ES2282256T3 - Anticuerpos policlonales recombinantes o purificados para tratar la alergia. - Google Patents

Abstract

El uso de un anticuerpo policlonal específico de alérgeno, el cual es capaz de reaccionar con, o unirse a, más de un determinante inmunógeno en un alérgeno que provoca alergia o un trastorno alérgico, por lo que se evita que dicho alérgeno reaccione con, o se una a, una IgE específica del alérgeno, para la fabricación de una composición farmacéutica para la profilaxis o el tratamiento de la alergia.

Description

Anticuerpos policlonales recombinantes o purificados para tratar la alergia.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la preparación de una composición que comprende un anticuerpo policlonal recombinante o una mezcla de anticuerpos monoclonales diferentes capaces de reaccionar con, o unirse a, un alérgeno, así como al uso de un anticuerpo policlonal capaz de reaccionar con, o unirse a, un alérgeno para el tratamiento de la alergia.

Antecedentes de la invención

Se sabe que los efectos protectores de la inmunidad humoral están mediados por una familia de glicoproteínas relacionadas estructuralmente denominadas anticuerpos. Los anticuerpos inician su actividad biológica uniéndose a los antígenos. La unión de los anticuerpos a los antígenos generalmente es específica para un antígeno, y la unión normalmente es de elevada afinidad. Los anticuerpos son producidos por los linfocitos B. La sangre contiene muchos anticuerpos diferentes, cada uno derivado de un clon de células B, y cada uno tiene una estructura y especificidad diferente por el antígeno. Los anticuerpos están presentes en la superficie de los linfocitos B, en el plasma, en el líquido intersticial de los tejidos y en los líquidos de secreción, tales como la saliva y la mucosidad de las superficies mucosas.

Todos los anticuerpos son similares en su estructura global, lo que justifica ciertas similitudes en las características fisicoquímicas, tales como la carga y la solubilidad. Todos los anticuerpos tienen una estructura central común de dos cadenas ligeras idénticas, cada una de alrededor de 24 kilodaltons, y dos cadenas pesadas idénticas de alrededor de 55-70 kilodaltons cada una. Una cadena ligera está unida a cada cadena pesada, y las dos cadenas pesadas están unidas entre sí. Tanto las cadenas ligeras como las pesadas contienen una serie de unidades homólogas repetitivas, cada una de alrededor de 110 residuos aminoácidos de longitud que se pliegan de forma independiente en un motivo globular común, denominado dominio de inmunoglobulina (Ig). La región de una molécula de anticuerpo formada por la asociación de las dos cadenas pesadas es hidrófoba. Se sabe que los anticuerpos se escinden en el sitio en el que la cadena ligera se une a la cadena pesada cuando se someten a condiciones físicas o químicas adversas. Debido a que los anticuerpos contienen numerosos residuos de cisteína, tienen muchos enlaces disulfuro cisteína-cisteína. Todos los dominios de Ig contienen dos capas de láminas \beta plegadas con tres o cuatro hebras de cadenas polipeptídicas antiparalelas.

A pesar de su similitud global, las moléculas de anticuerpo se pueden dividir en distintas clases y subclases basándose en características fisicoquímicas tales como el tamaño, la carga y la solubilidad, y en su comportamiento en la unión a los antígenos. En humanos, las clases de moléculas de anticuerpo son: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Se dice que los miembros de cada clase son del mismo isotipo. Los isotipos IgA e IgG se subdividen adicionalmente en los subtipos denominados IgA_{1}, IgA_{2} e IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3} e IgG_{4}. Las cadenas pesadas de todas las moléculas de anticuerpo de un isotipo comparten regiones amplias de identidad de secuencia de aminoácidos, pero difieren de los anticuerpos que pertenecen a otros isotipos o subtipos. Las cadenas pesadas se designan mediante las letras del alfabeto griego que corresponden al isotipo global de la molécula de anticuerpo, p.ej., IgA contiene \alpha, IgD contiene \delta, IgE contiene \varepsilon, IgG contiene \gamma, e IgM contiene cadenas pesadas \mu. IgG, IgE e IgD circulan en forma de monómeros. Las moléculas de IgA secretadas a través de los epitelios hacia el recubrimiento mucoso de las cavidades corporales son homodímeros, mientras las moléculas de IgM son pentámeros. La IgA circulante existe principalmente en forma de monómero. Las formas multiméricas de IgA e IgM están estabilizadas por la denominada cadena J. La IgA secretada (S-IgA) es producida por las células B que residen en la lámina propia, y es captada por las células epiteliales del lado basolateral por medio del receptor de poli-inmunoglobulinas (pIgR), transportada a través de la célula epitelial y secretada en la mucosa del lado luminal. Cuando se libera el complejo IgA:cadena J:pIgR, el pIgR se escinde mediante una proteasa, y una parte de la molécula pIgR denominada componente secretor (SC) permanece unida al complejo IgA:cadena J. Así, S-IgA es un complejo que consiste en IgA, la cadena J, y el SC, de los cuales los dos últimos están unidos de forma covalente a la molécula de IgA por medio de enlaces disulfuro. S-IgA es muy resistente al medio proteolítico de la mucosa epitelial, p.ej., en el tracto respiratorio o gastrointestinal, y como tal constituye el sistema inmunitario específico primario en estas localizaciones. Se ha demostrado que S-IgA tiene un efecto inmunomodulador, y puede inducir tolerancia a los antígenos a los que se une.

Existen entre 10^{8} y 10^{10} moléculas de anticuerpo estructuralmente diferentes en cada individuo, cada una con una secuencia única de aminoácidos en sus sitios de combinación con el antígeno. La diversidad de secuencias en los anticuerpos se halla de forma predominante en tres tramos cortos en los dominios aminoterminales de las cadenas pesadas y ligeras denominados regiones variables (V), para distinguirlos de las regiones constantes (C) más conservadas.

La inmunoglobulina E (IgE) es responsable de la hipersensibilidad denominada de tipo 1, que se manifiesta en forma de enfermedades habituales, tales como rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, fiebre del heno, asma alérgica (extrínseca), alergia al veneno de abejas, y alergia alimentaria. La IgE específica de alérgeno se produce en exceso en pacientes con alergias mediadas por IgE. La IgE circula en la sangre y se une a receptores Fc de elevada afinidad para IgE en los basófilos y mastocitos de la sangre, diversos tejidos, o en las superficies mucosas. En la mayoría de las respuestas alérgicas, los alérgenos entran en el organismo de un paciente a través de la inhalación, ingestión o a través de la piel. Las moléculas de alérgeno se unen a la IgE preformada ya unida al receptor de elevada afinidad Fc\varepsilonRI en las superficies de los mastocitos y de los basófilos, lo que da como resultado el entrecruzamiento de varias moléculas de IgE y el desencadenamiento de la liberación de histamina y de otros mediadores inflamatorios que provocan los diversos síntomas alérgicos.

Entre los tejidos que son los más susceptibles a las reacciones alérgicas locales mediadas por IgE están la conjuntiva, la mucosa de la cavidad nasal o la orofaringe (rinitis alérgica), los recubrimientos mucosos del tracto bronquial, y la mucosa gastrointestinal. Así, los alérgenos entran en el tracto respiratorio a través de la inhalación, y quedan atrapados en las superficies mucosas del recubrimiento nasal o de los conductos bronquiales del tracto respiratorio. Los alérgenos transportados por el aire también entran en contacto con las superficies húmedas de los ojos y de los oídos y son retenidos en la mucosa. Los tejidos mucosos están densamente poblados por mastocitos, y los alérgenos que llegan a estas localizaciones se pueden unir, por lo tanto, a la IgE y activar a los mastocitos.

Los principios terapéuticos y las modalidades de tratamiento en el manejo de la alergia no han cambiado sustancialmente en los últimos años. Los fármacos inmunodepresores tales como los esteroides para inhibir las actividades inmunitarias y los broncodilatadores para aliviar los síntomas del asma han sido durante mucho tiempo la modalidad de tratamiento principal para los pacientes con asma alérgica. La inmunoterapia de desensibilización es la terapia nueva más importante para los pacientes gravemente afectados, pero los avances médicos se han limitado a perfeccionar la clasificación de las sustancias alérgenas, mejorar los métodos diagnósticos, y proporcionar una biblioteca de extractos de alérgenos mejor controlada y más amplia para la inmunoterapia. En cuanto a la investigación, se ha progresado en la identificación y el aislamiento de los componentes alérgenos principales de las sustancias alérgenas. Por ejemplo, se han identificado los componentes alérgicos principales de la ambrosía, los ácaros del polvo doméstico, y la caspa y saliva de gato y perro. Cuando las partículas de alérgenos, p.ej. polen de fleo de los prados, llegan a la mucosa de las vías respiratorias se desintegran en componentes alérgicos principales y secundarios.

Los anticuerpos se han propuesto para varios tratamientos clínicos: MedImmune Inc. está estudiando el uso de anticuerpos monoclonales humanizados anti-virus sincitial respiratorio (VSR), y comercializa un producto de inmunoglobulina humana policlonal anti-VSR (RespiGam) aislado de sangre de donante humano y usado para tratar la infección por VSR. MedImmune también comercializa CytoGam, una inmunoglobulina humana anti-CMV (citomegalovirus) para el tratamiento de la infección por CMV. IDEC y Genentech están realizando conjuntamente ensayos clínicos de un anticuerpo monoclonal híbrido ratón-humano (Rituximab) dirigido contra el antígeno CD20 hallado en las células B maduras y en la mayoría de los tumores de linfoma no Hodgkin para el tratamiento del linfoma no Hodgkin de grado bajo en recaída o refractario. GalaGen está estudiando el uso de inmunoglobulina policlonal bovina (Diffistat-G) para el tratamiento de la diarrea asociada a antibióticos para Clostridium difficile. SmithKline Beecham y Schering-Plough están desarrollando un anticuerpo monoclonal anti-IL-5 que en los ensayos clínicos se ha demostrado que previene la inflamación eosinofílica y la constricción de las vías respiratorias. Genentech está desarrollando un anticuerpo monoclonal anti-IgE para "desconectar" las alergias. Se ha demostrado que el anticuerpo Rhu-Mab-E25, que es un anticuerpo monoclonal IgG_{1} híbrido humanizado específico para un epítopo único en los receptores de IgE de elevada afinidad de humanos (Fc\varepsilonRI), reduce las concentraciones de IgE libre después de la primera administración mediante inyección. Atenuó tanto las respuestas de fase temprana como las de fase tardía a los alérgenos inhalados después de múltiples inyecciones. Los ejemplos de anticuerpos usados de forma terapéutica también incluyen una IgG nebulizada (Sandoz) que se usa de forma intranasal contra VSR; HNK20 (Oravax), una IgA anti-VSR; y 4B9 (Bristol Myers-Squibb), un anticuerpo monoclonal IgM anti-Streptococcus del grupo B. Otros anticuerpos monoclonales terapéuticamente útiles incluyen los anticuerpos monoclonales anti-CD4, anticuerpos anti-IL-2 y anticuerpos
anti-IL-4.

Piazza et al. (J. Infect. Dis., vol. 166, págs. 1422-1424, 1992) ha descrito la inmunoterapia de la infección por VSR mediante el uso de aerosoles de partículas pequeñas de IgG. En este estudio se demostró que una exposición de 15 minutos a una disolución pulverizada de un 5% de IgG realizó una reducción de 50 veces del virus pulmonar. Brown (Aerosol Science and Technology, vol. 24, págs. 45-56, 1996) describe el uso de anticuerpos como inhibidores o antagonistas de citocinas para reducir las enfermedades inflamatorias respiratorias o las respuestas asmáticas inducidas por alérgenos. También se menciona la administración respiratoria local del anticuerpo específico de patógeno para el tratamiento de las infecciones respiratorias agudas víricas o bacterianas.

Maruyama et al. (Biochim. Biophys. Acta, vol. 1234, págs. 74-80, 1995) describe liposomas de anticuerpos, es decir, inmunoliposomas. El revestimiento de liposomas con anticuerpos conduce a una absorción aumentada del liposoma por el sistema reticuloendotelial. Se sabe que los anticuerpos monoclonales humanos son útiles como agentes antitumorales. Paborji et al. (Pharmaceutical Research, vol. 11, nº 5, págs. 764-771, 1994) describe un anticuerpo monoclonal IgG de ratón/humano específico para el antígeno Lewis Y hallado en la superficie de las células tumorales. El uso de anticuerpos en aerosoles impulsados por propelente con dosis medidas para la terapia con aerosol de anticuerpos pasivos contra infecciones respiratorias se propone en Brown et al. (Journal of Immunological Methods, vol. 176, págs. 203-212, 1994). Las respuestas inmunitarias en el tracto respiratorio son de gran importancia para la protección contra infecciones del sistema respiratorio y por su implicación en las alergias respiratorias y el asma. Se ha demostrado que la administración dirigida eficaz de reactivos inmunomoduladores que incluyen anticuerpos monoclonales en el tracto respiratorio es beneficiosa para incrementar la inmunidad local hacia los patógenos respiratorios o para disminuir la patología respiratoria mediada por el sistema inmunitario. Los inmunoconjugados, inmunoliposomas o inmunomicroesferas inhalados tienen aplicación en el pulmón como destructores de células cancerosas (inmunoconjugados) o, en el caso de inmunoliposomas y microesferas, como partículas estabilizadas de administración de una diversidad de agentes terapéuticos. Gombotz et al. (Pharmaceutical Research, vol. 11, págs. 624-632, 1994) describe un anticuerpo monoclonal IgM anti-Streptococcus del grupo B.

El documento US 5.670.626 propone el uso de anticuerpos monoclonales para el tratamiento de enfermedades alérgicas mediadas por IgE tales como rinitis alérgica, asma alérgica y conjuntivitis alérgica empleando anticuerpos monoclonales para inhibir la entrada de las moléculas alérgenas a los tejidos mucosos. Se asume que la unión de las moléculas alérgenas por los anticuerpos impide que los alérgenos sean absorbidos por las células epiteliales de la mucosa.

En ciertas situaciones clínicas, el uso de anticuerpos monoclonales está asociado a desventajas específicas. Así, los anticuerpos monoclonales se dirigen contra epítopos antigénicos únicos. Por lo tanto, si el objetivo es de una naturaleza compleja que presenta muchos epítopos diferentes, entonces la avidez funcional del anticuerpo monoclonal puede ser baja, o puede bajar por debajo de un umbral crítico que permite que el objetivo escape a la eliminación a través del reconocimiento inmunitario.

Además, debido a que los anticuerpos monoclonales se dirigen contra determinantes antigénicos únicos, la densidad de los objetivos del anticuerpo, p.ej., en los alérgenos, puede no ser lo suficientemente elevada para mediar en la eliminación del alérgeno. La activación eficaz del complemento requiere, de forma similar, densidades elevadas de anticuerpos unidos a los objetivos, que pueden no conseguirse con anticuerpos monoclonales de especificidad única.

Así, en el caso de los alérgenos, los anticuerpos monoclonales son sub-óptimos, ya que se dirigen contra epítopos únicos. La mayoría de los alérgenos son proteínas complejas, que consisten en muchos epítopos proteicos y peptídicos, y que existen en muchas variantes. Así, no se puede esperar que una preparación de anticuerpo monoclonal único cubra de forma exhaustiva más de una minoría de los epítopos posibles en un alérgeno, p.ej. una partícula de polen o proteínas de caspa de gato. Esto significa que si el efecto clínico deseado de un anticuerpo se puede caracterizar como un bloqueo completo de los epítopos disponibles del anticuerpo, entonces un anticuerpo monoclonal único no será suficiente. Además, si se tuviera que desarrollar una preparación de anticuerpos preferiblemente contra varios alérgenos homólogos a partir de alérgenos estrechamente relacionados, p.ej. pólenes, o contra diversas proteínas de una fuente de alérgenos, p.ej. caspa de animales, entonces un anticuerpo monoclonal único no alcanzará la eficacia necesaria.

Sin embargo, un artículo de Schwarze y colaboradores (Am. J. Resp. Crit. Care Med., vol. 158, págs. 519-525, 1998) investigó la eficacia terapéutica de un anticuerpo monoclonal dirigido contra el alérgeno principal de ambrosía Amb a I en un modelo de alergia murina basado en ratones (Balb/c) sensibilizados y sometidos a exposición con Amb a I y extractos completos de ambrosía. Se demostró que la administración del anticuerpo monoclonal IgA antes de la exposición al alérgeno disminuyó la reactividad de las vías respiratorias a la exposición a metacolina, y disminuyó el número de eosinófilos pulmonares y las concentraciones de IgE específica de Amb a I en suero. Además, el estudio indica que la administración de IgA tuvo un efecto inmunomodulador, que implica que el tratamiento con IgA podría tener un efecto desensibilizante a largo plazo sobre la alergia. Además, se debe recalcar que este modelo de alérgeno se basa en la inducción de síntomas similares a la alergia mediante el uso de un alérgeno único, Amb a I. Así, el estudio no tiene en cuenta que la gran mayoría de alergias están provocadas por reacciones hacia varias proteínas del alérgeno y epítopos derivados de una única partícula alérgena, lo cual enfatiza la necesidad de una mezcla de anticuerpos policlonales en este régimen de tratamiento. Además, la alergia humana es profundamente más compleja que los síntomas similares a alergia inducidos en una cepa de ratones endogámicos (Inhal. Toxicol., vol. 12, págs. 829-622, 2000). Por lo tanto, la utilidad potencial de los anticuerpos monoclonales como agentes bloqueantes de alérgenos es limitada. Finalmente, los anticuerpos monoclonales pueden exhibir reactividad cruzada hacia estructuras antigénicas del tejido celular del hospedador, lo que da como resultado efectos secundarios potenciales indeseados. Cuando esto ocurre, la reactividad cruzada no se puede eliminar mediante adsorción. Por lo tanto, puede ser necesario producir un gran número de anticuerpos monoclonales diferentes para generar la combinación deseada de especificidad antigénica y selectividad por el objetivo, e incluso así sigue existiendo un riesgo significativo de reactividad cruzada hacia auto-antígenos endógenos en una proporción de los pacientes.

Un problema distinto es la generación de respuestas de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA). Los anticuerpos monoclonales murinos convencionales son proteínas extrañas para el receptor humano, y por lo tanto a menudo se provoca una respuesta inmunitaria HAMA en el receptor, que puede llevar a efectos secundarios indeseados, además de una eficacia reducida del tratamiento. Para evitar este problema, se han desarrollado anticuerpos monoclonales híbridos que poseen regiones constantes (C) humanas y regiones variables (V) murinas. Además, para evitar estos problemas se han desarrollado anticuerpos monoclonales humanizados, en los que solamente la región hipervariable determinante de la complementariedad (CDR) deriva de anticuerpos monoclonales de ratón y, finalmente, los denominados anticuerpos monoclonales completamente humanos producidos en ratones transgénicos para genes de inmunoglobulinas humanas. Sin embargo, aún existe la posibilidad de generación de respuestas de anticuerpos anti-idiotipo específicos para la región V determinante de la especificidad CDR cuando se inyectan grandes cantidades de anticuerpos monoclonales con regiones V idénticas.

Por estas razones, como se resumió anteriormente, a menudo puede ser preferible usar anticuerpos policlonales.

En el documento WO 98/10776 se expone la teoría de que la fosfolipasa A_{2} (PLA_{2}) está implicada en la patogénesis de muchas enfermedades, en las que actúa como un mediador inflamatorio que promueve la inflamación crónica. Así, se propone usar suero reactivo con al menos una enzima fosfolipasa A_{2} para el tratamiento de neoplasias en mamíferos. No se sugiere usar anticuerpos policlonales para bloquear la absorción de un alérgeno mediante administración tópica de un anticuerpo que se una al alérgeno.

El documento US 4.740.371 describe una modificación de la inmunoterapia de alérgenos, en la cual se usa un inmunocomplejo del alérgeno y de un anticuerpo para él para un tratamiento de desensibilización, y el anticuerpo está presente en un exceso molar con respecto al alérgeno para evitar una respuesta anafiláctica. El propósito de la inclusión del anticuerpo en este tratamiento es disminuir el riesgo de efectos secundarios alérgicos, tales como choque anafiláctico, para el tratamiento de desensibilización. La proporción de anticuerpo a añadir al alérgeno está definida esencialmente por el poder de neutralización del anticuerpo. Se debe usar suficiente anticuerpo, de forma que cuando se administra la composición prácticamente no hay efecto alérgico inducido por el alérgeno. La adición del anticuerpo a la composición del alérgeno es solamente un remedio para evitar los efectos secundarios de la exposición al alérgeno, y el tratamiento todavía es una inmunoterapia con alérgeno.

Existen varias desventajas al usar anticuerpos policlonales convencionales en el tratamiento de la alergia. En primer lugar, los anticuerpos policlonales en forma de IgG purificada a partir de suero humano hiperinmune están disponibles en suministros limitados y en cantidades insuficientes para el tratamiento de las enfermedades alérgicas y de otros trastornos habituales. Además, las preparaciones de \gamma-globulinas son caras de producir y exhiben una eficacia baja debido a su naturaleza mixta, al contener una gran mayoría de reactividades de inmunoglobulinas séricas humanas inespecíficas. Además, existe un riesgo real de transmitir reactivos contaminantes, que incluyen microorganismos infecciosos (virus de la hepatitis, VIH, priones, y otros), o mitógenos, citocinas y toxinas. Por último, la variabilidad entre preparaciones sigue siendo un problema importante. Para resolver el problema del suministro, se han ensayado fuentes xenogénicas de anticuerpos policlonales que incluyen suero de animales inmunizados no humanos. Sin embargo, tales composiciones pueden dar como resultado la generación de respuestas potentes anti-xenoanticuerpo, y conllevan un riesgo real de efectos secundarios serios, tales como choque anafiláctico o enfermedad del suero, así como la transmisión de infecciones xenotrópicas.

El documento US 5.789.208 describe el uso de un anticuerpo policlonal recombinante para la terapia y profilaxis con vacuna para tratar o prevenir enfermedades neoplásicas. Los anticuerpos se usan para reforzar el sistema inmunitario de un paciente para el posible reconocimiento posterior del antígeno al que se une el anticuerpo, y por ello iniciar una reacción de eliminación. Se tendrá que repetir la vacunación para que sea eficaz. No se propone usar anticuerpos policlonales que reaccionen con, o se unan a, los alérgenos en el tratamiento de la alergia, en el que los anticuerpos policlonales se deberían administrar de forma completamente diferente antes, durante o poco después de que el paciente se haya expuesto al alérgeno.

Resumen de la invención

Por lo tanto, la presente invención se refiere a la preparación de una composición farmacéutica que comprende como ingrediente activo un anticuerpo policlonal recombinante o una mezcla de anticuerpos monoclonales diferentes o un anticuerpo policlonal aislado o purificado capaz de reaccionar con, o unirse a, un alérgeno junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.

En la mayoría de las realizaciones, la composición farmacéutica preparada según la invención está exenta del alérgeno al que se une o con la que es reactivo el anticuerpo policlonal recombinante o la mezcla de anticuerpos monoclonales diferentes o el anticuerpo policlonal aislado o purificado. Sin embargo, en casos especiales durante la denominada inmunoterapia con alérgeno específico para inducir tolerancia al alérgeno en un paciente, el anticuerpo policlonal específico de alérgeno se puede administrar al paciente junto con una preparación de alérgeno, para posibilitar o aumentar la eficacia del procedimiento de inducción de tolerancia.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un anticuerpo policlonal con las especificidades deseadas para la fabricación de una composición farmacéutica para la profilaxis o el tratamiento de trastornos de alergia o alérgicos, tales como rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, fiebre del heno, asma, etc.

La invención posibilita un método para prevenir o tratar la alergia, que comprende administrar a un paciente que lo necesita una cantidad suficiente de un anticuerpo policlonal capaz de reaccionar con, o unirse a, un alérgeno hacia el cual el paciente ha mostrado una reacción alérgica.

El uso de un anticuerpo policlonal tiene ventajas clínicas potenciales comparado con el uso de un anticuerpo monoclonal, debido a la presencia de reactividades múltiples en el anticuerpo policlonal contra el alérgeno-objetivo en cuestión. Se puede generar un anticuerpo policlonal que tiene reactividades contra todos los epítopos de un alérgeno-objetivo complejo. Debido a la naturaleza policlonal de la composición, que contiene muchas especificidades por los epítopos, la densidad de anticuerpo funcional que se puede alcanzar sobre los antígenos de los alérgenos complejos cuando se usa un anticuerpo policlonal es significativamente superior que con un anticuerpo monoclonal. Esto da como resultado un bloqueo o eliminación más eficaz del alérgeno objetivo. Además, la naturaleza policlonal de la composición posibilita el reconocimiento y el bloqueo de epítopos en isotipos de alérgenos homólogos relacionados, debido a la amplia reactividad con varios epítopos compartidos parcialmente entre los alérgenos relacionados, algo que no es posible con un anticuerpo monoclonal.

Además, se puede esperar que el tratamiento con anticuerpos policlonales específicos de alérgeno del isotipo IgA o IgG tendrá un efecto inmunomodulador induciendo tolerancia a un alérgeno, y así tendrá un efecto a largo plazo para curar la alergia o para reducir la necesidad de tratamiento posterior. Así, un aspecto adicional de la invención posibilita el uso de una composición farmacéutica preparada según la invención para el tratamiento profiláctico mediante la inducción de tolerancia al alérgeno. Esto se puede usar incluso en pacientes en los que todavía no se ha observado una reacción alérgica, pero que debido a los antecedentes familiares o a análisis genéticos es probable que desarrollen alergia hacia un alérgeno.

Además, al contrario que un anticuerpo monoclonal, una preparación de anticuerpo policlonal comprende una mezcla de especificidades, y por lo tanto cualquier idiotipo único e individual de especificidad con reactividad cruzada se administrará a una concentración muy baja, reduciendo así de forma significativa la posibilidad de efectos secundarios dañinos debidos a la reactividad cruzada. En otras palabras, la posibilidad de efectos secundarios adversos debido a reactividad cruzada tisular indeseada se reduce en el reactivo de anticuerpo policlonal. Además, cualquier reactividad cruzada indeseada de la preparación de anticuerpo policlonal se puede eliminar mediante adsorción. Si un anticuerpo monoclonal da como resultado una reactividad cruzada indeseada, ésta es inherente al único anticuerpo presente, y por supuesto no se puede eliminar sin destruir la actividad de la preparación.

Además, por analogía con las propiedades de los anticuerpos policlonales en cuanto a la posibilidad disminuida de reactividad cruzada, los anticuerpos policlonales serán mucho menos propensos que los anticuerpos monoclonales a la inducción de una respuesta inmunitaria neutralizante anti-idiotipo, ya que cada idiotipo único específico de epítopo de la preparación administrada de anticuerpo policlonal está presente en una cantidad o concentración muy baja, que está por debajo del umbral de generación de una respuesta anti-idiotipo.

Algunas de las desventajas de usar anticuerpos policlonales convencionales en forma de IgG purificada de humanos hiperinmunizados (suministro limitado, producción cara) o de suero de animales normales (respuestas anti-xenoanticuerpo, choque anafiláctico) se pueden evitar mediante el uso de suero u otro material biológico de animales transgénicos para genes de inmunoglobulinas humanas. Así, tales animales se pueden inmunizar con alérgenos, y se pueden usar como fuente para aislar productos de anticuerpos policlonales específicos de alérgeno de secuencia completamente humana.

Los complejos inmunitarios de los recubrimientos nasales se eliminarán al tragar la secreción mucosa. Los complejos inmunitarios de las superficies mucosas de las vías respiratorias traqueales y bronquiales se expelerán hacia la boca, se mezclarán con saliva, se tragarán y se digerirán en el tracto gastrointestinal. Para conseguir mejores efectos en la adsorción y eliminación de moléculas alérgenas de los fluidos mucosos de las superficies mucosas y evitar la absorción del alérgeno complejado por las células epiteliales mucosas, el anticuerpo específico del alérgeno se puede conjugar con esqueletos poliméricos o microperlas que forman microesferas.

Así, la composición farmacéutica preparada según la invención se puede formular como una disolución, dispersión, polvo o en forma de microesferas.

Descripción detallada de la invención

La expresión "molécula de anticuerpo" describe la molécula proteica de anticuerpo única o sus fragmentos que contienen uno o más dominio(s) variable(s) de unión al antígeno y regiones constantes. Una molécula de anticuerpo normalmente es monoespecífica, pero también se puede describir como idioespecífica, heteroespecífica, poliespecífica o de especificidad indeseada. No puede ser inespecífica, excepto en el sentido de la unión no inmunoquímica. Las moléculas de anticuerpo se unen por medio de sitios de unión específicos a los determinantes antigénicos específicos o epítopos en los antígenos.

Colectivamente, los anticuerpos pueden existir como una población de moléculas en la que una fracción o todos los miembros son capaces de reaccionar con un determinante antigénico específico. Así, en el presente contexto, el término "anticuerpo" se refiere a composiciones/mezclas/poblaciones de moléculas de anticuerpo, tales como las que se hallan como componente funcional del anti-suero o inmunosuero derivado de mamíferos, o como se hallan en las composiciones de anticuerpos monoclonales o policlonales con funcionalidad similar preparadas a partir de fuentes humanas o animales o mediante técnicas recombinantes, que incluyen los animales transgénicos y la expresión en fagos, o mediante técnicas convencionales con hibridomas.

La expresión "anticuerpo policlonal" denota una mezcla de moléculas de anticuerpos diferentes que reaccionan con más de un determinante inmunógeno de un antígeno.

En el presente contexto, la expresión "anticuerpo policlonal" abarca anticuerpos policlonales recombinantes, así como una mezcla de anticuerpos monoclonales diferentes.

La expresión "anticuerpo policlonal recombinante" se refiere a un anticuerpo policlonal generado mediante el uso de técnicas recombinantes, y tales anticuerpos policlonales se denominan a continuación sinfocuerpos. Así, un sinfocuerpo contiene una elevada concentración de moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales todas o la mayoría exhiben una actividad de unión deseada hacia un antígeno compuesto de más de un epítopo.

Los sinfocuerpos se pueden generar mediante técnicas de ADN recombinante seguidas por la expresión en células eucarióticas, que incluyen células de levaduras, hongos, insectos, plantas o mamíferos, o en células procarióticas tales como bacterias, o expresados a partir de vectores virales, o por medio de terapia génica, o a partir de la expresión de transgenes en animales.

Preferiblemente, al menos un 85% de las moléculas de anticuerpo en la preparación de sinfocuerpos son específicas del objetivo, más preferiblemente al menos el 90% son específicas del objetivo, incluso más preferiblemente al menos el 95% son específicas del objetivo, y lo más preferiblemente todas las moléculas de anticuerpo de la preparación de sinfocuerpos son específicas del objetivo.

Mediante la expresión "una mezcla de anticuerpos monoclonales diferentes" se quiere decir una mezcla de dos o más anticuerpos monoclonales diferentes. La expresión "dos o más" en el presente contexto denota de 2 a 100, preferiblemente de 3 a 60, más preferiblemente de 5 a 40, y lo más preferiblemente de 10 a 25 anticuerpos monoclonales diferentes.

Se debe entender que las expresiones "un anticuerpo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo recombinante y una mezcla de anticuerpos monoclonales diferentes" también abarcan los fragmentos funcionales de los anticuerpos mencionados.

Un método preferido actualmente para preparar un anticuerpo policlonal recombinante es mediante la realización de bibliotecas de anticuerpos policlonales (PCAL), por ejemplo como se describe en el documento US 5.789.208 (de J. Sharon), que se incorpora aquí como referencia en su totalidad.

Más específicamente, el anticuerpo policlonal incluido en la composición farmacéutica se puede preparar inmunizando a un animal, preferiblemente un mamífero, con un alérgeno de elección, seguido del aislamiento de los linfocitos B productores del anticuerpo de la sangre, médula ósea, nódulos linfáticos o bazo. De forma alternativa, se pueden aislar las células productoras de anticuerpos de un animal y exponerlas a un alérgeno in vitro contra del cual se van a generar anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos se pueden cultivar después para obtener una población de células productoras de anticuerpos, opcionalmente tras la fusión con una línea celular inmortalizada, tal como un mieloma.

Más preferiblemente, se pueden aislar linfocitos B como material de partida del tejido de un paciente alérgico, para generar anticuerpos policlonales completamente humanos.

La presente composición se puede generar también mediante el uso de tejido adecuado procedente de ratones, ratas, cerdos, ovejas, material bovino, u otros animales transgénicos para los genes de inmunoglobulinas humanas, como material de partida para generar anticuerpos policlonales completamente humanos.

En particular, en el caso de ratones o de otros animales transgénicos para los genes de inmunoglobulinas humanas (p.ej. como se describe en el documento US 5.939.598), los animales se pueden inmunizar para estimular la generación in vivo de anticuerpos específicos y células productoras de anticuerpos antes de la preparación de la composición de anticuerpos policlonales del animal mediante la extracción de linfocitos B o mediante la purificación del suero policlonal.

Se puede preparar una biblioteca combinatoria a partir de linfocitos B inmunizados asociando V_{L} y V_{H} aleatoriamente en un vector de clonado. Así, el anticuerpo policlonal recombinante se genera en condiciones tales que los segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina se unen aleatoriamente para permitir la transferencia conjunta de los pares de genes de la cadena ligera y de la cadena pesada de la región variable de un vector al otro, a la vez que se permite el emparejamiento estable de los segmentos génicos de la cadena ligera y de la cadena pesada de la región variable de la inmunoglobulina específica, ya que están presentes tras la selección a partir de una biblioteca inicial de pares de segmentos génicos de la cadena ligera y de la cadena pesada de la región variable de la inmunoglobulina que codifican moléculas de anticuerpo capaces de reaccionar con, o unirse a, un alérgeno.

Se puede usar la PCR de célula única en un intento por mantener el emparejamiento nativo de V_{L} y V_{H} en la célula única. En este caso, los linfocitos B productores del anticuerpo, que se han aislado de animales o humanos, se pueden fijar con una disolución fijadora o una disolución que contiene un producto químico tal como formaldehído, glutaraldehído o similares. Las células se permeabilizan después con una disolución de permeabilización que comprende, por ejemplo, un detergente tal como Brij, Tween, polisorbato, Triton X-100, o similares. El proceso de fijación y permeabilización debería proporcionar una porosidad suficiente para permitir la entrada de enzimas, nucleótidos y otros reactivos a las células sin la destrucción indebida de los compartimentos celulares o de los ácidos nucleicos que se encuentran en ellos. La adición de enzimas y nucleótidos puede entrar entonces en las células para transcribir inversamente el ARNm celular de V_{H} y V_{L} a las secuencias de cADN correspon-
dientes.

La transcripción inversa se puede realizar en una única etapa, o de forma opcional junto con un procedimiento de PCR, mediante el uso de una transcriptasa inversa, cantidades suficientes de los cuatro dNTPs y los cebadores que se unen al ARNm, que proporcionan un grupo 3'-hidroxilo para que la transcriptasa inversa inicie la polimerización. Se puede usar cualquier cebador complementario al ARNm, pero se prefiere usar cebadores complementarios al extremo 3'-terminal de las moléculas V_{H} y V_{L} para facilitar la selección del ARNm de la región variable.

Tras la transcripción inversa, las secuencias de cADN resultantes se pueden amplificar mediante PCR con el uso de cebadores específicos para los genes de inmunoglobulinas y, en particular, para las regiones terminales de los ácidos nucleicos de V_{H} y V_{L}. Los procedimientos de PCR se pueden seguir como se describe en, p.ej., el documento US 4.683.195. Preferiblemente, los cADNs se amplifican mediante PCR y se unen en la misma reacción, mediante el uso de, además de los cebadores del cADN, un cebador para el extremo 5' del gen de la región de V_{H} y otro para el extremo 5' del gen de V_{L}. Estos cebadores también contienen colas complementarias de secuencia extra, para permitir el auto-ensamblaje de los genes de V_{H} y V_{L}. Tras la amplificación mediante PCR y la unión, la probabilidad de obtener productos mixtos, en otras palabras, regiones variables mixtas, es mínima porque las reacciones de amplificación y de unión se realizaron dentro de cada célula. El riesgo de mezcla se puede disminuir adicionalmente utilizando reactivos voluminosos, tales como nucleótidos marcados con digoxigenina, para asegurar adicionalmente que los pares de cADN de las regiones V no dejan el compartimento celular y se entremezclan, sino que permanecen dentro de la célula para la amplificación mediante PCR y la unión. Las secuencias amplificadas se unen mediante hibridación de secuencias terminales complementarias. Tras la unión, las secuencias se pueden recuperar de las células. Por ejemplo, tras la unión, las células se pueden lavar en una disolución de dodecilsulfato sódico (SDS). El SDS precipita las células tras incubación en hielo, y el sobrenadante se puede someter a electroforesis en un gel de agarosa o de acrilamida. De forma alternativa, o en combinación con el proceso con SDS, mediante el uso de un reactivo tal como nucleótidos unidos a digoxigenina, los productos de ADN sintetizados permanecerán dentro de la célula y serán amplificados. El producto unido se recupera tras electroforesis del sobrenadante.

Tras la electroforesis del sobrenadante, se extrae el trozo de gel que corresponde al peso molecular apropiado del producto unido y se aísla el ADN, por ejemplo, con esferas de sílice. El ADN recuperado se puede amplificar mediante PCR con el uso de cebadores terminales, si es necesario, y se puede clonar en vectores que pueden ser plásmidos, fagos, cósmidos, fagómidos, vectores virales o sus combinaciones. Se pueden incorporar sitios para enzimas de restricción convenientes en las secuencias hibridadas para facilitar el clonado. Estos vectores también se pueden guardar como una biblioteca de regiones variables unidas para su uso posterior.

Los genes de las regiones V_{H} y V_{L} unidos se pueden amplificar mediante PCR una segunda vez mediante el uso de cebadores anidados terminales, lo que produce una población de fragmentos de ADN que codifican las regiones genéticas de V_{H} y V_{L} unidas. La agrupación de las combinaciones de V_{H} y V_{L} es una ventaja de este proceso, y permite la transferencia en masa o en grupo de todos los clones y de todos los fragmentos de ADN durante éste y todos los procedimientos de clonado.

Preferiblemente, el anticuerpo policlonal recombinante se pude generar en condiciones tales que los segmentos génicos de la región variable de la cadena pesada y de la región variable de la cadena ligera de la inmunoglobulina se unen en una orientación cabeza-cabeza, para permitir la transferencia conjunta de los pares de cadena ligera y cadena pesada de la región variable desde un vector al otro, lo que incluye desde un fago a un vector, y lo que incluye desde la célula de origen a un fago o vector, lo que da como resultado un emparejamiento estable de segmentos génicos de la cadena ligera y de la cadena pesada de la región variable de la inmunoglobulina específica como se encuentran en la respuesta inmunitaria policlonal original del animal o del individuo humano.

A veces puede ser deseable tratar las secuencias génicas de la región variable con un agente mutágeno. Los agentes mutágenos crean mutaciones puntuales, huecos, deleciones o adiciones en la secuencia genética que pueden ser generales o específicas, o aleatorias o dirigidas a un sitio. Los agentes mutágenos útiles incluyen luz ultravioleta, radiación \gamma, productos químicos tales como bromuro de etidio, psoraleno y análogos de ácidos nucleicos, o enzimas modificadoras del ADN tales como enzimas de restricción, transferasas, ligasas y nucleasas y polimerasas específicas e inespecíficas. Además, puede ser factible usar cepas con elevada tasa de mutaciones. En particular se pueden introducir mutaciones aleatorias en las CDRs de los genes de las regiones V_{H} y V_{L} mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos. Las mutaciones introducidas en la secuencia génica incrementarán finalmente la complejidad y la diversidad de la biblioteca, así como la afinidad por el antígeno, lo que puede incrementar adicionalmente la utilidad de la biblioteca en el tratamiento. Además, tal mutagénesis se puede usar en un único par de V_{H} y V_{L} o en un grupo definido de tales pares para generar una biblioteca de novo.

El clonado se realiza, por ejemplo, escindiendo el cADN y las secuencias del vector con una enzima de restricción, si es necesario aislando ciertos fragmentos de ácidos nucleicos, mezclando los fragmentos en presencia de una ligasa en una disolución salina tamponada adecuada, e incubando la mezcla en condiciones enzimáticamente aceptables durante un periodo de tiempo prescrito. Mediante el uso de diferentes sitios de reconocimiento enzimático en cada extremo del cADN, se puede predeterminar la orientación del clonado.

Los vectores se transforman en células hospedadoras adecuadas, y los cultivos se amplifican para expandir las diferentes poblaciones de vectores que componen la biblioteca. Las células hospedadoras para los vectores procarióticos pueden ser un cultivo de bacterias tales como Escherichia coli. Las células hospedadoras para los vectores eucarióticos pueden ser un cultivo de células eucarióticas tales como cualquier línea celular de mamífero, insecto o levadura adaptada al cultivo tisular. Las células bacterianas se transforman con los vectores mediante cloruro cálcico-choque térmico o electroporación, aunque también serían aceptables otros muchos procedimientos de transformación. Las células eucarióticas se transfectan con precipitación con fosfato cálcico o electroporación, aunque también serían aceptables otros muchos procedimientos de transformación. Los fragmentos de ADN se pueden clonar en vectores de expresión de procariotas o de eucariotas, vectores híbridos o vectores dobles. El vector de expresión puede ser un plásmido, cósmido, fago, vector viral, fagómido y sus combinaciones, pero preferiblemente es un vector de expresión en fagos en el que el producto recombinante se expresa en la superficie del fago para facilitar el cribado y la selección. Se pueden colocar sitios transcripcionales y traduccionales útiles en el vector de expresión, que incluyen regiones de reconocimiento de la ARN polimerasa tales como un sitio de caja TATA, un sitio CAT, un potenciador, sitios apropiados de corte y empalme, si es necesario, una región terminal rica en AT y un sitio de iniciación de la transcripción. Los sitios útiles para facilitar la traducción incluyen los sitios de inicio y finalización traduccionales y los sitios de unión al ribosoma. Típicamente, algunos de los sitios más útiles para la expresión eucariótica eficaz, tales como la región promotora/potenciadora de SV40, CMV, HSV o baculovirus, derivan de virus. El anticuerpo recombinante resultante puede ser de las clases murinas IgG_{1}, IgG_{2a}, IgG_{2b}, IgM, IgA, IgD o IgE, las clases humanas IgG_{1}, IgG_{2}, IgG_{3}, IgG_{4}, IgM, IgA_{1}, IgA_{2}, IgD o IgE, o sus combinaciones o fragmentos. Preferiblemente, la biblioteca de anticuerpos híbridos está compuesta principalmente de anticuerpos IgG o de fragmentos de anticuerpos Fab.

La selección de un anticuerpo policlonal recombinante con una especificidad deseada se puede realizar, p.ej., mediante selección por afinidad (lavado) mediante el uso de una superficie revestida con alérgeno para unir las partículas de fago que exhiben una especificidad relevante de anticuerpo. La mayoría de los fagos de la biblioteca de fagos se eliminan mediante lavado, y las partículas de fago unidas se recuperan mediante condiciones más rigurosas (elución). Tras los procedimientos de selección, los pares de genes de anticuerpos de V_{L} y V_{H} en la biblioteca seleccionada de partículas de fagos se pueden subclonar en un vector diferente, diseñado para la expresión del anticuerpo policlonal recombinante en forma de una molécula de anticuerpo completa o de un fragmento suyo, tal como un fragmento Fab.

El uso de técnicas de ADN recombinante para generar un anticuerpo policlonal recombinante es una forma económicamente eficaz de generar anticuerpos, y la producción de preparaciones de anticuerpos policlonales bien caracterizados con especificidades deseadas superaría los problemas anteriores con los sueros de anticuerpos policlonales convencionales y los anticuerpos monoclonales individuales, y permitiría el uso de tales reactivos para la profilaxis o el tratamiento de la alergia o de trastornos alérgicos, p.ej. asma.

Composiciones farmacéuticas

En una realización preferida, la composición farmacéutica preparada según la invención es una composición destinada a administración/aplicación tópica a la mucosa, tal como la orofaringe, cavidad nasal, tracto respiratorio, tracto gastrointestinal, ojo tal como la mucosa conjuntiva, vagina, mucosa urogenital o para aplicación dérmica.

Un uso particularmente interesante de la composición farmacéutica es para la aplicación a la mucosa nasal, bronquial o pulmonar. Específicamente, el tratamiento tópico de la alergia mediante el uso de anticuerpos policlonales inhalados sería una aplicación particularmente útil de tales reactivos, lo que permitiría el descubrimiento y el desarrollo de nuevas modalidades terapéuticas o preventivas que son baratas de producir, inocuas y atóxicas, y dirigidas hacia una enfermedad que aflige a una gran proporción de la población humana.

Para obtener una administración óptima del anticuerpo policlonal en la cavidad pulmonar en particular, puede ser ventajoso añadir un tensoactivo tal como un fosfoglicérido, p.ej. fosfatidilcolina, y/o un complejo hidrófilo o hidrófobo de un excipiente cargado positiva o negativamente y un anticuerpo cargado de carga opuesta.

Otros excipientes adecuados para las composiciones farmacéuticas destinadas a la administración del anticuerpo policlonal a la mucosa del tracto respiratorio pueden ser del grupo que consiste en a) hidratos de carbono, p.ej., monosacáridos tales como fructosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, trehalosa, celobiosa y similares; ciclodextrinas, tales como 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina; y polisacáridos, tales como rafinosa, maltodextrinas, dextranos y similares; b) aminoácidos, tales como glicocola, arginina, ácido aspártico, ácido glutámico, cisteína, lisina y similares; c) sales orgánicas preparadas a partir de ácidos y bases orgánicas, tales como citrato sódico, ascorbato sódico, gluconato magnésico, gluconato sódico, hidrocloruro de trometamina y similares; d) péptidos y proteínas, tales como aspartamo, albúmina de suero humano, gelatina y similares; e) alditoles, tales como manitol, xilitol y similares, f) polímeros policatiónicos, tales como quitosano o una sal de quitosano o derivado.

A lo largo de los años, ciertos fármacos se han vendido en composiciones adecuadas para formar una dispersión del fármaco para inhalación oral (administración pulmonar) para tratar diversos trastornos en humanos. Tales composiciones de administración pulmonar de fármaco están diseñadas para ser administradas mediante inhalación por el paciente de la dispersión de fármaco, de forma que el fármaco activo de la dispersión puede alcanzar el pulmón.

La administración pulmonar de fármaco se puede conseguir mediante diferentes aproximaciones, que incluyen los nebulizadores de líquidos, los inhaladores de dosis medida basados en aerosoles (MDIs) y los dispositivos de dispersión de polvo seco. Los MDIs basados en clorofluorocarbonos (CFC) están perdiendo aceptación debido a su efecto adverso sobre el medio ambiente. Los dispositivos de dispersión de polvo seco, que no dependen de la tecnología de aerosoles con CFC, son prometedores para la administración de fármacos que se pueden formular fácilmente en forma de polvos secos. Muchas macromoléculas de otra manera lábiles se pueden almacenar de forma estable en forma de polvos liofilizados o secados por pulverización, solos o en combinación con vehículos adecuados en
polvo.

Muchas composiciones farmacéuticas, que incluyen anticuerpos, son bastante caras. Así, es crítica la capacidad para formular, procesar, empaquetar y distribuir de forma eficaz los polvos secos con una pérdida mínima de fármaco.

Un requisito importante para los dispositivos de administración de polvos manuales y de otros tipos es la eficacia. Es importante que la dosis administrada sea relativamente elevada para reducir el número de respiraciones necesarias para conseguir la dosis total. La capacidad para conseguir una dispersión adecuada y volúmenes dispersados pequeños es un desafío técnico significativo que requiere en parte que cada dosis unitaria de la composición en polvo sea dispersable fácilmente y de forma segura. Ciertos dispositivos de administración pulmonar, tales como los descritos en la pat. de EE.UU. nº 5.797.392, la pat. de EE.UU. nº 5.458.135 y la publicación de patente internacional WO96/09085 son útiles para la administración pulmonar de fármacos en forma de polvo seco. Otras formas de administración de la presente composición incluyen líquidos, geles, pomadas u otras formulaciones adecuadas para administración ocular, pulverizadores, aerosoles, polvos, u otras composiciones para la administración en la cavidad nasal, goma de mascar, pasta u otras composiciones para la cavidad oral, cremas, pomadas, lociones, geles u otras composiciones adecuadas para la aplicación en la piel, supositorios vaginales, geles u otras composiciones adecuadas para la aplicación en la mucosa vaginal o urogenital, o formuladas como cápsulas o comprimidos para la administración en el tracto digestivo. Para aplicación dérmica, el anticuerpo policlonal se puede formular de forma adecuada con uno o más de los siguientes excipientes: disolventes, agentes tamponadores, conservantes, humectantes, agentes quelantes, antioxidantes, estabilizantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensión, agentes formadores de geles, bases de pomada, potenciadores de la penetración, perfumes y agentes protectores de la piel.

Los ejemplos de disolventes son, p.ej., agua, alcoholes, aceites vegetales o marinos (p.ej. aceites comestibles tales como aceite de almendra, aceite de ricino, manteca de cacao, aceite de coco, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de linaza, aceite de oliva, aceite de palma, aceite de cacahuete, aceite de semilla de amapola, aceite de colza, aceite de sésamo, aceite de soja, aceite de girasol y aceite de semilla de té), aceites minerales, aceites grasos, parafina líquida, polietilenglicoles, propilenglicoles, glicerol, polialquilsiloxanos líquidos y sus mezclas.

Los ejemplos de agentes tamponadores son, p.ej., ácido cítrico, ácido acético, ácido tartárico, ácido láctico, ácido fosfórico, dietilamina, etc.

Los ejemplos adecuados de conservantes para el uso en las composiciones son los parabenos, tales como p-hidroxibenzoato de metilo, etilo, propilo, butilparabeno, isobutilparabeno, isopropilparabeno, sorbato potásico, ácido sórbico, ácido benzoico, benzoato de metilo, fenoxietanol, bronopol, bronidox, MDM hidantoína, butilcarbamato de yodopropinilo, EDTA, cloruro de benzalconio y alcohol bencílico, o mezclas de conservantes. Los ejemplos de humectantes son glicerina, propilenglicol, sorbitol, ácido láctico, urea y sus mezclas.

Los ejemplos de antioxidantes son butilhidroxianisol (BHA), ácido ascórbico y sus derivados, tocoferol y sus derivados, cisteína, y sus mezclas. Los ejemplos de agentes emulsionantes son las gomas naturales, p.ej. goma arábiga o goma de tragacanto; fosfatidatos naturales, p.ej. lecitina de soja; derivados de monooleato de sorbitán; lanolinas; alcoholes de lanolinas; ésteres de sorbitán; monoglicéridos; alcoholes grasos; ésteres de ácidos grasos (p.ej. triglicéridos de ácidos grasos); y sus mezclas.

Los ejemplos de agentes de suspensión son, p.ej., celulosas y derivados de celulosa tales como, p.ej., carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carragenano, goma de acacia, goma arábiga, tragacanto y sus mezclas.

Los ejemplos de bases de gel, agentes incrementadores de la viscosidad o componentes que son capaces de absorber el exudado de una herida son: parafina líquida, polietileno, ácidos grasos, sílice o aluminio coloidal, jabones de cinc, glicerol, propilenglicol, tragacanto, polímeros de carboxivinilo, silicatos de magnesio-aluminio, Carbopol®, polímeros hidrófilos tales como, p.ej., derivados de almidón o celulosa tales como, p.ej., carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa y otros derivados de celulosa, hidrocoloides hinchables con agua, carragenanos, hialuronatos (p.ej. gel de hialuronato que contiene opcionalmente cloruro sódico), y alginatos que incluyen alginato de propilenglicol.

Los ejemplos de bases de pomada son, p.ej., cera de abeja, parafina, cetanol, palmitato de cetilo, aceites vegetales, ésteres de sorbitán de ácidos grasos (Span), polietilenglicoles, y productos de condensación entre ésteres de sorbitán de ácidos grasos y óxido de etileno, p.ej. monooleato de sorbitán polioxietilenado (Tween).

Los ejemplos de bases de pomada hidrófoba o emulsionante con agua son las parafinas, aceites vegetales, aceites animales, glicéridos sintéticos, ceras, lanolina y polialquilsiloxanos líquidos. Los ejemplos de bases de pomada hidrófila son los macrogoles sólidos (polietilenglicoles). Otros ejemplos de bases de pomada son los jabones de trietanolamina, alcoholes grasos sulfatados y polisorbatos.

Los ejemplos de otros excipientes son polímeros tales como carmelosa, carmelosa sódica, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, pectina, goma de xantano, goma garrofín, goma arábiga, gelatina, carbómero, emulsificantes como vitamina E, estearatos de glicerol, glucósido de cetilo, colágeno, carragenano, hialuronatos y alginatos y quitosanos.

Normalmente, se prefiere obtener un efecto local para el anticuerpo policlonal. La eliminación, y por lo tanto la actividad, se pueden controlar y prolongar sustancialmente mediante composiciones farmacéuticas tales como microesferas, liposomas, complejos de excipientes cargados positiva o negativamente con moléculas de anticuerpo de carga opuesta.

Usos terapéuticos de los anticuerpos policlonales

En una realización preferida, el sinfocuerpo incluido en la presente composición es uno que reacciona con/se une a un alérgeno inhalado, que incluye los alérgenos conjuntivos y nasofaríngeos, así como los alérgenos que entran en el tracto respiratorio, o que entran de otra forma en el organismo. La inhalación preventiva o terapéutica de anticuerpos policlonales, p.ej. sinfocuerpos, dirigidos contra los alérgenos inhalados comunes se dirige directamente a eliminar la causa de la alergia ayudando al bloqueo, la neutralización y la eliminación del tracto respiratorio del agente causal alérgico antes de que se origine la sensibilización alérgica.

Así, la invención permite la posibilidad de neutralizar el efecto de la inhalación del alérgeno por medio de inhalaciones del anticuerpo policlonal, bloqueando los epítopos del alérgeno disponibles de otra forma para la unión a moléculas de IgE. Además, se predice que la unión de anticuerpos policlonales ejerce un efecto de eliminación sobre los alérgenos interviniendo en la fagocitosis y en la degradación de los alérgenos sin la inducción de respuestas alérgicas, así como facilitando la eliminación hacia la parte superior del tracto respiratorio hacia la faringe del alérgeno atrapado en inmunocomplejos con IgA o IgG junto con la mucosidad de las mucosas, y la ingestión posterior hacia el tracto digestivo.

Finalmente, se realiza la hipótesis de que la administración mucosa de anticuerpo policlonal específico de alérgeno, p.ej. sinfocuerpo del isotipo IgG o IgA, que son bloqueantes con respecto a la unión de la IgE específica del alérgeno, inhibe la presentación del antígeno mediada por IgE a los linfocitos T, que puede inducir la respuesta de los linfocitos T predominantemente de tipo T_{H}2 hacia los alérgenos, que en los individuos alérgicos se cree que perpetúa la alergia. Sin embargo, la presencia de anticuerpos policlonales bloqueantes específicos del alérgeno, p.ej., sinfocuerpos, puede dar como resultado la presentación de antígenos mediada por IgG o IgA a las células T, lo cual a su vez puede promover de forma preferente una respuesta de linfocitos T de tipo T_{H}1 hacia los alérgenos, interrumpiendo así el círculo vicioso de la reacción inflamatoria alérgica.

Los epítopos de alérgeno, p.ej. de polen, derivan de varias proteínas, y así, para que un anticuerpo inhalado único pueda funcionar, será necesario que contenga varias, si no muchas, especificidades idiotípicas/reactividades antigénicas individuales. A este respecto, los anticuerpos policlonales parecen muy superiores a los anticuerpos monoclonales.

Por lo tanto, se pueden usar las composiciones de anticuerpos policlonales para la profilaxis o el tratamiento de todos los tipos de alergia, que incluyen la rinitis alérgica, fiebre del heno, conjuntivitis alérgica y asma alérgica (extrínseca), así como la alergia alimentaria. En particular, pero sin limitarse, el anticuerpo policlonal para el uso en la presente invención es uno que reacciona con/se une a un alérgeno de: los ácaros del polvo doméstico (p.ej. Dermatophagoides farinae o D. pteronyssimus); caspa de gato, perro o caballo; pólenes de árbol de abedul (Betula alba), aliso, avellano, roble, sauce, plátano, haya, olmo, arce, fresno y carpe; pólenes de hierba de fleo de los prados (Phleum pratense), poa de los prados (Poa pratense), ballico (Lolium perenne), dáctilo apelotonado (Dactylis glomerata), ambrosía (p.ej. Ambrosia artemisiifolia), grama de olor (Anthoxanthum odoratum), y centeno (Secale cereale); u hongos (p.ej. Alternaria, Aspergillus, Cladosporium, y Penicillium). Además, los anticuerpos policlonales específicos de alérgeno, p.ej. sinfocuerpos, se pueden usar para tratar alergias contra otros agentes, tales como alérgenos alimentarios (p.ej. cacahuetes y otros frutos, crustáceos, huevo, leche, maíz) o alérgenos de veneno de abeja. Muchos de estos alérgenos se pueden adquirir en forma de proteínas bien caracterizadas de proveedores comerciales.

La dosis de anticuerpo policlonal necesaria en humanos para que sea eficaz en el tratamiento o la prevención de la alergia varía con el tipo y gravedad del trastorno alérgico a tratar, el tipo de alérgeno, la edad y el estado del paciente, etc. Las dosis típicas de anticuerpo policlonal a administrar están en el intervalo de 1 \mug a 1 g, preferiblemente 1-1000 \mug, más preferiblemente 2-500, incluso más preferiblemente 5-50, lo más preferiblemente 10-20 \mug por forma farmacéutica unitaria.

Experimental

La presente invención se describe con detalle en los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de la invención como se reivindica.

Inmunización de ratones para la generación de bibliotecas de sinfocuerpos

Se inmunizan ratones BALB/c de forma subcutánea (s.c.) o intraperitoneal (i.p.) con, p.ej., 1 mg de proteína alérgena en adyuvante completo de Freund. La inmunización se realiza mediante el uso de proteína de alérgeno recombinante (p.ej. Der p 1) o extractos de alérgenos nativos. Las inmunizaciones posteriores se administran a intervalos de dos a tres semanas y en adyuvante incompleto de Freund. Se toman los bazos y/o la médula ósea 3 días tras la última inmunización y se usan para la preparación de la biblioteca de sinfocuerpos, como se describió en el documento US 5.789.208.

Generación de bibliotecas de sinfocuerpos a partir de material de pacientes alérgicos

Se preparan las bibliotecas de sinfocuerpos a partir de muestras de sangre o de médula ósea tomadas de pacientes alérgicos caracterizados por antecedentes de casos positivos, pruebas de punción cutánea, ensayo radioalergosorbente (RAST), o reactividad de los sueros de los pacientes con extractos de alérgeno mediante inmunotransferencia con IgG o IgE, o reactividad hacia alérgenos recombinantes purificados (p.ej. alérgenos de polen o alérgenos de animales).

La unión de anticuerpos al alérgeno se detecta mediante ELISA

Se revisten entre 50 y 1000 ng de alérgeno, alérgeno desintegrado, o alérgeno recombinante por pocillo de placas de microtitulación de 96 pocillos Nunc Maxisorp. Después de lavar en PBS que contiene gelatina o BSA y además Tween-20, los pocillos se bloquean 1 hora a 37ºC mediante el uso de gelatina o BSA. Posteriormente, los pocillos se lavan y se incuban con anticuerpos policlonales, p.ej. sinfocuerpos, IgE, IgG murinos o humanos derivados de suero o de lavados broncoalveolares (LBA). Tras rondas repetidas de lavado, el anticuerpo unido se detecta mediante incubaciones sucesivas de inmunoglobulina secundaria anti-ratón o anti-humano biotinilada según sea apropiado, seguido de AP-avidina, y sustrato de pNPP. Los anticuerpos monoclonales específicos de alérgeno previamente caracterizados se usan como control positivo, y los anticuerpos monoclonales y policlonales con especificidades diferentes y no relacionadas se usan como controles negativos.

En algunos experimentos, las incubaciones con anticuerpos policlonales van precedidas de incubaciones con anticuerpos monoclonales bien caracterizados en un ELISA competitivo.

Inhibición con anticuerpos policlonales de la unión de IgE derivada de pacientes a alérgenos

Se estudia la unión de IgE derivada de pacientes a extractos de alérgenos en ELISA competitivo (similar al protocolo anterior con las siguientes modificaciones) para la unión de IgE o mediante SDS-PAGE preparativa y transferencia de Western. Después del revestimiento del pocillo de ELISA o de la electroforesis mediante el uso de alérgeno, alérgeno desintegrado o alérgeno recombinante, la superficie revestida de alérgeno se bloquea con gelatina o BSA, antes de incubación de 3-4 horas a 4ºC con anticuerpos policlonales específicos del alérgeno. Posteriormente, las muestras se incuban 3-4 horas a 4ºC con sueros de pacientes o IgE de LBA diluida 1:5, y los anticuerpos IgE humanos unidos se detectan con, p.ej., anticuerpos anti-IgE humana marcados con ^{125}I (RAST; Pharmacia) y se visualizan mediante autorradiografía. La unión de IgG de ratón se detecta como se describió anteriormente.

Caracterización de la reactividad de los anticuerpos policlonales con extractos de alérgeno mediante electroforesis y transferencia de Western

Los extractos de alérgeno se separan mediante SDS-PAGE y se inmunotransfieren a tiras de nitrocelulosa antes de la incubación con la preparación de anticuerpo (sueros de pacientes, sueros de ratón, anticuerpos policlonales, p.ej. sinfocuerpos, o anticuerpos monoclonales de control). En algunos experimentos se examina la reactividad cruzada de los anticuerpos policlonales generados contra un alérgeno mediante ensayo en ELISA o transferencia de Western contra un panel de alérgenos homólogos.

Inhibición de la liberación de histamina inducida por el alérgeno de granulocitos basófilos humanos tras la preincubación de los alérgenos con anticuerpos policlonales

Se obtienen muestras de sangre heparinizada de pacientes alérgicos y se aislan los granulocitos mediante sedimentación con dextrano. Los alérgenos recombinantes, alérgenos desintegrados o extractos de alérgenos se preincuban con anticuerpos policlonales específicos de alérgeno, p.ej. sinfocuerpos, o anticuerpos de control o tampón sólo, durante 1 h a temperatura ambiente antes de la incubación a diferentes concentraciones (1, 0,1, 0,01 y 0,001 \mug/ml) con granulocitos desintegrados en tampón de liberación de histamina (PIPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 110 mM, KCl 5 mM, CaCl_{2} 1 mM, 1 g/L de glucosa, 0,3 mg/ml de albúmina de suero humano). La liberación de histamina en el sobrenadante exento de células se determina mediante radioinmunoanálisis, y se expresa como un porcentaje de la liberación total de histamina tras la lisis celular.

Inhibición con anticuerpos policlonales de la inflamación alérgica en un modelo de alergia en ratón

Se sensibilizan ratones (p.ej. ratones BALB/c) a alérgenos (p.ej. alérgeno de ambrosía) mediante dos o más inyecciones i.p. de alérgeno (p.ej. 150 microgramos) y alumbre, p.ej., en los días 0 y 4. En el día 11, p.ej., y en un periodo de tiempo de dos a cuatro semanas, se realiza una exposición a alérgeno intratraqueal o intranasal en los ratones anestesiados, los cuales se analizan después como se describe más adelante. En algunos experimentos se usa un modelo en ratón basado en la sensibilización con ovoalbúmina (OVA). Brevemente, se inyecta a los ratones BALB/c i.p., p.ej., 5-100 \mug de OVA (albúmina de huevo de gallina de grado V, Sigma) en 2 mg de adyuvante de hidróxido de aluminio (alumbre, Pierce) en el día 1 y en el día 14, antes de la exposición en los días del protocolo 28, 29 y 30 con un 1% de OVA en PBS pulverizado durante 20 minutos mediante el uso de un nebulizador ultrasónico (DeVilbiss Somerset, PA, EE.UU.) o 5-100 \mug de OVA en 40 \muL de PBS inyectado de forma intratraqueal en los ratones anestesiados. Los ratones de control reciben la misma cantidad de PBS.

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En el día 32, 24 horas después de la exposición al antígeno, se somete a 12 ratones a un ensayo de sensibilidad de las vías respiratorias y se sacrifican en el día 33. Se usaron 8 ratones en el grupo de control.

Se liga el pulmón izquierdo y se obtiene un LBA del pulmón derecho mediante 5 lavados repetidos con 200 \mul de PBS. El pulmón izquierdo se fija y se incrusta en parafina para realizar la histología del pulmón. También se toma una muestra de sangre (sangre de la cola) de cada ratón y se almacena a -80ºC hasta que se realiza el análisis.

En los experimentos en los que se examina la capacidad de los anticuerpos policlonales específicos de alérgeno, p.ej. sinfocuerpos, para inhibir la inflamación alérgica, la preparación de anticuerpos policlonales específicos del alérgeno en dosis que varían de 1 \mug a 1 mg se administra antes, durante o después de la administración de la dosis de exposición de antígeno.

Se usaron anticuerpos policlonales con especificidades diferentes o no relacionadas y también PBS como control negativo, y en algunos experimentos se compara el efecto con un anticuerpo monoclonal específico del alérgeno como control positivo.

Evaluación de la eficacia de los anticuerpos policlonales para bloquear la respuesta alérgica en el modelo de alergia murina

Tras la finalización de la exposición al alérgeno, la reacción alérgica se estudia realizando un lavado bronquial (LBA) en ratones sacrificados, y el líquido de LBA se examina mediante recuento diferencial del contenido de eosinófilos, neutrófilos, linfocitos y macrófagos.

Los lóbulos inferior y superior del pulmón izquierdo se recogen y se fijan en disolución de Carnoy (6x de etanol; 3x de ácido acético glacial; 1x cloroformo) a 20ºC durante \sim15 horas. Después de incrustar en parafina los tejidos se cortan en secciones de 4-5 \mum. De cada ratón, se estudian 10 secciones distribuidas aleatoriamente de las vías respiratorias en cuanto a la gravedad de la inflamación celular y de la oclusión mucosa. El infiltrado celular de las áreas peribronquiales y perivasculares se estudia de forma semicuantitativa en cuanto a la presencia de leucocitos (eosinófilos, linfocitos), y se cuantifica en una escala de 0-5 con un incremento de 0,5. Se asigna un índice a la oclusión mucosa de la luz bronquial mediante el uso de las siguientes medidas: 0, 0-10% de oclusión; 1, 10-30% de oclusión; 2, 30-60% de oclusión; 3, 60-90% de oclusión; 4, 90-100% de oclusión. La lesión del epitelio de las vías respiratorias se estima además en una escala equivalente. Todas las determinaciones las realizan individuos que desconocen el diseño del protocolo, y los resultados se registran fotográficamente. Los cortes de tejido se tiñen con hematoxilina y eosina para la tinción celular, o hematoxilina y ácido peryódico-Schiff para la tinción de la mucosidad.

Las concentraciones totales y de IgE, IgG, IgG_{1}, IgG_{2a} e IgG_{3} específicas de OVA en la sangre de los ratones se determinan mediante ELISA como se describió anteriormente.

Claims (13)

1. El uso de un anticuerpo policlonal específico de alérgeno, el cual es capaz de reaccionar con, o unirse a, más de un determinante inmunógeno en un alérgeno que provoca alergia o un trastorno alérgico, por lo que se evita que dicho alérgeno reaccione con, o se una a, una IgE específica del alérgeno, para la fabricación de una composición farmacéutica para la profilaxis o el tratamiento de la alergia.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que la composición farmacéutica es para la inducción profiláctica o terapéutica de tolerancia hacia el alérgeno.

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo policlonal es una mezcla de anticuerpos recombinantes diferentes.

4. El uso según la reivindicación 3, en el que el anticuerpo policlonal recombinante se genera mediante tecnología de exposición en fagos.

5. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que el anticuerpo policlonal es una mezcla de anticuerpos monoclonales diferentes.

6. El uso según la reivindicación 5, en el que los anticuerpos monoclonales se generan mediante tecnología de hibridomas.

7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que la composición está exenta del alérgeno con el cual el anticuerpo es reactivo o se une.

8. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la composición comprende al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable capaz de efectuar la aplicación tópica de dicho anticuerpo policlonal.

9. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que la composición se destina a la administración tópica a la orofaringe, cavidad nasal, tracto respiratorio, tracto gastrointestinal, mucosa conjuntiva, vagina, mucosa urogenital, o para aplicación dérmica.

10. El uso según la reivindicación 9, en el que el tracto respiratorio comprende la mucosa nasal, oral, faríngea, bronquial o alveolar.

11. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que la composición se proporciona en forma de una disolución, dispersión, polvo o en forma de microesferas.

12. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en el que el anticuerpo policlonal está incluido en la composición en una cantidad en el intervalo de 1 \mug a 1 g, preferiblemente 1-1000 \mug, más preferiblemente 2-500 \mug, aún más preferiblemente 5-50 \mug, lo más preferiblemente 10-20 \mug por forma farmacéutica unitaria.

13. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que el alérgeno es un alérgeno de ácaros del polvo doméstico, p.ej. Dermatophagoides farinae o D. pteronyssimus; caspa de gato, perro o caballo; polen de árbol, p.ej. polen de abedul (Betula alba), aliso, avellano, roble, sauce, plátano, haya, olmo, arce, fresno, artemisa (Artemisia) y carpe; polen de hierba, p.ej. polen de fleo de los prados (Phleum pratense), poa de los prados (Poa pratense), ballico (Lolium perenne), dáctilo apelotonado (Dactylis glomerata), ambrosía (Ambrosia artemisiifolia), grama de olor (Anthoxanthum odoratum) y centeno (Secale cereale); u hongos (p.ej. Alternaria, Aspergillus, Cladosporium y Penicillium).