BRPI0808673A2

BRPI0808673A2 - Anticorpos recombinantes para tratamento de infecções com vírus sinciciais respiratórios.

Info

Publication number: BRPI0808673A2
Application number: BRPI0808673-7A2A
Authority: BR
Inventors: Johan Lantto; Henriette Schjoenning Nielsen
Original assignee: Symphogen As
Priority date: 2007-03-06
Filing date: 2008-03-05
Publication date: 2014-08-12
Also published as: US20080226630A1; MX2009009226A; AU2008224259A1; IL200330A0; WO2008106980A2; JP2010534057A; ZA200905990B; EP2134747A2; US7879329B2; US20110189171A1; CN101679513A; KR20090127341A; CA2678628A1; RU2009136677A; WO2008106980A3

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS RECOMBINANTES PARA TRATAMENTO DE INFECÇÕES COM VÍRUS SINCICIAIS RESPIRATÓRIOS".

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições de anticorpos mo

no e policlonais recombinantes, específicos, para a prevenção, tratamento ou atenuação de um ou mais sintomas associados às infecções com vírus sinciciais respiratórios. A invenção também refere-se a linhagens celulares de expressão policlonal produtoras de anticorpo policlonal recombinante an10 ti-RSV (rpAb anti-RSV). Ainda, são descritas composições para diagnósticos e farmacológicas que compreendem rpAb anti-RSV e uso na prevenção, tratamento ou atenuação de um ou mais sintomas associados à infecção com RSV.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Vírus sincicial respiratório (RSV) é a causa principal de doença

do aparelho respiratório inferior em bebês e crianças pequenas. Bebês prematuros e crianças com problema de saúde subjacente, tal como doença pulmonar crônica ou doença cardíaca congênita, são as de maior risco de contrair doença séria tais como bronquiolite e pneumonia seguinte à infec20 ção com RSV. Recentemente, RSV foi também reconhecido como um patógeno importante em certos adultos de alto risco, tais como adultos imunocomprometidos, particularmente, pacientes de transplantes de medula óssea, pessoas idosas e indivíduos com doença pulmonar crônica.

RSV ser humano é um membro da subfamília de Pneumovírus 25 da família Paramyxoviridae, e existe como subtipo AeB. RSV é um vírus de RNA senso negativo, não-segmentado, envelopado. O genoma viral codifica pelo menos 11 proteínas das quais três são as proteínas associadas ao envelope, F (glicoproteína de fusão), G (glicoproteína de ligação de receptor), e SH (proteína hidrofóbica pequena). As proteínas de envelope estão presen30 tes na superfície viral, e em até certo grau na superfície de células infectadas. A proteína F promove a fusão das membranas virais e celulares permitindo assim, a penetração do RNA viral no citoplasma da célula. A proteína F consiste em duas subunidades ligados a dissulfeto, Fi e F2, produzidas por clivagem proteolítica de um precursor N-glicosilado, inativo, de 574 aminoácidos. A proteína G é uma glicoproteína transmembrânica do tipo Il de 289- 299 aminoácidos (dependendo da cepa do vírus). A forma precursora é de 5 32 kDa, que matura para um proteína de 80-90 kDa mediante adição de ambos os oligossacarídeos N- e O-ligados. A proteína G do RSV é responsável pela ligação de vírions às células-alvo. Além da forma ligada à membrana da proteína G, uma forma truncada, solúvel é também produzida. Foi também sugerido que a função desta é a de redirecionar a imunorresposta para longe 10 do vírus e das células infectadas. Assim, foi mostrado que a proteína G está associada a vários efeitos pró-inflamatórios tais como modificação da expressão da quimioquina e da citoquina, bem como recrutamento de leucócitos. A proteína SH é uma proteína com 64-65 aminoácidos que está presente em quantidades muito pequenas na superfície de peptídeos de RSV, mas 15 é expressa abundantemente na superfície das células infectadas com RSV. A função da proteína SH não foi identificada, mas é possível que ela auxilie o transporte da proteína do vírus através do complexo de Golgi (Rixon et ai, 2002), J. Gen Virol. 85:1153-1165). Acredita-se que bloquear a função das proteínas GeF seja relevante para a prevenção de infecção com RSV.

A prevenção e o tratamento da infecção com RSV têm recebido

atenção considerável durante as últimas décadas, incluem o desenvolvimento de vacina, compostos antivirais (Ribavirina aprovada para tratamento) fármacos antissenso, tecnologia de RNA de interferência (RNAi) e produtos de anticorpos, tais como imunoglobulina e anticorpos monoclonais (todos 25 revistos por Maggon e Barik, 2004, Ver. Med. Virol. 14:149-168). Dessas abordagens, a imunoglobulina intravenosa, RSV-IVIG, e o anticorpo monoclonal, Palivizumab, foram aprovados para a profilaxia de RSV em crianças de alto risco.

Os produtos de imunoglobulina, tal como RSV-IVIG (RespiGam)1 são, contudo, conhecidos por terem várias desvantagens, tal como baixa atividade específica resultando em necessidade de injeção em grandes volumes, que é difícil em crianças com acesso venoso limitado devido à terapia intensiva anterior. Ainda, há também o risco de transmissão de doenças virais a partir de produtos de imunoglobulina derivada do soro, bem como problemas com variações de um lote para o outro. Finalmente, é difícil de obter doadores que satisfaçam às necessidades para a produção de imunoglobu5 Iina de RSV hiperimune, já que somente aproximadamente 8% dos doadores normais têm títulos de anticorpos neutralizadores de RSV que sejam suficientemente altos.

Anticorpos monoclonais contra a proteína Fea proteína G mostram que têm efeito neutralizador in vitro e efeitos profiláticos in vivo (por e' 10 xemplo, Beeler e Coelingh 1989. J.Virol. 63:2941-50; Garcia-Barreno et ai. 1989. J.Virol. 63:925-32; Taylor et ai. 1984. Immunology 52: 137-142; Walsh et ai. 1984, Infection and Immunity 43:756-758; US 5.842.307 e US 6.818.216). Hoje em dia, o anticorpo monoclonal Palivizumab tem quase que completamente substituído o uso de RSV-IVIG. Ensaio de neutralização mostram que Palivizumab e RSV-IVIG têm um desempenho igualmente bom contra o subtipo B do RSV, ao passo que Palivizumab tem um desempenho melhor contra o subtipo A (Johnson et ai. 1997. J. Infect. Dis. 176:1215-24). Contudo, apesar dos bons efeitos de neutralização e profiláticos dos anticorpos monoclonais conforme ilustrados pelos produtos como Palivizumab e Numax, esses podem ser também associados a certas substâncias devido à natureza do vírus RSV.

~ “ RSV existe em dois grupos ou subtipos antigênicos distintos, A e B. A maioria das proteínas de RSV é aitamente conservada entre os dois subgrupos, com a proteína F mostrando 91% de similaridade de aminoáci25 dos. Contudo, a proteína G exibe extensiva variabilidade de seqüências, com somente 53% de similaridade de aminoácidos entre os subgrupos AeB (Sullender 2000. Clin. Microbiol.Rev. 13:1-15). A maioria das proteínas mostra também alguma variação limitada intra-subgrupos, exceto a proteína G, que difere de até 20% dentro do subgrupo A e 9% dentro do subgrupo B no 30 nível de aminoácidos. Os subtipos do vírus AeB cocirculam na maioria das epidemias de RSV, com a frequência relativa variando entre anos diferentes. Assim um anticorpo monoclonal deve ser cuidadosamente selecionado de modo que seja capaz de neutralizar ambos os subtipos bem como as variações intra-subtipos.

Além da questão dos dois subtipos de RSV e a diversidade intrasubtipos, o RSV ser humano, como a maioria dos vírus de RNA1 tem a capacidade de sofrer mutações rápidas sob pressão seletiva. A seleção dos mutantes de escape de RSV in vitro usando mAb é bem-documentada (por exemplo, Garcia-Barreno et ai 1989. J.Virol. 63:925-32). Importantemente foi recentemente descoberto que Palivizumab seleciona também mutantes de escape, in vitro bem como in vivo, e que alguns dos mutantes isolados são completamente resistentes à profilaxia com Palivizumab em ratos de algodão (Zhao e Sullender 2005. J.Virol. 79:3962-8 e Zhao et ai. 2004. J.Infect.Dis. 190:1941-6.). Ainda, cepas de RSV do tipo selvagem que são intrinsecamente resistentes ao Palivizumab podem existir também, conforme demonstrado pela falha do anticorpo de murino, do qual o Palivizumab se origina, para neutralizar um isolado clínico (Beeler e Coelingh 1989. J.Virol. 63:2941-50). Além disso, um vírus aparentemente resistente foi também identificado seguinte à profilaxia com Palivizumab em ratos de algodão imunocompetentes (Johnson et ai. 1997. J.Infect.Dis. 176:1215-24). Assim, sob certas condições, o uso de anticorpo monoespecífico, simples, pode não ser adequado ou suficiente para o tratamento de doença por RSV, já que os mutantes de escape existem ou podem se desenvolver com o tempo, em conseqüência do tratamento.

Uma outra consideração em relação à utilidade do RSV-IVIG e Palivizumab é a dose necessária para o tratamento eficaz. Foi mostrado que 25 são necessárias concentrações de soro de mais que 30 μg/mL para reduzir a replicação de RSV pulmonar por 100 vezes no modelo de rato de algodão de infecção com RSV. Para RSV-IVIG, uma dose mensal de 750 mg de proteína total/kg administrada intravenosamente foi eficaz para reduzir a incidência de hospitalização com RSV em crianças de alto risco, ao passo que 30 para doses intramusculares, mensais, de Palivizumab de 15 mg/kg mostrou ser eficaz. Contudo, a administração de altas doses múltiplas intravenosas ou intramusculares é inconveniente para o paciente, e impede que o produto seja usado amplamente na profilaxia e no tratamento do grupo grande de adultos em risco de contrair infecção com RSV.

Assim, há a necessidade por um produto de anticorpo que não seja dependente da disponibilidade de doadores, e que se ligue imunoespe5 cificamente a um ou mais antígenos de RSV abrangendo os subtipos A e B, bem como quaisquer mutantes de escape devido a mutações do vírus, seja altamente potente, tenha perfil farmacocinético aperfeiçoado, e tenha assim um perfil terapêutico aperfeiçoado total, e, portanto, requeira administração menos freqüente e/ou administração de uma dose menor.

Portanto, o objetivo da presente invenção é proporcionar um

produto de imunoglobulina anti-RSV, alternativo, altamente potente, que seja produzido recombinantemente e mostre reatividade aos subtipos A e B do vírus sincicial respiratório bem como aos epitopos múltiplos sobre pelo menos um dos principais antígenos de superfície para limitar a possibilidade de mutações de escape.

A invenção tem também como objetivo proporcionar moléculas de anticorpo anti-RSV ser humano, bem como derivados destes, em que as moléculas ou derivados de anticorpo exibem características aperfeiçoadas em reação aos anticorpos anti-RSV monoclonais e derivados de anticorpo.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a anticorpos capazes de competir em ligação como o anticorpo 824 como definido aqui ou com seu fragmento Fab. O anticorpo 824 se liga fracamente à proteína recombinante, mas com muito pouca afinidade às células humanas infectadas com RSV, resultando em 25 neutralização muito potente do RSV. Ao proporcionarem o anticorpo 824, os inventores identificaram um epitopo que resulta em uma mais eficaz neutralização in vitro e in vivo que visto antes para qualquer epitopo de RSV simples. Ao proporcionarem o anticorpo 824, os inventores também permitiram a identificação de outros anticorpos que ligam ao mesmo epitopo. Esses ou30 tros anticorpos podem ser de qualquer origem e incluem fragmentos de ligação bem como anticorpos maturados por afinidade. Anticorpos capazes de competir com o anticorpo 824 podem ser identificados em um ensaio de competição célular (determinação das especificidades relativas de epitopos) conforme descrição no Exemplo 1, seção g-4. Em outros aspectos, a invenção refere-se a um anticorpo anti-RSV que compreende CDRH3 tendo a seguinte fórmula: CAX1X2X3X4X5X6PX7X8X9X10X11W,

Em que Xi a Xn são selecionados individualmente dos grupos

de aminoácidos listados abaixo X1 = R ou K;

X2 = D, E, N ou Q;

X3 = S, T, G ou A;

X4 = S, T, G ou A;

X5 = N, Q, D ou E;

X6 = W, Y, F ou H;

X7 = A, G, V, ou S;

X8 = G, A, V, ou S;

X9 = Y1F1WouH;

X-io = E ou D; e Χ11 = D, E, N ou Q; e uma CDRL3 descrita pela fórmula: CXiX2X3X4X5X6PXyTF em que Xi a X7 são selecionados individualmente dos grupos de aminoácidos listados abaixo:

X1 = Q ou H;

X2 = Q, E ou H;

X3 = F, Y, W ou H;

X4 = N, Q ou H;

X5 = T, S, G ou A;

X6 = Y, F, W ou H; e X7 = F, Y, W ou H.

Espera-se que os anticorpos compreendendo essas seqüências de CDR com base no anticorpo 824 resultam em neutralização de vírus muito eficaz tanto in vitro como in vivo já que se espera que eles se liguem ao mesmo epitopo. Em outros aspectos, a invenção refere-se a ácidos nucleicos que codificam essas seqüências de CDR1 a ácido nucleico que codifica seqüências de VL e de VH do anticorpo 824, a vetores de expressão que codificam tais anticorpos e CDRs e a células que expressam estas.

Preferivelmente, o anticorpo anti-RSV compreende as regiões de CDR1 e de CDR2 do par de VH e VL de anticorpo 824 como mostrado nas SEQ ID NOs: 232, 317, 487, e 572, e uma região de CDRH3 tendo a fórmula CARiD2S3S4N5W6PA7G8YgEioDiiW (SEQ ID NO 402), e uma região de CDRL3 tendo a fórmula CQ1Q2F3N4T5Y6PF7TF (SEQ ID NO 657).

Em um outro aspecto, a invenção refere-se a uma composição de anticorpo que compreende um anticorpo com base nas seqüências de CDR acima e um ou mais anticorpos anti-RSV adicionais.

A invenção refere-se também a uma composição de anticorpo que compreende membros distintos compreendendo as regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e de cadeia leve selecionadas do grupo de pares de VH e de VL listadas na Tabela 6, em que os membros distintos são 15 os membros distintos de uma das composições de anticorpos de 2 a 56 na Tabela 9 aqui.

Em outros aspectos, a invenção refere-se a um método de prevenir, tratar ou atenuar um ou mais sintomas associadas a uma infecção de RSV em um mamífero, que compreende administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-RSV de acordo com a invenção.

Espera-se de uso de uma composição de anticorpo policlonal que alveja os epitopos no RSV minimize o desenvolvimento de mutantes de escape e pode também proporcionar contra vírus naturalmente circulantes diversos. Em contraste para RSV-IVIG derivado e soros, um anticorpo poli25 clonal da presente invenção não contém moléculas de anticorpos, que se ligam a antígenos não-RSV.

A presente invenção proporciona um anticorpo anti-RSV policlonal. Preferencialmente, 0 anticorpo anti-RSV policlonal é obtido de células que não produzem anticorpos naturalmente. Tal anticorpo é denominado um 30 anticorpo policlonal recombinante (rpAb), Um rpAb anti-RSV da presente invenção é direcionado contra epitopos múltiplos na proteína F ou G. Em particular, um rpAb anti-RSV que é direcionado contra epitopos múltiplos em ambos as proteínas G e F é preferido. Preferivelmente, os epitopos de proteína G pertencendo ao grupo conservado e também potencialmente o grupo específico de subtipo e o grupo específico de cepa são cobertos pelo rpAb anti-RSV. Adicionalmente, os anticorpos com reatividade contra a terceira 5 proteína envelope, proteína hidrofóbica pequena (SH) é um componente desejado de um rpAb anti-RSV da presente invenção.

Ainda, a presente invenção proporciona as composições farmacêuticas em que o ingrediente ativo é um anticorpo policlonal anti-RSV, bem como usos de tais composições para a prevenção, atenuação ou tratamento de infecções com RSV.

A presente invenção proporciona ainda procedimentos para refletir a imunorresposta humoral gerada quando da infecção com RSV, por isolamento dos pares de gene de Vh e VL, originais, de tais indivíduos, e produção de anticorpos que mantêm esse pareamento original.

Definições

O termo "anticorpo" descreve um componente funcional do soro e é frequentemente referido ou como uma coleção de moléculas (anticorpos ou imunoglobulina) ou como uma molécula (a molécula de anticorpo ou a molécula de imunoglobulina). Uma molécula de anticorpo é capaz de se ligar 20 a ou reagir a um determinante antigênico específico (o antígeno ou o epitopo antigênico), que, por sua vez, pode levar à indução de mecanismos efetores imunológicos. Uma molécula de anticorpo individual é usualmente referida como monoespecífico, e uma composição de moléculas de anticorpo pode ser monoclonal (isto é, consistindo em moléculas de anticorpos idênticos) ou 25 policlonal (isto é, consistindo em moléculas de anticorpos que reagem com os mesmos ou diferentes epitopos no mesmo antígeno ou em antígenos distintos, diferentes). Cada molécula de anticorpo tem uma estrutura única que permite que se ligue especificamente a seu antígeno correspondente, e todas as moléculas de anticorpos naturais têm a mesma estrutura básica total 30 de duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas. Os anticorpos são também conhecidos coletivamente como imunoglobulina. Os termos anticorpo e anticorpos como usados aqui são empregados no sentido mais amplo e englobam anticorpos intactos, anticorpos quiméricos, humanizados, inteiramente ser humanos e de cadeia única, bem como fragmentos de ligação de anticorpos, tais como Fab, fragmentos Fv ou fragmentos scFv, bem como formas multiméricas tais como moléculas de IgA diméricas ou de 5 IgM pentavalentes. Em alguns casos, a presente invenção usa o termo "análogo de anticorpo sintético ou semissintético", que se refere especificamente a moléculas não-naturais que exibem características de anticorpo (por exibirem ligação específica aos antígenos de RSV) e inclui CDRs de anticorpos naturais - tais análogos são, por exemplo, representados por fragmentos de 10 scFv, unicorpos, diacorpos, etc., mas poderiam ser, por exemplo, também anticorpos que parecem naturais que são engenheirados para incluir as CDRs (por exemplo, por técnicas de enxerto conhecidas da técnica) de uma molécula de anticorpo anti-RSV descrita aqui - por exemplo, tal análogo de anticorpo poderia compreender CDRs descritos aqui incorporados em uma 15 molécula de anticorpo de uma outra espécie de animal ou em um isótipo de anticorpo diferente ou classe da mesma espécie.

O termo "anticorpo policlonal recombinante anti-RSV" ou "rpAb anti-RSV" descreve uma composição de moléculas de anticorpo diversas produzidas recombinantemente, em que os membros individuais são capazes de se ligar a pelo menos um epitopo em um vírus sincicial respiratório, e em que a composição policlonal como um todo é capaz de neutralizar o —RSVrPreferiveImenteruma composição de rpAb anti-RSV neutraliza ambos os subtipos A e B do RSV. Ainda mais preferido, o rpAb anti-RSV compreende ainda a reatividade de ligação às proteínas GeF. Preferivelmente, a composição é produzida de uma linhagem celular de fabricação policlonal única.

O termo "par de codificadores de Vh e VL" descreve um par original de seqüências de-codificação de Vh e Vl contido dentro ou derivado da mesma célula. Assim, o par de Vh e Vl representa o pareamento de Vh e Vl 30 presente no doador do qual tal célula é derivado. O termo "um anticorpo expresso de um par de codificadores de Vh e VL" indica que um anticorpo ou um fragmento de anticorpo é produzido de um vetor, plasmídeo ou similar contendo a seqüência de codificação de Vh e VL. Quando um par de codificadores de Vh e Vl é expresso, tanto como um anticorpo completo ou como um fragmento estável deste, ele conserva afinidade por ligação e especificidade do anticorpo originalmente expresso da célula da qual eles derivam. 5 Uma biblioteca de pares cognatos é também denominada um repertório ou coleção de pares cognatos, e pode ser mantida individualmente ou em uma reunião.

A expressão "um membro distinto de um anticorpo policlonal recombinante" denota uma molécula de anticorpo individual da composição de 10 anticorpo policlonal recombinante, compreendendo uma ou mais extensões dentro das regiões variáveis, que são caracterizadas pelas diferenças na seqüência de aminoácidos em comparação com os outros membros individuais da proteína policlonal. Essas extensões estão em particular localizadas nas regiões de CDR1, CDR2 e CDR3.

O termo "epitopo" é comumente usado para descrever uma pro

porção de uma molécula maior ou uma parte de uma molécula maior (por exemplo, antígeno ou sítio antigênico) tendo atividade antigênica ou imunogênica em um animal, preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente em um epitopo. Um epitopo tendo atividade imunogênica é uma porção de 20 uma molécula maior que elicita uma resposta ao anticorpo em um animal. Um epitopo tendo atividade antigênica é uma porção de uma molécula maior à qual um anticorpo imunoespecificamente se liga como determinado por qualquer método bem-conhecido da técnica, por exemplo, pelos imunoensaios descritos aqui. Epitopos antigênicos não precisam ser necessariamen25 te imunogênicos. Um antígeno é uma substância à qual um anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga imunoespecificamente, por exemplo, toxina, vírus, bactéria, proteínas ou DNA. Um antígeno ou sítio antigênico tem frequentemente mais que um epitopo, a menos que eles sejam muito pequenos, e é frequentemente capaz de estimular uma imunorresposta. Anticorpos 30 que se ligam a epitopos diferentes no mesmo antígeno podem ter efeitos variáveis na atividade do antígeno ao qual eles se ligam dependendo da localização do epitopo. Um anticorpo se ligando a um epitopo em um sítio ativo do antígeno pode bloquear completamente a função do antígeno, ao passo que um outro anticorpo que se liga em um epitopo diferente pode não ter qualquer efeito ou pouco efeito na atividade do antígeno sozinho. Tais anticorpos podem, contudo, ainda ativar o complemento e assim resultar na eli5 minação do antígeno, e pode resultar nos efeitos sinergísticos quando combinados com um ou mais anticorpos que se ligam em diferentes epitopos no mesmo antígeno. Na presente invenção, a molécula maior do qual o epitopo é uma proporção é preferivelmente uma proporção de um polipeptídeo de RSV. Os antígenos da presente invenção são preferivelmente proteínas, po10 lipeptídeos associados ao RSV ou fragmentos destes aos quais um anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga imunoespecificamente. Um antígeno associado ao RSV pode ter também um análogo ou derivado de um polipeptídeo de RSV ou fragmento deste ao qual um anticorpo ou fragmento de anticorpo se liga imunoespecificamente.

O termo "inteiramente ser humano" usado, por exemplo, em re

lação às seqüências de DNA, RNA ou de proteína descreve seqüências que são entre 98 e 100% humanas.

O termo "imunoglobulina" é comumente usado como uma designação coletiva da mistura de anticorpos encontrada no sangue ou no soro, mas pode ser usado também para designar uma mistura de anticorpos derivada de outras fontes.

O termo "reflete a imunorresposta humoral" quando usado em relação a um anticorpo policlonal refere-se a uma composição de anticorpo, em que as seqüências de ácidos nucleicos que codificam os membros de 25 anticorpos individuais são derivadas de um doador com uma frequência aumentada de células plasmáticas que produzem anticorpos específicos antiRSV. Tal doador pode ou ser convertido de uma infecção com RSV, ter tido contato íntimo com um indivíduo infectado com RSV, ou foi submetido à vacinação contra RSV (para exemplos de vacinas contra RSV vide, por exem30 pio, Maggon e Barik, 2004, Rev. Med. Virol. 14:149-168). De modo a refletir a afinidade e especificidade de anticorpos produzidos em um doador mediante infecção ou desafio, as seqüências que codificam a cadeia pesada variável (Vh) e a cadeia leve variável (Vl) devem ser mantidas nos pares ou combinações de genes originalmente presentes no doador (pares cognatos) quando eles são isolados. De modo a refletir a diversidade de uma imunorresposta humoral em um doador, todas as seqüências que codificam anti5 corpos que se ligam ao RSV são selecionadas com base no procedimento de seleção. As seqüências isoladas são analisadas com respeito à diversidade das regiões variáveis, em particular as regiões de CDR, mas também com respeito à família de Vh e VL. Com base nessas análises, é selecionada uma população de pares cognatos que representam a diversidade total dos 10 anticorpos de ligação de RSV. Tal anticorpo policlonal tem tipicamente pelo menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 1.000 ou 104 membros distintos.

Diz-se que uma composição é "farmacologicamente aceitável" se sua administração pode ser tolerada por um paciente recipiente - o mesmo, naturalmente, se aplica aos excipientes, veículos e diluentes que são parte de uma composição.

O termo "anticorpo policlonal" descreve uma composição de moléculas de anticorpos (diversas) diferentes, que é capaz de se ligar a ou reagir com vários determinantes/epitopos antigênicos específicos nos mesmos ou nos antígenos diferentes, em que cada anticorpo individual na composi20 ção é capaz de reagir com um epitopo particular. Usualmente, a variabilidade de um anticorpo policlonal está localizada nas assim chamadas regiões variáveis do anticorpo policlonal, em particular nas regiões de CDR1, CDR2 e CDR3. Na presente invenção, um anticorpo policlonal pode ser produzido ou em um pote de uma linhagem celular policlonal, ou ele pode ser uma mis25 tura de anticorpos policlonais diferentes. Uma mistura de anticorpos monoclonais não é como tal considerada um anticorpo policlonal, já que eles são produzidos em bateladas individuais e não necessariamente da mesma linhagem celular, que resultará em, por exemplo, diferenças de modificação pós-traducionais. Contudo, se uma mistura de anticorpos monoclonais pro30 porciona a mesma cobertura antígeno/epitopo que um anticorpo policlonal da presente invenção, ela será considerada como um equivalente do anticorpo policlonal. Quando se estabelece que um membro de um anticorpo policlonal se liga especificamente a ou tem reatividade específica contra um antígeno/sítio antigênico/epitopo, é aqui entendido que a constante de ligação está abaixo de 100 nM. Preferivelmente abaixo de 10nM, ainda mais preferido abaixo de 1 nM.

O termo "anticorpo recombinante" é usado para descrever uma

molécula ou várias moléculas de anticorpos que são expressas a partir de uma célula ou linhagem de célula transfectada com um vetor de expressão que compreende a seqüência de codificação do anticorpo que não está naturalmente associado à célula. Se as moléculas de anticorpos em uma compo10 sição de anticorpo recombinante são diversas ou diferentes, o termo "anticorpo policlonal recombinante" ou "rpAb" se aplica de acordo com a definição de um anticorpo policlonal.

O termo "linhagem de célula policlonal recombinante" ou "linhagem de célula policlonal" se refere a uma mistura/população de células que expressam proteínas que são transfectadas com um repertório de seqüências de ácidos nucleicos variantes (por exemplo, um repertório de seqüências de ácidos nucleicos que codificam anticorpo), que não são naturalmente associadas às células transfectadas. Preferivelmente, a transfecção é realizada de modo que as células individuais, que juntas constituem a linhagem de célula policlonal recombinante, transportam, cada uma, uma cópia ativa de modo transcricional de uma seqüência de ácidos nucleicos simples de interesse, que codifica um membro do anticorpo policlonal recombinante de interesse. Ainda mais preferida, somente uma cópia simples da seqüência de ácidos nucleicos, distinta, é integrada em um sítio específico no genoma. As células que constituem a linhagem de célula policlonal recombinante são selecionadas conforme sua capacidade de reter a cópia integrada (ou cópia) da seqüência de ácido nucleico de interesse, distinta, por exemplo, por seleção de antibiótico. As células que podem constituir tal linhagem de célula policlonal podem ser, por exemplo, bactérias, fungos, células eucarióticas, tal como levedura, células de inseto, células vegetais ou células de mamíferos, especialmente linhagens de células de mamíferos imortais, tais como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0, NSO), NIH 3T3, YB2/0 e células humanas imortalizadas, tais como células HeLa, células HEK 293, ou PER.C6.

Os termos "seqüências que codificam pares de Vh e VL" ou "pares de seqüências que codificam Vh e VL" indicam moléculas de ácido nucle5 ico, em que cada molécula compreende uma seqüência que codifica a expressão de uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável, de modo que estas podem ser expressas como um par proveniente da molécula de ácido nucleico se um promotor adequado e/ou regiões de IRES estão presentes e ligados operavelmente às seqüências. A molécula de ácido nuclei10 co pode também codificar parte das regiões constantes ou da região constante completa da cadeia pesada e/ou da cadeia leve, permitindo a expressão de um fragmento Fab, um anticorpo de tamanho natural ou outros fragmentos de anticorpo, se promotor adequado e/ou regiões de IRES estão ligados ou operavelmente ligados às seqüências.

Diz-se que um anticorpo policlonal recombinante é para ser ad

ministrado em uma "quantidade terapeuticamente eficaz" se a quantidade administrada é fisiologicamente significante, por exemplo, previne ou atenua uma infecção com RSV em um animal ou ser humano.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1: (A) Alinhamento das seqüências de aminoácidos da

proteína G integral das cepas prototípicas, Long (subtipo A) e 18537 (subtipo B)rA'região de^sinal/transmembrana está em um retângulo com linha tracejada. Os dois domínios variáveis entre aminoácidos 101-133 e 208-299 conforme identificados por Cane et al. 1991 J. Gen. Virol. 72:2091-2096 são i25 dentificados com um sublinhado. O fragmento central da proteína G foi expresso como uma proteína de fusão em E. coli e está em um retângulo em preto. As 2 seqüências de aminoácidos estão mostradas em SEQ ID NOs: 711-(subtipo A) e 712 (subtipo B). (B) Alinhamento do fragmento central, conforme indicado em (a). A localização da região conservada de 13 aa (re30 síduo de aa 164-176) e a região rica em cisteína da proteína G (GCRR) são indicadas entre chaves. As pontes de dissulfeto na GCRR (idêntica para ambos os subtipos) são indicadas em chaves quadradas. A 2 seqüências de aminoácidos são mostradas nas SEQ ID NOs: 713 (subtipo A) e 714 (subtipo B).

Figura 2: Esquema da RT-PCR de sobreposição-extensão em multiplex (A) e as etapas de clonagem (B). (A) Dois grupos de iniciadores, 5 CH + VH 1-8 e VK1-6 +CK1, específicos para famílias de genes de Vh e Vk, respectivamente, foram usados para a primeira etapa de PCR. Uma região homóloga entre os iniciadores de Vh e Vk resulta na geração de um produto de PCR de sobreposição. Na segunda etapa, esse produto é amplificado na aninhada PCR. Os iniciadores incluem também sítios de reconhecimento 10 para enzimas de restrição que facilitam a clonagem. (B) Os pares de codificação de Vh e VK, ligados, cognatos, são reunidos e inseridos em um vetor de expressão de IgG de mamífero (por exemplo, Figura 3) pelo uso dos sítios de Xho\ e Nott flanqueadores. Subsequentemente, um promotor bidirecional é inserido no sítio de restrição Asc\-Nhe\ entre as seqüências de codi15 ficação de Vh e Vk para facilitar a expressão dos anticorpos de tamanho natural. Iniciadores de PCR usados são indicados por setas horizontais. CH1: domínio 1 constante dé cadeia pesada, CL: domínio constante, LC: cadeia leve; Ab: anticorpo; P1-P2: promotores bidirecionais.

Figura 3: Apresentação esquemática de um vetor de expressão de anticorpo de tamanho natural 00-VP-530. O vetor compreende os seguintes elementos: Amp e Amp pro = gene resistente à ampicilina e seu promotor. Origem "pUC-"origem pUC de replicãção; P1 = promotor de mamífero qUe aciona a expressão de cadeia leve. P2 - promotor de mamífero que aciona a expressão da cadeia pesada. Líder IGHV = lide de cadeia pesada, humana, genômica. VH = seqüência de codificação de região variável de cadeia pesada. IgGI = Seqüência que codifica a região constante de cadeia pesada de isótipo G1 de imunoglobulina genômica. Seqüência de poli-A de beta-globina de coelho. Líder capa =-sequência que-codifica cadeia leve. Termo SV40 = seqüência terminadora do vírus símio 40. FRT = sítio-alvo de reconhecimento de Flp. Neo = gene de resistência à neomicina. SV40 poli-A = Seqüência de sinal poli-A de vírus símio 40.

Figura 4: Caracterização da especificidade de epitopo do anticorpo obtido do clone 801 (Ab801) usando análise Biacore. A ligação do anticorpo 801 foi testada por competição de pares quanto à ligação à proteína F1 usando três anticorpos, 9c5 (2), 133-h (3) e Palivizumab (4), que se ligam aos sítios antigênicos F1, C e II, respectivamente. Essa célula de referência ilustra a Iiga5 ção à proteína F de Ab801 (1) não-competido. Tempos de injeção dos quatro anticorpos estão indicados por uma seta. A resposta é indicada em unidades de ressonância relativa (RU). As setas de ponta dupla e longas indicam a magnitude da resposta não-competida e a seta de ponta dupla indica a magnitude da resposta inibida por 9c5.

Figura 5: Mostra os resultados na neutralização in vitro das cepas de RSV de subtipos AeB. Diluições das misturas de anticorpos anti-F foram testadas quanto a sua capacidade de neutralizar cepas de RSV Long (Painel A) e RSV1 (Painel B). A mistura de anticorpos, anti-F(l) obtida dos clones 810, 818, 819, 825 e 827 é mostrada como triângulos (A) e a mistura de anticor15 pos, anti-F(l), obtida dos clones 735, 800, 810, 818, 819, 825, 827, 863, 880, 884 e 894 é mostrada como quadrados (■). Palivizumab é mostrado como diamantes (♦), e um anticorpo (anti-Rhesus D) de controle negativo correspondido ao isótipo é mostrado como círculos (·). A absorbância foi medida em 490 nm e está correlacionada com a replicação de RSV.

Figura 6: Mostra os resultados de um ensaio de inibição de fusão de RSV in vitro. Diluições de misturas de anticorpos foram testadas quanto à sua capacidãdé dé^nêüt~rãlizã7~a_cepa "RSV BI . A mistura de anticorpos, anti-F(l)G, obtida dos clones 810, 818, 819, 825, 827, 793, 838, 841, 856 e 888 é mostrada como quadrados vazios (□) e a mistura de anticorpos, anti-F(ll)G, obti25 da dos clones 735, 800, 810, 818, 819, 825, 827, 863, 880, 884, 894, 793, 796, 838, 841, 856 e 888 é mostrada como triângulos vazios (Δ). Palivizumab é mostrado como diamantes (♦). A absorbância foi medida em 490 nm e está correlacionada com RSV.

Figura 7: Mostra os resultados de uma neutralização in vitro de RSV por combinações de clones de anticorpos anti-G conforme medida por PRNT em presença de complemento ativo. Diluições das composições de anticorpos individuais (descritas na Tabela 9) foram incubadas com cepa de RSV Long em presença de complemento de coelho e depois disso deixadas para infectar as células Hep-2. Depois de 24 horas de incubação, o grau de infecção foi detectado usando-se imunodetecção de placas específicas de RSV. rpAb 13 anti-RSV é mostrado como triângulos vazios (Δ), rpAb 35 anti-RSV como triângulos (A), rpAb 36 anti-RSV como quadrados (■), rpAB 41 anti-RSV como círculos (·) e rpAb 4 anti-RSV como quadrados vazios (□). Os dados são apresentados em % de infecção em comparação com o controle ± DP; Figura 8. O perfil farmacocinético de rpAb 33 e rpAb 56 anti-RSV em camundongos. Camundongos BALB/c foram tratados com os rpAb 33 anti-RSV e rpAb 56 anti-RSV (composições de anticorpos da Tabela 9) em uma dose de 15 mg/kg. Amostras de soro foram tiradas em vários pontos de tempo, variando do dia O (antes da inoculação) até o dia 29. Cada ponto representa o nível médio de IgGI humana no soro em tempo de amostragem ± DP. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Antígenos-alvo e composições de anticorpos policlonais

Um anticorpo policlonal da presente invenção é composto de várias moléculas de anticorpos distintos na mesma composição. Cada molécula é selecionada com base em sua capacidade de se ligar a um antígeno associado ao RSV. Um anticorpo policlonal da presente invenção compre20 ende reatividade de ligação correspondente à reatividade de ligação compilada das moléculas de anticorpos distintos que constituem a composição de anticorpos policlonais.

Um anticorpo policlonal anti-RSV da presente invenção compreende preferivelmente uma reatividade de ligação compilada contra ambas as 25 proteínas GeFe ainda mais preferidas contra epitopos múltiplos para minimizar o risco de desenvolvimento de mutante de escape e obter a maior capacidade de neutralização possível. Pelo menos cinco sítios antigênicos principais que são reconhecidos por anticorpos neutralizadores foram identificados na proteína F (Lopez et ai 1988. J. Virol. 72:6922-8). Todos os sítios 30 antigênicos foram mapeados para a cadeia F1, e incluem sítios I, II, IV, Vl e VI, em que os sítios Iell podem ser também denominados BeA, respectivamente. O sítio Il está localizado em uma região resistente à protease no segmento N-terminal, e os sítios IV, V e Vl na extremidade C-terminal da região rica em cisteína da proteína. Sítio I está localizado no grupo de cisteína. Um outro sítio antigênico na proteína F é o sítio C no qual o epitopo F2 incluindo as posições 241 e 242 de aminoácidos está localizado. Adicional5 mente, existem anticorpos monoclonais que se ligam a um sítio antigênico denominado F1, compreendendo os epitopos denominados F1a, F1b e F1c. Correntemente, esse sítio antigênico não foi mapeado para um sítio particular na proteína F, mas parece estas se sobrepondo ao sítio I. A maioria desses sítios/epitopos dão origem a anticorpos amplamente neutralizadores, 10 mas alguns anticorpos específicos para o sítio I antigênico têm mostrado ser específicos do subtipo A. Anticorpos que se ligam ao sítio I têm também efeito marginal na neutralização do vírus. O epitopo reconhecido por Palivizumab está localizado no sítio Il antigênio como julgado pela localização das mutações de escape selecionada na posição 272 de aminoácido (Zhao et al. 15 2004. J.Infects.Dis. 190:1941-6). Além disso, três tipos de epitopos foram identificados na proteína G: i) epitopos conservados que estão presentes em todas as cepas de RSV, ii) epitopos específicos de grupo que estão em todos os vírus pertencentes somente em um subconjunto de cepas pertencem ao mesmo subtipo. Os epitopos conservados e específicos de grupo foram 20 mapeados para a parte central da proteína G contendo um grupo de quatro cisteínas (o resíduo de aminoácidos 173, 176, 182 e 186) e um segmento de aminoácidos curto (resíduos 164-176) de seqüência idêntica dentre todos os isolados de RSV ser humano. O grupo de cisteína é mantido por ligações de dissulfeto entre a posição 173-183 e 176-182 e constitui a parte central da 25 região rica em cisteína da proteína G (GCRR) variando a partir do resíduo de aminoácidos 171-187, de modo que a GCRR se sobrepõe à região conservada de 13 aminoácidos. A glicoproteína G parece desempenhar um papel tanto na indução da imunidade protetora como a patogênese da doença. Por exemplo, estudos em camundongos mostraram que os iniciadores da glico30 proteína G para uma resposta de células T Th2 CD4+ são caracterizados pela produção de IL-4, IL-5, IL-13 e eosinofilia pulmonar. Recrutamento e ativação dos eosinófilos são promovidos por vários fatores, tais como IL-4 e IL-5. Ainda, a expressão da proteína G do RSV durante infecção aguda em camundongos foi associada a uma imunorresposta inata modificada, caracterizada por expressão reduzida da citoquina Th1 (por exemplo, lL-2 e gama-interferon), expressão de mRNA de quimioquina altera (por exemplo, 5 MIP-1 alfa, MIP-1 beta, MIP-2, IP-10, MCP-1), e tráfico de células NK na modulação da resposta inflamatória inata, retardando, assim, de modo potencial, a renovação do RSV (Polack et al. 2005. PNAS 102:8996-9001). A GCRR compreende um motivo CX3C em posições de aminoácidos 182 a 186. Redução em taxas respiratórias em camundongos infectados com RSV 10 mostrou estar associada ao motivo CX3C, já que os anticorpos contra esse motivo abolem a redução das frequências respiratórias (Tripp et al. 2003. J. Virol. 77:6580-6584 e US 2004/0009177 (Pedido 10/420.387)). Os epitopos específicos de cepa são preferencialmente localizados no terceiro C-terminal variável do polipeptídeo G, embora um epitopo específico de cepa tenha si15 do mapeado para um uma região variável N-terminal para o grupo de cisteína no ectodomínio da proteína G (Martinez et al. 1997. J. Gen. Virol. 78:2419-29). A Figura 1 mostra um alinhamento das proteínas G da cepa Long (subtipo A) e a cepa 18537 (subtipo B), indicando as várias regiões da proteína G. Geralmente, os anticorpos anti-proteína G monoclonais têm efei20 tos marginais sobre a neutralização do RSV. Contudo, foi reportado que misturas de anticorpos anti-G monoclonais intensificam a neutralização do RSV in vitro bem como in vivo (Walsh et al. 1999). J.Gen.Virol. 70:2953-61 e Martinez e Melero 1989 J.Gen.Virol. 79:2215-20). O maior efeito de se combinar anticorpos anti-G monoclonais é aparentemente obtido quando os anticorpos 25 se ligam a epitopos diferentes, embora uma fração do vírus ainda permaneça resistente à neutralização. Adicionalmente. Foi mostrado que combinações de dois anticorpos anti-F diferentes com especificidades de epitopo diferentes bem como combinações de um anticorpo anti-F e um anti-G mostraram um efeito neutralizador in vitro intensificado sobre o RSV (Anderson 30 et al. 1988. J.Virol. 62: 4232-4238). Algumas das vantagens obtidas misturando-se anticorpos monoclonais parecem ser devido às propriedades individuais dos anticorpos monoclonais, tal como um efeito antagonista, por exemplo, por bloqueio do sítio ativo. Outros efeitos parecem ser sinergísticos por razões que não são correntemente entendidas.

Os mecanismos da neutralização do RSV são complexos e não completamente entendidos. O grande número de epitopos diferentes, epito5 pos conservados, específicos de subtipo bem como específico de cepa, identificados nas proteínas FeG sozinhas, bem como a geração potencial dos mutantes de escape sugere que um largo espectro de especificidades de anticorpos é necessário para direcionar todos os mecanismos de neutralização que podem desempenhar um papel na prevenção de infecção com 10 RSV. Assim, seria muito difícil, de um modo racional, selecionar a mistura dos anticorpos monoclonais capaz de prevenir infecção com RSV com cepa de RSV de ambos os subtipos AeB, bem como mutantes de escape e novas cepas que surgem das cepas de RSV conhecidas hoje.

Um aspecto da presente invenção é para proporcionar um anticorpo anti-RSV policlonal com uma diversidade considerável e uma ampla especificidade anti-RSV. O anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção não é dependente da disponibilidade do doador durante a produção e a variação de batelada para batelada é consideravelmente menor que aquela observada para produtos de imunoglobulina anti-RSV derivada de doador (por exemplo, IVIG de RSV). Em um anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção todos os membros dos anticorpos individuais são capazes de se~ligare a unrrantígeno associado'RSV e o'anticorpo policlonal é capaz de neutralizar subtipos A e B de RSV. É preferido que cada anticorpo distinto do anticorpo policlonal se ligue a um epitopo que não esteja ligado por qualquer um dos outros membros do anticorpo policlonal. Um anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção se ligará aos antígenos de RSV em um modo multivalente, que resulta usualmente na neutralização sinergística, fagocitose de células infectadas por macrófagos e citotoxicidade celular dependente de anticorpo aperfeiçoado (ADCC) contra células infectadas bem como ativação de complemento aumentada. Ademais, um anticorpo policlonal da presente invenção não é "diluído" por proteína de não-ligação que é o caso para IVIG de RSV, em que uma dose de 750 mg de proteína total/kg é necessária para ser eficaz. A percentagem de anticorpos específicos de RSV dentro de 750 mg de proteína total, mas não é provável de constituir mais que no máximo 1%, e mais provável menos. Assim, quando a potência in vitro de Palivizumab foi estimada como sendo de 25-30 vezes maiores que 5 aquela da IVIG de RSV (Johnson et al. 1997, J. Infect.Dis. 176:1215-24), essa é a compensação pela atividade específica reduzida da IVIG de RSV. Assim, se somente 1% das moléculas de imunoglobulina contida na IVIG de RSV são específicas para RSV, então a dose ativa do anticorpo policlonal da IVIG de RSV é somente de 7,5 mg, que é menor que aquela do anticorpo 10 monoclonal Palivizumab.

Por essas razões, espera-se que um anticorpo específico de RSV policlonal recombinante da presente invenção seja significantemente mais potente que um anticorpo monoclonal, e, portanto, será possível administrar uma dose menor de um anticorpo policlonal da presente invenção, em 15 comparação com as doses eficazes de Palivizumab e IVIG de RSV. Assim, um anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção é também considerada adequado para a profilaxia e o tratamento de adultos de alto risco, em particular recipientes de transplante de medula óssea, indivíduos idosos e indivíduos com doença pulmonar crônica. Uma outra vantagem de um anti20 corpo anti-RSV policlonal da presente invenção, é que a concentração dos membros de anticorpos individuais é significantemente menor que a concentração de um anticorpo monoclonal (mesmo que a dose usada seja a mesma), a possibilidade que um anticorpo individual seja reconhecido como estranho pelo sistema imunológico do indivíduo sob tratamento é diminuía, é 25 mesmo que um anticorpo individual é eliminado por uma imunorresposta no paciente, isso não é possível de afetar a capacidade de neutralização ou taxa de renovação do anticorpo anti-RSV policlonal, já que os membros de anticorpo permanecem intactos.

Uma modalidade da presente invenção é um anticorpo anti-RSV policlonal recombinante capaz de neutralizar subtipos A e B do RSV, e quando o dito anticorpo policlonal compreende membros de anticorpos distintos que em união se ligam especificamente a pelo menos três epitopos diferentes em pelo menos uma proteína envelope de RSV. Preferivelmente, a proteína F é ligada especificamente por pelo menos três membros de anticorpos distintos, e os ditos epitopos estão preferivelmente localizados em sítios antigênicos diferentes.

Uma outra modalidade da presente invenção é um anticorpo an

ti-RSV policlonal recombinante capaz de neutralizar subtipos A e B do RSV, e onde o dito anticorpo policlonal compreende membros de anticorpos distintos que em união proporciona, reatividade específica contra pelo menos duas proteínas envelope de RSV. As duas proteínas envelope podem ser sele10 cionadas da proteína G de RSV, proteína F de RSV e proteína SH de RSV. Preferivelmente, o anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção compreende reatividade anti-G e anti-F. A reatividade anti-G e anti-F de tal anticorpo policlonal é preferivelmente compreendida de pelo menos dois anticorpos anti-G distintos e pelo menos um anticorpo anti-F distinto. Preferivel15 mente, pelo menos três anticorpos distintos se ligam a epitopos diferentes, abrangendo, assim pelo menos três epitopos diferentes, e juntos os anticorpos são capazes de neutralizar, igualmente bem, as cepas de subtipo A e subtipo de RSV. Ainda mais preferida, a reatividade anti-G e anti-F de um anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção é compreendida de qual20 quer combinação das reatividades anti-G e anti-F, descritas abaixo. Mais preferido, um anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção é compreendido da reatividade anti-G e anti-F contra todos os sítios antigênicos/epitopos mencionados abaixo. Para obter a especificidade possível de um anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção, é desejado que um 25 ou mais, preferivelmente todos os sítios antigênicos são cobertos por mais que um anticorpo distinto. Consequentemente, é preferido que vários epitopos no mesmo antígeno ou sítio antigênico sejam ligados por membros distintos de unTanticorpo policlonal da presente invenção.

Com respeito à reatividade anti-G de um anticorpo anti-RSV poIiclonal da presente invenção, esta reatividade é preferivelmente direcionada contra epitopos conservados. Ainda mais preferido, a reatividade anti-G é compreendida de um primeiro anticorpo anti-G capaz de se ligar especificamente a um epitopo conservado na proteína G, e um segundo anticorpo antiG capaz de se ligar especificamente à região rica em cisteína da proteína G (GCRR). O anticorpo anti-RSV compreende preferivelmente pelo menos dois anticorpos anti-G distintos, em que pelo menos um primeiro anticorpo é ca5 paz de se ligar especificamente a um epitopo conservado na proteína G, e pelo menos um segundo anticorpo é capaz de se ligar especificamente a um epitopo conservado diferente ou a um epitopo específico de grupo que reconhece tanto o subtipo A como o subtipo B. Preferivelmente, o anticorpo policlonal compreende pelo menos três anticorpos anti-G distintos em que o 10 primeiro anticorpo é capaz de se ligar especificamente a um epitopo conservado na proteína G, e o segundo anticorpo é capaz de se ligar especificamente à proteína G do subtipo Aeo terceiro anticorpo é capaz de se ligar especificamente a uma proteína G do subtipo B. A região rica em cisteína da proteína G (GCRR) se sobrepõe especificamente à região de 13 aminoáci15 dos a montante, onde os epitopos conservados estão localizados e uma região onde os epitopos específicos do grupo estão localizados. Assim, os anticorpos capazes de se ligarem especificamente a um epitopo conservado bem como anticorpos específicos do grupo podem ser ligar à GCRR se o epitopo que eles reconhecem estiver localizado na GCRR. Preferivelmente, 20 pelo menos um dos anticorpos distintos caracterizados por sua ligação a um epitopo conservado ou a um epitopo específico da cepa também reconhece a GCRR. Anticorpos que se ligam ao motivo CX3C d GCRR são especialmente preferidos do ponto de vista de neutralização de vírus. Contudo, anticorpos que se ligam aos motivos CX3c podem se ligar também a vários ou25 tros antígenos ser humanos não relacionados, tal como fractalcina e outras quimioquinas CX3C humanas e assim produzem efeitos colaterais indesejados significando que será uma abordagem racional testar tais anticorpos quanto à reatividade cruzada (por exemplo, conforme demonstrada para certos anticorpos nos exemplos) e mais tarde testar os mesmos anticorpos em 30 sistemas de modelos adequados. Em qualquer taxa será sempre necessário testar um dado produto farmacêutico, tal como um anticorpo da presente invenção, em um experimento clínico antes poder ser estabelecido com um grau de certeza de que os efeitos colaterais estão ausentes, pequenos ou pelo menos aceitáveis. Além da reatividade anti-G conservada e específica de grupo, a reatividade anti-G direcionada contra epitopos específicos de cepa podem ser também compreendidos no anticorpo anti-RSV policlonal da 5 presente invenção. A reatividade anti-G específica de cepa direcionada contra os epitopos específicos de cepa abundantes presentes nas cepas do vírus, que resultaram da infecção com RSV dentro dos últimos cinco anos é preferida. Na presente invenção, os epitopos específicos de cepa são entendidos como epitopos que estão somente presentes em um número limitado 10 de cepas de RSV. A adição de anticorpos anti-G específico de grupo e/ou específico de cepa pode proporcionar diversidade adicional a um anticorpo anti-RSV da presente invenção, e podem induzir sinergia quando em combinação com anticorpos com reatividade à região conservada da proteína G. Preferivelmente, os anticorpos anti-G da presente invenção neutralizam o 15 RSV diretamente, bloqueiam a entrada do vírus na célula, previnem a migração celular, inibem respostas inflamatórias e/ou previnem a formação de sincícios.

Com respeito à reatividade anti-F de um anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção, esta reatividade é direcionada preferivelmente 20 contra pelo menos um epitopo em um ou mais dos sítios antigênicos I, II, IV, V, VI, C ou F1. Em outras modalidades da presente invenção, pelo menos dois, três, quatro, cinco, seis ou todos estes sítios antigênicos/epitopos são abrangidos pelos anticorpos distintos em um anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção. Preferivelmente, os anticorpos anti-F da presente in25 venção neutralizam RSV diretamente e/ou bloqueiam a entrada do vírus na célula e/ou previnem a formação de sincícios.

Em composições de anticorpos anti-RSV policlonais da presente invenção em que a composição não compreende reatividade de ligação direcionada contra todos os sítios antigênicos na proteína F, a presença de 30 pelo menos um anticorpo anti-F distinto que se liga especificamente a um epitopo do sítio Il antigênico preferido. Ainda mais preferido, o anticorpo antiF específico de sítio Il se liga ao mesmo epitopo ou sítio antigênico como o anticorpo Palivizumab. Além dos anticorpos específicos do sítio II, um ou mais anticorpos anti-F específico de sítio IV, distintos, são desejados, tal anticorpo se liga preferivelmente ao mesmo epitopo como RSVF2-5.

Anticorpos anti-F específicos de subtipo são também conhecidos 5 da técnica. Contudo, já que a proteína F mostra 91% de similaridade de aminoácidos entre os dois subgrupos A e B, os anticorpos anti-F específicos de subtipo são menos abundantes que para os anticorpos anti-G. Tais anticorpos anti-F específicos de cepa contribuirão, contudo, para obtenção como especificidade tal ampla quanto possível, e, portanto, são também compo10 nentes desejados de um anticorpo anti-RSV policlonal da presente invenção.

Além dos antígenos de proteínas G e F do RSV mencionados acima, o vírus RS expressa uma terceira proteína envelope, proteína hidrofóbica pequena (SH). Soros hiperimunes produzidos contra peptídeos provenientes das proteínas SH mostraram ser incapazes de neutralizarem RSV 15 in vitro (Akerlin-Stopner et al. 1993 J. Med. Virol. 40:112-120). Contudo, já que a proteína é principalmente expressa em células infectadas, acreditamos que anticorpos contra a proteína SH terão um efeito na inibição de fusão e serão potencialmente relevantes para proteção in vivo contra infecções com RSV. Isso é fundamentado no fato que as cepas de RSV que ca20 recem do gene SH replicam 10 vezes menos eficientes no aparelho respiratório superior (Bukreyev et al. 1997 J. Virol. 71:8973-82).

Uma modalidade adicional da presente invenção é um anticorpo anti-RSV capaz de neutralizar os subtipos AeB dos RSV e de compreender reatividade anti-SH, e reatividade anti-G ou anti-F. A terminação C que varia 25 de o aminoácido 41 ao 64/65 (subtipo A/B) da proteína SH é exposta na superfície celular. Logo, a reatividade anti-SH contra um epitopo localizado nesta área é desejado. A terminação C da proteína SH varia de subtipos A e B, e se deseja, portanto, incluir reatividade anti-SH tanto contra ambos os subtipos A e B em um anticorpo policlonal da presente invenção. Essa reati30 vidade de SH pode ser proporcionada por pelo menos dois anticorpos antiSH distintos onde o primeiro anticorpo é capaz de se ligar especificamente ao subtipo A de SH e o segundo anticorpo é capaz de se ligar especificamente ao subtipo B de SH.

Em uma modalidade da presente invenção, um anticorpo antiRSV policlonal compreende reatividade específica contra subtipos A e/ou B de SH bem como reatividade específica contra a proteína G. A reatividade contra a proteína G pode ser composta de qualquer uma das reatividades mencionadas acima.

Em uma modalidade alternativa, a reatividade específica contra os subtipos A e/ou B de SH pode ser combinada com qualquer uma das reatividades anti-F descritas acima para constituir um anticorpo anti-RSV policlonal.

Em uma modalidade preferida da presente invenção, um anticorpo anti-RSV policlonal compreende reatividade contra todas as três proteínas envelope, F, G e SH.

A reatividade compreendida em um anticorpo anti-RSV policlonal 15 da presente invenção pode constituir qualquer combinação possível de anticorpos distintos com reatividade de ligação específica contra os antígenos/sítios antigênicos e/ou epitopos sumarizados na Tabela 1, desde que a combinação seja capaz de neutralizar os subtipos A e B do RSV. Preferivelmente, a combinação contém reatividade contra pelo menos duas proteínas 20 envelope de RSV.

Preferivelmente, os membros do anticorpo distinto individual de um anticorpo policlonal de acordo com a presente invenção têm propriedades neutralizadoras e/ou anti-inflamatórias deles mesmos. Os anticorpos sem essas propriedades particulares podem, contudo, desempenhar tam25 bém um papel na renovação do RSV, por exemplo, através da ativação de complemento. Antígeno Sítio antigênico/epitopo Proteína F Sítio antigênico I Sítio antigênico Il Sítio antigênico IV Sítio antigênico V Sítio antigênico Vl Sítio antigênico C Epitopo F1 Proteína G Região conservada (a.a. 164-176) Específico de subtipo A Específico de subtipo B GCRR (a.a. 171-187) (conservada bem como específica de cepa) Motivo CX3C (a.a. 182-186) Específico de cepa Proteína SH Subtipo A Subtipo B Preferivelmente, um anticorpo policlonal da presente invenção é

produzido como batelada simples ou várias bateladas de uma linhagem de célula policlonal que não está naturalmente expressando moléculas de anticorpos (também corrTã' denominação de expressão- dé anticorpo policlonal recombinante). Uma das vantagens de produzir um anticorpo policlonal recombinante em comparação com uma mistura de anticorpos monoclonais é a capacidade de produzir um número ilimitado de moléculas de anticorpos distintos ao mesmo tempo (e a um custo similar ao de produzir um anticorpo monoclonal simples). Assim, é possível incluir anticorpos com reatividade a um grande número de antígenos associados ao RSV, sem aumentar significantemente o custo do produto final. Em particular, com um alvo tão complexo como o RSV, do qual a biologia não é completamente entendida, anticorpos individuais que não têm mostrado neutralizar ou proteger contra RSV sozinho, podem quando combinados com outros anticorpos induzir um efeito sinergístico. Assim, pode ser vantajoso incluir anticorpos distintos, além daqueles descritos acima, em uma composição de anticorpos policlonais, na qual o único critério é que o anticorpo individual se ligue a um antígeno associado ao RSV (por exemplo, avaliado por ligação a células infectadas com 5 RSV). Preferivelmente, todas as composições de anticorpos anti-RSV policlonais descritas acima são composições de anticorpos (rpAB anti-RSV) anti-RSV policlonais recombinantes.

Um modo de se adquirir anticorpos potencialmente relevantes que se ligam aos antígenos-alvo de RSV, que não se verificou serem antígenos relevantes, mas, no entanto, podem ser, é gerar uma composição de anticorpos policlonais que é composta de anticorpos individuais produzidos por uma imunorresposta de um doador que foi infectado com RSV (imunorresposta completa). Além de se obter anticorpos que representa uma imunorresposta completa contra RSV, uma seleção positiva por anticorpos que se ligam aos antígenos que têm a probabilidade de serem de particular relevância na proteção, neutralização, e/ou eliminação de infecções com RSV, pode ser realizada. Ainda, se os anticorpos para um antígeno particular, sítio antigênico ou epitopo que se acredita ser de relevância na proteção, neutralização e/ou eliminação do RSV não são identificados na imunorresposta completa do doador, tais anticorpos podem ser produzidos por imunização/vacinação de um doador com aquele antígeno particular (imunorrespos_tâ~selecionada). Geralmente,~ã neutralização é avaliãda "põr~ensaios de neutralização in vitro tais como redução de placa, micro neutralização ou ensaios de inibição de fusão (por exemplo, Johnson et al. 1997. J.Infect.Dis. 176:1215-24). Logo, um anticorpo ou composição de anticorpos tendo um efeito significante em um dos ensaios, quando comparado com controle negativo, é considerado ser neutralizador. A proteção é geralmente avaliada por experimentos de desafio in vivo, por exemplo, no modelo de rato de algodão (por exemplo, Johnson et al. 1997. J. Infect.Dis. 176:1215-24) ou o modelo de murino (por exemplo, Taylor et al. 1984. Immunolgy 52, 137-142 e Mejias, et al. 2005. Antimicrob. Agentes Chemother. 49: 4700-4707). Os experimentos de desafio in vivo podem ser executados tanto em um modo profilático, em que os anticorpos são administrados antes do desafio viral ou como tratamento, no qual os anticorpos são administrados depois do desafio viral ou como uma combinação de ambos.

Uma composição de anticorpos policlonais da presente invenção pode ser composta de anticorpos capazes de se ligarem a um antígeno de RSV que não seja necessariamente conhecido ou não necessariamente uma proteína envelope (o anticorpo se liga às células infectadas, mas não aos antígenos selecionados ou aos sítios antigênicos), mas quando os anticorpos são adquiridos de uma imunorresposta completa seguinte à infecção com RSV, por exemplo, por obtenção de seqüências de ácidos nucleicos que codificam os anticorpos distintos de um ou mais doadores infeccionados com RSV ou se recuperando de infecção com RSV. Em segundo lugar, anticorpos provenientes da mesma imunorresposta completa, que tenham sido selecionados, com base em sua capacidade de se ligarem a um antígeno particular, sítio antigênico e/ou epitopo, podem ser incluídos em anticorpo policlonal da presente invenção. Em terceiro lugar, anticorpos distintos codificados de pares de Vh e Vl obtidos e um ou mais doadores que foram imunizados/vacinados com um antígeno relacionado a RSV particular, produzindo assim uma imunorresposta "selecionada" nesses doadores, podem ser incluídos em uma composição de anticorpos policlonais da presente invenção. Assim, os anticorpos derivados de qualquer uma das técnicas mencionadas na presente invenção podem ser combinados em um anticorpo policlonal simples. Preferivelmente, os ácidos nucleicos que codificam os anticorpos da presente invenção são obtidos de doadores ser humanos e os anticorpos produzidos são anticorpos inteiramente ser humanos.

A motivação por trás das composições de anticorpos policlonais da presente invenção é: se um doador infectado com RSV produz uma imunorresposta humoral contra um antígeno, esses anticorpos têm a probabilidade de, pelo menos até certo grau, contribuir com a renovação viral e assim se qualificar para inclusão em um produto de anticorpo policlonal.

Um outro aspecto da presente invenção é produzir um rpAB antiRSV em que a composição dos membros de anticorpos distintos espelha a imunorresposta humoral com respeito à diversidade, afinidade e especificidade contra antígenos envelope de RSV. Preferivelmente, o espelhamento da resposta humoral é estabelecido por assegurar que um ou mais dos seguintes são preenchidos: i) as seqüências de ácidos nucleicos que codificam 5 as regiões de Vh e Vl dos membros do anticorpo individual em tal rpAB antiRSV são derivadas de doador(es) que tenham produzido uma imunorresposta humoral contra RSV, por exemplo, seguinte a infecção com RSV; ii) as seqüências de codificação de Vh e Vl são isoladas de o(s) doador(es) de modo que o pareamento original das seqüências de codificação de Vh e Vl 10 presentes no(s) doador(es) é mantido, iii) os pares de Vh e VL, que codificam os membros individuais do rpAB são selecionados de modo que as regiões CDR são tão diversas quanto possíveis, ou iv) a especificidade dos membros individuais do rpAb anti-RSV são selecionados de modo que a composição de anticorpos se liga coletivamente aos antígenos que elicitam respos15 tas aos anticorpos significantes em mamíferos. Preferivelmente, a composição de anticorpos se liga coletivamente aos antígenos, sítios antigênicos e/ou epitopos que produzem significantes títulos de anticorpos em uma amostra de soro de o(s) dito(s) doador(es). Tais antígenos, sítios antigênicos e/ou epitopos estão resumidos na Tabela 1 acima, mas podem se constituir 20 também de antígenos desconhecidos, sítios antigênicos e/ou epitopos bem como antígenos não-envelope, conforme descrição acima. Preferivelmente, os doadores são ser humanos, e o anticorpo policlonal é um anticorpo inteiramente ser humano.

A presente invenção identificou uma série de pares de Vh e Vl 25 que podem ser expressos como anticorpos de comprimento natural, fragmento Fab ou outros fragmentos de anticorpos que têm especificidade de ligação para um antígeno associado a RSV. Os pares de Vh e Vl específicos são identificados pelo número de clones na Tabela 6 do Exemplo 2. Um anticorpo que contém um par de Vh e VL, conforme identificado na Tabela 6 é, 30 preferivelmente, um anticorpo de tamanho natural. Contudo, se desejado, anticorpos quiméricos podem ser produzidos também.

Um anticorpo policlonal recombinante anti-RSV, preferido, da presente invenção, é composto de membros distintos que compreendem regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e de cadeia leve selecionadas do grupo de pares de Vh e Vl listado na Tabela 6. Preferivelmente, as regiões CDR estão mantidas no pareamento indicado na Tabela 6 e inseri5 das em uma estrutura desejada. Alternativamente, as regiões CDR da cadeia pesada (CDRH) de um primeiro clone são combinadas com as regiões CDR da cadeia leve (CRDL) de um segundo clone (mistura dos pares de Vh e VL). As regiões CDR podem ser também misturadas dentro da cadeia leve ou da cadeia pesada, por exemplo, por combinação da região CDRL1 de um 10 primeiro clone com região CDRL2 e região CDRL3 de um segundo clone. Tal mistura é realizada preferivelmente dentre os clones que se ligam ao mesmo antígeno. As regiões CDR da presente invenção podem ser também submetidas à maturação por afinidade, por exemplo, por mutações em pontos.

Composições preferidas de anticorpos

Composições de anticorpos particularmente preferidas compreendendo mais que uma molécula de anticorpo distinto foram identificadas pelos presentes inventores. Essas incluem composições de anticorpos que são eficazes em ensaios de neutralização de vírus (Tabela 9) e in vivo (Tabelas 10 e 11).

Uma composição de anticorpos particularmente preferida é uma composição de anticorpos que compreende o anticorpo 824 ou um anticorpo derivado deste conforme descrito aqui e um ou mais anticorpos anti-RSV adicionais. O anticorpo 824, por si mesmo, é um anticorpo muito potente e 25 quando combinado com outros anticorpos - em particular com anticorpos direcionados contra a proteína G - exibem potência bastante alta in vitro e in vivo.

O um ou mais anticorpos anti-RSV adicionais podem ser selecionados do grupo que consiste em anticorpos ser humanos, anticorpos humanizados, e anticorpos quiméricos camundongo-ser humanos.

Preferivelmente, o um ou mais anticorpos anti-RSV adicionais são selecionados do grupo que consiste nas moléculas de anticorpos listadas na Tabela 6 aqui, ou especificamente um fragmento de ligação da dita molécula de anticorpo ou um análogo de anticorpo semissintético, em que o dito fragmento de ligação ou análogo compreende pelo menos as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da dita molécula de anticorpo 5 isolado, exceto um anticorpo tendo as CDRs do clone 824.

Uma composição de anticorpos preferida é composta de membros distintos compreendendo regiões de CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia pesada e de cadeia leve selecionadas do grupo de pares de Vh e Vl listado na Tabela 6, em que os membros distintos são os membros distintos de uma 10 das composições de anticorpos 2 a 56 na Tabela 9 abaixo. Tais composições de anticorpos mostraram ser potentes na neutralização de uma ou mais cepas de RSV in vitro.

Preferivelmente, a composição de anticorpos é capaz de neutralizar o subtipo A de RSV em um ensaio de neutralização de vírus, mais pre15 ferivelmente a composição é também capaz de neutralizar o subtipo A do RSV em um ensaio de neutralização de vírus, mais preferivelmente a composição é também capaz de neutralizar o subtipo B de RSV em um ensaio de neutralização de vírus. Ensaios adequados incluem a redução de placas e ensaios de microneutralização descritos aqui.

As composições particularmente preferidas demonstraram po

tência in vivo e compreendem os membros distintos selecionados dos membros distintos de uma das composições de anticorpos 2, 9, 13, 17, 18, 28, 33, e 56 da Tabela 9 abaixo.

Em algumas modalidades, a composição de anticorpos não contém anticorpos anti-RSV além dos anticorpos com as CDRs dos membros distintos descritos para cada composição 2-56 da Tabela 9 abaixo. Isolamento e seleção dos pares de codificação de cadeia pesada variável e cadeia leve variável

O processo de gerar uma composição de anticorpos policlonais recombinantes anti-RSV envolve o isolamento das seqüências que codificam cadeias pesadas variáveis (Vh) e cadeias leves variáveis (Vl) de uma fonte adequada, gerando assim um repertório de pares de codificação de Vh e VL. Geralmente, uma fonte adequada para obtenção de seqüências de codificação de Vh e Vl são frações celulares contendo linfócitos tais como amostras de sangue, do baço e da medula óssea de um animal ou de ser humano que esteja infectado com RSV ou se recuperando de uma infecção com RSV, ou 5 de um animal ou de ser humano imunizado/vacinado com uma cepa de RSV ou de proteínas ou DNA derivados de tal cepa. Preferivelmente, frações contendo linfócitos são coletadas de ser humanos ou de animais transgênicos com genes de imunoglobulina humana. A fração celular contendo linfócitos coletada pode ser ainda enriquecida para obter uma população de linfócitos 10 particular, por exemplo, células da linhagem de linfócitos B. Preferivelmente, o enriquecimento é realizado usando-se classificação de células com contas magnéticas (MACS) e/ou classificação de células ativadas com fluorescência (FACS), aproveitando a vantagem de proteínas marcadoras de superfície celular específicas da linhagem, por exemplo, para células B, blastos plas15 máticos e/ou células plasmáticas. Preferivelmente, a fração de células contendo linfócitos é enriquecida com respeito às células B, blastos plasmáticos e/ou células plasmáticas. Ainda mais preferidas, células com alta expressão de CD37 e expressão intermediária de CD19 e/ou de CD45 são isoladas do sangue. Essas células são algumas vezes denominadas células plasmáticas 20 circulantes, células plasmáticas precoces ou blastos plasmáticos. Para facilitar, essas são prontamente denominadas de células plasmáticas na presente invenção, embora outros termos possam ser usados de modo intercambiável.

O isolamento de seqüências de codificação pode ser ou realiza25 do do modo clássico, em que as seqüências de codificação de Vh e Vl são combinadas aleatoriamente em um vetor para gerar uma biblioteca combinatória de seqüências de codificação de Vh e Vl- Contudo, na presente invenção, é referido espelhar a diversidader afinidade e especificidade dos anticorpos produzidos em uma imunorresposta humoral mediante infecção com 30 RSV. Isso envolve a manutenção do pareamento de Vh e Vl originalmente presente no doador, gerando, assim, um repertório de pares de seqüências em que cada par codifica uma cadeia pesada variável (Vh) e uma cadeia leve variável (Vl) correspondendo a um par de Vh e Vl originalmente presente em um anticorpo produzido pelo doador do qual as seqüências são isoladas. Isso é também denominado um par cognato de seqüências que codificam Vh e Vl e o anticorpo é denominado um anticorpo cognato. Preferivel5 mente, os pares de codificação de Vh e Vl da presente invenção, combinatórios ou cognatos, são obtidos de doadores ser humanos, e, portanto, as seqüências são completamente humanas.

Existem várias abordagens diferentes para a geração de pares cognatos de seqüências que codificam Vh e VL, uma abordagem envolve a amplificação e isolamento de seqüências de codificação de Vh e Vl a partir de células simples escolhida de uma fração celular contendo linfócitos. As seqüências de codificação de Vh e Vl podem ser amplificadas separadamente e emparelhadas em uma segunda etapa ou podem ser emparelhadas durante a amplificação (Coronella et al. 2000, Nucleic Acids Res. 28: E85; Babcook et al. 1996. PNAS 93: 7843-7848 e WO 2005/042774). Uma segunda abordagem envolve amplificação na célula e emparelhamento de seqüências que codificam Vh e Vl (Embleton et al. 1992. Nucleie Acids Res. 20: 3831-3837; Chapai et al. 1997. BioTechniques 23: 518-524). Uma terceira abordagem é o método de anticorpo de linfócito selecionado (SLAM) que combina um ensaio de placa hemolítica com clonagem de cDNA de Vh e Vl (Babcook et al. 1996. PNAS 93: 7843-7848).I De modo a se obter um repertório de pares de seqüências que codificação Vh e Vl que se assemelham a diversidade de pares de seqüências de Vh e de Vl no doador, é preferido um método de alto rendimento com o mínimo possível de mistura (combinação aleatória) dos pares de Vh e Vl, por exemplo, conforme descrito no WO 2005/042774 (aqui incorporado a título de referência).

Em uma modalidade preferida da presente invenção, um repertório de pares codificadores de Vh e VL, em que os pares dos membros espelham os pares de genes responsáveis pelo imunorresposta humoral resul30 tante de infecção com RSV, é gerado de acordo com um método que compreende as etapas i) proporcionar uma fração celular contendo linfócitos de um doador infectado com RSV ou recuperar de uma infecção com RSV; ii) opcionalmente enriquecer as células B ou células plasmáticas provenientes da dita fração celular; iii) obter uma população de células simples isoladas, compreendendo distribuir as células provenientes da dita fração celular individualmente em uma pluralidade de vasos; iv) amplificar e efetuar a ligação 5 dos pares codificadores de Vh e VL, em um procedimento de a RT-PCR por sobreposição-extensão em multiplex e v) realizar opcionalmente uma Nested PCR dos pares codificadores de Vh e Vl ligados. Preferivelmente, os pares cognatos que codificam Vh e Vl são submetidos a um procedimento de seleção conforme descrito abaixo.

Depois de gerados os pares de seqüências de Vh e Vl, é efetua

do um procedimento de seleção para identificar seqüências que codificam pares de Vh e Vl com reatividade de ligação a um antígeno associado a um RSV. Preferivelmente, o antígeno associado ao RSV é uma proteína envelope de RSV, em particular a proteína G do RSV, proteína F do RESV e prote15 ína SH do RSV. Se os pares de seqüências de Vh e Vl são combinatórios, um procedimento de exposição de fago pode ser aplicado para enriquecer os pares de Vh e Vl que codificam fragmentos de anticorpos que se ligam ao RSV antes da seleção.

De modo a espelhar a diversidade, afinidade e especificidade dos anticorpos produzidos em uma imunorresposta humoral mediante infecção com RSV, a presente invenção desenvolveu um procedimento de seleção para os pares cognatos, de modo a obter a diversidade mais ampla possível. Para fins de seleção, o repertório de pares cognatos de Vh e Vl é expresso individualmente tanto como fragmentos de anticorpos (por exemplo, scFv ou Fab) ou como anticorpos de tamanho natural usando tanto vetor de seleção bacteriano como de mamífero em uma célula hospedeira adequada. 0 repertório de Fabs/anticorpos é selecionado quanto à reatividade em uma célula hospedeira'adequada. Ό repertório de Fabs/anticorpos é selecionado quanto à reatividade às partículas de vírus de uma ou mais cepas de RSV. Preferivelmente, pelo menos duas cepas, um de subtipo A e um de subtipo B são usados. As cepas de subtipo A são, por exemplo, Long (ATCC VR-26), A2 (ATCC VR-1540) ou mais recentes ou isolados de subtipo A como Long mais recentes. Cepas de subtipo A são, por exemplo, 18537 (ATCC VR1580), B1 (ATCC VR-1400), 9320 (ATCC VR-955) ou isolados mais recentes como 18537. Em paralelo, o repertório dos Fabs/anticorpos é selecionado contra antígenos selecionados tais como proteína G recombinante, proteína 5 F recombinante e peptídeos derivados de antígenos RSV. Os peptídeos antigênicos podem ser, por exemplo, selecionados da região conservada da proteína G (aminoácidos 164-176) e região de núcleo da cisteína (aminoácidos 171-187 das cepas do subtipo A e do subtipo B) da proteína G e, da região extracelular da proteína SH (aminoácidos 42-64 do subtipo A e 42-65 10 do subtipo A). Preferivelmente, os peptídeos são biotinilados para facilitar a imobilização nas contas ou placas durante a seleção. Os meios de imobilização alternativos podem ser usados também. Os antígenos são selecionados com base no conhecimento da biologia de RSV e do efeito esperado de neutralização e/ou protetor que os anticorpos capazes de se ligarem a estes an15 tígenos podem potencialmente proporcionar. Esse procedimento de seleção pode igualmente ser aplicado a uma biblioteca combinatória de exposição de fago. As proteínas F e/ou F recombinantes usadas para seleção podem ser expressas em bactérias, células de insetos ou um outro sistema de expressão. As proteínas G e/ou F podem ser ou expressas como uma proteína so20 lúvel (sem a região transmembrânica) ou elas podem ser fundidas a uma

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terceira proteína, para aumentar a estabilidade. Se as proteínas G e/ou F são expressas com um marcador de fusão, o parceiro de fusão pode ser clivado antes da seleção. Preferivelmente, as proteínas G e/ou F representativas de ambos o subtipo Aeo subtipo B são expressos e usados para sele25 ção. Adicionalmente, as proteínas G específicas da cepa podem ser expressas e usadas para seleção. Além da seleção primária descrita acima, uma seleção secundária pode ser realizada, de modo a assegurar que nenhuma das seqüências selecionadas codifica positivos falsos. Na segunda seleção, todos os pares de Vh e Vl de ligação do RSV/antígeno identificados na pri30 meira seleção são selecionados de novo contra tanto as cepas de vírus como os antígenos selecionados. Geralmente, ensaios imunológicos são adequados para a seleção realizada na presente invenção. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica e constituem, por exemplo, ELISPOTS, ELISA, FLISA, ensaios de membrana (por exemplo, Western blots), séries de filtros, e FACS. Os ensaios podem ser ou realizados sem qualquer enriquecimento anterior, utilizando polipeptídeos produzidos das seqüências que codificam 5 os pares de Vh e VL. No caso que o repertório de pares de codificação de Vh e Vl são pares cognatos, sem enriquecimento, por exemplo, por exposição de fago é necessário antes da solução. Contudo, na seleção das bibliotecas combinatórias, os imunoensaios são preferivelmente realizados em combinação com ou seguintes aos métodos de enriquecimento tais como exposi10 ção em fago, exposição em ribossomo, exposição na superfície bacteriana, exposição em levedura, exposição de vírus eucariótico, exposição de RNA ou exposição covalente (revisto por FitzGeraId, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253-258).

As seqüências que codificam pares de Vh e Vl selecionadas na seleção são geralmente submetidas ao sequenciamento, e analisadas com respeito à diversidade das regiões variáveis. Em particular, a diversidade nas regiões CDR é de interesse, mas também a representação da família de VH e Vl é de interesse. Com base nessas análises, são selecionadas as seqüências que codificam os pares de Vh e Vl que representam a diversidade total dos anticorpos de ligação de RSV isolados de um ou mais doadores. Preferivelmente, seqüências com diferenças em todas as regiões CDR (CDRH1, CDRH2, CDRH3 e CDRL1, CDRL2 e CDRL3) são selecionadas. Se existem seqüências com uma ou mais regiões CDR idênticas ou muito similares que pertencem a diferentes famílias de Vh ou Vl, essas são selecionadas também. Preferivelmente, pelo menos a região CDR3 da cadeia pesada variável (CDRH3) difere dentre os pares de seqüências selecionados. Potencialmente, a seleção de pares de seqüência de Vh e Vl pode se basear somente na-variabilidade da região CDRH3. Durante a iniciação e amplificação das seqüências, podem ocorrer mutações nas regiões de estrutura da região variável, em particular na primeira região de estrutura. Preferivelmente, os erros que ocorrem na primeira região de estrutura são corrigidos de modo a assegurar que as seqüências correspondam completamente ou pelo menos 98% àquelas do doador, por exemplo, de modo que as seqüências sejam inteiramente humanas.

Quando é assegurado que a diversidade total da coleção de seqüências selecionadas que codificam pares de Vh e Vl seja altamente repre5 sentativa da diversidade vista no nível genético em uma resposta humoral a uma infecção por RSV, é esperado que a especificidade total dos anticorpos expressos a partir de uma coleção de pares codificadores de Vh e Vl selecionados seja representativa com respeito à especificidade dos anticorpos produzidos nos doadores infectados com RSV. Uma indicação de se a espe

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10 cificidade dos anticorpos expressos de uma coleção de pares codificadores de Vh e Vl é representativa da especificidade dos anticorpos produzidos por doadores infectados pode ser obtida por comparação dos títulos de anticorpos com respeito às cepas do vírus bem como os antígenos selecionados do sangue do doador com a especificidade dos anticorpos expressos a partir de 15 uma coleção de pares de codificação Vh e VL. Adicionalmente, a especificidade dos anticorpos expressos de uma coleção de pares codificadores de Vh e Vl pode ser analisada'subsequentemente. O grau de especificidade está correlacionado com vários antígenos diferentes cuja reatividade de ligação pode ser detectada. Em uma outra modalidade da presente invenção, a 20 especificidade dos anticorpos individuais expressos de uma coleção de pares codificadores de Vh e Vl é analisada por mapeamento de epitopos.

O mapeamento de epitopos pode ser realizado por várias metodologias, que não excluem necessariamente um do outro. Um modo de mapear da especificidade dos epitopos de um clone de anticorpo é para avaliar 25 a ligação aos peptídeos de comprimentos variáveis derivados da estrutura primária do antígeno-alvo. Tais peptídeos podem ambos lineares e conformacionais e podem ser usados em vários formatos de ensaios, inclusive ELISA1 ELISA e ressonância de plasmônio de superfície (SPR, Biacore). Além disso, os peptídeos podem ser racionalmente selecionados usando-se dados 30 de seqüências e estruturas para representar, por exemplo, regiões extraceluIares e regiões conservadas do antígeno-alvo, ou eles podem ser desenhados como um painel de peptídeos de sobreposição representado uma parte selecionada ou todo o antígeno (Meloen RH, Puijk WC1 Schaaper WMM. Epitopo mapping by PEPSCAN. Em: Immunology Methods Manural. Ed Iwan Lefkovits 1997, Academic Press, pp. 982-988). A reatividade específica de um clone de anticorpo com um ou mais de tais peptídeos será geralmente uma indicação da especificidade do epitopo. Contudo, os peptídeos são em muitos casos miméticos pobres dos epitopos reconhecidos por anticorpos produzidos contra antígenos proteicos, ambos devido à falta de conformação e devido à área superficial coberta geralmente maior de interação entre um anticorpo e um antígeno de proteína em comparação a um anticorpo e um peptídeo. Um segundo método para mapeamento de epitopo, que permite a definição de especificidades diretamente no antígeno de proteína, é por mascaramento de epitopo seletivo usando anticorpos bem-definidos existentes. A ligação reduzida de um segundo anticorpo de sonda para o antígeno seguinte ao bloqueio é geralmente indicativa de epitopos compartilhados ou de sobreposição. O mapeamento de epitopos por mascaramento seletivo pode ser realizado por vários imunoensaios, incluindo, mas sem restrição, ELISA e Biacore1 que são bem conhecidos da técnica (por exemplo, Ditzel et al. 1997. J. Mol. Biol. 267:684-695; Aldaz-Carroll et al. 2005. J. Virol. 79: 6260-6271). Ainda, um outro método potencial para a determinação da especificidade do epitopo de anticorpos de antivírus é a seleção de mutantes de escape viral na presença de anticorpo. O sequenciamento do(s) gene(s) ‘desinteresse de tais mutantes de escape revelará geralmente que aminoácidos no(s) antígeno(s) que são importantes para o reconhecimento pelo anticorpo e assim constituem (parte) do epitopo.

Preferivelmente, membros individuais a ser compreendidos por um rpAb anti-RSV da presente invenção são selecionados de modo que a especificidade da composição de anticorpos abrange coletivamente ambos os subtipos A-e B do RSV, bem como os antígenos associados ao RSV, proteínas F e G, e preferivelmente também SH.

Produção de um anticorpo policlonal recombinante de pares codificadores de Vh e Vl

Um anticorpo policlonal da presente invenção é produzido a partir de uma linhagem de célula de expressão policlonal em um ou em uns poucos reatores ou equivalentes destes. Seguintes a essa abordagem, o rpAb anti-RSV pode ser purificado do reator como uma preparação simples sem ter que separar os membros individuais que constituem o rpAb anti-RSV 5 durante o processo. Se o anticorpo policlonal é produzido em mais que um biorreator, os sobrenadantes de cada biorreator podem ser reunidos antes da purificação, ou o rpAb anti-RSV purificado pode ser obtido por reunião dos anticorpos obtidos de sobrenadantes purificados individualmente de cada biorreator.

Um modo de produzir um anticorpo policlonal recombinante está

descrito no WO 2004/061104 e WO 2006/007850 (PCT/DK2005/000501) (esses documentos são aqui incorporados a título de referência). O método descrito neles é baseado em integração específica de sítio da seqüência que codifica anticorpo no genoma das células hospedeiras individuais, assegu15 rando que as cadeias de proteína de Vh e Vl sejam mantidas em seu emparelhamento original durante a produção. Além disso, a integração específica de sítio minimiza os" efeitos de posição è, portanto, espera-se que as propriedades de crescimento e de expressão das células individuais na linhagem de célula policlonal sejam muito similares. Geralmente, o método envolve o 20 seguinte: i) uma célula hospedeira com um ou mais sítios de reconhecimento de recombinase; ii) um vetor de expressão com pelo menos um sítio de reconhecimento de recombinase compatível com aquele da célula hospedeira: iii) geração de uma coleção de vetores de expressão por transferência dos pares codificadores de Vh e Vl do vetor de seleção para um vetor de ex25 pressão de modo que um anticorpo de tamanho natural ou fragmento deste pode ser expresso a partir do vetor (tal transferência pode não ser necessário se o vetor de seleção for idêntico ao vetor de expressão); iv) transfecção da célula hospedeira com a coleção dos vetores de expressão e um vetor que codifica uma recombinase capaz de combinar os sítios de reconheci30 mento de recombinase no genoma da célula hospedeira com àquela no vetor; v) obter/gerar uma linhagem de célula policlonal da célula hospedeira transfectada; e vi) expressar e coletar o anticorpo policlonal da linhagem de célula hospedeira.

Preferivelmente, são usadas células mamíferas tais como células CHO1 células COS, células BHK, células de mieloma (por exemplo, células Sp2/0 ou NSO), fibroblastos tais como NlH 3T3, e células humanas imor5 talizadas, tais como célula HeLa, células HEK 293, ou PER.C6. Contudo, células eucarióticas de não-mamíferos ou procarióticas, tais como células vegetais, células de insetos, células de levedura, fungos, E. coli, etc., podem ser empregadas também. Uma célula hospedeira adequada compreende um ou mais sítios de reconhecimento de recombinase adequados em seu ge10 noma. A célula hospedeira deve conter também um modo de seleção que é operavelmente ligado ao sítio de integração de modo a ser capaz de selecionar integrantes, (isto é, células tendo uma cópia integrada de um vetor de expressão de Ab anti-RSV ou fragmento de vetor de expressão no sítio de integração). A preparação de células tendo um sítio FRT em um local prede15 terminado no genoma foi descrito, por exemplo, na Patente US 5.677.177. Preferivelmente, uma célula hospedeira tem um sítio de integração simples, que está localizado em um sítio que permite alta expressão do integrante (o assim chamado ponto quente).

Um vetor de expressão adequado compreende um sítio de reconhecimento de recombinação correspondendo com o(s) sítio(s) de reconhecimento de recombinase da célula hospedeira. Preferivelmente, o sítio de 'reconhecimento de recõTnbinase esta ligádo^ã um gene de seleção adequado diferente do gene de seleção usado para a construção da célula hospedeira. Os genes de seleção são bem conhecidos da técnica, e incluem gene de glutamina sintetase (GS), gene de di-hidrofolato redutase (DHFR), e neomicina, em que GS o DHFR pode ser usado para amplificação de gene da seqüência de Vh e Vl inserida. O vetor pode conter também dois sítios de reconhecimento de recombinase, diferentes, para permitir que a troca de cassete mediada por recombinase (RMCE) da seqüência de codificação de anticorpo em vez da integração completa do vetor. RMCE é descrita por Langer et al 2002. Nucleic Acids Res. 30, 3067-3077; Schlake e Bode 1994. Biochemistry 33, 12746-12751 e Belteki et al 2003. Nat. biotech. 21, 321- 324. Sítios de reconhecimento de recombinase adequados são bem conhecidos da técnica, e incluem sitos FRT1 Iox e attP/attB. Preferivelmente, o vetor de integração é um vetor de que codifica isótipo, onde as regiões constantes (preferivelmente incluindo íntrons) estão presentes no vetor antes de transferir o par codificador de Vh e Vl do vetor de seleção (ou as regiões constantes já estão presentes no vetor de seleção se a seleção é realizada nos anticorpos de tamanho natural). As regiões constantes presentes no vetor pode ser tanto a região constante da cadeia pesada inteira (CH1 a CH3 ou a CH4) ou a região constante que codifica a parte Fc do anticorpo (CH2 a CH3 ou a CH4). A região constante Capa ou Lambda da cadeia leve pode estar presente também antes da transferência. A escolha do número de regiões constantes presentes, se alguma, depende do sistema de seleção ou de transferência usado. As regiões constantes de cadeia pesada podem ser selecionadas dos isótipos IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI, lgA2, IgM1 IgD e IgE. Isótipos preferidos são IgGI e/ou lgG3. Ainda, o vetor de expressão para integração específica de sítio do ácido nucleico que codifica o anticorpo anti-RSV contém promotores adequados ou seqüências equivalentes que direcionam os altos níveis de expressão de cada uma das cadeias Vh e Vl. A Figura 3 ilustra um modo possível de se desenhar o vetor de expressão, embora outros numerosos desenhos sejam possíveis.

A transferência dos pares codificadores de Vh e Vl do vetor de “seleçãor pode ser realizada por clivagem e ligação de enzima de restrição, convencionais, de modo que cada molécula de vetor de expressão contenha um par codificador de Vh e VL. Preferivelmente, os pares codificadores de Vh 25 e Vl são transferidos individualmente, contudo, eles podem também ser transferidos em massa se desejado. Quando todos os pares codificadores de Vh e Vl selecionados são transferidos para o vetor de expressão, uma coleção ou uma biblioteca de vetores de expressão é obtida. Modos alternativos de transferência podem ser usados também, se desejado. Se o vetor 30 de seleção é idêntico ao vetor de expressão, a biblioteca de vetores de expressão é constituída dos pares de seqüências de Vh e Vl selecionados durante a seleção, os quais são situados no vetor de seleção/expressão. Métodos para transfectar uma seqüência de ácidos nucleicos em uma célula hospedeira são conhecidos da técnica. Para assegurar a interação específica de sítio, uma recombinase adequada deve ser proporcionada à célula hospedeira também. Isso é preferivelmente obtido por cotransfecção 5 de um plasmídeo que codifica a recombinase. Recombinases adequadas são, por exemplo, Flp, Cre ou fago OC31 integrase, usadas juntas com um sistema de célula hospedeira/vetor com os sítios de reconhecimento de recombinase. A célula hospedeira pode ser ou transfectada em massa, significando que a biblioteca de vetores de expressão é transfectada na linhagem 10 da célula em uma reação simples obtendo assim uma linhagem de célula policlonal. Alternativamente, a coleção de vetores de expressão podem ser transfectados individualmente na célula hospedeira, gerando, assim uma coleção de linhagens de células individuais (cada linhagem de célula produz um anticorpo com uma especificidade particular). As linhagens celulares ge15 radas mediante transfecção (individual ou policlonal) são então selecionadas quanto aos integrantes específicos de sítio, e adaptadas para crescerem em suspensão e meios isentos de soro, se eles já não possuírem estas propriedades antes da transfecção. Se a transfecção foi realizada individualmente, as linhagens de células individuais são analisadas posteriormente com res20 peito as suas propriedades de crescimento e produção de anticorpo. Preferivelmente, as linhagens de células com taxas de proliferação e níveis de expressão de anticorpos similares são selecionadas para a geração da linhagem de célula policlonal. A linhagem de célula policlonal é então gerada misturando-se as linhagens de células individuais em uma razão predefinida. 25 Geralmente, um banco de células mestre policlonais (pMCB), um banco de células de pesquisa policlonais (pRCB) e/ou um banco de célula de trabalho policlonais (pWCB) é depositado sobre a linhagem de células policlonal. A linhagem de célula policlonal é gerada misturando as linhagens de células individuais em uma razão predefinida. A linhagem de célula policlonal é dis30 tribuída em ampolas, gerando, assim, um banco de células de pesquisa policlonais (pRCB) ou um banco de células mestre (pMCB) do qual um banco de células de trabalho (pWCB) pode ser gerado por expansão do banco de células de pesquisa ou mestre. O banco de células de pesquisa é principalmente para prova de estudos de conceito, nos quais a linhagem de célula policlonal não pode compreender tantos anticorpos individuais quando a linhagem de célula policlonal na banco de células máster. Normalmente, o 5 pMCB é expandido para subsequentemente produzir um pWCB para fins de produção. Uma vez que o pWCB tenha se exaurido, uma nova ampola do pMCB podem ser expandida para formular um novo pWCB.

Uma modalidade de presente invenção é uma linhagem de célula policlonal capaz de expressar um anticorpo anti-RSV policlonal recombinante da presente invenção.

Uma outra modalidade da presente invenção é uma linhagem de célula policlonal, em que cada célula indvidual é capaz de expressar um par de codificadores de Vh e Vl simples, e a linhagem de célula policlonal, como um todo, é capaz de expressar uma coleção de pares codificadores de Vh e 15 VL, em que cada par de Vh e Vl codifica um anticorpo anti-RSV. Preferivelmente, a coleção de pares codificadores de Vh e Vl são pares cognatos gerados de acordo com os métodos da presente invenção.

Um anticorpo policlonal recombinante da presente invenção é expresso cultivando-se uma ampola de um pWCB em um médio apropriado por um período de tempo que permite expressão suficiente de anticorpo e em que a linhagem de célula policlonal permanece estável (A janela é de -aproximadamente 15 dias a 50 dias). Métodos de cultura tal como em batelada alimentada ou perfusão podem ser usados. O anticorpo policlonal recombinante é obtido do meio de cultura e purificado por técnicas de purificação convencionais. Cromatografia por afinidade combinada com etapas de -purificação subsequentes tais como cromatografia de troca iônica, interações hidrofóbicas e filtração de gel tem sido usada frequentemente para a purificação de IgG. Depois da purificação, a presença de todos os membros individuais na composição de anticorpos policlonais é avaliada, por exemplo, por cromatografia de troca iônica. A caracterização de uma composição de anticorpos policlonais é descrita em detalhes no WO 2006/007853 (PCT/DK2005/000504) (aqui incorporados a título de referência). Um método alternativo para expressar uma mistura de anticorpos em um hospedeiro recombinante é descrito no WO 2004/009618. Esse método produz anticorpos com cadeias pesadas diferentes associadas à mesma cadeia leve proveniente de uma linhagem de célula simples. Essa 5 abordagem pode ser aplicável se o rpAb anti-RSV é produzido a partir de uma biblioteca combinatória.

Composições terapêuticas

Um outro aspecto da invenção é uma composição farmacêutica que compreende como um ingrediente ativo um rpAB anti-RSV ou um Gab 10 policlonal recombinante anti-RSV ou um fragmento de anticorpo policlonal recombinante anti-RSV. Preferivelmente, o ingrediente ativo de tal composição é um anticorpo policlonal recombinante anti-RSV conforme descrito na presente invenção. Tais composições são destinadas à prevenção e/ou ao tratamento de infecções com RSV. Preferivelmente, a composição farmacêu15 tica é administrada a um ser humano, um animal doméstico, ou um animal de estimação.

A composição farmacêutica compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável. rpAb anti-RSV ou fragmentos policlonais deste podem ser administrados em um diluente, veículo ou excipiente, farmaceuticamente aceitáveis, em forma de dosagem unitária. A prática farmacêutica convencionais pode ser empregada para proporcionar formulações ou composições adequadas para administração a pacientes infectados com RSV, ou a paciente que podem ficar em alto risco de infectados com RSV. Em uma modalidade preferida, a administração é terapêutica, significando que ela é administrada depois do início dos sintomas relacionados à infecção com RSV. Qualquer via de administração apropriada pode ser empregada, por exemplo, a administração pode ser parenteral, intravenosa, intra-arterial, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal, aerossol, supositório, ou administração oral. Por exemplo, as formulações farmacêuticas podem estar na forma de comprimidos, cápsulas, goma de mascar ou confeito, e para formulações intranasais, na forma de pós, gotas nasais ou aerossóis.

As composições farmacêuticas da presente invenção são preparadas de um modo conhecido por si, por exemplo, por meios de processos convencionais de dissolução, liofilização, misturamento, granulação ou confeito. As composições farmacêuticas podem ser formuladas de acordo com a prática de farmácia convencional (vide, por exemplo, Remington: The Scien5 ce and Practice of Pharmacy (20a Edição), ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, PA e Encyclopeda of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nova Iorque, NI).

Preferivelmente, soluções ou suspensões do ingrediente ativo, e especialmente soluções ou suspensões aquosas isotônica, são usadas na preparação das composições farmacêuticas da presente invenção. No caso de composições Iiofilizadas que compreendem o ingrediente ativo sozinho ou junto com um veículo, por exemplo, manitol, tais soluções podem, se possível, ser produzidas antes do uso. As composições farmacêuticas podem ser esterilizadas e/ou podem compreender excipientes, por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes molhantes e/ou emulsificantes, solubilizantes, sais para regular a pressão osmótica e/ou tampões, e são preparadas de um modo conhecido por si, por exemplo, por meios de processos convencionais de dissolução ou liofilização. As ditas soluções ou suspensões podem compreender substâncias aumentadoras de viscosidade, tais como carboximetilcelulose sódica, carboximetilcelulose, dextrana, polivinilpirrõlidona ou gelatina.'

As composições de injeção são preparadas do modo usual sob condições estéreis; o mesmo se aplica também à introdução das composições em ampolas ou frascos e vedação dos recipientes.

As composições farmacêuticas para administração oral podem ser obtidas por combinação dos ingredientes ativos com veículos sólidos, se desejado, granulando-se a mistura resultante e processando-se a mistura, se desejado ou necessário, depois da adição dos excipientes apropriados, 30 em comprimidos, pílulas, ou cápsulas, que podem ser revestidas com gomalaca, açúcar ou ambos. É também possível para estes serem incorporados em veículos de plásticos que permitem que os ingredientes ativos se difundam ou que sejam liberados em quantidades dosadas.

As composições farmacêuticas compreendem de aproximadamente 1% a aproximadamente 95%, preferivelmente de aproximadamente 20% a aproximadamente 90% de ingrediente ativo. As composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem estar, por exemplo, na forma de dose unitária, tal como na forma de ampolas, frascos, supositórios, comprimidos, pílulas, ou cápsulas. As formulações podem ser administradas a indivíduos ser humanos em quantidades terapêutica ou profilaticamente eficazes (por exemplo, quantidades que previna, eliminem ou reduzam uma condição patológica) para proporcionar terapia para uma doença ou condições. A dosagem preferida do agente terapêutico a ser administrado é provável de depender e tais variáveis tais como a gravidades de a infecção com RSV, o estado de saúde geral do doente em particular, a formulação dos excipientes dos compostos e de sua via de administração Usos terapêuticos das composições de acordo com a invenção.

As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser usadas para o tratamento, atenuação ou profilaxia de uma doença em um mamífero. As condições que podem ser tratadas ou prevenidas com as presentes composições farmacêuticas incluem prevenção, e o 20 tratamento de pacientes infectados com RSV, ou em risco de tornar infectado com RSV, em particular pacientes que podem estar em alto risco de se infectar com RSV. Pacientesüe alto risco são, por exemplo, bebês e crianças pequenas. Em particular, bebês prematuros e crianças com um problema subjacente tais como doença pulmonar crônica ou doença cardíaca con25 gênita estão em alto risco de desenvolver doenças sérias tais como bronquiolite e pneumonia seguinte à infecção com RSV. Também adultos de alto risco, tais como adultos imunocomprometidos, particularmente recipientes de “transplante da medula óssèãrindivídüos idosos e indivíduos com doença pulmonar crônica, podem ser preferivelmente submetidos ao tratamento pro30 filático ou terapêutico com uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção.

Uma modalidade da presente invenção é um método para prevenir, tratar ou atenuar um ou mais sintomas associados a infecção com RSV em um mamífero, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um anticorpo policlonal recombinante anti-RSV da presente invenção ao dito mamífero.

Uma outra modalidade da presente invenção é o uso de um an

ticorpo policlonal recombinante da presente invenção na preparação de uma composição para o tratamento, atenuação ou prevenção de um ou mais sintomas associados a uma infecção com RSV em um mamífero.

Uma quantidade eficaz pode ser no máximo 100 mg do anticor10 po por kg de peso corporal, tal como no máximo 90, no máximo 80, no máximo 70, no máximo 60, no máximo 50, no máximo 40, no máximo 30, no máximo 20, no máximo 10, no máximo 9, no máximo 8, no máximo 7, no máximo 6, no máximo 5, no máximo 4, no máximo 3, no máximo 2, no máximo 1, no máximo 0,9, no máximo 0,8, no máximo 0,7, no máximo 0.6, no 15 máximo 0,5, no máximo 0,4, no máximo 0,3, no máximo 0,2 e no máximo 0,1. mg por kg de peso corporal.

Em outra modalidade, a quantidade eficaz é pelo menos 0,01 mg do anticorpo por kg de peso corporal, tal como, pelo menos, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8.

Preferivelmente, a quantidade eficaz está entre 0,1 a 50 mg de

anticorpo por kg de peso corporal. Mais preferivelmente, a quantidade eficaz está entre 1 e 20 mg de anticorpo por kg de peso corporal.

O anticorpo pode ser administrado pelo menos 1 vez ao ano, tal como 1,2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, e 20 vezes ao ano.

Em particular, o anticorpo pode ser administrado em intervalos regulares durante o período do ano em que há risco elevado de se contrair uma infecção com RSV. Os intervalos regulares podem ser semanais, bissemanais, mensais ou bimensais.

Preferivelmente, o mamífero nas modalidades acima é um ser

humano, um animal doméstico ou um animal de estimação.

Em uma outra modalidade, o mamífero, paciente do método para prevenir, tratar ou atenuar um ou mais sintomas associados a infecção com RSV, tem preferivelmente peso corporal acima de 40 kg.

Em modalidades em que o paciente é um ser humano, ele é preferivelmente um bebê prematuro, uma criança com doença pulmonar crônica 5 ou doença cardíaca congênita. Em modalidades alternativas, o ser humano é um adulto imunocomprometido, em particular um recipiente de transplante de medula óssea, um indivíduo idoso ou um indivíduo com doença pulmonar crônica.

Uso diagnóstico

Uma outra modalidade da invenção é direcionada a kit para di

agnóstico. Os kits de acordo com a presente invenção compreendem um rpAB anti-RSV preparado de acordo com a invenção cuja proteína pode ser marcada com um marcador detectáve! ou não marcado para detecção não marcado para detecção de não marcador. O kit pode ser usado para identificar indivíduos infectados com RSV.

Um kit para diagnóstico compreende geralmente os seguinte: a) um anticorpo de captura, b) um anticorpo detector, c) um controle positivo, e d) um controle negativo. Dependendo do método de detecção, um reagente simples pode ser usado tanto como um anticorpo de captura como detector. 20 Um método com base na ressonância de plasmônio de superfície (SPR) é um exemplo em que um anticorpo simples será suficiente para captura e detecção específica do antígeno de interesse. O rpAb anti-RSV da invenção pode ser usado tanto como anticorpo de captura como anticorpo detector. Como anticorpo de captura, o rpAb anti-RSV não marcado é adsorvido sobre 25 um suporte sólido, por exemplo, a superfícies dos poços da placa de ELISA ou microcontas, para captura subsequente das partículas de RSV ou de antígenos nas amostras de paciente. O antígeno capturado é então detectado usando-se um anticorpo diferente (detector), que e outro diretamente marcado ou detectado usando-se um anticorpo conjugado secundário ou reagente 30 de especificidade suficiente. Como anticorpo detector, o rpAb anti-RSV da invenção pode ser usado marcado ou não marcado e a quantidade de anticorpo ligado detectado diretamente (rpAb marcado) ou usando-se um anticorpo secundário ou reagente (rpAb não marcado).

A leitura do kit de diagnóstico pode ser baseado, por exemplo, na detecção de fluorescência de um marcador fluorogênico anexado ou absorbância de um substrato cromogênico adicionado catalisado por uma en5 zima conjugada ao anticorpo detector ou ao anticorpo secundário (imunoensaio enzimático). Em um método com base em SPR1 a quantidade de antígeno ligado é detectada em tempo real pelas alterações no índice local de refração conforme ele se ligado ao anticorpo de captura adsorvido. Independente da leitura, por comparação de intensidade do sinal para uma curva10 padrão gerada usando-se o controle positivo, a quantidade de antígeno presente na mesma amostra pode ser determinada.

Moléculas de anticorpo da presente invenção e aspectos relacionados a estas

Deve ser observado que é acreditado aqui que as novas molécu15 Ias de anticorpo descritas aqui contribuem para o estado da técnica em seu próprio direito. Logo, a presente invenção também se refere a qualquer uma das moléculas de anticorpo descritas aqui bem como a fragmentos e a análogos destes anticorpos, em que os ditos fragmentos ou análogos pelo menos incorporam as CDRs dos anticorpos descritos aqui.

Por exemplo, foi verificado pelos presentes inventores que al

gumas das moléculas de anticorpos inteiramente ser humanos que foram isolados de doadores ser humanos incluem sítios de ligação que exibem perfis cinéticos aperfeiçoados, extremamente altos, com relação aos anticorpos monoclonais conhecidos da técnica anterior quando se refere à ligação de 25 antígeno. Assim, embora muito foco seja colocado emas composições de anticorpos policlonais na presente exposição, toda a matéria referente à utilização de anticorpos policlonais estabelecida aqui é também relevante para qualquer uma das moléculas de anticorpos simples descritas aqui - isto é, todas as exposições que estão relacionadas à formulação, dosagem, admi30 nistração etc., que se referem às composições de anticorpos policlonais da presente invenção se aplicam mutatis mutandis às moléculas de anticorpos individuais, fragmentos de anticorpos e análogos de anticorpos descritos aqui, preferivelmente também às seqüências de estrutura.

Logo, a presente invenção também se refere a uma molécula de anticorpo anti-RSV ser humano isolado selecionada das moléculas de anticorpos mostradas na Tabela 6 abaixo, ou um fragmento especificamente de 5 ligação da dita molécula de anticorpo ou um análogo de anticorpo sintético ou semissintético, em que o dito fragmento de ligação ou análogo compreende pelo menos as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da dita molécula de anticorpo isolado. Frequentemente, as regiões de estrutura provenientes das regiões variáveis do anticorpo ser humano nativo se10 rão incluídas também nos fragmentos ou análogos, já que a especificidade do antígeno dos anticorpos é conhecida ser independente da organização tridimensional das CDRs e das regiões de estrutura.

A expressão de "molécula de anticorpo isolada" significa uma coleção de anticorpos que são isolados de contaminantes naturais, e que exibem as mesma seqüência de aminoácidos (isto é, regiões variáveis e constantes idênticas).

Tipicamente, qualquer molécula de anticorpo, fragmento ou análogo é derivada dos anticorpos listados na Tabela 6, ou inclui as seqüências de aminoácido da CDR de cadeia pesada incluídas em uma das SEQ ID 20 NOs; 1-44, e nas seqüências de aminoácidos de CDR de cadeia leve acompanhantes tendo uma SEQ ID NO que é 88 maior que a seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: 1-44. Isso significa que a molécula de anticorpo, fragmento ou análogo incluirá os pares cognatos das regiões variáveis encontradas nos mesmos dos 44 clones discutidos acima.

Conforme mencionado acima, várias moléculas de anticorpo e

xibem afinidades bastante altas, de modo que a invenção também pertence a uma molécula de anticorpo isolado, um fragmento de anticorpo, ou um análogo de anticorpo sintético ou semissintético, em que o Fab tendo uma constante de dissociação Kd, para a proteína G do RSV de no máximo 500 30 nM quando medida por análise de ressonância de plasmônio em um Biacore 3000, usando proteína G de RESV recombinante imobilizada na superfície do sento em densidade muito baixa de modo a evitar limitações no transporte de massa. A molécula de anticorpo isolado, fragmento de anticorpo ou anticorpo sintético ou semissintético exibe tipicamente uma K0 mais baixa de no máximo 400 nM, tal como no máximo 300 nM, , no máximo 200 nM, no máximo 100 nM, no máximo 1 nM, no máximo 900 pM, no máximo 800 pM, 5 no máximo 700, pM, no máximo 600 pM, no máximo 500 pM, no máximo 400 pM, no máximo 300 pM, no máximo 200 pM, no máximo 100 pM, no máximo 90 pM, and no máximo 80 pM. Os detalhes concernentes às medições com Biocore são dados nos exemplos.

Uma outra modalidade da invenção refere-se a uma molécula de anticorpo isolado, um fragmento de anticorpo ou um anticorpo sintético ou semissintético, que compreende um sito de ligação de antígeno idêntico ao sítio de ligação de antígeno em um Fab derivado de um anticorpo ser humano, em que o dito Fab tem uma constante de dissociação, KD, para a proteína F de RSV de no máximo 500 nM quando medida realizando-se a análise de ressonância de plasmônio de superfície em um Biacore 3000, empregado-se uma proteína F de RSV recombinante imobilizada na superfície do sensor em densidade muito baixa para evitar limitações de transporte em massa. Esse anticorpo isolado, fragmento de anticorpo ou anticorpo sintético ou semissintético exibe tipicamente uma K0 de no máximo 400 nM, tal como no máximo 300 nM, no máximo 200 nM, no máximo 100 nM, no máximo 1 nM, no máximo 900 pM, no máximo 800 pM, no máximo 700, pM, no máximo 600 pM, no máximo 500 pM, no máximo 400 pM, no máximo 300 pM, no máximo 200 pM, no máximo 100 pM, no máximo 90 pM, no máximo 80 pM, no máximo 70 pM, no máximo 60 pM, no máximo 50 pM, no máximo 40 pM, no máximo 30 pM, no máximo 25 pM no máximo 20 pM, no máximo 15 pM, no máximo 10 pM, no máximo 9 pM, no máximo 8 pM, no máximo 7 pM, no máximo 6 pM, e no máximo 5 pM.

Uma molécula de anticorpo especialmente útil ou fragmento especificamente de ligação ou análogo de anticorpo sintético ou semissintético compreende as CDRs de um anticorpo ser humano produzido no clone N0 810, 818, 819, 824, 825, 827, 858 ou 894.

Como mencionado acima, essas moléculas de anticorpos úteis da presente invenção podem ser formuladas do mesmo modo e para as mesmas aplicações que as formulações monoclonais da presente invenção. Logo, a presente invenção se refere a uma composição de anticorpo que compreende uma molécula de anticorpo, fragmento especificamente de Iiga5 ção ou análogo de anticorpo sintético ou semissintético discutido nesta seção em mistura com um carreador, excipiente, veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. A composição pode compreender mais que uma especificidade de ligação, e pode incluir, por exemplo, 2 moléculas de anticorpos distintas da invenção e/ou fragmentos especificamente de ligação e/ou aná10 Iogos de anticorpos sintéticos ou semissintéticos da invenção. A composição pode compreender ainda pelo menos 3 moléculas de anticorpos distintas e/ou fragmentos especificamente de ligação e/ou análogos de anticorpos sintéticos ou semissintéticos da invenção, e podem, portanto, constituir uma composição que compreende pelo menos 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 15 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 moléculas de anticorpos distintas e/ou fragmentos e/ou análogos de anticorpos sintéticos ou semissintéticos.

Composições especialmente interessantes incluem pelo menos uma molécula de anticorpo, fragmento ou análogo da invenção que se liga à proteína F de RSV e pelo menos um anticorpo, fragmento ou análogo da invenção que se liga à região de proteína G do RSV.

Também uma parte da invenção é um fragmento de ácido nucleico isolado que codifica a seqüência de aminoácidos de pelo menos uma CDR definida de uma molécula de anticorpo da presente invenção, tal como 25 um fragmento de ácido nucleico, que pelo menos codifica as CDRs de um anticorpo produzido por um dos clones listados na Tabela 6. O fragmento de ácido nucleico é tipicamente DNA, mas pode ser também RNA.

Uma outra modalidade é um fragmento de ácido nucleico isolado, que codifica seqüências de CDR de uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada estabelecida em qualquer uma das DES ID NOs: 1-44, ou um fragmento de ácido nucleico isolado, que codifica as seqüências de CDR de uma seqüência de aminoácidos de cadeia leve estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 89-132. Os fragmentos de ácidos nucleicos preferidos da invenção codificam as seqüências de CDR de uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1-44 e estabelecidas nas seqüências de aminoácidos tendo uma SEQ 5 ID NO que é 88 maior que a seqüência de aminoácidos selecionada das SEQ ID NOs: 1-44. Esse significa, naturalmente, que o fragmento de ácido nucleico codificará os pares cognatos de regiões variáveis encontradas nos mesmos dos 44 clones discutidos acima. O fragmento de ácido nucleico pode incluir, portanto, seqüências de codificação compreendidas nas SEQ ID 10 NOs: 45-88 e/ou 133-176.

Convenientemente, os fragmentos de ácidos nucleicos são introduzidos em um vetor, que é também parte da presente invenção. Tal vetor pode ser capaz de replicação autônoma, e é, tipicamente, do grupo que consiste em um plasmídeo, um fago, um cosmídio, um minicromossomo, e um vírus.

No caso em que o vetor é um vetor de expressão, ele terá preferivelmente o seguinte perfil (cf. também um vetor exemplar na Figura 3).

- na direção 5’->3’ e em ligação operável pelo menos um promotor para acionar a expressão de um primeiro fragmento de ácido nucleico discutido

acima, que codifica pelo menos uma CDR de cadeia leve juntamente com quaisquer regiões de estrutura necessárias, opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codificam um peptídeo líder, o dito primeiro fragmento de ácido nucleico, opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica regiões constantes de um anticorpo, e opcionalmente uma se25 quência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro terminador, e/ou

- na direção 5’->3’ e em ligação operável pelo menos um promotor para acionar a expressão de um segundo fragmento de ácido nucleico da invenção, que codifica pelo menos uma CDR de cadeia pesada juntamente com quaisquer regiões de estrutura necessárias, opcionalmente uma seqüência

de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo líder, o dito segundo fragmento de ácidos nucleicos, opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica regiões constantes, e, opcionalmente, uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um segundo terminador. Tal vetor é especialmente útil se ele puder ser usado para transformar estavelmente uma célula hospedeira, que pode ser subsequentemente cultivada de modo obter o produto de expressão recombinante. Assim, o vetor preferido é aquele que quando introduzido em uma célula hospedeira é integrado ao genoma da célula hospedeira.

Logo, a invenção pertence também a uma célula transformada que transporta o vetor da invenção discutido nesta seção e também a uma linhagem de célula estável que transporta o vetor e que expressa o fragmento de ácido nucleico da invenção discutido nesta seção. Ambas a célula transformada e a linhagem de célula secreta opcionalmente ou transporta seu produto de expressão recombinante (i.e, a molécula de anticorpo inventiva, o fragmento de anticorpo ou análogo) sobre sua superfície. mAb 824 e análogos

A presente invenção refere-se ao anticorpo monoclonal 824 (mAb 824) e seus análogos. A cadeia leve do anticorpo 824 tem a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 107. A região variável da cadeia pesada tem a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 19.

A invenção se refere a anticorpos capazes de competir com a ligação do anticorpo 824 como definido aqui ou com o seu fragmento Fab. O anticorpo codificado pelo clone 824 conforme definido aqui não se liga ao antígeno de RSV recombinante com afinidade ou potência particularmente alta. Por outro lado, em ensaios de neutralização de vírus (vide Tabela 8), o anticorpo 824 tem um valor de EC50 particularmente baixo contra vários isolados de RSV diferentes. Quando testado em um modelo in vivo de infecção de RSV (modelo de desafio de camundongo, Exemplo 1, k-1), o mAb824 mostrou uma redução significantemente maior da carga de vírus que Synagis (Tabela 11b).

Ao proporcionar o anticorpo 824, os inventores identificaram um epitopo, que resulta em neutralização in vitro e in vivo mais eficiente que visto antes para qualquer epitopo de RSV simples. Ao proporcionar o anticorpo 824, os inventores também possibilitaram a identificação de outros anticorpos que se ligam ao mesmo epitopo. Esses outros epitopos podem ser de qualquer origem e incluem fragmentos de ligação bem como anticorpos amadurecidos por afinidade. Anticorpos capazes de competir com o anticorpo 5 824 podem ser identificados em um ensaio de competição celular (determinação de especificidades de epitopos relativas) conforme descrição no Exemplo 1, seção g-4.

Um anticorpo preferido capaz de competir com o anticorpo 824 é um anticorpo anti-RSV que compreende uma CDRH3 que tem a fórmula: CAX1X2X3X4X5X6PX7X8X9X10X11W,

em que Xi a Xn são selecionados individualmente dos grupos de aminoácidos listados abaixo,

Xi = R ou K (isto é positivamente carregados em pH fisiológico);

X2 = D, E, N ou Q (isto é razoavelmente volumosos, aminoácidos polares);

X3 = S, T, G ou A (isto é pequenos, preferivelmente aminoácidos polares);

X4 = S, T, G ou A (isto é pequenos, preferivelmente aminoácidos polares);

X5 = N, Q, D ou E (isto é razoavelmente volumosos, aminoácidos polares);

X6 = W, Y, F ou H (isto é volumosos, aminoácidos aromáticos);

X7 = A, G, V, ou S (isto é pequenos aminoácidos);

X8 = G, A, V, ou S (isto é pequenos aminoácidos);

Xg = Y, F, W ou H (isto é volumosos, aminoácidos aromáticos);

X-io = E ou D (isto é negativamente carregados em pH fisiológico); e

X11 = D, E, N ou Q (isto é razoavelmente volumosos, aminoácidos polares);

e uma CDRL3 descrita pela seguinte fórmula: CX-1X2X3X4X5X6PX7TF onde X1 a X11 são selecionados individualmente dos grupos de aminoácidos listados abaixo:

X1 = Q ou H (isto é volumosos, aminoácidos polares); X2 = Q1 E ou H (isto é volumosos, aminoácidos polares);

X3 = F, Y, W ou H (isto é volumosos, aminoácidos aromáticos);

X4 = N, Q ou H (isto é razoavelmente volumoso, aminoácidos polares);

X5 = T, S, G ou A (isto é pequenos, preferivelmente aminoácidos polares);

Χδ = Y, F, W ou H (isto é volumosos, aminoácidos aromáticos); e

X7 = F, Y, W ou H (isto é volumosos, aminoácidos aromáticos).

A especificidade de ligação de anticorpos é determinada principalmente pela região CDR3 da cadeia pesada e leve. Como é conhecido da técnica, 10 certas substituições podem ser feitas em uma seqüência de aminoácidos sem alterar a estrutura tridimensional da proteína. É assim esperado que mutações como descritas acima podem ser feitas nas seqüências de CDR3 do anticorpo 824 conforme definido aqui ao mesmo tempo a especificidade e a potência de anticorpo 824 são mantidas.

A introdução de alterações de aminoácidos em uma proteína é conhecida da técnica. Os anticorpos com CDR3s alteradas comparados ao anticorpo 824 podem ser feitos e eles podem ser testados nos ensaios de neutralização de vírus conforme descrição nos exemplos. A conservação e a especificidade de ligação podem ser verificadas em um ensaio de competição 20 com o anticorpo 824.

Preferivelmente, o anticorpo anti-RSV compreende as regiões de CDR1 e CDR2 do par de Vh e Vl conforme estabelecidas nas SEQ ID NOs: 232, 317, 487, e 572, e uma região de CDRH3 tendo a fórmula CaR1D2S3S4N5W6Pa7G8Y9E1ODiiW (SEQ ID NO: 402), e uma região CDRL3 tendo a fórmula formula CQ1Q2F3N4T5Y6PF7TF (SEQ ID NO: 657).

Em modalidades preferidas, a CDRH3 tem a seqüência de aminoácidos estabelecidas na SEQ ID NO: 402 e/ou na CDRL3 tem a seqüência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 657.

Em uma modalidade, 0 anticorpo compreende a região de VH (SEQ ID NO: 19) do anticorpo 824. O anticorpo monoclonal pode compreender também a região VL (aminoácidos 1 a 107 da SEQ ID NO: 107) do anticorpo 824. Preferivelmente, o anticorpo compreende a cadeia leve (SEQ ID NO: 107) do anticorpo 824.

O anticorpo pode compreender a CH conforme definida na SEQ ID NO: 178. Outras regiões constantes para a cadeia pesada podem ser usadas.

Preferivelmente, o anticorpo monoclonal é capaz de neutralizar os subtipos A e B da RSV em um ensaio de neutralização de vírus. A potência de neutralização do anticorpo monoclonal é preferivelmente comparável à potência do mAB925.

Preferivelmente, o anticorpo é capaz de proporcionar uma redu

ção significante da carga do vírus RSV nos pulmões de um mamífero infectados com RSV. Preferivelmente, essa redução é significante em comparação com a redução proporcionada por Synagis, e, mais preferivelmente, a redução é comparável à redução proporcionada por mAb824.

O anticorpo mAb824 e os anticorpos baseados nas seqüências

de CDR do mAb824 podem ser combinados com e um ou mais anticorpos anti-RSV adicionais para proporcionarem um anticorpo policlonal. Tal anticorpo policlonal ou mistura(s) de anticorpos podem(m) ser menos suscetível(eis) a mutantes de escape.

O um ou mais anticorpos anti-RSV adicionais podem ser sele

cionados do grupo que consiste em anticorpos ser humanos, anticorpos humanizados e anticorpos ser humanos/camuridongõ quiméricos. Por exemplo, o anticorpo adicional pode ser Palivizumab (Synagis) ou MEDI-524 (Numax).

Preferivelmente, o um ou mais anticorpos adicionais são sele25 cionados do grupo que consiste nas moléculas de anticorpos mostradas aqui na Tabela 6, ou um fragmento especificamente de ligação da dita molécula de anticorpo ou um análogo de anticorpo sintético ou semissintético, em que o dito fragmento de ligação ou análogo compreende pelo menos as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) da dita molécula de anticorpo 30 isolado, exceto pelo fato que um anticorpo tem as CDRs do clone 824.

São também proporcionados ácidos nucleicos compreendendo uma seqüência de aminoácidos de pelo menos uma CDR definida nesta seção.

O fragmento de ácido nucleico pode codificar as seqüências de CDR de uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada estabelecida na SEQ ID NO: 19. O fragmento de ácido nucleico isolado pode codificar as seqüências de CDR da seqüência de aminoácidos de cadeia leve estabelecida na SEQ ID NO: 107.

Preferivelmente, o fragmento de ácido nucleico isolado codifica as seqüências de CDR da seqüências de aminoácidos de cadeia pesada estabelecidas na SEQ ID NO: 19 e nas seqüências de aminoácidos de CDR 10 de cadeia pesada, acompanhantes. Em uma outra modalidade preferida, o fragmento de ácidos nucleicos inclui seqüências de codificação compreendidas na SEQ ID NO: 63 e/ou 151.

Os ácidos nucleicos isolados e fragmentos podem ser inseridos em um vetor.

O vetor pode ser capaz de replicação autônoma e pode ser se

lecionado do grupo que consiste em plasmídeo, fago, cosmídeo, um minicromossomo e vírus.

Em uma outra modalidade o vetor compreende:

- na direção 5’-»3’ e em ligação operável pelo menos um promotor para acionar a expressão de um primeiro fragmento de ácido nucleico conforme

descrito nesta seção, que codifica pelo menos uma CDR de cadeia leve derivada do clone 824 juntamente com as regiões de estruturas necessárias, opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo líder, em que o dito primeiro fragmento de ácido nucleico, opcionalmente 25 uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica regiões constantes, e opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro terminador, e/ou

- na direção 5’-»3’ e em ligação operável pelo menos um promotor para acionar a expressão de um segundo ácido nucleico conforme descrito nesta

seção, que codifica pelo menos uma CDR de cadeia pesada derivada do clone 824 juntamente com as regiões de estruturas necessárias, opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo líder, em que o adito segundo fragmento de ácido nucleico, opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica regiões constantes, e opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um segundo terminador.

O vetor quando introduzido em uma célula hospedeira podem

ser integrado ao genoma da célula hospedeira.

É também proporcionada uma célula transformada que transporta o vetor conforme descrito nesta seção, e uma linhagem de célula estável que transporta o vetor conforme descrito nesta seção e que expressa um 10 fragmento de ácido nucleico conforme descrito nesta seção, e que opcionalmente secreta ou transporta seu produto de expressão recombinante em sua superfície.

EXEMPLO 1

Este exemplo é uma coleção dos métodos aplicados para ilustrar a invenção.

a. Classificação dos blastos negativos para Lambda do sangue

do doador

Células mononucleares de sangue periféricas (PBMC) foram isoladas de sangue retirado de doadores usando Lymphoprep (Axis Shield) e centrifugação com gradiente de acordo com as instruções do fabricante. As PBMC isoladas foram ou crioconservadas em FCS: 10% de DMSO a -150°C ou usadas diretamente. A fração de células B foi marcada com anticorpo anti-CD19 e isolada da fração de PBMC usando classificação magnética de células (MACS). As PBMC (1x106 células) foram incubadas com anticorpo conjugado anti-CD19-FITC (BD Pharmingen) por 20 minutos, a 4°C. As células foram lavadas duas vezes em e ressuspensas em tampão de MACS (Miltenyl Biotec). As Microcontas Anti-FITC (Miltenyl Biotec) foram misturadas com as células marcadas e incubadas por 15 minutos a 4°C. O procedimento de lavagem foi repetido antes da suspensão de células/contas ser aplicada a uma coluna LS MACS (Miltenyl Biotec). A fração de células positivas CD19 foi eluída da coluna de acordo com as instruções do fabricante e ou armazenada em FCS-10% de DMSO, ou classificada diretamente em célula simples.

Os blastos plasmáticos foram selecionados da fração de células B CD19+ por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) com base no perfil de expressão de proteínas de superfície de células CD19, CD38 e CD45. CD19 é um marcador de células B que é também expresso nos precursores de células plasmáticas, enquanto CD38 é altamente expressa em blastos plasmáticos e células plasmáticas. Os blastos plasmáticos têm aparentemente uma expressão de CD19 e CD45 algo menor que o resto das células CD19+, que permite a separação de uma população discreta. As células foram lavadas em tampão FACS (PBS; 1% de BSA) e coloridas por 20 minutos com anti-CD19-FITC, anti-CD38-APC, anti-Lambda-PE (BD Pharmingen). A coloração da cadeia leve Lambda foi incluída de modo a permitir a exclusão das células que não podem servir como modelo para a PCR (vide Seção c). As células coloridas foram lavadas e ressuspensas em tampão FACS.

A vazão das células durante a FACS foi ajustada para aproximadamente 200 eventos/segundo e a concentração de células era de 5x105/mL para obter um alto resgate de células plasmáticas. O seguinte conjunto de portas foi usado. Cada porta é uma filha da anterior.

Porta 1: porta FSC/SCC. A população de linfócitos tendo o mais alto FSC foi selecionada, assegurando, assim, a classificação de células vivas.

Porta 2: SSChSSCw. Essa porta assegurou a classificação de células simples (discriminação dubleto);

Porta 3: Eventos que representam os blastos plasmáticos foram colocados na porta no traçado pontilhado CD38/CD19 como CD38 Alto/CD19 intermediário.

Porta 4: Já que o procedimento de PCR descrito na Seção c amplifica somente cadeias leves Capa, eventos negativos Lambda foram colocados na porta em um traçado pontilhado Lambda/CD19.

Como alternativa ou em acição à porta 3, os blastos plasmáticos

podem ser também identificados como CD38 alto e CD45 intermediário em um traçado pontilhado de CD45/CD38. Isso requererá a coloração das céluIas com anti-CD45-PerCP.

A população resultante que preencheram esses quatro critérios foi classificada de células simples em placas de PCR de 96 poços contendo o tampão de classificação (vide Seção c). As placas contendo as células foram armazenadas a -80°C.

b. ELISpot

ELISpot foi usado para estimar a percentagem de blastos plasmáticos que expressam anticorpos anti-RSV nas amostras de células obtidas, isto é, PBMC, células CD19+ purificadas por MACS, ou uma população 10 de blastos plasmáticos classificados por FACS. Placas de 96 poços com superfície de nitrocelulose (MiIIipore) foram revestidas com uma solução de 25 μg/mL de partículas de RSV Long inativadas (HyTest). Os poços foram bloqueados por incubação, durante 1 hora, a 37°C. As placas foram lavadas e as amostras de células foram adicionadas em meio de cultura RPMI para 15 cada poço, seguindo por incubação em condições de cultura de tecido padrão, por 24 horas. Os anticorpos específicos de RSV secretados se ligarão às partículas com vírus imobilizado circundando a célula produtora de anticorpos. As células foram removidas lavando-se por três vezes em PBS;

0,01% de Twee20 e três vezes em PBS. IgG anti-ser humano conjugado 20 com HRP (H+L) (CaITag) e IgA anti-ser humano conjugado com HRP (Serotec) foram adicionados e deixados reagirem com os anticorpos imobilizados, por 1 horã, ã 37°C. O procedimento de~làvagem foi repetido e o substrato de cromógeno (3-amino-9-etilcarbazol) solubilizado em N,N-DMF (di-dimetil formamida) foi adicionado. A revelação de cor terminou depois de 4 minutos 25 por adição de H2O. Pontos vermelhos foram identificados nos sítios onde células secretoras de anticorpos específicos de antígeno haviam sido localizadas.

c. Ligação de pares cognatos de Vh e Vl

A ligação de seqüências codificadoras de Vh e Vl foi realizada sobre as células simples obtidas conforme descrição de Seção a, facilitando o emparelhamento cognato das seqüências codificadoras de Vh e Vl- O procedimento utilizou um procedimento de PCR em duas etapas com base em a RT-PCR por sobreposição-extensão em multiplex de uma etapa seguido por Nested PCR. As misturas de iniciadores usadas no presente exemplo amplificam somente cadeias leves Capa. Os iniciadores capazes de amplificar cadeias leves Lambda podiam, contudo, ser adicionados à mistura de 5 iniciadores multiplex e à mistura de iniciadores de Nested PCR, se desejado. Se iniciadores Lambda são adicionados, o procedimento de classificação na Seção a deve ser adaptado de modo que as células positivas Lambda não sejam excluídas. O princípio para ligação de seqüências de Vh e Vl cognatas está ilustrado na Figura 2.

As placas de PCR de 96 poços produzidas na Seção a foram

descongeladas e a células classificadas serviram como molde para a RTPCR por sobreposição-extensão em multiplex. O tampão de classificação adicionado a cada poço antes da classificação de células simples continha tampão de reação (Tampão para RT-PCR OneStep; Qiagen), iniciadores 15 para RT-PCR (vide Tabela 2) e inibidor de RNase (RNasin, Promega). Isso foi suplementado com Mistura de Enzimas para RT-PCR OneStep (diluição de 25 x; Qiagen) e mistura de dNTP (200 μΜ cada) para obter a dada concentração final em um volume reacional de 25 μί.

As placas foram incubadas por 30 minutos a 55°C para permitir a transcrição reversa do RNA de cada célula. Seguinte à RT, as placas foram submetidas ao seguinte ciclo de PCR: 10 minutos a 94°C, 35x(40 segundos a 94°C, 40 segundos a 60°C, 5 minutos a 72°C), 10 minutos a 72°C.

As reações de PCR foram realizadas no ciclador H20BIT Thermal com uma Peel Seal Basket para 24 placas de 96 poços (ABgene) para facilitar um rendimento alto. As placas foram armazenadas a -20°C, depois da ciclagem.

Tabela 2: Mistura de iniciadores para RT-PCT de sobreposiçãoextensão em multiplex

Nome Cone. Seqüência SEQ do Ini- Final nM ID NO: ciador Conjun¬ to de VH Nome Cone. Seqüência SEQ do Ini- Final nM ID NO: ciador CH-IgG 0,2 GACSGATGGGCCCTTGGTGG 179 CH-IgA 0,2 GAGTGGCTCCTGGGGGAAGA 180 VH-1 0,04 T ATT CCCATGGCGCGCCCAGRT G- 181 CAGCTGGTGCART VH-2 0,04 T ATT CCCATGGCGCGCCSAGGT CCAGCTGG- 182 TRCAGT VH-3 0,04 T ATT CCCATGGCGCGCCCAGRT CACCTT GA- 183 AGGAGT VH-4 0,04 T ATT CCCAT GGCGCGCCSAGGT G- 184 CAGCTGGTGGAG VH-5 0,04 TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTGCAGCTA- 185 CAGCAGT VH-6 0,04 TATTCCCATGGCGCGCCCAGSTGCAGCTG- 186 CAGGAGT VH-7 0,04 TATTCCCATGGCGCGCCGARGTG- 187 CAGCTGGTGCAGT VH-8 0,04 TATTCCCATGGCGCGCCCAGGTACAGCTG- 188 CAGCAGTC LC set CK1 0,2 AT AT AT AT GCGGCCGCTT ATT AA- 189 CACT CT CCCCT GTT G VL-1 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGACATCCA 190 GWT G ACCCAGT CT VL-2 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATGTTGT 191 GAT GACT CAGT CT VL-3 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAAATTGT 192 GWT G ACRCAGT CT VL-4 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGATATTGT 193 GAT GACCCACACT VL-5 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAAACGA- 194 CACT CACGCAGT VL-6 0,04 GGCGCGCCATGGGAATAGCTAGCCGAAATTGT 195 G CT GACT CAGT CT W=A/T, R=A/G, S=G/C

Para a etapa de Nested PCR, placas de PCR de 96 poços foram preparadas com a seguinte mistura em cada poço (reações com 20 μΙ_) para obter a dada concentração final: 1x tampão FasStart (Roche), mistura de dNTP (20 μΜ cada), mistura de iniciadores nested (vide Tabela 3), DNA PoIimerase Phusion (0,08 U; Finnzymes) e Combinação de Enzimas de Alta Fidelidade FastStart (0,8 U; Roche). Como molde para a Nested PCR, 1 μΙ_ for transferido das reações de PCR de sobreposição-extensão em multiplex. As placas de Nested PCR foram submetidas ao seguinte ciclo; 35x(30 se5 gundos a 95°C, 30 segundos a 60°C, 90 segundos a 72°C), por 10 minutos a 72°C.

Reações aleatoriamente selecionadas foram analisadas em gel da agarose a 1% para verificar a presença de um fragmento de sobreposição-extensão de aproximadamente 1070 bp.

As placas foram armazenadas a -20°C até posterior processa

mento dos fragmentos de PCR.

fabela 3: Conjunto de iniciadores nested Nome do Cone. Final. Seqüência SEQ Iniciador nM ID CK2 0,2 ACCGCCTCCACCGGCGGCCGCTTATTAAC 196 ACT CT CCCCT GTT GAAGCT CTT PJ 1-2 0,2 GGAGGCGCTCGAGACGGTGAC- 197 CAG G GTG CC PJ 3 0,2 GGAGGCGCTCGAGACGGTGAC- 198 CATTGTCCC PJ 4-5 0,2 GGAGGCGCTCGAGACGGTGAC- 199 CAGGGTTCC PJ 6 0,2 GGAGGCGCTCGAGACGGT- 200 .... GACCGT GGT CCC d. Inserção de pares codificadores de Vh e Vl em um vetor de

seleção

De modo a identificar anticorpos com especificidade de ligação

para partículas ou antígenos de RSV, as seqüências codificadoras de Vh e Vl obtidas conforme descrição na Seção c foram expressas como anticorpos de tamanho natural. Esta inserção envolvida dos pares codificadores de Vh e Vl do repertório em um vetor de expressão e transformação em uma célula hospedeira. Um procedimento de clonagem de duas etapas foi empregado para geração de um repertório de vetores de expressão contendo os pares codificadores de Vh e Vl ligados. Estatisticamente, se o repertório dos vetores de expressão contém dez vezes tanto plasmídeos que o número de pro5 dutos de PCR de Vh e Vl emparelhados usados para geração do repertório de seleção, há 99% de probabilidade de que todos os pares de genes únicos estejam representados. Assim, se 400 fragmentos de gene V de sobreposição-extensão forme obtidos na Seção c, um repertório de pelo menos 4.000 clones foi gerado para seleção.

Em resumo, os repertórios de pares codificadores de Vh e Vl

ligados da Nested PCR na Seção c foram reunidos (sem misturar os pares de doadores diferentes). Os fragmentos de PCT foram clivados com Xho\ e Not\ DNA endonucleases nos sítios de reconhecimento introduzidos nos terminais de produtos de PCR. Os fragmentos clivados e purificados foram 15 ligados em um vetor de expressão de IgG de mamífero digerido em Xho\INot\ (Figura 30 por procedimentos de ligação-padrão. A mistura de ligação foi eletroporada em E. coli e adicionada a 2x placas YT contendo o antibiótico apropriado e incubada e 37°C, durante a noite. O repertório amplificado de vetores foi purificados de células recuperadas das placas usando 20 métodos de purificação de DNA-padrão (Qiagen). Os plasmídeos foram preparados para inserção de fragmentos de promotor-líder por clivagem usando /Ascl e NheI endonucleases. Os sítios de restrição para èstas enzimas foram localizados entre os pares de genes codificadores de Vh e VL. Depois da purificação do vetor, um fragmento promotor-líder de mamífero bidirecional di25 geridos em Asc\-Nhe\ foi inserido os sítios de restrição /Ascl e NheI por procedimentos de ligação-padrão. O vetor ligado foi amplificado em E. coli e o plasmídeo foi purificado por métodos-padrão. O repertório gerado de vetores de seleção foi transformado em E. coli por procedimentos convencionais. As colônias obtidas foram consolidadas em placas-mestre de 384 poços e ar30 mazenadas. O número de colônias dispostas excedeu o número de produtos de PCR na entrada de pelo menos 3 vezes, dando assim 95% de probabilidade para a presença de todos os pares de gene V únicos obtidos na seção C.

e. Seleção

As colônias bacterianas dispostas na Seção d foram inoculadas em um meio de cultura em placa de 384 poços similares e cresceram duran5 te a noite. DNA para transfecção foi preparado as partir de cada poço na placa de cultura de células. No dia anterior à transfecção placas de 384 poços foram semeadas com células CHO-FIp-In (Invitrogen) em 3.000 células/poço em 20 μΙ de meio de cultura. As células foram transfectadas com o DNA usando Fugene6 (Roche) de acordo com as instruções do fabricante.

' 10 Depois de 2-3 dias de incubação, os sobrenadantes contendo anticorpos de tamanho natural foram colhidos e armazenados para fins de seleção.

A seleção foi realizada usando o Sistema Applied Biosystems 8200 FMAT®, um FLISA ensaio de captura solúvel com base em contas homogêneas (com imunossorvente ligado fluorescente) (Swartzaman et al. 15 1999, Anal Biochem. 271:143-151). Vários antígenos, incluindo partículas de vírus, proteína G recombinante e peptídeos biotinilados derivados de antígenos de RSV, foram usados para a seleção. Os peptídeos eram derivados da região conservada (aminoácidos 164-176) e a região de núcleo de cisteína (aminoácidos 171-187, cepa Long e 18537) da proteína Gea região extra20 celular da proteína SH (aminoácidos 42-64 da cepa A2 e 42-65 da cepa 18537). Partículas de vírus inativados de cepa Long de RSV (HyTest) foram imobilizadas em contas de poliestireno por incubação de 300 μί de contas a 5% p/v (6,79 μητι de diâmetro, Spherotech Inc.) com 300 μί de estoque de vírus (concentração de proteína: 200 μg/mL). Proteína G recombinante solú25 vel (aminoácidos 66-692 da seqüência de cepa 18537) foi similarmente imobilizada diretamente nas contas de poliestireno, ao passo que os peptídeos biotinilados foram capturados em contas de poliestireno pré-revestidas com estreptavidina (diâmetro de 6,0-8,0 μιη, Gerlinde Kisker) em concentrações saturanates. A mistura de revestimento foi incubada durante a noite e lavada 30 duas vezes em PBS. As contas foram ressuspenso em 50 mL de PBS contendo albumina sérica bovina a 1% (PBS/BSA) e 5 μΙ de conjunto de Alexa 647 IgG anti-ser humano de bode (Molecular probes). Dez microlitros de mistura de revestimento ressuspensa foram adicionados a 20 μΙ_ sobrenadante contendo anticorpo em placas de 384 poços compatíveis com FMAT e incubadas por aproximadamente 12 h, depois do que a fluorescência na superfície da conta em poços individuais foi medida. Um evento de fluorescên5 cia foi reconhecido como positivo se sua intensidade mostrasse pelo menos seis padrões de desvio acima da linha de base residual.

Os clones resultantes nos alcances principais foram retirados das placas-mestres originais e coletados em novas placas. DNA foi isolado destes clones e submetidos a sequenciamento de DNA dos genes V. As sequências foram alinhadas e todos os clones únicos foram selecionados.

Os clones selecionados foram ainda validados. Em resumo, 2x106 células 293 Freestyle (Invitroen) foram transfectadas com 1,7 μg de DNA provenientes dos clones selecionados e 0,3 μg do plasmídeo pAdVAntage (Promega) em 2 mL de meio Freestyle (Invitrogen) de acordo com as 15 instruções do fabricante. Depois de dois dias, os sobrenadantes foram testados quanto à expressão de IgG e reatividade com os antígenos diferentes usados para a seleção primária bem como proteína F purificada recombinante e um fragmento produzido de E. coli de proteína G (aminoácidos 127-203 da seqüência da cepa 18537) por FLISA e/ou ELISA. Os sobrenadantes de 20 anticorpo foram testados em diluições em série permitindo uma classificação dos clones de acordo com a reatividade dos antígenos.

f. Reparo de clone

Quando se usou uma abordagem de PCR em multiplex, conforme descrita na Seção c, certo grau de sensibilização cruzada da família de 25 intra- e intergenes V é esperada devido ao alto grau de homologia. A sensibilização cruzada introduz aminoácidos que não ocorrem naturalmente na estrutura da imunoglobulina com várias conseqüências potenciais, por exemplo, alterações estruturais e imunogenicidade aumentada, tudo resultando em uma atividade terapêutica diminuída.

De modo a eliminar essas desvantagens e para assegurar que

clones selecionados espelhem a imunorresposta humoral natural, tais mutações de sensibilização cruzada foram corrigidas em um processo denominado reparo de clone.

Na primeira etapa do procedimento de reparo de clone, a seqüência de Vh foi amplificada por PCR com um conjunto de iniciadores contendo a seqüência correspondente ao gene Vh de interesse originado daí, 5 corrigindo assim quaisquer mutações introduzidas por sensibilização cruzada. O fragmento de PCR foi digerido com Xho\ e /Asci e ligado de volta ao vetor de expressão mamífero digerido com Xho\/Asc\ (Figura 3) usando procedimentos de ligação convencionais. O vetor ligado foi amplificado em E. coli e o plasmídeo foi purificado por métodos-padrão. O vetor ligado foi am10 plificado em E. coli e o plasmídeo foi purificado por métodos-padrão. A seqüência de Vh foi sequenciada para verificar a correção e o vetor foi digerido com Nhe\INot\ para prepará-lo para inserção da cadeia leve.

Na segunda etapa, a cadeia leve completa foi amplificada por PCR com um conjunto de iniciadores contendo a seqüência correspondente ao gene Vl do clone de interesse originado daí,

corrigindo assim quaisquer mutações introduzidas por sensibilização cruzada. O fragmento de PCR foi digerido com Nhe\INot\ e ligado ao vetor contendo Vh preparado acima. O produto de ligação foi amplificado em E. coli e o plasmídeo foi purificado por métodos-padrão. Subsequentemente, a cadeia leve foi sequenciada para verificar a correção.

No caso em que a região constante Capa de um clone selecio~nado continha mutações, introduzidas durante a amplificação dos genes conforme descrição na Seção c, esta foi substituída por uma região constante não-mutada. Isso foi feito em PCR por sobreposição em que o gene Vl 25 reparado (amplificado sem a região constante) foi fundido a uma região constante com a seqüência correta (obtida em uma PCR separada). A seqüência inteira foi amplificada e clonada para o vetor contendo Vh conforme descrição acima e a cadeia leve reparada foi sequenciada para verificar a correção.

g. Geração de uma linhagem de célula policlonal

A geração de uma linhagem de célula de expressão policlonal produtora de um anticorpo policlonal recombinante é um procedimento de múltiplas etapas envolvendo a geração de linhagens de células de expressão individuais em que cada uma expressa um anticorpo único a partir de uma seqüência de genes Vh e VL. Simples. A linhagem de células policlonais é obtida misturando-se linhagens de células individuais e distribuindo a mis5 tura em ampolas, gerando assim um banco de células de pesquisa policlonais (pRCB) ou um banco de células mestre (pMCB) a partir do que um banco de células de trabalho policlonais (pWCB) pode ser gerado expandindose células de banco de células de pesquisa ou mestre. Geralmente, as linhagem células policlonais provenientes do pRCB são usadas diretamente 10 sem gerar um pWCB.

As etapas individuais no processo de gerar uma linhagem de célula policlonal são descritas abaixo.

g-1 Transfecção e seleção de linhagens de células mamíferas A linhagem de células Flp-In CHO (Invitrogen) foi usada como linhagem de célula de partida. De modo a se obter uma linhagem de célula mais homogênea, a linhagem de célula Flp-In CHO foi subclonada por diluição limitada e vários clones foram selecionados e expandidos. Com base o comportamento de crescimento, um clone, CHO-FIp-IN (019), foi selecionado como linhagem de célula de partida. As células CHO-FiIp-In (019) foram cultivada como células aderentes em HAM-F12 com soro de bezerro fetal a 10% (FCS).

As preparações de plasmídeos individuais, contendo, cada uma, um par de codificadores de Vh e Vl selecionado e reparados obtido na Seção f, foram cotransfectados com plasmídeo que codifica recombinase Flp 25 em -19x106 células CHO-FIp-In (019) (para maiores detalhes, vide WO 04/061104) em um frasco de T175 usando Fugene6 (nunc). As linhagens de células recombinantes foram selecionadas por cultura em presença de 500 μg/mL de Geneticina, que foi adicionada 48 depois da transfecção. Aproximadamente duas semanas depois, os clones apareceram. Os clones foram 30 contados e as células foram tripsinados e depois disso cultivadas como reuniões de clones expressando um dos anticorpos específicos de RSV.

g-2 Adaptação para cultura de suspensão isenta de soro As culturas de células expressando o anticorpo anti-RSV aderentes, individuais, foram tripsinados, centrifugados e transferidos para separar frascos de agitação (250 mL) com 1,15x106 células/mL em meio isento de soro apropriado (Excell302, JRH Biosciences; 500 pg/mL de geneticina, 5 agente antiaglomerante (1:250) e de L-glutamina a 4 mM. O crescimento e a morfologia da célula foram seguidos por várias semanas. Depois de 4 a 6 semanas, as linhagens de células mostraram usualmente comportamento de crescimento bom e estável sem duplicar os tempos abaixo de 30 horas e as linhagens celulares individuais adaptadas foram então crioconservadas em 10 ampolas múltiplas.

Os anticorpos individuais expressos durante a adaptação foram purificados a partir de sobrenadantes usando o método descrito na Seção i. O anticorpo purificado foi usado para a caracterização de especificidade do antígeno e propriedades bioquímicas conforme descritas abaixo.

g- 3 Caracterização das linhagens celulares

Todas as linhagens celulares individuais foram caracterizadas com respeito à produção e proliferação de anticorpo. Isso foi realizado com os seguintes ensaios:

Produção:

A produção de anticorpos recombinantes das linhagens de célu

las de expressão individual foi seguida durante a adaptação por ELISA específica Capa. As placas ELISA foram revestidas com anticorpo purificado Fc ser humano anti-ser humano de bode (Serotec) em tampão de carbonato, pH 9,6. As placas foram lavadas 6 vezes com tampão de lavagem (PBS; 25 Tween 20 a 0,05%) e bloqueadas por incubação por 1 h em tampão de lavagem contendo leite desnatado a 2%. Sobrenadantes de meios de cultura de células foram adicionados e a incubação estendida por 1 hora. As placas foram lavadas 6 vezes em tampão de lavagem e anticorpos secundários (HRP Capa anti-ser humano de bode, Serotec) foram adicionados e a incu30 bação repetida. Depois de lavagem vigorosa, a ELISA foi desenvolvida com substrato de TMB e a reação terminou por adição de H2SO4. As placas foram lidas a 450 nm. Ainda, a coloração intracelular foi usada para determinar nível de expressão geral bem como para determinar a homogeneidade da população de células em relação à expressão de anticorpo recombinante. 5X105 de células foram lavadas em tampão de FACS gelado (PBS: FCS 2%) antes da 5 fixação por incubação em CeIIFix (BD-Biosciences) por 20 minutos. As células foram precipitadas e permeabilizadas em metanol gelado por 10 minutos e lavadas duas vezes em tampão FACS. A suspensão era um anticorpo fluorescentemente marcado (Fragmento F(ab’)2 de Bode, lgG(H+L) anti-ser humano-PE, Beckman Coulter) foi adicionado. Depois de 20 minutos em gelo, 10 as células foram lavadas e ressuspensas em tampão FACS seguido por análise FACS.

Proliferação:

Alíquotas das suspensões de células foram tiradas de duas a três vezes na semana e o número de células, o tamanho de célula e a viabi15 Iidade foram determinados por análise Vi-Cell XR (Analisador de viabilidade celular, Beckman Coulter). O tempo de duplicação para as culturas de células foi calculado usando os números de células derivados de medições de Vi-Cell.

g-4 Caracterização da especificidade de antígeno dos anticorpos

individuais

O antígeno e a especificidade do epitopo dos anticorpos individualmente expressos foram avaliados de modo a permitir que a geração de um rpAb anti-RSV com uma especificidade bem-caracterizada. Conforme descritos na Seção e, os anticorpos identificados durante a seleção foram 25 validados por avaliação de sua especificidade para antígenos de RSV simples (proteína G recombinante, proteína F recombinante ou purificada) ou fragmentos de peptídeos destes (região conservada e motivo de núcleo de cisteína de proteína G, subtipo A e subtipo B, epitopos lineares na proteína F, e o domínio extracelular da proteína SH, subtipo AeB) por FLISA, ELISA 30 e ressonância de plasmônio de superfície (SPR; Biacore). As especificidades de epitopo foram determinadas em ELISA por competição com anticorpos comerciais bem-caracterizados, alguns dos quais são mostrados na Tabela 4. Não necessariamente todos os anticorpos mostrados na Tabela 4 foram usados na caracterização de cada anticorpo individual da presente invenção, e potencialmente outros anticorpos ou fragmentos de anticorpo, que foram caracterizados com respeito ao antígeno, sítio antigênico e/ou epitopo ao qual eles se ligam podem ser também usados. Em resumo, os anticorpos ou fragmentos de anticorpo usados para bloquear epitopos foram incubados com o antígeno imobilizado (partículas de RSV Long, HyTest) em excesso grande, isto é concentrações 100 vezes os que dão 75% da ligação máxima, conforme determinado empiricamente (Ditzel et al., J. Mol. Biol. 1997, 267:684-695). Depois da lavagem, os clones de anticorpos individuais foram incubados com o antígeno bloqueado em várias concentrações e qualquer IgG ser humano ligado foi detectado usando conjugado de HRP anti-ser humano de bode (Serotec) de acordo com protocolos de ELISA padrão. As especificidades do epitopo foram posteriormente caracterizadas por competição do tipo par entre os clones diferentes em Biacore usando concentrações saturantes (empiricamente determinadas) de ambos os anticorpos de bloqueio e de sonda. Proteína F ou G purificada imobilizada por acoplamento direto de amina (Biacore) foi usada como antígeno. Em ambos os mapeamentos com base em ELISA e Bioacore, a ligação reduzida seguinte ao bloqueio de epitopo for comparada à ligação não-competida.

Tabela 4: Anticorpos monoclonais para mapeamento de epitopo

de anticorpos anti-F e anti-G

MAb/Fab Antígeno Sítio Antigênico Epitopo (aa) Ref. 131-2a F F1 F1a 1,2 9C5 F F1 F1a 5 92-11c F F1 F1b 1,2 102-1 Ob F F1 F1c 1,2 133-1h F C F2 1,2,3 130-8f F C F2 (241/421) 1,2,3,4 143-6c F A/ll F3 1,2,3 Palivizumab F A/l I (272) 8 1153 F A/ll (262) 3,4 MAb/Fab Antígeno Sítio Antigênico Epitopo (aa) Ref. 1142 F A/ll 3 1200 F A/ll (272) 2,4 1214 F A/ll (276) 3,4 1237 F A/ll (276) 3,4 1129 F A/ll (275) 3,4 1121 F A/ll 3 1112 F B/l (389) 3,6 1269 F B/l (389) 3,6 1243 F C (241/421) 3,6 Fab 19 F A/ll (266) 7 RSVF2-5 F IV (429) 4 Mab19 F IV (429) 12 7.936 F V (432-447) 13 9.432 F Vl (436) 13 63-1 Of G(A) G11 GCRR (A171-187) 1,2 130-6d G(A) G12 (A174-214) 1,2,9 131-2g G (A+B) G13 (150-173) 1,2,9 143-5a G (A+B) G 5a 2 L9 G (A+B) A1/B1 Conservado (164-176) 14,15 8C5 G ND 5 1C2 G(A) ND GCRR (A172-188) 10,11 3F4 G(A) ND 10,11 4G4 G(A) ND GCRR (A172-188) 10,11 A coluna "Antígeno" indica o antígeno associado ao RSV ligado

pelo Mab/Fab, e se uma especificidade de subtipo é conhecida, isso é indicado em (). A coluna "Epitopo (aa)" indica o nome do epitopo reconhecido pelo MAb/Fab, ainda em () posições de aminoácidos resultantes em mutan5 tes de escape de RSV, ou peptídeos/fragmentos de proteína com respeito a qual ligação foi mostrada, são indicadas. As referências numeradas (Ref.) dadas na Tabela 4 correspondem a:

1. Anderson et ai, J. Clin. Microbiol. 1986, 23:475-480. 2. Anderson et ai, J. Virol. 1988, 62:1232-4238.

3. Beeler & van Wyke Coelingh, J. Virol. 1989, 63:2941-2950.

4. Crowe et ai, JID 1998, 177:1073-1076.

5. Sominina et ai, Vestn Ross Akad Med Nauk 1995, 9:49-54.

6. Collins et al., Fields Virology, p. 1313-1351.

7. Crowe et ai, Virology 1998, 252:373-375.

8. Zhao & Sullender, J. Virol. 2004, 79:3962-3968.

9. Sullender, Virology 1995, 209:70-79.

10. Morgan et ai, J. Gen. Virol. 1987, 68:2781-2788.

11. McGiII et al., J. Immunol. Methods 2005, 297:143-152.

12. Arbiza et ai, J. Gen. Virol. 1992, 73:2225-2234.

13. Lopez et ai J. Virol. 1998, 72:6922-6928.

14. Walsh et ai, J. Gen. Virol. 1989, 70:2953-2961.

15. Walsh et ai, J. Gen. Virol. 1998, 79:479-487.

Além disso, os clones de anticorpo foram também caracteriza

dos em termos de ligação às células HEp-2 epiteliais laríngeas humanas (ATCC CLL-23) infectadas com cepas de RSV diferentes (Long, B1, ou 18537) por FACS e/ou ELISA. A ligação para células HEp-2 infectadas por Mock foram analisadas similarmente.

Em resumo, para o ensaio FACS, as células Hep-2 foram infec

tadas ou como a cepa RSV Long (Número de ATCC VR-26) ou a cepa RSV B1 (Número de ATCC VR-1400) em meio isento de soro em uma razão de

0,1 pfu/célula por 24 (cepa Long) ou 48 horas (cepa B1). Seguinte ao deslocamento e lavagem, as células foram dispensadas em placas de 96 poços e 25 incubadas com diluições (4 pM-200 μΜ) dos anticorpos anti-RSV individuais, por 1 hora, a 37°C. As células foram fixadas em formaldeído a 1% e o anticorpo ligado à superfície da célula foi detectado por incubação com conjugado IgG-PE anti-ser humano a 1% (Beckman Coulter) por 30 minutos a 4°C.

Para o ensaio ELISA, células HEp-2 foram infectadas ou com a cepa RSV Long ou com a cepa 18537 (Número de ATCC VR-1580) em meio isento de soro em uma razão de 0,01 pfu/célula. Depois de duas horas de incubação, o meio com soro de bezerro fetal a 10% foi adicionado e as céluIas foram incubadas por 45 horas adicionais (cepa Long) ou 70 horas (cepa 18537). Depois da lavagem, as células foram incubadas com diluições dos anticorpos anti-RSV (0,1 μΜ - 0,03 nM) por 1 hora, à temperatura ambiente. O anticorpo ligado à superfície da célula foi detectado por incubação com 5 conjugado de IgG-HRP anti-ser humano de F(ab)2 de bode (Jackson ImmunoResearch) por 1 hora à temperatura ambiente, seguido por adição de TMBplus (Ken-Em-Tec). Depois de 10 minutos de incubação, a reação foi terminada com H2SO4 e a absorbância medida. Esses ensaios celulares podem ser também usados como ensaio de competição para determinação de 10 especificidades de epitopos relativas conforme descritas para o ensaio ELISA de partículas de vírus e SPR, descritos acima.

Os clones selecionados identificados como específico de proteína G foram testados também quanto à reatividade cruzada com fractalcina humana recombinante (CX3CL1) por ELISA. O anticorpo monoclonal CX3CL1/Fractalcina anti-ser humano (R&D systems) foi usado como controle positivo.

g- 5 Caracterização da cinética de ligação dos anticorpos individuais

Análise da cinética dos anticorpos da invenção foi realizada usando-se análise de ressonância de plasmônio de superfície em um Biacore 3000 (Biacore AB, Uppsala, Suécia), usando-se antígenos recombinantes imobilizados sobre a superfície sensora em densidade muito baixa para evitar limitações em transporte de massa. A análise foi realizada com fragmentos Fab preparados de clones de anticorpos individuais usando-se o Kit de preparação de Fab ImmunoPure (Pierce). Em resumo, um total de 200 unidades de ressonância (RU) de proteína F recombinante ou um total de 50 RU de proteína G recombinante foi conjugado a uma superfície de chip de CM5 usando o Kit Amine Coupling (Biacore) de acordo com as instruções do fabricante. Os fragmentos Fab foram injetados sobre a superfície de chip em diluições em série, partindo de uma concentração otimizada que não resultou em valores RUmax acima de 25 quando testados no chip com a proteína imobilizada. A constante de taxa de associação (ka) e a constante de dissociação (kd) foram avaliadas globalmente usando-se a associação predefinida 1:1 (Langmuir) e modelos de dissociação no software BIAevaIuation 4.1 (BlAcore).

Ao se realizar a análise da cinética nos fragmentos Fab1 é asse5 gurado que os dados obtidos verdadeiramente refletem as afinidades de ligação com respeito à proteína de RSV. No caso de serem usados anticorpos completos, os dados refletiriam a avidez de ligação, que não pode ser prontamente traduzida em medida significativo da natureza exata das características de ligação dos anticorpos versus o antígeno.

g- 6 Caracterização das propriedades bioquímicas de anticorpos

individuais

Heterogeneidade é um fenômeno comum em anticorpos e proteínas recombinantes. As modificações nos anticorpos ocorrem tipicamente durante a expressão, por exemplo, modificações pós-traducionais como N15 glicosilação, fragmentação proteolítica, e heterogeneidade N e C-terminal resultando em heterogeneidade de tamanho ou de carga. Além disso, modificações como oxidação de metionina e desamidação podem ocorrer durante armazenagem de longo e de curto prazo. Já que esses parâmetros precisam ser bem-definidos para anticorpos terapêuticos, eles foram analisados antes 20 da geração de linhagem celular policlonal.

Os métodos usados para a caracterização de anticorpos individuais purificados (vide Seção i) incluíram SDS-PAGE (condições redutoras e não-redutoras), cromatografia por troca catiônica fraca (IEX), cromatografia de exclusão de tamanho (SEC), e RP-HPLC (condições redutoras e não25 redutoras). A análise de SDS-PAGE sob condições redutoras e nãoredutoras e SEC indicaram que os anticorpos purificados eram certamente intactos com quantidades diminutas de formas fragmentadas e agregadas. Análise de perfil por IEX dos anticorpos purificados resultou em perfis com picos únicos ou cromatogramas com picos múltiplos, indicando heterogenei30 dade de carga nesses anticorpos particulares. Preparações de anticorpos resultando em picos múltiplos na análise IEX e/ou migração aberrante tanto da cadeia leve como da pesada em géis de SDS, ou perfis incomuns de RPHPLC foram analisados em detalhes para terminações N por sequenciamento de N-terminal e para heterogeneidade causada por diferenças nos perfis de oligossacarídeos. Além disso, anticorpos selecionados foram analisados quanto à presença de sítios de N-glicosilação nas cadeias variáveis usando tratamento enzimático e análise SDS-PAGE subsequente.

g- 7 Estabelecimento de uma linhagem de célula policlonal para produção de anticorpo policlonal recombinante anti-RSV

Da coleção de linhagens de células de expressão estabelecidas, um subconjunto é selecionado para ser misturado para geração de uma Ii10 nhagem de célula policlonal e do banco de células de pesquisas/mestre, policlonais (pRCB/pMCB). Os parâmetros de seleção podem ser definidos de acordo com o uso do anticorpo policlonal a ser produzido a partir da linhagem de célula policlonal e a execução das linhagens de células individuais. Geralmente, os seguintes parâmetros são considerados:

· Características da linhagem de célula; para otimizar a estabili

dade da linhagem de célula policlonal, linhagens de células individuais sem tempos de duplicação entre 21 e 30 horas e produtividade de anticorpos acima de 1 pg/célula/dia são preferidas.

• Reatividade; os antígenos/sítios antigênicos contra os quais o rpAb anti-RSV exercerá reatividade são cuidadosamente considerados.

• Química da proteína; preferivelmente anticorpos com características bioquímicas bem-definidas são incluídos no rpAb anti-RSV final.

As linhagens de células individuais selecionadas expressam cada uma um anticorpo anti-RSV recombinante são descongelados e expandi25 dos a 37°C em meio isento de soro em frascos agitadores para alcançar pelo menos 4x108 células de cada clone tendo um tempo de duplicação de população de 21 a 34 horas. As viabilidades estão preferivelmente na faixa de 93% a 96%. A linhagem de célula policlonal é preparada misturando-se 2x106 células provenientes de cada linhagem de célula. A linhagem de célula 30 policlonal é distribuída em ampolas de congelamento contendo 5,6x107 células e crioconservadas. Essa coleção de frascos com uma linhagem de célula policlonal é denominada de o banco de células de pesquisa/mestre, policional (pRCB/pMCB) do qual o banco de células de trabalho policlonal (pWCB) pode ser gerado por expansão de uma ampola do pRCB/pMCB para alcançar um número suficiente de células para formar um banco de células de trabalho (pWCB) de aproximadamente 200 ampolas com a mesma densida5 de celular que as ampolas do pRCB/pMCB. Amostras dos bancos de células são testadas quanto ao micoplasma e esterilidade.

h. Expressão de um anticorpo anti-RSV policlonal recombinante

Bateladas de anticorpos anti-RSV policlonais recombinantes são

produzidos em biorreatores de 5 litros (B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemanha). Em resumo, os frascos de o pRCB ou o pWCB são descongelados e expandidos em frascos agitadores (Corning). As células no grupo de sementes são cultivadas em meio ExCeII 302 com G418 e com agente antiaglomeração a 37°C, CO2 a 5%. Os biorreatores são inoculados com 0,6x10® células/mL suspensas em 3 L de meio Excell 302 sem G418 e sem agente antiaglomerante. Os números de células/células viáveis são monitoradas diariamente por Casy e contagem ViCeII. Nas 50 horas, 2.000 ml_ de meio ExCeII 302 são suplementados e depois de 92 horas uma queda de temperatura de 37°C para 32°C é realizada. O sobrenadante de cultura de células é coletado depois de 164 horas e submetido à purificação conforme descrição na Seção i).

i. Purificação de anticorpos anti-RSV individuais e anticorpos anti-RSV policlonais

Os anticorpos expressos conforme descrição na Seção g.g- 2 e h, todos do isótipo IgGI, foram purificados por afinidade usando-se uma co25 Iuna MabSeIect SuRe (Proteína A). Os anticorpos individuais interagiram com Proteína A imobilizada em pH 7,4, ao passo que as proteínas contaminadoras foram lavadas da coluna. Os anticorpos ligados foram subsequentemente eluídos da coluna por redução do pH para 2,7. As frações contendo anticorpos, determinadas a partir de medições de absorbância a 280 nm, 30 foram reunidas e o tampão trocado usando-se uma coluna G-25 em acetato de sódio a 5 mM, NaCI a150 mM, pH 5 e armazenadas a -20°C.

j. Ensaios de neutralização in vitro j-1 Preparação de RSV vivo para uso in vitro Células HEp-2 epiteliais laríngeas humanas (ATCC CLL-23) foram semeadas em frascos de 175 cm2 em 1x107 células/frasco. As células foram infectadas com a cepa RSV Long (número ATTCC VR-26), RSV A2 (Advanced Biotechnologies Inc., número ATCC VR-1540), RSV B1 (número ATCC VR-1400) ou RSV B Wash/18537 (Advanced Biotechnologies Inc., número ATCC VR-1580) em 3 mL de meio isento de soro em uma razão de 0,1 pfu/célula. As células foram infectadas por 2 horas a 37°C; CO2 a 5% seguido por adição de 37 mL de meio MEM completo. As células foram incubadas até que os efeitos citopáticos ficassem visíveis. As células foram retiradas por raspagem e os meios e as células foram sonicadas por 20 segundos, e formadas em alíquotas, congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80°C.

j-2 Teste de neutralização de redução de placa (PRNT)

Células HEp-2 foram semeadas em placas de cultura de 96 po

ços em 2x104 células/poço, e incubadas durante a noite a 37°C; CO2 a 5%. As substâncias foram diluídas em MEM isento de soro e deixadas em préincubação com RSV em ausência ou presença de complemento (Soros de complemento de coelho, Sigma) por 30 minutos, a 37°C. Essa mistura foi 20 aplicada à monocamada de células HEp-2 e efetuada incubação por 24-72 horas a 37°C; CO2 a 5%. As células foram fixadas com acetona a 80%; PBS a-20% por 20 minutos. Depois da lavagem, anticorpo anti-RSV de bode biotinilado (AdB Serotec) foi adicionado (1.200) em PBS com BSA a 1% e incubação efetuada por 1 hora à temperatura ambiente. Depois da lavagem, 25 HRP-avidina foi adicionada e deixada em incubação por 30 minutos. As placas foram desenvolvidas por incubação com substrato de 3-amino-9- etilcarbazol (AEC) até que as placas ficassem visíveis por microscopia, por exemplo, por 25 minutos (RSV LOng) ou 45 minutos (RSV BI). As placas foram contadas em um Biorreator (Bio-Syz GmbH). Valores de EC5O (con30 centrações eficazes requeridas para induzir uma redução de 50% no número de placas) foram calculados, onde aplicável, para possibilitar para uma comparação das potências. j- 3 Ensaio de inibição de fusão

O ensaio de inibição de fusão foi essencialmente realizado como o ensaio de neutralização de redução de placas exceto de o RSV foi deixado infectar antes da adição de substâncias de teste. Na prática, o vírus foi adi5 cionado ao meio isento de soro à monocamada de células HEp-2 por 1,5 h. Os sobrenadantes foram removidos e as substâncias de teste foram adicionados em meio MEM completo com ou sem complemento (Soros de complemento de coelho, Sigma). As placas foram incubadas durante a noite e processadas conforme descrição acima para o ensaio de neutralização por 10 redução de placas.

j- 4 Ensaio de microneutralização

Além da PRNT e o ensaio de inibição de fusão conforme descrição nas Seções j-2 e j- 3, um ensaio de microneutralização com base na detecção de proteínas de RSV foi empregado para a determinação da neutralização de RSV e in inibição de fusão.

Para o teste de neutralização, as substâncias de teste foram diluídos em MEM isento de soro e deixada em pré-incubação com RSV em ausência ou presença de complemento (Soros de complemento de coelho, Sigma) em placas de cultura de 96 poços por 30 minutos, à temperatura 20 ambiente. Células HEp-2 tripsinadas foram adicionadas a 1,5x104 células/poço, e incubadas por 2-3 dias, a 37°C; CO2 a 5%. As células foram lavadas e fixadas com acetona a 80%; PBS a 20%, por 15 minutos, a 4°C e secadas. As placas foram então bloqueadas com PBS com gelatina a 0,5% por 30 minutos, à temperatura ambiente e coloridas com uma reunião de 25 anticorpos monoclonais de murino contra proteínas de RSV (NCL-RSV3), Novocastra), diluídas 1:200 em PBS com gelatina a 0,5% e Tween-20 a

0,5%, por 2 horas, à temperatura ambiente. Depois da lavagem, conjugado de HRP Imunoglobulina anti-camundongo de Coelho Policlonal (P0260; DakiCytomation), diluído em 1:1000 em PBS com gelatina a 0,5% e Tween-20 30 a 0,5% foi adicionado e deixado em incubação por 2 horas, à temperatura ambiente. As placas foram lavadas e desenvolvidas por adição de ortofenilendiamina. A reação foi finalizada por adição de H2SO4 e as placas foram lidas em uma leitura de placas ELISA, e 490 nm.

O ensaio de inibição de fusão foi essencialmente realizado como o teste de microneutralização com exceção do fato de o vírus ter sido adicionado e incubado por 1,5 h 37°C; CO2 a 5% antes das substâncias de teste, 5 diluídas em MEM completo terem sidos adicionados. As placas foram incubadas por 2-3 dias, a 37°C; CO2 a 5%, desenvolvidas conforme descrição acima.

k. Ensaios de proteção in vivo

k-1 Modelo de desafio de camundongo Camundongos MBALB/c, fêmeas, de 7 a 8 semanas foram ino

culados intraperitonealmente com 0,2 mL de preparação de anticorpos no dia 1 do estudo. Os camundongos tratados com placebo foram similarmente inoculados i.p. com 0,1 mL de tampão PBS. No dia 0 do estudo, os camundongos foram anestesiados usando isofluorano inalado e intranasalmente 15 inoculado com 10'6-10'7 pfu da cepa RSV A2 em 50 μί ou com Iisado de células (inóculo mock). Os animais foram deixados 30 segundos aspirando o inóculo, enquanto mantidos em pé até inteiramente recuperados da anestesia.

Cinco dias depois do desafio, os camundongos foram mortos 20 com uma superdose de pentobarbitona sódica. No pos-mortem, o sangue foi obtido por exsanguinação dos vasos axilares para a preparação dos soros. Os pulmões foram removidos e homogeneizados em 2,5 mL de tampão estéril. Homogeneizados de pulmão foram centrifugados para sedimentar areia e fragmentos de células e sobrenadantes foram colocados em alíquotas e 25 armazenados a -70°C.

Em uma versão de longo praso do modelo de desafio, grupos de animais foram mortos em horários diferentes, isto é, 5, 27 e 69 dias depois do desafio e os homogeneizados de amostra de soro foram preparados conforme descrição acima. Além disso, grupos separados de animais que foram 30 mortos nos mesmos horários foram usados para amostras de lavagem broncoalveolar (BAL) e de histopatologia. Em resumo, as vias aéreas foram canuladas e lavadas com 1 mL de soro fisiológico. O número total de células presentes na BAL foi determinado por microscopia de luz. Preparações de citosina de célula BAL foram coloridas com hematoxilina e eosina e contagens de células diferenciais feitas usando-se microscopia de imersão. Depois da lavagem, os pulmões foram fixados para histopatologia. As amostras 5 de tecidos fixadas foram preparadas inflando-se os pulmões com formalina tamponada, e o tecido fixado foi embutido em blocos de parafina para processamento e coloração com hematoxilina e eosina por métodos-padrão. Os escores da patologia do pulmão foram determinados como a soma de escore de gravidade multiplicado pelo escore de prevalência para de cada 3 Ιοί 0 bos do pulmão (Tabela 5a). O escore máximo da patologia do pulmão para um camundongo é assim 36.

Tabela 5a. O sistema de escores para patologia do pulmão usa

do para os estudos de desafio de camundongo.

Gravidade Prevalência 0 Normal 0 Normal 1 infiltração de células perivasculares e peri- 1 <25% da amostra bronquiais <3 células de espessura de 2 infiltração de células perivasculares e peri- 2 25 a 50% da abronquiais de 4 a 10 células de espessura mostra 3 infiltração de células perivasculares e peri- 3 51-75% da amos¬ bronquiais >10 células de espessura tra 4 >75% da amostra A carga de vírus foi inicialmente determinada por quantificação

do número de cópias de RNA de RSV nas amostras de pulmão usando transcriptase reversa (RT)-PCR. O RNA foi extraído das amostras de homogeneizado de pulmão usando o sistema de extração com o Kit de Ácido Nucleico Total MagNA Pure LC (Roche Diagnóstics) de acordo com a instru20 ções do fabricante. A detecção do RNA de RSV foi realizada por RP-PCR em tempo real com tubo simples usando o instrumento LightCycIer e reagentes (Roche Diagnóstics) com iniciadores e sondas marcadas com fluoróforo específicos para o gene de RSV do subtipo A conforme descrição de Whiley et aí. (J, Clinicai Microbiol. 2002, 40: 4418-22). As amostras com números de cópias de RNA de RSV conhecidos foram analisadas de modo similar para derivar uma curva-padrão.

Subsequentemente, o número de cópias de RNA de RSV nas 5 amostras de pulmão foi determinado durante transcriptase reversa (RT)-PCR quantitativa. O RNA foi extraído das amostras de homogeneizado de pulmão usando o mini-kit RNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A detecção de RNA de RSV foi realizada usando-se o Sitema de RT Quantitvativo-PCR de Uma Etapa SuperScript IN Platinum (Invitrogen) com 10 iniciadores e sondas marcadas com fluoróforo para o gene N do RSV de subtipo A conforme descrição na Tabela 5b, abaixo. As amostras com números de cópias de RNA de RSV foram analisadas de modo similar para derivar uma curva-padrão.

Tabela 5b. Iniciadores específicos de RSV de subtipo A e sonda ' para RT-PCR quantitativa.

Nome Seqüência 5’ - 3’ RSV-A de avanço av- CAA CAA AGA TCA ACT TCT GTC ATC RSV-A reversa GCA CAT CAT AAT TAG GAG TAT CAA T Sonda RSA 6-FAM-CA CCA TCC AAC GGA GCA CAG GAG Os níveis de citoquinas diferentes e quimioquinas em amostras de tecido de pulmão foram determinados por um imunoensaio em mutiplex comercial em Rules-Based Medicine (Austin, TX) usando seu perfil de multianalisados de roedor (MAP).

k-2 Modelo de desafio de rato de algodão

Ratos de algodão fêmeas de 6 a 8 semanas (Sigmodon hispidus) são inoculados peritonealmente com 0,5 mL da preparação de anticorpos ou placebo (PBS) no dia 1 do estudo. Vinte e quatro horas depois, os animais estão levemente anestesiados com isofluorano e foi dado um desa25 fio intranasal de 10'6-10'7 pfu de cepa 42 de RSV ou meio de controle (inóculo mock). Um volume total de 100 μί de inóculo é administrado e distribuído uniformemente a ambas às narinas. Depois de completado o desafio intranasai, cada animai é mantido na posição vertical por um mínimo de 30 segundos para permitir a inspiração total do inóculo. Cinco dias depois do desafio, os animais são mortos por injeção intraperitoneal letal de pentobarbitona e exsanguinados por punção cardíaca. Amostras de soro são obtidas e congeladas a -80°C e cada animal é dissecado sob condições assépticas 5 para remoção dos pulmões e o tecido nasal. As amostras de tecido são homogeneizadas e os sobrenadantes armazenados em alíquotas a -80°C.

A carga de vírus nas amostras de tecido é determinada por quantificação do número de cópias de RNA de RSV por um ensaio em tempo real Taq-Man com base no método de Van Elden et al. (J Clin Microbiol. 10 2003, 41(9): 4378-4381). Em resumo, RNA é extraído das amostras de homogeneizado do pulmão usado o método Rneasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA é extraído e submetido à transcrição reversa em cDNA e subsequentemente amplificado por PCR usando o Sistema de RT-PCR quantitativa de uma etapa (Invitrogen) com iniciadores e 15 sondas marcados específicos para o gene N do RSV de subtipo A com concentrações de RSV conhecidas são similarmente analisadas para derivar uma curva-padrão.

k- 3 Estudo farmacocinético em camundongos Camundongos BALB/c fêmeas de 7 a 8 semanas foram inoculados intraperitonealmente com 0,2 mL de preparação de anticorpos no dia 0. As amostras de soro foram tiradas do plexo orbital em horários múltiplos (0 hora, 4 horas, dias 3, 6, 9, 13, 16, 21, 24, e 29) depois do tratamento com anticorpo. Os camundongos foram sacrificados e homogeneizados em 1,5 mL de tampão usando um tampão para Iise de tecido tampão para Iise de tecido (tissuelyzer)zer (Qiagen). Os homogeneizados de pulmão foram depois disso centrifugados para sedimentação dos fragmentos celulares e os sobrenadantes foram armazenados a -70°C. Os níveis de anticorpo ser humano presentes nas amostras de soro e nos homogeneizados de pulmão foram medidos usando ELISA capa IgGI ser humano.

EXEMPLO 2

No presente Exemplo, estão ilustrados o isolamento, a triagem, a seleção e a formação de bancos de clones contendo pares de Vh e Vl cognatos expressaram como anticorpos de tamanho natural com especificidade anti-RSV.

Doadores

Um total de 89 doadores foi recrutado dentre os empregados e parentes que estavam hospitalizados no Departamento de Pediatria do Hospital Hvidovre (Dinamarca) durante a estação de RSV. Uma amostra de sangue inicial de 18 mL foi tirada, células B CD19+ foram purificadas (Exemplo

1, Seção a) e selecionadas quanto à presença de anticorpos anti-RSV usando ELISpot (Exemplo 1, Seção b) e a frequência de células de plasma foi determinada por análise FACS.

Onze doadores foram detectados como positivos na seleção das amostras de sangue iniciais e uma segunda amostra de sangue de 450 mL foi coletada de dez destes. Blastos plasmáticos foram células simples escolhidas de acordo com o Exemplo 1, Seção a. ELISpot foi realizado em uma fração dos células B positivas CD19.

Foram identificados quatro doadores com frequências de ELISpot na segunda doação de sangue entre 0,2 e 0,6% de células plasmáticas especificas de RSV (lgG' e IgA+) da população de células plasmáticas total. Essas frequências foram consideradas altas o bastante para proceder à Iigação de repertórios dos pares Vh e Vl cognatos.

Isolamento de pares codificadores de Vh e Vl

Os ácidos nucleicos que codificam os repertórios de anticorpos foram isolados das células plasmáticas selecionadas de células simples dos cinco doadores, por RP-PCR por sobreposição-extensão em multiplex (E25 xemplo 1, seção c). A RT-PCR por sobreposição-extensão em multiplex cria uma ligação física entre o fragmento de gene da região variável de cadeia pesada (Vh) e a cadeia leve de tamanho natural (LC). O protocolo foi desenhado para amplificar genes de anticorpos de todas as famílias de gene Vh e a cadeia leve capa, usando-se dois conjuntos de iniciadores, um para ampli30 ficação de Vh e um para a amplificação de LC. Seguintes à transcrição reversa e PCR por sobreposição-extensão em multiplex, as seqüências ligadas foram submetidas a uma segunda amplificação de PCT com um primeiro conjunto de iniciadores nested.

Cada doador foi processado individualmente, e 1480 a 2450 produtos de sobreposição foram gerados pela RT-PCR por sobreposiçãoextensão em multiplex. A coleção gerada de pares codificadores de Vh e Vl 5 cognatos provenientes de cada doador foram reunidos e inseridos em um vetor de expressão de IgG de mamífero (Figura 3) conforme descrição no Exemplo 1 seção d). Os repertórios gerados foram transformados em E. Co

li, e consolidados em doze placas-mestre de 384 poços e armazenados. Os repertórios constituídos entre 1x106 e 3,6x10® clones por doador.

Seleção

Sobrenadantes contendo anticorpos IgG foram obtidos de células CHO transfectadas transientemente com DNA preparado de clones bacterianos das placas-mestre. Os sobrenadantes foram selecionados conforme descrito no Exemplo 1, seção e. Aproximadamente, 600 alcances primários 15 foram sequenciados e alinhados. A maior parte caiu em grupos de dois ou mais membros, mas havia também clones que foram isolados somente uma vez, os assim chamados singletons. Clones representativos de cada grupo e os singletons foram submetidos a estudos de validação conforme descritos no Exemplo 1, seção e). Vários alcances primários foram excluídos para 20 posterior caracterização devido a características de seqüências não desejadas, tais como cisteínas desemparelhadas, mutações não-conservativas, que são erros potenciais da PCR, inserções e/ou deleção de códons múltiplos, e truncamentos.

Um total de 85 clones únicos passou a validação. Esses estão sumarizados na Tabela 6. Cada número de clone especificou um par de Vh e Vl particular. A família de genes IGHV e IGKV é indicado para ca

da clone e especifica a regiões de estrutura (FR) dos clones selecionados. A seqüência de aminoácidos das regiões determinantes complementaridade (CDR) de um anticorpo expresso a partir de cada clone é mostra, em que 30 CDRH1, CRH2, CDRH3 indicam as regiões 1, 2 e 3 da CDR da cadeia pesada e CDRL1, CDRL2 e CDRL3 indicam as regiões 1, 2 e 3 da CDR da cadeia leve. A seqüência de cadeias, pesada e leve, variáveis completas pode ser estabelecida a partir da informação na Tabela 6.

Outros detalhes para as colunas individuais da Tabela 6 são dados abaixo.

Os nomes das famílias de genes IGHV e IGKV foram designa

dos de acordo com como a nomenclatura oficial HUGO/IMGT (IMGT; Lefranc & Lefranc, 2001, The Immunoglobulin FactsBook, Academic Press). Numeração e alinhamentos são de acordo com a Chothia (Al-Lazikani et al. 1997 J. Mol. Biol. 273:927-48). O clone 809 tem uma inserção 5’ de dois có10 dons em CDRH1, que provavelmente traduz em um laço de CDR estendido. O clone 831 tem uma deleção de códon na posição 31 em CDRH1.

A coluna "AG" indica o antígeno associado ao RSV reconhecidos pelo anticorpo produzido do clone nomeado, conforme determinado por ELISA, FLISA e/ou Biacore. "+" indica que a clone se liga às partículas de RSV e/ou às células infectadas com RSV, mas aquela do antígeno não foi identificada.

A coluna "Epitopo" indica o sítio antigênico ou epitopo reconhecido pelo anticorpo produzido da partir do clone designado (vide Tabela 4 e abaixo). "U" indica que o epitopo é desconhecido. UCI e UCII referem-se ao 20 grupo I e Il desconhecido. Os anticorpos pertencentes a esses grupos têm perfis de reatividade similares, mas correntemente não são vistos como designados a um epitopo particular. Alguns anticorpos reconhecem epitopos complexos, tal como A&C. Os epitopos indicados em () foram somente identificados por ELISA. Tabela 6: Sumário de seqüência e especificidade de cada clone validado único IGHV CDRH1 CDRH2 CDRH3 IGKV CDRL1 CDRL2 CDRL3 Ag Epitopo Clone gene 3 3 5 6 9 0 0 gene 2 3 3 5 89 9 1ab2345 012abc3456789012345 234567890abcdefghijklmn123 45678901abodel234 0123456 8901234Sab678 735 4-59 D-YDWS NIN-YRGNTNYNPSLKS CARDVGYGGGQYFAM-DVW 3-11 RASQSVNS-HlA NTFNRVT CQQRSNWPPALTF F UCI 736 3-30 T-YGMH FIRY-DGSTQDYVDSVKG CAKDMDYYGSRSYSVTYYYGM- 1-39 RASQRISN-HLN GASTLQS CQQSYRTPP-INF F A/ll DWV 743 1-69 T-YALT RITP-MFDaNYAQKFQG CARRGAVALVPAAEDPYYYGM- 2-28 RSSQSLLHS-NGNNYLD LASNRAS CMQSLQT---PTF G Domínio central DWV 744 1-2 G-YYMH WINT-SSGGTNYAQKFQG CAREDGTMGTNSWYGWF-DPW 3-20 RASQSVSSS---YLA GASSRAT CQQYDSSLSTWTF F A/ll 793 3-11 D-YYMS YINR-GGTTIYYADSVKG CARGLILALPTATVELGAF---DIW 1-39 RASQSITG-YLN ATSTLQS CQQSYNT---LTF G Conservado 794 1-18 N-YGLN WINA-YNDNTYYSPSLQG CARSYRSQTDILTGRYKGPGDVFDN 1-12 RASEGISS---WLA AASTLQS CQQTNSFP-YTF G GCRRA W 795 4-304 SGDYYW YIF-HSGTTYYNPSLKS CARDVDDFPVWGMNRYL---ALW 3-20 RASQSVSSS---YLA GASTGAT CQQYGRTP-YTF F UCI S 796 3-30 H-FGMH IISY-DGNNVHYADSVKG CAKDDVATDLAAYYYF-DVW 2-29 RSSQSLLRS-DGKTFLY EVSSRFS CMQGLKIR-RTF G Conseivado 797 1-18 R-FGIS WISA-DNGNTYYAQNFQD CVRGGWTNRVYYYYGM-DWV 1-9 RASQGISS-YLA AASUQS CQQVDTYP-LTF G GCRRA 798 7-4-1 S-YVMN WINT-NTGDPAYAQDFTG CAWFGEFGLF-DYW 1-16 RASQDINN---YLA AASSLQS CQQYKSLP-FTF G GCRRA 799 3-30 N-YGMH VISY-DGRNKYFADSVKG CARGSVQVWLHLGLF-DNW 1-5 RASQSVSS---WVA EASNLES CQQYHSYSG-YTF F U 800 3-33 D-YGMN VIWH-DGSNKNYLDSVKG CARTPYEFWSGYYF-DFW 1D-13 RASQGITD-SLA AASRLES CQQYSKSP-ATF F F1 801 3-33 S-YAMH VIYY-EGSNEYYADSVKG CARKWLGM-DFW 2-28 RSSQSLLNS-NGFNYVD LGSNRAS CMQALETP-LTF F F1 802 3-48 S-YEMN YIGT-GGSDIYYGDSVKG CARARPGYKV-DFW 1-9 RASQGISS-YLA VASILES CQQSKSFP-PTF F U 803 4-304 SGDYFW YIY-SSGSTFYNASLKS CARGGTLYTTGGEM-HtW 3-20 RASQTVSSS---YLV GASTRAT CQQYGGSG-LTF F U S 804 3-64 N-YAMH ATST-DGGSTYYADSLKG CARRFWGFGNFF-DYW 3-20 RASQSVSSG---YLA GASGRAT CQQYFGSP-YTF F F1 805 4-59 G-DFWS YIY-YRGSTYYNPSLKS CAREGHHSGSGDYYSFF-DYW 1-39 RASQGINT---YLN AASSLQS CQQSANSP-HTF F (F1) 806 5-51 S-YWIG IVYP-GDSDTTYSPSFQG CVRRGGFCTATGCYAGHWF--- 3-20 RASQSISSG---YLA GASHRAT CQQYGSSL-WTF + U DPW 808 2-70 T- RID-WDDDKYYSTSLKT CARIVFHTSGGYYNPYM-DVW 1-39 RASQTIAS-YLS TASSLQS CQHSYNTP-YTF F (F1) TRMSVS 809 5-51 FVSTWIG IINP-ADSDTRYSPSFQG CARRAYDSGWHF-EHW 3D-15 RASQSVGS-KLA GASTRAT CQQYNNWPP-YTF F (F1) 810 1-69 N-YAIN I RIIP-VFDTTNYAQKFQG CLRGSTRGWDTDGF-DIW 1D-17 RASQGISN---YLV AASSLQS CLQHNISP-YTF F M 811 1-46 N-YYIH VINP-NGGSTTSAQKFQD CARQRSVTGGFDAWLLIPDAS- 4-1 RSSETVLYTSKNQSYLA WASTRES CQQFFRSP-FTF G Conservado NTW 812 1-69 S-YSIS MILP-ISGTTN YAQTFQG CARVFREFSTSTLDPYYF---DYW 3-20 RASQSVSSS---YIA AASRRAT CQHYGNSL-FTF F F1 813 5-51 S-YWIG IIYP-GDSDTRNSPSFQG CVRQGGYYDRNGYHEKYAF---DIW 1-5 RASQSISS---WLA KSSILES CQHYNSYS-GTF F (F1) 814 I 3-30-3 D-YAMH VISY-DGANEYYAESVKG CARAGRSSMNEEVIMYF-DNW 1-5 RASQSIGS-RLA dassles CQQYNRDSP-WTF G Conservado 816 3-23 817 3-30 818 2-70 819 4-304 822 5-51 823 4-b 824 4-59 825 1-18 827 1-24 828 1-3 829 2-70 830 1-18 831 1-3 833 3-30 834 1-18 835 1-18 836 4-b 838 3-30 839 3-30 841 1-18 842 1-18 843 1-18 845 1-18 846 4-302 848 4-61 849 3-73 850 1-3 851 1-18 852 1-69 853 5-51 855 1-18 856 1-18 857 3-23 τ-YAivrr T-HGMH A

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1-12

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1-12

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3-20

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1-39

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CMQUQTP-RTF

G Conservado F A/ll F B/I/F1 A/ll F F U U + F A/ll* (F1&C) F A/ll* (UCI) F (A&COIV* + A&C F U (F1) G GCRRA F A/ll G Domínio central G GCRRA G GCRR F (A/ll) G Conservado G GCRRA G GCRRA G GCRRA G GCRRA G GCRRA F U F U F U F (ΑΛΙ) G GCRRA F U G Domínio central G GCRRA G GCRRA F F1 CD

O 858 1-69 G-YTIS RWP-TLGFPNYAQKFQG CARMNLGSHSGRPGF-DMW 1D-33 QASQDISN-YLN DATKLET CQHFANLP-YTF F B/I/F1 859 3-33 K-YGIH VISY-DGSKKYFTDSVKG CATGGGVNVTSWSDVEHSSSL- 1-27 RASQGIRN-YLA AASUQS CQRYNSAP-LTF G Conservado GYW 861 3-30 S-YGMH FIWN-DGSNKYYADSVKG CVKDEVYDSSGYYLYYF-DSW 1-39 RASQIIAS-YLN AASSLQS CQQSYSTPI-FTF F F1 863 3-23 S-YTMS SISA-STVLTYYADSVKG CAKDYDFWSGYPGGQYWFF--- 3-11 RTSQSVSS-YLA DASNRAT CQQRSDW---LTF F A/ll DLW 866 1-18 T-YGIS WISA-DNGNTYYAQKFQG CVRGGTYSSDVEYYYYGM---DVW 1-9 RASQGISI---YLA AASUQT CQQLNIYP-LTF G GCRRA 867 1-69 R-YTIH RWP-SLGIPNYAPKFQG CARLTLGSYTGRPGF-DSW 1D-33 QASQDINN-YLN DATDLET CQHFANLP-YTF F (F1) 868 4-b NA- SIH-HSGSAYYNSSLKS CARDTILTFGEPHWF DPW 3-15 RASQSIKN-NLA GASARAT CQEYNNWPL-LTF G Conservado YYWG 869 3-30 Y-YAMH VISY-GETNKLYADSVKG CARDLRYLTYYSGSGD-DSW 3-20 RASQSLSDN---YLA GASSRPT CQQYGTTP-ITF G Conservado 870 4-59 N-YYWS EIS---NTWSTNYNPSLKS CARGLFYDSGGYYLFYF-QHW 1n39 RASQRIAS-YLN AASSLQS CQQSYSTPI-YTF F (F1> 871 3-33 N-YGMH VIWY-DDSNKQYGDSVKG CARASEYSISWRHRGVL-DYW 1D-33 QASQGISN-YLN DASNLES CQQYDNFP-YTF F UCI 874 3-30 H-YGMH VISH-DGNIKYSADSVKG CHGEGYSTSWLGTAAL-DYW 1-27 RASQGIRN-FLA AASTLQS CQKYNSAP-WTF G Conservado 879 3-23 A-YAMS AISG-GGGTTYYADSVKG CAKTRGYSYTWGDAF-DLW 3-15 RASQSVÍS-NLA GASTRAT CQQYNNWP-QTF F U 880 2-5 TS- LVD-WDDDRRYRPSLKS CAHSAYYTSSGYYLQYF---HHW 1-39 RASQTIAS-YVN AASSLQS CQQSYSFP-YTF F UCII KLGVG 881 3-48 S-YEMT HIGN-SGSMIYYADSVKG CARSDYYDSSGYYLLYL---DSW 1-39 FtASQTIAS-YVN AASNLQS CQQSYSVPR-LTF F UCII 884 1-3 N-FAMH YINA-VNGNTQYSQKFQG CARNNGGSAIIF-YYW 1-39 RSSQTISV---FLN AASSLHS CQESFSS---STF F U 885 4-b SN- SMH-HSGSSYYKPSLKS CARDLWVTDISIKNYF-DPW 3-11 RASQSVTK-YLA DASNRAT CQHRRSW---PTF + U YYWG 886 3-30 S-YGMH VISN-DGSNKYYADSVKG CAKTTDQRLLVDWF-DPW 3-15 RASQSVSS-NLA SASTRAT CQQYNMWPP-WTT= F A/ll 887 2-70 TS- RID-WDDDKYYSTSLKT CARTLVYAPDS YYLYYF-DYW 1-39 RASQTIAS-YVN AASRLQS CQQSYSIP-WTF F U(FI) RMSVS 888 4-39 SSNFYW SIF-YSGTTYYNPSLKS CARHGFRYCNNGVCSINLDAF-DIW 2-28 RSSQSLLRT-NGYNYLD LGSIRAS CMQSLQTS-ITF G GCRR G 889 1-18 T-YGIS WISA-YNGNTFYAQRLQG CARDLRMLPGGLPTRRGM---DVW 1-5 RASQSISS-WLA KASS LES CQQYNSYP-YTF G GCRRA 890 1-46 K-FYIH IINP-SGGSTTYAQTFQD CARGIREGGVSVEDWMLVYSWF- 1-39 RASQNIRT-FIN AASKLES CQQGHSTP-YTF G Conservado DPW 891 3-30 S-YTMH WSY-DGNHNDVADSVKG CVRAPGSMGL-DVW 2-28 RSSQSLLHR-NGYNHLD LGSNRAS CMQALQ7P-RTF G Domínio central 892 3-15 N-AWMS LIKSHFEGGATDYAAPVKG CAPLGGPTPF-DYW 1-17 RAGQGIRN-DLG GASUQS CLQHNSYP-WTF + U 893 3-30 I-YGMH VISY-DGAKKFYANSVKG CATASTYFYDSR-DYW 2-24 RSSRSLVHS-DGNTYLS KISNRFS CLQATQF---LTF G Conservado 894 3-33 D-YGMH VIWH-DGSNIRYADSVRG CARVPFQIWSGLYF-DHW 3-15 RASQSVGN-NLA GASTRAT CQQYDKWP-ETF F C* (UCI) 924 4-b SE- SVH-HSGSTYYNPSLKS CARDRVALGVHYWYF-DlW 3-15 RASQSVSS-HLA GASTRAT CQQYDNWL-PTF G Dominto central YYWG 955 146 D-YCMH ILNP-DGGTTFYAEKFQD CAIUARAYCGLADGQEGDF---DTW 1-5 RASRSITS-WLA KASSLQS CQQYNSYP-LTF SH A2 aa42-64 novos experimentos confirmaram a ligação ao epitopo com um asterisco. As seqüências de aminoácidos de cima para baixo na coluna denomina CDRH1 são mostradas na mesma ordem nas SEQ ID NOs: 201- 285.

As seqüências de aminoácidos de cima para baixo na coluna denomina CDRH2 são mostradas na mesma ordem nas SEQ ID NOs: 286- 370.

As seqüências de aminoácidos de cima para baixo na coluna denomina CDRH3 são mostradas na mesma ordem nas SEQ ID NOs: 371- 455.

As seqüências de aminoácidos de cima para baixo na coluna

denomina CDRL1 são mostradas na mesma ordem nas SEQ ID NOs: 456- 540.

As seqüências de aminoácidos de cima para baixo na coluna denomina CDRL2 são mostradas na mesma ordem nas SEQ ID NOs: 541- 625.

As seqüências de aminoácidos de cima para baixo na coluna denomina CDRL3 são mostradas na mesma ordem nas SEQ ID NOs: 626- 710.

Caracterização de especificidade de antígeno Durante a validação, a especificidade de antígeno dos clones foi

determinado para o mesmo grau pela ligação das partículas virais, proteína G e proteína F solúveis, bem como fragmentos da proteína G.

Para clones com reatividade anti-F, a especificidade dos anticorpos individuais expressos dos clones foi avaliada subsequentemente de mo25 do a determinar o sítio antigênico, e, se possível, o epitopo ligado pelos clones individuais (vide Exemplo 1, Seção g- 4). A Figura 4 ilustra a caracterização da especificidade do epitopo do anticorpo obtido do clone 801 usando análise de Biacore. A análise mostra que quando a proteína F é bloqueada por 133-1h ou Palivizumab (sítio antigênico C e II, respectivamente) antes da 30 injeção de anticorpo 801 na célula Biacore, um alto grau de ligação de anticorpo 801 podem ser detectado. A ligação do anticorpo 801 nãocompetido é reduzida um pouco em comparação com a ligação do anticorpo 801 competido. A redução é, contudo, tão baixa que é mais provável de ser devida ao impedimento estérico que a competição direta para o sítio de ligação. O bloqueio de proteína F com o anticorpo 9c5 (sítio antigênico F1) antes da injeção de anticorpo 801 na célula Biacore mostra uma inibição quase completa 5 da ligação do anticorpo 801 a proteína F1 E portanto concluído que o anticorpo 801 se liga à proteína F no sítio F1, ou muito próxima a este.

Para clones com reatividade anti-G, a especificidade dos anticorpos individuais expressos a partir dos clones foi avaliada subsequentemente para determinar se o anticorpo de liga ao domínio central da proteína 10 G, à região conservada, ou à GCRR, e também se o epitopo é conservado ou específico de subtipo. Isso foi feito por ELISA e/ou FLISA usando os seguintes fragmentos de proteína G:

G(B); resíduos 66-292 provenientes da cepa RSV 18537 (expressa em células CHDO DE DG44)

Fragmento G(B): Resíduo 127-203 proveniente da cepa 18537 de RSV (expressa em E. coli).

GCRR A: Resíduos 171-187 da cepa Long de RSV (sintetizada com pontes de cisteína seletivamente formadas).

GCRR B: Resíduos 171-187 da cepa 18537 de RSV (sintetizada com pontes de cisteína seletivamente formadas).

G conservada: Resíduos 164-176.

Análises de epitopo adicionais foram também realizadas nos clones reativos anti-G por ensaios de competição conforme descrição no Exemplo 1, Seção g- 4.

Ainda, um dos clones identificados em um procedimento de se

leção conforme descrito no Exemplo 1, Seção e, produz um anticorpo específico de SH. Adicionalmente, vários clones se ligam a uma ou mais das cepas de RSV testadas, mas o antígeno não foi determinado.

Os dados relacionados à especificidade do antígeno para todos os clones validados estão resumidos na Tabela 6. Nenhum dos clones validados se liga às células epiteliais laríngeas humanas e também nenhum dos clones específicos de G testados (793, 816, 835, 841, 853, 855, 856, e 888) se liga uma fractalcina humana (CX3CL1).

Caracterização da cinética de ligação

A afinidade de ligação para antígenos de RSV recombinantes, foi determinada por ressonância de plasmônio de superfície para vários clo5 nes de anticorpos. A análise foi realizada com fragmentos Fab preparados por clivagem enzimática com valores de K0 na faixa picomolar a nanomolar são mostrados na Tabela 7. Os fragmentos Fab derivados de Palivizumab (Synagis) comercialmente disponível foram analisados de modo similar pAra referência.

Tabela 7: Constantes de ligação cinética e afinidades dos clones

ecionados. Clone de Fab kon koff t’/2 Kd (antígeno) (IO5M'1 s'1) (10‘5 1/s) (min) (pM) 735(F) 4,07 9,18 130 226 810(F) 17,40 34,80 33 200 818(F) 1,92 2,20 530 115 817 (F) 0,92 7,54 150 820 819 (F) 3,56 4,99 230 140 825 (F) 7,72 15,00 77 195 858(F) 4,97 0,34 3400 7 831 (F) 3,72 42 28 1130 796 (G) 8,33 40,3 28,67 480 811 (G) 4,98 17,1 68 340 816 (G) 20,20 17,80 65 90 838 (G) 2,64 5,06 230 190 853 (G) 17,7 140 8,25 790 859 (G) 3,8 4,63 250 120 Synagis (F) 2,00 75,70 15 3780 Geração de um banco de células de clones expressando um anticorpo individual

Um subconjunto de 47 pares de codificadores de Vh e Vl cogna

tos, únicos, correspondente aos clones N0

735, 736, 744, 793, 795, 796, 799, 800, 801, 804, 810, 811, 812, 814, 816, 817, 818, 819, 824, 825, 827, 828, 829, 830, 831, 835, 838, 841, 853, 855, 856, 857, 858, 859, 861, 863, 868, 870, 871, 880, 881, 884, 885, 886,

888, 894 e 955 na Tabela foram selecionados para gerar linhas de células de expressão individuais, em que cada um expressa um anticorpo único de

uma seqüência genes de Vh e Vl simples. As seqüências inteiras (DNA e

aminoácidos deduzidos) de 44 clones selecionados (exceto os identificados

acima 828, 885, e 955) são mostradas nas SEQ ID NOs: 176;

Os 44 clones são caracterizados por produzirem as seguintes

seqüências de VH, que estão estabelecidas nas SEQ ID NOs: 1-44:

Clone No. 735:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSNGAIGDYDWSWIRQSPGKGLEWIGNI NYRGNTNYNPSLKSRVTMSLRTSTMQFSLKLSSATAADTAVYYCARDVGY GGGQYFAMDVWSPGTTVTVSS Clone No. 736:

QVQLVESGGGWQPGGSLRLSCTASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWV AFIRYDGSTQDYVDSVKGRFTISRDNSKNMVYVQMNSLRVEDTAVYYCAK DM D YYG S RS YS VTYYYG M D VWGQGTTVTVSS Clone No. 744:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSGYYMHWVRQAPGQGLEWM GWINTSSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAHMELRRLRSDDTAVYYCAR EDGTMGTNSWYGWFDPWGQGTLVTVSS Clone No. 793:

QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFPFGDYYMSWIRQAPGKGLEWVA YINRGGTTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAGDTALYYCARGLI LALPTATVELGAFDIWGQGTMVTVSS Clone No. 795:

QVQ LQES G PG LVKPSQTLS LT CTVSG AS ISSG DYYW SWIRQS P RKG L EWI GYIFHSGTTYYNPSLKSRAVISLDTSKNQFSLRLTSVTAADTAVYYCARDVD DFPVWGMNRYLALWGRGTLVTVSS Clone No. 796:

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSFSHFGMHWVRQVPGKGLEWV AIISYDGNNVHYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRDDDTGVYYCAKD DV ATDLAA YYYFDVWGRGTLVTVSS Clone No. 799:

QVQLVESGGGVVQPGRSLKLSCEASGFNFNNYGMHWVRQAPGKGLEWV AVISYDGRNKYFADSVKGRFIISRDDSRNTVFLQMNSLRVEDTAVYYCARG

SVQVWLHLGLFDNWGQGTLVTVSS

Clone No. 800:

QVQLVESGGAWQPGRSLRLSCEVSGFSFSDYGMNWVRQGPGKGLEWV AVIWHDGSNKNYLDSVKGRFTVSRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCAR TPYEFWSGYYFDFWGQGTLVTVSS Clone No. 801:

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFPFNSYAMHWVRQAPGKGLEWV AVIYYEGSNEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMDSLRAEDTAVYYCARK WLGMDFWGQGTL VTVSS Clone No. 804:

EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCSASGFTFSNYAMHWVRQAPGKRLEYVS ATSTDGGSTYYADSLKGTFTISRDNSKNTLYLQMSSLSTEDTAIYYCARRF WGFGNFFDYWGRGTLVTVSS Clone No. 810:

QVQLVQSGAEVKKSGSSVKVSCRASGGTFGNYAINWVRQAPGQGLEWVG RIIPVFDTTNYAQKFQGRVTITADRSTNTAIMQLSSLRPQDTAMYYCLRGST RGWDTDGFDIWGQGTMVTVSS Clone No. 811:

QVQLVQSGAVVETPGASVKVSCKASGYIFGNYYIHWVRQAPGQGLEWMA VINPNGGSTTSAQKFQDRITVTRDTSTTTVYLEVDNLRSEDTATYYCARQR SVTGGFDAWLLIPDASNTWGQGTMVTVSS Clone No. 812:

QVQLVQSGAEMKKPGSSVKVSCKASGGSFSSYSISWVRQAPGRGLEWVG MILPISGTTNYAQTFQGRVIISADTSTSTAYMELTSLTSEDTAVYFCARVFRE FSTSTLDPYYFDYWGQGTLVTVSS Clone No. 814:

QVQLVESGGGWQPGKSVRLSCVGSGFRLMDYAMHWVRQAPGKGLDWV AVISYDGANEYYAESVKGRFTVSRDNSDNTLYLQMKSLRAEDTAVYFCARA GRSSMNEEVIMYFDNWGLGTLVTVSS Clone No. 816:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSTYAMTWVRQAPGKGLEWVS VIRASGDSEIYADSVRGRFTISRDNSKNTVFLQMDSLRVEDTAVYFCANIGQ

RRYCSGDHCYGHFDYWGQGTLVTVSS

Clone No. 817:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFGFNTHGMHWVRQAPGKGLEWL SIISLDGIKTHYADSVKGRFTISRDNSKNTVFLQLSGLRPEDTAVYYCAKDHI GGTNAYFEWTVPFDGWGQGTLVTVSS Clone No. 818:

QVTLRESGPAWKPTETLTLTCAFSGFSLNAGRVGVSWIRQPPGQAPEWL ARIDWDDDKAFRTSLKTRLSISKDSSKNQWLTLSNMDPADTATYYCARTQ VFASGGYYLYYLDHWGQGTLVTVSS Clone No. 819:

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSSGAISGADYYWSWIRQPPGKGLEWV GFIYDSGSTYYNPSLRSRVTISIDTSKKQFSLKLTSVTAADTAVYYCARDLGY GGNSYSHSYYYGLDVWGRGTTVTVSS Clone No. 824:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIGNYYWGWIRQPPGKGLEWIGHI YFGGNTNYNPSLQSRVTISVDTSRNQFSLKLNSVTAADTAVYYCARDSSN WPAGYEDWGQGTLVTVSS Clone No. 825:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGYTFTSNGLSWVRQAPGQGFEWLG WISASSGNKKYAPKFQGRVTLTTDISTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCAKDG GTYVPYS DAFDFWGQGTMVTVSS Clone No. 827:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCRVSGHTFTALSKHWMRQGPGGGLEWM GFFDPEDGDTGYAQKFQGRVTMTEDTATGTAYMELSSLTSDDTAVYYCAT VAAAGN FDNWGQGTLVTVSS Clone No. 829:

QVTLKESGPALVKATQTLTLTCTFSGFSLSRNRMSVSWIRQPPGKALEWLA RIDWDDDKFYNTSLQTRLTISKDTSKNQWLTMTNMDPVDTATYYCARTGI YDSSGYYLYYFDYWGQGTLVTVSS Clone No. 830:

QVQLVQSGAEVKVPGASVKVSCKASGYTFTTYGVSWVRQAPGQGLEWM GWISAYNGNTYYLQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRGLRSDDTAMYYCAR

DRVGGSSSEVLSRAKNYGLDVWGQGTTVTVSS

Clone No. 831:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASANIFTYAMHWVRQAPGQRLEWMG WINVGNGQTKYSQRFQGRVTITRDTSATTAYMELSTLRSEDTAVYYCARRA SQYGEVYGNYFDYWGQGTLVTVSS Clone No. 835:

QVQLVQSGAEVKRPGASVKVSCKASGYTFISYGFSWVRQAPGQGLEWMG WSSVYNGDTNYAQKFHGRVNMTTDTSTNTAYMELRGLRSDDTAVYFCAR DRNVVLLPAAPFGGMDVWGQGTMVTVSS Clone No. 838:

QVQLVESGGGWQPGTSLRLSCAASGFTFSTFGMHWVRQAPGKGLEWVA VISYDGNKKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQVNSLRVEDTAVYYCAAQT PYFNESSGLVPDWGQGTLVTVSS Clone No. 841:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFISFGISWVRQAPGQGLEWMG WISAYNGNTDYAQRLQDRVTMTRDTATSTAYLELRSLKSDDTAVYYCTRD ESMLRGVTEGFGPIDYWGQGTLVTVSS Clone No. 853:

EVQLVQSGAEVKKPGQSLKISCKTSGYIFTNYWIGWVRQRPGKGLEWMGV IFPADSDARYSPSFQGQVTISADKSIGTAYLQWSSLKASDTAIYYCARPKYY FDSSGQFSEMYYFDFWGQGTLVTVSS Clone No. 855:

QVQLVQSGPEVKKPGASVKVSCKASGYVLTNYAFSWVRQAPGQGLEWLG WISGSNGNTYYAEKFQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYFCARD LLRSTYFDYWGQGTLVTVSS Clone No. 856:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNYGFSWVRQAPGRGLEWM GWISAYNGNTYYAQNLQGRVTMTTDTSTTTAYMVLRSLRSDDTAMYYCAR DGNTAGVDMWSRDGFDIWGQGTMVTVSS Clone No. 857:

EVQLLESGGGLVQPGGPLRLSCVASGFSFSSYAMNWIRLAPGKGLEWVSG ISGSGGSTYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEP

WIDIWASVISPYYYDGMDVWGQGTTVTVSS

Clone No. 858:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGSFDGYTISWLRQAPGQGLEWMG RWPTLGFPNYAQKFQGRVTVTADRSTNTAYLELSRLTSEDTAVYYCARM NLGSHSGRPGFDMWGQGTLVTVSS Clone No. 859:

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAVSGSSFSKYGIHWVRQAPGKGLEWVA VISYDGSKKYFTDSVKGRFTIARDNSQNTVFLQMNSLRAEDTAVYYCATGG GVNVTSWSDVEHSSSLGYWGLGTLVTVSS Clone No. 861:

QVQLVESGGGWQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV AFIWNDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCVKD EVYDSSGYYLYYFDSWGQGTLVTVSS Clone No. 863:

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLEWVS SISASTVLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAKDYD FWSGYPGGQYWFFDLWGRGTLVTVSS Clone No. 868:

QVQLQESGPGLVTPSETLSVTCTVSNYSIDNAYYWGWIRQPPGKGLEWIG SIHHSGSAYYNSSLKSRATISIDTSKNQFSLNLRSVTAADTAVYYCARDTILT FGEPHWFDPWGQGTLVTVSS Clone No. 870:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSISNYYWSWIRQPPGKGLEWIGEI SNTWSTNYNPSLKSRVTISLDMPKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARGLFYD SGGYYLFYFQHWGQGTLVTVSS Clone No. 871:

QVQLVESGGGVVQPGRSLRVSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEWV AVIWYDDSNKQYGDSVKGRFTISRDNSKSTLYLQMDRLRVEDTAVYYCAR ASEYSISWRHRGVLDYWGQGTLVTVSS Clone No. 880:

QITLKESGPTLVRPTQTLTLTCTFSGFSLSTSKLGVGWIRQPPGKALEWLAL VDWDDDRRYRPSLKSRLTVTKDTSKNQWLTMTNMDPVDTATYYCAHSAY

YTSSGYYLQYFHHWGPGTLVTVSS

Clone No. 881:

EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCEVSGFTFNSYEMTWVRQAPGKGLEWVS HIGNSGSMIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDTAVYYCARSD YYDSSGYYLLYLDSWGHGTLVTVSS Clone No. 884:

QVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGHTFINFAMHWVRQAPGQGLEWM GYINAVNGNTQYSQKFQGRVTFTRDTSANTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR NNGGSAIIFYYWGQGTLVTVSS Clone No. 886:

QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFSFSSYGMHWVRQAPGKGLEWV AVISNDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKKTMYLQMNSLRAEDTAVYFCAKT TDQRLLVDWFDPWGQGTLVTVSS Clone No. 888:

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTASGGSINSSNFYWGWIRQPPGKGLEWI GSIFYSGTTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSPVTAADTAVYHCARHGF RYCN NGVCSINLDAFDIWGQGTMVTVSS Clone No. 894:

QVQLVESGGGWQPGKSLRLSCAASGFRFSDYGMHWVRQAPSKGLEWV AVIWHDGSNIRYADSVRGRFSISRDNSKNTLYLQMNSMRADDTAFYYCAR VPFQIWSGLYFDHWGQGTLVTVSS

Essas seqüências de aminoácidos estão nos clones codificados pelas seguintes seqüências de ácidos nucleicos, que estão também estabeIecidas nas SEQ ID NOs: 45-88:

Clone No. 735:

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacgtgcact gtgtctaatggcgccatcggcgactacgactggagctggattcgtcagtccccagggaagggactggagt ggattgggaacataaattacagagggaacaccaactacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatgt 30 ccctacgcacgtccacgatgcagttctccctgaagctgagctctgcgaccgctgcggacacggccgtctat tactgtgcgagagatgtaggctacggtggcgggcagtatttcgcgatggacgtctggagcccagggacca cggtcaccgtctcgagt Clone No. 736:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtacag cgtctggattcaccttcagtacctatggcatgcactgggtccgccaggctcccggcaaggggctggaatgg gtggcatttatacggtatgatggaagtactcaagactatgtagactccgtgaagggccgattcaccatctcc 5 agagacaattccaagaatatggtgtatgtgcagatgaacagcctgagagttgaggacacggctgtctatta ctgtgcgaaagacatggattactatggttcgcggagttattctgtcacctactactacggaatggacgtctgg ggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt Clone No. 744:

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaag 10 gcttctggatacaccttcagcggctattatatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtg gatgggatggatcaacactagcagtggtggcacaaactatgcgcagaagtttcagggcagggtcaccat gaccagggacacgtccatcagcacagcccacatggaactgaggaggctgagatctgacgacacggcc gtgtattattgtgcgagagaggacggcaccatgggtactaatagttggtatggctggttcgacccctggggc cagggaaccctggtcaccgtctcgagt 15 Clone No. 793:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtcaagcctggggggtccctgagactctcctgtgcgg cctctggattccccttcggtgactactacatgagctggatccgccaggctccagggaagggactggagtgg gttgcatacattaatagaggtggcactaccatatactacgcagactctgtgaagggccgattcaccatctcc agggacaacgccaagaactccctgtttctgcaaatgaacagcctgagagccggggacacggccctctat 20 tactgtgcgagagggctaattctagcactaccgactgctacggttgagttaggagcttttgatatctggggcc aagggacaatggtcaccgtctcgagt Clone No. 795:

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactg tctctggtgcctccatcagcagtggtgattattactggagttggatccgtcagtctccaaggaagggcctgga 25 gtggattgggtacatcttccacagtgggaccacgtactacaacccgtccctcaagagtcgagctgtcatctc actggacacgtccaagaaccaattctccctgaggctgacgtctgtgactgccgcagacacggccgtctatt attgtgccagagatgtcgacgattttcccgtttggggtatgaatcgatatcttgccctctggggccggggaac cctggtcaccgtctcgagt Clone No. 796:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcag cctctggattcagcttcagtcactttggcatgcactgggtccgccaggttccaggcaaggggctggagtggg tggcaattatatcatatgatgggaataatgtacactatgccgactccgtaaagggccgattcaccatctcca gagacaattccaagaacacgctgtttctgcaaatgaacagcctgagagatgacgacacgggtgtgtatta ctgtgcgaaggacgacgtggcgacagatttggctgcctactactacttcgatgtctggggccgtggcaccct

ggtcaccgtctcgagt

Clone No. 799:

caggtgcagctggtggagtctgggggcggcgtggtccagcctgggaggtccctgaaactctcttgtgaag 5 cctctggattcaacttcaataattatggcatgcactgggtccgccaggcaccaggcaaggggctggagtg ggtggcagttatttcatatgacggaagaaataagtattttgctgactccgtgaagggccgattcatcatctcca gagacgattccaggaacacagtgtttctgcaaatgaacagcctgcgagttgaagatacggccgtctattac tgtgcgagaggcagcgtacaagtctggctacatttgggactttttgacaactggggccagggaaccctggt caccgtctcgagt 10 Clone No. 800:

caggtgcagctggtggagtctgggggagccgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgaag tgtctggattcagtttcagtgactatggcatgaactgggtccgccagggtccaggcaaggggctggagtgg gtggcagttatatggcatgacggaagtaataaaaattatctagactccgtgaagggccgattcaccgtctcc agagacaattccaagaacacattgtttctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacacggctgtatatt 15 actgtgcgaggacgccttacgagttttggagtggctattactttgacttctggggccagggaaccctggtcac cgtctcgagt Clone No. 801:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcag cgtctggattccccttcaatagctatgccatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgg 20 gtggcagtgatatattatgaagggagtaatgaatattatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacactctgtatttgcaaatggatagcctgagagccgaggacacggctgtctatta ctgtgcgaggaagtggctggggatggacttctggggccagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 804:

gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtccggcctggggggtccctgagactctcctgttcagc ctctggattcaccttcagtaactatgctatgcactgggtccgccaggctccagggaagagactggaatatgt ttcagctactagtactgatggggggagcacatactacgcagactccctaaagggcacattcaccatctcca gagacaattccaagaacacactgtatcttcaaatgagcagtctcagtactgaggacacggctatttattact gcgcccgccgattctggggatttggaaacttttttgactactggggccggggaaccctggtcaccgtctcga

gt

Clone No. 810:

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagtccgggtcctcggtgaaggtctcctgcaggg

cttctggaggcaccttcggcaattatgctatcaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtgg

gtgggaaggatcatccctgtctttgatacaacaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgatta ccgcggacagatccacaaacacagccatcatgcaactgagcagtctgcgacctcaggacacggccatg tattattgtttgagaggttccacccgtggctgggatactgatggttttgatatctggggccaagggacaatggt caccgtctcgagt Clone No. 811:

caggttcagctggtgcagtctggggctgtcgtggagacgcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaagg catctggatacatcttcggcaactactatatccactgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtgg atggcagttatcaatcccaatggtggtagcacaacttccgcacagaagttccaagacagaatcaccgtga ccagggacacgtccacgaccactgtctatttggaggttgacaacctgagatctgaggacacggccacata ttattgtgcgagacagagatctgtaacagggggctttgacgcgtggcttttaatcccagatgcttctaatacct 10 ggggccaggggacaatggtcaccgtctcgagt Clone No. 812:

caggtgcagctggtgcagtctggggctgagatgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaagg cttctggaggctccttcagcagctattctatcagctgggtgcgacaggcccctggacgagggcttgagtggg tgggaatgatcctgcctatctctggtacaacaaactacgcacagacatttcagggcagagtcatcattagc 15 gcggacacatccacgagcacagcctacatggagctgaccagcctcacatctgaagacacggccgtgta tttctgtgcgagagtctttagagaatttagcacctcgacccttgacccctactactttgactactggggccagg gaaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 814:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaagtccgtgagactctcctgtgtag 20 gctctggcttcaggctcatggactatgctatgcactgggtccgccaggctccaggcaagggactggattgg gtggcagttatttcatatgatggagccaatgaatactacgcagagtccgtgaagggccgattcaccgtctcc agagacaattcagacaacactctgtatctacaaatgaagagcctgagagctgaggacacggctgtgtattt ctgtgcgagagcgggccgttcctctatgaatgaagaagttattatgtactttgacaactggggcctgggaac cctggtcaccgtctcgagt 25 Clone No. 816:

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgtagc ctccggattcacctttagtacctacgccatgacctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgg gtctcagtcattcgtgctagtggtgatagtgaaatctacgcagactccgtgaggggccggttcaccatctcca gagacaattccaagaacacggtgtttctgcaaatggacagcctgagagtcgaggacacggccgtatattt 30 ctgtgcgaatataggccagcgtcggtattgtagtggtgatcactgctacggacactttgactactggggcca gggaaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 817:

csggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccaacctgggaggtccctgagactctcctgtgcag cctctggattcggcttcaacacccatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtg gctgtcaattatctcacttgatgggattaagacccactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacacggtgtttctacaattgagtggcctgagacctgaagacacggctgtatatta ctgtgcgaaagatcatattggggggacgaacgcatattttgaatggacagtcccgtttgacggctggggcc 5 agggaaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 818:

caggtcaccttgagggagtctggtccagcggtggtgaagcccacagaaacgctcactctgacctgcgcct tctctgggttctcactcaacgccggtagagtgggtgtgagttggatccgtcagcccccagggcaggccccg gaatggcttgcacgcattgattgggatgatgataaagcgttccgcacatctctgaagaccagactcagcat 10 ctccaaggactcctccaaaaaccaggtggtccttacactgagcaacatggaccctgcggacacagccac atattactgtgcccggacacaggtcttcgcaagtggaggctactacttgtactaccttgaccactggggcca gggaaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 819:

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcacagaccctgtccctcacctgcactg 15 tctctagtggcgccatcagtggtgctgattactactggagttggatccgccagcccccagggaagggcctg gagtgggttgggttcatctatgacagtgggagcacctactacaacccgtccctcaggagtcgagtgaccat atcaatagacacgtccaagaagcagttctccctgaagctgacctctgtgactgccgcagacacggccgtg tattactgtgccagagatctaggctacggtggtaactcttactcccactcctactactacggtttggacgtctgg ggccgagggaccacggtcaccgtctcgagt 20 Clone No. 824:

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcact gtctctggtggctccatcggaaattactactggggctggatccggcagcccccagggaagggacttgagt ggattgggcatatctacttcggtggcaacaccaactacaacccttccctccagagtcgagtcaccatttcag tcgacacgtccaggaaccagttctccctgaagttgaactctgtgaccgccgcggacacggccgtgtattac 25 tgtgcgagggatagcagcaactggcccgcaggctatgaggactggggccagggaaccctggtcaccgt ctcgagt

Clone No. 825:

caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaagg tttctggttacacctttaccagtaatggtctcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggtttgagtggct 30 gggatggatcagcgctagtagtggaaacaaaaagtatgccccgaaattccagggaagagtcaccttgac cacagacatttccacgagcacagcctacatggaactgaggagtctgagatctgacgatacggccgtatat tactgtgcgaaagatgggggcacctacgtgccctattctgatgcctttgatttctggggccaggggacaatg gtcaccgtctcgagt Clone No. 827:

caggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcagg gtttccggacacactttcactgcattatccaaacactggatgcgacagggtcctggaggagggcttgagtg gatgggattttttgatcctgaagatggtgacacaggctacgcacagaagttccagggcagagtcaccatga 5 ccgaggacacagccacaggcacagcctacatggagctgagcagcctgacatctgacgacacggccgt atattattgtgcaacagtagcggcagctggaaactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtct cgagt

Clone No. 829:

caggtcaccttgaaggagtctggtcctgcgctggtgaaagccacacagaccctgacactgacctgcacct 10 tctctgggttttcactcagtaggaatagaatgagtgtgagctggatccgtcagcccccagggaaggccctg gagtggcttgcacgcattgattgggatgatgataaattctacaacacatctctgcagaccaggctcaccatc tccaaggacacctccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatggaccctgtggacacagccacc tattactgcgcacggactgggatatatgatagtagtggttattacctctactactttgactactggggccaggg aaccctggtcaccgtctcgagt 15 Clone No. 830:

caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaaggtgcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaagg cttctggttacacctttaccacttacggtgtcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggat gggttggatcagcgcttacaatggtaacacatactatctacagaagctccagggcagagtcaccatgacc acagacacatccacgagcacagcctacatggagctgcggggcctgaggtctgacgacacggccatgta 20 ttactgtgcgagagatcgtgttgggggcagctcgtccgaggttctatcgcgggccaaaaactacggtttgga cgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt Clone No. 831:

caggttcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagttaaggtttcctgcaaggc ttctgcaaacatcttcacttatgcaatgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgg 25 gatggatcaacgttggcaatggtcagacaaaatattcacagaggttccagggcagagtcaccattaccag ggacacgtccgcgactacagcctacatggagctgagcaccctgagatctgaggacacggctgtgtattac tgtgcgaggcgtgcgagccaatatggggaggtctatggcaactactttgactactggggccagggaaccc tggtcaccgtctcgagt Clone No. 835:

caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaggcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaag gcttcaggttacacctttatcagctatggtttcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtgg atgggatggagcagcgtttacaatggtgacacaaactatgcacagaagttccacggcagagtcaacatg acgactgacacatcgacgaacacggcctacatggaactcaggggcctgagatctgacgacacggccgt gtatttctgtgcgagggatcgcaatgttgttctacttccagctgctccttttggaggtatggacgtctggggcca

agggacaatggtcaccgtctcgagt

Clone No. 838:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagccggggacttccctgagactctcctgtgcag 5 cctctggattcaccttcagtacgtttggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgg gtggcagttatatcatatgatggaaataagaaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaacacgctgtatctgcaagtgaacagcctgagagtcgaggacacggctgtgtatt actgtgcggcccaaactccatatttcaatgagagcagtgggttagtgccggactggggccagggcaccct ggtcaccgtctcgagt 10 Clone No. 841:

caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaag gcttctggttacacctttatcagttttggcatcagctgggtgcgacaggcccctggacaaggacttgagtgga tgggatggatcagcgcttacaatggtaacacagactatgcacagaggctccaggacagagtcaccatga ctagagacacagccacgagcacagcctacttggagctgaggagcctgaaatctgacgacacggccgtg 15 tactattgcactagagacgagtcgatgcttcggggagttactgaaggattcggacccattgactactggggc cagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 853:

gaagtgcagctggtgcagtctggagcagaggtgaaaaagccggggcagtctctgaagatctcctgtaag acttctggatacatctttaccaactactggatcggctgggtgcgccagaggcccgggaaaggcctggagt 20 ggatgggggtcatctttcctgctgactctgatgccagatacagcccgtcgttccaaggccaggtcaccatct cagccgacaagtccatcggtactgcctacctgcagtggagtagcctgaaggcctcggacaccgccatat attactgtgcgagaccgaaatattactttgatagtagtgggcaattctccgagatgtactactttgacttctggg gccagggaaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 855:

caggttcagctggtgcagtctggacctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaagg cttctggttatgtgttgaccaactatgccttcagctgggtgcggcaggcccctggacaagggcttgagtggct gggatggatcagcggctccaatggtaacacatactatgcagagaagttccagggccgagtcaccatgac cacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagtctgagatctgacgacacggccgttta tttctgtgcgagagatcttctgcggtccacttactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcga 30 gt

Clone No. 856:

caggtgcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaag

gcttctggttacaccíttíccaactacggtttcagcígggtgcgacaggcccctggacgagggcttgagtgga tgggatggatcagcgcttacaatggtaacacatactatgcacagaacctccagggcagagtcaccatga ccacagacacatccacgaccacagcctacatggtactgaggagcctgagatctgacgacacggccatg tattactgtgcgagagatggaaatacagcaggggttgatatgtggtcgcgtgatggttttgatatctggggcc aggggacaatggtcaccgtctcgagt Clone No. 857:

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggcccctgaggctctcctgtgtagc ctctggattcagctttagcagctatgccatgaactggatccgcctggctccagggaaggggctggagtggg tctcaggtattagtggtagcggtggtagcacttactacggagactccgtgaagggccggttcaccatctcca gagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggccgtatatt 10 actgtgegaaagagecgtggatcgatatagtagtggcatetgttatatccccctactactacgacggaatgg acgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcgagt Clone No. 858:

caggttcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaagg cctctggaggatccttcgacggctacactatcagctggctgcgacaggcccctggacaggggcttgagtg 15 gatgggaagggtcgtccctacacttggttttccaaactacgcacagaagttccaaggcagagtcaccgtta ccgcggacagatccaccaacacagcctacttggaattgagcagactgacatctgaagacacggccgtat attactgtgcgaggatgaatctcggatcgcatagcgggcgccccgggttcgacatgtggggccaaggaa ccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 859:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccttgagactctcctgtgcagt gtctggatccagcttcagtaaatatggcatacactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgg gtggcagttatatcgtatgatggaagtaaaaagtatttcacagactccgtgaagggccgattcaccatcgcc agagacaattcccagaacacggtttttctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtctatt actgtgcgacaggagggggtgttaatgtcacctcgtggtccgacgtagagcactcgtcgtccttaggctact 25 ggggcctgggaaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 861:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctggggggtccctgagactctcctgtgcag cgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgg gtggcatttatatggaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctcc 30 agagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtatt actgtgtgaaagatgaggtctatgatagtagtggttattacctgtactactttgactcttggggccagggaacc ctggtcaccgtctcgagt Clone No. 863:

gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagc ctctggattcacgtttagctcctataccatgagctgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtggg tctcaagtattagtgctagtactgttctcacatactacgcagactccgtgaagggccgcttcaccatctccag 5 agacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgagtagcctgagagccgaggacacggccgtatatta ctgtgcgaaagattacgatttttggagtggctatcccgggggacagtactggttcttcgatctctggggccgtg gcaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 868:

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgacgccttcggagaccctgtccgtcacttgcactg 10 tctctaattattccatcgacaatgcttactactggggctggatccggcagcccccagggaagggtctggagt ggataggcagtatccatcatagtgggagcgcctactacaattcgtccctcaagagtcgagccaccatatct atagacacgtccaagaaccaattctcgttgaacctgaggtctgtgaccgccgcagacacggccgtatatta ctgtgcgcgcgataccatcctcacgttcggggagccccactggttcgacccctggggccagggaaccctg gtcaccgtctcgagt 15 Clone No. 870:

caggtgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccttgtccctcacctgcactg tctcaggtgactccatcagtaattactactggagttggatccggcagcccccagggaagggactggagtg gattggagaaatatctaacacttggagcaccaattacaacccctccctcaagagtcgagtcaccatatctct agacatgcccaagaaccagttgtccctgaagctgagctctgtgaccgctgcggacacggccgtatattact 20 gtgcgagagggcttttctatgacagtggtggttactacttgttttacttccaacactggggccagggcaccctg gtcaccgtctcgagt Clone No. 871:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagagtctcctgtgcag cgtctggattcaccttcagtaactatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgg 25 gtggcagttatatggtatgatgacagtaataaacagtatggagactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagagtacgctgtatctgcaaatggacagactgagagtcgaggacacggctgtgtatt attgtgcgagagcctccgagtatagtatcagctggcgacacaggggggtccttgactactggggccaggg aaccctggtcaccgtctcgagt Clone No. 880:

cagatcaccttgaaggagtctggtcctacgctggtgagacccacacagaccctcacactgacctgcacctt ctctgggttctcactcagcactagtaaactgggtgtgggctggatccgtcagcccccaggaaaggccctgg agtggcttgcactcgttgattgggatgatgataggcgctacaggccatctttgaagagcaggctcaccgtca ccaaggacacctccaaaaaccaggtggtccttacaatgaccaacatggaccctgtggacacagccaca tattactgtgcacacagtgcctactatactagtagtggttattaccttcaatacttccatcactggggcccgggc

accctggtcaccgtctcgagt

Clone No. 881:

gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtacagcctggaggctccctgagactctcctgtgaag 5 tctccggattcaccttcaatagttatgaaatgacctgggtccgccaggccccagggaaggggctggagtg ggtttcacacattggtaatagtggttctatgatatactacgctgactctgtgaagggccgattcaccatctcca gagacaacgccaagaactcactatatctgcaaatgaacagcctgagagtcgaggacacggctgtttatta ctgtgcgaggtcagattactatgatagtagtggttattatctcctctacttagactcctggggccatggaaccct ggtcaccgtctcgagt 10 Clone No. 884:

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaggaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaagg cttctggacatactttcattaactttgctatgcattgggtgcgccaggcccccggacaggggcttgagtggat gggatacatcaacgctgtcaatggtaacacacagtattcacagaagttccagggcagagtcacctttacg agggacacatccgcgaacacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaagacacggctgtgta 15 ttactgtgcgagaaacaatgggggctctgctatcattttttactactggggccagggaaccctggtcaccgtc tcgagt

Clone No. 886:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcag cctctggattcagcttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgg 20 gtggcagttatatcaaatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctcc agagacaattccaagaaaacgatgtatctgcaaatgaacagcctgagagctgaggacacggctgtgtat ttctgtgcgaagacaacagaccagcggctattagtggactggttcgacccctggggccagggaaccctgg tcaccgtctcgagt Clone No. 888:

cagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccatcggagaccctgtccctcacctgcact gcctctggtggctccatcaacagtagtaatttctactggggctggatccgccagcccccagggaaggggct ggagtggattgggagtatcttttatagtgggaccacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccat atccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagccctgtgaccgccgcagacacggctgtc tatcactgtgcgagacatggcttccggtattgtaataatggtgtatgctctataaatctcgatgcttttgatatctg 30 gggccaagggacaatggtcaccgtctcgagt Clone No.894:

caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtcgtccagcctggaaagtccctgagactctcctgtgcag

cgtctggaítcagatícagígactacggcatgcactgggtccggcaggctccaagcaaggggctggagtg ggtggcagttatctggcatgacggaagtaatataaggtatgcagactccgtgaggggccgattttccatctc

cagagacaattccaagaacacgctgtatttgcaaatgaacagcatgagagccgacgacacggctttttatt

attgtgcgagagtcccgttccagatttggagtggtctttattttgaccactggggccagggaaccctggtcac

cgtctcgagt

Nos mesmos clones, as seqüências de aminoácidos completas

das cadeias leves (isto é cadeias leves que incluem as regiões constantes e variáveis) têm as seguintes seqüências de aminoácidos, que estão também estabelecidas na SEQ ID NOs: 89-132:

Clone No. 735:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVNSHLAWYQQKPGQAPRLLIYNT FNRVTGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLATEDFGVYYCQQRSNWPPALTFGG GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC 15 Clone No. 736:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTFTCRASQRISNHLNWYQQKPGKAPKLLIFGA STLQSGAPSRFSGSGSGTDFTLTITNVQPDDFATYYCQQSYRTPPINFGQG TRLDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS 20 PVTKSFNRGEC Clone No. 744:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYDSSLSTWTFG QGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV 25 DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG LSSPVTKSFNRGEC Clone No. 793:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITGYLNWYQQKPGKAPKLLIYATS TLQSEVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTLTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC Clone No. 795:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIHG ASTGATGTPDRFSGSGSGTDFTLTISTLEPEDFAVYYCQQYGRTPYTFGQG TKLENKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDN 5 ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC Clone No. 796:

DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCRSSQSLLRSDGKTFLYWYLQKPGQSPQP LMYEVSSRFSGVPDRFSGSGSGADFTLNISRVETEDVGIYYCMQGLKIRRT 10 FGPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC Clone No. 799:

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTFSCRASQSVSSWVAWYQQKPGKAPKLLISE 15 ASNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQYHSYSGYTFGQ GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC Clone No. 800:

AIQLTQSPSSLSASVGDRVTLTCRASQGITDSLAWYQQKPGKAPKVLLYAA SRLESGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSKSPATFGPGT KVEIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKS F N RG EC 25 Clone No. 801:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGFNYVDWYLQKPGQSPQL LIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALETPLT FGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH 30 QGLSSPVTKSFNRGEC Clone No. 804:

EIVLTQSPGTLSLSPGGRATLSCRASQSVSSGYLAWYQQKPGQAPRLLIYG

ASGRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYFGSPYTFGQG TKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC Clone No. 810:

NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRASQGISNYLVWFQQKPGKVPKRLIYAA SSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNISPYTFGQGT KLETKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 10 Clone No. 811:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSETVLYTSKNQSYLAWYQQKARQPPK LLLYW ASTRESGVPARFSGSGSGTDFTLAISSLQAEDVAVYYCQQFFRSPF TFGPGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVY ACEVTH 15 QGLSSPVTKSFNRGEC Clone No. 812:

EIVLTQSPGTLSLSPGERVTLSCRASQSVSSSYIAWYQQKPGQAPRLVIYAA SRRATGVPDRFSGSGSATDFTLTISRLEPEDLAVYYCQHYGNSLFTFGPGT KVDVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNA 20 LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 814:

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGSRLAWYQQQPGKAPKFLIYDA SSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDLATYYCQQYNRDSPWTFGQ 25 GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC Clone No. 816:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSDGRYYVDWYLQKPGQSPHL LIYLASNRASGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLHTPWT FGQGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPXiTKSFNRGEC Clone No. 817:

EIVMTQSPATLSASPGERATLSCWASQTIGGNLAWYQQKPGQAPRLLIYGA STRATGVPARFSGSGSGTEFTLAISSLQSEDFAVYYCQQYKNWYTFGQGT KLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA 5 LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 818:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPGRAPSLLIYAAS NLQSGVPPRFSGSGSGTDFTLTISGLQPDDFATYYCQQSYSYRALTFGGG 10 TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC Clone No. 819:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSLAWYQQTPGQAPRLLIYDAS 15 YRVTGIPARFSGSGSGIDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPGLTFGGG TKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC Clone No. 824:

AIQLTQSPSSLSASVGDTVTVTCRPSQDISSALAWYQQKPGKPPKLLIYGAS TLDYGVPLRFSGTASGTHFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNTYPFTFGPGTKV DIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC 25 Clone No. 825:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYNSNNKNYLAWYQQKPGQPP KLLIHLASTREYGVPDRFSGSGSGTDFALIISSLQAEDVAVYYCQQYYQTPL TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT 30 HQGLSSPVTKSFNRGEC Clone No. 827:

DIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQFISSYLHWYQQRPGKAPKLLMYAA

STLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTNPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 829:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIASYLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHSYSTRFTFGPGTK VDVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 10 Clone No. 830:

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSVTSELAWYQQKPGKAPNFLIYKA SSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSFPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP 15 VTKSFNRGEC Clone No. 831:

DIQMTQSPSTLSASVGDRLTITCRASQNIYNWLAWYQQKPGKAPKLLIYDA STLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSLSPTFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL 20 QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 835:

DIQLTQSPSFLSASLEDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLLDAAS TLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTK 25 VDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 838:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVSITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAAS TLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQKYNSAPQTFGQGTK VEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 841:

DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPP KLLVYW ASTRASGVPDRFSGSGSGTDFTLTLSSLQAEDVAVYYCQQFHST PRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKV 5 QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEV THQGLSSPVTKSFNRGEC Clone No. 853:

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSNYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRAAGMPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGNSPLTFGG 10 GTEVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNF.YPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL SSPVTKSFNRGEC Clone No. 855:

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQAISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAA 15 SSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDFATYYCQQADTFPFTFGPGT KVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNA LQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 856:

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLDSNDGNTYLDWYLQKPGQSPQ LLIYTFSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQRIEFPYT FGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH QGLSSPVTKSFNRGEC 25 Clone No. 857:

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHRNEYNYLDWYLQKPGQSPQL LIYWGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLQTPR TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVT 30 HQGLSSPVTKSFNRGEC Clone No. 858:

DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFDA

TKLETGVPTRFIGSGSGTDFTVTITSLQPEDVATYYCQHFANLPYTFGQGTK LEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC Clone No. 859:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKVPKLLVFAA STLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNSAPLTFGGGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC 10 Clone No. 861:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIIASYLNWYQQKPGRAPKLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPIFTFGPGTK VNIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP 15 VTKSFNRGEC Clone No. 863:

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRTSQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDAS NRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSDWLTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ 20 SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC Clone No. 868:

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSIKNNLAWYQVKPGQAPRLLTSGA SARATGIPGRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDIAVYYCQEYNNWPLLTFGGG 25 TKVEIQRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC Clone No. 870:

DIQMTQSPPSLSASVGDRVTITCRASQRIASYLNWYQQKPGRAPKLLIFAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDYATYYCQQSYSTPIYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 871:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIFDA SNLESEVPSRFSGRGSGTDFTFSISSLQPEDIATYFCQQYDNFPYTFGQGT KLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL 5 QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 880:

DIQMTQSPSSLAASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPGKAPNLLIYAAS SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYFCQQSYSFPYTFGQGTK 10 LDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 881:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIASYVNWYQQKPGKAPKLLIYAAS 15 NLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPRLTFGGGT KVDITRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC Clone No. 884:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQTISVFLNWYQQKPGKAPKLLIYAAS SLHSAVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYCQESFSSSTFGGGTKV EIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT KSFNRGEC 25 Clone No. 886:

EIVMTQSPATLSVSPGETATLSCRASQSVSSNLAWYQHKPGQAPRLLIHSA STRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNMWPPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVD NALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGL 30 SSPVTKSFNRGEC Clone No. 888:

DIVMTQSPLSLPVTPGAPASISCRSSQSLLRTNGYNYLDWYLQKPGQSPQL

LIYLGSIRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQSLQTSITF GQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ GLSSPVTKSFNRGEC Clone No. 894:

EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNNLAWYQQRPGQAPRLLIYG ASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDKWPETFGQG TKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDN ALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS PVTKSFNRGEC

Os fragmentos de ácidos nucleicos que codificam a cadeia leve

nesses clones têm as seguintes seqüências de ácidos nucleicos, que são também proporcionadas como SEQ ID NOs: 133-176

Clone No 735:

gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtccttgtctccaggagaaagagccaccctctcctgcagg 15 gccagtcagagtgttaacagccacttagcctggtaccaacagaaacctggccaggctcccaggctcctca tctataatacattcaatagggtcactggcatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttca ctctcaccatcagcagccttgcgactgaagattttggcgtttattactgtcagcagcgtagcaactggcctcc cgccctcactttcggcggagggaccaaagtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatctt cccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagag 20 aggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagag caggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag aaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaac aggggagagtgt

Clone No 736:

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtgggagacagagtcaccttcacttgccgg gccagtcagaggattagcaaccatttaaattggtatcaacaaaagccagggaaagcccctaaactcctg atctttggtgcatccactcttcaaagtggggccccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttca ctctcaccatcactaatgtacaacctgacgattttgcaacttactactgtcaacagagttacagaactccccc gatcaacttcggccaagggacacgcctggacattaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttccc 30 gccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagag gccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagca ggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaa acacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacag

gggagagtgt

Clone No 744:

gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagg 5 gccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtatcagcagaaacctggccaggctcccaggctcc tcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacaga cttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtatgatagctcac tttctacgtggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttc atcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatccc 10 agagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcac agagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagacta cgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagct tcaacaggggagagtgt

Clone No 793:

15 gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgg gcaagtcagagcattaccggctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaaactcctga tctatgctacatccactttgcaaagtgaggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcac tctcaccatcagcagtcttcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttataataccctcacttt cggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctg 20 atgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagt acagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagc aaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaa gtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggaga gtgt

25 Clone No 795:

gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagg gccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtatcagcagaaacctggccaggctcccaggctcc tcatacatggcgcatccaccggggccactggcaccccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacag acttcactctcaccatcagtacactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcaatatggtaggac 1 30 accgtacacttttggccaggggaccaagctggagaacaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatctt cccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagag aggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagag

caggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgag

aaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaac

aggggagagtgt

Clone No 796:

gatattgtgatgacccagactccactctctctgtccgtcacccctggacagccggcctccatctcctgcaggt ctagtcagagcctcctgcgaagtgatggaaagacgtttttgtattggtatctgcagaagccaggccagtctc cccaacccctaatgtatgaggtgtccagccggttctctggagtgccagataggttcagtggcagcgggtca ggggcagatttcacactgaacatcagccgggtggagactgaggatgttgggatctattactgcatgcaag 10 gtttgaaaattcgtcggacgtttggcccagggaccaaggtcgaaatcaagcgaactgtggctgcaccatct gtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttct atcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagt gtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagca gactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaa 15 gagcttcaacaggggagagtgt

Clone No 799:

gacatccagatgacccagtctccttccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccttctcttgccggg ccagtcagagtgttagtagttgggtggcctggtatcagcagaaaccaggaaaagcccctaagctcctgat ctctgaggcctccaatttggaaagtggggtcccatcccggttcagcggcagtggatccgggacagaattca 20 ctctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacagtatcatagttactctggg tacacttttggccaggggaccaagttggaaatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgc catctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggc caaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcagg acagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaac 25 acaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacagg ggagagtgt

Clone No 800:

gccatccagttgacccagtctccatcgtccctgtctgcatctgtaggcgacagagtcaccctcacttgccgg gcgagtcagggcattaccgattctttagcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaaggtcctgct ctatgctgcttccagattggaaagtggggtcccatccaggttcagtggccgtggatctgggacggatttcact ctcaccatcagcagcctgcagcctgaagactttgcaacttattactgtcaacagtattctaagtcccctgcga cgttcggcccagggaccaaggtggaaatcagacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgcca tctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggcca aagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggac agcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacac 5 aaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacagggg agagtgt

Clone No 801:

gatattgtgatgacccagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggt ctagtcagagcctcctaaatagtaatggattcaactatgtggattggtacctgcagaagccagggcagtctc 10 cacaactcctgatctatttgggttctaatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcagg cacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaagctct agaaactccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtc ttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatc ccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtc 15 acagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcaga ctacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaaga gcttcaacaggggagagtgt

Clone No 804:

gaaattgtgttgacgcagtctccaggcaccctgtctttgtctccagggggaagagccaccctctcctgcagg 20 gccagtcagagtgttagcagcggctacttagcctggtaccagcagaaacctggccaggctcccaggctc ctcatctatggtgcatccggcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacag acttcactctcaccatcagcagactggagcctgaagattttgcagtgtattactgtcagcagtattttggctcac cgtacacttttggccaggggaccaagctggagctcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcc cgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga 25 ggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagc aggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca ggggagagtgt

Clone No 810:

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Clone No 811:

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Clone No 858:

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Clone No 861:

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Clone No 863:

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Clone No 868:

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Clone No 870:

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Clone No 871:

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccag 20 gcgagtcagggcattagcaactatttaaattggtatcaacagaaaccagggaaagcccctaagctcctga tcttcgatgcatccaatttggaatcagaggtcccatcaaggttcagtggacgtggatctgggacagattttact ttctccatcagcagcctgcagcctgaagatattgcaacatatttctgtcaacagtatgataatttcccgtacact tttggccaggggaccaagctggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatct gatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaa 25 gtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacag caaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaa agtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggag agtgt

Clone No 880:

gacatccagatgacccagtctccatcctccctggctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacctgccg ggcaagtcagacgattgccagttatgtaaattggtatcaacagaaaccagggaaagcccctaatctcctg atctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttca ctctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcatcttacttctgtcaacagagttacagtttcccgtaca cttttggccaggggaccaagctggatatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatc tgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaa 5 gtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacag caaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaa agtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggag agtgt

Clone No 881:

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgg gcaagtcagaccattgccagctatgtaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctg atctatgctgcatccaatttgcaaagtggggtcccttcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttca ctctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcaacagagttacagtgtccctcg gctcactttcggcggagggaccaaggtggacatcacacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttccc 15 gccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagag gccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagca ggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaa acacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacag gggagagtgt

Clone No 884:

gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgg tcaagtcagaccattagcgtctttttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatc tatgccgcatccagtttgcacagtgcggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactc tcaccatcagcagtctgcaacctgaagattctgcaacttactactgtcaagagagtttcagtagctcaactttc 25 ggcggagggaccaaggtggagatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctga tgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagta cagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagca aggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaag tctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagt 30 gt Clone No 886:

gaaattgtaatgacacagtctccagccaccctgtctgtgtctccaggggaaacagccaccctctcctgcag ggccagtcagagtgttagcagcaacttagcctggtaccaacataaacctggccaggctcccaggctcctc atccatagtgcatccaccagggccactgggatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagt 5 tcactctcaccataagcagcctgcagtctgaagattttgcagtttattactgtcagcagtataatatgtggcctc cctggacgttcggccaagggaccaaggtggaaatcaaacgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttc ccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga ggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagc aggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga 10 aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca ggggagagtgt

Clone No 888:

gatattgtgatgacccagtctccactctccctgcccgtcacccctggagcgccggcctccatctcctgcaggt ctagtcagagcctcctgcgtactaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctc 15 cacagctcctgatctatttgggttctattcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggctcagg cacagattttacactgaaaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgcatgcaatctcta caaacttcgatcaccttcggccaagggacacgactggagattaaacgaactgtggctgcaccatctgtctt catcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcc cagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtca 20 cagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagact acgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagag cttcaacaggggagagtgt

Clone No 894:

gaaattgtaatgacacagtctccagccaccctgtctgtgtctccgggggaaagagccaccctctcctgcag 25 ggctagtcagagtgttggcaacaacttagcctggtaccagcagagacctggccaggctcccagactcctc atctatggtgcgtccaccagggccactggtatcccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagagtt cactctcaccatcagcagcctgcagtctgaggattttgcagtttattactgtcagcagtatgataagtggcctg agacgttcggccaggggaccaaggtggacatcaagcgaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccg ccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagagg 30 ccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcag gacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaa cacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacagg

ggagagtgt

Em todos os 44 clones discutidos acima, os anticorpos codificados incluem a mesma cadeia pesada de IgG constante, que tem a seguinte 5 seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 178):

SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGK 10 EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLV KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

A seqüência genômica que codifica esta cadeia pesada tem a seguinte seqüência de ácidos nucleicos (SEQ ID NO: 177):

15 aqtacctccaccaaaaacccatcaatcttccccctaacaccctcctccaaaaacacctctaaaaacaca

taaccaacaacatacacaccttcccaactatcctacaatcctcaaaactctactccctcaacaacataata

accataccctccaacaacttaaacacccaaacctacatctacaacataaatcacaaacccaacaacac caaaataaacaaqaqaqttgqtgagagqccagcacagqqagggaqggtgtctgctgqaagccaggct ( 20 cagcgctcctgcctggacgcatcccggctatgcagtcccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctg cctcttcacccggaggcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttccccaggct ctgggcaggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctca gacctgccaagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactct ccactccctcaqctcoqacaccttctctcctcccaaattccaataactcccaatcttctctctqcaoaqccca aatcttqtqacaaaactcacacatocccaccQtqcccaaqtaaqccaqcccaqqcctcqccctccaqctc aaggcgggacaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtc cacctccatctcttcctcaqcacctaaactcctqqqqqqaccqtcaqtcttcctcttccccccaaaacccaa qaacaccctcatoatctcccqqacccctaaggtcacatocqtoqtqgtggacgtqaqccacqaaoaccc taaqatcaaqttcaactqqtacataaacqocQtqaaqatacataatqccaaqacaaaaccacaaqaqq aqcaqtacaacagcacgtaccqtqtqqtcaqcqtcctcaccqtcctqcaccaqqactqqctqaatqgca aoqaqtacaaqtqcaaqqtctccaacaaaqccctcccaocccccatcqaqaaaaccatctccaaaqcc

aaaqqtqqqacccgtggggtgcqaqqqccacatqqacaqaggccggctcggcccaccctctgccctg agagtaaccgctataccaacctctatccctacaaaacaaccccaaaaaccacaaatatacaccctaccc ccatcccaaaaaaaaataaccaaaaaccaaatcaacctaacctacctaatcaaaaacttctatcccaac aacatcaccataaaataaaaaaacaataaacaaccaaaaaacaactacaaaaccacacctcccatac taaactccaacaactccttcttcctctataacaaactcaccataaacaaaaacaaataacaacaaaaaaa 5 catcttctcatactccataatacataaaactctacacaaccactacacacaaaaaaacctctccctatcccc aaataaataa

Nessa seqüência, exons são indicados por sublinhado duplo. Ainda, os nucleotideos agt que codificam SER (sublinhados em negrito) são criados em conseqüência de introdução no vetor de expressão digerido com XHoI de um produto de PCR digerido com XHo\ que codifica o sítio de cadeia pesada variável no vetor de expressão de IgG.

Os pares codificadores de Vh e Vl discutidos acima foram selecionados de acordo com a especificidade de ligação para vários antígenos e peptídeos em ELISA e/ou FLISA, mapeamento de epitopos, diversidade de 15 antígenos, e diversidade de seqüências. Os pares de gene V cognatos selecionados foram submetidos a reparo de clone (Exemplo 1, Seção f) se erros foram identificados. As construções de expressão individuais foram cotransfectadas com um palmídeo de expressão de Flp-recombinase na linhagem de célula recipiente CHO-FIpIn (Invotrogen), seguido por seleção de antibió20 ticos dos integrantes. As transfecções, a seleção e a adaptação à cultura isenta de soro foram realizadas conforme descrição no Exemplo 1, seção g1 e g- 2.

A cultura isenta de soro, estavelmente transfectada, adaptada às linhagens de células de expressão individuais foram crioconservadas em ampolas múltiplas para gerar um banco de células de linhagens de células produtoras de anticorpos individuais.

EXEMPLO 3

Experimentos de neutralização in vitro foram realizados tanto com clones de anticorpos simples como combinações de anticorpos purificados. Todas as misturas de anticorpos descritas abaixo são constituídas de vários anticorpos anti-RSV da presente invenção, que foram combinados em uma mistura usando quantidades iguais dos anticorpos diferentes. Teste de anticorpos simples

Inicialmente, a atividade de neutralização de cada anticorpo foi determinada na PRNT em presença de complemento contra cepas de RSV do subtipo A e do subtipo B conforme descrição no Exemplo 1, seção j- 2.

Os valores de EC50 de vários anticorpos purificados são mostrados na Tabela 8. Interessantemente, embora a maioria dos anticorpos anti-F tenha individualmente exibido atividade de neutralização de vírus, nenhum valor de EC50 pode ser determinado para a maioria dos anticorpos de proteína G antiRSV. Isso poderia ser interpretado como indicando que esses anticorpos 10 não são capazes de neutralizar o vírus individualmente, Contudo, refino subsequente do ensaio gerou também valores de EC50 para clones com reatividade G. Os campos em branco indicam que a análise não foi ainda realizada. ND indica que um valor de EC50 não pode ser determinado na PRNT devido a uma atividade de neutralização muito baixa ou ausente.

Tabela 8: Valores de EC50 de anticorpos de proteína FeG antiRSV contra RSV de subtipos AeB._

Clone Especificidade Valor de EC50 (pg/mL) Long A2 18537 B1 793 G 2,52 0,09 800 F 0,15 0,16 810 F 0,04-0,06 0,02 0,02-0,14 0,29 816 G ND ND 818 F (1,86) 0,21 0,15* 819 F 0,18 0,09 824 F 0,03 0,007 0,02 0,07 825 F 0,12 0,04 827 F 0,16 0,10 831 F 0,08 0,72 1,66 853 G (1,49) 0,14 0,13* 855 G 6,35 ND Valor de EC50 (pg/mL) 856 G ND ND 858 F ND 0,13 868 G ND 880 F 0,38 0,95 0,40 888 G 0,14 894 F 0,08 0,07 Syna- F 0,14 0,15 0,20 gis * valor de nova determinação Misturas de anticorpos anti-F

A capacidade de misturas de anticorpos de proteína F anti-RSV de neutralizar cepas de RSV de subtipos AeB foi comparadas com o efeito 5 de neutralização obtido usando Palivizumab (também um anticorpo anti-F). A capacidade de neutralização foi avaliada usando o teste de microneutralização ou a PRNT conforme descrição no Exemplo 1, Seção j. Em um experimento inicial duas misturas de anticorpos, anti-F(l) e anti-F(ll), contendo cinco e onze anticorpos anti-F distintos, respectivamente, foram comparados 10 conta Palivizumab usando o teste de microneutralização. Anti-F(I) é composto de anticorpos obtidos dos clones 810, 818, 819, 825 e 827. Os anticorpos 810e819se ligam ao sítio antigênico AJW, o anticorpo 818 ao sítio B/l ou F1, o anticorpo 825 se liga a um epitopo complexo se sobrepondo aos sítios A e Ceo anticorpo 827 se liga a um outro epitopo complexo de sobrepondo ao 15 sítio IV (vide Tabela 6). Anti-F(II) é composto de anticorpos obtidos dos clones 735, 800, 810, 818, 819, 825, 827, 863, 880, 884 e 894. O Anti-F(II) contém Iigantes múltiplos para alguns dos sítios antigênicos definidos: os anticorpos 810, 819 e 863 se ligam a A/ll, os anticorpos 800 e 818 de liga a F1 (ou B/l), os anticorpos 827 e 825 aos epitopos complexos descritos acima, 20 os anticorpos 735 e 894 pertencem ao grupo desconhecido (UC)I, o anticorpo 880 ao UCII, e o anticorpo 844 se liga a um outro epitopo correntemente desconhecido (vide Tabela 6). Conforme mostrado na Figura 5, ambas as composições de Anti-F(I) e F(II) foram mais potentes que Palivizumab com respeito à neutralização das cepas de RSV de ambos os subtipos.

A Figura 5 mostra também que a combinação de cinco anticorpos (anti-F(l)) pareceu mais potente que a combinação de onze anticorpos (AntiF(II)). A mistura de anti-F(l) contém alguns dos mais potentes anticorpos 5 individualmente neutralizadores de as especificidades de epitopos diferentes que têm sido até agora definidas. A mistura de anti-F(ll) contém os mesmos cinco anticorpos altamente potentes, mas contém também Iigantes adicionais para alguns dos epitopos definidos e os anticorpos incluídos também exibem uma faixa mais ampla de atividade de neutralização por si mesmo. É 10 também possível que a atividade dos anticorpos altamente potentes se torne diluída na combinação de anti-F(ll) devido à competição por ligação aos epitopos neutralizadores na proteína F. Contudo, já existem potencialmente outros efeitos que o efeito neutralizador associado a cada anticorpo individual, por exemplo, fagocitose aumentada, citotoxicidade celular dependente de 15 anticorpo (ADCC), efeitos anti-inflamatórios, ativação de complemento, e uma probabilidade diminuída de gerar mutantes de escape, quando considerados in vivo, este resultado não deve ser tomado como uma indicação que uma mistura de cinco é melhor que uma mistura de onze anticorpos quando usada in vivo.

Tanto os ensaios in vitro como as combinações de clones foram

refinados desde este experimento inicial e várias combinações de clones de anticorpos específicos de F que são altamente potentes em presença de complemento foram identificadas. As potências neutralizadoras, expressas como valores de EC50 (concentrações eficazes requeridas para induzir uma 25 redução de 50% no número de placas), de composição de anticorpos anti-F adicionais, estão listadas na Tabela 9. Independentemente do número exato de clones nas composições, a maioria das combinações testadas de anticorpos específicos de F é mais potente que o Palivizumab com respeito à neutralização de cepa de RSV do subtipo A.

Misturas de anticorpos anti-G

A capacidade das misturas de anticorpos anti-G de neutralizar as cepas de RSV do subtipo A foi testada suando a PRNT conforme descrição no Exemplo 1, seção j-2. Os valores de EC50 de as composições de anticorpos anti-G testadas estão listados na Tabela 9. A maioria das composições de dois anticorpos anti-G não exibiram uma capacidade acentuadamente marcada de neutralizar vírus em comparação com os anticorpos anti5 G individuais. Algumas combinações de dois ou três anticorpos anti-G nunca chegaram a 100% de neutralização do vírus, independente da concentração. Contudo, quando os anticorpos anti-G adicionais foram adicionados à composição, a potência aumentou possivelmente indicando um efeito de neutralização sinergístico entre os anticorpos anti-G. A Figura 7 mostra um exem10 pio do aumento da potência quando clones específicos de G múltiplos são combinados.

Misturas de anticorpos anti-F e anti-G

A capacidade das misturas de anticorpos de proteína F e proteína G anti-RSV de neutralizarem a cepa de RSV do subtipo B foi comparada 15 com o efeito de neutralização obtido usando-se o Palivizumab. A capacidade de neutralização foi avaliada usando tanto o ensaio de inibição de fusão por microneutralização conforme descrito no Exemplo 1, seção j- 4 como o ensaio de neutralização por redução de placas (Exemplo 1, seção j-2).

Inicialmente, a atividade neutralizadora de duas misturas de anticorpos, anti-F(l)G e anti-F(ll)G, foi medida no ensaio de inibição de fusão por microneutralização. Cada uma destas misturas contém os anticorpos anti-F da composição de anti-F(l) e anti-F(ll) descritos acima bem como os anticorpos anti-G obtidos dos clones 793, 796, 838, 841, 856 e 888, em que os anticorpos 793, 796 e 838 se ligam à região conservada da proteína G, 841 e 856 se ligam à GCRR do RSV do subtipo A e 888 se liga à GCRR de ambos os subtipos (vide Tabela 6). Conforme mostrado na Figura 6, ambas as composições de Anti-F(I)G e F(II)G foram mais potentes que o Palivizumab com respeito à neutralização da cepa B1 do RSV. Ainda, a atividade de neutralização das duas misturas foi mais ou menos igual. Assim, parece que quando os anticorpos anti-F são combinados com vários clones específicos da proteína G, a diferença de potência previamente observada entre as duas mistura de anticorpos anti-F é diminuída. Isso pode indicar um aumento geral da atividade de neutralização quando os anticorpos que reconhecem uma ampla faixa de antígenos e de epitopos no RSV são combinados.

Um grande número de combinações diferentes de ambos os anticorpos anti-F e anti-G foi desde então testado na PRNT em presença ou 5 ausência de complemento. Valores de EC50 obtidos por esse ensaio em presença de complemento ativo são apresentados na Tabela 9. Todas as composições testadas incluindo ambos os anticorpos anti-F e anti-G realmente neutralizaram RSV do subtipo Aea maioria destas são mais potentes que o Palivizumab.

Os resultados e resultados mostrados nas Tabelas 7 e 8 mos

tram também que os anticorpos com afinidades naturalmente altas poderiam ser repetidamente obtidos de doadores ser humanos usando a técnica de clonagem de anticorpo da presente invenção.

Tabela 9: Valores de EC50 das combinações dos anticorpos antíRSV contra RSV do subtipo A e do subtipo B. Os campos em branco indicam que a análise ainda não foi realizada. ND indica que um valor de EC5O não pode ser determinado na PRNT devido a uma atividade de neutralização muito baixa ou ausência dela.

Número da Anticorpos na composição Valor de EC50 (pg/mL) Long A2 18537 B1 1 810, 818, 819,825, 827 0,19 0,38 2 810, 818, 819, 825, 827, 831, 858, 0,34 863, 884, 894, 793, 796, 816, 838, 853, 856, 859, 888 3 810, 818, 825, 827, 884, 886, 793, 0,30 853, 868, 888 4 810, 818, 825, 827, 831, 858, 884, 0,19 886, 793, 796, 816, 853, 856, 868, 888 810, 818, 825, 827, 831, 858, 884, 0,21 886, 793, 853, 868, 888 6 810, 819, 825, 827, 831, 793, 853, 0,20 856, 858, 868 7 810, 811, 817, 819, 825, 827, 831, 0,18 838, 853, 856, 858, 859, 863, 868 Número da Valor de EC50 (pg/mL) Anticorpos na composição Long A2 18537 B1 8 800, 801, 811, 838, 853, 855, 859, (ND) 861, 880, 894, 736, 795, 796, 799 0,92* 9 810, 818, 825 0,14 0,03 0,29 810, 818, 819, 825, 827, 884 0,21 0,42 11 810, 818, 819, 825, 827, 884, 886 0,15 0,29 12 793, 816, 853, 856 0,06 13 793, 816, 853, 855, 856 0,03 0,0 0,86 3 14 793, 868, 888, 853, 856 0,34 793, 796, 818, 816, 838, 853, 855, 0,11 856, 859, 868, 888 16 810, 818, 827 0,11 0,21 17 810, 818, 825, 827, 858, 886 0,10 0,05 0,16 18 810, 818, 825, 827, 858, 886, 793, 0,04 0,06 0,15 816, 853, 855, 856 19 818, 825, 827, 858, 886, 793, 816, 0,06 853, 855, 856 810, 818, 819, 825, 827, 858, 793, 0,10 0,06 816, 853, 855, 856 21 810, 793, 816, 853, 855, 856 0,04 22 818, 825, 827, 831, 858, 886, 793, 0,06 816, 853, 855, 856 23 818, 825, 827, 831, 858, 819, 793, 0,06 0,03 816, 853, 855, 856 24 818, 827, 831, 858, 819, 793, 816, 0,06 0,04 853, 855, 856 810, 818, 819, 824, 825, 827, 858, 0,07 793, 816, 853, 855, 856 26 831, 818, 819, 824, 825, 827, 858, 0,08 793, 816, 853, 855, 856 27 831, 818, 819, 824, 827, 858, 793, 0,05 816, 853, 855, 856 28 810, 818, 824 0,03- 0,0 0,04 0,04 0,06 4 29 810, 824 0,05 818, 824 0,04 Número da Anticorpos na composição Valor de EC50 (pg/mL) Long A2 18537 B1 31 810,818 0,08- 0,11 32 824, 793, 816, 853, 855, 856 0,05 33 810, 818, 819, 824, 825, 827, 858, 0,03- 0,0 0,03 0,06 894, 793, 816, 853, 855, 856 0,07 6 34 810, 818, 819, 824, 825, 827, 894, 0,07 793, 816, 853, 855, 856 793,816 5,94 36 855,856 ND 37 793, 856 ND 38 793, 853 2,35 39 853, 856 0,21 40 793, 853, 856 2,84 41 793, 816, 853 1,97 42 853, 855, 856 0,25 43 793, 816, 853, 856 0,45 44 793, 853, 855 0,26 45 793, 853, 855, 856 0,16 46 816, 853, 855, 856 0,07 47 816, 856 0,06 48 816, 853 0,75 49 816, 853, 856 0,07 50 810, 818, 824, 816 0,09 51 810, 818, 824, 853 0,11 52 810, 818,824,856 0,10 53 810, 818,824,816,853 0,09 54 810, 818, 824, 816, 856 0,05 55 810, 818, 824, 853, 856 0,08 56 810, 818,824,816,853, 856 0,05 0,0 0,03 0,06 3- 0,0 5 Palivizumab (Synagis) 0,14 0,1 0,20 5 *valor da nova determinação Exemplo 4

Redução de cargas virais nos pulmões dos camundongos infectados com RSV.

A capacidade protetora in vivo de combinações de anticorpos purificados da invenção contra infecção por RSV foi demonstrada no modelo para ratos BALB/c (Taylor et al. 1984. Immunoiogy 52, 137-142; Mejias, et ai. 2005. Antimicrob. Agents Chemother. 49: 4700-4707), conforme descrito no exemplo 1, Seção k-1. Na tabela 10, dados com um experimento com três rpAb anti-RSV diferentes, consistindo em quantidades iguais de diferentes clones de anticorpos da invenção (descritos na tabela 9), são apresentados em comparação com dados de animais de controle não-infectados e animais tratados com placebo (PBS) do mesmo experimento. Cada grupo de tratamento continha 5 camundongos e as amostras foram obtidas no quinto dia pós-infecção, que se situa aproximadamente no pico de replicação viral neste modelo. Conforme é mostrado na Tabela 10, as combinações de rpAb reduzem eficazmente a carga viral em pelo menos uma ordem de magnitude quando administradas profilaticamente. Números de cópia são apresentados como médias ± desvio padrão. O número de cópias estava abaixo ou no limite de detecção desse ensaio, ou seja, 3,8 IogIO cópias de RNA/mL, para dois dos grupos de tratamento.

Tabela 10: Carga viral nos pulmões dos camundongos após pro

filaxia e o desafio com RSV.

Grupo de Tratamento Carga viral por RT-PCR Dados novos (Iog10 cópias de RNA/ml) Não-infectado Neqativo PBS 5,14 ±0,09 4,25 rpAb anti-RSV 18 (50 mq/kq) ND rpAb anti-RSV 18 (5 mq/kq) 4,61 ±0.22 3.64 rpAb anti-RSV 9 (50 mq/kq) ND rpAb anti-RSV 9 (5 mq/kq) Small 4.74 ± 0.38 3.82 rpAb anti-RSV 17 (50 mq/kq) 4,41 ± 0,14 3,04 rpAb anti-RSV 17 (5 mq/kq) Lar- 4,69 ±0,05 3,90 A seguir as amostras foram analisadas usando-se uma configuração de RT-PCR quantitativa diferente (descrita na seção k-1). Na Tabela 11a, dados com um experimento com quatro rpAb anti-RSV diferentes, consistindo em quantidades iguais de diferentes clones de anticorpos da invenção (descritos na Tabela 9) e do clone 810 sozinho são apresentados em comparação com dados de animais de controle não-infectados e animais 5 tratados com placebo (PBS) do mesmo experimento. Cada grupo de tratamento continha 5 camundongos e as amostras foram obtidas no quinto dia pós-infecção, que se situa aproximadamente no pico de replicação viral neste modelo. Conforme é mostrado na Tabela 11a, as combinações de rpAb reduzem eficazmente a carga viral em pelo menos uma ordem de magnitude 10 quando administradas profilaticamente a 25 mg/kg de peso corporal. Números de cópia são apresentados como médias ± desvio padrão.

Tabela 11a: Carga viral dos pulmões do camundongos após pro

filaxia e desafio com RSV.

Grupo de Tratamento (dose) Carga viral por RT-PCR (Iog10 cópias de RNA/ml) Não-infectado Neqativa PBS 4,11±0,12 rpAb anti-RSV 18 (25 mq/kq) 2,74±0.16 rpAb anti-RSV 18 (5 mq/kq) 3.40±0.09 rpAb anti-RSV 9 (25 mq/kq) 2,95±0,19 rpAb anti-RSV 9 (5 mq/kq) 3.56±0.31 roAb anti-RSV 17 (25 mq/kq) 2.81±0.29 rpAb anti-RSV 17 (5 mq/kq) 3,39±0,12 rpAb anti-RSV 13 (25 mq/kq) 3,02±0,33 rpAb anti-RSV 13 (5 mq/kq) 3,34±0,26 Clone 810 (25 mq/kq) 3,03±0,16 Clone 810 (5 mq/kq) 3,37±0.22 Na Tabela 11b, dados de um segundo estudo com três rpAb an

ti-RSV diferentes, consistindo em quantidades iguais de diferentes clones de anticorpos da invenção (descritos na Tabela 9) e do clone 824 sozinho são apresentados em comparação com dados de animais de controle nãoinfectados e animais tratados com placebo (PBS) e animais tratados com 20 Palivizumab (Synagsis) do mesmo experimento. Cada grupo de tratamento continha 5 camundongos e as amostras foram obtidas no quinto dia pósinfecção. Números de cópia são apresentados como médias ± desvio padrão. Na Tabela 11c, dados de um terceiro estudo com rpAb anti-RSV 33, consistindo em quantidades iguais de diferentes clones de anticorpos da invenção (descritos na Tabela 9) e do clone 824 sozinho são apresentados em comparação com dados de animais de controle não-infectados e animais 5 tratados com placebo (PBS) e animais tratados com Palivizumab (Synagsis) do mesmo experimento. Cada grupo de tratamento exceto o último continha 5 camundongos e as amostras foram obtidas no quinto dia pós-infecção. Um camundongo foi removido de cada grupo tratado com rpAb anti-RSV 33 a

15, 5 e 1,5 mg/kg de peso corporal, já que descobriu-se que eles nunca tiveram o anticorpo injetado. Números de cópia são apresentados como médias ± desvio padrão.

Em todos os três estudos, há uma redução estatisticamente significativa do número de cópias do RNA de RSV em grupos tratados com anticorpos se comparados ao controle tratado com placebo (p<0,05; teste t 15 homoscedástico). No segundo estudo, a carga viral nos grupos tratados com os anticorpos da invenção é significativamente menor que a dos grupos tratados com Synagis em doses correspondentes (Tabela 11b). No terceiro estudo, a carga viral é significativamente menor nos grupos tratados com o rpAb anti-RSV 33 que nos grupos tratados com Synagis em todas as doses 20 testadas (Tabela 11 c).

Tabela 11b: Cargas virais nos pulmões dos camundongos após

profilaxia e desafio com RSV.

Grupo de Tratamento (dose) Carga viral por RT-PCR (Iog10 cópias de RNA/ng de RNA total) Não-infectado Neqativa PBS 4.22±0.20 Svnaqis (15 mq/kq) 3,68±0,25 Svnaqis (3 mq/kq) 3.83±0,12 rpAb anti-RSV 28 (15 mq/kq) 2,96±0,19 rpAb anti-RSV 28 (3 mq/kq) 3.32±0.23 rpAb anti-RSV 33 (15 mq/kq) 2,9510.30 rpAb anti-RSV 33 (3 mq/kq) 3.66+0.07 rpAb anti-RSV 56 (15 mq/kq) 2.6610.18 rpAb anti-RSV 56 (3 mq/kq) 3.25+0.38 Clone 824 (15 mq/kq) 2.51+0.28 Clone 824 (3 mq/kq) 3.09+0.18 Tabela 11c: Cargas virais nos pulmões dos camundongos após

profilaxia e desafio com RSV. Os asteriscos indicam que os grupos continham apenas quatro animais. _

Grupo de Tratamento (dose) Carga viral por RT-PCR (Iog10 cópias de RNA/ng de RNA total) Não-infectado Negativa PBS 4,13±0,17 Synagis (45 mg/kg) 3,56±0,22 Synagis (15 mg/kg) 3,60±0,27 Synagis (5 mg/kg) 3,77±0,14 Synagis (1.5 mg/kg) 3,86±0,12 rpAb anti-RSV 33 (45 mg/kg) 2,38±0,18 rpAb anti-RSV 33 (15 mg/kg)* 2,70±0,18 rpAb anti-RSV 33 (5 mg/kg)* 3,15±0,24 rpAb anti-RSV 33 (1.5 mg/kg)* 3,53±0,12 Finalmente, Ta tabela 11 d, dados de um estudo de longo prazo

com rpAb anti-RSV 33, consistindo em quantidades iguais de clones de anticorpos diferentes constituindo rpAB 33 (descritos na Tabela 9), são apresentados em comparação com dados de animais de controle não-infectados e animais tratados com placebo (PBS) do mesmo experimento. Cada grupo de tratamento continha 5 camundongos e as amostras foram obtidas nos dias 5, 10 27 e 69 após a infecção. Números de cópias são apresentados como médias ± desvio padrão. Devido a números de cópias muito baixos no dia 69 após a infecção, o número de cópias foi calculado por mL de tecido pulmonar. O limite de detecção deste ensaio é de aproximadamente 2 IogIO de cópias de RNA/mL de tecido pulmonar homogeneizado.

Em todos os três pontos temporais, há uma redução estatistica

mente significativa do número de cópias do RNA de RSV em grupos tratados com anticorpos se comparados ao controle tratado com placebo (p<0,01; teste t homoscedástico) (Tabela 11 d).

Tabela 11 d: Cargas virais nos pulmões dos camundongos após profilaxia e desafio com RSV. Cada grupo de tratamento continha 5 animais por ponto temporal. Grupo de Tratamento (do¬ Carga viral por RT-PCR se) (Iog10 cópias de RNA/mL de pulmão homo¬ geneizado) Dia 5 Dia 27 Dia 69 Não-infectado Negativa Negativa Negativa PBS 9,36±0,15 4,52±0,22 4,05±0,18 rpAb 33 anti-RSV(45 7,51±0,22 3,22±0,22 2,68±0,41 mg/kg) Níveis de citoquinas e quimioquinas em amostras pulmonares

dos camundongos infectados com RSV.

Amostras pulmonares de um estudo piloto de profilaxia em ca5 mundongos foram analisadas através de um imunoensaio em multiplex comercial, para que fosse determinado os níveis de diferentes citoquinas e quimioquinas após infecção por RSV e profilaxia com anticorpos com rpAb 18 (Tabela 9), conforme descrito no Exemplo 1, Seção k-1. Amostras de animais não-infectados e não-tratados também foram analisadas para que se 10 obtivessem dados normativos para o camundongo BALB/c. Todas as amostras foram obtidas no quinto dia pós-infecção. Os dados são apresentados como médias ± desvio padrão.

A análise mostrou (tabela 12) que os níveis de algumas citoquinas e quimioquinas que foram indicadas como sendo marcadores importantes de uma infecção por RSV e a resposta inflamatória subsequente, tanto em ser humanos quanto em camundongos, incluindo interferon (IFN)-y, interIeucina (IL)-I β, IL-4, IL-6, IL-8 (KC/GROa), IL-10, proteína inflamatória de macrófago (MIP)-Ia, regulados a partir da ativação de células T normais expressas e secretadas (RANTES, CCL5) e fator de necrose tumoral (TNF)- α foram elevados nos pulmões dos animais tratados com placebo, enquanto que os pulmões tratados com aproximadamente 50 mg/kg de rpAb tinham níveis mais ou menos iguais aos dos animais de controle não-infectados. Resultados similares também foram obtidos com outras combinações de rpAb anti-RSV. Deve ser notado que camundongos não possuem um homólogo de corte claro para IL-8, mas eles possuem um homólogo funcional para a GROa humana (de função similar a IL-8) denominado KC. A cinética da resposta inflamatória e os efeitos de resposta a doses de profilaxia com anticorpos permanecem para serem investigados.

Tabela 12: Níveis de citoquinas e quimioquinas em tecido pul

monar de camundonc os infectados com RSV. Nível na amostra de Camundongos Camundongos tra¬ Camundongos tra¬ tecido não-infectados tados com placebo tados com rpAb (pg/mL) de controle anti-RSV IL-Ιβ 270±71 570+100 310+140 IL-4 7,7±4,7 26+4,6 14+8,5 IL-6 6,4±2,6 22112 8,213,8 IL-10 120±17 320+58 170141 IFN-γ 20±7,6 420188 81172 KC/GROa (IL-8) 51138 290+83 94+99 MIP-Ia (CCL3) 39+16 9401170 . 160+110 RANTES (CCL5) 60+28 380+32 140+66 TNF-a 18+6,1 95110 38+25 Efeito da profilaxia com anticorpos na patologia pulmonar e infil

tração celular em camundongos infectados com RSV.

As amostras histopatológicas de tecido pulmonar dos estudos de longo prazo foram examinadas em busca de sinais de inflamação e pontuação classificadas de acordo com o sistema descrito no Exemplo 1, Seção k10 1. Cada grupo de tratamento continha 5 camundongos e as amostras foram obtidas nos dias 5, 27 e 69 após infecção. Um camundongo foi removido do grupo e tratado com rpAb anti-RSV 33 e morto no quinto dia pós-infecção já que descobriu-se que anticorpos não haviam sido injetados nele. Os dados são apresentados como médias ± desvio padrão. Cinco dias após a infecção 15 por RSV, houve um aumento significativo na patologia pulmonar nos camundongos tratados com placebo quando comparados aos camundongos de controle não-infectados (p<0,05; teste t homeoscedástico; tabela 13). Os sinais de inflamação diminuíram com o tempo, mas ainda eram significativos se comparados aos camundongos de controle não-infectados no dia 69 após 20 a infecção (p<0,0001). A patologia pulmonar foi caracterizada por acumulações peribronquiolares e perivasculares de linfócitos e linfócitos de alveolite nos dias 27 e 69 após a infecção. Por outro lado, houve pouca ou nenhuma acumulação de linfóides nos pulmões de camundongos tratados com anticorpos e os pulmões ficaram similares àqueles dos camundongos nãoinfectados de controle. A patologia ,pulmonar nos camundongos tratados com placebo também foi significativamente maior que nos camundongos 5 tratados com anticorpos (p<0,02 no dia 5, <0,03 no dia 27 e <0,0001 no dia 69).

Tabela 13: Pontuação da patologia pulmonar dos camundongos

após a profilaxia e o desafio com RSV. O asterisco indica grupos que continham somente quatro animais._

Grupo de tratamento (do¬ Pontuação da patologia pulmonar (Grase) vidade x Preva ência) Dia 5 Dia 27 Dia 69 Não-infectados 0 0,4±0,5 0 PBS 10,8±4,3 2,8±1,1 2,6±0,5 rpAb 33 anti-RSV(45 mg/kg) 3±0,8* 0,6±0,9 0,2±0,4 10

As acumulações de linfóides perivasculares e peribronquiolares nos pulmões de camundongos infectados com RSV, 28 e 70 dias após a infecção, correlacionaram-se com os valores aumentados de linfócitos em BAL. Como mostra a Tabela 14, houve um aumento significativo do número 15 de células inflamatórias em BAL de camundongos tratados com placebo se comparado aos camundongos não-infectados de controle nos dias 5, 27 e 69 após a infecção (p<0,002; p<0,03 e p<0,03, respectivamente). A resposta inflamatória pulmonar em camundongos tratados com rpAb anti-RSV 33 foi significativamente menor que aquela de camundongos tratados com placebo 20 em todos os pontos temporais (p<0,003 no dia 5; p<0,03 no dia 27; p<0,02 no dia 69, respectivamente). Os grupos são os mesmos da patologia pulmonar descrita acima e os dados são apresentados como médias ± desvio padrão.

Tabela 14: Contagem de leucócitos em BAL após profilaxia e desafio com RSV. Os asteriscos indicam grupos que continham somente quatro animais. Grupo de tratamento (dose) Contagem celu ar em BAL (x105) Dia 5 Dia 27 Dia 69 Não-infectados 1,1±0,2 1,4±0,3 1,0±0,1 PBS 7,2±2,0 3,0±1,0 1,8±0,5 rpAb anti-RSV 33 (45 mg/kg) 1,8±0,5* 1,5±0,3 0,9±0,1 Farmacocinética de rpAb ser humano em camundongos.

O perfil farmacocinético das combinações de anticorpos purificados da invenção foi determinado em camundongos BALB/c como descrito no 5 Exemplo 1, Seção I. Dois rpAb anti-RSV 33 e rpAb anti-RSV 56 diferentes (vide Tabela 9), consistindo em quantidades iguais de clones de anticorpos diferentes da invenção foram investigados. Cada grupo de tratamento consistiu em 15 camundongos. Os níveis de IgG ser humano em amostras de soro e homogeneizado de pulmão correspondem ao nível de rpAb anti-RSV 10 presente em pontos temporais específicos.

A Figura 8 mostra os perfis farmacocinéticos no soro de rpAb anti-RSV 33 e rpAb anti-RSV 56 em uma dose de anticorpos de 15 mg/kg. Usando esses dados, alguns parâmetros foram determinados, os quais são resumidos na Tabela 15. As duas diferentes composições de rpAb anti-RSV 15 possuem perfis farmacocinéticos similares com meia vida (T1/2) de 11 dias. Essas descobertas foram verificadas usando-se uma dosagem de 37,5 mg/kg.

Tabela 15. Dados farmacocinéticos do soro obtido em camun

dongos.

Cmax Tmax (horas) AUC(0-694)* Ty2 (dias) (mg/mL) rpAb anti-RSV rpAb 33 15,4 25 51 11,1 rpAb anti-RSV 56 17,2 25 52 11,0 *Área sob a curva entre tempo = 0 hora e tempo = 694 horas.

Como o alvo primário do RSV durante a infecção é o tecido pulmonar, a presença de rpAb anti-RSV neste tecido é vital para eficácia. Para determinar a distribuição de rpAb anti-RSV 33 e rpAb anti-RSV 56 (de acordo com a Tabela 9) no tecido pulmonar, os níveis de IgG foram medidos em homogeneizados de pulmão nos dias 1 (25 horas), 6 e 29 após o tratamento com anticorpos. Em todos os pontos temporais medidos, descobriu-se que os níveis de rpAb anti-RSV 33 e rpAb anti-RSV 56 no tecido pulmonar eram 5 quase idênticos à máxima concentração média de IgGI, cerca de 0,006 mg/mL no primeiro dia após o tratamento. Nos dias 6 e 29, os níveis haviam diminuído. Entretanto, IgGI ainda podia ser medido no tecido pulmonar no dia 29 após o tratamento com anticorpos. Essas descobertas mostram não só que as composições de rpAb anti-RSV 33 e rpAb anti-RSV 56 estão pre10 sentes brevemente após o tratamento, mas também que anticorpos podem ser encontrados em níveis detectáveis até 29 dias após o tratamento.

Claims

1. Anticorpo anti-RSV capaz de competir na ligação com o anticorpo 824 como definido aqui, ou.com um fragmento Fab baseado neste.

2. Anticorpo anti-RSV compreendendo uma CDRH3 de fórmula geral: CAX1X2X3X4X5X6PX7X8X9X10X11W em que Xi a Xn são individualmente selecionados dos grupos de aminoácidos listados abaixo: XI = R ou K; X2 = D, E, N ou Q; X3 = S, T, G ou A; X4 = S, T, G ou A; X5 = N, Q, D ou E; X6 = W, Y, F ou H; X7 = A, G, V, ou S; X8 = G, A, V, ou S; X9 = Y, F, W ou H; X10 = E ou D; e XII = D, E, N ou Q; e uma CDRL3 descrita pela seguinte fórmula: CX1X2X3X4X5X6PX7TF em que X1 to X7 são individualmente selecionados dos grupos de aminoácidos listados abaixo: X1 = Q ou H; X2 = Q, E ou H; X3 = F, Y, W ou H; X4 = N1QouH; X5 = T1 S, G ou A; X6 = Y, F1 W ou H; e X7 = F1 Y1 W ou H.

3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo as regiões de CDR1 e CDR2 do par de Vh e Vl do anticorpo 824 como estabelecido nas SEQ ID NOs: 232, 317, 487, e 572, em que até 2 aminoácidos foram trocados se comparado às ditas SEQ ID NOs.

4. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo a região CDR3 de fórmula CARDSSNWPAGYEDW (SEQ ID NO: 402), e uma região CDRL3 de fórmula CQQFNTYPFTF (SEQ ID NO: 657).

5. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo a região Vh (SEQ ID NO:9) do anticorpo 824.

6. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo a região Vl (aminoácidos 1 a 107 de SEQ ID NO: 107) do anticorpo 824.

7. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo a cadeia leve (SEQ ID N0:107) do anticorpo 824.

8. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, compreendendo Ch como definido em SEQ ID NO:178.

9. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 2, tendo a especificidade de ligação do anticorpo 824.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, capaz de neutralizar os subtipos A e B de RSV em um ensaio de neutralização viral.

11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, capaz de fornecer uma redução significativa da carga do vírus RSV nos pulmões de um mamífero infectado com RSV.

12. Composição de anticorpos compreendendo os anticorpos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um ou mais anticorpos anti-RSV adicionais.

13. Composição de anticorpos, de acordo com a reivindicação 12, em que os anticorpos anti-RSV adicionais são escolhidos do grupo que consiste em anticorpos ser humanos, anticorpos humanizados e anticorpos de ser humanos-camundongos quiméricos.

14. Composição de anticorpos, de acordo com a reivindicação 12, em que os anticorpos anti-RSV adicionais são escolhidos do grupo que consiste em moléculas de anticorpos descritas aqui na Tabela 6, ou um fragmento especificamente Iigante de tal molécula de anticorpo ou um anticorpo sintético ou semissintético análogo, tal análogo ou fragmento Iigante compreendendo pelo menos uma das regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de tal molécula de anticorpo isolada, exceto um anticorpo contendo as CDRs do clone 824.

15. Composição de anticorpos, compreendendo membros distintos que compreendem regiões CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve e pesada selecionadas do grupo de pares de Vh e Vl listados na Tabela 6, em que os membros distintos são os membros distintos de uma das composições de anticorpos 2 a 56, na Tabela 9, aqui.

16. Composição de anticorpos, de acordo com a reivindicação15, capaz de neutralizar um RSV de subtipo A em um ensaio de neutralização viral.

17. Composição de anticorpos de acordo com a reivindicaçã15, capaz de neutralizar um RSV de subtipo B em um ensaio de neutralização viral.

18. Composição de anticorpos de acordo com a reivindicação15, em que os membros distintos são os membros distintos de uma das composições de anticorpos 2, 9,13,17, 18, 28, 33 e 56 da Tabela 9.

19. Método para prevenir, tratar ou atenuar um ou mais sintomas associados a uma infecção por RSV em um mamífero, compreendendo administrar uma dose eficaz de um anticorpo anti-RSV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou uma composição de anticorpos como definida em qualquer uma das reivindicações 12 a 18 a tal mamífero.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que uma quantidade eficaz está entre 0,1 e 50 mg de anticorpo por kg de peso corporal.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em que os anticorpos são administrados pelo menos 1 vez por ano.

22. Método, de acordo com a reivindicação 20, em que os anticorpos são administrados em intervalos regulares durante o período do ano em que há um maior risco de se atrair uma infecção por RSV.

23. Método, de acordo com a reivindicação 21, em que os intervalos regulares são semanais, quinzenais, mensais ou bimestrais.

24. Uso de um anticorpo policlonal recombinante anti-RSV como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou composição de anticorpos como definida em qualquer umas das reivindicações 12 a 18 para preparar uma composição para tratar, atenuar ou prevenir um ou mais sintomas associados à infecção por RSV em um mamífero.

25. Fragmento de ácido nucleico isolado que codifica a seqüência de aminoácidos de pelo menos uma CDR de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 9.

26. Fragmento de ácido nucleico isolado que codifica as seqüências de CDR de uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada estabelecida na SEQ ID NO: 19.

27. Fragmento de ácido nucleico isolado que codifica as seqüências de CDR de uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada estabelecida na SEQ ID NO: 107.

28. Fragmento de ácido nucleico isolado que codifica as sequências de CDR de uma seqüência de aminoácidos de cadeia pesada estabelecida na SEQ ID NO:19 e as seqüências de aminoácidos de cadeia pesada acompanhantes que possuem SEQ ID NO: 107.

29. Fragmento de ácido nucleico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 28, que inclui codificar as seqüências compreendidas na SEQ ID NO: 63 e/ou 151.

30. Vetor, compreendendo o fragmento de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 29.

31. Vetor, de acordo com a reivindicação 30, capaz de replicação autônoma.

32. Vetor, de acordo com a reivindicação 30 ou 31, selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, um fago, um cosmídeo, um minicromossomo e um vírus.

33. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 32, compreendendo, - na direção 5'—>3' e no ligamento operacional, pelo menos um promotor para acionar a expressão de um primeiro fragmento de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 29, que codifica pelo menos uma CDR de cadeia leve junto com as regiões de estrutura necessárias, opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica regiões constantes e, opcionalmente, uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um primeiro terminador, e/ou - na direção 5'-»3' e no ligamento operacional, pelo menos um promotor para acionar a expressão de um segundo fragmento de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 29, que codifica pelo menos uma CDR de cadeia pesada junto com as regiões de estruturas necessárias, opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um peptídeo líder, o dito fragmento de ácido nucleico, opcionalmente uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica regiões constantes e, opcionalmente, uma seqüência de ácidos nucleicos que codifica um segundo terminador.

34. Vetor, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a33, que, ao ser introduzido em uma célula hospedeira, integra-se ao genoma da célula hospedeira.

35. Célula transformada que carrega o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 30 a 34.

36. Linhagem celular estável, a qual carrega o vetor como definido em qualquer uma das reivindicações 30 e 34 e a qual expressa um fragmento de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 25 a 29, e a qual opcionalmente secreta ou carrega seu produto de expressão recombinante em sua superfície.