CN103814047A - 通过与TaqMan探针组合的多重PCR从单一抗体产生细胞中获得Fab片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本文报道了用于从单细胞中扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸（人IgG同种型）的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应的方法。

Description

通过与TaqMan探针组合的多重PCR从单一抗体产生细胞中获得Fab片段的方法
在本文中报道了通过组合多重聚合酶链式反应（PCR）和TaqMan探针，从单一抗体产生细胞中获得抗体的方法，以允许PCR产物的快速筛选。通过体外翻译，可以获得各个抗体的Fab片段，并且可以测定Fab片段的结合性质。
发明背景
随着杂交瘤技术的建立（Cole,S.P.C.,等人,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；和Boerner,P.,等人,J.Immunol.147(1991)86-95），单克隆免疫球蛋白已经在科学研究、人类保健和诊断学中发挥着关键的作用。因此，单克隆（特别是治疗性）免疫球蛋白的产生是一个进行了大量研究的领域。在这方面，其中杂交瘤技术和噬菌体展示技术（Hoogenboom,H.R.和Winter,G.,J.Mol.Biol.227(1992)381-388；Marks,J.D.,等人,J.Mol.Biol.222(1991)581-597）是用于单克隆免疫球蛋白产生的两种最常见技术。在杂交瘤技术中，稳定克隆的获得是需要克服的障碍，因此，减少抗体的多样性，使得仅有限数量的B细胞可以成功地融合、增殖，以及随后的被表征。相似地，基于噬菌体或酵母展示的组合文库方法的缺点是免疫球蛋白重链和轻链的随机配对。原始重链和轻链对的分离以及非同源配对（non cognate pairing），需要筛选大量免疫球蛋白产生细胞以鉴定高亲和力的重链和轻链对。此外，此类非同源对可能显示出与人抗原的不想要的交叉反应。最后，由于固有的选择偏倚，通过选择和筛选组合文库鉴定的靶特异性免疫球蛋白的遗传多样性通常是受限制的。
可以根据本领域已知的方法从免疫球蛋白产生细胞中产生免疫球蛋白。此类方法是例如杂交瘤技术。不同的方法是基于免疫球蛋白的核酸序列的鉴定。通常，所述方法足以鉴定可变区或者甚至仅CDR区或者仅CDR3区的序列。例如，mRNA分离自免疫球蛋白产生细胞库，并用于构建编码免疫球蛋白的CDR区的cDNA文库。然后，将cDNA文库转染到合适的宿主细胞，例如NS0或CHO中，并用于筛选特异性免疫球蛋白产生。
WO2008/104184报道了用于克隆同源抗体（cognate antibody）的方法。Tiller等人（Tiller,T.,等人,J.Immunol.Meth.329(2007)112-124）报道了来自单个人B细胞的单克隆抗体的有效产生。Braeuninger等人（Braeuninger,A.,等人,Blood93(1999)2679-2687）报道了来自T细胞富集的B细胞淋巴瘤的单个B细胞分子的分析。Rohatgi等人（Rohatgi,S.,等人,J.Immunol.Meth.339(2008)205-219）报道了嵌套式（RT-）PCR引物的系统设计和测试。在WO02/13862中，报道了改变B细胞介导的病理的方法和组合物。Haurum等人（Meijer,P.J.和Haurum,J.S.,J.Mol.Biol.358(2006)764-772）报道了一步RT多重重叠延伸PCR（one-stepRT-multiplex overlap extension PCR）。Stollar等人和Junghans等人通过单细胞PCR反应报道了序列分析（Wang,X.和Stollar,B.D.,J.Immunol.Meth.244(2000)217-225；Coronella,J.A.和Junghans,R.P.,Nucl.AcidsRes.28(2000)E85）。Jiang,X.和Nakano,H.,等人（Biotechnol.Prog.22(2006)979-988）报道了用于体外转录和翻译的线性表达元件的构建。
发明概述
已经发现，通过组合在反转录和基因特异性聚合酶链反应中所需的引物，以及在多重单管实时聚合酶链反应中实时定量所需的探针，可以改进（例如变得更快和更强）通常使用的用于获得编码同源（cognate）VH和VL的核酸的多步骤方法。
在一个方面，在本文中报道了用于多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应的方法，所述聚合酶链反应用于从单个B细胞或成浆细胞或浆细胞中扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸（人IgG同种型），所述方法包括以下步骤：
-用第一和第二5’-引物以及第一和第二3’-引物以及第一和第二TaqMan探针，在一个步骤中进行反转录和聚合酶链反应。
在一个实施方案中，第一5'-引物与编码重链前导肽或第一重链构架区的核酸序列互补。在一个实施方案中，第二5'-引物与编码轻链前导肽或第一轻链构架区的核酸序列互补。在一个实施方案中，第一3'-引物与编码重链CH1结构域的C-端氨基酸残基的核酸序列互补。在一个实施方案中，第二3'-引物与编码轻链恒定域的C-端氨基酸残基的核酸序列互补。在一个实施方案中，第一TaqMan探针与编码重链CH1结构域的N-端氨基酸残基的核酸互补。在一个实施方案中，第二TaqMan探针与编码轻链恒定域的N-端氨基酸残基的核酸互补。
在一个方面，本文中还报道了获得单克隆抗体的方法，其包括体外翻译编码人免疫球蛋白G片段的核酸，其中使用如本文中所报道的用于扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应方法，通过特异性扩增获自产生单一免疫球蛋白的人B细胞、成浆细胞或浆细胞或者包含人免疫球蛋白基因座的动物的B细胞的mRNA的cDNA片段来获得核酸。
在一个实施方案中，随后将Fab PCR产物转录成mRNA并使用大肠杆菌裂解物进行体外翻译。
使用如本文中所报道的方法，有可能根据B细胞产生的免疫球蛋白的抗原结合特征，表征所提供的许多B细胞。因此，不会发生免疫球蛋白多样性的丢失。由于分析的B细胞是体外成熟步骤之后获得的成熟B细胞，所以所述B细胞产生的免疫球蛋白不太可能显示出与其他抗原的交叉反应。
在另外的实施方案中，如本文中所报道的方法的特征在于，引物提供了用于5’-引物的编码翻译起始密码子ATG的突出端和/或用于3’-引物的编码翻译终止密码子TTA的突出端。在另外的实施方案中，如本文中所报道的方法的特征在于包括其他步骤：
-提供单细胞并获得该细胞的mRNA。
如本文中所报道的另一方面是用于产生免疫球蛋白Fab片段的方法，其包括以下步骤：
-提供单一免疫球蛋白产生细胞，
-使用如本文中所报道的用于扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应，从细胞中获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域，任选地还编码轻链恒定域的一部分和重链CH1结构域的一部分的核酸，
-产生包含所获得的核酸的线性表达基质，
-体外翻译核酸从而产生免疫球蛋白Fab片段。
本文中所报道的另一方面是用于产生免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：
-提供单一免疫球蛋白产生细胞，
-使用用于扩增和定量如本文中所报道的编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应，从细胞中获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域的核酸，
-将前述步骤中获得的每一核酸与编码各个免疫球蛋白轻链或重链恒定域的非编码C-端恒定域氨基酸残基的核酸有效连接，
-用在前述步骤中获得的核酸转染真核或原核细胞，
-培养经转染的细胞，在一个实施方案中，在适合于表达免疫球蛋白的条件下培养经转染的细胞，
-从细胞或者培养基中回收免疫球蛋白，从而产生免疫球蛋白。
在如本文中所报道的全部方法的一个实施方案中，免疫球蛋白是免疫球蛋白G类（IgG）。
在如本文中所报道的全部方法的一个实施方案中，每一引物彼此相互独立地选自SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:07、SEQ IDNO:08、SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
在如本文中所报道的全部方法的一个实施方案中，用彼此相互独立的一对引物进行聚合酶链反应，所述引物选自SEQ ID NO:05、SEQ ID NO:06、SEQ ID NO:07、SEQ ID NO:08、SEQ ID NO:09、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12。
发明详述
在一个方面，本文报道了用于多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应的方法，所述聚合酶链反应用于扩增和定量来自单个B细胞或成浆细胞或浆细胞的编码同源IgG重链和轻链的核酸（人IgG同种型）。
-使用第一和第二5’-引物以及第一和第二3’-引物以及第一和第二TaqMan探针，在一个步骤中进行反转录和聚合酶链反应。
已经发现，通过组合在反转录和基因特异性聚合酶链反应中所需的引物，以及在多重单管实时聚合酶链反应中实时定量所需的探针，可以改进（例如变得更快和更强）通常使用的用于获得编码同源VH和VL的核酸的多步骤方法。
尤其可以将该方法用作为改进目前所使用的具有某些缺点的两步方法的其他可能方法。例如，由于有可能诱导引物-引物-二聚体形成和/或诱导非特异性结合，所以为了增加灵敏性而使用高引物浓度是不合适的，或者增加扩增循环的数目可以导致非特异性序列的扩增。
通过使用用人pan B细胞标记，CD19包被的磁性微珠（参见例如，Bertrand,F.E.,III,等人,Blood90(1997)736-744），可以从外周血中分离B细胞。在有限稀释方法的情况下，可以将单细胞置于96孔微量滴定板的孔中。可以提取这些细胞的mRNA。
在如本文中所报道的方法中，在单管聚合酶链反应中，将多重聚合酶链反应用于同时扩增编码重链和轻链可变域的核酸。与在分离的反应中扩增重链可变域和轻链可变域相反，当前方法提供了增加的灵敏性和增加量的扩增序列。在聚合酶链反应中使用基因特异性引物增强了该方法的特异性和准确性。
对于所需的灵敏性和准确性，更复杂的基因结构（在人IgG的情况下）需要引物设计、放置以及聚合酶链反应的不同策略。
因此，本文报道了可以在不连接和连接扩增的重链编码区和轻链编码区的情况下实施多重实时逆转录酶聚合酶链反应。对于所获得的核酸的体外翻译，有益的是编码结构域包含适合于形成链间二硫键的半胱氨酸残基。
例如，在Ausubel,F.M.,ed.,Current Protocols in Molecular Biology,Volumes I toIII(1997),Wiley and Sons；Sambrook,J.,等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；Morrison,S.L.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81(1984)6851-6855；US5,202,238和US5,204,244.中报道了本领域技术人员已知的用于实施当前发明的方法和技术。
术语“免疫球蛋白”表示基本上由免疫球蛋白基因编码的一种或多种多肽组成的蛋白质。公认的免疫球蛋白基因包括不同的恒定区基因以及无数的免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以以多种形式存在，所述形式包括例如，Fv、Fab和F(ab)2以及单链（scFv）或双抗体。免疫球蛋白一般包含两个所称作的轻链多肽（轻链）和两个所称作的重链多肽（重链）。每一重链和轻链多肽含有可变域（可变区）（通常为多肽链的氨基端部分），其包含能与结合配偶体（通常为抗原）相互作用的结合区。每一重链和轻链多肽包含恒定区（通常为羧基端部分）。重链的恒定区介导抗体与以下细胞的结合：i)携带Fcγ受体（FcγR）的细胞，例如吞噬细胞或者ii)携带新生Fc受体（FcRn）（也已知为Brambell受体）的细胞。重链的恒定区还介导与一些因子的结合，包括经典补体系统的因子如成分（C1q）。免疫球蛋白的轻链或重链的可变域依次包含不同区段，即四个构架区（FR）和三个超变区（CDR）。
术语“嵌合免疫球蛋白”表示包含来自第一非人种属的可变域即结合区和来自第二不同来源或物种的恒定区的至少一部分的免疫球蛋白，优选地单克隆免疫球蛋白。嵌合免疫球蛋白通常通过重组DNA技术制备。在一个实施方案中，嵌合免疫球蛋白包含小鼠、大鼠、仓鼠、兔或绵羊可变域和人恒定区。在一个实施方案中，人重链恒定区是人IgG恒定区。在另一个实施方案中，人轻链恒定域是κ轻链恒定域或λ轻链恒定域。
免疫球蛋白的“Fc部分”不直接参与结合抗原，但显示出多种效应子功能。取决于重链的恒定区的氨基酸序列，将免疫球蛋白划分为以下类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。将这些类别的一些进一步划分为亚类，即将IgG划分为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4或者将IgA划分为IgA1和IgA2。根据免疫球蛋白所属的免疫球蛋白类别，将免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)。在一个实施方案中，免疫球蛋白属于IgG类。“免疫球蛋白的Fc部分”是本领域技术人员熟知的术语，并且基于木瓜蛋白酶切割免疫球蛋白而定义。在一个实施方案中，免疫球蛋白含有的Fc部分是人Fc部分或者来源于人类来源的Fc部分。在另外的实施方案中，Fc部分是亚类IgG4或IgG1的人免疫球蛋白的Fc部分或者是亚类IgG1、IgG2或IgG3的人免疫球蛋白的Fc部分，其以这样的方式修饰，以使不能检测到如下所定义的Fcγ受体（例如FcγRIIIa）结合和/或C1q结合。在一个实施方案中，Fc部分是人Fc部分，在另一个实施方案中，是人IgG4或IgG1亚类Fc部分或来自人IgG1亚类的突变的Fc部分。在另外的实施方案中，Fc部分来自具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类。尽管IgG4显示出降低的Fcγ受体（例如FcγRIIIa）结合，但其他IgG亚类的免疫球蛋白显示出强烈的结合。然而，如果改变Pro238、Asp265、Asp270、Asn297（丢失Fc糖）、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434或/和His435，那么也提供了降低的Fcγ受体结合（Shields,R.L.,等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604；Lund,J.,等人,FASEB J.9(1995)115-119;Morgan,A.,et al.,Immunol.86(1995)319-324；EP0307434）。在一个实施方案中，提及Fcγ受体结合，免疫球蛋白是具有L234、L235和/或D265、和/或含有PVA236突变的IgG4或IgG1亚类或者IgG1或IgG2亚类。在另一个实施方案中，突变是S228P、L234A、L235A、L235E和/或PVA236（PVA236意为来自IgG1的氨基酸位置233至236氨基酸序列ELLG（以单字母氨基酸密码给出）或者IgG4的EFLG被PVA替换）。在另外的实施方案中，突变是IgG4的S228P和IgG1的L234A和L235A。在一个实施方案中，重链恒定区具有这样的氨基酸序列：SEQ ID NO:01、SEQ IDNO:02、具有突变L234A和L235A的SEQ ID NO:01或具有突变S228P的SEQ ID NO:02，而轻链恒定区具有SEQ ID NO:03或SEQ ID NO:04的氨基酸序列。
如本文中所用，术语“人免疫球蛋白”表示这样的免疫球蛋白，其具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区（域）并与这些种系序列具有高度的序列相似性或同一性。抗体的恒定区是人IgG1或IgG4型的恒定区或其变体。此类区域可以是异型的，并且由例如Johnson,G.和Wu,T.T.,Nucleic Acids Res.28(2000)214-218，及其中所参考的数据库所述。
如本文中所用，术语“重组免疫球蛋白”表示通过重组方法制备、表达或产生的免疫球蛋白。该术语包括从宿主细胞，例如大肠杆菌、NS0、BHK或CHO细胞分离的免疫球蛋白。在一个实施方案中，根据本发明的“重组人免疫球蛋白”具有重排形式的可变区和恒定区。重组人免疫球蛋白已经进行了体内体细胞高变。因此，重组人免疫球蛋白的VH和VL区的氨基酸序列是归属于定义的人种系VH和VL序列的序列，但不能天然地存在于体内人抗体种系的所有组成成分中。
术语“单克隆免疫球蛋白”表示获自基本上同质的免疫球蛋白的群体的免疫球蛋白，即除以少量存在的天然发生的突变外，各个免疫球蛋白群是相同的。单克隆免疫球蛋白是针对单个抗原位点高度特异的。此外，与多克隆免疫球蛋白制备物（其包括针对不同抗原位点（决定簇或表位）的不同免疫球蛋白）相反，每一单克隆免疫球蛋白针对单一抗原位点。除单克隆免疫球蛋白的特异性之外，它们的有利之处在可以通过其他免疫球蛋白无污染的合成。修饰语“单克隆”表示获自基本上同质的免疫球蛋白群体的免疫球蛋白的特征，并且并不应解释为需要通过任意特定的方法产生免疫球蛋白。
如本文中所用，术语“可变域”（轻链（VL）的可变域、重链（VH）的可变域）表示直接参与靶抗原的结合的免疫球蛋白的一对轻链和重链的各个结构域。可变域通常是轻链和重链的N-端结构域。轻链和重链的可变域具有相同的一般结构，即它们拥有“免疫球蛋白构架”，并且每一结构域包含通过三个“高变区”（或者“互补决定区，CDR”）连接的四个“构架区”（FR），其序列是相当保守的。在本申请内，术语“互补决定区（CDR）”或“高变区”（HVR）是可互换使用的，并表示主要参与抗原结合的抗体的氨基酸残基。“构架”区（FR）是那些除高变区以外的可变域的区域。因此，免疫球蛋白的轻链和重链可变域从N-端至C-端包含区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据Kabat,E.A.,等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)的标准定义，确定CDR和FR氨基酸残基。
如本申请中所用，术语“氨基酸”表示羧基a-氨基酸的组群，其可以由核酸直接编码或者编码为前体形式。各个氨基酸通过由三个核苷酸（所称作的密码子或碱基-三联体）组成的核酸编码。每一氨基酸通过至少一个密码子编码。将通过不同密码子编码的同一氨基酸称为“遗传密码的简并性”。如本申请中所用，术语“氨基酸”表示天然存在的羧基a-氨基酸，并且包括丙氨酸（三字母密码：ala，单字母密码：A）、精氨酸（arg，R）、天冬酰胺（asn，N）、天冬氨酸（asp，D）、半胱氨酸（cys，C）、谷氨酰胺（gln，Q）、谷氨酸（glu，E）、甘氨酸（gly，G）、组氨酸（his，H）、异亮氨酸（ile，I）、亮氨酸（leu，L）、赖氨酸（lys，K）、甲硫氨酸（met，M）、苯丙氨酸（phe，F）、脯氨酸（pro，P）、丝氨酸（ser，S）、苏氨酸（thr，T）、色氨酸（trp，W）、酪氨酸（tyr，Y）和缬氨酸（val，V）。
在本申请内，“核酸”或“核酸序列”是可以互换使用的术语，指由各个核苷酸（也称为碱基）‘a’、‘c’、‘g’和‘t’（或者在RNA中为‘u’）组成的聚合分子，即指DNA、RNA或其修饰物。多核苷酸分子可以是天然存在的多核苷酸分子或者合成的多核苷酸分子或者一个或多个天然存在的多核苷酸分子与一个或多个合成的多核苷酸分子的组合。该定义还包括这样的天然存在的多核苷酸分子，其中改变（例如通过诱变）、缺失或添加一个或多个核苷酸。核酸可以是分离的或者是整合到另一核酸中的，例如整合到表达盒、质粒或宿主细胞的染色体中。核酸的特征在于其核酸序列由各个核苷酸组成。
对于本领域技术人员而言，将例如多肽的氨基酸序列转变成编码该氨基酸序列的相应核酸序列的步骤和方法是熟知的。因此，核酸的特征在于其核酸序列由各个核苷酸组成，并且同样地所述核酸编码多肽的氨基酸序列。
使用如本文中所报道的包含单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应（PCR）的方法，可以从单细胞获得编码单克隆免疫球蛋白的核酸。此外，使用如本文中所报道的PCR方法和体外翻译的组合，可以从单细胞获得编码单克隆免疫球蛋白的核酸，并且可以以足以表征免疫球蛋白的结合性质的量至少以Fab片段的形式提供编码的免疫球蛋白。为了扩增获自单细胞的非常少量的mRNA，PCR（聚合酶链反应）必须非常灵敏。
因此，基于从单细胞中扩增编码IgG同种型免疫球蛋白的同源IgG HC（免疫球蛋白G重链）和IgG LC（免疫球蛋白G轻链）的核酸以及随后体外翻译所获得的扩增核酸，可以提供Fab片段或完整的免疫球蛋白。使用该方法，提供了获得通过单细胞产生的免疫球蛋白的有关信息的高灵敏度的方法。所述信息甚至可以从单细胞的微量mRNA中获得。根据本发明的方法允许用生物化学方法表征由单细胞表达的免疫球蛋白的结合特征。因此，与杂交瘤技术相比，使用该方法，可以实现更高的多样性的表征。此外，由于可以例如从抗原接触后的成熟B细胞中获得同源免疫球蛋白链，所以可以选择性地获得编码高特异性以及正确装配的免疫球蛋白的核酸。
如本文中所报道，用于从单细胞中获得编码免疫球蛋白Fab片段的核酸的方法包括用于从单个B细胞中扩增编码同源IgG HC和IgG LC（人IgG同种型）的核酸的单管实时多重半嵌套式PCR。因此，可以使用大肠杆菌细胞裂解物体外翻译Fab片段。可以使用ELISA和蛋白质印迹方法确认表达。
总之，如本文中所报道的方法包括以下一般步骤
i)用人CD19包被的磁性微珠从外周血中分离B细胞，
ii)通过例如有限稀释或FACS沉积单细胞，
iii)提取各个B细胞的mRNA，
iv)获得由各个B细胞产生的编码免疫球蛋白的至少可变域（VH和VL）的一个或多个核酸，
v)体外翻译RNA模版，和，
vi)任选地，表征免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的结合性质。
如本文中报道的基于PCR的方法是高度灵敏的，并且导致扩增的编码免疫球蛋白的重链和轻链或其片段的核酸的高度回收。在体外翻译用如本文中所报道的基于PCR的方法获得的核酸后，还提供了表达功能性和稳定的Fab片段的方法。
可以互换使用的术语“聚合酶链反应”和“PCR”表示用于特异性扩增核酸例如DNA或RNA的区域的方法。该方法已经由K.Mullis（参见例如Winkler,M.E.,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA79(1982)2181-2185）研发。区域可以是单个基因、基因的一部分、编码或者非编码序列。大多数PCR方法通常扩增数百个碱基对（bp）的DNA片段，尽管一些技术允许扩增多达40千个碱基对（kb）大小的片段。基本的PCR设置需要几种组分和试剂。这些组分包括含待扩增区域的核酸模版、与待扩增区域的5’-和3’-末端互补的两种引物、聚合酶，例如Taq聚合酶或者另一热稳定性聚合酶、聚合酶从中合成新链的脱氧核苷三磷酸（dNTP）、为聚合酶的最佳活性和稳定性提供合适的化学环境的缓冲液、二价阳离子，通常为Mg2+，以及最后，单价阳离子如钾离子。
可以互换使用的术语“多重聚合酶链反应”或“多重PCR”表示在单个PCR反应/混合物中使用多个独特的引物的聚合酶链反应，以产生对不同DNA序列特异的不同大小的扩增子。通过一次靶向多个基因，可以从单个测试运行中获得其他信息，否则需要几倍的试剂和更多的时间运行才能获得该信息。必须优化每一引物集的退火温度，以在单个反应内正确地运行。此外，当通过凝胶电泳目测时，扩增子大小应当足够不同，以形成不同的条带。
在人类基因组中，含有免疫球蛋白编码基因的染色体基因座位于染色体2、14和22（参见图1）。人免疫球蛋白G重链基因座可以见于染色体14（14q32.2）上，所述基因座中的染色体方向：端粒–5’-末端-VH-D-JH-CH-3’-末端–着丝粒。如下表1中所述，对染色体上的VH区段进行分类。
表1.根据Matsuda,F.,等人,J.Exp.Med.188(1998)2151-2162和Tomlinson,I.M.,等人,V Base sequence directory1999，将VH-基因分组成VH家族。
VH家族 家族成员的数目 具有可读框的基因
VH1 14 9/11
VH2 4 3
VH3 65 22
VH4 32 7/11
VH5 2 2
VH6 1 1
VH7 5 1
人免疫球蛋白G重链基因座包含全部123-129个VH-基因（其中51个是功能性的）、其被分组成7个家族的23个功能性D-基因（D=多样性）、6个功能性JH-基因（J=连接），以及最常见的单倍型9功能性CH-基因（C=恒定）。
κ型和λ型的人免疫球蛋白G轻链的基因座位于两个不同的染色体，染色体2和22上。κ轻链基因座可以见于染色体2的短臂上（2p11.2），并且包含40个功能性Vκ-基因区段。所述Vκ-基因区段被分组成7个家族。该基因座还包含5个Jκ-基因和单个Cκ-基因（Schable,K.F.和Zachau,H.G.,Biol.Chem.Hoppe Seyler374(1993)1001-1022；Lefranc,M.P.,Exp.Clin.Immunogenet.18(2001)161-174）。
表2：根据Foster,S.J.,等人,J.Clin.Invest.99(1997)1614-1627，将Vκ-基因分组成Vκ家族。
Vκ家族 功能基因的数目
Vκ1 19
Vκ2 9
Vκ3 7
Vκ4 1
Vκ5 1
Vκ6 3
λ轻链基因座可以见于染色体22的长臂（22p11.2）上，并且包含73-74个Vλ-基因，其中30个是功能性的。所述Vλ-基因被分组成10个家族，其另外地被分组成3个簇。该基因座还包含7个7Jλ-基因，其中5个是功能性的。
表3：根据Frippiat,J.P.,等人,Hum.Mol.Genet.4(1995)983-991；Farner,N.L.,等人,J.Immunol.162(1999)2137-2145；Lefranc,M.P.,Exp.Clin.Immunogenet.18(2001)242-254，将Vλ-基因分组成Vλ家族。
Vλ家族 功能基因的数目 簇
Vλ1 5 B
Vλ2 5 A
Vλ3 8 A
Vλ4 3 A-C
Vλ5 3 B
Vλ6 1 C
Vλ7 2 B
Vλ8 1 C
Vλ9 1 B
Vλ家族 功能基因的数目 簇
Vλ10 1 C
从单一免疫球蛋白产生细胞，例如从单个B细胞中扩增（基于PCR）编码IgG HC和LC或者至少其可变域的核酸是基于B淋巴细胞的单细胞沉积，然后使用对重链和轻链的可变域特异的引物进行基于PCR的核酸扩增。PCR的结果基本上取决于所使用的PCR引物。最好地，所使用的引物应当覆盖全部V-基因，不易于形成二聚体，并且应当与编码免疫球蛋白的cDNA特异地结合。因此，在一个实施方案中，编码免疫球蛋白可变域的核酸获自cDNA。
由于在人免疫球蛋白G基因座上存在大量功能基因，所以在PCR反应中需要使用不同的引物，以尽可能多地覆盖已知的基因。因此，已经确立了一组简并引物，其也是本发明的一方面。在一个实施方案中，在一个聚合酶链反应中进行编码重链和轻链的核酸的扩增。在该实施方案中，选择引物以允许在相同的PCR条件下提供大约相同长度的核酸的扩增。在该实施方案中，使用用于编码重链的核酸的引物，其中一个引物结合于重链CH1区中，因此，提供了与编码轻链的相应核酸的核酸片段大小相当的核酸片段。
在如本文中所报道的方法中，通过在单个多重聚合酶链反应中组合不同的5’-和3’-引物，在单个聚合酶链反应中获得了编码轻链可变域的核酸和编码重链可变域的核酸。
本发明的另一方面是从单细胞中获得编码至少免疫球蛋白可变域的核酸的方法，其包括以下步骤：
-使用包含两个5’-引物和两个3’-引物以及两个TaqMan探针的一组引物，在一个步骤中进行反转录和聚合酶链反应。
在所述方法的一个实施方案中，在多重实时单管反转录基因特异性引物聚合酶链反应中使用的5’-引物结合于免疫球蛋白的第一构架区的编码区中。在另一个实施方案中，在PCR反应中使用的引物提供了用于5’-引物的编码翻译起始密码子ATG的突出端和/或用于3’-引物的编码翻译终止密码子TTA的突出端。在用于产生核酸的任选的以下重叠聚合酶链反应中，该突出端是有用的，所述核酸用于体外翻译。在一个实施方案中，将该方法用于获得免疫球蛋白重链可变域。在一个实施方案中，免疫球蛋白可变域是免疫球蛋白重链可变域或者免疫球蛋白κ轻链可变域或者免疫球蛋白λ轻链可变域。
在一个实施方案中，在多重单管实时PCR中使用的，用于获得编码免疫球蛋白重链可变域的核酸的引物具有SEQ ID NO:05和06的核酸序列。
表4：在多重实时PCR反应中使用的，用于获得编码免疫球蛋白重链可变域的核酸的引物。
在根据本发明的方法的一个实施方案中，在多重单管实时PCR中使用的，用于获得编码免疫球蛋白κ轻链可变域的核酸的引物具有SEQ IDNO:07和08的核酸序列。
表5：在多重单管实时PCR中使用的，用于获得编码免疫球蛋白κ轻链可变域的核酸的引物。
Figure BDA0000478369600000152
Figure BDA0000478369600000161
在根据本发明的方法的一个实施方案中，在多重单管实时PCR中使用的，用于定量PCR结果的TaqMan探针具有SEQ ID NO:09和10的核酸序列。
表6：在多重单管实时PCR中使用的，用于获得编码免疫球蛋白可变域的核酸的TaqMan探针。
Figure BDA0000478369600000162
在组合如本文中所报道的PCR方法和无细胞体外翻译系统的情况下，可以以足以表征免疫球蛋白的结合性质的量以Fab片段的形式获得编码同源免疫球蛋白VH和VL结构域的核酸。为了扩增获自单细胞的极少量mRNA，PCR（聚合酶链反应）必须非常灵敏。
术语“无细胞体外翻译系统”表示下列细胞的无细胞裂解物：原核细胞或真核细胞，优选原核细胞，含核糖体、tRNA、ATP、CGTP、核苷酸和氨基酸的细胞。在一个实施方案中，原核细胞是大肠杆菌。
无细胞体外翻译是现有技术中已知很久的方法。Spirin等人在1988年研发了连续流无细胞（CFCF）翻译以及偶联的转录/翻译系统，其中产生了相对大量的蛋白质合成（Spirin,A.S.,等人,Science242(1988)1162-1164）。对于此类无细胞体外翻译，将含核糖体的细胞裂解物用于翻译或转录/翻译。来自大肠杆菌的此类无细胞提取物由例如Zubay（Zubay,G.,等人,Ann.Rev.Genetics7(1973)267-287）研发，并由Pratt（Pratt,J.M.,等人,Nucleic Acids Research9(1981)4459-4474；和Pratt,J.M.,et al.,Transcription and Translation:A Practical Approach,Hames and Higgins(ed),179-209,IRL Press(1984)）使用。无细胞蛋白质合成的其他进展报道于US5,478,730、US5,571,690、EP0932664、WO99/50436、WO00/58493和WO00/55353中。真核无细胞表达系统由例如Skup,D.和Millward,S.,Nucleic Acids Research4(1977)3581-3587；Fresno,M.,等人,Eur.J.Biochem.68(1976)355-364；Pelham,H.R.和Jackson,R.J.,Eur.J.Biochem.67(1976)247-256以及在WO98/31827中报道。
基于编码同源IgG HC（免疫球蛋白G重链）和IgG LC（免疫球蛋白轻链）的核酸的扩增，可以获得来自单细胞的IgG同种型免疫球蛋白的编码核酸，并随后体外翻译所获得的免疫球蛋白Fab片段的核酸，还可以提供用于从可获得的微量mRNA中获得由单细胞产生的免疫球蛋白有关的信息的高灵敏度方法。如本文中所报道的方法允许表征单个B细胞的免疫球蛋白，因此与杂交瘤技术相比，提供了更高的多样性。此外，由于可以从抗原接触后的成熟B细胞中获得同源免疫球蛋白可变域或免疫球蛋白链，因此可以选择性地获得编码高特异性和正确装配的免疫球蛋白的核酸。
因此，本发明的一个方面是用于产生免疫球蛋白Fab片段的方法，其包括以下步骤：
-提供单一免疫球蛋白产生细胞，
-使用如本文中所报道的单管实时多重反转录PCR，从细胞中获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域的核酸，任选地还编码轻链恒定域的一部分和重链CH1结构域的一部分的核酸，
-任选地产生包含所获得的核酸的线性表达基质，
-体外翻译核酸从而产生免疫球蛋白Fab片段。
在一个实施方案中，通过体外温育大肠杆菌裂解物与核酸进行翻译。
为了重组产生使用根据本发明的方法从单细胞中获得的包含可变域的免疫球蛋白，可以进一步修饰所获得的编码免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的可变域的核酸。例如，可以将编码可变域的核酸与编码免疫球蛋白恒定区或其片段的核酸组合。在一个实施方案中，将编码轻链可变域的核酸与编码SEQ ID NO:03的人κ轻链恒定区的核酸或者与编码SEQ IDNO:04的人λ轻链可变域的核酸组合。在另一个实施方案中，将编码重链可变域的核酸与编码SEQ ID NO:01的人免疫球蛋白G1（IgG1）恒定区的核酸或者与编码SEQ ID NO:02的人免疫球蛋白G4（IgG4）恒定区的核酸组合。
编码完整免疫球蛋白重链和轻链或其片段的核酸分子在下文称为结构基因。它们可以位于同一表达质粒上或者位于不同的表达质粒上。在免疫球蛋白分泌到培养基中之前在表达细胞内发生完整免疫球蛋白或Fab片段的装配。因此，在一个实施方案中，编码免疫球蛋白链的核酸分子在同一宿主细胞中表达。如果重组表达后获得免疫球蛋白的混合物，可以通过本领域技术人员已知的方法分离和纯化它们。这些方法是已经确立的，且广泛用于免疫球蛋白纯化，并且可以单独地或者组合地使用。此类方法是例如，使用微生物衍生蛋白质的亲和层析（例如A蛋白或G蛋白亲和层析）、离子交换层析（例如阳离子交换（羧甲基树脂）、阴离子（氨乙基树脂）和混合模式的交换层析）、亲硫吸附（例如用β-巯基乙醇和其他SH配体）、疏水相互作用或芳族吸附层析（例如用苯基-琼脂糖、氮杂嗜砂（aza-arenophilic）树脂或间-氨基苯硼酸（m-aminophenyl boronic acid）、金属螯合亲和层析（例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和物质）、大小排阻层析，以及预制的电泳方法（例如凝胶电泳、毛细管电泳）（Vijayalakshmi,M.A.,Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93-102）。
“有效连接”指两个或两个以上组分的并列，其中所述组分在允许他们以预期的方式发挥功能的关系中。术语“以有效的形式连接”表示两个或两个以上的各个核酸以各个核酸在最终核酸中被有效连接的方式组合。例如，如果启动子和/或增强子顺式作用以控制或调节连接序列的转录，那么其与编码序列有效连接。通常但并非必需，“有效连接”的DNA序列是连续的，根据需要连续地并且在（可读）框中连接两个蛋白质编码区，例如第一结构域和第二结构域，如免疫球蛋白可变域和免疫球蛋白恒定结构域或恒定区。如果翻译终止密码子位于编码序列的下游末端（3’-端），以使翻译进程经编码序列到达终止密码子并终止于此，那么所述翻译终止密码子与外显子核酸序列有效连接。可以通过本领域已知的重组方法，例如使用PCR方法和/或通过在合适的限制位点连接，来完成连接。如果不存在合适的限制位点，那么根据常规实践，可以使用合成的寡核苷酸接头或连接体。
因此，本发明的一个方面是产生免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：
-提供单一免疫球蛋白产生细胞，
-使用如本文中所报道的方法，从该细胞中获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域的核酸，
-将编码轻链可变域的核酸以有效形式与编码SEQ ID NO: 03或SEQID NO: 04的免疫球蛋白轻链恒定域的核酸连接，并将编码重链可变域的核酸以有效形式与编码SEQ ID NO: 01或SEQ ID NO: 02的免疫球蛋白重链恒定区的核酸连接，
-用前述步骤的核酸转染真核或原核细胞，
-在适合于编码免疫球蛋白的条件下培养经转染的细胞，
-从细胞或培养基中回收免疫球蛋白，并从而产生免疫球蛋白。
术语“在适合于表达的条件下”表示用于培养能表达异源多肽的细胞的条件，其是本领域技术人员已知的或者可以容易地测定的。这些条件是本领域技术人员已知的并可以依据所培养的细胞的类型和所表达的多肽的类型而改变。总之，在0.01升至107升的体积中，在20℃至40℃之间的温度，将细胞培养足以允许缀合物有效产生的一段时间，例如4天至28天。
提供了以下实施例、序列表和附图，以帮助理解本发明，本发明的真正范围描述于所附权利要求中。应当理解，在不背离本发明的精神的情况下，可以对前述方法进行修改。
序列表的说明
SEQ ID NO:01   人IgG1重链恒定区
SEQ ID NO:02   人IgG4重链恒定区
SEQ ID NO:03   人IgGκ轻链恒定域
SEQ ID NO:04   人IgGλ轻链恒定域
SEQ ID NO:05   VH-引物
SEQ ID NO:06   VCH-引物
SEQ ID NO:07   VL-引物
SEQ ID NO:08   VCL-引物
SEQ ID NO:09   TaqMan探针1
SEQ ID NO:10   TaqMan探针2
SEQ ID NO:11   用于重叠PCR的引物1
SEQ ID NO:12   用于重叠PCR的引物2
附图简述
图1人免疫球蛋白G重链基因座（A）、人免疫球蛋白κ轻链基因座（B）和人免疫球蛋白λ轻链基因座（C）的染色体定位。
实施例
材料和方法
B细胞和浆细胞
用于该方法的样品是分离自健康供体的外周血和针对人IgG进行转基因的小鼠的组织（脾、骨髓）的B细胞和浆细胞。首先，在单独的管中的DMEM中分解实体组织。在后续步骤中，温和地处理并且低温使细胞裂解最小化，这对于后续阳性分离目的细胞以及保持mRNA来源的完整性是重要的。通过精密地添加细胞分离介质，悬浮分离的组织，以制备不同的细胞类型梯度（具有Ficoll密度梯度的Leucosep管（Greiner Bio-One））。通过在离心机中，在800x g和22℃，在不间断的情况下在冰冷的分离介质上离心20分钟，纯化悬浮的细胞，以富集浆细胞（PBMC）和淋巴细胞。在冰冷的缓冲液（(PBS（磷酸缓冲盐水）、0.1%（w/v）BSA（牛血清白蛋白）、2mM EDTA（乙二胺四乙酸））中洗涤细胞，并小心地丢弃悬浮液，以仅保留淋巴细胞。然后在PBS中重悬淋巴细胞，并通过用移液管小心吹打来混合。在800x g和22℃离心5分钟，以沉淀细胞。用鼠和人FC阻断剂预处理B细胞和浆细胞，以阻断Ab在那些细胞表面上的非特异性结合。用缓冲液（PBS、0.1%（w/v）BSA、2mM EDTA）洗涤细胞一次，离心所述细胞并在PBS中重悬。仅使用CD19+B细胞和CD138+浆细胞。为了防止mRNA降解，加入RNA酶抑制剂。根据厂商说明，实施来自小鼠脾的CD19+B细胞的阳性分离（Dynal Biotech DynabeadsCD19Pan B）。按照厂商说明，实施CD138+浆细胞的选择（StemCellTechnologies EasySep Human CD138选择试剂盒）。
通过有限稀释培养物或FACS分选的原理分离成单细胞：
计数细胞，并通过有限稀释培养物的原理，以单细胞的形式将细胞沉积于96孔PCR板或384孔板的孔中。用PCR膜密封平板，并立即放置于冰上。可以在PT-PCR（逆转录酶聚合酶链反应）中立即使用分选的细胞，或者储存于-20℃用于短期使用或者-80℃用于长期使用。在FACSAria细胞分选系统（Becton Dickinson）上进行单细胞分选。收集CD19染色阳性、CD38染色强阳性和CD45染色中等阳性的细胞，并指定为浆细胞（PC）。引入前向散射/侧向散射上的其他门控和侧向散射宽度/侧向散射高度，以分别选择活的淋巴细胞和单线态。将单细胞直接分配到含有10μl体积除逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲液和dNTP之外的全部必需的PCR试剂的96孔PCR板（Eppendorf）的孔中，并冷冻于-80℃用于以后的处理。
一步多重实时逆转录酶基因特异性PCR：
为了能在聚合酶链反应中扩增mRNA，必须将B细胞和浆细胞直接分配到含有除逆转录酶、DNA聚合酶、缓冲液和dNTP之外的全部必需的PCR试剂的10μl体积的96孔PCR板（Eppendorf）的孔中，并冷冻于-80℃用于以后的处理。
RT步骤：
在一个步骤中进行反转录和PCR（一步多重RT-PCR）。将分离、分选和储存的细胞用作反转录或RT-PCR的原材料。在室温冻融全部必需的试剂。在MOLBIOL TIB GmbH实验室合成全部引物。在整个过程中，将平板和全部其他试剂都保持于冰上。对于cDNA合成，直接使用具有突出端的基因特异性引物。酶复合体由两种Sensiscript逆转录酶和一种Omniscript聚合酶（Qiagen OneStep RT PCR）组成。通过Sensiscript复合体（Qiagen OneStep RT PCR）进行mRNA至cDNA的再写，并使用HotStarTaq DNA聚合酶（Qiagen OneStep RT PCR）进行cDNA的扩增，所述HotStarTaq DNA聚合酶是最初分离自在大肠杆菌表达的Thermosaquaticus的重组94kDa DNA聚合酶（脱氧核苷-三磷酸：DNA转脱氧核苷酰酶，EC2.7.7.7）的化学形式。在96孔PCR板中分选细胞，并将所述细胞储存在含5μl PCR级H2O、1μl0.1μM用于VH和VL的引物、1μl20U/反应的RNA酶抑制剂和3μl1.5mM Tris的10μl体积中。短暂地离心（1400转/分钟20秒）在-60℃储存的细胞，以收集液体和孔底的细胞，之后加入用于进行PCR反应的另外10μl。
表7：用于RT-PCR的主混合物
主混合物1 终浓度/孔 体积/孔（μl）
H2O 5
引物VH/VL(k) 0.1μM 1
RNA酶抑制剂 20U/反应 1
Tris-缓冲液 1.5mM 3
B/浆细胞
终体积 10
表8：用于RT-PCR的主混合物1
Figure BDA0000478369600000221
Figure BDA0000478369600000231
将每孔10μl的主混合物2加入到细胞中。第二主混合物含有2.2μlPCR级H2O、4μl的1x缓冲液、0.8μl的dNTP每一种400μM、1μl的Q-溶液0.25x、1.2μl的酶复合体和1μl的RNA酶抑制剂20U。
表9：用于RT-PCR的引物
Figure BDA0000478369600000232
表10：用于RT-GSP-PCR的Block cycler程序。
PCR产物的纯化：
为了在接下来的重叠PCR（第三PCR）中提高用于体外翻译的线性模板的产生效率，通过去除PCR扩增期间未掺入的引物、dNTP、DNA聚合酶和所使用的盐，来进行前述扩增的PCR产物的纯化，以避免干扰下游应用。使用Agencourt AMPure。优化缓冲液，以使100bp及更大的PCR扩增子与顺磁性珠子结合。使用简单的洗涤方法，可以去除过量的寡核苷酸、核苷酸、盐和酶。得到的纯化的PCR产物基本上是不含污染物的，并且可以用于以下应用：荧光DNA测序（包括毛细管电泳）、微阵列点样、克隆和引物延伸基因型分型。96孔形式的工作流程从轻微振荡储存在缓冲液中的珠子开始，以重悬可能已经沉降的任何磁性颗粒。将校正体积的36μl珠子溶液加入到20μl的样品中，并用移液管上下吹打10次。接下来的步骤是温育10分钟，并然后将反应板放置在磁性平板上10分钟，以从溶液中分离珠子。从反应板中吸取澄清的溶液（上清液）并丢弃。从反应板中吸取澄清的溶液（上清液）并丢弃。对于珠子-cDNA洗涤，每孔分配200μl70%的乙醇，并室温温育至少30秒。吸出乙醇并丢弃。进行洗涤步骤两次，并然后将反应板置于室温风干20分钟。然后加入40μl的洗脱缓冲液，并再次用移液管上下吹打混合物10次。在cDNA与磁珠分离后，将纯化的DNA转移到新的平板中。
重叠延伸PCR：
然后通过使用对于转录/翻译步骤所必需的组分（核糖体结合位点（RBS）、T7启动子和T7终止序列）进行的重叠延伸PCR来连接扩增的DNA。对于该PCR，使2μl的第二PCR产物成为20μl的终体积，其含有以下组分：10.7μl水、2μl具有MgCl2（10mM）的10x反应缓冲液、0.8μl的DMSO、0.5μl dNTP（每种10mM）、1.6μl T7启动子和终止子引物（每种6μM）、0.4μl C-端HA-标记引物和0.4μl的酶混合物，全部组分均来自RTS E.coli Linear Template Generation Set，HA-Tag（RocheDiagnostics GmbH,Mannheim，德国）。最后，将重叠PCR产物用作为使用大肠杆菌裂解物进行的体外转录的模板，并通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）针对F(ab’)2IgG筛选得到的功能性Fab。
表11：用于PCR的组分
表12：用于第三PCR的Block cycler程序
凝胶电泳：
使用合适的对照，进行凝胶电泳分析（1%琼脂糖凝胶，InvitrogenCorp.，美国），以评价扩增和cDNA模板的特异性。
表13：凝胶电泳方案
组分 体积（μl） 迁移时间
H20 6
5x Orange G 3
PCR产物 6
组分 体积（μl） 迁移时间
终体积 15
凝胶的体积 10 20分钟
体外转录和翻译：
使用如所报道的组分，按照RTS100E.coli Disulfide试剂盒（RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国）的厂商方案实施体外偶联的转录和翻译（参见表12）。在RTS Proteo Master仪器（Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，德国）中，在37℃，在50μl的总体积中翻译和转录4μl的每种重叠PCR产物20小时。在没有cDNA模板的情况下，在相同的条件下进行对照反应。将GFP（绿色荧光蛋白）载体作为阳性对照加入到反应系统中放射自显影。体外转录/翻译后，将50μl反应混合物转移到75μl PBS中（1:2.5稀释），并在4℃温育过夜，以用于蛋白质的正确折叠和成熟。
表14：用于体外转录和翻译的组分。
混合物 组分 体积（μl）
混合物1： 大肠杆菌裂解物 25
裂解物激活剂 1
终体积 26
室温温育10-20分钟
混合物2： 进料混合物 640
氨基酸混合物 140
甲硫氨酸 20
H2O 200
终体积 1000
混合物3： 反应混合物 7
氨基酸混合物 7
甲硫氨酸 1
混合物1 25
GroE补充剂 5
混合物 组分 体积（μl）
RNA酶抑制剂 1
PCR3产物 4
终体积 50
ELISA：
使用50μl（在PBS中1:1000）山羊抗人IgG Fab片段（由BethylLaboratories Inc.生产，获自Biomol GmbH，Hamburg，德国，1mg/1ml）包被384孔板（Nunc GmbH&Co.KG，Thermo Fisher Scientific，Langenselbold，德国），4℃温育过夜。使用洗涤溶液（100μl PBST（磷酸缓冲盐水Tween-20））洗涤平板3次，并加入60μl的封闭液（0.25%CroteinC（w/v）/0.5%Tween（w/v）/PBS）室温温育1小时。进行另一洗涤步骤（3x100μl PBST）后，转移37.5μl样品，37.5ml阴性对照（阴性对照来自体外转录/翻译）以及37.5μl含0.75μl人重组Fab片段（RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，德国）的阳性对照。将样品滴定成1:3的稀释度。室温温育平板1.5小时。洗涤步骤（3x100μl PBST）后，加入25μl山羊抗人IgG F(ab’)2（Dianova，Hamburg，德国；0.8mg/ml（在封闭液中1:2000稀释）），并室温温育1小时。进行最后的洗涤步骤（3x100μl PBST），并用移液管将25μl的TMB（POD底物，Roche DiagnosticsGmbH，Mannheim，德国，Art-No:1484281）吸到每孔中。2-3分钟后，在405nm和495nm处（Tecan，Safire2；Tecan Deutschland GmbH，Crailsheim，德国）检测吸收信号。
流式细胞检测分析和细胞分选：
对于FACS分析和细胞分选，使用针对以下抗原的生物素化的或者与FITC（异硫氰酸荧光素）、PE（藻红素）或APC（异藻蓝蛋白）缀合的单克隆抗体：CD3（UCHT1）、CD4（13B8.2）、CD8（B9.11）、CD40（MAB89）、CD80（MAB104）、CD83（HB15a）、CD86（HA5.2B7)（全部获自Imunotech/Beckman Coulter，Marseille，法国）、CD19（HIB19）、CD20（2H7）、CD34(581）、IL-3Ra/CD123（9F5）、CD11c（B-ly6）CD14（M5E2）、CD24、CD22a、CD38、CD138（全部获自BDPharmingen，San Diego，CA，美国）、CD45（HI30）、CD45RA（MEM56）、HLA-DR（TU36)（全部获自Caltag，Burlingame，CA，美国）、TLR2（TL2.1）、TLRR4（HTA125）、TCRab（IP26）、（全部获自Bioscience，San Diego，CA）、BDCA-1、BDCA-2、BDCA-4、CD25（4E3）（全部获自Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）、IgM（JacksonImmunoresearch，West Grove，PA，美国）、CCR7（3D12，由M.Lipp，Berlin，德国提供)。将IOTest Beta Mark用于Vb分析（Imunotech/BeckmanCoulter）。将缀合有链霉亲和素的FITC、PE或APC（全部来自BDPharmingen）用于生物素化抗体的可视化。通过碘化丙啶染色排除死细胞。将合适的匹配的同种型、不相关对照mAb用于测定背景染色的水平。使用FACS Calibur分析细胞，并使用FACSAria（Becton DickinsonImmunocytometry Systems，Mountain View，CA，美国）分选细胞。
实施例1
通过实时单管逆转录酶聚合酶链反应从人源化的免疫小鼠的单个B细胞中扩增IgG基因
实施例2
用于体外翻译的线性模板的产生
对于第一聚合酶链反应，设计包含T7噬菌体调节DNA区域必需的重叠序列的基因特异性引物。对于第二聚合酶链反应，将第一PCR的产物分别与包含调节序列的核酸片段和编码标记序列的核酸片段组合。通过与包含调节元件的核酸片段杂交，实现了3’-末端的延伸。在两种末端引物的帮助下，进一步扩增该线性表达构建体。这些引物包含以下序列：5’
CTTTAAGAAGGAGATATACC+ATG+15-20的基因特异性序列（5’-引物，SEQ ID NO:11）或者
5’-ATCGTATGGGTAGCTGGTCCC+TTA+15-20的基因特异性序列（3’-引物，SEQ ID NO:12）。
在图X中，泳道1、5和9表示空白水对照。重链核酸包含于泳道4、8和12中，而κ轻链包含于泳道3、7和11中。泳道2、6和10显示了两条链的组合样品。全部核酸具有预期的大小（参见表38）。
表15：线性表达构建体的大小
免疫球蛋白链 两组固定的引物 一组固定的引物 两组可变的引物
IgG HC ～1110bp ～1110bp ～822bp
IgG LC(κ) ～1089bp ～1089bp ～799bp
实施例3
体外翻译和huFab特异性ELISA
如上所述实施体外翻译。
如图10中所示，用两组可变引物进行的两步聚合酶链反应获得的核酸并不提供这样的线性表达构建体，其允许体外产生编码的Fab免疫球蛋白片段。相反，在分离的连续聚合酶链反应中使用一组固定引物和一组可变引物的两步聚合酶链反应允许随后提供线性表达构建体，以及包含免疫球蛋白Fab片段的IgG HC和IgG LC的体外翻译。
与此相反的是，包含一组固定引物的两步聚合酶链反应在多重形式方面比使用两组固定的引物的聚合酶链反应更高效。通过使用仅一组固定的引物，可以实现多达5倍的更高的光密度。
Figure IDA0000478369650000011
Figure IDA0000478369650000031
Figure IDA0000478369650000041
Figure IDA0000478369650000051
Figure IDA0000478369650000061
Figure IDA0000478369650000071
Figure IDA0000478369650000081
Figure IDA0000478369650000091

Claims (12)

1.用于从单细胞扩增和定量编码同源IgG重链和轻链的核酸的方法，其包括以下步骤：
-使用第一和第二5’-引物以及第一和第二3’-引物以及第一和第二TaqMan探针，在一个步骤中进行反转录和聚合酶链反应。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于
a)第一5'-引物与编码重链前导肽或第一重链构架区的核酸序列互补，和/或
b)第二5'-引物与编码轻链前导肽或第一轻链构架区的核酸序列互补，和/或
c)第一3'-引物与编码重链CH1结构域的C-端氨基酸残基的核酸序列互补，和/或
d)第二3'-引物与编码轻链恒定域的C-端氨基酸残基的核酸序列互补，和/或
e)第一TaqMan探针与编码重链CH1结构域的N-端氨基酸残基的核酸互补，和/或
f)第二TaqMan探针与编码轻链恒定域的N-端氨基酸残基的核酸互补。
3.用于获得单克隆抗体的方法，其包括以下步骤
-体外翻译编码免疫球蛋白片段的核酸，其中所述核酸通过使用根据权利要求1或2中任一项的方法，特异性扩增获自单一免疫球蛋白产生细胞的mRNA的cDNA片段获得。
4.根据权利要求3的方法，其进一步包括以下步骤
-随后将PCR产物转录成mRNA，并使用大肠杆菌细胞裂解物体外翻译所述mRNA。
5.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述引物提供了用于5’-引物的编码翻译起始密码子ATG的突出端和/或用于3’-引物的编码翻译终止密码子TTA的突出端。
6.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于包括另外的步骤：
-提供单细胞并获得该细胞的mRNA。
7.用于产生免疫球蛋白Fab-片段的方法，其包括以下步骤：
-提供单一免疫球蛋白产生细胞，
-使用用于扩增和定量根据权利要求1或2中任一项中的编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应，从所述细胞中获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域，任选地还编码轻链恒定域的一部分和重链CH1结构域的一部分的核酸，
-产生包含获得的核酸的线性表达基质，
-体外翻译所述核酸，从而产生所述免疫球蛋白Fab片段。
8.用于产生免疫球蛋白的方法，其包括以下步骤：
-提供单一免疫球蛋白产生细胞，
-使用用于扩增和定量根据权利要求1或2中任一项的编码同源IgG重链和轻链的核酸的多重单管实时逆转录酶基因特异性聚合酶链反应，从所述细胞获得编码免疫球蛋白轻链和重链可变域的核酸，
-将前述步骤中获得的每一所述核酸与编码所述各个免疫球蛋白轻链或重链恒定域的非编码C-端恒定域氨基酸残基的核酸有效连接，
-用前述步骤中获得的所述核酸转染真核细胞或原核细胞，
-培养经转染的细胞，在一个实施方案中，在适合于表达所述免疫球蛋白的条件下培养所述转染的细胞，
-从所述细胞或者培养基中回收所述免疫球蛋白，从而产生免疫球蛋白。
9.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述免疫球蛋白是G类免疫球蛋白（IgG）。
10.根据前述权利要求中任一项的方法，其特征在于所述单细胞是单个B细胞或者单个成浆细胞或者单个浆细胞。
11.SEQ ID NO:05或06或07或08或09或10的核酸。
12.试剂盒，其包含SEQ ID NO:05、06、07、08、09和10的核酸。
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