CN101166542A - 用于治疗th2介导的疾病的kim-1抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了治疗Th2－介导的疾病和Th1－介导的疾病的组合物和方法。

Description

用于治疗TH2介导的疾病的KIM-1抗体
发明背景
特应性疾病如过敏性哮喘(allergic asthma)和特应性皮炎(atopicdermatitis)都被认为涉及向优势Th2免疫(predominant Th2 immunity)方面进行致病性转变(Umetsu等，2002，Nat Immunol.3：715-20)。
在哮喘中，Th2细胞因子的生成驱使嗜酸性粒细胞流入肺中、嗜酸性粒细胞活化、IgE生成且IgE介导肥大细胞活化并脱颗粒、单核细胞在肺间隙(lung interstitial space)中积累，T细胞和活化的粒细胞在这里继续分泌Th2细胞因子、趋化因子和效应分子，从而造成(fostering)持续的肺部炎症。含有KIM基因家族的TAPR基因座在小鼠中参与特应性炎症的发生，KIM-1等位基因变异在患病群体分析(patient population analyses)中被发现与特应性(atopy)的发生率有关(McIntire等，2001，Nat Immunol 2：1109-16；McIntire等，2003，Nature 425：576)。
发明概述
本发明是基于(至少是部分基于)以下发现：与KIM-1的特定区域结合的试剂(agent)(如抗体分子)可以有差别的调节Th1和/或Th2介导的免疫。例如，与KIM-1柄区(stalk region)或与KIM-1的唾液酸结合区结合的试剂，可调节Th2细胞因子的表达，并可用于治疗Th2介导的疾病如哮喘；与KIM-1的粘蛋白(mucin)区中特定表位结合的试剂，可减弱致病性Th1应答，并可用于治疗Th1介导的疾病，如炎性疾病(inflammatory disorder)或自身免疫病，如炎性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)、克隆病(Crohn’s disease)、多发性硬化(multiple sclerosis)、糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病(psoriasis)、急性移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植(transplant)、胰腺炎(pancreatitis)、迟发型超敏反应(DTH)。本发明还提供了可以用于治疗Th2和Th1介导的疾病的组合物和方法。
本发明一个方面提供了治疗疾病的方法，所述疾病是Th2介导的疾病，如哮喘(特别是过敏性哮喘)、过敏性鼻炎(allergic rhinitis)、变态反应(allergy)、湿疹(eczema)、以及其它特应性疾病。所述方法包括，对患有Th2介导的疾病的哺乳动物(优选人)给药与KIM-1柄区或与KIM-1的唾液酸结合基元结合的试剂。例如，所述方法可以包括给药药物组合物，所述组合物含有与KIM-1柄区或与KIM-1的唾液酸结合基元结合的单特异性抗体，如单克隆抗体(或其抗原结合片段)，给药量和给药时间导致足以治疗所述疾病。本文中，KIM-1柄区是指，位于KIM-1的粘蛋白区和跨膜区之间的带电荷区，且该区中含有高度保守的N连接糖基化位点。人KIM-1的柄区和唾液酸结合基元见图1。应理解，本文中提到这些区的N末端和C末端时，是模糊的概念，可以多几个(如1、2或3个)或少几个来自KIM-1序列的邻接残基。
在一实施方案中，所述试剂是与人KIM-1柄区结合的抗体。例如，所述抗体与具有序列DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO：1的氨基酸236-269)的肽结合。在一实施方案中，所述抗体结合具有序列LLTANTTKG(SEQ ID NO：1的氨基酸262-270)、HSLLTANTTKG(SEQ ID NO：1的氨基酸260-269)、FLEHSLLTANTTKG(SEQ ID NO：1的氨基酸257-270)、或NQTQLFLEHSLLTANTTKG(SEQ IDNO：1的氨基酸252-270)的肽。在另一些实施方案中，所述抗体与具有SEQID NO：1的氨基酸236-250或236-258所示序列的肽结合。
在一实施方案中，所述抗体结合KIM-1的唾液酸结合基元。例如，所述抗体结合(至少部分结合)包含在具有序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO：1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO：1的氨基酸29-42)的肽中、或与所述肽重叠的表位。在一实施方案中，所述抗体结合还原型和非还原型蛋白，即，它结合GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO：1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO：1的氨基酸29-42)的至少4，5，6，7，8，9，或10个邻接氨基酸残基的线性表位。
在另一实施方案中，所述抗体结合由序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO：1的氨基酸81-107)和RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO：1的氨基酸29-42)之一或两者组成的结构性表位。在一实施方案中，所述表位可以是包含在与重组小鼠KIM-1 IgV-人IgG1 Fc融合蛋白的8kDa TPCK胰蛋白酶片段对应的人KIM-1序列中的结构性表位。
在一实施方案中，所述抗体干扰SEQ ID NO：1的残基R86、W92和F93中的一个或多个，这些残基是唾液酸结合所必需的。
虽然可以理解，本文所述方法不局限于任何具体机制或理论，但所述抗体可以具有下列一或多个特征：(a)它干扰KIM-1的IgV区中的唾液酸结合基元与KIM-1柄区的一或多个N糖基化位点上展示的糖分子之间的相互作用，(b)它结合所述柄区中的一或多个N连接糖基化位点，或者对所述位点产生空间阻碍，(c)它抑制对KIM-1信号传递的下调，(d)它是激动剂抗体，例如，它通过结合来促进或增加经由KIM-1向下游传递信号，(e)它阻止KIM-1多聚化(multimerization)，(f)它结合所述柄区或者在空间上阻碍该柄区与共同受体(co-receptor)或配体的相互作用，从而破坏正常功能，(g)它干扰KIM-1的IgV区中的唾液酸结合基元与邻接KIM-1柄区的粘蛋白区的一或多个O糖基化位点上展示的糖分子之间的相互作用，(h)它改变Ig区的结构特征，因而改变蛋白构象，例如，通过改变或干扰二硫键或氢键来实现这种改变，(i)它改变KIM-1 Ig-区的结构特征或功能特征，因而改变与其它蛋白如KIM-1配体的结合。
在一实施方案中，所述抗体并不抑制KIM-1从细胞表面释出，例如，它不抑制KIM-1从培养的293Ebna(E293)细胞中释出。
在优选实施方案中，所述抗体是单特异性抗体，例如，所述抗体是单克隆抗体，例如人源化或完全人化(fully human)的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一实施方案中，所述疾病是过敏性哮喘。在该实施方案中，所述方法任选(optionally)还包括鉴定有患过敏性哮喘的风险或者已经患有过敏性哮喘的受试者。任选地，所述方法还包括评估受试者中的哮喘症状，如IgE水平、气道过度反应(airway hyperresponsiveness)、咳嗽(coughing)、喘鸣(wheezing)、胸闷(chest tightness)、呼吸困难(dyspnea)、气道平滑肌收缩(airwaysmooth muscle contraction)、支气管粘液分泌(bronchial mucus secretion)、炎症(inflammation)、血管舒张(vasodilation)、炎性细胞(如中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞)募集、杯状细胞增生(goblet cellhyperplasia)、肥大细胞或迁移中的炎性细胞释放炎性介质。所述评估步骤可以在给药步骤之前、期间和/或之后进行。所述评估可以由医师、其它提供健康护理服务者或者由该受试者进行。所述评估可以进行一次或多次，例如在给药后一或多次，例如在给药后的一周、一个月、两个月、三个月、六个月期间或更长时间内进行至少两次。
在一优选实施方案中，所述方法包括，测定给药所述试剂(或多次给药)是否减轻所述受试者中气道疾病的一或多个症状的严重程度或减少所述症状的发生。
在一些实施方案中，所述抗体与第二种有效治疗受试者哮喘的试剂一起给药，所述第二种试剂例如皮质类固醇(corticosteroid)、支气管扩张剂(bronchodilator)、白三烯调节剂(leukotriene modifier)、抗炎剂、抗IgE剂(如抗IgE抗体，如omalizumab(
Figure A20068001398900091
))。″一起给药(co-administered)″或″联用(administered in combination)″是指，同时给药或有间隔地给药，如隔周给药，使这些物质对患者的效果发生重叠。
在另一实施方案中，所述疾病是变态反应，如食物变态反应或季节性(如花粉)变态反应。可以通过以下一或多种方法诊断变态反应：进行过敏原(allergen)皮肤测试；测定血清IgE浓度(如IgE＞300ng/ml)；以及测定血清中的过敏原特异性IgE或IgG抗体。
所述抗体可以在以下一或多个时期给药：在特应性患者暴露于过敏原之前；在暴露于过敏原之后、但在出现症状之前；在出现症状之时；在出现症状之后。
在一实施方案中，所述试剂作为疗程来给药，如按预定的频率(如每天一次、每周一次、两周一次、或一个月一次)间歇给药(in periodicadministration)。在一些实施方案中，抗体的给药时间和/或给药量足以在一段时间(如3个月、6个月、1年或更长时间)内，减少(如大大减少)喘鸣、咳嗽、气促(shortness of breath)、胸闷(tightness in the chest)发作的频率或严重程度。
本发明另一方面提供了分离的与KIM-1柄区特异性结合的抗体或其抗原结合片段。所述抗体不抑制KIM-1从培养的E293细胞中释出。在一实施方案中，所述抗体结合人KIM-1柄区。例如，所述抗体结合具有序列DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO：1的氨基酸236-269)的肽。在一实施方案中，所述抗体结合具有序列LLTANTTKG(SEQ ID NO：1的氨基酸262-270)、HSLLTANTTKG(SEQ ID NO：1的氨基酸260-270)、FLEHSLLTANTTKG(SEQ ID NO：1的氨基酸257-270)或NQTQLFLEHSLLTANTTKG(SEQ ID NO：1的氨基酸252-270)的肽。在另一些实施方案中，所述抗体结合具有SEQ ID NO：1的氨基酸241-254、242-258、242-255所示序列的肽。
本发明另一方面提供了分离的、与KIM-1的唾液酸结合基元特异性结合的抗体或其抗原结合片段。例如，所述抗体结合(至少部分结合)包含在具有序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO：1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO：1的氨基酸29-42)的肽中的表位，或者与该肽重叠的表位。在一实施方案中，所述抗体结合还原型和非还原型蛋白，即它结合GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ IDNO：1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO：1的氨基酸29-42)的至少4、5、6、7、8、9或10个邻接氨基酸残基的线性表位。在另一实施方案中，所述抗体结合由序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO：1的氨基酸81-107)和RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO：1的氨基酸29-42)之一或两者构成的结构性表位。在一些实施方案中，所述表位是包含在与重组小鼠KIM-1 IgV-人IgG1 Fc融合蛋白的8kDa TPCK胰蛋白酶片段相对应的人KIM-1区中的结构性表位。在一实施方案中，所述抗体干扰SEQ ID NO：1的残基R86、W92和F93中的一个或多个，这些残基是唾液酸结合所必需的。
所述分离的抗体可以具有下列一或多个特征：(a)它干扰KIM-1的IgV区中的唾液酸结合基元与KIM-1柄区的一或多个N糖基化位点上展示的糖分子之间的相互作用，(b)它结合所述柄区中的一个或全部两个N连接糖基化位点，或者对所述位点产生空间阻碍，(c)它抑制对KIM-1信号传递的下调，(d)它是激动剂抗体，例如，它通过结合来促进或增加经由KIM-1向下游传递信号，(e)它阻止KIM-1多聚化，(f)它结合所述柄区与共同受体或配体的相互作用，或者空间上阻碍该相互作用，从而破坏正常功能，(g)它干扰KIM-1的IgV区中的唾液酸结合基元与邻接KIM-1柄区的粘蛋白区的一或多个O糖基化位点上展示的糖分子之间的相互作用，(h)它改变Ig区的结构特征，因而改变蛋白构象，例如，通过改变或干扰二硫键或氢键来实现这种改变，(i)它改变KIM-1 Ig-区的结构特征或功能特征，因而改变与其它蛋白如KIM-1配体的结合。
本发明另一方面涉及治疗Th1介导的疾病的方法，所述疾病例如以致病性或增强的Th1应答为特征的疾病。所述疾病包括炎性疾病和/或自身免疫病，如炎性肠病(IBD)、克隆病、多发性硬化、糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病、急性移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植、胰腺炎、迟发型超敏反应(DTH)。所述方法包括，对患有Th1介导的疾病的哺乳动物(优选人)给药与包含在序列VATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTT(SEQ IDNO：1的残基200-235)中的表位结合的试剂，所述试剂例如是抗体。例如，所述方法可以包括给药药物组合物，所述组合物含有与KIM-1的特定区域结合的单特异性抗体，如单克隆抗体(或其抗原结合片段)，给药量和给药时间导致足以治疗所述疾病。所述KIM-1的特定区域被发现在小鼠的KIM-1另路剪接变体中。应理解，本文中提到该区的N末端和C末端时，是模糊的概念，可以多几个(如1或2个)或少几个来自KIM-1序列的邻接残基。
在一实施方案中，所述抗体结合还原型和非还原型蛋白。
在优选实施方案中，所述抗体是单特异性抗体，如所述抗体是单克隆抗体，如人源化或完全人化的单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一实施方案中，所述疾病是炎性肠病(IBD)、克隆病、类风湿性关节炎、银屑病、急性移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植、胰腺炎、或迟发型超敏反应(DTH)。所述方法任选还包括鉴定有患上述任一种疾病的风险或者已患上述任一种疾病的受试者。
在一优选实施方案中，所述方法包括，测定给药所述试剂(或多次给药)是否减轻该受试者中所述疾病的一或多个症状的严重程度或减少所述症状的发生。
在一些实施方案中，所述抗体与第二种有效治疗受试者中所述疾病的试剂一起给药，所述第二种试剂例如皮质类固醇、或其它抗炎剂、DMARD、抗TNF疗法或抗CD20疗法。″一起给药″或″联用″是指，同时给药或有间隔地给药，如隔周给药，使这些物质对患者的效果发生重叠。
在一实施方案中，所述试剂作为疗程来给药，如按预定的频率(如每天一次、每周一次、两周一次、或一个月一次)间歇给药。在一些实施方案中，抗体的给药时间和/或给药量足以在一段时间(如3个月、6个月、1年或更长时间)内，减少(如大大减少)症状的频率或严重程度。
本文中，术语“治疗”是指，实施疗法，且治疗量、治疗方式(manner)和/或治疗模式(mode)导致有效改进病理性疾病(pathological condition)特有的症状或参数；降低病理性疾病特有的症状或参数的严重程度；阻止、延缓或逆转该病理性疾病的进展；或预防该病理性疾病的一或多个症状或参数。
本文中，与KIM-1的指定区域“结合的试剂”是指，与该指定区域以小于10-6 M的Kd结合的任何化合物。一例KIM-1结合试剂是KIM-1结合蛋白，如KIM-1结合抗体，优选单特异性抗体。
本文中术语“唾液酸结合区”、“唾液酸结合基元”、和“唾液酸结合所需”、以及这些术语的变化形式是指，与在结合唾液酸的Ig类凝集素(涎免凝集素(Siglec))家族中鉴定出的、结合糖分子所需的氨基酸残基、氨基酸序列、以及氨基酸二级和三级结构相似或同源的氨基酸残基、氨基酸序列、以及氨基酸二级和三级结构。
术语“抗体或其抗原结合片段”是指蛋白，其包括至少一个免疫球蛋白可变区，如提供足以特异性结合抗原的免疫球蛋白可变区或免疫球蛋白可变区序列的氨基酸序列。例如，该术语包括具有重链(H)可变区(缩写VH)和轻链(L)可变区(缩写VL)的抗原结合蛋白。在另一例中，该术语包括含有两个重链(H)可变区和两个轻链(L)可变区的抗原结合蛋白。该术语还包括抗体的抗原结合片段(如单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、和dAb片段)以及完整抗体，如IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(及其亚型)的完整幼稚(intact)免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻链可以是kappa型或lambda型。在一实施方案中，抗体是糖基化抗体。抗体可以具有抗体依赖性细胞毒活性和/或补体-介导的细胞毒活性，或者可以不具有上述一种或全部两种活性。VH和VL区可以进一步细分成：被称为“互补决定区”(“CDR”)的超变区，以及多个超变区之间间插的更为保守、被称为“框架区”(FR)的区。FR和CDR的范围是确定的(间Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest，Fifth Edition，US Department of Health and人Services，NIH Publication No.91-3242；Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.196：901-917)。Kabat定义在本文中使用。每一个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，它们按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
以上概述和以下说明都不对权利要求的发明构成限制。
附图说明
图1是带注解的人KIM-1多肽序列(SEQ ID NO：1)(不含信号序列，也不含插入多态性(insertional polymorphism)MTTVP)，显示了本文所述的各种区。
图2显示，用OVA进行气溶胶攻击(aerosol challenge)、并用3A2进行治疗后，支气管灌洗液(bronchial lavage fluid，BAL)中的嗜酸性粒细胞百分比(y轴)。
图3显示，洗出(draining)的(支气管)淋巴结细胞用OVA抗原进行体外(ex vivo)刺激、并用3A2进行治疗后的增殖。Y轴是滴定出的胸苷掺入量，以cpm表示。
图4显示洗出的(支气管)淋巴结细胞对OVA抗原体外刺激的反应。LN在经OVA气溶胶攻击后收集，用OVA进行体外培养并用3A2进行治疗。取这些培养物的上清液，分析TH2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)的生成。Y轴是皮克(pg)/ml。
图5显示3A2与固相蛋白的结合曲线。MAb 3A2等效地结合mKIM-1-ECD-Fc(圆)、mKIM-1-137-216-Fc(三角)、和mKIM-1-196-216-Fc(菱形)，但不结合mKIM-1-IgV-Fc(正方形)。
图6显示，用OVA进行气溶胶攻击、并用4A2进行治疗后，支气管灌洗液(BAL)中嗜酸性粒细胞和淋巴细胞的百分比(y轴)。
图7显示洗出的(支气管)淋巴结细胞对OVA抗原体外刺激及4A2治疗的反应。LN在经OVA气溶胶攻击后收集，用OVA进行体外培养。取这些培养物的上清液，分析TH2细胞因子(IL-4、IL-5、IL-10和IL-13)的生成。Y轴是皮克(pg)/ml。
图8显示，用OVA进行气溶胶攻击、并用4A2进行治愈性治疗(therapeutic treatment)后，支气管灌洗液(BAL)中嗜酸性粒细胞的百分比(y轴)。
图9显示mAb 4A2与纯化的KIM-1蛋白的结合曲线。
发明详述
如本文所述，用抗体疗法靶定KIM-1的特定区域，可以对Th2和Th1细胞因子表达产生严格的控制，并提供了治疗Th2介导的疾病和其它特应性疾病，以及治疗Th1介导的疾病的治疗策略。
抗体生成(Antibody Generation)
与KIM-1柄区或KIM-1的唾液酸结合基元结合的抗体可以通过免疫(例如用动物进行免疫)、或通过体外方法如噬菌体展示方法而生成。包含KIM-1的靶表位(如KIM-1柄区或KIM-1的唾液酸结合基元)的多肽可以用作免疫原。在另一些实施方案中，KIM-1多肽的较大一部分，例如胞外区，可以用作免疫原，并可以对所得抗体筛选与目标KIM-1区或结构域的反应性。
在一实施方案中，经免疫的动物含有产生免疫球蛋白的细胞，这些细胞具有天然的、人化的或部分人化的免疫球蛋白基因座。在一实施方案中，所述非人动物包含人免疫球蛋白基因的至少一部分。例如，可以用人Ig基因座的大片段对抗体生成有缺陷的小鼠品系进行改造。可以用杂交瘤技术从具有所需特异性的基因生成并筛选出抗原特异性单克隆抗体。参见例如XenoMouseTM，Green等Nature Genetics 7：13-21(1994)，US2003-0070185，美国专利5,789,650以及WO 96/34096。
还可以在例如啮齿类动物中产生抗KIM-1的非人抗体。可以将这种非人抗体人源化，例如参见美国专利6,602,503，EP 239 400，美国专利5,693,761，和美国专利6,407,213。
EP 239 400(Winter等)描述了通过将一个物种的抗体(指定可变区内)的互补决定区(CDR)用另一物种的CDR取代，从而改变抗体的方法。CDR-取代型抗体可比真正的嵌合抗体较少激发人的免疫应答，因为CDR-取代型抗体中的非人成分很少(Riechmann等，1988，Nature 332，323-327；Verhoeyen等，1988，Science 239，1534-1536)。通常利用重组核酸技术，将鼠抗体的CDR取代为人抗体的相应区，产生编码所需取代型抗体的序列。可以添加具有所需同种型(isotype)的人恒定区基因节段(通常是CH的gamma I和CL的kappa)，并使人源化的重链基因和轻链基因在哺乳动物细胞中一起表达，从而产生可溶性人源化抗体。
Queen等，1989和WO 90/07861描述了一种方法，其包括，通过利用计算机分析与原始鼠抗体的V区框架的最佳蛋白序列同源性，来选择人V区框架区，并建立鼠V区的三级结构模型，从而显示出很有可能与鼠CDR相互作用的框架氨基酸残基。然后将这些鼠氨基酸残基置于同源人框架之上。也参见美国专利5,693,762；5,693,761；5,585,089；和5,530,101。Tempest等(1991，Biotechnology 9：266-271)利用分别源自NEWM和REI重链和轻链的V区框架作为标准，在不引进小鼠残基的情况下，进行CDR-移植。用Tempest等的方法构建基于NEWM和REI的人源化抗体的一个好处在于，NEWM和REI的可变区的三维结构已通过X-线晶体成像技术弄清楚了，因而可以针对CDR和V区框架残基之间的特异性相互作用建立模型。
非人抗体可以经过修饰而包括插入人免疫球蛋白序列的取代，例如在具体位置的共有的人氨基酸残基，例如以下一或多个(优选至少5，10，12，或全部)位置：(在轻链可变区的FR中)4L，35L，36L，38L，43L，44L，58L，46L，62L，63L，64L，65L，66L，67L，68L，69L，70L，71L，73L，85L，87L，98L，和/或(在重链可变区的FR中)2H，4H，24H，36H，37H，39H，43H，45H，49H，58H，60H，67H，68H，69H，70H，73H，74H，75H，78H，91H，92H，93H，和/或103H(遵循Kabat编号)。参见，例如美国专利6,407,213。
与目标KIM-1区结合的完全的人单克隆抗体可以利用例如体外刺激(invitro-primed)的人脾细胞来制备，参见Boerner等，1991，J.Immunol.，147，86-95。它们可以通过所有组分克隆(repertoire cloning)来制备，参见Persson等，1991，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，88：2432-2436或Huang和Stollar，1991，J.Immunol.Methods 141，227-236；以及美国专利5,798,230。大型非致敏人噬菌体展示文库也可以用于分离高亲和力抗体，将它们研发为人类治疗剂，这可以利用标准噬菌体技术(参见，例如Vaughan等，1996；Hoogenboom等(1998)Immunotechnology 4：1-20；Hoogenboom等(2000)Immunol Today2：371-8；US 2003-0232333)。
本文中，“免疫球蛋白可变区序列”是指，可形成免疫球蛋白可变区结构的氨基酸序列。例如，所述序列可包括天然可变区的全部或部分氨基酸序列。例如，所述序列可省略1个、2个或更多个N-端或C-端氨基酸、内部氨基酸，可包括一或多个插入或额外的末端氨基酸，或者可包括其它改变。在一个实施方案中，含有免疫球蛋白可变区序列的多肽可以与另一免疫球蛋白可变区序列结合，形成靶结合结构(或“抗原结合位点”)，例如与KIM-1的指定区域相互作用的结构。
抗体的VH或VL链还可以包括重链恒定区或轻链恒定区的全部或部分，以分别形成免疫球蛋白重链或轻链。在一个实施方案中，抗体是具有两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体。免疫球蛋白重链和轻链可以经二硫键相连。重链恒定区一般包括三个恒定区：CH1、CH2和CH3。轻链恒定区一般包括CL区。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合区。抗体恒定区一般介导抗体与宿主组织或因子(包括免疫系统的多种细胞(如效应细胞)和经典补体系统的第一种成分(Clq))的结合。
抗体的一或多个区可以是人的、被有效人化或人源化。例如，一或多个可变区可以是人的或被有效人化。例如，一或多个CDR，例如HC CDRl，HC CDR2，HC CDR3，LC CDR1，LC CDR2，和LC CDR3可以是人的。每一轻链CDR可以是人的。HC CDR3可以是人的。一或多个框架区，例如HC或LC的FR1，FR2，FR3，和FR4可以是人的。在一个实施方案中，所有框架区都已经是人的，例如源自人的体细胞，例如生成免疫球蛋白的造血细胞、或非造血细胞。在一个实施方案中，所述人的序列是种系(germline)序列，例如由种系核酸编码的序列。一或多个恒定区可以是人的、被有效人化或人源化。在另一实施方案中，框架区(如FR1、FR2、和FR3一起，或FR1、FR2、FR3、和FR4一起)的至少70％，75％，80％，85％，90％，92％，95％，或98％或整个抗体可以是人的、被有效人化或人源化。例如，FR1，FR2，和FR3一起可以至少70％，75％，80％，85％，90％，92％，95％，98％，或99％与由人的种系节段(germline segment)编码的人的序列相同。
“有效人化”免疫球蛋白可变区是，含有足够数量的人框架氨基酸位置、因而在正常人体内不激发免疫应答的免疫球蛋白可变区。“有效人化”抗体是，含有足够数量的人氨基酸位置、因而不在正常人体内激发免疫应答的抗体。
“人源化”免疫球蛋白可变区是经过修饰的免疫球蛋白可变区，所述修饰致使修饰后的形式在人体内激发的免疫应答比未经修饰的形式激发的应答弱，例如免疫球蛋白可变区经过修饰含有足够数量的人框架氨基酸位置、因而该免疫球蛋白可变区在正常人体内不激发免疫应答。对“人源化”免疫球蛋白的描述包括例如美国专利6,407,213和5,693,762。在一些情况中，人源化免疫球蛋白可以在一或多个框架氨基酸位置包含非人氨基酸。
抗体的全部或部分可以由免疫球蛋白基因或其节段编码。人免疫球蛋白基因例如有kappa，lambda，alpha(IgA1和IgA2)，gamma(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4)，delta，epsilon和mu恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25Kd或214个氨基酸)在NH2-末端(约110个氨基酸)由可变区基因编码，在COOH-末端由kappa或lambda恒定区基因编码。同样，全长免疫球蛋白“重链”(约50Kd或446个氨基酸)由可变区基因(约116个氨基酸)和上述其它恒定区基因之一，例如gamma(编码约330个氨基酸)编码。
术语全长抗体的“抗原结合片段”是指，全长抗体的一或多个保留与目标靶特异性结合的能力的片段。由术语全长抗体的“抗原结合片段”所涵盖的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，是单价片段，由VL，VH，CL和CH1区组成；(ii)F(ab′)2片段，是二价片段，包括两个经二硫桥在铰链区相连的Fab片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1区组成；(iv)Fv片段，由抗体单臂的VL和VH区组成；(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，由VH区组成；和(vi)分离的保留功能的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的VL和VH区分别由不同基因编码，但可以利用重组方法将它们用合成的连接子连接，使它们能够形成单链蛋白，从而其中的VL和VH区配对形成已知为单链Fv(scFv)的单价分子。参见，例如Bird等(1988)Science242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883。
抗体制备(Antibody Production)
抗体可以在原核细胞和真核细胞中产生。在一个实施方案中，抗体(如scFv)在毕赤酵母(Pichia)(参见，例如Powers et al.(2001)J Immunol Methods.251：123-35)、汉逊酵母(Hanseula)或糖酵母(Saccharomyces)等酵母细胞中表达。
在一个实施方案中，抗体，尤其是全长抗体，例如IgG，在哺乳动物细胞中生成。用于重组表达的哺乳动物宿主细胞例如有，中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，见Urlauband Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，使用DHFR选择标记，例如见Kaufman and Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621)、淋巴细胞系例如NS0骨髓瘤细胞和SP2细胞、COS细胞、K562、以及转基因动物(例如转基因哺乳动物)的细胞。例如，所述细胞是哺乳动物上皮细胞。
重组表达载体除了携带编码免疫球蛋白区的核酸序列，还可以携带其它核酸序列，如调节该载体在宿主细胞中的复制的序列(如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有利于选出引入了所述载体的宿主细胞(参见，例如美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017)。选择标记基因例如有，二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(其利用氨甲蝶呤选择/扩增dhfr-宿主细胞)和neo基因(其用于G418筛选)。
在一例抗体(如全长抗体或其抗原结合部分)重组表达系统中，将编码抗体重链和抗体轻链两者的重组表达载体，通过磷酸钙介导的转染，引入dhfr-CHO细胞。在该重组表达载体中，抗体的重链和轻链基因各自与增强子/启动子调节元件(如源自SV40、CMV、腺病毒等，诸如CMV增强子/AdMLP启动子调节元件或SV40增强子/AdMLP启动子调节元件)可操作相连，以便驱动所述基因的高水平转录。所述重组表达载体还可以携带DHFR基因，其允许用氨甲蝶呤选择/扩增转染了所述载体的CHO细胞。对选出的转化宿主细胞进行培养，使之表达抗体重链和轻链，并从培养基中回收完整抗体。用标准分子生物学技术制备所述重组表达载体，来转染宿主细胞，选出转化体，培养宿主细胞，并从培养基中回收抗体。例如，一些抗体可以利用蛋白A或蛋白G通过亲和层析进行分离。
抗体还可以包含修饰，例如改变Fc功能的修饰，从而例如减弱或消除与Fc受体和/或与Clq的相互作用。例如，人IgG1恒定区可以突变一或多个残基，例如残基234和237的一或多个，编号例如见美国专利5,648,260。其它修饰例子可参见美国专利5,648,260。
对于一些含Fc区的抗体，可以设计抗体制备系统，来合成含糖基化Fc区的抗体。例如，IgG分子的Fc区在CH2区的天冬酰胺297处糖基化。该天冬酰胺是用双触角型寡糖(biantennary-type oligosaccharide)进行修饰的位置。这种糖基化参与Fcγ受体和补体Clq所介导的效应器功能(Burton andWoof(1992)Adv.Immunol.51：1-84；Jefferis等(1998)Immunol.Rev.163：59-76)。Fc区可以在哺乳动物表达系统中产生，从而使对应于天冬酰胺297的残基适当糖基化。Fc区也可以包含其它的真核细胞翻译后修饰。
抗体也可以由转基因动物产生。例如，美国专利5,849,992描述了在转基因哺乳动物乳腺中表达抗体的方法。构建转基因，使其含有乳特异性启动子、编码目标抗体(如本文所述抗体)的核酸序列、以及用于分泌的信号序列。由这类转基因哺乳动物中的雌性动物产出的乳汁含有分泌至其中的目标抗体(如本文所述抗体)。所述抗体可以从乳汁中纯化出来，或在一些应用中，不经纯化而直接使用。
抗体还可以用例如改进其在循环(如血液、血清、淋巴)、支气管肺泡灌洗液或其它组织中的稳定性和/或滞留时间的组分(moiety)进行修饰，所述改进例如是改进至少1.5、2、5、10、或50倍。
在一例中，KIM-1结合抗体可以与聚合物结合，所述聚合物例如基本上无抗原性的聚合物，如聚环氧烷烃(polyalkylene oxide)或聚环氧乙烷(polyethylene oxide)。合适的聚合物分子量可以差别很大。可以采用分子量平均约200-约35,000道尔顿(或约1,000-约15,000、以及2,000-约12,500)的聚合物。
在另一例中，KIM-1结合抗体可以与水溶性聚合物偶联，所述聚合物例如亲水聚乙烯聚合物，如聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。这类聚合物的非限制性例子有，聚环氧烷烃均聚物如聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇(polyoxyethylenated polyols)、它们的共聚物和嵌段共聚物，只要维持所述嵌段共聚物的水溶性即可。其它可用的聚合物包括，聚氧化烯(polyoxyalkylenes)如聚氧化乙烯(polyoxyethylene)、聚氧化丙烯(polyoxypropylene)、以及聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段共聚物(Pluronics)；聚甲基丙烯酸酯(polymethacrylates)；丙烯酸共聚物(carbomer)；含有以下单糖的分支或非分支多糖：D-甘露糖、D-及L-半乳糖、岩藻糖(fucose)、果糖、D-木糖(xylose)、L-阿拉伯糖、D-葡糖醛酸(glucuronic acid)、唾液酸(sialicacid)、D-半乳糖醛酸(galacturonic acid)、D-甘露糖醛酸(mannuronic acid)(如聚甘露糖醛酸或藻酸(alginic acid))、D-葡糖胺(glucosamine)、D-半乳糖胺(galactosamine)、D-葡萄糖和神经氨酸(neuraminic acid)包括同多糖(homopolysaccharide)和杂多糖(heteropolysaccharide)如乳糖、支链淀粉(amylopectin)、淀粉(starch)、羟乙基淀粉、直链淀粉(amylose)、硫酸葡聚糖(dextrane sulfate)、葡聚糖(dextran)、糊精(dextrin)、糖原(glycogen)、或酸性粘多糖(acid mucopolysaccharide)的多糖亚基，如透明质酸(hyaluronic acid)；糖醇聚合物如聚山梨糖醇(polysorbitol)和聚甘露糖醇(polymannitol)；肝素(heparin)或heparon。
用途和给药方法
在本文所述方法中，对受试者给药与KIM-1具体区域结合的试剂(如抗体)，以治疗Th2介导的疾病或Th1介导的疾病。接受治疗的受试者是哺乳动物，例如人。
“给药(Administration)”不限于任何具体的配制剂(formulation)、递送体系(delivery system)、或途径，可以包括例如支气管内(intrabronchial)、非胃肠道(包括皮下、静脉、髓内(intramedullary)、关节内(intraarticular)、肌肉、或腹腔(intraperitoneal)注射)直肠、表面局部(topical)、经皮(transdermal)、或口服(例如胶囊、悬液、或片剂)。给药可以是，在单次剂量中或在重复多次剂量中，给药含有生理可接受的盐形式和/或可药用赋形剂(excipient)的多种药物组合物中的任一种。生理可接受的盐形式、药物配制剂、以及赋形剂是本领域已知的(参见，例如2004 Physicians’Desk
Figure A20068001398900201
(PDR)(2003)Thomson Healthcare，第58版；Gennado等，(2000)，第20版，Lippincott，Williams & Wilkins)Remington：The Science and Practice of Pharmacy)。
有多种治疗剂可以有效用于管理(management)和治疗哮喘。它们包括但不限于，用于放松气道的支气管扩张剂，如抗胆碱能的支气管扩张剂(如异丙托品(ipratropium bromide)，羟甲叔丁肾上腺素(albuterol)/异丙托品)；用于放松气道肌肉的beta激动剂(如肾上腺素(epinephrine)、间羟异丙肾上腺素(metaproterenol)、间羟叔丁肾上腺素(terbutaline)、甲磺酸乙基异丙肾上腺素(isoetharinemesylate)、乙基异丙肾上腺素(isoetharine)、异丙肾上腺素(isuprel)、吡布特罗(pirbuterol)、羟甲叔丁肾上腺素、沙美特罗(salmeterol)、比托特罗(bitolterol))；用于减少炎症的口服型或吸入型皮质类固醇(如氢化可的松(hydrocortisone)、可的松(cortisone)、地塞米松(dexamethasone)、强的松龙(prednisolone)、强的松(prednisone)、甲基强的松龙(methylprednisolone)、氟尼缩松(flunisolide)、氟羟强的松龙(triamcinolone)、丙酸倍氯米松(beclomethosone)、地塞米松、氟替卡松(fluticasone)、布地缩松(budesonide))；用于防止气道肿胀并减少粘液生成的白三烯调节剂(如扎鲁司特(zafirlukast)、孟鲁司特钠(montelukast sodium)、弃白通(zileuton))；以及茶碱(theophylline)，在其多种用途中，包括帮助打开气道并减少粘液释放。抗哮喘剂还包括治疗性抗体(或其功能片段)，包括但不限于，抗IgE、抗IL-9、抗IL-3、抗IL-4、抗IL-5、抗IL-13、抗VLA蛋白、和抗移动抑制因子(MIF)。本文所述抗体可以与一或多种上述试剂联用而治疗过敏性哮喘。
治疗剂可以有效管理和治疗Th1-介导的炎性疾病，包括抗炎性化合物，如类固醇(steroid)和NSAID。
在一个动物模型中实现有效治疗的剂量，可以用已知的换算系数(conversion factor)换算后用于其它动物(包括人)，所述系数参见例如Freireich等(1966)Cancer Chemother.Reports，50(4)：219-244。
以下实施例旨在举例说明实施方案。这些实施例无论如何都不对本发明构成限制。本领域技术人员可以理解，在本发明范围内可以进行多种改良和变化。这些改良和变化因此都被本发明涵盖。
实施例
实施例1：鉴定抗小鼠KIM-1的大鼠单克隆抗体
鼠KIM-1的全长胞外区表达构建体和仅有IgV区的表达构建体用标准PCR和克隆技术产生，并稳定转染到CHO细胞中。这些融合蛋白通过蛋白A层析和SEC层析从CHO细胞系上清液中纯化出来。与人IgG1-Fc区融合的全长KIM-1看上去是双联体(doublet)，与差异糖基化(differentialglycosylation)一致。大鼠用由完整胞外区组成的全长小鼠KIM-1-Ig融合蛋白免疫。一组抗mKIM-1的大鼠单克隆抗体用ELISA试验和FACS筛选法进行鉴定，其中的一些抗体还通过Biacore(Biacore表面等离子共振仪)、以及通过区(domain)特异性ELISA和Western印迹分析进行鉴定，结果表明，该组中包含结合不同表位的多种抗体。因此，有7种抗体在Biacore和ELISA分析中结合全长蛋白，但其中有4种不与仅编码IgV区的蛋白结合(表1)。在4种于Biacore模式中表现为需要粘蛋白-柄区的存在才能结合的抗体中，有3种进一步经ELISA和Western印迹分析确定与粘蛋白区结合，1种则在柄区结合(表1)。多种抗体识别粘蛋白区中由外显子4编码的特有区(表1)。因此，鉴定出识别IgV、粘蛋白、以及柄区的抗体。表1显示了大鼠抗mKIM-1mAb的总体(gross)表位作图结果。表1的数据是用KIM-1-Ig的全长胞外区(ECD)、KIM-1-IgV-Ig、及KIM-1-Ig蛋白的水解片段进行多项试验(Biacore、ELISA、Western印迹、和FACS)汇总得到的。
表1
ECD区 IgV区   ECD由另路剪接的外显子编码的最小区(minus region) 仅有柄区
  1H9   +   +   +   -
  1D9   +   -   -   -
  1C11   +   -   -   -
  3A2   +   -   +   +
  1H8   +   -   -   -
  4A2   +   +   +   -
  2A7   +   +   +   -
*预测的结果
实施例2：在高活性肺(hyperactive lung)中诱导KIM-1表达
Balb/c小鼠用OVA/明矾(alum)进行两次引发免疫(prime)，休息3周后，用喷雾器(nebulizer)使该小鼠连续3天暴露于OVA气溶胶。收集肺组织、洗出的(支气管)淋巴结(LN)和脾脏，通过RT-PCR检测KIM-1表达的诱导情况。在支气管LN和肺组织中，直到喷雾之后24小时，KIM-1讯息(message)都被诱导。与KIM-1mRNA水平不同的是，KIM-3mRNA水平在用OVA气溶胶攻击后未受到调节。KIM-2水平被上调，其方式与KIM-1相似。
实施例3：抗KIM-1抗体对OVA-诱导的超反应(hyper-responsiveness) 的影响
用OVA气溶胶模型，以及预防性剂量方案和治疗性剂量方案，测试具有不同的表位特异性的抗KIM-1抗体影响肺部炎症发展的能力。
在预防性研究中，OVA诱导的肺部炎症和回忆试验(recall assay)如下进行：Balb/c小鼠在第1天和第7天腹腔(ip)注射100μl 0.5mg/ml OVA(Grade V，Sigma)与100μl ImjectAlum(Pierce，Rockford IL USA)的混合物。第二次注射的三周后，用超声喷雾器(Devilbiss，Carlsbad CA USA)，使小鼠连续3天每天暴露于1％OVA-PBS气溶胶20分钟。mAbs剂量方案如下：在第1，3，6和9天腹腔注射200μg，然后，在开始喷雾的当天，腹腔注射500μg。
在治疗性研究中，小鼠如上所述用OVA的明矾制剂免疫，但直到马上要进行一系列喷雾之前，一直都未给予mAb：即，在第一次喷雾的前一天，给予250μg mAb 4A2，在第二次喷雾的当天早上(morning)给予250μg mAb4A2。
在预防性研究和治疗性研究中，都是在最后一次喷雾结束的两天后，将小鼠处死，进行分析。经气管切开术(tracheotomy)收集支气管灌洗液(BAL)，用含0.1％BSA和0.02mM EDTA的PBS洗3次。BAL细胞用cytospin沉降(pellet)，用载玻片(Shandon，Pittsburgh，PA USA)覆盖，然后在空气中干燥，用Hema3染料(Fisher Scientific，Pittsburgh PA USA)染色，鉴别不同的细胞群。将肺组织收集在中性缓冲的福尔马林溶液(neutral buffered formalin)中进行常规组织学检查，或者在trizol中速冻(snap-frozen)，接着分离RNA。收集洗出的(支气管)淋巴结和脾脏，分离单核细胞，将这些细胞放置在含有不同浓度的OVA的RPMI/10％FBS中进行培养。72小时后，收集上清液，细胞则用1uCi氚标记的胸苷(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ USA)脉冲8小时，平板用Microbetajet system(Wallac，Gaithersburg，MD USA)计数。上清液用CBA Th1/Th2及炎症试剂盒(CBA Th1/Th2 and Inflammation kits，BD Biosciences)和IL-13 ELISA试验(R & D Systems，Minneapolis MN USA)进行分析。
结果：
小鼠在OVA引发免疫阶段以及攻击阶段被给予抗体。攻击后，收集支气管灌洗液(BAL)、支气管淋巴结、脾脏、和肺组织。算出BAL中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、和淋巴细胞的百分率。mAb 1H8在治疗组小鼠的BAL中诱导出高活力(robust)嗜酸性粒细胞计数，使嗜酸性粒细胞百分率比对照高出两倍还多。另外还发现，中性粒细胞和淋巴细胞的百分率有中等程度的增加，这两种细胞构成了BAL细胞组成(cellularity)中的一小部分。与该结果一致，从经1H8处理并经OVA体外攻击的小鼠中分离出的支气管LN细胞，比对照培养物增殖更活跃，且表达更高水平的Th2相关细胞因子。尤其是，相对于对照而言，产生了非常高水平的IL-5和IL-13，而IL-4、IL-6、和IL-10的水平也有升高。有趣的是，IFN-γ水平也升高，但该细胞因子的总体水平较低。优先诱导Th2细胞因子对于Th1细胞因子依赖性病理情况，如多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、克隆病，是有效的。
与1H8不同，在支气管淋巴结回忆试验中，mAb 3A2减少BAL中的嗜酸性粒细胞百分率，并减少Th2相关细胞因子的生成(图2)。即，抗体1H8和3A2在该试验中具有相反的效果。其它几种抗体，包括识别IgV区中的表位的1H9，在该模型中对于肺部炎症或细胞因子生成不产生影响。分析洗出的(支气管)淋巴结细胞对OVA抗原和3A2体外刺激的反应，结果表明，细胞对抗原刺激发生反应而出现的增殖减少(图3)。此外，分析这些培养物的上清液的结果表明，Th2细胞因子包括IL-4、IL-5、和IL-10的表达明显减少(图4)。该试验中，IL-13的水平也减少。
用抗Ig区的mAb 4A2进行治疗，导致经OVA致敏并经喷雾处理后回流到BAL中的嗜酸性粒细胞和淋巴细胞大大减少(图6)。BAL中的嗜酸性粒细胞百分率比对照平均减少84％(p＜0.0001，平均等值检验(test of meanequivalence))，淋巴细胞百分率比对照平均减少90％(p＜0.001，平均等值检验)。当支气管淋巴结细胞用OVA再次进行体外刺激时，Th2细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-10、和IL-13的生成明显减少(图7)。可见，用mAb 4A2进行治疗减少了肺部炎症，并减少了与哮喘反应有关的细胞因子的生成。
为了进一步鉴定mAb 4A2的临床效力，进行治疗性用药实验。在该模型中，对小鼠进行免疫，使之对OVA抗原敏感，但不给予任何mAb治疗。然后，让小鼠休息3周，也是不进行任何治疗，接下来，在用1％OVA进行3轮喷雾的第1轮开始的前一天，给予4A2 mAb。在第二轮喷雾之前，反复给予mAb。该治疗方案导致肺部炎症减少，可通过测量嗜酸性粒细胞回流到BAL中的量来反映(图8)。嗜酸性粒细胞百分率平均减少70％(p＜0.001，平均等值检验)。可见，在OVA诱导肺部炎症的模型中，mAb 4A2对于预防性剂量方案和治疗性剂量方案都有效。这提示，4A2所识别的表位是治疗Th2介导的疾病的相关治疗目标。
其它抗KIM-1 mAb经证实也在OVA诱导肺部炎症的模型中具有治疗活性，这些抗体包括，例如mAb 2A7和mAb 2B3。在
Figure A20068001398900241
试验中，结果显示，mAb 2A7与4A2竞争结合固相KIM-1，这表明它们分享相同或重叠的表位。
实施例4：KIM-1抗体对CD4T细胞的抗原应答的影响
抗KIM-1 mAb的活性用KLH抗原回忆试验进行评估。小鼠用抗KIM-1mAb、对照mAb、或PBS进行处理，接着用KLH进行免疫，6天后切出洗过的LN。分离出LN CD4+T细胞，在有从未处理的小鼠分离得到、并接受了辐射的全部脾细胞存在的条件下，LN CD4+T细胞用纯化的OVA进行体外再刺激。体外刺激的48小时后，测定细胞增殖和细胞因子生成。在该试验中，多种抗KIM-1 mAb有明显的效果。mAb 1H8大大增加T细胞对KLH体外攻击产生反应所导致的细胞增殖。相反，mAb 3A2在该试验中减少T细胞增殖。测定培养物中由接受mAb 1H8处理的细胞所产生的细胞因子。结果发现，经处理的培养物比对照含有更多的IFN-γ和TH2相关细胞因子。但TNF和IL-2的水平与对照相似。
该信息表明，1H8可以减少致病性Th1应答。该信息还表明，1H8以及其它结合KIM-1中本文针对1H8所限定的区的抗体可以作为佐剂增强免疫应答。本发明还涉及增强免疫应答的方法，例如增加疫苗效果的方法。上述的佐剂活性(adjuvancy)也可以用在免疫接种、免疫缺陷、以及抗肿瘤免疫中。
在Western印迹中，1H8结合Balb/C序列的KIM-1ECD但不结合Dba/2序列的KIM-1 ECD。这表明，该抗体结合另路剪接的、具有序列EPTTFCPHETTAEVTGIPSHTPT(SEQ ID NO：2)的小鼠等位基因变体。所述序列与人KIM-1的序列VATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTT(SEQ ID NO：1的氨基酸200-235)对应。
实施例5：鉴定mAb 3A2
鉴于3A2mAb在OVA模型中显示治疗效果，因此更详细鉴定了它与KIM-1的结合。
在ELISA试验中，用多种纯化蛋白测定mAb 3A2的表位(表2)。就3A2与固相蛋白的相互作用生成全部结合曲线(图5)。MAb 3A2与下列小鼠蛋白等效结合：鼠KIM-1胞外区(KIM-1-ECD-1-216)、mKIM-1-137-216和mKIM-1-196-216-Fc。相反，mAb 3A2不与单独的mKIM-1-IgV区结合，该区缺乏完整的粘蛋白和柄区。该信息表明，3A2的表位在mKIM-1的196-216位所示21个氨基酸残基中，该区域是KIM-1柄区的一部分。此表位等同于人KIM-1的247-272，见图1。
表2
  区域   序列   3A2结合
  mKIM-1-ECD(1-216)   SYVEVKGVVGHPVTLPCTYSTYRGITTTCWGRGQCPSSACQNTLIWTNGHRVTYQKSSRYNLKGHISEGDVSLTIENSVESDSGLYCCRVEIPGWFNDQKVTFSLQVKPEIPTRPPTRPTTTRPTATGRPTTISTRSTHVPTSIRVSTSTPPTSTHTWTHKPEPTTFCPHETTAEVTGIPSHTPTDWNGTATSSGDTWSNHTEAIPPGKPQKNPTK(下划线区由另路剪接的外显子编码)   有
  mKIM-1-IgV(1-109)   SYVEVKGVVGHPVTLPCTYSTYRGITTTCWGRGQCPSSACQNTLIWTNGHRVTYQKSSRYNLKGHISEGDVSLTIENSVESDSGLYCCRVEIPGWFNDQKVTFSLQVKP   无
  mKIM-1-137-216(137-216)   STHVPTSIRVSTSTPPTSTHTWTHKPEPTTFCPHETTAEVTGIPSHTPTDWNGTATSSGDTWSNHTEAIPPGKPQKNPTK   有
  mKIM-1-196-216(196-216)   DTWSNHTEAIPPGKPQKNPTK   有
由于包含小鼠KIM-1的氨基酸196-216(对应于人KIM-1的氨基酸247-272)的柄区含有N-糖基化位点，因此有兴趣测定，是否糖分子与N-糖基化位点结合是3A2结合所必需的。对糖基化和去糖基化的KIM-1-196-216-Fc进行Western印迹分析(图2)。结果表明，去糖基化(deglycosylation)不影响3A2与KIM-1-196-216-Fc结合的能力。可见，糖分子并非3A2识别其表位时所必需的结构。
为了确定3A2是否抑制KIM-1从细胞表面释出，将经过KIM-1转染的E293细胞用5ug/mL 3A2、25ug/mL 3A2或无3A2的对照进行处理。从两组3A2处理组的细胞获得的上清液表明，在用生物素化1H8抗体进行的Western印迹中，KIM-1染色与对照无差别。这提示，3A2不阻止KIM-1的释出。
实施例6.鉴定4A2 mAb
经ELISA和Biacore分析证实，mAb 4A2识别鼠KIM-1的Ig-区(图9，表1)。为进一步鉴别mAb 4A2所识别的表位，将单独的重组鼠KIM-1 IgV-人IgG1 Fc融合蛋白、或其与4A2的复合物，用TPCK胰蛋白酶消化。单独的KIM-1产生8kDa的条带，而与4A2结合时不产生该条带。这表明，4A2与KIM-1结合封闭了产生该条带所必需的裂解位点，使之不能被胰蛋白酶接近。该8kDa条带在非还原条件下进行消化，结果发现，4A2保护与人KIM-1序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO：1的氨基酸81-107)对应的片段。因此，4A2抗体保护TPCK胰蛋白酶位点，所述位点至少部分位于SEQ ID NO：1的氨基酸81-107中，或与该区域重叠。
用2A7进行同样的TPCK胰蛋白酶消化实验，得到差不多相同分子量的条带。用1H9进行同样的实验未得到该条带，鉴于1H9是在哮喘模型中无效力但也与Ig区结合的mAb，上述结果表明，该表位与在哮喘中的效力有关(track with)。
本说明书可参照文中引用的参考文献的指教进行最全面的理解。说明书中的实施方案是对本发明的举例说明，不应理解为对本发明进行限制。本领域技术人员可以很容易地认识到，多种其它的实施方案也被本发明覆盖。本文中提到的所有出版物、专利以及生物序列都完整引入作参考。当引入作为参考的信息与本说明书冲突或者不一致时，本说明书将取代任何这类信息。本文中对任何参考文献的引用并不表示承认这些文献是本发明的现有技术。
除非另外指明，本说明书包括权利要求书中用到的表示成分含量、细胞培养、处理条件等等的所有数字，都应被理解为在所有情况下可以用术语“约”进行调整。相应地，除非有相反指示，参数数字是近似值，可以根据需要由本发明进行改变。除非另外指明，出现在一系列元素(element)之前的术语“至少”应被理解为指该系列中的每一个元素。本领域技术人员可以认识到，或者能够确定，仅仅用常规实验，就可以得到本文所述发明的具体实施方案的多种等价方案。这些等价方案都打算被权利要求书覆盖。
<110>比奥根艾迪克MA公司(Biogen Idec MA Inc)
     Rennert，Paul
     McCoon，Patricia
     Bailly，Veronique
     Lugovskoy，Alexey
<120>用于治疗TH2介导的疾病的KIM-1抗体
<130>P0643
<150>60/657,789
<151>2005-03-02
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>339
<212>PRT
<213>人
<400>1
Ser Val Lys Val Gly Gly Glu Ala Gly Pro Ser Val Thr Leu Pro Cys
1               5                   10                  15
His Tyr Ser Gly Ala Val Thr Ser Met Cys Trp Asn Arg Gly Ser Cys
            20                  25                  30
Ser Leu Phe Thr Cys Gln Asn Gly Ile Val Trp Thr Asn Gly Thr His
        35                  40                  45
Val Thr Tyr Arg Lys Asp Thr Arg Tyr Lys Leu Leu Gly Asp Leu Ser
    50                  55                  60
Arg Arg Asp Val Scr Leu Thr Ile Glu Asn Thr Ala Val Ser Asp Scr
65                  70                  75                  80
Gly Val Tyr Cys Cys Arg Val Glu His Arg Gly Trp Phe Asn Asp Met
                85                  90                  95
Lys Ile Thr Val Ser Leu Glu Ile Val Pro Pro Lys Val Thr Thr Thr
            100                 105                 110
Pro Ile Val Thr Thr Val Pro Thr Val Thr Thr Val Arg Thr Ser Thr
        115                 120                 125
Thr Val Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr
    130                 135                 140
Met Ser Ile Pro Thr Thr Thr Thr Val Pro Thr Thr Met Thr Val Ser
145                 150                 155                 160
Thr Thr Thr Scr Val Pro Thr Thr Thr Ser Ilc Pro Thr Thr Thr Scr
                165                 170                 175
Val Pro Val Thr Thr Thr Val Ser Thr Phe Val Pro Pro Met Pro Leu
            180                 185                 190
Pro Arg Gln Asn His Glu Pro Val Ala Thr Ser Pro Ser Ser Pro Gln
        195                 200                 205
Pro Ala Glu Thr His Pro Thr Thr Leu Gln Gly Ala Ile Arg Arg Glu
    210                 215                 220
Pro Thr Ser Ser Pro Leu Tyr Ser Tyr Thr Thr Asp Gly Asn Asp Thr
225                 230                 235                 240
Val Thr Glu Ser Ser Asp Gly Leu Trp Asn Asn Asn Gln Thr Gln Leu
                245                 250                 255
Phc Leu Glu His Scr Leu Leu Thr Ala Asn Thr Thr Lys Gly Ilc Tyr
            260                 265                 270
Ala Gly Val Cys Ile Ser Val Leu Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Val
        275                 280                 285
Ile Ile Ala Lys Lys Tyr Phe Phe Lys Lys Glu Val Gln Gln Leu Ser
    290                 295                 300
Val Ser Phe Ser Ser Leu Gln Ile Lys Ala Leu Gln Asn Ala Val Glu
305                 310                 315                 320
Lys Glu Val Gln Ala Glu Asp Asn Ile Tyr Ile Glu Asn Ser Leu Tyr
                325                 330                 335
Ala Thr Asp
<210>2
<211>23
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>2
Glu Pro Thr Thr Phe Cys Pro His Glu Thr Thr Ala Glu Val Thr Gly
1               5                   10                  15
Ile Pro Ser His Thr Pro Thr
            20

Claims (46)

1.治疗哺乳动物中Th2介导的疾病的方法，包括对该哺乳动物给药与KIM-1柄区结合的抗体或其抗原结合片段。
2.权利要求1的方法，其中所述哺乳动物是人。
3.权利要求1的方法，其中所述疾病是特应性。
4.权利要求1的方法，其中所述疾病是哮喘。
5.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗体与至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO：1的氨基酸236-269)中的表位结合。
6.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗体是人源化抗体或者完全是人的单特异性抗体。
7.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗体是人源化抗体或者完全是人的单特异性抗体，且所述抗体与至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO：1的氨基酸236-269)中的表位结合。
8.权利要求1，2，3或4的方法，其中给药了全长抗体。
9.权利要求1，2，3或4的方法，其中给药了全长抗体，且所述抗体与至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO：1的氨基酸236-269)中的表位结合。
10.权利要求1，2，3或4的方法，其中给药了抗体的抗原结合片段。
11.权利要求1，2，3或4的方法，其中给药了抗体的抗原结合片段，且所述抗体与至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO：1的氨基酸236-269)中的表位结合。
12.权利要求10的方法，其中所述抗原结合片段选自：单链抗体，Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、以及dAb片段。
13.权利要求11的方法，其中所述抗原结合片段选自：单链抗体，Fab片段，F(ab′)2片段，Fd片段，Fv片段，和dAb片段。
14.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与针对该疾病的第二种治疗剂联用。
15.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与针对该疾病的第二种治疗剂联用，且所述抗体与至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO：1的氨基酸236-269)中的表位结合。
16.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的用量为0.05-20mg/kg。
17.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的用量为0.05-20mg/kg，且所述抗体与至少部分包含在肽DGNDTVTESSDGLWNNNQTQLFLEHSLLTANTTK(SEQ ID NO：1的氨基酸236-269)中的表位结合。
18.分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与KIM-1柄区特异性结合，其中所述抗体不抑制KIM-1从培养的E293细胞中释出。
19.权利要求1，2，3或4的方法，其中所述抗体与具有选自下组的序列的肽结合：
(a)SEQ ID NO：1的氨基酸262-270，
(b)SEQ ID NO：1的氨基酸260-269，
(c)SEQ ID NO：1的氨基酸257-270，
(d)SEQ ID NO：1的氨基酸252-270，
(e)SEQ ID NO：1的氨基酸236-250，和
(f)SEQ ID NO：1的氨基酸236-258。
20.权利要求19的方法，其中所述抗体是人源化抗体或者完全是人的单特异性抗体。
21.权利要求19的方法，其中给药了全长抗体。
22.权利要求19的方法，其中给药了所述抗体的抗原结合片段。
23.权利要求19的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与针对该疾病的第二种治疗剂联用。
24.权利要求19的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的用量为0.05-20mg/kg。
25.在哺乳动物中治疗Th1介导的疾病或减弱致病性Th1应答的方法，包括对该哺乳动物给药与人KIM-1的序列VATSPSSPQPAETHPTTLQGAIRREPTSSPLYSYTT(SEQ ID NO：1的氨基酸200-235)或覆盖该序列的表位结合的抗体或其抗原结合片段。
26.权利要求25的方法，其中所述哺乳动物是人。
27.权利要求25的方法，其中所述抗体是人源化抗体或者完全是人的单特异性抗体。
28.权利要求25的方法，其中给药了全长抗体。
29.权利要求25的方法，其中所述给药了所述抗体的抗原结合片段。
30.权利要求25的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与针对该疾病的第二种治疗剂联用。
31.权利要求25的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的用量为0.05-20mg/kg。
32.治疗哺乳动物中Th2介导的疾病的方法，包括对该哺乳动物给药与KIM-1的唾液酸结合基元结合的抗体或其抗原结合片段。
33.权利要求32的方法，其中所述抗体与包含在具有序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO：1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO：1的氨基酸29-42)的肽中或与所述肽重叠的表位至少部分地结合。
34.权利要求32的方法，其中所述抗体与连续氨基酸残基GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO：1的氨基酸81-107)或RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO：1的氨基酸29-42)的线性表位结合。
35.权利要求32的方法，其中所述抗体与由序列GVYCCRVEHRGWFNDMKITVSLEIVPP(SEQ ID NO：1的氨基酸81-107)和RGSCSLFTCQNGIV(SEQ ID NO：1的氨基酸29-42)之一或两者组成的结构性表位结合。
36.权利要求32的方法，其中所述抗体保护SEQ ID NO：1的氨基酸81-107。
37.权利要求32的方法，其中所述抗体干扰SEQ ID NO：1的残基R86、W92和F93中的一个或多个。
38.权利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述哺乳动物是人。
39.权利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述疾病是特应性。
40.权利要求1的方法，其中所述疾病是哮喘。
41.权利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述抗体是人源化抗体或者完全是人的单特异性抗体。
42.权利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中给药了全长抗体。
43.权利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中给药了所述抗体的抗原结合片段。
44.权利要求43的方法，其中所述抗原结合片段选自：单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、Fd片段、Fv片段、以及dAb片段。
45.权利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段与针对该疾病的第二种治疗剂联用。
46.权利要求32，33，34，35，36或37的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段的用量为0.05-20mg/kg。
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