ES2375529T3

ES2375529T3 - Procedimiento para unir secuencias de interés.

Info

Publication number: ES2375529T3
Application number: ES08152066T
Authority: ES
Inventors: Martin B. Oleksiewicz; Lars S. Nielsen; Peter S. Andersen; Margit H. Hansen
Original assignee: Symphogen AS
Current assignee: Symphogen AS
Priority date: 2003-09-18
Filing date: 2004-09-17
Publication date: 2012-03-01
Anticipated expiration: 2024-09-17
Also published as: NZ545936A; US20070141048A1; TW200519201A; JP2007505611A; BRPI0414282A; WO2005042774A2; PL1921144T3; EP1516929A3; CN1856571B; EP1921144B1; SI1921144T1; CA2539576A1; DE602004012299D1; EP1921144A3; PT1670912E; WO2005042774A3; CN102199593A; PL1670912T3; ATE388228T1; US20100310558A1

Abstract

Una biblioteca de pares análogos que comprende secuencias de ácido nucleico unidas que codifican la región variable, en la que cada par análogo es un par original de secuencias de ácido nucleico no contiguas amplificadas a partir de un único linfocito, estando presente la biblioteca en una pluralidad de recipientes en la que cada recipiente contiene un único par análogo.

Description

Procedimiento para unir secuencias de interés

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de amplificación molecular múltiplex que puede unir secuencias de nucleótidos de interés en relación con la amplificación, en particular la reacción en cadena de la polimerasa (PCR múltiplex). El procedimiento es particularmente ventajoso para la generación de bibliotecas de pares análogos de secuencias que codifican regiones variables a partir de inmunoglobulinas.

Antecedentes de la invención

Las proteínas de unión a antígeno implicadas en la respuesta inmunitaria están presentes en mamíferos como grandes repertorios policlonales que representan una amplia diversidad de especificidades de unión. Esta diversidad se genera mediante la transposición de secuencias génicas que codifican regiones variables de estas proteínas de unión. Tales proteínas de unión a regiones variables incluyen formas solubles y unidas a membrana del receptor de las células B (también conocidas como inmunoglobulinas o anticuerpos) y receptores de células T (RcT) unidos a membrana. Con respecto a las inmunoglobulinas, su afinidad se potencia posteriormente al reconocimiento de un antígeno por un receptor de antígeno de células B, a través de un proceso denominado maduración de la afinidad que implica ciclos de hipermutación somática de estos genes variables.

De manera destacada, las inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas, tales como fragmentos Fab, fragmentos Fv y moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), se han sometido a clonación y expresión recombinante. Sin embargo, todas las otras proteínas de unión a la región variable en principio también pueden clonarse y expresarse usando los mismos conceptos que para los anticuerpos.

Enfoques conocidos para aislar anticuerpos con una especificidad de unión deseada implican de la manera más frecuente la generación de hibridomas a partir de huéspedes inmunizados seguido por la exploración para seleccionar clones específicos o implican la generación de bibliotecas de expresión combinatorias en E. coli compuesta de dominios variables de inmunoglobulinas, que se enriquecen posteriormente usando técnicas tales como, por ejemplo presentación en fago.

La restricción principal en el uso de la tecnología de hibridoma para preparar anticuerpos terapéuticos es la ausencia de un linfoma humano adecuado como componentes de fusión para los linfocitos B humanos. Los heterohibridomas (es decir, fusión de células B humanas con linfomas de ratón) son notoriamente inestables y por tanto rara vez conducen a líneas celulares adecuadas para fines de producción. Las células B humanas inmortalizadas a través de la infección con el virus Epstein-Barr muestran problemas similares de inestabilidad. La ausencia de metodología celular sólida para preparar anticuerpos humanos para tratamiento puede compensarse con ventajas más recientes en biología molecular.

El uso de bibliotecas combinatorias y presentación en fago permite la generación de grandes repertorios de clones de anticuerpos con una posible diversidad en exceso de 1010. A partir de esto puede realizarse una selección de repertorio para la unión a una diana específica, generando de ese modo una subbiblioteca. Esta subbiblioteca puede usarse para generar anticuerpos monoclonales o bien policlonales. Las secuencias que codifican la región variable (por ejemplo las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas) que constituyen la biblioteca pueden amplificarse a partir de linfocitos, células plasmáticas, hibridomas o cualquier otra población de células que expresa inmunoglobulinas. Las tecnologías actuales para generar bibliotecas combinatorias implican el aislamiento separado de las secuencias que codifican la región variable a partir de una población de células. Por tanto, se perderá el apareamiento original de, por ejemplo, las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas. Más bien, en una biblioteca combinatoria, dichas secuencias están apareadas aleatoriamente y las combinaciones originales de estas secuencias variables sólo se producirán por casualidad. Por tanto, con el fin de aislar secuencias que codifican la región variable responsables de una especificidad de unión deseada, es necesaria una cantidad considerable de exploración. Normalmente esto se realiza en combinación con procedimientos para enriquecer clones que muestran una especificidad deseada, tales como presentación en ribosoma o presentación en fago. Incluso entonces, la diversidad conseguida podría no ser lo suficientemente grande para aislar pares de secuencias que codifican la región variable dando origen a proteínas de unión de alta afinidad similar a las encontradas en las células originales. Además, los procedimientos de enriquecimiento usados normalmente para seleccionar bibliotecas combinatorias introducen un gran error sistemático por ejemplo para polipéptidos de baja toxicidad particular en E. coli, un plegado eficaz, constantes de disociación lentas, u otros parámetros dependientes del sistema, que reducen la diversidad de la biblioteca incluso más. Además, los clones derivados de tales bibliotecas combinatorias serán más propensos a producir proteínas de unión con reactividad cruzada frente a autoantígenos porque como pares, al contrario que los pares originales (denominados a continuación en el presente documento pares análogos), nunca han pasado la selección negativa in vivo frente a autoantígenos, tal como es el caso de los receptores de linfocitos B y T durante las fases particulares de su desarrollo. Por tanto, la clonación de pares originales de las secuencias que codifican la región variable es un enfoque deseable. Además, se espera que la frecuencia de clones que muestran una especificidad de unión deseada sea considerablemente superior dentro de una biblioteca de pares análogos, que en una biblioteca combinatoria convencional, particularmente si las células de material de partida se derivan de un donante con alta frecuencia de células que codifican pares de unión específica, por ejemplo donantes inmunitarios o inmunizados. Se cumple que el tamaño de una biblioteca de pares análogos no necesitará ser tan grande como una biblioteca combinatoria: una biblioteca de pares análogos de tamaño de 104 clones a 105 clones o incluso tan pequeña como de 102 clones a 103 clones derivada de un donante con una respuesta inmunitaria continua relevante, podría ser suficiente con el fin de obtener proteínas de unión que representan una amplia diversidad de especificidades de unión.

Con el fin de generar bibliotecas de pares análogos, se requiere la unión de las secuencias que codifican la región variable derivadas de la misma célula. Actualmente, se han descrito dos enfoques diferentes que pueden conseguir apareamiento análogo de secuencias que codifican la región variable.

La PCR en célula es un enfoque en el que una población de células se fija y permeabiliza, seguido por la unión en célula de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas. Esta unión puede realizarse mediante RT-PCR de extensión por solapamiento (documento WO 93/03151) o mediante recombinación (Chapal, N. y col. 1997 BioTechniques 23, 518-524). El proceso de amplificación según se describe en estas publicaciones es un proceso de tres o cuatro etapas que consiste en i) transcripción inversa que usa cebadores de región constante que generan ADNc de inmunoglobulinas, ii) amplificación por PCR de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y pesada que usa conjuntos de cebadores que contienen sitios de recombinación o bien de diseño de extensión por solapamiento, iii) unión mediante recombinación, si se elige este enfoque, iv) PCR anidada de los productos que generan sitios de restricción para la clonación. Puesto que las células se permeabilizan existe un riesgo considerable de que los productos de amplificación pudieran salirse de las células, introduciendo de ese modo aleatorizaciones de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada, dando como resultado la pérdida del apareamiento análogo. Por tanto, el procedimiento incluye etapas de lavado tras cada reacción que hace el proceso laborioso y reduce la eficacia de las reacciones.

De manera más general, la PCR en célula es notoriamente ineficaz, dando como resultado baja sensibilidad. Por consiguiente, la técnica de unión por PCR en célula no se ha usado nunca de manera generalizada y de hecho el estudio original no se ha repetido nunca de manera fidedigna de modo que pueda usarse para verificar que la unión se produce realmente dentro de la célula. Sin embargo, esto es absolutamente crucial para evitar aleatorizaciones de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada e interrumpiendo de ese modo los pares análogos.

Un enfoque en célula diferente se describe en el documento WO 01/92291. Este enfoque se basa en corte y empalme en trans de ARN, y consigue la unión de ARNm que codifica VH y VL dentro de la célula. Este enfoque requiere la presencia de un constructo de ADN que conduce al corte y empalme en trans dentro de las células.

La PCR de célula individual es un enfoque diferente para conseguir apareamiento análogo de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada (véase, por ejemplo, Coronella,

J.A. y col. 2000 Nucleic Acids Res. 28, E85; Wang, X., y col. 2000 J. Immunol. Methods 20, 217-225). En estas publicaciones una población de células que expresan inmunoglobulinas se distribuyen diluyendo hasta una densidad de una célula por reacción, eliminando de ese modo aleatorizaciones de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada durante el proceso de clonación. Básicamente, el proceso descrito es un procedimiento de tres a cuatro etapas que consiste en i) transcripción inversa que usa cebadores de región constante, hexámeros aleatorios u oligo-dT que generan ADNc, ii) fraccionamiento del producto de ADNc en varios tubos y realización de amplificación por PCR en las secuencias que codifican la cadena variable individuales (en tubos separados) con conjuntos de cebadores que contienen sitios de restricción para la clonación, iii) PCR anidada de los productos que generan sitios de restricción para la clonación (opcionalmente) y iv) la unión de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de los tubos separados clonándolas dentro de un vector apropiador, que en sí mismo es un proceso de múltiples etapas.

En seres humanos existen dos tipos de cadenas ligeras: lambda (A) y kappa (K). Esto significa que con el ADNc generado a partir de cada célula individual deben realizarse al menos tres reacciones de PCR separadas seguidas por análisis y clonación de los fragmentos apropiados dentro de un único vector para conseguir el apareamiento análogo. Por tanto, el enfoque de PCR en célula individual según lo descrito requiere un gran número de manipulaciones para generar una biblioteca de pares análogos. Aunque una biblioteca de pares análogos no necesita ser tan grande como una biblioteca combinatoria con el fin de obtener proteínas de unión que representen una amplia diversidad de especificidades de unión, todavía sería una tarea laboriosa generar una biblioteca de, por ejemplo, 104 clones a 105 clones mediante el enfoque de PCR en célula individual descrito. Además, el gran número de manipulaciones aumenta enormemente el riesgo de contaminación y error humano.

El documento WO 01/89563 divulga una composición farmacéutica para tratar alergia que comprende un anticuerpo policlonal recombinante o una mezcla de diferentes anticuerpos monoclonales capaces de reaccionar con o unirse a un alérgeno.

El documento WO 95/20401 divulga procedimientos para producir bibliotecas de anticuerpos policlonales usando el procedimiento de PCR en célula tratado anteriormente.

Con el fin de obtener proteínas de unión de alta afinidad correspondientes a las afinidades observadas normalmente durante una respuesta inmunitaria, el apareamiento análogo de las secuencias de la región variable en asociación con su amplificación es sumamente ventajoso. Para generar una biblioteca de gran diversidad es necesario tener una técnica de clonación que pueda ajustarse a un formato de alta resolución y en el que el riesgo de contaminación y aleatorización sea mínimo.

De la misma manera se desea una reducción del número de etapas de clonación que permiten la generación de bibliotecas combinatorias que van a ajustarse a un formato de alta resolución.

Descripción de la aportación

La presente invención proporciona bibliotecas de pares análogos que comprenden secuencias de ácidos nucleicos unidas que codifican regiones variables amplificadas a partir de un único linfocito.

Descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama que ilustra los diferentes tipos de colas de extensión por solapamiento. La línea en negrita corresponde a una parte específica de gen del cebador y la línea normal corresponde a la cola de solapamiento. Las barras verticales ilustran regiones complementarias. Los cebadores facilitan la unión de dos secuencias de nucleótidos de interés. La figura 1 (I) ilustra dos variedades del tipo I de colas de extensión por solapamiento en las que sólo solapan las colas de extensión, completamente o bien parcialmente; la figura 1 (II) ilustra el tipo II de colas de extensión por solapamiento en las que algunos de los 5’-nucleótidos de la primera cola de extensión del cebador son complementarios a la parte específica de gen del cebador adyacente; la figura 1 (III) ilustra el tipo III de colas de extensión por solapamiento en las que las colas de extensión por solapamiento enteras son complementarias a la región específica de gen del cebador adyacente.

La figura 2 es un diagrama que muestra una visión esquemática de una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que puede aplicarse en la unión de secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulinas. El ADNc que codifica la cadena ligera (LC) y la región variable de cadena pesada (VH) que van a unirse se ilustran como tubos con la indicación de sus extremos en 5’ y 3’ de la hebra en sentido correcto así como el tamaño esperado del producto amplificado. Los conjuntos de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex usados para amplificar la secuencia codificante se ilustran mediante las flechas. Las colas de flechas dobladas con proyecciones en 5’ discontinuas ilustran las colas de clonación. Las colas de extensión por solapamiento están en negrita. Los sitios de restricción presentes en las colas se nombran en relación con la cola. El número total de cebadores en la mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex es dieciséis, distribuidos sobre los cebadores externos que comprenden un cebador CKy otro CH1 y los cebadores de extensión por solapamiento que comprenden seis cebadores VL y ocho VH. El cebador CH1 se aparea con el extremo 5’ del dominio 1 constante de cadena pesada. Se espera que el producto resultante de la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex sea de aproximadamente 1070 pb que constituye la cadena ligera kappa entera compuesta por la región constante, el gen de unión y el gen variable (CK + JL + VL) y la región variable de cadena pesada, compuesta por el gen variable, el segmento de diversidad y el gen de unión (VH + D + JH). 5’ y 3’ indica la dirección del marco de lectura abierto. Sólo una pequeña parte de la secuencia que codifica la región CH1 se amplifica mediante esta mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex, porque la posición de apareamiento del cebador CH1 está próxima a la región J de cadena pesada.

La figura 3 es una serie de diagramas que ilustran la diferente dirección de unión de los productos que puede obtenerse dependiendo de qué cebadores están equipados con la cola de unión. La zona en negro ilustra la región de solapamiento. 5’ y 3’ indica la dirección del marco de lectura abierto. La figura 3A es un diagrama que ilustra una orientación cabeza a cabeza de los productos. La figura 3B es un diagrama que ilustra una orientación cola a cola. La figura 3C es un diagrama que ilustra una orientación cabeza a cola estando en primer lugar la secuencia que codifica la cadena ligera. La figura 3D es un diagrama que ilustra una orientación cabeza a cola estando en primer lugar la secuencia que codifica la cadena pesada.

La figura 4 es un diagrama esquemático de vector de expresión de inmunoglobulinas pLL113, en el que las secuencias codificantes están en una orientación cabeza a cola. El vector comprende los siguientes elementos: bla = promotor que permite la expresión del gen resistente a ampicilina. Amp = gen que codifica la resistencia a ampicilina. pUC ori = origen pUC de replicación. AdMLP= promotor tardío mayor del adenovirus. IgG1 humana = secuencia que codifica la cadena pesada de isotipo G1 de inmunoglobulina. hGH pA = secuencia señal poli A de la hormona de crecimiento humana. bGH poli A = secuencia poli A de la hormona de crecimiento bovina. LC kappa humana= secuencia que codifica la cadena ligera kappa de inmunoglobulina. FRT = un sitio diana de reconocimiento Flp. Higromicina = gen que codifica la resistencia a higromicina. SV40 poli A = secuencia señal poli A del virus del simio

40.

La figura 5A es un gel electroforético que muestra los resultados de una RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de dos etapas seguida por una PCR semianidada. Los productos de amplificación se derivan de ADNc aislado a partir de células únicas CHO Flp-In pLL113. Los carriles 1-12 son carriles de muestra y las flechas indican productos de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex anidada correcta de 1076 pb; M1 es una escalera de 100 pb. W es agua usada como molde control negativo. C es un molde control de ADNc positivo derivado de la línea celular HB-8501. En un panel separado se han representado los mismos carriles W, C y la escalera de 100 pb con menos contraste con el fin de resolver los fragmentos de ADN individuales. La figura 5B es un esbozo del gel mostrado en la figura 5A, que ilustra los fragmentos relevantes del gel.

La figura 6 es una serie de fotografías y una representación gráfica de geles electroforéticos que muestran los resultados de una reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa sin amplificación por PCR adicional. En cada panel, M1 es una escalera de 100 pb y M2 es una escalera de 500 pb. La figura 6A es un gel electroforético que muestra los productos de amplificación derivados del lisado correspondiente a 100, 10, 1 ó 0 células. La flecha indica el producto de extensión por solapamiento. La figura 6B es un esbozo del gel de la figura 6A. La figura 6C es un gel electroforético que verifica la presencia de producto de extensión por solapamiento en los carriles de células 100 y 1 en la figura 6A. La figura 6D es un gel electroforético que muestra la rotura mediante enzimas de restricción con NheI y NcoI, respectivamente, del producto de extensión por solapamiento del carril de células 1 de la figura 6C.

La figura 7 es un gel electroforético que muestra los resultados de una RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa seguida por una amplificación por PCR semianidada. M1 es una escalera de 100 pb y M2 es una escalera de 500 pb. Los resultados de las mezclas de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que contiene CH1, CH2, CH3, CH4 o bien CH5 como cebador externo en la reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Se realizaron las reacciones en lisados celulares correspondientes a 100, 10, 1 ó 0 células. El tamaño del producto de extensión por solapamiento se indica con una flecha.

La figura 8 es un gel electroforético que muestra los resultados de una RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa seguida por una amplificación por PCR semianidada usando linfocitos B humanos enriquecidos como molde. M1 es una escalera de 100 pb. Los carriles 5 y 6 muestran bandas de tamaño esperado para el producto de extensión por solapamiento.

La figura 9A es un diagrama esquemático de los vectores de expresión de mamíferos (Em465/01P582/Em465/01P581) usados para la generación de líneas celulares que expresan IgG1-lambda, en las que las secuencias codificantes están en una orientación cabeza a cabeza. Los vectores comprenden los siguientes elementos: Amp = gen que codifica la resistencia a ampicilina. pUC ori = origen pUC de replicación. AdMLP = promotor tardío mayor del adenovirus. EFP = promotor del factor de elongación. Líder FA = secuencia líder de fosfatasa alcalina. VH = secuencia que codifica la región variable de cadena pesada. IgG1 HC = secuencia que codifica la región constante de cadena pesada del isotipo G1 de inmunoglobulina. rBG poli A = secuencia señal poli A de beta-globina de conejo. bGH poli A = secuencia poli A de la hormona de crecimiento bovina. Líder IgK = secuencia que codifica la cadena líder kappa de murinos. IgL (1b ó 1c) = secuencia que codifica la familia 1b ó 1c de cadena ligera lambda de inmunoglobulina. FRT = un sitio diana de reconocimiento Flp. Higromicina = gen que codifica la resistencia a higromicina. SV40 poli A = secuencia señal poli A del virus del simio 40. Las figuras 9B y 9C son geles de agarosa teñidos con bromuro de etidio cargados con productos de PCR aislados de la línea celular CHO Flp-In/Em464/01P581 y CHO Flp-In/Em464/01P582, respectivamente. Los carriles 1 a 4 corresponden a las concentraciones de molde de ARN total de 50 pg, 5 pg, 0,5 pg o 0 pg usadas para la reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex. M es una escaleta de 100 pb (New England Biolabs, Nueva Inglaterra, EE.UU.). Las flechas indican el producto de PCR de extensión por solapamiento.

La figura 10 es un diagrama de flujo que muestra las etapas aplicadas con el fin de generar una biblioteca de expresión de anticuerpos análoga de la que pueden expresarse anticuerpos monoclonales o policlonales.

La figura 11 es un diagrama esquemático de JSK301, un vector de E. coli usado para generar una biblioteca de vectores Fab insertando los fragmentos de extensión por solapamiento que comprende las secuencias análogas que codifican la región variable dentro del vector en los sitios de restricción NotI/ XhoI indicados. El vector comprende los siguientes elementos: Amp y Amp pro = gen de resistencia a ampicilina y su promotor. pUC19 Ori = origen de replicación. Human CH1 = secuencia que codifica el dominio 1 de cadena pesada gamma 1 de inmunoglobulina humana. Relleno= un inserto de secuencia irrelevante que se corta tras la inserción de los fragmentos de extensión por solapamiento. tac P y lac Z = promotores bacterianos que pueden cortarse en los sitios de restricción NheI y AscI.

La figura 12 es un diagrama esquemático que ilustra la generación de una biblioteca de vectores de expresión Fab análogos. La etapa I ilustra la inserción de pares análogos de secuencias que codifican la región variable (VH1-VL1 a VHx-VLx) dentro del vector JSK301 de E. coli mediante la digestión con XhoI-NotI. La etapa II ilustra la inserción de un promotor bacteriano y un casete líder (líder pelB – promotor P tac que conduce la expresión de VHx y promotor P lac – líder pelB que conduce la expresión de VLx) mediante la digestión con AscI-NheI.

La figura 13 ilustra la unión de subunidades a, y y que constituyen una proteína G, usando una RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa seguida por amplificación por PCR adicional. Se facilitan los tamaños de las regiones codificantes individuales así como el tamaño del producto unido. Los sitios de restricción introducidos mediante las colas de cebador durante la amplificación se indican para el producto final.

La figura 14 muestra gráficos de puntos de una tinción mediante FACS analítica de (A) PBMC purificadas a partir de sangre del donante; (B) la fracción celular CD 19 negativa no marcada clasificada magnéticamente y (C) fracción de células CD19+ clasificadas magnéticamente. Se muestra para cada fracción un diagrama de dispersión, un diagrama CD19/CD38 y un diagrama CD38/CD45.

La figura 15 muestra la fracción CD19+ de la figura 9 C, que se ha almacenado en nitrógeno líquido, se ha descongelado y se ha teñido con anti-CD19, anti-CD38 y anti-CD45. Se muestran los gráficos de puntos correspondientes a la figura 9C.

La figura 16 muestra ventanas usadas para clasificar la fracción celular CD19+. Se usaron una ventana de dispersión y una ventana de fluorescencia basadas en CD38 y CD45 para aislar las células CD38 altas (CD38hi), CD45 intermedias (CD45in).

La figura 17 es un gel electroforético que muestra la reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex satisfactoria en TT03 del donante (fila A, pocillo 1-12 de ocho placas de 96 pocillos). Las muestras se han aplicado al gel de agarosa en dos filas (A y B) con 48 muestras en cada una. El tamaño esperado del fragmento de extensión por solapamiento era de aproximadamente 1070 pb. Los supuestos fragmentos de extensión por solapamiento están marcados con flechas.

La figura 18 muestra un análisis ELISA de extractos periplásmicos de la placa G060. La placa de ELISA se cubrió con kappa de cabra (gt) anti-humana y se detectaron los fragmentos Fab capturados con un anticuerpo específico de Fab, gt anti-humano, conjugado con HRP.

La figura 19 muestra un análisis ELISA de extractos periplásmicos de la placa G060. La placa de ELISA se cubrió con ovoalbúmina 10 !g/ml (Sigma A-5503) y se detectaron los fragmentos Fab capturados con un anticuerpo específico de Fab, gt anti-humano, conjugado con HRP.

La figura 20 muestra un análisis ELISA de extractos periplásmicos de la placa G060. La placa de ELISA se cubrió con toxoide tetánico y se detectaron los fragmentos Fab capturados con un anticuerpo específico de Fab, gt antihumano, conjugado con HRP.

La figura 21 muestra un análisis ELISA de competición de una única etapa de extractos periplásmicos de la placa G060. La placa de ELISA se cubrió con toxoide tetánico (TT) y se añadió TT soluble a cada pocillo a 10-7 M con el fin de competir por la unión de los fragmentos Fab de los sobrenadantes bacterianos, a TT inmovilizado. Se detectaron los fragmentos Fab capturados con un anticuerpo específico de Fab, gt anti-humano, conjugado con HRP

La figura 22 muestra la alineación de secuencias de proteínas de la cadena pesada variable de clones de unión a antígeno TT de la placa G060. El grado de homología de secuencia se representó mediante diferentes colores; el 100 %, 80 % y el 60 % se representaron con negro, gris y gris claro, respectivamente. CDR1 está ubicado en la posición de alineación 34 a 41. CDR2 está ubicado en la posición de alineación 55 a 73. CDR3 está ubicado en la posición de alineación 107 a 127. Los codones de terminación temprana están marcados por un asterisco. La alineación está dividida en 8 figuras (a-h) separadas distribuidas en dos filas de izquierda a derecha estando las figuras 22a a d en la fila superior y las figuras 22e a h en la fila inferior.

La figura 23 muestra alineación de secuencia de proteínas de cadena ligera variable a partir de clones de unión a antígeno TT de la placa G060. El grado de homología de secuencia se representó mediante colores diferentes; 100 %, 80 % y 60 % se representaron con negro, gris y gris claro, respectivamente. CDR1 está ubicado en la posición de alineación 26 a 42. CDR2 está ubicado en la posición de alineación 58 a 64. CDR3 está ubicado en la posición de alineación 97 a 106. Los codones de terminación temprana están marcados por un asterisco. La alineación está dividida en 8 figuras (a-h) separadas distribuidas en dos filas de izquierda a derecha estando las figuras 23a a d en la fila superior y las figuras 23e a h en la fila inferior.

La figura 24 muestra un ensayo ELISA de competición para la determinación de afinidades aparentes de clones seleccionados de la placa G060. Se añadieron diluciones de TT soluble en concentraciones desde 100 nM hasta 25 pM (diluciones de cuatro veces) a los fragmentos Fab, compitiendo de ese modo la unión de los fragmentos Fab a TT inmovilizado. Los grados de las reacciones se facilitan como la proporción de la unión observada a una concentración de TT soluble dada a la unión encontrada cuando se añade a las reacciones TT no soluble.

La figura 25 muestra un gráfico de matriz de puntos filogenético doble que muestra la relación intra e intergenética entre las secuencias de dominio variable de cadena ligera y pesada de anticuerpo. Los árboles filogenéticos de las secuencias VH y VL están apareados en una matriz de puntos con el fin de indicar el apareamiento real de genes V particulares. A) clones de unión a TT obtenidos a partir de una biblioteca combinatoria usando una presentación en fago. B) clones de unión a TT obtenidos a partir de una biblioteca de pares análogos usando la presente invención.

Descripción de la invención

La presente memoria descriptiva divulga un proceso de amplificación y unión de dos o más secuencias de nucleótidos no contiguas de interés que permite la clonación de tales secuencias que van a ajustarse a un formato de alta resolución. Esto se consigue básicamente reduciendo el número de etapas necesarias para amplificar y unir las secuencias que van a clonarse.

La presente memoria descriptiva divulga un procedimiento de unión de una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguas que comprende amplificar, en un procedimiento de amplificación molecular múltiplex, secuencias de nucleótidos de interés usando un molde derivado de una célula individual aislada, una población de células isogénicas o una población de células genéticamente diversas y efectuar una unión posterior de las secuencias amplificadas. Si el molde es una célula individual aislada o una población de células isogénicas, la unión da como resultado un segmento de ácido nucleico que comprende secuencias de nucleótidos de interés asociadas entre sí de manera análoga.

En una realización descrita en el presente documento este procedimiento de amplificación molecular múltiplex es una amplificación por PCR múltiplex, preferentemente precedida por una etapa de transcripción inversa. En una realización preferente la transcripción inversa, la amplificación y la unión se realizan en una única etapa, usando RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex o como alternativa en dos etapas usando RT-PCR múltiplex seguida por la unión mediante acoplamiento o recombinación.

Otra realización se refiere a la generación de bibliotecas de pares análogos que comprenden secuencias unidas que codifican la región variable, en particular secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada o secuencias que codifican la cadena alfa y secuencias que codifican la cadena beta del receptor de células T (RcT). El proceso implica obtener una fracción celular que contiene linfocitos a partir de al menos un donante adecuado y enriquecer opcionalmente una población de linfocitos particular de esta fracción, por ejemplo linfocitos B o linfocitos T, dependiendo de si se desean las secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulinas o RcT. La fracción celular que contiene linfocitos o la fracción celular enriquecida se distribuye dentro de una serie de recipientes, obteniéndose una célula en cada recipiente. La serie de células únicas se someten a una etapa de transcripción inversa (RT) o un procedimiento alternativo de generación de ADNc, usando los ácidos nucleicos derivados de la población de células únicas como molde. La etapa de RT va seguida por un procedimiento de amplificación molecular múltiplex y la unión de pares de secuencias que codifican la región variable generadas a partir de cada célula según uno de los procedimientos de la presente invención.

Las técnicas de clonación divulgadas en la presente invención suprimen enfoques de clonación laboriosos e ineficaces y reducen adicionalmente el riesgo de contaminación y pérdida de la diversidad durante las múltiples etapas de clonación.

Un aspecto de la invención se refiere a bibliotecas de pares análogos producidas mediante el proceso de amplificación molecular múltiplex y unión. En particular, la invención se refiere a una biblioteca de pares análogos que comprende secuencias de ácidos nucleicos unidas que codifican la región región variable, en la que cada par análogo es un par original de secuencias de ácidos nucleicos no contiguos amplificadas a partir de un linfocito individual y estando presente la biblioteca en una pluralidad de recipientes, conteniendo cada recipiente un único par análogo. La biblioteca inicial de pares análogos (biblioteca original) generada mediante el procedimiento descrito en la presente invención puede someterse a exploración, generando de ese modo una subbiblioteca de pares análogos que codifican dominios variables de proteínas de unión específica de diana o proteínas de unión de longitud completa.

Las bibliotecas y sub-bibliotecas de la presente invención pueden usarse en la expresión de proteínas monoclonales

o policlonales recombinantes, en las que se conservan las especificidades y afinidades de unión originales presentes en el donante.

Definiciones

La expresión “par análogo” describe un par original de ácidos nucleicos no contiguos de interés que están contenidos en o se derivan de una célula individual. En realizaciones preferentes, un par análogo comprende dos secuencias que codifican la región variable que juntas codifican el dominio variable de proteína de unión y cuyas secuencias génicas se derivan de la misma. Por tanto, cuando se expresa como una proteína de unión completa o bien como un fragmento estable de la misma, conservan la especificidad y afinidad de unión de la proteína de unión expresada originalmente a partir de esta célula. Un par análogo puede estar compuesto, por ejemplo, por una secuencia que codifica la cadena pesada variable de anticuerpo asociada a una secuencia que codifica la cadena ligera variable a partir de la misma célula, o una secuencia que codifica la cadena a del receptor de células T asociada a una secuencia que codifica la cadena 1 a partir de la misma célula. Una biblioteca de pares análogos es una colección de tales pares análogos.

La expresión “polimerasa hot-start (de inicio o arranque en caliente)” describe las polimerasas que son inactivas o tienen muy poca actividad a temperaturas usadas para la transcripción inversa. Tales polimerasas necesitan activarse mediante altas temperaturas (90 ºC a 95 ºC) para volverse funcionales. Esto es por ejemplo una ventaja de los procedimientos de RT-PCR de una única etapa, puesto que esto impide que existan interferencias de la polimerasa con la reacción de transcriptasa inversa.

La expresión “población isogénica de células” describe una población de células genéticamente idénticas. En particular, una población isogénica de células derivada mediante la expansión clonal de una célula individual aislada es de interés en la presente invención.

La expresión “célula individual aislada” describe una célula que se ha separado físicamente de una población de células correspondiente a “una célula individual en un único recipiente”. Cuando se distribuye una población de células individualmente entre una pluralidad de recipientes, se obtiene una población de células únicas aisladas. Según se específica en la sección titulada “fuentes de moldes” la proporción de recipientes con una célula individual no es necesariamente un 100 % con el fin de denominarla una población de células únicas.

Los términos derivados de “unir” o “unión” en relación con la amplificación, describe la asociación de las secuencias de ácido nucleico amplificadas que codifican las secuencias de ácido nucleico de interés dentro de un único segmento. En relación con los pares análogos, un segmento comprende secuencias de ácido nucleico que codifican un dominio variable, por ejemplo una región variable de cadena pesada de anticuerpo asociada a una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera, derivadas de la misma célula. La unión puede conseguirse simultáneamente con la amplificación o bien como una etapa intermedia tras la amplificación. No existen requisitos para la forma o funcionalidad del segmento, puede ser lineal, circular, monocatenario o bicatenario. La unión tampoco es permanente necesariamente, una de las secuencias de ácido nucleico de interés puede aislarse a partir del segmento si se desea, una de las secuencias que codifica la región variable puede aislarse por ejemplo a partir de un segmento de pares análogos. Sin embargo, siempre que las regiones variables originales que constituyen el par análogo no están aleatorizadas con otras regiones variables, se consideran todavía un par análogo, aunque no estén unidas juntas dentro de un único segmento. La unión es preferentemente una unión fosfodiéster de nucleótidos. Sin embargo, también puede obtenerse la unión mediante diferentes procedimientos de reticulación química.

La expresión “amplificación molecular múltiplex” describe la amplificación simultánea de dos o más secuencias diana en la misma reacción. Los procedimientos de amplificación adecuados incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (documento U.S. 4.683.202), reacción en cadena de la ligasa (LCR), (Wu y Wallace, 1989, Genomics 4, 560-9), técnica de amplificación por desplazamiento de la cadena (SDA) (Walker y col., 1992, Nucl. Acids Res. 20, 1691-6), replicación de secuencia autosostenida (Guatelli y col., 1990, Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU., 87, 1874-8) y amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA) (Compton J., 1991, Nature 350, 91-2). Los dos últimos procedimientos de amplificación implican reacciones isotérmicas basadas en la transcripción isotérmica, que producen tanto el ARN monocatenario (ARNcs) como el ADN bicatenario (ADNdc).

La expresión “PCR múltiplex” describe una variante de PCR en la que dos o más secuencias diana se amplifican simultáneamente, incluyendo más de un conjunto de cebadores en la misma reacción, por ejemplo un conjunto de cebadores adaptado para la amplificación de la región variable de cadena pesada y un conjunto de cebadores adaptado para la amplificación de la región variable de cadena kappa en la misma reacción de PCR. Adicionalmente un conjunto de cebadores adaptado para la amplificación de la región variable de cadena lambda puede combinarse con estos conjuntos de cebadores.

La expresión “RT-PCR múltiplex” describe una reacción de PCR múltiplex, que esta precedida por una etapa de transcripción inversa (RT). La RT-PCR múltiplex puede realizarse como un proceso de dos etapas con una RT separada antes de la PCR múltiplex o bien como un proceso de una única etapa en el que todos los componentes para tanto la RT como la PCR múltiplex están combinados en un único tubo.

Las expresiones “PCR de extensión por solapamiento múltiplex” y “RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex” implican que la PCR múltiplex o la RT-PCR múltiplex se realizan usando una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex para amplificar las secuencias diana, permitiendo de ese modo la amplificación y la unión simultáneas de las secuencias diana.

La expresión “una pluralidad de recipientes” describe cualquier objeto (o colección de objetos) que permitan la separación física de una célula individual a partir de una población de células. Estos pueden ser tubos, placas de múltiples pocillos (por ejemplo placas de microvaloración de 96 pocillos, de 384 pocillos u otras placas de múltiples pocillos), chips, biochips, microchips, geles, o una matriz de gel. Preferentemente, el objeto puede aplicarse para la amplificación por PCR.

La expresión “proteína policlonal” o “policlonalidad” según se usa en el presente documento, se refiere a una composición proteica que comprende moléculas de proteínas diferentes, pero homólogas, preferentemente seleccionadas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Por tanto, cada molécula de proteína es homóloga con respecto a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de secuencia polipeptídica variable, que está(n) caracterizado(s) por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal. Los ejemplos conocidos de tales proteínas policlonales incluyen moléculas de anticuerpos o de inmunoglobulinas, receptores de células T y receptores de células B. Una proteína policlonal puede estar constituida por un subconjunto de moléculas de proteínas definido, que se ha definido mediante una característica común tal como la actividad de unión compartida hacia una diana deseada, por ejemplo un anticuerpo policlonal que muestra especificidad de unión hacia un antígeno diana deseado.

La expresión “una población de células genéticamente diversas” según se usa en el presente documento, se refiere a una población de células en la que las células individuales difieren entre sí en el nivel genómico. Una población de células genéticamente diversas de este tipo es por ejemplo una población de células derivadas de un donante, o una fracción de tales células, por ejemplo una fracción de células que contienen linfocitos B o una que contiene linfocitos

T.

La expresión “conjunto de cebadores” se usa de manera intercambiable con la expresión “par de cebadores” y describe dos o más cebadores que juntos pueden cebar la amplificación de una secuencia de nucleótidos de interés (es decir, un miembro de un par análogo). Un conjunto de cebadores de la presente invención podría diseñarse para cebar una familia de secuencias de nucleótidos que contienen secuencias que codifican la región variable. Los ejemplos de diferentes familias son cadenas ligeras kappa de anticuerpo, cadenas ligeras lambda, regiones variables de cadena pesada y regiones variables a, 1, y, o 8 del receptor de células T. Un conjunto de cebadores para la amplificación de una familia de secuencias de nucleótidos que contienen secuencias que codifican la región variable a menudo constituye una pluralidad de cebadores en la que varios cebadores pueden ser cebadores degenerados.

La expresión “identidad de secuencia” se expresa como un porcentaje que indica el grado de identidad entre secuencias de ácido nucleico a lo largo de la longitud de la más corta de las dos secuencias. Puede calcularse como (Nref-Ndif)x100/Nref, en la que Nref es el número de residuos en la más corta de las secuencias y en la que Ndif es el número total de residuos no idénticos en una comparación óptimamente alineada larga de Nref entre las dos secuencias. Por tanto, la secuencia de ADN AGTCAGTC tendrá una identidad de secuencias del 75 % con la secuencia TAATCAATCGG (Ndif=2 y Nref=8) (el alineamiento óptimo se muestra subrayado y se indica en negrita los dos residuos no idénticos de los 8).

Los términos “aleatoriamente” o “aleatorio” con respecto a la unión se refieren a la unión de secuencias de nucleótidos que no se derivan de la misma célula pero se unen transversalmente entre una población de células genéticamente diversas. Si las secuencias de nucleótidos de interés son secuencias que codifican la región variable, esto dará como resultado una biblioteca combinatoria de secuencias unidas. Por otro lado, si las secuencias de nucleótidos de interés codifican una proteína heteromérica no diversa, las secuencias unidas aleatoriamente parecerán similares a secuencias unidas a partir de una célula individual.

La expresión “molde derivado de una célula individual aislada”, con respecto a la transcripción inversa, se refiere a los ácidos nucleicos dentro de una célula aislada de este tipo. Los ácidos nucleicos pueden estar por ejemplo en forma de ARN, ARNm, ADN o ADN genómico. Los ácidos nucleicos pueden aislarse a partir de la célula o bien estar todavía con los contenidos restantes de la célula, estando la célula en una forma intacta o una forma lisada.

El proceso de amplificación y unión

Una característica del presente procedimiento reduce el número de tubos necesarios para amplificar las secuencias de nucleótidos de interés, usando una variante de PCR en la que se amplifican dos o más secuencias diana simultáneamente en el mismo tubo, incluyendo más de un conjunto de cebadores, por ejemplo todos los cebadores necesarios para amplificar secuencias que codifican la región variable, en la misma reacción. Generalmente este enfoque se conoce como una reacción en cadena de la polimerasa múltiplex (PCR múltiplex).

La amplificación por PCR múltiplex y PCR múltiplex precedida por la transcripción inversa (RT-PCR múltiplex) son técnicas bien conocidas dentro del campo de diagnóstico, por ejemplo en el análisis de mutaciones, deleciones y polimorfimos de ADN, para ensayos cuantitativos de niveles de ARNm y para la identificación de virus, bacterias y parásitos (revisado en Markoulatos, P. y col. 2002. J. Clin. Lab. Anal. 16, 47-51). Sin embargo, existen sólo muy pocos ejemplos en los que se han amplificado secuencias que codifican la región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas en el mismo recipiente que las secuencias que codifican la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas usando una mezcla de cebadores múltiplex compuesta por más de cuatro cebadores que constituyen un conjunto de cebadores VK y/o VA junto con un conjunto de cebadores VH (Chapal, N. y col. 1997. BioTechniques 23, 518-524.; Liu, A.H. y col. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89, 7610-7614; Embleton, M.J. y col. 1992. Nucleic Acids Res. 20, 3831-3837). La razón para esto podría ser que los conjuntos de cebadores adaptados para la amplificación de secuencias que codifican los dominios variables de proteínas de unión a antígeno están constituidos generalmente por una pluralidad de cebadores degenerados con el fin de capturar la diversidad de estas secuencias que codifican la región variable. Por tanto, la complejidad de la reacción de PCR se aumenta mucho cuando se realiza la amplificación por PCR múltiplex en secuencias que codifican la región variable.

Otra característica es que dos o más secuencias diana amplificadas por PCR múltiplex se unen de manera muy próxima con respecto al proceso de amplificación. En particular, los pares análogos de secuencias que codifican la región variable se unen mediante este proceso.

Una realización del presente procedimiento se aprovecha de que una mezcla de cebadores múltiplex puede diseñarse para que funcione en un procedimiento de PCR de extensión por solapamiento, dando como resultado una amplificación y unión simultánea de secuencias de nucleótidos de interés. Esta técnica de PCR de extensión por solapamiento múltiplex sirve para reducir el número de reacciones necesarias para aislar y unir secuencias de nucleótidos de interés, en particular pares análogos de regiones variables unidas.

Otras realizaciones aplican la unión mediante acoplamiento o mediante recombinación como alternativa a la unión por PCR de extensión por solapamiento múltiplex. En estos procedimientos, la unión no se realiza simultáneamente con la amplificación por PCR múltiplex, pero es una etapa inmediata tras la amplificación. Sin embargo, todavía puede realizarse la unión en el mismo tubo en el que se realizó la PCR múltiplex.

Con el fin de realizar la PCR de extensión por solapamiento múltiplex, se necesita la presencia de dos o más conjuntos de cebadores (una mezcla de cebadores múltiplex), en los que al menos un cebador de cada conjunto está equipado con una cola de extensión por solapamiento. Las colas de extensión por solapamiento permiten la unión de los productos generados mediante cada uno de los conjuntos de cebadores durante la amplificación. Una mezcla de cebadores de este tipo se denomina una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex. La PCR de extensión por solapamiento múltiplex, difiere de la PCR de extensión por solapamiento convencional en que las secuencias que van a unirse se generan simultáneamente en el mismo tubo, proporcionando de ese modo la unión inmediata de las secuencias diana durante la amplificación, sin ninguna purificación intermedia. Además, la PCR de extensión por solapamiento convencional requiere una reacción de PCR de unión separada con un conjunto de cebadores externos o bien un conjunto de cebadores anidados con el fin de generar el producto unido (Horton,

R.M. y col. 1989. Gene 77, 61-68). Una etapa de amplificación adicional de este tipo es opcional en la PCR de extensión por solapamiento múltiplex de la presente invención.

Otra característica de la presente invención es una etapa de transcripción inversa (RT) que precede a la amplificación por PCR de extensión por solapamiento múltiplex o PCR múltiplex, usando un molde derivado de una célula individual aislada o una población de células isogénicas.

Otra característica de la presente invención es el uso de secuencias de nucleótidos derivadas de una célula individual aislada o una población de células isogénicas como molde para la amplificación por PCR múltiplex. Preferentemente, se transcribe de manera inversa el ARN a partir de una célula individual en ADNc antes de la PCR múltiplex. Para la amplificación de algunas secuencias de ácido nucleico de interés puede usarse ADN genómico como alternativa al ARNm. Mediante el uso de células únicas aisladas o una población de células isogénicas derivadas por expansión clonal de una célula única aislada como fuente de moldes, es posible evitar aleatorizaciones de secuencias de nucleótidos que codifican una proteína heteromérica de interés, con secuencias de nucleótidos derivadas de diferentes células dentro de una población de células. Esto es importante si se desea obtener la composición original de las secuencias de interés. Especialmente para la generación de un par análogo de secuencias que codifican la región variable, el uso de una célula individual aislada o una población de células isogénicas como fuente de moldes es una característica importante.

La PCR de extensión por solapamiento múltiplex es una tecnología usada pocas veces. El documento WO 99/16904 da a conocer la unión de exones a partir de una secuencia genómica en una única reacción, generando de ese modo ADNc sin usar transcripción inversa. El proceso según se describe usaba un conjunto de cebadores (que consiste en dos cebadores) por exón que iba a unirse, componiéndose de ese modo una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex. Cada conjunto de cebadores individual podía solapar con el conjunto de cebadores adyacente mediante colas de extensión por solapamiento complementarias. El ADNc se generó a partir de un molde de ADN genómico realizando una reacción de PCR de extensión por solapamiento usando la mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex seguida por una PCR anidada, que se describió como una etapa necesaria.

La generación de ADNc a partir de exones de ADN genómico según se describe en el documento WO 99/16904 es un campo diferente de la clonación de secuencias que codifican proteínas heteroméricas. En primer lugar, las proteínas heteroméricas se expresan generalmente a partir de genes diferentes, mientras que la unión de exones según se describe en el documento WO 99/16904 se refiere a la unión de exones a partir de un único gen. Adicionalmente, la presente invención facilita la generación de bibliotecas de secuencias de ácido nucleico unidas de interés, en particular bibliotecas combinatorias y bibliotecas de pares análogos de regiones variables; una situación completamente diferente de la unión de una serie de exones a partir de un único gen, da como resultado un único ADNc no variable. Además, la presente invención usa ácidos nucleicos derivados de células únicas, preferentemente en forma de ARN que no necesita que se aísle de los contenidos celulares restantes antes de que se utilice como molde.

Existen algunas publicaciones en las que se ha descrito RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex en relación a la unión de secuencias que codifican la región variable.

La forma más simple de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex se describió para el aislamiento de una secuencia que codifica scFv a partir de una línea de células de hibridoma (Thirion, S. y col. 1996. Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-511 y Mullinax, R.L y col. 1992. BioTechniques 12, 864-869). Los procedimientos descritos por Thirion y Mullinax usaban transcripción inversa de ARNm con cebadores oligo-dT en ARN total extraído a partir de la línea de células de hibridoma seguida por una etapa de unión separada. La etapa de unión se realizó con un total de cuatro cebadores, constituyendo dos pares de cebadores para la amplificación de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada, respectivamente. El cebador directo VL y el cebador inverso VH o CH contenían colas de extensión por solapamiento complementarias, permitiendo de ese modo la amplificación y la unión simultáneas de las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada. Estos procedimientos no usaban una PCR anidada para aumentar la sensibilidad del procedimiento de unión.

El otro ejemplo de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex en relación a la unión de secuencias que codifican la región variable se describió en el documento WO 93/03151 mencionado anteriormente, proporcionando un procedimiento de clonación de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada que se originan a partir de la misma célula sin tener que aislar células únicas antes de la clonación. El procedimiento descrito en el documento WO 93/03151 requería lavar entre la etapa de RT y la etapa de PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Además, uno de los objetivos específicos determinado por el documento WO 93/03151, era resolver el problema de tener que aislar células únicas con el fin de obtener pares análogos de secuencias que codifican la región variable.

Ninguna de estas técnicas de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex conocidas se desarrollaron para funcionar en un molde derivado de una célula única aislada. Tampoco, ninguno de los procedimientos pudo realizarse como reacciones de RT-PCR de una única etapa.

Una realización del presente procedimiento engloba la unión de una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguas de interés. El procedimiento comprende amplificar, en un procedimiento de amplificación por RT-PCR múltiplex o PCR múltiplex, secuencias de nucleótidos de interés usando un molde derivado de una célula única aislada o una población de células isogénicas y efectuar la unión de las secuencias de nucleótidos de interés amplificadas. Además, el procedimiento comprende una etapa opcional de realización de una amplificación adicional de los productos unidos.

Otra realización engloba un procedimiento de producción de una biblioteca de pares análogos que comprende secuencias unidas que codifican la región variable. El procedimiento comprende proporcionar una fracción celular que contiene linfocitos a partir de un donante, que se enriquece opcionalmente en una población de linfocitos particular de dicha fracción celular. Además, se obtiene una población de células únicas aisladas mediante la distribución de células de la fracción celular que contiene linfocitos, o la fracción celular enriquecida, individualmente entre una pluralidad de recipientes. Se realiza la amplificación molecular múltiplex (amplificación por RT-PCR múltiplex) de las secuencias que codifican la región variable que están contenidas en la población de células únicas aisladas y se efectúa la unión de pares de secuencias que codifican la región variable, en los que un par individual se deriva de una célula única, dentro de la población de célula única aislada. Además, la técnica comprende dos etapas opcionales: en la primera etapa, la célula única aislada individual en la población de células únicas se expande hasta una población de células isogénicas antes de realizar la amplificación por RT-PCR múltiplex. Obteniéndose de ese modo una pluralidad de recipientes con una población diversa de células isogénicas (una población de células isogénicas en un recipiente). La segunda etapa opcional engloba realizar una amplificación adicional de las secuencias unidas que codifican la región variable.

En realizaciones preferentes, un miembro individual de dicha biblioteca de pares análogos que está comprendido por una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas está asociado con una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas, que se originan a partir de la misma célula o por secuencias que codifican un dominio de unión al receptor de células T, que consiste en una región variable de la cadena alfa asociada a una región variable de la cadena beta o una región variable de la cadena gamma asociada a una región variable de la cadena delta, originándose las regiones variables asociadas a partir de la misma célula.

La amplificación por RT-PCR múltiplex de la presente invención puede realizarse como un proceso de dos etapas, en el que se realiza la transcripción inversa (RT) por separado de la amplificación por PCR múltiplex (o amplificación molecular múltiplex alternativa), o bien como un proceso de una única etapa, en el que se realizan las etapas de RT y amplificación por PCR múltiplex con los mismos cebadores en un tubo.

La transcripción inversa (RT) se realiza con una enzima que contiene actividad transcriptasa inversa dando como resultado la generación de ADNc a partir de ARN total, ARNm o ARN específico de diana a partir de una célula única aislada. Los cebadores que pueden usarse para la transcripción inversa son por ejemplo cebadores oligo-dT, hexámeros aleatorios, decámeros aleatorios, otros cebadores aleatorios, o cebadores que son específicos para las secuencias de nucleótidos de interés.

El procedimiento de amplificación por RT-PCR múltiplex de dos etapas, permite que el ADNc generado en la etapa de RT se distribuya en más de un recipiente, permitiendo el almacenamiento de una fracción de molde antes de continuar con la amplificación. Adicionalmente, la distribución de ADNc en más de un tubo, permite la realización de más de una amplificación por PCR múltiplex de ácido nucleico derivado del mismo molde. Aunque esto da como resultado un aumento del número de reacciones separadas, abre la posibilidad de disminuir la complejidad de la mezcla de cebadores múltiplex si ésta se desea. Este enfoque de dos etapas puede aplicarse por ejemplo para amplificar y unir las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera kappa y la región variable de cadena pesada en un tubo y la secuencias que codifican la región variable de cadena ligera lambda y la región variable de cadena pesada en un tubo diferente usando el mismo molde. Normalmente, una célula única sólo expresa una de las cadenas ligeras. Sin embargo, será con frecuencia más fácil realizar las reacciones simultáneamente en lugar de esperar el resultado de una de las reacciones antes de realizar la otra. Además, la amplificación de tanto kappa como lambda sirve como un control negativo interno, puesto que se esperaría que se amplificara sólo kappa o lambda a partir de una célula única.

En el procedimiento de RT-PCR múltiplex de una única etapa, la transcripción inversa y la amplificación por PCR múltiplex se llevan a cabo en el mismo recipiente. Todos los componentes necesarios para realizar tanto la transcripción inversa como la PCR múltiplex en una única etapa se añaden inicialmente dentro de los recipientes y se realiza la reacción. Generalmente, no se necesita añadir otros componentes una vez se ha iniciado la reacción. La ventaja de la amplificación por RT-PCR múltiplex de una única etapa es que se reduce incluso más el número de etapas necesarias para generar las secuencias de nucleótidos unidas de la presente invención. Esto es particularmente útil cuando se realiza RT-PCR múltiplex en una serie de células únicas, en la que se necesita que se lleve cabo la misma reacción en una pluralidad de recipientes. La RT-PCR múltiplex de una única etapa se realiza usando los cebadores inversos presentes en la mezcla de cebadores múltiplex necesarios para la amplificación por PCR múltiplex así como cebadores para la transcripción inversa. Generalmente, la composición necesaria para la RT-PCR múltiplex de una única etapa comprende un molde de ácido nucleico, una enzima con actividad transcriptasa inversa, una enzima con actividad ADN polimerasa, mezcla de desoxinucleósido trifosfatos (mezcla de dNTP que comprende dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y una mezcla de cebadores múltiplex. El molde de ácido nucleico es preferentemente ARN total o ARNm derivado de una célula única aislada en forma purificada, como un lisado de la célula o bien todavía dentro de la célula intacta. Generalmente, la composición exacta de la mezcla de reacción requiere alguna optimización para cada mezcla de cebadores múltiplex que va a usarse con la presente invención. Esto se aplica para los procedimientos tanto RT-PCR múltiplex de dos etapas como de una única etapa.

En realizaciones alternativas puede ser apropiado usar ADN genómico en lugar de ARN como molde. En tales casos se omite la etapa de transcripción inversa y se realizan las etapas restantes de la invención según se describen a lo largo de la solicitud.

Para algunas reacciones de RT-PCR múltiplex de una única etapa puede ser una ventaja añadir otros componentes durante la reacción. Por ejemplo, la adición de la polimerasa tras la etapa de RT. Otros componentes pueden ser por ejemplo una mezcla de dNTP o una mezcla de cebadores múltiplex posiblemente con una composición de cebadores diferentes. Esto puede considerarse entonces como una RT-PCR múltiplex en único tubo, que generalmente tiene las mismas ventajas que la RT-PCR múltiplex de una única etapa, puesto que también limita el número de tubos necesarios para obtener los productos unidos deseados.

Las secuencias de nucleótidos de interés, amplificadas por la RT-PCR múltiplex, pueden unirse a otra mediante varios procedimientos, tales como RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex, acoplamiento o recombinación, usando diferentes mezclas de cebadores múltiplex. Preferentemente, el proceso de amplificación por RT-PCR múltiplex y de unión es un proceso de una única etapa o de dos etapas. Sin embargo, el proceso de unión también puede realizarse como un proceso de múltiples etapas, usando por ejemplo un fragmento de relleno para unir las secuencias de ácido nucleico de interés, con PCR, acoplamiento o bien recombinación. Un fragmento de relleno de este tipo puede contener elementos en cis, elementos promotores o una secuencia de reconocimiento o una secuencia codificante relevante. En una realización preferente, el proceso de unión se realiza en el mismo recipiente que la amplificación por RT-PCR múltiplex.

En una realización del presente procedimiento, la unión de una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguas de interés se realiza en asociación con la amplificación por PCR múltiplex, usando una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex. Esto da como resultado la amplificación y la unión combinadas de las secuencias diana. Generalmente, la composición necesaria para la PCR de extensión por solapamiento múltiplex comprende, un molde de ácido nucleico, una enzima con actividad ADN polimerasa, mezcla de desoxinucleósido trifosfatos (mezcla de dNTP que comprende dATP, dCTP, dGTP y dTTP) y una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex.

En una realización particular, la unión de una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguas de interés se realiza por RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex usando un molde derivado de una célula única aislada

o una población de células isogénicas. Además, el procedimiento comprende una etapa opcional de realización de una amplificación molecular adicional de productos unidos. Preferentemente, la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex se realiza como una reacción de una única etapa/en un único tubo.

Una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex comprende al menos dos conjuntos de cebadores que pueden cebar la amplificación y la unión de al menos dos secuencias que codifican la región variable, por ejemplo, la amplificación y la unión de secuencias de familias de región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas con familias de región variable de cadena ligera kappa o lambda, o la amplificación y la unión de secuencias de familias a, 1, y o 8 del receptor de células T.

En otra realización del presente procedimiento, la pluralidad de secuencias de nucleótidos de interés, amplificada mediante RT-PCR múltiplex, se unen mediante acoplamiento. Para conseguir esto, la mezcla de cebadores múltiplex usada para la RT-PCR múltiplex se diseña de tal modo que las secuencias diana amplificadas pueden romperse con enzimas de restricción apropiadas y puede realizarse la unión covalente mediante acoplamiento de ADN (el diseño de cebadores se describe en la sección “diseño y mezclas de cebadores”). Tras la amplificación por RT-PCR múltiplex con una mezcla de cebadores múltiplex de este tipo, se añaden a la mezcla las enzimas de restricción, necesarias para formar extremos compatibles de las secuencias diana, junto con la ligasa. Antes de esta etapa no se necesita purificación de los productos de PCR, aunque puede realizarse la purificación. La temperatura de reacción para la rotura por restricción y el acoplamiento combinados es aproximadamente entre 0 ºC y 40 ºC. Sin embargo, si la polimerasa de la reacción de PCR múltiplex está todavía presente en la mezcla, es preferente una temperatura de incubación inferior a la temperatura ambiente, del modo más preferente son temperaturas entre 4 ºC y 16 ºC.

En otra realización más, la pluralidad de secuencias de nucleótidos de interés, amplificada mediante RT-PCR múltiplex, se une mediante recombinación. En este enfoque, las secuencias diana amplificadas pueden unirse usando sitios de recombinación idénticos. La unión se realiza entonces añadiendo las recombinasas que facilitan la recombinación. Algunos sistemas de recombinasa adecuados son recombinasa Flp con una variedad de sitios FRT, recombinasa Cre con una variedad de sitios lox, integrasa <C31 que lleva a cabo la recombinación entre el sitio attP y el sitio attB, el sistema de seis 1-recombinasa así como el sistema Gin-gix. La unión mediante recombinación se ha ejemplificado para dos secuencias de nucleótidos (VH unida con VL) (Chapal, N. y col. 1997 BioTechniques 23, 518524), incorporada por el presente documento por referencia.

En una realización preferente, las secuencias de nucleótidos de interés comprenden secuencias que codifican la región variable y la unión genera un par análogo de secuencias que codifican la región variable. Un par análogo de este tipo puede comprender una o más secuencias que codifican la región constante además de las regiones variables.

En una realización incluso más preferente, las secuencias de nucleótidos de interés comprenden secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulinas y la unión genera un par análogo de secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera. Un par análogo de este tipo puede comprender una o más secuencias que codifican la región constante además de las regiones variables. Además, un par análogo de este tipo puede aislarse a partir de un molde derivado de células del linaje de linfocitos B enriquecidas a partir de la fracción celular que contiene linfocitos, tal como sangre completa, células mononucleares

o leucocitos.

En una realización lo más preferente, las secuencias de nucleótidos de interés comprenden secuencias que codifican la región variable del RcT y la unión genera un par análogo de secuencias que codifican la región variable de la cadena a y la región variable de la cadena 1 o secuencias que codifican la región variable de la cadena y y la región variable de la cadena 8. Un par análogo de este tipo puede comprender una o más secuencias que codifican la región constante además de las regiones variables. Además, un par análogo de este tipo puede aislarse a partir de un molde derivado de células del linaje de linfocitos T enriquecidas a partir de una fracción celular que contiene linfocitos, tal como sangre completa, células mononucleares o leucocitos.

Un modo eficaz de aumentar la especificidad, sensibilidad y rendimiento del proceso de unión por RT-PCR múltiplex es realizando una amplificación molecular adicional de las secuencias de nucleótidos unidas obtenidas a partir de la RT-PCR múltiplex seguida por la unión mediante acoplamiento o recombinación o unión usando la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Esta amplificación adicional se realiza preferentemente con amplificación por PCR, usando una mezcla de cebadores adaptada para amplificar las secuencias de ácido nucleico unidas de interés. La mezcla de cebadores usada puede ser los cebadores externos de la mezcla de cebadores múltiplex o mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex, que quiere decir los cebadores que se aparean al extremo 5’ externo y al extremo 3’ de la hebra en sentido correcto de las secuencias unidas que codifican la región variable, permitiendo de ese modo la amplificación del producto unido completo. Los cebadores externos también pueden describirse como los cebadores de la mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que no contienen colas de extensión por solapamiento. Como alternativa, pueden usarse un conjunto de cebadores anidados o semianidados para la amplificación adicional de las secuencias de nucleótidos unidas. Una PCR anidada de este tipo sirve especialmente para aumentar la especificidad del procedimiento así como para aumentar la cantidad del producto unido. Para la presente invención, se considera que la PCR semianidada (según se describe en la sección con título diseño y mezclas de cebadores) funciona tan bien como la PCR anidada. Por tanto, se desea, aunque no es necesario para la presente invención, realizar una amplificación adicional por PCR de los productos unidos a partir de la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex o de los productos unidos mediante acoplamiento o recombinación, preferentemente usando PCR anidada o PCR semianidada.

La amplificación adicional puede realizarse usando directamente una fracción o el producto de acoplamiento o el producto de recombinación o el producto de reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex completo

o una fracción de uno cualquiera de estos productos, o bien usando productos unidos purificados parcialmente a partir de una cualquiera de estas reacciones, por ejemplo realizando una electroforesis en gel de agarosa de los productos unidos y cortando el fragmento correspondiente al tamaño esperado de las secuencias unidas que codifican la región variable. Para los productos unidos mediante RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex, la amplificación adicional se realiza preferentemente de manera directa en una fracción de la reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex, puesto que esto ayudaría a la unión de las secuencias diana individuales que no se hayan unido en la primera reacción.

Secuencias de interés

Las secuencias de nucleótidos de interés de la presente invención pueden seleccionarse a partir de secuencias que codifican diferentes subunidades o dominios, que cuando se expresan, forman una proteína o parte de una proteína. Tales proteínas que están compuestas por al menos dos subunidades no idénticas se conocen como proteínas heteroméricas. Las proteínas heteroméricas son comunes en todos los tipos de especie. Algunas de las clases a las que pertenecen tales proteínas son por ejemplo enzimas, inhibidores, proteínas estructurales, toxinas, proteínas de canal, G-proteínas, proteínas receptoras, proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, proteínas de transporte, etc. Las secuencias de nucleótidos que codifican tales proteínas heteroméricas son no contiguas, que quiere decir por ejemplo que se originan de diferentes genes o diferentes moléculas de ARNm. Sin embargo, no contiguas según se usa en la presente invención también puede significar secuencias de nucleótidos que codifican dominios de la misma proteína, estando separados los dominios mediante secuencias de nucleótidos que no son de interés.

En una realización de la presente invención las secuencias de nucleótidos de interés contienen secuencias que codifican la región variable de la superfamilia de las inmunoglobulinas, tales como inmunoglobulinas (anticuerpos), receptores de células B y receptores de células T (RcT). Especialmente son de interés las secuencias que codifican la región variable de las inmunoglobulinas. Tales secuencias que codifican la región variable comprenden anticuerpos de longitud completa así como fragmentos Fab, Fv, scFv y combinaciones de fragmentos de las secuencias que codifican la región variable, por ejemplo regiones determinantes de complementariedad (RDC), genes de unión o genes V o combinaciones de estos. Generalmente, la presente invención puede aplicarse con cualquier combinación de secuencias que codifican la región variable y fragmentos de las mismas. La presente solicitud ejemplifica la unión de la cadena ligera entera con el dominio variable de la cadena pesada. Sin embargo, la presente invención también permite la unión de sólo los dominios variables de las cadenas pesada y ligera generando secuencias que codifican Fv o scFv, o la unión de la cadena ligera entera con la región variable de cadena pesada + el dominio CH1 de región constante + las partes de la región bisagra, generando Fab, Fab’ o F(ab)2. Además, es posible añadir cualquier región de los dominios de región constante de cadena pesada a la cadena pesada variable, generando de ese modo secuencias que codifican anticuerpos truncados o secuencias que codifican anticuerpos de longitud completa.

En otra realización de la presente invención las secuencias que codifican la región variable comprenden un tipo de secuencia que codifica la cadena ligera (kappa o lambda) de inmunoglobulinas y una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas.

Las secuencias que codifican la región variable derivadas de receptores de células T (RcT) también son de interés. Tales secuencias que codifican los RcT comprenden secuencias que codifican las cadenas alfa y beta o las cadenas gamma y delta de longitud completa así como RcT solubles o sólo los dominios variables de estas cadenas o proteínas de fusión de una única cadena de las mismas (por ejemplo una única cadena a1 o una única cadena y8).

Fuentes de moldes

Una característica de la presente invención es la capacidad de unir secuencias de nucleótidos derivadas de una célula única aislada, una población de células isogénicas o una población de células genéticamente diversa que no se han separado en únicos recipientes. Las células usadas en la presente invención pueden ser, por ejemplo, bacterias, levaduras, hongos, células de insecto, células vegetales o células de mamífero o fracciones de tales células. Las células sanguíneas derivadas de mamíferos son un ejemplo de una fracción de células que pueden usarse en la presente invención.

Una característica de la presente invención es el uso de células únicas aisladas o de una población de células isogénicas como fuente de moldes, puesto que se evitan las aleatorizaciones de las secuencias de ácido nucleico de interés, en particular las secuencias que codifican la región variable. Esto es importante si se desea obtener un par original de, por ejemplo, secuencias que codifican la región variable.

Otra característica preferente de la presente invención, es obtener una célula única o una población de células únicas a partir de una fracción celular que comprende linfocitos, tales como linfocitos B, linfocitos T, células plasmáticas y/o diversas fases de desarrollo de estos linajes celulares. Otras poblaciones de células que expresan proteínas de unión de la superfamilia de las inmunoglobulinas también podrían usarse para obtener células únicas. También pueden aplicarse en la presente invención líneas celulares tales como células de hibridoma, líneas celulares del linaje de linfocitos B o linfocitos T o líneas celulares inmortalizadas con virus o células derivadas de donante que participan en la respuesta inmunitaria. Las fracciones celulares que contienen linfocitos derivadas de donante pueden obtenerse a partir de tejido natural o fluido que es rico en tales células, por ejemplo sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, tejido del bazo, tejido amigdalino o a partir de infiltraciones en o alrededor de tumores o infiltraciones de tejidos inflamatorios. Los donantes de células adecuados para la presente invención pueden seleccionarse de vertebrados que todos contienen un sistema inmunitario adquirido. Los donantes pueden no haber recibido tratamiento previo o pueden estar hiperinmunizados con respecto a una diana deseada. Para el aislamiento de proteínas de unión a antígeno con especificidades de unión hacia una diana deseada, son preferentes donantes hiperinmunizados. Tales donantes hiperinmunizados pueden ser donantes inmunizados con la diana, o fragmentos de la diana, o bien pueden ser pacientes convalecientes, o individuos no sanos que están desarrollando una respuesta inmunitaria natural frente a la diana, por ejemplo pacientes con enfermedades autoinmunitarias, pacientes con cáncer, pacientes con enfermedades infecciosas, por ejemplo pacientes con VIH, pacientes con hepatitis A, B o C, pacientes con síndrome respiratorio agudo severo o pacientes con enfermedades crónicas.

Cuando se usan proteínas recombinantes para el tratamiento, es preferente que se deriven de secuencias que tengan identidad de especie con el individuo que va a tratarse (por ejemplo, secuencias humanas para el tratamiento de seres humanos). En primer lugar, porque las proteínas recombinantes derivadas de una fuente foránea (es decir, no humana) se reconocerán por el sistema inmunitario conduciendo a una respuesta inmunitaria que implica anticuerpos anti-proteína policlonales. Estos anticuerpos anti-proteína pueden bloquear la acción farmacológica mediante la ocupación del sitio activo, acelerarán el aclaramiento del fármaco y pueden inducir posiblemente reacciones adversas tales como reacciones de hipersensibilidad tras la exposición repetida.

Sin embargo, también puede observarse inmunogenicidad en casos en los que la proteína recombinante se deriva de una secuencia que tiene identidad de especie. Tal inmunogenicidad puede inducirse por ejemplo mediante modificaciones postraduccionales que podrían diferir de las observadas in vivo. Las bibliotecas combinatorias de secuencias que codifican la región variable también podrían dar lugar a la inmunogenicidad, puesto que están constituidas por pares aleatorios de secuencias que codifican la región variable creadas in vitro. Las reglas que gobiernan la formación de pares de secuencias que codifican la cadena ligera y la cadena pesada de anticuerpos (o receptores de células T) in vivo no se entienden completamente. Por eso se deduce que algunos de los pares formados in vitro pueden reconocerse como foráneos por el sistema inmunitario, incluso aunque las dos secuencias que constituyen el par sean perfectamente humanas. Por otra parte, las proteínas de unión obtenidas a partir de bibliotecas análogas no crean dichas combinaciones anómalas y en consecuencia tienen posiblemente peor inmunogenicidad que las proteínas de unión a partir de bibliotecas combinatorias. Esto no quiere decir que los productos a partir de bibliotecas combinatorias no sean adecuados para el tratamiento, sólo requieren un grado mayor de control con respecto a los efectos secundarios mencionados anteriormente.

Para su uso en la presente invención, los donantes de células deben ser preferentemente de la misma especie que la especie que va a tratarse con los productos que pueden obtenerse a partir de las secuencias de nucleótidos unidas de la presente invención. Preferentemente, un donante de células es un animal doméstico, un animal de compañía, un ser humano o un animal transgénico. Los animales transgénicos que portan locus de inmunoglobulina humana se describen en la patente estadounidense número 6.111.166 y Kuroiwa, Y. y col. Nature Biotechnology; 2002; 20:889-893. Tales animales transgénicos pueden producir inmunoglobulinas humanas. Por tanto, los anticuerpos completamente humanos frente a una diana específica pueden producirse mediante técnicas de inmunización habitual de tales animales transgénicos. Esto permite la generación de bibliotecas que codifican proteínas de unión con especificidades hacia dianas más difíciles tales como antígenos humanos para los que no existe una respuesta de anticuerpos humanos natural o existe limitada. Tales animales transgénicos pueden desarrollarse de la misma manera para producir receptores de células T humanos.

En otra realización del presente procedimiento, la fracción celular que contiene linfocitos está constituida por sangre completa, médula ósea, células mononucleares o leucocitos obtenidos a partir de un donante. Las células mononucleares pueden aislarse a partir de sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, bazo, infiltraciones alrededor de células cancerígenas e infiltraciones inflamatorias. Las células mononucleares pueden aislarse mediante técnicas de centrifugación en gradiente de densidad, por ejemplo gradientes de Ficoll. Si se aíslan las células mononucleares a partir de muestras compuestas por tejido, el tejido se disgrega antes de realizar la centrifugación en gradiente. La disgregación puede realizarse, por ejemplo, mediante procedimientos mecánicos tales como procedimientos de molienda, de electroporación y/o químicos tales como los tratamientos enzimáticos. El aislamiento de leucocitos puede realizarse directamente a partir de donantes usando leucoféresis. Las preparaciones de partida, por ejemplo de médula ósea o de tejido, que contienen linfocitos, también pueden usarse en la presente invención. Tales preparaciones necesitarán que se disgreguen, por ejemplo según lo descrito anteriormente, con el fin de facilitar la distribución de células únicas.

Otra característica de la presente invención es el enriquecimiento de la fracción celular que contiene linfocitos, por ejemplo sangre completa, células mononucleares, leucocitos o médula ósea, con respecto a una población de linfocitos particular, tal como células del linaje de linfocitos B o linfocitos T. El enriquecimiento de linfocitos B puede realizarse, por ejemplo, usando la clasificación de células mediante perlas magnéticas o clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, “fluorescence activated cell sorting”) aprovechando las proteínas marcadoras de superficie celular específicas del linaje tales como CD19 u otros marcadores específicos del linaje de células B. El enriquecimiento de linfocitos T puede realizarse, por ejemplo, usando un marcador de superficie celular tal como CD3 u otros marcadores específicos del linaje de células T.

Una característica preferente de la presente invención es clasificar los linfocitos B enriquecidos adicionalmente con el fin de adquirir células plasmáticas, antes de la distribución de las células individualmente entre una pluralidad de recipientes. El aislamiento de células plasmáticas se realiza generalmente mediante clasificación FACS, usando marcadores de superficie tales como CD38 posiblemente en combinación con CD45. También pueden usarse otros marcadores de superficie específicos de células plasmáticas o combinaciones de los mismos, por ejemplo CD138, CD20, CD21, CD40, CD9, HLA-DR o CD62L, dependiendo la elección exacta del marcador de la fuente de células plasmáticas, por ejemplo, amígdalas, sangre o médula ósea. Las células plasmáticas también pueden obtenerse a partir de una población de células que contienen linfocitos, no enriquecida obtenida a partir de cualquiera de estas fuentes. Las células plasmáticas aisladas a partir de sangre se denominan a veces células plasmáticas de sangre tempranas o plasmablastos. En la presente invención estas células también se denominan células plasmáticas aunque son CD19 positivas a diferencia de las células plasmáticas que residen en la médula ósea. Se desean las células plasmáticas para el aislamiento de pares análogos de secuencias que codifican inmunoglobulinas, porque una frecuencia superior de estas células produce anticuerpos específicos de antígeno que reflejan la inmunidad adquirida frente al antígeno deseado y la mayor parte de las células han experimentado hipermutación somática y por tanto codifican anticuerpos de alta afinidad. Además, los niveles de ARNm en células plasmáticas son elevados en comparación con la población de linfocitos B restante, por tanto el procedimiento de transcripción inversa es más eficaz cuando se usan células plasmáticas únicas. Como alternativa al aislamiento de células plasmáticas, pueden aislarse células B de memoria a partir de una fracción celular que contiene linfocitos usando un marcador de superficie celular tal como CD22.

Una característica alternativa de la presente invención es seleccionar los linfocitos B enriquecidos para determinar la especificidad de antígeno antes de la distribución de las células entre una pluralidad de recipientes. El aislamiento de linfocitos B específicos de antígeno se realiza poniendo en contacto los linfocitos B enriquecidos con el antígeno

o los antígenos deseados que permiten la unión del antígeno a la inmunoglobulina expuesta en la superficie, seguido por el aislamiento de agentes de unión. Esto puede realizarse, por ejemplo, mediante recubrimiento de perlas magnéticas con el antígeno o los antígenos deseados seguido por la clasificación de células mediante perlas magnéticas, mediante FACS, mediante recubrimiento de una columna con los antígenos seguido por cromatografía de afinidad, mediante ensayos de exploración con filtros u otros procedimientos conocidos en la técnica. Las células plasmáticas así como los linfocitos B, células mononucleares no enriquecidas, leucocitos, sangre completa, médula ósea o preparaciones de tejido pueden someterse a aislamiento con respecto a la especificidad de antígeno, si esto se desea.

Otra característica de la presente invención, es clasificar linfocitos T enriquecidos (por ejemplo células CD3 positivas) usando marcadores de superficie CD45R0 y/o CD27 para obtener una fracción de células T de memoria. Los linfocitos T también pueden seleccionarse para determinar la especificidad de antígeno de CMH usando complejos péptido-CMH (por ejemplo Callan, M.F. y col. 1998. J. Exp. Med. 187, 1395-1402; Novak, E.J. y col. 1999.

J. Clin. Invest 104, R63-R67).

Otra característica de la presente invención es la inmortalización de cualquiera de las fracciones celulares aisladas descritas anteriormente (por ejemplo linfocitos B, células plasmáticas, linfocitos T o células de memoria). La inmortalización puede realizarse, por ejemplo, con el virus Epstein-Barr (Traggiai, E., y col., 2004. Nat Med 10, 871875) antes de la distribución de las células. Como alternativa, las células únicas aisladas pueden inmortalizarse y expandirse antes de la transcripción inversa. Traggiai y col., Nat Med. 2004 Aug;10(8): 871-5.

Otra característica de la presente invención, es la distribución de una población de células deseadas (por ejemplo células de hibridoma, líneas celulares del linaje de linfocitos B o de linfocitos T, células de sangre completa, células de médula ósea, células mononucleares, leucocitos, linfocitos B, células plasmáticas, linfocitos B específicos de antígeno, células B de memoria, linfocitos T, linfocitos T específicos de antígeno/MHC o células T de memoria) individualmente, dentro de una pluralidad de recipientes, con el fin de obtener una población de células únicas aisladas. Este aislamiento de células únicas se refiere a la separación física de células de una población de células de modo que un único recipiente contiene una célula única, o se carga un microchip, chip o matriz de gel de modo que producen células únicas. Las células pueden distribuirse directamente dentro de múltiples recipientes tales como series de únicos recipientes limitando la dilución. Los únicos recipientes usados en la presente invención son preferentemente aquéllos que pueden aplicarse en PCR (por ejemplo tubos de PCR y placas de PCR de 96 pocillos

o de 384 pocillos o series mayores de recipientes). Sin embargo, también pueden usarse otros recipientes. Cuando se distribuyen las células únicas dentro de un gran número de únicos recipientes (por ejemplo placas de 384 pocillos), se obtiene una población de células únicas. Una distribución de este tipo puede realizarse, por ejemplo, dispensando un volumen dentro de un único recipiente que engloba en promedio una concentración celular de una, 0,5 ó 0,3 células, obteniendo de ese modo recipientes que contienen en promedio una célula única o menos. Puesto que la distribución de células limitando la dilución es un acontecimiento estadístico, una fracción de los recipientes estará vacía, una fracción mayoritaria contendrá una célula única y una fracción minoritaria contendrá dos o más células. Si dos o más células están presentes en un recipiente pueden producirse entre las células presentes en el recipiente algunas aleatorizaciones de las secuencias que codifican la región variable. Sin embargo, puesto que es un acontecimiento minoritario no afectará a la utilidad global de la presente invención. Adicionalmente, las combinaciones de las secuencias que codifican la región variable que no tienen la especificidad ni afinidad de unión deseada no se seleccionarán lo más probablemente y por eso se eliminarán durante un proceso de exploración. Por tanto, acontecimientos minoritarios de aleatorizaciones no afectarán significativamente a la biblioteca final de la presente invención.

Existen alternativas a la distribución celular mediante el límite de la dilución usando, por ejemplo, clasificadores de células tales como máquinas o robots de FACS que pueden programarse para dispensar de manera precisa células únicas dentro de únicos recipientes. Estas alternativas son preferentes, puesto que son menos laboriosas y son más eficaces para obtener uniformemente una distribución de células únicas dentro de únicos recipientes.

Los procedimientos de enriquecimiento, clasificación y aislamiento descritos anteriormente se realizan de modo que la mayoría de las células se mantienen intactas. La ruptura de células durante el enriquecimiento y la clasificación podría dar como resultado aleatorizaciones de las secuencias que codifican la región variable. Sin embargo, no se espera que esto sea un problema puesto que se espera que la frecuencia de ruptura sea baja. El lavado y el posible tratamiento con ARNasa de las células antes de la distribución dentro de únicos recipientes eliminarán cualquier ARN que haya rezumado durante el proceso.

Además, cuando se consideran las descripciones anteriores de cómo distribuir las células con el fin de obtener una población de células únicas en una población de únicos recipientes, no ha de interpretarse como una característica absolutamente que cada recipiente deba contener una única célula. Más bien, indica que una mayoría de los recipientes contienen células únicas, por ejemplo el número de recipientes con dos o más células es inferior al 25 % de la cantidad total de células distribuidas, o incluso mejor es inferior al 10 %.

Otra característica de la presente invención es la realización de una transcripción inversa usando un molde derivado de células distribuidas individualmente entre una pluralidad de recipientes.

Para el fin de la transcripción inversa (RT), según la presente invención, los ácidos nucleicos dentro de una célula única que va a servir como fuente de moldes para la RT, se consideran que se derivan de una célula única aunque no se hayan separado necesariamente de los contenidos restantes de esa célula única.

Cuando se ha realizado la distribución final de las células únicas en sus únicos recipientes, las células únicas pueden expandirse con el fin de obtener una población de células isogénicas antes de la transcripción inversa. Este proceso proporciona más ARNm que va a usarse como molde, que podría ser importante si una diana poco común va a amplificarse y unirse. Sin embargo, las células deben seguir siendo genéticamente idénticas con respecto al gen diana durante la expansión. Las células o la población de células isogénicas aisladas pueden mantenerse intactas o bien lisarse, siempre que el molde para la transcripción inversa no se degrade. Preferentemente, las células se lisan con el fin de facilitar la transcripción inversa y amplificación por PCR posteriores.

La sensibilidad de la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa de la presente invención permite el uso de una cantidad de molde muy pequeña. Según se muestra en el ejemplo 2 y 3, la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa puede llevarse a cabo en una cantidad de molde correspondiente al lisado de una célula única.

Diseño y mezclas de cebadores

Las mezclas de cebadores de la presente invención comprenden al menos cuatro cebadores que forman conjuntos de cebadores de dos en dos, que pueden amplificar al menos dos secuencias diana diferentes de interés. Las mezclas de dos o más de tales conjuntos de cebadores constituyen una mezcla de cebadores múltiplex. Preferentemente, una mezcla múltiplex comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 100, 110, 120, 130, 140 ó 150 conjuntos de cebadores (pares de cebadores). En particular para la amplificación de secuencias que codifican la región variable, un conjunto de cebadores individual dentro de la mezcla de cebadores múltiplex puede constituir varios más de dos cebadores. Preferentemente, un conjunto de cebadores individual comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280 ó 300 cebadores. Preferentemente, el número total de cebadores en una mezcla de cebadores múltiplex es al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150 ó 200 y como mucho 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375 ó 400 cebadores.

Todos los cebadores de la presente invención comprenden una región específica de gen y preferentemente todos los cebadores están equipados adicionalmente con una cola de cebador en el extremo 5’ del cebador, es decir secuencias no codificantes en 5’ que se fusionan al extremo 3’ de la parte de cebador específica de gen. Una cola de cebador de este tipo es aproximadamente desde 6 nucleótidos hasta 50 nucleótidos de longitud, pero puede ser más larga si se desea. Tras la amplificación, se añaden las colas de cebadores a las secuencias diana.

Las colas de cebadores de la presente invención son por ejemplo, colas de clonación y colas de unión tales como, colas adaptadas para la unión mediante acoplamiento, colas adaptadas para la unión mediante recombinación o colas de extensión por solapamiento.

Las colas de clonación pueden ser desde 6 nucleótidos hasta 20 nucleótidos de longitud o más largas y comprenden sitios de restricción y/o sitios de recombinación, que son útiles para la inserción del producto unido dentro de un vector apropiado.

Para permitir la unión mediante acoplamiento, los conjuntos de cebadores de la mezcla de cebadores múltiplex se diseñan de modo que una parte (cebador(es) directo(s) o inverso(s)) del primer conjunto de cebadores está equipado con una cola de unión que contiene un sitio de restricción que tras la rotura será compatible con un sitio de restricción ubicado en la cola de unión de una parte del segundo conjunto de cebadores. Para la unión de más de dos secuencias diana, la segunda parte del segundo conjunto de cebadores está equipada con un sitio de restricción que tras la rotura será compatible con un sitio de restricción ubicado en una parte del tercer conjunto de cebadores. Este segundo sitio de restricción ubicado en el segundo conjunto de cebadores debe ser no compatible con el del primer conjunto de cebadores. Un número considerable de secuencias diana puede unirse diseñando conjuntos de cebadores de este modo. Deben elegirse sitios de restricción con una baja frecuencia o sin aparición en la secuencias diana. Además, es preferente que los sitios de restricción compatibles no sean idénticos, de modo que el sitio de acoplamiento se vuelva resistente a la rotura para las enzimas de restricción particulares usadas. Esto conducirá la reacción hacia la unión de la secuencia diana uno con la secuencia diana dos, puesto que la unión entre secuencias diana idénticas podrá romperse mediante enzimas de restricción. Los pares adecuados de sitios de restricción son por ejemplo, SpeI con XbaI (como alternativa NheI o AvrII pueden sustituir una o ambas de estas), NcoI con BspHI, EcoRI con MfeI o PstI con NsiI. Para la unión, SpeI puede estar ubicada, por ejemplo, en la secuencia diana uno, XbaI puede estar ubicada en la secuencia diana dos, NcoI puede estar ubicada en el otro extremo de la secuencia diana dos y BspHI en la secuencia diana tres, etcétera. Además, para simplificar el proceso, es una ventaja si las enzimas de restricción funcionan en el mismo tampón.

Para permitir la unión mediante recombinación, los conjuntos de cebadores de la mezcla de cebadores múltiplex pueden diseñarse, por ejemplo, según se ejemplifica en el artículo por Chapal (1997 BioTechniques 23, 518-524).

Para permitir la unión de las secuencias de nucleótidos de interés en la misma etapa que la amplificación por PCR múltiplex, las colas adaptadas para la PCR de extensión por solapamiento se añaden al menos a un cebador de cada conjunto de cebadores de la mezcla de cebadores múltiplex, generando de ese modo una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex.

Las colas de extensión por solapamiento son normalmente más largas, oscilando entre 8 nucleótidos y 75 nucleótidos de longitud y pueden contener sitios de restricción o sitios de recombinación que permiten la inserción posterior de elementos reguladores tales como promotores, sitios de unión a ribosomas, secuencias de terminación,

o secuencias conectoras tales como en una scFv. La cola de extensión por solapamiento también puede contener un codón de terminación si se desea. Generalmente existen tres tipos de colas de extensión por solapamiento, tal como se ilustra en la figura 1. En el tipo I, las colas de extensión por solapamiento de dos conjuntos de cebadores solapan únicamente entre sí. No necesariamente todos los nucleótidos de dos colas de extensión por solapamiento son complementarios entre sí. En un aspecto los nucleótidos complementarios representan entre el 60 % y el 85 % de la cola de extensión por solapamiento. En las colas de extensión por solapamiento de tipo II, de 4 a 6 de los nucleótidos en 5’ son complementarios a la región específica de gen de la secuencia diana adyacente. En las colas de extensión por solapamiento de tipo III, el solapamiento entero es complementario a la secuencia diana adyacente. Son preferentes las colas de extensión por solapamiento de tipo I y II cuando los elementos reguladores y similares van a insertarse posteriormente entre las secuencias diana unidas. Son preferentes las colas de extensión por solapamiento de tipo II si las secuencias diana van a unirse mediante un conector definido tal como se observa con scFv. Son preferentes las colas de extensión por solapamiento de tipo III si las secuencias diana van a unirse en marco entre sí.

El diseño de las colas de extensión por solapamiento depende de las características de secuencia tales como la longitud, el contenido en GC relativo ( %GC), presencia de sitios de restricción, palíndromos, temperatura de fusión, parte específica de gen a la que se acoplan, etc. La longitud de las colas de extensión por solapamiento debe ser entre 8 nucleótidos y 75 nucleótidos de longitud, preferentemente son desde 15 nucleótidos hasta 40 nucleótidos de longitud. Incluso más preferentemente son desde 22 nucleótidos hasta 28 nucleótidos de longitud. El uso de colas de extensión por solapamiento largas (de 50 nucleótidos a 75 nucleótidos) podría favorecer la unión de los productos producidos por cada conjunto de cebadores. Sin embargo, la proporción entre la longitud de la cola de extensión por solapamiento y la región específica de gen necesitará probablemente que se ajuste cuando se usan colas de extensión por solapamiento muy largas. La preferencia del %GC depende de la longitud de la cola de extensión por solapamiento. Puesto que las colas más cortas tienen una zona más corta en la que son complementarias, necesitan un %GC superior para fortalecer la interacción que las colas más largas. Otros principios del diseño de cebadores deben observarse de la misma manera, por ejemplo debe minimizarse la formación de horquillas y la dimerización de cebadores. En ninguno de los dos se unirán para dar un falso cebado. Además se sabe que la Taq ADN polimerasa a menudo añade una adenosina (A) en el extremo 3’ de la cadena de ADN recientemente sintetizada y esto puede adaptarse para el diseño de la cola de extensión por solapamiento permitiendo que las colas de extensión por solapamiento adapten la adición de A sin molde en 3’.

La elección de cebadores que llevan la cola de unión, por ejemplo la cola de extensión por solapamiento, la cola adaptada para la unión mediante acoplamiento o la cola adaptada para la unión mediante recombinación, define el orden y la dirección de la unión de las secuencias diana. No es esencial para la invención si es/son el/los cebador(es) directo(s) o el/los cebador(es) inverso(s) de un conjunto de cebadores o posiblemente tanto los cebadores directos como los inversos los que están equipados con la cola de unión. Sin embargo, de todos modos debe darse alguna consideración a esto, puesto que el orden y la dirección de las secuencias diana en el producto final pueden ser relevantes por ejemplo, para la inserción de elementos reguladores tales como promotores y secuencias de terminación o para la unión en marco de las secuencias diana individuales.

Para la unión de dos secuencias de nucleótidos de interés puede añadirse la cola de unión o al/a los cebador(es) inverso(s) o bien al/a los cebador(es) directo(s) de cada conjunto de cebadores usados para la amplificación por PCR de cada secuencia diana. La presente invención ejemplifica la adición de colas de extensión por solapamiento y colas adaptadas para la unión mediante acoplamiento, a los cebadores directos VH y VL de cada conjunto (por ejemplo la figura 2 y el ejemplo 9, respectivamente). Esto da como resultado una dirección de unión de los productos que es de 5’ a 5’ (cabeza a cabeza y bidireccional). Sin embargo, las colas de unión podrían añadirse también al/a los cebador(es) inverso(s) de cada conjunto (por ejemplo CK y/o CA, en el primer conjunto y CH o JH en el segundo conjunto). Esto da como resultado una dirección de unión del producto que es de 3’ a 3’ (cola a cola y bidireccional). Una tercera opción es añadir las colas de unión al/a los cebador(es) inverso(s) del primer conjunto de cebadores (por ejemplo los cebadores CK y/o CA) y el/los cebador(es) directo(s) del segundo conjunto de cebadores (por ejemplo cebador(es) VH) o viceversa. Esto da como resultado una orientación de 3’ a 5’ (cabeza a cola y unidireccional). La figura 3 ilustra las posibles direcciones que pueden generarse dependiendo de qué cebador de cada conjunto de cebadores está equipado con la cola de unión.

Cuando se unen más de dos secuencias de nucleótidos de interés, algunos de los conjuntos de cebadores necesitan tener colas de unión en tanto los cebadores directos como inversos, de modo que una cola es complementaria a una cola del conjunto de cebadores anterior y la otra cola es complementaria a uno de los cebadores del conjunto de cebadores posterior. Este principio se mantiene para todos los conjuntos de cebadores que amplifican las secuencias diana que van a unirse entre otras dos secuencias diana.

El diseño de la parte de cebador específica de gen generalmente debe observar las reglas de diseño de cebadores conocidas tales como minimizar la dimerización del cebador, la formación de horquillas y la apareamiento no específica. Además, han de evitarse cuando sea posible los múltiples nucleótidos G o C como las bases en 3’. La temperatura de fusión (Tf) de las regiones específicas del gen en un conjunto de cebadores debe ser igual preferentemente entre sí más/menos 5 ºC. En la presente invención se desean valores de Tf entre 45 ºC y 75 ºC y valores de Tf de aproximadamente 60 ºC son óptimos para la mayor parte de las aplicaciones. Ventajosamente, el diseño inicial de cebadores puede asistirse mediante programas informáticos desarrollados para este fin. Sin embargo, los diseños de cebadores generalmente necesitan pruebas de laboratorio y optimización rutinaria. Esto puede realizarse, por ejemplo, analizando el tamaño, el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) y secuenciando los productos de amplificación obtenidos usando los conjuntos de cebadores. El uso de las posiciones degeneradas dentro de los cebadores es un enfoque útil cuando se amplifican secuencias con regiones variables o cuando se buscan nuevos miembros de familia que pertenecen a una clase específica de proteínas. Los números de posiciones degeneradas también pueden requerir optimización.

La presente invención engloba conjuntos de cebadores mejorados que pueden usarse juntos en un formato sumamente multiplexado. El conjunto de cebadores descrito por de Haard (de Haard, H.J. y col. 1999. J. Biol. Chem. 274, 18218-18230) se usó como punto de partida y se modificó recortando los extremos 3’ de los cebadores para reducir las interacciones no específicas y añadiendo colas de extensión por solapamiento o colas adaptadas para la unión mediante acoplamiento.

Una característica de la presente invención son las mezclas de cebadores compuestas por al menos dos conjuntos de cebadores que pueden cebar la amplificación y promover la unión de al menos dos secuencias de nucleótidos de interés. Las mezclas de cebadores de la presente invención pueden cebar la amplificación de al menos dos subunidades o dominios de proteínas heteroméricas, por ejemplo que pertenecen a la clase de enzimas, inhibidores, proteínas estructurales, toxinas, proteínas de canal, proteínas G, proteínas receptoras, proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, proteínas de transporte, etc.

Otra característica de la presente invención es una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que comprende conjuntos de cebadores en los que al menos un miembro de conjunto de cebadores de cada conjunto de cebadores comprende una cola de extensión por solapamiento que puede hibridar con la cola de extensión por solapamiento de un miembro de conjunto de cebadores de un segundo conjunto de cebadores.

Las colas de extensión por solapamiento permiten la unión inmediata de los nucleótidos de interés durante la amplificación por PCR de extensión por solapamiento múltiplex, equipando cada producto individual que surge a partir de los conjuntos de cebadores con una cola que es complementaria a un producto colindante. Sin embargo, esto no significa que la unión se produzca necesariamente durante esta primera amplificación por PCR. Dependiendo del sistema de reacciones, la mayor parte de la unión real puede realizarse durante una amplificación adicional con los cebadores externos de la primera amplificación por PCR (amplificación por PCR múltiplex).

Otra característica de la presente invención, es un conjunto de cebadores diseñado para amplificar una familia de secuencias de nucleótidos que contienen las secuencias que codifican la región variable. Ejemplos de tales familias son las cadenas ligeras kappa (por ejemplo VKI-VI en seres humanos), las cadenas ligeras lambda (por ejemplo VL1-10 en seres humanos) y las cadenas pesadas variables (por ejemplo VH1-7 en seres humanos y VH1-15 en ratones) de las inmunoglobulinas, y las regiones variables a, 1, y o 8 del RcT. Un conjunto de cebadores para la amplificación de una familia de secuencias de nucleótidos que contienen secuencias que codifican la región variable a menudo comprende una pluralidad de cebadores en la que varios cebadores pueden ser cebadores degenerados. La amplificación de familias de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas se realiza por ejemplo usando un conjunto de cebadores compuesto por una pluralidad de cebadores complementarios al extremo 5’ de la región variable de la cadena kappa (cebador(es) VLK) o la secuencia líder kappa (cebador(es) VLKL) y/o la cadena lambda (cebador(es) VLA) o la secuencia líder lambda (cebador(es) VLAL) (cebadores directos) junto con la región constante kappa (cebador(es) CK) y/o cebadores lambda (cebador(es) CA) (cebadores inversos) o una pluralidad de tales cebadores. Como alternativa, pueden usarse los cebadores de la región de unión de la cadena ligera (cebador(es) JLK y/o JLA) como cebadores inversos en lugar de los cebadores de la región constante. Como alternativa, los cebadores directos se aparean en la región UTR que precede a la secuencia líder de la cadena ligera variable. Igualmente, las familias de las secuencias que codifican la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas pueden amplificarse con un conjunto de cebadores usando diversas combinaciones de cebadores. Por ejemplo, una pluralidad de cebadores complementarios al extremo 5’ de la región variable de cadena pesada (cebador(es) VH) o la secuencia líder de esta región (cebador(es) VHL) (cebadores directos) junto con una pluralidad de cebadores de la región de unión de cadena pesada (cebador(es) JH) o cebador(es) de la región constante de cadena pesada (cebadores inversos). El cebador CH puede ser específico de isotipo y en principio puede usarse cualquier cebador CH (por ejemplo CH1, CH2, CH3 o CH4), también uno que daría como resultado una cadena pesada de longitud completa. Como alternativa, los cebadores directos se aparean en la región UTR que precede a la secuencia líder de la cadena pesada variable.

El uso de cebadores directos que se aparean en la secuencia líder en lugar del extremo 5’ de la región variable es particularmente útil si se observa la hibridación cruzada para los cebadores de la región variable. Puesto que las mutaciones debidas a la hibridación cruzada se eliminarán de la proteína final porque las secuencias líder se rompen durante el procesamiento de proteínas dentro de la célula. El ejemplo 9 describe el diseño de cebadores líder de cadena ligera kappa y de cadena pesada variable de anticuerpo. El aspecto de que el sitio de cebado se localiza en el extremo 3’ de la secuencia líder codificante (C-terminal) es una ventaja sobre cebadores líder de anticuerpos previos, puesto que esto permite lanzar las secuencias amplificadas entre los vectores de expresión bacterianos y eucariotas de modo que permiten las secuencias líder funcionales en ambos sistemas. El sistema de diseño descrito en el ejemplo 9 puede aplicarse fácilmente a cadenas ligeras lambda de anticuerpos, también cadenas a, 1, y o 8 del RcT.

Una característica de la presente invención son los cebadores que se aparean en el extremo 3’ de la secuencia líder codificante que precede a la secuencia que codifica la región variable, y su uso para la amplificación de secuencias que codifican la región variable.

Una característica preferente de la presente invención es la aplicación de cebadores con al menos el 90 % de identidad de secuencia (preferentemente al menos el 95 % de identidad) con la región específica de gen de SEC ID Nº 86 a 92, que corresponde a los cebadores que se aparean en el extremo C-terminal de las secuencias líder que codifican la cadena pesada (cebadores VHL). La secuencia específica de gen de estas SEC ID Nº corresponde al número de base 18 con respecto al extremo 3’ de las secuencias (véase también la tabla 11).

Otra característica preferida de la presente invención es la aplicación de cebadores con al menos el 90 % de identidad de secuencia (preferentemente al menos el 95 % de identidad) con la región específica de gen de SEC ID Nº 93 a 98, que corresponde a los cebadores que se aparean en el extremo C-terminal de las secuencias líder que codifican la cadena ligera kappa (cebadores VLKL). La secuencia específica de gen de estas SEC ID Nº corresponde al número de base 25 con respecto al extremo 3’ de las secuencias (véase también la tabla 11).

En una realización del presente procedimiento, la mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex usada para la PCR de extensión por solapamiento múltiplex y posiblemente para la etapa de transcripción inversa también comprende a) al menos un cebador CL o JL complementario a la hebra en sentido correcto de una secuencia que codifica la región de cadena ligera de inmunoglobulinas; b) al menos un cebador VL 5’ o cebador líder VL complementario a la hebra antisentido de una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas y puede formar un conjunto de cebadores con el/los cebador(es) en a); c) al menos un cebador CH

o JH complementario a la hebra en sentido correcto de una secuencia que codifica el dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulinas o la región de unión de cadena pesada y d) al menos un cebador VH 5’ o cebador líder VH complementario a la hebra antisentido de una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas, y puede formar un conjunto de cebadores con el/los cebador(es) en c).

Los conjuntos de cebadores de la presente invención pueden ser, por ejemplo, VLK + CK, VLA + CA, VLK + JLK, VLA + JLA, VLKL+ CK, VLAL+ CA, VLKL + JLK, VLAL + JLA, VH + JH, VH + CH, VHL + JH o VHL + CH o combinaciones de estos, que pueden amplificar una secuencia diana que codifica la región variable.

En una realización adicional, son cebador(es) CL (JL) y cebador(es) VL (VLL) adaptados para amplificar secuencias que comprenden las regiones variables de cadena ligera kappa o las regiones variables de cadena ligera lambda.

En una realización preferente, son cebador(es) CL (JL) y cebador(es) VL (VLL) adaptados para amplificar las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera tanto kappa como lambda.

En una realización aún más preferente, son los cebadores directos para cebadores VLL de amplificación de cadena ligera con al menos el 90 % de identidad de secuencia (preferentemente al menos el 95 % de identidad) con la región específica de gen de SEC ID 93 a 98, y los cebadores directos para cebadores VHL de amplificación de cadena pesada con al menos el 90 % de identidad (preferentemente al menos el 95 %) con la región específica de gen de SEC ID 86 a 92.

En una realización adicional, los cebadores VL/VLL y VH/VHL de inmunoglobulinas llevan colas de unión, preferentemente en forma de colas de extensión por solapamiento complementarias. Esto genera secuencias que codifican la región variable que están unidas de un modo cabeza a cabeza. Para la unión de secuencias que codifican la región variable de un modo cabeza a cola, los cebadores CL/JL y VH/VHL contienen colas de unión o bien los cebadores VL/VLL y CH/JH contienen colas de unión, preferentemente en forma de colas de extensión por solapamiento complementarias. Para la unión de secuencias que codifican la región variable de un modo cola a cola, los cebadores CL/JL y CH/JH contienen colas de unión, preferentemente en forma de colas de extensión por solapamiento complementarias (figura 3).

Preferentemente, las mezclas de cebadores múltiplex, incluyendo mezclas de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex, de la presente invención comprenden dos conjuntos de cebadores. Por tanto, una mezcla de cebadores múltiplex comprende al menos cuatro cebadores diferentes. En un aspecto adicional una mezcla de cebadores múltiplex comprende más de cuatro cebadores diferentes. Una mezcla de cebadores múltiplex de la presente invención se usa para la amplificación de secuencias diana en un único recipiente. Por ejemplo, se amplifican las regiones variables de cadena pesada, lambda y kappa todas en el mismo recipiente. Una mezcla de cebadores múltiplex de la presente invención estaba compuesta por 16 cebadores degenerados diferentes distribuidos tal como sigue: ocho cebadores VH, un cebador CH1, seis cebadores VLK y un cebador CK (figura 2). Otro conjunto estaba compuesto por 19 cebadores degenerados distribuidos tal como sigue: ocho cebadores VH, cuatro cebadores JH, seis cebadores VLK y un cebador CK. Un tercer conjunto estaba compuesto por 22 cebadores degenerados distribuidos tal como sigue: ocho cebadores VH, un cebador CH1, once cebadores VLA y dos cebadores CA. Un cuarto conjunto estaba compuesto por 27 cebadores degenerados distribuidos tal como sigue: ocho cebadores VH, un cebador CH1, seis cebadores VLK, un cebador CK, once cebadores VLA y dos cebadores CA.

La presente invención también engloba cebadores para una amplificación adicional por PCR de los productos unidos obtenidos mediante RT-PCR múltiplex seguido por la unión mediante acoplamiento o recombinación o mediante RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Esta amplificación adicional por PCR puede realizarse usando una mezcla de cebadores adaptada para amplificar las secuencias diana unidas. Una mezcla de cebadores de este tipo puede comprender los cebadores externos de la mezcla de cebadores múltiplex o mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex, los que significa que los cebadores se aparean con el extremo 5’ más externo y el extremo 3’ de la hebra sentido de las secuencias de nucleótidos unidas, permitiendo de ese modo la amplificación del producto unido entero. Un ejemplo de cebadores que pueden usarse como externos en la presente invención son los cebadores CK/JK y/o CK/JA que forman un conjunto de cebadores con los cebadores JH o CH. Este proceso sirve generalmente para aumentar la cantidad de producto unido obtenido a partir de la RT-PCR múltiplex seguido por la unión mediante acoplamiento o recombinación o partir de la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex.

Como alternativa puede usarse para la amplificación adicional de las secuencias de nucleótidos unidas un conjunto de cebadores que está anidado en comparación con los cebadores externos usados en la reacción de RT-PCR múltiplex primaria o RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex. En la presente invención un conjunto de cebadores de este tipo se denomina un conjunto de cebadores anidados. El diseño de cebadores anidados generalmente observa las mismas reglas de diseño que para los cebadores específicos de gen descritos anteriormente, excepto que ceban en 3’ con respecto a la posición de apareamiento de los cebadores externos usados en la RT-PCR múltiplex o RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex. El producto resultante a partir de una PCR anidada es por tanto más corto que el producto unido obtenido mediante la RT-PCR múltiplex seguido por la unión mediante acoplamiento o recombinación o mediante la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Además de aumentar la cantidad de producto unido, la PCR anidada sirve además para aumentar la especificidad global, especialmente de la tecnología de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Sin embargo, debe observarse que no todas las mezclas de cebadores múltiplex/mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que se han descrito anteriormente son adecuadas para la combinación con un conjunto de cebadores anidados cuando se realiza la amplificación adicional. En tales casos los cebadores externos de la mezcla de cebadores múltiplex/mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex pueden usarse para la amplificación adicional o puede aplicarse una PCR semianidada según se describe a continuación.

En una realización del presente procedimiento, una mezcla de cebadores JL y JH se usa como cebadores anidados para la amplificación adicional de las secuencias unidas que codifican la región variable de inmunoglobulinas.

Los conjuntos de cebadores anidados de la presente invención también pueden estar compuestos por un(os) cebador(es) externo(s) inverso(s) (o directo(s)) de la primera mezcla de cebadores múltiplex/mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex y un segundo cebador anidado que ceba en 3’ con respecto a la posición de apareamiento del/de los cebador(es) externo(s) directo(s) (o inverso(s)) de la primera mezcla de cebadores múltiplex/mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex. El uso de un conjunto de cebadores de este tipo para una amplificación adicional por PCR se conoce generalmente como una PCR semianidada. La PCR semianidada puede aplicarse, por ejemplo, si es difícil diseñar un cebador anidado en una región específica, por ejemplo para las secuencias de región variable (cebadores V y J), porque un cebador de este tipo tendría que aparearse en las regiones determinantes de complementariedad (CDR). Además, puede usarse PCR semianidada cuando se desea mantener un extremo de las secuencias unidas intacto, por ejemplo para fines de clonación.

Una característica de la presente invención mantiene intacta la secuencia que codifica la cadena ligera constante durante la reacción de amplificación adicional. El/los cebador(es) CL (inverso(s)) usado(s) para la amplificación adicional sólo se modifica(n) ligeramente en comparación con el/los cebador(es) externo(s) usado(s) para la reacción primaria (la reacción de RT-PCR múltiplex o RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex). La modificación comprende la adición de algunas bases al extremo 3’ del/de los cebador(es) CL usado(s) para la amplificación primaria. Además, podría añadirse una cola de clonación diferente al/a los cebador(es) CL anidado(s). El/los cebador(es) directo(s) usado(s) en la amplificación adicional está(n) completamente anidado(s) en comparación con el/los cebador(es) externo(s) específico(s) de cadena pesada constante usado(s) en la reacción primaria. El uso combinado del/de los cebador(es) externo(s) en la reacción primaria y el/los cebador(es) CL anidado(s) ligeramente modificado(s) junto con el/los cebador(es) directo(s) completamente anidado(s) en la amplificación adicional da como resultado un aumento de la especificidad que puede compararse con la que puede conseguirse con una PCR anidada usando un conjunto de cebadores completamente anidados.

En una realización preferente del presente procedimiento, la PCR anidada se realiza con cebador(es) JH y cebador(es) CL modificado(s) en los que se han añadido entre 2 pares de bases y 10 pares de bases específicas de gen en el extremo 3’ en comparación con el/los primer(os) cebador(es) CL de la mezcla de cebadores múltiplex/mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex.

Optimización de PCR de extensión por solapamiento múltiplex

Los parámetros de la etapa de PCR de extensión por solapamiento múltiplex del procedimiento de tanto dos etapas como de una única etapa pueden optimizarse en varios parámetros (véase, por ejemplo, Henegariu, O. y col. 1997. BioTechniques 23, 504-511; Markoulatos, P. y col. 2002. J. Clin. Lab. Anal. 16, 47-51). Generalmente se aplican los mismos parámetros de optimización para la RT-PCR múltiplex, aunque la proporción entre cebadores externos e internos es menos importante para una reacción de este tipo.

a. Concentración de cebadores

La concentración de los cebadores que llevan la cola de extensión por solapamiento (por ejemplo los cebadores VH y VL) es preferentemente inferior a la concentración de los cebadores externos sin cola de extensión por solapamiento (por ejemplo cebadores JH y kappa).

Si una de las secuencias diana se amplifica con una eficacia inferior que las otras, por ejemplo, como resultado de un %GC superior, puede ser posible igualar la eficacia de amplificación. Esto puede realizarse usando una concentración superior del conjunto de cebadores que median la amplificación con baja eficacia, o disminuyendo la concentración del otro conjunto de cebadores. Por ejemplo, las secuencias que codifican las regiones variables de cadena pesada tienden a tener un %GC superior y por tanto una eficacia de amplificación inferior que las regiones variables de la cadena ligera. Esto señala el uso de cebadores VL a una concentración inferior que los cebadores VH.

Además, cuando se usa un gran número de cebadores, podría ser una cuestión la concentración de cebadores total. El límite superior se determina experimentalmente mediante experimentos de valoración. Para el sistema de PCR “AmpliTaq Gold” de Applied Biosystems, se encontró que el límite superior era la concentración de oligonucleótidos total 1,1 !M, sin embargo para otros sistemas puede ser tan alto como 2,4 !M. Un límite superior de este tipo de la concentración de oligonucleótidos total influye a la concentración máxima de cebadores individuales. Si la concentración del cebador individual es demasiado baja, esto provoca probablemente una baja sensibilidad de PCR.

También se ha descubierto que la calidad de los cebadores de oligonucleótidos es importante para los oligonucleótidos purificados por HPLC para PCR de extensión por solapamiento múltiplex, que han producido los mejores resultados.

b. Condiciones de ciclado de PCR:

Preferentemente las condiciones de ciclado son las siguientes:

Desnaturalización:: 10-30 s 94 ºC

Apareamiento:: 30-60 s 50-70 ºC Aproximadamente 5 ºC por debajo de Tj de los cebadores

Extensión:: 1 min x LP E 65-72 ºC LPE es la longitud producto esperado en kb del

Número de ciclos:: 30-80

Extensión final:: 10 min 65-72 ºC

Para la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa se construyeron las siguientes etapas dentro del programa de ciclado antes del ciclado de amplificación explicado de manera resumida anteriormente:

Transcripción 30 42-60 ºC Estas condiciones también se usan si se realiza la

inversa: min transcripción inversa separada

Activación de la 10-15 95 ºC Las polimerasas de inicio en caliente son favorables en la

polimerasa: min activación de RT-PCR de una única etapa según el fabricante

Es posible optimizar en todos estos parámetros. Es especialmente importante la temperatura de apareamiento. Por tanto, inicialmente todos los conjuntos de cebadores individuales que constituyen la mezcla de cebadores final deben someterse a prueba por separado con el fin de identificar el tiempo y la temperatura de apareamiento óptimos, así como los tiempos de elongación y desnaturalización. Esto dará una buena idea sobre el intervalo dentro del que pueden optimizarse estos parámetros para la mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex.

Pueden superarse los problemas con la baja sensibilidad de PCR, por ejemplo debido a la baja concentración de cebadores o concentración de molde usando un alto número de ciclos térmicos. Un alto número de ciclos térmicos constituye entre 35 ciclos y 80 ciclos, preferentemente aproximadamente 40 ciclos.

Además, tiempos de extensión más largos pueden mejorar el proceso de PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Los tiempos de extensión largos constituyen 1,5-4 min x LPE en comparación con la extensión normal de 1 min.

c. Uso de coadyuvantes

Las reacciones de PCR múltiplex pueden mejorarse significativamente usando un aditivo para PCR, tal como DMSO, glicerol, formamida o betaína, que relaja ADN, haciendo más fácil de ese modo la desnaturalización del molde.

d. dNTP y MgCl2

La calidad y concentración de desoxinucleósido trifosfato (dNTP) son importantes para la PCR de extensión por solapamiento múltiplex. La mejor concentración de dNTP está entre 200!M y 400 !M de cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), por encima de la cual se inhibe rápidamente la amplificación. Concentraciones de dNTP inferiores (100 !M de cada dNTP) son suficientes para conseguir la amplificación por PCR. Las soluciones madre de dNTP son sensibles a ciclos de congelación/descongelación. Después de tres a cinco ciclos de este tipo, la PCR múltiplex a menudo no funciona bien. Para evitar tales problemas, pueden prepararse pequeñas alícuotas de dNTP y mantenerlas congeladas a -20 ºC.

La optimización de la concentración de Mg2+ es crítica puesto que la mayor parte de las ADN polimerasas son enzimas dependientes de magnesio. Además de la ADN polimerasa, los cebadores de ADN de molde y los dNTP se unen a Mg2+. Por tanto, la concentración de Mg2+ óptima dependerá de la concentración de dNTP, del ADN de molde y de la composición de tampón de muestra. Si los cebadores y/o tampones de ADN de molde contienen agentes quelantes tales como EDTA o EGTA, puede alterarse el Mg2+ aparente óptimo. Una concentración de Mg2+ excesiva estabiliza la cadena doble de ADN y evita la desnaturalización completa del ADN, que reduce el rendimiento. El Mg2+ en exceso también puede estabilizar la falsa apareamiento de cebador con los sitios de molde incorrectos, disminuyendo de ese modo la especificidad. Por otro lado, una concentración de Mg2+ inadecuada reduce la cantidad de producto.

Un buen equilibrio entre dNTP y MgCl2 es aproximadamente de 200 !M a 400 !M de dNTP (de cada uno) a de 1,5 mM a 3 mM de MgCl2.

e. Concentración de tampón para PCR

Generalmente, los tampones a base de KCl son suficientes para la PCR de extensión por solapamiento múltiplex; sin embargo, tampones a base de otros componentes tales como (NH4)2SO4, MgSO4, Tris-HCl o combinaciones de los mismos, también pueden optimizarse para funcionar con la PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Los pares de cebadores implicados en la amplificación de productos más largos funcionan mejor a concentraciones salinas inferiores (por ejemplo KCl de 20 mM a 50 mM), mientras que los pares de cebadores implicados en la amplificación de productos cortos funcionan mejor a concentraciones salinas superiores (por ejemplo KCl de 80 mM a 100 mM). Elevando la concentración de tampón a 2X en lugar de a 1X puede mejorar la eficacia de la reacción múltiplex.

f. ADN polimerasa

La presente invención se ejemplifica con la Taq polimerasa. Como alternativa, pueden usarse otros tipos de ADN polimerasas resistentes al calor incluyendo, por ejemplo, Pfu, Phusion, Pwo, Tgo, Tth, Vent, Deep-vent. Las polimerasas sin o con actividad exonucleasa de 3’ a 5’ pueden usarse solas o bien en combinación entre si.

Vectores y bibliotecas

La unión de secuencias de nucleótidos de interés según la presente invención produce un segmento de nucleótidos que comprende las secuencias de nucleótidos unidas de interés. Además, las bibliotecas de tales secuencias de ácido nucleico de interés unidas se producen mediante los procedimientos de la presente invención, en particular bibliotecas de secuencias que codifican la región variable.

Una característica de la presente invención es la inserción de un segmento que contiene secuencias de nucleótidos unidas de interés o una biblioteca de secuencias de nucleótidos unidas de interés, generada mediante un procedimiento de la presente invención, dentro de vectores adecuados. Las bibliotecas pueden ser bibliotecas combinatorias o bibliotecas de pares análogos de secuencias que codifican la región variable. Los sitios de restricción generados por los cebadores externos, cebadores anidados o cebadores semianidados se diseñan preferentemente para aparear sitios de restricción apropiados del vector de elección. Las secuencias de ácido nucleico unidas de interés también pueden insertarse dentro de vectores mediante recombinación, si uno de los cebadores semianidados, anidados o cebadores externos estaban equipados con un sitio de recombinación adecuado y el vector de elección contiene uno también.

Básicamente no hay limitaciones para los vectores que pueden usarse como vehículos de los productos generados por uno de los procedimientos de unión por RT-PCR múltiplex de la presente invención. Los vectores de elección pueden ser aquéllos adecuados para la amplificación y expresión en células incluyendo, por ejemplo, bacterias, levaduras, otros hongos, células de insectos, células vegetales, o células de mamíferos. Tales vectores pueden usarse para facilitar además las etapas de clonación, lanzamiento entre sistemas de vectores, presentación del producto insertado dentro del vector, expresión del producto insertado y/o integrado dentro del genoma de la célula huésped.

Los vectores lanzadera y de clonación son preferentemente vectores bacterianos. Sin embargo, los otros tipos de vectores también pueden aplicarse en los procedimientos de lanzamiento y clonación.

Los vectores de presentación pueden ser, por ejemplo, vectores de fago o vectores de fagemido que se originan a partir de la clase de bacteriófagos filamentosos fd, M13 o f1. Tales vectores pueden facilitar la presentación de una proteína incluyendo, por ejemplo, una proteína de unión o un fragmento de la misma, en la superficie de un bacteriófago filamentoso. Los vectores de presentación adecuados para la presentación en ribosomas, ADN, célulasde levadura o células de mamíferos también se conocen en la técnica. Éstos comprenden por ejemplo vectores virales o vectores que codifican las proteínas quiméricas.

Los vectores de expresión existen para todas las especies mencionadas y el que va a elegirse depende completamente de la proteína que va a expresarse. Adicionalmente, algunos vectores de expresión pueden integrarse dentro del genoma de una célula huésped mediante integración aleatoria o bien mediante integración específica del sitio, usando sitios de recombinación apropiados. Los vectores de expresión pueden diseñarse para proporcionar otras secuencias codificantes que, cuando el producto unido se inserta en marco en estas secuencias, permiten la expresión de una proteína más larga, por ejemplo un anticuerpo monoclonal de longitud completa, cuando se introducen dentro de una célula huésped apropiada. Esta inserción en marco también puede facilitar la expresión de proteínas quiméricas que facilitan la presentación en la superficie de una célula o bacteriófago filamentoso. En un sistema de presentación en bacteriófago, las secuencias de nucleótidos unidas de interés pueden insertarse en marco en una secuencia que codifica una cubierta proteínica tal como pIII o pVIII (Barbas, C.F. y col. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982; Kang, A.S. y col. 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4363-4366).

En una realización de la presente invención, los segmentos individuales de secuencias de nucleótidos unidas de interés están compuestos por una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas asociada a una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera. Preferentemente, estas secuencias unidas se insertan dentro de un vector que contiene secuencias que codifican uno o más dominios constantes de inmunoglobulinas. La inserción está modificada mediante ingeniería genética de modo que las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y/o la región variable de cadena pesada unidas se insertan en marco en las secuencias que codifican la región constante. Una inserción de este tipo puede generar, por ejemplo, un vector de expresión Fab, un vector de expresión de anticuerpo de longitud completa o un vector de expresión que codifica un fragmento de un anticuerpo de longitud completa. Preferentemente un vector de este tipo es un vector de expresión adecuado para examinar (por ejemplo vectores de mamífero, fagemido o E. coli) y las secuencias que codifican la cadena pesada de la región constante se eligen de las clases de inmunoglobulina humana IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD o IgE, permitiendo de ese modo la expresión de un Fab o anticuerpo recombinante de cadena completa. Además de las secuencias que codifican la cadena pesada constante, el vector también puede contener una secuencia que codifica la cadena ligera constante elegida de las cadenas kappa o lambda humanas. Esto es apropiado cuando las secuencias de nucleótidos unidas sólo codifican las secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulinas (Fv’s).

En otra realización, los segmentos individuales de las secuencias de nucleótidos unidas están compuestos por una secuencia que codifica la región variable de la cadena a del RcT asociada a una secuencia que codifica la región variable de la cadena P o una secuencia que codifica la región variable de la cadena y asociada a una secuencia que codifica la región variable de la cadena 8. Preferentemente, estas secuencias unidas se insertan dentro de un vector que contiene secuencias que codifica uno o más dominios constantes del RcT. La inserción está modificada mediante ingeniería genética de modo que las secuencias unidas que codifican la región variable insertadas están en marco en las correspondientes secuencias que codifican la región constante del RcT. En una realización adicional, un vector de este tipo es un vector de expresión quimérico que comprende secuencias que codifican una cremallera de leucina en marco en las regiones constantes del RcT. Se ha demostrado que tales constructos aumentan la estabilidad de RcT solubles (Willcox, B.E. y col. 1999. Protein Sci 8, 2418 2423).

Las bibliotecas de pares análogos de la presente invención pueden introducirse dentro de vectores mediante dos enfoques diferentes. En el primer enfoque, los pares análogos únicos se insertan individualmente en un vector adecuado. Esta biblioteca de vectores puede mantenerse entonces separada o bien combinada. En el segundo enfoque, todos los pares análogos se combinan antes de la inserción en el vector, seguido por la inserción en masa dentro de vectores adecuados generando una biblioteca de vectores combinada (ilustrada en la figura 12). Una biblioteca de vectores de este tipo comprende una gran diversidad de pares de secuencias que codifican la región variable.

Un aspecto de la presente invención es una biblioteca de pares análogos de secuencias unidas que codifican la región variable. Preferentemente, los pares análogos individuales de la biblioteca comprenden una secuencia que codifica la región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas asociada a una secuencia que codifica la región variable de cadena pesada.

Otra biblioteca de pares análogos preferente comprende secuencias unidas que codifican la región del RcT, en la que cada una de las secuencias que codifican la región del RcT individuales comprende una secuencia que codifica la región variable de la cadena alfa asociada a una secuencia que codifica la región variable de la cadena beta y/o una secuencia que codifica la región variable de cadena gamma del RcT asociada a una secuencia que codifica la región variable de la cadena delta.

Una realización de la presente invención es una subbiblioteca de pares análogos de secuencias unidas que codifican la región variable que codifican las especificidades de unión deseadas dirigidas frente a una diana particular. Preferentemente, estos pares análogos comprenden secuencias unidas que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas, secuencias que codifican la región variable de la cadena alfa y la región variable de la cadena beta del RcT y/o secuencias que codifican la región variable de la cadena gamma y la región variable de la cadena delta del RcT.

Otra realización es una subbiblioteca seleccionada de una biblioteca original de pares análogos de secuencias que codifican la región variable según se describe a lo largo de la memoria descriptiva.

Una realización preferente de la presente invención es una biblioteca o subbiblioteca que codifica pares análogos de inmunoglobulinas de longitud completa seleccionadas de clases de inmunoglobulina humana IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 o IgM.

Otra característica preferente de la presente invención es una biblioteca o subbiblioteca que codifica pares análogos solubles y estables de RcT.

Una característica de la presente invención es la diversidad de dichas bibliotecas, que están compuestas por al menos 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 ó 106 pares análogos diferentes.

En otra realización de la presente invención, dichas bibliotecas de pares análogos de secuencias unidas que codifican la región variable pueden obtenerse mediante un procedimiento que comprende las etapas descritas en el presente documento. Esta biblioteca también se denomina la biblioteca original.

Exploración y selección

Se espera que la biblioteca original de pares de secuencias unidas que codifican la región variable aislada a partir de un donante, usando uno de los procedimientos de la presente invención, represente una diversidad de proteínas de unión de las cuales algunas serán irrelevantes, es decir de no unión a una diana deseada, en particular para bibliotecas combinatorias. Por tanto, la presente invención engloba enriquecer y examinar para seleccionar una subbiblioteca que codifica un subconjunto de diversidades de especificidades de unión dirigidas frente a una diana particular.

Para bibliotecas de pares análogos, se espera que la diversidad de la biblioteca represente la diversidad presente en el material del donante, con sólo un número minoritario de regiones variables unidas aleatoriamente. Por tanto, una etapa de enriquecimiento puede no ser necesaria antes de la exploración para seleccionar las afinidades de unión específica de diana en una biblioteca compuesta por pares análogos.

En una realización adicional, el procedimiento de generación de una biblioteca de pares de secuencias unidas que codifican la región variable, comprende además crear una subbiblioteca seleccionando un subconjunto de pares de secuencias unidas de la región variable que codifican proteínas de unión con una especificidad diana deseada. Una selección de este tipo de secuencias unidas que codifican la región variable, también se denomina una biblioteca de pares análogos específicos de diana.

En una realización preferente, la biblioteca de pares análogos específicos de diana de secuencias que codifican la región variable se transfiere a un vector de expresión de mamíferos.

Los ensayos inmunológicos son generalmente adecuados para la selección de secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulinas específicas de diana. Tales ensayos se conocen bien en la técnica y constituyen, por ejemplo, ensayos ELISPOTS, ELISA, de membrana (por ejemplo inmunotransferencias de tipo Western), matrices sobre filtros, o FACS. Los ensayos pueden realizarse de manera directa, usando los polipéptidos producidos a partir de las secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulinas. Como alternativa, los inmunoensayos pueden realizarse en combinación con o tras procedimientos de enriquecimiento tales como presentación en fago, presentación en ribosoma, presentación en la superficie bacteriana, presentación en levaduras, presentación en virus eucariotas, presentación en ARN o presentación covalente (revisado en FitzGerald, K., 2000. Drug Discov. Today 5, 253-258). Tal como se ilustra en la figura 10, tanto las bibliotecas análogas de expresión de Fab como las bibliotecas análogas de expresión de anticuerpo de longitud completa pueden someterse a exploración, generando de ese modo una subbiblioteca de clones positivos. Tales ensayos de exploración y procedimientos de enriquecimiento también son adecuados para obtener fragmentos Fv o scFv o bibliotecas combinatorias de regiones variables unidas.

En una realización preferente de la presente invención, la selección de una subbiblioteca de pares análogos específicos de diana de secuencias que codifican la región variable se realiza usando un ensayo de exploración de alta resolución. Los ensayos de exploración de alta resolución pueden ser, pero sin limitarse a, ensayos ELISA realizados con un equipo semiautomático o completamente automático. También puede ser un ensayo con membranas en el que las bacterias se cogen y se siembran por estrías roboticamente en una membrana apropiada en la parte superior de placas de agar generando series de colonias que expresan moléculas de unión a antígeno. Las moléculas se secretan a través de la membrana sobre una segunda membrana recubierta de antígeno subyacente que puede desarrollarse por separado y usarse para identificar clones que secretan moléculas de unión a antígeno hacia la diana deseada (de Wildt, R.M., y col. 2000. Nat. Biotechnol. 18, 989-994).

Cuando se ha seleccionado una subbiblioteca de pares análogos o pares combinatorios de clones de unión a antígeno mediante una tecnología apropiada es posible realizar otro análisis mediante secuenciación de ADN de las secuencias unidas que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas. En primer lugar una secuenciación de ADN de este tipo proporcionará información sobre la diversidad de la biblioteca tal como el origen de la línea germinal, distribución de la familia y maduración dentro de las regiones CDR. Un análisis de este tipo permitirá la selección de clones que representan una amplia diversidad y excluyendo clones repetidos. En segundo lugar, la secuenciación de ADN revelará mutaciones introducidas durante el proceso de aislamiento.

Cuando se analizan las secuencias que codifican la región variable existen tres tipos de mutaciones a considerar cuando se evalúa si una mutación es aceptable: i) el tipo más frecuente de mutaciones resulta del cebado cruzado intrafamiliar, en el que los cebadores de gen V ceban al subconjunto erróneo dentro de una familia de genes V particular. Los cambios introducidos son principalmente sustituciones de codones que se producen naturalmente en una posición particular. Debido al alto grado de homología de secuencia dentro de una familia de genes V, estos cambios pueden considerarse normalmente como cambios conservadores y aceptables; ii) las mutaciones menos frecuentes se inducen mediante el cebado cruzado interfamiliar (por ejemplo, un cebador de la familia VH3 ceba una secuencia que codifica la familia VH1) e inducen más cambios estructurales, significativos, a veces sin equivalentes naturales. Tales cambios pueden afectar posiblemente la inmunogenicidad de la región variable creando nuevo epítopos. Tales cambios pueden identificarse fácilmente y repararse posteriormente usando técnicas biológicas moleculares convencionales o pueden excluirse los clones de la biblioteca; iii) los errores creados mediante la Taq ADN polimerasa se identifican más fácilmente en las secuencias que codifican la región constante y pueden eliminarse fácilmente. Sin embargo, las mutaciones inducidas por Taq desde luego también estarán presentes en las secuencias que codifican la región variable, en las que pueden distinguirse de las mutaciones somáticas que se producen naturalmente, que también son el resultado de las mutaciones aleatorias en las secuencias que codifican la región variable. Considerando que las mutaciones no son sistemáticas y sólo afectan a pares particulares de distinta manera, parece razonable ignorar tales cambios.

Además, los análisis de secuencias pueden usarse para identificar el grado de aleatorizaciones en una biblioteca de pares análogos, tal como se ilustra en la tabla 20 para el grupo de VH H4.

Según se describe en el ejemplo 9, la presencia de las mutaciones descritas en i) y ii) puede circunvenirse en la biblioteca de expresión, cuando se usan cebadores que se aparean en la secuencia líder de las secuencias que codifican la región variable en lugar de cebadores que se aparean en la región 5’ de las regiones variables.

En una realización adicional de la presente invención, la subbiblioteca de pares analizados posiblemente de secuencias y específicos de diana de secuencias unidas que codifican la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera de inmunoglobulinas se transfieren a un vector de expresión de mamíferos. Una transferencia de este tipo puede realizarse dentro de cualquiera de los vectores descritos en la sección anterior, permitiendo la expresión de un anticuerpo recombinante de cadena completa. Si la exploración se realiza con una biblioteca análoga de expresión de anticuerpos de cadena completa de mamífero, puede no ser necesaria una transferencia de este tipo.

En otra realización de la presente invención, la biblioteca original se genera a partir de una fracción celular que contiene linfocitos que está enriquecida en linfocitos T. Los pares de secuencias unidas que codifican la región variable que constituyen la biblioteca original, pueden seleccionarse para codificar un subconjunto de pares de secuencias unidas de la región variable, compuesto por las cadenas alfa y beta y/o gamma y delta que codifican proteínas de unión con una especificidad de diana deseada, generando una subbiblioteca de pares análogos o pares combinatorios. Posteriormente pueden identificarse receptores de células T específicos de antígeno a partir de una combinación de células transfectadas usando metodología convencional tal como tinción con complejos péptido-MHC tetraméricos (por ejemplo, Callan, M.F. y col. 1998. J. Exp. Med. 187, 1395-1402; Novak, E.J. y col. 1999. J. Clin. Invest 104, R63-R67), midiendo las respuestas celulares en forma de liberación de IL-2 o mediante medios más sofisticados tales como técnicas de presentación retrovirales o en levaduras.

Células huésped y expresión

Las bibliotecas de la presente invención pueden transferirse a vectores adecuados para la expresión y producción de proteínas codificadas a partir de las secuencias de ácido nucleico unidas de interés, en particular las proteínas de unión que contienen la región variable o fragmentos de las mismas. Tales vectores se describen en la sección de Vectores y bibliotecas, y proporcionan la expresión de por ejemplo anticuerpos de longitud completa, fragmentos Fab, fragmentos Fv, scFv, RcT solubles o unidos a membrana o fragmentos de RcT de una especie de elección.

Una característica de la presente invención es la introducción dentro de una célula huésped de una biblioteca o una subbiblioteca de vectores de pares análogos de secuencias unidas que codifican la región variable o un único clon que codifica un par análogo de secuencias unidas que codifican la región variable, para la amplificación y/o expresión. Las células huésped pueden elegirse de bacterias, levaduras, otros hongos, células de insecto, células vegetales, o células de mamíferos. Para los fines de expresión, son preferentes células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, Sp2/0 células, NS0), NIH 3T3, fibroblasto o células humanas inmortalizadas tales como células HeLa, células HEK 293, o POR.C6.

La introducción de vectores dentro de células huésped puede realizarse mediante diversos procedimientos de transformación o transfección conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo precipitación con fosfato de calcio, electroporación, microinyección, fusión de liposomas, fusión de fantasma de RBC, fusión de protoplastos, infección viral y similares. Se conoce bien la producción de anticuerpos monoclonales de longitud completa, fragmentos Fab, fragmentos Fv y fragmentos scFv.

La producción de anticuerpos policlonales recombinantes que van a usarse para el tratamiento es un área bastante nueva. Se ha descrito una tecnología de fabricación policlonal recombinante en la solicitud PCT WO 2004/061104. En resumen, esta tecnología implica la generación de una colección de células, adecuadas como una línea celular de fabricación. La siguiente descripción de la técnica se realiza para una biblioteca de pares análogos, sin embargo puede aplicarse para una biblioteca combinatoria. Las células individuales en la colección de células pueden expresar un miembro distinto de la proteína de unión policlonal recombinante por ejemplo de una biblioteca de pares análogos. Con el fin de garantizar que las células individuales expresen un único par análogo y no varios pares análogos de la proteína de unión policlonal, las secuencias de ácido nucleico que codifican los pares análogos se introducen dentro de un único sitio-sitio específico en el genoma de cada célula individual. Esto es una característica importante de la colección de células, puesto que esto evita las aleatorizaciones de las cadenas pesada y ligera expresadas a partir de cada célula, pero también porque genera células que son prácticamente idénticas a otras, excepto para las pequeñas diferencias en las regiones variables de los pares análogos individuales. Este rasgo permitirá un crecimiento ecuánime de la colección de células a lo largo del periodo de tiempo necesario para la producción. Para garantizar la integración específica de un único sitio, debe usarse una célula huésped con sólo un sitio de integración, éstas están comercialmente disponibles por ejemplo células CHO Flp-In de Invitrogen que contienen un único sitio FRT. Los vectores apropiados para esta línea celular contienen un sitio FRT correspondiente y se introducen dentro del genoma usando la Flp recombinasa. Existen otras varias recombinasas conocidas por ejemplo Cre, beta-recombinasa, Gin, Pin, PinB, PinD, R/RS, lambda integrasa, o fago <C31 integrasa que pueden usarse en combinación con sus correspondientes sitios de recombinación. Además, los vectores apropiados contienen un marcador de selección que permite la selección de integrantes específicos de sitio.

La generación de una línea celular de fabricación policlonal y la producción de una proteína policlonal a partir de una línea celular de este tipo puede obtenerse mediante varias estrategias distintas de fabricación y transfección.

Un modo es usar una biblioteca de vectores mixtos juntos dentro de una única composición, para la transfección de la línea de células huésped con un único sitio de integración por célula. Este procedimiento se denomina transfección masal o transfección en masa. Generalmente, el diseño del vector y la célula huésped descritos anteriormente garantizarán que una línea celular policlonal que puede crecer de maneta ecuánime se obtendrá tras la selección apropiada. Una solución madre congelada de la línea celular policlonal se generará antes de la iniciación de la fabricación de la proteína policlonal recombinante.

Otro modo es usar una biblioteca de vectores dividida en fracciones que contienen aproximadamente de 5 vectores a 50 vectores individuales de la biblioteca en una composición, para la transfección. Preferentemente, una fracción de la biblioteca constituye de 10 vectores a 20 vectores individuales. Entonces se transfiere cada composición dentro de una alícuota de células huésped. Este procedimiento se denomina transfección semimasal. El número de alícuotas transfectadas dependerá del tamaño de la biblioteca y el número de vectores individuales en cada fracción. Si la biblioteca por ejemplo constituye 100 pares análogos distintos, que se dividen en fracciones que contienen 20 miembros distintos en una composición, se necesitarían que 5 alícuotas de células huésped se transfirieran con una composición de biblioteca que constituye una fracción distinta de la biblioteca original. Las alícuotas de células huésped se seleccionan para la integración específica de sitio. Preferentemente, las distintas alícuotas se seleccionan por separado. Sin embargo, también pueden estar combinadas antes de la selección. Las alícuotas pueden analizarse para determinar su diversidad clonal y sólo aquéllas con diversidad suficiente se usarán para generar una solución madre de biblioteca de pares análogos policlonales. Para obtener la línea celular policlonal deseada para la fabricación, pueden mezclarse las alícuotas antes de generar la solución madre congelada, inmediatamente después de haberlas recuperado de la solución madre o después de un corto tiempo de proliferación y de adaptación. Opcionalmente, las alícuotas de células se mantienen separadas a lo largo de la producción y la composición de proteína policlonal se ensambla combinando los productos de cada alícuota en lugar de las alícuotas de células antes de la producción.

Un tercer modo es un procedimiento de alto rendimiento en el que las células huésped se transfieren por separado usando los vectores individuales que constituyen la biblioteca de pares análogos. Este procedimiento se denomina transfección individual. Las células huésped transfectadas individualmente se seleccionan preferentemente para la integración específica de sitio por separado. Los clones de células individuales generados tras la selección pueden analizarse con respecto al tiempo de proliferación y preferentemente, aquéllos con velocidades de crecimiento similares se usan para generar una solución madre de biblioteca de pares análogos policlonales. Los clones de células individuales pueden mezclarse para obtener la línea celular policlonal deseada antes de generar la solución madre, inmediatamente después de haberlos recuperado de la solución madre o después de un corto tiempo de proliferación y de adaptación. Este enfoque puede eliminar cualquier sesgo de secuencia residual posible durante la transfección, integración y selección. Como alternativa, las células huésped transfectadas individualmente se mezclan antes de realizar la selección, esto permitirá el control de sesgo de secuencia debido a la transfección.

Una característica compartida en las estrategias de fabricación explicada de manera resumida anteriormente es que todos los pares análogos individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante pueden producirse en uno

o un número limitado de biorreactores. La única diferencia es la fase en la que se elige para generar la colección de células que constituye la línea celular de fabricación policlonal.

Una realización de la presente invención es una población de células huésped que comprende una biblioteca o subbiblioteca análoga de pares unidos de secuencias que codifican la región variable

En una realización adicional, una población de células huésped comprende una biblioteca obtenida a partir de una población de células únicas aisladas que constituyen linfocitos, usando la amplificación por RT-PCR múltiplex seguido por la unión mediante acoplamiento o recombinación o la tecnología RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de la presente invención, para unir los pares análogos.

Otra realización de la presente invención es una población de células huésped que comprende una biblioteca o subbiblioteca combinatoria de pares unidos de secuencias que codifican la región variable.

Una población de células huésped según la presente invención englobará una población diversa de células correspondiente a la diversidad de la biblioteca con la que se han transformado/transfectado las células. Preferentemente, cada célula de la población de células sólo constituye un par análogo de la biblioteca completa de pares análogos y ningún miembro individual de la biblioteca de pares análogos supera más del 50 %, más preferentemente el 25 %, del modo más preferente el 10 %, del número total de miembros individuales expresados a partir de la población de células huésped.

En una realización preferente de la presente invención, la población de células huésped son normalmente células de mamíferos.

Una población de células huésped según se ha descrito anteriormente puede usarse para la expresión de una proteína de unión policlonal recombinante, puesto que las células individuales de la población constituyen las secuencias que codifican la región variable de diversidad diferente.

Una realización del presente procedimiento es una proteína policlonal recombinante expresada a partir de una población de células huésped que comprende una biblioteca de vectores que codifican diversos pares análogos de secuencias unidas que codifican la región variable, pudiéndose obtener una biblioteca de este tipo mediante el procedimiento de la presente invención. Normalmente, una proteína policlonal recombinante de este tipo está compuesta por al menos 2, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 ó 106 proteínas compuestas por pares análogos diferentes.

Una realización preferente es una inmunoglobulina policlonal recombinante expresada a partir de una población de células huésped que comprende una biblioteca de vectores que codifican diversos pares análogos de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada.

Otra realización preferente es un RcT policlonal recombinante expresado a partir de una población de células huésped que comprende una biblioteca de vectores que codifican diversos pares análogos de secuencias que codifican la región variable de la cadena alfa unida con la región variable de la cadena beta de RcT y/o secuencias que codifican la región variable de la cadena gamma unida con la región variable de la cadena delta de RcT.

Otra realizació es una célula huésped adecuada para la producción de una proteína monoclonal. En particular un anticuerpo monoclonal compuesto por un par análogo de una región variable de cadena ligera con una región variable de cadena pesada o un RcT monoclonal compuesto por un par análogo de una región variable alfa con una región variable beta o una región variable delta con una región variable gamma. Preferentemente, una línea celular de producción monoclonal de este tipo no es una línea celular de hibridoma.

Un anticuerpo o RcT monoclonal de este tipo puede generarse añadiendo las siguientes etapas al procedimiento de unión de una pluralidad de secuencias de nucleótidos no contiguas de interés a) insertar dichas secuencias de ácido nucleico unidas dentro de un vector, b) introducir dicho vector dentro de una célula huésped; c) cultivar dichas células huésped en condiciones adecuadas para la expresión; y d) obtener el producto proteico expresado a partir del vector insertado dentro de dicha célula huésped. Preferentemente, el vector introducido dentro de la célula huésped codifica un par análogo individual de secuencias que codifican la región variable.

Aplicaciones de la invención

Una de las principales aplicaciones de la presente invención es la unión de pares análogos de secuencias que codifican la región variable, especialmente secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas o secuencias que codifican la región variable de la cadena alfa y beta o cadena gamma y delta del RcT, mediante un procedimiento de alto rendimiento para la generación de bibliotecas de pares análogos. Además de la generación de bibliotecas de pares análogos, las técnicas de RT-PCR múltiplex seguido por la unión mediante acoplamiento o recombinación o de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de la presente invención pueden usarse en la generación de bibliotecas combinatorias realizando la técnica en una población de células genéticamente diversas, lisados celulares a partir de una población de células de este tipo, o en ARN purificado a partir de una población de células de este tipo. Las bibliotecas, subbibliotecas o clones únicos a partir de una de estas bibliotecas facilitan la expresión de proteínas monoclonales o policlonales. Especialmente, los anticuerpos monoclonales o policlonales pueden obtenerse a partir de las bibliotecas de la presente invención.

Se conoce bien el uso de anticuerpos monoclonales recombinantes en diagnósticos, tratamiento y profilaxis. Los anticuerpos monoclonales y policlonales recombinantes generados mediante la presente invención tendrán las mismas aplicaciones que los productos de anticuerpos generados mediante las tecnologías existentes. En particular, una composición farmacéutica que comprende una inmunoglobulina recombinante policlonal como principio activo, combinada con al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, puede producirse por medio de la presente invención. Son más preferentes las composiciones farmacéuticas en las que la inmunoglobulina recombinante policlonal está compuesta por pares análogos de secuencias que codifican la región variable. Tales composiciones farmacéuticas de inmunoglobulinas recombinantes policlonales pueden usarse como medicamentos. La inmunoglobulina recombinante policlonal de la composición puede ser específica para o reactiva frente a una diana de enfermedad predeterminada y la composición puede usarse por tanto para el tratamiento, mejora o prevención de enfermedades tales como cáncer, infecciones, enfermedades inflamatorias, alergias, asma y otras enfermedades respiratorias, enfermedades autoinmunitarias, disfunciones inmunológicas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades en el sistema nervioso central, enfermedades metabólicas y endocrinas, rechazo de transplante o embarazo no deseado, en un mamífero tal como un ser humano, un animal doméstico o un animal de compañía.

La presente invención tiene una aplicación adicional que no puede obtenerse con las técnicas convencionales de anticuerpos combinatorios monoclonales. En situaciones en las que los antígenos protectores están poco caracterizados o bien se desconocen completamente, tal como en las enfermedades infecciosas emergentes, es imposible explorar un anticuerpo monoclonal que proporcionará protección frente a la enfermedad.

Sin embargo, con la presente invención será posible obtener células que expresan anticuerpos directamente a partir de donantes con una respuesta de anticuerpo protector establecida, por ejemplo pacientes convalecientes, y el uso del material de partida a partir de estos individuos para generar una biblioteca de pares análogos de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y pesada de inmunoglobulinas.

En situaciones en las que, por ejemplo, se conoce el virus, pero los antígenos protectores se desconocen, será posible generar una subbiblioteca de pares génicos de anticuerpos análogos con amplia reactividad hacia las estructuras antigénicas en el virus. Si se produce un anticuerpo policlonal recombinante a partir de una subbiblioteca de este tipo, probablemente contendrá anticuerpos protectores.

En situaciones en las que los antígenos se desconocen completamente, puede usarse un anticuerpo policlonal recombinante generado a partir de una biblioteca de pares análogos de por ejemplo pacientes convalecientes, de la misma manera que las inmunoglobulinas hiperinmunitarias se están usando actualmente. El motivo de esto es el apareamiento análogo que garantiza que el anticuerpo policlonal recombinante producido se asemeja mucho a la respuesta inmunitaria de anticuerpos del paciente convaleciente.

Otra aplicación de las técnicas para unir pares análogos de regiones variables, descritas en la presente invención, es para fines analíticos y de diagnóstico. Cuando se administra un medicamento a un paciente, la posibilidad de una respuesta inmunitaria dirigida hacia el medicamento siempre existe. Esta inmunogenicidad puede evaluarse mediante técnicas convencionales, tales como ensayos de unión específica a medicamento con suero o plasma derivado del individuo tratado con el medicamento. Como alternativa, los procedimientos de la presente invención pueden usarse para reflejar la respuesta inmunitaria del paciente poco después de la administración del medicamento, aislando pares análogos de secuencias que codifican la cadena pesada y la cadena ligera variable. Entonces, los anticuerpos expresados a partir de una biblioteca de este tipo pueden explorarse para determinar la reactividad hacia el medicamento o componentes del medicamento. Este procedimiento es particularmente útil si la presencia del medicamento en plasma o en suero interfiriere con el procedimiento convencional. Tales medicamentos son por ejemplo anticuerpos. Con los procedimientos convencionales, la identificación de una respuesta inmunitaria anti-medicamento (por ejemplo una respuesta inmunitaria anti-idiotípica, anti-estructura o anti-Fc) con respecto al tratamiento con un anticuerpo no puede realizarse hasta que el anticuerpo usado para el tratamiento se haya eliminado completamente de la sangre. Con la presente invención pueden aislarse y analizarse secuencias que codifican tales anticuerpos anti-medicamentos del individuo tratado con el medicamento en el plazo de un par de semanas. Por tanto, sería un procedimiento alternativo para evaluar si los fármacos en general y en particular los fármacos a base de anticuerpos son inmunogénicos.

Una aplicación adicional de la presente invención está en la validación y comparación de vacunas y programas de inmunización. Esto es particularmente útil durante el desarrollo de vacunas, puesto que será posible evaluar y comparar la diversidad de secuencias de las respuestas de anticuerpos generadas en respuesta a las vacunas candidatas novedosas, además de las comparaciones actuales de afinidades de unión a anticuerpo y valoración sérica. Además, la presente invención puede usarse para analizar, controlar y comparar respuestas de anticuerpos en la vigilancia de la eficacia de vacunas en poblaciones.

La presente invención también se aplica fuera del campo de las proteínas de unión que contienen la región variable. Esto es simplemente una cuestión de optimización para un experto en la técnica para adaptar las técnicas dadas a conocer en la presente invención para unir dos o más secuencias de nucleótidos transcritas que codifican una proteína heteromérica distinta de una proteína de unión. Una unión de este tipo de secuencias que codifican dominios o subunidades de una proteína heteromérica puede ser una ventaja en el aislamiento de estas secuencias que codifican proteínas, puesto que reduciría el número de éstas considerablemente. Además, es posible aislar por ejemplo variantes de corte y empalme, mutaciones o nuevos miembros de familia de tales proteínas usando sólo una mezcla de cebadores múltiplex/mezcla de cebadores de extensión por solapamiento.

La unión de secuencias que codifican dominios distantes de una única proteína también es una posibilidad. Una técnica de este tipo facilitaría la búsqueda con respecto a la importancia de ciertos dominios en una proteína de múltiples dominios, puesto que facilitaría la deleción de dominios intermedios.

La generación de proteínas quiméricas o acopladas también es un área en la que puede aplicarse la presente invención. Incluso si las proteínas que van a unirse son de origen diferente, por ejemplo una quimera entre una proteína de ser humano y una de ratón, la presente invención puede usarse mezclando las células antes de la transcripción inversa. Una mezcla de células de este tipo puede constituir una población de células de cada especie o bien una célula única de cada especie.

Ejemplos Ejemplo 1: RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de dos etapas

En este ejemplo, se realizó la transcripción inversa (RT) usando un molde derivado de una célula única aislada y se usó el ADNc producido como molde para más de una PCR de extensión por solapamiento múltiplex.

a. Células

Se generó una línea de células de ovario de hámster chino (CHO) que expresaba kappa de IgG1 usando la tecnología Flp-In (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.).

Se construyó un vector de plásmido pLL113 que expresaba kappa de IgG de mamíferos (figura 4) basándose en el vector de expresión de Flp-In, pcDNA5/FRT. Se transfectaron conjuntamente las células CHO-Flp-In, usando Lipofectamin2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, con pLL113 que contenía los genes que codifican el anticuerpo y pOG44 que confería la expresión transitoria de la Flp recombinasa. Se seleccionaron los transformantes y se verificaron para la producción de kappa de IgG mediante inmunoensayos. La línea celular seleccionada se denominó CHO Flp-In pLL113, y se mantuvo en medio F-12 de Ham, complementado con L-glutamina 2 mM, FCS al 10 % e higromicina B 900 (medios de mantenimiento).

Se recogieron las células CHO Flp-In pLL113 usando tripsina y se lavaron 3x en medios de mantenimiento. Después del lavado final se resuspendieron las células en el volumen original de medios de mantenimiento. Se determinó la concentración celular usando un sistema Casy-1 (Schärfe System GmbH, Reutlingen, Alemania) y se diluyó en medios de mantenimiento hasta una concentración de 1 célula/5 !l.

b. Transcripción inversa

Se dispensó la suspensión de células CHO Flp-In pLL113, que contenía en promedio una célula, dentro de pocillos

individuales de una placa de PCR de 96 pocillos (Thermo-Fast 96, skirted AB-0800, ABgene, Epsom, Surrey, RU). Se sintetizó el ADNc a partir de células distribuidas usando la etapa de transcriptasa inversa (RT) en el protocolo de RT-PCR de una única etapa de Qiagen (kit OneStep RT-PCR de Qiagen, nº de catálogo 210210, Hilden, Alemania).

Cada pocillo contenía los siguientes reactivos en un volumen total de 20 !l: 1 x tampón para RT-PCR de una etapa, dNTP en una concentración final de 1 mM de cada uno, 5 pmol de Oligo poly-dT (18), 26 U de inhibidor de RNasa (RNasin, Promega, Madison EE.UU., nº de catálogo N2111), 2 !l de mezcla de enzimas para RT-PCR de una etapa, y 5 !l de suspensión de células CHO Flp-In pLL113. Se realizó la reacción de RT incubando las mezclas de reacción a 55 ºC durante 30 min. Posteriormente, se inactivó

la transcriptasa inversa incubando la mezcla de reacción a 94 ºC durante 10 min.

c. PCR de extensión por solapamiento múltiplex

Se usó una fracción de los productos de ADNc generados en la etapa b) como molde para PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Se realizaron las reacciones en placas de 96 pocillos. Cada pocillo contenía, en un volumen total de 40 !l, los siguientes reactivos: 1 x tampón para RT-PCR de una etapa,

dNTP en una concentración final de 500 !M de cada uno, mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex en las concentraciones tal como se indican en la tabla 1,

26 U de inhibidor de RNasa (RNasin, Promega, Madison EE.UU., nº de catálogo N2111), 2 !l de mezcla de enzimas para RT-PCR de una etapa, y

1 !l de molde de ADNc (derivado de una célula única (etapa b)). La mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex usada comprendía los cebadores mostrados en la tabla 1. Tabla 1

Nombre de cebador: Conc. SEC ID Nº Secuencia de cebador en la dirección de 5’ a 3’

VH: 20 nM de cada uno 1 2 3 4 5 6 7 8 agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCART agcctatactattgattaggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGT agcctatactattgattaggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG agcctatactattgattaggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGT agcctatactattgattaggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT agcctatactattgattaggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGT agcctatactattgattaggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC

CH: 100 nM 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG

VL: 20 nM de cada uno 10 11 12 13 14 cgcctaatcaatagtataggctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT cgcctaatcaatagtataggctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT cgcctaatcaatagtataggctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT cgcctaatcaatagtataggctagccGATATTGTGATGACCCACACT cgcctaatcaatagtataggctagccGAAACGACACTCACGCAGT

15: cgcctaatcaatagtataggctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT

CLK: 100 nM 16 atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTG

W=A/T, S=G/C, R=A/G. Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen.

5 Se realizaron las reacciones con un termociclador MWG Primus HT de 96 pocillos (MWG Biotech AG, Ebersberg,

Alemania) con las siguientes condiciones de ciclado: Desnaturalización 30 s 95 ºC Apareamiento 30 s 50 ºC

50 ciclos Extensión 5 min 72 ºC Extensión final 10 min 72 ºC

d. PCR anidada

10 Se realizó la PCR anidada usando los productos de extensión por solapamiento múltiplex como molde. Las reacciones se realizaron en placas de 96 pocillos. Cada pocillo contenía, en un volumen total de 50 !l, los siguientes reactivos: 1 x tampón BioTaq, dNTP en una concentración final de 400 !M de cada uno,

MgCl2 2 mM, mezcla de cebadores para PCR anidada, 1,25 U de ADN polimerasa BIOTAQ (Nº de catálogo BIO-21040, Bioline, RU), y 1 !l de producto de PCR de extensión por solapamiento múltiplex (etapa c). Los cebadores usados se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

JH: 100 nM de cada uno 17 18 19 20 atattctcGAGACGGTGACCAGGGTG atattctcGAGACGGTGACCATTGT atattctcGAGACGGTGACCAGGGTTC atattctcGAGACGGTGACCGTGGT

CLK: 100 nM 21 accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT

Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen

Se realizaron las reacciones con un termociclador MWG Primus HT de 96 pocillos (MWG Biotech AG, Ebersberg, Alemania) con las siguientes condiciones de ciclado:

Desnaturalización 30 s 95 ºC

Apareamiento 30 s 50 ºC

25 ciclos

Extensión 90 s 72 ºC

Extensión final 10 min 72 ºC

Se analizaron los productos de PCR anidada mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % usando bromuro de etidio para la detección (figura 5). El tamaño esperado del producto de extensión por solapamiento era de 1076 pb. Un producto de este tipo puede observarse en los carriles 1, 5, 6, 7, 8 y 12 indicados mediante las flechas (figura

15 5A). En el experimento mostrado, el control negativo está contaminado y también está presente una contaminación similar en las muestras. La figura 5B ilustra los fragmentos de la figura 5A, que son relevantes para el presente experimento.

El presente experimento ilustra un modo para realizar la PCR de extensión por solapamiento múltiplex de dos etapas, usando un molde derivado de una célula única. Además, se demostró que es posible realizar

20 aproximadamente veinte PCR de extensión por solapamiento múltiplex usando el ADNc generado a partir de una célula única aislada.

Ejemplo 2: RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa

En este ejemplo se realizó la transcripción inversa y PCR de extensión por solapamiento múltiplex en una única etapa usando un molde a partir de células lisadas, en concentraciones correspondientes a 100, 10 ó 1 células.

25 a. Células

La línea celular de hibridoma humana HB-8501 que producía un anticuerpo kappa de IgG1 anti-tétano se adquirió de la Colección Americana de Cultivos Tipo y se cultivaron en un medio Iscove modificado por Dulbecco (Vitacell, Kiev, Ucrania, nº de catálogo 30-2005) que contenía suero bovino fetal al 10 %. Antes de realizar la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex, se recogieron las células, se contaron y se congelaron a -80 ºC en medio de cultivo en una concentración de 200 células/!l.

b. RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa

Se usó el kit para RT-PCR de una única etapa de Qiagen (Qiagen nº de catálogo 210212, Hilden, Alemania) para la

RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex esencialmente según la recomendación del fabricante. Antes de la

5 adición a los tubos de PCR se descongelaron los lisados celulares y se diluyen en H2O para dar una concentración

de lisado correspondiente a 100, 10 y 1 células por 5 !l.

Cada tubo de PCR contenía los siguientes reactivos en un volumen total de 50 !l:

1 x tampón para RT-PCR de una etapa,

dNTP en una concentración final de 400 !M de cada uno, 10 mezcla de cebadores de extensión por solapamiento en las concentraciones tal como se indican en la tabla 3,

2 !l de mezcla de enzimas para RT-PCR de una etapa,

50 U de inhibidor de RNasa (RNasin, Promega, Madison EE.UU., nº de catálogo N2515), y

5 !l de lisado celular diluido

La mezcla de cebadores de extensión por solapamiento usada comprendía los cebadores mostrados en la tabla 3. 15 Tabla 3 Se realizaron las reacciones usando las siguientes condiciones de ciclado:

22: gctageattattattaccatggccCAGRTGCAGCTGGTGCART

23: gctagcattattattaccatggccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT

24: gctagcattattattaccatggccCAGRTCACCTTGAAGGAGT

25: gctagcattattattaccatggccSAGGTGCAGCTGGTGGAG

VH: 40 nM 26 tattggcgcgccatggccsaggtgCAGCTGGTGGAG

de cada uno: 27 gctagcattattattaccatggccCAGGTGCAGCTACAGCAGT

28: gctagcattattattaccatggccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT

29: gctagcattattattaccatggccGARGTGCAGCTGGTGCAGT

30: gctagcattattattaccatggccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC

31: atattctcGAGACGGTGACCAGGGTG

200 nM: 32 atattctcGAGACGGTGACCATTGTCC

JH: de cada uno 33 atattctcGAGACGGTGACCAGGGTTC

34: atattctcGAGACGGTGACCGTGGTCC

VL: 40 nM de cada uno 35 36 37 38 39 40 ccatggtaataataatgctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT ccatggtaataataatgctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT ccatggtaataataatgctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT ccatggtaataataatgctagccGATATTGTGATGACCCACACT ccatggtaataataatgctagccGAAACGACACTCACGCAGT ccatggtaataataatgctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT

CLK: 200 nM 16 atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTG

W=A/T, S=G/C, R=A/G. Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen

Transcripción inversa: 30 min 55 ºC Activación de la polimerasa: 15 min 95 ºC inactivando la transcriptasa inversa

y activando la Taq polimerasa

5 Reacción de PCR:

Desnaturalización 30 s 94 ºC Apareamiento 30 s 44 ºC

50 ciclos

Extensión 3 min 72 ºC

Extensión final 10 min 72 ºC

Se analizaron diez microlitros de los productos de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % usando bromuro de etidio para la detección (figura 6A).

10 El tamaño esperado de los fragmentos (el tamaño exacto depende de las longitudes de las regiones variables):

VH: 410 pb

LC: 680 pb

Fragmento de extensión por solapamiento: 1070 pb

Se observan para todas las diluciones del lisado celular fragmentos de ADN diferenciados con movilidades

15 correspondientes a las longitudes de la región constante (LC) y variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada (VH). Se observa en los lisados de 100 y 10 células un fragmento menos intenso con movilidad correspondiente al supuesto fragmento de extensión por solapamiento. El fragmento de extensión por solapamiento de una muestra de lisado celular, es difícil de reconocer, aunque puede observarse en el gel original (véase la flecha en la foto mostrada en la figura 6A y el esquema mostrado en la figura 6B).

20 c. Identificación del fragmento de extensión por solapamiento

A partir de un experimento reproducido como el descrito anteriormente se verifica la presencia de la banda de extensión por solapamiento. Se cortaron las regiones en el gel de agarosa de aproximadamente 1070 pb de un carril correspondiente a 1 célula y de un carril correspondiente a 100 células y se purificó el ADN usando Qiaex II (Qiagen nº de catálogo 20051, Hilden, Alemania) y se eluyó en 20 !l de agua.

Se sometió un microlitro del eluato a PCR (kit Biotaq, Bioline, RU, nº de catálogo BIO-21040) según las instrucciones del fabricante con cebadores flanqueando el supuesto fragmento de extensión por solapamiento (cebadores JH correspondientes a la SEC ID Nº 32 a 35 y cebador CLK correspondiente a SEC ID Nº: 17, cada cebador a una concentración de 0,5 !M). Los parámetros de ciclado fueron:

Desnaturalización 30 s 95 ºC

Apareamiento 30 s 55 ºC

30 ciclos

Extensión 3 min 72 ºC

Se analizaron diez microlitros de cada producto de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % usando bromuro de etidio para la detección. Pueden observarse varios fragmentos incluyendo, tanto desde 1 como 100 células, un fragmento con movilidad del fragmento de extensión por solapamiento esperado (flecha en la figura 6C). Se cortó del gel el fragmento de 1 kb del carril del gel correspondiente a una célula y se purificó usando Qiaex II 10 según se describió anteriormente. Se digirió el fragmento purificado con las enzimas de restricción NheI y NcoI (por separado) y se analizaron los productos de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % usando bromuro de etidio para la detección (figura 6D). Estos sitios de restricción están presentes en el solapamiento entre VH y LC y los tamaños esperados tras la digestión son de aproximadamente 410 pb y 680 pb de longitud, respectivamente (figura 2). La digestión con NheI fue parcial puesto que la fracción grande todavía está presente en

15 el tamaño original.

Ejemplo 3: RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa y PCR anidada combinadas

En este ejemplo, se realizaron las reacciones de transcripción inversa y PCR de extensión por solapamiento múltiplex en una única etapa seguido por una amplificación por PCR semianidada, usando un molde a partir de células lisadas, en concentraciones correspondientes a 100, 10 ó 1 células.

20 a. RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa

Se realizó la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex usando lisado de células HB-8501 según se describió en el ejemplo 2 usando una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que comprende los cebadores mostrados en la tabla 4.

Tabla 4 Sin embargo debe observarse que para cada mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex se usó sólo uno de los cebadores CH1-5, dando como resultado cinco mezclas de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex diferentes.

Nombre de cebador: Conc. SEC ID NO Secuencia de cebador en la dirección de 5’ a 3’

41: tattggcgcgccatggccCAGRTGCAGCTGGTGCART

42: tattggcgcgccatggccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT

43: tattggcgcgccatggccCAGRTCACCTTGAAGGAGT

VH: 40 nM de cada uno 44 45 tattggcgcgccatggccSAGGTGCAGCTGGTGGAG tattggcgcgccatggccCAGGTGCAGCTACAGCAG

46: tattggcgcgccatggccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT

47: tattggcgcgccatggccGARGTGCAGCTGGTGCAGT

48: tattggcgcgccatggccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC

49: AAGTAGTCCTTGACCAGGCAGCC

50: TGAGTTCCACGACACCGTCA

CH1-5: 200 nM de cada uno de estos 51 AGAGGTGCTCTTGGAGGAGG AGTTTTGTCACAAGATTTGGG

cebadores: 52

53: GTTGCAGATGTAGGTCTGGGTGC

(cont.)

VL: 20 nM de cada uno 54 55 56 57 58 59 gccatggcgcgccaatagctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT gccatggcgagccaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT gccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT gccatggcgcgccaatagctagccGATATTGTGATGACCCACACT gccatggcgcgccaatagctagccGAAACGACACTCACGCAOT gccatggcgcgccantagctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT

CLK: 200 nM 60 atstatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAA

W=A/T, S=G/C, R=A/G, las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen.

5 Los parámetros restantes fueron según se describieron para la reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex en el ejemplo 2, sólo con un cambio en la temperatura de apareamiento hasta 50 ºC. Se realizó una reacción para cada cebador inverso de la región constante de cadena pesada (CH1, CH2, CH3, CH4, CH5 correspondientes a SEC ID Nº: 49 a 53, respectivamente) usando lisados correspondientes a 100, 10, 1 y 0 células.

b. PCR semianidada

10 Se sometió un microlitro del producto de reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex a PCR semianidada (kit Biotaq, Bioline, RU, nº de catálogo BIO-21040), esencialmente según lo propuesto por el fabricante. El volumen total de las reacciones fue de 50 !l. Los cebadores usados se muestran en la tabla 5.

Tabla 5

Nombre del cebador JH: Conc. 200 nM de cada uno SEC ID Nº 61 62 63 64 Secuencia de cebador en la dirección de 5’ a 3’ ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC

CLK: 200 nM 21 accgcctccncaggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT

Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen.

15 Las condiciones de ciclado fueron las siguientes:

Desnaturalización 30 s 95 ºC Apareamiento 30 s 50 ºC

25 ciclos Extensión 1,5 min 72 ºC Extensión final 5 min 72 ºC

Se analizaron diez microlitros de cada reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % usando bromuro de etidio para la detección (figura 7). El supuesto fragmento de extensión por solapamiento a partir de la PCR semianidada correspondiente al lisado de 20 una célula y en la que se usó el cebador CH4 en la primera reacción (véase la flecha en la figura 7), se escindió del

gel de agarosa, se purificó usando un kit Qiaex II (Qiagen nº de catálogo, 20051, Hilden, Alemania) y se insertó dentro de pCR2.1-TOPO usando un kit de clonación TOPO TA de Invitrogen (Invitrogen nº de catálogo 45-0641, Carlsbad, CA, EE.UU.). Se secuenciaron insertos de ocho clones y siete de estos parecían que estaban constituidos por una región variable de cadena pesada unida a una región constante y variable de cadena ligera, mediante la región de solapamiento esperada.

En resumen, la sensibilidad de la reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex y PCR semianidada combinadas era muy satisfactoria, pudiendo amplificar con 4 de los 5 cebadores de la región constante cantidades significativas de productos de extensión por solapamiento a partir del lisado correspondiente a una célula única.

Ejemplo 4: RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa y PCR anidada combinadas usando linfocitos B humanos enriquecidos como fuente de molde

En este ejemplo, se realizaron las reacciones de transcripción inversa y PCR de extensión por solapamiento múltiplex en una única etapa seguida por una amplificación por PCR semianidada, usando linfocitos B humanos únicos aislados como fuente de molde.

a. Aislamiento de células B

Se inmunizó un donante macho humano con toxoide tetánico. Se recogió una muestra de sangre de 120 ml del donante 6 días después de la inmunización y se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo Noruega, nº de prod. 1001967) según las instrucciones del fabricante. Se enriqueció la población de células positivas CD19 usando clasificación de células mediante perlas magnéticas. Se tiñeron las PBMC con anticuerpo anti-CP19 conjugado con FITC (Becton Dickinson, NJ, EE.UU., nº de catálogo 345776). Se realizó la clasificación de células mediante perlas magnéticas usando microperlas magnéticas anticonjugado con FITC y se realizó la purificación en columna según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania, nº de catálogo 130-042-401). Se diluyeron las células hasta una concentración de 200 células por ml en PBS que contenía EDTA 2 nM y BSA al 0,5 %. Se distribuyeron cinco microlitros de las células diluidas en tubos de PCR obteniendo aproximadamente una célula única por tubo. Los tubos se almacenaron a -80 ºC hasta su uso.

b. RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex y PCR semianidada

Las condiciones para la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex y PCR semianidada fueron según se describieron en el ejemplo 3. Sin embargo, las reacciones sólo se realizaron con la mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que estaba constituida por cebador CH3 correspondiente a SEC ID Nº: 51. Se analizaron dieciséis muestras a partir de las reacciones de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex y PCR semianidada combinadas sometiendo 10 !l de cada reacción de PCR semianidada a electroforesis en gel de agarosa al 1 % usando bromuro de etidio para la detección (figura 8).

Tal como puede observarse en la figura 8, 2 de cada 16 carriles (carriles 5 y 6) contenían fragmentos de la movilidad esperada (de aproximadamente 1 kb). Además, el carril 2 contenía un fragmento menos intenso a la movilidad esperada. Se escindieron los fragmentos de 1 kb del carril 5 y 6 del gel de agarosa, se purificaron usando un kit Qiaex II (Qiagen nº de catálogo 20051) y se insertaron dentro de pCR2.1-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA de Invitrogen (Invitrogen nº de catálogo 45-0641, Carlsbad, CA, EE.UU.). Dos clones de cada fragmento aislado tenía insertos del tamaño correcto. La digestión con enzimas de restricción (NcoI y NheI, por separado) mostró los fragmentos de los tamaños esperados (410 y 680 pb) lo que indica una unión correcta entre las secuencias que codifican la región variable de cadena pesada y la región constante y variable de cadena ligera.

Se secuenciaron los dos clones que se originan a partir del fragmento en el carril 5 y mostraron ser idénticos, lo que indica que la VH y LC unidas eran pares análogos.

Ejemplo 5: RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa y PCR anidada combinadas usando cebadores específicos de V

En este ejemplo, se realizaron las reacciones de transcripción inversa y PCR de extensión por solapamiento múltiplex en una única etapa usando cebadores específicos de VA, seguidas por una reacción de PCR semianidada. Se usaron como moldes el ARN total purificado a partir de dos líneas celulares diferentes que expresan familias génicas de lambda 1b y 1e en combinación con la misma región variable de cadena pesada.

a. Células

Se generaron dos líneas de células de ovario de hámster chino (CHO) que expresaban lambda de IgG1 usando la tecnología Flp-In (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.).

Se construyeron los vectores de expresión de lambda de IgG1 de mamíferos pEm465/01P581 y pEm465/01P582 (figura 9A) que representan dos familias génicas de lambda basándose en el vector de expresión de Flp-In, pcDNA5/FRT. Se transfectaron conjuntamente las células CHO-Flp-In, usando Fugene 6 (Roche, Mannheim, Alemania) según las instrucciones del fabricante, con los plásmidos mencionados anteriormente que contenían los genes que codifican el anticuerpo y pOG44 que confería la expresión transitoria de la Flp recombinasa. Se seleccionaron los transformantes para las inserciones. Las líneas celulares seleccionadas se nombraron CHO FlpIn/Em464/01P581 y CHO Flp-In/Em464/01P582, y se mantuvieron en medio F-12 de Ham, complementado con L

5 glutamina 2 mM, FCS al 10 % e higromicina B 900 !g/ml (medios de mantenimiento).

Se recogieron las líneas celulares usando tripsina y se lavaron 3x en medios de mantenimiento. Se usaron aproximadamente 107 células para la purificación de ARN total usando el kit Nucleo Spin L (Macherey-Nagel, Düren, Alemania) según la descripción del fabricante. Se determinaron las concentraciones de ARN finales mediante mediciones de DO260.

10 b. RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa

Se realizó la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex usando 50 pg, 5 pg, o 0,5 pg de ARN total como molde esencialmente según se describió en el ejemplo 3 usando una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que comprendía los cebadores mostrados en la tabla 6 y las condiciones de ciclado especificadas a continuación.

Transcripción inversa: 30 min 55 ºC

Activación de la polimerasa: 15 min 95 ºC inactivando la transcriptasa

inversa

y activando la

Taq polimerasa

Reacción de PCR: Desnaturalización 30 s 95 ºC

Apareamiento 30 s 50 ºC

35 ciclos

Extensión 5 min 72 ºC

Extensión final 10 min 72 ºC Tabla 6

1: agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCART

2: agcctatactattgattaggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT

40 nM: 3 agcctatactattgattaggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGT

de: 4 agcctatactattgattaggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG

VH: cada 5 agcctatactattgattaggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGT

uno: 6 agcctatactatrgattaggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT

7: agcctatactattgattaggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGT

8: agcctatactattgattaggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC

CH: 100 nM 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG

65: cgcctaatcaatagtataggctagccCAGTCTGTGCTGACTCAGCCA

66: cgcctaatcaatagtataggctagccCAGTCTGTGYTGACGCAGC

67: cgcctaatcaatagtataggctagccCAGTCTGTCGTGACGCAGC

68: cgcctaatcaatagtataggctagccCARTCTGCCCTGACTCAGCCT

100 nM: 69 cgcctaatcaatagtataggctagccTCCTATGWGCTGACTCAGCCA

VA: de 70 cgcctaatcaatagtataggctagccTCTTCTGAGCTGACTCAGGAC

cada: 71 cgcctaatcaatagtataggctagccCACGTTATACTGACTCAACCG

uno: 72 cgcctaatcaatagtataggctagccCAGGCTGTGCTGACTCAGC

73: cgcctaatcaatagtataggctagccAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA

74: cgcctaatcaatagtataggctagccCAGRCTGTGGTGACYCAGGA

75: cgcctaatcaatagtataggctagccCWGCCTGTGCTGACTCAGC

CA2/CA7: 100 nM 76 77 gccgcttattaTGAACATTCTGTAGGGGCCA gccgcttattaAGAGCATTCTGCAGGGGCCA

Y=CPT, W=A/T, S=G/C, R=A/G. Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen.

c. PCR semianidada

Se sometió un microlitro del producto de reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex a PCR semianidada (kit Biotaq, Bioline, RU, nº de catálogo BIO-21040), esencialmente según lo propuesto por el fabricante. Los volúmenes totales de las reacciones fueron de 20 !l. Los cebadores usados se muestran en la tabla 7.

Tabla 7

JH: 200 nM de cada uno 61 62 63 64 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTTCC ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC

CLA: 200 nM 78 79 atatatatgcggccgcttattaTGAACATTCTGTAGGGGCCACTG atatatatgcggccgcttattaAGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG

Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen

Las condiciones de ciclado fueron las siguientes:

Desnaturalización 30 s 95 ºC

Apareamiento 30 s 50 ºC

25 ciclos

Extensión 1,5 min 72 ºC

Extensión final 5 min 72 ºC

Se analizaron diez microlitros de los productos anidados mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % usando bromuro de etidio para la detección (figuras 9B y 9C). Las flechas indican productos de extensión por solapamiento con las propiedades de migración esperadas de aproximadamente 1 kb.

10 El presente experimento ilustra que la mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex de lambda mostrada en la tabla 6 puede aplicarse en la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa independientemente del molde usado. Además, se produjeron productos de PCR de extensión por solapamiento específicos con 0,5 pg de ARN total. Esta sensibilidad sugiere que las secuencias unidas análogas que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada pueden amplificarse a partir de una célula

15 única.

Ejemplo 6: Generación de una subbiblioteca de pares análogos específicos de tétanos de secuencias que codifican anticuerpos

En el presente ejemplo, se ejemplifican las etapas esquematizadas en el diagrama de flujo ilustrado en la figura 10, usando toxoide tetánico (TT) como antígeno diana.

20 a. Donantes

A los donantes, que se habían inmunizado previamente con la vacuna contra el tétanos, se les administra una inmunización de recuerdo con la vacuna contra el tétanos (Statens Serum Institut, Dinamarca). Seis días después de la inmunización de recuerdo con la vacuna contra el tétanos se extrajo una muestra de sangre de aproximadamente 200 ml de los donantes en un tubo que contenía anticoagulante.

25 Se requiere que los donantes estén sanos generalmente sin infecciones crónicas o silenciosas. No deben padecer enfermedades autoinmunitarias o recibir ninguna medicación inmunosupresora y no deben haberse vacunado en el plazo de los últimos 3 meses. Además, en el momento de la inmunización de recuerdo con la vacuna contra TT, los donantes no deben haber tenido ninguna infección grave en el plazo de los últimos 3 meses.

b. Preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

Las PBMC se aíslan a partir de muestras de sangre usando Lymphoprep (Axis-Shield PoC AS, Noruega, nº de ist. 1001967) según las recomendaciones del fabricante. En resumen, se diluye la sangre 1:1 en PBS y se estratifica esta suspensión sobre Lymphoprep en una proporción de 2:1. Se centrifugan los viales durantes 20 min, 25 ºC a 800 g y se recoge la banda de interfase blanca. Las células se lavan con PBS que contiene EDTA 2 mM.

c. Enriquecimiento de células B

Se enriquece el linaje de células B (células CD19+) de las PBMC mediante clasificación de células mediante perlas magnéticas usando el siguiente procedimiento.

Se tiñen las PBMC aisladas con anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, EE.UU., nº de catálogo 345776). Todas las etapas se realizan a 4 ºC en la oscuridad. Se realiza la tinción con 10 !l de anti-CD19-FITC por 1 x 106 células en un volumen de 100 !l por 1 x 106 células usando tampón M (PBS, pH 7,2, BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM). Esto teñirá el linaje de células B de las PBMC. Se incuban las células durante 20 min seguido por dos etapas de lavado con tampón M. Las células teñidas con anti-CD19-FITC se marcan magnéticamente con microperlas anti-conjugado con FITC, usando 10 !l de perlas magnéticas anti-FITC (Miltenyi istec, Gladbach, Alemania, nº de catálogo 130-042401) por 1 x 106 células en un volumen de 100 !l de tampón M por 1 x 106 células. Se realiza la incubación durante 15 min seguida por una única etapa de lavado con tampón M. Se resuspenden las células en tampón M desgasificado.

Se trata previamente una columna MACS LS (Miltenyi istec, Gladbach, Alemania, nº de catálogo 130-042-401) con tampón M desgasificado según las prescripciones del fabricante. La suspensión de células teñidas con anti-CD19-FITC y marcada con perlas magnéticas anti-FITC se aplica a la columna y se deja pasar a través de ella. Las células teñidas y marcadas (CD19+) se retendrán en el campo magnético que rodea la columna mientras que las células no teñidas (CD19-) pasarán a través de la columna. Se lava la columna con tampón M desgasificado. Se elimina el campo magnético y se recogen las células CD19+.

d. Clasificación de células plasmáticas

Se centrifuga el eluato de la columna MACS y se resuspende en tampón para FACS (PBS, pH 7,2, BSA al 2,2 %) en una concentración de 1 x 106 células/60 !l de tampón para FACS. Se añaden anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, EE.UU., nº de catálogo 345776) (10 !l/106 células), anti-CD38-PE (Becton Dickenson, NJ, EE.UU., nº de catálogo 555460) (10 !l/106 células) y anti-CD45-PerCP (Becton Dickenson, NJ, EE.UU., nº de catálogo 345809) (20 !l/106 células). Se realiza la incubación a 4 ºC durante 20 min en la oscuridad, seguido por un lavado en dos veces y resuspensión en tampón para FACS. Se clasifican las células mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) usando los siguientes parámetros de proceso de ventana:

1.: Dispersión directa y dispersión lateral con el fin de retener linfocitos y monolitos incluyendo blastocitos plasmáticos y células plasmáticas y evitar las células muertas y células con dispersión lateral muy alta que pueden ser agregados o granulocitos.

2.: Células que son CD19 positivas y expresan niveles aumentados de CD38 (CD38hi). Ésta es básicamente sólo una ventana en CD38 dado que las PBMC se han enriquecido en una columna MACS para la expresión de CD19, pero esto revelará cualquier contaminante.

3.: Células CD45 positivas. Todos los linfocitos expresan CD45. Sin embargo, las células plasmáticas regulan por disminución su expresión de CD45 en comparación con fases de diferenciación de linfocitos tempranas. Por tanto, puede obtenerse una población diferenciada de células que corresponden a células plasmáticas cuando se realiza el proceso de ventana en CD45.

Se recogen las células clasificadas mediante FACS como células únicas directamente en pocillos individuales de placas de 96 pocillos que contienen 5 !l de tampón PBS complementado con 5 U de inhibidor de Rnasa (Rnasin, Promega, Madison EE.UU., nº de catálogo N2515) por pocillo. En este momento las células pueden congelarse para la RT-PCR posterior o las células pueden proceder inmediatamente a la RT-PCR.

e. Unión de pares análogos de secuencias que codifican la región variable de inmunoglobulinas

La tecnología de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex se aplica a las células únicas, consiguiendo de ese modo la unión análoga de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada anti-toxoide tetánico transcritas.

e-1. RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa

Se usa el kit de RT-PCR de una única etapa de Qiagen (Qiagen nº de catálogo 210212, Hilden, Alemania) para la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex esencialmente según la recomendación del fabricante. Se retiran las placas de 96 pocillos congeladas que contienen una célula única por pocillo del congelador y cuando los pocillos

5 están libres de cristales de hielo, se añaden 15 !l de mezcla de reacción de RT-PCR inmediatamente a cada muestra (célula única). La mezcla de reacción de RT-PCR contiene, en un volumen total de 20 !l, los siguientes reactivos: 1 x tampón de RT-PCR de una etapa dNTP en una concentración final de 400 !M de cada uno 10 Mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex en las concentraciones según se indican en la tabla 8, 0,8 !l de mezcla de enzimas de RT-PCR de una etapa, y 20 U de inhibidor de Rnasa (Rnasin, Promega, Madison EE.UU., no de catálogo N2515) La composición de la mezcla de cebadores de extensión por solapamiento se muestra en la tabla 8. Tabla 8

VH: 40 nM de cada uno 41 42 43 44 45 46 47 48 tattggcgcgccatggccCAGRTGCAGCTGGTGCART tattggcgcgccatggccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT tattggcgcgccatggccCAGRTCACCTTGAAGGAGT tattggcgcgccatggccSAGGTGCAGCTGGTGGAG tattggcgcgccatggccCAGGTGCAGCTACAGCAG tattggcgcgccatggccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT tattggcgcgccatggccGARGTGCAGCTGGTGCAGT tattggcgcgccatggccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC

CH(IgG): 200 nM 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG

VL: 40 nM de Cada uno 54 55 56 57 58 59 gccatggcgcgccaatagctagccGACATCCAGWTGACCAGTCT gccatggcgcgccaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT gccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT gccatggcgcgccaatagctagccGATATTGTGATGACCCACACT gccatggcgcgccaatagctagccGAAACGACACTCACGCAGT gccatggcgcgccaatagctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT

CLK: 200 nM 60 atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAA

15

Las condiciones de ciclado son las siguientes:

43

Transcripción inversa: 30 min 55 ºC

Activación de polimerasa: 15 min 95 ºC inactiva la transcriptasa inversa y activa la Taq polimerasa

Reacción de PCR:

e-2. Amplificación adicional

Se sometió un microlitro del producto de reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex, de cada

5 muestra, a PCR semianidada (kit Biotaq, Bioline, RU nº de catálogo BIO-21040), esencialmente tal como propone el fabricante usando placas de PCR de 96 pocillos. El volumen total de cada reacción es de 50 !l, conteniendo una concentración final de 1x tampón Biotaq, dNTP 200 !M (de cada uno), MgCl2 2 mM, 1,25 U de Bio Taq polimerasa y los cebadores mostrados en la tabla 9.

Las condiciones de ciclado son las siguientes:

Desnaturalización 30 s 95 ºC

Apareamiento 30 s 55 ºC

30 ciclos

Extensión 1,5 min 72 ºC

Extensión final 10 min 72 ºC

Tabla 9

CLK: 200 nM 21 accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT

Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen.

Se analizan diez microlitros de un conjunto limitado de muestras mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 %

15 usando bromuro de etidio para la visualización, con el fin de verificar que la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex ha sido satisfactoria.

El tamaño esperado de los fragmentos (el tamaño exacto depende de las longitudes de las regiones variables):

VH: � 410 pb

LC: � 680 pb

20 Fragmento de extensión por solapamiento: ~ 1070 pb

Se combinan en un único tubo dos microlitros de todas las muestras, realizadas en las placas de 96 pocillos, que se originan a partir del mismo donante. Se digieren las muestras combinadas con XhoI y NotI. Se purifican los fragmentos de extensión por solapamiento digeridos mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % preparativa; se escinden los fragmentos de extensión por solapamiento del gel de agarosa y se purifican usando un kit Qiaex II (Qiagen nº de catálogo 20051, Hilden, Alemania). No es necesario combinar los pares análogos en esta fase si esto no se desea. En ese caso, cada reacción individual se someterá a rotura por restricción y se clonan los productos individualmente dentro del vector descrito a continuación.

f. Biblioteca de expresión de Fab análoga

Se genera una biblioteca de vectores Fab insertando la combinación de los fragmentos de extensión por solapamiento digeridos con XhoI/NotI dentro del vector JSK301 de E. coli (figura 11) mediante acoplamiento. E. coli (TOP10) se transforma mediante electroporación con la biblioteca de vectores Fab y se seleccionan los transformantes en 2xYT agar que contiene 100 !g/ml de carbenicilina. Se prepara ADN de plásmido a partir de colonias directamente de las placas de agar. La preparación de plásmido se deriva de un número de mínimo de colonias por donante, correspondiente a 3x el número total de células únicas plasmáticas clasificadas originalmente, con el fin de mantener la diversidad. Se genera una biblioteca de expresión de Fab insertando un promotor procariota y un casete líder derivado de phh3 (Den, W. y col. 1999. J. Immunol. Methods 222, 45-57) dentro de la preparación de plásmido resultante mediante la digestión de la preparación de plásmido con AscI y NheI y acoplamiento posterior. El proceso de generación de biblioteca se esquematiza en la figura 12. E. coli (TG1) se transforma mediante electroporación con la biblioteca de expresión de Fab resultante y se seleccionan los transformantes en 2xYT agar que contienen 100 !g/ml de carbenicilina. Se mantienen separados los donantes separados durante el procedimiento descrito en Den y col, J Immunol Methods. 1 de enero de 1999; 222(1-2):45-57. Sin embargo, pueden combinarse en cualquier fase en la que esto pueda desearse.

g. Exploración de clones

Se exploran clones que expresan Fab para determinar la unión a antígeno TT mediante ensayos ELISA específicos de antígeno.

g-1. Generación de placas maestras y expresión de Fab

Se ponen colonias seleccionadas individuales de las células TG1, albergando cada una un vector de expresión de Fab análogo de la biblioteca generada en la etapa (f) en pocillos individuales de placas de 96 pocillos que contienen 2 x YT/100 !g/ml de Amp/glucosa al 1 %. Se hacen crecer las colonias durante la noche a 37 ºC con agitación suave. Estas placas se denominan placas maestras, que se almacenan a -80 ºC tras la adición de glicerol hasta una concentración final del 15 %.

Antes de almacenar las placas maestras, se usan para la inoculación de una o más placas de 384 pocillos que contienen 2 x YT/100 !g/ml de Amp, glucosa al 0,1 % usando un replicador de 96 agujas. Las placas se sellan y se agitan durante 2 -3 h a 37 ºC.

Se induce la expresión de Fab añadiendo un volumen igual de 2 x YT/100 !g/ml de Amp/IPTG 0,2 mM, obteniendo una concentración de IPTG final de 0,1 mM. Las placas se sellan y se agitan durante la noche a 30 ºC. Al día siguiente, se analizan los sobrenadantes que contienen Fab para determinar la especificidad de unión a antígeno TT mediante ELISA.

g-2. Análisis ELISA

Se recubren placas de ELISA de trescientos ochenta y cuatro (384) pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca, nº de catálogo 265196) durante la noche a 4 ºC con antígeno del toxoide tetánico (TT), diluido hasta una concentración final de 1 !g/ml en PBS en un volumen de 25 !l por pocillo. Los sitios de unión en exceso de los pocillos se bloquean durante 1 h a TA añadiendo M-PBS-T al 2 % (leche en polvo desnatada al 2 % en PBS, Tween 20 al 0,05 %). Se lavan los pocillos 2 veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,05 %).

Se diluyen los sobrenadantes bacterianos que contienen Fab de g-1 1:2 en M-PBS-T al 2 % y se transfirieren a los pocillos de ELISA por duplicado. Se realiza la incubación durante 1 h a TA. Se lavan los pocillos 4 veces con PBS-T. Se añade HRP/Fab de cabra anti-humano (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU., nº de catálogo A0293) dilución 1:10.000 en M-PBS-T al 2 % a los pocillos. Se realiza la incubación durante 1 h a TA. Se lavan los pocillos 4 veces con PBS-

T. Se añade sustrato TMB Plus (KemEnTec, Copenhague, Dinamarca, nº de catálogo 4390L) y se realiza la incubación durante 5 -15 minutos. Se detienen las reacciones añadiendo un volumen igual de H2SO4 1 M. Se leen las extensiones de las reacciones a 450 nm en un lector de ELISA (Multiscan Ascent, Labsystems, Franklin, EE.UU.).

Los clones bacterianos originales correspondientes a clones de unión a antígeno TT se recuperan posteriormente de las placas maestras originales. El ADN de plásmido se prepara a partir de los clones de Fab positivos para antígenos aislados, generando una subbiblioteca de expresión de Fab análoga de clones de unión a antígeno TT.

Los clones también pueden analizarse mediante un ensayo ELISA anti-cadena ligera, con el fin de obtener una correlación entre el número de clones de unión a antígeno y el número de clones que expresan Fab. Además, un análisis de este tipo proporciona información de la representación de la cadena ligera de kappa y lambda en los clones.

h. Biblioteca de expresión de anticuerpos análogos

Con el fin de facilitar la expresión de anticuerpos humanos de cadena completa, las regiones variables análogas a partir del vector de expresión de Fab bacteriano deben transferirse a un vector de expresión de mamífero que contiene los dominios constantes de uno de los isotipos de inmunoglobulina humana. Una transferencia de este tipo puede realizarse clon a clon o bien en masa. A continuación se describe cómo realizar la transferencia de masa.

La transferencia de masa se realiza en dos etapas. En primer lugar, se combinan las preparaciones de plásmido de los clones de Fab de unión a antígeno aislados individualmente. El casete que contiene la secuencia líder y el promotor procariota se intercambian con un casete líder y promotor de mamífero que consiste en la secuencia líder de la fosfatasa alcalina humana (FA líder), promotor 1-alfa de factor de elongación humano (EFP), promotor último principal de adenovirus (AdMLP), secuencia líder de IgK mediante la digestión de la subblioteca de expresión de Fab combinada con AscI y NheI seguido por la inserción de un casete líder y promotor de mamífero mediante un acoplamiento posterior. E. coli (TOP10) se transforma mediante electroporación con la biblioteca de expresión de Fab con intercambio de promotor resultante y se seleccionan los transformantes en 2xYT agar que contiene 100 !g/ml de carbenicilina. Se prepara ADN de plásmido a partir de colonias directamente de las placas de agar. La preparación de plásmido se deriva de un número mínimo de colonias por donante, correspondiente a aproximadamente 3x el número total de clones en la biblioteca original, con el fin de mantener la diversidad.

En segundo lugar, se aíslan las regiones variables análogas del vector de expresión de Fab con intercambio de promotor mediante la digestión de la preparación de plásmido con XhoI y NotI. Se inserta el fragmento aislado mediante acoplamiento dentro de un vector de expresión de mamífero dando como resultado una biblioteca de expresión de anticuerpos análogos. El vector usado es esencialmente el mismo que en la figura 9A, excepto que IgL en este caso corresponde a la secuencia que codifica la cadena ligera kappa. El vector de expresión de mamífero usado anteriormente se basa en el sistema Flp-In específico de sitio (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU., nº de catálogo K6010-01). E. coli (TOP10) se transforma mediante electroporación con la biblioteca de expresión de anticuerpos análogos resultante y se seleccionan los transformantes en 2xYT agar que contiene 100 !g/ml de carbenicilina. Se prepara ADN de plásmido a partir de colonias directamente de las placas de agar. La preparación de plásmido se deriva de nuevo de un número mínimo de colonias por donante, correspondiente a aproximadamente 3x el número total de clones en la biblioteca original, con el fin de mantener la diversidad. La preparación de plásmido resultante de la biblioteca de expresión de anticuerpos análogos puede usarse para transfectar una célula huésped de mamífero, por ejemplo las células CHO del sistema Flp-In de Invitrogen (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU., nº de catálogo K6010-01) con el fin de generar una línea celular de expresión de mamífero estable mediante la integración mediada por la Flp recombinasa. Una línea celular de este tipo puede usarse en la producción de anticuerpos policlonales recombinantes.

Ejemplo 7: Exploración mediante ensayo de membrana de alta densidad

Se exploran los clones de expresión de Fab del ejemplo 6f mediante un ensayo de membrana de alta densidad.

a. Generación de placas maestras

Se generan placas maestras según se describió en la etapa (g-1) del ejemplo 6.

b. Preparación de membrana PVDF

Se recubren las membranas PVDF (Amersham, Uppsala, Suecia, nº de catálogo RPN2020F) según las instrucciones del fabricante durante la noche a 4 ºC con antígeno TT diluido hasta una concentración final de 1 !g/ml en PBS. Se bloquean los sitios de unión en exceso en las membranas durante 1 h en M-PBS al 2 % (lecho en polvo desnatada al 2 % en PBS). Se enjuagan las membranas 3 veces en PBS. Se empapan las membranas con 2 x YT durante algunos minutos.

c. Consolidación de clones

Se realiza la consolidación de clones en placas de 384 pocillos transfiriendo clones desde las placas maestras hacia una o más placas de 384 pocillos que contienen 20 !l 2 x YT/pocillo, usando un replicador de 96 agujas.

Usando un replicador de 384 agujas, se transfieren las bacterias a una o más membranas de nailon por duplicado (Amersham, Uppsala, Suecia, nº de catálogo RPN2020B) colocadas en placas de agar 2 x YT/Carb/glucosa al 1 %. Las placas se incuban durante 4 -6 h a 37 ºC.

d. Inducción de Fab

Las membranas PVDF preparadas en la etapa b, se colocan en placas de agar 2 x YT/Carb/IPTG 0,1 mM. Las membranas de nailon con las colonias de bacterias que se han hecho crecer se colocan en la parte superior de las membranas PVDF (una membrana de nailon por membrana PVDF) en la placa de agar que contiene IPTG. Se

incuba la placa de agar que contiene IPTG a 30 ºC durante la noche para facilitar la expresión de Fab inducido por IPTG de las colonias. Las moléculas Fab difunden a través de la membrana de nailon sobre la membrana PVDF, en la que se retendrán Fab de unión a antígeno TT sobre la membrana.

e. Detección

Se eliminan las membranas de nailon y se lavan las membranas PVDF 2 x 5 minutos con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,05 %). Se incuban las membranas durante 30 minutos con M-PBS al 2 %. Se lavan las membranas PVDF 2 x 5 minutos con PBS-T, seguido por la incubación durante 1 h con HRP/IgG de cabra anti-humana (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU., nº de catálogo A0293), diluido 1:10.000 en M-PBS al 2 %. Se lavan las membranas PVDF 3 x 5 minutos con PBS-T. Finalmente, se incuban las membranas PVDF durante 5 minutos con sustrato quimioluminiscente SuperSignal West Femto (Pierce, Rockford, Il, EE.UU., nº de catálogo 34095) según las instrucciones del fabricante. Se elimina el sustrato en exceso y se colocan las membranas PVDF en una cámara CCD para la detección de la señal quimioluminiscente generada en las posiciones en la membrana PVDF en las que un fragmento Fab se une al antígeno TT.

Los clones de unión a antígeno TT positivos aparecerán como puntos en la imagen. Posteriormente se recupera el clon bacteriano original de las placas maestras originales. Se prepara ADN de plásmido a partir de clones de Fab positivos para antígenos aislados, generando una subbiblioteca de expresión de Fab análoga de clones de unión a antígeno TT.

f. Correlación entre clones de unión a antígeno y clones de expresión de Fab

Las membranas de nailon eliminadas en la etapa e. se colocan en una serie de membranas PVDF recubiertas con anticuerpo anti-cadena ligera o anticuerpo anti-Fab según el procedimiento en la etapa b. Se repiten entonces la etapa d. y e.

Entonces, los clones positivos para Fab aparecerán como puntos en la imagen y puede hacerse una correlación entre el número de clones de unión a antígeno TT y el número de clones que expresan Fab.

Ejemplo 8: Ejemplo ilustrativo que describe el aislamiento de las secuencias que codifican una proteína heteromérica

El presente ejemplo ilustra cómo puede aislarse una proteína de unión a nucleótido de guanina trimérica (proteína G) en una única etapa que usa la técnica de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de la presente invención. La familia de las subunidades de la proteína G es grande, solo en seres humanos existen aproximadamente 16 subunidades alfa diferentes, 5 subunidades beta y 12 subunidades gamma. Para el presente ejemplo se eligieron la subunidad GaS (Nº de acceso GenBank X04408), la subunidad G11 (Nº de acceso GenBank AF501822) y la subunidad Gy1 (Nº de acceso GenBank BC029367). El procedimiento de unión se ilustra en la figura 13, en el que la etapa 1 es la etapa de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex y la etapa 2 es la amplificación adicional del producto unido.

a. Células

Se obtiene una población de células hepáticas humanas a partir de muestras de secreción quirúrgica. Las células hepáticas se desintegran y se lisan, se aísla el ARN total del lisado usando el kit RNA L (Macherey -Nagel, Düren, Alemania, nº de catálogo 740 962.20) según las instrucciones del fabricante.

b. RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex

Se usa el kit para RT-PCR de una etapa de Qiagen (Qiagen nº de catálogo 210212, Hilden, Alemania) para la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex esencialmente según la recomendación del fabricante.

Cada tubo de PCR contiene, en un volumen total de 50 !l, los siguientes reactivos:

1 x de tampón para RT-PCR de una etapa,

dNTP en una concentración final de 400 !M de cada uno,

mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex en las concentraciones según se indican en la tabla 10,

2 !l de mezcla de enzimas para RT-PCR de una etapa,

1 U/!l de inhibidor de RNasa (RNasin, Promega, Madison EE.UU., nº de catálogo N2515), y

50 ng de ARN total.

La mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex usada comprende los cebadores mostrados en la tabla 10.

Tabla 10

Nombre de cebador: Conc. SEC ID NO Secuencia de cebador en a dirección de 5’ a 3’

a1: 400 nM 80 atatatatgcggccgcttaATGGGCTGCCTCGGGAA

a2: 80 nM 81 gccatggegegeeaatagetagccTTAGAGCAGCTCGTACTGACGAA

11: 80 nM 82 tattggegegccatggeeATGAGTGAGCTIGACCAGTIACG

12: 80 nM 83 ggtacctaataataatcgatcgcTTAGTTCCAGATCTTGAGGAAGCT

y1: 80 nM 84 cgatcgattattattaggtaccccATGCCAGTAATCAATATTGAGGAC

y2: 400 nM 85 ggaggcgctcgagTTATGAAATCACACAGCCTCCTTTG

Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen.

5 Las condiciones de ciclado usadas son:

Transcripción inversa: 30 min 42 ºC

Activación de la polimerasa: 15 min 95 ºC inactivando la transcriptasa inversa y activando la Taq polimerasa

Reacción de PCR: Desnaturalización 30 s 94 ºC Apareamiento 30 s 49 ºC

45 ciclos Extensión 3 min 72 ºC Extensión final 10 min 72 ºC

10 c. Amplificación por PCR

Se somete un microlitro del producto de reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex a una etapa de amplificación por PCR adicional (kit Biotaq, Bioline, RU, nº de catálogo BIO-21040) esencialmente según lo propuesto por el fabricante. Los cebadores usados son a1 y y2 tal como se muestran en la tabla 10 correspondientes a SEC ID Nº 80 y 85. El volumen total de la reacción es de 50 !l.

15 Las condiciones de ciclado son las siguientes:

Desnaturalización: 30 s 95 ºC

Apareamiento: 30 s 53 ºC 25 ciclos

Extensión: 3 min 72 ºC

Extensión final: 10 min 72 ºC

Se analizan cinco microlitros del producto de reacción mediante electroforesis en gel de agarosa al 1 % usando bromuro de etidio para la detección. Se espera que el tamaño del producto sea de 2215 pb. Sin embargo, podrían estar presentes fragmentos no unidos adicionales de las subunidades. Los tamaños esperados de estos fragmentos son Ga: 1228 pb, G1: 1064 pb y Gy: 262 pb.

d. Clonación

Se somete el producto de reacción restante a electroforesis en gel de agarosa al 1 % usando bromuro de etidio para la detección y se escinde el fragmento de extensión por solapamiento de 2215 pb del gel de agarosa, se purifica usando un kit Qiaex II (Qiagen, Hilden, Alemania, nº de catálogo 20051) y se inserta dentro de pCR2.1-TOPO usando un kit de clonación TOPO TA de Invitrogen (Invitrogen nº de catálogo 45-0641, Carlsbad, CA, EE.UU.).

Además, podrían insertarse secuencias de promotor o sitios de unión a ribosoma en el sentido 5’ de cada secuencia que codifica la subunidad con el fin de facilitar su expresión a partir del vector. Los sitios de restricción presentes en las secuencias de extensión por solapamiento pueden aplicarse para tal inserción.

e. Consideraciones generales

La unión de secuencias que codifican las subunidades que constituyen una proteína heteromérica, según se describió anteriormente, puede realizarse para la mayor parte de las proteínas heteroméricas en las que se conoce la secuencia de las subunidades individuales. Además, cuando se usa una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que puede amplificar varios miembros de una familia particular, por ejemplo todas las subunidades a, 1 y y de la proteína G, es posible identificar y unir cualquier combinación de subunidades a partir de un tipo de células sin tener que analizare en primer lugar qué miembros de la familia se expresan mediante qué tipo de células. Por ejemplo, el ejemplo anterior puede realizarse usando un molde derivado de células hepáticas únicas aisladas que emplean una mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex que puede amplificar y unir todas las 16 subunidades Ga con las 5 subunidades G1 y las 12 subunidades Gy, identificando de ese modo qué combinación de subunidades se expresan en cada célula y simultáneamente aislando las secuencias codificantes responsables de tal combinación de subunidades. Además, el uso de cebadores degenerados podría servir incluso para identificar nuevos miembros de una familia particular.

Cuando se unen las subunidades de una proteína heteromérica usando la técnica de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de la presente invención, debe considerarse el tamaño global del producto unido puesto que existen límites para el número de pares de base que una ADN polimerasa puede amplificar. La polimerasa Deep Vent de New England Biolabs, MA, EE.UU. es una ADN polimerasa que puede generar extensiones de cebadores muy largas, de hasta 14.000 pb de longitud. Teóricamente, 14.000 pb pueden codificar una proteína con un peso promedio de 510 kDa. Por tanto, debe ser posible aislar secuencias codificantes para proteínas heteroméricas muy largas usando el procedimiento de la presente invención. Posiblemente puede aumentarse la capacidad de extensión incluso además usando mezclas de ADN polimerasas.

Ejemplo 9: Diseño de cebadores líder:

En este ejemplo, se diseñó un conjunto múltiplex de cebadores en los que se mantiene el sitio de cebado en la secuencia que codifica la región líder de las familias de cadena ligera kappa y cadena pesada de anticuerpos humanos.

Cuando se usan cebadores que se aparean con las secuencias codificantes N-terminales de las familias de la región variable, puede observarse algún grado de hibridación cruzada. Pueden hibridarse cebadores de una secuencia de familia génica particular con el ADNc de la otra familia génica, que en muchos casos provoca la creación de secuencias novedosas. Las proteínas producidas a partir de tales secuencias son potencialmente inmunogénicas cuando se usan en tratamiento. Generalmente, estas secuencias novedosas pueden corregirse por PCR, o eliminarse de la biblioteca.

Una solución alternativa, es colocar el sitio de cebado en la secuencia que codifica la región peptídica líder de la región variable de anticuerpos. Las secuencias híbridas, generadas como resultado del cebado cruzado, se eliminarán durante el procesamiento intracelular del anticuerpo, en el que la secuencia líder peptídica que contiene las secuencias inmunogénicas potenciales se separarán mediante corte y por tanto no estarán presentes en el producto de anticuerpo secretado. Se han localizado en el extremo 5’ de la secuencia líder codificante, conjuntos

previos de cebadores líder para clonar anticuerpos, lo que permite la expresión ecucariota directa (Campbell M.J. y col. 1992 Mol Immunol. 29, 193-203). Desafortunadamente, los péptidos líder eucariotas son poco adecuados para el procesamiento procariota.

La facilidad con la que se manipulan las secuencias de ácido nucleico en bacterias hace atractivo desarrollar

5 sistemas de clonación en los que sea posible lanzar secuencias entre vectores bacterianos y vectores para otros microorganismos huéspedes. Por tanto, se diseñó en el presente ejemplo un conjunto de cebadores múltiplex, en los que el sitio de cebado se mantiene en una posición en la secuencia que codifica la región líder, que permite la expresión funcional de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en ambos sistemas de expresión eucariotas y procariotas.

10 El requisito de secuencias para la rotura por la peptidasa señal en la región C-terminal de cualquier péptido líder parece muy similar para sistemas eucariotas y procariotas (Nielsen H. y col. 1997 Proteína Eng. 10, 1-6.). Además, se deduce que las mutaciones en la región C-terminal del péptido líder probablemente tendrán poco efecto sobre la conformación de la región N-terminal y viceversa. Por tanto, se espera que las secuencias C-terminales puedan ser transferibles entre especies sin perdida de la función.

15 El concepto básico del diseño de cebadores en el presente ejemplo, era colocar el sitio de cebado en los últimos seis codones de la región C-terminal del péptido líder. La parte restante de la secuencia codificante líder, en el sentido de 5’ del sitio de cebado (aproximadamente 50 nucleótidos) debe administrarse por el vector de expresión apropiado que aparea las especies huésped. Por ejemplo, pueden diseñarse vectores adecuados para la expresión en bacterias gram negativas con una secuencia líder PelB de longitud completa o parcial. Para la expresión de

20 anticuerpos en eucariotas será adecuado un vector con una secuencia líder parcial que codifica la cadena pesada de anticuerpos y una secuencia líder parcial que codifica la cadena kappa variable. Independientemente del sistema de expresión, los últimos seis aminoácidos de la secuencia líder, se originarán a partir de la secuencia líder que codifica anticuerpos endógenos que está contenida en el segmento de ácido nucleico insertado dentro del vector.

Se diseñaron las siguientes secuencias de cebadores para su uso en la RT-PCR de extensión por solapamiento

25 múltiplex (tabla 11). Sin embargo, las colas de solapamiento (letras en minúsculas) pueden volver a diseñarse fácilmente para funcionar en la unión mediante procedimientos de acoplamiento o recombinación.

Tabla 11

Nombre de cebador: SEC ID NO Secuencia de cebador en la dirección de 5’ a 3’

VHL: 86 87 88 89 90 91 92 tattcccagcggccgccGCCACAGGTGCCCACTC tattcccagcggccgccCCTTCMTGGGTCTTGTC tattcccagcggccgccTTARAAGGTGTCCAGTGT tattcccagcggccgccCCCAGATGGGTCCTG tattcccagcggccgccCTCCAAGGAGTCTGTTC tattcccagcggccgccCCATGGGGTGTCCTGTCA tattcccagcggccgccGCAACAGGTGCCCACT

CH(IgG): 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG

VLKL: 93 94 95 96 97 98 ggcggccgctgggaatagctagcgYTCCCAGGTGCCAGATG ggcggccgctgggaatagctagcgGTCCCTGGATCCAGTG ggcggccgctgggaatagctagcgCTCCCAGATACCACCGGA ggcggccgctgggaatagctagcgATCTCTGGTGCCTAC ggcggccgctgggaatagctagcgATCTCTGATACCAGGGCA ggcggccgctgggaatagctagcgGTTCCAGCCTCCAGGGGT

CLK: 99 atatatatggcgcgccTTAACACTCTCCCCTGTTGAA

M=A/T, R=A/G, Y=C/T, S=G/C. Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen.

Debe observarse que los sitios de restricción en este diseño de cebadores estaban ligeramente modificados en comparación con los cebadores descritos en los ejemplos anteriores. Por tanto, la secuencia de solapamiento entre las secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y cadena pesada comprendía un sitio de restricción NotI y uno NheI y en el cebador kappa constante (CLK), el sitio NotI anterior se ha intercambiado por un sitio AscI. La última modificación debe observarse desde luego cuando se diseñan los cebadores para la amplificación por PCR adicional. Además, el sitio NotI en el vector de clonación, mostrado en la figura 11, debe cambiarse por un sitio AscI, y el sitio AscI en la unidad de promotor debe cambiarse por un sitio NotI.

La funcionalidad con respecto a la rotura de secuencia líder se ha sometido a prueba in silico usando SignalP proporcionado por CBS en la Universidad Técnica Danesa.

Los péptidos líder quiméricos sometidos a prueba para determinar la cadena pesada variable, estaban codificados por secuencias de ácido nucleico compuestas por una secuencia PelB truncada, un sitio NotI C-terminal (SEC ID Nº

100: ATG AAA TAT CTT CTA CCA ACA GCG GCA GCT GGA TTA TTG GCG GCC GCC), y en asociación con el sitio NotI la parte específica de gen de una de las SEC ID Nº 86 a 92, que codifican los seis aminoácidos Cterminales de los miembros de la familia VHL nativa. Las siete secuencias mostraron rotura del péptido señal en bacterias gram negativas, usando el programa SignalP.

Los péptidos líder quiméricos sometidos a prueba para determinar la cadena ligera variable, estaban codificados por secuencias de ácido nucleico compuestas por una secuencia PeIB truncada, un sitio NheI C-terminal (SEC ID Nº

101: ATG AAA TAT TTG CTA CCA ACA GCG GCA GCT GGA TTA TTG TTA CTA GCG), y en asociación con el sitio NheI la parte específica de gen de una de las SEC ID Nº 93 a 98, que codifican los seis aminoácidos Cterminales de los miembros de la familia VLKL nativa. Las seis secuencias mostraron rotura del péptido señal en bacterias gram negativas, usando el programa SignalP.

Las secuencias de SEC ID Nº 100 y 101 son adecuadas para la construcción de un vector de expresión bacteriano similar al ilustrado en la figura 11, porque el sitio AscI ilustrado en la figura 11 está sustituido con SEC ID Nº 100 y el sitio NheI está sustituido con SEC ID Nº 101. Además, el sitio NotI ilustrado en la figura 11 necesita sustituirse por el sitio AscI.

El vector de expresión de mamífero (figura 9) puede volver a diseñarse asimismo para permitir la expresión en células de mamífero tras la transferencia de los segmentos que codifican la región variable a partir del vector bacteriano que se acaba de describir.

Ejemplo 10: RT-PCR múltiplex y unión mediante acoplamiento en un tubo

El presente ejemplo ilustra cómo puede generarse un par análogo que comprende secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada en una reacción en un único tubo usando acoplamiento en lugar de PCR de extensión por solapamiento, para obtener la unión.

a. RT-PCR múltiplex

Una línea celular producida in situ que expresa moléculas Fab con especificidad hacia el toxoide tetánico se distribuye limitando la dilución para obtener una célula única en un único tubo de PCR.

Además de la célula única, cada tubo de PCR contiene los siguientes reactivos en un volumen total de 20 !l:

1 x tampón Phusion HF dNTP en una concentración final de 200 !M de cada uno mezcla de cebadores múltiplex en las concentraciones tal como se indican en la tabla 12 0,8 U de Phusion polimerasa (FinnZymes nº de catálogo F-530-L) 1 !l de transcriptasa inversa Sensiscript (Qiagen nº de catálogo 205213) 20 U de inhibidor de RNasa

Tabla 12

Nombre de cebador VH: Conc.200 nM de cada uno SEC ID NO 102 103 104 105 106 107 108 109 Secuencia de cebador en la dirección de 5’ a 3’ tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCART tgttgttctagatgaaggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGT tgttgttctagatgaaggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGT tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT tgttgttctagatgaaggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGT tgttgttctagatgaaggcgcgccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC

200 nM: 61 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGTGCC

de: 62 ggaggcgctcGAGACGGTGACCATTGTCCC

JH: cada 63 ggaggcgctcGAGACGGTGACCAGGGITCC

uno: 64 ggaggcgctcGAGACGGTGACCGTGGTCCC

110: aacaacactagtgataggctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT

200 nM: 111 aacaacactagtgataggctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT

de: 112 aacaacactagtgataggctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT

VL: cada 113 aacaacactagtgataggctagccGATATTGTGATGACCCACACT

uno: 114 aacaacactagtgataggctagccGAAACGACACTCACGCAGT

115: aacaacactagtgataggctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT

CLK: 200 nM 16 atatatatgcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTG

W=A/T, R=A/G, S=G/C. Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen

Las condiciones de ciclado son:

10

52

Transcripción inversa 30 min 37 ºC Desnaturalización 30 s 98 ºC Desnaturalización 10 s 98 ºC

40 ciclos Apareamiento 30 s 55 ºC

Extensión 30 s 72 ºC

Extensión final 5 min 72 ºC

b. Unión mediante acoplamiento

Para realizar la unión mediante acoplamiento, se añaden enzimas de restricción y ligasa directamente a los productos de reacción de RT-PCR múltiplex. Como alternativa, la RT-PCR múltiplex puede purificarse antes de esta adición con el fin de liberar la mezcla de la polimerasa.

Se añaden los siguientes reactivos a cada tubo en un volumen total de 40 !l: 1 x tampón NEBII ATP 1 mM 50 U de XbaI (New England Biolabs nº de catálogo R0145L) 25 U de SpeI (New England Biolabs nº de catálogo R0133S) 100 !g/ml de BSA 400 U de ADN ligasa de T4 (New England Biolabs nº de catálogo M0202S) La reacción se incuba a 16 ºC durante la noche. Las secuencias unidas que codifican la región variable de cadena ligera y de cadena pesada se purifican a partir de

la reacción mediante electroforesis en gel y escisión de la banda de aproximadamente 1000 pb. En una versión como alternativa de este procedimiento, la reacción de RT-PCR múltiplex se realiza con un cebador CH en lugar de los cebadores JH en el conjunto de cebadores múltiplex. Este cebador puede equiparse con una cola de clonación que permite la inserción en marco de la región variable de la cadena pesada dentro de un vector de expresión o bien puede realizarse una PCR semianidada con los cebadores de la tabla 5.

Ejemplo 11: Generación de una inmunoglobulina policlonal recombinante con especificidad hacia toxoide tetánico

En el presente ejemplo se usan los resultados de un único donante (TT03) inmunizado con toxoide tetánico (TT) para ilustrar las etapas esquematizadas en el diagrama de flujo en la figura 10.

a. Donantes

A ocho donantes que se habían inmunizado previamente con la vacuna contra el tétanos se les administró una inmunización de recuerdo con vacuna contra el tétanos (Statens Serum Institut, Dinamarca). Se les asignó a los donantes los números TT01 a TT08. Seis días tras la inmunización de recuerdo con la vacuna contra el tétanos se extrajo una muestra de sangre de aproximadamente 200 ml de los donantes en un tubo que contenía anticoagulante.

Los donantes estaban sanos sin infecciones crónicas, enfermedad autoinmunitaria o medicación inmunosupresora y no habían recibido ninguna vacunación en el plazo de los últimos 3 meses.

a-1. Control de la calidad del donante

Se tomaron sangrados previos de los donantes en el momento de la inmunización. Catorce días más tarde se tomaron sangrados adicionales para determinar el título en suero. Todos los donantes respondieron con un aumento en el título de TT. También se estableció un ensayo ELISPOT para medir la frecuencia de células plasmáticas específicas de TT. Pueden usarse diferentes fracciones celulares para el ELISPOT, por ejemplo el sangrado principal del día 6, la fracción de PBMC, la fracción clasificada magnéticamente o la fracción clasificada mediante FACS. El ELISPOT puede usarse para evaluar el material de donante y para identificar a los que responden mejor, que pueden proceder entonces a través de la etapa de clasificación y RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Para el donante TT03 se realizó un ELISPOT usando la fracción celular CD19+ (véase la sección c). El ensayo ELISPOT se realizó según se describe por Lakew (Lakew, M. y col. 1997. J. Immunol. Methods 203, 193198) con modificaciones menores. La frecuencia de células plasmáticas específicas de TT en la fracción de PBMC se calculó como un 0,021 %.

b. Preparación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

Se aislaron PBMC a partir de la muestra de sangre usando Lymphoprep (Axis-Shield PoC AS, Noruega, nº de prod. 1001967) según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se diluyó la sangre 1:1 en PBS y se estratificó esta suspensión sobre Lymphoprep en una proporción 2:1. Se centrifugaron los viales durante 20 min, 25 ºC a 800 g y se recogió la banda de interfase blanca. Se lavaron las células en PBS que contenía EDTA 2 mM.

A partir de los 200 ml de sangre completa extraída del donante TT03 se obtuvieron aproximadamente 2 x 108 PBMC.

c. Enriquecimiento de células B

Se enriqueció el linaje de células B (células CD19+) de las PBMC mediante clasificación de células mediante perlas magnéticas usando el siguiente procedimiento.

Se tiñeron las PBMC aisladas con anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, EE.UU., nº de catálogo 345776). Se realizaron todas las etapas a 4 ºC en la oscuridad. Se realizó la tinción con 10 !l de anti-CD19-FITC por 1 x 106 células en un volumen de 100 !l por 1 x 106 células usando tampón M (PBS, pH 7,2, BSA al 0,5 %, EDTA 2 mM). Esto teñirá el linaje de células B de las PBMC. Se incubaron las células durante 20 min seguido por dos etapas de lavado con tampón M. Las células teñidas con anti-CD19-FITC se marcaron magnéticamente con microperlas anticonjugado con FITC, usando 10 !l de perlas magnéticas anti-FITC (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania, nº de catálogo 130-042-401) por 1 x 106 células en un volumen de 100 !l de tampón M por 1 x 106 células. Se realizó la incubación durante 15 min seguido por una única etapa de lavado con tampón M. Se resuspendieron las células en tampón M desgasificado.

Se pretrató una columna MACS LS (Miltenyi Biotec, Gladbach, Alemania, nº de catálogo 130-042-401) con tampón M desgasificado según las descripciones del fabricante. La suspensión de células teñidas con anti-CD19-FITC y marcadas con perlas magnéticas anti-FITC se aplicó a la columna y se dejó pasar. Se retuvieron las células teñidas y marcadas (CD19+) en el campo magnético que rodea la columna mientras que las células sin teñir (CD19) se hicieron pasar a través de la columna. Se lavó la columna con tampón M desgasificado. Se eliminó el campo magnético y se recogieron las células CD19+.

Se realizó una tinción analítica del material de partida (PBMC), de la fracción sin marcar y de la fracción marcada con CD19 de TT03, usando anti-CD19-FITC, anti-CD38-PE y anti-CD45-PerCP (figura 14). Esto muestra que la clasificación magnética de células da como resultado dos fracciones diferenciadas en comparación con la fracción de PBMC. Las células CD19 negativas se muestran en el panel B y las células CD19 se muestran en el panel C. De la fracción de PBMC el 11 % de las células eran CD19+, el grado de purificación de células CD19 positivas era del 99,5 % de R1 (la ventana de dispersión en la figura 14C) para TT03.

Tal como se observa en la figura 14C, el gráfico de anti-CD38/anti-CD45 mostraba una población distinta de células CD38hi, CD45in (R2) que corresponde al 1,1 % de R1. Esta población contenía las células plasmáticas y se recogió durante la posterior etapa de clasificación. Esto indicaba que en la fracción de PBMC el 0,12 % de las células correspondía a células plasmáticas.

Se congeló la fracción celular CD19 positiva en FCS (Invitrogen, nº de catálogo 16000-044) + DMSO al 10 % (Sigma, nº de catálogo D2650) para la posterior clasificación. Se realizó una análisis como el observado en la figura 14 en las células purificadas mediante MACS que se habían congelado para asegurar que las células estuvieron intactas (figura 15). Los patrones de tinción observados en la figura 15 eran los mismo que los observados en la figura 14C aunque se observó una intensidad de tinción ligeramente más amplia. Las células que se recogieron mediante la clasificación son el subconjunto de R1 y R2. Esto corresponde a aproximadamente el 1,1 % de las células purificadas mediante MACS.

d. Clasificación de células plasmáticas

Se descongeló el eluato congelado de la columna MACS, se centrifugó y se resuspendió en tampón para FACS (PBS, pH 7,2, BSA al 2 %) en una concentración de 1 x 106 células/60 !l de tampón para FACS. Se añadieron anti-CD19-FITC (Becton Dickenson, NJ, EE.UU., nº de catálogo 345776) (10 !l/106 células), anti-CD38-PE (Becton Dickenson, NJ, EE.UU., nº de catálogo 555460) (10 !l/106 células) y anti-CD45-PerCP (Becton Dickenson, NJ, EE.UU., nº de catálogo 345809) (20 !l/106 células) y se incubó la mezcla a 4 ºC durante 20 min en la oscuridad, seguido por un lavado en dos veces y resuspensión en tampón para FACS.

Se clasificaron las células mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) usando los siguientes parámetros de proceso de ventana:

1.: Dispersión directa y dispersión lateral con el fin de retener linfocitos y monocitos incluyendo blastocidos plasmáticos y células plasmáticas y para evitar las células muertas y células con una dispersión lateral muy alta que pueden ser agregados o granulocitos.

2.: Células que son CD19 positivas y expresan niveles aumentados de CD38 (CD38hi). Ésta es básicamente

5 sólo una ventana en CD38 dado que las PBMC se han enriquecido en una columna MACS para la expresión de CD19, pero esto revelará cualquier contaminante.

3. Células intermedias CD45 positivas. Todos los linfocitos expresan CD45. Sin embargo, las células plasmáticas regulan por disminución su expresión de CD45 en comparación con etapas de diferenciación de linfocitos tempranas. Por tanto, puede obtenerse una población diferenciada de células que corresponde

10 a células plasmáticas cuando se realiza el proceso de ventana en CD45.

Se recogieron las células clasificadas mediante FACS del donante TT03 como el subconjunto de las dos ventanas P2 y P1 (figura 16A y 16B, respectivamente). Las células eran CD38hi (FL2-A), CD45in (FL3-A) y CD19+, lo último debido a la purificación mediante MACS. Brevemente, se recogieron las células a granel, se contaron y se diluyeron en RPMI (Invitrogen, nº de catálogo 21875-034) que contenía FCS al 10 % (Invitrogen nº de catálogo 16000-044),

15 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen, nº de catálogo 15140-122), L-glutamina 2 mM (nº de catálogo 25030-024). Entonces se dispensaron las células en cincuenta placas de PCR de 96 pocillos (ABgene, nº de catálogo AB-0800) con una célula por pocillo en 5 !l de medio. Se sellaron las placas y se congelaron inmediatamente y se almacenaron para el posterior análisis de RT-PCR.

20 La tecnología de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex se aplicó a las células únicas obtenidas a partir del donante TT03, consiguiendo de este modo la unión análoga de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada anti-toxoide tetánico transcritas.

e-1. RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa

Se usó el kit de RT-PCR de una etapa de Qiagen (Qiagen nº de catálogo 210212, Hilden, Alemania) para la RT-PCR

25 de extensión por solapamiento múltiplex esencialmente según la recomendación del fabricante. Se retiraron del congelador cincuenta placas de PCR de 96 pocillos congeladas que contenían aproximadamente una célula única por pocillo y cuando los pocillos estuvieron libres de cristales de hielo, se añadieron 15 !l de mezcla de reacción de RT-PCR inmediatamente a cada pocillo.

La mezcla de reacción de RT-PCR contenía, en un volumen total de 20 !l, los siguientes reactivos:

30 1 x tampón RT-PCR de una etapa

dNTP en una concentración final de 400 !M de cada uno

mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex en las concentraciones tal como se indican en la tabla 13

0,8 !l de mezcla de enzimas de RT-PCR de una etapa

35 20 U de inhibidor de RNasa (RNasin, Promega, Madison EE.UU., nº de catálogo N2515)

La composición de la mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex se muestra en la tabla 13.

Tabla 13

Nombre de cebador: Conc. SEC ID NO Secuencia de cebador en la dirección 5’ a 3’

VH: 40 nM de cada uno 116 117 118 119 tattcccatggcgcgccCAGRTGCAGCTGGTGCART tattcccatggcgcgccSAGGTCCAGCTGGTRCAGT tattcecatggcgcgccCAGRTCACCTTGAAGGAGT tattcccatggcgcgccSAGGTGCAGCTGGTGGAG

120 121 122 123: tattcccatggcgcgccCAGGTGCAGCTACAGCAGT tattcccatggcgcgccCAGSTGCAGCTGCAGGAGT tattcccatggcgcgccGARGTGCAGCTGGTGCAGT tattcccatggcgegccCAGGTACAGCTGCAGCAGTC

CH(IgG): 200 nM 9 GACSGATGGGCCCTTGGTGG

VL: 40 nM de cada uno 124 125 126 127 128 129 ggcgcgccatgggaatagctagccGACATCCAGWTGACCCAGTCT ggcgcgccatgggaatagctagccGATGTTGTGATGACTCAGTCT ggcgcgccatgggaatagctagccGAAATTGTGWTGACRCAGTCT ggcgcgccatgggaatagctagccGATATTGTGATGACCCACACT ggcgcgccatgggaatagctagccGAAACGACACTCACGCAGT ggcgcgccatgggaatagctagccGAAATTGTGCTGACTCAGTCT

CLK: 200 nM 130 atatatatgcggccgcTTAACACTCTCCCCTGTTGAA

Las condiciones de ciclado eran tal como sigue: Transcripción inversa: 30 min 55 ºC Activación de polimerasa: 15 min 95 ºC inactiva la transcriptasa

inversa y activa la Taq polimerasa

Reacción de PCR: Desnaturalización 30 s 94 ºC Apareamiento 30 s 52 ºC

35 ciclos Extensión 5 min 72 ºC Extensión final 10 min 72 ºC

5 e-2. Amplificación adicional

Se sometió un microlitro del producto de reacción de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex, de cada muestra, a PCR semianidada (kit Biotaq, Bioline, RU nº de catálogo BIO-21040), esencialmente tal como propone el fabricante usando placas de PCR de 96 pocillos (ABgene, nº de catálogo AB-0800). El volumen total de cada reacción era 50 !l, conteniendo una concentración final de 1x tampón Biotaq, dNTP 200 !M (de cada uno), MgCl2 2

10 mM, 1,25 U de Bio Taq polimerasa y los cebadores mostrado en la tabla14.

35 Tabla 14

CLK: 200 nM 21 accgcctccaccggcggccgcttaTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTT

Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen.

Las condiciones de ciclado eran tal como sigue:

Desnaturalización 30 s 95 ºC

Apareamiento 30 s 55 ºC

30 ciclos Extensión 1,5min 72 ºC

Extensión final 5 min 72 ºC

Se analizaron diez microlitros de muestras de la columna A, pocillo 1-12 de cada placa mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5 % usando bromuro de etidio para la visualización, con el fin de verificar que la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex era satisfactoria. El tamaño esperado del fragmento de extensión por solapamiento era de aproximadamente 1070 pb (el tamaño exacto depende de las longitudes de las regiones variables). La figura 17 muestra muestras de ocho placas de 96 pocillos. El número promedio de fragmentos de RT-PCR de extensión por solapamiento satisfactorios de cincuenta placas de 96 pocillos, se estimó en ocho por placa. Por tanto, el número total de fragmentos de RT-PCR de extensión por solapamiento satisfactorios se estimó en aproximadamente 400.

Se consolidaron diez microlitros de todas las reacciones realizadas, ejecutadas en las placas de 96 pocillos, que se originaron a partir del mismo donante, en un único tubo. Posteriormente se purificó una alícuota constituida por 200 !l de los productos de PCR combinados usando el kit de purificación de PCR QIAquick según el procedimiento del fabricante (Qiagen nº de catálogo 28106, Hilden, Alemania) usando 60 microlitros de tampón EB para la elución. La combinación purificada de los productos de PCR por solapamiento se digirió con XhoI y NotI y posteriormente se purificó mediante electroforesis preparativa en gel de agarosa al 1 %; los fragmentos de extensión por solapamiento se quitan del gel de agarosa y se purifican usando un kit Qiaex II (Qiagen nº de catálogo 20051, Hilden, Alemania).

f. Biblioteca de expresión de Fab análoga

Se generó una biblioteca de expresión de Fab mediante un procedimiento de acoplamiento de dos etapas. Inicialmente se acopló la combinación de fragmentos de extensión por solapamiento digeridos descritos anteriormente dentro del vector JSK301 de E. coli digerido XhoI/NotI (figura 11). La reacción de acoplamiento se transformó posteriormente en células de E. coli electrocompetentes (XL1-Blue competentes por electroporación, Stratagen, nº de catálogo 200228, La Jolla, EE.UU.), según las instrucciones del fabricante. Las células de E. coli transformadas se colocaron en placas sobre 2xYT agar que contenía 100 !g/ml de carbenicilina. Se usó la biomasa correspondiente a aproximadamente 1010-1011 células que se originaron a partir de un número de colonias independientes que superaron al menos 5 veces el número total de productos de PCR por solapamiento como material de partida para la preparación de plásmidos usando el kit Maxi de preparación de plásmidos de Qiagen (Qiagen nº de catálogo 12163, Hilden, Alemania). Para permitir la expresión de Fab de las secuencias unidas que codifican VH y VL análogas clonadas, se insertaron un promotor procariota y un casete líder en una segunda etapa de acoplamiento. El fragmento de promotor bidireccional usado (SEC ID Nº 321) se extrajo del JSK301 parental mediante digestión con AscI/NheI. La combinación purificada de plásmidos se digirió de la misma manera con endonucleasas de restricción AscI/NheI y se purificó en gel según lo descrito previamente. Los fragmentos purificados se acoplaron posteriormente y se transformaron en células E. coli electrocompetentes (TG1, Stratagene, nº de catálogo 200123, La Jolla, EE.UU.) y se colocaron en placas sobre 2xYT agar que contenía 100 !g/ml de carbenicilina y glucosa al 1 %. El proceso de generación de biblioteca de expresión de Fab se esquematiza en la figura 12.

g. Exploración de clones

Se exploraron clones que expresan Fab para determinar la unión a antígeno TT mediante ensayos ELISA específicos de antígeno.

g-1. Generación de placas maestras y expresión de Fab

Se pusieron colonias seleccionadas individuales de las células TG1, albergando cada una un vector de expresión de Fab análogo de la biblioteca generada según se describe en la sección (f) dentro de pocillos individuales de placas de 96 pocillos que contenían 2 x YT/100 !g/ml de Carb/glucosa al 1 %. Se incubaron las placas durante la noche a 37 ºC con agitación suave. Se consolidaron cuatro placas de 96 pocillos dentro de los pocillos de una placa de 384 pocillos, que contenía 2 x YT/100 !g/ml de Carb/glucosa al 1 %, usando replicadores de 96 agujas. Se incubaron las placas de 384 pocillos durante el día a 37 ºC. Estas placas se denominan placas maestras y se almacenaron a -80 ºC tras la adición de glicerol hasta una concentración final del 15 %.

Las placas maestras se usaron para la inoculación de placas de 384 pocillos profundos que contenían 2 x YT/100 !g/ml de Carb/glucosa al 0,1 % usando un replicador de 96 agujas. Las placas se sellaron y se incubaron durante 2 3 h a 37 ºC con agitación.

Se indujo la expresión de Fab añadiendo un volumen igual de 2 x YT/100 !g/ml de Carb/IPTG 0,2 mM, obteniendo una concentración de IPTG final de 0,1 mM. Las placas se sellaron y se incubaron durante la noche a 30 ºC con agitación. Al día siguiente, se analizaron los sobrenadantes que contenían Fab para determinar la especificidad de unión a antígeno TT mediante ELISA.

g-2. Análisis ELISA

Se recubrieron placas de ELISA de trescientos ochenta y cuatro (384) pocillos (Corning Inc., Corning, NY, EE.UU., nº de catálogo 3700) durante la noche a 4 ºC con antígeno del toxoide tetánico (TT), diluido hasta una concentración final de 1 !g/ml en PBS en un volumen de 25 !l por pocillo. Los sitios de unión en exceso de los pocillos se bloquearon durante 1 h a temperatura ambiente (TA) añadiendo MPBS-T al 2 % (leche en polvo desnatada en PBS al 2 %, Tween 20 al 0,05 %). Se lavaron los pocillos 2 veces con PBS-T (PBS, Tween 20 al 0,05 %).

Se diluyeron los sobrenadantes bacterianos que contenían Fab de la sección (g-1) 1:2 en M-PBS-T al 2 % y se transfirieron a los pocillos de ELISA por duplicado. Se realizó la incubación durante 1 h a TA. Se lavaron los pocillos 4 veces con PBS-T. Se añadió HRP/Fab anti-humano de cabra (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU., nº de catálogo A0293) dilución 1:10.000 en M-PBS-T al 2 % a los pocillos. Se realizó la incubación durante 1 h a TA. Se lavaron los pocillos 4 veces con PBS-T. Se añadió sustrato TMB Plus (KemEnTec, Copenhague, Dinamarca, nº de catálogo 4390L) y se realizó la incubación durante 5-15 minutos. Se detuvieron las reacciones añadiendo un volumen igual de H2SO4 1 M y se analizaron usando un espectrofotómetro a 450 nm (Multiscan Ascent, Labsystems, Franklin, EE.UU.).

Los clones bacterianos originales correspondientes a clones de unión a antígeno TT pueden recuperarse posteriormente de las placas maestras originales. El ADN de plásmido puede prepararse a partir de los clones de Fab positivos para antígenos aislados, generando una subbiblioteca de expresión de Fab análoga de clones de unión a antígeno TT.

Un subconjunto de los clones se analizó además mediante un ensayo ELISA anti-kappa, con el fin de obtener una correlación entre el número de clones de unión a antígeno y el número de clones que expresan Fab. El ensayo antikappa se realizó generalmente como el ensayo TT, excepto porque los pocillos se recubrieron con una dilución 1:1000 de anticuerpo anti-kappa humana de cabra (Caltag, California, EE.UU., nº de catálogo H16000), usando un tampón carbonato, pH 9,6.

g-3. Resultados de la exploración

Se exploraron clones de cuatro placas de 384 pocillos para determinar la reactividad con Ac anti-kappa y TT usando ensayos ELISA según el procedimiento descrito en g-2. Los resultados obtenidos se resumen en las tablas 15 a 19. Los resultados de ELISA anti-kappa informan sobre la expresión de fragmentos Fab en un clon dado, los resultados de ELISA TT informan sobre la funcionalidad de los fragmentos Fab.

Tabla 15 Exploración ELISA, anti-kappa de cubierta (1440 clones en total)

Nº de placa: 2 x fondo 3 x fondo 4 x fondo

G050: 105 79 73

G051: 93 79 68

G052: 120 96 73

G053: 164 141 125

Suma: 482 395 339

% de clones pos. para Fab: 34 % 27 % 24 %

De 1440 clones únicos analizados, 482 clones o el 34 % mostraron reactividad con anti-kappa a un nivel superior a 2 x la reactividad de fondo. 395 clones o el 27 % de los clones mostraron una reactividad superior a 3 x fondo, etc.

Los mismos clones se analizaron para determinar la reactividad con antígeno TT mediante ELISA y los resultados se facilitan en la tabla 16 a continuación:

Tabla 16 Exploración ELISA, TT de cubierta (1440 clones en total)

Nº de placa: 2 x fondo 3 x fondo 4 x fondo

G050: 26 19 17

G051: 24 18 15

G052: 34 31 24

G053: 46 36 30

Suma: 130 104 86

% de clones pos. para TT: 9,0 % 7,2 % 6,1 %

10 A partir de esta tabla se observa que el 9,0 % de los clones mostraba reactividad con TT a 2 x fondo (definido como la señal obtenida mediante la reactividad de un fragmento Fab con una especificidad irrelevante). 104 clones reaccionaron a 3 x fondo (7,2 %) etc.

De los clones positivos para Fab (482 clones en total), aproximadamente el 27 % de los clones (130/482) mostraron reactividad con TT a 2 x el nivel de fondo. Este nivel no cambia significativamente a los otros niveles de fondo.

15 Se exploraron seis placas de 384 pocillos para determinar los clones con reactividad con TT. El número de clones que dieron lugar a reactividad con el antígeno se muestran en la tabla 17. El ELISA anti-kappa no se llevó a cabo con estas placas.

Tabla 17 Exploración ELISA, TT de cabra (2160 clones en total) El porcentaje de clones positivos para TT en las placas G054 -G059 era comparable al encontrado en las placas G050 -G053 (tabla 16).

Nº de placa: 2 x fondo 3 x fondo 4 x fondo

G054: 82 65 52

G055: 30 24 21

G056: 25 23 21

G057: 30 28 26

G058: 24 21 19

G059: 18 14 13

Suma: 209 175 151

% de clones pos. para TT: 9,7 % 8,1 % 7,0 %

Los resultados de todos los clones explorados frente a TT (tabla 16 y 17) se resumen en la tabla18.

Tabla 18 Todos los clones explorados, clones reactivos con TT

Placas: 2 x fondo 3 x fondo 4 x fondo

G050 -G053: 130 104 86

G054 -G059: 209 175 151

Suma: 339 279 237

% del total (3600): 9,4 % 7,8 % 6,6 %

En resumen, un total de 339 clones mostraron reactividad con TT al menos a 2x los niveles de fondo (tabla 18). Esto corresponde al 9,4 % de todos los clones explorados.

10 Todos los clones positivos que mostraron reactividad con TT a 2x fondo se inocularon en placas de 96 pocillos según lo descrito previamente, a partir de la placa maestra. Al día siguiente, se recogieron las bacterias mediante centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos y se resuspendió el sedimento en EDTA 0,8 mM, 0,4 x PBS, NaCl 0,8 M, y se incubó en hielo durante 15 minutos. Se recogió el extracto periplásmico mediante centrifugación y se analizó adicionalmente la reactividad de los clones. Aquí se muestran los resultados de una placa de este tipo (G060) para

15 la reactividad con anti-kappa (figura 18), ovoalbúmina (antígeno no relacionado) (figura 19), TT (figura 20) y un ensayo competitivo de una etapa usando una concentración 10-7 M de antígeno TT en disolución (figura 21). Estos ensayos ELISA se realizaron en el mismo extracto periplásmico, a la misma dilución.

La mayoría de los clones expresaron fragmentos Fab (90/96) (figura 13) y ningún clon reaccionó con ovoalbúmina (figura 19). La reactividad con TT inmovilizado se redujo o inhibió completamente mediante TT en disolución (figura

20 21), lo que indica que los clones reaccionan específicamente con TT. La reactividad de los clones en la placa G060 se resume en la tabla 19.

Tabla 19 Resumen de la placa G060 (96 clones en total)

Nivel de fondo: Positivos para anti-Kappa Positivos para TT

2 x: 94 % (90/96) 74 % (71/96)

3 x: 91 % (87/96) 72 % (69/96)

4 x: 84 % (81/96) 69 % (66/96)

25 h. Análisis de diversidad y aprobación de clones

Los plásmidos aislados de 47 clones (de la placa G060) de la subbiblioteca de expresión de Fab de unión a antígeno TT análoga se sometieron a análisis de secuencia. Las secuencias que codifican la cadena pesada variable se secuenciaron usando el cebador LSN-HCP: AGGAAACAGGAGATATACAT (SEC ID Nº 131), apareando con el promotor P tac, y se secuenciaron las secuencias que codifican la cadena ligera usando el cebador LSN-LCP: 30 TCGCCAAGGAGACAGTCATA (SEC ID Nº 132), apareando con el promotor P lac. Se analizaron los datos de secuencia usando el programa Vector NTI (Informax, Frederick, MD, EE.UU.). El dato de secuencia resultante de la

cadena pesada se redujo a un par de bases en 5’ del sitio de restricción AscI en el sentido de 5’ e inmediatamente en 3’ del sitio de restricción XhoI en el sentido de 3’. El dato de secuencia de cadena ligera se redujo al segundo par de bases en 5’ del sitio de restricción NheI en el sentido de 5’, y en 3’ del último codón “AAA” que codifica la lisina Cterminal de cadena variable. La reducción se realizó con el fin de facilitar un análisis adicional tal como la traducción de cada secuencia de ADN.

Las secuencias que codifican la cadena ligera y pesada variables se analizaron para determinar el uso del gen de la línea germinal comparando las secuencias con la base de datos de secuencias de región variable de la línea germinal de base V (MRC Centre for Protein Engineering, Cambridge, RU). Se determinó, por tanto, el alelo de la línea germinal más relacionado para cada secuencia que muestra un repertorio de gen V que se origina de 12 alelos de la línea germinal de cadena pesada variable diferentes que pertenecen a la familia VH de VH1 a VH5 y 8 alelos de la línea germinal de cadena ligera kappa variable diferentes que pertenecen a VKI, VKIII y VKIV (tabla 20).

Además, las secuencias de genes variables se tradujeron en secuencias de proteínas que se alinearon usando el programa AlignX (Informax, Frederick, MD, EE.UU.) tal como se representa en la figura 22 y figura 23. Basándose en las alineaciones de secuencias de proteínas, pudieron categorizarse las secuencias de cadena variable en grupos según los acontecimientos de transposición V(D)J, designados con H para la secuencia de cadena pesada variable y L para secuencia de cadena kappa variable seguido por un número único. En cada grupo de transposición, se categorizaron las secuencias según el genotipo de maduración (tipo M en la tabla 20) dentro de las regiones CDR1, 2 y 3, representado por una letra en minúsculas en orden alfabético. Siete de los clones tenían codones de terminación prematuros, de los que 6 clones eran una mutación ámbar (TAG) (ID de clones g060:b12, d08, f06, c12, f03, c04) y 1 clon eran una mutación ópalo (TGA) (ID de clon g060:h12). Estos codones tenían la mayor probabilidad de ser suprimidos por E. coli dando como resultado fragmentos Fab funcionales. Cuatro de estos clones eran miembros de los grupos que contenían clones similares, haciéndolos redundantes. Hubo que analizar clones adicionales con el fin de sustituir los 3 clones restantes con condones de terminación prematuros ya que eran miembros individuales de sus grupos. Como alternativa, las secuencias podían corregirse mediante técnicas de biología molecular convencionales tales como PCR, sustituyendo el codón de terminación con un codón apropiado.

Las 47 secuencias de región V analizadas pudieron dividirse en 20 grupos de transposición V(D)J únicos (designados “grupos” en la tabla 20) para el gen tanto de pesado variable como kappa variable. Cuatro de los grupos de transposición pudieron dividirse adicionalmente en 1 a 4 tipos de maduración (a hasta d), dando como resultado 27 secuencias que codifican anticuerpos únicas (tabla 12). Generalmente, los grupos de transposición de cadena pesada específicos se combinan con grupos de transposición de cadena ligera específicos (por ejemplo H1 con L1, H12 con L24, etc.). Además, el tipo de maduración concuerda entre los pares de las secuencias que codifican la cadena pesada variable y ligera variable (por ejemplo H4c concuerda con L13c). Tal rigurosidad en el apareamiento entre grupos de transposición y tipos de maduración indica un apareamiento análogo de las secuencias que codifican la región variable.

Sin embargo, el grupo de transposición de cadena pesada H4 es una excepción. Los pares H4 con dos cadenas ligeras diferentes L28 y L13. L13 era único de H4, que comprende tipos de maduración a, b y c que concuerdan con los tipos de maduración L13. L28, por otro lado, se encontró también apareado con el único miembro en el grupo de cadena pesada H2. Dos de siete secuencias de cadena pesada H4a se aparean con la cadena pesada L13a y cinco de siete secuencias de cadena pesada H4a se aparean con L28a. En resumen, estas observaciones sugerían un acontecimiento de RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex en el que dos células plasmáticas que producen anticuerpos específicos de TT, con las combinaciones de genotipo H2-L28 y H4a-L13a, estaban presentes en un pocillo individual. Se esperaban acontecimientos de aleatorización poco comunes del apareamiento de genes de cadena ligera y cadena pesada, tal como para H2 y H4a con L28, ya que el experimento se basaba en la dilución limitante de células plasmáticas.

La identidad de secuencia entre pares análogos individuales de las secuencias que codifican la cadena pesada variable y cadena ligera variable del mismo grupo y tipo de maduración es al menos del 90 % y preferentemente al menos del 95 %. Tómense por ejemplo g060g03 y g060a01 del grupo H1 del tipo de maduración a. El clon g060g03 corresponde al par de SEC ID de nucleótidos 168:215, en las que la secuencia que codifica la cadena pesada variable corresponde a SEC ID Nº 168 y las secuencias que codifican la cadena ligera variable corresponden a SEC ID Nº 215. El clon g060a01 corresponde al par de SEC ID de nucleótidos 133:180. Cuando SEC ID Nº 168 está alineada con SEC ID Nº 133 (las cadenas pesadas variables) las bases 4/369 no son idénticas y para las cadenas ligeras variables (las SEC ID Nº 215 y 180) las bases 8/327 no son idénticas, esto corresponde a una identidad de secuencia del 98,3 % entre estos dos pares análogos (g060g03 y g060a01). Sin embargo, cuando se mira una identidad de secuencia entre diferentes grupos no se espera que la identidad de secuencia sea alta, ya que es una subbiblioteca policlonal y se desea diversidad. En este ejemplo particular, la menor identidad entre los pares análogos es aproximadamente del 40 % (por ejemplo g060b11 y g060h11 tienen una identidad de secuencia del 39,5 %).

Una subbiblioteca de pares análogos de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas puede ser una en la que las inmunoglobulinas que pueden obtenerse a partir de dicha biblioteca pueden reaccionar con o unirse a toxina tetánica.

Una subbiblioteca de este tipo de pares análogos de secuencias que codifican la región variable de cadena ligera y la región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas puede comprender pares análogos individuales con al menos el 90 % de identidad de secuencia con un par de SEC ID individual, seleccionado del grupo que consiste en los pares de SEC ID 135:182, 168:215, 146:193, 151:198, 173:220, 152:199, 164:211, 148:195, 137:184, 169:216, 138:185, 143:190, 161:208, 166:213, 157:204, 139:186, 134:181, 150:197, 156:203, 158:205, 170:217, 178:225,

141:188 ó 144:191.

Tabla 20

VH: Vkappa

ID delclon: Grupo TipoM Familia Líneagerminal Sec.nucl. Sec.prot. Grupo TipoM Familia Líneagerminal Sec.nucl. Sec.prot.

g060a03: H1 b VH1 DP-14 42135 136229 L1 b VKI DPK9 89182 183276

g060g03: H1 a VH1 DP-14 75168 169262 L1 a VKI DPK9 122215 216309

g060a01: H1 a VH1 DP-14 13340 134227 L1 a VKI DPK9 87180 181274

g060b12: H11 a VH3 DP-77 52145 146239 L10 a VKIII DPK22 99192 193286

g060c03: H11 a VH3 DP-77 53146 147240 L10 a VKIII DPK22 100193 194287

g060d08: H11 a VH3 DP-77 61154 155248 L10 a VKIII DPK22 108201 202295

g060f06: H11 a VH3 DP-77 69162 163256 L10 a VKIII DPK22 116209 210303

g060d04: H12 a VH1 DP-10 58151 152245 L24 a VKI DPK4 105198 199292

g060h02: H12 a VH1 DP-10 82175 176269 L24 a VKI DPK4 129222 223316

g060h10: H12 a VH1 DP-10 84177 178271 L24 a VKI DPK4 131224 225318

g060g11: H12 b VH1 DP-10 80173 174267 L24 b VKI DPK4 127220 221314

g060d05: H12 c VH1 DP-10 59152 153246 L24 c VKI DPK4 106199 200293

g060f09: H12 d VH1 DP-10 71164 165258 L24 d VKI DPK4 118211 212305

g060c07: H15 a VH5 DP-73 55148 149242 L16 a VKIII DPK22 102195 196289

g060d11: H15 a VH5 DP-73 62155 156249 L16 a VKIII DPK22 109202 203296

g060g02: H15 a VH5 DP-73 74167 168261 L16 a VKIII DPK22 121214 215308

g060a09: H16 - VH1 DP-73 44137 138231 L4 - VKI DPK9 91184 185278

g060g04: H17 a VH4 DP-66 76169 170263 L3 a VKI DPK9 123216 217310

g060h04: H17 a VH4 DP-66 83176 177270 L3 a VKI DPK9 130223 224317

g060a10: H18 a VH2 VII-5 45138 139232 L21 a VKI L12a 92185 186279

g060h12: H18 a VH2 VII-5 86179 180273 L21 a VKI L12a 133226 227320

g060b09: H19 a VH2 VII-5 50143 144237 L23 a VKI DPK8 97190 191284

g060f10: H19 a VH2 VII-5 72165 166259 L23 a VKI DPK8 119212 213306

g060f05: H2* - VH1 DP-88 68161 162255 L28* a VKIV DPK24 115208 209302

g060f11: H21 a VH3 DP-32 73166 167260 L31 a VKI DPK9 120213 214307

g060g12: H21 a VH3 DP-32 81174 175268 L31 a VKI DPK9 128221 222315

g060f01: H10 - VH3 COS-8 64157 158251 L7 - VKI DPK8 111204 205298

g060a11: H23 a VH3 DP-77 46139 140233 L5 a VKI DPK9 93186 187280

g060c12: H23 b VH3 DP-77 56149 150243 L5 b VKI DPK9 103196 197290

g060f03: H24 - VH3 DP-38 66159 160253 L20 - VKI DPK8 113206 207300

g060a02: H3 - VH3 DP-77 41134 135228 L9 - VKI 016 88181 182275

g060d03: H4 a VH1 DP-88 57150 151244 L13 a VKIII DPK22 104197 198291.

g060f08: H4 a VH1 DP-88 70163 164257 L13 a VKIII DPK22 117210 211304

g060b05: H4* a VH1 DP-88 47140 141234 L28* a VKIV DPK24 94187 188281

g060b07: H4* a VH1 DP-88 49142 143236 L28* a VKIV DPK24 96189 190283

g060f04: H4* a VH1 DP-88 67160 161254 L28* a VKIV DPK24 114207 208301

g060g10: H4* a VH1 DP-88 79172 173266 L28* a VKIV DPK24 126219 220313

g060d07: H4* a VH1 DP-88 60153 154247 L28* a VKIV DPK24 107200 201294

g060e05: H4 c VH1 DP-88 63156 157250 L13 c VKIII DPK22 110203 204297

g060102: H4 b VH1 DP-88 65158 159252 L13 b VKIII DPK22 112205 206299

g060g09: H4 c VH1 DP-88 78171 172265 L13 c VKIII DPK22 125218 219312

g060c04: H6 - VH1 DP-88 54147 148241 L12 - VKIII DPK22 101194 195288

g060g07: H20 - VH4 DP-71 77170 171264 L8 a VKI DPK9 124217 218311

g060h11: H7 - VH2 VII-5 85178 179272 L18 - VKI L12a 132225 226319

g060b06: H8 a VH3 DP-46 48141 142235 L17 a VKI DPK1 95188 189282

g060a04: H8 a VH3 DP-46 43136 137230 L17 a VKI DPK1 90183 184277

g060b10: H9 - VH1 DP-14 51144 145238 L30 - VKI DPK1 98191 192285

El asterisco indica secuencias que codifican V implicadas en aleatorizaciones. Sec. prot. indica los números de SEC ID del listado de secuenciascorrespondiente a las secuencias de proteínas y Sec. nucl. indica los números de SEC ID correspondientes a la secuencia de ácido nucleico en el listado desecuencias

i. Afinidades aparentes

Se estableció un ensayo de competición con el fin de determinar la afinidad aparente o CI50 de clones seleccionados de la placa G060.

Brevemente, se expresaron fragmentos Fab en cultivos de 50 ml tal como sigue: a 50 ml de 2 x YT/100 !g/ml

5 de Carb/glucosa al 0,1 % se les añadieron 0,5 ml de cultivo durante la noche y se agitó durante aproximadamente 2 h a 37 ºC. Se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,1 mM y se continuó agitando durante la noche a 30 ºC. Al día siguiente, se recogieron las bacterias mediante centrifugación a 4000 rpm durante 15 minutos y se resuspendió el sedimento en 1 ml de EDTA 0,8 mM, 0,4 x PBS, NaCl 0,8 M, y se incubó en hielo durante 15 minutos. Se recogió el extracto periplásmico mediante centrifugación y se

10 almacenó a -20 ºC.

El ensayo de competición se realizó tal como sigue: se añadieron extractos periplásmicos en diluciones apropiadas estimadas mediante valoración a una serie de tubos. Como control positivo se usó el fragmento Fab mp584 derivado de la presentación en fago, derivado de la línea celular HB8501 de hibridoma humano que expresa un anticuerpo anti-TT. Se añadió TT soluble al primer tubo a una concentración 100 nM y 15 posteriormente se diluyó en etapas de cuatro veces en los siguientes tubos, preparando un total de siete diluciones de TT (desde 100 nM hasta 25 pM). Se incubaron las reacciones durante aproximadamente 45 minutos a temperatura ambiente. Se transfirieron las muestras a placas de ELISA recubiertas con TT a 1 !g/ml y se bloquearon según lo descrito previamente. Se incubaron las placas durante 1 h a temperatura ambiente, seguido por un lavado 4x con PBS-T, se añadió HRP/Fab anti-humano de cabra a una dilución

20 1:10.000 y se incubó durante 1 h. Se añadió sustrato TMB Plus (KemEnTech, Dinamarca, nº de catálogo. 4390A), se realizó la incubación durante aproximadamente 10 minutos y se detuvieron las reacciones con H2SO4 1 M. Se leyeron las placas a 450 nm. Se representaron los datos en la figura 24.

Las afinidades aparentes de los clones analizados se facilitan en la tabla 21:

25 Tabla 21

Clon: Afinidad aparente

g060a10: 0,50 nM

g060b06: 0,60 nM

g060b12: 1,2 nM

g060c04: 0,55 nM

g060d04: 1,1 nM

g060f01: 1,2 nM

g060g04: 0,9 nM

g060g07: 0,35 nM

g060h11: 3,0 nM

mp584 (cont. pos.): 6,0 nM

Tal como se observa en la tabla 21, los fragmentos Fab tienen afinidades aparentes en el intervalo nanomolar inferior o picomolar superior. Además, todos los fragmentos Fab apareados análogos muestran una afinidad aparente superior que la del fragmento Fab derivado de presentación en fago.

j. Resumen

En el donante TT03 la frecuencia de células plasmáticas específicas de TT en la fracción celular de monocitos en sangre periférica se calculó como el 0,022 %. Aproximadamente se generaron 400 pares análogos a partir de TT03. Se exploraron 3600 clones de las células transformadas con la biblioteca de pares análogos usando ELISA, de estos, 339 clones mostraron reactividad con TT en la exploración ELISA. Se han analizado 47 de estos clones con respecto a su diversidad clonal. De estos 47 clones, 27 demostraron parecer secuencias que codifican la región variable no aleatorizadas únicas. Tres de estos clones contenían un codón de terminación prematuro que necesitará corrección antes de la transferencia a un vector de expresión de mamífero. La transferencia a vectores de expresión de mamífero se describió en el ejemplo 1 sección h. Se midieron las afinidades aparentes en clones seleccionados, oscilando entre el intervalo nanomolar inferior y el picomolar superior.

k. Prospectos

La toxina tetánica es una de las sustancias más tóxicas conocidas con una dosis letal de unos pocos nanogramos. La toxina se produce por Clostridium tetani, una bacteria del suelo también presente en el tracto digestivo de hasta el 25 % de los seres humanos. El programa de inmunización contra el tétanos ha suprimido de manera eficaz la enfermedad en el mundo occidental, aunque todavía se observan 100-200 casos en la mayoría de los países occidentales anualmente, con una proporción de caso-fatalidad del 50 %. En el mundo en desarrollo el número de casos es significativamente mayor. El crecimiento bacteriano en heridas penetrantes contaminadas puede conducir a la liberación de toxina, lo que conduce en última instancia a rigidez, espasmos, paro respiratorio y muerte.

Los productos de inmunoglobulinas hiperinmunitarios aislados a partir de donantes de sangre humana con un título alto de respuesta de anticuerpos frente al toxoide tetánico pueden usarse para prevenir el tétanos o si se inicia de manera temprana para tratar el tétanos establecido, también junto con inmunización activa. Sin embargo, debido a la escasez de producto humano, se usa anti-toxoide tetánico hiperinmunitario equino en el mundo en desarrollo. Los anticuerpos monoclonales o policlonales recombinantes frente al toxoide tetánico tienen potencial para sustituir a los productos de globulinas hiperinmunitarios para el uso terapéutico y/o profiláctico. Se ha descrito que los anticuerpos monoclonales recombinantes originados a partir de la tecnología de hibridoma convencional son eficaces frente a TT (Chin, J. y col. 2003. Biologicals 31, 45-53). De manera interesante, se observó un efecto sinérgico cuando se mezclaban dos anticuerpos monoclonales. Por tanto, un anticuerpo anti-toxoide tetánico policlonal recombinante que puede reaccionar con o unirse a la toxina tetánica podía potencialmente ser muy eficaz en el tratamiento o la protección profiláctica de pacientes con riesgo de desarrollar el tétanos.

La presente memoria descriptiva describe una inmunoglobulina policlonal recombinante o fragmentos de la misma que puede reaccionar con o unirse a la toxina tetánica.

Una inmunoglobulina policlonal recombinante que puede reaccionar con o unirse a la toxina tetánica puede comprender pares análogos de región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas.

Una inmunoglobulina policlonal recombinante que puede reaccionar con o unirse a la toxina tetánica puede obtenerse mediante el procedimiento descrito en el presente documento.

Una inmunoglobulina policlonal recombinante que puede reaccionar con o unirse a la toxina tetánica puede comprender pares análogos individuales de región variable de cadena ligera y región variable de cadena pesada de inmunoglobulinas con al menos el 90 % de identidad de secuencia con un par de SEC ID individual, seleccionado entre los pares de SEC ID 229:276, 262:309, 240:287, 245:292, 267:314, 246:293, 258:305, 242:289, 231:278, 263:310, 232:279, 237:284, 255:302, 260:307, 251:298, 233:280, 228:275, 244:291, 250:297, 252:299, 264:311, 272:319, 235:282 ó 238:285.

Una composición farmacéutica puede comprender un anticuerpo policlonal recombinante que puede reaccionar con o unirse a la toxina tetánica como principio activo concebido para el tratamiento o la prevención de un tétanos. Preferentemente, el anticuerpo policlonal recombinante se combina con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Una inmunoglobulina policlonal recombinante que puede reaccionar con o unirse a la toxina tetánica puede usarse como medicamento para el tratamiento o la protección profiláctica de un paciente con riesgo de desarrollar el tétanos.

Una composición que comprende un anticuerpo policlonal recombinante que puede reaccionar con o unirse a la toxina tetánica puede adiministrarse a un paciente con necesidad de ello para prevenir o tratar a un paciente con riesgo de desarrollar el tétanos.

En el siguiente ejemplo se compararan los resultados obtenidos a partir del donante TT08 con los resultados obtenidos a partir del donante TT03 en el ejemplo 11. Los resultados se resumen en la tabla 22.

Tabla 22

Ejemplo 12: Comparación de los resultados obtenidos a partir de dos donantes

TT03: TT08

Células plasmáticas específicas de TT en la fracción de PBMC (ELISPOT): 0,021 % 0,011 %

Células CD19+ en la fracción de PBMC (FACS): 11 % 5 %

Células plasmáticas en la fracción de PBMC (FACS CD38hi, CD45in): 0,12 % 0,08 %

Número estimado de secuencias VH y VL unidas: 400 400

Número de clones explorados para la expresión de Fab: 1400 2000

Número de clones positivos para Fab (2 x fondo): 482 558

Número de clones explorados para la especificidad de TT: 3600 3400

Número de clones específicos de TT (2 x fondo): 339 188

Número de secuencias analizadas a partir de los clones específicos de TT: 47 102

Alelos de la línea germinal de VH: 12 (VH1-5) NA

Alelos de la línea germinal de VL: 8 (VKI, III, IV) NA

Número de pares análogos únicos: 27 40

Intervalo de afinidad aparente: 0,35-3,0 nM NA

NA = no analizado

Esto ilustra claramente que podrían aislarse bibliotecas de calidad similar a partir de dos donantes diferentes inmunizados con TT.

La razón para el número más alto de pares análogos únicos en la biblioteca obtenida a partir del donante 10 TT08 se debe de la manera más probable al mayor número de secuencias analizadas.

Ejemplo 13: Comparación de la biblioteca de pares análogos del ejemplo 11 con una biblioteca de presentación en fago combinatoria generada a partir del mismo donante

En el presente ejemplo se preparó una biblioteca de presentación en fago combinatoria a partir del mismo donante usado previamente para preparar la biblioteca de pares análogos, con el fin de comparar la 15 diversidad de bibliotecas, la afinidad y la especificidad entre bibliotecas de pares análogos y bibliotecas combinatorias.

a. Construcción de bibliotecas de fagos combinatorias

Se generó una biblioteca de presentación en fago a partir de la fracción CD 19+ de células del donante TT03 (idéntica a la fracción celular obtenida en el ejemplo 11c).

Se preparó el ARN total a partir de aproximadamente 5 x 106 células CD19+ usando el kit L de ARN 5 NucleoSpin (Machery-Nagel nº de catálogo 740 962.20). Posteriormente se sintetizó ADNc en una reacción cebada con oligo(dT) usando la transcriptasa inversa de ThermoScript (Invitrogen nº de catálogo 11146-016).

Se amplificaron mediante PCR las cadenas VH y Kappa usando ADN polimerasa de HotMasterTaq (Eppendorf nº de catálogo 0032 002.692) y cebadores esencialmente según se describe por de Haard y col.

(J. Biol. Chem. 274, 18218-18230; 1999), sólo modificados con respecto a las secuencias de reconocimiento 10 de enzima de restricción en el extremo 5’.

Se generó la biblioteca de presentación en fago combinatoria mediante la inserción sucesiva de productos de PCR Kappa y VH en el vector de presentación en fago Em351 (modificado a partir de phh3 descrito en Den,

W. y col. 1999 J. Immunol. Methods 222, 45-57).

Se sometió a electroporación la biblioteca final en una cepa de E.coli de TG1 (Stratagene). El tamaño de la 15 biblioteca combinatoria contenía 3 x 106 clones independientes con una frecuencia de inserción elevada.

b. Cribado de la biblioteca combinatoria

Se prepararon partículas de fago que presentaban Fab según procedimientos convencionales (por ejemplo Antibody Engineering, A Practical Approach 1996, Ed. McCafferty, Hoogenboom y Chiswell).

El cribado se realizó en toxoide tetánico (TT; SSI lote nº 89-2) diluido hasta 1 !g/ml en PBS, y se inmovilizó

20 en tubos de inmunización MaxiSorp (Nunc nº de catálogo 444202). Tras un periodo de incubación de una hora y varias etapas de lavado, se eluyeron las partículas de fago unidas usando TEA 100 mM (trietilamina).

Se neutralizó el eluato de partículas de fago y se usó para infectar exponencialmente las células TG1 crecientes, a partir de las que se obtuvieron partículas de fago que presentaban Fab enriquecidas para la especificidad de TT. Se realizó una segunda ronda de cribado usando los fagos eluidos siguiendo el

25 procedimiento general resumido anteriormente.

Se realizaron en paralelo tres rondas de cribado en el fragmento C de la molécula de toxina tetánica (Sigma nº de catálogo T3694), siguiendo el procedimiento resumido anteriormente.

Se exploraron colonias individuales para unirse al toxoide tetánico y el fragmento C de la biblioteca no seleccionada, y tras cada ronda de cribado, de ambos conjuntos de cribado descritos anteriormente.

30 c. Comparación de la especificidad y la afinidad de clones de partículas de fago combinatorios y clones de pares análogos

Se recogieron colonias individuales de la biblioteca no seleccionada y tras cada ronda de cribado (en el toxoide tetánico (TT) intacto y el fragmento C de toxoide tetánico, respectivamente). Se analizaron las partículas de fago que presentaban Fab para determinar la reactividad mediante ensayos ELISA. El número

35 de clones positivos para Fab que muestran reactividad con TT y/o fragmento C de al menos 2 x la reactividad de fondo y al menos 4 x la reactividad de fondo se facilitan en la tabla 23 a 25 a continuación. Todos los resultados se muestran como el número de clones específicos/número de clones positivos para Fab.

Tabla 23: Clones seleccionados en TT y analizados mediante ELISA específica de TT

Enriquecimiento: 2 x fondo 4 x fondo

Clones no seleccionados: - 13/aprox. 5000

Tras 1 ronda de cribado: 61/99 59/93

Tras 2 rondas de cribado: 165/169 163/166

Tabla 24: Clones seleccionados en TT y analizados mediante ELISA específica de fragmento C

Enriquecimiento: 2 x fondo 4 x fondo

Clones no seleccionados: 0/13 0/13

Tras 1 ronda de cribado: 0/85 0/85

Tras 2 rondas de cribado: 0/85 0/85

Tabla 25: Clones seleccionados en el fragmento C, analizados mediante ELISA específica de fragmento C

Enriquecimiento: 2 x fondo 4 x fondo

Tras 1 ronda de cribado: 1/35 0/35

Tras 2 rondas de cribado: 12/47 9/47

Tras 3 rondas de cribado: 64/126 26/126

5 El cribado de la biblioteca de presentación en fago frente a TT reveló un número creciente de clones específicos de TT cuando aumentaba el número de rondas de cribado y sólo se identificaron unos pocos clones en la biblioteca no seleccionada. Se encontró que ningún clon era reactivo con el fragmento C de toxoide tetánico de la biblioteca no seleccionada o tras dos rondas de cribado de la biblioteca frente a TT. Para obtener fragmentos Fab con especificidad de fragmento C a partir de la biblioteca de presentación en

10 fago combinatoria, tenía que cribarse esta biblioteca frente al fragmento C específicamente.

Para la comparación se sometieron trece clones específicos de TT del ejemplo 11 a ELISA específica de fragmento C, de éstos, siete mostraron reactividad superior a 2 x fondo. Por tanto, los fragmentos Fab con especificidad hacia el fragmento C de toxina tetánica pudieron expresarse a partir de una biblioteca de pares análogos obtenida a partir de un individuo inmunizado con TT.

15 Esto ilustra claramente la desventaja de usar el cribado para identificar clones con especificidad hacia un antígeno particular. Si son desconocidos los epítopos o fragmentos de antígeno, pueden descartarse durante el cribado, dando como resultado de ese modo al final un producto menos eficaz.

Además, se midieron las afinidades aparentes de los clones combinatorios según se describe en el ensayo del ejemplo 11i. Se analizaron diez de los clones combinatorios obtenidos tras dos rondas de cribado en TT,

20 revelando afinidades de unión aparentes entre 1 nM y 15 nM.

Para la comparación cuatro de los nueve clones analizados a partir de la biblioteca de pares análogos (tabla 21) mostraron afinidades en el intervalo de picomolar.

Esto indica que el apareamiento de regiones variables tal como se seleccionaron originalmente mediante el sistema inmunitario de los donantes, en combinación con las hipermutaciones somáticas a las que se han

25 sometido los pares como par, potencialmente da como resultado afinidades de unión aparentes más altas que las combinaciones al azar de tales regiones variables.

d. Comparación de las secuencias de clones de partículas de fago combinatorias específicas de TT y clones de pares análogos

La gran cantidad de datos de secuencias generados a partir de las dos bibliotecas impide las comparaciones

30 directas de las secuencias sin procesar. Con el fin de visualizar la diferencia entre los pares de secuencias de VH y VL en la biblioteca de presentación en fago y en la biblioteca de pares análogos, se generaron árboles filogenéticos para las secuencias de VH y VL, y se ilustraron los pares en una matriz de puntos. El apareamiento de la información filogenética en una matriz de puntos (figura 25) reveló perfiles de distribución muy diferentes de pares de secuencias de VH y VL en las dos bibliotecas. La aparición dispersa de los pares

35 de secuencias de VH y VL en la biblioteca de presentación en fago (figura 25A) indicaba la poca relación filogenética entre los genes de VH y VL de acuerdo con el apareamiento al azar de los genes V en esta biblioteca. Por el contrario, los pares de secuencias de VH y VL de la biblioteca de pares análogos (figura 25B) muestran una aparición en grupos indicando la coevolución de los genes V tal como se esperaba para los pares análogos. Además, la diversidad genética es mucho mayor para los genes V en la biblioteca de pares análogos en comparación con los genes V de la biblioteca combinatoria, indicando que el procedimiento de aislamiento de genes V apareados análogos está menos sesgado.

Ejemplo 14: RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa y PCR anidada usando células T como fuente de molde combinadas

En este ejemplo, se describe cómo puede realizarse una RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa en linfocitos T derivados de un donante humano.

a. Obtención de una fracción celular que contiene linfocitos

Se obtiene una muestra de sangre de donantes humanos que se han sometido al antígeno deseado, por ejemplo mediante inmunización, infección natural, tumor maligno, a través de una reacción autoinmunitaria u otras enfermedades. Se aíslan las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) usando Lymphoprep (Axis-Shield, Oslo Noruega, nº de prod. 1001967) según las instrucciones del fabricante.

En el presente ejemplo se generan células T específicas de antígeno mediante estimulación adicional de la fracción de PBMC. Sin embargo, la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex también puede realizarse directamente en células únicas a partir de la fracción de PBMC o en una fracción celular enriquecida por T células (por ejemplo mediante clasificación FACS para células CD3 positivas).

b. Generación de células T específicas de antígeno

Se resuspende la fracción celular de PBMC en un medio de cultivo apropiado que contiene citocinas relevantes tales como IL2. Además, se añade el antígeno deseado al cultivo, en el que se presentará en los linfocitos T mediante células presentadoras de antígeno (CPA) presentes en la fracción de PBMC. Como alternativa, pueden añadirse a la fracción de PBMC células alimentadoras de CPA tratadas de antemano de modo que están presentando el antígeno deseado. Pueden exponerse mediante CPA tales células alimentadoras de CPA al antígeno deseado en forma de por ejemplo péptido, proteína u otra forma molecular,

o CPA infectada de manera microbiana o células transfectadas para expresar y presentar el antígeno, o CPA cultivadas conjuntamente con otras células antigénicas, por ejemplo tales como células cancerígenas en forma de tejido primario o líneas celulares. A partir de la bibliografía se conocen muchos tipos diferentes de células alimentadoras de CPA, incluyendo líneas de células transformadas, líneas de células B, células dendríticas, etc.

Se cultiva la fracción de PBMC durante aproximadamente de 3 a 5 semanas, durante las que se añaden células presentadoras de antígeno nuevas junto con citocinas, por ejemplo semanalmente. Esto da como resultado la proliferación, activación y maduración de linfocitos T. Al final del periodo de cultivo, el cultivo celular estará dominado por las células T específicas de antígeno. Si estas células son CD4+ o CD8+ depende de la enfermedad, el antígeno, las células CPA y las mezclas de citocinas usadas durante el periodo de estimulación.

Puede someterse a prueba la especificidad de antígeno, por ejemplo, con un ensayo de CCF, ensayos de proliferación y tetrámeros de MHC cargados con el antígeno deseado (Altman, J.D., y col. 1996. Science 274, 94-96).

Se distribuyen las células T específicas de antígeno en tubos de PCR, limitando la dilución o bien usando un FACS con el fin de obtener una única célula por recipiente. Puede almacenarse el recipiente a -80 ºC hasta su uso.

b. RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex de una única etapa

Se usa el kit para RT-PCR de una única etapa de Qiagen (Qiagen nº de catálogo 210212, Hilden, Alemania) para la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex esencialmente según la recomendación del fabricante. Antes de la adición de la mezcla de reacción de PCR a los tubos de PCR, se descongelan las células.

Inicialmente se fijan las mezclas de reacción de PCR y las condiciones de ciclado según se describe en el ejemplo 11e-1. Sin embargo, puede esperarse una cierta cantidad de optimización para un nuevo conjunto de cebadores.

La mezcla de cebadores de extensión por solapamiento múltiplex usada comprende los cebadores mostrado en la tabla 26.

Tabla 26

322: tattggcgcgccatggccGCCCAGTCTGTGACCCAGC

323: tattggcgcgccatggccGCCCAGAAGATAACTCAA

324: tattggcgcgccatggccGATGCTAAGACCACCCAG

325: tattggcgcgccatggccGCCCAGACAGTCACTCAG

326: tattggcgcgccatggccAAACAGGAGGTGACACAGA

327: tattggcgcgccatggccGGAGACTCGGTTACCCAGA

328: tattggcgcgccatggccGGAGATTCAGTGACCCAGA

329: tattggcgcgccatggccAGCAATTCAGTCAAGCAGA

330: tattggcgcgccatggccGGACAAAACATTGACCAG

331: tattggcgcgccatggccAAAAATGAAGTGGAGCAGA

332: tattggcgcgccatggccGAAGACCAGGTGACGCAGA

333: tattggcgcgccatggccGGAATACAAGTGGAGCAGA

10 nM: 334 tattggcgcgccatggccCTACATACACTGGAGCAGA

de: 335 tattggcgcgccatggccGAAGACAAGGTGGTACAAA

Va: cada 336 tattggcgcgccatggccGAAAACCAGGTGGAGCACA

uno: 337 tattggcgcgccatggccCAGGAGAATGTGGAGCAG

338: tattggcgcgccatggccGGAGAGAGTGTGGGGCTG

339: tattggcgcgccatggccGGAGAGGATGTGGAGCAGA

340: tattggcgcgccatggccAGCCAAAAGATAGAACAGA

341: tattggcgcgccatggccAGTCAACAGGGAGAAGAG

342: tattggcgcgccatggccCAACAACCAGTGCAGAGT

343: tattggcgcgccatggccAGCCAAGAACTGGAGCAGA

344: tattggcgcgccatggccGGTCAACAGCTGAATCAGA

345: tattggcgcgccatggccACCCAGCTGCTGGAGCAGA

346: tattggcgcgccatggccCAGCAGCAGGTGAAACAA

347: tattggcgcgccatggccATACTGAACGTGGAACAA

348: tattggcgcgccatggccGACCAGCAAGTTAAGCAA

349: tattggcgcgccatggccGGACAACAGGTAATGCAA

350: tattggcgcgccatggccAAGGACCAAGTGTTTCAG

Ca: 200 nM 351 TAGGCAGACAGACTTGTCACT

352: gccatggcgcgccaatagctagccGGTGAAGAAGTCGCCCAGA

353: gccatggcgcgccaatagctagccGATGCCATGGTCATCCAGA

354: gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCCCAAGTGACCCAGA

355: gccatggcgcgccaatagctagccCATGCCAAAGTCACACAGA

356: gccatggcgcgccaatagctagccGACACAGCCGTTTCCCAGA

357: gccatggcgcgccaatagctagccGAAACGGGAGTTACGCAGA

358: gccatggcgcgccaatagctagccGAACCTGAAGTCACCCAGA

359: gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGACATCTACCAGA

360: gccatggcgcgccaatagctagccATATCTGGAGTCTCCCACA

en nM: 361 gccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGGAATCACCCAGA

de: 362 gccatggcgcgccaatagctagccAATGCTGGTGTCACTCAGA

V1: cada 363 gccatggcgcgccaatagctagccAGTGCTGTCGTCTCTCAA

uno: 364 gccatggcgcgccaatagctagccGACGCTGGAGTCACACAA

365: gccatggcgcgccaatagctagccGATGGTGGAATCACTCAGT

366: gccatggcgcgccaatagctagccACTGCTGGGATCACCCAG

367: gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGGAGTfGCCCAGT

368: gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGGAGTGGTTCAGT

369: gccatggcgcgccaatagctagccGAAGCTGGAGTTACTCAGT

370: gccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGTAGTTACACAA

371: gccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGGAGTTATCCAGT

372: gccatggcgcgccaatagctagccGGTGCTGGAGTCTCCCAG

373: gccatggcgcgccaatagctagccGATGCTGATGTTACCCAGA

374: gccatggcgcgccaatagctagccTCTCAGACTATTCATCAAT

C1: 200 nM 375 CAGGCACACCAGTGTGGCCTT

c. PCR semianidada

Asimismo que propone realizar la PCR semianidada según se describe en el ejemplo 11 e-2, y puede esperarse alguna optimización.

Los cebadores usados se muestran en la tabla 27.

Tabla 27

Nombre de cebador: Conc. SEC ID Nº Secuencia del cebador en la dirección 5’ a 3’

Ca: 200 nM 376 caccttagagctcTTAGAGTCTCTCAGCTGGTACAC

C1: 200 nM 377 gacattatgCAtGATCTCTGCTTCTGATGGCTC

Las secuencias en mayúsculas corresponden a la región específica de gen

Con el fin de verificar que la RT-PCR de extensión por solapamiento múltiplex es satisfactoria se analiza una proporción de las muestras de las reacciones de PCR semianidada sometiendo 10 !l de cada reacción de

5 PCR semianidada a electroforesis en gel de agarosa al 1 % usando bromuro de etidio para la detección. El tamaño esperado del fragmento de extensión por solapamiento es aproximadamente de 850 pb (el tamaño exacto depende de las longitudes de las regiones variables).

Se consolidan en un único tubo aproximadamente diez microlitros de todas las reacciones realizadas que se originan a partir del mismo donante. Posteriormente se purifica una alícuota de los productos de PCR

10 combinados usando el kit de purificación de PCR QIAquick según el procedimiento del fabricante (Qiagen nº de catálogo. 28106, Hilden, Alemania). La combinación purificada de productos de PCR por solapamiento puede digerirse con enzimas de restricción apropiadas y posteriormente purificarse e insertarse en un vector adecuado.

En el presente experimento, se diseñan cebadores de región constante (SEC ID Nº 376 y 377) usados en la

15 PCR semianidada para la subclonación del producto de PCR semianidada en un vector adecuado. El diseño del cebador C1 se basa en cambiar una SER por Met en la posición 21 en el péptido de región constante de cadena 1, mediante lo cual puede introducirse un sitio NsiI en la secuencia de ácido nucleico:

20 Esta transición debe ser relativamente segura puesto que SER 21 se expone en la región constante de cadena 1 en una estructura de bucle en el extremo proximal de la membrana del dominio. Por tanto no es probable que este cambio conservativo relativo perturbe la estructura de dominio global.

El diseño del cebador Ca se basa en cambiar nucleótidos correspondientes a las posiciones 15-17 en el péptido de región constante de cadena a, mediante lo cual puede introducirse un sitio SacI en la secuencia

25 de ácido nucleico:

Los vectores adecuados contendrán por tanto las partes restantes de las regiones constantes de las cadenas a y 1 de los RcT y contendrán la modificación apropiada en cuanto a sitios de restricción. Estos cambios

pueden realizarse usando PCR y técnicas de subclonación convencionales.

e. Consideraciones adicionales

La gran cantidad de cebadores de región variable puede interaccionar potencialmente de una manera inhibidora durante la amplificación mediante PCR de extensión por solapamiento múltiplex. Para evitar esto pueden dividirse los cebadores de región variable en dos subconjuntos y usarse por separado en combinaciones apropiadas.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Symphogen A/S

<120> PROCEDIMIENTO PARA UNIR SECUENCIAS DE INTERÉS

<130> 15881PCT00

<160> 377

<170> Patent In versión 3.3

<210> 1

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de cebador

<400> 1

<210> 2

<211> 45

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

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<213>: Homo Sapiens 15

15 10

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<212> ADN

<213> Homo Sapiens

<400> 162

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<211> 378

<212> ADN

<213> Homo Sapiens

10 <400> 163

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<212> ADN

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<220>

<221> MISC_FEATURE 10 <222> (6)..(6)

<223> Xaa corresponde a un codón de terminación

<400> 243

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<212> PRT

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<210> 252

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<212> PRT

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<400> 252

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>: 10 <221> MISC_FEATURE

<222> (4)..(4)

<223> Xaa corresponde a un codón de terminación

<400> 253

<210> 254

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<212> PRT

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>: 10 <221> MISC_FEATURE

<222> (4) .. (4)

<223> Xaa corresponde a un codón de terminación

<400> 256

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<211> 126

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<212> PRT

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<210> 273

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<213> Homo Sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE 10 <222> (52) .. (52)

<223> Xaa corresponde a un codón de terminación

<400> 273

<210> 274

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<212> PRT

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<400> 274

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<212> PRT

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<400> 280

<212> PRT

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<400> 281

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<212> PRT

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<400> 282

<210> 283

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<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 283

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<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 284

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<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 285

<210> 286

<211> 110 5 <212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE 10 <222> (93) .. (93)

<223> Xaa corresponde a un codón de terminación

<400> 286

<210> 287

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 287

<210> 288

<211> 110 5 <212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220>

<221> MISC_FEATURE 10 <222> (45)..(45)

<223> Xaa corresponde a un codón de terminación

<400> 288

<210> 289

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 289

<210> 290

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<212> PRT

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<400> 290

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<212> PRT

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<400> 291

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<212> PRT

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<400> 292

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<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 293

<210> 294

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 294

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<220> 10 <221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa corresponde a un codón de terminación

<400> 295

<210> 296

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 296

<210> 297

<211> 110

<212> PRT

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<400> 297

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<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 298

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<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 299

<210> 300

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 300

<210> 301

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 301

<210> 302

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 302

<210> 303

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 303

<210> 304

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 304

<210> 305

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 305

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<211> 110

<212> PRT

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<400> 308

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<212> PRT

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<400> 309

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<400> 310

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<212> PRT

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<400> 311

<210> 312

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<212> PRT

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<400> 312

<210> 313

<211> 115

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 313

<210> 314

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 314

<210> 315

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 315

<210> 316

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 316

<210> 317

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 317

<210> 318

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 318

<210> 319

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 319

<210> 320

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo Sapiens

<400> 320

<210> 321

<211> 402 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Secuencia de vector 10

<400> 321

<210>: 322 15 <211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 322

<210> 323

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 324

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 325

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 326

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 327

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 328

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 329

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 330

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 330

<210> 331

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 332

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 333

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 334

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 335

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 336

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 337

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 337

<210> 338

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 339

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 340

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 341

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 342

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 343

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 344

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 345

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 346

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 347

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 347

<210> 348

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 348

<210> 349

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 350

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 351

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 352

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 352

<210> 353

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 354

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 354

<210> 355

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 356

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 357

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 358

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 359

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 360

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 361

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 362

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 362

<210> 363

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 363

<210> 364

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 365

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 366

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 367

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 367

<210> 368

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 368

<210> 369

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 370

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 371

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 372

<211> 42

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 373

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 373

<210> 374

<211> 43

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 375

<211> 21

<212> ADN

<213> Artificial

<210> 376

<211> 36

<212> ADN

<213> Artificial

<400> 376

<210>: 377 15 <211> 33

<212> ADN

<213> Artificial

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Una biblioteca de pares análogos que comprende secuencias de ácido nucleico unidas que codifican la región variable, en la que cada par análogo es un par original de secuencias de ácido nucleico no contiguas amplificadas a partir de un único linfocito, estando presente la biblioteca en una pluralidad de recipientes en la que cada recipiente contiene un único par análogo.
2.

La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 10 pares análogos diferentes.
3.

La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 20 pares análogos diferentes.
4.

La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 50 pares análogos diferentes.
5.

La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 100 pares análogos diferentes.
6.

La biblioteca de la reivindicación 1, comprendiendo la biblioteca al menos 1000 pares análogos diferentes.
7.

La biblioteca de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que los pares análogos comprenden una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina unida a una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera.
8.

La biblioteca según la reivindicación 7, en la que los pares análogos comprenden una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina unida a una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera, y dichas secuencias se insertan en marco dentro de un vector que contiene secuencias que codifican al menos un dominio constante de inmunoglobulina o un fragmento del mismo.
9.

La biblioteca según una de las reivindicaciones anteriores, en la que el vector es un vector de expresión de mamífero.
10.

La biblioteca según la reivindicación 9, en la que el vector de expresión de mamífero codifica al menos un dominio de región constante seleccionado de las clases de inmunoglobulina humana IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, cadena ligera kappa y cadena ligera lambda, o de las cadenas alfa, beta, delta, gamma del receptor de células T humano.
11.

La biblioteca según la reivindicación 10, en la que dicho vector de expresión de mamífero que comprende los pares análogos individuales codifica un anticuerpo de longitud completa seleccionado de las clases de inmunoglobulina humana IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgM.
12.

La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, siendo dicha biblioteca una subbiblioteca que comprende un subconjunto de pares análogos específicos de diana de secuencias unidas de región variable que codifican proteínas de unión con una especificidad de diana deseada.
13.

La subbiblioteca según la reivindicación 12, en la que los pares análogos de dicha subbiblioteca comprenden una secuencia que codifica la región variable de la cadena pesada de inmunoglobulina unida a una secuencia que codifica la región variable de la cadena ligera de inmunoglobulina.
14.

La subbiblioteca según la reivindicación 13, en la que los pares análogos de dicha subbiblioteca codifican inmunoglobulinas de longitud completa seleccionadas de las clases de inmunoglobulina humana IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 y IgM.
15.

La biblioteca según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la pluralidad de recipientes son placas con varios pocillos.
16.

La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dichos pares análogos de secuencias que codifican la región variable se obtienen mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:

a) proporcionar una fracción celular que contiene linfocitos de un donante;

b) obtener una población de células únicas aisladas distribuyendo las células de dicha fracción celular individualmente en una pluralidad de recipientes, y

c) amplificar y efectuar la unión de las secuencias que codifican la región variable contenidas en dicha población de células únicas aisladas

i) amplificando en un procedimiento de amplificación molecular multiplex secuencias de nucleótidos de interés usando un molde derivad de una célula única aislada; y

ii) efectuando la unión de las secuencias de nucleótidos de interés amplificadas.
17. La biblioteca de la reivindicación 16, en la que el procedimiento comprende enriquecer la fracción celular 5 que contiene linfocitos obtenida en la etapa (a) para una población de linfocitos particular.
18.

La biblioteca de la reivindicación 17, en la que la fracción celular que contiene linfocitos está enriquecida por células del linaje de linfocitos B.
19.

La biblioteca de la reivindicación 17 ó 18, en la que la fracción celular que contiene linfocitos o el linaje de linfocitos B están enriquecidos por células plasmáticas.

10 20. La biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, en la que las células de la fracción celular que contiene linfocitos, el linaje de linfocitos B o las células plasmáticas están enriquecidas por especifidad de antígeno.
21. Una población de células huésped que comprende una biblioteca según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

15 22. La población de células huésped según la reivindicación 21, en la que las células son células de mamífero.