JP2024506409A - 抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、（ａ）生理学的試料中の４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合するか；又は（ｂ）生理学的試料中の３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。本発明はさらに、そのような抗体又は抗原結合フラグメントをコードする核酸及びベクター、ならびにそのような核酸及びベクターを含む宿主細胞を提供する。抗体及びフラグメントは、タウオパチーの治療及び診断に使用され得る。

Description

本発明は、特定のタウタンパク質に特異的な抗体、特に４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的なそのような抗体に関する。抗体は、例えば、検出、診断及び治療に使用され得る。

微小管関連タンパク質タウ（タウ）は１９７５年に発見された。これは最初、ニューロンの軸索内の微小管成長及び安定化に不可欠な微小管結合タンパク質として特徴付けられた。微小管への結合は、タウの微小管結合領域（ＭＴＢＲ）を介してチューブリンのＣ末端で達成される（エクソン９～１２を介してコードされる）。具体的には、タウが残基２２４～２３７、２４５～２５３、２７５～２８４及び３００～３１７によってαチューブリンとβチューブリンとの間の界面と相互作用することが、ペプチド競合ＮＭＲによって示されている。

タウ遺伝子（ＭＡＰＴ）は、染色体１７ｑ２１上に位置する１６個のエクソンを含む。単一のタウのプレｍＲＮＡからの選択的スプライシングにより、３４２～４４１アミノ酸長の範囲の中枢神経系内のタウの６つのスプライスバリアントアイソフォームが生じる。タウアイソフォームは、（ＭＴＢＲ内で）エクソン１０の包含又は排除に基づいて２つのカテゴリーに分類され、エクソン１０が存在する４つのＭＴＢＲ（４リピート（４Ｒ）タウ）及びエクソン１０が排除された３つのＭＴＢＲ（３リピート（３Ｒ）タウ）が生じる。これらのカテゴリーの各々の中には、エクソン２及び３のスプライシングに基づくタウの３つのＮ末端バリアントがある。これにより、０Ｎタウ（エクソン２又は３のいずれも含まない）、１Ｎタウ（エクソン２のみを含む）及び２Ｎタウ（エクソン２及び３の両方を含む）が生じる。タウ命名法は、タウの最大（２Ｎ４Ｒ）アイソフォームからのアミノ酸ナンバリングに基づいており、それ自体、４つの別個の機能ドメイン；Ｎ末端突出（アミノ酸１～１６５）；プロリンリッチドメイン（アミノ酸１６６～２４２）；ＭＴＢＲ（アミノ酸２４３～３６７）；Ｃ末端ドメイン（アミノ酸３６８～４４１）を有する。ＭＴＢＲドメインにおけるエクソン１０によってコードされる配列の有無は、３Ｒ又は４Ｒタウを意味するものである。

タウＭＴＢＲは、タウのアイソフォーム全体で配列が同一である３つ（３Ｒタウ）又は４つ（４Ｒタウ）のリピート領域からなるタンパク質のリピート領域である。各リピートは、異なるタウエクソン；リピート１（エクソン９）（アミノ酸２４２～２７３）；リピート２（エクソン１０）（アミノ酸２７４～３０４）；リピート３（エクソン１１）（アミノ酸３０５～３３５）；リピート４（エクソン１２）（３３６～３６７）である。４つすべてのリピート領域にわたる完全な同一配列相同性は３４％のみであるが、類似のクラス（極性、帯電、非帯電）のアミノ酸の間、又はリピート領域の少なくとも２つの間の相同性のレベルは９０％であり、リピート領域１及びリピート４が最も相違している。

タウは、ほとんど構造化されていないタンパク質であるが、ＦＲＥＴ実験は、Ｎ末端及びＣ末端が近接するように配向されていることを示唆している。ＮＭＲを使用したさらなる研究により、タウのＮ及びＣ末端がタンパク質の中央領域上に「ペーパークリップ」様構造に折り畳まれることが確認された。タウは、より複雑な一過性の局所的な二次構造、具体的には、ＭＴＢＲ中のβ鎖及びプロリンリッチドメイン中のポリプロリンヘリックスを形成する傾向を有することも実証されている。

タウは、主にニューロンにおいて発現され、乏突起膠細胞及び星状膠細胞において低レベルで発現されることが見出される。タウは、元々、軸索微小管に関連して同定され、程度は低いが、原形質膜、核及びミトコンドリアに関連して同定された。健康な成体ニューロンにおいて、軸索へのタウの分布は、チューブリンを架橋し、神経フィラメント及びアクチンなどの他の細胞骨格成分との相互接続を可能にする。これらの相互作用は、チューブリン集合を微小管内に安定化し、それらの動的に不安定な性質を調節して、軸索成長に必要な細胞骨格の再編成を可能にする。タウはまた、軸索に沿ってそれぞれ逆行方向及び順行方向にカーゴを輸送する、モーター輸送タンパク質ダイニン及びキネシンの微小管結合を直接調節することが示されている。この調節効果は、微小管へのアクセスのための前述のモータータンパク質との直接競合を介して起こると考えられる。タウ過剰発現系では、正味の逆行性輸送、及びカーゴ（ミトコンドリアなど）の軸索の下流への拡散ではなく細胞体における蓄積をもたらす、キネシンへのより大きな影響が観察される。しかしながら、この調節効果は完全には理解されておらず、軸索輸送に影響がないことがタウノックアウトマウスにおいて実証されているように、相補的な機構を有し得る。

タウタンパク質及びそのアイソフォームは、典型的にはタウ原線維の沈着を特徴とするいくつかの疾患に関与しており、これらの状態はタウオパチーとして集合的に知られている。タウオパチーの大部分は集団において散発性に発生するが、散発性対応物と同じ疾患表現型を示す、ＭＡＰＴ変異に関連するタウオパチーが多く存在する（Ｇｈｅｔｔｉ ら、２０１５、Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ａｐｐｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、４１（１）、２４～４６）。タウオパチーは、原発性タウオパチーと二次性タウオパチーにさらに分けることができる。原発性タウオパチーは、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）のサブグループであり、これは、脳の前頭葉及び側頭葉において支配的な細胞死を伴うニューロンのタウ封入体を特徴とする。これらの葉内では、タウ封入体が病変における主要な駆動因子であると考えられている。上手く特徴付けられた例は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）である。対照的に、二次性タウオパチーは、他の脳病変に関連してタウ病変が観察される疾患である。上手く特徴付けられた二次性タウオパチーの例はアルツハイマー病（ＡＤ）であり、この疾患病変は、１９０７年にアロイス・アルツハイマーによって定義されたように、ニューロンのタウ原線維及び細胞外のアミロイド斑の両方を特徴とする。ＡＤでは、タウ量と認知低下との間に依然として関連があり、この多因子疾患においてタウが依然として重要な役割を果たすことを示していることは注目に値する。

タウアイソフォームの比は、タウを非病原性状態に維持するのに重要な役割を果たすようである。したがって、タウオパチーは、それぞれ３Ｒ又は４Ｒタウの過剰を特徴とする、３Ｒタウオパチー又は４Ｒタウオパチーとして存在し得る。ピック病は主として、ピック球として知られる３Ｒ形成糸状３Ｒタウ封入体の過剰に関連するタウオパチーである。ピック病に関連する主な病変は、脳の前頭葉、側頭葉及び頭頂葉におけるニューロン及び神経膠の喪失である。タウアイソフォームの不均衡に関連するタウオパチーのはるかに一般的な形態は、４Ｒタウオパチーである。過剰な４Ｒタウ及び４Ｒタウ封入体が、１７番染色体に関連する前頭側頭型認知症及びパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）；進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）；及び皮質基底核変性症（ＣＢＤ）などの疾患で観察されている。

多数の病的状態におけるタウの重要性を考えると、タウを標的とする新しい診断及び治療アプローチへの継続的な需要が存在する。

本発明は、
（ａ）生理学的試料中の４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合するか；又は
（ｂ）生理学的試料中の３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合する、
抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

抗体又はその抗原結合フラグメントが４Ｒタウタンパク質に特異的に結合する場合、それは：
（ａ）４Ｒタウタンパク質がタウ４Ｒのアミノ酸位置２７９、２８０、２８１、２８５及び２８９のうちの１つ以上に翻訳後修飾を含む場合、４Ｒタウタンパク質のエクソン１０によってコードされるアミノ酸領域に結合し；
（ｂ）４Ｒタウタンパク質のアミノ酸２９４～３０２を含むか、又はそれらからなるペプチドに結合し；
（ｃ）タウのエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列からの単一エピトープに対応するペプチドに結合し；又は
（ｄ）（ａ）～（ｃ）の抗体又はフラグメントのいずれかをクロスブロックするか、もしくはそれらにクロスブロックされることができる。

抗体又はその抗原結合フラグメントは、生理学的４Ｒタウタンパク質アイソフォームを発現する細胞からの細胞溶解物、好ましくは４Ｒタウタンパク質アイソフォームを発現するｉＰＳＣ由来神経細胞からの細胞溶解物において、４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合し得る。抗体又は抗原結合フラグメントは、４Ｒタウタンパク質アイソフォームを発現する細胞上又は細胞内での免疫蛍光によって４Ｒタウタンパク質アイソフォームを検出し得る。

４Ｒタウタンパク質に対する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号３、５及び７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上、ならびに配列番号１１、１３及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上を含み、好ましくは配列番号３、５及び７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列ならびに配列番号１１、１３及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、
（ｂ）配列番号１及び９の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
（ｃ）好ましくは配列番号１７の配列、又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有し、依然としてタウタンパク質４Ｒアイソフォームに特異的に結合することができる配列を含む、細胞内発現抗体（イントラボディ：ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）であり；又は
（ｄ）（ａ）～（ｃ）の抗体又はフラグメントのいずれかをクロスブロックするか、又はそれらによってクロスブロックされることができる。

抗体又はその抗原結合フラグメントが３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合する場合、それは：
（ａ）タウのエクソン９及び１１を架橋する領域によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチド、例えば環状ペプチドに結合し、かつ／又は
（ｂ）タウのエクソン９及び１１によってコードされる配列の境界のいずれかの側の７個のアミノ酸からなるペプチド、例えば環状ペプチドに結合することができる。

３Ｒタウタンパク質に対する抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号２０、２２及び２４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上、ならびに配列番号２８、３０及び３２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上を含み、好ましくは配列番号２０、２２及び２４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列ならびに配列番号２８、３０及び３２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、
（ｂ）配列番号１８及び２６の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
（ｃ）好ましくは配列番号３４の配列、又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有し、タウタンパク質３Ｒアイソフォームに特異的に結合することができる配列を含む細胞内発現抗体（イントラボディ）であり；又は
（ｄ）（ａ）～（ｃ）の抗体又はフラグメントのいずれかをクロスブロックするか、又はそれらによってクロスブロックされることができる。

本発明はまた、４Ｒタウタンパク質を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸Ｋ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６、及びＩ２９７を含む４Ｒタウタンパク質のエピトープを結合し、エピトープは４Ｒタウタンパク質のＫ２９８及びＶ３００をさらに含んでもよい。

抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞内発現抗体（イントラボディ）又はデグラボディ（ｄｅｇｒａｂｏｄｙ）であり得る。

本発明はまた、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする１つ又は複数の核酸；前記核酸を含む１つ又は複数のベクター；及び前記１つもしくは複数の核酸又は前記１つもしくは複数のベクターを含む宿主細胞を提供する。

本発明はまた、本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、本発明の１つもしくは複数の核酸、又は本発明の１つもしくは複数のベクター及び医薬担体又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。

本発明はまた、（ａ）試験試料を本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させること；及び（ｂ）抗体又はその抗原結合フラグメントの結合を検出することを含む、４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームを検出する方法を提供する。本発明はまた、４Ｒ及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームのレベルを決定する方法を提供する。方法は、タウオパチー、好ましくはＰＳＰ、ＣＢＤ、又はピック病を診断するために使用され得る。

抗体又はその抗原結合フラグメントを使用して、タウオパチー、例えば４Ｒタウタンパク質アイソフォームと３Ｒタウタンパク質アイソフォームとの間の不均衡を含むタウオパチーを治療することができる。

タウタンパク質配列エクソン９～１２を示す。ＴＥ９／１１ペプチド配列を実線の枠内で概説する。エクソン９～１０、１０～１１及び１１～１２の境界における潜在的に交差反応性のエピトープが破線の枠で強調されている。ＴＥ９／１１間のアミノ酸差異をアスタリスクで強調している。 タウタンパク質配列エクソン９～１２を示す。ＴＥ１０ペプチド配列を実線の枠内で概説する。エクソン９、１１及び１２内の潜在的に交差反応性のエピトープが破線の枠で強調されている。ＴＥ１０間のアミノ酸差異をアスタリスクで強調している。Ｎ２７９、Ｋ２８０／２８１及びＳ２８５／２８９における文書化された翻訳後修飾が、実線で囲まれた領域のすぐ左側の点線の枠で強調表示される。 初代Ｂ細胞培養上清をスクリーニングする均質な蛍光ベースのアッセイ。緑色の点は、ヒットピッキングのために選択されたものを表し、赤色のものは選択されなかった。 バックグラウンドに対する倍率変化として示したＴＥ１０ ｖ ＴＥ９／１１のＥＬＩＳＡデータであり、３Ｒ特異的について選択されたウェルをグラフの左上に赤色でマークし、４Ｒ特異的については右下に緑色でマークした。 バックグラウンドに対する倍率変化として示した０Ｎ３Ｒ ｖ ０Ｎ４ＲのＥＬＩＳＡデータであり、３Ｒ特異的について選択されたウェルを左上に赤色でマークし、４Ｒ特異的については右下に緑色でマークした。 ニートなＴＡＰ ＩｇＧ発現産物結合のＥＬＩＳＡ、フォーカス群あたり１つの代表的なＴＡＰ発現。値は、バックグラウンド結合に対する倍率変化として表される。クローニングのために選択された３Ｒ及び４Ｒ特異的抗体は、それぞれ左上に赤色で、右下に緑色で強調される。黒点は、クローニングのために選択されなかった抗体を含むウェルを表す。 Ａ ウサギアイソフォーム特異的抗体のそれぞれのクローン化過渡状態の６３０ｎｍでのＥＬＩＳＡ光学密度（ＯＤ）を示す図である。これは、各クローンの１０μｇ／ｍｌでのシグナルを表す。４Ｒ選択的抗体は緑色で示され、３Ｒ選択的抗体は赤色で強調されている。クローン２は、繰り返し発現できなかったため、示されていない。クローン１４（ＶＲ７０８１）及びクローン３（ＶＲ７０８２）をそれぞれ赤色及び緑色で囲み、これらをさらなる研究のための好ましいアイソフォーム特異的抗体として選択した。Ｂ クローン化ウサギ抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３配列決定。緑色及び赤色の枠で強調されているのは、それぞれＥＬＳＡによって３Ｒ及び４Ｒ特異的であると選択された抗体のＣＤＲ３である。 ＥＬＩＳＡプレート上に直接コーティングしたすべてのタウアイソフォームに対するＶＲ７０８１（Ａ）及びＶＲ７０８２（Ｂ）の完全滴定。ＶＲ７０８１はタウ３アイソフォームに対して、ＶＲ７０８２はタウ４アイソフォームに対して選択的である。 フローサイトメトリーアッセイ、細胞内発現タウアイソフォームに対して滴定したＶＲ７０８１（Ａ）及びＶＲ７０８２（Ｂ）。 ＶＲ７０８１（Ａ）又はＶＲ７０８２（Ｂ）でプロービングした、単一アイソフォーム過剰発現細胞溶解物からのウェスタンブロット。 非タウ反応性ウサギ（Ａ）又はマウス（Ａ）ＩｇＧでブロットした、２Ｎ３Ｒ又は２Ｎ４Ｒタウ含有溶解物に対するウェスタンブロット。 マウスＩｇＧとしてフォーマットされたＶＲ７０８１（Ａ）又はＶＲ７０８２（Ｂ）でプロービングした、単一アイソフォーム過剰発現細胞溶解物からのウェスタンブロット。 ＶＲ７０８１（ＡＦ６４７）及びポリクローナル抗全タウ抗体（ＡＦ４８８）で共染色した、０Ｎ３Ｒ又は０Ｎ４Ｒタウを発現するＣＨＯＫ１細胞の免疫蛍光染色。 ＶＲ７０８２（ＡＦ６４７）及びポリクローナル抗全タウ抗体（ＡＦ４８８）で共染色した、０Ｎ３Ｒ又は０Ｎ４Ｒタウを発現するＣＨＯＫ１細胞の免疫蛍光染色。 ＶＲ７０８１によるｉＰＳＣ由来ニューロンの免疫蛍光染色。ＶＲ７０８１（３Ｒ－タウ）ＡＦ６４７で染色した非変異（対照）ｉＰＳＣ由来ニューロン及びモノアレリック（単一対立遺伝子の）１０＋１６ ＭＡＰＴ変異ニューロンの免疫蛍光染色。合成画像では、ＤＡＰＩは青色で示され、タウ染色は赤色で示されている。緑色の矢印は、ＶＲ７０８１による軸索染色の例を示す。 ＶＲ７０８２を用いたｉＰＳＣ由来ニューロンの免疫蛍光染色。ＶＲ７０８２（４Ｒ－タウ）ＡＦ６４７で染色した、非変異（対照）ｉＰＳＣ由来ニューロン及びモノアレリック１０＋１６ ＭＡＰＴ変異ニューロンの免疫蛍光染色。合成画像では、ＤＡＰＩは青色で示され、タウ染色は赤色で示されている。緑色の矢印は、ＶＲ７０８２による軸索染色の例を示す。 ＶＲ７０８１（Ａ）又はＶＲ７０８２（Ｂ）のいずれかでプロービングしたシンプルウェスタン免疫ブロット。 ＶＲ７０８１（Ａ）及びＶＲ７０８２（Ｂ）でプロービングしたヒト脳溶解物及び組換えタウラダーのウェスタンブロット。 ＶＲ７０８２結合プロファイル確認のｓｃＦｖマウスＦｃ変換。ウサギＩｇＧ（Ａ）及びｓｃＦｖ－Ｍｓ－Ｆｃ（Ｂ）フォーマット図。ＶＲ７０８２ウサギＩｇＧ ＥＬＩＳＡ（Ｃ）フローサイトメトリー（Ｅ）結合アッセイ及びウェスタンブロット（Ｇ）。ＶＲ７０８２ ｓｃＦｖ－Ｍｓ－Ｆｃ ＥＬＩＳＡ（Ｄ）、フローサイトメトリー（Ｆ）結合アッセイ及びウェスタンブロット（Ｈ）。 ＶＲ７０８２ ｓｃＦｖ－ＧＦＰ 細胞内発現抗体（イントラボディ）試験。Ａ ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ－ＧＦＰトランスフェクト細胞及びモック（ｍｏｃｋ）トランスフェクト細胞のフローサイトメトリー蛍光。Ｂ ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ－ＧＦＰによる４つの反復トランスフェクションからのウェスタンブロット。Ｃ ＴＥ１０又は対照ペプチドのいずれかでプルダウンした、４つの反復ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ－ＧＦＰトランスフェクト細胞からの溶解物プルダウンのウェスタンブロット。Ｄ ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ－ＧＦＰプルダウンからのウェスタンブロットバンドデンシメトリー。 潜在的ＶＲ７０８２ デグラボディ構築物による分解スクリーニング。Ａ． デグラボディ又は対照細胞内発現抗体（イントラボディ）融合物による０Ｎ４Ｒタウのコトランスフェクション後の全タウ及びＧＡＰＤＨの代表的なウェスタンブロット。Ｂ． ウェスタンブロットバンドデンシメトリーＮ＝３のウェスタンブロット。 ＶＲ７０８２－デグラボディを用いた分解のフローサイトメトリーアッセイ。Ａ ＧＦＰ対照、非分解細胞内発現抗体（イントラボディ）（Ａ－１）、デグラボディ（Ａ－２）、及びＭＧ１３２の存在下でのデグラボディ（Ａ－３）についてのタウ染色のレベルを実証する代表的なフローサイトメトリーゲーティング及びヒストグラムプロット。Ｂ ＭＧ１３２の存在下及び非存在下での０Ｎ４Ｒ及び０Ｎ３Ｒタウ染色を、すべてのデグラボディ構築物ついてＧＦＰ非分解細胞内発現抗体（イントラボディ）対照のパーセンテージとして表す。 ｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＶＲ７０８２－ＸＩＡＰ分解試験。Ａ ＧＦＰベースの選別のためのゲーティング戦略 Ａ－１ ＴｏＰｒｏ－３排除による生細胞の同定。Ａ－２ ＦＳＣ－Ａ ｖ ＳＳＣ－Ａによるデブリ／細胞小胞からの細胞の同定。Ａ－３ ＧＦＰ陽性及びＧＦＰ陰性選別ゲート。Ａ－４ ＶＲ７０８２－ＸＩＡＰ ＩＲＥＳ ＧＦＰ ＡＡＶ処置細胞（緑色）及び非処置細胞（赤色）を含む選別ゲーティングの重ね合わせプロット。Ｂ ポリクローナル抗タウ抗体で明らかにされたＧＦＰ陰性選別細胞Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅシンプルウェスタン。Ｃ ポリクローナル抗タウ抗体で明らかにされたＧＦＰ陽性選別細胞Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅシンプルウェスタン。 ｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＶＲ７０８２－ＸＩＡＰ デグラボディミトコンドリア膜極性化アッセイ。Ａ ｉＰＳＣ由来ニューロンのミトコンドリア極性化アッセイのための代表的なゲーティング戦略。Ａ－１ ＤＡＰＩ染色による有核細胞の同定。Ａ－２ ＦＳＣ－Ａ ｖ ＳＳＣ－Ａによる無傷細胞の同定。Ａ－３ βＩＩＩチューブリン染色によるニューロンの同定。Ａ－４ ミトコンドリア膜極性化評価。Ｂ ミトコンドリア極性化／総ミトコンドリア量の比から誘導された代表的なミトコンドリア膜極性化ヒストグラム。Ｂ－１ ＷＴ細胞ｉＰＳＣ由来ニューロン。Ｂ－２ １０＋１６モノアレリック１０＋１６ ＭＡＰＴ変異ｉＰＳＣ由来ニューロン（１０＋１６モノ）。Ｂ－３ Ａ１２バイアレリック（２対立遺伝子の）ＭＡＰＴ変異ｉＰＳＣ由来ニューロン（１０＋１６バイアレリック）。Ｃ 各３－ｉＰＳＣ由来ニューロン株及びＡＡＶ処置群全体のミトコンドリア極性化アッセイ。ＡＮＯＶＡを使用して群間の統計学的有意性を決定する。Ｄ 各３－ｉＰＳＣ由来ニューロン株及びＡＡＶ処置群全体にわたる正規化３Ｒタウ染色。ＡＮＯＶＡを使用して群間の統計学的有意性を決定する。 種々のタウアイソフォームの構造の比較。タウタンパク質の種々のアイソフォームに存在するエクソン配列を示す。 ＶＲ７０８２抗体エピトープ分析。グラフは、ＯＮ４Ｒタウへの結合と比較した、パーセンテージとして表される様々なタウ変異体へのＶＲ７０８２抗体の相対結合を示す。結果は、タウへのＶＲ７０８２の結合がＫ２９４；Ｄ２９５；Ｎ２９６；及びＩ２９７のそれぞれに依存することを実証している。これらの残基のいずれかが独立してアラニンに変異すると、０Ｎ４Ｒタウに結合している抗体が完全に切断される。結果はまた、結合がＫ２９８及びＶ３００に部分的に依存することを示す。それらの位置がアラニンに変異すると、結合が約５０％減少するからである。結果は、Ｈ２９９、Ｐ３０１及びＧ３０２がＶＲ７０８２のタウへの結合に関与しないことを示す。それらが独立してアラニンに変異している場合に、アラニン変異と０Ｎ４Ｒタウとの間で観察される結合レベルの間に差がないからである。最後に、結果は、ＶＲ７０８２がタウタンパク質のＰ３０１Ｓ及びＰ３０１Ｌ形態の両方に結合することができることを示している。

タウタンパク質
本発明によって提供される抗体及びその抗原結合フラグメントは、タウタンパク質を結合する。特に好ましい一実施形態では、本明細書で言及されるタウタンパク質は、ヒトタウタンパク質である。タウタンパク質の最大ヒトアイソフォーム、すなわち２Ｎ４Ｒアイソフォームに基づくアミノ酸ナンバリングの慣例が本明細書で採用される。２Ｎ４Ｒアイソフォームのアミノ酸配列は、配列番号３５として提供される。本明細書でさらに論じるように、提供される抗体及びフラグメントは、４Ｒタウタンパク質アイソフォーム又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームのいずれかに特異的である。

特定のタウタンパク質に特異的な抗体
本発明は、４Ｒタウタンパク質アイソフォーム又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームのいずれかに特異的な抗体及びその抗原結合フラグメントを提供する。以下にさらに論じるように、典型的には、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な抗体及びその抗原結合フラグメントは、タウ遺伝子（ＭＡＰＴ遺伝子）のエクソン１０によってコードされる領域の少なくとも一部を含む４Ｒタウタンパク質アイソフォームの領域に結合し、その領域は４Ｒタウタンパク質アイソフォームに固有である。逆に、典型的には、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、タウ遺伝子のエクソン９及び１１の接合部によってコードされる架橋配列を含むタンパク質の一部を認識する。

一実施形態では、本発明の特定の利点は、抗体又はその抗原結合フラグメントが、例えばタンパク質が変性形態ではない生理学的状態で４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームを結合することである。例えば、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば免疫蛍光によって決定されるように、無傷の細胞中の４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合し得る。一実施形態では、細胞のフローサイトメトリー分析においてタンパク質を検出することができる。別の実施形態では、例えば免疫蛍光によって、組織試料中のタンパク質を検出するために使用され得る。他には、免疫組織化学によってタンパク質を検出することが可能であり得る。好ましい実施形態では、ウェスタンブロットを介して、特にＰｅｇｇｙ Ｓｕｅのシンプルウェスタンによってタウタンパク質を検出することが可能であり得る。

一実施形態では、本明細書で使用される「特異的に結合する」とは、抗体又はその抗原結合フラグメントが、それが特異的である４Ｒ及び３Ｒタウアイソフォームのいずれに対しても少なくとも１０倍強く結合することを意味する。例えば、それは、３Ｒタウタンパク質アイソフォームよりも５０倍、１００倍、２００倍又は５００倍強く４Ｒタウに結合し得る。別の実施形態では、それは、４Ｒタウタンパク質アイソフォームよりも５０倍、１００倍、２００倍又は５００倍強く３Ｒタウに結合し得る。一実施形態では、結合は、それが特異的である４Ｒ及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームのいずれに対しても少なくとも１０００倍強い。一実施形態では、結合のＫ_Ｄ値は、それが特異的である３Ｒ又は４Ｒタウタンパク質のいずれについても、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、５００倍又は１０００倍低い。別の実施形態では、結合は、それが特異的であるタウタンパク質の形態について５，０００倍、１０，０００倍、又は５０，０００倍強くてもよい。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、他の形態のタウタンパク質に全く結合しないか、又は有意に結合しない。別の実施形態では、非タウタンパク質への結合レベルは、抗体が特異的でないタウの形態への結合レベルと少なくとも同程度に低い。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、非タウタンパク質を結合しないか、又は有意に結合しない。結合のレベルは、当技術分野で周知の技術、例えば表面プラズモン共鳴又は本明細書に開示される他の関連技術のいずれかによって測定され得る。一実施形態では、上記の特異性のレベルは、４Ｒタウタンパク質アイソフォームの、３Ｒタウタンパク質アイソフォームを上回る特異性に関する。別の実施形態では、上記の特異性のレベルは、３Ｒタウタンパク質アイソフォームの、４Ｒタウタンパク質アイソフォームを上回る特異性に関する。

図２５に示されるように、４Ｒタウタンパク質アイソフォームは、すべてがタウ遺伝子のエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列を有する群を表すのに対して、３Ｒタウタンパク質アイソフォームは、すべてがエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列を欠くという共通の特徴を有するアイソフォームの群を表す。これらの特徴は、タウタンパク質がどのように４Ｒ及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームにグループ分けされるかを示すが、それらの名称のそれぞれの中には、エクソン２及び３によってコードされるアミノ酸配列が存在するか否かに応じて異なるアイソフォームが存在する。したがって、例えば、４Ｒタウタンパク質アイソフォームは、エクソン２及び３によってコードされる配列を有する２Ｎ４Ｒ；エクソン２によってコードされるが、エクソン３によってコードされない配列を有する１Ｎ４Ｒ；及びエクソン２によってコードされる配列もエクソン３によってコードされる配列も有さない０Ｎ４Ｒである。２Ｎ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ及び０Ｎ４Ｒの３つはすべて、エクソン１０によってコードされる配列を含むので、４Ｒタウタンパク質と呼ばれる。したがって、本明細書において４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントに言及する場合、それは典型的には、抗体又はフラグメントが２Ｎ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ、及び０Ｎ４Ｒの３つすべてを結合するが、３Ｒタウタンパク質アイソフォーム２Ｎ３Ｒ、１Ｎ３Ｒ、及び０Ｎ３Ｒのいずれも結合しないことを意味する。抗体又は抗原結合フラグメントが３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合するものである実施形態では、逆も成り立つので、抗体は２Ｎ３Ｒ、１Ｎ３Ｒ及びＯＮ３Ｒを結合するが、２Ｎ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ及び０Ｎ４Ｒを結合しないであろう。

一実施形態では、特異的である４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームのいずれかに対する抗体又はその抗原結合フラグメントの親和性は、約１００ｎＭ以上、例えば約５０ｎＭ、２０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、２５０ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ以上である。一実施形態では、結合親和性は５０ｐＭ以上である。一実施形態では、４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質のいずれかに特異的な抗体の親和性は、１μＭ未満、７５０ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満、７５ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、１０ｐＭ未満、１ｐＭ未満、又は０．１ｐＭ未満であり得る。いくつかの実施形態において、Ｋｄは、約０．１ｐＭ～約１μＭである。

タウタンパク質は、ＭＴＢＲ領域に高レベルの配列同一性を有するリピートを含む。４Ｒの場合、４つのこのようなリピートが存在し、３Ｒの場合、３つのこのようなリピートが存在する。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、そのエピトープを含有するリピートのみに結合し、他のリピートには結合しない。例えば、一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、エクソン９と１１との間の接合部を含むリピートに結合するが、他のリピートには結合しないので、３Ｒタウに特異的である。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、タウ遺伝子のエクソン１０によってコードされる配列に存在するリピート内の配列に結合するが、他の３つのリピートの配列には結合しない。

タウ４Ｒ特異的抗体
特に好ましい一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、タウ４Ｒタンパク質アイソフォームに特異的である。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、タウ４Ｒタンパク質アイソフォームを特異的に結合し、３Ｒタウタンパク質アイソフォームにはそうしない。例えば、それは、所与の種又は被験者のタウ４Ｒタンパク質のすべてのアイソフォームに結合し得るが、その種又は被験者のタウ３Ｒタンパク質のいずれのアイソフォームにも結合し得ない。したがって、それは一実施形態では、タウ４Ｒタンパク質の２Ｎ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ及び０Ｎ４Ｒアイソフォームのすべてに結合し得るが、タウ３Ｒタンパク質の２Ｎ３Ｒ、１Ｎ３Ｒ及び０Ｎ３Ｒアイソフォームのいずれにも結合しない。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ヒト、ラット及びマウス由来のタウ４Ｒタンパク質アイソフォームに特異的に結合するが、それらの種由来の３Ｒタウタンパク質アイソフォームには結合しない。

４Ｒタウタンパク質アイソフォームと３Ｒタウタンパク質アイソフォームとの一般的な違いは、後者がタウ遺伝子のエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列を欠くことである。したがって、一実施形態では、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な抗体又はその抗原結合フラグメントは、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに固有の領域、したがってエクソン１０によってコードされる領域に結合する。好ましい一実施形態では、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な抗体又はその抗原結合フラグメントは、タウ遺伝子のエクソン１０によってコードされる配列内に全体的又は部分的にあるエピトープに結合する。好ましい一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、タウ遺伝子のエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列内の領域に結合し、特に３Ｒタウタンパク質アイソフォームに結合しない。

一実施形態では、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、タウ遺伝子のエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチドを結合することができる。一実施形態では、ペプチド配列は、完全に、タウ遺伝子のエクソン１０によってコードされる領域内にある。一実施形態では、ペプチドは、１５アミノ酸長未満である。一実施形態では、それは、１４、１３、１２、１１、又は１０アミノ酸長未満である。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、９アミノ酸長であるペプチド配列を結合する。好ましい一実施形態では、４Ｒタウタンパク質アイソフォームのアミノ酸２９４から３０２からなるペプチドを結合することができる。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ペプチドが線状形態である場合、そのようなペプチドに結合することができる。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、１つのみのエピトープが存在する長さの、タウ遺伝子のエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列に対応するペプチドに結合することができる。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、担体、例えばＫＬＨ、オボアルブミン、又はＢＳＡにコンジュゲートされた場合、特にペプチドが線状形態である場合、そのようなペプチドに結合することができる。

好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、タンパク質がアミノ酸位置２７９、２８０、２８１、２８５及び２８９のうちの１つ以上に何らかの翻訳後修飾を有するか否かにかかわらず、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的に結合することができる。一実施形態では、それは、タンパク質がアミノ酸位置２７９、２８０、２８１、２８５及び２８９のいずれか又は全部で修飾されているか否かにかかわらず、タウ４Ｒタンパク質アイソフォームに特異的に結合することができる。これらの位置への高頻度の翻訳後修飾には、グリコシル化、リン酸化及びアセチル化が含まれる。位置２７９で最も高頻度な翻訳後修飾はグリコシル化であり、位置２８１及び２８９で最も高頻度な翻訳後修飾はアセチル化であり、位置２８５及び２８９で最も高頻度な翻訳後修飾はリン酸化である。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、それらの位置にグリコシル化、アセチル化、又はリン酸化があるかどうかにかかわらず、タウ４Ｒタンパク質アイソフォームを結合することができる。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、タンパク質が位置２７９でグリコシル化されているか、位置２８１でアセチル化されているか、位置２８９でアセチル化されているか、位置２８５でリン酸化されているか、及び／又は位置２８９でリン酸化されているかどうかにかかわらず、タウ４Ｒタンパク質アイソフォームを結合することができる。換言すれば、抗体は、これらの位置でグリコシル化、アセチル化及び／又はリン酸化された場合と、これらの位置でグリコシル化、アセチル化及び／又はリン酸化されていない場合の両方で、タウ４Ｒタンパク質を結合する。

一実施形態では、４Ｒタウアイソフォームに特異的な抗体又は抗原結合フラグメントは、４Ｒタウタンパク質配列内のリピート２に結合するが、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに存在する他の３つのリピートには結合しない。各リピートは異なるタウエクソンに対応する；リピート１（エクソン９）（アミノ酸２４２～２７３）；リピート２（エクソン１０）（アミノ酸２７４～３０４）；リピート３（エクソン１１）（アミノ酸３０５～３３５）；リピート４（エクソン１２）（３３６～３６７）。したがって、一実施形態では、抗体は、４Ｒタウタンパク質アイソフォームのエクソン９、１１及び１２によってコードされる配列によってではなく、エクソン１０によってコードされる配列に結合し得る。

一実施形態では、４Ｒタウタンパク質に特異的な抗体又はその抗原結合フラグメントは：
（ａ）タウ４Ｒタンパク質がタウ４Ｒのアミノ酸位置２７９、２８０、２８１、２８５及び２８９のうちの１つ以上において翻訳後修飾を含む場合、タウのエクソン１０によってコードされるアミノ酸領域に結合し；
（ｂ）タウ４Ｒタンパク質のアミノ酸２９４～３０２を含むか、もしくはそれらからなるペプチドに結合し；かつ／又は
（ｃ）タウのエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列からの単一エピトープに対応するペプチドに結合し；又は
（ｄ）（ａ）～（ｃ）の抗体又はフラグメントのいずれかをクロスブロックするか、もしくはそれらにクロスブロックされる。

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号３、５及び７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上、ならびに配列番号１１、１３及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上を含み、好ましくは配列番号３、５及び７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列ならびに配列番号１１、１３及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含むか、又は
（ｂ）配列番号１及び９の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
（ｃ）好ましくは配列番号１７の配列、又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有し、依然としてタウタンパク質４Ｒアイソフォームに特異的に結合することができる配列を含む、細胞内発現抗体（イントラボディ）であり、又は
（ｄ）（ａ）～（ｃ）の抗体又はフラグメントのいずれかをクロスブロックするか、又はそれらによってクロスブロックされる。

一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号３、５及び７の配列に対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はＣＤＲを含み、その場合、各ＣＤＲは配列番号３、５及び７の配列と比較して２つ以下のアミノ酸配列変化を有し、抗体は依然として４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、配列変化は保存的アミノ酸配列変化である。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号１１、１３及び１５の配列に対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列、又はＣＤＲを含み、その場合、各ＣＤＲは配列番号１１、１３及び１５の配列と比較して２つ以下のアミノ酸配列変化を有し、抗体は依然として４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、そのような軽鎖及び重鎖ＣＤＲの両方を含み、好ましい実施形態では、配列番号３、５及び７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１１、１３、及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。一実施形態では、抗体の軽鎖は、配列番号２、４、６及び８のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３及びＦＷ４のフレームワーク領域の１つ以上を含み得る。一実施形態では、それは、配列番号２、４、６及び８のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３及びＦＷ４の４つすべてを含み得る。別の実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号１０、１２、１４及び１６のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３及びＦＷ４のフレームワーク領域の１つ以上を含み得る。一実施形態では、それは、それらのフレームワーク領域の４つすべてを含み得る。別の実施形態において、それは、そのような重鎖フレームワーク領域及び軽鎖フレームワーク領域の両方を含み得る。一実施形態では、上記の配列を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えばＣＤＲ配列以外の抗体の配列のすべてがヒト配列であるようにヒト化され、抗体又はその抗原結合フラグメントは依然として４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合する。別の実施形態では、可変領域とは別に、抗体の配列のすべてがヒトであり得る。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１の軽鎖可変領域又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、ここで抗体又は抗原結合フラグメントは、依然として４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１と比較して、少なくとも９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するか、又は１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸配列変化を有するが、依然として４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９の重鎖可変領域又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、ここで抗体又は抗原結合フラグメントは、依然として４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号９と比較して、少なくとも９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するか、又は１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸配列変化を有し、依然として４Ｒタウアイソフォームを特異的に結合する。一実施形態では、重鎖及び軽鎖配列と比較した配列変化は、可変領域のフレームワーク領域のみにある。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方を含む。一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、上記の軽鎖及び／又は重鎖可変領域配列のいずれかを含むが、それらは、ＣＤＲ配列以外の配列のすべてがヒトであるようにヒト化されている。

以下にさらに論じるように、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、様々な抗体及び抗体フラグメントフォーマットで提供され得、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的なものは、本明細書に記載の抗体フォーマットのいずれかで提供され得る。それらはまた、本明細書に記載される配列変異のレベルのいずれか、及び本明細書に記載される特性のいずれかを有し得る。

タウ３Ｒ特異的抗体
さらに好ましい実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的である。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的に結合し、４Ｒタウタンパク質アイソフォームではそうしない。例えば、それは、所与の種又は被験者の３Ｒタウタンパク質のすべてのアイソフォームに結合し得るが、その種又は被験者の４Ｒタウタンパク質のいずれのアイソフォームにも結合し得ない。したがって、それは一実施形態では、３Ｒタウタンパク質の２Ｎ３Ｒ、１Ｎ３Ｒ及び０Ｎ３Ｒアイソフォームのすべてに結合し得るが、４Ｒタウタンパク質の２Ｎ４Ｒ、１Ｎ４Ｒ及び０Ｎ４Ｒアイソフォームのいずれにも結合しない。

３Ｒタウタンパク質と４Ｒタウのそれらとの一般的な違いは、前者がタウ遺伝子のエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列を欠くことである。したがって、一実施形態では、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な抗体又はその抗原結合フラグメントは、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに固有の領域、特にタウ遺伝子のエクソン９と１１との間の接合部に対応するアミノ酸配列を含む領域に結合する。好ましい一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、エクソン９と１１との間の前記接合部を含むエピトープに結合する。

一実施形態では、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、エクソン９と１１との間の接合部によってコードされる配列を含むペプチドを結合することができる。一実施形態では、ペプチドは、１５アミノ酸長未満である。一実施形態では、それは１４アミノ酸長である。好ましい一実施形態では、それは、エクソン９と１１との間の接合部の各側からの７個のアミノ酸を含む、１４個のアミノ酸からなるペプチドを結合することができる。一実施形態では、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３５のアミノ酸２６８～２７４及び３０６～３１２を含むが、配列番号３５のアミノ酸２７５～３０５を含まないタンパク質を結合することができる。一実施形態では、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号３６のアミノ酸配列を含むペプチドを結合することができる。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ペプチドが環状形態である場合、特にＫＬＨ、オボアルブミン、又はＢＳＡなどの担体にコンジュゲートされている場合、そのようなペプチドに結合することができる。

一実施形態では、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な抗体又はその抗原結合フラグメントは、
（ａ）配列番号２０、２２及び２４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上、ならびに配列番号２８、３０及び３２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上を含み、好ましくは配列番号２０、２２及び２４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列ならびに配列番号２８、３０及び３２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み、かつ／又は
（ｂ）配列番号１８及び２６の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、
（ｃ）好ましくは配列番号３４の配列、又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有し、依然としてタウタンパク質３Ｒアイソフォームに特異的に結合することができる配列を含む、細胞内発現抗体（イントラボディ）であり、
（ｄ）（ａ）～（ｃ）の抗体又はフラグメントのいずれかをクロスブロックするか、又はそれらによってクロスブロックされる。

一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号２０、２２及び２４の配列に対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はＣＤＲを含み、その場合、各ＣＤＲは配列番号２０、２２及び２４の配列と比較して２つ以下のアミノ酸配列変化を有し、抗体は依然として３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、配列変化は保存的アミノ酸配列変化である。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、配列番号２８、３０及び３２の配列に対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、又はＣＤＲを含み、その場合、各ＣＤＲは配列番号２８、３０及び３２の配列と比較して２つ以下のアミノ酸配列変化を有し、抗体は依然として３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、そのような軽鎖及び重鎖ＣＤＲの両方を含み、好ましい実施形態では、配列番号２０、２２及び２４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２８、３０、及び３２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む。一実施形態では、抗体の軽鎖は、配列番号１９、２１、２３及び２５のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３及びＦＷ４のフレームワーク領域の１つ以上を含み得る。一実施形態では、それは、配列番号１９、２１、２３及び２５のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３及びＦＷ４の４つすべてを含み得る。別の実施形態では、抗体の重鎖は、配列番号２７、２９、３１及び３３のＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３及びＦＷ４のフレームワーク領域の１つ以上を含み得る。一実施形態では、それは、それらのフレームワーク領域の４つすべてを含み得る。別の実施形態において、それは、そのような重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の両方を含み得る。一実施形態では、上記の配列を含む抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えばＣＤＲ配列以外の抗体の配列のすべてがヒト配列であるようにヒト化され、抗体又はその抗原結合フラグメントは依然として３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１８の軽鎖可変領域又は配列番号１８と少なくとも９０％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、ここで抗体又は抗原結合フラグメントは、依然として３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１８と比較して、少なくとも９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するか、又は１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸配列変化を有するが、依然として３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号２６の重鎖可変領域又はそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含み、ここで抗体又は抗原結合フラグメントは、依然として３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号１８又は２６と比較して、少なくとも９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するか、又は１０、９、８、７、６、５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸配列変化を有し、依然として３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる。一実施形態では、重鎖及び軽鎖配列と比較した配列変化は、可変領域のフレームワーク領域のみにある。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、上記の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の両方を含む。一実施形態では、本発明の抗原結合フラグメントの抗体は、上記の軽鎖及び／又は重鎖可変領域配列のいずれかを含むが、それらは、ＣＤＲ配列以外の配列のすべてがヒトであるようにヒト化されている。

以下にさらに論じるように、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、様々な抗体及び抗体フラグメントフォーマットで提供され得、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的なものは、本明細書に記載の抗体フォーマットのいずれかで提供され得る。それらはまた、本明細書に記載される配列変異のレベルのいずれかを有し得る。

エピトープ
一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、本明細書に開示される抗体又は抗原結合フラグメントの１つと同じエピトープ又は少なくとも実質的に同じエピトープに結合する。タウの特異的領域又はエピトープは、本開示によって提供される抗体のいずれか１つと組み合わせて、当技術分野で公知の任意の適切なエピトープマッピング方法によって特定することができる。そのような方法の例としては、本開示のタウ結合抗体又はその結合フラグメントに結合するためのタウタンパク質由来の様々な長さのペプチドを、タウ結合抗体又はその結合フラグメントによって認識されるエピトープの配列を含有する抗体に特異的に結合することができる最小フラグメントを用いてスクリーニングすることが挙げられる。特に好ましい一実施形態では、抗体のエピトープの一部を形成する残基は、変異分析を使用して、例えば、タウタンパク質の残基をアラニンに交換し、抗体又はその抗原結合フラグメントのタウタンパク質、特に４Ｒタウタンパク質への結合に対する影響を決定することによって特定され得る。

一実施形態では、Ｋ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６、Ｉ２９７、Ｋ２９８、及びＶ３００の少なくとも１つは、抗体のエピトープに存在し得、ここで特に、それらのアミノ酸位置は、配列番号３５のものに関連して定義されている。

特に好ましい一実施形態では、アミノ酸残基Ｋ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６及びＩ２９７の少なくとも１つを含むエピトープに結合する抗体又は抗原結合フラグメントが提供される。好ましくは、アミノ酸残基Ｋ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６及びＩ２９７の少なくとも２つを含むエピトープに結合する抗体又は抗原結合抗体が提供される。したがってより好ましくは、抗体又は抗原結合フラグメントは、アミノ酸残基Ｋ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６及びＩ２９７の少なくとも３つを含むエピトープに結合する。さらにより好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、アミノ酸残基Ｋ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６及びＩ２９７の４つすべてを含むエピトープに結合する。

さらに好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、タウタンパク質のアミノ酸残基Ｋ２９８及びＶ３００をさらに含むようなエピトープに結合し得る。好ましい一態様において、抗体又はその抗原結合フラグメントは、タウタンパク質の残基Ｋ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６、Ｉ２９７、Ｋ２９８及びＶ３００のすべてを含むエピトープに結合する。

上記の実施形態のいずれにおいても、抗体又はその抗原結合フラグメントは、好ましくは４Ｒ特異的抗体であり得る。したがって、一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、４Ｒタウタンパク質のＫ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６、及びＩ２９７を含むエピトープに結合する４Ｒ特異的抗体である。別の好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、４Ｒタウタンパク質のＫ２９４、Ｄ２９６、Ｎ３９６、Ｉ２９７、Ｋ２９８及びＶ３００を含むエピトープに結合する４Ｒ特異的抗体である。

一実施形態では、アミノ酸Ｈ２９９、Ｐ３０１及びＧ３０２は、タウタンパク質に提供される抗体又はその抗原結合フラグメントの結合に関与しない。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、４Ｒタウタンパク質のＫ２９４、Ｄ２９６、Ｎ３９６、Ｉ２９７、Ｋ２９８及びＶ３００を含むエピトープに結合する４Ｒ特異的抗体であるが、Ｈ２９９、Ｐ３０１及びＧ３０２残基は、抗体又はその抗原結合フラグメントのタウタンパク質への結合に関与しない。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントの全体的なエピトープは、タウ４Ｒタンパク質の残基Ｋ２９４～Ｖ３００の領域内のアミノ酸を含む。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントのエピトープのアミノ酸は、その領域のみにある。別の実施形態では、エピトープを形成する残基は、少なくともその領域にある。

言及される抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれも、そのようなエピトープに結合することができる。一実施形態では、そのような抗体は、キメラ、ヒト化もしくは完全ヒトモノクローナル抗体であり得るか、又はキメラ、ヒト化もしくは完全ヒトモノクローナル抗体を得るために使用することができる。特に好ましい一実施形態では、エピトープに結合する抗体又はその抗原結合フラグメントは、デグラボディである。

抗体フォーマット
本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、任意の適切なフォーマットで提供され得る。好ましい一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＧクラスの抗体又はそのフラグメントであり得る。一実施形態では、それはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４アイソタイプ抗体、特にＩｇＧ１であり得る。別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、又はＩｇＭクラスの抗体であってもよい。

本開示は、抗体及び抗体フラグメントに関する。抗体について言及する場合はいつでも、特に明記しない限り、抗体フラグメントを用いることができる。したがって、本発明の抗体は、完全長の重鎖及び軽鎖を有する完全抗体を含み得るか、又は抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、単一ドメイン抗体（例えばＶＨ又はＶＬ又はＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価、三価もしくは四価抗体、Ｂｉｓ－ｓｃＦｖ、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）又は上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントであり得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３（９）：１１２６－１１３６；Ａｄａｉｒ ａｎｄ Ｌａｗｓｏｎ，２００５，Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｏｎｌｉｎｅ ２（３），２０９－２１７を参照されたい）。抗体フラグメントを作製及び製造する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｒｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２１６，１６５－１８１を参照のこと）。本発明で使用するための他の抗体フラグメントには、国際特許出願、国際公開第ＷＯ２００５／００３１６９号、国際公開第２００５／００３１７０号及び国際公開第２００５／００３１７１号に記載されているＦａｂ及びＦａｂ’フラグメントが含まれる。多価抗体は、多特異性、例えば二重特異性を含み得るか、又は単一特異的であり得る（例えば、国際公開第９２／２２８５３号、国際公開第０５／１１３６０５号、国際公開第２００９／０４０５６２号及び国際公開第２０１０／０３５０１２号を参照されたい）。可能な抗体フォーマットの例は当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、総説「Ｔｈｅ ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ Ａｇｅ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｎｕｎｅｚ－Ｐｒａｄｏ ｅｔ ａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ Ｖｏｌ ２０ Ｎｕｍｂｅｒ ５ Ｍａｒ ２０１５、５８８－５９４ページ、Ｄ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｎｏｖ ２０１１：１０；７９８，Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１０，Ｍａｙ ２０１０，３０１に開示されている。

一実施形態では、抗体フォーマットは、当技術分野で公知のもの及び本明細書に記載のものを含み、例えば、抗体分子フォーマットは、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ＢＹｂｅ、ｓｃダイアボディ（ｓｃｄｉａｂｏｄｙ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、トリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ＴｒＹｂｅ、タンデムｓｃＦｖ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ－ｓｃＦｖ、Ｆａｂ－ｄｓｓｃＦｖ、Ｆａｂ－（ｄｓｓｃＦｖ）２、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、タンデムｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディ（ｓｃｄｉａｂｏｄｙ）－Ｆｃ、ｓｃダイアボディ（ｓｃｄｉａｂｏｄｙ）－ＣＨ_３、Ｉｇ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｉｇ、Ｖ－Ｉｇ、Ｉｇ－Ｖ、Ｄｕｏｂｏｄｙ及びＤＶＤＩｇを含むか、又はそれらからなる群から選択されるものの１つであるか、又はそれを含む。

特に好ましい一実施形態では、本発明の抗体はｓｃＦｖ－Ｍｓ－Ｆｃフォーマット抗体である。

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するのに十分小さい。

一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗原結合部位の少なくとも１つが４Ｒタウタンパク質アイソフォーム又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的である、二重特異性又は多特異性抗体である。したがって、１つの好ましい実施形態において、それはそのような二重特異性抗体である。

特に好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、細胞内で発現され得るものであり、特に細胞内発現抗体（イントラボディ）である。細胞内発現抗体（イントラボディ）は、細胞内での発現、正しい折り畳み及び抗原結合が可能な抗体又は抗体フラグメントである。細胞内発現抗体（イントラボディ）は、典型的には鎖間及び鎖内ジスルフィド結合の欠如による細胞質の還元性環境において、典型的に正しい折り畳みが可能である。細胞内発現抗体（イントラボディ）は、いくつかの例では抗体自体の投与よりも細胞を標的とするのが容易であり得るので、本発明の治療用抗体の代替フォーマットである。

一実施形態において、本発明の抗体は、標的化細胞内発現抗体（イントラボディ）である。例えば、一実施形態では、ＥＲ－細胞内発現抗体（イントラボディ）は、そのＣ末端にＫＤＥＬ又はＳＥＫＤＥＬ配列を使用するＥＲ管腔に標的化される（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｃｈｅｎ，ａｎｄ Ｓａｎｅ ２００３ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，８：３５５－６６；Ｌｅｗｉｓ ａｎｄ Ｐｅｌｈａｍ １９９２ Ｃｅｌｌ，６８：３５３－６４に記載される通りであり、これらは両方とも、その全体が参照により組み込まれる）。一実施形態では、本発明の細胞内発現抗体（イントラボディ）は、例えばリーダー配列の除去によって、細胞質を標的とする（このような特定のクラスの細胞内発現抗体（イントラボディ）は、細胞イントラボディ（イントラボディ）と呼ばれ得る）。本出願の例で使用される細胞内発現抗体（イントラボディ）は、細胞の細胞質で発現される。別の実施形態では、本発明の細胞内発現抗体（イントラボディ）は、適切な標的化シグナルの付加によってミトコンドリア又は核を標的化（例えば、その全体が参照により組み込まれるＢｉｏｃｃａ、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、ａｎｄ Ｃａｔｔａｎｅｏ １９９０ ＥＭＢＯ Ｊ、９：１０１－８に記載されているように）するものである。

ＩｇＧ由来細胞内発現抗体（イントラボディ）は、ｓｃＦｖフラグメントを作製するためのＧｌｙ_４Ｓｅｒペプチドリンカーを介して連結されたＩｇＧの可変領域ドメインを使用して作製され得る（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．１９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－６、参照により組み込まれる）。これらは、正しい折り畳みのためにジスルフィド結合形成をもはや必要としないので、次いで細胞内発現抗体（イントラボディ）として直接使用することができる。一実施形態において、本発明の細胞内発現抗体（イントラボディ）は、単一ドメイン抗体イントラボディ（イントラボディ）である。例えば、一実施形態において、本発明の細胞内発現抗体（イントラボディ）は、重鎖のみの抗体、例えば、ラクダ科重鎖のみの抗体（ＨＣａｂｓ）（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４４６－８、その全体は参照により組み込まれる）である。ＨＣａｂの単一の可変領域（ＶＨＨとして知られる）を細胞内発現抗体（イントラボディ）として使用することができる。

一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、非ジスルフィド安定化ｓｃＦｖであるので、細胞内発現抗体（イントラボディ）として使用され得る。ｓｃＦｖフォーマットでは、重鎖及び軽鎖可変領域は、柔軟なリンカーによって物理的に連結されていてもよい。これにより、重鎖と軽鎖とが細胞内で正確に対合し、重鎖と軽鎖との間にシステイン架橋を形成する必要なく結合部分を形成することが保証される。

好ましい一実施形態では、提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、分解ドメインを含むものであり得る。使用され得る可能な分解ドメインの例としては、オルニチンデカルボキシラーゼのＣ末端配列（ＯＤＣ）、ヒトＦｋＢＰ－１２タンパク質（ＦｋＢＰ）、Ｈｓｃ７０相互作用タンパク質のＣ末端（ＣＨＩＰ）、Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（ＸＩＡＰ）、フォン・ヒッペル－リンドウタンパク質（ＶＨＬ）、及びＳｉｍｂタンパク質のＮ末端（ＮＳＩｍｂ）が挙げられる。分解ドメインは、一実施形態では、分解をユビキチンプロテアソームに依存するものであり得る。別の実施形態では、それはそのように依存しない。一実施形態では、分解ドメインは、抗体の残りの部分へのＮ末端融合、例えばｓｃＦｖへのＣ末端融合として存在する。別の実施形態では、それはＮ末端融合、例えばｓｃＦｖへのＮ末端融合である。

一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、標的分解細胞内発現抗体（イントラボディ）又はデグラボディとしても知られる細胞内分解抗体である。デグラボディフォーマットでは、細胞内発現抗体（イントラボディ）が分解ドメインに連結されているので、デグラボディは事実上、特定の種類の細胞内発現抗体（イントラボディ）である。したがって、本発明の特に好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントはデグラボディである。

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントは、ウサギ抗体又はそのフラグメントである。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ウサギ可変領域を含むものであり、抗体の残りの配列はマウス配列である。別の実施形態では、抗体のＣＤＲはウサギＣＤＲであり、抗体の残りはマウスである。さらなる実施形態では、抗体は完全ヒト抗体である。さらなる実施形態では、ＣＤＲ配列以外の抗体の配列はすべてヒト配列である。

バリアント
一実施形態では、本明細書に記載の特異的配列ではなく、本発明によって提供される抗体又は抗体フラグメントは、その特異的配列と比較した特定のレベルの配列同一性の又はアミノ酸配列変化数を有し得るが、抗体又はフラグメントが依然として、特異的であることが意図される４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームのいずれかに特異的に結合することができる場合に限る。別の実施形態では、核酸配列は、本明細書に記載の特異的配列の１つに対する特定のレベルの配列同一性を有し得るが、特異的であることが意図される４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームのいずれかに、依然として特異的に結合することができる抗体又はそのフラグメント、又はそれらの成分を依然としてコードする場合に限る。

同一性及び相似性の程度は、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９１、ＮＣＢＩより入手可能なＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．３：２６６－２７２．Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１－１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．＆Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．１９９７，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６，）。

したがって、本開示は、本明細書に開示される新規なポリペプチド配列、及びそれと少なくとも８０％相似又は同一の、例えば相似性又は同一性が８５％以上、例えば９０％以上、特に９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の配列に及ぶ。本明細書で使用される「同一性」は、アラインメントされた配列の任意の特定の位置で、アミノ酸残基が配列間で同一であることを示す。一実施形態では、コードされた抗体又はフラグメントが依然として４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合することができる限り、配列は、それらのレベルの配列同一性のうちの１つを有し得る。

特定のアミノ酸配列は、依然として４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的に結合することができるという条件で、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列の１つと最大１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個のアミノ酸配列変化で異なってもよい。一実施形態では、それは、その配列変化の数で特定の配列と異なっていてもよく、配列変化は保存的なものである。

同一性パーセンテージ又は配列変化数によって定義されるバリアント配列だけでなく、本発明はさらに、本明細書に記載の特異的抗体又はフラグメントの１つをクロスブロックする能力によって定義される抗体又は抗原結合フラグメントを提供する。抗体はまた、列挙されたレベルの配列同一性又は配列変化数のうちの１つを有し得る。クロスブロッキング抗体は、当技術分野における任意の適切な方法を使用して、例えば競合ＥＬＩＳＡもしくはＢＩＡｃｏｒｅアッセイを使用することによって同定することができ、ここでクロスブロッキング抗体の抗原（目的の特定のタウタンパク質、例えば４Ｒもしくは３Ｒ、又は本明細書で論じられるペプチドからのペプチドの１つ）への結合は、本発明の抗体又は抗体フラグメントの結合を妨げるか、又はその逆である。一実施形態では、抗体は、本明細書に開示される特異的抗体又は抗原結合フラグメントの結合を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上減少させる。

ペプチド
本発明はまた、抗体及びそのような抗体の抗原結合フラグメントを生成するために使用され得るペプチドを提供する。一実施形態では、タウタンパク質のエクソン９及び１０を架橋する配列を含むペプチドが提供される。例えば、一実施形態では、ＴＥ９／１１ペプチドとしても知られる、配列番号３６の配列を含むか又はそれからなるペプチドが提供される。別の実施形態では、本発明は、抗体が４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に認識する可能性が高いことを示すような、タウのエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列に対応するペプチド配列を提供する。一実施形態では、ペプチドは、天然の４Ｒタウタンパク質アイソフォーム中の翻訳後修飾部位を表すアミノ酸を含まない。一実施形態では、ＴＥ１０ペプチドとも呼ばれる、配列番号３７のアミノ酸配列を含むか又はそれからなるペプチドが提供される。

一実施形態では、ペプチドは、タウタンパク質に由来しないさらなるアミノ酸残基を含み、例えば、ペプチドを担体にコンジュゲートするのを助ける末端システインを含み得る。一実施形態では、ペプチドは担体にコンジュゲートされる。例えば、一実施形態では、担体タンパク質はＫＬＨ、オボアルブミン又はＢＳＡである。一実施形態では、ペプチドは、線状ペプチドとして担体にコンジュゲートされ、特に、特異的抗体を生じる可能性が最も高いペプチドの部分は、担体からさらに離れている。別の実施形態では、ペプチドは、環状ペプチド、例えば、４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な抗体を生じさせる可能性が最も高いアミノ酸残基が担体からさらに離れるように、担体に接合したものである。

一実施形態では、上記のペプチドの１つ、特に担体にコンジュゲートしたもので動物を免疫することによって得ることができる抗体又はその抗原結合フラグメントが提供される。一実施形態では、抗体又は抗体フラグメントは、そのような方法によって得られるものである。一実施形態では、免疫化動物はウサギである。任意の適切な方法を使用して、そのような免疫化動物から所望の抗体を特定することができ、例えば、タウのペプチドもしくはタンパク質を使用するＥＬＩＳＡによるスクリーニング、又は本明細書で論じられる他の方法のいずれかを使用することができる。

一実施形態では、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ｄｅ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ（２００３）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２９：２８８－３０２で言及されている抗体ではない。一実施形態では、抗体又は抗原フラグメントは、ｄｅ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．に開示されているＲＤ３抗体ではない。別の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的であるが、Ｃｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ（２０１８）ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１９５２１１で言及されている抗体ではない。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的であるが、ｄｅ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ（２０１３）及びＣｒｏｆｔ ｅｔ ａｌ（２０１８）のいずれかで言及されている抗体ではない。

核酸、ベクター及び宿主細胞
さらなる態様では、ヌクレオチド配列、例えば本明細書に記載の本発明の抗体又は抗体フラグメントをコードするＤＮＡ配列が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド配列、例えば本明細書に記載の本発明の抗体又はフラグメントをコードするＤＮＡ配列が提供される。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、複数のポリヌクレオチド上に集合的に存在するが、ヌクレオチド配列は一緒になって本発明の抗体又は抗体フラグメントをコードすることができる。

本発明はまた、上で定義したヌクレオチド配列を含むベクターにも及ぶ。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの一例は、追加のＤＮＡセグメントがライゲーションされ得る環状二本鎖ＤＮＡループである、「プラスミド」である。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、そこで追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）を宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、その後、それらは宿主ゲノムと共に複製される。本明細書において、「プラスミド」及び「ベクター」という用語は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるので、互換的に使用され得る。ベクターを構築することができる一般的な方法、トランスフェクション方法及び培養方法は、当業者に周知である。この点に関しては、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、１９９９，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ）、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、及びＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇによって作製されたＭａｎｉａｔｉｓ Ｍａｎｕａｌを参照されたい。

本明細書におけるベクターという用語は、例えばベクターを含む粒子、例えばＬＮＰ（脂質ナノ粒子）粒子、特にＬＮＰ－ｍＲＮＡ粒子も含む。それはまた、本発明のベクターを移入するために使用されるウイルス粒子を含む。

本発明のベクターは、選択可能マーカーを含んでいてもよい。本明細書で使用される「選択可能マーカー」という用語は、タンパク質を指し、その発現によって、マーカー遺伝子を含むベクターで形質転換又はトランスフェクトされた細胞を同定することができる。広範囲の選択マーカーが当技術分野で公知である。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞上に付与する。選択可能マーカーはまた、例えば蛍光マーカーなどの視覚的に識別可能なマーカーであり得る。蛍光マーカーの例としては、ローダミン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒｓ及びそれらの様々なコンジュゲートが挙げられる。一実施形態において、選択可能マーカーは、マーカーの除去を可能にする配列、例えばｌｏｘＰ又はｆｒｔに隣接していてもよい。

本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする１つ以上のＤＮＡ配列を含む１つ以上のクローニングベクター又は発現ベクターを含む、宿主細胞も提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体又はフラグメントをコードするＤＮＡ配列の発現に使用することができる。細菌、例えば大腸菌、及び他の微生物系を使用してもよく、又は真核生物、例えば哺乳動物、宿主細胞発現系を使用してもよい。適切な哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、骨髄腫又はハイブリドーマ細胞が含まれる。本発明の核酸分子又はベクターを含む宿主細胞も提供される。

タウの検出及び診断
本発明の抗体及びその抗原結合フラグメントは、診断／検出キットに使用することができる。一実施形態では、本発明の抗体又は抗体フラグメントは、固体表面に固定される。固体表面は、例えば、チップ又はＥＬＩＳＡプレートであり得る。本発明の結合分子、特に抗体は、例えば、結合した抗体－抗原複合体の検出を容易にする蛍光マーカーにコンジュゲートされ得る。それらは免疫蛍光顕微鏡法に使用することができる。あるいは、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ウェスタンブロッティング又はＥＬＩＳＡにも使用され得る。

特に好ましい一実施形態では、３Ｒ又は４Ｒタウタンパク質アイソフォームに結合する能力が測定され、ここで、タウタンパク質は、例えば変性した形態ではなく、生理学的に存在するのと同じ形態で存在する。好ましい一実施形態では、それは細胞内に存在する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、タンパク質を、それが細胞上に存在する場合に結合するので、細胞上に存在する場合のタンパク質を検出するために使用され得る。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、タンパク質を、例えば分泌された原線維の形態で、それが細胞外空間に存在する場合に結合し得る。

任意の適切な方法を使用して、３Ｒタウと比較した４Ｒタウへの所与の抗体又はその抗原結合フラグメントの結合を決定することができる。一実施形態では、ＥＬＩＳＡを使用する：例えば、固定化タウ４Ｒタンパク質への結合を、固定化３Ｒタウタンパク質で見られるものと比較することができる。本明細書で論じられるペプチドへの結合はまた、ＥＬＩＳＡによって測定及び比較され得る。

別の実施形態では、ウェスタンブロッティングを使用して、４Ｒ及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームへの所与の抗体又はその抗原フラグメントの結合を検出することができる。そのようなウェスタンブロットは、任意の適切な材料、例えば４Ｒ又は３Ｒ又は両方のタウタンパク質アイソフォームを発現することが知られている細胞の細胞溶解物で実施され得る。一実施形態では、使用される細胞は、ｉＰＳｃ細胞、特に特定のタウタンパク質を発現することが知られているそのような細胞である。別の実施形態では、それらは、ｉＰＳＣから分化したニューロンである。一実施形態では、ウェスタンブロットは、組織試料、例えば被験者からの脳組織に実施される。好ましい一実施形態では、Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅのシンプルウェスタンが使用される。

別の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントの特定の形態のタウタンパク質を結合する能力は、免疫蛍光によって測定される。例えば、抗体又はその抗原結合フラグメントは、蛍光色素自体にコンジュゲートされてもよく、本発明はまた、そのようなコンジュゲートされた抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。あるいは、タウタンパク質への抗体又はその抗原結合フラグメントの結合は、例えば一次抗体の種に特異的な二次抗体を使用して同定及び測定され得る。一実施形態では、そのような免疫蛍光は、４Ｒ又は３Ｒタウタンパク質を発現する細胞、例えばＣＨＯ細胞、特に所望のタウを過剰発現するＣＨＯＫ１細胞に対して行われる。別の実施形態において、免疫組織化学は、ｉＰＳｃ細胞に対して行われる。別の実施形態では、結合は、例えば蛍光又は他の手段による免疫組織化学（ＩＨＣ）によって、組織試料で測定され得る。

特に好ましい一実施形態では、ｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）を使用して、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを評価する。別の好ましい実施形態では、ニューロン、例えばｉＰＳＣを分化させることによって得られるニューロンが使用される。好ましい一実施形態において、細胞は、特定の障害、例えば、本明細書中で言及される障害のいずれかを有する被験者から単離され、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを評価するために使用される。一実施形態では、タウオパチーを有する被験者から線維芽細胞を単離し、ｉＰＳＣ、次いでニューロンを作製するために使用する。一実施形態では、細胞を得るために使用される被験者は、タウ遺伝子（ＭＡＰＴ）遺伝子に変異、例えば本明細書で言及される変異の１つを有するものである。例えば、そのような被験者からの線維芽細胞を使用して、被験者と同じタウ遺伝子の変異を含むであろうｉＰＳＣを作製することができる。特に好ましい実施形態では、そのようなｉＰＳＣはニューロンへと分化する。一実施形態では、ニューロンは、使用される前に少なくとも５、６、７、８、又は９ヶ月間培養される。一実施形態では、タウ遺伝子にタウオパチーに関連する変異がない対照細胞株、例えばそのような変異がない健康な被験者から単離された細胞と比較することができる。１つの実施形態において、線維芽細胞は、健康な対照被験者から単離され、ｉＰＳＣを作製するために使用され、その後、ニューロンに分化される。

別の実施形態では、タウ遺伝子に特定の疾患変異を有する被験者からの細胞を使用するのではなく、タウオパチーに関連する変異を、選択された細胞株、例えばｉＰＳＣであるもの、又はｉＰＳＣを生成するために使用されるものへと操作する。一実施形態では、次いで、ｉＰＳＣを、変異を含むニューロンに分化させる。

一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、４Ｒタウタンパク質アイソフォーム又は３Ｒタウタンパク質アイソフォームを検出する。例えば、本発明は、（ａ）試験試料を本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させること；及び（ｂ）抗体の結合を検出することを含む、４Ｒタウタンパク質アイソフォームを検出又は測定する方法を提供する。本明細書で論じられる検出手段のいずれかを使用することができ、例えばＥＬＩＳＡ、免疫蛍光、フローサイトメトリー分析又は免疫組織化学を検出手段として使用することができる。一実施形態では、試験試料は、例えば被験者由来の細胞溶解物又は細胞又は組織を含む。一実施形態において、試験試料は、ニューロン又はそれらからの溶解物を含むものである。一実施形態では、試験試料は脳組織又は溶解物である。一実施形態では、そのような方法はまた、陽性対照、例えば４Ｒタウタンパク質を発現することが知られているもの、又はそれを正常レベルで発現するものを含み得る。そのような方法はまた、存在するタウタンパク質の総量と比較した４Ｒタウタンパク質の量の指標を得るために、被験者のすべてのタウタンパク質アイソフォームに結合する抗体を用いて別々に方法を実施することを含み得る。

別の実施形態では、４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントではなく、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的なものが、３Ｒタウタンパク質アイソフォームの検出又は測定のための方法を除く、４Ｒタウタンパク質アイソフォームについて上に記載した方法で使用される。

方法は、４Ｒタウタンパク質アイソフォームのレベル及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームのレベルの両方について試験試料を分析することを含み得る。例えば、方法は、同じ試験材料の２つの部分を試験すること、又は４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な抗体もしくはそのフラグメント及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な抗体もしくはそのフラグメントの両方で同時に染色することを含み得る。１つの例では、それぞれが異なるように、例えば異なる蛍光色素で標識して、４Ｒタウタンパク質及び３Ｒタウタンパク質の相対量を直接比較することを可能にする。

４Ｒタウタンパク質アイソフォーム及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームの相対量を検出するためのそのような方法は、２つの不均衡を検出するために使用され得、例えば、健康な被験者からの試料又はタウオパチーを発症する前の同じ被験者からの試料と比較することができる。一実施形態では、本発明の抗体又はそのフラグメントを使用して、タウオパチーを診断することができる。１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体又はそのフラグメントを使用して、４Ｒ及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームの不均衡を伴う状態を診断する。例えば、１７番染色体に関連する前頭側頭型認知症及びパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、及び皮質基底核変性症（ＣＢＤ）はすべて、４Ｒタウタンパク質アイソフォームの優勢を伴うと考えられているので、状態を診断する方法として本発明を使用して、そのような不均衡を検出することができる。逆に、ピック病は、４Ｒタウタンパク質よりも多くの３Ｒタウタンパク質が存在するものであると考えられる。したがって、やはり本発明を使用して、そのような不均衡の特定に基づいてその状態を診断することができる。

好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅのシンプルウェスタンにおいて、３Ｒタウタンパク質アイソフォームではなく４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的に結合することができるものである。他では、フローサイトメトリーによって測定すると、特にタウを過剰発現する細胞に対してそのような特異性を示すことができる。別の実施形態では、例えばウェスタンブロットによってヒト脳試料を分析するために使用される場合、そのような特異性を示す。特に好ましい実施形態では、抗体又はフラグメントを使用して、ニューロン、特に生理学的レベルで関連タウタンパク質を発現するｉＰＳＣから得られたものに対して免疫蛍光を行うと、そのような特異性を示す。

好ましい一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅのシンプルウェスタンブロットにおいて、４Ｒタウタンパク質アイソフォームではなく３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的に結合することができるものである。他では、フローサイトメトリーによって測定すると、特にタウを過剰発現する細胞に対してそのような特異性を示すことができる。別の実施形態では、例えばウェスタンブロットによってヒト脳試料を分析するために使用される場合、そのような特異性を示す。特に好ましい実施形態では、抗体又はフラグメントを使用して、ニューロン、特に生理学的レベルで関連タウタンパク質を発現するｉＰＳＣから得られたものに対して免疫蛍光を行うと、そのような特異性を示す。

病理学的状態
一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントを使用して、タウオパチーを治療又は診断することができる。一実施形態では、治療される状態は原発性タウオパチーである。一実施形態では、状態、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）を含み得る：例えば、それは、脳の前頭葉及び側頭葉において支配的な細胞死を伴うニューロンのタウ封入体によって特徴付けられ得る。別の実施形態では、状態は、二次性タウオパチー、したがって他の脳病変に関連してタウ病変が観察される状態であり得る。

本発明を使用して、一般にタウオパチー、例えばアルツハイマー病（ＡＤ）、及び進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、ピック病又は前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む他の状態の範囲を治療又は診断することができる。

本発明の１つの好ましい実施形態では、治療又は診断される症状は、二次性タウオパチーであるアルツハイマー病（ＡＤ）である。

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを使用して、タウオパチーを有する被験者の３Ｒ及び４Ｒタウタンパク質のバランスをシフトさせる。例えば、３Ｒタウタンパク質に特異的な抗体を使用して、バランスを４Ｒタウタンパク質の方へシフトさせることができる。あるいは、４Ｒタウタンパク質に特異的な抗体を使用して、バランスを３Ｒタウタンパク質の方へシフトさせることができる。

好ましい一実施形態では、本発明によって治療又は診断される状態は、ピック病（ＰＤ）であり得る。好ましい一実施形態では、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体又はその抗原フラグメントを使用して、ピック病を治療することができる。好ましい実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントを使用して、バランスを３Ｒタウタンパク質アイソフォームから離して変化させることができる。例えば、そのように本発明を適用することにより、ピック球の減少又は除去をもたらす。３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体を使用することにより、被験者、特にピック病を有する被験者の脳の前頭葉、側頭葉及び頭頂葉におけるニューロン及び神経膠の喪失を排除、低減又は安定化することができる。一実施形態では、３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的な本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントで被験者を治療することにより、被験者におけるタウタンパク質アイソフォームの３Ｒ：４Ｒ比を、ピック病を有さない個体に見られるレベルに向けて、又はそれまでにシフトさせることができる。

別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを使用して、健康な被験者よりも多くの４Ｒタウタンパク質が存在する状態、特にタウタンパク質の４Ｒ：３Ｒ比が４Ｒタウタンパク質の方へシフトしている状態を治療する。したがって、４Ｒタウタンパク質に特異的な本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを使用して、４Ｒタウオパチーを治療することができる。治療され得るそのような状態の例は、１７番染色体に関連する前頭側頭型認知症及びパーキンソニズム（ＦＴＤＰ－１７）；進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）；及び皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む。

一実施形態では、治療される被験者は、ＭＡＰＴ変異、すなわちタウ遺伝子の変異を有し得る。一実施形態では、被験者は、エクソン１０（ＭＴＢＲ Ｒ３）の過度の封入及び４Ｒタウの増加をもたらす、イントロン１０内又はその付近のスプライス変異を有し得る。好ましい一実施形態では、タウオパチーは１０＋１６変異を伴う。言い換えれば、一実施形態では、変異はＩＶＳ １０＋１６ Ｃ－Ｔ変異である。一実施形態では、被験者は、４Ｒタウタンパク質のｍＲＮＡの増加をもたらすＭＡＰＴ変異を有する。一実施形態では、４Ｒタウタンパク質に特異的な本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを使用して、このような状態を治療することができる。一実施形態では、治療される被験者は、ＦＴＤＰ－１７、特に早期発症型ＦＴＤＰ－１７を有する。

本発明を適用して、エクソン１０の封入に影響を及ぼし、したがって４ＲタウｍＲＮＡの増加をもたらし得る他の変異から生じるタウオパチーを治療、予防又は診断することができる。これらは、Ｓ３０５Ｎ及びＳ３０５Ｉなどのステムループ構造内に存在することができ、イントロン変異と同様の方法でステムループを不安定にしてエクソン１０の封入の増加を引き起こす（Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．１９９８，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ，４４３（２），９３－９６；Ｋｏｖａｃｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，ｐｒｏｔｅｉｎ－ｂａｓｅｄ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ：２５１－２７２；Ｓｔａｎｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｒａｉｎ，１２３（５），８５７－８５９）。

あるいは、エクソン１０の調節エレメント内の変異は、エクソン１０封入を増加させることが実証されている。変異Ｎ２７９Ｋ及びＬ２８４Ｌは、エクソン１０内のエンハンサー領域を強化し、封入の増加及び過剰な４Ｒタウ発現をもたらす（Ｄ’Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ，２００２，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７（２９），２６５８７－９９；Ｄ’Ｓｏｕｚａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９６（１０），５５９８－６０３；Ｈａｓｅｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，１９９９、上掲）。４Ｒタウ発現を増加させることが実証されているエクソン１０内の他の変異には、Ｎ２９６Ｎ及びＮ２９６Ｈが含まれ、これらはサイレンサー領域を破壊するか（Ｄ’Ｓｏｕｚａ及びＳｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇ、２００２、上掲）又は新しいエンハンサーを作り出すか（Ａｎｄｒｅｗ Ｇｒｏｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｌｅｔｔｅｒｓ，３２３（１）、３３－３６）のいずれかであると仮定されている。やや直感に反して、エクソン１２及び１３内の変異（それぞれＥ３４２Ｖ及びＮ４１０Ｈ）は、ニューロン内の４Ｒタウの発現を増加させることが報告されている（Ｌｉｐｐａ ｅｔ ａｌ．２０００，Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，４８（６），８５０－５８）。この場合も、本発明は、そのような変異を伴うタウオパチーを治療するために使用され得る。

ミトコンドリア障害も、タウオパチーの特徴であり得る。一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントによる治療は、タウオパチーにおいてミトコンドリア機能を回復させるのに役立ち得る。例えば、このようなタウオパチーでは、ミトコンドリア膜電位が影響を受ける可能性があり、抗体又はその抗原結合フラグメントによる治療は、ミトコンドリア膜電位を正常レベルまで、又は正常レベルに向かって回復させるのに役立ち得る。一実施形態では、治療される被験者は、ミトコンドリア機能障害を示す被験者である。一実施形態では、被験者は、ミトコンドリア膜電位の変化を示す被験者であり得る。一実施形態では、被験者は、低下した膜電位を示す。好ましい実施形態では、被験者は膜電位の上昇を示し、特にそのような膜電位の上昇を示し、１０＋１６のＭＡＰＴ変異を有する。一実施形態では、そのような被験者は、過剰な４Ｒタウタンパク質アイソフォームを示し得る。別の実施形態では、被験者は、Ｐ３０１Ｌ変異を有し、特に、過分極ミトコンドリア膜を示し得る。一実施形態では、本発明を使用することは、ミトコンドリア膜電位が正常に戻るか、又は少なくとも正常に近くなり得ることを意味し得る。

特に好ましい一実施形態では、血液脳関門を通過することができる抗体又はその抗原結合フラグメントを使用することができる。さらに好ましい実施形態では、抗体又は抗原結合フラグメント自体を投与するのではなく、本発明の１つもしくは複数の核酸又は１つもしくは複数のベクターを投与してもよく、１つの好ましい実施形態では、細胞内発現抗体（イントラボディ）又はデグラボディをコードするものを被験者に投与してもよい。別の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントを発現することができる、本発明の宿主細胞が使用される。

医薬組成物
一態様では、（ａ）本発明の抗体もしくはその抗原結合フラグメント、１つもしくは複数の核酸分子、又は１つもしくは複数のベクター；及び（ｂ）薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物が提供される。好ましい一実施形態では、医薬組成物は、抗体又は抗原結合フラグメントを含む。組成物は、固体又は液体の形態であってもよく、とりわけ、粉末、錠剤、溶液又はエアロゾルの形態であってもよい。

ヒト又は動物の身体の治療又は診断の方法に使用するための、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、１つもしくは複数の核酸分子、１つもしくは複数のベクター、又は医薬組成物も提供される。病理学的状態又は障害の治療用の医薬品の製造のための、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、１つもしくは複数の核酸分子、１つもしくは複数のベクター、又は医薬組成物の使用が、さらに提供される。本発明の治療薬が、第２の治療薬も投与されている被験者に投与される一実施形態では、２つを、例えば、同時に、連続的に、又は別々に投与してもよい。一実施形態では、２つは同じ医薬組成物で与えられる。別の実施形態では、２つは別個の医薬組成物で与えられる。

本発明の組成物は、通常、滅菌された医薬組成物として供給される。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるアジュバントをさらに含み得る。別の実施形態では、そのようなアジュバントは本発明の組成物中に存在しない。本発明はまた、本発明の結合分子、特に抗体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１つ以上と一緒に添加及び混合することを含む、医薬組成物又は診断組成物を調製するためのプロセスを提供する。

本明細書で使用される「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、本発明の組成物の所望の特徴を増強するための薬学的に許容される製剤担体、溶液又は添加剤を指す。賦形剤は当技術分野で周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液及び重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール及びグリセロールが挙げられる。溶液又は懸濁液は、リポソーム又は生分解性マイクロスフェアにカプセル化することができる。製剤は、一般に、滅菌製造プロセスを使用して実質的に滅菌された形態で提供される。これは、製剤に使用される緩衝溶媒溶液の濾過による製造及び滅菌、滅菌緩衝溶媒溶液中の抗体の無菌懸濁、及び当業者によく知られている方法による滅菌容器への製剤の分注を含み得る。

薬学的に許容される担体は、それ自体、組成物を投与される個体に有害な抗体の産生を誘導すべきではなく、毒性であってはならない。適切な担体は、ゆっくりと代謝される大きな高分子、例えばタンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー及び不活性ウイルス粒子であり得る。

薬学的に許容され得る塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩及び硫酸塩などの鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩及び安息香酸塩などの有機酸の塩を使用することができる。治療用組成物中の薬学的に許容され得る担体は、水、生理食塩水、グリセロール及びエタノールなどの液体をさらに含有し得る。そのような担体により、医薬組成物を、患者による摂取のための錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー及び懸濁液として製剤化することができる。

薬学的に許容される担体の完全な考察は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、ニュージャージー州、Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。

本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、標的疾患もしくは状態を治療、改善もしくは予防するため、又は検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。任意の結合分子、特に抗体について、治療有効量は、細胞培養アッセイ又は動物モデル、通常はげっ歯類、ウサギ、イヌ、ブタ又は霊長類のいずれかで最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定することもできる。次いで、そのような情報を使用して、ヒトにおける有用な投与量及び投与経路を決定することができる。ヒト被験者に対する正確な治療有効量は、疾患状態の重症度、被験者の全般的な健康状態、被験者の年齢、体重及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、ならびに治療に対する耐性／応答に依存する。この量は、慣例的な実験によって決定することができ、臨床医の判断の範囲内である。一般に、治療有効量は、日毎０．０１ｍｇ／ｋｇ～５０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇである。あるいは、用量は、１～５００ｍｇ／日、例えば１０～１００、２００、３００又は４００ｍｇ／日であり得る。医薬組成物は、所定量の本発明の活性薬剤を含有する単位用量形態で都合よく提供され得る。一実施形態では、所与の用量中の量は、特定の機能をもたらすのに少なくとも十分である。

限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮（例えば、国際公開第９８／２０７３４号パンフレットを参照されたい）、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内又は直腸経路を含む多数の投与経路のいずれかを使用して、本発明を被験者に投与することができる。ハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）を使用して、本発明の医薬組成物を投与することもできる。組成物の直接送達は、一般に、注射によって、皮下に、腹腔内に、静脈内もしくは筋肉内に達成されるか、又は組織の間質腔に送達される。組成物は、目的の特定の組織中に投与することもできる。一実施形態では、投与は脳へ行われる。投薬治療は、単回用量スケジュール又は複数回用量スケジュールであり得る。製品が注射又は注入用である場合、それは油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形態をとることができ、懸濁化剤、保存剤、安定化剤及び／又は分散剤などのフォーミュラトリ（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ）剤を含有することができる。あるいは、本発明の医薬組成物は、使用前に適切な無菌液体で再構成するための、乾燥形態であってもよい。組成物が消化管を使用する経路によって投与される場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、抗体又はその抗原結合フラグメントを、消化管から吸収されたら放出する薬剤を含有し得る。本発明による噴霧可能な製剤は、例えば、ホイルエンベロープに包装された単回投与単位（例えば、密封されたプラスチック容器又はバイアル）として提供され得る。各バイアルは、ある体積、例えば２ｍｌの溶媒／溶液緩衝液中の単位用量を含有する。

一実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント、核酸、ベクター、宿主細胞、又は医薬組成物は、脳に投与されるか、又は脳にアクセスすることができるように投与される。

本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメント、特に抗体を、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は担体の１つ以上と一緒に添加及び混合することを含む、医薬組成物又は診断組成物を調製するためのプロセスを提供する。本発明の抗体又は抗原結合分子は、医薬組成物又は診断組成物中の唯一の有効成分であってもよく、又は抗体成分又は非抗体成分、例えばステロイドもしくは他の薬物分子を含む他の活性成分を伴ってもよい。医薬組成物は、治療有効量の抗体又はその抗原結合フラグメントを適切に含む。本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、標的疾患もしくは状態を治療、改善もしくは予防するため、又は検出可能な治療効果もしくは予防効果を示すために必要な治療剤の量を指す。

医薬組成物は、用量毎に所定量の本発明の活性薬剤を含有する単位用量形態で都合よく提供され得る。本発明の医薬組成物は、被験者への投与手段を提供する容器に提供され得る。本発明の医薬組成物は、プレフィルドシリンジ中に提供され得る。本発明はしたがって、そのような充填シリンジを提供する。本発明の医薬組成物が充填された自動注射器も提供する。

本発明の結合分子、特に抗体は、遺伝子治療の使用によって投与され得ることも想定される。これを達成するために、結合分子が抗体である場合、適切なＤＮＡ成分の制御下で抗体分子の重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡ配列が患者に導入され、それにより抗体鎖がＤＮＡ配列から発現され、インサイチュで組み立てられる。別の特定の好ましい実施形態において、本発明のイントラボディをコードする配列は、被験者に投与され得る。

本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを、場合により投与のための説明書と共に含むキットにも及ぶ。さらに別の実施形態において、キットは、１つ以上の、例えば本明細書中で論じられるアッセイ又は方法を行うための１つ以上の試薬をさらに含む。

一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む本発明の分子は、実験試薬として使用するために提供される。

上記で使用される「精製された形態」は、少なくとも９０％の純度、例えば９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％ ｗ／ｗ以上の純度を指すことが意図される。

本明細書の文脈において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と解釈されるものとする。特定の要素を含む本発明の態様はまた、関連要素「からなる」、又はそれから「本質的になる」代替の実施形態にも及ぶことが意図される。

本明細書では、肯定的に列挙された実施形態を、免責事項の基礎として使用することができる。

本明細書で単数形が言及される場合、特に明記されない限り、又は明らかでない限り、複数形も包含される。特に、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」等は、別途文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書で言及されるすべての参考文献は、参照により具体的に組み込まれる。

本明細書の小見出しは、本明細書の構造化を支援するために使用され、本明細書の技術用語の意味を構成するために使用されることを意図しない。

本発明の配列を以下に提供する。

例１
ペプチド免疫原設計３Ｒタウ
タウＭＴＢＲのアミノ酸配列、エクソン９～１２を図１に示す。エクソン１０のこのスプライシングは、３Ｒタウにのみ見られる、エクソン９とエクソン１１との間の特有のエクソン境界を形成する。このエピトープは、４Ｒタウを上回る３Ｒタウへの特異性を付与する抗体を製造する手段として使用された。このエピトープに対する免疫応答を駆動するために、図１の実線の枠及び表１のＴＥ９／１１配列によって示されるような、タウのアミノ酸２６８～３１１を包括するようにペプチドを設計した（ペプチドはＴＥ９／１１と命名される）。

ＴＥ９／１１は、タウＭＴＢＲの全エクソン間のエクソン境界に存在するタウの他の領域と相同性を共有する。これらの潜在的交差反応性エピトープは、破線の枠で強調表示され（図１）、アスタリスクは配列の差異を強調している。より明確な比較のために、表１は、潜在的な交差反応性エピトープの厳密なペプチドアラインメントを示す。

これらの１番目は、エクソン１０と１１との間のエクソン境界であり（図１のタウ残基２９９～３１２）、２つのアミノ酸のみがＴＥ９／１１と異なる（ペプチド残基２及び７（表１））。２番目の相似性領域は、エクソン９と１０との間の境界に存在し（タウ残基２６８～２８１（図１））、３つのアミノ酸が異なる（ペプチド残基１１、１２及び１４（表１））。最後に、エクソン１１とエクソン１２との境界部位に配列相同性がある（タウ残基３３０～３４３（図１））。しかしながら、エピトープ空間の５０％に相当する８つの相違点（ペプチド残基２、７及び９～１４（表１））があるので、非特異的抗体結合を駆動する可能性は減少する。

例２
ペプチド免疫原設計４Ｒタウ
前述のように、３Ｒタウを上回る４Ｒタウの固有の特徴は、４Ｒタウにおけるエクソン１０の存在である。これは、３Ｒタウを超える４Ｒタウへの特異性を与える、抗体のためのエピトープを表す。エクソン９／１０とエクソン１０／１１との間のエクソン境界を標的とすることによって４Ｒ特異性の達成が可能であり得ることは、注目に値する。どちらの場合も、標的とするアミノ酸は１つだけであろう（それぞれＩ２７８又はＳ３０１）。エクソン１０、Ｎ２７９、Ｋ２８０／２８１及びＳ２８５／２８９内に既知の翻訳後修飾のいくつかの部位があることを考慮することも重要である（Ｅｒｃａｎｅｔ ａｌ．２０１７，Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ，１２（１），８７；Ｋｏｎｔａｘｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｆｒｏｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｓｃｉ，４，５６；Ｍａｉｒ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，８８（７），３７０４－１４）（図２においてエクソン１０内の破線枠に示す）。抗体が４Ｒタウに特異的であること、及びタウの翻訳後修飾状態にかかわらず結合することを確実にするために、ペプチドＴＥ１０は、タウアミノ酸２９４～３０２を包含するように設計された（図２２）。これがエクソン１０内及びエクソン１０の領域にあり、翻訳後修飾部位を回避するからである。図２は、タウＭＴＢＲの４つのエクソン内のＴＥ１０の位置を実線枠で示す。表２のＴＥ１０の線は、正確なペプチド配列を示す。

ＭＴＢＲの反復性質を考慮すると、ＴＥ１０は、ＭＴＢＲの３つの他のエクソンと配列相同性を共有する（図２の破線の枠で強調され、表２でアラインメントされている）。これらの１番目は、エクソン１２内にあり（タウ残基３５７～３６５（図２））、２つのアミノ酸がＴＥ１０ペプチドとは異なる（ペプチド残基１及び５（表２））。２番目の相似性領域は、エクソン９内に存在し（タウ残基２６３～２７１（図２））、４つのアミノ酸が異なる（ペプチド残基１、２、５及び７（表２））。最後に、エクソン１１内に配列相同性があり（タウ残基３２５～３３３（図２））、４つのアミノ酸で異なる（ペプチド残基１、２、４及び７（表２））。

例３
免疫化のためのペプチドコンジュゲーション
免疫応答を誘発するために、ペプチドをキャリアタンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にコンジュゲートさせた。すべてのペプチドをビオチンにコンジュゲートさせて、ビーズ又はプレートへのストレプトアビジン捕捉によるスクリーニングを可能にした（ＣＲＯ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓにより実施）。

免疫化を通して、ペプチド免疫原の免疫優性位置をキャリアタンパク質から最も遠くに配置するのは、これが免疫系に最もさらされるからである。したがって、ＴＥ９／１１を環状ペプチドとしてコンジュゲートして、予測される重要な残基２、７、１１及び１２（表２）を最も免疫優性度の高い位置に確実に存在させた。ＴＥ１０（４Ｒタウ特異的免疫応答を付与するように設計された）を、キャリアタンパク質にそのＣ末端を介して結合される線状ペプチドとして設計した。これは、ペプチドの１位及び５位のリジン残基、すなわちＴＥ１０に固有の２つだけのアミノ酸（表２）が、免疫優性の位置にあることを保証するためであった。両方のペプチドについて、チオール基を介してマレイミドリンカー及びキャリアタンパク質又はビオチン－ＰＥＧ－マレイミドに連結するために、単一のシステインをペプチドに添加した。ペプチドの環化を、Ｎ末端からＣ末端へのアミド結合形成によって達成して、環状ペプチドループを生成した。

例４
ウサギ由来の３Ｒ及び４Ｒ特異的抗体の同定
コンジュゲートされたペプチドを使用してウサギを免疫した。ウサギ６１７０及び６１７１由来のＢ細胞を、４００×９６ウェルプレート培養で抗体分泌Ｂ細胞に活性化した。培養上清を結合について一次スクリーニングした。この均一な蛍光アッセイは、ストレプトアビジンビーズ上に捕捉されたビオチン化ＴＥ９／１１及びＴＥ１０ペプチドの混合物に対するものであった。図３は、５０×３８４ウェルアッセイスクリーニングプレートからの一次スクリーニングデータを示す。緑色で強調されているのは、ビーズ関連蛍光が観察されたウェルであり、ＴＥ１０又はＴＥ９／１１のいずれかへの特異性を有する抗体を示している。事実上、緑色で強調表示されたコロニーは、グラフにおける１０００のビーズ関連蛍光をおおよそ上回る。これらのヒットは、ビーズ関連蛍光単位１０００の結合値閾値に基づいて選択した。この閾値は、結合プロファイルに高い信頼性を与え、１２×８０ウェルマスタープレートへの試料の固定を可能にする。

例５
ウサギＢ細胞培養二次スクリーニング
ＴＥ１０又はＴＥ９／１１のいずれかに対する反応性を示した上清の同定（図３）及び活性化Ｂ細胞の凍結保存に続いて、二次上清スクリーニングを実施して、アイソフォーム特異性を示す抗体を有するウェルを同定した。これは、各ペプチド抗原を使用するＥＬＩＳＡ（図４）、ならびに組換え０Ｎ３Ｒ及び０Ｎ４Ｒタウに対するＥＬＩＳＡ（図５）によって達成された。

重要なことに、残りの４つのタウアイソフォームはすべてＭＴＢＲ内で同一であり、タンパク質の残りの部分内には他の潜在的な交差反応性エピトープは存在しない。

得られたデータは、図４にペプチドＥＬＩＳＡの結果を示し、図５にタンパク質ＥＬＩＳＡの結果を示す。すべてのＥＬＩＳＡデータを、各データポイントについてバックグラウンドに対する変化倍率としてプロットする。単一ペプチドへの結合を示し、所望のタウ０Ｎアイソフォームへの少なくとも４倍高い結合を示したウェルからの上清を、Ｂ細胞単離及び可変領域遺伝子回収のために選択した。各ケースにおいて、３Ｒ特異的であると選択されたウェルは赤色で強調表示され、４Ｒ特異的ウェルは緑色で強調表示される。いくつかのウェルが、両方のペプチドに対して交差反応性を示すように見えること注目するのは興味深い。これらは、ペプチド上の共通のエピトープを認識している可能性が高い。２つのタウペプチド間の配列相同性の欠如は、交差反応性が、ペプチドをビオチン分子又はキャリアタンパク質又はウサギの発達中の免疫レパートリー内の多反応性抗体にコンジュゲートさせるリンカーに起因する可能性が高いことを示唆している。

例６
Ｂ細胞単離、ＲＴ－ＰＣＲ及び転写活性ＰＣＲ組換え一過性スクリーニング
蛍光法によるＢ細胞単離を、図４及び図５において赤色又は緑色で強調されている選択されたウェルのすべてに対して行った。逆転写及び３ラウンドのＰＣＲを行って、可変領域遺伝子を回収し、トランスフェクションに使用可能な線状発現カセットを作製した。表３は、Ｂ細胞単離からの回収レベル、各ウェルからのＰＣＲ及びそれらのＰＣＲの成功の数を、そのウェルの３Ｒ又は４Ｒタウのいずれかに対する特異性と共に示す。

一般に、得られた結果は、８３％のウェルから蛍光フォーカスが発生する、良好なＢ細胞単離効率を示した。可変領域の回収は、ｖＨ ＰＣＲの９７％及びｖＫ ＰＣＲの９９％から観察された。これは、９６％の全体的なＶ領域対の回収率を表した。

三次ＴＡＰ ＰＣＲによって生成された線状発現カセットを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に直接トランスフェクトした。発現後、抗体含有上清をＥＬＩＳＡによってＩｇＧ発現についてアッセイした。ＩｇＧの発現は、ＰＣＲでＶ領域対が回収されたすべてのケースにおいて観察された。９０ウェルから合計で７７の試料がＩｇＧを含んでいた。その後、すべてのウェルを、ＥＬＩＳＡによって０Ｎ３Ｒ又は０Ｎ４Ｒタウのいずれかへの結合についてアッセイした。フォーカス群あたり１つの代表的なＴＡＰ発現を含むＥＬＩＳＡデータを図６に示す。クローニング及びさらなる試験のために選択されたウェルは、図６において、４Ｒ及び３Ｒ特異的抗体についてそれぞれ緑色及び赤色で強調されている。

１つを除くすべてのピッキングされたフォーカスウェルが、ＴＡＰ発現後に３Ｒ又は４Ｒタウに対するそれらの結合特異性を保持したことを注記するのは興味深い。もはや３Ｒ又は４Ｒタウのいずれにも結合しないように見える黒色で強調された単一抗体については、これがタンパク質でのＢ細胞上清スクリーニングＥＬＩＳＡにおいて偽陽性であり（図５）、ＴＥ１０ペプチド上の非タウ代表的エピトープに結合した可能性が高い。これは、ペプチドを使用して実施された場合、どのようにして蛍光フォーカスを生成することができたかを説明し、その後は、ＴＡＰが一過性であるのでタウタンパク質への結合を示さない。

例７
ウサギＩｇＧのクローン化一過性スクリーニング及び配列決定
ＰＣＲによって生成された可変領域フラグメントを、完全長ウサギＩｇＧとしてクローン化した。すべてのクローン化抗体を配列決定し、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞における３０ｍｌの過渡的なものとして発現させ、得られた培養上清をアッセイして、それらが含有するＩｇＧの濃度を決定した。すべての上清を、０Ｎ３Ｒ及び０Ｎ４Ｒタウに対して１０ｕｇ／ｍｌのＩｇＧでＥＬＩＳＡによってアッセイして、それらがクローニング後にそれらの特異性プロファイルを保持していたかどうかを決定した。図７Ａは、すべてのクローン化抗体のＥＬＩＳＡデータを示し、図７Ｂは、これらの抗体のＣＤＲ３配列を示す。

図７から分かるように、相似又は同一の抗体配列を含む抗体の群は、それらのＥＬＩＳＡ値において非常に密接に集合していた。３Ｒ特異的抗体と４Ｒ特異的抗体との間に明確な分離があり、４Ｒ特異性は一般に、より高い交差反応性を示す。２つの抗体配列、クローン３（ＶＲ７０８２）（４Ｒ特異的）及びクローン１４（ＶＲ７０８１）（３Ｒ特異的）は、より大規模な発現／精製及びより詳細な特徴付けを正当化するのに適したレベルのアイソフォーム選択性（測定可能な望ましくない交差反応性なし）を有すると考えられた。２つの抗体の配列及びその後生成されたｓｃＦｖ イントラボディの配列を以下、他の関連配列も含む表に示す。

例８
３Ｒ及び４Ｒ特異的抗体の特徴付け
３Ｒ及び４Ｒタウ特異的抗体、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の同定後、すべてのさらなる研究についてのそれらの適合性を評価した。これは、組換え及び天然発現タウに対するアッセイのある範囲における特徴付けによって行われた。

（ａ）組換えタウの結合及び特徴付けアッセイ
前述のように、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２は、ＥＬＩＳＡによって１０μｇ／ｍｌで０Ｎ３Ｒ及び０Ｎ４Ｒタウに対する優れた特異性を示した（図７）。精製後にこの特異性が確実に保持されることが重要であり、したがって、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２を、ＥＬＩＳＡによってタウの組換え発現アイソフォームの６つすべてに対して試験した（図８Ａ及びＢ）。

ＥＬＩＳＡによるＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の３Ｒ及び４Ｒへの選択性プロファイルの確認後、図８、タウに対するこれらの抗体の特異性を細胞環境において確認することが重要であった。このフローサイトメトリーアッセイのデータを図９に示す。図９は、ＶＲ７０８１（Ａ）及びＶＲ７０８２（Ｂ）の両方が、フローサイトメトリーによって細胞環境においてタウに対する絶対特異性を示すことを実証する。ウェスタンブロットにおいてこの特異性が保持されたことを確認するために、タウのすべてのアイソフォームを過剰発現する細胞から溶解物が生成され、ポリクローナル抗全タウ抗体を使用して検証された。ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２を含むウェスタンブロットは、それぞれ図１０Ａ及び図１０Ｂに見ることができる。ペプチドＴＥ９／１１及びペプチドＴＥ１０は、３Ｒタウに固有のタウエクソン９／１１境界にわたる範囲内の、及び４Ｒタウに固有のエクソン１０内の線状エピトープを表す。したがって、これらのエピトープは、ウェスタンブロットのために行われた試料還元による影響を受ける可能性は低かった。図１０は、ＶＲ７０８１（図１０Ａ）及びＶＲ７０８２（図１０Ｂ）の両方が、それぞれ３Ｒ及び４Ｒタウに対するそれらの特異性プロファイルをウェスタンブロットによって保持することを示す。

両抗体はまた、およそ４９ｋＤａ（ＶＲ７０８１）又は６０ｋＤａ（ＶＲ７０８２）の非タウバンドとの反応性を示すように見えた。何がこの余分なバンドを駆動しているのかは不明であり、ウサギＩｇＧ、二次ＨＲＰコンジュゲート抗体の結果であるか、又は標的外可変領域結合によって駆動される可能性がある。

この問題に対処するために、２Ｎ３Ｒ及び２Ｎ４Ｒタウ含有溶解物ならびに組換えタウラダー及びモックライセートを用いてウェスタンブロットを行い、非タウ反応性ウサギ又はマウスＩｇＧでプロービングし、結果を図１１に示す。図１１Ａのウェスタンブロットは、非タウ反応性ウサギＩｇＧでの約６０ｋＤａ及び４２ｋＤａの非特異的バンドを有し、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２と同様の非特異的バンディングパターンを示す。しかしながら、図１１Ｂにおける非タウ反応性マウスＩｇＧでは、これらのバンドは観察されない。結果は、図１０で観察された任意の非タウバンドが、タウ特異的可変領域ではなくウサギＩｇＧ定常領域又はＨＲＰが示すものに起因することを明確に示している。

その後さらなる実験を行って、抗体がより一般的な有用性を有することを確認した。これが可能であることを確認するために、ウサギＩｇＧをウサギ可変領域を有するマウスＩｇＧに変換した。これは、非タウ反応性マウスＩｇＧがタウ過剰発現溶解物においてバンディングを示さなかったために行われた（図１１Ｂ）。次いで、得られたキメラ抗体を、それぞれのタウアイソフォームを過剰発現する細胞溶解物に対してウェスタンブロットによってアッセイした。これらのブロットの結果を図１２に見ることができる。図１２から、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の両方を有するマウスキメラ抗体への変換により、ブロットから非タウバンドが除去されたことが明らかである。このデータは、図１１Ａの非タウ抗体で見られるバンディングと共に、この非タウ反応性バンドが、ウェスタンブロッティングに使用したウサギＩｇＧ定常領域又は二次ＨＲＰコンジュゲート抗体の結果であったことを実証する。この非タウ反応性がフローサイトメトリーアッセイにおいて同じ細胞では観察されないので、これは、おそらく他の細胞タンパク質の線状エピトープの提示に起因する、ウェスタンブロットの人為結果であることに留意することが重要である。

マウスＩｇＧへの変換は、非常に首尾よくこれらの抗体の特異性に役立つことがウェスタンブロットによって証明されたが、前述のように、すべてのデータがこれらの抗体のウサギＩｇＧバージョンを用いて生成されたことが特に明記されない限り、この非タウ反応性バンドは、そのように行われた実験にとって問題ではない。

これらの抗体を評価することが重要であった別の重要な領域は、免疫蛍光にあった。これらの抗体を評価するために、０Ｎ３Ｒ及び０Ｎ４Ｒのタウを接着性ＣＨＯＫ１細胞において過剰発現させた後、固定し、透過処理し、いずれかのＶＲ７０８１／ＶＲ７０８２及びポリクローナル抗全タウ抗体で共染色した。得られた免疫蛍光データは、ＶＲ７０８１については図１３、ＶＲ７０８２については図１４に見ることができる。その抗体によるＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２染色の各ケースでは、抗体が特異的であるタウタンパク質を発現する細胞についてのみ見られた。図１３及び図１４に示されるデータは、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の両方が、それぞれ３Ｒ及び４Ｒタウに対する優れた特異性を保持することを免疫蛍光によって明確に実証する。ポリクローナル抗全タウ抗体染色は、これらの集団内でタウを発現するすべての細胞を可視化することができる。したがって、両方のケースにおいて、ＶＲ７０８１又はＶＲ７０８２のいずれかによる染色が、適切なタウアイソフォームについてのすべてのポリクローナル抗全タウ抗体染色と重なり合うことに注目することが重要である。

したがって、得られたデータは、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２がそれぞれ３Ｒ及び４Ｒタウに高度に特異的であることを明確に示している。実施したすべてのアッセイにおいて、両方の抗体は、所望でないタウアイソフォームに対して標的外結合を示さなかった。

（ｂ）天然タウの結合及び特徴付けアッセイ
次に、ｉＰＳＣ由来ニューロンの天然系において、又はヒト脳試料から発現されるタウへの結合を実証した。

ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の結合を、最初にｉＰＳＣ由来ニューロンにおける免疫蛍光によって評価した。タウ変異のない対照ニューロン（０Ｎ３Ｒタウのみを発現する）又はモノアレリック１０＋１６ ＭＡＰＴ変異ニューロン（０Ｎ３Ｒタウ及び０Ｎ４Ｒタウの両方を発現する）の両方を使用した。得られた画像は、ＶＲ７０８１については図１５、ＶＲ７０８２については図１６に見ることができる。

予想されるように、ＶＲ７０８１は、非変異対照細胞及び１０＋１６ ＭＡＰＴ変異ニューロンの両方において３Ｒタウに結合する（図１５）。ＶＲ７０８２は、１０＋１６変異ニューロン内の４Ｒタウへの結合を実証し（図１６）、予想通り非変異対照ニューロンへは、これらが４Ｒタウを発現しないので、結合しないことを示す。

０Ｎ３Ｒ又は０Ｎ４Ｒタウを過剰発現するＥｘｐＨＥＫ－２９３Ｆ細胞からの溶解物、ならびにタウ陰性細胞溶解物、及びすべてのタウアイソフォームを含む組換えタウラダーを一緒に用いたＰｅｇｇｙ Ｓｕｅのシンプルウェスタンを介した、対照、１０＋１６モノアレリック及びバイアレリックＭＡＰＴ突然変異ニューロンからの溶解物を使用する免疫ブロットでも特異性を確認した（図１７）。図１７Ａ及び図１７Ｂのブロットから、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の両方が、過剰発現溶解物における、それぞれ３Ｒ及び４Ｒの両方へのそれらの特異性を保持することが分かる。ＶＲ７０８１は、予想された通り、ｉＰＳＣ溶解物の３つすべてにおいて、０Ｎ３Ｒタウサイズのバンドに結合することが分かる。この年齢で前述したように、非変異ニューロンは４Ｒタウを発現しない。したがって、予想通り、ＶＲ７０８２は、１０＋１６変異ｉＰＳＣ由来ニューロンにおいてのみ、０Ｎ４Ｒタウサイズのバンドへの結合を実証している。

ＶＲ７０８１とＶＲ７０８２の両方で、図１０で観察された非タウバンドが、この方法ではもはや見えないことに注目するのは興味深い。このブロットは、標準的なウェスタンブロットとは異なる二次抗体を使用し、これが非タウバンディングを解決したようである。これは、ＶＲ７０８１／ＶＲ７０８２及び非タウウサギ抗体の両方で観察されたこの非タウバンド（図１０及び図１１）が二次ＨＲＰコンジュゲート化抗体の結果であったことをさらに示す。

タウは、有意な翻訳後修飾を受けることができる（Ｅｒｃａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１７、上掲；Ｋｏｎｔａｘｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７、上掲；Ｍａｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６、上掲）。したがって、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の両方が、タウの翻訳後修飾状態にかかわらず、それぞれ３Ｒ及び４Ｒタウを結合することができたことを確認することが重要であった。老化した脳の溶解物は、多くの翻訳後修飾及びタウ切断を有する一連のタウ種を含む。それは、したがって、ウェスタンブロットで試験し、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の両方がタウの多くの形態に結合することができることを確認するための良好な材料源を代表した（図１８）。

ＶＲ７０８１又はＶＲ７０８２のいずれのブロットでも複数のバンドが観察されるが（図１８）、しかしながら、重要なことに、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２のタウラダーについて３つの明確な異なるバンドが存在する。脳溶解物による複数のバンディングは、おそらくはタウの複数のリン酸化状態、タウの高分子量凝集体及び／又は切断型タウバリアントに起因する。このデータは、これらの溶解物を使用した他のデータと一致する。このデータは、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８３の両方が３Ｒ及び４Ｒタウのすべての翻訳後修飾状態に結合することができるという高い確信を与える。

「天然タウ結合及び特徴付けアッセイ」のセクションに示されるデータは、一連のアッセイにおいてＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の両方が、天然に発現されるタウに結合することができることを実証している。図１７では、標準的なウェスタンブロットで観察された非タウバンディングが二次ＨＲＰコンジュゲート抗体に起因することも実証されている。最後に、図１８は、ＶＲ７０８１及びＶＲ７０８２の両方が、ある範囲の翻訳後修飾状態のタウを結合することができることを実証している。

例９
４Ｒ分解タウデグラボディの生成
ＩｇＧ又はＦａｂフラグメントなどの誘導体が細胞内抗体として使用され得ないのは、それらのジスルフィド結合が細胞質の還元環境で正しく形成されないからである。これにより、重鎖と軽鎖が会合せず、したがって結合部分が形成されないことが確実となる。しかしながら、ＩｇＧは、細胞内発現抗体（イントラボディ）としての使用を可能にする、非ジスルフィド安定化ｓｃＦｖに再フォーマットされ得る。ｓｃＦｖフォーマットでは、重鎖及び軽鎖可変領域は、柔軟なリンカーによって物理的に連結されている。これにより、重鎖と軽鎖が細胞内で正確に対合し、結合部分を形成することが確実となる。そのように再フォーマットされたＶＲ７０８２がその結合特性を保持することを確保するために、ＩｇＧを最初にｓｃＦｖ－ｍｓＦｃへと再フォーマットした。これは、ｓｃＦｖがマウスＦｃに融合されて、抗マウス二次抗体による検出を可能にするスクリーニング構築物であり、ＩｇＧ及びｓｃＦｖ－Ｆｃの概略図をそれぞれ図１９Ａ及び図１９Ｂに見ることができる。ＶＲ７０８２ ｓｃＦｖ－Ｍｓ－Ｆｃを試験した。ＶＲ７０８２ ｓｃＦｖ－Ｍｓ－Ｆｃ変換の結果を図１９に見ることができる。変換をＥＬＩＳＡ（図１９Ｄ）、フローサイトメトリー（図１９Ｆ）及びウェスタンブロット（図１９Ｈ）によって試験した。比較目的のために、図１９Ｃ及び図１９Ｅに見られるデータは、それぞれＥＬＩＳＡ及びフローサイトメトリーデータである。図１９Ｇは、ＶＲ７０８２のｓｃＦｖフォーマットとの比較のためにＶＲ７０８２ ＩｇＧを利用するウェスタンブロットのデータである。

抗体フラグメント又は任意の他のタンパク質の細胞内細胞質発現を可能にするために、任意の特定のリーダー配列を欠く発現ベクターが設計される。タウは主に細胞の細胞質内に存在するので、細胞内発現抗体（イントラボディ）研究のためには、細胞内発現抗体（イントラボディ）も細胞質内で発現されることが重要であった。したがって、発現構築物は、リーダー又は局在化シグナルを含まずに設計された。ＶＲ７０８２のｓｃＦｖフォーマットへの変換の成功にもかかわらず（図１９）、ｓｃＦｖフラグメントの細胞質発現及び免疫化ペプチドへの特異的結合の可能性を確保することが重要であった。ｓｃＦｖ イントラボディとしてのＶＲ７０８２の試験を可能にするために、ＧＦＰをＶＲ７０８２－ｓｃＦｖに柔軟なリンカーで融合することによって、ＧＦＰとの融合構築物を設計した。ＧＦＰを選択したのは、将来の融合の代用として使用することができ、蛍光による生細胞における発現の検出、及び抗ＧＦＰ抗体を介した、ウェスタンブロットによる細胞内発現抗体（イントラボディ）の検出を可能にするからである。

その後の発現構築物をＨＥＫ－２９３Ｆ細胞にトランスフェクトした（ｎ＝４）。次いで、これらをフローサイトメトリーによってＧＦＰ蛍光について評価し（図２０Ａ）、細胞を溶解した。次いで、溶解物をウェスタンブロットによってアッセイして（図２０Ｂ）、イントラボディ ＧＦＰ融合物が無傷であり、正しい分子量であることを確認した。最後に、これらの溶解物をプルダウン実験で使用し、ここでは後続のウェスタンブロットの前に、ＴＥ１０、４Ｒタウ特異的ペプチドを使用して細胞内発現抗体（イントラボディ）をプルダウンし、これを、ペプチド対照の無関係な混合物を用いたプルダウンと比較した（図２０Ｃ及び図２０Ｄ）。

このデータから、イントラボディ－ＧＦＰ融合がＨＥＫ－２９３Ｆ細胞で発現され、ＧＦＰ蛍光によって示されるようにＧＦＰが正しく折り畳まれたことが分かる（図２０Ａ）。ＶＲ７０８２がＧＦＰに正しく融合されていることを実証するために、ＧＦＰ抗体によるトランスフェクトＨＥＫ－２９３Ｆ細胞のウェスタンブロットを行った。無傷の場合、ｓｃＦｖ－ＧＦＰ融合イントラボディ－は、約５３ｋＤａの分子量で観察されるはずである（ｓｃＦｖ ２６ｋＤａ＋リンカー１ｋＤａ＋ＧＦＰ ２６ｋＤａ）。細胞溶解物のウェスタンブロッティング（図２０Ｂ）は、この構築物が、５３ｋＤａに示される単一バンドを有する、無傷の融合タンパク質を発現していたことを示す。最後に、細胞内発現抗体（イントラボディ）をその免疫化ペプチドへの結合について評価した。ウェスタンブロット（図２０Ｃ）は、ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ－ＧＦＰ溶解物をＴＥ１０コーティングビーズでプルダウンした場合（レーン１～４）、ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ－ＧＦＰのサイズのバンドが観察されることを示す。しかしながら、ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ－ＧＦＰ溶解物を無関係なペプチドコーティングビーズでプルダウンした場合（レーン７～１０）、又はモックトランスフェクト溶解物をＴＥ１０コーティングビーズでプルダウンした場合（レーン５～６）、バンドは観察されない（図２０Ｃ）。このブロットからのバンドデンシトメトリー（図２０Ｄ）は、ｓｃＦｖ－ＧＦＰ イントラボディ構築物が依然としてＴＥ１０ペプチドに特異的に結合することができることを示した。

研究のこの段階は、ＶＲ７０８２、４Ｒタウ特異的ウサギＩｇＧの、両方とも依然として４Ｒタウ又は４Ｒタウのペプチドへの特異的結合を実証するｓｃＦｖ－Ｍｓ－Ｆｃ及びｓｃＦｖ－ＧＦＰ イントラボディへの変換の成功を示した。研究の次の段階は、この細胞内発現抗体（イントラボディ）の標的分解イントラボディ、すなわちデグラボディへの変換に焦点を合わせることであった。

例１０
ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ イントラボディからのデグラボディの生成
ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ イントラボディを、４Ｒタウを分解することができるデグラボディに変換するために、ＧＦＰドメインを、文献から選択された６つの分解ドメインのうちの１つと置き換えた。これらのドメインを、文献によって提案される向きに応じて、ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖへのＮ又はＣ末端融合として融合した（表５）。

すべてのデグラボディ融合構築物ならびにＧＦＰ Ｎ及びＣ末端融合物（非分解イントラボディ対照として）を、０Ｎ３Ｒタウ又は０Ｎ４Ｒタウのいずれかを含むＨＥＫ－２９３Ｆ細胞にコトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を溶解し、ポリクローナル全タウ抗体（Ｄａｋｏ）を利用するウェスタンブロットによって分析した。次いで、バンドデンシメトリーを行い、値をＧＦＰ融合対照のパーセンテージとして表した。代表的なウェスタンブロット（図２１Ａ）及びタウウェスタンブロットからのｎ＝３デンシトメトリーのデータ（図２１Ｂ）を見ることができる。

分解の正確な比較を可能にするために、各構築物は、非分解ＶＲ７０８２－ＧＦＰ対照（それぞれＮ又はＣ末端に融合）と比較したタウの％として表される（図２１Ｂ）。これは、非分解イントラボディ以外、結合だけでないデグラボディの効果を示すので重要であった。

図２１に示されるデータは、ＶＲ７０８２ デグラボディと０Ｎ４Ｒタウとのコトランスフェクションが、非分解ＶＲ７０８２－ＧＦＰ イントラボディ対照と比較して０Ｎ４Ｒの分解を誘導することを実証している。デグラボディ構築物に０Ｎ３Ｒタウをコトランスフェクションした場合、これは当てはまらないことも分かる。

この研究の後、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）の存在が４Ｒタウの分解を停止させるかどうかを決定することは興味深いものであった。これは、ユビキチンプロテアソームへの依存度が低いことが以前に実証されているＯＤＣを除く（Ｅｒａｌｅｓ ａｎｄ Ｃｏｆｆｉｎｏ，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４３（１），２１６－２１）、すべてのデグラボディに当てはまるはずである。デグラボディ構築にＨＥＫ－２９３Ｆ細胞中の０Ｎ４Ｒ又は０Ｎ３Ｒタウをコトランスフェクションし、６時間のインキュベーション後、ＭＧ１３２を培養物の半分に添加した。次いで、すべての培養物をさらに１８時間インキュベートした後、フローにより分析した。これらの実験では、ウェスタンブロッティングではなくフローサイトメトリーを使用したのは、ＭＧ１３２処置の有無にかかわらず、すべてのデグラボディ構築物の０Ｎ３Ｒ及び０Ｎ４Ｒタウに対するより高いスループットスクリーニングを可能にするからである。技術的にはウェスタンブロッティングで可能であるが、多くの状態及び構築物を試験する場合、必要なブロットの数は、この技術の実用性がはるかに低いことを意味した。いかなる分解もウェスタンブロッティングの人為結果ではないこと、及びそれが複数の技術によって確認され得ることを確保することも重要であった。代表的なフローサイトメトリープロット及び比較アッセイデータを図２２Ａに見ることができ、ＶＲ７０８２－ＧＦＰレベルに対して正規化された、ＶＲ７０８２ デグラボディでコトランスフェクションされたすべての単一細胞集団の幾何平均を図２２Ｂに見ることができる。

このアッセイのためのゲーティング戦略は、まずＨＥＫ－２９３Ｆ細胞の同定を可能にし（図２２Ａ－１）、続いて高さと比較した前方散乱面積によって単一細胞の同定を可能にする（図２２Ａ－２）ことであった。次いで、０Ｎ４Ｒ－（図２２Ａ－３）又は０Ｎ３Ｒ－（図２２Ａ－４）トランスフェクト細胞のいずれかにおいて、ポリクローナル全タウ抗体（Ｄａｋｏ）による細胞内タウ染色について単一細胞を評価した。

図２２Ｂにおいて図２１Ｂについて上述したように、すべてのタウレベルは、ＶＲ７０８２－ＧＦＰ（結合性であるが非分解性のイントラボディ）対照の％として表される。図２２のデータは、別のアッセイシステムにおいて、すべてのデグラボディ構築物が、ＨＥＫ－２９３Ｆ細胞内の０Ｎ３Ｒタウのレベルを保持しながら、０Ｎ４Ｒタウを分解することができることを明確に実証している。すべての構築物について、（Ｔ検定によって）３Ｒタウレベルと比較して、４Ｒタウレベルが統計的に有意に減少している（図２２Ｂ）。ＭＧ１３２処置が４Ｒタウの分解をブロックしたので（図２２Ｂ）、ＯＤＣを除くすべての融合物はプロテアソーム依存性であり、ＭＧ１３２の添加の有無にかかわらず、すべての０Ｎ４Ｒコトランスフェクションについて統計学的に有意に差があった（Ｔ検定による）（図２２Ｂ）。再度、これは、ＭＧ１３２処置群と非処置群との間に統計的差異を示さない０Ｎ３Ｒタウトランスフェクト細胞には当てはまらず（図２２Ｂ）、ＭＧ１３２での処置がプロテアソーム分解のみをもたらし、細胞内の一般的なタウプロテオスタシスもたらさないことを示す。

図２１及び図２２に示されるデータは、ＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ イントラボディが、０Ｎ４Ｒタウの特異的分解が可能なｓｃＦｖ デグラボディに首尾よく変換されたことを明確に実証している。

例１１
ｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＶＲ７０８２ デグラボディを使用した４Ｒタウの分解
脂質ベースのトランスフェクション方法論によるニューロンのトランスフェクションでは、トランスフェクションされたＤＮＡを受容する細胞のパーセンテージはごくわずかである（Ｋａｒｒａ ａｎｄ Ｄａｈｍ ２０１０）。このため、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用したウイルストランスフェクションを、このプロジェクトのためのデグラボディ及び対照の送達方法として選択した。３つのＡＡＶ構築物をＧｅｎｅＣｏｐｅｉａから取得し、そのうちの２つは、ＸＩＡＰ分解ドメイン又はＨａｌｏタグ（非分解対照）のいずれかに融合したＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ、ならびに欠いている構築物を含むＡＡＶベクター陰性対照を含んでいた。ＶＲ７０８２－ＸＩＡＰ構築物はまた、ＧＦＰトランスフェクションマーカーのＩＲＥＳ発現の有無にかかわらず得られた。

ＶＲ７０８２－ＸＩＡＰ＋ＩＲＥＳ ＧＦＰ ＡＡＶを最初に使用して、誘導後９０日目に１０＋１６バイアレリックＭＡＰＴ変異ニューロンをトランスフェクションした。デグラボディ及びＧＦＰトランスフェクションマーカーの発現を考慮するために、細胞をトランスフェクションの７日後に分析した。次いで、２つの細胞集団を同定し、ＧＦＰ陽性又は陰性シグナルに基づくフローサイトメトリーを使用して選別した（図２３Ａ－３）。これらの２つの集団を溶解し、タウタンパク質レベルを、Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅのシンプルウェスタンを用いて評価した（図２３Ｂ及び図２３Ｃ）。完全なゲーティング戦略を図２３Ａに見ることができる。

生細胞をＴｏＰｒｏ３染色の欠如によって最初に同定した（図２３Ａ－１）。無傷の細胞を、ＦＣＳ－Ａ ｖ ＳＳＣ－Ａによって同定した（図２３Ａ－１－２）。ＴｏＰｒｏ３陰性であるが非常に小さく、ＦＳＣ－Ａ ｖ ＳＳＣ－Ａプロットのデブリ領域（プロットの左下）にある事象が多く存在することに注目することは興味深い。それらは、小さな脂質ミセルを形成した細胞デブリである可能性がある。そのようなデブリは、理論的には無傷の脂質二重層膜を有するであろうし、したがってＴｏＰｒｏ３染色を除外するであろう（生細胞がそうするように）。最後に、細胞をＧＦＰ発現に基づいて２つの方法で選別した（図２３Ａ－３）。

選別後、２つの細胞集団を溶解し、次いで、Ｐｅｇｇｙ Ｓｕｅのシンプルウェスタンで泳動させた。得られたトレースは、選別されたＧＦＰ陰性細胞（図２３Ｂ）及び選別されたＧＦＰ陽性細胞（図２３Ｃ）から見ることができる。ＧＦＰ陰性細胞のトレースは、２つのピーク、０Ｎ３Ｒを表す大きなピーク、及び０Ｎ４Ｒタウに対応する小さなピークを示す（図２３Ｂ）。対照的に、ＧＦＰ陽性細胞は、０Ｎ３Ｒタウを表すピークを有したが、０Ｎ４Ｒタウを表すピークは検出されなかった（図２３Ｂ）。これは、０Ｎ４ＲがＸＩＡＰを形質導入された細胞において分解されたことを示唆する。

まとめると、図２３に示されるデータは、デグラボディをｉＰＳＣ由来ニューロンに送達し、これらの細胞から４Ｒタウタンパク質を分解することが可能であることを実証している。

例１２
ｉＰＳＣ由来ニューロンに対する４Ｒタウ除去の表現型効果
以前の研究は、ＧＦＰが神経細胞に対して毒性であり得ることを示している（Ｄｅｔｒａｉｔ ｅｔ ａｌ．２００２，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，５（６），７２３－３０）。ミトコンドリア極性化アッセイへのＧＦＰの効果は不明であるため、この研究では、ＧＦＰなしでＡＡＶベクターを使用した。同じ理由で、以前に使用されたＶＲ７０８２－ＧＦＰイントラボディではなく、非分解対照としてのＶＲ７０８２－Ｈａｌｏタグイントラボディ。

ニューロンを、ＷＴ、１０＋１６モノアレリック及び１０＋１６バイアレリックＭＡＰＴ変異ｉＰＳＣ株細胞株から分化させた。８０～９０日目に、ＡＡＶを含有するＶＲ７０８２－ＸＩＡＰ、ＶＲ７０８２－Ｈａｌｏ又は陰性ＡＡＶ構築物で処置し、さらに７日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞をミトコンドリア膜極性化アッセイで泳動した。ここで、ミトコンドリア膜極性化は、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ ＣＭＸ ＲＯＳによる染色によって評価され、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ｄｅｅｐ ｒｅｄによる染色によって総ミトコンドリア量に対して正規化される。得られたデータを図２４に示す。

このアッセイのためのゲーティング戦略は、ミトコンドリア膜極性化及び総ミトコンドリア量についてアッセイされ得る無傷の神経細胞を同定することである（図２４Ａ）。各ｉＰＳＣ由来神経細胞株に対する各処置群の代表的な例（図２４Ｂ）は、ＷＴ対照ニューロンにおいて（図２４Ｂ－１）、対照ＡＡＶ、ＶＲ７０８２－Ｈａｌｏ又はＶＲ７０８２－ＸＩＡＰ処置群のいずれの効果もないことを示す。しかしながら、これらの処置を１０＋１６モノニューロン（図２４Ｂ－２）又は１０＋１６バイアレリックニューロンに適用すると、（図２４Ｂ－３）ＶＲ７０８２－ＸＩＡＰ デグラボディでの処置により、ミトコンドリア膜極性化のレベルが低下した。これは、各遺伝子型及び処置群についてｎ＝５のニューロン誘導で観察された（図２４Ｃ）。予想されるように、１０＋１６ ＭＡＰＴ変異ニューロンにおいて、１０＋１６モノアレリック又は１０＋１６バイアレリック株について、対照ＡＡＶ粒子処置とＶＲ７０８２－Ｈａｌｏ イントラボディとの間のミトコンドリア極性化の統計学的に有意な差は観察されなかった（ｐ＝０．１４５＋ｐ＝０．９２２、ＡＮＯＶＡ）。これは、ＶＲ７０８２－Ｈａｌｏ イントラボディがこれらの細胞内の４Ｒタウに結合するが、４Ｒタウの分解を誘導しないためである。しかしながら、細胞をＶＲ７０８２－ＸＩＡＰ デグラボディでトランスフェクションした場合、ミトコンドリア極性化の統計学的に有意な減少が、対照ＡＡＶからの（ｐ＝＜０．０００１＋ｐ＝０．００５２、ＡＮＯＶＡ）、及びＶＲ７０８２－Ｈａｌｏ処置群からの（ｐ＝＜０．０００１＋ｐ＝０．００１８、ＡＮＯＶＡ）１０＋１６モノアレリック及び１０＋１６バイアレリック変異細胞株の両方で観察される（図２４Ｃ）。１０＋１６バイアレリックニューロンでは変異表現型のわずかな減少しか観察されないが、１０＋１６モノアレリックニューロンでは、ミトコンドリア極性化のレベルがＷＴニューロンと有意に異ならないレベルまで低下することに注目するのは興味深い（ｐ＝０．５６７、ＡＮＯＶＡ）（図２４Ｃ）。

ＶＲ７０８２－ＲｂＩｇＧ ４Ｒ特異的抗体はＶＲ７０８２－ｓｃＦｖ デグラボディと同じエピトープを有するので、これらの実験では４Ｒタウレベルを評価することはできなかった。しかしながら、ＶＲ７０８２－ＸＩＡＰは特異的に４Ｒタウ分解を誘導し、３Ｒ分解を誘導しなかったことが以前に実証されている（図２１、図２２及び図２３）。いずれの処置群間でも３Ｒタウレベルに変化がないことが確認され、これらの実験では、標的外分解効果がないことを示唆している（図２４Ｄ）。

ここで、本発明者らは、ＶＲ７０８２ デグラボディを１０＋１６ ＭＡＰＴ変異ｉＰＳＣ由来ニューロンに適用して、ミトコンドリア膜極性化の非変異レベルを回復させることができることを首尾よく実証した。

例１３
ＶＲ７０８２抗体のエピトープ特徴付け
細胞内タウ発現構築物を、ペプチドエピトープＴＥ１０全体で１つのアラニン点変異、ならびにタウオパチーの疾患モデルで一般的なＰ３０１Ｓ及びＬ変異を有するように設計した。構築物をＴＷＩＳＴ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅによって、タウの細胞内発現に適したベクターに合成した。

構築物を得たら、製造業者の指示に従って、単一構築物をＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ）に一過性にトランスフェクションした。細胞を、加湿した５％ＣＯ_２環境において、２２０ＲＰＭで振盪しながら、３８℃でインキュベートした。４８時間のインキュベーション後、細胞を３５０Ｇ_（ａｖ）で１０分間の遠心分離によって回収した。製造業者の指示に従って、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｓ Ｆｉｘ ａｎｄ Ｐｅｒｍキットを用いて細胞を固定し、透過処理した。次いで、細胞を、ａｌｅｘａ－４８８で標識した非ＶＲ７０８２クロスブロッキング抗体ＨＴ７で氷上で３０分間染色した後、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡで洗浄し、次いで、２０，０００細胞／ウェルで播種した。その後、各ウェルを氷上で３０分間１０μｇ／ｍｌ ＶＲ７０８２で染色し、細胞をＰＢＳ＋１％ ＢＳＡで１回洗浄し、二次抗ウサギＦｃ－Ａｌｅｘａ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）は、抗体が１：１０００希釈で添加されたことを示す。細胞を氷上で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡで洗浄し、５０μｌ／ウェルに再懸濁した。細胞をＩＱｕｅ３で泳動し、タウ含有細胞をａｌｅｘａ－４８８蛍光によってＨＴ７からゲーティングし、タウ結合をａｌｅｘａ－６４７染色によって評価した。データを正規化し、変異していないタウについて観察された結合シグナルのパーセンテージとして表した。

得られた結果を図２６に示す。図２６のデータは、ペプチド結合部位全域で単一の特異的アラニン変異の存在下（左から右に向かって２番目から１０番目のバー）、Ｐ３０１Ｓタウへの結合（左から右に向かって１１番目のバー）、Ｐ３０１Ｌタウへの結合（左から右に向かって１２番目のバー）及びモックトランスフェクト細胞への結合（左から右に向かって最後のバー）におけるタウ結合シグナルのノックダウンを実証する。すべての値は、非変異０Ｎ４Ｒタウ（１番左のバー）への結合のパーセンテージとして表される。結果は、アラニンへのＫ２９４；Ｄ２９５、Ｎ２９６及びＩ２９７のいずれの変異も、タウに対するＶＲ７０８２抗体の結合をほぼ完全に消失させる。アラニンへのＫ２９８及びＶ３００のどちらの変異も、タウに対するＶＲ７０８２抗体の結合をほぼ半分にする。Ｈ２９９、Ｐ３０１及びＧ３０２の変異は、ＶＲ７０８２のタウへの結合に影響を及ぼさなかった。結果はまた、ＶＲ７０８２がＰ３０１ＳとＰ３０１Ｌの両方に結合することができることを実証し、これらの変異を含むタウオパチーの動物又は細胞モデルで使用できることを示している。

Claims (29)

1. （ａ）生理学的試料中の４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的に結合するか；又は
   （ｂ）生理学的試料中の３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的に結合する、
   抗体又はその抗原結合フラグメント。
2. ４Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. （ａ）４Ｒタウタンパク質がタウ４Ｒのアミノ酸位置２７９、２８０、２８１、２８５及び２８９のうちの１つ以上において翻訳後修飾を含む場合、タウのエクソン１０によってコードされるアミノ酸領域に結合する；
   （ｂ）４Ｒタウタンパク質のアミノ酸２９４～３０２を含むか、もしくはそれらからなるペプチドに結合する；
   （ｃ）タウのエクソン１０によってコードされるアミノ酸配列からの単一エピトープに対応するペプチドに結合する；又は
   （ｄ）（ａ）～（ｃ）の抗体又はフラグメントのいずれかをクロスブロックするか、もしくはそれらにクロスブロックされる、
   請求項２に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. （ａ）抗体又はその抗原結合フラグメントが、生理学的４Ｒタウタンパク質アイソフォームを発現する細胞からの細胞溶解物、好ましくは４Ｒタウタンパク質アイソフォームを発現するｉＰＳＣ由来神経細胞からの細胞溶解物において、４Ｒタウタンパク質アイソフォームを特異的に結合する；及び／又は
   （ｂ）抗体又はその抗原結合フラグメントが、４Ｒタウタンパク質アイソフォームを発現する細胞上又は細胞内での免疫蛍光によって、４Ｒタウタンパク質アイソフォームを検出することができる、
   請求項２又は３に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. 抗体又はその抗原結合フラグメントが、
   （ａ）配列番号３、５及び７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上、ならびに配列番号１１、１３及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上を含み、好ましくは配列番号３、５及び７の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列ならびに配列番号１１、１３及び１５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む；
   （ｂ）配列番号１及び９の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む；
   （ｃ）イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、好ましくは配列番号１７の配列、又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有し、依然としてタウタンパク質４Ｒアイソフォームに特異的に結合することができる配列を含むイントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）である；又は
   （ｄ）（ａ）～（ｃ）の抗体又はフラグメントのいずれかをクロスブロックするか、又はそれらによってクロスブロックされる、
   請求項２～４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
6. アミノ酸Ｋ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６及びＩ２９７を含む４Ｒタウタンパク質のエピトープに結合する、請求項２～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
7. エピトープが４Ｒタウタンパク質のＫ２９８及びＶ３００をさらに含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
8. ３Ｒタウタンパク質アイソフォームに特異的に結合する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
9. 抗体又はその抗原結合フラグメントが、
   （ａ）タウのエクソン９及び１１を架橋する領域によってコードされるアミノ酸配列を含むペプチドに結合する、及び／又は
   （ｂ）タウのエクソン９及び１１によってコードされる配列の境界のいずれかの側の７個のアミノ酸からなるペプチドに結合する、
   請求項８に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
10. ペプチドが環状ペプチドである、請求項９に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
11. 抗体又はその抗原結合フラグメントが、
    （ａ）配列番号２０、２２及び２４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上、ならびに配列番号２８、３０及び３２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の１つ以上を含み、好ましくは配列番号２０、２２及び２４の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列ならびに配列番号２８、３０及び３２の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む；
    （ｂ）配列番号１８及び２６の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む；
    （ｃ）イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）、好ましくは配列番号３４の配列、又はそれと少なくとも９５％の配列同一性を有し、タウタンパク質３Ｒアイソフォームに特異的に結合することができる配列を含む、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）である；又は
    （ｄ）（ａ）～（ｃ）の抗体又はフラグメントのいずれかをクロスブロックするか、又はそれらによってクロスブロックされる、
    請求項８～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
12. ４Ｒタウタンパク質を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントであって、抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸Ｋ２９４、Ｄ２９５、Ｎ２９６、及びＩ２９７を含む４Ｒタウタンパク質のエピトープに結合し、場合によりエピトープが４Ｒタウタンパク質のＫ２９８及びＶ３００をさらに含む、抗体又はその抗原結合フラグメント。
13. 抗体が、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）又はデグラボディ（ｄｅｇｒａｂｏｄｙ）である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする、１つ又は複数の核酸。
15. 請求項１４に記載の１つ又は複数の核酸を含む、１つ又は複数のベクター。
16. 請求項１４に記載の１つもしくは複数の核酸、又は請求項１５に記載の１つもしくは複数のベクターを含む、宿主細胞。
17. （ａ）請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１４に記載の１つもしくは複数の核酸、又は請求項１５に記載の１つもしくは複数のベクター；及び
    （ｂ）医薬担体又は賦形剤
    を含む、医薬組成物。
18. （ａ）試験試料を請求項２～７又は１２のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させること；及び
    （ｂ）抗体又はその抗原結合フラグメントの結合を検出すること
    を含む、４Ｒタウタンパク質アイソフォームを検出する方法。
19. （ａ）試験試料を請求項８～１１のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させること；及び
    （ｂ）抗体又はその抗原結合フラグメントの結合を検出すること
    を含む、３Ｒタウタンパク質アイソフォームを検出する方法。
20. 請求項１７及び１８の両方に記載の方法を実施することを含む、４Ｒタウタンパク質アイソフォーム及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームのレベルを測定する方法。
21. ４Ｒタウタンパク質アイソフォーム及び３Ｒタウタンパク質アイソフォームの相対量が被験者について予想されるものと異なるかどうかを、場合により健康な被験者からの試料中の４Ｒ及び３Ｒの相対量と比較することによって、判定することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
22. タウオパチー、好ましくはＰＳＰ、ＣＢＤ、又はピック病を診断するために使用される、請求項１９又は２０に記載の方法。
23. （ａ）検出が免疫蛍光を介する；
    （ｂ）検出がＰｅｇｇｙ Ｓｕｅのシンプルウェスタンブロットを介する；
    （ｃ）検出がＥＬＩＳＡを介する；又は
    （ｃ）試験試料が、細胞溶解物、細胞又は組織を含む、
    請求項１８～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. タウオパチーを治療する方法に使用するための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１４に記載の１つもしくは複数の核酸、請求項１５に記載の１つもしくは複数のベクター、又は請求項１６に記載の医薬組成物。
25. タウオパチーが４Ｒタウタンパク質アイソフォームと３Ｒタウタンパク質アイソフォームとの間の不均衡を含む、請求項２４に記載の方法で使用するための抗体、その抗原結合フラグメント、１つもしくは複数の核酸、１つもしくは複数のベクター、又は医薬組成物。
26. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１４に記載の１つもしくは複数の核酸、請求項１５に記載の１つもしくは複数のベクター、又は請求項１５に記載の医薬組成物をタウオパチーを有する被験者に投与することを含む、タウオパチーを治療する方法。
27. タウオパチーが、４Ｒタウタンパク質アイソフォームと３Ｒタウタンパク質アイソフォームとの間の不均衡を含む、請求項２６に記載の方法。
28. タウオパチーの治療に使用するための医薬品の製造における、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、請求項１４に記載の１つもしくは複数の核酸、請求項１５に記載の１つもしくは複数のベクター、又は請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
29. タウオパチーが、４Ｒタウタンパク質アイソフォームと３Ｒタウタンパク質アイソフォームとの間の不均衡を含む、請求項２８に記載の使用。