KR20210040998A - 특정 장내 박테리아의 항체-매개 중화를 통한 면역 질환의 치료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로, 여기서 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원에 결합하여 (i) 장내 상피 세포, 바람직하게는 인간 장내 상피 세포로의 박테리아의 결합을 억제하고/하거나 (ii) 박테리아를 고갈시킨다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나 본 발명에 따른 방법에 의해 생산된 항체를 포함하는 약물을 제공한다. 본 발명은 또한 Th17 세포 증식, Th17 세포 분화 또는 Th17 세포 활성의 감소 및/또는 B 세포에 의한 내인성 항원에 대한 항체 형성 억제를 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 키트는 선택적으로 항생제를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체의 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 닭을 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원 유래의 면역 펩티드로 면역화하는 단계; 및 b) 닭 또는 상기 닭이 낳은 알에서 형성된 항체를 회수하고 정제하는 단계를 포함한다. 본 발명은 마지막으로 본 발명에 따른 약물의 제조 방법에 관한 것으로서, 이는 a) 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 단계; 및 b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약물로 제형화하는 단계를 포함한다.

Description

특정 장내 박테리아의 항체-매개 중화를 통한 면역 질환의 치료

본 발명은 특정 장내 박테리아의 항체-매개 중화를 통한 면역 질환 및 기타 질환의 치료에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 항체 또는 항원-결합 단편이 박테리아 칸디다투스 사바겔라(Candidatus Savagella)의 항원에 결합하여 (1) 장내 상피 세포, 바람직하게는 인간 장내 상피 세포에 대한 박테리아의 부착을 억제하고/하거나 (2) 박테리아를 고갈시키는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나 본 발명에 따른 방법으로 생산된 항체를 포함하는 약물을 제공한다. 본 발명은 또한 Th17 세포 증식, Th17 세포 분화 또는 Th17 세포 활성 감소 및/또는 B 세포에 의한 내인성 항원에 대한 항체 형성 억제를 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트는 선택적으로 항생제를 함유한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 생산 방법을 제공하며, 상기 방법은 a) 닭을 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원 유래 면역 펩티드로 면역화하는 단계; 및 b) 닭 또는 상기 닭이 낳은 알에 형성된 항체를 회수 및 정제하는 단계를 포함한다. 본 발명은 마지막으로 본 발명에 따른 약물의 생산 방법에 관한 것으로서, 이는 a) 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 단계; 및 b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약물로 제형화하는 단계를 포함한다.

모든 사람은 100조 개 이상의 박테리아를 보유하고 있으며, 그 전체를 마이크로바이옴(microbiome)이라고 지칭된다. 대부분의 이러한 박테리아는 장에서 군집을 형성하며 식물 섬유소 소화, 비타민 공급 및 유해 미생물의 대체에 있어 인간에게 유용하다. 이러한 공생은 인간 면역계에 대한 일일 시험을 나타낸다: 상피 세포의 단층 장벽만이 이들 마이크로바이옴으로부터 인간을 분리한다. 장 벽 면역 세포는 유용한 박테리아에 대한 내성과 유해한 박테리아에 대한 방어 사이에서 지속적으로 결정을 해야 한다. 따라서, 마이크로바이옴의 조성이 면역계와 이에 따른 인간 건강에 직접적으로 중요한 영향을 미친다는 것은 놀라운 일이 아니다[1].

지난 수 십년 동안, 모든 선진국에서 면역-매개 질환이 크게 증가하였다. 이는 궤양성 대장염, 크론병, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병 및 다발성 경화증의 빈번한 진단뿐만 아니라, 아토피 질환, 예컨대 신경성피부염 및 알러지성 천식도 포함한다. 이러한 질환이 증가하는 속도는 너무 빨라서 유전적 변화가 원인이될 수 없다. 예컨대, 미국에서 알러지성 천식의 발생률은 1980년에서 1994년 사이에 75% 증가한 반면, 같은 기간 동안 개발 도상국에서의 발생률은 변하지 않았다[6]. 질문해야 할 것은 면역-매개 질환의 급속한 증가를 설명할 수 있는 환경 영향이다. 식습관 변경, 특히 소금, 지방, 설탕 및 살충제 및 항생제로 오염된 음식 섭취 증가뿐만 아니라 면역 조절, 기생 회충의 부재는 마이크로바이옴과 면역계 사이의 항상성 장애(장내 세균 불균형, dysbiosis)를 유발할 수 있다. 장내 세균 불균형의 다른 원인은 예를 들어 제왕 절개 후와 같이 출생 후 변경된 장 군집화에 있을 수 있으며 생활 환경의 위생 증가로 인한 것일 수 있다. 그러나, 인간 마이크로바이옴은 면역 반응의 발현에 상당한 영향을 미친다[1]. 그 자체로 비병리적으로 작용하는 특정 박테리아는 여전히 면역조절 또는 면역자극 영향을 미칠 수 있다. 따라서 치료적 면역조절의 목적으로 마이크로바이옴에 영향을 미치는 것은 선택된 면역 질환의 발생률[7], 수많은 사회경제적으로 관련된 질병에 대한 흥미로운 치료적 접근을 나타낸다. 프로 바이오틱[8], 프리바이오틱[9], 및 항생제[10] 요법과 같은 이전의 접근법이 일부 경우에 성공적이었지만, 원하는 면역학적 효과를 달성하기에는 너무 비특이적이다.

칸디다투스 사바겔라(Candidatus Savagella)(분절된 사상균, SFB: segmented filamentous bacteria)라고 지칭되는 사상균은 이의 숙주와 특히 흥미로운 상호작용을 나타낸다: 유아기에는, 면역계의 발달 및 성숙에 실질적으로 관여한다; 삶의 후기 단계에서는, 후천성 면역계의 특정 이펙터 세포인 Th17 세포를 자극하여 해로운 장내 박테리아와 싸울 수 있다. 그러나, 동일한 면역 세포는 또한 자가면역 질환 및 아토피와 같은 면역-매개 질환의 발달 및 진행을 담당한다. 실제로, SFB 군집이 없는 실험 동물은 류마티스 관절염, 다발성 경화증 및 알러지성 천식 동물 모델에서 현저히 적은 증상을 나타낸다[2-4].

박테리아 칸디다투스 사바겔라(SFB)는 장 점막에서 지속적인 생리적 염증 반응을 일으켜 병원성 장내 세균에 대한 면역 방어를 강화한다. 이러한 진화적으로 보존된 개념은 지나치게 해로울 수 있으며(예컨대, 장내 세균 불균형의 경우) 신체의 나머지 부분에서 면역-매개 질환으로 이어질 수 있다[1]. 최근 몇 년 동안, 이러한 연관성은 기초 과학에 대한 관심이 증가하고 있으며 고위 간행물의 주제가 되었다[2; 3; 11-13].

미국특허공개 제US 2012/276149호는 장내 감염에 대한 면역능을 강화하기 위한 SFB 투여를 기술한다.

국제특허공개 제WO 2011/047153호는 SFB의 부착 및 증식에 영향을 미치는 것을 포함하여, Th17 면역 반응의 조절을 기술한다.

그러나, 구체적인 치료 개념은 아직 설명되지 않았다.

본 발명에 의해 다루어지는 기술적 문제점은 따라서 이러한 치료적 접근법을 제공하는 것으로 간주될 수 있다.

기술적 문제점은 청구범위 및 후술되는 실시형태에 의해 해결된다.

따라서 본 발명은 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것으로서, 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원에 결합하여 (i) 장내 상피 세포, 바람직하게는 인간 장내 상피 세포에 대한 박테리아의 부착을 억제하고/하거나, (2) 박테리아를 고갈시킨다. 바람직하게는, 항체 또는 항원-결합 단편은 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원에 결합하여 장내 상피 세포, 바람직하게는 인간 장내 상피 세포에 대한 박테리아의 부착을 억제하고, 박테리아를 고갈시킨다.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 박테리아 칸디다투스 사바겔라(분절된 사상균, SFB:segmented filamentous bacteria)의 항원, 바람직하게는 박테리아 벽 단백질에 특이적으로 결합한다.

여기서, 항원은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 결합이 장내 상피 세포에 대한 박테리아의 부착을 억제하거나 박테리아를 고갈시키도록 선택된다. 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 항원에 대한 결합은 또한 박테리아의 증식을 억제할 수 있다. 이러한 기작의 조합이 또한 본 발명의 맥락에서 포함된다. 예컨대, 항원은 본 발명에 따른 항체가 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원에 결합하여 장내 상피 세포에 대한 박테리아의 부착을 억제하고 박테리아를 고갈시키도록 선택될 수 있다. 대안적으로, 항원은 본 발명에 따른 항체가 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원에 결합하여 장내 상피 세포에 대한 박테리아의 부착을 억제하고 박테리아의 증식을 억제하도록 선택될 수 있다. 3개 모두의 기작의 조합이 또한 포함되며, 따라서 항원은 본 발명에 따른 항체 또는 항원-결합 단편이 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원에 결합하여 장내 상피 세포에 대한 박테리아의 부착을 억제하고, 박테리아의 증식을 억제하고 박테리아를 고갈시키도록 정의된다.

Fraunhofer IZI 및 ITEM에서 수행된 연구에서, SFB의 군집 밀도가 경구 항체 치료로 감소될 수 있으며 마이크로바이옴의 이러한 특이적 교정이 면역-매개 질환의 맥락에서 면역관용을 유발함을 보여줄 가능성이 있었다. SFB-특이적 항체는 SFB 단백질로 면역화된 닭의 알에서 회수되었으며; 이러한 방법은 강력하게 결합하는 항체를 신속하고 매우 비용-효율적으로 생성할 수 있도록 하며 또한 뛰어난 산 안정성을 나타내므로 경구 치료에 매우 적합하다[5].

본 발명의 기초를 이루는 개념이 도 1에 예시되어 있다: 사상체 칸디다투스 사바겔라 박테리아(분절된 사상균, SFB)는 장 벽에 군집화하고, 수지상 세포를 통해 Th17 세포를 활성화시켜 자가면역 및 아토피에 기여한다. 우선, 상기 박테리아의 적합한 박테리아 벽 단백질이 식별되고, 합성되어 닭에 주입된다. 닭은 고도로 특이적인 중화 항-SFB 항체를 형성하며, 이는 알로부터 단리될 수 있고 경구 항체 요법에 이용 가능하다. 장에서 SFB 미생물 수의 감소는 Th17 이펙터 세포 활성을 감소시켜 면역관용을 유발할 수 있다.

경구 투여된 항체를 사용한 SFB의 특이적 중화는 항체가 혈액 순환으로 실제로 전달되지 않으므로 항체 요법의 일반적인 부작용, 또는 예컨대 알러지성 호흡기 질환에 대한 덱사메타손의 경우 관찰되는 부작용을 피할 수 있다는 주요 이점이 있다. 장내 병원성 바이러스[14], 진균류[15] 및 박테리아[16; 17]의 감소를 위한 항체의 성공적인 경구 사용의 예를 이미 기술하였다. 그러나, 면역조절을 목적으로 하는 경구 항체 요법은 현재까지 면역계의 직접적인 표적을 대상으로만 수행되어왔다. 이의 성공적인 예는 T 세포 표면 단백질 CD3에 대한 항체의 사용이다([18]; US 7,883,703 B2).

본 발명의 주요 이점은 면역화된 닭의 알 유래의 치료적 IgY 항체의 사용이다. 이러한 방법은 다수의 이점을 갖는다: 매우 비용-효율적인 생산 공정 외에, 항체가 신속하게 대량으로 생산될 수 있다. IgY는 IgG보다 더 내산성이므로 경구 투여에 특히 매우 적합하다. 한 마리 닭은 연간 최대 30 g의 순수한 항체를 생산할 수 있으며, 상기 항체는 또한 높은 결합력을 나타낸다. 마지막으로, IgY는 포유류 IgG와 상이한 Fc 영역을 갖는다; 따라서, 수용체 보체 시스템의 활성화로 인한 부작용이 없다[5].

"개념 증명(proof-of-concept)" 실험에서, 항-SFB IgY 항체의 경구 투여가 장내 SFB 군집화의 상관관계로서 SFB 분비(excretion)를 뚜렷하게 감소시킨다는 것을 이미 입증할 수 있었다. 이러한 마이크로바이옴 변화의 치료적 관련성에 대한 적응증은 알러지성 호흡기 질환의 동물 모델에서 궁극적으로 관찰되었다(Fraunhofer ITEM): 장내 SFB 군집화의 감소는 표준 치료 덱사메타손에 필적할 정도로 염증 세포의 폐로의 침윤을 약화시켰다.

박테리아 칸디다투스 사바겔라(SFB)의 IgY 항체-매개 억제는 면역-매개 질환에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. 여기서, 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 알러지성 천식과 같은 면역 질환은 Th17 면역 세포의 활성화에 의해 실질적으로 결정된다. 그러나, Th17 활성에 의해 결정된 다른 면역 질환 또는 종양학적 질환이 또한 SFB의 고갈에 의해 예방적으로 또는 치료적으로 치료될 수 있다.

이러한 IgY 항체의 사용은 면역-매개 질환, 특히 Th17-의존성 질환의 예방 또는 치료를 위한 약물로 인지될 수 있다. 여기서 의도된 것은 마이크로바이옴 교정을 위한 치료제이다. 또한 기능성 식품(functional food)이나 건강기능식품(nutraceuticals)으로도 사용될 수 있으므로, 예를 들어 새로운 식품과 같이 크게 단순화된 승인 절차가 가능할 수 있다.

본 발명에 따른 항체는 바람직하게는 인간의 경구 투여에 사용된다.

박테리아 "칸디다투스 사바겔라"(분절된 사상균, SFB)는 예컨대 문헌[Schnupf et al. Curr Opin Microbiol. 2017 Feb; 35: 100-109. doi: 10.1016/j.mib.2017.03.004. Epub 2017 Apr 25; Semin Immunol. 2013 Nov 30; 25(5): 342-51. doi: 10.1016/j.smim.2013.09.001. Epub 2013 Oct 31]에 기술되었으며 미국공개특허 제US 2012/276149호 및 국제공개특허 제WO 2011/047153호에도 또한 기술되어 있다.

본 발명에 따른 항체 또는 상기 항체의 항원-결합 단편에 의해 특이적으로 결합되는 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 "항원"은 장내 상피 세포, 바람직하게는 인간 장내 상피 세포로의 박테리아의 부착, 박테리아 증식, 및/또는 고갈 매개, 즉 박테리아 사멸과 연관되어 있다. 칸디다투스 사바겔라 박테리아 유래의 적합한 항원은 기능-결정 및 분절된 사상균(SFB)-특이적 단백질의 군으로부터 선택된다. 이러한 단백질은, 예컨대 이들이 박테리아 벽(박테리아 벽 단백질)에 위치하고 장 상피세포에 대한 부착 및/또는 칸디다투스 사바겔라 또는 분절된 사상균(SFB)의 생존에 필수적이거나 심지어는 고유한 역할을 하는 것을 특징으로 한다.

상기 박테리아 유래의 적합한 항원은, 예컨대 하기 상세히 기술된 미오신-교차-반응성 항원(MCRA: myosin-cross-reactive antigen) 단백질이며, 이의 아미노산 서열이 서열번호 1로 제시되어 있다. 미오신-교차-반응성 항원(MCRA: myosin-cross-reactive antigen) 단백질 유래의 특이적 에피토프는, 예컨대 아미노산 서열 SVLDEFYWLDKKDPYSL(서열번호 2), PDFKAVRFTRRNQYESMI(서열번호 3) 및 QATSIKILRDGKEEEIKL(서열번호 4)를 포함한다.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 단편의 칸디다투스 사바겔라로부터의 항원에 대한 "특이적 결합"은 항체의 결합 특성, 예컨대, 예를 들어, 결합 친화도, 결합 특이성 및 바인딩 결합력을 기술하며; 예컨대, 문헌[David J. King, Applications and Engineering of Monoclonal Antibodies, pp. 240 (1998)]을 참조한다. 예를 들어 표면 플라즈몬 공명(SPR: surface plasmon resonance)을 사용하면 항원-항체 상호작용에 대한 자세한 분석이 가능하다. 항체 및 이의 항원의 결합 특성에 대한 동 역학적 특성은 다양한 방법에 대한 적용 가능성을 평가할 수 있는 필수 요건이다. 결합 강도(친화도, KD 값) 외에도 결합(kass) 및 해리(kdiss)에 대한 속도 상수도 결정된다. 이는 또한 복합체(complex) 형성 및 복합체 분해 속도를 확립하는 것을 가능하게 한다. 이 정보는 진단, 생명 공학 또는 치료 적용에서 본 발명에 따른 항체의 효율성을 평가하고 적용 과정을 최적화하는 데 도움이 된다. 특이적 결합과 관련하여 언급된 용어 및 약어는 표준 의미로 사용된다.

용어 "항체"는 다클론 항체 및 단클론 항체(mAb)를 모두 포함하며, 이는 아래에 설명된 바와 같이 변형될 수 있다. 항체는 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원에 특이적으로 결합하고 바람직하게는 중화 항체이다.

본원에서 "중화 항체"는 (바람직하게는 인간) 장내 상피 세포로의 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 부착 또는 결합의 억제, 상기 박테리아의 증식 억제 및/또는 항체에 의한 그의 고갈 또는 이의 사멸을 의미한다.

박테리아 칸디다투스 사바겔라의 "중화"는, 시험관 내 시험에서 측정된 바와 같이, 적어도 50%, 60%, 70% 또는 75%, 바람직하게는 80% 또는 85%, 특히 바람직하게는 90% 또는 95%의 장내 상피 세포로의 상기 박테리아의 부착 또는 결합 억제, 또는 박테리아의 증식 억제, 또는 적어도 50%, 60%, 70% 또는 75%, 바람직하게는 80% 또는 85%, 특히 바람직하게는 90% 또는 95%의 박테리아의 총 수 또는 집단이 고갈되는 것을 지칭한다.

"변형된 항체"는 변형된 면역글로불린-코딩 영역에 의해 코딩된 단백질을 지칭하며, 상기 단백질은 선택된 숙주 세포에서 발현함으로써 수득될 수 있다. 이러한 변형된 항체는 유전적으로 조작된 항체(예를 들어, 키메라, 변형, 인간화 또는 벡터화된 항체) 또는 항체 단편을 포함하며, 이는 면역글로불린의 불변 영역의 전부 또는 일부, 예를 들어 Fv, Fab 또는 F(ab)₂ 등이 결여되어 있다.

"변형된 면역글로불린-코딩 영역"은 변형된 항체를 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 변형된 항체가 CDR-이식 또는 인간화 항체인 경우, 비인간 면역글로불린 유래, 예를 들어 닭 항체 유래의 상보성-결정 영역(CDR: complementarity-determining region)을 코딩하는 서열은 인간 가변 프레임워크 서열을 포함하는 제1 면역글로불린 파트너에 삽입된다. 선택적으로, 제1 면역글로불린 파트너는 예를 들어 이중특이적 항체를 생산하기 위해 제2 면역글로불린 파트너에 작동 가능하게 연결된다.

"제1 면역글로불린 파트너"는 인간 프레임워크 영역 또는 인간 면역글로불린의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 지칭하며, 여기서 천연(또는 자연 발생) CDR-코딩 영역이 공여자 항체, 예컨대 닭 항체의 CDR-코딩 영역으로 대체되었다. 인간 가변 영역은 면역글로불린의 중쇄, 경쇄(또는 두 사슬 모두), 이의 유사체 또는 기능적 단편일 수 있다. 항체의 가변 영역(면역글로불린) 내에 위치한 이러한 CDR 영역은 당 업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어 문헌[Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]은 CDR의 위치를 찾는 규칙을 개시하고 있다. 또한, CDR 영역/구조를 식별하는데 유용한 컴퓨터 프로그램이 공지되어 있다.

"제2 면역글로불린 파트너"는 제1 면역글로불린 파트너가 융합된, 즉 프레임 내에서 또는 임의의 통상적인 링커 서열에 의해 작동 가능하게 연결된 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 상이한 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 바람직하게는 이는 면역글로불린 유전자이다. 제2 면역글로불린 파트너는 동일한(즉, 상동성 - 동일한 공급원으로부터 유래된 제1 및 제2 변형된 항체) 또는 추가(즉, 이종성) 관심 항체 에 대한 전체 불변 영역을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이는 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄(또는 개별 폴리펩티드의 일부인 두 사슬 모두)일 수 있다. 제2 면역글로불린 파트너는 특정 면역글로불린 클래스 또는 이소타입에 제한되지 않는다. 또한, 제2 면역글로불린 파트너는 Fab 또는 F(ab)₂에서 발견되는 바와 같이 면역글로불린의 불변 영역의 일부, 즉 인간 불변 영역 또는 프레임 워크 영역의 분리된 부분을 포함할 수 있다. 이러한 제2 면역글로불린 파트너는 또한 예를 들어 파지 디스플레이 라이브러리의 일부로서 숙주 세포의 외부 표면에 노출되는 통합 막 단백질을 코딩하는 서열, 또는 분석 또는 진단 검출용 단백질을 코딩하는 서열, 예컨대 호스래디시 퍼옥시다제(horseradish peroxidase), β-갈락토시다제 등을 포함할 수 있다.

용어 Fv, Fc, Fd, Fab 또는 F(ab)₂는 표준 의미로 사용된다(예를 들어, 문헌[Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 참조).

본원에서 사용된 "유전적으로 조작된 항체"는 변형된 항체의 유형, 즉 전장 합성 항체(예컨대 항체 단편과 반대되는 키메라, 비형상 또는 인간화 항체)를 설명하며, 여기서 선택된 수용체 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인의 일부는 선택된 에피토프에 대한 특이성을 갖는 하나 이상의 공여자 항체(예를 들어, 닭 항체)의 유사한 부분으로 대체된다. 예를 들어, 이러한 분자는 변형되지 않은 경쇄(또는 키메라 경쇄)와 연관된 인간화 중쇄를 특징으로 하는 항체를 포함할 수 있으며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 유전적으로 조작된 항체는 또한 공여자 항체, 예를 들어 닭 항체의 결합 특이성을 유지하기 위해 수용체 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역을 코딩하는 핵산 서열의 변형을 특징으로 할 수 있다. 상기 항체는 본원에 기술된 공여자 항체, 즉 닭 항체로부터의 CDR에 대한 수용체 항체로부터 하나(예를 들어, CDR-H3) 이상의 CDR(바람직하게는 모든 CDR, 즉, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)의 교환을 포함할 수 있다.

"키메라 항체"는 수용체 항체 유래의 경쇄 및 중쇄의 불변 영역과 결합하여 공여자 항체(예컨대 닭 항체) 유래의 자연 발생 가변 영역(경쇄 및 중쇄)을 포함하는 유전적으로 조작된 항체 유형을 지칭한다.

"인간화 항체"는 유전적으로 조작된 항체의 유형을 지칭하며, 이의 CDR은 비인간 공여자 면역글로불린, 예를 들어 닭 항체에서 유래하고, 나머지 면역글로불린-유래 부분의 분자는 하나(또는 그 이상)의 인간 면역글로불린에서 유래한다. 또한, 결합 친화도를 유지하기 위해 프레임워크 잔기를 변형할 수 있다(예를 들어, 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10032 (1989)], 문헌[ Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)] 참조).

예를 들어 장으로의 수송을 개선하기 위해 제제가 항체에 결합될 수 있다. 예를 들어, 항체에 결합된 제제는 장의 수송체 단백질에 능동적으로 또는 수동적으로 영향을 미칠 수 있다. 부착은 화학적일 수 있거나, 대안적으로 대상체는 유전자 기술에 의해 항체에 통합될 수 있다.

용어 "공여자 항체"는 변형된 면역글로불린-코딩 영역을 제공하기 위해 제1 면역글로불린 파트너에 대한 이의 가변 영역, CDR 또는 다른 기능적 단편 또는 이의 유사체의 핵산 서열에 기여하는 항체(단클론 또는 재조합) 및 공여자 항체 예컨대 닭 항체의 항원 특이성 및 중화 활성 특성을 가진 결과적으로 발현된 변형된 항체를 지칭한다.

용어 "수용체 항체"는 공여자 항체에 대해 이종성이고 중쇄 및/또는 경쇄의 프레임워크 영역 및/또는 제1 면역글로불린 파트너에 대한 중쇄 및/또는 경쇄의 불변 영역을 코딩하는 모든(또는 일부, 바람직하게는 모든) 핵산 서열에 기여하는 항체(단클론 또는 재조합)를 지칭한다. 수용체 항체는 바람직하게는 인간 항체이다.

"CDR"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역인 항체의 상보성-결정 영역의 아미노산 서열로 정의된다. 예를 들어, 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)]을 참조한다. 3개의 중쇄 CDR(CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3)과 3개의 경쇄 CDR(CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3)(또는 CDR 영역)이 면역글로불린의 가변 부분에 존재한다. 여기에서 사용되는 "CDR"은 3개의 중쇄 CDR 모두 또는 3개의 경쇄 CDR 모두(또는 적절한 경우, 모든 중쇄 CDR 및 모든 경쇄 CDR 모두)를 지칭한다. 항체의 구조 및 단백질 폴딩은 다른 잔기가 항원 결합 영역의 일부로 간주된다는 것을 의미할 수 있으며, 이는 당업자에 의해 이러한 방식으로 이해될 것이다. 예를 들어, 문헌[Chothia et al. (1989), Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, pp. 877-883]을 참조한다.

CDR은 항원 또는 에피토프에 대한 항체의 결합을 위한 접촉 잔기의 대부분을 제공한다. 본 발명에서 관심 CDR은 공여자 항체, 예를 들어 닭 항체의 가변 중쇄 및 경쇄의 서열로부터 유래하고, 자연 발생 CDR의 유사체, 동일한 항원-결합 특이성을 공유하거나 보유하는 유사체 및/또는 그들이 유래된 공여자 항체로서 중화 능력을 포함한다.

"기능성 단편"은 단편이 유래 된 항체와 동일한 항원-결합 특이성 및/또는 중화 능력을 보유하는 중쇄 또는 경쇄의 부분 가변 서열(예컨대 면역글로불린의 가변 영역의 아미노 또는 카복시 말단에서의 사소한 결실)이다.

"유사체"는 적어도 하나의 아미노산으로 변형된 아미노산 서열이며, 여기서 변형은 화학적 또는 몇 가지 아미노산의 치환 또는 재배열일 수 있으며(즉, 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 이하의 아미노산 잔기), 아미노산 서열의 변형은 변형되지 않은 서열의 생물학적 특성, 예를 들어 항원 특이성 및 높은 친화도를 유지할 수 있도록 한다. 예를 들어, (침묵) 돌연변이는 특정 엔도뉴클레아제 제한 부위가 CDR-코딩 영역 내 또는 주변에 확립될 때 치환을 통해 구축될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체 유사체의 사용을 고려한다. 예를 들어, 아미노산 또는 핵산 서열의 사소한 변형은 실질적으로 유사한 특성을 유지하는 본래 단백질의 대립유전자 형태로 이어질 수 있다는 것이 일반적으로 알려져 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 유사체는 중쇄 및 경쇄의 초가변 영역의 CDR이 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3에 대해 상기 정의된 바와 같은 CDR에 대해 적어도 80% 상동성 바람직하게는 적어도 85%, 적어도 90% 상동성, 특히 바람직하게는 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상동성이고 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원에 대해 특이적 결합 및 중화 활성을 보유하는 것을 포함한다. 아미노산 서열은 서열이 최적으로 정렬될 때 유사한 위치에 80% 동일한 아미노산 잔기가 있는 경우 적어도 80% 상동성이며, 갭 또는 삽입은 동일하지 않은 잔기로 계수된다. 서열 동일성 결정을 위한 알고리즘 및 서열 비교를 위한 프로그램은 선행 기술에 잘 알려져 있다.

유사체는 또한 대립유전자 변이로 나타날 수 있다. "대립유전자 변이 또는 변형"은 핵산 서열의 변화이다. 이러한 변이 또는 변형은 유전자 코드의 퇴행에 의해 유발될 수 있거나 원하는 특성을 제공하기 위해 의도적으로 유전적으로 조작되거나 재조합적으로 생성될 수 있다. 상기 변이 및 변형은 코딩된 아미노산 서열의 변화를 초래할 수 있고 그렇지 않을 수도 있다.

용어 "이펙터 제제"는 변형된 항체 및/또는 공여자 항체, 예를 들어 닭 항체의 천연 또는 합성 경쇄 또는 중쇄, 또는 공여자 항체의 다른 단편이 통상적인 수단에 의해 결합될 수 있는 비단백질 담체 분자를 지칭한다. 이러한 비단백질 담체는 진단 분야에서 사용되는 통상적인 담체, 예를 들어 폴리스티렌 또는 기타 플라스틱 비드, 예를 들어 BIAcore 시스템[Pharmacia]에서 사용되는 다당류, 또는 의료 분야에서 유용하고 인간과 동물에게 투여하기에 안전한 기타 비단백질 물질을 포함할 수 있다. 다른 이펙터 제제는 중금속 원자 또는 방사성 동위원소를 착화하기 위한 거대환(macrocycle)을 포함할 수 있다. 이러한 이펙터 제제는 또한 변형된 항체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG: polyethylene glycol)의 반감기를 증가시키기에 유용할 수 있다.

박테리아 칸디다투스 사바겔라에 특이적인 중화 항체는 현재까지 선행 기술에 아직 기술되지 않았으며 본 발명에 의해 처음으로 이용가능하게 되었다.

추가 측면에서, 본 발명은 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 본 발명에 따른 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

당업자에게 익숙한 바와 같이, 박테리아 칸디다투스 사바겔라 유래의 천연 또는 재조합 항원에 대해 교차-반응하는 항체가 예컨대 인간 또는 닭에서 생성될 수 있는 임의의 종으로부터의 박테리아 칸디다투스 사바겔라 유래의 천연 또는 재조합 항원과 함께 제시 시 원하는 면역글로불린을 생성하기 위해, 비인간 종(예컨대 소, 양, 유인원, 닭, 설치류(예컨대 마우스, 햄스터 및 쥐) 등)을 면역화하여 항체, 변형된 항체 및 단편을 구축하는 것이 가능하다. 박테리아 칸디다투스 사바겔라 유래의 천연 항원에 대해 비인간 단클론 항체, 예를 들어 닭 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 제공하기 위해 통상적인 하이브리 도마 기술이 사용된다. 그런 다음, 이러한 하이브리도마는 384- 또는 96-웰 플레이트에 적용된 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 천연 또는 재조합 항원을 사용하여 결합에 대해 스크리닝되며, 여기서 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 비오틴화된 천연 또는 재조합 항원은 스트렙타비딘-코팅된 플레이트에, 또는 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 비오틴화된 천연 또는 재조합 항원을 사용하는 동종 유로퓸-APC-결합 면역 분석에서 결합된다.

천연 인간 항체는 예를 들어 "제노마우스(Xenomouse)"(Abgenix)와 같은 인간 항체 마우스에서 생성될 수 있으며, 여기서 마우스 면역글로불린 유전자는 제거되고 인간 면역글로불린을 코딩하는 유전자는 마우스 염색체에 삽입된다. 마우스는 정상적으로 면역되고 인간 유전자에서 유래하는 항체 반응이 발생한다. 따라서 마우스는 양성 하이브리도마를 선택한 후 인간화의 필요성을 우회하면서 인간 항체를 생성한다(문헌[L.L. Green, J. Immunol. Methods, 10 Dec. 1999; 231 (1-2):11-23] 참조).

Fab 단편은 전체 경쇄와 중쇄의 아미노-말단 부분을 포함한다; 그리고 F(ab')₂ 단편은 이황화 결합에 의해 결합된 2개의 Fab 단편에 의해 형성된 단편이다. Fab 단편 및 F(ab')₂ 단편은 통상적인 수단, 예를 들어 적절한 단백질 분해 효소인 파파인 및/또는 펩신을 사용한 단클론 항체(mAb)의 절단, 또는 재조합 방법에 의해 수득될 수 있다. Fab 및 F(ab')₂ 단편은 그 자체가 치료적 또는 예방적이며 본원에 기술된 바와 같이 재조합 또는 인간화 항체의 형성에 유용한 가변 영역 및 CDR 서열을 포함하는 서열에 대한 공여자로서 유용하다.

Fab 및 F(ab')₂ 단편은 또한 조합 파지 라이브러리(예를 들어, 문헌[Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)] 참조) 또는 면역글로불린 사슬 교환(사슬 셔플링)(예를 들어, 문헌[Marks et al., Bio Technology, 10: 779-783 (1992)] 참조)을 통해 구축될 수 있다.

따라서, 박테리아 칸디다투스 사바겔라 유래의 천연 또는 재조합 항원에 특이적인 인간 항체 단편(Fv, scFv, Fab)은 인간 항체 단편 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 분리될 수 있다. 인간 항체 단편 단백질을 나타내는 박테리오파지 입자의 라이브러리는 박테리아 칸디다투스 사바겔라 유래의 천연 또는 재조합 항원에 대해 시험된다. 박테리아 칸디다투스 사바겔라 유래의 천연 또는 재조합 항원에 결합하는 항체 단편을 나타내는 파지는 라이브러리에서 유지되고 클로닝에 의해 증폭된다. 그런 다음 인간 항체 유전자를 특정 박테리오파지에서 잘라내어 인간 IgG의 불변 영역을 포함하는 인간 IgG 발현 구축물에 삽입하여, 박테리아 칸디다투스 사바겔라 유래의 천연 또는 재조합 항원에 특이적인 분리된 박테리오파지 유래의 가변 영역을 가진 온전한(intact) 인간 IgG 분자를 형성한다.

공여자 항체는 예를 들어 가변 중쇄 및/또는 경쇄의 펩티드 서열, 프레임워크 서열, CDR 서열, 이의 기능적 단편 및 유사체, 및 이들을 코딩하는 핵산 서열과 같은 서열을 제공할 수 있으며, 이 서열은 공여자 항체, 예를 들어 닭 항체의 항원-결합 특이성을 특징으로 하는 다양한 변형된 항체를 구축하고 수득하는데 유용하다.

유전자 코드의 퇴행을 고려하여, 가변 중쇄 및 경쇄 및 CDR 서열의 아미노산 서열을 코딩하는 다양한 코딩 서열 및 공여자 항체, 예컨대 닭 항체의 항원 특이성을 공유하는 이의 기능적 단편 및 유사체를 또한 구축할 수 있다. 가변 사슬 또는 CDR의 펩티드 서열을 코딩하는 단리된 핵산 서열 또는 이의 단편은 변형된 항체, 예를 들어 키메라 또는 인간화 항체, 또는 이들이 제2 면역글로불린 파트너와 작동 가능하게 조합되는 경우 다른 유전적으로 조작된 항체를 생성하는데 사용될 수 있다.

변형된 면역글로불린 분자는 키메라 항체 및 인간화 항체와 같은 유전적으로 변형된 항체를 포함하는 변형된 항체를 코딩할 수 있다. 원하는 변형된 면역글로불린-코딩 영역은 제1 면역글로불린 파트너(인간 프레임워크 영역 또는 인간 면역글로불린의 가변 영역)에 삽입된 항-칸디다투스 사바겔라 항원 항체, 바람직하게는 고-친화도 항체의 항원 특이성을 가진 펩티드를 코딩하는 CDR-코딩 영역을 포함한다.

바람직하게는, 제1 면역글로불린 파트너는 제2 면역글로불린 파트너에 작동 가능하게 연결된다. 제2 면역글로불린 파트너는 상기 정의되어 있고 제2 관심 항체 영역, 예를 들어 Fc 영역을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 제2 면역글로불린 파트너는 또한 경쇄 또는 중쇄의 불변 영역이 프레임 내에서 또는 링커 서열에 의해 융합된 또 다른 면역글로불린을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 박테리아 칸디다투스 사바겔라 유래의 천연 또는 재조합 항원의 기능적 단편 또는 유사체에 대해 유전적으로 조작된 항체는 결합을 증가시키도록 구축될 수 있다.

제2 면역 글로불린 파트너는 또한 제2 면역글로불린 파트너가 통상적인 수단에 의해 작동 가능하게 결합될 수 있는 비단백질 담체 분자를 포함하는 상기 정의된 바와 같은 이펙터 제제와 결합될 수 있다.

제2 면역글로불린 파트너, 예를 들어 항체 서열과 이펙터 제제제 사이의 융합 또는 결합은 임의의 적합한 수단, 예를 들어 통상적인 공유 또는 이온 결합, 단백질 융합 또는 이종이작용성 가교제, 예를 들어 카보다이이미드, 글루타르알데히드 등에 의해 달성될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있으며 일반적으로 통상적인 화학 및 생화학 텍스트에 설명되어 있다.

또한, 제2 면역글로불린 파트너와 이펙터 제제 사이에 원하는 양의 공간을 단순히 제공하는 통상적인 링커 서열은 또한 변형된 면역글로불린-코딩 영역으로 구축될 수 있다. 이러한 링커의 구성은 통상의 기술자에게 일반적으로 알려져 있다.

추가 실시형태에서, 항체는 그에 부착된 추가 제제를 가질 수 있다. 예를 들어, 완전한 항체 분자의 Fc 단편 또는 CH2-CH3 도메인이 효소 또는 일부 다른 검출가능한 분자(즉, 폴리펩티드 이펙터 또는 리포터 분자)로 대체된 유전적으로 조작된 항체를 생성하기 위해 재조합 DNA 기술의 방법을 사용할 수 있다.

제2 면역글로불린 파트너는 또한 항-칸디다투스 사바겔라 항원 항체의 항원 특이성을 갖는 CDR-함유 서열과 관련하여 이종인 비면역 글로불린 펩티드, 단백질 또는 이의 단편에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 생성된 단백질은 발현될 때 항-칸디다투스 사바겔라 항원 특이성 및 비면역글로불린의 특성을 모두 나타낼 수 있다. 융합 파트너의 특성은 예를 들어, 융합 파트너 자체가 치료 단백질인 경우 다른 결합 또는 수용체 도메인 또는 치료 특성과 같은 기능적 특성, 또는 추가 항원 특성일 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 단백질은 중쇄 및 경쇄를 가진 완전한 전장 항체 분자 또는 Fab 또는 F(ab')₂ 단편, 중쇄 이량체 또는 이의 임의의 최소 재조합 단편 예컨대 Fv 또는 단일쇄 항체(SCA: single-chain antibody) 또는 선택된 공여자 항체, 예컨대 닭 항체와 동일한 특이성을 가진 임의의 다른 분자와 같은 이의 임의의 개별 단편일 수 있다. 이러한 단백질은 변형된 항체의 형태로 사용되거나 융합되지 않은 형태로 사용될 수 있다.

제2 면역글로불린 파트너가 공여자 항체, 예컨대 닭 항체와 상이한 항체에서 유래할 때 마다, 그 결과는 유전적으로 조작되거나 재조합적으로 생성된 항체가 된다. 유전적으로 조작되거나 재조합적으로 생성된 항체는 면역글로불린(Ig) 불변 영역 및 공급원, 예를 들어 수용체 항체로부터의 가변 프레임워크 영역, 및 공여자 항체, 예를 들어 닭 항체로부터의 하나 이상의(바람직하게는 모두) CDR을 포함할 수 있다. 또한, 핵산 또는 아미노산 수준에서 수용체 단클론 항체(mAb)의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 또는 공여자 CDR 영역에 대한 변형, 예를 들어 결실, 치환 또는 추가는 공여자 항체, 예를 들어 닭 항체의 항원-결합 특이성을 유지하기 위해 수행된다.

이러한 유전적으로 조작되거나 재조합적으로 생성된 항체는 항-칸디다투스 사바겔라 항원 항체의 가변 중쇄 및/또는 경쇄 중 하나(또는 둘 모두) 또는 중쇄 또는 경쇄의 CDR 중 하나 이상을 사용하기 위해 구축된다. 유전적으로 조작되거나 재조합적으로 생성된 항체는 상기 정의된 바와 같이 중화될 수 있다.

이러한 유전적으로 조작되거나 재조합적으로 생성된 항체는 항-칸디다투스 사바겔라 항원 항체의 기능적 단편에 융합된, 선택된 인간 면역글로불린 또는 하위 유형의 프레임워크 영역을 포함하는 인간화 항체 또는 인간 중쇄 및 경쇄의 불변 영역을 포함하는 키메라 항체를 포함할 수 있다. 적합한 인간(또는 다른 동물) 수용체 항체는 공여자 항체, 예를 들어 닭 항체의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열과의 상동성에 의해 종래의 데이터베이스, 예를 들어 KABAT® 데이터베이스, Los Alamos 데이터베이스 및 Swiss Protein 데이터베이스로부터 선택된 것일 수 있다. 공여자 항체의 프레임워크 영역(아미노산 기준)과 상동성을 특징으로 하는 인간 항체는 공여자 CDR 삽입을 위한 중쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 가변 프레임워크 영역을 제공하는데 적합할 수 있다. 경쇄 불변 또는 가변 프레임워크 영역을 제공할 수 있는 적합한 수용체 항체가 유사한 방식으로 선택될 수 있다. 수용체 항체의 중쇄 및 경쇄는 동일한 수용체 항체에서 유래할 필요가 없다는 점에 유의해야 한다.

바람직하게는, 이종 프레임워크 영역 및 불변 영역은 인간 면역글로불린 클래스 및 IgG(서브 타입 1 내지 4), IgM, IgA 및 IgE와 같은 이소타입으로부터 선택된다. 그러나, 수용체 항체는 인간 면역글로불린 단백질 서열만을 포함할 필요는 없다. 예를 들어, 인간 면역글로불린 사슬의 일부를 코딩하는 DNA 서열이 폴리펩티드 이펙터 또는 리포터 분자와 같은 비면역글로불린 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열에 융합된 유전자를 구축하는 것이 가능하다.

인간화 항체에서, 인간 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 바람직하게는 하나 이상의 CDR 교환을 통해 유전적으로 조작되었다. 6개의 CDR을 모두 사용하거나 6개 미만의 CDR의 다양한 조합을 사용할 수 있다. 바람직하게는 6개의 CDR이 모두 교환된다. 인간 중쇄에서만 CDR을 교환할 수 있으며, 사용된 경쇄는 인간 수용체 항체로부터의 변형되지 않은 경쇄이다. 대안적으로, 다른 인간 항체로부터의 적합한 경쇄는 통상적인 항체 데이터베이스를 사용하여 선택될 수 있다. 유전적으로 조작된 항체의 나머지는 임의의 적합한 인간 수용체 면역글로불린에서 유래할 수 있다.

따라서 유전적으로 조작되거나 재조합적으로 생성된 인간화 항체는 천연 인간 항체 또는 이의 단편의 구조를 가지며 효과적인 치료 용도에 필요한 특성의 조합을 갖는다.

당업자는 유전적으로 조작된 항체가 공여자 항체, 예를 들어 닭 항체(즉, 유사체)의 특이성 및 고 친화도에 반드시 영향을 미치지 않으면서 가변 도메인의 아미노산에 대한 변화에 의해 추가로 변형될 수 있음을 이해할 것이다. 중쇄 및 경쇄의 아미노산은 가변 도메인의 프레임워크 또는 CDR 또는 둘 모두에서 다른 아미노산으로 치환될 수 있는 것으로 예상된다.

또한, 불변 영역은 예를 들어, 이량체화, Fc 수용체에 대한 결합 또는 보체에 결합하여 활성화하는 능력과 같은 본 발명의 분자의 선택적 특성을 증가 또는 감소시키기 위해 변형될 수 있다(예를 들어, 문헌[Angal et al., Mol. Immunol. 30: 105-108 (1993)], 문헌[Xu et al., J. Biol. Chem. 239: 3469-3474 (1994)], 문헌[Winter et al., EP 307,434-B] 참조).

키메라 항체인 변형된 항체는 프레임워크 영역을 포함하여, 비인간 공여자 항체, 예컨대 닭 항체의 중쇄 및 경쇄의 전체 가변 영역을 두 사슬 모두에 대한 인간 면역글로불린의 불변 영역과 결합하여 제공함으로써 위에서 설명한 인간화 항체와 상이하다.

항원에 특이적으로 결합하는 항체의 생산은 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989; 2001))]에 기술된 기술에 의해, 선행 기술에 잘 기술되어 있다. 인간화된 단클론 항체의 생산은 아래 간략하게 요약되어 있다. 적어도 CDR-코딩 영역 및 공여자 mAb, 예를 들어, 닭 단클론 항체의 결합 특이성을 유지하는데 필수적인 수용체 mAb의 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역의 부분을 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 및 또한 인간 면역글로불린 유래의 항체 사슬의 나머지 면역글로불린-유래 부분이 폴리뉴클레오티드 프라이머 및 역전사 효소를 사용하여 수득된다. CDR-코딩 영역이 공지된 데이터베이스를 사용하여 그리고 다른 항체와 비교하여 식별된다.

이어서 닭/인간 키메라 항체가 생산될 수 있고 결합 능력에 대해 시험될 수 있다. 이러한 키메라 항체는 두 사슬 모두에 대한 인간 Ig의 불변 영역과 관련하여 비인간 닭 공여자 항체의 전체 VH 및 VL 영역을 포함한다.

인간 항체로부터의 중쇄의 가변 영역의 상동 프레임워크 영역은 컴퓨터화된 데이터베이스, 예컨대 KABAT®을 사용하여 식별될 수 있으며, 닭 공여자 항체와 상동성을 가진 인간 항체가 수용체 항체로서 선택될 것이다. 경쇄의 적합한 가변 프레임워크 영역이 유사한 방식으로 설정될 수 있다.

인간화된 항체는 키메라 항체로부터 유래될 수 있거나 바람직하게는 중쇄 및 경쇄의 선택된 프레임워크 내에서 적합한 방식으로 중쇄 및 경쇄로부터의 닭 공여자 mAb의 CDR-코딩 영역의 삽입에 의해 합성적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 인간화된 항체는 표준 돌연변이 기법을 사용하여 생산될 수 있다. 따라서, 생산된 인간화된 항체는 인간 프레임워크 영역 및 닭 공여자 mAb의 CDR-코딩 영역을 포함한다. 프레임워크 잔기는 후속적으로 조작될 수 있다. 생성된 인간화된 항체는 재조합 숙주 세포, 예컨대 COS, CHO 또는 골수종 세포에서 발현될 수 있다.

통상적인 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드가 숙주 세포에서의 증식 및 발현 및/또는 숙주 세포로부터의 분비를 제어할 수 있는 통상적인 조절 제어 서열과 작동적으로 연결되어 항체에 대한 이러한 코딩 서열을 배치함으로써 생산된다. 조절 서열은 프로모터 서열, 예컨대 CMV 프로모터, 및 다른 공지된 항체로부터 유래할 수 있는 신호 서열을 포함한다. 유사하게, 제2 발현 벡터는 항체의 상보적 경쇄 또는 중쇄를 코딩하는 DNA 서열을 사용하여 생산될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 사슬이 기능적으로 발현되는 것을 최대한 보장하기 위해, 코딩 서열 및 선별 마커가 관련된 경우를 제외하고는 첫 번째 것과 동일하다. 대안적으로, 변형된 항체에 대한 중쇄 및 경쇄의 코딩 서열은 단일 벡터에 기초할 수 있다.

선택된 숙주 세포는 재조합 또는 합성 경쇄 및 중쇄 둘 모두를 포함하는 형질감염된 숙주 세포를 생산하기 위한 통상적인 기법에 의해 제1 및 제2 벡터 모두와 함께 공동형질감염(또는 단일 벡터로 간단히 형질감염)된다. 형질감염된 세포는 이어서 본 발명의 유전적으로 조작되거나 재조합적으로 생산된 항체를 생성하기 위한 통상적인 기술에 의해 배양된다. 재조합 중쇄 및/또는 경쇄의 결합을 포함하는 인간화된 항체는 적합한 분석, 예를 들어 ELISA 또는 RIA에 의해 배양물로부터 스크리닝된다. 다른 변형된 항체 분자를 구축하기 위해 유사한 통상적인 기술이 사용될 수 있다.

본원에 제공된 조성물의 방법 및 구축에 사용된 클로닝 및 서브클로닝 단계에 적합한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 기존의 pUC 시리즈의 클로닝 벡터가 사용될 수 있다. 하나의 벡터인 pUC19는 Amersham(영국, 버킹햄셔) 또는 Pharmacia(스웨덴, 웁살라)와 같은 공급업체에서 상업적으로 이용 가능하다. 또한, 쉽게 증식할 수 있고, 다수의 클로닝 부위와 선별 가능한 유전자(예컨대, 항생제 내성)를 가지고 있으며 조작이 용이한 임의의 벡터가 클로닝에 사용될 수 있다.

유사하게, 항체의 발현을 위해 사용되는 벡터는 당업자에 의해 임의의 통상적인 벡터로부터 선택될 수 있다. 벡터는 또한 선택된 숙주 세포에서 이종 DNA 서열의 증식 및 발현을 달성하는 선택된 조절 서열(예컨대 CMV 프로모터)을 포함한다. 상기 벡터는 항체 또는 변형된 면역글로불린-코딩 영역을 코딩하는 상기 기재된 DNA 서열을 포함한다. 또한, 벡터는 원하는 제한 부위를 삽입하여 쉽게 조작할 수 있도록 변형된 선택된 면역글로불린 서열을 수용할 수 있다.

발현 벡터는 또한 이종 DNA 서열의 발현을 증폭시키는데 적합한 유전자, 예를 들어 포유 동물 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR: dihydrofolate reductase gene)를 특징으로 할 수 있다. 다른 바람직한 벡터 서열은 예를 들어 소 성장 호르몬(BGH: bovine growth hormone)과 같은 폴리 A 신호 서열; 및 베타-글로빈 프로모터 서열(Betaglopro)을 포함한다. 본원에서 유용한 발현 벡터는 당업자에게 일반적으로 알려진 기술에 의해 합성될 수 있다.

이러한 벡터의 성분, 예를 들어 레플리콘, 선별 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호 서열 등은 상업적 또는 천연 공급원에서 얻거나 선택된 숙주에서 재조합 DNA의 생성물의 발현 및/또는 분비를 달성하는데 사용되는 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 포유 동물, 박테리아, 곤충, 효모 및 진균 발현을 위해 본 분야에 공지된 다양한 유형의 다른 적합한 발현 벡터가 마찬가지로 이러한 목적을 위해 선택될 수 있다.

벡터는 항체 또는 이의 변형된 면역글로불린 분자의 코딩 서열을 포함하는 재조합 플라스미드로 형질감염된 세포주의 생성에 사용될 수 있다. 이들 클로닝 벡터의 클로닝 및 기타 조작에 유용한 숙주 세포는 마찬가지로 통상적이다. 예를 들어, 박테리아 세포 예컨대 대장균, 효모 세포, 곤충 세포 또는 포유 동물 세포의 다양한 균주 유래의 세포가 클로닝 벡터의 증식 및 본 발명의 변형된 항체의 구축의 다른 단계에 사용될 수 있다.

본 발명의 항체의 발현에 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 바람직하게는 포유 동물 세포 예컨대 NS0, Sp2/0, CHO, COS, 섬유아 세포(예를 들어, 3T3) 및 골수 세포, 특히 바람직하게는 CHO 또는 골수 세포이다. 인간 세포가 사용될 수 있으므로, 인간 글리코실화 패턴으로 분자를 변형할 수 있다. 대안적으로, 다른 진핵 세포주가 사용될 수 있다. 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생산 및 정제를 위한 적합한 포유 동물 숙주 세포의 선택 및 방법이 당업계에 공지되어 있으며; 예를 들어, 위에 인용 된 Sambrook 등을 참조한다.

박테리아 세포는 본 발명의 재조합 Fab의 발현에 적합한 숙주 세포로서 유용함이 입증될 수 있다(예를 들어, 문헌[A. Pluckthun, Immunol. Rev., 130: 151-188 (1992)] 참조). 그러나, 박테리아 세포에서 발현되는 단백질이 접히지 않거나(unfolding) 부적절하게 접힌 형태 또는 비글리코실화 형태인 경향이 있기 때문에, 박테리아 세포에서 생성된 임의의 재조합 Fab은 항원-결합 능력의 유지를 위해 스크리닝되어야 한다. 박테리아 세포에 의해 발현되는 분자가 적절하게 접힌 형태로 생성된다면, 박테리아 세포는 바람직한 숙주가 될 것이다. 예를 들어, 발현에 사용되는 다양한 대장균 균주는 일반적으로 생명공학 분야에서 숙주 세포로 알려져 있다.

B. 섭틸리스(B. subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 기타 바실리(Bacili) 등의 다양한 균주도 이 방법에서 사용될 수 있다.

필요에 따라, 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라(Drosophila) 및 레피도프테라(Lepidoptera) 및 바이러스 발현 시스템과 마찬가지로 당업자에게 공지된 효모 세포 균주도 숙주 세포로서 이용 가능하다. 예를 들어, 문헌[Miller et al., Genetic Engineering, 8: 277-298, Plenum Press (1986)] 및 여기에 인용된 참고 문헌을 참조한다.

벡터를 구축할 수 있는 일반적인 방법, 숙주 세포의 생성에 필요한 형질감염 방법, 및 이러한 숙주 세포로부터 본 발명의 변형된 항체를 생성하는데 필요한 배양 방법은 모두 통상적인 기술이다. 유사하게, 일단 본 발명의 항체가 생성되면, 이들은 황산 암모늄 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기 영동 등을 포함하는 이 분야의 표준 방법에 따라 세포 배양 내용물로부터 정제될 수 있다. 이러한 기술은 당업자의 능력 내에 있다.

원하는 방법으로 발현되면, 항체는 적절한 시험(분석)을 사용하여 시험관 내 활성에 대해 시험된다. 기존의 ELISA 시험 형식은 현재 MAG에 대한 항체의 정성적 및 정량적 결합을 평가하는데 사용된다. 또한, 통상적인 제거 메커니즘에도 불구하고 체내 항체의 지속성을 평가하기 위해 수행되는, 후속 인간 임상 연구 이전에 본원에 기술된 바와 같이 항원에 대한 특이적 결합 및 중화 효능을 검증하기 위해 다른 시험관 내 분석을 사용할 수 있다.

바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 면역글로불린 분자, 다클론 항체, 단클론 항체, 키메라 항체, CDR-이식에 의해 생성된 항체, 인간화 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화-결합 Fv, scFv, 단일-도메인 항체, 디아바디, 다중특이적 항체, 이중-특이적(dual-specific) 항체 및 이특이적(bispecific) 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

바람직하게는, 항체는 닭 면역글로불린 분자 또는 항체이다. 항체는 바람직하게는 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원 또는 적합한 펩티드에 대해 생성되고 바람직하게는 다클론 또는 단클론 닭 항체이다. 동시에, 닭 항체는 다른 곳에서 정의된 대로, 인간화되거나 변형될 수 있다.

특히 바람직하게는, 닭 면역글로불린 분자는 IgY 면역글로불린 분자 또는 다클론 IgY 항체이다.

IgY로 약칭되는 면역글로불린 Y는 닭의 혈청, 특히 닭 알의 노른자에 고농도로 존재하는 면역글로불린 분자의 한 부류이다. 다른 면역글로불린과 마찬가지로, IgY는 또한 특정 외래 구조에 반응하여 면역계에 의해 형성되고 이들을 특이적으로 인식하는 단백질이다.

면역글로불린 Y는 닭의 IgG와 기능적으로 동등하며, IgG처럼 두 개의 경쇄와 두 개의 중쇄로 구성된다. 구조적으로, 두 가지 면역글로불린 부류는 특히 중쇄가 다르며, IgY의 경우 약 65.1 킬로달톤의 분자량을 갖고 따라서 IgG의 경우보다 더 크다. 약 18.7 킬로달톤의 몰 질량으로, IgY의 경쇄는 IgG에 비해 약간 작다. 따라서 IgY의 몰 질량은 약 167 킬로달톤이다. IgY 분자의 입체적 유연성은 IgG보다 낮다.

기능적으로, IgY는 부분적으로 IgE 및 IgG 둘 다와 유사하다. 그러나, IgG와 달리, IgY는 단백질 A 또는 단백질 G 또는 세포 Fc 수용체에 결합하지 않는다. 또한, IgY는 보체 시스템을 활성화하지 않는다. 면역글로불린 Y라는 명칭은 1969년 G.A. Leslie와 L.W. Clem이 닭 알에서 발견되는 면역글로불린과 면역글로불린 G 사이의 차이를 보여줄 수 있었던 후에 제안되었다.

항체의 특정 회수 및 생물학적 분석에서의 사용을 위해, IgY는 포유류 항체 사용에 비해 다양한 이점을 제공한다. 산란된 알의 노른자에서 항체가 회수되기 때문에, 비침습적인 항체 생산 방법이 고려된다. 따라서 혈청을 얻기 위해 닭에서 혈액을 채취할 필요가 없다. 동일한 닭이 반복적으로 알을 낳으면 특정 항체의 이용 가능한 양이 상당히 증가한다. 포유류 단백질과의 교차 반응도 IgG보다 매우 현저하게 낮다. 또한 특정 항원에 대한 면역 반응이 토끼나 다른 포유류보다 닭에서 더 두드러진다. 면역 반응 중에 형성된 면역글로불린 중, IgY만이 닭 알에서 발견될 수 있기 때문에, 해당 제제에는 IgA 또는 IgM 오염이 포함되어 있지 않다. 하나의 닭 알에서 IgY의 수율은 높고 토끼 혈청의 IgG와 비슷하다. IgY는 단백질 A/G에 결합하지 않고 보체 인자를 활성화하지 않으며 항체의 Fc 부분에 결합하지 않기 때문에, 결과적으로 많은 응용 분야에서 배경이 감소한다.

또한, IgY는 특히 일본과 같은 아시아 국가에서 식품 성분으로 사용된다. 예를 들어, 특정 IgY를 포함하는 요구르트 제품이 판매된다. 이는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 종의 박테리아가 위장에 붙는 것을 방지한다. 이 목적으로 사용되는 IgY는 면역화된 닭의 알에서 회수된다. 따라서 항체는 살모넬라 균 및 기타 박테리아에 대해서도 생산되지만, 바이러스에 대해서도 생산되며, 이러한 병원균에 대한 보호를 위한 식품 성분으로 사용된다. 따라서, 본 발명에 따른 IgY는 예를 들어 새로운 식품 또는 기능성식품의 형태로 사용될 수 있다.

현재 닭 알 노른자에서 다클론 항체를 생산하거나 닭에서 단클론 항체를 생산하는 여러 상업적 공급업체가 있다(예컨대, Genosphere Biotechnologies, David's Biotechnology).

추가의 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 (간접적으로) Th17 세포 증식, Th17 세포 분화 또는 Th17 세포 활성의 감소를 유도한다. 대안적으로 또는 추가적으로, 항체 또는 항원-결합 단편은 B 세포에 의한 내인성 항원에 대한 항체의 형성을 억제한다.

Th17 세포는 소위 나이브(naive) T 헬퍼 세포, 즉 항원 접촉에 의해 활성화 된 후에만 특정 항원과 아직 접촉하지 않은 T 헬퍼 세포에서 발생한다. Th17 세포의 분화에는 IL-6 및 TGF-β가 필요하다. Th17 세포는 그들이 생산하는 인터루킨 IL-17의 이름을 따서 명명되었으며, 호중구의 활성화에 중요한 역할을 하고, 만성 염증 및 자가면역 질환의 발병과도 관련이 있다. Th17 세포의 추가 분비 생성물은 TNF-α와 IL-6이다. IL-17에 대한 수용체는 면역계의 다양한 세포 유형, 예를 들어 호중구를 포함하는 골수 세포, 및 림프구에 위치하고 있다. Th17 세포에서 방출되는 메신저 물질은 호중구가 지배적인 역할을 하는 염증 과정을 야기한다. 언급된 표적 세포에서, IL-17은 특히 G-CSF, IL-6 및 IL-8의 방출을 일으켜 호중구의 이동 및 활성화를 유발한다. 또한, IL-1, IL-6, PGE-2, 사이클로옥시게나제 2 및 매트릭스 메탈로프로테아제와 같은 전염증성 단백질이 증가된 정도로 발현된다.

상기 언급된 매커니즘, 즉 Th17 세포 증식의 감소, Th17 세포 분화 또는 Th17 세포 활성 및/또는 B 세포에 의한 내인성 항원에 대한 항체 형성의 억제의 결과, 본 발명의 항체는 면역관용 증가에 기여한다. 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 제1형 당뇨병 및 알러지성 천식과 같은 면역 질환은 실질적으로 Th17 면역 세포의 활성에 의해 결정된다. 장내 박테리아 칸디다투스 사바겔라(분절된 사상균)는 이러한 Th17 면역 세포를 정확하게 유도한다(예를 들어, 미국공개특허 제US 2012/276149호; 국제공개특허 제WO 2011/047153호 참조). 본 발명은 Th17 면역 세포-매개 질환을 치료하기 위해 경구 투여된 닭 단백질 항체로 상기 박테리아를 중화시키는 것을 포함한다. Th17 세포 증식의 감소, Th17 세포 분화의 감소, Th17 세포 활성의 감소 또는 B 세포에 의한 내인성 항원에 대한 항체 형성의 억제에 대한 시험은 당업자에게 공지되어 있으며 선행 기술에 기재되어 있고; 예를 들어, 미국공개특허 제US 2012/276149호 또는 국제공개특허 제WO 2011/047153호를 참조한다.

바람직한 실시형태에서, 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원은 박테리아 벽 단백질, 특히 바람직하게는 미오신-교차-반응성 항원(서열번호 1)이다.

본 발명의 맥락에서 항원의 예는 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 세포벽 단백질, 예를 들어 미오신-교차-반응성 항원이며, 이의 아미노산 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.

바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 아미노산 서열 SVLDEFYWLDKKDPYSL(서열번호 2), PDFKAVRFTRRNQYESMI(서열번호 3) 또는 QATSIKILRDGKEEEIKL(서열번호 4)을 포함하거나 이로 이루어진, 미오신-교차-반응성 항원 유래의 에피토프에 결합한다.

본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 본 발명에 따른 항체를 생산하는 방법에 관한 것이다:

a) 닭을 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원 유래의 면역 펩티드로 면역화하는 단계; 및

b) 닭 또는 상기 닭이 낳은 알에서 형성된 항체를 회수하고 정제하는 단계.

본 발명의 중화 항체는 기능-결정 및 분절된 사상균(SFB)-특이적 단백질의 군으로부터 박테리아 벽 단백질이고 장 상피에 대한 부착 및/또는 칸디다투스 사바겔라 또는 분절된 사상균(SFB)의 생존에 비중복 역할을 하는 것을 특징으로 하는 적합한 단백질, 예컨대, 예를 들어, 미오신-교차-반응성 항원(MCRA) 단백질을 선택함으로써 생성된다. 이어서 적합한 에피토프는 예를 들어 에피토프 예측 프로그램 및/또는 데이터베이스의 도움으로 선택된 표적 항원의 단백질 서열 내에서 결정된다. 수학적으로 최고의 항원성/면역원성을 갖는 표적 서열이 이어서 항체 생산을 위해 선택된다. 아미노산 서열을 이용하여, 해당 펩티드가 다음 단계에서 충분한 양으로 합성된다. 항원으로 작용할 수 있으려면, 펩티드와 같은 저분자량 분자가 운반체 단백질(운반체)에 결합되어야 한다. 오브알부민(닭 알 알부민)과 소 또는 인간 혈청 알부민 외에도, 달팽이 단백질 KLH는 동물의 면역화를 위한 생명공학 분야에서 널리 퍼져있는 운반체 단백질이다. 따라서, 펩티드는 예를 들어 단백질 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH: keyhole limpet hemocyanin)에 커플링될 수 있다. 닭은 60일 이내에 펩티드-KLH 복합체를 이용하여 4회 면역화되고, 첫 번째 면역화 동안 동물은 2배의 양을 받는다. 상기 면역화 단계 후에, 닭 한 마리가 한 달에 최대 3 g의 IgY를 생산할 것이다. 그런 다음 항체를 난황으로부터 분리하고 이의 중화 효과, 즉 항체가 장내 상피 세포에 대한 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 부착 또는 결합 억제, 상기 박테리아의 증식 억제 및/또는 박테리아의 고갈 또는 사멸 능력의 여부가 시험된다.

상기 언급된 방법에 의해 본 발명에 따른 항체를 생산하는데 바람직한 것은 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원으로서 미오신-교차-반응성 항원이다. 아미노산 서열 서열번호 1을 갖는 미오신-교차-반응성 항원, 즉 아미노산 서열 SVLDEFYWLDKKDPYSL(서열번호 2), PDFKAVRFTRRNQYESMI(서열번호 3) 또는 QATSIKILRDGKEEEIKL(서열번호 4)을 가진 펩티드 유래의 에피토프 서열이 특히 바람직한 것으로 주어진다.

상기 주어진 용어에 대한 정의 및 설명은 후술하는 실시형태에서 준용된다.

본 발명은 또한 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 항체를 포함하는 약물에 관한 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 약학적으로 허용되는 담체에 현탁된다. 바람직하게는, 치료될 환자는 인간이다.

본 발명의 추가 주제는 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편 또는 본 발명에 따른 방법에 의해 생성된 항체 및 또한 바람직하게는 적합한 첨가제 및/또는 부형제를 포함하는 약물이다. 적합한 첨가제 및/또는 부형제는 예를 들어 생리 식염수, 적합한 안정화제, 프로테나제 억제제 등이다. 적합한 안정화제는 예를 들어 Tween 80(0.02%), 설탕 용액, 예를 들어 수크로스 용액(20 내지 30%) 또는 아미노산 용액, 예를 들어 글리신 또는 시스테인 용액이다. 본 발명에 따른 약물은 일반적으로 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편을 적합한 첨가제 및/또는 부형제와 혼합하여 생산된다.

본 발명의 치료제는 예방제로서 또는 필요에 따라 투여될 수 있다. 치료의 용량 및 기간은 인간 순환에서 본 발명의 분자의 상대적 기간과 관련되며 치료된 상태 및 환자의 일반적인 건강에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다.

본 발명의 치료제의 투여 방식은 제제를 숙주에 전달하는 임의의 적절한 경로일 수 있다. 본 발명의 항체 및 약학 조성물/약물은 특히 경구 투여에 유용하다.

바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따른 약물은 종양학적 질환, 알러지성 질환 또는 면역 질환, 바람직하게는 자가면역 질환의 예방 또는 치료에 사용되며, 상기 질환은 Th17 세포의 활성에 의해 매개된다.

예를 들어, 알러지 환자 또는 자가면역 질환을 앓고 있는 환자는 정의된 치료 요법에서 정의된 기간에 걸쳐 본 발명의 특정 SFB 항체를 경구 복용한다. 그런 다음, 알러지 반응의 감소는 예를 들어 찌르기 시험(prick test)을 통해 결정된다. 자가면역 질환을 앓고 있는 환자에 대한 특정 SFB 항체의 효과는 예를 들어 자가항체의 형성 감소를 통해 검출될 수 있다. 기준은 SFB 항체 처리가 없을 때 반응의 강도에 해당한다.

바람직하게는, 알러지 질환, 면역질환 또는 자가면역 질환은 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 류마티스성 관절염, 알러지성 호흡기 질환 및 알러지성 천식으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가의 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 경구 투여된다. 닭 항체(IgY)는 특히 산에 안정하기 때문에 환자의 경구용에 특히 적합하다. 그러나, 면역글로불린의 전달에 사용된 모든 이전 경로, 예를 들어 근육 내, 정맥 내, 복강 내 또는 척수강 내 투여도 포함된다.

추가의 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항생제, 바람직하게는 베타-락탐 및/또는 글리코 펩티드 항생제와 조합하여 사용된다.

또한, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 본 발명에 따른 약물의 제조 방법에 관한 것이다:

a) 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 단계; 및

b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약물로 제형화하는 단계.

본 발명은 마지막으로 Th17 세포 증식, Th17 세포 분화 또는 Th17 세포 활성의 감소 및/또는 B 세포에 의한 내인성 항원에 대한 항체 형성의 억제를 위한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 외에, 키트는 또한 베타-락탐 및/또는 글리코펩티드 항생제와 같은 항생제 및 키트의 구성요소 사용 지침을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "약"은 +/- 20%, +/- 10%, +/- 5%, +/- 4%, +/- 3%, +/- 2% 또는 +/- 1% 범위의 변형을 포함하여, 본 설명에서 언급된 특정 값을 지칭한다.

본원에서 사용된 용어 "결정하다", "결정" 또는 "검출"은 정성적, 반정량적 및/또는 정량적 결정, 예를 들어 치료 목적으로 상기 항체를 투여받은 환자의 혈청 또는 혈장에서 본 발명의 항체의 정량적 결정을 포함한다.

본원에서 인용된 모든 문헌 참고의 내용은 각각의 특정 개시내용 및 그 전체가 인용되어 본원에 포함된다.

본 발명의 더욱 특히 바람직한 실시형태가 하기 실시예에 제시되어 있다.

도 1: 본 발명의 기초를 형성하는 개념의 도면 요약: 특이적 사상체 칸디다투스 사바겔라 박테리아(분절된 사상균, SFB)가 장벽에 군집화하고, 수지상 세포(DC)를 통해, Th17 세포를 활성화하여, 자가면역 및 아토피에 기여한다. 먼저, 상기 박테리아의 적절한 박테리아 벽 단백질을 식별하고(1), 합성하여 닭에 주입한다(2). 닭은 고도로 특이적인 항-SFB 항체를 형성하는데, 이는 알에서 단리될 수 있고(3) 인간의 경구 항체 요법에 이용가능하다(4). 장에서 SFB 미생물 수의 감소는 Th17 이펙터 세포 활성을 감소시켜 면역관용을 유발할 수 있다.

실시예:

다음 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다. 보호 범위와 관련하여, 이들은 제한적인 방식으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1 : 미오신-교차-반응성 항원(MCRA) 단백질에 대한 중화 항체의 생산 및 회수

기능-결정 및 분절된 사상균(SFB)-특이적 단백질 군으로부터, 미오신-교차-반응성 항원(MCRA) 단백질을 선택하였으며, 이는 박테리아-벽 위치 및 인간의 장 상피에 대한 부착 및 칸디다투스 사바겔라 또는 분절된 사상균(SFB)의 생존에 있어 비중복 역할로 인해 중화 항체에 대해 적합한 표적을 나타냈다. 이어서 MCRA 단백질(서열번호 1)의 공지된 단백질 서열 내에서 적합한 에피토프를 결정하였다. 산술적으로 가장 우수한 항원성을 갖는 표적 서열을 항체 생산을 위해 선택하였다. 다음 단계에서, 공지된 아미노산 서열을 사용하여, 서열번호 2, 3 및 4를 가진 상응하는 펩티드를 충분한 양으로 합성한 후 단백질 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)에 결합시켰다. 닭은 60일 이내에 펩티드-KLH 복합체로 4회 면역화하였고, 첫 번째 면역화 동안 동물은 2배의 양을 받았다. 상기 면역화 단계 후, 한 마리의 닭은 한 달에 최대 3 g의 IgY를 생산하였다. 그런 다음 항체를 난황으로부터 단리하였다(문헌[Hassl et al., 1987 http://www.unet.univie.ac.at/~a7505973/texte/JiM1.pdf]).

실시예 2: 미오신-교차-반응성 항원(MCRA) 단백질에 대한 중화 항체의 치료 적 사용

본 발명자들의 기본 작동 가설에 따르면, 환자의 장에서 SFB 군집화 밀도가 감소하면 TH17 반응이 감소한다. 이것은 일반적으로 TH17-매개 염증성 질환에서 큰 치료적 관련성이 있다.

본 발명자들은 SFB가 또한 인간 환자의 장에도 존재하고 중화 항체를 이용한 경구 요법이 모든 범위의 알러지성 질환, 면역 질환, 자가면역 질환 및 종양 질환의 치료에 적합할 수 있다고 가정하였다.

이러한 선택된 치료적 접근법은 - 예를 들어, 알러지성 호흡기 질환에 대한 덱사메타손과 같은 대부분의 확립된 요법과는 달리 - 임의의 부작용이 거의 예상되지 않으며 예를 들어 새로운 식품과 같은 매우 단순화된 승인 절차의 가능성이 있기 때문에 특히 매력적이다.

이와 관련하여, 닭 항체(IgY)의 사용은 본 발명의 기본 개념이다. 닭 항체(IgY)의 사용은 고전적인 접근법에 비해 많은 장점이 있다: 예를 들어, IgY는 인간 보체 시스템과 반응하지 않고 특히 높은 산 안정성을 가지고 있어, 경구 투여 치료제 개발에 매력적이다.

이 경우, 경구 투여는 다음과 같이 보일 수 있다:

알러지 환자는 정의된 치료 요법에서 정의된 기간에 걸쳐 특정 SFB 항체를 경구 복용한다. 그런 다음, 알러지 반응의 감소는 예를 들어 찌르기 시험(prick test)을 통해 결정된다. 기준은 SFB 항체 처리가 없을 때 반응의 강도에 해당한다.

요약하면, 본 프로젝트에서 적합한 SFB 박테리아 벽 단백질을 확인하고 합성하여 닭에 주입하였다. 닭은 알에서 단리된 매우 특이적인, 중화 항-SFB 항체를 생산하였다. 알에서 단리된 상기 생성물은 약학적 잠재력을 가지고 있으며 이어서 광범위한 알러지성 질환, 면역 질환, 자가면역 질환 및 종양 질환의 치료를 위해 환자의 경구 항체 치료에 사용될 수 있다.

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Claims (15)

1. 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 항체 또는 항원-결합 단편이 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원에 결합하여 (i) 장내 상피 세포, 바람직하게는 인간 장내 상피 세포로의 박테리아의 결합을 억제하고/하거나 (ii) 박테리아를 고갈시키는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
2. 제1항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 면역글로불린 분자, 다클론 항체, 단클론 항체, 키메라 항체, CDR-이식에 의해 생성된 항체, 인간화 항체, Fab, Fab', F(ab')₂, Fv, 이황화-결합 Fv, scFv, 단일-도메인 항체, 디아바디, 다중특이적 항체, 이중-특이적(dual-specific) 항체 및 이특이적(bispecific) 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 닭 면역글로불린 분자 또는 항체인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
4. 제3항에 있어서, 닭 면역글로불린 분자가 IgY인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 Th17 세포 증식, Th17 세포 분화 또는 Th17 세포 활성 감소를 야기하고/하거나 B 세포에 의한 내인성 항원에 대한 항체 형성을 억제하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원이 박테리아 벽 단백질, 바람직하게는 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 미오신-교차-반응성 항원인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편이 미오신-교차-반응성 항원 유래의 에피토프에 결합하고, 상기 에피토프가 아미노산 서열 SVLDEFYWLDKKDPYSL(서열번호 2), PDFKAVRFTRRNQYESMI(서열번호 3) 또는 QATSIKILRDGKEEEIKL(서열번호 4)로 이루어지거나 이를 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체를 생산하는 방법으로서,
   a) 닭을 박테리아 칸디다투스 사바겔라의 항원, 바람직하게는 박테리아 벽 단백질 유래의 면역 펩티드로 면역화하는 단계; 및
   b) 닭 또는 상기 닭이 낳은 알에서 형성된 항체를 회수하고 정제하는 단계를 포함하는 방법.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편 또는 제8항에 청구된 방법으로 생산된 항체를 포함하는 약물.
10. 제9항에 있어서, 종양학적 질환, 알러지성 질환, 면역질환 또는 자가면역 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 약물로서, 상기 질환은 Th17 세포의 활성에 의해 매개되는 것인, 약물.
11. 제10항에 있어서, 알러지성 질환, 면역질환 또는 자가면역 질환이 다발성 경화증, 제1형 당뇨병, 류마티스 관절염 및 알러지성 천식으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약물.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 경구 투여되는, 약물.
13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 항생제, 바람직하게는 베타-락탐 및/또는 글리코펩티드 항생제와 조합하여 사용되는, 약물.
14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항의 약물의 제조 방법으로서,
    a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 단계; 및
    b) 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 약물로 제형화하는 단계를 포함하는 방법.
15. Th17 세포 증식, Th17 세포 분화 또는 Th17 세포 활성의 감소 및/또는 B 세포에 의한 내인성 항원에 대한 항체 형성 억제를 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 선택적으로 항생제를 포함하는 키트.

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