JP6152090B2 - 視神経脊髄炎を処置するための組成物および方法 - Google Patents
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Description
本発明は、全般的に医学、免疫学、神経学、および病理学の分野に関する。より詳しくは、本発明は、視神経脊髄炎(NMO)の処置での使用のための免疫試薬の開発に関する。
AQP4(アクアポリン4)は、中枢神経系全体に存在するアストロサイトにおいて発現される水チャネルであり(Lennon et al., 2005)、脳(Manley et al., 2000; Papadopoulos et al., 2004)および脊髄(Saadoun et al., 2008)における水バランス、知覚神経シグナル伝達(Li and Verkman, 2001; Lu et al., 2008)、ならびに発作の機能活動(Binder et al., 2006)および皮質拡延性抑制(Padmawar et al., 2005)およびアストロサイト遊走およびグリア性瘢痕(Saadoun et al., 2005; Auguste et al., 2007)を含む神経興奮現象に関与する。AQP4は、アストロサイトにおいて2つの主なアイソフォームとして、すなわちMet-1で翻訳を開始する長い(M1)アイソフォームおよびMet-23で翻訳を開始するより短い(M23)アイソフォーム(Hasegawa et al., 1994; Jung et al., 1994; Yang et al., 1995; Lu et al., 1996)として発現される。M23 AQP4は、膜において、凍結割断電子顕微鏡によって初めて認められた粒子直交アレイ(OAP)と呼ばれる正方形アレイとして集合する(Landis and Reese, 1974; Wolburg, 1995)。M23によるOAP形成は、その細胞質N末端のMet-23のすぐ下流の残基を含む四量体-四量体相互作用に起因するが、Met-23のすぐ上流のM1 AQP4の残基はこの相互作用を崩壊させる(Crane and Verkman, 2009)。M1はそれ自身OAPを形成しないが、ヘテロ四量体ではM23と共に集合することができ、このためにOAPのサイズは制限される(Neely et al., 1999; Furman et al., 2003; Crane et al. (2009); Tajima et al., 2010)。AQP4によるOAP形成の生物学的意義は、まだ分かっていないが、細胞-細胞接着、AQP4水透過性の増強、およびアストロサイト終足に対するAQP4分極を含む機能が推測されている。
抗アクアポリン4(AQP4)抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬を対象に投与する段階
を含む、視神経脊髄炎(NMO)スペクトラム疾患を有する対象を処置する方法。
[本発明1002]
対象がヒト対象である、本発明1001の方法。
[本発明1003]
投与する段階が、眼内投与、動脈内投与、皮下投与、静脈内投与、またはくも膜下経路の投与を含む、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記試薬が、エフェクター機能を欠く変異Fc領域を含む、本発明1001の方法。
[本発明1005]
変異Fc領域が、L234A/L235A置換を有するIgG1配列を含む、本発明1004の方法。
[本発明1006]
変異Fc領域が、K322A置換を有するIgG1配列を含む、本発明1004の方法。
[本発明1007]
変異Fc領域が、G237Aアミノ酸置換を有するIgG1配列を含む、本発明1004の方法。
[本発明1008]
変異Fc領域が、L234A/L235A/G237A置換を有するIgG1配列を含む、本発明1004の方法。
[本発明1009]
前記試薬がIgG4抗体である、本発明1001の方法。
[本発明1010]
前記試薬が、化学的に改変されたFc領域を含む、本発明1001の方法。
[本発明1011]
前記試薬が、抗体Fab断片を含み、かつFc領域を欠いている、本発明1001の方法。
[本発明1012]
前記試薬が、非抗体タンパク質セグメントと融合された抗体Fab断片を含む、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記試薬が一本鎖抗体またはF(ab') 2 を含む、本発明1001の方法。
[本発明1014]
処置することが、網膜神経節細胞死、視神経損傷、脊髄損傷、または軸索離断のうちの1つまたは複数を低減させることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1015]
処置することが、視神経脱髄、脊髄脱髄、アストロサイト死、またはオリゴデンドロサイト死のうちの1つまたは複数を低減させることを含む、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記試薬が、長期間および毎日を含む複数回投与される、本発明1001の方法。
[本発明1017]
前記試薬が、NMO発作の発生時またはNMO発作後に投与される、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記試薬が、NMO発作から約1時間、6時間、12時間、24時間、または2日以内に投与される、本発明1017の方法。
[本発明1019]
NMOの1つまたは複数の局面を処置する第二の物質を対象に投与する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1020]
第二の物質が、前記試薬と同時に投与される、本発明1019の方法。
[本発明1021]
第二の物質が、前記試薬の投与前または投与後に投与される、本発明1019の方法。
[本発明1022]
抗体または抗原結合断片が、SEQ ID NO:6に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:6と80%の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:8に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:8と80%の同一性を有する配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1023]
抗体または抗原結合断片が、SEQ ID NO:10に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:10と80%の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:12に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:12と80%の同一性を有する配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1024]
抗体または抗原結合断片が、SEQ ID NO:19に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:19と80%の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:17に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:17と80%の同一性を有する配列を含む、本発明1001の方法。
[本発明1025]
軽鎖可変配列が、SEQ ID NO:5を含むか、またはSEQ ID NO:5と70%の同一性を有する配列を含み、かつ重鎖可変配列が、SEQ ID NO:7を含むか、またはSEQ ID NO:7と70%の同一性を有する配列を含む、本発明1022の方法。
[本発明1026]
軽鎖可変配列が、SEQ ID NO:9を含むか、またはSEQ ID NO:9と70%の同一性を有する配列を含み、かつ重鎖可変配列が、SEQ ID NO:11を含むか、またはSEQ ID NO:11と70%の同一性を有する配列を含む、本発明1023の方法。
[本発明1027]
軽鎖可変配列が、SEQ ID NO:20を含むか、またはSEQ ID NO:20と70%の同一性を有する配列を含み、かつ重鎖可変配列が、SEQ ID NO:18を含むか、またはSEQ ID NO:18と70%の同一性を有する配列を含む、本発明1024の方法。
[本発明1028]
抗体または抗原結合断片が、rAb-53またはrAb-58との研究室での名称を有する抗体の抗原結合部分を含む、本発明1001の方法。
[本発明1029]
NMO-IgG(AQP4)血清陽性に関して患者を評価する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1030]
対象がNMO-IgG(AQP4)血清陽性を示す、本発明1001の方法。
[本発明1031]
対象が、横断脊髄炎、視神経炎、または他の関連性のない神経機能障害のうちの1つまたは複数を示す、本発明1001の方法。
[本発明1032]
関連性のない神経機能障害が、長引く悪心または嘔吐を含む、本発明1029の方法。
[本発明1033]
抗アクアポリン4(AQP4)抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬を対象に投与する段階
を含む、対象における視神経脊髄炎(NMO)スペクトラム疾患の増悪を予防するまたは低減させるために対象を長期間処置する方法。
[本発明1034]
抗アクアポリン4(AQP4)抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬を対象に投与する段階
を含む、対象における視神経脊髄炎(NMO)スペクトラム疾患の進行を予防または阻害する方法。
[本発明1035]
抗アクアポリン4(AQP4)抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、インタクトな抗体のエフェクター機能を欠いている該試薬。
[本発明1036]
エフェクター機能を欠く変異Fc領域を含む、本発明1035の試薬。
[本発明1037]
変異Fc領域が、L234A/L235A置換を有するIgG1配列を含む、本発明1036の試薬。
[本発明1038]
変異Fc領域が、K322A置換を有するIgG1配列を含む、本発明1036の試薬。
[本発明1039]
変異Fc領域が、G237A置換を有するIgG1配列を含む、本発明1036の試薬。
[本発明1040]
変異Fc領域が、L234A/L235A/G237A置換を有するIgG1配列を含む、本発明1036の試薬。
[本発明1041]
IgG4抗体である、本発明1001の試薬。
[本発明1042]
化学的に改変されたFc領域を含む、本発明1001の試薬。
[本発明1043]
抗体Fab断片を含み、かつFc領域を欠いている、本発明1001の試薬。
[本発明1044]
非抗体タンパク質セグメントと融合された抗体Fab断片を含む、本発明1001の試薬。
[本発明1045]
一本鎖抗体またはF(ab') 2 を含む、本発明1001の試薬。
[本発明1046]
IgG2もしくはIgG3抗体、またはその抗原結合断片である、本発明1036の試薬。
本発明の他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明により様々な変更および修正が当業者には明らかとなるであろうが、それらも本発明の精神および範囲に含まれることから、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の具体的な態様を示しているが、説明のために与えられるに過ぎないと理解すべきである。
本発明者らは、これまでに、NMO患者の血清および組換えモノクローナルNMO-IgGが各々、AQP4のM23およびM1アイソフォームの両方に結合できることを示したが(Crane et al., 2009)、このことは、1人のNMO患者の血清のM1 AQP4に対する結合は検出できなかったと報告する初期の研究(Nicchia et al., 2009)とは矛盾した。1つのNMO血清検体を分析したこれまでの報告は、OAPがNMO-IgGの唯一の標的であるという結論を下した(Nicchia et al., 2009)。しかし、血清抗AQP4自己抗体についての臨床血清アッセイがM1 AQP4を用いていること(Wingerchuk et al., 2006)、ならびに本発明者ら(Bennett et al., 2009; Crane et al., 2009)および他の研究者(Hinson et al., 2007)が、いくつかのNMO自己抗体が、M1 AQP4のみを発現する細胞に強く結合することを報告したことから、前述の結論が正しいことはありえない。最近の研究により、M23発現細胞を用いることによって、NMO-IgG結合アッセイの臨床的感度を改善できることが示されたが(Mader et al., 2010)、NMO-IgG AQP4特異性に関する定量的試験はなく、またAQP4アイソフォームに対するNMO-IgG結合の親和性も測定されていない。
ドヴィック病またはドヴィック症候群としても知られる視神経脊髄炎(NMO)は、ヒトの自分自身の免疫系が視神経および脊髄を攻撃する自己免疫性の炎症障害である。これは、視神経(視神経炎)および脊髄(脊髄炎)の炎症を生じる。炎症はまた、脳にも影響を及ぼしうるが、病変は、関連する病態である多発性硬化症(MS)において観察される病変とは異なる。脊髄の病変により、脚または腕における様々な程度の衰弱または麻痺、知覚喪失(失明を含む)、および/または膀胱および腸管機能障害が起こる。
1.絶対基準:
視神経炎
急性脊髄炎
2.支持基準:
疾患発生時にMSの基準を満たしていない脳MRI。
脊髄に比較的大きい病変があることを示す、脊椎分節3つ以上に及ぶ連続的なT2強調像の信号異常を有する脊髄MRI。
NMO-IgG血清陽性状態。NMO-IgG試験は、アクアポリン4抗原に対する抗体の存在をチェックする。
・ 上記の診断基準に従う標準的なNMO。
・ 長軸方向の広範囲にわたる脊髄炎の1回または再発性事象、および左右同時または再発性の視神経炎などの、NMOの限定型。
・ アジア視神経脊髄型MS。この異型はMSのようなCNS障害を呈しうる。
・ 全身性自己免疫疾患に関連する、長軸方向の広範囲にわたる脊髄炎または視神経炎。
・ 視床下部、周室核、および脳幹などの特定の脳の領域の病変に関連する視神経炎または脊髄炎。
A.全般的方法
AQP4に結合するモノクローナル抗体は、いくつかの応用において有用性を有すると理解される。これらは、NMOを検出および診断するために用いるための、ならびにNMOを処置するための診断キットの作製を含む。これらの関連では、そのような抗体を診断用もしくは治療用物質に連結させてもよく、それらを競合アッセイにおける捕捉物質もしくは競合物質として用いてもよく、またはそれらを追加の物質を付加させることなく個々に用いてもよい。以下にさらに考察されるように、抗体は変異または改変させてもよい。抗体を調製および特徴付けする方法は、当技術分野において周知である(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;米国特許第4,196,265号を参照されたい)。
本発明による抗体は、第一の例において、この場合はAQP4に対するその結合特異性によって定義されうる。当業者は、当業者に周知の技術を用いて所定の抗体の結合特異性/親和性を評価することによって、そのような抗体が本発明の特許請求の範囲の範囲内に入るか否かを決定することができる。
様々な態様において、発現の改善、交叉反応性の改善、標的以外への結合の減少、または補体の活性化もしくは免疫細胞(例えば、T細胞、単球、またはNK細胞)の動員などの1つもしくは複数の天然のエフェクター機能の抑止などの多様な理由により、同定された抗体の配列を操作することを選択してもよい。以下は、抗体操作のための関連する技術に関する全般的考察である。
Fc領域におけるIgG機能を損なわせるための別のアプローチは、抗体をカルバミル化、アミド化、またはベンジル化することである。これらの改変のための技術は、Thrasher and Cohen, J. Immunol, 107:672-677 (1971)において提示されている。
一本鎖可変断片(scFv)は、短い(通常、セリン、グリシン)リンカーによって共に連結された、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域の融合体である。このキメラ分子は、定常領域の除去およびリンカーペプチドの導入にもかかわらず、もとの免疫グロブリンの特異性を保持する。この改変は通常、特異性を変化させない。これらの分子は、これまで、1つのペプチドとして抗原結合ドメインを発現させるために非常に簡便であるファージディスプレイを容易にするために作製された。または、scFvは、ハイブリドーマに由来するサブクローニングした重鎖および軽鎖から直接作製することができる。一本鎖可変断片は、完全な抗体分子において見いだされる定常Fc領域を欠き、したがって、抗体を精製するためには共通の結合部位(例えば、プロテインA/G)を用いる。プロテインLは、κ軽鎖の可変領域と相互作用することから、これらの断片はしばしば、プロテインLを用いて精製/固定化することができる。
ある態様において、本発明の抗体は精製されうる。本明細書において用いられる「精製された」という用語は、タンパク質がその天然に得ることができる状態と比較して何らかの程度精製されている、他の成分から単離可能な組成物を意味すると意図される。それゆえ、精製タンパク質は、そのタンパク質が天然に存在しうる場合の環境を含まないタンパク質も意味する。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この名称は、タンパク質またはペプチドが組成物の主成分を形成している、例えば、組成物中のタンパク質の約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%またはそれより多くを構成している場合などの、組成物を意味する。
A.製剤および投与
本発明は、抗AQP4抗体およびそれを生成するための抗原を含む薬学的組成物を提供する。そのような組成物は、抗体またはその断片の予防的または治療的有効量と、薬学的に許容される担体とを含む。具体的な態様において、「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局によって承認されていること、または動物において、およびより特にヒトにおいて用いるために米国薬局方もしくは他の一般的に認識される薬局方に記載されていることを意味する。「担体」という用語は、治療用物質が共に投与される希釈剤、賦形剤、または媒体を意味する。そのような薬学的担体は、水、ならびに落花生油、大豆油、鉱油、およびゴマ油などの、石油、動物、植物、または合成起源の油を含む油などの滅菌液体でありうる。水は、薬学的組成物を静脈内注射する場合の特定の担体である。生理食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、特に注射用溶液のための液体担体として利用することができる。他の適した薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、およびエタノールなどが挙げられる。
本発明の抗体治療の有効性を増加させるために、この処置を、NMOを処置または予防するために有効である他の物質と併用することが望ましい可能性がある。このプロセスは、本発明の抗体と他の物質とを同時に患者に投与する段階を伴いうる。これは、両方の物質を含む1つの薬学的組成物を用いることによって、または1つの組成物が本発明の抗体を含み、他の組成物が第二の物質を含む、2つの別個の組成物を同時に投与することによって、行われうる。
第二の物質の投与は、もしあれば毒性を考慮に入れて、その薬物の全般的プロトコールに従う。処置サイクルは必要に応じて繰り返されると予想される。第二の処置を以下に考察する。
プレドニゾンなどのコルチコステロイド(急性発作に関しては高用量;長期間の治療に関しては低用量)は、NMOの主要な治療であり、したがって本発明の抗AQP4抗体との併用治療として容易に適用される。抗AQP4抗体との併用において用いることができる免疫抑制剤処置には、アザチオプリン(Imuran)とプレドニゾンの併用、ミコフェノール酸モフェチルとプレドニゾンの併用、リツキシマブ、ミトキサントロン、免疫グロブリン静注(IVIG)、およびシクロホスファミドが挙げられる。
プラスマフェレーシスは、血液循環から血漿(の成分)を除去、処置、および戻すことである。このように、これは体外治療(体外で行われる医学的技法)である。方法はまた、多様な薬剤へとさらに製造するための血漿を採取するためにも用いることができる。技法は、重症筋無力症、ギラン-バレー症候群、狼瘡、血栓性血小板減少性紫斑病、およびNMOなどの、免疫系の障害を含む多様な障害を処置するために用いられる。プラスマフェレーシスの際に、血液は最初に針または既に埋め込まれたカテーテルを通して体から採取される。次に、細胞分離器によって血液から血漿を除去する。血球から血漿を分離するために、3つの技法が一般的に用いられる:
・ 不連続流遠心分離:1つの静脈カテーテルラインを必要とする。典型的には、一度に300 mlバッチの血液を採取して遠心分離して、血球から血漿を分離する。
・ 連続流遠心分離:2つの静脈ラインを用いる。この方法は、血漿を連続的に除去することができることから、体から1回に採取するために必要な血液量がわずかにより少ない。
・ 血漿濾過:2つの静脈ラインを用いる。血漿を標準的な血液透析装置を用いて濾過する。この連続プロセスでは、一度に体外に出す必要がある血液は100 ml未満である。
各々の方法はその利点および短所を有する。血漿の分離後、処置を受けている人に血球が戻されるが、抗体を含む血漿は、まず処置された後、従来のプラスマフェレーシスにおいて患者に戻される。(血漿交換において、除去された血漿は廃棄されて、患者は代用ドナー血漿、アルブミン、またはアルブミンと生理食塩水の混合物(通常、70%アルブミンおよび30%生理食塩水)を投与される)。まれに、輸血を嫌がる人では、ヒドロキシエチルデンプンなどの他の代用液が用いられうるが、これらは重度の副作用によりめったに用いられない。血液が凝固しないように維持するための薬剤(抗凝固剤)が、技法のあいだ、患者に与えられる。
抗体を少なくとも1つの物質に連結させて、抗体コンジュゲートを形成してもよい。診断用物質または治療用物質としての抗体分子の効能を増加させるために、少なくとも1つの望ましい分子または部分との連結または共有結合または複合体形成が一般的に行われている。そのような分子または部分は、少なくとも1つのエフェクターまたはレポーター分子でありうるが、これらに限定されるわけではない。エフェクター分子は、所望の活性、例えば免疫抑制/抗炎症活性を有する分子を含む。そのような分子の非制限的な例は先に記述したとおりである。そのような分子は任意で、標的部位またはその近傍で分子を放出させるように設計された切断可能なリンカーを介して付加される。
なおさらなる態様において、AQP4およびその関連する抗原に結合する、それらを精製、除去、定量、およびそうでなければ全般的に検出する免疫検出法が存在する。いくつかの免疫検出法には、例を挙げれば酵素免疫測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、免疫放射測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイ、およびウェスタンブロットが挙げられる。特に、AQP4抗体を検出および定量するための競合アッセイも同様に提供される。様々な有用な免疫検出法の段階が、例えばDoolittle and Ben-Zeev (1999), Gulbis and Galand (1993), De Jager et al. (1993), and Nakamura et al. (1987)などの科学論文に記述されている。一般的に、免疫結合法は、試料を得る段階、および場合によっては免疫複合体を形成させるために有効な条件で、本明細書において考察される態様に従って試料に第一の抗体を接触させる段階を含む。
イムノアッセイは、その最も単純で直接的な意味において結合アッセイである。ある好ましいイムノアッセイは、当技術分野において公知の様々なタイプの酵素免疫測定法(ELISA)およびラジオイムノアッセイ(RIA)である。組織切片を用いる免疫組織化学的検出も同様に、特に有用である。しかし、検出はそのような技術に限定されず、ウェスタンブロッティング、ドットブロッティング、およびFACS分析なども同様に用いられうることは容易に認識される。
ウェスタンブロット(または、タンパク質イムノブロット)は、所定の組織ホモジネートまたは抽出物試料中の特定のタンパク質を検出するために用いられる分析技術である。これは、ポリペプチドの長さによって(変性条件)、またはタンパク質の三次元構造によって(ネイティブ/非変性条件)、ネイティブまたは変性したタンパク質を分離するためにゲル電気泳動を用いる。タンパク質をメンブレン(典型的にニトロセルロースまたはPVDF)に転写して、標的タンパク質に対して特異的な抗体を用いてそれらを探索(検出)する。
抗体はまた、免疫組織化学(IHC)による試験のために調製した新鮮凍結組織ブロック、および/またはホルマリン固定してパラフィン包埋した組織ブロックの両方とともに用いられうる。これらの微粒子検体から組織ブロックを調製する方法は、様々な予後予測因子に関するこれまでのIHC研究に用いることに成功しており、当業者に周知である(Brown et al., 1990; Abbondanzo et al., 1990; Allred et al., 1990)。
なおさらなる態様において、上記の免疫検出法と共に用いるための免疫検出キットが存在する。このように、免疫検出キットは、適した容器手段の中に、AQP4抗原に結合する第一の抗体、および任意で免疫検出試薬を含む。
以下の実施例は、好ましい態様を証明するために含められる。以下の実施例において開示される技術は、本発明者らによって開発された技術が、態様の実践において良好に機能することを表しており、このように、その実践に関する好ましい様式を構成すると見なすことができることは当業者によって認識されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な態様に多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の精神および範囲に含まれる同様または類似の結果が得られることを認識すべきである。
DNA構築物、細胞培養物、およびトランスフェクション
完全長のヒトAQP4(M1およびM23アイソフォーム)をコードするDNA構築物を、鋳型として全脳cDNAを用いてPCR増幅によって生成した。いくつかの試験に関して、Mycエピトープ(NH2-EQKLISEEDL-COOH; SEQ ID NO:13)を、鋳型としてタグなしの構築物を用いるPCR増幅によって第二の細胞外ループに挿入した。M1およびM23の変異体を、タグ付けしたまたはタグ付けしていない鋳型のいずれかを用いるPCR増幅によって生成した。PCR断片は全て、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1にライゲートして、完全にシークエンシングした。
臨床疾患に関する改訂診断基準(Wingerchuk et al., 2006)を満たすNMO-IgG血清陽性者4人から、NMO血清を得た。対照(非NMO)ヒト血清は、UCSF細胞培養施設から購入した。組換えモノクローナルNMO抗体を、既に記述されたように(Bennett et al., 2009)、クローン増殖させた脳脊髄液形質芽球から生成した。重鎖および軽鎖構築物をHEK293細胞に同時トランスフェクトして、上清を採取して遠心分離していかなる細胞および破片も除去し、プロテインA-セファロース(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)と共に4℃で終夜インキュベートした。rAbを0.1 Mグリシン/1M NaCl(pH 3.0)中で溶出させて、0.1 M Tris-HCl pH 8.0によってpH 7.5に調節した。組換えIgGを、Ultracel YM-30微量濃縮器(Millipore, Billerica, MA)を用いて、プロテアーゼを含まない0.1%ウシ血清アルブミンを含むPBS中で交換して濃縮した。固定されたパパインによるIgG全体の消化によってFab断片を生成して、非消化IgGおよびFc断片をプロテインA(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL)によって除去することによって精製した。抗体の完全性を、変性およびネイティブゲル電気泳動によって確認して、ヒトIgG捕捉ELISAを用いてIgG濃度をアッセイした。
AQP4発現U87MG細胞を、生細胞ブロッキング緩衝液(6 mMグルコース、1 mMピルビン酸、1%ウシ血清アルブミン、2%ヤギ血清を含むPBS)中で20分間インキュベートした後、ブロッキング緩衝液中でNMO患者血清または組換えNMO-IgGと共に30分間インキュベートした。次に、細胞をPBSによって十分にすすぎ、4%パラホルムアルデヒド中で15分間固定して、0.1%Triton X-100によって透過処理した。細胞を、再度ブロックして、0.4μg/mLポリクローナルC末端特異的ウサギ抗AQP4抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)と共に30分間インキュベートした後、PBSによってすすいだ。最後に、細胞を、緩衝液中で4μg/mLヤギ抗ヒトIgGコンジュゲートAlexa Fluor 488およびヤギ抗ウサギIgGコンジュゲートAlexa Fluor 555(Invitrogen)と共に30分間インキュベートした。二次抗体と共にインキュベートした後、細胞をPBS中で十分にすすいで、カバーガラスにVectaMountハードセット培地(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を封入した。いくつかの実験において、U87MG細胞を上記のように、しかしNMO-IgG全体の代わりにモノクローナルマウス抗Myc-IgG(Covance, Emeryville, CA)または精製Fab断片によって標識した。抗Mycをヤギ抗マウスIgGコンジュゲートAlexa Fluor 488(Invitrogen)によって染色したが、Fab断片は、Dylight 488結合F(ab')2特異的二次抗体(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)によって染色した。AQP4抗体結合の定量的分析を、Nikon 10倍対物レンズ(開口数0.3)を備えたNikon Eclipse TE2000S倒立落射蛍光顕微鏡(Nikon, Melville, NY)において行った。緑色および赤色色素を励起して、それぞれ、Chromaフィルターセット#41001および#42001(Chroma, Rockingham, VT)を通して観察した。画像を、CCDカメラ(Hamamatsu Orca, Bridgewater, NJ)によって記録して、顕微鏡に合わせたソフトウェアを用いて強度を決定した。
TIRFMは、スルーオブジェクティブ(through-objective)TIRFアタッチメントおよび自動焦点維持モジュール(Nikon)を搭載した100倍TIRF油浸対物レンズ(開口数1.49)を備えたNikon Eclipse TE2000E顕微鏡を用いて行った。Alexa Fluor 555標識AQP4を、Z514/1O倍励起フィルターおよびZ514RDC光二色性ミラーを通してアルゴンイオンレーザーを用いて励起して、ET605/40m吸収フィルター(Chroma)を通して検出した。画像は、QuantEM 512SC 冷却CCDカメラ(Photometrics, Tucson, AZ)を用いて得た。
量子ドット(Qドット)によるAQP4の標識の前に、Mycタグ付きAQP4を発現する細胞を、6 mMグルコースおよび1 mMピルビン酸塩を含むPBS(GP緩衝液) 2 mLによって洗浄して、ブロッキング緩衝液中で5分間インキュベートした。次に、細胞を、ブロッキング緩衝液中で70 ng/mLマウス抗Myc抗体(Covance)と共に5分間インキュベートして、すすぎ、ブロッキング緩衝液中で0.1 nMヤギF(ab')2抗マウスIgGコンジュゲートQドット655(Invitrogen)と共に5分間インキュベートした。細胞を十分にすすいで、実験を通してGP緩衝液中で維持した。SPTは、Nikon 100倍TIRF油浸対物レンズ(開口数1.45)および冷却CCDカメラ(Hamamatsu EM-CCD, Bridgewater, NJ)を備えたNikon Eclipse TE2000S倒立落射蛍光顕微鏡において行った。Qドット蛍光は、E460SPUV励起フィルターおよび475DCXRU光二色性ミラーを用いて励起して、D655/40m吸収フィルター(Chroma)を通して検出した。データを、6秒間、1フレームあたり11 ms(91 Hz)で連続的に得た。連続画像を分析して、以下に詳細に記述されるように(Crane and Verkman, 2008)軌跡を構築した。拡散データは、1秒間での範囲の累積分布の形で報告され、P(範囲)は、粒子の範囲がt=1秒で所定の距離未満であるかまたは所定の距離に等しい確率として定義される。
細胞培養物を、0.5%ドデシル-β-D-マルトシド(EMD chemicals, Gibbstown, NJ)を含むネイティブPAGE試料緩衝液(Invitrogen)によって氷中で10分間溶解した。溶解物を20,000 gで4℃で30分間遠心分離して、沈降物を廃棄した。ブルーネイティブゲル電気泳動(BN-PAGE)に関して、ポリアクリルアミドネイティブ勾配ゲル(3〜9%)を、既に記述されたように(Wittig et al., 2006)調製した。タンパク質10μgを5%クーマシーブルーG-250(Invitrogen)と混合して、各レーンにロードした。フェリチンを分子量標準物質(440および880 kDa)として用いた。泳動用緩衝液は、25 mMイミダゾール、pH 7(正極緩衝液)および50 mMトリシン、7.5 mMイミダゾール、0.02%クーマシーブルーG-250、pH 7(陰極緩衝液)であった。トリシンSDS-PAGEを、既に記述されているように(Schagger and Tricine, 2006)、12%泳動ゲルおよび3%スタッキングゲルによって行った。試料は、ローディング前に加熱しなかった。SeeBlue Plus2 Pre-Stained Standard(Invitrogen)を分子量マーカーとして用いた。タンパク質をポリビニルジフルオリドメンブレン(Bio-Rad, Hercules, CA)上にブロットした。イムノブロット分析に関して、メンブレンを3%BSAによってブロックして、ウサギ抗AQP4一次抗体(Santa Cruz)と共に2時間インキュベートした。メンブレンをすすいで西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ウサギIgG(Jackson ImmunoResearch)と共に1時間インキュベートして、十分にすすぎ、標識されたタンパク質をECL Plus酵素化学発光キット(Amersham Biosciences, Pittsburgh, PA)を用いて検出した。
AQP4に対するNMO-IgG結合の定量的分析のためのアプローチ
図1は、AQP4に対するNMO-IgG結合の定量的分析のために用いられるアプローチを図示する。指定のAQP4アイソフォームをその形質膜に発現する細胞を、NMO-IgG(NMO患者血清または組換えモノクローナル抗体)と共にインキュベートして、固定し、透過処理した後、抗AQP4抗体と共にインキュベートした(図1A)。抗AQP4抗体は、全てのAQP4アイソフォームに対して共通であるAQP4のC末端を認識する(図1B)。蛍光二次抗体を用いて、緑色蛍光によってNMO-IgGをおよび赤色蛍光によってAQP4を検出した。AQP4に対するNMO-IgGの結合を、緑色対赤色(G/R)蛍光比によって定量した。結合親和性およびストイキオメトリは、NMO-IgG濃度を増加させて滴定することによって決定した。1つのNMO-IgG濃度で行った測定とは対照的に、完全な濃度依存的結合の測定は、AQP4に対するNMO-IgG結合の定量的な偏りのない説明を提供する。
M1およびM23 AQP4アイソフォームに対するヒトNMO血清中のNMO-IgGの結合を、蛍光比イメージング法によって測定した。1:100希釈で調べたNMO患者からの血清検体10個について行った初回測定は、0.14から0.67の広範囲のM1:M23の相対的結合を示した。図3Aは、NMO患者4人からの血清検体に関する代表的な蛍光顕微鏡写真を示す。各血清検体は、M23 AQP4に対する強いNMO-IgG結合を示したが、M1 AQP4に対しては多様な結合を示した。図3Bは、バックグラウンド補正済のR/G比を、血清濃度の関数として決定した濃度依存的NMO-IgG結合を示す。AQP4に対するNMO-IgG結合は飽和可能であり、M23:M1の相対的結合親和性は、0.11(血清1)、0.26(血清2)、0.03(血清3)、および0.21(血清4)であった。興味深いことに、結合データは、NMO血清の組成がポリクローナルであると推定されるにもかかわらず、1サイト飽和結合モデルに、ヒル係数がほぼ1で良好に適合した。総血清IgGにおけるNMO-IgGの比率は不明であることから、またはポリクローナルNMO-IgG組成であることから、血清を用いてAQP4に対するNMO-IgGの絶対的な結合親和性を決定することは不可能である。
1人のNMO患者からの血清中のNMO-IgGは、複数のモノクローナルNMO-IgGのプールからなるポリクローナルである。以下を決定するために、1人のNMO患者に由来する複数のモノクローナル組換えNMO-IgGを用いて、類似の結合分析を行った:(i)絶対結合親和性;(ii)M23:M1の差次が、1人のNMO患者において不均一であるか否か、および(iii)M23:M1の差次的結合が、NMO-IgG結合親和性および/またはストイキオメトリの差によるものであるか否か。図4Aは、1人のNMO患者からの2つの組換えモノクローナルNMO-IgG(rAb-53およびrAb-58)の蛍光顕微鏡写真を示す。本試験において用いられるモノクローナル抗体は、1人のNMO患者のCSF(図3における「血清1」に対応する)に由来した。各々の場合においてM23 AQP4に対する強いモノクローナル抗体結合が認められたが、M1 AQP4に対する結合は多様であった。図4Bは、1サイト結合モデルに曲線が適合する、3つの組換えNMO-IgGに関する濃度依存的結合曲線をまとめている。各々の場合において、データは、ヒル係数がほぼ1で1サイトモデルに良好に適合した。最も低い解離定数は44 nMであり、これはM23 AQP4に対するrAb-53の結合に関して見いだされた。1人のNMO患者からの複数のモノクローナルNMO-IgGに関して顕著な不均一性が見いだされ、M23:M1の相対的結合親和性は0.02(rAb-53)、0.46(rAb-58)、および0.02(rAb-186)であった。図4Bにおける結合曲線はまた、M23:M1の結合の差が、結合能よりむしろ結合親和性の差によるものであるという結論を支持している。
本発明者らは、M23対M1でのAQP4に対するNMO-IgG結合親和性の差が、M23 AQP4によるOAPの形成によるのかどうか、および/またはM23とM1とで異なるN末端によるのかどうかを調べた。以下を発現する細胞に対するNMO-IgG結合の測定を行った:(i)M23:M1の比が異なるAQP4;(ii)M23と同時発現させた場合にOAP崩壊能が減少しているM1変異体;および(iii)OAPの形成能が減少しているM23 AQP4変異体。これらの試験に関して、本発明者らは、一過性にトランスフェクトしたU87MG細胞を用いた。一過性にトランスフェクトした細胞が適性であることは、固定濃度のNMO-IgGを用い、安定的にトランスフェクトした細胞と一過性にトランスフェクトした細胞とで同等の結合が示されることによって、上記で確認した(図2D)。
本明細書において、本発明者らは、AQP4に対するNMO-IgGの結合を定量するために、およびNMO-IgG結合におけるAQP4アイソフォームおよびOAPの役割を決定するために、蛍光比イメージングを用いた。この生細胞システムは、モノクローナルNMO-IgGおよびポリクローナルNMO患者血清の特徴を調べるためには頑健な方法が必要であることから開発された。本発明者らは、U87MG細胞が、安定的または一過性トランスフェクション後に形質膜においてAQP4を効率よく発現し、細胞内にはAQP4をほとんどまたは全く発現しないことから、定量的結合測定に適していることを見いだした。U87MG細胞におけるAQP4の優れた膜発現は、おそらくそのグリア起源のためであり、それゆえネイティブヒトグリア細胞の機構と同じ輸送機構を発現することによる。この試験において用いられる安定的にトランスフェクトしたクローンのイムノブロット分析により、個々のAQP4アイソフォームが独占的に発現し、M1細胞株においてはM23が検出可能ではないことが示されている(図2C)。U87MG細胞は、迅速に増殖して、培養支持体に良好に接着するため、自動ハイスループットアッセイに適している。
組換えNMO-IgGおよびNMO患者血清
組換えモノクローナルNMO抗体(rAb)を、記述されるように(Bennett et al., 2009)、脳脊髄液(CSF)中のクローン増殖させた形質芽球から生成した。部位特異的変異誘発については、IgG1重鎖定常領域(IgG1Fc)のKpnI-XhoI断片をpSp73Xにクローニングした。GeneTailor部位特異的変異誘発システム(Invitrogen)を用いて、点突然変異をIgG1Fc配列に導入して、CDC(変異K322A)、ADCC(変異K326W/E333S)、または両方(変異L234A/L235A)を欠損している構築物を生成した(Baudino et al., 2008; Duncan and Winter, 1988; Hezareh et al., 2001; Idusogie et al., 2001)。変異IgG1Fc配列のAgeI-XhoI断片を、rAb-53の重鎖可変領域を含むpIgG1Flagにクローニングして、C末端Flagエピトープを有する変異体IgG1 Fc配列を含むアクアポルマブ構築物を生成した。
ヒトAQP4をコードするDNA構築物を、鋳型として全脳cDNAを用いるPCR増幅によって生成した。PCR断片を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1にライゲートして、完全にシークエンシングした。COS-7(ATCC CRL-1651)、U87MG(ATCC HTB-14)、およびCHO-K1(ATCC CCL-61)細胞培養物を、5%CO2/95%空気中で、10%ウシ胎児血清、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含む適切な培地中37℃で維持した。CD16を発現するNK-92細胞(CD16-176V-NK92、Fox Chase癌センターから得た)を、5%CO2/95%空気中で、10%ウシ胎児血清、10%ウマ血清、0.1 mM 2-メルカプトエタノール、2 mMグルタミン、0.2 mMミオイノシトール、2.5μM葉酸、非必須アミノ酸、110μg/mLピルビン酸ナトリウム、100 U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含む、デオキシリボヌクレオシドおよびリボヌクレオシドを有するa-MEM中37℃で培養した。
AQP4に対するrAbのリアルタイム結合を、Biacore T-100機器(GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ)を用いて、報告された技法(Patel et al., 2009)に基づいて25℃での表面プラズモン共鳴によって測定した。精製組換えヒトM1 AQP4(William Harries and Robert Stroud, UCSFによって提供された)を、95:5のL-a-ホスファチジルコリン:L-a-ホスファチジルセリン(Avanti Polar Lipids)比を含むプロテオリポソームに3%(重量/重量)AQP4で再構成した。簡単に説明すると、脂質(計37.5 mg、500 nmol)を40 mM b-オクチルグルコシド(PBS中)375μLに溶解した後、AQP4(300 ml、450 mg、15 nmol)を添加した。混合物を4℃でPBSに対して48時間透析した(10,000ダルトンカットオフ)。AQP4を含まないリポソームを調製するために、等量の40 mM b-オクチルグルコシド(AQP4の代わり)を脂質溶液に添加した。プロテオリポソームを、2μl/分での10分/注入を4回注入して、プロテオリポソーム固定の6000反応単位が得られるように、L1センサーチップ(Biacore)上に固定した。次に、表面を50 mM NaOHの100μl/分での20秒間の2回の注入によって洗浄し、0.01 mg/ml BSAを20μl/分で300秒間注入することによって表面の品質に関してチェックした。フローチャネル1(Fc 1)を参照としての0%AQP4で固定して、Fc 2はAQP4プロテオリポソームを含んだ。結合試験をPBSによって流速15μl/分で行った。PBS中のrAbを80秒間注入した後、注入後期間は240秒間であった。50 mM NaOHを100μl/分で20秒間注入することによって、再生を行った。結合試験を1試料あたり2回ずつ行った。データは、Biacore T100評価ソフトウェアを用いて分析した。
AQP4に対するrAb-53の結合の動態を、記述されるように(Crane et al., 2011)、定量的イメージングによってヒトAQP4-M23を安定的に発現するU87MG細胞において測定した。細胞を生細胞ブロッキング緩衝液(6 mMグルコース、1 mMピルビン酸塩、1%ウシ血清アルブミン、2%ヤギ血清を含むPBS)において20分間インキュベートした後、NMO-IgGと共に指定の時間インキュベートした。次に細胞をすすいで4%パラホルムアルデヒド中で15分間固定して、0.1%Triton X-100によって透過処理した。次に、細胞を再度ブロックして、0.4μg/mLポリクローナルC末端特異的ウサギ抗AQP4抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)と共に30分間インキュベートした後、PBSによってすすいだ。最後に、細胞を4μg/mLヤギ抗ヒトIgGコンジュゲートAlexa Fluor 488およびヤギ抗ウサギIgGコンジュゲートAlexa Fluor 555(Invitrogen)と共にブロッキング緩衝液中で30分間インキュベートした。NMO-IgG結合は、記述(39)のように比画像分析によって定量した。いくつかの試験において、rAb-53を、標準的なスクシンイミジルケミストリーを用いてCy3によって蛍光標識した。
CDCのアッセイに関しては、ヒトAQP4を発現するCHO細胞を、12.5μg/mlアクアポルマブ(または対照IgG)と共に30分間プレインキュベートした後、NMO-IgG(2.5μg/ml)または対照IgGおよび5%ヒト補体と共に37℃で90分間インキュベートした。カルセイン-AMおよびエチジウムホモ二量体(Invitrogen)を添加して生細胞を緑色におよび死細胞を赤色に染色した。1〜2%NMO患者血清(および対照の非NMO血清)および5%ヒト補体による補体媒介性細胞傷害を、同様に、50〜100μg/mlアクアポルマブの非存在下 対 存在下で測定した。ADCCアッセイに関しては、CD16を発現するNK-92細胞をエフェクター細胞として用いた。AQP4発現CHO細胞を15μg/mlアクアポルマブ(または対照IgG)と共に30分間プレインキュベートした後、NMO-IgG(5μg/ml)または対照IgGおよびエフェクター細胞(エフェクター:標的の比30:1)と共に37℃で3時間インキュベートした。細胞をPBSによってすすいだ後、カルセイン-AMおよびエチジウムホモダイマーを添加した。
成体マウス(30〜35 g)を2,2,2-トリブロモエタノール(125 mg/kg i.p.)によって麻酔して、定位フレームに固定した。記述されるように(Saadoun et al., 2010)、NMO患者血清(調べた5人の異なるNMO血清陽性患者)から単離された精製総IgG(14μL、6〜38 mg/mL)およびヒト補体(10μL)を、アクアポルマブ(10μg)の非存在下または存在下でマウスに脳内注射した。対照は、非NMOヒトIgG(調べた3人の異なる対照血清)、AQP4ヌルマウスの使用、およびアクアポルマブ単独の注射を含んだ。注射後24時間でマウスを屠殺して、脳をホルマリン中で固定して、パラフィンに処理して、前頭極から1.6 mmで冠状切片を作製した。切片をヘマトキシリン/エオジン、ルクソールファストブルー(ミエリンに関して)によって染色するか、またはAQP4(Millipore, Watford, UK)およびC5b-9(Abcam, Cambridge, UK)に対する抗体によって免疫染色した。顕微鏡写真を、記述のように(Saadoun et al., 2010; Crane et al., 2011)AQP4免疫反応性およびミエリンの喪失に関して定量した。
改変気液界面培養法を用いて、器官型脊髄切片培養物を調製した。生後7日目のマウス仔を断頭して、脊髄を迅速に摘出して氷冷Hank's緩衝塩類溶液(HBSS、pH 7.2)に入れた。厚さ300μmの頚髄の横断切片を、ビブラトーム(Leica VT-1000S; Leica)を用いて切断した。個々の切片を、培養培地1 mLを含む6ウェル(35 mm)プレートにおいて透明な非コーティングメンブレンインサート(Millipore, Millicell-CM 0.4μm孔、直径30 mm)上に載せて、切片を培養培地の薄膜で覆った。切片を、50%最小必須培地(MEM)、25%HBSS、25%ウマ血清、1%ペニシリン-ストレプトマイシン、グルコース(0.65%)およびHEPES(25 mM)(3日毎に交換)中5%CO2中37℃で10日間培養した。7日目に、精製IgG(NMO患者または対照血清から単離、300μg/mL)およびヒト補体(10%)を、アクアポルマブ(L234A/L235AまたはK322A、10μg/ml)の非存在下または存在下で培養培地に添加した。切片をさらに3日間培養して、AQP4、GFAP、およびMBP免疫蛍光のために固定した。切片を以下のように採点した:0、均一でインタクトなGFAPおよびAQP4染色を有するインタクトな切片;1、AQP4染色が減少し、GAFP染色によって認められるいくつかのアストロサイトの膨張を伴うインタクトな切片;2、GFAPおよびAQP4染色を喪失した、切片における少なくとも1つの病変;3、GFAPおよびAQP4染色を喪失した、切片面積の>30%に及ぶ多数の病変;4、切片面積の>80%に及ぶGFAPおよびAQP4染色の広範囲の喪失。AQP4ヌルマウスの切片は、GFAP免疫蛍光のみによって採点した。
NMOのアクアポルマブ治療の根本原理を図7Aに描写する。AQP4の細胞外エピトープに結合する病原性の自己抗体(NMO-IgG)は、AQP4四量体より実質的に大きく、1つより多くの抗体が同時に結合するのを阻止する。それゆえ、本発明者らは、結合親和性が高く、流出が遅い非病原性抗体が、病原性抗体の結合と競合して、したがって下流のアストロサイトの損傷および神経炎症を遮断すると推論した。
本明細書において提示されるデータは、NMO治療のためにアクアポルマブブロッキング抗体の有用性の証拠を提供する。操作された高親和性非病原性組換えモノクローナル抗体は、細胞培養におけるNMO患者の血清中でのポリクローナルNMO-IgGの細胞表面AQP4結合を遮断して、NMOのエクスビボ脊髄およびインビボマウスモデルにおいて下流の細胞傷害およびNMO病変を阻止する。モノクローナル抗体治療は広く多様な標的および疾患のために用いられているが、非病原性ブロッキングモノクローナル抗体という考え方は、自己免疫疾患の治療のために自己抗体-抗原の相互作用を標的とする考え方であることから、新規である。NMOは、病原性自己抗体の1つの標的であるAQP4が、抗体のサイズと比較して小さい細胞外フットプリントを有する形質膜タンパク質であり、病態が抗体エフェクター機能に依存することから、モノクローナル抗体遮断剤治療にとって理想的な独自の疾患である。
Claims (18)
- (i)視神経脊髄炎(NMO)スペクトラム疾患を有する対象を処置する方法に使用するための;(ii)対象におけるNMOスペクトラム疾患の増悪を予防するまたは低減させるために対象を長期間処置する方法に使用するための;または(iii)対象におけるNMOスペクトラム疾患の進行を予防または阻害する方法に使用するための、抗アクアポリン4(AQP4)抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、該試薬がインタクトな抗体のエフェクター機能を欠いており、該試薬が、エフェクター機能を欠いており且つIgG1配列を含む変異Fc領域を含み、該エフェクター機能が、補体依存性細胞傷害機能または抗体依存性細胞傷害機能であり、且つ該方法が該試薬の該対象への投与を含む、前記試薬。
- 前記投与が、眼内投与、動脈内投与、皮下投与、静脈内投与、またはくも膜下経路の投与を含む、請求項1記載の試薬。
- 前記変異Fc領域が、L234A/L235A置換、K322A置換、G237Aアミノ酸置換、またはL234A/L235A/G237A置換を有するIgG1配列を含む、請求項1または2記載の試薬。
- (i)化学的に改変されたFc領域を含むか;(ii)抗体Fab断片を含み、かつFc領域を欠いているか;(iii)非抗体タンパク質セグメントと融合された抗体Fab断片を含むか;または(iv)一本鎖抗体またはF(ab')2を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の試薬。
- 前記処置が、網膜神経節細胞死、視神経損傷、脊髄損傷、軸索離断、視神経脱髄、脊髄脱髄、アストロサイト死、またはオリゴデンドロサイト死のうちの1つまたは複数を低減させることを含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の試薬。
- 複数回投与される、請求項1〜5のいずれか一項記載の試薬。
- NMO発作の発生時またはNMO発作後に投与される、請求項1〜5のいずれか一項記載の試薬。
- NMO発作から約1時間、6時間、12時間、24時間、または2日以内に投与される、請求項7記載の試薬。
- 前記方法が、NMOの1つまたは複数の局面を処置する第二の物質の対象への投与をさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の試薬。
- 前記第二の物質が、前記試薬と同時または前記試薬の投与前もしくは投与後に投与される、請求項9記載の試薬。
- 前記抗体または抗原結合断片が、
(i)SEQ ID NO:6に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:6と80%の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:8に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:8と80%の同一性を有する配列;
(ii)SEQ ID NO:10に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:10と80%の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:12に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:12と80%の同一性を有する配列;
(iii)SEQ ID NO:19に記載の軽鎖可変配列またはSEQ ID NO:19と80%の同一性を有する配列、およびSEQ ID NO:17に記載の重鎖可変配列またはSEQ ID NO:17と80%の同一性を有する配列;
(iv)SEQ ID NO:6に記載の軽鎖可変配列およびSEQ ID NO:8に記載の重鎖可変配列を有する抗体の抗原結合部分;または
(v)SEQ ID NO:10に記載の軽鎖可変配列およびSEQ ID NO:12に記載の重鎖可変配列を有する抗体の抗原結合部分
を含む、請求項1〜10のいずれか一項記載の試薬。 - (i)軽鎖可変配列が、SEQ ID NO:5を含むか、またはSEQ ID NO:5と70%の同一性を有する配列を含み、かつ重鎖可変配列が、SEQ ID NO:7を含むか、またはSEQ ID NO:7と70%の同一性を有する配列を含むか;
(ii)軽鎖可変配列が、SEQ ID NO:9を含むか、またはSEQ ID NO:9と70%の同一性を有する配列を含み、かつ重鎖可変配列が、SEQ ID NO:11を含むか、またはSEQ ID NO:11と70%の同一性を有する配列を含むか;または
(iii)軽鎖可変配列が、SEQ ID NO:20を含むか、またはSEQ ID NO:20と70%の同一性を有する配列を含み、かつ重鎖可変配列が、SEQ ID NO:18を含むか、またはSEQ ID NO:18と70%の同一性を有する配列を含む、
請求項11記載の試薬。 - 前記方法が、NMO-IgG(AQP4)血清陽性に関する患者の評価をさらに含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の試薬。
- 前記対象が、NMO-IgG(AQP4)血清陽性、横断脊髄炎、視神経炎、または長引く悪心もしくは嘔吐などの他の関連性のない神経機能障害のうちの1つまたは複数を示す、請求項1〜13のいずれか一項記載の試薬。
- 前記対象がヒト対象である、請求項1〜14のいずれか一項記載の試薬。
- 抗AQP4抗体またはその抗原結合断片を含む試薬であって、該試薬がインタクトな抗体のエフェクター機能を欠いており、該試薬が、エフェクター機能を欠いており且つIgG1配列を含む変異Fc領域を含み、且つ該エフェクター機能が、補体依存性細胞傷害機能または抗体依存性細胞傷害機能である、前記試薬。
- 前記変異Fc領域が、L234A/L235A置換、K322A置換、G237A置換、またはL234A/L235A/G237A置換を有するIgG1配列を含む、請求項16記載の試薬。
- (i)化学的に改変されたFc領域を含むか;
(ii)抗体Fab断片を含み、かつFc領域を欠いているか;
(iii)非抗体タンパク質セグメントと融合された抗体Fab断片を含むか;または
(iv)一本鎖抗体またはF(ab')2を含む、
請求項16または17記載の試薬。
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