KR20140064857A - TaqMan 프로브와 조합된 다중 PCR 에 의해 단일 항체 생성 세포로부터 FAB 단편을 수득하는 방법 - Google Patents

TaqMan 프로브와 조합된 다중 PCR 에 의해 단일 항체 생성 세포로부터 FAB 단편을 수득하는 방법 Download PDF

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Abstract

본원은 단일 세포로부터의 동족 IgG 중쇄 및 경쇄 인코딩 핵산 (인간 IgG 동형) 의 증폭 및 정량을 위한 다중 단일 튜브 실시간 역전사효소 유전자-특이적 중합효소 연쇄 반응 방법을 보고하고 있다.

Description

TaqMan 프로브와 조합된 다중 PCR 에 의해 단일 항체 생성 세포로부터 FAB 단편을 수득하는 방법 {METHOD FOR OBTAINING FAB FRAGMENTS FROM SINGLE ANTIBODY PRODUCING CELLS BY MULTIPLEXED PCR IN COMBINATION WITH TaqMan PROBES}
본원에서는 PCR 생성물을 신속히 스크리닝하기 위해 다중 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 TaqMan 프로브의 조합에 의해 단일 항체 생성 세포로부터 항체를 수득하는 방법을 보고하고 있다. 항체 각각의 Fab 단편은 측정될 수 있는 Fab 단편의 시험관내 번역 및 결합 특성에 의해 수득될 수 있다.
하이브리도마 기술의 구축 (Cole, S.P.C., et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); 및 Boerner, P., et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95) 이래로, 단일클론 면역글로불린이 과학적 연구, 인간 보건 및 진단에 있어서 중심적 역할을 하는 것으로 나타났다. 따라서, 단일클론, 특히 치료적인 면역글로불린의 생성은 집중적으로 연구되고 있는 분야이다. 이러한 면에 있어서, 그 중에서도 하이브리도마 기술 및 파지 디스플레이 기술 (Hoogenboom, H.R., and Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388; Marks, J.D., et al., J. Mol. Biol. 222 (1991) 581-597) 은 단일클론 면역글로불린의 생성을 위한 흔히 사용하는 2 가지 기술이다. 따라서 하이브리도마 기술에 있어서, 오직 제한된 수의 B-세포만이 성공적으로 융합되고, 증식되고 그 이후 분석되기 때문에, 안정적 클론을 수득하는 것은 항체 다양성을 감소시키는 장애물이다. 유사하게, 파지 또는 효모 디스플레이-기재 조합 라이브러리 접근법의 결점은 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 페어링 (pairing) 이다. 본래의 중쇄 및 경쇄 페어링, 및 비(非)-동족 (cognate) 페어링의 분리는 고 친화성의 중쇄 및 경쇄 페어를 식별하기 위해 다수의 면역글로불린 생성 세포의 스크리닝을 필요로 한다. 또한, 이러한 비-동족 페어는 인간 항원에 대해 원치 않는 교차-반응성을 나타낼 수 있다. 결국, 조합 라이브러리의 선택 및 스크리닝에 의해 식별된 표적-특이적 면역글로불린의 유전적 다양성은 내재적 선택 바이어스로 인해 통상 제한된다.
면역글로불린 생성 세포로부터의 면역글로불린 생성은 당업계에 공지되어 있는 방법에 따라 수행될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어 하이브리도마 기술이다. 상이한 방법은 면역글로불린의 핵산 서열의 식별을 기반으로 한다. 통상 이는 가변부 또는 오직 CDR 부위 또는 오직 CDR3 부위의 서열을 식별하는데 충분하다. 예를 들어, mRNA 는 면역글로불린 생성 세포의 풀 (pool) 로부터 단리되며 면역글로불린의 CDR 부위를 인코딩하는 cDNA-라이브러리의 구성에 사용된다. cDNA-라이브러리는 이후 적합한 숙주 세포, 예컨대 NS0 또는 CHO 에 트랜스펙션되고, 특정 면역글로불린 생성에 대해 스크리닝된다.
WO 2008/104184 는 동족 항체를 클로닝하는 방법을 보고하고 있다. 단일 인간 B 세포로부터의 단일클론 항체의 효율적 생성은 Tiller 등 (Tiller, T., et al., J. Immunol. Meth. 329 (2007) 112-124) 에 의해 보고되어 있다. Braeuninger 등 (Braeuninger, A., et al., Blood 93 (1999) 2679-2687) 은 T-세포-풍부 B-세포 림프종으로부터의 단일 B 세포의 분자적 분석을 보고하고 있다. 네스티드 (nested) (RT-) PCR 프라이머의 체계적 설계 및 시험이 Rohatgi 등 (Rohatgi, S., et al, J. Immunol. Meth. 339 (2008) 205-219) 에 의해 보고되어 있다. WO 02/13862 에서는 B-세포 매개 병리적 측면을 변경시키기 위한 방법 및 조성물을 보고하고 있다. Haurum 등 (Meijer, P.J. and Haurum, J.S., J. Mol. Biol. 358 (2006) 764-772) 은 1-단계 RT-다중 오버랩 연장 (overlap extension) PCR 을 보고하고 있다. Stollar 등 및 Junghans 등은 단일 세포 PCR 반응에 의한 서열 분석을 보고하고 있다 (Wang, X. and Stollar, B.D., J. Immunol. Meth. 244 (2000) 217-225; Coronella, J.A. and Junghans, R.P., Nucl. Acids Res. 28 (2000) E85). Jiang, X. 와 Nakano, H., 등 (Biotechnol. Prog. 22 (2006) 979-988) 은 시험관내 전사 및 번역을 위한 선형 발현 (linear expression) 요소의 구성을 보고하고 있다.
발명의 개요
일반적으로 사용된 동족 VH 및 VL 인코딩 핵산을 수득하기 위한 다단계 접근법이, 역전사 및 유전자 특이적 중합효소 연쇄 반응에 필요한 프라이머 및 다중 단일 튜브 실시간 중합효소 연쇄 반응에서의 실시간 정량에 필요한 프로브를 조합함으로써 개선될 수 있다 (예를 들어 보다 신속하고 강건하게) 는 것이 발견된 바 있다.
본원에서는 한 양태로서, 하기 단계를 포함하는, 단일 B-세포 또는 형질아세포 또는 혈장 세포로부터의 동족 IgG 중쇄 및 경쇄 인코딩 핵산 (인간 IgG 동형) 의 증폭 및 정량을 위한 다중 단일 튜브 실시간 역전사효소 유전자-특이적 중합효소 연쇄 반응 방법을 보고하고 있다:
- 제 1 및 제 2 의 5'-프라이머 및 제 1 및 제 2 의 3'-프라이머 및 제 1 및 제 2 의 TaqMan 프로브를 사용하여 역전사 및 중합효소 연쇄 반응을 1-단계로 수행하는 단계.
한 구현예에서 제 1 의 5'-프라이머는 중쇄 리더 펩티드 또는 제 1 중쇄 골격 부위를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 상보적이다. 한 구현예에서 제 2 의 5'-프라이머는 경쇄 리더 펩티드 또는 제 1 경쇄 골격 부위를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 상보적이다. 한 구현예에서 제 1 의 3'-프라이머는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 상보적이다. 한 구현예에서 제 2 의 3'-프라이머는 경쇄 불변 도메인의 C-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 상보적이다. 한 구현예에서 제 1 의 TaqMan 프로브는 중쇄 CH1 도메인의 N-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산에 대해 상보적이다. 한 구현예에서 제 2 의 TaqMan 프로브는 경쇄 불변 도메인의 N-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산에 대해 상보적이다.
본원에서는 또한 한 양상으로서 인간 면역글로불린 G 단편을 인코딩하는 핵산의 시험관내 번역을 포함하는 단일클론 항체 수득 방법을 보고하며, 그로써 본원에서 보고하는 바와 같은 동족 IgG 중쇄 및 경쇄 인코딩 핵산의 증폭 및 정량을 위한 다중 단일 튜브 실시간 역전사효소 유전자-특이적 중합효소 연쇄 반응 방법으로 단일 면역글로불린 생성 인간 B-세포, 형질아세포 또는 혈장 세포 또는 인간 면역글로불린 유전자 좌위 (locus) 를 포함하는 동물의 B-세포의 mRNA 로부터 수득한 cDNA 단편의 특이적 증폭에 의해 상기 핵산이 수득된다.
한 구현예에서 Fab PCR 생성물은 이후 대장균 (E. coli) 용해물을 이용하여 시험관내에서 mRNA 로 전사되고 번역된다.
본원에 보고하는 바와 같은 방법으로, 생성된 면역글로불린의 항원 결합 특징에 대해 다수의 제공된 B-세포를 분석할 수 있다. 따라서, 면역글로불린 다양성의 손실은 발생하지 않는다. 분석된 B-세포가 생체내 성숙 과정 후 수득한 성숙 B-세포이므로, 그의 생성된 면역글로불린이 다른 항원과의 교차-반응성을 나타내기 매우 어렵다.
추가 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 방법은 프라이머가 5'-프라이머에 대해 번역 시작 코돈 ATG 및/또는 3'-프라이머에 대해 번역 중지 코돈 TTA 를 인코딩하는 오버행 (overhang) 을 갖는 것을 특징으로 한다. 추가 구현예에서 본원에서 보고하는 바와 같은 방법은 하기 추가적 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다:
- 단일 세포를 제공하고 상기 세포의 mRNA 를 수득하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 추가의 양상은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 Fab-단편 생성 방법이다:
- 단일 면역글로불린 생성 세포를 제공하는 단계,
- 본원에 보고하는 바와 같은 동족 IgG 중쇄 및 경쇄 인코딩 핵산의 증폭 및 정량을 위한 다중 단일 튜브 실시간 역전사효소 유전자-특이적 중합효소 연쇄 반응으로, 상기 세포로부터 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하고 임의로는 또한 일부의 경쇄 불변 도메인 및 일부의 중쇄 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계,
- 수득한 핵산을 포함하는 선형 발현 매트릭스를 생성시키는 단계,
- 핵산을 시험관내 번역하고 그로써 면역글로불린 Fab 단편을 생성시키는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 또 다른 양상은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 생성 방법이다:
- 단일 면역글로불린 생성 세포를 제공하는 단계,
- 본원에 보고하는 바와 같은 동족 IgG 중쇄 및 경쇄 인코딩 핵산의 증폭 및 정량을 위한 다중 단일 튜브 실시간 역전사효소 유전자-특이적 중합효소 연쇄 반응으로, 상기 세포로부터 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계,
- 이전 단계에서 수득한 각각의 핵산을 각각의 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인의 인코딩되지 않은 C-말단 불변 도메인 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산과 작동가능하게 연결하는 단계,
- 진핵 또는 원핵 세포를 이전 단계에서 수득한 핵산으로 트랜스펙션시키는 단계,
- 한 구현예에서, 면역글로불린 발현에 적합한 조건 하에, 트랜스펙션된 세포를 배양하는 단계,
- 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린을 회수하고, 그로써 면역글로불린을 생성시키는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서 면역글로불린은 클래스 G 의 면역글로불린이다 (IgG).
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서 각각의 프라이머는 서로 독립적으로 SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 를 포함하는 군에서 선택된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 모든 방법의 한 구현예에서 중합효소 연쇄 반응은 서로 독립적으로 SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 를 포함하는 군에서 선택되는 프라이머 페어로 수행된다.
발명의 상세한 설명
본원에서는 한 양상으로서 하기 단계를 포함하는, 단일 B-세포 또는 형질아세포 또는 혈장 세포로부터의 동족 IgG 중쇄 및 경쇄 인코딩 핵산 (인간 IgG 동형) 의 증폭 및 정량을 위한 다중 단일 튜브 실시간 역전사효소 유전자-특이적 중합효소 연쇄 반응 방법이 보고된다:
- 제 1 및 제 2 의 5'-프라이머 및 제 1 및 제 2 의 3'-프라이머 및 제 1 및 제 2 의 TaqMan 프로브를 사용하여 역전사 및 중합효소 연쇄 반응을 1-단계로 수행하는 단계.
일반적으로 사용된 동족 VH 및 VL 인코딩 핵산을 수득하기 위한 다단계 접근법이, 역전사 및 유전자 특이적 중합효소 연쇄 반응에 필요한 프라이머 및 다중 단일 튜브 실시간 중합효소 연쇄 반응에서의 실시간 정량에 필요한 프로브를 조합함으로써 개선될 수 있다 (예를 들어 보다 신속하고 강건하게) 는 것이 발견된 바 있다.
이러한 접근법은 현재 사용되는 특정 결점을 갖는 2 단계 방법을 개선시키는 다른 가능한 방법으로서 특히 유용하다. 예를 들어, 민감도를 증가시키는 고농도의 프라이머는 프라이머-프라이머-프라이머 형성의 유도 및/또는 비-특이적 결합의 유도 가능성으로 인해 적합하지 않거나, 증폭 사이클 수를 증가시키는 것은 비-특이적 서열의 증폭을 초래할 수 있다.
인간 pan B-세포 마커, CD19 (예를 들어 Bertrand, F.E., III, et al., Blood 90 (1997) 736-744 참조) 로 코팅된 자석 마이크로비드를 이용하여, B-세포는 말초 혈액으로부터 단리될 수 있다. 제한 희석 접근법으로, 단일 세포를 96 웰 마이크로타이터 플라이트의 웰 내에 넣을 수 있다. 이들 세포의 mRNA 를 추출할 수 있다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법에서 다중 중합효소 연쇄 반응은 단일 튜브 중합효소 연쇄 반응에서 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 인코딩 핵산의 증폭에 동시에 사용된다. 개별적 반응에서의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인의 증폭과 반대로, 현 접근법은 민감도 증가 및 증폭 서열량 증가를 제공한다. 중합효소 연쇄 반응에서의 유전자-특이적 프라이머의 사용은 방법의 특이성 및 정확도를 증강시킨다.
인간 IgG 의 경우 보다 복잡한 유전자 구조는 필요한 민감도 및 정확도를 위해 프라이머 설계, 배치 및 중합효소 연쇄 반응에 대한 상이한 전략을 필요로 한다.
따라서, 본원에서는 증폭되는 중쇄 및 경쇄 인코딩 부위의 연결의 부재 또는 존재 하에 실행될 수 있는 다중 실시간 역전사효소 중합효소 연쇄 반응이 보고된다. 수득한 핵산의 시험관내 번역에 대해서는, 인코딩된 도메인이 사슬간 디술피드 결합의 형성에 적합한 시스테인 잔기를 포함하는 것이 유리하다.
본 발명을 실행하기에 유용한 당업자에게 공지된 방법 및 기술은 예를 들어 Ausubel, F.M., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I ~ III (1997), Wiley and Sons; Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Morrison, S.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855; US 5,202,238 및 US 5,204,244 에 보고되어 있다.
용어 "면역글로불린" 은 면역글로불린 유전자에 의해 실질적으로 인코딩된 하나 이상의 폴리펩티드(들) 로 이루어지는 단백질을 나타낸다. 인지된 면역글로불린 유전자는 상이한 불변부 유전자 뿐 아니라 무수히 많은 면역글로불린 가변부 유전자를 포함한다. 면역글로불린은 예를 들어 Fv, Fab 및 F(ab)2 뿐 아니라 단일 사슬 (scFv) 또는 디아바디 (diabody) 를 포함하는 다양한 포맷으로 존재할 수 있다. 일반적으로 면역글로불린은 2 개의 소위 경쇄 폴리펩티드 (경쇄) 및 2 개의 소위 중쇄 폴리펩티드 (중쇄) 를 포함한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 결합 파트너, 일반적으로 항원과 상호작용할 수 있는 결합 부위를 포함하는 가변 도메인 (가변부) (일반적으로 폴리펩티드 사슬의 아미노 말단 부분) 을 함유한다. 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 불변부 (일반적으로 카르복실 말단 부분) 를 포함한다. 중쇄의 불변부는 항체가 i) Fc 감마 수용체 (FcγR) 를 갖는 세포, 예컨대 식세포에 결합하거나, 상기 항체가 ii) 브람벨 (Brambell) 수용체로도 알려져 있는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) 를 갖는 세포에 결합하는 것을 매개한다. 이는 또한 보체 성분 (C1q) 과 같은 전통적 보체 시스템의 인자를 포함하는 일부 인자에 대한 결합을 매개한다. 면역 글로불린의 경쇄 또는 중쇄의 가변 도메인은 상이한 부분, 즉 4 개의 골격 부위 (FR) 및 3 개의 과가변부 (CDR) 를 포함한다.
용어 "키메라 면역글로불린" 은 제 1 의 비-인간 종류로부터의 가변 도메인, 즉 결합 부위 및 제 2 의 상이한 원천 또는 종류로부터 유래한 적어도 일부의 불변부를 포함하는 면역글로불린, 바람직하게는 단일클론 면역글로불린을 나타낸다. 키메라 면역글로불린은 일반적으로 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. 한 구현예에서 키메라 면역글로불린은 마우스, 랫트, 햄스터, 토끼 또는 양 가변 도메인 및 인간 불변부를 포함한다. 한 구현예에서 인간 중쇄 불변부는 인간 IgG 불변부이다. 또 다른 구현예에서 인간 경쇄 불변 도메인은 카파 경쇄 불변 도메인 또는 람다 경쇄 불변 도메인이다.
면역글로불린의 "Fc 부분" 은 항원에 대한 결합에 직접적으로 관련되지는 않으나, 다양한 효과기 기능을 나타낸다. 중쇄 불변부의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 의 클래스로 분류된다. 이들 클래스 중 일부는 하위클래스, 즉 IgG 는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 로, 또는 IgA 는 IgA1 및 IgA2 로 추가 분류된다. 면역글로불린이 속하는 면역글로불린의 클래스에 따라서, 면역글로불린의 중쇄 불변부는 각각 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 및 μ(IgM) 으로 지칭된다. 면역글로불린은 한 구현예에서 IgG 클래스에 속한다. "면역글로불린의 Fc 부분" 은 당업자에게 널리 공지되어 있는 용어이며 면역글로불린의 파파인 분열을 기반으로 정의된다. 한 구현예에서 면역글로불린은 Fc 부분으로서 인간 Fc 부분 또는 인간 기원에서 유래한 Fc 부분을 포함한다. 추가 구현예에서 Fc 부분은 하위클래스 IgG4 또는 IgG1 의 인간 면역글로불린의 Fc 부분이거나 하위클래스 IgG1, IgG2 또는 IgG3 의 인간 면역글로불린의 Fc 부분이며, 이는 하기 정의한 바와 같은 Fcγ 수용체 (예를 들어 FcγRIIIa) 결합 및/또는 C1q 결합이 검출될 수 없는 방식으로 변형된다. 한 구현예에서 Fc 부분은 인간 Fc 부분이고, 또 다른 구현예에서 인간 IgG4 또는 IgG1 하위클래스 Fc 부분 또는 인간 IgG1 하위클래스로부터의 돌연변이된 Fc 부분이다. 추가 구현예에서 Fc 부분은 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 인간 IgG1 하위클래스로부터의 것이다. IgG4 가 감소된 Fcγ 수용체 (FcγRIIIa) 결합을 나타내는 한편, 다른 IgG 하위클래스의 면역글로불린은 강력한 결합을 나타낸다. 그러나 Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (Fc 탄수화물의 손실), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및/또는 His435 는, 변경되는 경우, 또한 감소된 Fcγ 수용체 결합을 제공하는 잔기이다 (Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604; Lund, J., et al., FASEB J. 9 (1995) 115-119; Morgan, A., et al., Immunol. 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). 한 구현예에서 면역글로불린은 L234, L235 및/또는 D265 에 있어서 돌연변이를 갖고/갖거나 PVA236 돌연변이를 포함하는 IgG4 또는 IgG1 하위클래스 또는 IgG1 또는 IgG2 하위클래스의 Fcγ 수용체 결합에 관련된다. 또 다른 구현예에서 돌연변이는 S228P, L234A, L235A, L235E 및/또는 PVA236 (PVA236 은 IgG1 의 아미노산 위치 233 ~ 236 으로부터의 아미노산 서열 ELLG (한 글자 아미노산 코드로 주어짐) 또는 IgG4 의 EFLG 가 PVA 로 대체된 것을 의미함) 이다. 추가 구현예에서 돌연변이는 IgG4 의 S228P, 및 IgG1 의 L234A 및 L235A 이다. 한 구현예에서 중쇄 불변부는 SEQ ID NO: 01, 또는 SEQ ID NO: 02, 또는 돌연변이 L234A 및 L235A 를 갖는 SEQ ID NO: 01, 또는 돌연변이 S228P 를 갖는 SEQ ID NO: 02 의 아미노산 서열을 갖고, 경쇄 불변부는 SEQ ID NO: 03 또는 SEQ ID NO: 04 의 아미노산 서열을 갖는다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "인간 면역글로불린" 은 인간 생식 세포 면역글로불린 서열에서 유래한 가변부 및 불변부 (도메인) 를 가지며 이들 생식 세포 서열과 높은 서열 유사성 또는 동일성을 갖는 면역글로불린을 나타낸다. 항체의 불변부는 인간 IgG1 또는 IgG4 유형 또는 이의 변이체의 불변부이다. 이러한 부위는 동종이인자형일 수 있으며 예를 들어 [Johnson, G. and Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218] 및 여기서 참조된 데이터베이스에 의해 기재된다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "재조합 면역글로불린" 은 재조합 수단에 의해 생성되고, 발현되거나 창출된 면역글로불린을 나타낸다. 상기 용어는 숙주 세포, 예컨대 대장균, NS0, BHK 또는 CHO 세포로부터 단리된 면역글로불린을 포함한다. 본 발명에 따른 "재조합 인간 면역글로불린" 은 한 구현예에서 가변부 및 불변부를 재배열된 형태로 갖는다. 재조합 인간 면역글로불린은 생체내 체세포 과돌연변이를 거친다. 따라서, 재조합 인간 면역글로불린의 VH 및 VL 부위의 아미노산 서열은 정의된 인간 생식 세포 VH 및 VL 서열에 부여될 수 있으나 생체내 인간 항체 생식세포 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
용어 "단일클론 면역글로불린" 은 실질적으로 동질인 면역글로불린 집단으로부터 수득된 면역글로불린을 나타내며, 즉 상기 집단의 개별적 면역글로불린은 소량으로 존재할 수 있는 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 면역글로불린은 고도로 특이적이어서, 단일 항원 위치에 대해 유도된다. 또한, 상이한 항원 위치 (결정자 또는 에피토프) 에 대해 유도된 상이한 면역글로불린을 포함하는 다클론 면역글로불린 제제와 반대로, 각각의 단일클론 면역글로불린은 단일 항원 위치에 대해 유도된다. 그의 특이성에 추가로, 단일클론 면역글로불린은 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않고 합성될 수 있다는 점에 있어서 유리하다. 수식 어구 "단일클론" 은 실질적으로 동질인 면역글로불린 집단으로부터 수득되는 바와 같은 면역글로불린의 특징을 나타내며 임의의 특정 방법에 의한 면역글로불린의 생성을 필요로 하는 것으로서 이해되지는 않는다.
본원에서 사용하는 바와 같은 용어 "가변 도메인" (경쇄의 가변 도메인 (VL), 중쇄의 가변 도메인 (VH)) 은 표적 항원의 결합에 직접적으로 관련되는 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 페어의 개별적 도메인 각각을 나타낸다. 가변 도메인은 일반적으로 경쇄 및 중쇄의 N-말단 도메인이다. 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인은 동일한 일반적 구조를 가지며, 즉 이들은 "면역글로불린 골격" 을 갖고, 각각의 도메인은 그 서열이 광범위하게 보존되는, 3 개의 "과가변부" (또는 "상보성 결정 부위", CDR) 에 의해 연결되는 4 개의 "골격 부위" (FR) 를 포함한다. 본 출원 내에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "상보성 결정 부위" (CDR) 또는 "과가변부" (HVR) 는 항원-결합에 주로 관련되는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. "골격" 부위 (FR) 는 과가변부 외의 가변 도메인 부위이다. 그러므로, 면역글로불린의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인은 N- 에서 C-말단으로 부위 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 를 포함한다. CDR 및 FR 아미노산 잔기는 [Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 의 표준 정의에 따라 결정된다.
본 출원 내에서 사용하는 바와 같은 용어 "아미노산" 은 카르복시 α-아미노산의 기를 나타내며, 이는 직접적으로 또는 전구체 형태로 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 개별적인 아미노산은 3 개 뉴클레오티드, 소위 코돈 또는 염기-삼중체 (base-triplet) 로 이루어지는 핵산에 의해 인코딩된다. 각각의 아미노산은 하나 이상의 코돈에 의해 인코딩된다. 상이한 코돈에 의한 동일 아미노산의 인코딩은 "유전 코드의 축퇴" 로서 알려져 있다. 본 출원 내에서 사용하는 바와 같은 용어 "아미노산" 은 자연 발생적 카르복시 α-아미노산을 나타내며 알라닌 (세 글자 코드: ala, 한 글자 코드: A), 아르기닌 (arg, R), 아스파라긴 (asn, N), 아스파르트산 (asp, D), 시스테인 (cys, C), 글루타민 (gln, Q), 글루탐산 (glu, E), 글리신 (gly, G), 히스티딘 (his, H), 이소류신 (ile, I), 류신 (leu, L), 리신 (lys, K), 메티오닌 (met, M), 페닐알라닌 (phe, F), 프롤린 (pro, P), 세린 (ser, S), 트레오닌 (thr, T), 트립토판 (trp, W), 티로신 (tyr, Y) 및 발린 (val, V) 을 포함한다.
본 출원 내에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "핵산" 또는 "핵산 서열" 은 개별적 뉴클레오티드 (또한 염기로도 지칭함) 'a', 'c', 'g' 및 't' (또는 RNA 의 경우 'u') 로 이루어지는 중합체성 분자, 즉 DNA, RNA 또는 이의 변형물을 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 분자는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 분자 또는 합성 폴리뉴클레오티드 분자 또는 하나 이상의 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 분자와 하나 이상의 합성 폴리뉴클레오티드 분자의 조합일 수 있다. 또한, 하나 이상의 뉴클레오티드가 변화 (예를 들어 돌연변이유발에 의해), 결실 또는 부가되는 자연 발생적 폴리뉴클레오티드 분자가 상기 정의에 의해 포함된다. 핵산은 또 다른 핵산, 예를 들어 발현 카세트, 플라스미드 또는 숙주 세포의 염색체 내에서 통합되거나 단리될 수 있다. 핵산은 개별적 뉴클레오티드로 이루어지는 이의 핵산 서열에 의해 특징지어진다.
예를 들어 폴리펩티드의 아미노산 서열을 상기 아미노산 서열을 인코딩하는 상응하는 핵산 서열로 전환시키는 절차 및 방법이 당업자에게 널리 알려져 있다. 그러므로, 핵산은 개별적 뉴클레오티드로 이루어지는 이의 핵산 서열에 의해 특징지어지며 마찬가지로, 이에 의해 인코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 의해 특징지어진다.
단일클론 면역글로불린을 인코딩하는 핵산은 단일 튜브 실시간 역전사효소 유전자-특이적 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 을 포함하는 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로 단일 세포로부터 수득될 수 있다. 추가로, 본원에 보고하는 바와 같은 PCR 방법 및 시험관내 번역의 조합으로 단일클론 면역글로불린을 인코딩하는 핵산이 단일 세포로부터 수득될 수 있으며, 인코딩된 면역글로불린이 면역글로불린의 결합 특성 분석에 충분한 양으로 적어도 Fab 단편으로서 제공될 수 있다. 단일 세포로부터 수득한 매우 소량의 mRNA 를 증폭하기 위해서, PCR (중합효소 연쇄 반응) 은 매우 민감해야 한다.
따라서, 단일 세포로부터의 IgG 동형 면역글로불린의 동족 IgG HC (면역글로불린 G 중쇄) 및 IgG LC (면역글로불린 G 경쇄) 를 인코딩하는 핵산의 증폭, 이후 수득한 증폭된 핵산의 시험관내 번역을 기반으로 Fab 단편 또는 전체 면역글로불린이 제공될 수 있다. 이러한 방법으로 단일 세포에 의해 생성된 면역글로불린에 대한 정보를 획득하기 위한 높은 민감도의 방법이 제공된다. 이는 심지어 단일 세포의 극미량의 mRNA 로도 가능하다. 본 발명에 따른 방법은 단일 세포에 의해 발현된 면역글로불린의 결합 특징의 생화학적 분석을 가능하게 한다. 따라서 이러한 방법으로, 하이브리도마 기술과 대조적으로 더 높은 다양성의 분석이 이루어질 수 있다. 또한, 동족 면역글로불린 사슬이 예를 들어 항원 접촉 후 성숙 B-세포로부터 수득될 수 있기 때문에, 선택적으로 고 특이적 및 올바르게 어셈블링된 면역글로불린을 인코딩하는 핵산이 수득될 수 있다.
본원에서 보고하는 바와 같은, 단일 세포로부터 면역글로불린 Fab 단편을 인코딩하는 핵산을 수득하는 방법은 단일 B-세포로부터의 동족 IgG HC 및 IgG LC 인코딩 핵산 (인간 IgG 동형) 의 증폭을 위한 단일 튜브 실시간 다중 세미-네스티드 PCR 을 포함한다. 그 후, 상기 Fab-단편은 대장균 세포 용해물을 사용하여 시험관내 번역될 수 있다. ELISA 및 웨스턴 블롯 방법을 사용하여 발현을 확인할 수 있다.
일반적으로, 본원에서 보고하는 바와 같은 방법은 하기의 일반적 단계를 포함한다:
i) 말초 혈액으로부터의 인간 CD19 B-세포로 코팅된 자석 마이크로비드를 사용하여 단리하는 단계,
ii) 예를 들어 제한 희석 또는 FACS 에 의해 단일 세포를 침적하는 단계,
iii) 개별화된 B-세포의 mRNA 를 추출하는 단계,
iv) 개별화된 B-세포에 의해 생성된 면역글로불린의 하나 이상의 가변 도메인 (VH 및 VL) 을 인코딩하는 하나 이상의 핵산을 수득하는 단계,
v) 시험관내 RNA 주형을 번역하는 단계, 및
vi) 임의로는, 면역글로불린 또는 면역글로불린 단편의 결합 특성을 분석하는 단계.
본원에서 보고하는 바와 같은 PCR-기재 접근법은 고도로 민감하며 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄 또는 이의 단편을 인코딩하는 증폭된 핵산의 높은 회수를 초래한다. 또한, 본원에서 보고하는 바와 같은 PCR-기재 방법으로 수득한 핵산의 시험관내 번역 후 기능적이고 안정한 Fab 단편의 발현 방법이 제공된다.
상호교환가능하게 사용될 수 있는 용어 "중합효소 연쇄 반응" 및 "PCR" 은 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA 의 부위를 특이적으로 증폭하는 방법을 나타낸다. 상기 방법은 K. Mullis (예를 들어 Winkler, M.E., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 (1982) 2181-2185 참조) 에 의해 개발되었다. 상기 부위는 단일 유전자, 유전자의 일부, 코딩 또는 비-코딩 서열일 수 있다. 대부분의 PCR 방법은 통상 수백 베이스 페어 (bp) 의 DNA 단편을 증폭시키지만, 일부 기술은 40 킬로 베이스 페어 (kb) 크기 이하의 단편을 증폭시킬 수 있다. 기본적인 PCR 셋업에는 여러 성분 및 시약이 필요하다. 이들 성분은 증폭시킬 부위를 포함하는 핵산 주형, 증폭시킬 부위의 5'- 및 3'-말단에 대해 상보적인 2 개 프라이머, 중합효소 예컨대 Taq 중합효소 또는 또 다른 내열성 중합효소, 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP) (이로부터 중합효소가 새로운 가닥을 합성함), 중합효소의 최적 활성 및 안정성을 위한 적합한 화학적 환경을 제공하는 완충액, 2 가 양이온, 일반적으로 Mg2 +, 및 마지막으로, 1 가 양이온 예컨대 칼륨 이온을 포함한다.
상호교환가능하게 사용될 수 있는 용어 "다중 중합효소 연쇄 반응" 또는 "다중 PCR" 은 단일 PCR 반응/혼합물에서 다수의, 고유 프라이머를 이용하여 상이한 DNA 서열에 특이적인 가변적 크기의 앰플리콘 (amplicon) 을 생성시키는 중합효소 연쇄 반응을 나타낸다. 다수의 유전자를 동시에 표적화하여, 단일한 시험 실행으로부터 추가적인 정보를 수득할 수 있는데, 그렇지 않으면 수행하기 위해 수 배의 시약 및 더 많은 시간이 필요하다. 각각의 프라이머 세트에 대한 어닐링 온도는 단일 반응 내 올바른 작동을 위해 최적화되어야 한다. 게다가, 앰플리콘 크기는 겔 전기영동에 의해 가시화될 때 별개의 밴드를 형성하기에 충분하게 상이해야 한다.
인간 게놈에서 면역글로불린 인코딩 유전자를 포함하는 염색체 유전자 좌위는 염색체 2, 14 및 22 상에 위치한다 (도 1 참조). 인간 면역글로불린 G 중쇄 유전자 좌위는 유전자 좌위에서 다음과 같은 염색체 배향을 갖는 염색체 14 (14q32.2) 상에서 발견될 수 있다: 말단소체 -5'-말단-VH-D-JH-CH-3'-말단 - 동원체. 염색체 상의 VH 부분은 하기 표 1 에서 나타낸 바와 같이 분류된다.
표 1: Matsuda, F., et al., J. Exp. Med. 188 (1998) 2151-2162 및 Tomlinson, I.M., et al., V Base sequence directory 1999 에 따른 VH-유전자의 VH 패밀리로의 그룹화.
Figure pct00001
인간 면역글로불린 G 중쇄 유전자 좌위는 전체 123-129 VH-유전자를 포함하며, 이 중 51 개는 기능적이고, 7 개 패밀리로 그룹화된 23 개의 기능적 D-유전자 (D=다양성), 6 개의 기능적 JH-유전자 (J=연결) 및 가장 빈번한 일배체형의 9 개의 기능적 CH-유전자 (C=불변) 이다.
카파 (κ) 유형 및 람다 (λ) 유형의 인간 면역글로불린 G 경쇄에 대한 유전자 좌위는 2 개의 상이한 염색체, 염색체 2 및 22 상에 위치한다. 카파 경쇄 유전자 좌위는 염색체 2 의 단완 (2p11.2) 상에서 발견될 수 있으며 40 개의 기능적 Vκ-유전자 부분을 포함한다. 이들은 7 개 패밀리로 그룹화된다. 유전자 좌위는 또한 5 개의 Jκ-유전자 및 단일 Cκ-유전자를 포함한다 (Schable, K.F. and Zachau, H.G., Biol. Chem. Hoppe Seyler 374 (1993) 1001-1022; Lefranc, M.P., Exp. Clin. Immunogenet. 18 (2001) 161-174).
표 2: Foster, S.J., et al., J. Clin. Invest. 99 (1997) 1614-1627 에 따른 Vκ-유전자의 Vκ 패밀리로의 그룹화
Figure pct00002
람다 경쇄 유전자 좌위는 염색체 22 의 장완 (22p11.2) 상에서 발견될 수 있고, 73-74 개의 Vλ-유전자를 포함하며 이 중 30 개는 기능적이다. 이들은 추가로 3 개의 클러스터로 그룹화되는 10 개 패밀리로 그룹화된다. 유전자 좌위는 또한 7 개의 Jλ-유전자를 포함하며 이 중 5 개는 기능적이다.
표 3: Frippiat, J.P., et al., Hum. Mol. Genet. 4 (1995) 983-991; Farner, N.L., et al., J. Immunol. 162 (1999) 2137-2145; Lefranc, M.P., Exp. Clin. Immunogenet. 18 (2001) 242-254 에 따른 Vλ-유전자의 Vλ 패밀리로의 그룹화
Figure pct00003
단일 면역글로불린 생성 세포, 예를 들어 단일 B-세포로부터의 IgG HC 및 LC 또는 이의 하나 이상의 가변 도메인을 인코딩하는 핵산의 PCR-기재 증폭은 B-림프구의 단일 세포 침적 후 중쇄 및 경쇄 가변 도메인에 대한 특이적 프라이머를 사용한 PCR 기재 핵산 증폭을 기반으로 한다. PCR 결과는 사용한 PCR 프라이머에 따라 본질적으로 좌우된다. 최대한, 사용한 프라이머는 모든 V-유전자를 커버해야 하며, 이량체를 형성하기 쉬워서는 안되며, 면역글로불린을 인코딩하는 cDNA 에 특이적으로 결합해야 한다. 따라서, 한 구현예에서 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 cDNA 로부터 수득된다.
인간 면역글로불린 G 유전자 좌위 상의 다수의 기능적 유전자로 인해, PCR 반응에서 상이한 프라이머를 이용하여 가능한 한 많은 공지된 유전자를 커버하는 것이 필요하다. 그러므로, 축퇴성 프라이머 (degenerated primer) 세트를 구축하였으며, 이는 또한 본 발명의 한 양상이다. 한 구현예에서 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 핵산의 증폭은 하나의 중합효소 연쇄 반응으로 수행된다. 이 구현예에서 프라이머는 동일한 PCR 조건을 감안하기 위해 대략 동일한 길이의 핵산 증폭이 이루어지도록 선택된다. 이 구현예에서 중쇄를 인코딩하는 핵산에 대한 프라이머가 사용되며, 이 중 하나는 중쇄 CH1 부위에서 결합하고, 그에 따라 경쇄를 인코딩하는 상응하는 핵산의 크기와 필적할만한 크기의 핵산 단편이 제공된다.
본원에서 보고하는 바와 같은 방법에서 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을, 단일한 다중 중합효소 연쇄 반응에서 상이한 5'- 및 3'-프라이머의 조합에 의해 단일한 중합효소 연쇄 반응에서 수득한다.
본 발명의 또 다른 양상은 하기 단계를 포함하는 단일 세포로부터 하나 이상의 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 방법이다:
- 2 개의 5'-프라이머 및 2 개의 3'-프라이머 및 2 개의 TaqMan 프로브를 포함하는 프라이머 세트를 사용하여 역전사 및 중합효소 연쇄 반응을 1 단계로 수행하는 단계.
상기 방법의 한 구현예에서 다중 실시간 단일 튜브 역전사 유전자 특이적 프라이머 중합효소 연쇄 반응에서 사용한 5'-프라이머는 면역글로불린의 제 1 골격 부위에 대한 코딩 부위에서 결합한다. 또 다른 구현예에서 PCR 반응에서 사용한 프라이머는 5'-프라이머에 대한 번역 시작 코돈 ATG 및/또는 3'-프라이머에 대한 번역 중지 코돈 TTA 를 인코딩하는 오버행을 갖는다. 이러한 오버행은 수득한 핵산의 시험관내 번역을 위한 핵산 생성용 임의의 후속 오버랩 (overlapping) 중합효소 연쇄 반응에서 유용할 수 있다. 한 구현예에서 상기 방법은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 수득하기 위한 것이다. 한 구현예에서 면역글로불린 가변 도메인은 면역글로불린 중쇄 가변 도메인 또는 면역글로불린 카파 경쇄 가변 도메인 또는 면역글로불린 람다 경쇄 가변 도메인이다.
한 구현예에서 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하기 위한 다중 단일 튜브 실시간 PCR 에서 사용한 프라이머는 SEQ ID NO: 05 및 06 의 핵산 서열을 갖는다.
표 4: 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하기 위한 다중 실시간 PCR 반응에서 사용한 프라이머
Figure pct00004
본 발명에 따른 방법의 한 구현예에서 면역글로불린 카파 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하기 위한 다중 단일 튜브 실시간 PCR 에서 사용한 프라이머는 SEQ ID NO: 07 및 08 의 핵산 서열을 갖는다.
표 5: 면역글로불린 카파 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하기 위한 다중 단일 튜브 실시간 PCR 에서 사용한 프라이머
Figure pct00005
본 발명에 따른 방법의 한 구현예에서 PCR 결과를 정량하기 위한 다중 단일 튜브 실시간 PCR 에서 사용한 TaqMan 프로브는 SEQ ID NO: 09 및 10 의 핵산 서열을 갖는다.
표 6: 면역글로불린 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하기 위한 다중 단일 튜브 실시간 PCR 에서 사용한 TaqMan 프로브
Figure pct00006
본원에서 보고하는 바와 같은 PCR 방법 및 무세포 (cell-free) 시험관내 번역 시스템의 조합으로, 면역글로불린의 결합 특성 분석에 충분한 양으로 동족 면역글로불린 VH 및 VL 도메인을 인코딩하는 핵산을 Fab 단편으로서 수득할 수 있다. 단일 세포로부터 수득한 매우 소량의 mRNA 를 증폭하기 위해서, PCR (중합효소 연쇄 반응) 은 매우 민감해야 한다.
용어 "무세포 시험관내 번역 시스템" 은 리보솜, tRNA, ATP, CGTP, 뉴클레오티드 및 아미노산을 포함하는 원핵 또는 진핵, 바람직하게는 원핵 세포의 무세포 용해물을 나타낸다. 한 구현예에서 원핵생물은 대장균이다.
무세포 시험관내 번역은 오랫동안 기술적 수준에 있어서 공지되어 온 방법이다. Spirin 등은 1988 년에 연속 흐름 무세포 (CFCF) 번역 및 커플링된 전사/번역 시스템 (상대적으로 높은 양의 단백질 합성이 발생함) 을 개발하였다 (Spirin, A.S., et al., Science 242 (1988) 1162-1164). 이러한 무세포 시험관내 번역을 위해서, 리보솜을 포함하는 세포 용해물을 번역 또는 전사/번역에 사용하였다. 이러한 대장균으로부터의 무세포 추출물은 예를 들어 Zubay (Zubay, G., et al., Ann. Rev. Genetics 7 (1973) 267-287) 에 의해 발전되었으며 Pratt (Pratt, J.M., et al., Nucleic Acids Research 9 (1981) 4459-4474; 및 Pratt, J.M., et al., Transcription and Translation: A Practical Approach, Hames and Higgins (eds.), 179-209, IRL Press (1984)) 에 의해 사용되었다. 무세포 단백질 합성의 추가적인 발달이 US 5,478,730, US 5,571,690, EP 0 932 664, WO 99/50436, WO 00/58493 및 WO 00/55353 에서 보고되어 있다. 진핵 무세포 발현 시스템이 예를 들어 Skup, D. and Millward, S., Nucleic Acids Research 4 (1977) 3581-3587; Fresno, M., et al., Eur. J. Biochem. 68 (1976) 355-364; Pelham, H.R. and Jackson, R.J., Eur. J. Biochem. 67 (1976) 247-256 및 WO 98/31827 에서 보고되어 있다.
단일 세포로부터의 IgG 동형 면역글로불린의 동족 IgG HC (면역글로불린 G 중쇄) 및 IgG LC (면역글로불린 G 경쇄) 인코딩 핵산의 증폭 및 수득한 핵산의 후속적인 시험관내 번역을 기반으로, 면역글로불린의 Fab 단편이 수득될 수 있으며, 수득가능한 극미량의 mRNA 로부터 단일 세포에 의해 생성된 면역글로불린에 대한 정보를 획득하기 위한 높은 민감도의 방법이 제공될 수 있다. 본원에 보고되는 바와 같은 방법은 단일 B-세포의 면역글로불린의 분석을 가능하게 하며, 그에 따라 하이브리도마 기술과 대조적으로 더 높은 다양성을 제공한다. 또한, 동족 면역글로불린 가변 도메인 또는 면역글로불린 사슬이 항원 접촉 후 성숙 B-세포로부터 수득될 수 있기 때문에, 선택적으로 고 특이적 및 올바르게 어셈블링된 면역글로불린을 인코딩하는 핵산이 수득될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 한 양상은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 Fab 단편 생성 방법이다:
- 단일 면역글로불린 생성 세포를 제공하는 단계,
- 본원에서 보고하는 바와 같은 단일 튜브 실시간 다중 역전사효소 PCR 로, 상기 세포로부터 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하고 임의로는 또한 일부의 경쇄 불변 도메인 및 일부의 중쇄 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계,
- 임의로는, 수득한 핵산을 포함하는 선형 발현 매트릭스를 생성시키는 단계,
- 핵산을 시험관내 번역하고 그로써 면역글로불린 Fab 단편을 생성시키는 단계.
한 구현예에서 번역하는 것은 대장균 세포 용해물을 사용하여 핵산을 시험관내 인큐베이션함에 의한 것이다.
본 발명에 따른 방법으로 단일 세포로부터 수득한 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린의 재조합체를 생성하기 위해서, 경쇄 및 중쇄 면역글로불린의 가변 도메인을 인코딩하는 수득한 핵산을 추가로 개질시킬 수 있다. 예를 들어, 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 면역글로불린 불변부 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산과 조합될 수 있다. 한 구현예에서 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 03 의 인간 카파 경쇄 불변 도메인을 인코딩하는 핵산 또는 SEQ ID NO: 04 의 인간 람다 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산과 조합된다. 또 다른 구현예에서 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산은 SEQ ID NO: 01 의 인간 면역글로불린 G1 (IgG1) 불변부를 인코딩하는 핵산 또는 SEQ ID NO: 02 의 인간 면역글로불린 G4 (IgG4) 불변부를 인코딩하는 핵산과 조합된다.
전체 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 또는 이의 단편을 인코딩하는 핵산 분자를 하기에서 구조적 유전자로 지칭한다. 이들은 동일한 발현 플라스미드 상에 위치할 수 있거나 상이한 발현 플라스미드 상에 위치할 수 있다. 전체 면역글로불린 또는 Fab-단편의 어셈블리는 면역글로불린이 배양 배지로 분비되기 전에 발현 세포 내에서 발생한다. 그러므로, 면역글로불린 사슬을 인코딩하는 핵산 분자는 한 구현예에서 동일한 숙주 세포 내에서 발현된다. 재조합 발현 후 면역글로불린의 혼합물이 수득되는 경우, 이들은 당업자에게 공지된 방법에 의해 분리되고 정제될 수 있다. 이들 방법은 잘 확립되어 있으며 면역글로불린 정제에 광범위하게 사용되고, 단독으로 또는 조합으로 사용된다. 이러한 방법은 예를 들어, 미생물-유래 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어 양이온 교환 (카르복시메틸 수지), 음이온 교환 (아미노 에틸 수지) 및 혼합-방식 교환 크로마토그래피), 황친화성 흡착 (예를 들어 베타-머캅토에탄올 및 기타 SH 리간드 사용), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피 (예를 들어 페닐-세파로오스, 아자-아레노필릭 (aza-arenophilic) 수지 또는 m-아미노페닐보론산 사용), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피 (예를 들어 Ni(II)- 및 Cu(II)-친화성 물질 사용), 크기 배제 크로마토그래피 및 제조용 (preparative) 전기영동 방법 (예컨대 겔 전기영동, 모세관 전기영동) (Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102) 이다.
"작동가능하게 연결" 은 2 개 이상의 성분의 병렬 배치를 지칭하며, 이때 그렇게 기재되는 상기 성분은 의도된 방식으로 이들을 기능하게 하는 관계에 있다. 용어 "...을 작동가능 형태로 연결하는" 은 개별적 핵산이 최종 핵산에서 작동가능하게 연결되는 방식으로의 2 개 이상의 개별적 핵산의 조합을 나타낸다. 예를 들어 프로모터 및/또는 인핸서는, 연결된 서열의 전사를 제어하거나 조절하기 위해 시스 (cis) 로 작용하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 반드시 그러한 것은 아니지만 일반적으로, "작동가능하게 연결되는" DNA 서열은 인접하며 필요한 경우 2 개 단백질 인코딩 부위 예컨대 제 1 도메인 및 제 2 도메인, 예를 들어 면역글로불린 가변 도메인 및 면역글로불린 불변 도메인 또는 불변부를 연결하고, 인접하며 (판독) 프레임 내에 있다. 번역 중지 코돈은, 코딩 서열의 다운스트림 말단 (3'-말단) 에 위치하는 경우 엑손 핵산 서열에 작동가능하게 연결되어, 코딩 서열을 통해 중지 코돈으로 번역이 진행되며 중지 코돈에서 종료된다. 당업계에 공지되어 있는 재조합 방법에 의해, 예를 들어 PCR 방법론을 사용하고/사용하거나 편리한 제한효소 위치에서의 라이게이션에 의해 연결이 이루어진다. 편리한 제한효소 위치가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 종래 실행에 따라 사용한다.
따라서, 본 발명의 한 양상은 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 생성 방법이다:
- 단일 면역글로불린 생성 세포를 제공하는 단계,
- 본원에서 보고하는 바와 같은 방법으로, 상기 세포로부터 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계,
- 경쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 SEQ ID NO: 03 또는 SEQ ID NO: 04 의 면역글로불린 경쇄 불변 도메인을 인코딩하는 핵산과 작동가능 형태로 연결시키고, 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 SEQ ID NO: 01 또는 SEQ ID NO: 02 의 면역글로불린 중쇄 불변부를 인코딩하는 핵산과 작동가능 형태로 연결시키는 단계,
- 이전 단계의 핵산으로 진핵 또는 원핵 세포를 트랜스펙션시키는 단계,
- 상기 트랜스펙션된 세포를 면역글로불린 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 단계,
- 면역글로불린을 세포 또는 배양 배지로부터 회수하고, 그로써 면역글로불린을 생성시키는 단계.
용어 "~의 발현에 적합한 조건 하" 는 이종 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포의 배양에 사용되며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있거나 공지되어 있는 조건을 나타낸다. 이들 조건이 배양된 세포 유형 및 발현된 폴리펩티드 유형에 따라 가변적일 수 있다는 것이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로 상기 세포는 예를 들어 20℃ 내지 40℃ 의 온도에서, 컨쥬게이트를 효과적으로 생성시키기에 충분한 시간, 예를 들어 4 일 내지 28 일 동안, 0.01 리터 내지 107 리터의 부피로 배양된다.
하기의 실시예, 서열 목록 및 도면을 제공하여 본 발명의 이해를 도우며, 이의 참된 범주를 첨부된 특허청구범위에서 나타낸다. 나타낸 절차에 있어서 본 발명의 취지에서 벗어나지 않고 변형을 가할 수 있다는 것이 이해된다.
서열 목록의 기재
SEQ ID NO : 01 - 인간 IgG1 중쇄 불변부
SEQ ID NO : 02 - 인간 IgG4 중쇄 불변부
SEQ ID NO : 03 - 인간 IgG 카파 경쇄 불변 도메인
SEQ ID NO : 04 - 인간 IgG 람다 경쇄 불변 도메인
SEQ ID NO : 05 - VH-프라이머
SEQ ID NO : 06 - VCH-프라이머
SEQ ID NO : 07 - VL-프라이머
SEQ ID NO : 08 - VCL-프라이머
SEQ ID NO : 09 - TaqMan 프로브 1
SEQ ID NO : 10 - TaqMan 프로브 2
SEQ ID NO : 11 - 오버랩 PCR 용 프라이머 1
SEQ ID NO : 12 - 오버랩 PCR 용 프라이머 2
도면의 설명
도 1: 인간 면역글로불린 G 중쇄 유전자 좌위 (A), 인간 면역글로불린 카파 경쇄 유전자 좌위 (B) 및 인간 면역글로불린 람다 경쇄 유전자 좌위 (C) 의 염색체 상의 위치 결정 (Chromosomal localization).
실시예
재료 & 방법
B-세포 및 혈장 세포:
이러한 접근법에서 사용한 샘플은 인간 IgG 에 대한 트랜스제닉 마우스의 건강한 공여체 및 조직 (비장, 골수) 의 말초 혈액으로부터 단리한 B-세포 및 혈장 세포이다. 고형 조직은 먼저 별개의 튜브 내에서 DMEM 중 수동으로 분해시킨다. 이후 단계에서, 부드러운 취급과 저온이 세포 용해를 최소화하는데, 이는 관심 세포가 추후 확실히 단리되고 mRNA 의 공급원이 손상되지 않게 하는데 있어서 중요하다. 분해된 조직을 세포 분리 배지의 세심한 첨가에 의해 현탁하여 상이한 세포 유형 구배를 만든다 (피콜 (Ficoll) 밀도 구배를 갖는 Leucosep-튜브 (Greiner Bio-One)). 현탁된 세포를, 혈장 세포 (PBMC) 및 림프구를 풍부하게 하기 위해 파쇄 없이, 원심분리기에서 800 x g 및 22℃ 에서 20 분 동안, 냉각된 분리 배지 상에서 원심분리에 의해 정제한다. 세포를 냉각된 완충액 (PBS (인산 완충 식염수), 0.1% (w/v) BSA (소 혈청 알부민), 2 mM EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세테이트)) 중에서 세척하고, 림프구만을 갖도록 상청액을 주의하여 폐기한다. 림프구를 PBS 중에 재현탁하고, 조심스럽게 피펫팅하여 혼합한다. 원심분리를 5 분 동안 800 x g 및 22℃ 에서 수행하여 세포를 펠렛화한다. B-세포 및 혈장 세포를 쥐과 및 인간 FC 차단제로 전처리하여 그의 세포 표면 상의 비특이적 Ab 결합을 차단한다. 세포를 완충액 (PBS, 0.1% (w/v) BSA, 2 mM EDTA) 으로 1 회 세척하고, 원심분리하고 PBS 중에서 재현탁한다. CD19+ B-세포 및 CD138+ 혈장 세포만을 사용하였다. mRNA 분해를 방지하기 위해서 RNAse 저해제를 첨가한다. 마우스 비장으로부터의 CD19+ B-세포 (Dynal Biotech Dynabeads CD19 Pan B) 의 확실한 단리를 제조사의 지시사항에 따라 실행하였다. 제조사의 지시사항에 따라, CD138+ 혈장 세포의 선택을 실행하였다 (StemCell Technologies EasySep Human CD138 Selection Kit).
제한-희석 배양 원칙 또는 FACS 분류에 의한 단일 세포로의 분리:
세포를 계수하고, 제한-희석 배양의 원칙에 의해, 단일 세포로서 96-웰 PCR 플레이트 또는 384-웰 플레이트에 침적시킨다. 플레이트를 PCR 필름으로 밀봉하고 즉시 얼음 상에 둔다. 분류된 세포를 즉시 RT-PCR (역전사효소 중합효소 연쇄 반응) 에서 사용할 수 있거나, 단기간 용도로는 -20℃ 에서 또는 장기간 용도로는 -80℃ 에서 보관할 수 있다. 단일-세포 분류를 FACSAria 세포-분류 시스템 (Becton Dickinson) 에서 수행하였다. CD19 에 대해 양성으로, CD38 에 대해 상당히 양성으로, 그리고 CD45 에 대해 중간 정도 양성으로 염색된 세포를 수집하고 혈장 세포 (PC) 로 지정하였다. 전방 산란/측방 산란 및 측방 산란 너비/측방 산란 높이에 대한 추가적인 게이트를 포함시켜, 각각 생존 림프구 및 단일항을 선택하였다. 단일 세포를, 10 μl 의 부피로 모든 필요 PCR 시약 (역전사효소, DNA 중합효소, 완충액 및 dNTP 제외) 을 함유하는 96-웰 PCR 플레이트 (Eppendorf) 의 웰에 직접적으로 분포시키고 후속 처리를 위해 -80℃ 에서 동결시켰다.
1 단계 다중 실시간 역전사효소 유전자-특이적 PCR :
중합효소 연쇄 반응에서 mRNA 를 증폭시킬 수 있게 하기 위해서는, B-세포 및 혈장 세포를, 10 μl 의 부피로 모든 필요 PCR 시약 (역전사효소, DNA 중합효소, 완충액 및 dNTP 제외) 을 함유하는 96-웰 PCR 플레이트 (Eppendorf) 에 직접적으로 분포시키고 후속 처리를 위해 -80℃ 에서 동결시켜야 한다.
RT -단계:
역전사 및 PCR 을 1 단계로 수행하였다 (1 단계 다중 RT-PCR). 단리, 분류 및 보관된 세포를 역전사 또는 RT-PCR 에 대한 원재료로서 사용하였다. 모든 필요 시약을 실온에서 해동시켰다. 모든 프라이머를 MOLBIOL TIB GmbH laboratories 에서 합성하였다. 플레이트 및 모든 기타 시약을 전체 절차 동안 얼음 상에서 유지시켰다. cDNA 합성을 위해 연장된 유전자 특이적 프라이머를 직접 사용하였다. 효소 복합체는 2 개의 Sensiscript 역전사효소 및 1 개의 Omniscript 중합효소로 이루어진다 (Qiagen OneStep RT PCR). Sensiscript 복합체에 의해 mRNA 의 cDNA 로의 개작을 수행하였고 (Qiagen OneStep RT PCR), 본래 대장균에서 발현된 테르모스 아쿠아티쿠스 (Thermos aquaticus) 로부터 단리된 재조합 94 kDa DNA 중합효소 (데옥시뉴클레오시드-트리포스페이트: DNA 데옥시뉴클레오티딜트랜스퍼라아제, EC 2.7.7.7) 의 화학적 형태인 HotStarTaq DNA 중합효소를 사용하여 cDNA 의 증폭을 수행하였다 (Qiagen OneStep RT PCR). 세포를 96-웰 PCR 플레이트 내에서 분류하고 10 μl 의 부피 (5 μl PCR 등급 H2O, VH 및 VL 에 대한 1 μl 0.1 μM 프라이머, 1 μl RNAse 저해제 20 U/반응 및 3 μl Tris 1.5 mM 함유) 로 보관하였다. PCR 반응 수행을 위해 다른 10 μl 를 첨가하기 전에, -60℃ 에서 보관한 세포를 짧게 원심분리 (1400 rpm 에서 20 초) 하여 웰 하부에 액체 및 세포를 수집하였다.
표 7: RT-PCR 에 대해 사용한 마스터 믹스 1
Figure pct00007
표 8: RT-PCR 에 대해 사용한 마스터 믹스 2
Figure pct00008
웰 당 10 μl 의 마스터 믹스 2 를 세포에 첨가하였다. 두 번째 마스터 믹스는 2.2 μl PCR 등급 H2O, 4 μl 의 1x 완충액, 0.8 μl 의 dNTP (각 400 μM), 1 μl 의 Q-solution 0.25x, 1.2 μl 의 효소 복합체 및 1 μl 의 RNAse 저해제 20U 를 함유하였다.
표 9: RT-PCR 에 대해 사용한 프라이머
Figure pct00009
표 10: RT-GSP-PCR 에 대한 블록 사이클러 (block cycler) 프로그램
Figure pct00010
PCR 생성물의 정제:
다음의 오버랩 PCR (세 번째 PCR) 에서의 시험관내 번역을 위한 선형 주형 생성의 효율을 향상시키기 위해서, PCR 증폭 동안 사용한, 전사 반응에 포함되지 않은 (unincorporated) 프라이머, dNTP, DNA 중합효소 및 염의 제거에 의해 이전에 증폭된 PCR 생성물의 정제를 수행하여 다운스트림 적용에서의 간섭을 방지하였다. Agencourt AMPure 를 사용하였다. 완충액을 최적화하여 PCR 앰플리콘 100 bp 이상을 상자성 비드에 선택적으로 결합시킨다. 간단한 세척 절차를 사용하여 과량의 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 염 및 효소를 제거할 수 있다. 생성된 정제 PCR 생성물은 본질적으로 오염물이 없으며 하기 적용에서 사용될 수 있다: 형광 DNA 서열분석 (모세관 전기영동 포함), 마이크로어레이 스포팅 (spotting), 클로닝 및 프라이머 연장 유전형 분석. 가라앉을 수 있는 임의의 자석 입자를 재현탁시키기 위해 보관된 비드를 부드럽게 진탕하면서 96-웰 포맷에 대한 작업 흐름을 시작하였다. 적절한 부피의 비드 용액 36 μl 를 20 μl 의 샘플에 첨가하고, 믹스를 10 회 상하로 피펫팅하였다. 다음 단계에서 10 분 동안 인큐베이션하고, 이후 반응 플레이트를 10 분 동안 자석 플레이트에 두어 용액으로부터 비드를 분리하였다. 맑은 용액 (상청액) 을 반응 플레이트로부터 흡입하고 폐기하였다. 비드-cDNA 세척을 위해 200 μl 의 70% 에탄올을 각 웰 마다 분산시키고 실온에서 30 초 이상 동안 인큐베이션하였다. 에탄올을 흡입해내고 폐기하였다. 세척 단계를 2 회 수행한 후, 반응 플레이트를 실온에서 20 분 동안 자연건조시켰다. 이후 40 μl 의 용리 완충액을 첨가하고, 믹스를 다시 10 회 상하로 피펫팅하였다. 자석 비드로부터의 cDNA 분리 후에, 정제된 DNA 를 새로운 플레이트에 옮겼다.
오버랩 연장 PCR :
증폭된 DNA 를 이후 전사/번역 단계에 필요한 하기 성분을 사용하여 오버랩 연장 PCR 방법에 의해 연결시켰다: 리보솜 결합 위치 (RBS), T7 프로모터 및 T7 터미네이터 서열. 이러한 PCR 을 위해서, 2 μl 의 두 번째 PCR 생성물을 최종 부피 20 μl {10.7 μl 물, MgCl2 (10 mM) 를 갖는 2 μl 의 10x 반응 완충액, 0.8 μl 의 DMSO, 0.5 μl dNTP (각각 10 mM), 1.6 μl T7 프로모터 및 터미네이터 프라이머 (각각 6 μM), 0.4 μl C-말단 HA-Tag 프라이머 및 0.4 μl 의 효소 배합물 (모두 RTS E.coli Linear Template Generation Set, HA-Tag (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 로부터의 것임) 함유} 가 되도록 수행하였다. 마지막으로, 오버랩 PCR 생성물을 대장균 (Escherichia coli) 용해물을 사용하는 시험관내 번역을 위한 주형으로서 사용하였고, 생성된 기능적 Fab 를 효소-연결 면역흡착제 검정 (ELISA) 에 의해 F(ab')2 IgG 에 대해서 스크리닝하였다.
표 11: PCR 에 대해 사용한 성분
Figure pct00011
표 12: 세 번째 PCR 에 대한 블록 사이클러 프로그램
Figure pct00012
겔 전기영동:
겔 전기영동 분석 (1% 아가로오스 겔, Invitrogen Corp., USA) 을 수행하여 적절한 대조군과 함께 cDNA 주형의 증폭 및 특이성을 평가하였다.
표 13: 겔 분석 프로토콜
Figure pct00013
시험관내 전사 및 번역:
시험관내 결합형 전사 및 번역을, 보고한 바와 같은 성분을 사용하여 RTS 100 E.coli Disulfide Kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 의 제조사 프로토콜에 따라 실행하였다 (표 12 참조). 4 μl 의 각각의 오버랩 PCR 생성물을 RTS Proteo Master 기기 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 에서, 총 부피 50 μl 로, 37℃ 에서 20 시간 동안 전사 및 번역하였다. 동일 조건 하에 cDNA 주형을 사용하지 않고 대조군 반응을 수행하였다. GFP (녹색 형광 단백질) 벡터를 양성 대조군으로서 방사능 사진 촬영용 반응 시스템에 첨가하였다. 시험관내 전사/번역 후에, 50 μl 반응 혼합물을 75 μl PBS (1:2.5 희석) 중에 옮기고 4℃ 에서 밤새 인큐베이션하여 단백질을 올바르게 폴딩 (folding) 및 성숙시켰다.
표 14: 시험관내 전사 및 번역을 위한 성분
Figure pct00014
ELISA :
384-웰 플레이트 (Nunc GmbH & Co. KG, Thermo Fisher Scientific, Langenselbold, Germany) 를 50 μl (PBS 중 1:1000) 염소 항-인간 IgG Fab 단편 (Bethyl Laboratories Inc. 에 의해 제조, Biomol GmbH, Hamburg, Germany 로부터 수득, 1 mg/1 ml) 으로 코팅하고 4℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 상기 플레이트를 세척 용액 (100 μl PBST (인산 완충 식염수 Tween-20)) 으로 3 회 세척하고 60 μl 의 차단 용액 (Blocking solution) (0.25% CroteinC (w/v)/0.5% Tween (w/v)/PBS) 을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 또 다른 세척 단계 (3x100 μl PBST) 를 수행하고, 37.5 μl 샘플 뿐 아니라 37.5 μl 음성 대조군 (시험관내 전사/번역으로부터의 음성 대조군) 및 37.5 μl 양성 대조군 (0.75 μl 의 인간 재조합 Fab 단편 (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) 함유) 을 옮겼다. 샘플을 1:3 희석으로 적정하였다. 플레이트를 실온에서 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 단계 (3x100 μl PBST) 후, 25 μl 염소 항-인간 IgG F(ab')2 (Dianova, Hamburg, Germany; 0.8 mg/ml (차단 용액 중 1:2000 희석)) 를 첨가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막 세척 단계 (3x100 μl PBST) 를 수행하고 25 μl 의 TMB (POD Substrate, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, Art-No: 1 484 281) 를 각각의 웰 내로 피펫팅하였다. 2-3 분 후, 흡수 신호를 405 nm 및 495 nm 에서 검출하였다 (Tecan, Safire 2; Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Germany).
유세포 분석 및 세포 분류:
FACS 분석 및 세포 분류를 위해서, 하기 항원: CD3 (UCHT1), CD4 (13B8.2), CD8 (B9.11), CD40 (MAB89), CD80 (MAB104), CD83 (HB15a), CD86 (HA5.2B7) (모두 Imunotech/Beckman Coulter, Marseille, France 로부터 이용가능), CD19 (HIB19), CD20 (2H7), CD34(581), IL-3Ra/CD123 (9F5), CD11c (B-ly6), CD14 (M5E2), CD24, CD22a, CD38, CD138 (모두 BD Pharmingen, San Diego, CA, USA 로부터 이용가능), CD45 (HI30), CD45RA (MEM56), HLA-DR (TU36) (모두 Caltag, Burlingame, CA, USA 로부터 이용가능), TLR2 (TL2.1), TLRR4 (HTA125), TCRab (IP26) (모두 Bioscience, San Diego, CA 로부터 이용가능), BDCA-1, BDCA-2, BDCA-4, CD25 (4E3) (모두 Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany 로부터 이용가능), IgM (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA), CCR7 (3D12, M. Lipp, Berlin, Germany 에 의해 제공됨) 에 대해, FITC (플루오레세인 이소티오시아네이트), PE (피코에리트린) 또는 APC (알로피코시아닌) 와 컨쥬게이션 또는 비오틴화된 단일클론 항체를 사용하였다. IOTest Beta Mark 를 Vb 분석에 사용하였다 (Imunotech/Beckman Coulter). 스트렙타비딘이 컨쥬게이션된 FITC, PE 또는 APC (모두 BD Pharmingen) 를 비오틴화된 항체의 시각화에 사용하였다. 프로피듐 요오디드 염색에 의해, 사멸 세포를 제외시켰다. 적절한 동형-매치된, 무관한 대조군 mAb 를 사용하여 배경 염색 수준을 측정하였다. FACS Calibur 를 사용하여 세포를 분석하고 FACSAria 를 사용하여 분류하였다 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Mountain View, CA, USA).
실시예 1
실시간 단일 튜브 역전사효소 중합효소 연쇄 반응에 의한, 인간화된 면역화 마우스의 단일 B 세포로부터의 IgG 유전자의 증폭
실시예 2
시험관내 번역을 위한 선형 주형의 생성
첫 번째 중합효소 연쇄 반응에 대해서, T7 파지의 조절 DNA 부위에 대한 필요 오버랩 서열을 포함하는 유전자 특이적 프라이머를 설계하였다. 두 번째 중합효소 연쇄 반응에 대해서, 첫 번째 PCR 의 생성물을, 각각 조절 서열을 포함하고 tag-서열을 인코딩하는 핵산 단편과 조합하였다. 조절 요소를 포함하는 핵산 단편과의 하이브리드화에 의해 3'-말단 연장을 수행하였다. 이러한 선형 발현 구성물을 2 개의 말단 프라이머를 사용하여 추가로 증폭한다. 이들 프라이머는 하기 서열을 포함한다: 5'-CTTTAAGAAGGAGATATACC+ATG+15-20 bp 의 유전자-특이적 서열 (5'-프라이머, SEQ ID NO: 11) 또는 5'-ATCGTATGGGTAGCTGGTCCC+TTA+15-20 bp 의 유전자-특이적 서열 (3'-프라이머, SEQ ID NO: 12).
도 X 에서 레인 1, 5 및 9 는 블랭크 물 대조군을 나타낸다. 중쇄 핵산은 레인 4, 8 및 12 에 포함되며, 카파 경쇄는 레인 3, 7 및 11 에 포함된다. 레인 2, 6 및 10 은 두 사슬 모두의 조합된 샘플을 나타낸다. 모든 핵산은 예측된 크기를 갖는다 (표 38 참조).
표 15: 선형 발현 구성물의 크기
Figure pct00015
실시예 3
시험관내 번역 및 huFab 특이적 ELISA
시험관내 번역을 상기 개략적으로 나타낸 바와 같이 실행한다.
도 10 에서 볼 수 있는 바와 같이 2 개의 가변적 프라이머 세트를 사용한 2-단계 중합효소 연쇄 반응으로 수득한 핵산은 인코딩된 Fab 면역글로불린 단편의 시험관내 생성을 가능하게 하는 선형 발현 구성물을 제공하지 않는다. 이와 대조적으로, 분리된 연속적 중합효소 연쇄 반응에서 하나의 고정 세트 및 하나의 가변적 세트의 프라이머를 사용한 2-단계 중합효소 연쇄 반응은, 선형 발현 구성물의 후속적 제공 및 면역글로불린 Fab 단편을 포함하는 IgG HC 및 IgG LC 의 시험관내 번역을 가능하게 한다.
이와 대조적으로, 하나의 고정 세트의 프라이머를 포함하는 2-단계 중합효소 연쇄 반응이 2 개의 고정 세트의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응으로서의 다중 포맷에 있어서 보다 효율적이다. 하나의 고정 세트의 프라이머만을 사용함으로써, 5 배까지 더 높은 광학 밀도가 수득될 수 있다.
<110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Method for obtaining Fab fragments from single antibody producing cells by multiplexed PCR in combination with TaqMan probes <130> 25242 WO <150> EP11182223.5 <151> 2011-09-21 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 2 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 20 25 30 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 85 90 95 Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 4 <211> 104 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 1 5 10 15 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 20 25 30 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys 35 40 45 Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 50 55 60 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 65 70 75 80 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 85 90 95 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 <210> 5 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH primer binding in the FR1 coding region <400> 5 ctttaagaag gagatatacc atggaggtgc agctgktgsa gtctgs 46 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer binding in the constant region coding region <400> 6 atcgtatggg tagctggtcc cttaaactbt cttgtccacc ttggtgttg 49 <210> 7 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Vkappa primer binding in the FR1 coding region <400> 7 ctttaagaag gagatatacc atggawrttg tgmtgackca gtctcc 46 <210> 8 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer binding in the constant region coding region <400> 8 atcgtatggg tagctggtcc cttaacactc tcccctgttg aagctc 46 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan Probe IgH <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Cyan500 dye <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> BBQ dye <400> 9 nccaagctgc tggagggcac ggtcaccn 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TaqMan Probe IgL <220> <221> misc_feature <222> (1) <223> Cy5 dye <220> <221> misc_feature <222> (28) <223> BBQ dye <400> 10 nccttgctgt cctgctctgt gacactcn 28 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 for overlapping PCR <400> 11 ctttaagaag gagatatacc atg 23 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 for overlapping PCR <400> 12 atcgtatggg tagctggtcc ctta 24

Claims (12)

  1. 하기 단계를 포함하는, 단일 세포로부터의 동족 IgG 중쇄 및 경쇄 인코딩 핵산의 증폭 및 정량 방법:
    - 제 1 및 제 2 의 5'-프라이머 및 제 1 및 제 2 의 3'-프라이머 및 제 1 및 제 2 의 TaqMan 프로브를 사용하여 역전사 및 중합효소 연쇄 반응을 1-단계로 수행하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서:
    a) 제 1 의 5'-프라이머가 중쇄 리더 펩티드 또는 제 1 중쇄 골격 부위를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 상보적이고, 및/또는
    b) 제 2 의 5'-프라이머가 경쇄 리더 펩티드 또는 제 1 경쇄 골격 부위를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 상보적이고, 및/또는
    c) 제 1 의 3'-프라이머가 중쇄 CH1 도메인의 C-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 상보적이고, 및/또는
    d) 제 2 의 3'-프라이머가 경쇄 불변 도메인의 C-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산 서열에 대해 상보적이고, 및/또는
    e) 제 1 의 TaqMan 프로브가 중쇄 CH1 도메인의 N-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산에 대해 상보적이고, 및/또는
    f) 제 2 의 TaqMan 프로브가 경쇄 불변 도메인의 N-말단 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산에 대해 상보적인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 하기 단계를 포함하는 단일클론 항체 수득 방법:
    - 면역글로불린 단편을 인코딩하는 핵산을 시험관내 번역함으로써 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 방법으로 단일 면역글로불린 생성 세포의 mRNA 로부터 수득한 cDNA 단편의 특이적 증폭에 의해 상기 핵산을 수득하는 단계.
  4. 제 3 항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는 방법:
    - 대장균 (E. coli) 세포 용해물을 이용하여, 시험관내에서 PCR 생성물을 이후 mRNA 로 전사하고 상기 mRNA 를 번역하는 단계.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 프라이머가 5'-프라이머에 대해 번역 시작 코돈 ATG 및/또는 3'-프라이머에 대해 번역 중지 코돈 TTA 를 인코딩하는 오버행 (overhang) 을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 하기의 추가적인 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
    - 단일 세포를 제공하고 상기 세포의 mRNA 를 수득하는 단계.
  7. 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 Fab-단편 생성 방법:
    - 단일 면역글로불린 생성 세포를 제공하는 단계,
    - 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 동족 IgG 중쇄 및 경쇄 인코딩 핵산의 증폭 및 정량을 위한 다중 단일 튜브 실시간 역전사효소 유전자-특이적 중합효소 연쇄 반응으로, 상기 세포로부터 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하고 임의로는 또한 일부의 경쇄 불변 도메인 및 일부의 중쇄 CH1 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계,
    - 수득한 핵산을 포함하는 선형 발현 (linear expression) 매트릭스를 생성시키는 단계,
    - 핵산을 시험관내 번역하고 그로써 면역글로불린 Fab 단편을 생성시키는 단계.
  8. 하기 단계를 포함하는 면역글로불린 생성 방법:
    - 단일 면역글로불린 생성 세포를 제공하는 단계,
    - 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 동족 IgG 중쇄 및 경쇄 인코딩 핵산의 증폭 및 정량을 위한 다중 단일 튜브 실시간 역전사효소 유전자-특이적 중합효소 연쇄 반응으로, 상기 세포로부터 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 도메인을 인코딩하는 핵산을 수득하는 단계,
    - 이전 단계에서 수득한 각각의 핵산을 각각의 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 불변 도메인의 인코딩되지 않은 C-말단 불변 도메인 아미노산 잔기를 인코딩하는 핵산과 작동가능하게 연결하는 단계,
    - 진핵 또는 원핵 세포를 이전 단계에서 수득한 핵산으로 트랜스펙션시키는 단계,
    - 한 구현예에서, 면역글로불린 발현에 적합한 조건 하에, 트랜스펙션된 세포를 배양하는 단계,
    - 세포 또는 배양 배지로부터 면역글로불린을 회수하고, 그로써 면역글로불린을 생성시키는 단계.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린이 클래스 G 의 면역글로불린 (IgG) 인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 세포가 단일 B-세포 또는 단일 형질아세포 또는 단일 혈장 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. SEQ ID NO: 05, 또는 06, 또는 07, 또는 08, 또는 09, 또는 10 의 핵산.
  12. SEQ ID NO: 05, 06, 07, 08, 09 및 10 의 핵산을 포함하는 키트.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
US5478730A (en) 1988-12-21 1995-12-26 Institute Of Protein Research Method of preparing polypeptides in cell-free translation system
US5571690A (en) 1991-05-08 1996-11-05 The University Of Virginia Patents Foundation Method for the cell-free synthesis of proteins
GB9613418D0 (en) 1996-06-26 1996-08-28 Crc Technology Ltd A cell-free system for initiation of DNA replication
EP0953055A1 (en) 1997-01-21 1999-11-03 Daniel Favre Production of biologically active polypeptides
RU2148649C1 (ru) 1998-03-31 2000-05-10 Институт белка РАН Способ получения полипептидов в бесклеточной системе (варианты) и устройство для его осуществления
CA2365668C (en) 1999-03-17 2014-05-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University In vitro macromolecule biosynthesis methods using exogenous amino acids and a novel atp regeneration system
RU2169154C2 (ru) 1999-03-25 2001-06-20 Институт белка РАН Способ получения полипептидов в бесклеточной системе
EP1309347B1 (en) 2000-08-11 2013-02-27 Mmrglobal, Inc. Method and composition for altering a b cell mediated pathology
US20050095634A1 (en) * 2003-10-16 2005-05-05 Genomic Health Inc. qRT-PCR assay system for gene expression profiling
ATE521704T1 (de) * 2007-03-01 2011-09-15 Symphogen As Verfahren zur klonierung verwandter antikörper
CA2751669C (en) * 2009-02-20 2017-11-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for obtaining immunoglobulin encoding nucleic acid
EP2524053A1 (en) * 2010-01-15 2012-11-21 Steffen Mergemeier Method for detecting more than one target in a pcr-based approach applying an unspecific dye which is not interfering with the emission of fluorophore-labeled probes

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