KR20030022134A - 알레르기를 치료하기 위한 재조합 폴리클로날 항체 또는정제된 폴리클로날 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알레르기를 치료하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 활성 성분으로서 재조합 폴리클로날 항체 또는 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 알레르기원과 반응할 수 있거나 알레르기원에 결합할 수 있는 사이한 모노클로날 항체들의 혼합물을 포함한다. 상기 조성물은 용액, 분산제, 분말로서 또는 미소구체의 형태로 국소적으로 사용될 수 있다. 폴리클로날 항체는 바람직하게는 파아지 디스플레이 기술에 의해 생성된 재조합 폴리클로날 항체이다. 본래의 폴리클로날 면역 반응으로부터 유지되거나 상기 알레르기원을 사용하여 패닝에 의해 선택되는 특이적인 면역글로불린 가변 영역 경쇄 및 중쇄의 페어링은 바람직하게는 발현 벡터내로의 상기 쌍의 벌크 트랜스퍼에 의해 유지된다. 상기 알레르기원은 집먼지 진드기, 예컨대, 더마토파고이데스 파리내(Dermatophagoides farinae) 또는 더마토파고이데스 프테로니시무스(D. pteronyssimus); 고양이, 개 또는 말로부터의 비듬; 수목화분, 예컨대 자작나무 베툴라 알바(Betula alba), 오리나무, 개암나무, 버드나무, 버즘나무, 너도밤나무, 느릅나무, 단풍나무, 물푸레나무 및 서나무로부터의 화분; 목초화분, 예컨대 큰조아재비 플레움 프라텐세(Phleum pratense), 새포아풀 포아 프라텐세(Poa pratense), 호밀풀 롤리움 페레네(Lolium perenne), 오차드 그래스 닥틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata), 두드러기쑥 암브로시아 아르테미시폴리아(Ambrosia artemisiifolia), 향기풀 안톡산툼 오도라툼(anthoxanthum odoratum) 및 호밀 세칼레 세레알레(Secale cereale)로부터의 화분, 또는 진균 (예컨대, 알테르나리아 (Alternaria), 아르페르길루스(Aspergillus), 클라도스포리움(Cladosporium) 및 페니실리움(Penicillium))일 수 있다.

Description

알레르기를 치료하기 위한 재조합 폴리클로날 항체 또는 정제된 폴리클로날 항체{RECOMBINANT OR PURIFIED POLYCLONAL ANTIBODIES FOR TREATING ALLERGY}

체액성 면역의 보호적 효과는 항체로 불리는 구조적으로 연관된 당단백질의 패밀리에 의해 매개되는 것으로 공지되어 있다. 항체는 항원과 결합함으로써 이들의 생물학적 활성을 개시한다. 항원과 결합하는 항체는 일반적으로 하나의 항원에 특이적이고 상기 결합은 대개 친화도가 높다. 항체는 B-림프구에 의해 생성된다. 혈액은 많은 상이한 항체들을 포함하고 있고, 각 항체는 B-세포의 클론으로부터 유래되며 항원에 대해 독특한 구조 및 특이성을 가진다. 항체는 B-림프구의 표면상에, 혈장내에, 조직의 간질성 유체내에 및 타액 및 점액성 표면상의 점액과 같은 분비성 유체내에 존재한다.

모든 항체는 이들의 전반적인 구조에서 유사한데, 이는 전하 및 용해도와 같은 물리화학적 특징에서의 특정 유사도를 설명해준다. 모든 항체는 2개의 동일한경쇄, 각각 약 24 킬로달톤, 및 각각 약 55 내지 70 킬로달톤의 2개의 동일한 중쇄로 이루어진 공통적인 코어 구조를 가지고 있다. 하나의 경쇄는 각 중쇄에 결합하고 2개의 중쇄는 서로 결합되어 있다. 경쇄 및 중쇄 둘 모두는 면역글로불린(Ig) 도메인이라 불리는 공통의 구형 모티프에서 독립적으로 폴딩되어 있는 길이가 각각 약 110개 아미노산 잔기로 이루어진 일련의 반복하는 상동성 유닛을 함유한다. 2개의 중쇄의 결합에 의해 형서된 항체 분자의 영역은 소수성이다. 항체는 불리한 물리적 또는 화학적 조건하에서 경쇄가 중쇄에 결합하고 있는 부위에서 절단되는 것으로 공지되었다. 항체가 수많은 시스테인 잔기를 함유하고 있기 때문에, 이들은 많은 시스테인-시스테인 디설피드 결합을 가지고 있다. 모든 Ig 도메인들은 3가닥 또는 4가닥의 역평행 폴리펩티드 사슬을 가진 2개 층의 베타-플리트 쉬트를 함유한다.

이들의 전체적인 유사도에도 불구하고, 항체 분자는 크기, 전하 및 용해도와 같은 물리화학적 특징, 및 항원과 결합시에 이들의 작용에 기초하여 명료한 클래스 및 서브클래스로 구분될 수 있다. 사람의 경우, 항체 분자의 클래스들은 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이다. 각 클래스의 구성원은 동일한 이소타입이라 부른다. IgA 및 IgG 이소타입은 IgA₁, IgA₂및 IgG₁, IgG₂, IgG₃및 IgG₄라 불리는 서브타입으로 추가로 하위분류된다. 이소타입에서 모든 항체 분자의 중쇄는 기다란 영역의 아미노산 서열 동일성을 공유하지만, 다른 이소타입 또는 서브타입에 속하는 항체와는 다르다. 중쇄는 항체 분자의 전체 이소타입에 상응하는 그리스 알파벳의 문자에 의해 지정되며, 예컨대, IgA는 α와 같고, IgD는 δ와 같고, IgE는 ε과 같고, IgG는 γ와 같고, IgM은 μ 중쇄와 같다. IgG, IgE 및 IgD는 단량체로서 순환한다. 체강의 점막 라이닝내로 상피를 통해 분비되는 IgA 분자는 동형이량체인 반면 IgM 분자는 5량체이다. 순환하는 IgA는 주로 단량체로서 존재한다. 다량체 형태의 IgA 및 IgM 둘 모두는 소위 J 사슬에 의해 안정화된다. 분비된 IgA(S-IgA)는 고유층에 존재하는 B 세포에 의해 생성되어 폴리-면역글로불린 수용체(pIgR)를 통해 기저측면상의 상피 세포에 의해 취해져서 상피 세포를 통해 운반되어 관내측면상의 점막내로 분비된다. IgA:J 사슬:pIgR 복합체가 방출되는 경우, pIgR은 프로테아제에 의해 절단되고 분비 성분(SC)이라 불리는 pIgR 분자의 일부분은 IgA:J 사슬 복합체에 결합된 채로 남아있다. 따라서, S-IgA는 IgA, J 사슬 및 SC로 구성된 복합체이며, 나중의 2가지는 디설피는 결합을 통해 IgA 분자에 공유결합되어 있다. S-IgA는 예컨대 호흡기 또는 위장관의 상피 점막의 단백질 가수분해 환경에 대해 높은 내성이 있으며, 이렇게 하여 이들 부위에 일차적인 특이적 면역계를 구성한다. 이것은 S-IgA가 면역조절 효과를 가지고 있고 이들이 결합하는 항원에 대해 내성을 유도할 수 있음을 입증한다.

모든 개체에는 10⁸내지 10¹⁰개의 구조적으로 상이한 항체 분자가 존재하며, 각각은 이들의 항원 결합 부위에 독특한 아미노산 서열을 가지고 있다. 항체에서 서열 다양성은 더욱 보존된 불변(C) 영역과 구별하기 위해 가변(V) 영역으로 불리는 중쇄 및 경쇄의 아미노 말단 도메인내에 3개의 짧은 스크레치에서 우세하게 발견된다.

면역글로불린 E(IgE)는 알레르기성 비염, 알레르기 결막염, 고초열, 알레르기성(외인성) 천식, 벌 독 알레르기 및 식품 알레르기와 같은 보편적인 질병으로서 나타나는 소위 타입 1 과민반응의 원인이다. 알레르기원-특이적 IgE는 IgE-매개된 알레르기에 걸린 환자에서 과량으로 생성된다. IgE는 혈액중에서 순환하고 혈액중의 호염구 및 비만 세포, 다양한 조직, 또는 점막 표면상에서 IgE에 대한 고친화도 Fc 수용체에 결합한다. 대부분의 알레르기 반응에서, 알레르기원은 흡입, 섭취 또는 피부를 통해 환자의 체내로 들어간다. 알레르기원 분자는 비만 세포 및 호염구의 표면상의 고친화도 수용체 FcεRI에 이미 결합된 예비형성된 IgE에 결합하여, 수개의 IgE 분자의 가교를 야기시키고 히스타민 및 기타 염증성 매개체의 방출을 촉진시켜 다양한 알레르기 증상을 일으킨다.

국소적 IgE-매개된 알레르기 반응을 일으키기 쉬운 조직에는 결막, 비강 또는 구강인두의 점막(알레르기성 비염), 기관지의 점막 라이닝 및 위장관 점막이 있다. 따라서, 알레르기원은 흡입을 통해 호흡기로 들어가서 코 라이닝의 점막 표면 또는 호흡기의 기관지 통로상에 트래핑된다. 공기매개 알레르기원은 또한 눈과 귀의 습한 표면과 접촉하여 점막상에 보유된다. 점막 조직에는 비만 세포가 밀집되어 있고 따라서 이 부위에 도달한 알레르기원은 IgE에 결합하여 비만 세포를 활성화시킬 수 있다.

알레르기의 처리에 있어서 치료학적 원리 및 치료 형태는 사실상 최근에 변화되지 않고 있다. 면역 활성을 억제하기 위한 스테로이드 및 천식 증상을 경감시키기 위한 기관지 확장제와 같은 면역억제 약물은 알레르기성 천식에 걸린 환자에 대한 오랫동안 주요한 치료 형태였다. 탈감작 면역요법은 심각한 호나자를 위한 가장 중요한 신규 치료법이지만, 의학적 발전은 알레르기성 물질의 분류를 세분하고, 진단 방법을 개선하고, 면역요법을 위해 더욱 양호하게 제어되고 더욱 폭넓은 알레르기원 추출물의 라이브러리를 제공하는데 제한되었다. 연구와 관련하여, 진척은 알레르기원 물질의 주요한 알레르기원 성분을 확인하고 단리하는 것이다. 예를 들어, 돼지풀, 집 먼지 진드기, 및 고양이 및 개 비듬 및 타액의 주요 알레르기 성분이 확인된다. 알레르기원 입자, 예컨대, 큰조아재비 화분이 기도 점막에 도달하는 경우, 이들은 주요 알레르기 성분 및 소수 알레르기 성분내로 해체된다.

항체는 수많은 임상학적 치료를 위해 제안되고 있다: 메드임뮨 인크.(MedImmune Inc.)는 사람화된 안티-호흡기 신시티움 바이러스(RSV) 모노클로날 항체의 용도를 연구하고 있고 사람 공여 혈액으로부터 단리되어 RSV 감염을 치료하기 위해 사용되는 폴리클로날 안티-RSV 사람 면역글로불린 생성물(RespiGam)을 판매하고 있다. 메드임뮨은 또한 CMV 감염의 치료를 위한 안티-CMV(사이코메갈로바이러스) 사람 면역글로불린인 CytoGam을 판매하고 있다. IDEC와 진엔테크(Genentech)는 공동으로 재발성이거나 불응성인 저등급 비호지킨 림프종의 치료를 위해 성숙한 B 세포 및 대부분의 비호지킨 림프종 종양상에서 발견되는 CD20 항원을 표적으로하는 키메라 마우스-사람 모노클로날 항체(Rituxi-mab)에 대한 임상학적 시도를 수행중이다. 갈라젠(GalaGen)은 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficle) 항생제 관련 설사의 치료를 위한 소 폴리클로날면역글로불린(Diffistat-G)의 사용을 연구중이다. 스미스클라인 비참(SmithKline Beecham) 및 쉐링-플라우(Schering-Plough)는 안티-IL-5 모노클로날 항체를 개발중인데 이것은 호산구성 염증 및 기도 수축을 방지하는 것으로 임상학적 시도에서 나타났다. 안티-IgE 모노클로날 항체는 "스위치-오프" 알레르기에 대해 진엔테크에 의해 개발중이다. 사람 고친화도 IgE 수용체(FcεRI)상의 독특한 에피토프에 대해 특이적인 사람화된 키메라 IgG₁모노클로날 항체인 항체 Rhu-Mab-E25는 주입에 의한 최초 투여후에 유리 IgE 레벨을 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 흡입된 알레르기원에 대한 초기 및 후기 반응 둘 모두는 다중 주입후에 약독화된다. 치료학적으로 사용된 항체의 예에는 분무되는 IgG(Sandoz)(이는 RSV에 대해 비내적으로 사용된다); HNK20(Oravax), 안티-RSV IgA; 및 4B9(Bristol Myers-Squibb), 안티-그룹 B 스트렙토코쿠스 IgM 모노클로날 항체가 포함된다. 그 밖의 치료학적으로 유용한 모노클로날 항체에는 모노클로날 안티-CD4 항체, 안티-IL-2 항체 및 안티 IL-4 항체가 포함된다.

IgG의 소입자 에어로졸을 사용하는 RSV 감염에 대한 면역요법은 피아자(Piazza) 등의 문헌[참조: J. Infect. Dis., Vol. 166, pp. 1422-1424, 1992]에 기재되어 있다. 이 연구에서 IgG의 에어로졸화된 5% 용액에 15분 노출시키는 것은 폐 바이러스의 50배 감소를 초래하는 것으로 밝혀졌다. 브라운(Brown)은 문헌(참조: Aerosol Science and Technology, Vol. 24, pp. 45-56, 1996)에 호흡기 염증성 질환 또는 알레르기원-유도된 천식성 반응을 둔화시키기 위한 사이토카인의 억제제 또는 길항제로서 항체를 사용하는 방법을 기술하였다. 또한 급성 바이러스성 또는 세균성 호흡기 감염의 치료를 위한 병원균-특이적 항체의 국소적 호흡기 전달이 언급되어 있다.

항체 리포솜, 즉, 면역리포솜은 마루야마(Maruyama) 등의 문헌[참조: Biochim. Biophys. Acta, Vol. 1234, pp. 74-80, 1995]에 기재되어 있다. 항체로 리포솜을 코팅시키는 것은 세망내피계에 의한 리포솜의 섭취를 향상시킨다. 사람 모노클로날 항체는 항종양제로서 유용한 것으로 공지되어 있다. 종양 세포의 표면상에서 발견된 루이스 Y 항원에 특이적인 마우스/사람 모노클로날 IgG 항체는 파보르지(Paborji) 등[참조: Pharmaceutical Research, Vol. 11, No. 5, pp. 764-771, 994]에 의해 기술되었다. 호흡기 감염에 대한 수동적 항체 에어로졸 치료를 위한 계량된-용량 추진제를 사용하는 에어로졸중에 항체의 사용은 브라운 등(참조: Journal of Immunological Methods, Vol. 176, pp. 203-212, 1994)에 의해 제안되었다. 호흡기에서 면역 반응은 호흡기계의 감염에 대한 보호 및 호흡기 알레르기 및 천식에 있어서 이들의 관련성을 위해 매우 중요하다. 호흡기에 대한 모노클로날 항체를 포함하는 면역조절 시약의 효과적인 표적화는 호흡기 병원균에 대한 국소적 면역을 증가시키거나 면역-매개된 호흡기 병리학을 감소시키는데 유리한 것으로 밝혀졌다. 흡입된 면역컨쥬게이트, 면역리포솜 또는 면역미소구체는 암세포의 킬러 세포(면역컨쥬게이트)로서, 또는 면역리포솜 및 미소구체의 경우에는, 다양한 치료제의 은폐형 전달 입자로서 폐에 적용된다. IgM 안티-그룹 B 스트렙토코쿠스 모노클로날 항체는 곰보츠(Gombotz) 등(참조: Pharmaceutical Research, Vol. 11,pp. 624-632, 1994)에 의해 기술되었다.

US 5,670,626에서는 점막 조직내로의 알레르기원 분자의 진입을 억제하기 위해 모노클로날 항체를 사용함으로써 알레르기성 비염, 알레르기성 천식 및 알레르기성 결막염과 같은 IgE-매개된 알레르기성 질환의 치료를 위한 모노클로날 항체의 용도를 제안되었다. 항체에 의한 알레르기원 분자의 결합은 점막 상피 세포에 의해 섭취됨으로써 알레르기원을 억제한다고 생각된다.

특정 임상학적 상황에서, 모노클로날 항체의 사용은 특정한 단점과 관련있다. 따라서, 모노클로날 항체는 단일 항원성 에피토프에 대해 지정된다. 그러므로, 표적이 많은 상이한 에피토프를 프리젠팅하고 있는 복합체 특징을 가진 경우 모노클로날 항체의 기능적인 결합활성은 표적이 면역 인식을 통한 제거를 모면하도록 하는 임계점 미만으로 낮거나 낮았을 수 있다.

또한, 모노클로날 항체는 단일 항원성 결정인자에 대해 지정되기 때문에, 예컨대, 알레르기원상의 항체 표적의 밀도는 알레르기원의 제거를 매개할 만큼 높지 않을 수 있다. 유사하게 보체의 효율적인 활성화는 단일 특이성 모노클로날 항체로 달성될 수 없는 높은 표적 항체 밀도를 필요로 한다.

따라서, 알레르기원의 경우, 모노클로날 항체는 이들이 단일 에피토프에 대해 지정되기 때문에 부-최적이다. 대다수의 알레르기원은 복잡한 단백질이고, 많은 단백질과 펩티드 에피토프로 구성되어 있으며, 많은 변이체로 존재한다. 따라서, 단일 모노클로날 항체 제제는 알레르기원, 예컨대 화분 입자 또는 고양이 비듬으로부터의 단백질상의 소수의 가능한 에피토프 보다 많은 부분을 남김없이 덮는다고 예상될 수 없다. 이것은 항체의 바람직한 임상학적 효과가 유용한 항체 에피토프의 완전한 차단으로서 특징화될 수 있는 경우, 단일 모노클로날 항체가 충분하지 못할 것임을 의미한다. 추가로, 항체 제제가 바람직하게는 근연관계의 알레르기원으로부터의 수개의 동족 알레르기원, 예컨대, 화분, 또는 하나의 알레르기원 공급원으로부터의 수개의 단백질, 예컨대, 동물 비듬에 대해 개발되어야 하는 경우, 단일 모노클로날 항체는 요구되는 효능을 충족하지 못할 것이다.

그럼에도 불구하고, 슈와츠(Schwarze) 및 공동연구자[참조: Am. J. Resp. Crit. Care Med., Vol. 158, pp. 519-525, 1998]는Amb a I및 전체 돼지풀 추출물 둘 모두를 감작시키고 챌린지시킨 마우스(Balb/c)를 기본으로 하는 뮤린 알레르기 모델에서 주요 돼지풀 알레르기원Amb a I에 대한 모노클로날 항체의 치료학적 효능을 연구하였다. 알레르기원 노출 전에 모노클로날 IgA 항체의 투여가 메타콜린 챌린지에 대한 기도 반응성을 감소시켰고, 혈중Amb a I-특이적 IgE 레벨 및 폐 호산구의 수를 감소시켰음이 입증되었다. 또한, 상기 연구는 IgA의 투여가 IgA 처리가 알레르기에 대해 장기간 탈감작 효과를 가질 수 있음을 암시하는 면역조절 효과를 가짐을 시사하였다. 그러나, 이러한 알레르기원 모델이 단일 알레르기원인Amb a I를 사용한 알레르기-유사 증상의 유도에 기초하였음이 강조되어야 한다. 따라서, 상기 연구는 대다수의 알레르기가 단일 알레르기원 입자로부터 유래된 수많은 알레르기원 단백질 및 에피토프에 대한 반응에 의해 일어남을 고려하지 않았으며, 이러한 치료 체제에서 폴리클로날 항체 혼합물의 필요성을 역설하는 것이다. 또한, 사람 알레르기는 동계교배의 마우스 스트레인에서 유도된 알레르기-유사 증상보다 훨씬 복잡하다[참조: Inhal. Toxicol., Vol 12, pp. 829-622, 2000]. 결과적으로, 알레르기원 차단제로서 모노클로날 항체의 잠재적인 유용성은 제한된다. 마지막으로, 모노클로날 항체는 숙주 세포 조직의 알레르기원성 구조와 교차-반응성을 나타내어 잠재적인 원치않는 부작용을 초래할 수 있다. 이것이 발생하는 경우 교차-반응성은 흡착에 의해 제거될 수 없다. 그러므로 다수의 상이한 모노클로날 항체는 항원 특이성 및 표적 선택성의 바람직한 조합을 생성시키도록 생성될 필요가 있을 수 있고, 심지어 환자에 따라서는 내인성 자가-항원에 대한 교차-반응성의 상당한 위험성이 여전히 남아있다.

별도의 논점은 사람 항마우스 항체 반응(HAMA)의 생성이다. 통상적인 뮤린 모노클로날 항체는 사람 수용자에 대해 외래 단백질이고, 따라서 HAMA 면역 반응이 종종 수용자에게서 일어나며, 이는 감소된 치료 효능 이외에 원치않는 부작용을 초래할 수 있다. 이러한 문제점을 모면하기 위해, 사람 불변(C) 영역과 뮤린 가변(V) 영역을 가진 키메라 모노클로날 항체가 개발되었다. 또한 단지 초가변 상보성 결정 영역(CDR)이 마우스 모노클로날 항체로부터 유래되어 최종적으로 소위 완전한 사람 모노클로날 항체가 사람 면역글로불린 유전자에 대한 트랜스제닉 마우스에서 생성되는 사람화된 모노클로날 항체가 이러한 문제점을 회피하기 위해 개발되었다. 그러나, CDR을 결정하는 V-영역 특이성에 대한 특이적인 항-이디오타입 항체의 생성을 위한 잠재성은 동일한 V-영역을 가진 다량의 모노클로날 항체를 주입하는 경우 여전히 존재한다.

상기 개괄한 바와 같은 이유로, 폴리클로날 항체를 사용하는 것이 종종 바람직할 수 있다.

WO 98/10776에서는 포스포리파제 A₂(PLA₂)가 만성 염증을 촉진시키는 염증 매개체로서 작용하는 많은 질환의 발병학과 관련있음을 이론화하였다. 따라서 포유동물의 신생물을 치료하기 위해 1종 이상의 포스포리파제 A₂효소와 반응하는 혈청을 사용하는 것이 제안되었다. 알레르기원과 결합하는 항체의 국소 투여에 의해 알레르기원의 섭취를 차단하기 위해 폴리클로날 항체를 사용하는 것은 제안되지 않았다.

US 4,740,371에는 알레르기원 면역요법의 변형이 기재되어 있고 이로써 알레르기원 및 이에 대한 항체의 면역 복합체가 탈감작 치료를 위해 사용되었고, 알레르기원에 대해 과잉의 몰로 존재하는 항체를 사용하여 아나필락시스 반응을 방지하였다. 이러한 처리에서 항체의 함유 목적은 탈감작 치료에 대한 아니필락시스 쇼크와 같은 알레르기성 부작용의 위험성을 감소시키는 것이다. 추가될 항체 대 알레르기원의 비율은 본질적으로 항체의 중화력에 의해 정의된다. 조성물이 투여되는 경우, 실제적으로 알레르기원에 의해 어떠한 알레르기성 효과도 유도되지 않도록 충분한 항체가 사용되어야 한다. 알레르기원 조성물에 항체를 추가하는 것은 단지 알레르기원 노출의 부작용을 회피하려는 구제책이며, 치료는 여전히 알레르기원 면역요법이다.

알레르기의 치료에서 통상적인 폴리클로날 항체를 사용하는데에는 몇가지 단점이 존재한다. 우선, 과면역 사람 혈청으로부터 정제된 IgG의 형태의 폴리클로날항체는 제한된 공급 및 알레르기성 질병 및 기타 보편적인 질환의 치료를 위해 충분한 양으로 이용될 수 있다. 또한, 감마 글로불린 제제는 생성 비용이 고가이고, 압도적 다수의 비특이적 사람 혈청 면역글로불린 반응성을 포함하는 이들의 혼합된 특성에 기인하여 낮은 효능을 나타낸다. 또한, 감염성 미생물(간염 바이러스, HIV, 프라이온, 기타), 또는 미토겐, 사이토카인 및 독소를 포함하는 오염성 시약을 전달할 실제 위험성이 존재한다. 마지막으로, 제제 사이의 변이성이 주요한 문제로 남아있다. 공급 문제를 해결하기 위해, 면역화된 사람 이외의 동물로부터의 혈청을 포함하는 폴리클로날 항체의 이종개체의 공급원이 시험되었다. 그러나, 이러한 조성물은 강력한 항-이종항체 반응의 생성을 초래할 수 있고, 제노트로픽 감염의 전달 뿐만 아니라 아나필락시스 쇼크 또는 혈청병과 같은 심각한 부작용의 실제 위험성을 전달할 수도 있다.

US 5,789,208에는 신생물 질환을 치료하거나 예방하기 위한 백신 요법 및 예방법을 위한 재조합 폴리클로날 항체의 용도가 기재되어 있다. 항체는 항체가 결합하는 항원의 가능한 차후 인식을 위한 환자의 면역계를 부스팅시켜 제거 반응을 개시시키기 위해 사용된다. 백신접종은 효과적이 되도록 반복되어야 할 것이다. 알레르기 치료에서 알레르기원과 반응하거나 결합하는 폴리클로날 항체를 사용하는 것은 제안되지 않았으며 여기서 폴리클로날 항체는 환자가 알레르기원에 노출되기 전, 동안, 직후에 상이하게 완전히 투여되어야 한다.

본 발명은 알레르기를 치료하기 위한 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 재조합 폴리클로날 항체 또는 상이한 모노클로날 항체 또는 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체의 혼합물을 포함하는 조성물 뿐만 아니라 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 폴리클로날 항체의 용도에 관한 것이다.

발명의 요약

따라서, 본 발명은 활성 물질로서 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 재조합 폴리클로날 항체 또는 상이한 모노클로날 항체의 혼합물 또는 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

대부분의 구체예에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 재조합 폴리클로날 항체 또는 상이한 모노클로날 항체의 혼합물 또는 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체가 결합하거나 반응하는 알레르기원을 포함하지 않는다. 그러나, 환자에게서 알레르기원 내성을 유도시키는 소위 특이적인 알레르기원 면역요법 동안의 특별한 경에, 알레르기원-특이적인 폴리클로날 항체는 알레르기원 제제와 함께 환자에게 투여되어 상기 내성 유도 과정의 효능을 가능하게 하거나 향상시킬 수 있다.

또 다른 일면에서, 본 발명은 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 고초열, 천식 등과 같은 알레르기성 질환 또는 알레르기의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위해 요망되는 특이성을 가진 폴리클로날 항체의 용도에 관한 것이다.

추가 일면에서, 본 발명은 알레르기를 예방하거나 치료하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 알레르기 반응을 보이는 환자에게 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 충분한 양의 폴리클로날 항체를 투여하는 것을 포함한다.

폴리클로날 항체의 사용은 문제의 알레르기원-표적에 대한 폴리클로날 항체의 다중 반응성의 존재로 인해 모노클로날 항체의 사용에 비해 잠재적인 임상학적 장점을 가진다. 복잡한 알레르기원 표적상의 모든 에피토프에 대해 반응성을 갖는폴리클로날 항체가 생성될 수도 있다. 많은 에피토프 특이성을 함유하는 조성물의 폴리클로날 특성에 기인하여, 폴리클로날 항체를 사용하는 경우 복잡한 알레르기원 항원상에서 달성될 수 있는 기능성 항체 밀도는 모노클로날 항체를 사용하는 경우 보다 현저하게 높다. 이것은 표적 알레르기원의 더욱 효율적인 차단 또는 제거를 초래한다. 또한, 조성물의 폴리클로날 특성은 관련 알레르기원간의 부분적으로 공유된 수개의 에피토프와의 폭넓은 반응성에 기인하여, 모노클로날 항체에 의해서는 불가능한, 관련된 동종 알레르기원 이소타입상의 에피토프의 인식 및 차단이 가능하도록 해준다.

또한, IgA 또는 IgG 이소타입의 알레르기원-특이적 폴리클로날 항체를 사용한 치료가 알레르기원에 대한 내성을 유도시킴으로써 면역조절 효과를 가지며 따라서 알레르기를 치료하거나 추가 치료의 필요성을 감소시키는 장기간 효과를 가질것으로 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명의 추가 일면은 알레르기원에 대한 내성을 유발시키는 예방학적 치료를 위한 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 용도에 관한 것이다. 이것은 심지어 알레르기성 반응이 관찰되지 않았지만 가계력 또는 유전학적 분석에 의해 알레르기원에 대한 알레르기를 발생시킬 것 같은 환자에게 사용될 수도 있다.

또한, 모노클로날 항체와는 대조적으로, 폴리클로날 항체 제제는 혼합적인 특이성을 포함하며, 따라서 임의의 단일 및 개별적인, 교차-반응성 특이성 이디오타입이 매우 낮은 농도로 전달되어, 교차-반응성으로 인해 유해한 부작용에 대한 잠재성을 현저하게 감소시킬 것이다. 다시 말하면, 원치않는 조직 교차-반응성으로 인한 해로운 부작용에 대한 잠재성은 폴리클로날 항체 시약에서는 약화된다. 또한, 폴리클로날 항체 제제의 임의의 원치않는 교차-반응성은 흡착에 의해 제거될 수 있다. 모노클로날 항체가 원치않는 교차-반응성을 야기시키는 경우, 이것은 존재하는 단일 항체에 고유한 것이며 물론 제제의 활성을 파괴시키지 않고는 제거될 수 없다.

또한, 교차-반응성에 대한 감소된 잠재성과 관련하여 폴리클로날 항체의 특성과 유사하게, 투여된 폴리클로날 항체 제제의 각각의 단일 에피토프-특이적 이디오타입이 매우 낮은 양 또는 농도로 존재하여 항-이디오타입 반응의 생성을 위한 임계값 보다 낮기 때문에, 폴리클로날 항체는 항-이디오타입 면역 반응의 중화를 유도시키는데 있어 모노클로날 항체 보다 훨씬 덜할 것이다.

과면역 사람으로부터 정제된 IgG(제한된 공급, 고가의 생산비용) 또는 정상 동물로부터의 혈청(안티-이종-항체 반응, 아나필락시스 쇼크)의 형태로 통상적인 폴리클로날 항체를 사용하는 단점중 일부는 사람 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물로부터의 혈청 또는 다른 생물학적 물질의 사용이다. 따라서, 이러한 동물은 알레르기원으로 면역화될 수 있고, 완전한 사람 서열의 알레르기원-특이적 폴리클로날 항체 생성물을 단리하기 위한 공급원으로서 사용될 수 있다.

코 라이닝상의 면역 복합체는 점막 분비물을 삼킬 때 제거될 것이다. 기관 및 기관지 기도의 점막 표면상의 면역 복합체는 입으로 배출시키고, 타액과 혼합시키고, 삼키고 위장관에서 소화될 것이다. 점막 표면상의 점액성 유체로부터 알레르기원성 분자를 흡착시키고 제거하고, 점막 상피 세포에 의한 복합체화된 알레르기원의 임의의 섭취를 방지하는데 있어 더욱 양호한 효과를 달성하기 위해, 알레르기원-특이적 항체는 미소구체를 형성하는 중합체 골격 또는 마이크로비드와 접합될 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 용액, 분산액, 분말 또는 미소구체의 형태로 포뮬레이션될 수 있다.

발명의 상세한 설명

용어 "항체 분자"는 하나 이상의 가변 항원 결합 도메인(들) 및 불변 영역을 함유하는 단일 항체 단백질 분자 또는 이의 단편을 의미한다. 항체 분자는 대개 단일 특이성이지만, 이디오특이적이거나 헤테로특이적이거나 다중특이적이거나 원치않는 특이성으로서 기술될 수도 있다. 이것은 비-면역화학적 결합의 측면을 제외하고는 비특이적일 수 없다. 항체 분자는 특이적 결합 부위에 의해 특이적인 항원성 결정인자 또는 항원상의 에피토프에 결합한다.

종합하면, 항체는 구성원의 분획 또는 전체가 특이적인 항원 결정인자와 반응할 수 있는 분자의 군집으로서 존재할 수 있다. 따라서, 본 맥락에서, 용어 "항체"는 이들이 포유동물로부터 유래된 항혈청 또는 면역 혈청의 기능성 성분으로서 발견되거나, 이들이 사람 또는 동물 공급원 또는 트랜스제닉 동물 및 파지 디스플레이를 포함하는 재조합 기술, 또는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 제조된 유사한 기능성을 가진 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 조성물에서 발견되는 바와 같이, 항체 분자의 조성물/혼합물/군집을 의미한다.

용어 "폴리클로날 항체"는 항원의 1종 이상의 면역원성 결정인자와 반응하는상이한 항체 분자의 혼합물을 의미한다.

본 맥락에서, 용어 "폴리클로날 항체"는 포유류 혈액, 분비물 또는 기타 유체, 또는 계란으로부터 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체 뿐만 아니라 상이한 모노클로날 항체의 혼합물을 포함하며, 마지막으로 폴리클로날 항체는 재조합 폴리클로날 항체로서 생성될 수 있다.

용어 "재조합 폴리클로날 항체"는 재조합 기술의 사용에 의해 생성된 폴리클로날 항체를 의미하며, 이러한 폴리클로날 항체를 향후 심포바디(symphobody)라 명명하였다. 따라서, 심포바디는 고농도의 상이한 항체 분자들을 함유하며, 이들 전부 또는 대다수는 1종 이상의 에피토프로 구성된 항원에 대해 요망되는 결합 활성을 나타낸다.

심포바디는 재조합 DNA 기술에 따른 효모, 진균, 곤충, 식물 또는 포유류 세포를 포함하는 진핵 세포, 또는 세균과 같은 원핵 세포에서의 발현에 의해, 또는 바이러스 벡터로부터의 발현으로써, 또는 유전자 요법을 통해, 또는 동물체내에서 트랜스유전자의 발현으로부터 생성될 수 있다.

바람직하게는 심포바디 제제중의 85% 이상의 항체 분자가 표적-특이적이고, 더욱 바람직하게는 90% 이상이 표적-특이적이고, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상이 표적-특이적이고, 가장 바람직하게는 심포바디 제제중의 모든 항체 분자가 표적-특이적이다.

용어 " 상이한 모노클로날 항체의 혼합물"은 둘 이상의 상이한 모노클로날 항체의 혼합물을 의미한다. 본 문맥에서 용어 "둘 이상"은 2 내지 100, 바람직하게는 3 내지 60, 더욱 바람직하게는 5 내지 40, 가장 바람직하게는 10 내지 25개의 상이한 모노클로날 항체를 나타낸다.

용어 "단리되거나 정제된 폴리클로날 항체"는 포유류 혈액, 분비물, 또는 다른 유체, 또는 계란으로부터 단리된거나 정제된 폴리클로날 항체를 의미한다.

표현 "항체, 폴리클로날 항체, 재조합 항체, 상이한 모노클로날 항체의 혼합물 및 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체"는 언급된 항체의 기능성 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

재조합 폴리클로날 항체를 제조하는 현재의 바람직한 방법은 예컨대 본원에 전체로서 참조로 인용된 US 5,789,208(제이. 샤론(J. Sharon)에게 허여됨)에 기재된 바와 같이, 폴리클로날 항체 라이브러리(PCAL)를 제조함으로써 수행된다.

더욱 상세하게는, 약제학적 조성물에 포함된 폴리클로날 항체는 동물, 바람직하게는 포유동물을 선택한 알레르기원으로 면역화시킨 다음 혈액, 골수, 림프절 또는 비장으로부터 항체-생성 B-림프구를 단리함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로는, 항체-생성 세포는 동물로부터 단리될 수 있고 시험관내에서 알레르기원에 노출되면 알레르기원에 대한 항체가 상승된다. 그런 다음 항체-생성 세포는 임의적으로는 골수종과 같은 불멸화된 세포주와 융합 후에, 항체-생성 세포의 군집을 수득하기 위해 배양될 수 있다.

더욱 바람직하게는, 출발 재료로서 B-림프구는 완전한 사람 폴리클로날 항체를 생성시키기 위해, 알레르기 환자의 조직으로부터 단리될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 완전한 사람 폴리클로날 항체를 생성시키기 위해출발 재료로서 사람 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 마우스, 래트, 돼지, 양, 소 재료, 또는 다른 동물로부터의 적절한 조직을 사용하여 생성될 수 있다.

특히, 사람 면역글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 마우스 또는 다른 동물의 경우에(예컨대, US 5,939,598에 기재된 바와 같이), 상기 동물은 B 림프구의 추출 또는 폴리클로날 혈청의 정제에 의해 동물로부터 폴리클로날 항체 조성물을 제조하기 전에 특이적 항체 및 항체 생성 세포의 생체내 생성을 자극하기 위해 면역화될 수 있다.

조합 라이브러리는 클로닝 벡터내에서 V_L및 V_H를 무작위로 결합시킴으로써 면역화된 B 림프구로부터 제조될 수 있다. 따라서, 재조합 폴리클로날 항체는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 유전자 절편이 무작위로 함께 결합되어 하나의 벡터로부터 다른 벡터로의 가변 영역 경쇄 및 중쇄 유전자 쌍의 벌크 이동을 가능하게 하는 반면, 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 항체 분자를 엔코딩하는 면역글로불린 가변 영역 경쇄 및 중쇄 유전자 절편 쌍의 모 라이브러리로부터 선택시에 이들이 존재하기 때문에 특이적인 면역글로불린 가변 영역 경쇄 및 중쇄 유전자 절편의 안정상 페어링(paring)이 가능하도록 하는 조건하에 생성된다.

단일 세포 PCR은 단일 세포에서 V_L및 V_H의 네이티브 페어링을 유지하려는 시도에서 사용될 수 있다. 이러한 경우 동물 또는 사람으로부터 단리된 항체-생성B-림프구는 고정액 또는 포름알데히드, 글루타르알데히드 등과 같은 화학물질을 함유하는 용액으로 고정될 수 있다.

그런 다음 세포는 예컨대 Brij, 트윈, 폴리소르베이트, 트리톤 X-100 등과 같은 계면활성제를 포함하는 투과성 용액으로 투과된다. 고정 및 투과 과정은 효소, 누클레오티드 및 다른 시약이 세포성 컴파트먼트 또는 세포내 핵산의 과도한 파괴없이 세포내로 들어가는 것을 허용하도록 충분한 다공도를 제공하여야 한다. 그런 다음 효소 및 누클레오티드가 첨가되면 세포로 들어가서 세포성 V_H및 V_LmRNA를 상응하는 cDNA 서열로 역전사시킨다.

역전사는 단일 단계 또는 임의적으로는 역전사효소, 충분한 양의 4가지 dNTP 및 중합 개시를 위한 역전사효소에 대해 3' 하이드록실기를 제공하는 mRNA에 결합하는 프라이머를 사용하는 PCR 과정과 함께 수행될 수 있다. mRNA와 상보적인 임의의 프라이머가 사용될 수 있지만, 가변 영역 mRNA의 선택이 용이하도록 V_H및 V_L의 3'-말단과 상보적인 프라이머를 사용하는 것이 바람직하다.

역전사시에, 생성된 cDNA 서열은 면역글로불린 유전자 및 특히 V_H및 V_L핵산의 말단 영역에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭될 수 있다. PCR 과정은 예컨대, US 4,683,195에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다. 바람직하게는, cDNA는 cDNA 프라이머 뿐만 아니라 V_H영역 유전자의 5' 말단을 위한 프라이머 및 V_L유전자의 5' 말단을 위한 다른 프라이머를 사용하여 PCR 증폭되고 동일한반응으로 연결된다. 또한 이들 프라이머는 여분의 서열의 상보적인 테일을 함유하여, V_H및 V_L유전자의 자가-조립을 허용한다. PCR 증폭 및 연결 후에, 혼합되는 생성물, 다시 말해서, 혼합되는 가변 영역의 기회는 증폭 및 연결 반응이 각 세포내에서 수행되기 때문에 최소이다. 혼합의 위험성은 V 영역 cDNA 쌍이 세포성 컴파트먼트를 떠나지 않고 서로 혼합되지 않으면서, PCR 증폭 및 연결을 위해 세포내에 남도록 하는 것을 추가로 보장하기 위해 디곡시게닌 표지된 누클레오티드와 같은 벌키 시약을 사용함으로써 추가로 감소될 수 있다. 증폭된 서열은 상보적인 말단 서열의 하이브리드화에 의해 연결된다. 연결 후에, 서열은 세포로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 연결 후에, 세포는 소듐 도데실 설페이트(SDS)의 용액중에 세척될 수 있다. SDS는 얼음상에서 인큐베이션 후에 세포를 침전시키며 상층액은 아가로오스 또는 아크릴아미드 겔에서 전기영동될 수 있다. 대안적으로 또는 SDS 과정과 함께, 디곡시게닌과 같은 시약-연결된 누클레오티드를 사용하여, 합성된 DNA 생성물은 세포내에 남아있고 증폭될 것이다. 상기 연결된 생성물은 상층액의 전기영동시에 회수된다.

상층액의 전기영동 후에, 연결된 생성물의 대략적인 분자량에 상응하는 겔 슬라이스를 도려내어 DNA를 예컨대, 실리카 비드상에서 단리하였다. 회수된 DNA는 필요한 경우 말단 프라이머를 사용하여 PCR 증폭될 수 있고, 플라스미드, 파아지, 코스미드, 파아지미드, 바이러스 벡터 또는 이들의 혼합물일 수 있는 벡터내로 클로닝될 수 있다. 편리한 제한 효소 부위를 하이브리드화된 서열내로 혼입시켜 클로닝을 용이하게 할 수 있다. 이들 벡터는 또한 차후 사용을 위해 연결된 가변 영역의 라이브러리로서 보관될 수 있다.

연결된 V_H및 V_L영역 유전자는 말단 네스티드(nested) 프라이머를 사용하여 두 번째로 PCR 증폭되어, 연결된 V_H및 V_L유전자 영역을 엔코딩하는 DNA 단편의 군집을 생성시킬 수 있다. V_H및 V_L조합 그룹화는 본 방법의 장점이며 이러한 클로닝 과정 및 모든 클로닝 과정 동안 모든 클론 및 모든 DNA 단편의 대량 또는 회분 이동을 가능하게 한다.

바람직하게는, 재조합 폴리클로날 항체는 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 유전자 절편이 헤드 대 헤드 배향으로 함께 연결되어, 파아지로부터 벡터, 및 본래의 세포로부터 파아지 또는 벡터로를 포함하여, 하나의 벡터로부터 다른 벡터로 가변 영역 경쇄 및 중쇄 쌍의 벌크 이동을 허용함으로써, 이들이 동물 또는 사람 개체의 본래의 폴리클로날 면역 반응에서 발견되는 바와 같이 특이적인 면역글로불린 가변 영역 경쇄 및 중쇄 유전자 절편의 안정한 쌍이 되도록 하는 조건하에서 생성될 수 있다.

가변 영역 유전자 서열을 돌연변이 작용제로 처리하는 것이 종종 바람직할 수도 있다. 돌연변이 작용제는 일반적이거나 특이적이거나 무작위적이거나 부위 특이적일 수 있는 유전자 서열내에 점 돌연변이, 갭, 결실 또는 첨가를 생성시킨다. 유용한 돌연변이 작용제에는 자외선, 감마선, 에티듐 브로마이드, 소랄렌 및 핵산 유사체와 같은 화학물질, 또는 제한 효소, 트랜스퍼라제, 리가제 및 특이적이고 비특이적인 누클레아제 및 중합효소와 같은 DNA 변형 효소가 포함된다. 또한 돌연변이유발 스트레인을 사용하는 것이 용이할 수 있다. 특히, 무작위 돌연변이는 올리고누클레오티드 특정부위 돌연변이유발에 의해 V_H및 V_L영역 유전자의 CDR에 도입될 수 있다. 유전자 서열내에 도입된 돌연변이는 라이브러리 복잡성 및 다양성 뿐만 아니라 처리시에 라이브러리의 무용성을 추가로 증가시킬 수 있는 항원에 대한 친화성을 궁극적으로 증가시킬 것이다. 또한, 이러한 돌연변이유발은 단일 V_H및 V_L쌍 또는 이러한 쌍의 정의된 그룹상에 사용되어 처음부터 새로 생성될 수 있다.

클로닝은 예컨대, 제한 효소로 cDNA 및 벡터 서열을 절단하고, 필요한 경우 특정 핵산 단편을 단리하고, 적합한 균형잡힌 염 용액중에 리가제의 존재하에서 단편들을 함께 혼합시키고, 규정된 시간 동안 효소적으로 허용되는 조건하에 혼합물을 인큐베이션시킴으로써 수행된다. cDNA의 각 말단에 상이한 효소 인식 부위를 사용하여, 클로닝 배향을 미리결정할 수 있다.

벡터는 적절한 숙주 세포내로 형질전환되고 배양물은 라이브러리를 포함하는 상이한 벡터 군집을 확장시키기 위해 증폭된다. 원핵성 벡터를 위한 숙주 세포는 대장균과 같은 세균 배양물일 수 있다. 진핵성 벡터를 위한 숙주 세포는 조직 배양에 적합한 임의의 포유류, 곤충 또는 효모 세포주와 같은 진핵 세포의 배양물일 수 있다. 세균 세포는 많은 다른 형질전환 방법이 허용되겠지만, 칼슘 클로라이드-열 쇼크 또는 일렉트로포레이션에 의해 벡터를 사용하여 형질전환된다.진핵 세포는 많은 다른 형질전환 방법이 허용되겠지만, 칼슘 포스페이트 침전법 ㄸ는 일렉트로포레이션을 사용하여 트랜스펙션된다. DNA 단편은 원핵성 또는 진핵성 발현 벡터, 키메라 벡터 또는 듀얼 벡터내로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 플라스미드, 코스미드, 파아지, 바이러스 벡터, 파아지미드 및 이들의 혼합물일 수 있지만, 재조합 생성물이 파아지 표면상에서 발현되어 스크리닝과 선별이 용이한 파아지 디스플레이 벡터가 바람직하다. 유용한 전사 부위 및 번역 부위는 TATA 박스 부위, CAT 부위, 인핸서, 적절한 스플라이싱 부위, 필요한 경우, AT 부화 말단 영역 및 전사 개시 부위를 포함하는 발현 벡터상에 위치될 수 있다. 번역을 용이하게 하는 유용한 부위는 번역 개시 부위, 번역 종결 부위 및 리보솜 결합 부위를 포함한다. 전형적으로, 효율적인 진핵성 발현을 위해 더욱 유용한 부위중 일부, 예컨대, SV40, CMV, HSV 또는 바큘로바이러스 프로모터/인핸서 영역은 바이러스로부터 유래된다. 생성된 재조합 항체는 뮤린 클래스 IgG₁, IgG_2a, IgG_2b, IgM, IgA 또는 IgE, 사람 클래스 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgM, IgA₁, IgA₂, IgD 또는 IgE, 또는 이들의 혼합 또는 단편일 수 있다. 바람직하게는, 키메라 항체 라이브러리는 주로 IgG 항체 또는 Fab 항체 단편으로 구성된다.

요망되는 특이성을 가진 재조합 폴리클로날 항체의 선별은 예컨대, 관련된 항체 특이성을 나타내는 파아지 입자를 결합시키기 위한 알레르기원-코팅된 표면을 사용하는 친화성 선별(패닝(panning))에 의해 수행될 수 있다. 파아지 라이브러리에서 대다수의 파아지는 세척에 의해 제거되며 결합된 파아지 입자는 더욱 엄격한조건(용리)에 의해 회수된다. 선별 과정 후에, 파아지 입자의 선별된 라이브러리내의 V_L및 V_H항체 유전자 쌍은 완전한 항체 분자 또는 Fab 단편과 같은 이의 단편으로서의 재조합 폴리클로날 항체의 발현을 위해 디자인된 상이한 벡터내로 서브클로닝될 수 있다.

재조합 폴리클로날 항체를 생성시키기 위한 재조합 DNA 기술의 사용은 항체를 생성시키는 비용-효율적인 방법이고, 널리 특징화된 요망되는 특이성을 가진 폴리클로날 항체 제제의 생성은 통상적인 폴리클로날 항체 혈청과 개별적인 모노클로날 항체로 상기 문제를 극복할 것이고 알레르기 또는 알레르기성 질환, 예컨대, 천식의 예방 또는 치료를 위해 이러한 시약의 사용을 허용할 것이다.

약제학적 조성물

바람직한 구체예에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 구강인두부, 비강, 기도, 위장관과 같은 점막, 결막 점막과 같은 눈, 질, 비뇨생식 점막에 대한 국소 투여/적용, 또는 피부 적용을 위한 것이다.

약제학적 조성물의 특히 흥미로운 용도는 코, 기관지 또는 폐 점막에 적용하기 위한 것이다. 상세하게는, 흡입된 폴리클로날 항체를 사용하는 알레르기의 국소 치료는 이러한 시약의 특히 유용한 적용일 것이고, 생산하기 저렴하고, 무해하고 독성이 없는 신규한 치료적 또는 예방적 치료술식의 발견 및 개발을 가능하게 하고, 매우 높은 비율의 사람 군집을 괴롭히는 질환에 대해 도움을 줄 것이다.

폐 캐비티로의 폴리클로날 항체의 최적의 전달을 수득하기 위해서는, 포스포글리세라이드, 예컨대, 포스패티딜콜린과 같은 계면활성제, 및/또는 포지티브 또는 네가티브로 하전된 부형제의 친수성 또는 소수성 복합체 및 반대 전하로 하전된 항체를 첨가하는 것이 장점적일 수 있다.

폴리클로날 항체를 호흡기 점막으로 전달하기 위해 의도된 약제학적 조성물을 위해 적합한 다른 부형제는 a) 탄수화물, 예컨대, 프럭토오스, 갈락토오스, 글루코오스, D-만노오스, 소르비오스 등과 같은 단당류; 락토오스, 트레할로오스, 셀로비오스 등과 같은 이당류; 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린과 같은 사이클로덱스트린; 및 라피노오스, 말토덱스트린, 덱스트란 등과 같은 다당류; b) 글리신, 아르기닌, 아스파르트산, 글루탐산, 시스테인, 리신 등과 같은 아미노산; c) 소듐 시트레이트, 소듐 아스코르베이트, 마그네슘 글루코네이트, 소듐 글루코네이트, 트로메타민 하이드로클로라이드 등과 같은 유기산 및 염기로부터 제조된 유기염; d) 아스파르탐, 사람 혈청 알부민, 젤라틴 등과 같은 펩티드 및 단백질; e) 만니톨, 자일리톨 등과 같은 알디톨, f) 키토산 또는 키토산 염 또는 유도체와 같은 다중양이온 중합체로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

수년에 걸쳐 특정 약물들은 사람의 다양한 질환을 치료하기 위해 경구 흡입(폐 전달)을 위한 약물 분산액을 형성시키기에 적합한 조성물로 판매되고 있다. 이러한 폐 약물 전달 조성물은 약물 분산액의 환자에 의한 흡입에 의해 전달되어 분산액내의 활성 약물이 폐에 도달할 수 있도록 디자인된다.

폐 약물 전달은 액체 연무기, 에어로졸에 기초한 미터계량흡입기(MID) 및 건조 분말화된 분산 장치를 포함하는, 상이한 접근법에 의해 달성될 수 있다. 클로로플루오로카본(CFC)에 기초한 MDI는 환경에 대한 이들의 부작용 때문에 지지를 상실했다. CFC 에어로졸 기술에 의존하지 않는 건조 분말 분산 장치는 건조 분말로서 쉽게 포뮬레이션될 수 있는 약물을 전달할 것으로 기대된다. 많은 다른 불안정한 고분자들은 그 자체로 또는 적합한 분말 캐리어와 함께 동결건조된 분말 또는 스프레이 건조 분말로서 안정하게 저장될 수 있다.

항체를 포함하는 많은 약제학적 조성물은 매우 고가이다. 따라서, 약제의 손실을 최소화하면서 건조 분말을 효율적으로 포뮬레이션, 공정, 포장 및 전달하는 능력이 중요하다.

휴대용 및 다른 분말 전달 장치를 위한 중요한 요건은 효능이다. 전달된 용량이 전체 투여량을 달성하기 위해 필요한 호흡의 수를 감소시키도록 비교적 높은 것이 중요하다. 충분한 분산액 및 분산된 작은 부피 둘 모두를 달성시키는 능력은 분말 조성물의 각각의 단위 투여량이 쉽고 신뢰할 수 있도록 분산가능함을 부분적으로 필요로 하는 중요한 기술적 문제이다. U.S. Pat. No. 5,797,392, U.S. Pat. No. 5,458,135 및 국제 특허 공개 WO96/09085에 기재된 바와 같은 특정한 폐 전달 장치들은 건조 분말 약물의 폐 전달을 위해 유용하다. 본 발명의 조성물의 다른 투여 형태에는 안구 투여를 위한 액체, 겔, 연고 또는 다른 적합한 포뮬레이션, 비강내 투여를 위한 스프레이, 에어로졸, 분말, 또는 조성물, 경구 캐비티를 위한 츄잉검, 파스타 또는 다른 조성물, 피부상에 도포하기에 적합한, 크림, 연고, 로션, 겔 또는 다른 조성물, 질 또는 비뇨생식기 점막상에 적용하기에 적합한 바지토리, 겔 또는 다른 조성물이 포함되거나 소화기관내 투여를 위한 캡슐 또는 정제로서 포뮬레이션된다. 피부 적용을 위해, 폴리클로날 항체는 적합하게는 1종 이상의 하기 부형제와 함께 포뮬레이션된다: 용매, 완충제, 보존제, 습윤제, 킬레이팅제, 산화방지제, 안정화제, 에멀션화제, 현탁제, 겔-형성제, 연고 베이스, 침투 인핸서, 향료 및 피부 보호제.

용매의 예는 물, 알코올, 식물성 오일 또는 마린 오일(예컨대, 편도유, 파마자유, 카카오 버터, 야자유, 옥수수 기름, 면실유, 아마인유, 올리브유, 팜유, 낙화생유, 양귀비 씨 기름, 평지씨 오일, 참기름, 콩기름, 해바라기씨 유 및 차 종자 오일과 같은 식용유), 광유, 지방유, 액체 파라핀, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 액체 폴리알킬실록산 및 이들의 혼합물이다.

완충제의 예는 시트르산, 아세트산, 타르타르산, 락트산, 하이드로겐포스포르산, 디에틸 아민 등이다.

조성물에 사용하기 위한 보존제의 적절한 예는 메틸, 에틸, 프로필 p-하이드록시벤조에이트, 부틸파라벤, 이소부틸파라벤, 이소프로필파라벤, 칼륨 소르베이트, 소르브산, 벤조산, 메틸 벤조에이트, 페녹시에탄올, 브로노폴, 브로니독스, MDM 히단토인, 요오도프로피닐 부틸카르바메이트, EDTA, 벤잘코늄 클로라이드 및 벤질알코올과 같은 파라벤, 또는 보존제의 혼합물이다. 습윤제의 예는 글리세린, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 락트산, 요소 및 이들의 혼합물이다.

산화방지제의 예는 부틸화된 하이드록시 아니솔(BHA), 아스코르브산 및 이들의 유도체, 토코페롤 및 이들의 유도체, 시스테인, 및 이들의 유도체이다. 에멀션화제의 예는 천연 검, 예컨대, 검 아카시아 또는 검 트래거캔스; 천연 포스패티드,예컨대, 콩 레시틴; 소르비탄 모노올레에이트 유도체; 양모 알코올; 소르비탄 에스테르; 모노글리세라이드; 지방산 알코올; 지방산 에스테르(예컨대, 지방산의 트리글리세라이드); 및 이들의 혼합물이다.

현탁제의 예는 셀룰로오스 및 카복시메틸 셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 카라게난, 아카시아 검, 아랍 검, 트래거캔스, 및 이들의 혼합물과 같은 셀룰로오스 유도체이다.

겔 베이스, 점도-증가제 또는 상처로부터의 삼출액을 취할 수 있는 성분의 예는 액체 파라핀, 폴리에틸렌, 지방유, 콜로이드 실리카 또는 알루미늄, 아연 비누, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 트래거캔스, 카복시비닐 중합체, 마그네슘-알루미늄 실리케이트, 카보폴(Carbopol)(등록상표), 예컨대, 전분과 같은 친수성 중합체 또는 예컨대, 카복시메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스 및 다른 셀룰로오스 유도체와 같은 셀룰로오스 유도체, 물-팽창성 하이드로콜로이드, 카라게난, 히알루로네이트(예컨대, 임의로 염화 나트륨을 함유하는 히알루로네이트 겔), 및 프로필렌 글리콜 알기네이트를 포함하는 알기네이트이다.

연고 베이스의 예는 밀랍, 파라핀, 세타놀, 세틸 팔미테이트, 식물성 오일, 지방산의 소르비탄 에스테르(Span), 폴리에틸렌 글리콜, 및 지방산의 소르비탄 에스테르와 에틸렌 옥시드간의 응축 생성물, 예컨대 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트(Tween)이다.

소수성 또는 물-에멀션화 연고 베이스의 예는 파라핀, 식물성 오일, 동물성지방, 합성 글리세라이드, 왁스, 라놀린 및 액체 폴리알킬실록산이다. 친수성 연고 베이스의 예는 고체 마크로골(폴리에틸렌 글리콜)이다. 연고 베이스의 다른 예는 트리에탄올아민 비누, 설페이트화된 지방산 알코올 및 폴리소르베이트이다.

다른 부형제의 예는 카르멜로오스, 소듐 카르멜로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 펙틴, 잔탄 검, 로우커스트 빈 검, 아카시아 검, 젤라틴, 카르보머와 같은 중합체, 비타민 E, 글리세릴 스테아레이트, 세타닐 글루코시드, 콜라겐, 카라게난, 히알루로네이트 및 알기네이트 같은 에멀션화제 및 키토산이다.

국소적 효과는 폴리클로날 항체에 대해 수득되는 것이 일반적으로 바람직하며, 제거 및 이에 의한 활성은 실질적으로 미소구체, 리포솜, 반대 전하의 항체 분자와 포지티브 또는 네가티브로 하전된 부형제의 복합체와 같은 약제학적 조성물에 의해 제어되고 연장될 수 있다.

폴리클로날 항체의 치료학적 용도

바람직한 구체예에서, 본 발명의 조성물에 포함된 심포바디는 결막 및 비인두 알레르기원을 포함하는 흡입 알레르기원 뿐만 아니라 호흡기에 들어가거나 그렇지 않으면 체내에 들어온 알레르기원과 반응/결합하는 것이다. 보편적인 흡입 알레르기원에 대한 폴리클로날 항체, 예컨대, 심포바디의 예방적 또는 치료학적 흡입은 알레르기 감작이 일어나기 전에 알레르기 원인 작용제를 호흡기로부터 차단, 중화 및 제거하는 것을 도움으로써 알레르기의 원인을 제거하는데 직접적으로 도움을 준다.

따라서, 본 발명의 본 구체예는 알레르기원 에피토프를 차단함으로써 폴리클로날 항체 흡입을 통한 알레르기원 흡입의 효과를 중화시키거나 그렇지 않으면 IgE 분자의 결합을 위해 유용한 가능성에 관한 것이다. 또한, 폴리클로날 항체의 결합은 알레르기 반응의 유도없이 알레르기원의 식작용 및 분해를 매개할 뿐만 아니라 점막 점액과 함께 IgA 또는 IgG를 가진 면역 복합체에 포획된 알레르기원을 호흡기로부터 인두내로 위쪽으로 제거하는 것을 용이하게 하여, 후속적으로 소화기관내로 삼켜지게 함으로써 알레르기원에 대한 제거 효과를 발휘할 것으로 예측된다.

마직막으로, 알레르기원-특이적 IgE의 결합에 대해 차단하는, 알레르기원-특이적인 폴리클로날 항체, 예컨대 IgG 또는 IgA 이소타입의 심포바디의 점막 투여는 알레르기가 지속된다고 생각되는 알레르기성 개체에서 알레르기원에 대한 우세한 T_H2 타입 T 림프구 반응을 유도할 수 있는 T 림프구에 대한 IgE-매개된 항원 프리젠테이션을 억제하는 것으로 가정되었다. 대신에, 차단성 알레르기원-특이적 폴리클로날 항체, 예컨대 심포바디의 존재는 T 세포에 대한 IgG- 또는 IgA-매개된 항원 프리젠테이션 초래할 수 있고, 차례로 알레르기원에 대한 T_H1 타입 T 림프구 반응을 우선적으로 촉진시켜, 염증 반응에서 알레르기의 악순환을 중단시킬 수 있다.

예컨대 화분으로부터의 알레르기원 에피토프는 몇가지 단백질로부터 유래되어, 작동할 수 있게 되는 단일 흡입 항체이고, 많은 개별적인 이디오타입 특이성/항원 반응성이 아닌 경우 여러개를 함유할 필요가 있을 것이다. 이에 대해, 폴리클로날 항체는 모노클로날 항체 보다 월등히 우수하다.

결론적으로, 폴리클로날 항체 조성물은 알레르기성 비염, 고초열, 알레르기성 결막염 및 알레르기성(외래) 천식 뿐만 아니라 식품 알레르기를 포함하는 모든 타입의 알레르기의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 폴리클로날 항체는 하기 알레르기원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 알레르기원과 반응/결합하는 폴리클로날 항체이다: 집먼지 진드기(예컨대, 더마토파고이데스 파리내(Dermatophagoides farinae) 또는 더마토파고이데스 프테로니시무스(D. pteronyssimus)); 고양이, 개 또는 말로부터의 비듬; 자작나무 베툴라 알바(Betula alba), 오리나무, 개암나무, 버드나무, 버즘나무, 너도밤나무, 느릅나무, 단풍나무, 물푸레나무 및 서나무로부터의 수목화분; 큰조아재비(플레움 프라텐세(Phleum pratense)), 새포아풀(포아 프라텐세(Poa pratense)), 호밀풀(롤리움 페레네(Lolium perenne)), 오차드 그래스(닥틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata)), 두드러기쑥(예컨대, 암브로시아 아르테미시폴리아(Ambrosia artemisiifolia)), 향기풀(안톡산툼 오도라툼(anthoxanthum odoratum)) 및 호밀(세칼레 세레알레(Secale cereale))로부터의 목초화분, 또는 진균(예컨대, 알테르나리아 (Alternaria), 아르페르길루스(Aspergillus), 클라도스포리움(Cladosporium) 및 페니실리움(Penicillium)). 추가적으로, 알레르기원-특이적 폴리클로날 항체, 예컨대 심포바디는 식품 알레르기원(예컨대, 땅콩 및 다른 너트, 패류, 계란, 우유, 옥수수) 또는 벌 독 알레르기원과 같은 다른 작용제에 대한 알레르기를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 수많은 이러한 알레르기원은 상용 공급자로부터 널리 특징화된 단백질로서 구입할 수 있다.

알레르기의 치료 또는 예방에 효과적인 사람에게 필요한 폴리클로날 항체의 용량은 치료될 알레르기 질환의 타입 및 중증도, 알레르기원의 타입, 환자의 연령 및 상태 등에 따라 다르다. 투여되는 폴리클로날 항체의 전형적인 용량은 단위 투여량 형태 당 1 ㎍ 내지 1 g, 바람직하게는 1 내지 1000 ㎍, 더욱 바람직하게는 2 내지 500, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 50, 가장 바람직하게는 10 내지 20 ㎍이다.

실험

본 발명은 하기 실시예에서 상세하게 기술되는데, 이는 어떠한 방식으로든 청구된 바와 같이 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.

심포바디 라이브러리의 생성을 위한 마우스의 면역화

BALB/c 마우스를 프로인트 완전 애쥬번트중의 알레르기원 1 mg으로 피하적으로(s.c.) 또는 복강내적으로(i.p.) 면역화시켰다. 면역화를 재조합 알레르기원 단백질(예컨대, Der p 1) 또는 네이티브 알레르기원으로부터의 추출물을 사용하여 수행하였다. 임의의 후속하는 면역화를 불완전 프로인트 애쥬번트중에서 2 내지 3주 간격으로 수행하였다. 비장 및/또는 골수를 최종 면역화시킨지 3일 후에 취하여 US 5,789,208에 기재된 바와 같이, 심포바디 라이브러리의 제조를 위해 사용하였다.

알레르기 환자 재료로부터 심포바디 라이브러리의 생성

심포바디 라이브러리를 포지티브 게이스 히스토리, 피부 프릭 시험, 방사선알레르기원흡착 시험(RAST), 또는 IgG 또는 IgE 면역블로팅에 의한 알레르기원 추출물과 환자 혈청의 반응성 또는 정제된 재조합 알레르기원(예컨대, 화분 알레르기원 또는 동물 알레르기원)에 대한 반응성에 의해 특징화된 알레르기 환자로부터 취해진 혈액 또는 골수 샘플로부터 제조하였다.

알레르기원에 결합하는 항체를 ELISA에 의해 검출하였다.

Nunc Maxisorp 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 웰 당 50 내지 1000 ng의 알레르기원, 분해된 알레르기원 또는 재조합 알레르기원을 코팅시켰다. 젤라틴 또는 BSA 뿐만 아니라 트윈-20을 함유하는 PBS중에 세척한 후에 웰을 젤라틴 또는 BSA를 사용하여 37℃에서 1시간 차단시켰다. 후속적으로 웰을 세척하고 폴리클로날 항체, 예컨대, 심포바디, 혈청 또는 기관지 폐포 세척(BAL)으로부터 유래된 뮤린 또는 사람 IgE, IgG와 함께 인큐베이션하였다. 세척의 반복된 라운드 후에, 결합된 항체를 이차 바이오티닐화된 항-마우스 또는 항-사람 면역글로불린, 적절한 경우, 이후 AP-아비딘, 및 pNPP 기질의 연속적인 인큐베이션에 의해 검출하였다. 이전에 특징화된 알레르기원-특이적 모노클로날 항체를 포지티브 대조표준으로서 사용하고 상이하고 무관한 특이성을 가진 모노클로날 항체 및 폴리클로날 항체를 네가티브 대조표준으로서 사용하였다.

일부 실험에서 폴리클로날 항체 인큐베이션을 경쟁 ELISA에서 널리 특징화된 모노클로날 항체와의 인큐베이션에 앞서 수행하였다.

알레르기원에 대한 환자-유래된 IgE의 결합의 폴리클로날 항체 억제

알레르기원 추출물에 대한 환자-유래된 IgE 결합을 IgE 결합에 대한 경쟁ELISA(하기 변경을 포함하는 상기 프로토콜과 유사함) 또는 제조용 SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅에 의해 연구하였다. 알레르기원, 분해된 알레르기원 또는 재조합 알레르기원을 사용한 ELISA 코팅 또는 알레르기원 전기영동 후에, 알레르기원-코딩된 표면을 젤라틴 또는 BSA로 차단한 다음, 알레르기원-특이적인 폴리클로날 항체와 4℃에서 3 내지 4시간 인큐베이션하였다. 후속적으로, 샘플을 1:5로 희석시킨 환자 혈청 또는 BAL IgE와 함께 4℃에서 3 내지 4 시간 인큐베이션시키고 결합된 사람 IgE 항체를 예컨대,¹²⁵I-표지된 항-사람 IgE 항체(RAST; Pharmacia)를 사용하여 검출하고 자동방사선사진술에 의해 가시화시켰다. 마우스 IgG의 결합을 상기 기술한 바와 같이 검출하였다.

전기영동 및 웨스턴 블로팅에 의한 알레르기원 추출물과 폴리클로날 항체 반응성의 특징화

알레르기원 추출물을 SDS-PAGE에 의해 분리하고 니트로셀룰로오스 스트립 상에 면역블로팅시킨 후에 항체 제조물(환자 혈청, 마우스 혈청, 폴리클로날 항체, 예컨대, 심포바디, 또는 대조표준 모노클로날 항체)와 함께 인큐베이션하였다. 일부 실험에서, 하나의 알레르기원에 대해 생성된 폴리클로날 항체의 교차-반응성을 동종 알레르기원의 패널에 대해 ELISA 또는 웨스턴 블로팅으로 시험함으로써 검사하였다.

폴리클로날 항체와 알레르기원의 예비인큐베이션 후에 사람 호염성 과립구로부터의 알레르기원-유도된 히스타민 방출의 억제

헤파린화된 혈액 샘플을 알레르기 환자로부터 수득하고 과립구를 덱스트란 침전에 의해 단리하였다. 재조합 알레르기원, 분해된 알레르기원 또는 알레르기원 추출물을 알레르기원-특이적인 폴리클로날 항체, 예컨대, 심포바디, 또는 대조표준 항체 또는 완충액 단독과 함께 실온에서 1시간 동안 예비인큐베이션시킨 후에 히스타민 방출 완충액(20 mM PIPES, pH 7.4, 110 mM NaCl, 5mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 g/L 글루코오스, 0.3 mg/ml 사람 혈청 알부민)중에 분해된 과립구와 함께 상이한 농도(1, 0.1, 0.01, 및 0.001 ㎍/ml)로 인큐베이션하였다. 무세포 상층액내로의 히스타민 방출을 방사선면역검정에 의해 측정하고 세포 용해 후에 전체 히스타민 방출의 퍼센트로서 표현하였다.

알레르기의 마우스 모델에서 알레르기성 염증의 폴리클로날 항체 억제

마우스(예컨대, BALB/c 마우스)를 알레르기원(예컨대, 150 ㎍) 및 알룸을 예컨대, 0일째 및 4일째에 2회 이상 복강내 주입에 의해 알레르기원(예컨대, 두드러기쑥 알레르기원)에 대해 감작시켰다. 11일째 및 2 내지 4주 시간간격으로, 기관내 또는 비내 알레르기원 챌린지를 마취된 마우스에서 수행한 후에 마우스를 하기 기술하는 바와 같이 분석하였다. 일부 실험에서 오발부민(OVA)-감작에 기초한 마우스 모델을 사용하였다. 요약하면, BALB/c 마우스에 알루미늄 하이드록시드 애쥬번트(알룸, Pierce) 2 mg중의 예컨대, 5 내지 100 ㎍ OVA(계란 알부민 등급 V, Sigma)를 1일째 및 14일째 복강내 주입한 후에, 초음파 분무기(DeVilbiss Somerset, PA, USA)를 사용하여 20분 동안 PBS중의 1% 에어로졸화된 OVA 또는 마취된 마우스에 기관내적으로 주입된 40 ㎕ PBS중의 5 내지 100 ㎍ OVA를 사용하여 28일, 29일 및 30일째에 프로토콜에 따라 챌린지하였다. 대조마우스에 동일한 양의 PBS를 주입하였다.

32일째, 항원 챌린지 24시간 후에, 12마리 마우스에 기도 반응성 시험을 수행하고 33일째에 죽였다. 대조 그룹으로 8마리 마우스를 사용하였다.

좌측 폐를 묶고 우측 폐의 BAL을 200 ㎕ PBS로 5회 반복 세척에 의해 수득하였다. 좌측 폐를 고정시키고 폐 조직학을 위해 파라핀에 엠베딩시켰다. 혈액 샘플(꼬리 혈액)을 각 마우스로부터 취하여 분석을 수행하기 전까지 -80℃에 보관하였다.

알레르기성 염증을 억제시키는 알레르기원-특이적 폴리클로날 항체, 예컨대, 심포바디의 능력을 검사하는 실험에서, 항원의 챌린지 용량의 투여 이전, 동안 또는 이후에 알레르기원-특이적 폴리클로날 항체 제제를 1 ㎍ 내지 1 mg의 다양한 용량으로 투여하였다.

상이하거나 무관한 특이성을 가진 폴리클로날 항체 뿐만 아니라 PBS를 네가티브 대조표준으로서 사용하고, 효과를 일부 실험에서 포지티브 대조표준 알레르기원-특이적 모노클로날 항체와 비교하였다.

뮤린 알레르기 모델에서 알레르기 반응을 차단하는데 있어 폴리클로날 항체의 효능 평가

알레르기원 챌린지의 완료시에, 알레르기 반응을 안락사시킨 마우스상에서 기관지 세척(BAL)을 수행함으로써 평가하고, BAL 유체를 호산구, 호중구, 림프구및 마크로파지의 함량에 대한 차별적인 카운팅에 의해 검사하였다.

좌측 폐의 하엽 및 상엽을 수집하고 카르노이(Carnoy) 용액(6x 에탄올; 3x 빙초산; 1x 클로로포름)중에 20℃에서 약 15시간 동안 고정시켰다. 파라핀에 엠베딩시킨 후에 조직을 4 내지 5 ㎛ 절편으로 절단하였다. 각 마우스로부터 10개의 무작위로 분포된 기도 절편을 세포성 염증 및 점액성 폐색의 중증도에 대해 평가하였다. 기관지 주위 및 혈관주위 영역의 세포성 침윤을 백혈구(호산구, 림프구)의 존재에 대해 반-정량적으로 평가하였고, 0.5의 증가를 가지는 0 내지 5의 스케일상에서 정량하였다. 기관지 루멘의 점액성 폐색에 다음 측정치 0, 0 내지 10% 폐색; 1, 10 내지 30% 폐색; 2, 30 내지 60% 폐색; 3, 60 내지 90% 폐색; 4, 90 내지 100% 폐색을 사용한 점수를 할당하였다. 기도 상피에 대한 손상을 또한 균등한 스케일로 평가하였다. 모든 평가를 프로토콜 디자인에 대해 블라인딩된 개체에 의해 수행하였고 결과를 사진으로 기록하였다. 조직 절편들을 세포 염색을 위해 헤마톡실린 및 에오신 또는 점액 염색을 위해 헤마톡실린 및 과요오드산-시프(Schiff)를 사용하여 염색하였다.

마우스 혈액중의 전체 및 OVA-특이적인 IgE, IgG, IgG₁, IgG_2a및 IgG₃레벨을 상기 기술한 바와 같이 ELISA에 의해 측정하였다.

Claims (24)

1. 활성 성분으로서의 재조합 폴리클로날 또는 개별적인 모노클로날 항체 분자의 혼합물 또는 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체를 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 활성 성분이 재조합 폴리클로날 항체임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 활성 성분이 개별적인 모노클로날 항체의 혼합물임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
4. 제 1항에 있어서, 활성 성분이 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 항체가 반응하거나 결합하는 알레르기원을 포함하지 않음을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 또는개별적인 모노클로날 항체의 혼합물 또는 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체의 국소적 적용을 가능하게 해주는 1종 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 구강인두부, 비강, 기도, 위장관, 결막 점막, 질, 비뇨생식기 점막에 국소 투여되도록 되어 있거나 피부 적용되도록 되어 있음을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 기도가 코, 입, 인두, 기관지 또는 치조 점막을 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 용액, 분산제, 분말 또는 미소구체의 형태로 제공됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
10. 제 2항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체가 파아지 디스플레이 기술에 의해 생성됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체가, 하나의 벡터로부터 또다른 벡터로의 가변 영역 경쇄 및 중쇄 유전자 쌍의 벌크 이동을 가능하게 하면서 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 항체 분자를 엔코딩하는 면역글로불린 가변 영역 경쇄 및 중쇄 유전자 절편의 모(parental) 라이브러리로부터의 선택시에 존재하는 경우에 특이적인 면역글로불린 가변 영역 경쇄 및 중쇄 유전자 절편의 안정한 페어링(paring)이 가능해지도록 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 유전자 절편이 모 라이브러리에서 함께 연결되어 있는 조건하에서 생성됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
12. 제 10항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체가, 하나의 벡터로부터 또다른 벡터로의 특이적인 가변 영역 경쇄 및 중쇄 유전자 쌍의 벌크 이동을 가능하게 하면서 동물 또는 사람 개체의 본래의 폴리클로날 면역 반응에 존재하는 경우에 특이적인 면역글로불린 가변 영역 경쇄 및 중쇄 유전자 절편의 안정한 페어링이 가능해지도록 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 유전자 절편이 함께 연결되어 있는 조건하에서 생성됨을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
13. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 알레르기원이 집먼지 진드기, 예컨대, 더마토파고이데스 파리내(Dermatophagoides farinae) 또는 더마토파고이데스 프테로니시무스(D. pteronyssimus); 고양이, 개 또는 말로부터의 비듬; 수목화분, 예컨대 자작나무(베툴라 알바(Betula alba)), 오리나무, 개암나무, 참나무, 버드나무, 버즘나무, 너도밤나무, 느릅나무, 단풍나무, 물푸레나무, 쑥(아르테미시아(Artemisia)) 및 서나무로부터의 화분; 목초화분, 예컨대 큰조아재비(플레움 프라텐세(Phleum pratense)), 새포아풀(포아 프라텐세(Poa pratense)),호밀풀(롤리움 페레네(Lolium perenne)), 오차드 그래스(닥틸리스 글로메라타(Dactylis glomerata)), 두드러기쑥(암브로시아 아르테미시폴리아(Ambrosia artemisiifolia)), 향기풀(안톡산툼 오도라툼(anthoxanthum odoratum)) 및 호밀(세칼레 세레알레(Secale cereale))로부터의 화분; 또는 진균(예컨대, 알테르나리아 (Alternaria), 아르페르길루스(Aspergillus), 클라도스포리움(Cladosporium) 및 페니실리움(Penicillium))의 알레르기원임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 혼합물 또는 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체를 단위 투여 형태당 1 ㎍ 내지 1g, 바람직하게는 1 내지 1000 ㎍, 더욱 바람직하게는 2 내지 500 ㎍, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 50 ㎍, 가장 바람직하게는 10 내지 20 ㎍의 양으로 포함함을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
15. 알레르기의 예방 또는 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 폴리클로날 항체의 용도.
16. 알레르기원에 대한 내성의 예방학적 유도 또는 치료학적 유도를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 폴리클로날 항체의 용도.
17. 면역계의 조절을 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 폴리클로날 항체의 용도.
18. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리클로날 항체가 재조합 폴리클로날 항체임을 특징으로 하는 용도.
19. 제 15항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리클로날 항체가 개별적인 모노클로날 항체의 혼합물임을 특징으로 하는 용도.
20. 제 15항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리클로날 항체가 단리되거나 정제된 폴리클로날 항체임을 특징으로 하는 용도.
21. 제 15항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 조성물이 구강인두부, 비강, 기도, 위장관, 결막 점막, 질, 비뇨생식기 점막에 국소 투여되도록 되어 있거나 피부 적용되도록 되어 있음을 특징으로 하는 용도.
22. 제 15항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리클로날 항체가 조성물에 단위 투여 형태당 1 ㎍ 내지 1 g, 바람직하게는 1 내지 1000 ㎍, 더욱 바람직하게는 2 내지 500 ㎍, 더욱 더 바람직하게는 5 내지 50 ㎍, 가장 바람직하게는 10 내지 20 ㎍의 양으로 포함됨을 특징으로 하는 용도.
23. 환자가 알레그기 반응을 나타냈거나 이를 발생시키는 경향이 있는 알레르기원과 반응하거나 결합할 수 있는 충분한 양의 폴리클로날 항체를 포함하는 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 알레르기를 예방하거나 치료하는 방법.
24. 치료 받지 않은 경우 알레르기원에 대해 알레르기 반응을 나타내기 쉬운 비처리된 환자에게 알레르기원과 반응하거나 결합하여 환자에게서 알레르기원에 대한 내성을 유도시킬 수 있는 충분한 양의 폴리클로날 항체를 포함하는 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하여 알레르기원에 대한 내성을 유도시키는 방법.