1つの態様において、キメラ免疫グロブリンは、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはヒツジの可変ドメインとヒト定常領域とを含む。1つの態様において、ヒト重鎖定常領域は、ヒトIgG定常領域である。別の態様において、ヒト軽鎖定常ドメインは、κ軽鎖定常ドメインまたはλ軽鎖定常ドメインである。

免疫グロブリンの「Fc部分」は、抗原への結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を呈する。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMのクラスに分類される。これらのクラスのいくつかは、サブクラス、すなわち、IgGはIgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4に、またはIgAはIgA1およびIgA2に、さらに分類される。免疫グロブリンが属する免疫グロブリンクラスに応じて、免疫グロブリンの重鎖定常領域は、それぞれ、α（IgA）、δ（IgD）、ε（IgE）、γ（IgG）、およびμ（IgM）と呼ばれる。1つの態様において、免疫グロブリンはIgGクラスに属する。「免疫グロブリンのFc部分」とは、当業者に周知の用語であり、免疫グロブリンのパパイン切断に基づいて定義される。1つの態様において、免疫グロブリンは、Fc部分として、ヒトFc部分またはヒト起源に由来するFc部分を含有する。さらなる態様において、Fc部分は、サブクラスIgG4もしくはIgG1のヒト免疫グロブリンのFc部分であるか、または、下記で定義されるFcγ受容体（例えば、FcγRIIIa）の結合および／もしくはC1qの結合が検出できないように修飾されている、サブクラスIgG1、IgG2、もしくはIgG3のヒト免疫グロブリンのFc部分であるかのいずれかである。1つの態様において、Fc部分はヒトFc部分であり、別の態様において、ヒトIgG4もしくはIgG1サブクラスのFc部分、またはヒトIgG1サブクラス由来の変異Fc部分である。さらなる態様において、Fc部分は、変異L234AおよびL235Aを有するヒトIgG1サブクラス由来である。IgG4は低下したFcγ受容体（FcγRIIIa）結合を示すが、他のIgGサブクラスの免疫グロブリンは強い結合を示す。しかしながら、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（Fcの糖の欠失）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434、または／およびHis435は、変更した場合にFcγ受容体の結合の低下も提供する残基である（Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604；Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119；Morgan, A., et al., Immunol. 86 (1995) 319-324；欧州特許第0307434号）。1つの態様において、免疫グロブリンは、IgG4もしくはIgG1サブクラスの、または、IgG1もしくはIgG2サブクラスのFcγ受容体結合に関して、L234、L235、および／もしくはD265に変異を有するか、かつ／または、PVA236変異を含有する。別の態様において、変異は、S228P、L234A、L235A、L235E、および／またはPVA236である（PVA236は、IgG1のアミノ酸233〜236位からのアミノ酸配列ELLG（1文字アミノ酸略号で示される）またはIgG4のEFLGが、PVAに置換されていることを意味する）。さらなる態様において、変異は、IgG4のS228P、ならびにIgG1のL234AおよびL235Aである。1つの態様において、重鎖定常領域は、SEQ ID NO: 01、またはSEQ ID N0: 02、または変異L234AおよびL235Aを有するSEQ ID NO: 01、または変異S228Pを有するSEQ ID NO: 02のアミノ酸配列を有し、かつ軽鎖定常領域は、SEQ ID NO: 03またはSEQ ID NO: 04のアミノ酸配列を有する。

本明細書において用いられる「ヒト免疫グロブリン」という用語は、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に由来する可変および定常領域（ドメイン）を有し、かつこれらの生殖細胞系列の配列と高い配列類似性または同一性を有する免疫グロブリンを意味する。抗体の定常領域は、ヒトIgG1型もしくはIgG4型またはそれらの変異体の定常領域である。そのような領域は、アロタイプであり得、例えば、Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218、およびその中で参照されるデータベースにより記載されている。

本明細書において用いられる「組み換え免疫グロブリン」という用語は、組み換え手段により調製、発現、または作製される免疫グロブリンを意味する。この用語は、大腸菌細胞、NS0細胞、BHK細胞、またはCHO細胞などの宿主細胞から単離された免疫グロブリンを含む。本発明による「組み換えヒト免疫グロブリン」は、1つの態様において、再編成された形態で可変および定常領域を有する。組み換えヒト免疫グロブリンは、インビボで体細胞超変異に供されている。したがって、組み換えヒト免疫グロブリンのVHおよびVL領域のアミノ酸配列は、規定のヒト生殖細胞系列のVHおよびVL配列に対応づけることはできるが、インビボのヒト抗体生殖細胞系列レパートリー内に天然には存在しないであろう配列である。

「モノクローナル免疫グロブリン」という用語は、実質的に均質な免疫グロブリンの集団から得られた免疫グロブリンを意味し、すなわち、集団の中の個々の免疫グロブリンは、少量で存在し得る天然で生じる変異を除いて同一である。モノクローナル免疫グロブリンは、単一の抗原部位に対して、高度に特異的である。さらに、様々な抗原部位（決定基またはエピトープ）に対する様々な免疫グロブリンを含むポリクローナル免疫グロブリン調製物と対照的に、各モノクローナル免疫グロブリンは、単一の抗原部位に対する。モノクローナル免疫グロブリンは、それらの特異性に加えて、他の免疫グロブリンが混入することなく合成され得るという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、免疫グロブリンの実質的に均質な集団から得られるような免疫グロブリンの特徴を示し、任意の特定の方法による免疫グロブリンの産生を必要とするように解釈されるべきではない。

本明細書において用いられる「可変ドメイン」（軽鎖の可変ドメイン（V_L）、重鎖の可変ドメイン（V_H））という用語は、標的抗原の結合に直接関与する、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖の対のうちの個々のドメインの各々を意味する。可変ドメインは一般的に、軽鎖および重鎖のN末端ドメインである。軽鎖および重鎖の可変ドメインは同じ一般構造を有し、すなわち、「免疫グロブリンフレームワーク」を保有し、各ドメインは4個の「フレームワーク領域」（FR）を含み、その配列は広く保存され、3個の「超可変領域」（または「相補性決定領域」、CDR）により連結されている。本出願内で互換的に用いられる「相補性決定領域」（CDR）または「超可変領域」（HVR）という用語は、抗原結合に主に関与する、抗体のアミノ酸残基を意味する。「フレームワーク」領域（FR）は、超可変領域以外の可変ドメイン領域である。したがって、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖可変ドメインは、N末端からC末端へと、領域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、およびFR4を含む。CDRおよびFRのアミノ酸残基は、Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)の標準定義にしたがって決定される。

本出願内で用いられる「アミノ酸」という用語は、核酸により直接または前駆体の形態でコードされ得る、カルボキシα-アミノ酸の群を意味する。個々のアミノ酸は、3個のヌクレオチドからなる核酸、いわゆるコドンまたは塩基トリプレットによりコードされる。各アミノ酸は、少なくとも1個のコドンによりコードされる。異なるコドンにより同じアミノ酸がコードされることは、「遺伝暗号の縮重」として公知である。本出願内で用いられる「アミノ酸」という用語は、天然に存在するカルボキシα-アミノ酸を意味し、アラニン（3文字略号：ala、1文字略号：A）、アルギニン（arg、R）、アスパラギン（asn、N）、アスパラギン酸（asp、D）、システイン（cys、C）、グルタミン（gln、Q）、グルタミン酸（glu、E）、グリシン（gly、G）、ヒスチジン（his、H）、イソロイシン（ile、I）、ロイシン（leu、L）、リジン（lys、K）、メチオニン（met、M）、フェニルアラニン（phe、F）、プロリン（pro、P）、セリン（ser、S）、スレオニン（thr、T）、トリプトファン（trp、W）、チロシン（tyr、Y）、およびバリン（val、V）を含む。

それらの用語が本出願内で互換的に用いられる、「核酸」または「核酸配列」は、個々のヌクレオチド（塩基とも呼ばれる）「a」、「c」、「g」、および「t」（またはRNAにおいては「u」）からなるポリマー分子、すなわち、DNA、RNA、またはそれらの修飾物を指す。このポリヌクレオチド分子は、天然に存在するポリヌクレオチド分子、または合成ポリヌクレオチド分子、または1つもしくは複数の天然に存在するポリヌクレオチド分子と1つもしくは複数の合成ポリヌクレオチド分子との組み合わせであり得る。この定義により、1つまたは複数のヌクレオチドが（例えば、変異誘発により）変更された、欠失された、または付加された、天然に存在するポリヌクレオチド分子も包含される。核酸は、単離されているか、または、別の核酸中、例えば、発現カセット、プラスミド、もしくは宿主細胞の染色体中に組み込まれているかのいずれかであり得る。核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列により特徴づけられる。

当業者にとって、アミノ酸配列、例えばポリペプチドのアミノ酸配列を、このアミノ酸配列をコードする対応する核酸配列に変換する手順および方法は、周知である。したがって、核酸は、個々のヌクレオチドからなるその核酸配列により特徴づけられ、同様に、それによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列により特徴づけられる。

モノクローナル免疫グロブリンをコードする核酸は、ワンチューブリアルタイム逆転写遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を含む本明細書において報告される方法を用いて、単一細胞から得ることができる。さらに、本明細書において報告されるPCR法とインビトロ翻訳との組み合わせを用いて、モノクローナル免疫グロブリンをコードする核酸を単一細胞から得ることができ、コードされる免疫グロブリンを、免疫グロブリンの結合特性の特徴づけに十分な量で、少なくともFab断片として提供することができる。単一細胞から得られる非常に少ない量のmRNAを増幅するために、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は非常に感度が高くなければならない。

したがって、単一細胞からの、IgGアイソタイプ免疫グロブリンの同族のIgG HC（免疫グロブリンG重鎖）およびIgG LC（免疫グロブリンG軽鎖）をコードする核酸の増幅と、それに続く、得られた増幅された核酸のインビトロ翻訳に基づいて、Fab断片または完全な免疫グロブリンを提供することができる。本方法により、単一細胞により産生される免疫グロブリンに関する情報を取得するための高感度の方法が提供される。これは、単一細胞の微量のmRNAからでさえ可能である。本発明による方法は、単一細胞により発現される免疫グロブリンの結合特性の生化学的な特徴づけを可能にする。したがって、本方法を用いて、ハイブリドーマ技術とは対照的に、より高度な多様性の特徴づけを達成することができる。さらに、同族の免疫グロブリン鎖を、例えば、抗原接触後の成熟B細胞から得ることができるため、高い特異性がありかつ正確に会合する免疫グロブリンをコードする核酸を選択的に得ることができる。

単一細胞から免疫グロブリンFab断片をコードする核酸を得るための、本明細書において報告される方法は、単一のB細胞から同族のIgG HCおよびIgG LCをコードする核酸（ヒトIgGアイソタイプ）を増幅するための、ワンチューブリアルタイムマルチプレックスセミネステッドPCRを含む。その後、Fab断片を、大腸菌細胞溶解物を用いてインビトロで翻訳することができる。この発現は、ELISAおよびウェスタンブロット法を用いて確認することができる。

概して、本明細書において報告される方法は、以下の一般的な段階を含む：
（i）ヒトCD19でコーティングされた磁気マイクロビーズを用いて、末梢血からB細胞を単離する段階、
（ii）例えば、限界希釈またはFACSにより、単一細胞を配置する段階、
（iii）個別化されたB細胞のmRNAを抽出する段階、
（iv）個別化されたB細胞により産生される免疫グロブリンの少なくとも可変ドメイン（VHおよびVL）をコードする、1つまたは複数の核酸を得る段階、
（v）インビトロでRNA鋳型を翻訳する段階、ならびに、
（vi）任意で、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片の結合特性を特徴づける段階。

本明細書において報告されるPCRベースのアプローチは、高感度であり、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖またはそれらの断片をコードする増幅された核酸の高度な回収をもたらす。本明細書において報告されるPCRベースの方法で得られた核酸のインビトロ翻訳の後の、機能的かつ安定なFab断片の発現のための方法もまた提供される。

互換的に用いることができる「ポリメラーゼ連鎖反応」および「PCR」という用語は、核酸の、例えばDNAまたはRNAの領域を特異的に増幅する方法を意味する。この方法は、K. Mullisにより開発された（例えば、Winkler, M.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 2181-2185を参照されたい）。前記領域は、単一の遺伝子、遺伝子の一部、コード配列、または非コード配列であり得る。ほとんどのPCR法は、典型的に、数百塩基対（bp）のDNA断片を増幅するが、いくつかの技術は、サイズが40キロ塩基対（kb）までの断片の増幅を可能にする。基本的なPCR機構は、いくつかの成分および試薬を必要とする。これらの成分は、増幅する領域を含有する核酸鋳型、増幅する領域の5'端および3'端に相補的な2種のプライマー、Taqポリメラーゼまたは別の耐熱性ポリメラーゼなどのポリメラーゼ、ポリメラーゼがそれらから新たな鎖を合成するデオキシヌクレオチド三リン酸（dNTP）、ポリメラーゼの最適な活性および安定性に適した化学的環境を提供する緩衝溶液、二価の陽イオン、一般的にはMg²⁺、ならびに最後に、カリウムイオンなどの一価の陽イオンを含む。

互換的に用いることができる「マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応」または「マルチプレックスPCR」という用語は、異なるDNA配列に特異的な種々のサイズの単位複製配列を産生するために、単一のPCR反応／混合物において複数の特有のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を意味する。複数の遺伝子を一度に標的とすることによって、そうでなければ、数倍の試薬およびより多くの実行時間を必要とするであろう追加的な情報を、単一の試験ランから取得することができる。各プライマーセットについてのアニーリング温度を、単一反応内で正確に作用するように最適化しなければならない。その上、単位複製配列のサイズは、ゲル電気泳動により可視化した場合に別個のバンドを形成するのに十分なほど異なっているべきである。

ヒトゲノムにおいて、免疫グロブリンをコードする遺伝子を含有する染色体遺伝子座は、染色体2、14、および22上に位置する（図1を参照されたい）。ヒト免疫グロブリンG重鎖遺伝子座は、染色体14（14q32.2）上に、テロメア‐5'端-V_H-D-J_H-C_H-3'端‐動原体という、遺伝子座内の染色体方向で見出すことができる。染色体上のV_Hセグメントは、以下の表1に示されるように分類される。

（表１）Matsuda, F., et al., J. Exp. Med. 188 (1998) 2151-2162およびTomlinson, I.M., et al., V Base sequence directory 1999にしたがうV_H遺伝子のV_Hファミリーへの分類

ヒト免疫グロブリンG重鎖遺伝子座は、全体で123〜129個のV_H遺伝子（そのうち51個が機能的である）、7個のファミリーに分類される23個の機能的なD遺伝子（D＝多様性）、6個の機能的なJ_H遺伝子（J＝連結）、および最も頻繁なハプロタイプにおいて9個の機能的なC_H遺伝子（C＝定常）を含む。

カッパ（κ）型およびラムダ（λ）型のヒト免疫グロブリンG軽鎖についての遺伝子座は、2本の異なる染色体、染色体2および22上に位置する。κ軽鎖遺伝子座は、染色体2の短腕（2p11.2）上に見出すことができ、40個の機能的なV_κ遺伝子セグメントを含む。これらは、7個のファミリーに分類される。前記遺伝子座はまた、5個のJ_κ遺伝子および単一のC_κ遺伝子を含む（Schable, K.F. and Zachau, H.G., Biol. Chem. Hoppe Seyler 374 (1993) 1001-1022；Lefranc, M,P., Exp. Clin. Immunogenet. 18 (2001) 161-174）。

（表２）Foster, S.J., et al., J. Clin. Invest. 99 (1997) 1614-1627にしたがうV_κ遺伝子のV_κファミリーへの分類

λ軽鎖遺伝子座は、染色体22の長腕（22p11.2）上に見出すことができ、73〜74個のV_λ遺伝子を含み、そのうち30個が機能的である。これらは、3個のクラスターにさらに分類される10個のファミリーに分類される。前記遺伝子座はまた、7個のJ_κ遺伝子を含み、そのうち5個が機能的である。

（表３）Frippiat, J.P., et al., Hum. Mol. Genet. 4 (1995) 983-991；Farner, N.L., et al., J. Immunol. 162 (1999) 2137-2145；Lefranc, M.P., Exp. Clin. Immunogenet. 18 (2001) 242-254にしたがうV_λ遺伝子のV_λファミリーへの分類

単一の免疫グロブリン産生細胞、例えば単一のB細胞からの、IgG HCおよびLCまたは少なくともそれらの可変ドメインをコードする核酸のPCRベースの増幅は、Bリンパ球の単一細胞の配置、その後の、重鎖および軽鎖の可変ドメインに対する特異的プライマーを用いたPCRベースの核酸増幅に基づく。PCRの結果は、使用するPCRプライマーに本質的に依存している。最善の状態では、使用するプライマーは、すべてのV遺伝子をカバーするべきであり、二量体を形成する傾向はないべきであり、免疫グロブリンをコードするcDNAに特異的に結合するべきである。したがって、1つの態様において、免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸は、cDNAから得られる。

ヒト免疫グロブリンG遺伝子座上の多数の機能的な遺伝子のため、できるだけ多くの公知の遺伝子をカバーするためにPCR反応において様々なプライマーを使用することが必要である。したがって、縮重プライマーのセットが確立され、これも本発明の1つの局面である。1つの態様において、重鎖および軽鎖をコードする核酸の増幅は、1つのポリメラーゼ連鎖反応において行われる。本態様において、プライマーは、同じPCR条件を可能にするためにほぼ同じ長さの核酸の増幅を提供するように、選択される。本態様において、重鎖をコードする核酸に対するプライマーが使用され、そのうちの1種は、重鎖C_H1領域中に結合し、したがって、軽鎖をコードする対応する核酸のサイズに匹敵するサイズの核酸断片を提供する。

本明細書において報告される方法において、軽鎖可変ドメインをコードする核酸および重鎖可変ドメインをコードする核酸は、単一のマルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応における異なる5'プライマーおよび3'プライマーの組み合わせにより、単一のポリメラーゼ連鎖反応において得られる。

本発明の別の局面は、以下の段階を含む、単一細胞から少なくとも免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得るための方法である：
‐2種の5'プライマーおよび2種の3'プライマーを含むプライマーのセットならびに2種のTaqManプローブを用いて、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応を一段階で行う段階。

本方法の1つの態様において、マルチプレックスリアルタイムワンチューブ逆転写遺伝子特異的プライマーポリメラーゼ連鎖反応において使用される5'プライマーは、免疫グロブリンの第1のフレームワーク領域についてのコード領域中に結合する。別の態様において、PCR反応において使用されるプライマーは、5'プライマーに関しては翻訳開始コドンATGをコードするオーバーハング、および／または3'プライマーに関しては翻訳停止コドンTTAをコードするオーバーハングを提供する。このオーバーハングは、得られた核酸のインビトロ翻訳のための核酸を生成するための、任意のその後のオーバーラップポリメラーゼ連鎖反応において有用であり得る。1つの態様において、本方法は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを得るためである。1つの態様において、免疫グロブリン可変ドメインは、免疫グロブリン重鎖可変ドメインまたは免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインまたは免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインである。

1つの態様において、免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るためにマルチプレックスワンチューブリアルタイムPCRにおいて使用されるプライマーは、SEQ ID NO: 05および06の核酸配列を有する。

（表４）免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードする核酸を得るためにマルチプレックスリアルタイムPCR反応において使用されるプライマー

本発明による方法の1つの態様において、免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るためにマルチプレックスワンチューブリアルタイムPCRにおいて使用されるプライマーは、SEQ ID NO: 07および08の核酸配列を有する。

（表５）免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインをコードする核酸を得るためにマルチプレックスワンチューブリアルタイムPCRにおいて使用されるプライマー

本発明による方法の1つの態様において、PCRの結果を定量するためにマルチプレックスワンチューブリアルタイムPCRにおいて使用されるTaqManプローブは、SEQ ID NO: 09および10の核酸配列を有する。

（表６）免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を得るためにマルチプレックスワンチューブリアルタイムPCRにおいて使用されるTaqManプローブ

本明細書において報告されるPCR法と無細胞インビトロ翻訳システムとの組み合わせにより、同族の免疫グロブリンVHおよびVLドメインをコードする核酸を、免疫グロブリンの結合特性の特徴づけに十分な量でFab断片として得ることができる。単一細胞から得られる非常に少ない量のmRNAを増幅するために、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）は非常に感度が高くなければならない。

「無細胞インビトロ翻訳システム」という用語は、リボソーム、tRNA、ATP、CGTP、ヌクレオチド、およびアミノ酸を含有する、原核細胞または真核細胞の、好ましくは原核細胞の無細胞溶解物を意味する。1つの態様において、原核生物は大腸菌である。

無細胞インビトロ翻訳は、長い間、当技術分野の最先端技術において公知の方法である。Spirinらは、1988年に、比較的多量のタンパク質合成が起きる連続流無細胞（CFCF）翻訳システムおよび一体化させた転写／翻訳システムを開発した（Spirin, A.S., et al., Science 242 (1988) 1162-1164）。そのような無細胞インビトロ翻訳については、リボソームを含有する細胞溶解物が、翻訳または転写／翻訳のために用いられた。そのような大腸菌由来の無細胞抽出物は、例えば、Zubay（Zubay, G., et al., Ann. Rev. Genetics 7 (1973) 267-287）により開発され、Pratt（Pratt, J.M., et al., Nucleic Acids Research 9 (1981) 4459-4474；およびPratt, J.M., et al., Transcription and Translation: A Practical Approach, Hames and Higgins (eds.), 179-209, IRL Press (1984)）により用いられた。無細胞タンパク質合成のさらなる開発は、米国特許第5,478,730号、米国特許第5,571,690号、欧州特許第0 932 664号、国際公開公報第99/50436号、国際公開公報第00/58493号、および国際公開公報第00/55353号において報告されている。真核生物無細胞発現システムは、例えば、Skup、D. and Millward, S., Nucleic Acids Research 4 (1977) 3581-3587；Fresno, M., et al., Eur. J. Biochem. 68 (1976) 355-364；Pelham, H.R. and Jackson, R.J., Eur. J. Biochem. 67 (1976) 247-256により、および国際公開公報第98/31827号において報告されている。

単一細胞からの、IgGアイソタイプ免疫グロブリンの核酸をコードする、同族のIgG HC（免疫グロブリンG重鎖）およびIgG LC（免疫グロブリンG軽鎖）をコードする核酸の増幅、ならびにそれに続く得られた核酸のインビトロ翻訳に基づいて、免疫グロブリンのFab断片を得ることができ、かつ、単一細胞により産生される免疫グロブリンに関する情報を、得ることができる微量のmRNAから取得するための高感度の方法を提供することができる。本明細書において報告される方法は、単一のB細胞の免疫グロブリンの特徴づけを可能にし、したがって、ハイブリドーマ技術とは対照的に、より高度な多様性を提供する。さらに、同族の免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン鎖を、抗原接触後の成熟B細胞から得ることができるため、高い特異性がありかつ正確に会合する免疫グロブリンをコードする核酸を選択的に得ることができる。

したがって、本発明の1つの局面は、以下の段階を含む、免疫グロブリンFab断片を産生するための方法である：
‐単一の免疫グロブリン産生細胞を提供する段階、
‐本明細書において報告されるワンチューブリアルタイムマルチプレックス逆転写PCRにより、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードし、任意で軽鎖定常ドメインの一部および重鎖C_H1ドメインの一部もコードする核酸を、該細胞から得る段階、
‐任意で、得られた核酸を含む直鎖発現マトリクスを生成する段階、
‐インビトロで該核酸を翻訳し、それにより免疫グロブリンFab断片を産生する段階。

1つの態様において、翻訳する段階は、前記核酸をインビトロで大腸菌細胞溶解物と共にインキュベートする段階による。

本発明にしたがう方法により単一細胞から得られた可変ドメインを含む免疫グロブリンの組み換え体の産生のために、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードする得られた核酸を、さらに修飾することができる。例えば、可変ドメインをコードする核酸を、免疫グロブリン定常領域またはその断片をコードする核酸と組み合わせることができる。1つの態様において、軽鎖可変ドメインをコードする核酸を、SEQ ID NO: 03のヒトκ軽鎖定常ドメインをコードする核酸と、またはSEQ ID NO: 04のヒトλ軽鎖可変ドメインをコードする核酸と組み合わせる。別の態様において、重鎖可変ドメインをコードする核酸を、SEQ ID NO: 01のヒト免疫グロブリンG1（IgG1）定常領域をコードする核酸と、またはSEQ ID NO: 02のヒト免疫グロブリンG4（IgG4）定常領域をコードする核酸と組み合わせる。

完全な免疫グロブリン重鎖および軽鎖またはそれらの断片をコードする核酸分子は、以下で構造遺伝子と呼ばれる。それらは同じ発現プラスミド上に配置させることができ、または、異なる発現プラスミド上に配置させることができる。完全な免疫グロブリンまたはFab断片の会合は、培養培地への免疫グロブリンの分泌の前に発現細胞の内部で起こる。したがって、免疫グロブリン鎖をコードする核酸分子は、1つの態様において同じ宿主細胞中で発現される。組み換え体発現後に免疫グロブリンの混合物が得られる場合、当業者に公知である方法によりこれらを分離および精製することができる。これらの方法は、免疫グロブリン精製のために十分に確立されており、かつ広範に用いられ、単独でまたは組み合わせて使用される。そのような方法は、例えば、微生物由来のタンパク質を用いるアフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル樹脂）、および混合モード交換クロマトグラフィー）、チオ親和性（thiophilic）吸着クロマトグラフィー（例えば、βメルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いる）、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニルセファロース、アザアレノフィリック（aza-arenophilic）樹脂、またはm-アミノフェニルボロン酸を用いる）、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（例えば、Ni(II)-親和性材料およびCu(II)-親和性材料を用いる）、サイズ排除クロマトグラフィー、ならびに分取用電気泳動法（ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など）である（Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。

「機能的に連結された」とは、2つ以上の構成要素の並置を指し、ここで、そのように記載される構成要素は、それらが意図される様式で機能することを可能にする関係にある。「...を機能的な形態で連結している」という用語は、個々の核酸が最終的な核酸において機能的に連結されているような、2個以上の個々の核酸の組み合わせを意味する。例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサーは、連結された配列の転写を制御または調節するようにシスで作用する場合、コード配列に機能的に連結される。一般的に、しかし必ずではないが、「機能的に連結された」DNA配列は隣接しており、第1のドメインと第2のドメイン、例えば、免疫グロブリン可変ドメインと免疫グロブリン定常ドメインまたは定常領域のような2個のタンパク質コード領域を、隣接して連結しかつ（リーディング）フレームにおいて連結することが必要である。翻訳停止コドンは、翻訳がコード配列を通して停止コドンまで進行し、そこで終結するように、コード配列の下流端（3'端）に位置する場合、エクソンの核酸配列に機能的に連結される。連結は、当技術分野において公知である組み換え法により、例えば、PCR手法を用いておよび／または都合のよい制限酵素部位でのライゲーションにより、達成される。都合のよい制限酵素部位が存在しない場合は、その時は合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーを、従来のやり方にしたがって用いる。

したがって、本発明の1つの局面は、以下の段階を含む、免疫グロブリンを産生するための方法である：
‐単一の免疫グロブリン産生細胞を提供する段階、
‐本明細書において報告される方法を用いて、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードする核酸を、該細胞から得る段階、
‐軽鎖可変ドメインをコードする核酸を、SEQ ID NO: 03またはSEQ ID NO: 04の免疫グロブリン軽鎖定常ドメインをコードする核酸と、機能的な形態で連結する段階、および、重鎖可変ドメインをコードする核酸を、SEQ ID NO: 01またはSEQ ID NO: 02の免疫グロブリン重鎖定常領域をコードする核酸と、機能的な形態で連結する段階、
‐前段階の核酸を、真核細胞または原核細胞にトランスフェクトする段階、
‐免疫グロブリンの発現に適した条件の下で、トランスフェクトさせた細胞を培養する段階、
‐免疫グロブリンを該細胞または該培養培地から回収し、それにより免疫グロブリンを産生する段階。

「の発現に適した条件の下で」という用語は、異種ポリペプチドを発現する能力を有する細胞の培養について用いられ、当業者に公知であるか、または当業者により容易に決定され得る条件を意味する。これらの条件は、培養する細胞のタイプおよび発現するポリペプチドのタイプに応じて変動し得ることが、当業者に公知である。一般に、細胞を、例えば20℃〜40℃の温度で、コンジュゲートの有効な産生を可能にするのに十分な期間、例えば、4日〜28日間、0.01リットル〜10⁷リットルの容量で培養する。

以下の実施例、配列表、および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲において示される。本発明の精神から逸脱することなく、示される手順において修正がなされ得ることが、理解される。

配列表の説明
SEQ ID NO: 01 ヒトIgG1重鎖定常領域
SEQ ID NO: 02 ヒトIgG4重鎖定常領域
SEQ ID NO: 03 ヒトIgGκ軽鎖定常ドメイン
SEQ ID NO: 04 ヒトIgGλ軽鎖定常ドメイン
SEQ ID NO: 05 VHプライマー
SEQ ID NO: 06 VCHプライマー
SEQ ID NO: 07 VLプライマー
SEQ ID NO: 08 VCLプライマー
SEQ ID NO: 09 TaqManプローブ1
SEQ ID NO: 10 TaqManプローブ2
SEQ ID NO: 11 オーバーラップPCR用のプライマー1
SEQ ID NO: 12 オーバーラップPCR用のプライマー2

材料および方法
B細胞および形質細胞：
本アプローチにおいて用いた試料は、健康なドナーの末梢血およびヒトIgGトランスジェニックマウスの組織（脾臓、骨髄）から単離したB細胞および形質細胞である。まず第1に、固体組織を、別々のチューブの中で、DMEM中に手動で分散させる。後の段階においては、穏やかな取扱いと低温とが細胞の溶解を最小限にし、このことは、関心対象の細胞の後のポジティブ単離のため、およびmRNAの供給源を無傷に保つために重要である。様々な細胞タイプの勾配を作製するための細胞分離媒体（Ficoll密度勾配を有するLeucosepチューブ（Greiner Bio-One））を慎重に添加することにより、分散させた組織を懸濁する。形質細胞（PBMC）およびリンパ球を濃縮するために、冷たい分離媒体上で、20分間、800 x g、22℃で遠心分離機においてブレーキ無しで遠心分離することにより、懸濁した細胞を精製する。細胞を冷緩衝液（PBS（リン酸緩衝生理食塩水）、0.1％ (w/v) BSA（ウシ血清アルブミン）、2 mM EDTA（エチレンジアミン四酢酸））中で洗浄し、リンパ球のみを残すように上清を注意深く廃棄する。次いで、リンパ球をPBS中に再懸濁し、注意深いピペッティングにより混合する。遠心分離を5分間、800 x g、22℃で実施し、細胞を沈殿させる。B細胞および形質細胞を、それらの細胞表面上の抗体の非特異的結合をブロックするように、マウスおよびヒトFCブロッカーで前処理する。細胞を緩衝液（PBS、0.1％（w/v）BSA、2 mM EDTA）で1回洗浄し、遠心分離し、PBS中に再懸濁する。CD19+ B細胞およびCD138+ 形質細胞のみを用いた。mRNAの分解を防ぐために、RNA分解酵素阻害剤を添加する。マウス脾臓からのCD19+ B細胞のポジティブ単離（Dynal Biotech Dynabeads CD19 Pan B）は、製造業者の指示書にしたがって実施した。CD138+ 形質細胞の選択（StemCell Technologies EasySep Human CD138 Selection Kit）は、製造業者の指示書にしたがって実施した。

限界希釈培養の原理またはFACS選別による単一細胞への分離：
細胞を計数し、限界希釈培養の原理により、単一細胞として96ウェルPCRプレートまたは384ウェルプレートのウェル中に配置した。プレートをPCRフィルムで密封し、直ちに氷上に置いた。選別した細胞を、直ちにRT-PCR（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）に用いることができ、または、短期間の使用のためには-20℃で、もしくは長期間の使用のためには-80℃で保存することができる。単一細胞選別は、FACSAria細胞選別システム（Becton Dickinson）で行った。CD19について陽性、CD38について高度に陽性、およびCD45について中程度に陽性に染色された細胞を回収し、形質細胞（PC）と呼んだ。前方散乱／側方散乱および側方散乱の幅／側方散乱の高さに対して追加のゲートを含め、生きているリンパ球およびシングレットをそれぞれ選択した。逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、緩衝液、およびdNTPを除くすべての必要なPCR試薬を10μlの容量で含有する、96ウェルPCRプレート（Eppendorf）のウェル中に、単一細胞を直接分配し、後の処理のために-80℃で凍結した。

一段階マルチプレックスリアルタイム逆転写遺伝子特異的PCR：
ポリメラーゼ連鎖反応においてmRNAを増幅することができるように、逆転写酵素、DNAポリメラーゼ、緩衝液、およびdNTPを除くすべての必要なPCR試薬を10μlの容量で含有する、96ウェルPCRプレート（Eppendorf）のウェル中に、B細胞および形質細胞を直接分配し、後の処理のために-80℃で凍結しなければならない。

RT段階：
逆転写およびPCRを、一段階（一段階マルチプレックスRT-PCR）で行った。単離し、選別し、保存した前記細胞を、逆転写またはRT-PCRのための原材料として用いた。すべての必要な試薬を、室温で融解した。すべてのプライマーは、MOLBIOL TIB GmbHの研究所において合成した。プレートおよびすべての他の試薬を、手順全体の間、氷上に維持した。cDNA合成のために、伸長部を有する遺伝子特異的プライマーを直接用いた。酵素複合体は、2種のSensiscript逆転写酵素および1種のOmniscriptポリメラーゼからなる（Qiagen OneStep RT PCR）。mRNAのcDNAへの書き換えは、Sensiscript複合体（Qiagen OneStep RT PCR）により行い、cDNAの増幅は、大腸菌内で発現させたサーマス・アクアチクス（Thermos aquaticus）から元々は単離された、組み換え94 kDa DNAポリメラーゼ（デオキシヌクレオシド三リン酸：DNAデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、EC 2.7.7.7）の化学的形態である、HotStarTaq DNAポリメラーゼ（Qiagen OneStep RT PCR）を用いて行った。前記細胞を96ウェルPCRプレート中に選別し、5μlのPCRグレードH₂O、1μlのVHおよびVL用の0.1μMプライマー、1μlのRNA分解酵素阻害剤20 U／反応、ならびに3μlのトリス1.5 mMを含有する10μlの容量中で保存した。PCR反応を行うための残りの10μlを添加する前に、-60℃で保存した細胞を短時間遠心分離し（1400 rpmで20秒）、ウェルの底面上に液体および細胞を集めた。

（表７）RT-PCRに用いたマスターミックス1

（表８）RT-PCRに用いたマスターミックス2

ウェル当たり10μlのマスターミックス2を、前記細胞に添加した。第2のマスターミックスは、2.2μlのPCRグレードH₂O、4μlの1×緩衝液、0.8μlのdNTP各々400μM、1μlのQ-solution 0.25×、1.2μlの酵素複合体、および1μlのRNA分解酵素阻害剤20Uを含有した。

（表９）RT-PCRに用いたプライマー

（表１０）RT-GSP-PCR用のブロックサイクラープログラム

PCR産物の精製：
次のオーバーラップPCR（第3のPCR）における、インビトロ翻訳のための直鎖鋳型の生成の効率を改善するため、PCR増幅中に用いた、組み込まれなかったプライマー、dNTP、DNAポリメラーゼ、および塩を、下流の適用において干渉するのを回避するために除去することにより、事前に増幅したPCR産物の精製を行った。Agencourt AMPureを用いた。緩衝液を、100 bpおよびそれより大きいPCR単位複製配列を常磁性ビーズに選択的に結合させるように最適化する。過剰なオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、塩、および酵素を、単純な洗浄手順を用いて除去することができる。得られた精製されたPCR産物は、本質的に混入物質を含まず、以下の適用に用いることができる：蛍光DNA塩基配列決定（キャピラリー電気泳動を含む）、マイクロアレイスポッティング、クローニング、およびプライマー伸長遺伝子型決定。96ウェルフォーマット用の作業フローは、沈降している可能性がある任意の磁気粒子を再懸濁するために、緩衝液中に保存されたビーズを穏やかに撹拌する段階から開始した。36μlの正確な容量のビーズ溶液を20μlの試料に添加し、この混合物を10回上下にピペッティングした。次の段階は、10分間インキュベートする段階であり、その後、ビーズを溶液から分離するために、反応プレートを10分間磁性プレート上に置いた。透明な溶液（上清）を反応プレートから吸い取り廃棄した。ビーズ-cDNAの洗浄のために、ウェル当たり200μlの70％エタノールを分散させ、室温で少なくとも30秒間インキュベートした。エタノールを吸い出して廃棄した。洗浄する段階を2回行い、次いで、反応プレートを放置して、20分間室温で風乾した。続いて、40μlの溶出緩衝液を添加し、この混合物を再び10回上下にピペッティングした。磁気ビーズからのcDNAの解離後、精製されたDNAを新たなプレートに移した。

オーバーラップ伸長PCR：
その後、増幅したDNAを、オーバーラップ伸長PCR法により、転写／翻訳段階に必要な以下の構成要素と連結した：リボソーム結合部位（RBS）、T7プロモーター、およびT7ターミネーター配列。このPCRのために、第2のPCRのうちの2μlを取り、以下を含有する20μlの最終容量とした：10.7μlの水、2μlのMgCl₂（10 mM）を含む10×反応緩衝液、0.8μlのDMSO、0.5μlのdNTP（各々10 mM）、1.6μlのT7プロモーターおよびターミネータープライマー（各々6μM）、0.4μlのC末端HAタグプライマー、ならびに0.4μlの酵素ブレンド、すべてRTS E.coli Linear Template Generation Set, HA-Tag（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）から。最後に、オーバーラップPCR産物を、大腸菌溶解物を用いるインビトロ転写のための鋳型として用い、得られた機能的Fabを、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）によりF(ab')₂ IgGに対してスクリーニングした。

（表１１）PCRに用いた成分

（表１２）第3のPCR用のブロックサイクラープログラム

ゲル電気泳動：
ゲル電気泳動解析（1％アガロースゲル、Invitrogen Corp., USA）を、cDNA鋳型の増幅および特異性を評価するために適切な対照を用いて行った。

（表１３）ゲル解析プロトコル

インビトロ転写および翻訳：
インビトロの一体化した転写および翻訳を、報告したような成分を用いて（表12を参照されたい）、製造業者のプロトコルRTS 100 E.coli Disulfide Kit（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）にしたがって実施した。4μlの各オーバーラップPCR産物を、RTS Proteo Master Instrument（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）において全容量50μlで、37℃で20時間、翻訳および転写した。対照反応を、cDNA鋳型無しの同一条件の下で行った。GFP（緑色蛍光タンパク質）ベクターを、オートラジオグラフィーのために陽性対照として反応システムに添加した。インビトロ転写／翻訳後に、50μlの反応混合物を75μlのPBS中に移し（1:2.5希釈）、タンパク質の正確なフォールディングおよび成熟のために4℃で一晩インキュベートした。

（表１４）インビトロ転写および翻訳のための成分

ELISA：
384ウェルプレート（Nunc GmbH & Co. KG, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Germany）を、50μl（PBS中で1:1000）のヤギ抗ヒトIgG Fab断片（Bethyl Laboratories Inc.により産生され、Biomol GmbH, Hamburg, Germanyから入手、1 mg/1 ml）でコーティングし、4℃で一晩インキュベートした。このプレートを3回洗浄溶液（100μl PBST（リン酸緩衝生理食塩水Tween-20））で洗浄し、60μlのブロッキング溶液（0.25％ CroteinC（w/v）／0.5％ Tween（w/v）／PBS）を添加して、1時間室温でインキュベートした。もう1度洗浄段階（3×100μl PBST）を行い、37.5μlの試料、ならびに37.5 mlの陰性対照（前記インビトロ転写／翻訳からの陰性対照）および0.75μlのヒト組み換えFab断片（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を含有する37.5μlの陽性対照を移した。前記試料は、1:3希釈に設定した。前記プレートを、1.5時間、室温でインキュベートした。洗浄段階（3×100μl PBST）後、25μlのヤギ抗ヒトIgG F(ab')₂（Dianova, Hamburg, Germany；0.8 mg/ml（ブロッキング溶液中で1:2000希釈））を添加し、1時間、室温でインキュベートした。最後の洗浄段階（3×100μl PBST）を行い、25μlのTMB（POD基質、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Art-No: 1 484 281）を各ウェル中へピペットで移した。2〜3分後、吸収シグナルを、405 nmおよび495 nmで検出した（Tecan, Safire 2; Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany）。

フローサイトメトリー解析および細胞選別：
FACS解析および細胞選別のために、ビオチン化されているか、またはFITC（フルオレセインイソチオシアナート）、PE（フィコエリトリン）、もしくはAPC（アロフィコシアニン）のいずれかと結合している、以下の抗原に対するモノクローナル抗体を用いた：CD3（UCHT1）、CD4（13B8.2）、CD8（B9.11）、CD40（MAB89）、CD80（MAB104）、CD83（HB15a）、CD86（HA5.2B7）（すべてImunotech/Beckman Coulter, Marseille, Franceから入手可能）、CD19（HIB19）、CD20（2H7）、CD34（581）、IL-3Ra/CD123（9F5）、CD11c（B-ly6）、CD14（M5E2）、CD24、CD22a、CD38、CD138（すべてBD Pharmingen, San Diego, CA, USAから入手可能）、CD45（HI30）、CD45RA（MEM56）、HLA-DR（TU36）（すべてCaltag, Burlingame, CA, USAから入手可能）、TLR2（TL2.1）、TLRR4（HTA125）、TCRab（IP26）（すべてBioscience, San Diego, CAから入手可能）、BDCA-1、BDCA-2、BDCA-4、CD25 (4E3)（すべてMiltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germanyから入手可能）、IgM（Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA）、CCR7（3D12、M. Lipp, Berlin, Germanyより提供されたもの）。Vb解析のために、IOTest Beta Markを用いた（Imunotech/Beckman Coulter）。ストレプトアビジンに結合させたFITC、PE、またはAPC（すべてBD Pharmingen）を、ビオチン化抗体の可視化のために用いた。死細胞は、ヨウ化プロピジウム染色により排除した。適切な、アイソタイプがマッチした無関係の対照モノクローナル抗体を、バックグラウンド染色のレベルを測定するために用いた。細胞を、FACS Caliburを用いて解析し、FACSAriaを用いて選別した（Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA, USA）。

実施例1
リアルタイムワンチューブ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による、免疫化したヒト化マウスの単一B細胞からのIgG遺伝子の増幅

実施例2
インビトロ翻訳のための直鎖鋳型の生成
第1のポリメラーゼ連鎖反応のために、T7ファージの制御DNA領域に必要なオーバーラップ配列を含む遺伝子特異的プライマーを設計した。第2のポリメラーゼ連鎖反応のために、第1のPCRの産物を、制御配列を含む核酸断片およびタグ配列をコードする核酸断片とそれぞれ組み合わせた。3'末端の伸長を、制御エレメントを含む核酸断片とのハイブリダイゼーションにより達成した。この直鎖発現構築物を、2種の末端プライマーを用いてさらに増幅する。これらのプライマーは、以下の配列を含む：

の遺伝子特異的配列（5'プライマー、SEQ ID NO: 11）または

の遺伝子特異的配列（3'プライマー、SEQ ID NO: 12）。

図Xにおいて、レーン1、5、および9は、ブランクの水対照を表す。重鎖核酸は、レーン4、8、および12に含有され、κ軽鎖は、レーン3、7、および11に含有される。レーン2、6、および10は、両鎖の組み合わされた試料を示す。すべての核酸は、期待されたサイズを有する（表38を参照されたい）。

（表１５）直鎖発現構築物のサイズ

実施例3
インビトロ翻訳およびhuFab特異的ELISA
インビトロ翻訳を、上記に概要を述べたように実施する。

図10から見ることができるように、2種の可変のプライマーセットによる二段階ポリメラーゼ連鎖反応で得られた核酸は、コードされるFab免疫グロブリン断片のインビトロ産生を可能にする直鎖発現構築物を提供しない。対照的に、別個の連続するポリメラーゼ連鎖反応において使用する1種の固定されたプライマーのセットおよび1種の可変のプライマーのセットによる二段階ポリメラーゼ連鎖反応は、その後の直鎖発現構築物の提供、ならびに、免疫グロブリンFab断片を含むIgG HCおよびIgG LCのインビトロ翻訳を可能にする。

これと対照的に、1種の固定されたプライマーのセットを含む二段階ポリメラーゼ連鎖反応は、2種の固定されたプライマーのセットを使用するポリメラーゼ連鎖反応のようなマルチプレックスフォーマットにおいて、より効率的である。1種の固定されたプライマーのセットのみを使用することによって、最大5倍のより高い光学濃度を達成することができる。

Claims

以下の段階を含む、単一細胞から同族のIgG重鎖および軽鎖をコードする核酸を増幅および定量するための方法：
‐第1および第2の5'プライマーならびに第1および第2の3'プライマーならびに第1および第2のTaqManプローブを用いて、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応を一段階で行う段階。
（a）第1の5'プライマーが、重鎖リーダーペプチドもしくは第1の重鎖フレームワーク領域をコードする核酸配列に相補的である、および／または
（b）第2の5'プライマーが、軽鎖リーダーペプチドもしくは第1の軽鎖フレームワーク領域をコードする核酸配列に相補的である、および／または
（c）第1の3'プライマーが、重鎖CH1ドメインのC末端アミノ酸残基をコードする核酸配列に相補的である、および／または
（d）第2の3'プライマーが、軽鎖定常ドメインのC末端アミノ酸残基をコードする核酸配列に相補的である、および／または
（e）第1のTaqManプローブが、重鎖CH1ドメインのN末端アミノ酸残基をコードする核酸に相補的である、および／または
（f）第2のTaqManプローブが、軽鎖定常ドメインのN末端アミノ酸残基をコードする核酸に相補的である
ことを特徴とする、請求項1記載の方法。
以下の段階を含む、モノクローナル抗体を得るための方法：
‐免疫グロブリン断片をコードする核酸をインビトロ翻訳する段階であって、該核酸が、請求項1または2のいずれか一項記載の方法を用いて単一の免疫グロブリン産生細胞のmRNAから得られたcDNA断片の特異的増幅により得られる、段階。
以下の段階をさらに含む、請求項3記載の方法：
‐大腸菌（E. coli）細胞溶解物を使用して、インビトロで、前記PCR産物を続いてmRNAへと転写し、該mRNAを翻訳する段階。
プライマーが、5'プライマーに関しては翻訳開始コドンATGをコードするオーバーハング、および／または3'プライマーに関しては翻訳停止コドンTTAをコードするオーバーハングを提供することを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
以下の追加の段階を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法：
‐単一細胞を提供し、この細胞のmRNAを得る段階。
以下の段階を含む、免疫グロブリンFab断片を産生するための方法：
‐単一の免疫グロブリン産生細胞を提供する段階、
‐請求項1または2のいずれか一項記載の、同族のIgG重鎖および軽鎖をコードする核酸を増幅および定量するためのマルチプレックスワンチューブリアルタイム逆転写遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応により、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードし、任意で軽鎖定常ドメインの一部および重鎖C_H1ドメインの一部もコードする核酸を、該細胞から得る段階、
‐得られた核酸を含む直鎖発現マトリクスを生成する段階、
‐インビトロで該核酸を翻訳し、それにより免疫グロブリンFab断片を産生する段階。
以下の段階を含む、免疫グロブリンを産生するための方法：
‐単一の免疫グロブリン産生細胞を提供する段階、
‐請求項1または2のいずれか一項記載の、同族のIgG重鎖および軽鎖をコードする核酸を増幅および定量するためのマルチプレックスワンチューブリアルタイム逆転写遺伝子特異的ポリメラーゼ連鎖反応により、免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードする核酸を、該細胞から得る段階、
‐前段階において得られた核酸の各々を、それぞれの免疫グロブリン軽鎖または重鎖の定常ドメインのうちのコードされていないC末端定常ドメインアミノ酸残基をコードする核酸と、機能的に連結する段階、
‐前段階において得られた核酸を、真核細胞または原核細胞にトランスフェクトする段階、
‐1つの態様において免疫グロブリンの発現に適した条件の下で、トランスフェクトされた細胞を培養する段階、
‐免疫グロブリンを該細胞または該培養培地から回収し、それにより免疫グロブリンを産生する段階。
前記免疫グロブリンがクラスGの免疫グロブリン（IgG）であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
前記単一細胞が、単一のB細胞または単一の形質芽球または単一の形質細胞であることを特徴とする、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
SEQ ID NO: 05、または06、または07、または08、または09、または10の核酸。
SEQ ID NO: 05、06、07、08、09、および10の核酸を含むキット。