CN1437482A - 用于治疗变态反应的重组的或纯化的多克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于治疗变态反应的药物组合物。该组合物含有能够与变应原发生反应或进行结合的重组多克隆抗体或由不同单克隆抗体组成的混合物作为活性成分以及一种或多种药用赋形剂。该组合物可以以溶液、分散体、粉剂或微球体的形式进行局部使用。所述多克隆抗体优选地是通过噬菌体展示技术制备的重组多克隆抗体。从原始多克隆免疫应答反应保留下来的或通过利用待研究的变应原的淘选技术筛选的特异性免疫球蛋白可变区轻链与重链的配对优选地通过将所述配对整体转移到一个表达载体中来保持。所述变应原可以是来自以下物质的变应原：屋尘螨，例如Dermatophagoides farinae或屋尘螨；猫、狗或马的皮屑；树花粉，例如桦树白桦树、桤木、榛树、橡树、柳树、悬铃木、山毛榉、榆树、枫木、岑树和鹅耳枥的花粉；草花粉，例如梯牧草梯牧草、六月禾早熟禾、黑麦草黑麦草、果园草鸭茅、豚草豕草、甜春草黄花茅和黑麦黑麦的花粉；或真菌(例如链格孢属、曲霉属、枝孢属和青霉属)。

Description

用于治疗变态反应的重组的 或纯化的多克隆抗体
发明领域
本发明涉及一种含有能够与变应原发生反应或进行结合的重组多克隆抗体或由不同单克隆抗体组成的混合物或分离的或纯化的多克隆抗体的组合物，以及能够与变应原发生反应或进行结合的多克隆抗体用于治疗变态反应的用途。
背景技术
已知体液免疫的保护作用是由被称作抗体的一族结构相关的糖蛋白介导的。抗体通过与抗原结合来启动它们的生物学活性。与抗原结合的抗体通常针对一种抗原具有特异性而且所述的结合通常具有高亲和力。抗体由B淋巴细胞产生。血液含有多种不同的抗体，每种抗体来源于B-细胞的克隆并且每种抗体针对抗原具有不同的结构和特异性。抗体存在于血浆、组织间液和分泌液如唾液和粘膜表面上的粘液中的B-淋巴细胞的表面。
所有抗体的整体结构相似，导致在生理化学特性如电荷和溶解性方面的某些相似性。所有抗体具有一个由两条相同轻链和两条相同重链组成的共同核心结构，每条轻链约为24千道尔顿，每条重链约为55-70千道尔顿。一条轻链与每条重链相连，并且两条重链彼此相连。轻链和重链均含有一系列重复同源单元，每个单元的长度大约为110氨基酸残基并且各自独立地折叠成一个共同的球形基元，该基元被称作免疫球蛋白(Ig)结构域。通过两条重链结合形成的抗体分子区域是疏水性的。已知当抗体处于不利的物理或化学条件时，抗体在轻链与重链连接的位点处发生裂解。由于抗体含有多个半胱氨酸残基，所以它们具有多个半胱氨酸-半胱氨酸二硫键。所有Ig结构域都含有两层β-折叠，具有三条或四条反向平行的多肽链。
尽管抗体在总体上相似，但是根据生理化学特性如大小、电荷和溶解性以及与抗原结合的行为，可以将抗体分子分成不同的类别和亚类。对于人类来说，抗体分子的类是：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM。每一类的成员被认为是相同的同种型。IgA和IgG同种型被进一步分为亚型，这些亚型被称作IgA1，IgA2和IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。同种型中的所有抗体分子的重链都具有广泛区域的氨基酸序列同一性，但是与属于其它同种型或亚型的抗体有差别。重链用对应于抗体分子整体同种型的希腊字母来表示，例如，IgA含有α，IgD含有δ，IgE含有ε，IgG含有γ，以及IgM含有μ重链。IgG，IgE和IgD环成单体。通过上皮分泌到体腔粘膜内层的IgA分子是同型二聚体而IgM分子是五聚体。环化的IgA主要以单体的形式存在。多聚体形式的IgA和IgM都通过所谓的J链来稳定。分泌性IgA(S-IgA)由定居在固有层中的B细胞产生并通过多-免疫球蛋白受体(pIgR)被基底外侧的上皮细胞所摄取，通过上皮细胞进行运输并被分泌到腔壁的粘膜中。当IgA：J链：pIgR复合体被释放时，pIgR被蛋白酶裂解并且被称作分泌组分(SC)的pIgR分子的一部分仍然与IgA：J链复合体保持结合。因此，S-IgA是由IgA、J链和SC组成的复合体，其中J链和SC与IgA分子通过二硫键共价结合。S-IgA对上皮粘膜如呼吸道或胃肠道中的上皮粘膜的蛋白水解环境具有很强的抗性，因而构成这些部位中的主要特异性免疫系统。已经表明S-IgA具有免疫调节作用并且可以诱导产生针对它们所结合抗原的耐受性。
在每一个体当中存在着108至1010个结构不同的抗体分子，每个抗体分子在它们的抗原结合位点具有独特的氨基酸序列。抗体序列多样性主要被发现存在于称作可变区(V)的重链和轻链的氨基末端区域内的三段短序列中，区别于更加保守的恒定区(C)。
免疫球蛋白E(IgE)引起所谓的1型超敏反应，它本身为常见疾病如过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、枯草热、过敏性(外因性)哮喘、蜂毒过敏以及食物过敏。在患有由IgE介导的变态反应的患者体内过量产生变应原-特异性IgE。IgE在血液中循环并与血液、各种组织或粘膜表面上的嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的针对IgE的高-亲和力Fc受体结合。在大多数变态反应中，变应原通过吸入、摄入或皮肤进入患者体内。所述变应原分子与预先形成的已经结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的高亲和力受体FcεR1的IgE相结合，结果导致几个IgE分子间发生交联并引发组胺和其它引起各种过敏症状的炎症介质的释放。
对IgE-介导的局部变态反应最敏感的组织有结膜、鼻腔或口咽粘膜(过敏性鼻炎)、支气管的粘膜内衬和胃肠道粘膜。因此，变应原通过呼吸进入呼吸道并且在鼻内衬或呼吸道支气管的粘膜表面上被捕获。空气传播的变应原也与眼睛和耳朵的湿润表面相接触并保留在粘膜上。所述粘膜组织聚集了大量的肥大细胞，因此到达这些部位的变应原可以结合IgE并激活肥大细胞。
对付变态反应的治疗原则和治疗方式在最近几年中没有发生实质性的变化。用于抑制免疫活性的免疫抑制药物如类固醇以及用于缓解哮喘症状的支气管扩张剂长期以来是对患有过敏性哮喘病人的主要治疗方式。脱敏免疫疗法是对病情严重患者最重要的新疗法，但是医学的发展已经局限于变应原物质的精确分类，诊断方法的改进以及提供控制得更好和更宽谱的变应原提取物用于免疫治疗。对于研究，在鉴定和分离变应原物质的主要变应原成分方面取得了进展。例如，豚草、屋尘螨以及猫和狗的皮屑和唾沫中的主要变应原成分已经得到鉴定。当变应原颗粒，例如梯牧草花粉到达气道粘膜时，这些颗粒就分解成主要和次要的变应原成分。
抗体已被建议用于一些临床治疗：医学免疫公司(MedImmuneInc.)正在研究抗呼吸道合胞病毒(RSV)的人源化单克隆抗体的用途并且上市了一种多克隆抗RSV人免疫球蛋白产品(RespiGam)，其分离自人供体血液并且被用于治疗RSV感染。MedImmune还上市了CytoGam，一种用于治疗CMV感染的抗CMV(巨细胞病毒)人免疫球蛋白。IDEC和Genentech正联合进行用于治疗复发性和顽固性低分级非霍奇金淋巴瘤的小鼠-人嵌合单克隆抗体(Rituxi-mab)的临床试验，其中所述抗体针对在成熟B细胞和大多数非霍奇金淋巴瘤上发现的CD20抗原。GalaGen正在研究牛多克隆免疫球蛋白(Diffistat-G)用于治疗艰难梭菌抗菌素相关性腹泻的用途。SmithKline Beecham和Schering-Plough正在开发在临床试验中已经显示出预防嗜酸性炎症和气道狭窄的抗-IL-5单克隆抗体。一种抗-IgE单克隆抗体正在被Genentech研制用来“关闭(switch-off)”变态反应。所述抗体Rhu-Mab-E25已显示在首次注射用药后降低游离IgE水平，该抗体是一种人源化的嵌合IgG1单克隆抗体，对人高度亲和性IgE受体(FcεRI)上的一种独特表位具有特异性。多次注射后，该抗体能够减弱针对吸入变应原的早期和晚期应答。治疗使用的抗体实例还包括一种抗RSV的鼻内使用的雾化IgG(Sandoz)；HNK20(Oravax)，一种抗-RSV IgA；和4B9(Bristol Myers-Squibb)，一种抗-B群链球菌IgM单克隆抗体。其它治疗用单克隆抗体包括单克隆的抗-CD4抗体、抗-IL-2抗体和抗-IL-4抗体。
利用小颗粒的IgG气雾剂进行RSV感染免疫治疗已被Piazza等公开(传染病杂志(J.Infect，Dis.)，166卷，1422-1424页，1992)。该项研究表明与雾化的5％ IgG溶液接触15分钟结果使肺中病毒减少了50倍。Brown(Aerosol Science and Technology，24卷，45-56页，1996)公开了抗体作为抑制呼吸道炎症疾病或变应原诱导的哮喘反应的细胞因子抑制剂或拮抗剂的用途。还提到了用于治疗急性病毒或细菌呼吸道感染的病原体-特异性抗体的局部呼吸道送递。
抗体脂质体，即免疫脂质体，已经被Maruyama等公开(Biochim.Biophys.Acta，1234卷，74-80页，1995)。用抗体包被脂质体能够增强网状内皮系统对脂质体的摄取。已知人单克隆抗体可用作抗肿瘤剂。一种对肿瘤细胞表面上发现的Lewis Y抗原特异性的小鼠/人单克隆抗体IgG抗体已被Paborji等公开(药物研究(Pharmaceutical Research)，11卷，5期，764-771页，1994)。抗体在用于抗呼吸道感染被动抗体气雾剂疗法的计量推进剂驱动气雾剂中的用途已由Brown等提出(免疫学方法杂志(Journal ofImmunological Methods)，176卷，203-212页，1994)。呼吸道中的免疫应答反应对防止呼吸系统感染以及对它们参与呼吸道变态反应和哮喘十分重要。包括单克隆抗体在内的免疫调节剂对呼吸道的有效靶向作用被显示有益于增强针对呼吸道病原体的局部免疫或减轻免疫介导的呼吸道病变。吸入的免疫缀合物、免疫脂质体或免疫微球体已被用作肺中癌细胞的杀伤剂(免疫缀合物)，或者对于免疫脂质体和微球体，被用作各种治疗剂的隐秘(stealth)传递颗粒。一种IgM抗-B群链球菌单克隆抗体已被Gombotz等公开(药物研究(Pharmaceutical Research)，11卷，624-632页，1994)。
US 5,670,626提出了单克隆抗体用于治疗由IgE介导的变态反应性疾病如过敏性鼻炎、过敏性哮喘和过敏性结膜炎的用途，所述治疗通过采用单克隆抗体来抑制变应原分子进入粘膜组织。据推测，抗体结合变应原分子抑制所述变应原被粘膜上皮细胞所摄取。
在某些临床情形中，单克隆抗体的使用伴有特定的缺陷。单克隆抗体针对单一抗原表位。因此，如果所述靶具有呈现多个不同表位的复杂性质，那么所述单克隆抗体的功能性亲和力可能很低或者低于临界阈值从而使得所述靶逃避了通过免疫识别进行的清除。
而且，由于单克隆抗体针对单一的抗原决定簇，所以在例如变应原上的抗体靶向物密度可能不足以高到介导清除变应原。补体的有效激活同样需要很高的靶抗体密度，利用单一特异性单克隆抗体可能达不到所述的靶抗体密度。
因此，对于变应原来说，单克隆由于针对单一表位，所以是次最适的。大多数的变应原是复合蛋白，由多个蛋白和肽表位组成并且存在许多变异体。因此，预计单一单克隆抗体制剂不能完全覆盖变应原上的多数可能性表位，所述变应原是例如一种花粉颗粒或猫皮屑中的蛋白。这意味着如果一种抗体的理想临床效果能够表征为完全阻断有效抗体表位，那么单一单克隆抗体是不够充分的。而且，如果一种抗体制剂优选应研制成针对几种来源于紧密相关的变应原的同源变应原，例如花粉，或者针对几种来源于一种变应原如动物皮屑的蛋白，那么单一单克隆抗体将不能满足所需的效力。
然而，由Schwarze及其同事一起发表的论文(Am.J.Resp.Crit.Care Med.，158卷，519-525页，1998)研究了针对主要豚草变应原Amb a I的单克隆抗体在一种小鼠变态反应模型中的疗效，所述模型基于用Amb a I和豚草完全提取物致敏和攻击的小鼠(Balb/c)。结果表明接触变应原前施用单克隆IgA抗体降低了气道对醋甲胆碱攻击的反应性，并且降低了肺嗜酸性粒细胞的数目和血清中Amb a I-特异性IgE水平。而且，所述研究表明施用IgA具有一种免疫调节作用，这意味着IgA治疗对变态反应可能具有长期的脱敏效果。然而，必须强调该变应原模型是基于利用单一变应原Amb a I来诱导变态反应样症状。因此，该研究没有考虑到大部分变态反应是由针对多种来源于单一变应原颗粒的变应原蛋白和表位的反应引起的，其强调了在该治疗方案中需要多克隆抗体混合物。而且，人的变态反应比在近交小鼠品系中诱导的变态反应样症状复杂得多(吸入毒理学(Inhal Toxico)，12卷，829-622页，2000)。因此，单克隆抗体作为变应原阻断剂的潜在用途是有限的。最后，单克隆抗体可以对宿主细胞组织的抗原性结构显示交叉反应性，结果产生潜在的不希望有的副作用。当这种情况发生时，该交叉反应性不能通过吸附来消除。因此，可能需要制备多种不同的单克隆抗体从而产生所需要的抗原特异性和靶选择性的结合，即使如此，在部分患者中仍然明显存在针对内源性自身-抗原发生交叉反应的风险。
另一个问题是产生人抗-小鼠的抗体应答(HAMA)。常规的小鼠单克隆抗体对于人接受者是外源蛋白，因此在接受者体内经常引发HAMA免疫应答，该免疫应答除了降低疗效外还产生不希望的副作用。为了解决这个问题，已经研制出具有人恒定区(C)和小鼠可变区(V)的嵌合单克隆抗体。而且，已经研制出人源化的单克隆抗体和由人免疫球蛋白基因的转基因小鼠产生的所谓完全人单克隆抗体来避免这些问题的出现，其中所述人源化单克隆抗体中只有高变互补决定区(CDR)来源于小鼠单克隆抗体。然而，当注射大量带有相同V-区的单克隆抗体时，仍然存在着产生特异于V-区特异性决定CDR的抗-独特型抗体应答反应的可能性。
出于上述这些原因，可经常优选使用多克隆抗体。
在W098/10776中的理论是磷脂酶A2(PLA2)作为一种促进慢性炎症的炎症介导物涉及多种疾病的发病机理。因此，建议利用与至少一种磷脂酶A2发生反应的血清来治疗哺乳动物的肿瘤。没有提示通过对与变应原结合的抗体进行局部用药来利用多克隆抗体阻断变应原的摄取。
US4,740,371记载了一种变应原免疫疗法的改进方法，该方法将变应原及其抗体的免疫复合体用于脱敏治疗，所述抗体以相对所述变应原摩尔数过量而存在以避免发生变态反应。该治疗方法中包括抗体的目的在于降低脱敏治疗过程中产生变应性副作用如过敏性休克的风险。被加到所述变应原中的抗体的比例主要由抗体的中和能力来确定。必须使用足够的抗体以使施用所述组合物时，基本上不产生由变应原诱导的变应性效应。向变应原组合物中添加抗体只是避免接触变应原后所产生的副作用的补救，所述治疗方法仍然是一种变应原免疫疗法。
利用传统的多克隆抗体治疗变态反应存在几个缺点。首先，从人超免疫血清中纯化的IgG形式的多克隆抗体供应有限并且其量不足以用于治疗变态反应疾病和其它常见病症。而且，γ-球蛋白制剂造价昂贵，并且由于它们含有超过多数的非特异性人血清免疫球蛋白反应性的混合性质而导致效率非常低。还存在一种传播污染物的实际危险，所述污染物包括传染性微生物(肝炎病毒、HIV、朊病毒等)或促细胞分裂原、细胞因子和毒素。最后，制剂间的差异仍然是一个主要问题。为了解决供给问题，已经测试了包括被免疫的非人动物血清在内的多克隆抗体的异种来源。然而，这种组合物可能导致产生很强的抗-异种抗体反应，并且带有产生严重副作用如过敏性休克或血清病以及传播他养传染病的实际危险。
US 5,789,208记载了用于疫苗治疗和预防的重组多克隆抗体用来治疗和预防肿瘤疾病的用途。所述抗体被用来增强患者的免疫系统以便能够在以后识别与抗体结合的抗原从而启动清除反应。必须反复进行所述的疫苗接种才是有效的。没有提到在变态反应治疗过程中利用与变应原发生反应或进行结合的多克隆抗体，其中在患者接触一种变应原前、过程中或稍后应当完全不同地施用多克隆抗体。
发明概述
因此，本发明涉及一种含有能够与变应原发生反应或进行结合的重组多克隆抗体或由不同单克隆抗体组成的混合物或被分离或纯化的多克隆抗体作为活性成分以及一种或多种药用赋形剂的药物组合物。
在多数技术方案中，本发明的药物组合物不含与重组多克隆抗体或由不同单克隆抗体组成的混合物或被分离或纯化的多克隆抗体结合或反应的变应原。然而，在特殊情况下，在诱导患者体内产生对变应原耐受性的所谓特异性变应原免疫治疗过程中，为了能够产生或提高耐受诱导过程的效力，可以与变应原制剂联合来对患者施用变应原-特异性的多克隆抗体。
另一方面，本发明涉及具有所需特异性的多克隆抗体用于制备预防或治疗变态反应或变态反应疾病如过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、枯草热、哮喘等的药物组合物的用途。
另一方面，本发明涉及一种预防或治疗变态反应的方法，该方法包括给需要治疗的患者施用足量的能够与变应原发生反应或进行结合的多克隆抗体，其中患者对所述变应原显示出变态反应。
由于在多克隆抗体中存在抵抗待研究的变应原靶的多重反应性，所以使用多克隆抗体与使用单克隆抗体相比具有潜在的临床优势。有可能产生一种针对复合变应原靶上所有表位具有反应性的多克隆抗体。由于所述组合物的多克隆性质，即含有多个表位特异性，所以当使用多克隆抗体时，在复合变应原抗原上达到的功能性抗体密度明显高于使用单克隆抗体时的密度。结果能更有效地封闭或清除靶变应原。而且，由于与相关变应原之间部分共有的几个表位的宽反应性，所述组合物的多克隆性质能够识别和封闭相关同源变应原同种型上的表位，这是单克隆抗体所不能的。
而且，可以预计利用IgA或IgG同种型的变应原-特异性多克隆抗体进行的治疗通过诱导产生针对变应原的耐受性而具有一种免疫调节作用，因而在治愈变态反应或降低对进一步治疗的需要方面具有一种长期的效果。因此，本发明另一方面涉及本发明的药物组合物用于预防性治疗诱导针对变应原的耐受性的用途。这甚至可以被用于还没有观察到变态反应，但是通过家族史或基因分析有可能对变应原发生变态反应的患者。
而且，与单克隆抗体相反，多克隆抗体制剂含有特异性的混合，因此任何单一和个体的交叉反应特异性独特型将以很低的浓度被送递，因而显著降低了由交叉反应产生有害副作用的可能性。换句话说，由于不希望的组织交叉反应性产生有害副作用的可能性在多克隆抗体试剂中被稀释降低了。而且，任何不希望的多克隆抗体制剂的交叉反应性可以通过吸附作用来消除。如果单克隆抗体产生不希望的交叉反应，那么这种副作用是存在的单一抗体所固有的，不破坏所述制剂的活性，当然就不能消除这种副作用。
并且，与多克隆抗体在消除发生交叉反应可能性方面的性能相类似，多克隆抗体比单克隆抗体诱导中和抗-独特型免疫应答的可能性也低很多，这是由于所施用的多克隆抗体制剂的每一单一表位-特异性独特型以很低的量或浓度存在，该量或浓度低于产生抗-独特型应答的阈值。
利用从超免疫人(有限的来源，造价昂贵)或正常动物血清中纯化的IgG型的常规多克隆抗体具有的某些缺点(抗-异种抗体应答，过敏性休克)在于利用了来源于转入了人免疫球蛋白基因的转基因动物的血清或其它生物学材料。因此，这种动物可以用变应原免疫，并被用作分离完全人序列的变应原-特异性多克隆抗体产物的来源。
当吞咽粘液分泌物时，鼻内衬上的免疫复合体就被清除掉了。气管和支气管粘膜表面上的免疫复合体被排入口腔内，与唾液混合一起被吞咽并在胃肠道中被消化。为了在从粘膜表面上的粘液中吸附和清除变应原分子和避免任何复合变应原被粘膜上皮细胞摄取方面获得更好的效果，可以将所述免疫原-特异性抗体与聚合物骨架或微珠缀合形成微球体。
因此本发明的药物组合物可以被配制成溶液、分散体、粉剂或微球体形式。发明详述
术语“抗体分子”表示单一抗体蛋白分子或其含有一个或多个可变抗原结合区和恒定区的片段。抗体分子通常是单特异性的，但也可以被描述为独特特异性、异种特异性、多特异性或具有不需要的特异性。除了非免疫化学结合意义之外，抗体分子不能是非特异性的。
抗体分子通过针对抗原上的特异性抗原决定簇或表位的特异结合位点来进行结合。
总之，抗体可以以分子群体的形式存在，其中部分或全部成员能够与特异性抗原决定簇发生反应。
因此，在本文中，术语“抗体”指的是抗体分子的组合物/混合物/群体，如抗体分子被发现作为哺乳动物的抗血清或免疫血清的功能性成分，或如它们被发现存在于具有相似功能性的单克隆抗体或多克隆抗体组合物中，该组合物从人或动物来源制备或是通过包括转基因动物和噬菌体展示在内的重组技术或者通过常规的杂交瘤技术制备。
术语“多克隆抗体”表示与一种以上抗原的致免疫原性决定簇发生反应的不同抗体分子的混合物。
在本文中，术语“多克隆抗体”包括从哺乳动物血液、分泌物或其它液体，或从卵中分离或纯化的多克隆抗体，以及由不同单克隆抗体组成的混合物，最后多克隆抗体可作为重组多克隆抗体制备。
术语“重组多克隆抗体”是指利用重组技术产生的多克隆抗体，而且这种多克隆抗体在下文中被称作联合体(symphobodies)。因此，一种联合体含有高浓度的不同抗体分子，其中所有或多数对由一种以上表位组成的抗原表现出理想的结合活性。
可以通过重组DNA技术，然后在包括酵母、真菌、昆虫、植物或哺乳动物细胞在内的真核细胞中，或原核细胞如细菌中进行表达，或由病毒载体表达，或通过基因疗法或由动物体内的转基因表达来产生联合体。
优选地在所述联合体制剂中至少85％的抗体分子是靶-特异性的，更优选地至少90％是靶-特异性的，甚至更优选地至少95％是靶-特异性的，以及最优选地是所述联合体制剂中的全部抗体分子都是靶-特异性的。
术语“由不同单克隆抗体组成的混合物”是指由两种或多种不同单克隆抗体组成的混合物。本文中的术语“两种或多种”表示从2至100，优选从3至60，更优选从5至40，最优选从10至25种不同的单克隆抗体。
术语“一种分离的或纯化的多克隆抗体”是指从哺乳动物的血液、分泌物或其它液体、或从卵中分离或纯化的多克隆抗体。
应当将“抗体、多克隆抗体、重组抗体、由不同单克隆抗体组成混合物和分离或纯化的多克隆抗体”的表述方式理解为均还包括所述抗体的功能性片段。
目前制备重组多克隆抗体的优选方法是通过制备多克隆抗体文库(PCAL)，如US 5,789,208(属于J.Sharon)中所公开的内容，其以完整形式被引入本文作为参考。
更具体地，被包含在所述药物组合物中的多克隆抗体可以通过利用所选择的变应原免疫动物，优选地是哺乳动物，然后通过从血液、骨髓、淋巴结或脾中分离产生抗体的B-淋巴细胞来制备。或者，可以从动物中分离产生抗体的细胞，然后使该细胞在体外与待产生其抗体的变应原接触。然后对产生抗体的细胞进行培养以获得一群产生抗体的细胞，任选地在融合到无限增殖化细胞系如骨髓瘤后进行培养。
更优选地，为了制备完全人多克隆抗体，可以从变态反应患者的组织中分离作为起始物的B-淋巴细胞。
本发明的组合物还可以通过以下方法来产生：利用转入了人免疫球蛋白基因的小鼠、大鼠、猪、羊、牛材料或其它动物的合适组织作为起始物以产生完全人多克隆抗体。
特别是，对于转入了人免疫球蛋白基因的小鼠或其它的动物(如US5,939,598中公开的内容)来说，在通过从动物中提取B淋巴细胞或纯化多克隆抗体血清来制备多克隆抗体组合物之前，可以对所述动物进行免疫从而刺激体内产生特异性抗体和产生抗体的细胞。
通过在克隆载体中随机连接VL和VH，可以由被免疫的B淋巴细胞制备组合抗体文库。因此，所述重组多克隆抗体是在这样的条件中产生的，使得所述免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区基因片段被随机连接在一起从而使可变区轻链和重链基因对能够实现从一个载体到另一个载体的整体转移，同时由于它们选自免疫球蛋白可变区轻链和重链基因片段对的亲本文库，所以特异性免疫球蛋白可变区轻链和重链基因片段能够实现稳定的配对，其中所述免疫球蛋白可变区轻链和重链基因片段对编码能与变应原反应或结合的抗体分子。
单细胞PCR可以被用于保持VL和VH在单细胞中天然配对的尝试中。对于这种情况，可以采用固定液或含有化学品如甲醛、戊二醛等的溶液来固定从动物或人体中分离的产生抗体的B淋巴细胞。
然后利用含有例如去污剂如Brij、Tween(吐温)、聚山梨醇、TritonX-100等的透化液对所述细胞进行透化处理。
所述固定和渗化过程应该提供充分的孔隙度从而使得酶、核苷酸和其它试剂能够进入到所述细胞中，而不过度破坏细胞区室或其中的核酸。加入的酶和核苷酸可进入细胞以将细胞的VL和VH mRNA逆转录成相应的cDNA序列。
逆转录可以单步进行或任选地与PCR程序一起进行，利用逆转录酶、足量的四种dNTP和与mRNA结合的引物为逆转录酶提供3’羟基基团以启动聚合反应。任何与mRNA互补的引物都可以使用，但是为了便于可变区mRNA的选择，优选使用与VL和VH分子的3’末端互补的引物。
通过逆转录，所产生的cDNA序列可以利用对免疫球蛋白基因特异的引物，特别是针对VL和VH核酸的末端区域特异性的引物，通过PCR来扩增。PCR过程可以按照例如US 4,683,195中公开的内容进行。优选地，所述cDNA在同一反应中进行PCR扩增和连接，除了利用cDNA引物外，还利用了一个针对VH区基因的5’端的引物和另一个针对VL基因的5’端的引物。这些引物还含有额外序列的互补尾，使得VL和VH基因能够自组装。PCR扩增和连接后，由于所述扩增和连接反应是在每个细胞中进行的，所以得到混合产物，换句话说，得到混合可变区的可能性降到最低。混合的危险可以通过采用大量的试剂如被地高辛配基标记的核苷酸来得到进一步降低从而进一步保证V区cDNA对不离开细胞区室并且不发生相互混合，而仍然保留在细胞中进行PCR扩增和连接。被扩增的序列通过互补末端序列的杂交被连接在一起。连接后，可以从细胞中回收序列。例如，连接后，用十二烷基硫酸钠(SDS)溶液冲洗所述的细胞。在冰上温育后，所述SDS从所述细胞中沉淀出来，可以将上清液加入琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。或者，或与SDS方法结合，利用一种试剂如连有地高辛配基的核苷酸，合成的DNA产物将仍然保留在细胞中并被扩增。通过对上清液进行电泳来回收所述的连接产物。
上清液电泳结束后，取下对应于适当分子量的连接产物的凝胶切片并且利用例如硅珠分离DNA。被回收的DNA可以利用末端引物来进行PCR扩增，如果需要，还可以被克隆到可以是质粒、噬菌体、粘粒、噬菌粒、病毒载体或其组合的载体中。可以将合适的限制酶切位点插入杂交序列以便进行克隆。还可以将这些载体保存为连接的可变区的文库以备后用。
利用末端嵌套引物可以对所述被连接起来的VL和VH区基因进行第二次PCR扩增，结果产生一批编码连接的VL和VH基因区的DNA片段。对VL和VH结合物进行分组是本方法的一个优势并且在该克隆过程和所有克隆过程中能够实现全部克隆和全部DNA片段的整体或分批转移。
优选地，所述重组多克隆抗体可以在这种条件下进行制备，使得按照头对头的方向将免疫球蛋白的重链可变区和轻链可变区的基因片段连接起来，从而能实现可变区轻链和重链对从一个载体向另一个载体的整体转移，其中包括从噬菌体到载体，并包括从源细胞向噬菌体或载体的整体转移，结果使得特异性免疫球蛋白可变区轻链和重链基因片段形成稳定的配对，如同在动物或人个体的原始多克隆免疫应答反应中发现的一样。
有时采用突变剂处理可变区基因序列可能是理想的。突变剂在基因序列中引起一般性的或特异性的，或随机的或定向位点的点突变、缺口、缺失或添加。有用的突变剂包括紫外光、γ辐射、化学剂如溴化乙锭、补骨脂素和核酸类似物或DNA修饰酶如限制酶、转移酶、连接酶以及特异性和非特异性核酸酶和聚合酶。而且，使用增变株也是可行的。尤其是，可以通过寡核苷酸定点诱变将随机突变引进VH和VL区基因的CDR。被引进基因序列的突变最终增加了文库的复杂性和多样性以及对抗体的亲和力从而进一步增强了所述文库在治疗中的可利用性。而且，这种诱变可以被用于单一VH和VL对或用于特定一组VH和VL对从而重新制备一个文库。
通过以下步骤进行克隆：例如通过利用限制酶切割cDNA和载体序列；如果需要，分离某些核酸片段；在适当的平衡盐溶液中在有连接酶存在的条件下将这些片段混合起来；在酶可接受的条件下将所述混合物温育预定的一段时间。通过利用cDNA各末端上不同的酶识别位点，可以预先决定克隆方向。
将载体转化到合适的宿主细胞中并进行培养物扩增从而扩充含有所述文库的不同载体种群。用于原核载体的宿主细胞可以是细菌如大肠杆菌的培养物。用于真核载体的宿主细胞可以是真核细胞如任何适合组织培养的哺乳动物、昆虫或酵母细胞系的培养物。尽管也可以采用其它多种转化方法，细菌细胞是通过氯化钙-热休克或电穿孔法用载体转化的。
尽管也可以采用其它多种转化方法，真核细胞通过磷酸钙沉淀或电穿孔进行转染。DNA片段可以被克隆到原核或真核表达载体、嵌合载体或双重载体中。所述表达载体可以是质粒、粘粒、噬菌体、病毒载体、噬菌粒及其组合，但是其中在噬菌体表面表达重组产物从而利于筛选和选择的噬菌体展示载体是优选的。在表达载体上可以设置有用的转录和翻译位点，包括RNA聚合酶识别区域如TATA盒位点、CAT位点、增强子、适当的剪接位点，如果需要，可包括富含AT的末端区域和转录起始位点。利于翻译的有用位点包括翻译起始和终止位点以及核糖体结合位点。典型地，一些用于真核细胞有效表达的更有用位点如SV40，CMV，HSV或杆状病毒启动子/增强子区域来源于病毒。得到的重组抗体可以是小鼠IgG1，IgG2a，IgG2b，IgM，IgA，IgD或IgE类，人IgGi，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，lgA1，lgA2，IgD或IgE类，或其组合或片段。优选地，嵌合抗体文库主要由IgG抗体或Fab抗体片段组成。
选择具有所需特异性的重组多克隆抗体可以如下进行：例如通过利用用于结合表现出相关抗体特异性的噬菌体颗粒的被变应原包被的表面进行亲和性选择(淘选)。噬菌体文库中的多数噬菌体通过冲洗被除去并且用更严格的条件(洗脱)来收回结合的噬菌体颗粒。所述筛选完成后，可以将噬菌体颗粒的筛选文库中的VH和VL抗体基因对亚克隆到被设计用来表达重组多克隆抗体的不同载体中，所述重组多克隆抗体作为完整抗体分子或其片段如Fab片段被表达。
使用产生重组多克隆抗体的重组DNA技术是一种合算的抗体制备方法，并且得到很好表征的具有所需特异性的多克隆抗体制剂的制备能够克服上述传统多克隆抗体血清和各个单克隆抗体所带来的问题，而且能够利用这种试剂预防或治疗变态反应或变态反应病症例如哮喘。药物组合物
在一个优选的技术方案中，本发明的药物组合物旨在对粘膜进行局部用药/应用或进行皮肤应用，所述粘膜例如是口咽、鼻腔、呼吸道、胃肠道、眼如结膜粘膜、阴道、泌尿生殖器粘膜。
所述药物组合物的一种特别有意义的用途是应用于鼻、支气管或肺粘膜。具体地，使用吸入多克隆抗体对变态反应进行局部治疗是这种试剂的特别有效的应用，从而针对一大部分人口患有的疾病，发现和开发了生产成本低、无害且无毒的新型治疗或预防方式。
特别是为了获得所述多克隆抗体向肺腔的最佳送递效果，加入表面活性剂如磷酸甘油酯，例如磷脂酰胆碱，和/或带正电荷或负电荷的赋形剂与带相反电荷的抗体的亲水性或疏水性复合物是有利的。
其它适合旨在将所述多克隆抗体送递到呼吸道粘膜的药物组合物的赋形剂可以选自a)碳水化合物，例如单糖如果糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖和山梨糖等；双糖如乳糖、海藻糖和纤维二糖等；环糊精如2-羟丙基-β-环糊精；和多糖如棉子糖、麦芽糖糊精和葡聚糖等；b)氨基酸如甘氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸和赖氨酸等；c)由有机酸和碱制备的有机盐如柠檬酸钠、抗坏血酸钠、葡糖酸镁、葡糖酸钠和氨丁三醇氢氯化物(tromethaminehydrochloride)等；d)肽和蛋白，如天冬苯丙二肽酯、人血清白蛋白和明胶等；e)糖醇如甘露糖醇和木糖醇等；f)聚阳离子聚合物如脱乙酰壳多糖或脱乙酰壳多糖盐或衍生物。
过去几年已经以适于形成经口吸入(肺部送递)药物分散体的组合物形式销售了某些药物来治疗人的各种病症。这种肺药物送递组合物被设计成通过患者吸入所述药物分散体进行送递从而使得所述分散体内的活性药物能够到达肺部。
肺药物送递本身能够通过不同方式来实现，包括液体雾化器、基于气溶胶的计量吸入器(MDI)和干粉分散装置。基于含氯氟烃(CFC)的MDI愈来愈不受欢迎，这是由于它们对环境产生不利影响。不依赖于CFC气溶胶技术的干粉分散装置有希望被用于送递便于制成干粉的药物。许多不稳定的大分子可以以冻干或喷雾干燥粉剂形式单独或者与适当的粉剂载体进行结合来得到稳定的贮存。
包括抗体在内的许多药物组合物非常昂贵。因此，关键是能够以最小的药物损失有效配制、加工、包装和运输所述干粉。
手持和其它粉剂送递装置的重要条件是效率。重要的是送递的剂量应当相对较高从而降低需要达到总剂量的呼吸次数。既能达到充分分散的程度又能达到小的分散体积是一个很大的技术挑战，其在某种程度上需要每一单位剂量的粉剂组合物能被容易和充分可靠地分散。某些肺送递装置如美国专利5,797,392，5,458,135和国际专利公开文献W096/09085中公开的装置可用于干粉药物的肺部传送。本发明组合物的其它用药形式包括适合于眼睛用药的液体、凝胶、软膏或其它制剂、适于鼻腔用药的喷雾、气雾剂、粉剂或其它组合物、用于口腔的口香糖、糊剂、凝胶或其它组合物、适于皮肤使用的霜、软膏、洗剂、凝胶或其它组合物、适于阴道或泌尿生殖器粘膜使用的阴道栓(vagitories)、凝胶或其它组合物或者被配制成适于消化道用药的胶囊或片剂。对于皮肤应用，所述多克隆抗体可以与以下一种或多种赋形剂进行适宜的配制：溶剂、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、螯合剂、抗氧化剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、胶凝剂、软膏基质、渗透增强剂、香料和皮肤保护剂。
溶剂的实例有例如水、醇、植物油或海洋产品油(例如食用油如杏仁油、蓖麻油、可可脂、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻子油、橄榄油、棕榈油、花生油、罂粟子油、油菜籽油、芝麻油、豆油、向日葵油和茶籽油)，矿物油，脂肪油，液体石蜡，聚乙二醇，丙二醇，甘油，液体聚烷基硅氧烷及其混合物。
缓冲剂的实例有例如柠檬酸、醋酸、酒石酸、乳酸、氢磷酸、二乙胺等。
用于组合物的防腐剂的合适例子有对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对-羟基苯甲酸丙酯、尼泊金丁酯、尼泊金异丁酯、尼泊金异丙酯、山梨酸钾、山梨酸、苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯氧基乙醇、溴硝丙二醇(bronopol)、bronidox、MDM乙内酰脲、氨基甲酸碘丙炔丁酯、EDTA、氯苄烷铵和苄醇或防腐剂的混合物。湿润剂的实例有甘油、丙二醇、山梨醇、乳酸、尿素及其混合物。
抗氧化剂的实例有丁基化羟基苯甲醚(BHA)、抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、半胱氨酸及其混合物。乳化剂的实例有天然树胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶；天然磷脂，例如大豆卵磷脂；失水山梨糖醇单油酸酯衍生物；羊毛脂；羊毛醇；失水山梨糖醇酯；单酸甘油酯；脂肪醇；脂肪酸酯(例如脂肪酸的甘油三酯)；及其混合物。
悬浮剂的实例有例如纤维素和纤维素衍生物如羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、角叉藻聚糖、阿拉伯胶(acacia gum、arabic gum)、黄蓍胶及其混合物。
凝胶基质、增粘剂或能够吸收伤口渗出物的成分的实例有：液体石蜡、聚乙烯、脂肪油、胶态二氧化硅或胶体氧化铝、锌皂、甘油、丙二醇、黄蓍胶、羧乙烯基聚合物、硅酸镁-铝、Carbopol、亲水性聚合物如淀粉或纤维素衍生物如羧甲基纤维素、羟乙基纤维素以及其它纤维素衍生物、水-可溶胀水胶体、角叉藻聚糖、透明质酸盐(例如选择性地含有氯化钠的透明质酸盐凝胶)和包括丙二醇藻酸盐在内的藻酸盐。
软膏基质的实例有蜂蜡、石蜡、鲸蜡醇、鲸蜡醇十六酸酯、植物油、脂肪酸的失水山梨糖醇酯(Span)、聚乙二醇以及脂肪酸的失水山梨糖醇酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween)。
疏水的或水-乳化软膏基质的实例有石蜡、植物油、动物脂肪、合成甘油酯、蜡、羊毛脂和液体聚烷基硅氧烷。亲水性软膏基质的实例是固体macrogols(聚乙二醇)。软膏基质的其它实例是三乙醇胺皂、硫酸化脂肪醇和聚山梨醇。
其它赋形剂的实例有聚合物如羧甲纤维素(carmelose)、羧甲纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、果胶、黄原胶、刺槐豆胶、阿拉伯胶、明胶、卡波姆、乳化剂如维生素E、甘油硬脂酸酯、十六烷基葡糖苷、胶原、角叉藻聚糖、透明质酸盐和藻酸盐和脱乙酰壳多糖。
对于多克隆抗体来说获得局部效果通常是优选的。清除率以及活性基本上可以通过药物组合物如微球体、脂质体、带正电荷或负电荷的赋形剂与带相反电荷的抗体分子的复合物得到控制和延长。多克隆抗体的治疗用途
在一个优选的技术方案中，包含在本发明组合物中的联合体与吸入变应原反应/结合，包括结膜和鼻咽变应原以及进入呼吸道的变应原，或者进入体内的变应原。预防或治疗性吸入针对常见吸入变应原的多克隆抗体，例如联合体，其直接目的在于在变应性致敏发生之前通过协助阻断、中和并清除呼吸道中的变态反应引发物来消除变态反应的诱因。
因此，本发明的这个技术方案涉及通过吸入多克隆抗体来阻断可与IgE分子结合的变应原表位从而中和吸入变应原作用的可能性。而且，预测多克隆抗体的结合发挥清除变应原的作用，其清除过程如下：介导对变应原的吞噬作用和降解作用而不诱导变态反应性应答，促进包在与IgA或IgG形成的免疫复合体中的变应原以及粘膜粘液从呼吸道向上被清除到咽部，然后被吞咽到消化道中。
最后，假定粘膜施用变应原-特异性多克隆抗体如IgG或IgA同种型的联合体能够抑制IgE介导的抗原向T淋巴细胞的提呈，其中所述多克隆抗体能够阻断变应原-特异性IgE的结合，所述向T淋巴细胞的抗原呈递可诱导主要是TH2型T淋巴细胞针对变应原的应答反应，认为这种应答在变态反应性个体中使变态反应永续。取而代之，阻断性变应原-特异性多克隆抗体例如联合体的存在可导致IgG-或IgA-介导的抗原向T细胞提呈，其依次可优先促使TH1型T淋巴细胞对变应原的应答反应，从而中断变应性炎症反应的恶性循环。
例如来自花粉的变应原表位由几种蛋白质产生，因此对于单一吸入抗体来说，如果不具有多种个体独特型特异性/抗原反应性，则需要含有几种单一吸入抗体，才能发挥作用。在这方面多克隆抗体似乎远比单克隆抗体优越。
因此，多克隆抗体组合物可以被用于预防或治疗所有类型的变态反应，包括过敏性鼻炎、枯草热、过敏性结膜炎、过敏性(外因性)哮喘以及食物过敏。本发明的多克隆抗体具体地，但不限于是一种与以下来源的变应原发生反应/结合的多克隆抗体：屋尘螨(例如Dermatophagoides farinae或屋尘螨)；猫、狗或马的皮屑；桦树(白桦树)、桤木、榛树、橡树、柳树、悬铃木、山毛榉、榆树、枫木、岑树和鹅耳枥的树花粉；梯牧草(梯牧草)、六月禾(早熟禾)、黑麦草(黑麦草)、果园草(鸭茅)、豚草(例如豕草)、甜春草(sweet vernal grass)(黄花茅)和黑麦(黑麦)的草花粉；或真菌(例如链格孢属、曲霉属、枝孢属和青霉属)。另外，变应原-特异性多克隆抗体，例如联合体可以被用于治疗针对其它活性剂如食物过敏原(例如花生和其它坚果，有壳的水生动物、蛋、奶、玉米)或蜂毒过敏原的变态反应。许多这些变应原可以以完全表征的蛋白形式从商业途径购得。
在人体中有效治疗或预防变态反应所需的多克隆抗体的剂量随着待治疗的变应性疾病的类型和严重程度、变应原的类型、患者的年龄和健康状况等而不同。
多克隆抗体的常规用药剂量范围是每单位剂型1μg至1g，优选1-1000μg，更优选2-500，甚至更优选5-50，最优选10-20μg。
实施例
本发明通过下列实施例进行详细的描述，但这些实施例不以任何方式限制本发明所要求保护的范围。通过免疫小鼠建立联合体文库
通过皮下注射(s.c.)或腹膜内注射(i.p.)例如含有1mg变应原蛋白的弗氏完全佐剂，对BALB/c小鼠进行免疫。利用重组变应原蛋白(例如Der p1)或天然变应原提取物进行免疫。以两至三个星期的间隔以及采用不完全弗氏佐剂进行后续免疫。按照US 5,789,208中的描述，最后一次免疫后的第3天取脾和/或骨髓并用以制备联合体文库。由变应反应患者的材料建立联合体文库
由取自变态反应患者的血液或骨髓样本制备联合体文库，所述患者特征为阳性病史、皮肤针刺试验、放射变应原吸附测定(RAST)、或由IgG或IgE免疫印迹检测到的患者血清对变应原提取物的反应性或对纯化重组变应原(例如花粉变应原或动物变应原)的反应性。通过ELISA测定与变应原结合的抗体
用50至1000ng的变应原、裂解变应原或重组变应原包被NuncMaxisorp 96-孔微滴板的每个孔。用含有明胶或BAS以及Tween-20的PBS冲洗后，在37℃下利用明胶或BAS将所有孔封闭1小时。然后，冲洗所述的孔并使这些孔与小鼠多克隆抗体，例如联合体或来自血清或支气管肺泡灌洗液(BAL)的人IgE、IgG一起进行温育。重复冲洗数次后，通过适当地连续温育生物素化的二级抗-小鼠或抗-人免疫球蛋白，然后利用AP-抗生物素蛋白和pNPP底物，测定结合的抗体。将先前表征的变应原-特异性单克隆抗体用作阳性对照，而将具有不同的、非相关特异性的单克隆抗体或多克隆抗体用作阴性对照。
在一些实验中，在竞争性ELISA中进行多克隆抗体温育前，预先与被完全表征的单克隆抗体一起温育。多克隆抗体抑制患者产生的IgE与变应原的结合
通过IgE结合的竞争性ELISA(类似于上述方案并进行以下修改)或制备型SDS-PAGE和蛋白质印迹研究了患者产生的IgE与变应原提取物的结合。利用变应原、裂解变应原或重组变应原进行ELISA孔包被或变应原电泳后，用明胶或BSA封闭被变应原包被的表面，然后与变应原-特异性多克隆抗体一起在4℃下温育3-4小时。然后将样品与患者血清或BAL IgE(按1∶5稀释)一起在4℃下温育3-4小时，并利用例如125I标记的抗-人IgE的抗体(RAST；Pharmacia)来测定结合的人IgE抗体并通过放射自显影术来观测结果。
按照上述方法测定小鼠IgG的结合。通过电泳和蛋白印迹对多克隆抗体与变应原提取物的反应性进行表征
通过SDS-PAGE分离变应原提取物并免疫印迹到硝化纤维素条上，然后与抗体制剂(患者血清、小鼠血清、多克隆抗体，例如联合体，或对照单克隆抗体)一起进行温育。在一些实验中，针对一种变应原产生的多克隆抗体的交叉反应性通过针对一组同源性变应原的ELISA或蛋白质印迹来测定。变应原与多克隆抗体进行预温育后抑制人嗜碱性粒细胞释放由变应原诱导的组胺
从变态反应患者身上获取肝素化血样，然后通过葡聚糖沉淀分离出粒细胞。将重组变应原、裂解变应原或变应原提取物与变应原-特异性多克隆抗体，例如联合体，或对照抗体或单纯缓冲液在室温下预温育1小时，然后以不同的浓度(1，0.1，0.01，和0.001ug/ml)与在组胺释放缓冲液(20mM PIPES，pH7.4，110mM NaCl，5mM KCl，1mMCaCl2，1g/L葡萄糖，0.3mg/ml人血清白蛋白)中裂解的粒细胞一起进行温育。通过放射免疫分析方法测定释放到不含细胞的上清液中的组胺，并将测定结果表示为细胞裂解后总组胺释放的百分率。多克隆抗体抑制小鼠变态反应模型中的过敏性炎症
通过在例如第0天和第4天两次或多次i.p.注射变应原(例如150微克)和明矾使小鼠(例如BALB/c小鼠)对变应原(例如豚草变应原)致敏。在例如第11天以及在两至四星期的时间范围内，对麻醉小鼠进行气管内或鼻内的变应原攻击，然后按照下述方法进行分析。在一些实验中，使用了基于卵清蛋白(OVA)致敏的小鼠模型。简而言之，在第1天和第14天给BALB/c小鼠i.p.注射例如在2mg氢氧化铝佐剂(明矾，Pierce)中的5-100ug OVA(V级鸡蛋白蛋白，Sigma)，然后在该方案的第28，29和30天，利用超声雾化器(DeVilbiss Somerset，PA，USA)用1％气雾化的在PBS中的OVA对小鼠攻击20分钟，或者将含5-100μg OVA的40μL PBS对麻醉小鼠进行气管内注射。对照小鼠接受相同量的PBS。
在第32天，抗原攻击后24小时，对12只小鼠进行气道应答反应性试验，并在第33天处死小鼠。在对照组中使用了8只小鼠。
将左肺扎起来并且通过用200μL PBS重复冲洗5次来获得右肺的BAL。将左肺固定并包埋在石蜡中用于进行肺组织学研究。从每只小鼠身上抽取血样(尾血)并保存在-80℃直到开始进行分析。
在对变应原-特异性多克隆抗体，例如联合体抑制过敏性炎症的能力进行测定的实验中，在施用攻击剂量的抗原以前、过程中或以后，所述变应原-特异性多克隆抗体制剂以1μg至1mg的剂量进行用药。
将具有不同或非相关特异性的多克隆抗体以及PBS用作阴性对照，在某些实验中将结果与阳性对照变应原-特异性单克隆抗体进行比较。多克隆抗体在小鼠变态反应模型中阻断变应性应答的效力评价
完成变应原攻击后，通过对安乐死的小鼠进行支气管灌洗(BAL)来评价变应性反应，并通过对嗜酸性粒细胞、中性白细胞、淋巴细胞和巨噬细胞的含量进行分类计数来检测BAL液体。
收集左肺的上叶和下叶并在20℃下于卡诺氏溶液(6×乙醇；3×冰醋酸；1×氯仿)中固定约15小时。
包埋在石蜡中后，将组织切成4-5μm的切片。对于每只小鼠取随机分布的10张气道切片评估细胞炎症和粘液闭塞的严重程度。半定量评估支气管周围和血管周围的细胞浸润中存在的白细胞(嗜酸性粒细胞、淋巴细胞)，以增量为0.5的标度0-5来量化。支气管腔的粘液闭塞通过利用下列测量指标来计分：0，0-10％闭塞；1，10-30％闭塞；2，30-60％闭塞，3，60-90％闭塞；4，90-100％闭塞。对气道上皮造成的损伤也用同样的等级来评价。所有评价过程由不知晓方案设计的个体来进行并且采用照片的形式来记录结果。对细胞染色，用苏木精和伊红对所述组织切片进行染色，或者采用苏木精和过碘酸希夫试剂对粘液染色。
如上述通过ELISA方法测定小鼠血液中的总体以及OVA-特异性的IgE，IgG，lgG1，IgG2a和IgG3水平。

Claims (24)

1.一种药物组合物，其含有能够与变应原发生反应或进行结合的重组多克隆抗体或由各单克隆抗体组成的混合物或分离的或纯化的多克隆抗体作为活性成分以及一种或多种药用赋形剂。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述活性成分是重组多克隆抗体。
3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述活性成分是由各单克隆抗体组成的混合物。
4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述活性成分是分离的或纯化的多克隆抗体
5.如权利要求1-4中任一项所述的药物组合物，其中该组合物不含抗体与之反应或结合的变应原。
6.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其含有至少一种能够实现所述重组多克隆抗体或由各单克隆抗体组成的混合物或分离的或纯化的多克隆抗体进行局部用药的药用赋形剂。
7.如权利要求5所述的药物组合物，其旨在对口咽、鼻腔、呼吸道、胃肠道、结膜粘膜、阴道、泌尿生殖器粘膜进行局部用药或者进行皮肤应用。
8.如权利要求7所述的药物组合物，其中所述呼吸道包括鼻、口、咽、支气管或肺泡粘膜。
9.如权利要求1-8中任一项所述的药物组合物，其以溶液、分散体、粉剂或微球体的形式提供。
10.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述重组多克隆抗体是通过噬菌体展示技术产生的。
11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述重组多克隆抗体是在这样的条件下产生的，使得在亲本文库中免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区基因片段连接在一起从而使可变区轻链和重链基因对能够实现从一个载体到另一个载体的整体转移，同时由于它们选自免疫球蛋白可变区轻链和重链基因片段对的亲本文库，所以特异性免疫球蛋白可变区轻链和重链基因片段能够进行稳定配对，其中所述免疫球蛋白可变区轻链和重链基因片段对编码能与变应原反应或结合的抗体分子。
12.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述重组多克隆抗体是在这样的条件下产生的，使得免疫球蛋白重链可变区和轻链可变区基因片段连接在一起从而使特异性可变区轻链和重链基因对能够实现从一个载体到另一个载体的整体转移，同时由于它们存在于动物或人个体的原始多克隆免疫应答中，所以特异性免疫球蛋白可变区轻链和重链基因片段能够进行稳定配对。
13.如权利要求1-12中任一项所述的药物组合物，其中所述变应原是以下来源的变应原：屋尘螨，例如Dermatophagoides farinae或屋尘螨；猫、狗或马的皮屑；树花粉，例如桦树(白桦树)、桤木、榛树、橡树、柳树、悬铃木、山毛榉、榆树、枫木、岑树、艾蒿(苦艾)和鹅耳枥的花粉；草花粉，例如梯牧草(梯牧草)、六月禾(早熟禾)、黑麦草(黑麦草)、果园草(鸭茅)、豚草(例如豕草)、甜春草(黄花茅)和黑麦(黑麦)的花粉；或真菌(例如链格孢属、曲霉属、枝孢属和青霉属)。
14.如权利要求1-13中任一项所述的药物组合物，其每单位剂型中所包含的重组多克隆抗体或由各单克隆抗体组成的混合物或分离的或纯化的多克隆抗体的含量范围是1μg至1g，优选1-1000μg，更优选2-500μg，甚至更优选5-50μg，最优选10-20μg。
15.能够与变应原反应或结合的多克隆抗体用于制备预防或治疗变态反应的药物组合物的用途。
16.能够与变应原反应或结合的多克隆抗体用于制备预防性或治疗性诱导对所述变应原产生耐受性的药物组合物的用途。
17.能够与变应原反应或结合的多克隆抗体用于制备调节免疫系统的药物组合物的用途。
18.如权利要求15-17中任一项所述的用途，其中所述多克隆抗体是重组多克隆抗体。
19.如权利要求15-17中任一项所述的用途，其中所述多克隆抗体是由各单克隆抗体组成的混合物。
20.如权利要求15-17中任一项所述的用途，其中所述多克隆抗体是分离的或纯化的多克隆抗体。
21.如权利要求15-21中任一项所述的用途，其中所述组合物旨在对口咽、鼻腔、呼吸道、胃肠道、结膜粘膜、阴道、泌尿生殖器粘膜进行局部用药或者进行皮肤应用。
22.如权利要求15-21中任一项所述的用途，其中所述组合物中包括的多克隆抗体的量为每单位剂型1μg至1g，优选1-1000μg，更优选2-500μg，甚至更优选5-50μg，最优选10-20μg。
23.预防或治疗变态反应的方法，其包括向需要治疗的患者施用权利要求1-14中任一项权利要求所述的组合物，该组合物含有足量的能够与变应原发生反应或进行结合的多克隆抗体，所述患者针对该变应原已经发生变态反应或具有发生变态反应的倾向。
24.诱导产生针对变应原的耐受性的方法，其包括对如果未接受治疗可能对所述变应原发生变态反应的患者施用权利要求1-14中任一项权利要求所述的组合物从而在患者体内诱导产生针对所述变应原的耐受性，该组合物含有足量的能够与该变应原发生反应或进行结合的多克隆抗体。
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