KR20070094890A - 안티 ａｄｄｌ 항체 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 ADDLs로 알려진 Aβ-유도된 확산성 리간드의 다차원 구조를 특이하게 인식하는 항체에 관한 것이다. 본 발명의 항체는 알츠하이머병과 대조표준 인간뇌 추출물을 구별할 수 있고, ADDLs를 검출하고 알츠하이머병을 진단하는 방법으로 유용하다. 본 항체는 또한 ADDLs의 결합, ADDLs의 어셈블리 및 타우인산화반응을 차단하고, 아밀로이드 β 1-42의 용해할 수 있는 올리고머와 연관된 병을 방지하고 치료하기 위한 방법에 유용하다.

Description

안티 ＡＤＤＬ 항체 및 그 용도{ANTI-ADDL ANTIBODIES AND USES THEREOF}
개요
본 출원은 2004. 10. 25일에 출원된 미국 특허출원 제60/621,776호, 2005. 2. ＤＤＤ14일에 출원된 제60/652,538호, 2005. 6. 30일에 출원된 제60/695,526호 및 2005. 6. 30일에 출원된 60/695,528호의 우선권을 주장하는 출원으로 그 내용은 상기 전체의 출원의 참조에 의해서 본 명세서에 포함되어 있다.
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institute of Health: NIH)에 의해서 일부 후원되는 연구 과정에서 만들어졌다(Grant Nos. NIH R01-AG18877 및 NIH R01-AG22547). 미국 정부는 본 발명에 일부 권리를 소유할 수 있다.
발명의 배경
알츠하이머병은 진행성 및 퇴행성 치매(Terry, 외 다수.(1991) Ann. Neurol. 30:572-580; Coyle (1987) In: 신경과학 백과사전, Adelman(ed.), Birkhauser, Boston-Basel-Stuttgart, pp 29-31)를 말한다. 초기 단계에서 알츠하이머병은 처음 알려진 바에 의하면 아밀로이드 베타(Amyloid beta: Aβ)로부터 유발되는 신경독을 원인으로 하여 새로운 기억을 형성하는데 있어서의 심각한 무능력인 것으로 밝혀졌었다. Aβ는 양 친매성의 펩티드로서 그 양은 변이 및 알츠하이머병에 관련된 위험 요소에 의하여 증가한다. Aβ로부터 형성된 소섬유들은 아밀로이드 플라크(plaque)의 중심으로 구성되고 알츠하이머병의 뇌에 대한 특징에 해당한다. 시험관 내에서 발생된 유사한 원섬유들은 배양된 뇌신경에 치명적이다. 이러한 발견은 기억 상실이 소섬유의 Aβ에 의하여 원인이 되는 신경사(神經死)의 결과가 된다.
소섬유의 Aβ 및 기억 상실에 대한 많은 실험적 지원에도 불구하고, 치매 및 아밀로이드 플라크의 유해물질의 존재량 사이에 약한 상호작용이 존재한다. (katzman (1998) Ann. Neurol. 23:138-144). 더욱이 이식유전자의 hAPP 쥐 (Dodart 외 다수. (2002) Nat. Neurosci. 5:452-457; Kotilinek 외 다수. (2002) J. Neurosci. 22:6331-6335)는 연령 의존적인 아밀로이드 플라크로, 가장 중요하게는 연령 의존적인 기억 기능장애로 발전하게 되고, Aβ에 대항하여 모노클로널 항체(monoclonal antibodies)를 가진 백신접종을 24시간 내에 하면 기억 상실은 플라크 레벨에 있어서 어떠한 변화 없이 전환될 수 있다. 상기 발견은 아밀로이드 원섬유에 의하여 유발되는 세포사 의존 기억상실에 대한 메커니즘과 일치하지는 않는다.
Aβ 자기조립에 의하여 형성된 신경학적으로 부가적인 활동분자들은 제안되어왔다. 상기 분자들은 용해할 수 있는 Aβ 올리고머를 포함하고, 또한 Aβ에서 유도된 확산성의 리간드 또는 ADDL로 불린다. 올리고머는 준안정상태이고, Aβ1-42의 낮은 농도에서 형성한다. (Lambert 외 다수. (1998) proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6448-6453). Aβ 올리고머는 급격하게 장기 시냅스 강화 현상(long-term potentiation: LTP), 기억을 위한 고전적인 실험 기준 및 접합 유연성(synaptic plasticity)을 차단한다. 상기한 바와 같이 기억상실은 신경사 및 Aβ 올리고머에 의한 시냅스 기능상실에 앞서서 원섬유가 아닌 시냅스 기능 상실로부터 유발된다(Hardy&Selkoe (2002) Science 297:353-356). 용해성의 올리고머는 뇌조직에서 발견되고, 알츠하이머병(Kayed, 외 다수. (2003) Science 300:486-489; gong, 외 다수. (2003) proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10417-10422) 및 hAPP 이식유전자 쥐의 알츠하이머병 모델(Kotilinek, 외 다수. (2002) J. Neurosci. 22:6331-6335; Chang, 외 다수. (2003) J. Mol. Neurosci. 20:305-313)에 있어서 강하게 상승한다.
다양한 알츠하이머병 치료 옵션은 제안되어 왔다. 백신 치료의 시도는 백신에 강력한 면역 반응을 가진 사람들이 정신작용의 이익을 나타낸다(Hock, 외 다수 (2003) Neuron 38:547-554); 그러나, 빈번한 CNS 염증은 실험의 부분의 조기 종료를 유발하였다(Birmingham & Frantz (2002) Nat. Med. 8: 199-200). 백신에 대한 대안으로서 모노머 또는 원섬유를 결합하는 것 없이 ADDL을 타겟으로 하는 치료상의 항체는 제안된다(Klein (2002) Neurochem. Int. 41:345-352). ADDL은 매우 항유전성이고, 50㎍/㎖의 농도로 토끼에 있어서 올리고머 선택적인 다클론성의 항체를 유발한다(Lambert, 외 다수. (2001) J.Neurochem. 79:595-605). 이식유전자 쥐 모델로부터의 결과는 또한 항체가 기억 감소를 역전시키는데 성공할 수 있다는 것을 제안한다(Dodart, 외 다수. (2002) Nat. Neurosci. 5:452-457). 따라서 알츠하이머병의 예방 및 치료를 위한 ADDL 선택적인 치료상의 항체에 대한 기술에 있어서의 필요성이 있다. 본 발명은 이러한 필요를 충족시킨다.
발명의 요약
본 발명은 분리된 항체이거나 또는 그에 대한 절편이고, 하나 또는 그 이상의 Aβ에서 유도된 확산성 리간드의 다차원적 조직을 특이하게 인식할 수 있다. 특별한 구체예에서 본 발명의 항체는 약제학적으로 수용 가능한 운반자를 가진 혼합물 내에 있다. 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 항체는 키트(kit) 내에 있다.
뉴런에 Aβ에서 유도된 확산성의 리간드의 결합을 차단하고, Aβ에서 유도된 확산성의 리간드의 결합을 차단하고, 하나 또는 그 이상의 Aβ에서 유도된 확산성 리간드의 다차원적 조직을 결합하는 항체 또는 항체 절편을 사용하는 ser202/thr205에서의 타우 단백질의 인산화반응을 차단하기 위한 방법은 또한 제공된다.
본 발명은 더욱이 본 발명의 항체를 사용하여 Aβ에서 유도된 확산성의 리간드와 관련하여 예방적으로 또는 치료적으로 병을 다루기 위한 방법을 포함한다. 발명의 항체에 대한 운영은 뉴런에 Aβ에서 유도된 확산성의 리간드의 결합을 차단할 수 있고, 그렇게 함으로써 Aβ에서 유도된 확산성의 리간드와 관련된 병을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명은 또한 뉴런에 Aβ에서 유도된 확산성의 리간드의 결합을 차단하는 치료 약제를 식별하기 위한 방법이다. 본 발명의 이러한 방법은 약제 존재하에 뉴런에 Aβ에서 유도된 확산성의 리간드의 결합을 결정하기 위하여 약제 존재하에 Aβ에서 유도된 확산성의 리간드와 뉴런을 접촉시키고 본 발명의 항체를 사용하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 Aβ에서 유도된 확산성 리간드의 리간드와 관련된 병을 진단하기 위하여 샘플 및 방법에 있어서 Aβ에서 유도된 확산성 리간드를 검출하기 위한 방법을 포함한다. 상기 방법들은 즉각적 발명의 항체를 가진 샘플을 접촉시키는 것을 포함해서 Aβ에서 유도된 확산성 리간드는 검출될 수 있고 Aβ에서 유도된 확산성 리간드와 관련된 병은 진단될 수 있다.
도면의 간단한 설명
제1도는 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 분석으로부터의 결과를 보여준다. 안티 ADDL 항체는 개별적으로 뉴런을 차단한다.
제2도는 B103 세포가 안티 ADDL 항체와 함께 사전 배양될 때 bADDL 결합의 요약을 보여주고 있다.
제3도는 ADDL의 다차원적 조직을 개별적으로 인식할 수 있는 항체의 결합 특성의 요약을 보여준다.
제4도는 여기에 나타난 항체의 ADDL 어셈블리 방해의 요약을 보여준다.
제5도는 N2A 결합을 보여준다: KADDL 상호작용 도면.
제6도는 뮤린 안티 ADDL 항체 20C2 (도 6A 및 6B), 5F10 (도 6C 및 6D), 2D6 (도 6E 및 6F), 2B4 (도 6G 및 6H), 4E2 (도 6I 및 6J), 2H4 (도 6K 및 6L), 2A10 (도 6M 및 6N), 3B3 (도 6O 및 6P), 1F6 (도 6Q 및 6R), 1F4 (도 6S 및 6T), 2E12 (도 6U 및 6V) 및 4C2 (도 6W 및 6X) 각각에 대하여 중쇄 및 경쇄 변이 영역에 대한 핵산 서열을 보여준다. 소문자는 항체 리더 시퀀스(leader sequences)를 나타내고, 대문자는 항체 변이 영역 시퀀스를 나타낸다. 상기 상보성 결정 영역(CDRs)에 대한 뉴클레오티드 코딩은 밑줄로 나타낸다.
제7도는 마우스(mouse) 안티 ADDL 항체에 대하여 중쇄 변이 영역에 대한 CDR1 (도 7A), CDR2 (도 7B), CDR3 (도 7C) 시퀀스와 경쇄 변이 영역에 대한 CDR1 (도 7D), CDR2 (도 7E), CDR3 (도 7F) 시퀀스의 비교를 보여준다.
제8도는 CDR 조직이식에 의해서 창조된 인간화 안티 ADDL 항체 20C2 (도 8A 및 8B), 26D6 (도 8C 및 8D), 4E2 (도 8E 및 8F), 3B3 (도 8G 및 8H), 2H4 (도 8I 및 8J), 1F6 (도 8K)에 대하여 중쇄 및 경쇄의 변이 영역에 대한 아미노산 시퀀스를 보여준다. 시퀀스는 마우스 시퀀스, NCBI 단백질 데이터베이스로부터 얻어진 가장 일치하는 인간 시퀀스, 가장 일치하는 인간 게놈 시퀀스 및 인간화 시퀀스 사이의 비교로써 표현된다. 인간화 시퀀스와 다른 마우스, 인간 및 인간 유전 시퀀스내의 아미노산은 볼드(bold)체이다. CDR은 밑줄로 표현된다. CDR 루프 배열 유지를 위하여 중요한 잔기들은 *로 나타낸다. VL/VH 인터페이스에서 발견되는 보존 잔여기들은 #으로 나타낸다. 강력한 글리코실화 위치는 이탤릭체로 나타낸다. 20C2의 중쇄에 있어서 두 개의 인간화 시퀀스가 산출되고(HCVRA 및 HCVRB), 24위치에서의 아미노산에 의하여 차이가 난다. 20C2 HCVRA에서는 인간 아미노산이 사용되었고 20C2 HCVRB에서는 마우스 아미노산이 사용되었다. 어떠한 경쇄도 1F6에 대하여 디자인되지 않았다. 왜냐하면 4E2에 대한 경쇄와 같은 시퀀스를 갖기 때문이다.
제9도는 베니어링(veneering)에 의하여 창조된 인간화 안티 ADDL 항체 20C2(도 9A 및 9B)와 26D6(도 9C 및 9D)에 대하여 중쇄 및 경쇄의 변이 영역에 대한 아미노산 시퀀스를 각각 보여준다. 시퀀스는 마우스 시퀀스, NCBI 단백질 데이터베이스로부터 얻어진 가장 일치하는 인간 시퀀스, 가장 일치하는 인간 게놈 시퀀스 및 인간화 시퀀스 사이의 비교로써 표현된다. 인간화 시퀀스와 다른 마우스, 인간 및 인간 게놈 시퀀스에서의 아미노산은 볼드(bold)체이다. CDR은 밑줄로 표현된다. CDR 루프 배열 유지를 위하여 중요한 잔기들은 *로 나타낸다. VL/VH 인터페이스에서 발견되는 보존 잔여기들은 #으로 나타낸다. 강력한 글리코실화 위치는 이탤릭체로 나타낸다. 20C2 중쇄에 대하여 두개의 인간화 시퀀스가 산출되었고(HCVRVenA 및 HCVRVenB), 81 위치에서의 아미노산에 의하여 차이가 난다. 20C2 HCVRVenA에서 마우스 아미노산이 사용되었고, 20C2 HCVRVenB에서 인간 아미노산이 사용되었다. 26D6 중쇄에 대하여는 세 개의 인간화 시퀀스가 베니어링을 기초로 디자인되었고(HCVR Ven1, Ven2 및 Ven3), 아미노산 11, 23, 15, 81, 89 및 118에서 차이가 있다. HCVR Venl에서 마우스 아미노산은 모든 포지션에서 사용되었다. Ven2에서 마우스 아미노산은 잔기 81 및 118에 대하여 사용되었고, 인간 아미노산은 잔기 11, 13, 15 및 89에 대하여 사용되었다. Ven3에서 인간 아미노산은 모든 포지션에서 사용되었다. 26D6 경쇄에 대하여 두개의 베니어링된 인간화 시퀀스가 디자인되었고(LCVR Ven1 및 Ven2), 아미노산 88 및 105에서 차이가 난다. LCVR Venl에서 마우스 아미노산은 양쪽 위치와 인간 아미노산이 사용된 Ven2에서 사용되었다.
제10도는 인간화 안티 ADDL 항체에 대하여 중쇄 및 경쇄 변이 영역에 대한 핵산 시퀀스들(각각 HCVRs 및 LCVRs)을 보여준다. 20C2, 2D6, 4E2, 3B3, 2H4 및 IF6에 대하여 HCVRs 및 LCVRs를 합체한 CDR은 각각 도 10A에서 도 10K까지 표현된다. 베니어링된 HCVRs(VenA 및 VenB)와 상기 VCVR은 도 10L에서 도 10N까지 표현되는데 반하여 26D6에 대하여 베니어링된 HCVRs(Ven1, Ven2, Ven3) 및 LCVRs(Ven1, Ven2)는 도 10O에서 도 10S까지 표현된다. 대문자는 항체 변이 영역 시퀀스를 나타낸다. CDRs는 밑줄로 나타낸다. 변이 영역 시퀀스는 완전한 중쇄 및 경쇄 항체 발현벡터로 복제되었다.
제11도는 안티 ADDL 항체에 대하여 완전히 IgG1 및 IgG2m4 인간화 중쇄와 인간화 카파(Κ)경쇄에 대한 아미노산 시퀀스를 보여준다. 도 11A, 20C2 HCVRA IgG1을 합체한 CDR; 도 11B, 20C2 HCVRB IgG1을 합체한 CDR; 도 11C, 20C2 HCVRA IgG2m4를 합체한 CDR; 도 11D, 20C2 HCVRB IgG2m4를 합체한 CDR; 도 11E, 20C2 HCVR Kappa를 합체한 CDR; 도 11F, 26D6 HCVR IgG1을 합체한 CDR; 도 11G, 26D6 HCVR IgG2m4를 합체한 CDR; 도 11H, 26D6 HCVR Kappa를 합체한 CDR; 도 11I, 4E2 HCVR IgG1을 합체한 CDR; 도 11J, 4E2 HCVR Kappa를 합체한 CDR; 도 11K, 3B3 HCVR IgG1을 합체한 CDR; 도 11L, 3B3 HCVR Kappa를 합체한 CDR; 도 11M, 2H4 HCVR IgG1을 합체한 CDR; 도 11N, 2H4 HCVR Kappa를 합체한 CDR; 도 11O, 1F6 HCVR IgG1을 합체한 CDR; 도 11P, 20C2 HCVR VenA IgG1을 베니어링한; 도 11Q, 20C2 HCVR VenB IgG1을 베니어링한; 도 11R, 20C2 HCVR VenB IgG2m4를 베니어링한; 도 11S, 20C2 HCVR Kappa를 베니어링한; 도 11T, 26D6 HCVR Ven1 Ig를 베니어링한; 도 11U, 26D6 HCVR IgG1을 베니어링한; 도 11V, 26D6 HCVR Ven2 IgG1을 베니어링한; 도 11W, 26D6 HCVR Ven3을 베니어링한; 도 11X, 26D6 HCVR Ven1 Kappa를 베니어링한; 도 11Y, 26D6 HCVR Ven2 Kappa를 베니어링한. 밑줄은 변이 영역 시퀀스를 나타내고, CDRs에 관련된 아미노산은 두 줄의 밑줄로 나타낸다. 잔여 아미노산 시퀀스는 일정 영역 시퀀스이다.
제12도는 인간 항체 일정 영역의 아미노산 시퀀스와 IgG2m4의 시퀀스의 비교를 보여준다. *은 Asn297에서 글리코실화 위치를 나타낸다. FcRn 결합 영역은 나타난다. IgG2m4가 IgG2와 다른 시퀀스는 밑줄로 나타낸다.
제13도는 Fab phage-display 벡터 pFab3d에서의 20C2의 인간화 항체의 중쇄 (도 13A) 및 경쇄 (도 13B)에 대한 주석을 단 아미노산 시퀀스를 보여준다.
제14도는 20C2 경쇄 CDR3를 성숙시키는 친화도를 발생시키기 위하여 두 개의 LC-CDR3 라이브러리 즉 LC3-1 및 LC3-2를 준비하는데 있어서 적용되는 디자인과 프라이머(Primer)를 도시한다. 클로닝(Cloning)을 위해 사용되는 제한 엔도뉴클레아제 인식 위치는 이택릭체로 나타낸다. 대문자는 항체 변이 영역 시퀀스를 암호화하는 핵산을 나타낸다. CDR을 암호화하는 핵산은 밑줄로 나타낸다.
발명의 상세한 설명
Aβ에서 유도된 확산성 리간드들(예: ADDLs)의 다차원적 조직을 특이적으로 인식하는 단일클론의 항체들은 현재 발생되어 왔다. 유리하게도 즉각적인 단일클론의 항체들은 알츠하이머병 및 대조표준인 인간뇌 추출물을 구분할 수 있고, 알츠하이머병 뇌 절편조직 및 배양된 해마 세포 내에서 내생의 올리고머를 식별할 수 있 다. 더욱이, 즉각적 항체들은 용액 내에서 내생적이고 합성적인 ADDLs를 중화시킨다. 소위 "합성" ADDLs는 ADDLs를 발생시키는 상태하에서 정제된 아밀로이드(amyloid) β1-42를 혼합하는 것에 의하여 시험관에서 생산된다. 미국 특허번호 제6,218,506호를 참조할 수 있다. 본 명세서에서 설명하는 특별한 항체들은 단량체 Aβ 펩티드의 최소한의 검출로 3 내지 24mers에 대한 높은 단계의 선택도를 나타낸다. 더욱이, 본 발명의 선택된 항체에 의한 ADDLs의 인식은 Aβ1-42 또는 Aβ1-40의 선형 시퀀스를 포함하는 짧은 펩티드에 의하여 차단되지 않는다. 그러나 결합은 Aβ1-28에서 또한 발견되는 배열적으로 특이한 구조에 기초하는 에피토프(epitope)를 나타내면서 Aβ1-28에 의하여 차단된다. 즉각적인 항체의 에피토프의 기술은 이러한 항체들이 ELISA에 의하여 측정되는 것과 같은 유사한 친화도 및 특이성을 가진 유사한 핵심 선형 시퀀스를 인식하는 것을 나타낸다. 더욱이, 즉각적인 항체들은 특이적으로 랫(rat)의 해마 뉴런 및 살아있는 신경아세포종의 세포라인의 초기 배양을 결합하기 위하여 ADDL을 포함한 준비의 능력을 차단한다. 그리고 또한 ADDL 복합체를 차단한다. 이러한 발견은 상기 항체들이 유사한 선형 시퀀스 인식 및 친화도에도 불구하고 ADDLs의 다차원적 조직을 인식하기 위한 특이적 능력을 소유한다는 것을 나타낸다. ADDLs는 작은 신경 집합으로 이루어지고, 일반적인 신경 기능을 분열시키는 것으로 알려져 있기 때문에 본 발명의 사용은 신경에 ADDLs의 결합을 차단하는 항체의 개발 및/또는 식별이다. 상기 항체들은 알츠하이머병을 포함하여 ADDL 관련 질환의 치료에 유용할 것이다. 이러한 사용의 개량은 뉴런에 결합한 ADDL 및 ADDLs 복합체의 예방을 위한 이러한 항체의 인간화 및/또는 친화도가 배양 된 개조에 특히 사용될 것으로 보인다.
따라서 본 발명은 ADDLs의 하나 또는 그 이상의 다차원적 조직을 특이적으로 인식하는 분리된 항체이다. 상기 즉각적인 발명의 항체는 동일 타입(type)의 다른 생물학적 거대분자들의 실질적인 부재로 존재하게 될 때 분리된다고 말해진다. 그러므로 "분리된 항체"는 실질적으로 다른 항체에 대하여 자유로운 항체라고 언급된다. 그러나 상기 분자는 항체의 기본적 특성에 해로운 영향을 주지 않는 몇몇 부가적 약제 및 일부분을 포함할 수 있다(예: 결합 특이성, 중립 활동도 등).
ADDLs의 하나 또는 그 이상의 다차원적 조직들을 특히 결합할 수 있는 항체들은 Aβ1-42의 올리고머화로부터 추출된 특유의 ADDLs에 결합한다. 그러나 여기에서 표현된 것처럼 웨스턴 블롯(western blot) 분석에 의하여 결정되듯이 다른 Aβ 펩티드 즉 Aβ1-12, Aβ1-28, Aβ1-40 및 Aβ12-28과 상호반응을 하지 않는다. 그리고 용액 내에서 ADDLs와 특이적으로 결합한다(예21 참조). 두개의 존재 사이에서 특유의 결합은 일반적으로 최소한 106, 107, 108, 109 또는 1010 M-1의 친화도로 알려져 있다. 108 M-1보다 더 큰 친화도는 특유 결합의 성취에 바람직하다.
상세한 구체예에서 하나 또는 그 이상의 ADDLs의 다차원적 조직과 특히 결합할 수 있는 항체는 또한 ADDLs의 다차원적 조직에 대항하여(예: 동물의 면역) 상승된다. 다른 구체예에서 하나 또는 그 이상의 ADDLs의 다차원적 조직과 특히 결합할 수 있는 항체는 Aβ1-42[Nle35-Dpro37]와 같은 낮은 n-mer 형성 펩티드에 대항하여 상승된다.
"에피토프"라는 용어는 B 및/또는 T세포가 반응하는 항원상의 위치 또는 항체가 생산될 및/또는 항체가 결합할 분자상의 위치를 의미한다. 예를 들면, 에피토프는 에피토프를 한정하는 항체에 의하여 인식될 수 있다.
선형 에피토프는 아미노산 프라이머리 시퀀스(primary sequence)가 인식된 에피토프를 구성하는 에피토프이다. 선형 에피토프는 예를 들어 특유 시퀀스에서 8개 내지 약 10개의 아미노산에 대하여 특히 최소 3개 및 그 이상을 포함하고, 더 일상적으로 최소 5개를 포함하게 된다.
조직 에피토프는 선형 에피토프와 대조적으로 에피토프를 구성하는 아미노산의 프라이머리 시퀀스가 에피토프의 한정된 성분만 인식되도록 하는 것은 아니다(예를 들면 에피토프에 있어서 아미노산의 프라이머리 시퀀스는 에피토프를 한정하는 항체에 의하여 주로 인식되는 것이 아니다). 전형적으로 조직 에피토프는 선형 에피토프에 비교하여 증가된 수의 아미노산을 포함한다. 조직 에피토프의 인식에 관하여 항체는 펩티드 또는 단백질의 삼차원적 구조를 인식한다. 예를 들면, 단백질 분자가 삼차원 구조를 형성하기 위하여 접히면, 일정한 아미노산 및/또는 조직 에피토프를 형성하는 폴리펩티드 백본(backbone)은 항체가 에피토프를 인식할 수 있도록 병치(竝置)된다. 에피토프의 조직을 결정하는 방식들은 예를 들면 X선결정법, 이차원 핵자기공명 분광법 및 위치지정 스핀 표지법 및 전자 상자성 공명 분광법에 포함되나 상기 방법에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어 분자생물학에서의 방법적인 에피토프 사상(寫像) 프로토콜(1996) Vol.66, Morris (Ed.)를 참조할 수 있다.
Aβ에서 유도된 확산성 리간드 또는 ADDLs는 아밀로이드 β1-42의 용해성 올리고머로 언급되며, 바람직하게는 여덟 내지는 아홉 개의 아밀로이드 β1-42 펩티드의 집합으로 구성되고 알츠하이머병과 관련된 것이 발견된다. 이것은 원세포 형성으로 이끄는 미셀(micelles)의 가시를 형성하는 고분자 무게 집적 매개체와 대조적이다.
본 예시와 같이 즉각적인 항체는 ADDL의 최소 하나의 다차원적 조직과 결합하거나 인식한다(도3 참조). 상세한 구체예로, 즉각적인 항체는 최소 둘, 최소 셋, 또는 최소 넷의 ADDL의 다차원적 구조와 결합한다. ADDL의 다차원적 구조는 SDS-PAGE를 통한 분석에 의하여 한정되듯이 2량체, 3량체, 4량체, 5량체, 6량체, 7량체, 8량체, 9량체, 10량체 등을 포함하도록 의도된다. 3량체, 4량체 등으로 인하여 지정은 적용된 분석법( Bitan, 외 다수. (2005) Amyloid 12:88-95)으로 다양화할 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이 3량체, 4량체, 및 그와 유사한 것들의 정의는 SDS-PAGE 분석에 따른다. 즉각적인 항체의 특이적으로 결합하는 능력을 나타내기 위하여 특정 항체는 하나의 다차원의 조직 예를 들면, ADDL의 4량체(항체 2D6 또는 4E2)를 인식할 것이나, 반면에 다른 항체들은 여러 개의 다차원의 조직 예를 들면, ADDL의 3량체 및 4량체(항체 2A10, 2B4, 5F10 또는 20C2)를 인식할 것이라고 발견되었다. 상기한 바와 같이 즉각적인 발명의 항체는 올리고머 특유의 특성을 가진다. 상세한 구체예에서 ADDL의 다차원적 구조는 본 발명의 항체에 의하여 인식되는 조직 에피토프로 되는 특별한 폴리펩티드 구조로 구성된다. 다른 구체예에서 본 발명의 항체는 특히 대략 3량체 또는 4량체의 크기 범위를 가지는 다차원 조직의 ADDL과 결합하고, 50kDa를 초과하는 분자 무게를 가진다.
특정 구체예에서는 다차원의 조직에 결합하는 것에 부가하여 즉각적인 항체는 아밀로이드 β1-42의 선택된 선형 에피토프와 결합한다. ADDLs의 선형 에피토프는 4, 5, 6 또는 그 이상의 아미노산 잔기 펩티드로서 아밀로이드 β1-42의 N-말단을 가지는 10, 11, 12, 15 또는 20 아미노산 잔기에 위치하도록 의도된다. 상세한 구체예에서 본 발명의 항체는 아밀로이드 β1-42의 잔기 1-10, 1-8, 3-10 또는 3-8 내부의 선형 에피토프에 특히 결합한다. 아밀로이드 β1-42의 전형적인 선형 에피토프는 아미노산 잔기들 EFRHDS (SEQ ID NO:177); DAEFRHDS (SEQ ID NO:178) 및 EFRHDSGY (SEQ ID NO:179)를 포함하나, 상기 잔기들에 제한되는 것은 아니다.
반면에 즉각적인 발명의 항체들은 유사한 선형 에피토프를 가질 수 있다. 상기 선형 에피토프가 전적으로 즉각적인 항체(즉, 신경에 결합하는 ADDL을 차단하고, 타우(τ) 인산화반응을 차단하고 그리고 ADDL 복합체를 차단하는 능력)의 결합 특성은 아니다. 왜냐하면, 당업자에게 잘 알려진 바와 같이 선형 에피토프는 항원의 에피토프(Breitling 및 Dubel (1999) In: Recombinant Antibodies, John Wiley & Sons, Inc., NY, pg. 115)의 부분에 단지 대응될 수 있기 때문이다. 예를 들면, 20C2는 charge-inverted, 절단된 Aβ7-42 펩티드의 복합체를 결합하기 위하여 발견되었다. 상기 펩티드는 20C2에 대하여 선형 에피토프가 부족하고(즉, 아미노산 잔기 3-8), Aβ의 잔기 7-16에 상응하는 매우 다른 시퀀스를 포함한다. 그러므로 20C2는 Aβ의 잔기 17-42 내로부터의 성분에 의존하는 조직 에피토프에 결합한다. 그러나 다차원의 조직에서만 국한된다. 즉각적인 발명의 항체들은 다차원의 ADDL을 특이적으로 인식하고, 신경에 결합한 ADDL을 특이적으로 차단하고, 타우 인산화반응을 특이적으로 차단하고, 그리고 ADDL 복합체를 특이적으로 차단할 수 있는 것으로서 당업자에 의하여 구별될 수 있다.
즉각적인 발명과 일치하여 사용되는 것처럼 항체는 다클론성 또는 단일클론성 항체와 그것에 관한 키메라, 인간(B세포로부터 분리된), 인간화, 중화, 이중특이적 또는 단사슬 항체를 포함하지만, 상기 항체에 제한되는 것은 아니다. 한 가지 구체예에서 즉각적인 발명의 항체는 단일큰론이다. 항체의 생산에 대하여 양, 토끼, 닭, 랫, 마우스, 인간 등의 다양한 숙주들은 합성 또는 천연 ADDLs에 주입에 의하여 면역화될 수 있다. 항체를 생산하기 위한 방식은 당 기술분야에서 잘 알려져 있다. Kohler와 Milstein ((1975) Nature 256:495-497) 및 Harlow와 Lane(항체: 연구 매뉴얼 (Cold Spring Habor Laboratory, New York (1988))을 참조할 수 있다.
숙주종에 의존하여 다양한 보조약들은 면역학적 반응을 증가시키는데 사용될 수 있다. 즉각적인 발명과 일치하여 사용되는 보조약들은 바람직하게는 반응의 질적 형태에 영향을 주는 면역유전자 내의 구조적 변화를 발생시키는 것 없이 ADDLs에 내재적인 반응을 증가시킨다. 특히 적합한 보조약들은 단일 인산화반응 지질 A(Stoute, 외 다수(1997) N. Engl. J. Med. 336:86-91을 참조), 뮤라밀(muramyl) 펩티드(N-acetylmuramyl-L-threonyl-D-isoglutamine(thr-MDP), N-acetyl-normuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine(nor-MDP), N-acetylmuranyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L0alanine-2-)1'-2'dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamine(E-PE), N-acetylglucsaminyl-L-Al-D-isoglu-L- Ala-dipalmitoxy propylamide(DTP-DPP)) 또는 다른 박테리아 세포벽 구성물과 같이 면역 자극제와 선택적으로 결합하여 3개의 탈산소아실레이트 단일인산화 지질 A(De-O-acylated monophosphoryl lipid A) (MPLTM; RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, MT; GB 2220211 참조) 및 수쿠알렌(squalene) 또는 땅콩 오일과 같은 수중유 에멀젼을 포함한다. 수중유 에멀젼의 상세한 예는 모델 110Y 미유동기(Microfluidics, Newton, MA)와 같은 미유동기를 사용하여 초미세입자로 형성하는 5% 스쿠알렌, 0.5% TWEENTM 80 및 0.5% SPAN 85(다량의 MTP-PE를 선택적으로 포함하는)를 구성성분으로 하는 MF59; 10% 스쿠알렌, 0.4% TWEENTM 80, 5% PLURONIC®IC-봉쇄된 폴리머 L121 및 미세유동화되어 초미세 에멀젼 또는 더 큰 입자 크기의 에멀젼을 발생시키기 위하여 와동된 thr-MDP를 구성성분으로 하는 SAF; 그리고 2% 스쿠알렌, 0.2% TWEENTM 80 및 단일인산화지질 A, 트레할로스 다이미코레이트(trehalose dimycolate: TDM) 및 세포벽 골격(CWS)과 같은 하나 또는 그 이상의 박테리아 세포벽 성분을 구성성분으로 하는 RIBI™ 보조 시스템(RAS)(Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT)을 포함한다.
다른 종류의 보조약은 STIMULON™(QS-21, Aquila, Framingham, MA)과 같은 사포닌(saponin) 보조약 또는 ISCOMs(면역자극성 복합체) 및 ISCOMATRIX®(CSL Ltd., Parkville, Australia)와 같이 그것으로부터 유발되는 입자가 있다. 다른 적 합한 보조약은 완전 프로인드 보조약(CFA), 불완전 프로인드 보조약(IFA), 수산화 알루미늄과 같은 미네랄 겔(mineral gel) 및 리소류신, PLURONIC®IC, polyols, polyanions, 펩티드, CpG(WO 98/40100), keyhole limpet hemocyanin, 디니트로페놀 및 인터류킨(IL-1, IL-2 및 IL-12), 매크로파지 클로니 자극 인자 (M-CSF) 및 종양 네크로시스 인자 (TNF)와 같은 시토카인 표면-활동 물질을 포함한다. 인간에 사용되는 보조약들 중에서 BCG(bacilli Calmette-Guerin) 및 Corynebacterium parvum이 특히 적합하다.
다차원의 조직 ADDL에서 항체는 ADDLs를 가진 동물을 면역화 하는 것에 의하여 유발된다. 일반적으로 ADDLs는 합성으로 또는 재조합 절편 발현 및 정제에 의하여 발생될 수 있다. 합성한 ADDLs는 본 발명의 공개로 또는 미국 특허 제6,218,506호 또는 동시계속출원 USSN　60/621,776,　60/652,538, 60/695,526 및 60/621,776에서 공개된 방법에 따라 준비될 수 있다. 더욱이, ADDLs는 키메라 분자에 대한 항체를 발생시키기 위하여 열쇠구멍삿갓조개헤모시아닌과 같은 또 다른 단백질과 융합될 수 있다. ADDLs는 본 발명에서 기술하는 바와 같이 에피토프를 유용하게 강제로 형성하도록 할 수 있고, 더욱이 예를 들어 본 발명의 항체에 의하여 인식되는 구조의 생산을 위하여 허락하는 방식으로 표면에 물리적으로 부착되거나 화학적으로 결합되는 표면과 결합될 수 있다.
ADDLs의 다차원 구조에 단일클론 항체는 배양에서 연속적인 세포 라인에 의하여 항체 분자들의 생산을 위하여 제공하는 어떠한 기술을 사용하여 준비될 수 있 다. 이러한 것들은 하이브리도마(hybridoma) 기술, 인간 B세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술(Kohler, 외 다수. (1975) Nature 256:495-497; Kozbor,외 다수. (1985) J. Immunol. Methods 81:31-42; Cote, 외 다수. (1983) Proc. Ma시. Acad. Sci. 80:2026-2030; Cole,외 다수. (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120)을 포함하나 상기 기술에 제한되는 것은 아니다. 전형적인 단일클론의 항체들은 2A10, 4C2, 2D6, 4E2, 20C2, 2B4, 5F10, 2H4, 2E12, 1F6, 1F4, 3B3, 5G12, 6B7, 6B11, 11B4, 11B5, 14A11, 15G6, 17G4, 20C2, 3B7, 1E3, 1A9, 1G3, 및 1E5를 지정하는 뮤린(murine)의 항체를 포함한다.
부가적으로 인간화 및 키메라 항체들은 적합한 항원 특이성 및 생물학적 활동도를 가진 분자를 얻기 위하여 인간 항체 유전자에 마우스 항체 유전자를 스플라이싱(splicing)하는 것에 의하여 생산될 수 있다(Morrison, 외 다수. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855; neuberger, 외 다수. (1984) Nature 312:604-608; Takeda, 외 다수. (1985) Nature 314:452-454; Queen, 외 다수. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033; WO 90/07861). 예를 들면, 마우스 항체는 파지(phage)선택벡터에서의 Fv 또는 Fab 절편으로 표현된다. 경쇄에 대한 유전자(그리고 병행된 시험에서 중쇄에 대한 유전자)는 인간 항체유전자 도서관을 위해서 교체된다. 여전히 항원과 결합하는 파지항체는 그 후 식별된다. 이러한 방법은 일상적으로 체인 셔플링(chain shuffling)으로 알려져 있는데, 하강하는 마우스 항체와 같은 에피토프를 결합하여야 하는 인간화된 항체를 제공했다(Jespers, 외 다수. (1994) Biotechnology NY 12:899-903). 대체물질로서 체인 셔플링은 단백질 수준에 서 수행될 수 있다(Figini, 외 다수. (1994) J. Mol. Biol. 239:68-78 참조).
인간 항체는 또한 파지표시방법을 사용하여 얻어질 수 있다. WO 91/17271 및 WO 92/01047을 참조할 수 있다. 이러한 방법으로, 파지도서관은 구성원들이 외부 표면상 다른 항체들을 표시하는데 생산된다. 항체들은 일반적으로 Fv 또는 Fab 절편으로 표시된다. 요구되는 특이성을 가진 파지표시항체들은 ADDLs에 친화도 강화에 의하여 선택된다. ADDLs에 대한 인간 항체들은 인간 면역글로불린 로커스(locus) 및 비활성 내생 면역글로불린 로커스의 최소한의 부분을 암호화하는 이식유전자를 가지는 비인간 이식유전자 포유동물로부터 또한 생산될 수 있다. WO 93/12227 및 WO 91/10741을 참조, 각각의 참조문헌에 의하여 여기에 표시되어 있다. 인간 항체는 경쟁결합 실험에 의하여 선택될 수 있거나 그렇지 않다면 특별한 마우스 항체와 같은 에피토프 특이성을 가지게 된다. 상기 항체들은 마우스 항체의 유용한 기능적 특성을 특히 공유하는 것 같다. 인간 다클론성의 항체들은 면역유전자로 면역된 인간으로부터 혈청의 형태로 또한 제공될 수 있다. 선택적으로, 상기 다클론항체들은 ADDLs를 친화성 반응물로서 사용하여 친화도 정화에 의해서 농축될 수 있다.
인간화 항체들은 뮤린 항체들을 베니어링 또는 리설페이싱(resurfacing)하는 것에 의하여 또한 생산될 수 있다. 베니어링은 마우스의 중쇄 및 경쇄 변이 영역내의 표면 고정 영역 아미노산을 단지 상동의 인간항체 시퀀스의 아미노산으로 대체하기 위하여 수반된다. 마우스 표면 아미노산을 상동의 인간시퀀스로부터 같은 위치에서 인간 잔기로 대체하는 것은 자체 리간드 결합을 보존하는 동안 마우스 항체 의 면역유전성을 감소시키는 것으로 보인다. 외부 잔기의 대체는 내부 도메인 또는 상호도메인 접촉에 그 효과가 미미하거나 전혀 없게 된다(미국특허 제6,797,492호 참조).
인간 또는 인간화 항체들은 IgG, IgD, IgA, IgM 또는 IgE 고정영역을 갖도록 디자인될 수 있고, 어떠한 표본은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함할 수 있다. 상세한 구체예에 있어서 본 발명의 항체는 IgG 또는 IgM이고, 또는 이것에 대한 조합이다. 특별한 조합은 인간 IgG4의 선택적 표시에 의하여 형성된 고정영역을 기준 인간 IgG2 고정 영역으로 받아들인다. 본 발명에서 전형적인 돌연변이 IgG2 Fc는 SEQ ID NO:254로서 설명한다. 항체는 두 개의 경쇄 및 중쇄를 포함하는 4량체, 각각의 중쇄 및 경쇄 또는 중쇄 및 경쇄 변이 영역이 스페이서(spacer)를 통하여 연결되는 단쇄 항체로서 표현될 수 있다. 단쇄 항체의 생산에 대한 기술은 당 기술분야에서 잘 알려져 있다.
CDR 그래프팅(grafting) 및 베니어링에 의하여 생산되는 전형적인 인간화 항체는 4E2, 26D6, 20C2, 3B3, 2H4 및 1F6 위치의 항체에 대하여 본 명세서에서 공개된다. CDR　그래프팅 및 베니어링에 의하여 유발되는 인간화 4E2, 26D6, 20C2, 3B3, 2H4 및 1F6에 대한 카파 경쇄 변이영역 뿐만 아니라 IgG1 및 IgG2M4 중쇄 변이영역에 대한 아미노산 시퀀스는 도 11A에서 11Y에서 표현되고, 본 명세서에서 SEQ ID 152번에서 176번으로 설명한다.
디아바디(diabody) 또한 고려된다. 디아바디는 결합 항체의 결합 영역(중쇄 및 경쇄)을 고립시키고, 동일 폴리펩티드 쇄에서의 중쇄 및 경쇄를 결합하거나 작 동적으로 연결하는 결합 모이어티(moiety)를 공급하여 그로 인하여 결합 기능을 보존하는 것에 의하여 준비되는 기계화 항체구조를 언급한다(Holliger, 외 다수. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444; Poljak (1994) Structure 2:1121-1123). 이것은 본질적으로 급격히 짧아진 항체를 형성하고, 항원에 결합하기 위하여 충분한 변이 영역만 가지게 된다. 같은 쇄 상의 두개의 영역 간 쌍을 형성하기에는 너무 짧은 링커(linker)를 사용하는 것에 의하여 영역은 다른 쇄의 상보성 영역과 쌍을 형성하고, 두개의 항원결합 위치를 형성하도록 강요된다. 이러한 2량체 항체 절편 즉 디아바디는 2가 및 이특이적이다. 당업자는 디아바디를 유발하기 위한 방법이 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 적합한 방법은 Holliger, 외 다수. (1993) Supra, Poljak (1994) Supra, Zhu, 외 다수. (1996) Biotechnology 14:192-196 그리고 미국 특허 제6,492,123호에 의하여 묘사되고, 상기 인용문헌에 의하여 본 명세서에 표현된다.
본 발명의 분리된 항체의 절편들은 또한 즉각적인 발명에 의하여 발현적으로 포위된다. 절편들은 펩티드 압타머(peptide aptamer) 뿐만 아니라 Fab절편, F(ab′)2절편, F(ab´)절편, 이중특이성 scFv절편, Fd절편 및 Fab 발현도서관에 의해서 생산된 절편들을 포함하여 지정된다. 예를 들면, F(ab´)2절편은 본 발명의 항체 분자의 펩신 소화에 의해서 생산되고, Fab절편은 F(ab´)2절편의 이황화다리를 감소시키는 것에 의해서 유발된다. 대안으로, Fab 발현도서관은 바람직한 특이성을 가진 단일클론의 Fab절편의 신속하고 쉬운 식별을 허락하도록 구성될 수 있다(Huse, 외 다수. (1989) Science 254:1275-1281). 상세한 구체예에서, 본 발명의 항체의 절편들은 그것에 관한 변이영역 결합위치를 보유하는 중화항체의 절편이다. F(ab´)2절편, F(ab´)절편 및 Fab절편이 전형적이다. 일반적으로 Immunology: Basic Processes (1985) 2판, J.Bellanti (Ed.) pp. 95-97.
ADDLs의 다차원적 구조를 특이적으로 인식하는 펩티드 압타머는 압타머 도서관에서 할당적으로 디자인되거나 차단될 수 있다(예를 들면, Aptanomics SA, Lyon, France에 의해서 제공된다). 일반적으로 펩티드 압타머는 합성인식분자이고, 그 디자인은 항체의 구조에 기초를 둔다. 펩티드 압타머는 스캐폴드 단백질에 양 끝으로 부착된 변이 펩티드 루프(peptide loop)로 구성된다. 이러한 이중구조적 제한은 펩티드 압타머의 결합 친화도를 항체의 결합 친화도와 비교한 수준으로 크게 상승시킨다(나노몰 수준의 범위).
즉각적인 발명의 항체 및 항체의 절편을 생산하는데 있어서 사용을 위한 전형적인 핵산 시퀀스 인코딩(encoding) 중쇄 및 경쇄 변이 영역은 도6 및 도10에서 보여준다(즉, SEQ ID NOs: 1-24 및 SEQ ID NOs: 132-151). 당업자에 의해서 이해될 수 있듯이 본 명세서에서 보여주는 중쇄변이영역은 변형된 친화도를 가진 항체를 발생시키고, 상수, 에피토프 및 이와 유사한 것들을 분리하기 위하여 보여주는 경쇄 변이영역들 중 하나와 결합에 사용될 수 있다. 예를 들면, 2H4의 경쇄 변이영역(SEQ ID NO:12에 의하여 인코딩되는)을 2A10의 중쇄 변이영역(SEQ ID NO:13에 의하여 인코딩되는)과 결합하는 것은 더 큰 선형 에피토프의 인식을 위하여 제공될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 절편을 생산하는데 있어서 사용을 위한 전형적인 중쇄 및 경쇄 CDRs는 도 7A-7F에서 보여주고, 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NOs: 25, 26 및 28(중쇄 CDR1); SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 33, 34, 35 및 36(중쇄 CDR2); SEQ ID NOs: 38, 39, 40, 41, 43, 44, 45, 46, 47 및 48(중쇄 CDR3); SEQ ID NOs: 49, 50, 51 및 53(경쇄 CDR1); SEQ ID NOs: 54, 55, 56 및 58(경쇄 CDR2); SEQ ID NOs: 59, 60, 61, 62, 63, 64 및 66(경쇄 CDR3)에서 나타남을 보여준다. 본 발명의 항체 또는 항체 절편의 중쇄 및 경쇄의 상세한 구체예는 다음과 같다. 중쇄 CDR1은 Ser-Phe-Gly-Met-His(SEQ ID NO:28) 또는 Thr-Ser-Gly-Met-Gly-Val-Xaa(SEQ ID NO:27)의 아미노산을 가지고, 여기에서 Xaa는 어떠한 측쇄도 가지지 않거나, 작은 측쇄를 가진다(예를 들면, Ser, Gly 또는 Ala). 중쇄 CDR2는 His-Ile-Xaa1-Trp-Asp-Asp-Asp-Lys-Xaa2-Tyr-Asn-Pro-Ser-Leu-Lys-Ser(SEQ ID NO:32)의 아미노산 시퀀스를 가지고, 여기에서 Xaa1은 방향족 측쇄 그룹(예를 들면, Phe, Tyr 또는 Trp)을 가진다. 그리고, Xaa2는 Ser, Arg 또는 Tyr이다; 또는 중쇄 CDR2는Tyr-Ile-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Ser-Xaa4-Thr-Ile-Tyr-Tyr-Ala-Asp-Thr-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO:37)의 아미노산 시퀀스를 가진다. 여기에서 Xaa1 및 Xaa2는 극성 측쇄 그룹(예를 들면, Arg, Ser, Gly, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys 또는 His)을 가진다; Xaa3는 Gly 또는 Val이고; Xaa4는 극성이고 대전되지 않은 측쇄 그룹을 가진 아미노산이다(예를 들면, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn 또는 Gln). 중쇄 CDR3는 Arg-Ser-Ile- Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Pro-Glu-Asp-Tyr-Phe-Xaa5-Tyr(SEQ ID NO:42)의 아미노산 서열을 가지고, 여기에서 Xaa1은 극성 및 대전되지 않은 측쇄그룹(예를 들면, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn 또는 Gln)을 가진 아미노산이다; Xaa2는 하이드록시기 측쇄 그룹(예를 들면, Ser 또는 Thr)을 가진 아미노산이다; Xaa3 및 Xaa4는 지방성의 측쇄 그룹(예를 들면, Ala, Val, Leu, Ile 또는 Pro)을 가진 아미노산이고; Xaa5는 Asp 또는 Ala이다. 경쇄 CDR1은 Arg-Ser-Ser-Gln-Ser-Xaa1-Xaa2-His-Ser-Asn-Gly-Asn-Thr-Tyr-Leu-Xaa3(SEQ ID NO:52)의 아미노산 시퀀스를 가지고, 여기에서 Xaa1 및 Xaa2는 지방성의 측쇄 그룹(예를 들면, Ala, Val, Leu, Ile 또는 Pro)을 가진 아미노산이다. 그리고, Xaa3은 대전된 측쇄 그룹(예를 들면, Asp, Glu, Arg, His 또는 Lys을 가진 아미노산이다. 경쇄 CDR2는 Lys-Xaa1-Ser-Asn-Arg-Phe-Xaa2(SEQ ID NO:57)의 아미노산 시퀀스를 가지고, 여기에서 Xaa1은 지방성의 측쇄 그룹(예를 들면, Ala, Val, Leu, Ile 또는 Pro)을 가진 아미노산이다. 그리고, Xaa2는 Ser 또는 Phe이다. 경쇄 CDR3은 Xaa1-Gln-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Val-Pro-Xaa5-Thr(SEQ ID NO:65)의 아미노산 시퀀스를 가지고, 여기에서 Xaa1은 Ser 또는 Phe이다; Xaa2는 어떠한 측쇄(예를 들면, gly)도 가지지 않거나 히드록시기 측쇄 그룹(예를 들면, Ser 또는 Thr)이다; Xaa3은 히드록시기 측쇄 그룹(예를 들면 Ser 또는 Thr)을 가진 아미노산이다; Xaa4는 His, Tyr 또는 Leu이고; Xaa5는 지방성의 측쇄 그룹(예를 들면, Ala, Val, Leu, Ile 또는 Pro)을 가진 아미노산이다. 당업자에 의하여 이해될 수 있듯이 항체의 중쇄 및 경쇄 변이영역 내에서의 하나 또는 그 이상의 CDRs는 전체적으로 새로운 항체 또는 항체 절편을 발생시키기 위하여 또 다른 항체로부터 하나 또는 그 이상의 CDRs로 대체될 수 있다. 예를 들면, 5F10 중쇄의 CDR3을 4E2로부터의 중 쇄 CDR3과 대체하는 것은 뉴런세포에 ADDLs의 결합을 차단하기 위한 5F10의 능력을 향상시킬 수 있다.
독특한 특성을 가진 항체들이 고려된다. 한 구체예에서 Aβ1-42의 3-8 아미노산 에피토프를 결합하는 항체는 Thr-Ser-Gly-Met-Gly-Val-Xaa(SEQ ID NO:27)의 중쇄 CDR1 아미노산 시퀀스를 가지고, 여기에서 Xaa는 어떠한 측쇄도 없거나 작은 측쇄(예를 들면, Ser, Gly 또는 Ala)를 가진 아미노산이거나 His-Ile-Xaa1-Trp-Asp-Asp-Asp-Lys-Xaa2-Tyr-Asn-Pro-Ser-Leu-Lys-Ser(SEQ ID NO:32)의 중쇄 CDR2 아미노산 시퀀스이고, 여기에서 Xaa1은 방향족 측쇄 그룹(예를 들면, Phe, Tyr 또는 Trp)을 가진 아미노산이고, Xaa2는 Ser, Arg 또는 Tyr이다. 또 다른 구체예에서 작은(<30 kDa) 집합체(즉, SEC peak1 및 peak2, 각각)에 대하여 큰(>50 kDa) ADDL 집합체에 대한 보통의 친화도를 가지는 항체는 Arg-Ser-Ile-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Pro-Glu-Asp-Tyr-Phe-Xaa5-Tyr(SEQ ID NO:42)의 중쇄 CDR3 아미노산 시퀀스를 가지고, 여기에서 Xaa1은 극성이고 대전되지 않은 측쇄 그룹(예를 들면, Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn 또는 Gln)을 가지는 아미노산이고, Xaa2는 하이드록시기 측쇄 그룹(예를 들면, Ser 또는 Thr)을 가지는 아미노산이며, Xaa3 및 Xaa4는 지방성의 측쇄 그룹(예를 들면, Ala, Val, Leu, Ile 또는 Pro)을 가지는 아미노산이다. 그리고, Xaa5는 Asp 또는 Ala이다.
본 발명의 항체 또는 항체 절편은 그것에 부착된 부가적인 모이어티를 가질 수 있다. 예를 들면, 미소구체 또는 극미립자는 참조에 의해서 본 명세서에 표시된 미국특허 제4,493,825호에서 나타나는 것처럼 항체 또는 항체 절편에 부착될 수 있 다.
더욱이, 본 발명의 항체 또는 항체 절편은 증가된 항원 친화도, 중립적 활성화도(즉, 뉴런 세포에 ADDLs의 결합을 차단하는 능력 또는 ADDL 복합체를 차단하는 능력) 또는 변경된 분리 상수를 위하여 변형되고 선택될 수 있다. 대장균의 변종들(Low, 외 다수. (1996) J. Mol. Bio1. 260:359-368), 체인 셔플링(chain shuffling)(Figini, 외 다수. (1994) supra) 및 PCR 돌연변이 생성은 핵산 분자 인코딩 항체를 변이시키기 위하여 형성된 방법이다. 실례로서 증가된 친화도는 적은 양의 바이오틴(biotin)이 부착된 항원을 가진 다량의 파지(phage) 항체를 접촉시키는 것에 의해서 선택될 수 있어서 항체들은 결합을 위하여 경쟁한다. 이러한 경우에 항원 분자들의 수는 파지 항체들의 수를 초과하여야 한다. 그러나 항원의 농도는 분리 상수보다 다소 낮아야 한다. 그러므로 증가된 친화도를 가진 현저하게 변이된 파지 항체들은 바이오틴이 부착된 항원에 결합하는 반면 더 약한 친화도의 파지 항체들의 더 많은 부분은 결합되지 않은 채 남아있다. 스트렙타비딘(streptavidin)은 더 높은 친화도를 가진 변이된 혼합물로부터의 파지 항체의 강화에 도움을 줄 수 있다(Schier, 외 다수. (1996) J. Mol. Biol. 255:28-43). 전형적인 친화도가 성숙된 경쇄 CDR3 아미노산 시퀀스는 Xaa1-Gln-Xaa2-Thr-Arg-Val-Pro-Leu-Thr(SEQ ID NO:316)의 경쇄 CDR3 아미노산 시퀀스를 포함하는 상세한 구체예를 가지고 본 명세서에서 보여주고 있고(표 11 및 12 참조), 여기에서 Xaa1은 Phe 또는 Leu이고, Xaa1은 Ala 또는 Thr이다.
몇몇 치료에 적용하기 위하여 항원으로부터 항체의 분리를 감소시키는 것은 바람직할 수 있다. 이것을 성취하기 위해서 파지 항체들은 바이오틴이 부착된 항원에 결합되고, 바이오틴이 부착되지 않은 다량의 항원은 첨가된다. 얼마 후 더 낮은 분리 상수를 가진 파지 항체들은 스트렙타비딘과 함께 획득될 수 있다(Hawkins, 외 다수. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-96).
본 명세서에서 보여준 것들을 포함하는 다양한 면역분석들은 ADDLs의 다차원 구조를 위한 바람직한 특성을 가지고 항체 또는 항체 절편을 인식하는 스크린(screen)을 위하여 사용될 수 있다. 경쟁적 결합, 라텍스(latex) 응집분석, 면역방사능측정 분석, 다클론 또는 단일클론항체 중 하나를 사용한 동역학, 또는 그에 대한 절편에 대한 수많은 프로토콜(protocol)들은 당업계에서 잘 알려져 있다. 상기 면역분석은 전형적으로 특정 항체 및 그 동종의 항원 사이에서 복잡한 구조의 측정을 포함한다. 두개의 개입하지 않는 에피토프에 반응하는 단일클론항체를 이용하는 단일클론에 기초를 둔 면역분석이 적합하나, 경쟁적 결합분석 또한 수행될 수 있다. 상기 분석은 또한 표본에 ADDLs의 다차원 구조의 검색에 사용될 수 있다.
항체 또는 항체 절편은 다른 생물학적 활동 분석 예를 들면, 뉴런이나 배양된 해마세포에 결합한 ADDL 결합의 치환 또는 ADDL 결합체의 차단으로 또한 종속될 수 있고, 이는 중립적 또는 약리학적 활동 및 예방 또는 치료원으로서의 잠재적 효능을 평가하기 위함이다. 상기 분석은 본 명세서에서 기술되어 있고, 당 기술분야에서 잘 알려져 있다.
항체 및 항체의 절편은 융합세포로 생산되고 유지될 수 있다. 또는 잘 설정된 발현시스템에서 선택적이고 재조합적으로 생산될 수 있다. 그러나 대장균, 효 모(예를 들면, Saccharomyces spp. 및 Pichia spp.), 바큘로바이러스(baculovirus), 포유류 세포(예를 들면, 골수종, CHO, COS), 이식 또는 이식유전자 동물(Breitling과 Dubel(1999) In: 재조합 항체, John wiley & Sons, Inc., NY, pp. 119-132). CDR 그래프팅 및 비니어링에 의해서 발생되고 인체에 적응된 4E2, 26D6, 20C2, 3B3, 2H4 및 1F6에 대한 카파 경쇄 변이영역 뿐만 아니라 IgG1 및 IgG2m4의 전형적인 핵산 시퀀스는 도 10A에서 10S까지에서 보여주고 있고, SEQ ID NOs:132에서 151까지 본 명세서에서 설명한다. 항체 및 항체 절편은 친화도 크로마토그래피, 면역글로불린 결합 분자(예를 들면 단백질 A, L, G 또는 H)를 포함하나 여기에 제한되지 않는 적합한 방식을 사용하여 분리될 수 있기 때문에 택(tag)은 항체 또는 항체 절편 등에 효과적으로 결합한다(예를 들면, His-tag, FLAG®-tag, Strep tag, C-myc tag). 상기 Breitling과 Dubel(1999)을 참조할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 절편은 ADDLs의 축적과 관련된 병의 진단, 뉴런세포에 ADDLs의 결합을 차단하거나 방해하는 것, ADDL 어셈블리의 차단, ADDLs와 관련한 병을 예방 또는 치료적으로 다루는 것, 뉴런에 ADDLs의 결합을 차단하는 치료 약제를 식별하는 것, 및 Ser202/Thr205에서의 타우 단백질의 인산화반응을 차단하는 것을 포함하는 다양한 용도를 가진다.
본 발명의 항체 및 항체 절편은 또한 뉴런세포에 ADDLs의 결합을 차단하거나 방해하는 것을 위한 방법에 유용성이 있다. 본 발명의 이러한 방법은 생체조건 내 또는 외에서 본 발명의 항체 또는 항체 절편과 뉴런을 접촉시키는 것에 의해서 수 행될 수 있고, 뉴런에 ADDLs의 결합은 차단된다. 상세한 구체예에서 본 발명의 항체 또는 항체 절편은 항체 또는 항체 절편의 부재에서 ADDLs의 결합에 비교할 때 ADDLs의 결합에 있어서 최소 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 97%의 감소를 성취한다. 항체가 뉴런에 ADDLs의 결합을 차단할 수 있는 단계는 본 명세서에서 보여주는 방법 즉, 면역세포화학나 세포에 기초한 알카라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 분석법 또는 다른 적합한 분석법에 따라서 결정될 수 있다. 특히 뉴런 세포에 ADDLs의 결합력을 감소시키기 위해서 특히 유용한 항체들은 전형적인 20C2, 3B3, 1F4, 1F6, 4E2, 2B4, 2D6, 2H4 단일클론 항체를 포함한다.
본 발명의 항체 및 항체 절편은 ADDLs의 어셈블리를 차단하거나 방해하기 위한 방법에서 더 유용하다. 상기 방법은 본 발명의 항체 또는 항체 절편을 가진 아밀로이드 β 1-42를 포함하는 샘플을 접촉시켜 ADDL 어셈블리가 차단되는 것을 포함한다. 항체가 ADDLs의 어셈블리를 차단할 수 있는 단계는 본 명세서에서 보여주는 방법 즉, FRET이나 형광 분극화 또는 다른 적합한 분석법에 따라 결정될 수 있다. ADDLs의 어셈블리를 차단하기 위해서 특히 유용한 항체는 전형적인 1F4, 20C2, 4C2, 1F6, 2B4, 5F10, 2A10 및 2D6 항체를 포함한다.
본 명세서에서 보여주는 항체는 Ser202/Thr205에서의 타우단백질의 인산화반응을 차단하기 위한 방법으로 또한 유용하다. 이러한 방법은 본 발명의 항체 또는 항체 절편을 가진 타우 단백질을 포함한 샘플과 접촉하여 뉴런에 ADDLs를 결합하는 것은 차단되고 결국 타우 단백질의 인산화반응을 차단하는 것을 포함한다. 항체가 Ser202/Thr205에서의 타우 단백질의 인산화반응을 차단할 수 있는 단계는 본 명세서에서 보여주는 방법 또는 다른 적합한 분석법에 따라 결정될 수 있다.
뉴런에 ADDLs의 결합을 차단하거나 감소시키는 것, ADDLs의 어셈블리를 차단하는 것, 그리고 Ser202/Thr205에서의 타우 단백질의 인산화반응을 차단하는 것 모두는 ADDLs의 축적과 관련된 병을 예방 또는 치료적으로 취급하는 방식에 적용을 발견하게 된다. 따라서 본 발명은 또한 ADDLs의 축적과 관련된 병(예를 들면 알츠하이머병 또는 유사한 기억관련 질환)을 막거나 치료하기 위해서 본 발명의 항체 또는 항체 절편의 사용을 포함한다. 치료를 받을 수 있는 환자들은 현재 증상을 나타내는 환자뿐만 아니라 병의 위기 상황이지만, 증상을 나타내지 않는 개인도 포함한다. 알츠하이머병의 경우에 만약 충분히 오래 생존한다면 사실상 알츠하이머병으로부터 고통을 받는 위험에 처한다. 그러므로 본 발명의 항체 또는 항체 절편은 대상 환자의 위험의 판단에 대한 필요가 없는 일반인에게는 예방목적으로 저장될 수 있다. 본 방법은 특히 알츠하이머병의 알려진 유전적 위험을 가지는 개인들에게 특히 유용하다. 상기 개인들은 상기 병으로 진단받은 관련성을 가진 사람들 및 병이 유전적이거나 생화학적 표지 분석에 의해서 결정된 사람들을 포함한다. 알츠하이머병의 유전표지는 APP 유전자에서의 변이, 특히 717 포지션(position) 및 각각 Hardy와 Swedish 돌연변이로 언급되는 670과 671 포지션에서의 돌연변이를 포함한다. 위험의 다른 표지들은 프리세닐린(presenilin) 유전자, PS1 및 PS2, 그리고 Apoe4에서의 돌연변이, 알츠하이머병의 가족히스토리, 과다콜레스테롤 또는 아테롬성 동맥 경화증 등이다. 알츠하이머병으로 현재 고통을 받고 있는 개인들은 상술한 위험요소의 존재뿐만 아니라 특징적 치매로 인식될 수 있다. 부가적으로, 많은 진단 테스트는 알츠하이머병을 가진 개인들을 식별하기 위해서 이용될 수 있다. 이러한 것들은 CSF tau 및 Aβ1-42 레벨의 측정을 포함한다. 알츠하이머병으로부터 고통을 받는 개인들은 또한 ADRDA 기준 또는 본 명세서에서 보여주는 방법에 의해서 진단받을 수 있다.
징후가 있는 환자에게 있어서, 치료는 어떠한 나이(예를 들면, 10, 20, 30세)에도 시작할 수 있다. 그러나 보통 환자가 40, 50, 60 또는 70세에 도달할 때까지 치료를 하는 것은 불필요하다. 치료는 전형적으로 일정 기간동안 다량의 약을 복용하는 것을 수반한다. 치료는 기간에 걸쳐서 ADDLs의 존재를 위한 분석에 의해 모니터할 수 있다.
치료의 적용에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 절편을 포함하는 의약 조성물 또는 의약은 병의 발전에서 자체의 복잡성 및 간헐적 병리학적 표현형을 포함하여 병의 징후(생화학적, 조직적 및/또는 행동적)를 치료하거나 최소한 특히 차단하기에 충분한 양인 ADDLs의 축적과 관련된 병으로 의심받거나 이미 고통을 받는 환자들에게 처방될 수 있다. 예방적 용도에 있어서, 본 발명의 항체 또는 항체 절편을 포함하는 약제 조성물 또는 의약은 병의 발전기 동안에 나타나는 생화학적, 조직적 및/또는 행동적 증상들, 자체 복잡성 및 병의 간헐적 병리학적 실제표현형을 포함하여 환자 내의 수동적 면역을 성취하는데 충분한 양인 ADDLs의 축적과 관련된 병에 민감하거나 그렇지 않더라도 위험에 있는 환자에게 처방되어서 위험을 제거 또는 감소시키거나 고통을 완화시키거나 또는 병의 발단을 늦추게 한다. 일부 방법에 있어서, 약품의 투여는 특징적인 알츠하이머병의 병리현상을 아직 발전시키지 않은 환자들에서 근육인식 장애를 감소하거나 제거한다. 상세한 구체예에서 본 발명의 항체 또는 항체 절편의 효과적인 양은 치료가 없을 때 ADDLs의 결합에 비교해서 환자 내의 뉴런에 ADDLs의 결합에서의 최소한 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 97% 감소를 성취하는 양이다. 상기한 바와 같이 장기 약효증가/기억 형성의 장애는 감소하게 된다.
상기 상태의 치료를 위해서 본 발명의 조성물의 효과적인 복용양은 투여 수단, 환자의 육체적 상태, 환자가 인간인지 동물인지 여부, 다른 의약들이 처방되는지 여부 및 치료가 예방 목적인지 치료 목적인지 여부 등 많은 다른 인자들에 의존하기 때문에 다양하다. 일상적으로 환자는 인간이나 개나 이식유전자의 포유류와 같은 비인간 포유류도 또한 치료될 수 있다.
치료 복용량은 일반적으로 안정성과 효율을 최적화하기 위하여 적정된다. 항체 또는 항체 절편을 가지는 수동적 면역에 대하여 복용 범위는 숙주의 체중에 대해서 약 0.0001에서 100 ㎎/㎏이고, 더 일반적으로는 0.01에서 5 ㎎/㎏이 적합하다. 예를 들면, 복용량은 체중당 1 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏ 또는 1-10 ㎎/㎏의 범위 내이다. 전형적인 치료 투약계획은 2주당 1회 또는 한달에 1회 또는 3달에서 6달에 1회의 처방을 한다. 일부 방법에서 다른 결합 특이성을 가진 발명의 둘 또는 그 이상의 항체는 동시에 처방되고, 이 경우 처방된 각 항체의 복용량은 지정된 범위내로 떨어지게 된다. 항체는 보통 여러번에 걸쳐서 처방되고, 여기에서 일회 복용의 간격은 주, 달 또는 년이 될 수 있다. 간격은 또한 환자 내의 ADDLs에 항체의 혈액 수치를 측정하는 것에 의해서 나타나는 것처럼 불규칙적이다. 일부 방법에서 복용량은 1-1000 ㎍/㎖의 플라스마 항체 농도를 성취하도록 조정되고, 다른 일부 방법에서는 25-300 ㎍/㎖의 농도를 성취하도록 조정된다. 대체적으로 항체 또는 항체 절편은 서방출성 형태로 처방될 수 있고, 상기 경우에 있어서 빈번하지 않은 처방이 요구된다. 복용량 및 빈도는 환자 내의 항체의 반감기에 의존하여 변화한다. 일반적으로 인간 및 인간화 항체는 키메라 항체 및 비인간 항체보다 더 긴 반감기를 갖는다. 상기한 바와 같이 처방의 복용량 및 빈도는 치료가 예방 목적인지 또는 치료 목적인지에 의존하여 변화한다. 예방적 용도에 있어서, 비교적 낮은 복용량은 긴 기간에 걸쳐서 비교적 빈번한 간격으로 처방된다. 일부 환자들은 잔여 생명을 위해서 지속적인 치료를 받는다. 치료적 용도에 있어서, 병의 진전이 감소하거나 종료할 때까지 그리고 바람직하게는 환자가 병의 징후의 부분적인 또는 완전한 개선을 보여줄 때까지 비교적 짧은 간격으로 비교적 높은 복용량이 때때로 요구된다. 그 후에 환자는 예방적인 투약계획을 처방받을 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 절편은 약제 조성물 또는 의약의 성분으로 처방될 수 있다. 약제 조성물 또는 의약은 일반적으로 활동적인 치료 약제 및 다양한 다른 약제학적으로 수용 가능한 요소를 포함한다. Remington: 과학과 약학의 실제, Alfonso R. Gennaro, editor, 20th ed. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000을 참조할 수 있다. 선호되는 형태는 처방 및 치료용도의 의도되는 방식에 의존한다. 바람직한 계통적 서술에 의하면 약제학적 조성물은 약제학적으로 수용 가능하고 무독성의 보균자 또는 희석액을 포함할 수 있고, 동물 또는 인간의 처방을 위한 약제학적 조성물을 제제화하여 일반적으로 사용되는 운반체로 정의된다. 희석액은 조합의 생물학적 활동에 영향을 주지 않기 위해서 선택된다. 상기 희석액의 예는 증류수, 인산염 완충 생리식염수, 링거액, 덱스트로스가 함유된 용액, 및 행크스 솔루션(Hank's solution)이 있다.
약제학적 조성물은 또한 단백질과 같은 크고 느린 물질대사를 하는 거대분자, 키토산과 같은 다당류, 폴리락트산(polylactic acid), 폴리글리콜 산(polyglycolic acid) 및 코폴리머(예를 들면 라텍스 기능화된 SEPHAROSE™, 아가로스(agarose), 셀룰로오스, 및 이와 유사한 물질들), 폴리머 아미노산, 아미노산 코폴리머, 및 지질 복합체(예를 들면 오일 드랍렛(oil droplets) 또는 리포솜(liposomes))를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물 또는 의약의 처방은 경구복용, 국소요법, 폐 흡입, 직장투여, 피하주사, 피내주사, 비강 내 주입, 두개주입, 근육 내 주입, 안구 내 주입, 또는 관절 내 주입 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 경로를 통하여 수행될 수 있다. 비록 다른 경로가 동등하게 효과를 발생하기는 하지만, 처방의 가장 전형적인 경로는 피하주사에 의하여 수행되는 것이다. 근육 내 주사 또한 팔 또는 다리 근육에서 수행될 수 있다. 일부 방법에 있어서, 병원체는 침전물이 축적된 특별한 조직 내로 직접 주입되고, 예를 들면 두개 주입이 이에 해당한다. 일부 구체예에서 항체 또는 항체 절편은 두개골 내로 직접 주입된다. 다른 구체예에 있어서, 항체 또는 항체 절편은 서방출성 조성물 또는 MEDIPAD™ 장치와 같은 장 치로 투약된다.
비경구의 투약을 위해서 본 발명의 항체 또는 항체 절편은 물, 오일, 식염수, 글리세롤, 또는 에탄올과 같은 무균의 액체가 될 수 있는 약제학적 운반체로 생리적으로 적용 가능한 희석액에서의 주입할 수 있는 복용약 또는 현탁액으로 투여될 수 있다. 부가적으로 습식의 또는 유상화된 병원체, pH 완충물질 및 이와 유사 물질들과 같은 보조 물질들은 조성물에 존재할 수 있다. 약제학적 조성물의 다른 성분들은 원유, 동물성, 식물성 또는 합성된 물질, 예를 들면 땅콩기름, 콩기름, 및 석유 성분이다. 일반적으로 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜들은 특히 주입할 수 있는 용액에 대하여 적합한 액체 운반체이다. 항체는 데포 주사(depot injection) 또는 이식 준비의 형태로 투여될 수 있고, 전형적인 조성이 5 ㎎/㎖로 항체를 포함하는 서방출성의 활동적 구성요소를 허락하기 위해서 상기 방식으로 제제화될 수 있으며, 50 mM L-히스티딘, 150 mM NaCl로 구성된 수용액 완충액으로 제제화되며, HCl로 pH 6.0으로 적정된다.
전형적으로, 조성물은 액체 용액 또는 현탁액; 용액에 적합한 고체형태 또는 부유물과 같은 주입할 수 있는 물질로 준비되고, 주사 전 단계의 액체 운반체 또한 준비 가능하다. 준비는 또한 리포솜 또는 폴리락티드(polylactide), 폴리글리콜라이드, 또는 향상된 운반성을 위한 코폴리머와 같은 미세 입자들로 유상으로 또는 캡슐로 제작될 수 있다.
좌약에 있어서, 바인더(binder) 및 운반체는 예를 들면, 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol) 또는 트리글리세리드(triglyceride)를 포함한다. 상기 좌 약은 0.5 %에서 10%의 범위 또는 더욱 바람직하게는 1 %에서 2 %로 활동적인 구성요소를 포함한 혼합물로부터 형성될 수 있다.
경구제제는 마니톨(mannitol), 락토오스(lactose), 녹말, 마그네슘 스테아르산염, 소듐 삭카라이드(sodium saccharide), 셀룰로오스 및 마그네슘 카보네이트(magnesium carbonate)와 같은 첨가제를 포함한다. 상기 조성물들은 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 서방출성 제제 또는 가루의 형태를 가지고, 활동적인 구성요소의 10 %에서 95 %, 더욱 적합하게는 25 %에서 70 %를 포함한다. 국소적인 사용은 피부를 통한 또는 피부 내부의 전달이 될 수 있다. 국소적인 투여는 콜레라독성 또는 독이 제거된 유도체 또는 그것에 관한 서브유닛(subunit) 또는 다른 유사한 박테리아 독성(Glenn, 외 다수.(1998) Nature 391:851)을 가진 병원체의 병용투여에 의해서 촉진될 수 있다. 병용투여는 혼합물로 또는 퓨젼 단백질로 화학적 교차 또는 발현에 의해서 얻어진 연관 분자들로 상기 성분들을 사용하는 것에 의해서 성취될 수 있다.
대체적으로, 피부를 통한 전달은 피부통과 또는 트랜스퍼로솜(transferosome)을 사용하는 것으로 성취될 수 있다(Paul, 외 다수. (1995) Eur. J. Immunol. 25:3521-24; Cevc, 외 다수. (1998) Biochem. Biophys. Acta 1368:201-15).
본 발명의 항체 또는 항체절편은 아밀로이드증 질환의 치료에 최소한 부분적으로 효과가 있는 다른 병원체들을 가진 조합으로 선택적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 절편은 또한 뉴런에서 ADDLs의 결합을 차단하는 치 료 용도의 병원체의 식별에서의 사용을 발견하게 되고(예를 들면, 해마세포), 결국 ADDLs에 나타나는 하향 이벤트를 차단하게 된다. 상기 분석은 병원체의 존재 내에서의 뉴런에 ADDLs의 결합을 결정하기 위해서 병원체의 존재 내에 ADDLs와 뉴런을 접촉시키고, 본 발명의 항체 및 항체 절편을 사용하는 것에 의해서 수행된다. 당업자에 의해서 이해될 수 있듯이, 뉴런에 ADDLs의 결합을 차단하는 병원체는 병원체와 접촉되지 않은 뉴런에 비유하는 것처럼 뉴런에 결합된 ADDLs의 양을 감소시킬 것이고, 본 발명의 항체 및 항체 절편에 적용하는 면역분석에서 감지할 수 있는 양이다. 뉴런에 결합한 ADDLs를 감지하기 위한 적합한 면역분석은 본 명세서에서 보여준다.
비록 전형적으로 유기분자들이고, 바람직하게는 100 이상 약 2,500 달톤(dalton) 이하의 분자무게를 가지는 작은 유기 혼합물이지만 본 명세서에서 제공된 방법을 사용하여 차단될 수 있는 병원체들은 많은 화학종들을 포함한다. 병원체들은 단백질, 특히 수소결합을 가진 구조적 상호반응을 위해 충분한 기능성 그룹을 포함하고, 전형적으로 최소한 아민, 카르보닐, 하이드록실, 또는 카르복실 그룹을, 바람직하게는 최소한 두 개의 기능성 화학그룹을 포함한다. 병원체들은 종종 상기 기능성 그룹의 하나 또는 그 이상과 대체된 고리식 탄소 또는 이종고리식 구조 및/또는 방향족 또는 다방향족 구조들을 포함한다. 병원체들은 또한 펩티드, 항체, 삭카린, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 구조적 상사기관 또는 그것에 관한 조합을 포함하는 생분자들 사이에서 발견될 수 있다. 병원체들은 천연 또는 합성 분자들의 도서관을 포함한 광범위한 자원으로부터 얻어질 수 있다.
염 및 중성 단백질과 같은 다양한 다른 반응물들은 선별분석에 포함될 수 있다. 또한, 프로테아제 반응억제제, 뉴클레아제 반응억제제, 항균성의 병원체 및 이와 유사한 물질들과 같은 분석의 효능을 다른 방법으로 향상시키는 반응물은 사용될 수 있다. 조성물의 혼합물들은 적합한 결합을 위해서 제공하는 순서로 부가될 수 있다.
본 발명의 선별분석에 의해서 식별되는 병원체들은 아밀로이드증 질환 및/또는 전두측두 치매증의 치료를 위해서 유용할 것이다. 부가적으로, 이러한 개념을 실증하는데 사용된 실험 시스템들은 평가, 식별 및 타우 인산화반응의 아밀로이드 베타의 도입과 연관된 신약 타겟(target)의 선별을 위한 연구 도구들을 나타낸다.
본 발명은 또한 ADDLs를 검출하고, 본 발명의 항체 또는 항체 절편을 사용하여 ADDLs의 축적과 연관된 병을 진단하기 위한 방법을 제공한다. ADDLs의 축적과 연관된 병은 ADDLs의 축적이 장기 약효증가/기억 강화의 생리학적 장애를 초래하는 불특정 질환을 포함하기 위한 것이다. 이러한 타입의 질환들은 알츠하이머병 및 유사한 기억과 연관된 장애를 포함하나 여기에 제한되는 것은 아니다.
이러한 방법에 따라서 환자로부터의 샘플은 본 발명의 항체 또는 항체 절편과 접촉하고, 상기 샘플에 항체 또는 항체 절편의 결합은 샘플내의 ADDLs의 존재를 나타낸다. 본 발명의 배경에서 사용되듯이 샘플은 면역분석을 사용하는 분석을 할 수 있는 액체 또는 조직을 의미하는 것이다. 본 발명의 방식에 따라서 분석될 수 있는 적합한 샘플들은 환자(예를 들면 인간과 같은 포유류)로부터 뇌의 생체검사 샘플 및 액체 샘플을 포함하나, 여기에 제한되는 것은 아니다. 생체조건 외에서의 목적에 대해서(예를 들면 올리고머 형성을 관찰하는 분석으로) 샘플은 중성세포 라인 또는 조직 샘플일 수 있다. 진단의 목적에 대해서 샘플은 ADDLs의 축적과 연관된 질환을 갖는 것으로 의심되거나 ADDLs의 축적과 연관된 질환을 가질 위험이 있는 개인, 예를 들면 ADDLs의 축적과 연관된 질환에 개인이 걸리기 쉬운 가족사를 가진 개인으로부터 얻을 수 있다고 예상된다.
샘플에서 ADDLs에 항체 또는 항체 절편의 결합을 검출하는 것은 기본적인 면역분석(예를 들면 본 명세서에서 나타난 바와 같이)을 사용하여 수행될 수 있고, 또는 선택적으로 항체 절편이 예를 들어 펩티드 압타머 이면 결합은 예를 들어 압타머에 용해된 검출할 수 있는 표지단백질(예를 들면 β-갈락토시다아제(galactosidase), GFP 또는 루시페라제(luciferase)에 의해서 직접 검출될 수 있다. 그 후에 ADDL-항체 복합체의 존재 또는 부재는 각각 샘플 내의 ADDLs의 존재 또는 부재 및 각각 ADDLs의 축적과 연관된 질환의 존재 또는 부재와 관련된다. 본 발명의 하나 또는 그 이상의 항체 또는 항체 절편은 ADDLs의 축적과 관련된 병의 탐지와 진단을 크게 향상시키기 위해 현재의 비침해성(non-invasive) 면역-기반 영상 기술과 연결하여 사용될 수 있다고 예상된다.
진단을 쉽게 하기 위해 본원발명은 인스턴트발명(instant invention)의 항체나 항체 조각을 갖는 키트(kit)에 포함된다. 키트는 다차원 형태의 ADDL들을 인식할 수 있는 하나 또는 그 이상의 항체 또는 항체조각들을 갖는 수용체(container)와 항원-항체 복합물을 형성하기 위해 ADDL에 항체를 결합하고, 항원-항체 복합물의 형성을 감지하기 위한 항체 사용에 관한 지시(instructions)가 포함되어 있어서 항원-항체 복합물의 존부와 샘플에서의 ADDL들의 존부가 서로 관련지어진다. 수용체(containers)의 실시예들은 다수 샘플들에서의 동시적인 ADDL의 감지가 가능한 멀티웰 플레이트(multiwell plates)를 포함한다.
이 발명은 다음 실시예에 의해 상세하게 설명되어 있으며, 실시예는 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1: 일반적인 재료와 방법
ADDL 조제. F12 배지(Biosource, Camarillo, CA)에서 ADDL은 확립된 방법(Lambert, 외 다수. (2001) supre)에 따라 Aβ1-42로부터 조제되었다. 짧게 말하면, 10 ㎎/㎖의 펩티드 농도를 만들기 위해 Aβ1-42 펩티드(Amerian Peptide Co., Sunnyvale, CA 또는 California Peptide Research, Inc., Napa, CA)는 무게가 측정되었고 충분한 양의 HFIP(1, 1, 1, 3, 3, 3-헥사플루오로-2-프로판올)를 담을 수 있는 유리병에 넣어졌다. HFIP는 건조된 펩티드에 첨가되었고, 유리병은 마개가 씌어지고, 혼합하기 위해 흔들고, 펩티드/HFIP 용액은 실온에서 적어도 한 시간 놓아두었다. 펩티드 용액의 나뉜 각 부분(50 또는 100 ㎕, 0.5 또는 1.0 mg, 각각)은 일련의 원뿔형 원심분리기 튜브에 넣어졌다. HFIP를 제거하기 위해 그 튜브들은 밤새 스피드백(speedvac)에 넣어졌다. 건조된 펩티드 막(film)을 포함하는 튜브는 마개가 씌어지고 건조제와 함께 봉인된 용기 내에서 -70℃에서 보관되었다.
사용에 앞서, Aβ1-42 펩티드 막은 -70℃의 저장소에서 빼내고, 실온까지 되 도록 놓아두었다. 신선한 DMSO(44 L/mg 펩티드 막; 5 mM)가 첨가되었고 펩티드/DMSO 혼합물은 소용돌이혼합기에서 가능한 낮은 속도로 10분간 배양되었다. F12 배지(2 mL/mg 펩티드)는 각 DMSO/펩티드 튜브에 넣어졌고 튜브는 마개가 씌어지고 거꾸로 하여 혼합된다. 100μM로 조제된 것은 2-8 ℃에서 18-24시간 동안 보관된다. 그 샘플들은 10분간 2-8 ℃에서 14,000 x g로 원심 분리되었다. 표면에 뜨는 물질(상청액)은 깨끗한 튜브에 옮겨지고 사용 전까지 2-8 ℃에서 보관되었다.
바이오티닐레이티드 ADDL (bADDLs)는 100 % N-말단 바이오티닐레이티드 아밀로이드 베타 펩티드(N-terminal biotinylated amyloid beta peptide, American Peptide Company, Sunnyvale, CA)를 사용하여 위에서 기술한 ADDL 조제방법으로 조제하였다.
ADDL 피브릴(fibril) 조제. 실온의 ADDL 펩티드 막에 펩티드 1mg 당 10 mM의 염산 2mL이 첨가된다. 용액은 소용돌이 혼합기에서 5 내지 10분간 가능한 낮은 속도로 혼합시켰고, 그 결과인 시약은 사용 전에 37℃에서 18 내지 24시간 보관되었다.
단위체 제조. 아밀로이드 베타 (1-40) 펩티드 (Aβ1-40) 의 HFIP 건조된 시약은 Aβ(1-42) 펩티드에 대한 설명된 대로 제조되었다. 펩티드 막은펩티드 1mg 당 25mM의 붕산염 완충액(borate buffer, pH 8.5) 2mL에서 용해되었고 사용 전에 나누어서 -70℃까지 냉동시켰다.
인간 피브릴 제조. 냉동된 인간 피질에서 얻은 샘플은 20X 차가운 F12 배지 에서 프로테아제 억제제(COMPLETE®, Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)와 함께 1분간 균질화되었다. 그리고 그 샘플은 1시간동안 4℃에서 10,000 x g로 원심 분리되었다. F12로 두 번 씻은 후에 그 펠렛(pellet)은 2 %의 SDS/F12에서 재현탁되고(resuspended), 얼음 위에서 30분간 배양되었다. 그 샘플은 1시간동안 4℃에서220,000 x g로 원심분리되었다. 그 펠렛은 차가운 F12에서 재현탁되고, 15-초 버스트(15-second bursts)에서 1분간 초음파 처리되었다. 단백질은 COOMASSIE PLUSTM 키트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)를 이용해 측정하였다.
면역. 결과물인 녹을 수 있는, 여기서는 "합성" ADDL로 지칭되는, Aβ 올리고머는 완전한 Freund's 보조제 (처음과 두 번째 접종) 또는 불완전한 Freund's 보조제(다음에 연속하는 모든 접종)와 1:1로 혼합되었고 쥐 1마리당 ∼1mL에 해당하는 총 용량으로 3마리의 쥐에 피하에(처음 두 번의 접종) 또는 복강 내에 주사되었다. 각 주사는 194 ± 25 ㎍ 전체 단백질에 해당하는 순수한 ADDL로 이루어졌다. 쥐들에게는 대략 매3주 마다 주사되었다. 6번의 주사 후에 1마리는 죽었고, 그것의 비장은 냉동되었다. 높은 적정 혈청(titer serum)을 가진 쥐의 비장은 폴리에틸렌 글리콜 존재 하에서 SP2/0 골수종 세포와 융합되었고 6개의 96-well 플레이트에 넣어졌다. 그 세포는 HAT 선택(selectin) 배지 200㎕에서 10일 동안 37℃에서 5%의 CO2와 함께 배양되었으며, 이 배지는 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), 1㎍/mL HYBRIMAX®(아자세린-하이포크산틴; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), SP2/0 세포 배양으로부터 수집된 30% 조절된 배지(media)로 보충된 ISCOV 배지로 이루어진다. 10일 날에는 10% FBS로 보충된 ISCOV 배지가 배양된 것에 공급되며, ELISA에서 양성 웰(positive well)을 위한 스크린을 하기 위해 14일 날에는 상청액을 제거하였다. 양성(positive) 배양된 것은 웰(well)당 0.3 세포의 확률을 가지는 희석으로 제한함으로써 더 클론(clone)되어졌다. 양성클론은 ELISA에서 확인되었고 더 증량되었다.
상청액을 스크리닝하는 것은 다섯 가지 분석을 포함한다.: 점 블롯(dot blot)과 웨스턴 이뮤노블롯(western immunoblot, Lambert, 외 다수. (2001) supra), 합성 ADDL을 이용하는 천연 이뮤노블롯(a native immunoblot), 인체 조직으로부터 얻어진 내부 원섬유를 사용하는 점 블롯과 웨스팅 블롯. 이 분석은 항체의 ADDL에 대한 결합을 측정하였고(점 블롯) 가장 높은 친화도를 갖는 올리고머를 확인하였다(웨스턴). 모든 항체들은 5 pmole ADDL을 사용하는 점 블롯에서 테스트되었다.(첫 융합에서 576 상청액(supernates)과 두 번째에서 1920 상청액(supernates)). 양성 판정된 상청액들은 10-20 pmole ADDL에서 웨스턴 블롯을 사용하여 스크린되었다. 그 스크린은 낮은 양성과 거짓양성(low positive and false positive)을 확인하기 위해 반복되었다. 첫 번째 쥐를 위해 10 웰이 증량하였고(expanded), 두 번째 쥐를 위해 45 웰이 증량하였다. 증량된 세포는 냉동되거나 아클론되었다(subcloned).
단일 클론성 항체를 포함하는 복수(ascites)는 표준 프로토콜(Current Protocol of Molecular Biology)을 이용하여 암컷 balb/c 쥐들 속에서 생성된다. 간단히 말하면, 쥐들은 0.5 mL 의 프리스테인(pristane)의 복강내 주사에 의해 준비된다(primed). 프라이밍(priming)다음 1주일 후, 쥐들에게 1mL의 인산염완충식염수(PBS)안의 대략 5× 106의 하이브리도마 셀들을 복강 내로 주사하였다. 복수는 10 내지 14일 후 수집되었다. IgG의 정제는 BIO-RAD® AFFI-GEL® 단백질 A MAPS® II 키트를 그 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 이루어졌다. 각각의 실행에서 3mL의 복수는 제염칼럼을 통과하고 4mL 결합 완충액(binding buffer)으로 세척함으로써 제염하였다. 그 후 그 샘플은 단백질 A 칼럼에 적용되었다. 40mL의 결합 완충액으로 세척한 후, 그 칼럼은 용출완충액으로 용출되며(eluted) 5mL의 프랙션(fraction)이 수집되었다. 샘플들은 10 N의 NaOH 60 μL의 첨가에 의해 중화된다. 완충액을 PBS로 교환하기 위해 샘플들은 2차 제염 칼럼에 적용되고 PBS로 용출된다.
조절 항체. 다클론성 항체 M71/2와 M90/1은 Bethyl Laboratores, Inc.(Montgomery, TX)로부터 얻어졌다. 항-Aβ 단일클론 항체 6E10(잔여물 1-17에 대해 증가된,raised against residuses 1-17)과 4G8(잔여물 17-24에 대해 증가된, raised against residuses 17-24)은 Signet Labs(Dedham, MA)로부터 얻어졌다. 단일클론 항체인 WO-2는 해당 기술분야에서 웨스턴 블롯 분석을 통해 1-40 과 1-42를 인식하는 능력이 잘 알려져 있다.(Ida, 외 다수. (1996) J. Biol. Chem. 271: 22908-22914). 단일클론 항체 BAM-10(Aβ1-40에 대항하여 증가된)은 ABCAM® (Cambridge, MA)으로부터 얻어졌다. 단일 클론성 항체 26D6은 해당 기술 분야에서 Aβ시퀀스의 아미노산 1-12를 인식하는 능력이 잘 알려져 있다.(Lu, 외 다수. (2000) Nat. Med. 6:397-404).
이뮤노블롯 분석. 소디움 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)은, 10-20%의 트리스-트리신 겔(Tris-Tricine gels, BIO-RAD® ,Hercules, CA)이 사용되고 120 V에서 분리가 행해졌다는 점을 제외하고는, 확립된 방법을 사용하여 실시하였다(Lambert, 외 다수. (2001) supra). 겔은 표준방법에 따라 이동되었고 2차 항체는 1:40,000의 묽기로 관용적으로 사용되었다.
시작 스크리닝에서, ∼16-20 pmol/lane에 상당하는 2.7 ㎍ ADDL는 2차원(2D) 4-20 % 겔에서 분리되었다. 전기영동과 이동은 위와 같다. 추적색소를 가이드로 사용하여, 니트로셀룰로오스는 서프-블롯 기구(Surf-blot apparatus, Idea Scientific, Minneapolis, MN)에 넣어졌고, TWEENTM 20 (TBS-T; Lambert 외 다수. (2001) supra)을 갖는 트리스-완충 식염수안의 5% 탈지분유로 이루어진 블락킹(blocking)완충액과 혼합된 200 μL의 하이브리도마 상청액이 20-21웰 각각에 첨가된다. 실온에서 1.5시간동안 흔들며 배양한 후에 상청액은 웰에서 제거되며 웰은 200 μL의 블락킹 완충액으로 세척된다. 막은 서프-블롯 기구에서 제거되었고 TBS-T에서 3 x 15분 세척되었다. 2차 항체(엔티-마우스(anti-mouse), IgG 컨쥬게이티드 -HRP, 1:40,000; Molecular Probe, Eugene, OR)는 막과 함께 실온에서 1시간동안 배양되었다. 세척(3 x 15분) 후 올리고머는 절반-세기 SUPERSIGNAL® (Pierce, Rockland, IL)로 시각화 된다. 인체 원섬유를 사용하는 웨스턴 이뮤노블롯은 각 2D SDS-PAGE 이뮤노블롯의 대략 64 ㎍ 의 인체 원섬유 조직을 사용하는 방법과 동일한 방법으로 실행되었다.
천연 폴리아크릴아미드 겔 영동은, 분리가 120V에서 이루어진 것을 제외하고, 확립된 방법(Cromy, 외 다수. (2003) 생화학 42: 12749-12760)에 의해 실행되었다.
웨스턴 블롯. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스로 이전된다. 블롯은 5% 탈지 분유 또는 TBS-T(0.1% TWEENTM 20을 가진 TBS)안의 1% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 막혔고, 주요 항체로 1시간 동안 배양되고, 세척되었고, 호스래디쉬 퍼옥시다제(horseradish peroxidase) (HRP)-컨쥬게이티드 이차 항체(Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)를 배양하였다. 마지막 세척 후 단백질은 웨스트 펨토 케미루미네슨스(Femto chemiluminescence) 키트(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)와 KODAK® 이미지 스테이션 440 CF 또는 필름(HYPERFILMTM, Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ)에 의해 시각화 된다.
해마 배양(Hippocampal Cultures). 배양은 표준방법으로 E18배아에서 조제된다(Brewer (1997) J. Neurosci. Methods 71:143-155; Stevens 외 다수. (199) J. Neurosci. Res. 46:445-455). 생존 가능한 세포수가 세어지고 1.5 x 104-106 cells/㎠농도의 폴리라이신(200 ㎍/mL)으로 코팅된 커버슬립위에 놓여졌다. 그 배지는 그 절반을 제거함으로써 변화되었고 그것을 보충된 NEUROBASALTM로 대체되었다.
주요 뉴런. 주요 해마 배양은 냉동되고 분리된 갓 태어난 쥐의 해마 세포(Cambrex, Corp., East Rutherford, NJ)로부터 조제되었고, 그 세포는 해동되고 하나의 웰에 20,000 세포정도의 농도로 96-웰 COSTAR® 플레이트에 넣어졌다. 그 세포들은 L-글루타민(GIBCO-BRLTM,, Gaithersburg, MD)없이 NEUROBASALTM에서 유지되었고, 2주의 기간동안 B27(GIBCO-BRLTM,, Gaithersburg, MD)로 보충되었으며 결합연구를 위해 사용되었다.
B103 세포들. B103 뉴로블라스토마 세포주(cell line)(Schubert 와 Behl (1993) Brain Res. 629:275-82)는 페놀 레드(GIBCO-BRLTM,, Gaithersburg, MD)없이 DMEM 안에서 10%의 FBS(Hyclone, Logan, UT)와 1%의 펜-스트렙(Pen-Strep)(GIBCO-BRLTM,, Gaithersburg, MD)의 존재 하에서 성장되었다. 기하급수적으로 성장하는 B103 세포들은 분리되고, 5,000 cells/well의 농도로 96-웰 CORNING® 플레이트에 넣어졌다. 접시에 담긴 지 24시간 후,그 세포들은 상업적이고 새로운 항-ADDL 모노클론 항체를 특징지을 뿐 아니라 ADDL과 bADDL의 결합을 평가하기 위해 사용되었다.
점 블롯 분석. 점 블롯은 Lambert, 외 다수.((2001), supra)에 따라 ADDL이나 원섬유를 니트로셀룰로오스에 적용하여 실시되었다 최근의 점 블롯의 경우, ADDL은 서프-블롯(surf-blot)기구에서 유도된 주형(template)를 사용하여 여러 가지 p몰농도의.0.5 μL에서 건조된 두(in duplicate) 니트로셀룰로오스에 적용되었다. 샘플들은 15분간 건조되었고, 차단 완충액으로 1시간동안 차단되었고(blocked), 적어도 1시간동안 미리 배양된 펩티드를 더해지거나 혹은 빼진 항체로 1.5시간동안 배양되었다. 그 용액은 서프-블롯 기구로부터 제거되었고, 웰들은 차단 완충액으로 세척되었고, 그리고 막들은 기구로부터 제거되었다. 니트로셀룰로오스는 세척되었고, 위에서 지시한대로 시각화되었다.
면역세포화학. 면역세포화학은 2차 항체가 ALEXAFLUOR® 588(Molecular Probes, Eugene,OR)에 결합되었다(conjugated)는 점을 제외하고는 확립된 방법(Lambert, 외 다수.((2001), supra)에 따라 실행되었다. 항체와 ADDL은 실온에서, 21-일(21-day) 해마 세포 배양에 적용하기 전에 항체:ADDL 몰 농도비 1:4로 1시간동안 미리 배양된다. 내생(endogenous) ADDL에 대해, 인체 뇌 단백질(Lambert, 외 다수.((2001), supra에 따라 제조되었다.)은 세포가 세척되고, 고정되고, 그리고 위와 같이 시각화되기 전 1시간동안 배양되었다.
알츠하이머병으로부터 가볍게 고정되고 냉동된 부분(4℃에서 30시간 동안 4% 파라포름알데하이드와 40㎛ 수크로오스에서 냉동 보존된)과 조절 해마는 항체(1:1000 인산염-완충액 식염수(PBS)안에서)는 배양되었다. 항체 제거 후, 섹션 들(sections)은 PBS로 3번 세척되었고 실온에서 2차 항체로 배양되었다. 결합은 DAB(SIGMATM, St. Louis, MO)로 시각화되었다. 그 후 섹션들은 헤마탁실린(hematoxylin)으로 대비 염색되었고, 표본화 되었으며(mounted), SPOTTM INSIGHTTM디지탈 비디오 카메라(v. 3. 2)로 NICON® ECLIPSE® E600 라이트 마이크로스코프위에서 이미지화되었다.
정량적 면역 세포 화학. 배양된 해마 세포 는 1시간 동안 37℃에서 500 nM의 ADDL로 배양되었다. ADDL은 세척하여 제거되었고, 세포들은 3.7%의 포름알데하이드로 고정되었다. 세포들은 PBS-NGS(10% 정상적인 염소 혈청)에서 0.1% TRITONTM X-100으로 30분간 배양되었고, 1번 세척되었으며, 원하는 1차 항체(PBS-NGS안에서 묽혀진)로 밤사이 4℃로 배양되었다. 샘플들은 세척되었고 적당한 2차 항체, 예를 들어, ALEXAFLUOR® 488 또는 594 항-쥐와 항-토끼 IgGs(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)로 2시간동안 37℃에서 배양되었다 커버슬립스는 세척되었고, PROLONG®. 안티-페이드 마운팅(anti-fade mounting)배지에 장착되었고, LEICA® TCS SP2 confocal Scanner DMRXE7 마이크로스코우프에서 이미지화되었다.
ELISA(효소면역측정법). 다중 클론성 항-ADDLs IgG(M90/1; Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX)는 IMMULONTM 3 REMOVALWELLTM 스트립스(strips)(Dynatech Labs, Chantilly, VA)위에서 0.25mg/well로 2시간동안 실온에 서 넣어졌고, 웰들은 TBS에서 2%의 BSA로 차단되었다. F12안의 1% BSA로 희석된 샘플들은 웰들에 첨가되었고, 2시간동안 4℃에서 결합되도록 하였고, 실온에서 BSA/TBS로 3X 세척되었다. BSA/TBS로 묽혀진 단일클론 항체는 실온에서 90분간 배양되었고 쥐의 IgG에 대한 VECTASTAIN® ABC 키트로 탐지하였다(detected) HRP라벨은 BIO.-RAD® 퍼록시다아제 기질로 시각화되었고, Dynex MRX-TC microplate reader 위에서 읽혀졌다.
실시예 2: 항-ADDL 항체의 개발과 특징화
세 마리의 쥐들은 총 6번의 접종을 위해 매 3주마다 ADDL(194±25 ㎍ 단백질/주사)로 접종되었다. SP2세포를 가진 세 마리 쥐들의 지라의 융합으로 얻어진 하이브리도마는 96-웰에서 생장되었다. 양성 클론들을 확인하기 위해 이러한 웰들의 상청액은 합성 ADDL로 점 블롯으로 스크린되었다. 이러한 클론들은 차이점을 확인하기 위해 내생 원섬유의 점 블롯과 비교되었다. 합성 ADDL에만 결합하고 내생 원섬유에는 결합하지 않는 하이브리도마가 발견되었다. 하이브리도마 생성물이 결합한 것이 무엇인지 어떤 조건 하에서 결합이 일어나는 지 상세히 논술하기 위해 각 양성 클론에 대해 웨스턴 블롯이 실시되었다: ADDL의 SDS-PAGE, ADDL의 천연 겔, 내생 원섬유를 가진 SDS-PAGE. 심도있는 검사를 위해 대략 40개의 클론이 선택되었다. 각 클론은 용융성 알츠하이머병 뇌 추출물의 인식, 배양된 해마 세포들에 부착된 ADDL의 확인, 여러 조건 하에서 ADDL이 결합하는 것을 차단하는 능력이 테스트 되었다. 선택된 항체들은 배양 매체에서 수집되었고, 단백질 G SEPHAROSETM를 사용하여 정제되었다.
한 세트의 하이브리도마가 점 블롯에 의해 스크린될 때마다 대략 ∼30%가 양성 상청액(supernates)을 생산하였다. 이것들 중에서 오직 하나 또는 두개의 하이브리도마가 합성 ADDL에 결합하였고 내생 원섬유에는 결합하지 않았다. 웨스턴 블롯 분석에 따라 측정된 대로 클론의 원래 수의 약 2%가 합성 ADDL에 부착되고 낮은 ADDL의 농도에서는 단량체는 그렇지 않다. 웨스턴 블롯에서 합성 ADDL에 부착하고 피브릴에는 부착하지 않는 클론 3B7은 심도 있는 분석을 위해 보관되었다.
하나 내지 둘의 클론은 트리머/테트리머 올리고머보다 더 높은 분자량의 물질(12-24)에 부착하는 것이 확인되었다. 2 내지 3의 클론은 자연 조건하에서 자연 ADDL에 부착되는 것이 확인되었고, SDS의 존재 하에서는 ADDL에 부착에 실패하는 것으로 확인되었다.
이 분석의 결과는 ADDL이 쥐에 있어서 좋은 항원이라는 것을 가리키며, 모노클론 항체는 모노머보다는 합성 ADDL에 큰 친화력으로 부착하는 것이 밝혀졌다.
실시예 3: 배양된 해마 세포에 부착되는 내생과 합성 ADDL의 면역조직화학 분석
배양된 해마 세포는 알츠하이머병과 조절 뇌 추출물을 구별할 수 있는 단일클론 항체가 배양된 세포에 부착된 ADDL(내생이든 합성이든)을 확인할 수 있는지 결정하기 위해 분석되었다. 해마 배양은 확립된 프로토콜에 의해 준비되었고 3-4주 정도 성장하도록 두었다. 합성 ADDL은 표준 프로토콜(예를 들어, U.S. Patent No. 6,218,506)에 따라 준비되었다. 내생 ADDL은 Gong, 외 다수.((2003) supra)에 따라서 알츠하이머병의 뇌에서 추출되었다. ADDL(100 nm in F12, 또는 F12에서 2mg 총 단백질)은 1시간동안 세포와 함께 배양되었고, 표준방법에 따라서 세척되고 배양되었다. 세척 후에 세포들은 20C2, 3B7, M94, 2A10, 4E2, 2D6, 4C2, 2B4, 5F10, 5G12항원과 함께 배양되었고 이어서 ALEXAFLUOR® 488 에 부착되는 항-쥐 2차로 배양되었다. 이미지는 COOLSNAPTM HQ를 가진 NICON® DIAPHOTTM 에피플루오레슨트 마이크로스코우프에서 찍혔다. 그리고 METAMORPHTM 소프트웨어(Universal Image, Downingtown, PA)를 이용하여 분석되었다.
내생과 합성 ADDL은 둘 다 20C2에 의해 시각화 되었을 경우 배양된 세포에서 뜨거운 점 패턴을 보였다. 단일 클론 항체20C2는 합성과 내생의 ADDL이 배양된 해마 세포에 부착되는 것을 확인하였다. 3B7이 피브릴, 높은 분자량의 올리고머, 모노머에 부착하지 않기에, 3B3에 의한 ADDL의 핫 스팟 결합(hot spot binding)은 올리고메릭 ADDL에 기인한다. 다른 항체들은 과정(M94, 2A10)상의 핫 스팟부터 세포 체 특정 부착(cell body specific attachment, 4E2)에 이르기까지와 그 사이의 다른 상태(2D6, 4C2, 2B4, 5F10, 5G12)에서 많은 세포에 부착된 ADDL위의 항원결정기(에피토우프)를 인식하는 것을 나타났다.
실시예 4: 쥐의 항-ADDL 항원을 사용하여 뉴런에 ADDL이 부착하는 것을 억제하기
알츠하이머병과 조절 뇌 추출물을 구별하는 단일클론 항체가 배양 세포에 ADDL이 부착되는 것을 억제하는 지를 결정하기 위해 배양된 해마 세포가 20C2항체와 함께 미리 배양되었고, ADDL의 결합은 면역세포화학에 의해 결정되었다. 해마 세포는 확립된 방법에 따라 준비되었고 3-4주 성장하도록 두었다. 합성ADDL은 표준 프로토콜(예를 들어, U.S. Patent No. 6,218,506과 그 외 비슷한 것)에 의해 준비되었다. 내생 ADDL은 Gong, 외 다수.((2003) supra)에 따라서 알츠하이머병의 뇌에서 추출되었다. ADDL(100 nm in F12, 또는 F12에서 2mg 총 단백질)은 1시간동안 20C2 항체와 미리 배양되었고, ALEXAFLUOR® 488 에 부착되는 항-쥐 2차로 배양되었다.
내생과 합성 ADDL의 배양세포에 부착되는 것은 20C2로 프리인큐베이션에 의해 차단되었다. 운반체와 비-이차 항체 조절 이미지는 검은 색이다.
실시예 5: 바이오티닐레이티드(Biotinylated) ADDL을 사용하여 뉴런에 대한 ADDL의 결합 검출
뉴런에 대한 ADDL 또는 bADDL(biotinylated ADDL)의 결합은 표준 면역 형광법에 의해 측정되었다. 14일간 배양된 주요 해마 뉴런 또는 24시간 플레이티드(plated)된 B103 세포는 1시간동안 37℃에서 5-25 ㎛ ADDL 또는 bADDL로 배양되었고 세포들은 부착되지 않은 ADDL 또는 bADDL을 제거하기 위해 따뜻한 배양배지로 3 내지 4회 세척되었다. 세포들은 PBS로 묽혀진 16% 파라포름알데하이드(Electron Microscopy Science, Fort Washinton, PA)로부터 제조된 4% 파라포름알데하이드로 실온에서 10분간 고정되었다. 결과적으로 용액은 제거되었고 실온에서 추가적인 10분간 신선한 고정제가 첨가되었다. 세포들은 10분간 투과(permeabilized)되었고(4% paraformaldehyde solution with 0.1% TRITONTM-X 100; SIGMA, St. Louis, MO), PBS로 6번 세척되었고, 차단완충액(PBS with 10% BSA; SIGMA, St. Louis, MO)으로 37℃에서 1시간동안 배양되었다. 이 시점에서 부착된 ADDL과 bADDL을 검출하는 프로토콜이 달라지게 된다. ADDL 결합을 검출하기 위해 세포들은 밤새도록 37℃에서 4G8(PBS를 포함하는 1%의 BSA에서 1:1,000으로 묽혀진; Signet Labs, Dedham, MA), 6E10( 1:1,000; Signet Labs, Dedham, MA) 또는 위에서 밝혀진 항-ADDL 단일 클론 항체 중 하나로 배양되었다(1:1,000으로 묽혀진). 추가하여 타우(tau, 1:1,000, SIGMA, St. Louis, MO)에 대항하여 상승된(raised) 다클론 항혈청은 셀 과정을 시각화하기 위해 사용되었다. 다음날 셀은 PBS로 세 번 세척되었고, 실온에서 한 시간 동안 ALEXA® 594-labeled 항-쥐 2차(1%의 BSA와 PBS에서 1:500으로 희석된; Molecular Probes, Eugene, OR)과 ALEXA® 488-labeled 항-토끼 2차(1:1000으로 희석된; Molecular Probes, Eugene, OR)로 배양되었고,PBS에서 세 번 세척되었다. 그리고 형광 가능한 마이크로스코우프를 사용하여 결합이 측정되었다. bADDL의 결합을 측정하기 위해 세포들은 타우 항체들과 함께 밤새도록 배양되었다. 다음에 이어서 세포들은 PBS로 세 번 세척되었고, 한 시간 동안 실온에서 ALEXA® 488-labeled 항-토끼 2차(위에서 언급된)와 ALEXA® 594-labeled 스트렙타비딘(streptavidin), 1:500 희석(Molecular Probes, Eugene, OR)으로 배양되었고, PBS에서 5-6 회 세척되었고, 결합은 형광 현미경으로 시각화되었다. 세포 핵의 염색을 원했었다면 표준 프로토콜에 따라 핵은 DAPI (1:1,000)으로 표지되었다.
ADDL-특정 단일 항체를 사용하는 ADDL의 면역세포화학의 분석을 위해 세포는 ADDL과 함께 배양된 후 세척되고 고정되고 투과되고(permealized) 차단되었다. 단일 클론형 항체와 결합된 bADDL을 검출하기 위해 세포는 밤새동안 4G8, 6E10, 또는 순간 항-ADDL 단일 클론 항체 중의 하나로 배양되었다. 그리고 면역반응은 계속하여 ALEXA® 488-labeled 항-쥐 2차 항체로 검출되었다. 결합 b-ADDL은 594-labeled 스트렙타비딘(streptavidin)으로 시각화되었고 핵은 DAPI로 염색되었다. 염색 후 bADDL 결합과 ADDL의 면역반응성의 콜로칼리제이션(colocalization)은 형광 현미경으로 검출되었다.
ADDL과 배양된 주요 해마 세포의 특정 면역 반응성은 평가된(즉, 20C2, 2H4, 2B4, 2A10) 단일 항체 클론 각각에서 보인다. 결합된 ADDL은 신경과정과 세포체를 따라 구두점을 찍는 것처럼 나타났다. 이러한 패턴은 신경의 서브세트(subset)에서만 오로지 보이며, 이것은 전에 발표된 리포트의상업적이거나 비상업적인 항체를 이용하여 주요 신경에 ADDL을 결합시키는 것에 관한 것과 일치한다. 염색 패턴과 많은 수의 조절연구는 이러한 항체들의 특이성을 나타내었다.
bADDL의 사용은 결합된 ADDL을 탐지하고 단일 클론 항체와 ADDL이 결합하는 것을 차단하는 정도를 평가할 수 있게 하였다. bADDL이 주요 해마 세포에 첨가되고 결합이 형광-표지된 스트렙타비딘(streptavidin)으로 평가되면, 특정 결합은 배양의 세포의 서브세트의 신경과정을 따라서 보였다. 만일 세포가 고정되고, 면역세포화학을 위해 처리되고 항-ADDL 항체가 결합을 시각화하기 위해 시각화되었다면, 염색의 비슷한 패턴이 관찰되었다. 게다가 이런 염색 패턴의 중첩은 항체 염색과 결합 bADDL이 완벽하게 겹쳐짐을 나타내며, 이와 같이 bADDL과 ADDL은 기능적으로 동등하며 그리고 결합 분석에서 bADDL을 사용할 수 있다.
실시예 6: 쥐의 항-ADDL 단일 클론 항체 감별 bADDL의 치환의 탐지와 측정
ADDL또는 bADDL이 신경 배양(주요 신경 또는 B103세포)에 결합하는 것을 차단하는 항체의 능력은 여기서 기술된 면역 세포 화학 방법에 약간의 조정을 한 것을 사용하는 것으로 특징 지워진다. 단일 클론 항체는 1-10 ㎛ bADDL과 몰농도비 1:1, 1:5, 1:10 (항체:bADDL)로 혼합되었다. 실리콘 마이크로원심분리기 튜브에 넣어져 느린 회전기(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)위에서 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 계속하여 항체/bADDL 혼합물에 세포가 첨가되고 1시간 동안 37℃에서 더 배양되었다. 배양 후 세포들은 세척되고 고정되고 투과되고 차단된다. 그리고 세포 과정을 시각화하기 위해 타우에 대항하여 상승된 다클론 항혈청으로 배양되었다. 다음날 세포들은 세척되었고 ALEXA® 488-labeled 항-토끼 2차 항체와 ALEXA® 594-labeled 스트렙타비딘(streptavidin)으로 배양되었고, 세포들은 DPI로 염색되어 핵 을 탐지할 수 있게 되었다. 일단 염색되면 결합의 정도는 형광 현미경과 함께 시각적으로 평가되었다.
bADDL 결합의 정도와 항-ADDL항체가 이 반응을 감소시키는 능력을 정량적으로 평가하기위해 세포-기반(cell-based) 알카라인 포스파타아제 분석이 개발되었다. 단일 항체 또는 PBS는 2.5-10㎛(최종 농도)의 bADDL과 1:1(B103 세포) 또는 1:5(주요 신경)의 몰농도 비율로 혼합되었고 느린 회전기에서 1시간동안 ALEXA® 594-labeled 스트렙타비딘(streptavidin) 배양되었다 프리인큐베이션 후에 항체/bADDL의 준비물은 B103 또는 주요 신경 배양에 첨가되었고 추가적인 1시간 동안 37℃에서 배양되었다. 배양기 끝 부분에서 bADDL/항체 혼합물은 제거되었고 플레이트는 배지(medium)로 6번 세척되었다. 세포들은 파라포름알데하이드로 10분간 실온에서 고정되었고 용액은 제거되었으며, 새로운 고정제가 첨가되었고 세포들은 추가적인 10분 동안 고정되었다. 세포들은 0.1% TRITONTM X-100을 포함하는 4%의 파라포름알데하이드로 투과되었고(실온에서 각 10분 동안 두 번) PBS에서 6번 세척되었고 1시간 동안 37℃에서 PBS에서 10%BSA로 처리되었다. 알카리성 포스파타제-칸쥬게이티드(alkaline phosphatase-conjugated) 스트렙타비딘(1:1, 500 in 1% BSA; Molecular Probes, Eugene, OR)은 1시간 동안 실온에서 세포에 첨가되었다. 세포는 PBS로 6번 세척되었고 알카라인 포스파타제 기질(CDP-STAR with SAPPHIRE-IITM; Applied Biosystems, Foster City,CA)은 세포에 첨가되었고 LJT 루미노미터(Analyst AD; LJT BioSystems, Sunnyvale, CA)에서 발광(luminescence)을 측정하 기 전에 30분간 배양되었다.
bADDL의 세포에 대한 결합이 측정되었을 때 염색의 항체-종속 패턴이 관찰되었다. 어떤 항체들은 놀랍게 bADDL의 결합을 감소시켰으며, 반면 다른 것들은 덜 효과적이다. 기대하는 것과 달리 항체의 세 번째 그룹은 bADDL에 대한 결합을 증가시키는 것으로 나타났다. 이러한 연구 결과는 정성적이고 자연에서 정량적이지는 않은 반면, 그 것들은 항체가 다르게 bADDL이 뉴런에 부착하는 것을 차단하였다는 것을 가리켰다. 정량적 평가는 비슷한 경향을 나타내었다(Figure 1) 즉 어떤 항체들은 bADDL는 뉴런에 부착하는 정도를 감소시켰고 어떤 것들은 약하거나 거의 영향을 받지 않으며, 몇몇은 결합을 증가시켰다(즉, 5F10, 4C2). 게다가 쥐 Fab은 bADDL의 결합을 차단할 수가 없었고, 이 분석에서 단일 클론 항체의 특이성을 더 나타내었다.
뉴로블라스토마 세포주 B103 안에서 bADDL의 결합과 단일 클론 항체와의 차단의 분석은 B103 세포에 결합하고 난소 세포주(CHO)에는 결합하지 않는 특정 bADDL을 나타내었다. 게다가, B103 세포에 첨가에 앞서 bADDL이 항-ADDL 단일 클론 항체로 프리-인큐베이티드되었을 때 결합은 현격하게 줄어들었다. 단일 클론 항체를 가지고 B103세포에 bADDL의 결합을 차단하는 정도를 정량적으로 평가하는 것은 단일 클론 항체가 세포에 bADDL이 결합하는 것을 차단하는 능력이 동등하지 않다는 것을 가리켜주었다(Figure 2). 주요 해마 세포에서 보이는 것처럼 어떤 항체들은 결합을 차단하는 데 탁월한 반면 다른 항체들은 그렇지 않았다. 게다가 항체 4C2는 배양에서 B103세포에의 결합을 증가시켰다.
학습과 기억과 관련된 해마의 영역에 bADDL이 결합하는 것을 보이기 위해 쥐의 해마 조각을 이용한 일련의 결합에 대한 연구가 수행되었다. 결합 연구는, CA1-3 안의 뉴런과 해마의 치상회(dentate gyrus)부분은 bADDL과 결합할 수 있었고 다른 영역의 뉴런은 그렇지 않았다는 것을 보였다. bADDL이 항-ADDL 단일 클론 항체와 미리 배양되었을 때 bADDL의 결합의 정도는 투입량-의존 방식으로(in a dose-dependent manner) 감소되었다. 이러한 결과는, 단일 클론 항체가 해마 뉴런의 서브세트(subset)에 bADDL이 결합하는 것을 감소시킨다는 것을 보였다
실시예 7: 알츠하이머와 조절 뇌의 내생 ADDL과의 항-ADDL 항체의 결합.
여기서 개시된 단일 클론 항체를 특성화하기 위해, 단일 클론 항체가 인간의 알츠하이머병의 뇌(내생 ADDL)의 용해성 추출물로부터의 ADDL을 인식할 수 있고 조절 뇌의 추출물을 구별할 수 있는지가 측정되었다. F12에서 제조된 합성 ADDL과 인간 뇌 추출물은 F12에서 희석되었고 건조 HYBONDTM ECLTM 니트로셀룰로오스 위로 두 벌로(in duplicate) 스팟되었다(1 pmole ADDDLs; 0.5 ㎍ 뇌추출물). 대응하는 CERAD(consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease) 그레이드(grade)와 바락(Barrak) 단계를 가지고 뇌 조직은 NU 브레인 뱅크 코어(NU Brain Bank Core)에서 얻어졌다. 그 블롯은 20분간 건조되었고 그 후 20분간 실온에서 TBS(20 mM tRIS-HCl, pH 7.5, 0.8% NaCl)안의 3% H2O2 안에서 배양되었다. 블롯은 스트립(strip)으로 잘려졌고 1시간 동안 실온에서 TBS-T(0.1% TWEENTM-20 in TBS)안 에서 5% 우유로 차단되었다. 여기(Figure 3)에서 개시한 토끼 다클론 항체 M71/2(1:2500, 0.4㎍; Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX); 단일클론 항체 6E10(1:500, 3㎍; Signet Labs, Dedham, MA) 그리고 단일클론항체 20C2(1.52 mg/mL, 5㎍), 11B5(2.54mg/mL, 5㎍), 2B4(1.71mg/mL, 5㎍) 그리고 2A10(1.93mg/mL, 7.5㎍)은 1.5 mL의 우유/TBS-T에서 희석되어졌고 1 시간동안 실온에서 배양되었다. 블롯은 3X10분 TBS-T로 세척되었다. 블롯은 호스래디쉬 퍼록시다아제(HPR)-연결된 2차 항체(1:40,000 in milk/TBS-T; American Life Science, Inc., Arlington Heights, IL)로 1시간동안 실온에서 배양되었다. 블롯은 3X10분 TBS-T로 세척되었고 dH2O로 3번 헹구어졌고 SUPERSIGNALTM기질(1:1 ddH2O희석, Pierce, Rockland, IL)로 현상되었고 HYPERFILMTM ECLTM(Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL)에 노출되었다.
테스트된 모든 항체들은 합성 ADDL이 강한 결합을 가짐을 확인하였다. 다만, 2A10 은 높은 단백질 농도 하에서 테스트되었지만 약한 결합을 가졌다. 다클론 항체 M71/2와 단일클론 항체 20C2와 11B5는 알츠하이머병의 샘플에 강하게 결합하였지만 조절 뇌의 비슷한 배경(background)에는 약한 결합을 보였다. 반대로 단일 항체들 6E10, 2B4, 그리고 2A10은 알츠하이머병의 뇌에는 약한 결합을 보였다.
이러한 분석의 결과는 테스트된 단일클론 항체 중 두 개는 알츠하이머병과 조절 뇌(여기서 내생 올리고머에의 결합은 높은 정도의 특이성을 갖는)를 구분할 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 8: 알츠하이머병과 조절 뇌 절편의 면역조직화학적 분석
여기서 개시된 단일클론 항체를 사용한 면역조직화학적 분석은 알츠하이머병과 조절뇌 추출물을 구분하는 단일클론 항체를 사용하여 뇌절편 안에서 ADDL이 시각화될 수 있는 지를 결정하고, ADDL의 라벨링(labeling)의 성질(예를 들어, 광범위하거나, 신경주변의(perineuronal), 판-같은(plaque-like))과 인체 조직에서의 분포를 나타내기 위해 실시되었다. 고정된 알츠하이머병과 조절 뇌의 부분(40㎛)은 표준방법에 따라 준비되었다. 절편들은 여러 단일클론 항체와 하나의 다클론 항체로 표지되었고(labeled) 그리고 계속하여 세포핵을 확인하기 위해 헤마탁실린(hematoxylin)을 사용하여 대조염색되었다. 영상은 SPOTTM INSIGHTTM 디지털 비디오카메라를 가진 NICON® ECLIPSE® E 600 광 현미경을 사용하여 얻었다(v.3.2)
면역조직화학분석은 ADDL염색은 해마, 엔토르히널 코텍스(entorhinal cortex), 뇌의 중전엽 이랑(gyrus)안의 알츠하이머병에서 명백해졌다. 심각한 알츠하이머병의 경우 판형(plaque-like)의 분포에서 아주 우세한 것으로 보이는 부분에서 가벼운 ADDL염색이 풍부하게 존재하였다. 어떤 가벼운 ADDL염색은 한 알츠하이머병의 케이스에서 페리뉴로럴(peri-neuronal)로 관찰되었다. 반대로 조절 샘플의 어떤 영역에서도 항체를 사용하여 염색할 수가 없고 심지어 점 같은 면역염색으로 둘러싸인 드문 뉴런조차도 없다. 이러한 데이터는 ,다양한 라벨링이 존재하는, 판형(plaque-like)부분, 혈관부분, 개개 세포의 신경주위 라벨링과 어떤 클러스터들 로 이루어지는 고정된 인간조직에서 ADDL을 확인하기 위해 다클론과 단일클론 항체가 사용될 수 있다는 것을 가리킨다. 조절을 제외한 알츠하이머병의 뇌에서 ADDL의 라벨링은 적어도 3가지 영역에서 관찰되었다: 해마, 엔토르히널 피질, 뇌의 전중부(middle frontal gyrus).
실시예 9: Aβ1-40 단량체-같은 조절의 면역염색
Aβ1-40은 ADDL과 비교해 볼 때 DMSO/F12 안에서 천천히 올리고머화된다(oligomerizes). 그래서 Aβ1-40이 단량체-같은 조절(a monomer-like control)로서 활동할 수 있는지 측정되었다. ADDL은 SUPERDEX® 75 칼럼에서 크기배제 크로마토그래피(SEC)검사를 받았고 이것은 두 개의 피크로 분리되었다. Aβ1-40은 DMSO/F12 (45.5mM)에서 제조되었고, 냉동되고 해동되었다. 샘플들은 F12로 희석되었고 Tricine 샘플 버퍼(BIO-RAD®, Waltham, MA)로 ∼2:1로 혼합되었다. SDS-PAGE가 Tris/Tricine/SDS 완충액(BIO-RAD®, Waltham, MA)으로 10-20% Tris-Tricine 겔(BIO-RAD®, Waltham, MA)에서 120V로 80분간 실온에서 실시되었다. 겔은 SILVERXPRESSTM (INVITROGENTM, Carlsbad, CA)로 은염색(silver stained, 60pmoles Aβ1-40 또는 ADDL; 40pmoles Peaks 1 또는 2)되었다. 대안적으로 겔(20 pmoles Aβ1-40 또는 ADDLs; 30 pmoles Peaks 1 또는 2)은 25mM Tris-192 mM 글리신, 20% v/v 메타놀, pH 8.3, 0.02% SDS를 사용하여 100V 8℃에서 1시간동안 HYBONDTM ECLTM 니트로 셀룰로오스위로 일렉트로블롯이 되었다(electroblotted). 블롯은 TBS-T(20mM Tris-HCl안의 0.1% TWEENTM-20, pH 7.5, 0.8%NaCl)안의 5%우유로 8℃에서 밤새도록 차단되었다. 단일클론 항체 6E10(1:2000;Signet Labs, Dedham, MA), 단일클론 항체 20C2(1.52mg/mL, 1:2000; 도3), 또는 다클론 항체 M71/2(1:4000, Bethyl Laboratories, Inc.,Montgomery,TX)는 우유/TBS-T안에서 희석되었고 90분간 실온에서 블롯으로 배양되었다. 블롯은 TBS-T로 3X10분간 세척되었고 이어서 HRP-컨쥬게이티드 2차 항체(TBS-T안에서 1:40000; Amersham Life Science, Inc., Arington Heights, IL)로 한 시간 동안 실온에서 배양되었다. TBS-T로 10분간 세척을 세 번 한 다음 블롯은 dH2O로 3X 헹궈지고(rinsed) SUPERSIGNAL West Femto Maximum Sensitivity 기질(ddH2O로 1:1희석, Pierce, Rockland, IL)로 현상되었고 HYPERFILMTM ECLTM (Amersham Life Science, Inc., Arington Heights, IL)에 노출시켰다.
은 염색 분석은 Aβ1-40이 무거운 단량체 밴드로 나타낸다. 대조적으로 ADDL과 피크 1은 비록 테트라머가 적기는 하지만 모노머, 트리머, 테트라머를 보였다. 피크 2의 은 염색 분석은 가벼운 트리머와 아주 가벼운 테트라머 밴드와 무거운 모노머를 나타내었다.
6E10으로 Aβ1-40를 면역 염색하는 것은 단지 가벼운 모노머 밴드를 보였다. 6E10으로 ADDL과 피크 1의 면역 염색하는 것은 모노머, 트리머, 테트라머 그리고 12-24머(12-24mer)를 보였다. 피크 2는 6E10으로 염색된 무거운 모노머와 가벼운 트리머와 테트라머를 보였고 16-24mer는 보이지 않았다. 20C2 또는 M71/2를 가진 Aβ1-40의 모노머 염색은 없었다. 20C2 와 M71/2는 아주 적거나 아예 없는 ADDL과 피크1의 모노머 염색을 보여주는 반면에 이러한 샘플들은 20C2 와 M71/2로 염색되는 트리머, 테트라머 그리고 12-24mer를 가진다. 20C2 또는 M71/2에 의한 피크 2 면역염색은 12-24mer는 관찰되지 않고 가벼운 모노머, 트리머 그리고 테트라머를 보였다. Aβ1-40은 더 무거운 은 염색에 불구하고 ADDL보다 6E10과 더 가볍게 면역 염색되었다.
이러한 결과는, 모노머를 잘 인식하는 6E10 항체에 비하여 전이 완충액에서 0.02% SDS 로 전이된(transferred) 올리머 특이 항체를 가지고 극소의 모노머 검출을 나타내었다. SEC 일부(fraction)의 면역염색은, 피크 1이 모노머, 트리머, 테트라머 그리고 12-24mer를 가지는 것에 비하여 피크 2는 작은 양의 트리머와 테트라머 그리고 대부분의 모노머로 이루어진 것을 보여주었다.
피크 1과 피크 2의 결합에 관하여 단일클론 항체를 좀 더 특성화하기위해 포획 항체로서 다클론 항체 M90을 사용하여 샌드위치 ELLSA가 개발되었다. 여기서 언급된 SEC 피크 1과 피크 2의 프랙션(fraction)은 잠재적으로 생물적 활성인 것과 비활성인 것을 구별하기위해 SEPHADEXTM 75 칼럼위에서 분별되었던 두개의 주요한 ADDL의 피크들이다. 비변성 겔 전기영동(non-denaturing gel electrophoresis)에 의해 37℃에서 안정적인 큰 집단(large aggregates, 〉50kDa)와 작은 집단(〈30kDa)으로 분리됨을 확인할 수 있다. 이러한 피크들은 각각 클론 상청액(clone supernates)의 검출 물질로 사용되었다. 결합은 VECTASTAIN® kit로 시각화되었다. 모든 항체에 대해 두 피크 인지(recognition)간의의 차이는 관찰되었다. 예를 들어 항체 2B4와 20C2(도 3)에 대해서 피크2에 대한 피크1의 비율을 비교할 수 있다. 하나의 항체만이 조절 항체 (6E10)의 피크 2에 대한 선호를 반영한다.
실시예 10: Aβ1-42로부터 ADDL 형성의 검출
다클론 항체들은 Aβ1-42로부터 ADDL의 시간에 따른 형성을 보여주기 위해 점-블롯에 사용되어 왔다. 따라서 올리고머에 부착하는 경향이 있는 단일클론 20C2 항체도 Aβ1-42로부터 ADDL이 형성되는 시간에 따라 증가된 신호를 나타낼 수 있다는 것이 증명되었다. Aβ1-42(750pmoles HFIP 막(film))은 1.5mL DMSO(0.5mM)안에서 용해되었고 2 ㎕로 나눠진 것(aliquots)들은 F12(10nM)fh 최종적으로100㎕이 되도록 희석되었고, 얼음 위에서 배양되었다. 반응 혼합물의 2 ㎕(20 fmole)은 건조 HYBONDTM ECLTM 니트로셀룰로오스(Amersham Life Sciende, Inc., Arlington Heights, IL)위에서 특정시간에 스팟되었다(spotted). 니트로셀룰로오스는 1시간 동안 실온에서 TBS-T(20mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.8 % NaCl, 0.1 % TWEENTM-20)안의 5% 탈지 건조우유로 차단되었다. 다클론 항체 M90/1(Bethyl Laboratories Inc., Montgomery, TX) 또는 단일클론 항체20C2(1.52mg/mL)는 우유/TBS-T안에서 1:2000으로 희석되었 고 블롯과 함께 실온에서 90분간 배양되었고 TBS-T로 10분간씩 세 번 세척되었다. HRP-컨쥬게이티드 2차 항체(Amersham Life Science Inc., Arlington Heights, IL)는 우유/TBS-T안에서 1:2000으로 희석되었고 실온에서 60분간 블롯 배양되었고 상기처럼 세척되었다. dH2O로 짧게 세척한 후 블롯은 60초간 SUPERSIGNAL West Femto Maximum Sensitivity 기질(ddH2O로 1:1로 희석; Pierce, Rockland, IL)로 배양되었고 HYPERFILMTM ECLTM(Amersham Life Science, Inc., Arlington Heights, IL)에 노출되었다. 점 블롯은 스캔되었고 스팟의 강도는 ADOBE® PHOTOSHOP®으로 결정되었다.
항체 둘다 Aβ1-42로부터 시간에 따라 ADDL이 형성되는 것을 검출하였고, 여기서 20C2의 결과는 좋은 신호와 일관성을 보였다. 어떤 항체도 ADDL들에 상당하는 농도에서 Aβ1-40을 검출할 수 없었다. 이러한 데이터는, 모노머는 항상 존재하고 올리고머는 시간에 따라 생성되므로, 이러한 항체의 올리고머 특이성을 증명한다. 게다가 M90/1과 20C2 양쪽 다 ADDL의 농도가 100배 넘는 경우에도 Aβ1-40 모노머를 거의 인식할 수 없는 것으로 나타났다.
실시예 11: 경쟁 점 블롯 분석
여기서 개시된 단일클론 항체가 모노머에 부착할 수 있는지 결정하기 위해 경쟁 점 블롯 분석이 합성 ADDL, 20C2그리고 Aβ1-40으로 수행되었다. ADDL은 건조 니트로셀룰로오스에 10pmole/ 0.5㎕에서 적용되었다. 니트로셀룰로오스가 1시간 동 안 5%의 NDM/TBS-T안에서 차단되는 동안 여러 농도의 ADDL과 신선한 Aβ1-40은 5% NDM/TBS-T 안에서 각 20C2(최종농도 1.5㎍/ml)으로 200㎕배양되었다. 그 후 이러한 용액들은 SURF-BLOT기구를 이용하여 니트로셀룰로오스에 적용되었고 실온에서 1.5시간 흔들며 배양되었다. 이어서 블롯은 항-쥐 IgG-HRP와 화학발광(chemiluminescence)로 시각화되었다. KODAK® IMAGESTATION® 440 과 EXCEL®로 정량화되었다.
이 분석의 결과는 용액 내의 합성 ADDL은 ADDL의 농도가 〈50 ,nM에서 관찰되는 최고 억제수준의 반으로 니트로셀룰로오스위에 고정된 ADDL에 20C2가 결합하는 것을 효과적으로 그리고 특이적으로 차단할 수 있다는 것을 보여주었다.
Aβ1-42 분자의 결합 항원결정기를 구성하는 단백질이 무엇인지를 결정하기위해 경쟁 점 블롯 분석방법이 ADDL, 20C2 그리고 펩티드로 수행되었다. ADDL은 니트로셀룰로오스에 4가지 농도(1, 0.5, 0.25, 0.125 pmole)로 각 0.5㎕안에서 스팟되었다. 니트로셀룰로오스가 두 시간동안 5% NDM/TBS-T안에서 차단되는 동안에 50, 100, 200pmole의 펩티드는 20C2(최종농도 1.52 ㎍/ml= 1.9 pmole, in 5% NDM/TBS-T) 200㎕에 첨가되고 실온에서 흔들어 졌다. 이어서 용액은 1.5시간동안 SURF-BLOT 장치를 사용하여 니트로셀룰로오스로 배양되었다. 결합은 화학발광(chemiluminescence)을 사용하여 항-쥐 IgG-HRP로 시각화되었다.
이 분석의 결과는 ADDL로의 결합이 ADDL자신과 Aβ1-28에 의해 차단되며 펩티드의 다른 조합에 의해서는 차단되지 않았다. 결합 항원결정기는 Aβ1-28이 달성 가능하고(그러나 Aβ1-12와 Aβ1-28 또는 그들의 조합위에는 활용할 수 없는) 어떤 형태를 요구한다. 대안적으로 Aβ1-28은 스테릭 힌드런스(steric hindrance)에 의한 ADDL의 결합을 차단하는 다이머를 형성한다.
Aβ1-28이 군집을 이루거나(Aβ1-40과 비슷하게) 겹쳐져 20C2의 결합 항원결정기를 차단하는지를 결정하기 위해 SDS-PAGE 겔은 은 염색되었고 웨스턴 블롯 분석이 수행되었다. ADDL과 Aβ1-28(은 염색을 위한 두 레인 각각에 60pmol과 다른 20pmol)은 10-20% Tris-Tricine SDS-PAGE를 사용하여 분리되었다. 60 pmol 레인은 절개되었고 SILVERXPRESSTM (INVITROGENTM, Carlsbad, CA); 대안적으로 겔(20pmoles의 ADDL과 Aβ1-28)은 100V로 1시간동안 8℃에서 25mM Tris-192 mM 글리신, 20% v/v 메타놀, pH 8.3, 0.02% SDS를 사용하여 HYBONDTM ECLTM 니트로셀룰로오스 위로 일렉트로블롯되었다. 블롯은 TBS-T(20mM Tris-HCl안의 0.1%TWEENTM-20, pH 7.5, 0.8%NaCl)안에서 5%우유로 차단되었다. 샘플들은 1.5시간동안 실온에서 상기 차단완충액에서 20C2(1:1000, 1.52mg/ml) 또는 20C2 + Aβ1-28(2nmol, 2시간 동안 미리 배양된 것)로 배양되었다. 항-쥐 결합은 IgG-HRP(TBS-T에서 1:4000)와 화학발광(chemiluminescence)로 시각화되었다.
은 염색은 ADDL레인에서 모노머, 트리머, 테트라머를 나타내었으나 반면, Aβ1-28레인은 거의 다이머에 이르는 하나의 종을 가졌다. Aβ1-28을 제외한 ADDL 은 20C2로 시각화되었고 20C2에 의한 모든 ADDL의 결합은 Aβ1-28에 의해 차단되었다. 게다가 20C2결합 항원결정기가 Aβ1-28에 의해 차단될 때 20C2는 웨스턴 블롯 에서 Aβ1-28펩티드를 인식하지 않는다.
실시예 12: 항-ADDL항체의 동형 분석
여기에 공개된 단일클론 항체를 좀 더 특성화 하기위해 쥐 단일 클r론 항체 동형화 시약(Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents)을 가진 SIGMA IMMUNOTYPE Kit를 제조자의 지시사항(Sigma-Aldrich Co., st. Louis, MO)에 따라 사용하여 동형분석이 이루어 졌다. 이 분석의 결과는 그림 3에 나타나 있다.
실시예 13: 항-ADDL 항체의 핵심 선형 항원결정기 매핑(Mapping)
항-ADDL 단일클론 항체와 아밀로이드 베타 펩티드와의 특정 반응은 표준 ELISA 분석에서 검출되었다. 요약해서 말하면 합성 펩티드 또는 ADDL 또는 어떤 경우에는 피브릴(fibril)은 4㎍/mL(약 800내지 1200nM)의 농도에서 NUNCTM MAXISORBTM 플레이트를 코팅하기 위한 항원으로 사용되었다. 특정되지 않는다면 펩티드는 5mM 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate) 완충액(pH 9.6)에 밤새도록 4℃에서 코팅되었다. 1시간 동안 0.05% TWEENTM 20과 3%(w/v) 탈지 건조우유를 포함하는 PBS로 플레이트(plates)를 차단한 후에 단일클론 항체는 정해진 농도의 차단완충액에서 적정되었고 플레이트는 부드럽게 흔들리면서 주위온도에서 1시간 동안 배양되었다 세척 후에 차단완충액에서 희석된 HRP-컨쥬게이티드 염소 항-쥐(conjugated goat anti-mouse) IgG (H+L)이 플레이트에 첨가되었다. 비색 기질, TMB,는 부착되지 않 은 HRP-컨쥬게이트를 제거하기 위해 오래 세척한 후에 첨가되었다. 흡수는 플레이트 리더기에서 450nm의 파장으로 측정되었다.
항-ADDL 단일 클론 항체에 대한 핵심 선형 항원결정기를 매핑(mapping)하기 위해, Aβ1-42를 포함하기 위해 겹치는 일련의 10개의 아미노산 펩티드가 합성되었다(표 1). 14개의 아미노산을 갖는, Aβ1-42와 반대 순서의 아미노산 배열을 갖는, 세 개의 펩티드가 비특이성 펩티드로 합성되었다.
Figure 112007038039374-PCT00001
모든 펩티드는 약 400 내지 500 μM(1mg/mL)의 DMSO에서 용해되었고 -20℃에서 여러 개로 나누어진 것(aliquots)은 저장되었다. 펩티드는 항-ADDL 단일 클론 항체의 핵심 항원결정기를 결정하기 위한 ELISA 분석에 사용되었다. 각 단일 클론 항체는 4개의 농도(3, 1, 0.3, 0.1㎍/mL)에서 N-터미널 펩티드 세트(from residues 1 to 25) 또는 C-터미널 펩티드 세트(from residues 17 to 42)중 하나에 대항하여 조절펩티드를 가지고 테스트되었다. 단일 클론 항체의 패널(panel)에 대한 핵심 선형 항원결정기는 표 2에 기재되어 있다. 여러 개의 상업적인 단일클론 항체(6E10, BAM-10, 4G8 및 WO-2)가 분석 체재(format)을 인증하기 위해 포함되어졌고 그 결과는 출판된 문헌에 나타난 대로 그 핵심 선형 항원결정기를 확인해 준다.
Figure 112007038039374-PCT00002
* Aβ1-42안의 위치. aIgGl, bIgG2b, cIgG2a. nd, 결정되지 않음.
평가된 12개의 ADDL-특이성 단일클론 항체중 아홉 개는 Aβ1-42의 N-터미널 부분과 매핑되었고 이것 중 7개는 아미노산 잔기 3 내지 8에 매핑되었다. 두 개의 단일 클론 항체(2H4와 2E12)는 약간 큰 항원결정기를 선호한다. 세 개의 단일 클론 항체(1F4, 1F6 및 3B3)는 3㎍/mL의 높은 농도에서조차도 겹치는 펩티드 세트에 부착하는 데 실패하였다. 그러나 그것들이 실험에서 양성 조절로 사용된 Aβ1-42 펩티드에 부착할 수 있으므로 그들의 항원결정기는 Aβ1-42의 N-터미너스(terminus)에 위치하는 것으로 인정되었다.
실시예 14: 쥐 항- ADDL 항체의 친화도와 특이성
용액-기반 결합 분석은 항-ADDL 항체의 서로 다른 아밀로이드 베타 펩티드 시약(ADDL, fibril, Aβ1-40 및 Aβ1-20)에 대한 특이성과 친화도를 결정하기 위해 개발되었다. 정량적 ELISA는 NUNCTM 플레이트에 코팅된 ADDL에 대한 단일클론 항체의 투입량-반응의 선형 범위를 수집할 수 있도록 설정되었다. 이러한 정보에 근거해서 ELISA에서 분석 잡음 바로 위의 일관된 OD신호를 줄 수 있는 단일클론 항체의 고정된 농도가 선택되었다(OD 450nm reading around 0.2 to 0.5). 이 고정된 농도에서 IgG는 평형에 이르기 위해 밤새도록 실온에서 용액 내에서 20 포인트 적정 안에서(in 20 point titration) 서로 다른 아밀로이드 베타 펩티드 기질(ADDL, fibril, Aβ1-40 및 Aβ1-20)로 배양되었다. 혼합물 내의 자유로운 IgG의 양은 정상적인 ELISA판위에서 1시간 동안 배양한 정량 ELISA안에서 그 다음날 결정되었다. 결합된 IgG의 작은 부분은 계산되었고 자유리간드의 적정에 대한 결합IgG의 상관도는 GraFit 프로그램을 이용하여 KD를 유도하기 위해 사용되었다(Erithacus Software, Surrey, UK). 그래서 서로 다른 아밀로이드 베타 펩티드 시약에 대한 각 항체의 기질 선호도는 고유 친화도 값으로 나타내어졌다(KD).
이런 분석 형식을 사용하는 것은 여러 가지 장점이 있다. 첫째 항체와 기질의 반응이 용액상태에서 일어난다는 것이다. 그래서 정규의 ELISA분석이나 BIOCORETM 실험에서처럼 ELISA 플레이트로부터나 단일클론 항체로부터의 고체표면에의 전위차 영향이나 기질반응이 고려되어야 하는 구속이 없다. 둘째 반응은 평형에 도달하도록 되었다. 따라서 IgG와 기질의 반응은 고농도의 실험에 기인하는 IgG의 침전이나 추가적인 아밀로이드 베타 펩티드올리고머화의 염려가 없는 제한된 농도에서 일어났다. 세 번째 분석결과는 용액에서 항원과 관련이 없다; 따라서 아밀로이드 베타의 이종형은 다른 펩티드 조제(예를 들어, ADDL이나 피브릴)에서 데이터 해석이나 수학적 모델링에 간섭을 일으키지 않는다. 이 분석의 감도는 나노 몰농도의 범위에서 단일클론 항체를 KD로 평가하는 ELISA분석의 감도에 따라 제한되었다. 형광시약과 같은 대체기질은 감도범위를 향상시키기 위해 고안되었다. 정량 ELISA에서 자유IgG를 포획하기 위한 1시간동안 배양시간동안에는 면역착화합물은 최소한 붕괴되었다.
자유 IgG의 양은 표준 곡선에 의해 결정되었고 서로 다른 기질의 적정에 대해 플롯되었다(plotted). 다른 기질과 결합된 IgG의 양은 플롯되었고 적당한 수학적 모델로 피팅(fitting)하는 곡선에 대한 GraFit에서 그 정보가 사용되었다. 여기서 공개된 단일 클론항체 패널에 대한, nM 범위에서 표현된, KD에 대한 요약은 표3에 나타나 있다.
Figure 112007038039374-PCT00003
* 모든 항체는 IgG 이었다.
이탤릭체로 기재된 값은 높은 SE와 적은 피팅(fitting)이다.
IC: 결론적이지 않은 데이터
N/T: 테스트되지 않음
실시예 15: 타우 포스포릴레이션(tau Phosphorylation)의 탐지와 측정
하이퍼포스포릴레이티드 타우(hyperphosphorylated tau, pTau)는 비록 이 하이퍼포스포릴세이션을 일으키는 사건(event)이 거의 알려져 있지 않지만 알츠하이머병의 특질이다. 어떤 이론에 구속되길 바라는 것은 없지만 여기 포스포릴레이션의 발생(event)에 ADDL이 역할을 한다고 믿어지고 있다. 이를 연구해 보면 신경 배양(1차 뉴런과 B103 세포)은 위에서 언급된 것처럼 성장되었고, 1㎛ bADDL 또는 운반체는 배지(media)에 첨가되었고 배양은 추가적으로 한시간, 6시간 또는 24시간동안 유지되었다. 각 배양의 끝에서 각 세포들은 세척되고 고정되고 투과되고(permeabilized) 차단되고 그리고 pTau(AT8, 1:500; Pierce, Rockland, IL)에 대항하여 키워진 단일클론 항혈청으로 밤새도록 배양되었다. 다음 날 상기 세포들은 세척되었고 ALEXA® 488-labeled 항-쥐 2차 항체와 ALEXA® 594-labeled 스트렙타비딘 으로 배양되었고 세포들은 핵을 감지하기 위해 DAPI로 염색되었다. 그리고나서 세포들은 형광 현미경으로 pTau 염색의 정도와 bADDL결합이 각 시간마다 알려지는 관계로 평가되었다.
이러한 분석의 결과는 운반체-처리된 세포와 비교하였을 때 세포내 과정에서 B103에 부착된 bADDL이 pTau의 수준을 증가시켰다는 것을 나타내었다. 1차 해마 세포에서 비슷한 변화가 감지되었다. 세포들이 6시간동안 bADDL에 노출되었을 때 bADDL에 부착된 세포들의 일부에서 pTau 염색이 관찰되었다. B103세포로 시간 진행에 따른 연구는 bADDL에 의한 pTau의 변화를 조사하였다. bADDL의 첨가는 한 시간에 pTau의 한계적 증가를 가져온다. 그러나 pTau염색은 bADDL의 첨가 후 6시간 후 크게 증가하며 24시간 후에도 증가한 채로 남아 있었다. 이러한 데이터는 뉴런의 ADDL의 결합이 tau의 하이퍼포스포릴레이션과 신경 섬유의 엉킴의 축적과 결과적인 세포의 죽음을 일으키는 세포내 사건들의 연속을 일으킨다. 이러한 목적을 위해 이 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자는 ADDL이 뉴런에 붙는 것을 차단하고 이번에는 차례로 연속적인 사건의 진행을 막고 아밀로이드성(amyloidogenic) 병 그리고/또는 타우오파티에스(tauopathies)의 치료에 유용하다. ADDL결합에 의해 촉발되고 결과적으로pTau 생성을 일으키는 신호성 사건을 잘 이해하는 것은 신규 치료법 개발을 위한 적절한 목표인 추가적인 경로를 또한 밝힐 수 있다.
실시예 16: Aβ 펩티드/ ADDL -항체 반응과 어셈블리 방해
여기서 개시된 선택된 단일클론 항체의 존재하에서, ADDL 어셈블리 키네틱스(kinetics)와 올리고머 크기의 변화는 형광표지된 Aβ1-42 모노머와 천연 펩티드 모노머를 1:4의 비율로 혼합한 혼합물을 사용하여 형광공명에너지전달(FRET)와 형광분극(FP)에 의해 관찰되었다. ADDL로의 모노머 혼입에 따른 형광 발산의 자기 약화는 FRET에 기인하는 짧은 시간 동안 형광 강도의 세배 내지 다섯 배의 약화를 가져온다. 게다가 모노머들이 올리고메릭(oligomeric) ADDL종(species)에 모일 때 크기의 증가는 두 배의 FP증가의 결과로 나타난다. 여러 가지 신규하고 상업적인 항-ADDL과 항-Aβ 펩티드 항체의 존재 하에서 ADDL의 어셈블리의 FRET와 FP 의 운동 진행곡선(kinetic progress curves)은 항체들이 ADDL 어셈블리를 방해하거나 그리고/또는 펩티드 올리고머를 결합하는 능력에서의 차이를 보였다(도 4).
분석은 384-well CORNING® Non-Binding Surface 검고 불투명한 마이크로 타이터 플레이트에서 수행되었다. 분석용 완충액은 100mM MgCl2를 가지고 50mM MOPS-Tris(pH 8.0)으로 이루어졌다. 0.2μM FITC-Aβ1-42와 0.8μM Aβ1-42을 포함하는 분석 부피는 50μL이고 분석온도는 37℃이었다. ADDL 어셈블리는 Tecan GENios Pro 플레이트 리더기를 사용하여 모니터되었고 485 nm의 파장으로 들뜨게 하고 515nm의 파장으로 방출을 검출하였다. 키네틱(kinetic) 추적은 6시간 동안 매 5분간 형광 강도와 분극의 읽은 값을 기록함으로써 수집되었다. 이 시간동안 ADDL로 인식할 정도로 모이지 않는 음성 제어반응들(Negative control reactions)은 MgCl2가 부족하지만 다른 모든 완충액과 펩티드 성분을 포함하였다. 양성 제어반응들은 첨가된 단일클론 항체 시약이 없음에도 모든 완충성분을 포함하였다. ADDL결합과 어셈블리 방해를 측정하기 위해 펩티드 혼합물은 500nm에서부터 5nm에 이르기까지 8개의 농도에서 항체들은 배양되었다.
이 분석은 ADDL의 결합 형태와 ADDL의 어셈블리 방해는 서로 다른 프로파일을 분류하는 데 도움을 준다. ADDL-특이 그리고/또는 입체적 항원결정기(conformational epitopes)와 반응을 통해 커다란 ADDL의 결합과 중성화는 생존가능한 치료 전략으로 제공된다. 순간적이고 중간체인 ADDL어셈블리 종(비-모노머)안에 존재하는 ADDL-특이 그리고/또는 입체 항원결정기(conformational epitopes)에 결합하는 것에 의해 커다란 ADDL으로의 올리고머화의 방해는 항-ADDL치료에 대한 전략적인 대안을 제공한다. 항체간 현저한 차이를 나타내는 FP진행 곡선은 그러한 중간체 또는 안정한 종 결합을 나타낸다. 단일클론 항체들의 FP/FRET형태와 다른 기능적, 세포적인 그리고 생체 조건 내에서의 관계는 행동의 원하는 면역치료 방식을 선택할 수 있도록 허용한다. 여기서 개시된 분석들의 결과는, 1F6, 2A10, 5F10, 2D6 및2B4는 강한 어셈블리 방해를, 20C2, 1F4 및 4C2는 중간 정도의 어셈블리 방해를, 2H4, 3B3 및 4E2는 약한 어셈블리 방해를 나타낸다는 것을 가리켰다(그림 4). 표 4에서 요약되고 그림 5에서 나타난 바와 같이, 20C2, 4E2, 3B3 및 5F10은 다양한 생화학적 행태를 나타낸다.
FP/FRET에 의한 강한 어셈블리 억제 FP/FRET에 의한 약하거나 없는 어셈블리 억제
30분에서의 FP래더링(laddering) 20C2 4E2
30분에서의 약하거나 없는 FP래더링(laddering) 5F10, 1A9 3B3
30분에서의 래더링
더욱이, 낮은 n-mer-형성 펩티드 Aβ1-42[Nle35-Dpro37]에 대항하여 생성된 5개의 순수화된 항체(즉, 1A9, 1E3, 1G3, 1A7 및 1E5)중 하나인 항체 1A9는 그것의 어셈블리 방해와 FPC/ICC로 결정되는 전하-변환되고(charge-converted), 잘려진(truncated) Aβ7-42 펩티드 어셈블리들인 어셈블리에 결합하는 것이 알려졌는데, 이는 Aβ7-42 전하-변환된 펩티드에 결합하는 전형적인 선형 항원결정기(epitope)가 부족하다는 것을 가리키며, 이 펩티드는 Aβ의 잔기 7-16,즉, Aβ7-42[Orn7Orn11D13D14E16Nle35]에 대응하는 전혀 다른 서열을 가졌다. 따라서 20C2는 Aβ의 잔기 17-42안의 원소에 의존하는 입체 항원결정기에 부착하며, 이것은 단지 모일 때만(assemble)이다.
실시예 17: 쥐 항체 변화 부위 시퀀스 (Mouse Antibody Variable Region Sequence)의 분리
쥐의 항체의 변화 영역에 대한 cDNA 코딩은 클론되고 시퀀스되었고(cloned and sequenced) 쥐의 일정 부위의 5'-말단과 V영역의 상류의 쥐의 리더 시퀀스(leader sequences)에 혼성화되는 특별히 계획된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연속 반응(PCR)이 뒤따른다. 이것은 얻어진 쥐의 변화 부위 서열은 완전하고 정확하다는 것을 보증하였다. 간단히 말하면, mRNA는 QIAGEN® OLIGOTEX® Direct mRNA Mini Kit를 사용하여 쥐의 하이브리도마 세포주로부터 추출되었고 첫째-가닥 cDNA 합성 키트를 이용하여 cDNA로 변환되었다. 항체 변화 영역 서열을 얻기 위해 PCR 반응에서 cDNA는 주형(template)으로 사용되었다.
가벼운 사슬 변화 영역 서열을 얻기 위해, 11개의 가벼운 사슬 5'PCR 프라이머(MKV-1 내지 MKV-11)의 각각과 3'PCR 프라이머 MKC-1을 사용하여 11개의 독립적인 PCR 반응이 설치되었다(표 5).
Figure 112007038039374-PCT00004
밑줄과 이탤릭 서열은 XbaI 와 SacI의 제한부위를 각각 나타낸다. W=A 또는 T, M=A 또는 C, K=G 또는 T 그리고 R=A 또는 G
무거운 사슬 변화 영역 서열을 얻기 위해, 12개의 무거운 사슬 5'PCR 프라이머(MHV-1 내지 MHV-12)의 각각과 적절한 이소타입(isotype) 특정 프라이머(MHCG-1, MHCG-2A, MHCG-3)를 사용하여 12개의 독립적인 PCR 반응이 설치되었다(표 6).
Figure 112007038039374-PCT00005
밑줄과 이탤릭 서열은 XbaI 와 SacI의 제한부위를 각각 나타낸다. W=A 또는 T, M=A 또는 C, K=G 또는 T 그리고 R=A 또는 G
각 가벼운 사슬 PCR반응은 46μL INVITROGENTM PLATINUM® PCR Super Mix, 100μM 5'프라이머(MKV-1 내지 MKV-11)중 하나의 1.0μL, 100μM 3'프라이머(MKV-1)의 1.0μL 및 하이브리도마 cDNA 2.0μL를 포함한다. 비슷한 PCR반응들이 쥐의 무거운 사슬 변화 영역을 클론하기위해 사용되었다. 반응은 DNA 열 사이클러(cycler)에 놓여졌고 그리고 97℃에서 2.0분간 초기 변성 단계를 거친 후에, 95℃에서 30초간, 55℃에서 45초간 그리고 72℃에서 90초간을 30 싸이클을 거치게 한다. 마지막 싸이클에 이어서, 72℃에서 10분간 마지막 익스텐션(extension) 단계가 수행되었다. 어떤 PCR 반응이 생성물을 산출하는지를 알아보기 위해 브롬산 에티디움(ethidium)을 포함하는1.5%(w/v)의 아가로스(agarose)/1X TAE 완충액 겔 위에 각 반응으로부터 5μL 앨리쿠오트(aliquot)이 분리되었다. 원하는 크기(420 내지 500 bp)의 조각을 생산하는 반응으로부터의 PCR 생산물은 겔 순수화되고, XbaI 와 SacI로 다이제스트(digested)되고 플라스미드 pNEB193(New England Biolabs, Beverly, MA)의 멀티 클로닝 영역안의 XbaI 와 SacI안으로 리게이트되었다. 대안적으로 PCR 생산물은 INVITROGENTM TA CLONING 키트를 사용하여 플라스미드 pCR® 2.1안으로 직접적으로 리게이트되었다. 리게이션 생산물은 XL-1세포내로 변형되었고 변형된 E. coli의 앨리쿠오트(aliquot)은 50μg/mL의 암피실린을 포함하는 LB 아가르(agar) 판위로 놓여졌고 40μL의 X-겔 스탁(stock, 50mg/mL)과 40μL IPTG(100 mM)용액으로 화이트/블루(white/blue)선택을 위해 칠하여졌다(overlaid). 밤새도록 37℃에서 플레이트는 배양되었고 잠재 클론들은 화이트 칼러니(colonies)f로 확인되었다. 각 PCR생산물을 위한 적어도 24개의 독립 클론들부터의 DNA는 pNEB193과 pCR® 2.1.을 위한 유니버설(universal) 포워드(forward)와 역 프라이머를 사용하여 양쪽 가닥위에 시퀀스되었다. 결과적인 서열은 각 항체의 가볍고 무거운 사슬의 변화 영역 에 대한 공통 서열을 발생시키기 위해 콘티그(contig)안으로 모여졌다. 이러한 접근방식을 이용하여 하이브리도마의 20C2, 5F10, 2D6, 2B4, 4E2, 2H4,2A10, 3B3, 1F6, 1F4, 2E12 및 4C2의 가볍고 무거운 항체 변화 영역에 대해 서열이 결정되었다(그림 6A-6X).
항원에 대해 상보적 구조를 형성하는 6개의 상보성(complementarity) 결정 영역(CDRs)은 그림 6A-6X에서 밑줄이 그어졌다. CDRs와 대응하는 항원결정기(표 2)의 분석에 의해 서열의 유사성이 관찰되었다. Aβ1-42(즉, 2A10, 4C2, 2D6, 4E2, 20C2, 2B4 및 5F10)의 3-8 아미노산 항원결정기를 공유하는 항체는 무거운 사슬의 매우 높게 일치하는 CDR1(그림 7A)와 CDR2(그림 7B)의 서열을 공유하였다. Aβ1-42의 1-8의 아미노산 항원결정기를 인식하는 것으로 알려진 항체 2H4는 무거운 사슬의 독특한 (CDR 3, 그림 7D)서열을 갖고, 가벼운 사슬의 독특한 CDR 1(그림 7D), CDR 2(그림 7E) 및 CDR 3(그림 7F) 서열을 갖는 것으로 나타났다. 비슷하게 Aβ1-42의 3-10의 아미노산 항원결정기를 인식하는 것으로 알려진 항체 2E12는 무거운 사슬의 독특한 CDR 3서열을 갖는다(그림 7C). 게다가 SEC 피크 1과 피크 2 ADDL(그림 3 참조)에 대한 비슷한 친화도를 갖는 항체 2A10, 2B4, 4C2 및 4E2는 무거운 사슬의 높게 일치하는 CDR 3 서열을 공유한다(그림 7C). 게다가 4E2가 2D6보다 뉴런에 ADDL이 부착되는 것을 차단하는 데 더 효과적이고 4E2와 2D6의 무거운 사슬과 가벼운 사슬은 무거운 사슬의 CDR 3의 3개의 아미노산 잔기를 제외하고는 동일하기 때문에, 항체 4E2의 무거운 사슬의 CDR 3의 아미노산 치환은 신경세포에 ADDL이 결합하는 것을 차단하는 능력을 향상시키는 것으로 나타났다; Ser vs. Asn, Thr vs. Ser, and Ile vs. Val For 2D6 and 4E2, respectively(그림 7C).
실시예 18: 쥐의 항- ADDL 항체 변화 영역 서열의 인간화(Humanization)
쥐의 하이브리도마 세포주 20C2, 26D6, 4E2, 3B3, 2H4 및 1F6으로부터 얻어진 쥐의 항체 무거운 그리고 가벼운 변화 영역 핵산은 CDR 이식 접근으로 인간화되었고 20C2와 26D6은 베니어링(Veneering)이 사용되었다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 혈청의 반감기를 개선시키고 항-글로블린 반응을 감소시키는 Fc 이펙터(effetor)작용을 개선하므로써 쥐의 항체 서열의 인간화는 항체의 치료 잠재력을 최대화할 수 있다는 것을 알 수 있다.
CDR 이식에 의한 인간화는 쥐의 변화 영역에 가장 일치하는 NCBI단백질 데이터베이스로부터 인간의 가벼운 그리고 무거운 사슬을 선택함으로써 수행되었다. 쥐의 변화 영역 서열은 단백질-단백질 Basic Local Alignment Tool(BLAST)를 사용하여 데이터베이스안의 모든 인간의 변화 영역 서열과 비교되었다. 다음으로 쥐의 CDR은 인간의 틀(framework) 영역에 연결되었고 예비 아미노산 서열이 분석되었다. 틀 영역 안의 쥐와 인간간의 모든 차이는 그것들이 고리 구조에 대한 전통적인 서열의 일부인지 아니면 VL/VH에 존재하는 잔기인지가 특히 평가되었다(O'Brien and Jones9(2001) In: Antibody Engineering, Kontermann and Dubel(Eds.)Springer Laboratory Manuals). 틀 영역은 인간의 서브그룹(subgroup)과 강력한 글리코실레이션 부위에 대한 공통 서열과 비교하여 보통이 아니고 흔치 않은 아미노산 서열에 대해 스캔되었다. 전형적인 서열과 관련이 없거나 VL/VH경계에서 위치하지 않는 쥐와 인간간의 아미노산 서열의 차이가 존재하는 곳에서, 인간의 잔기는 그 지점에서 선택되었다. 핵심(key) 잔기의 차이가 존재하는 곳에서 평가를 위해 변화 영역 서열의 두 종류(version)이 발생되었다. CDR이식 전략은 인간의 틀 영역에 최소한의 변화를 일으키므로 자연적인 인간 항체의 서열과 매치되는 인간 틀 영역을 유지하면서 좋은 항원 결합이 이루어졌다.
20C2와 26D6에 대한 인간화 서열은 베니어링 전략(예를 들어, U.S. Patent No. 6,797,492를 참조)을 사용하여 계획되었다. 인간화는 인간 항체 점라인 족(germline family)이나 족들(families)에 가장 유사함은 물론 쥐의 변화 영역에 가장 일치하는 NCBI 단백질 데이터베이스로부터 인간의 가벼운 그리고 무거운 사슬 변화 영역을 선택함으로써 수행되었다(참조, Kabat, eta 1.(1991) Sequence of proteins of immunological interest, 5th ed., U.S. Dept. Health and Human Services, NIH, Washington DC). 쥐의 변화 영역 서열은 단백질-단백질 BLAST를 이용하여 데이터베이스 내의 인간의 모든 변화 영역 서열과 비교되었다. 쥐의 변화 영역 서열과 인간의 것과 가장 상응하는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 관용적으로 사용되는 컴퓨터 모델링으로 가장 근접하게 구체화되었다. 쥐의 VH와 VL의 모델로부터 쥐의 무거운 그리고 가벼운 변화 영역안의 아미노산의 해석 가능한 접근을 지시하는 표면 지역 지도가 작성되었다. 모델링을 확인하기 위해 이러한 노출된 잔기들이 알려진 표면 접근가능한 잔기와 위치 대 위치로 비교되었다(예를 들어, Padlan(1994) Mol. Immunol.31(3):169-217참조). 정해진 방법에 따라 서열안의 그것을 지정하는 각 잔기를 노출된(exposed), 가장 노출된, 부분적으로 묻혀진(buried), 대부분 묻혀진, 묻혀진 으로 배정되었다(U.S. patent No. 6,797,492 참조). 노출된 또는 대부분 노출된 것으로 평가된 쥐의 틀 잔기는 그 위치에서 인간의 잔기로 변화되었다. 계획된 베니어드(veneered) 서열은 쥐의 CDRs, CDRs에 근접한 잔기, 일반적인 서열과 관계된 것으로 알려진 잔기, VH/VL 경계에 위치하는 잔기 및 쥐의 무거운 그리고 가벼운 사슬의 N-말단 서열의 잔기를 보유하였다. N-말단 서열은 CDR표면과 접촉하는 것으로 알려져 있고 리간드 결합과 잠재적으로 관련이 있다. 비슷하게 Pro, Gly 또는 하전된 잔기에서의 극한 변화에 관심이 주어졌다. 일단 베니어드(veneered)서열이 끝나고 리모델이 된 것은 찾는 것은 명백한 구조적 이슈이다. 어떤 예에서는 분석을 위해 하나 이상의 베니어드 서열이 생성되었다. 베니어링 접근법에 의한 인간화된 아미노산 서열의 계획은 그림 9에 나타내었다.
일단 인간화된 아미노산 서열이 선택된 후에는 상응하는 DNA서열을 얻기 위해 그 서열은 역전사되었다. 상기 DNA서열은 확립된 기술적 방법으로(art-established method) 코돈-적정화되었고(codon-optimized, Lathe(1985) J. Mol. Biol. 183(1):1-12) 클로닝을 위해 인간 항체 표현 벡터로 측면 제한 효소자리로 계획되었다. 합성된 DNA서열은 그림 10A-10S에서 나타내었다. CDR이식과 베니어링으로 계획된 20C2 인간화된 항체에 대해서, 인간의 IgG1/kappa 와 IgG2m4/kappa 형(version)이 구성되고 IgG2m4는 표준 인간 IgG2 일정 영역으로 인간 IgG4 서열의 선택적인 혼입을 나타낸다. IgG1/kappa 와 IgG2m4/kappa 형(version)은 또한 26D6 CDR 이식된 항체를 위해 만들어졌다. 다른 모든 항체에 불구하고 오로지 IgG1/kappa형(versions)이 만들어졌다. 결과적인 항체의 완전한 아미노산 서열이 그림 11A-11Y에서 나타난다.
항체들은 분리된 가벼운 그리고 무거운 사슬 발형 플라스미드가 293 EBNA세포로 동시-일과성의 전달감염(co-transient transfection)에 의해 발현되었다. 하나 이상의 인간화된 무거운 그리고 가벼운 사슬 서열이 주어진 항체를 위해 계획된 경우에 무거운 그리고 가벼운 사슬의 모든 조합은 상응하는 항체를 생성하기 위해 조합되었다. 항체들은 단백질 A칼럼을 이용하여 7-10일 전달감염 후 배양 상청액으로부터 순수화되고 연속하는 분석에 사용되었다.
실시예 19: IgG2m4 항체의 생성
IgG2m4 항체 유도체는 전형적인 인간 항체의 긴 반감기와 약동학적(pharmacokinetic) 성질을 유지하는 동안 Fc 수용체 진입, C1q 결합, 원하지 않는 세포독성, 면역 착화합물(immunocomplex) 형성하는 것을 감소시키기 위해 제조되었다. 기초적인 IgG2m4의 포맷(format)은 실험에서 월등한 반감기를 갖는 것으로 나타난 IgG2의 포맷이다(Zuckier, 외 다수. (1994) J. Exp. Med. 173:794-799). IgG2의 구조는 FcγR결합의 전형적인 낮은 수준이 유지되는 동안 IgG4 서열의 의 선택적인 혼입을 통하여 C1q결합을 제거하기위해 조정되었다(Canfield and Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491). 이것은 IgG2와 IgG4의 서열이 일치하고 다른 인공 변이 서열보다 자연적인 Fc 서열을 포함하는 항체를 생성하는 교차점을 이용하여 달성되었다.
인간항체의 일정 영역의 IgG2m4의 형태는 그림 12에서 나타낸 바와 같이 인간의 IgG4서열을 표준 인간의 IgG2 일정 영역내로 선태적인 혼입을 하여 형성되었다. 개념적으로, IgG2m4는 그림 12에 나타낸 바와 같이 CH2 영역안의 사슬-교환(chain-swaps)의 한 쌍으로부터 기인한다. 4개의 단일 변이가 IgG4의 서열에 대응하여 만들어졌다. IgG2안의 변이된 Fc잔기는 새로운 항원결정기(neoepitopes)에 대한 잠재력을 최소화시키는 HIS268Gln, Val309Leu, Ala330Ser 및 Pro331Ser을 포함하였다. IgG2일정 영역내로 자리잡은 특정 IgG4아미노산 잔기는, 기초적인 구조로부터의 다른 대안들과 함께, 표 7에 나타내어졌다.
잔기(Kabat numbering) IgG2 안의 잔기 IgG4 안의 잔기 IgG2m4 안의 잔기 IgG2m4 안의 대체 잔기 비고
189 Pro 또는 Thr* Pro Thr Pro IgG2의 핵심 다형성(key polymorphism);IGHG*01동종이형 안에 존재하는 Pro 잔기와 IGHG*02동종이형a,b 안에 존재하는 Thr 잔기
268 His Gln Gln -- FcγRII결합c과 관련이 있는 것으로 알려진 B/C 고리의 변화
309 Val Leu 또는 Val Leu Val FcRN결합영역
330 Ala Ser Ser -- Clq 결합d을 위한 핵심 잔기; 또한 FcγRII결합과 FcγRIIIe결합과 잠재적으로 관련있다.
331 Pro Ser Ser -- Clq 결합d,f과 FcγRIg을 위한 핵심 잔기; 또한 FcγRII결합과 FcγRIIIe결합과 잠재적으로 관련있다.
397 Met 또는 Val* Val Met Val IGHG*01동종이형 안에 존재하는 Val 잔기와 IGHG*02동종이형a, 안에 존재하는 Met 잔기
*별표로 표시된 위치는 대립변화(allelic variations)를 받기 쉬운 곳이다.
aHougs, 외 다수. (2001) Immunogenetics 50(3-4):242-8.
bWO 97/11971.
cMedgyesi, 외 다수. (2004) Eur. J. Immunol. 34:1127-1135.
dTao, 외 다수. (1991) J. Exp. Med. 173:1025-1028.
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gCanfield and Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483.
실시예 20: 인간화 Anti- ADDL 항체의 결합 친화력
인간화 항체의 ADDL 결합 친화력을 향상시키기 위해서, titration ELISA가 본 명세서에서 공개한 바와 같이 수행되었다. 스트렙트아비딘(streptavidin)-코팅된, 96-웰 마이크로타이터 플레이트(96-well microtiter plate)는 10%의 비오틴(biotin)이 결합된 ADDL 항체(1 μM)로 코팅되었다. 500 ng/mL에서 시작한 정제된 항체의 일련의 2-fold dilution이 ADDL 고정 플레이트에 첨가되었고, 상기 플레이트는 25℃에서 2시간동안 배양되었다. 플레이트 세정제(Bio-Tek, Winooski, VA)를 사용한 PBS 용액으로 5회에 걸쳐 세정한 후, 다클론성의 염소 항-인간 카파 경량 사슬 항체(goat anti-human kappa light chain antibody)(Biomeda, Foster City, CA)를 3%의 무-지방 우유 차단제 내에 1/2000으로 희석하여 첨가하였고, 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 토끼 항-염소 IgG (H+L) HRP-결합된 (Bethyl Laboratories, Inc., Montgomery, TX) 검출 항체가 차단 용액 내에 1/2000으로 희석하여 첨가되고, 실온에서 1시간동안 배양되었다. PBS, HRP 기질로 세정한 후, 3,3',5'5-테트라메틸벤지딘(3,3',5'5-tetramethylbenzidine)(ready-to-use TMB; Sigma, St. Louis, MO)을 첨가하였고, 0.5 N H2SO4를 첨가하고 10분후에 반응을 종료하였다. 450 nm의 파장의 흡수된 것이 플레이트 리더(모델 VICTOR V; Perkin Elmer, Boston, MA)에 의해 감지되었고, 데이터는 EXCEL® 워크 시트에 기재하였다. 플레이트들 간의 분석 편차는 20% 내로 측정되었다.
각기 다른 그룹의 인간화 항체들을 각기 다른 실험으로 비교하였다. CDR 그라프팅으로 인간화된 IgG1 항체 20C2A, 20C2B, 3B3, 4E2, 1F6 및 2H4을 비교한 결과 모든 항체들은 ADDL과 결합할 수 있고, 1F6과의 결합이 그 중 제일 약하였고 20C2A가 가장 강하였다. 20C2 IgG1 항체의 네 개의 다른 인간화 버전(두 개의 CDR 그라프트된 버전과 두 개의 베니어(veneered) 버전)은 매우 유사한 ADDL 결합 곡선들이 최상의 20C2 항체보다 약간 더 뛰어난 결합력을 가지는 것으로 비교 판단되었다. 26D6 IgG1의 일곱 개의 다른 인간화 버전(한 개의 CDR 그라프트된 버전과 여섯 개의 베니어 버전) 또한 비교되었다. 상기 모든 버전들은 26D6의 최상의 형태와 유사한 ADDL 결합 곡선을 가지는 것으로 비교 판단되었다. CDR 그라프팅으로 인간화된 상기 두 개의 20C2 버전에 대한 IgG1과 IgG2m4 항체들이 분석되었고 CDR 그라프팅으로 인간화된 26D6의 IgG1과 IgG2m4의 아이소타이프(isotype)와 마찬가지로 유사한 결합 곡선을 가지는 것으로 판단되었다.
실시예 21: 인간화 Anti- ADDL 항체를 사용한 뉴런에의 ADDL 결합 억제
상기 인간화된 Anti-ADDL 항체에 대하여 본 명세서에서 공개한 방법을 적용하여 일차 해마 뉴런에 ADDL이 결합되는 것을 방지하기 위한 항체들의 특성을 향상시켰다. 적절한 항체들, 또는 조절된 PBS는 1:1(B103 신경아세포종 세포) 또는 1:5(일차 해마 뉴런)의 몰농도로 2.5-10 μm(최종 농도)의 bADDL과 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 느린 교반기 위에서 배양되었다. 상기 조기 배양 후에 상기 항체/bADDL 혼합물을 상기 B103 또는 일차 뉴런 배양액에 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 더 배양하였다. 배양 기간의 말기에, 상기 항체/bADDL 혼합물을 제거하였고, 상기 플레이트는 미디어(media)를 사용하여 6회에 걸쳐 세정하였다. 상기 세포들은 실온에서 10분 동안 4%의 파라포름알데히드 내에 고정되었고, 상기 용액을 제거하고 새로운 고정액을 첨가한 후, 상기 세포들을 추가적으로 10분 동안 더 고정하였다. 상기 세포들은 0.1 % TRITONTM x-100을 포함하는 4%의 파라포름알데히드에 투과되었고(실온에서 매 10분마다 2회), PBS 내에서 6회에 걸쳐 세정하였고, 그 후 37℃에서 1시간 동안 PBS 내에서 10%의 BSA로 처리하였다. 그 후 알칼리성 포스페타아제-적용 스트렙트아비딘(phosphatase-conjugated streptavidin)(1:1, 500 in 1% BSA; Molecular Probes, Eugene, OR)을 실온에서 1시간 동안 상기 세포에 첨가하였다. 상기 세포들을 6회에 걸쳐 PBS로 세정하였고, 상기 알칼리성 포스페타아제 기질(바이오시스템이 적용된 SAPPHIRE-IITM의 CDP-STAR®, Foster City, CA)을 상기 세포에 첨가하였고, LJL 루미노미터(luminometer)(Analyst AD; LJL Biosystems, Sunnyvale, CA) 상의 발광을 측정하기 전에 30분 동안 배양하였다. 뮤린 항체와 함께, 26D6, 20C2, 4E2, 3B3, 2H4 및 1F6의 인간화 버전은 ADDL 혼합물이 B103 신경아세포종 세포 및 일차 뉴런에 결합되는 것을 억제할 수 있었다.
실시예 22: 인간화 Anti-ADDL 항체의 친화력 성숙
핵산 분자 인간화 20C2 버전으로 암호화된다. 다양한 중량 사슬만, 또는 경량 사슬만, 또는 중량 사슬과 경량 사슬이 함께 파브 파지-디스플레이 벡터(fab-phage-display vector) pFab3d 내에서 클론화된다. 핵산 시퀀스 분석으로 pFab3d 내에서 시퀀스와 방향을 확인하였다. 주석이 달린 pFab3d 내에서의 20C2 Fab 시퀀스를 도 13에 나타내었고 본 명세서에서 중량 사슬에 대해 SEQ ID NO:255로 표시하고 경량 사슬에 대해 SEQ ID NO:256으로 설명하였다. 공지된 기술인 파지-디스플레이 파브 라이브러리(fab library) 방법을 사용하는 20C2 성숙 프로그램에서 세 개의 구성체가 사용되었다.
간단히 말하면, 두 개의 라이브러리들은 20C2의 경량 (카파) 사슬 CDR3의 아홉 개의 원형의 아미노산이 변형되도록 형성되었다(즉, Phe-Gln-Gly-Ser-Leu-Val-Pro-Leu-Thr; SEQ ID NO:60). 이러한 라이브러리들은 각각 Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Val-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:257)와 Phe-Gln-Gly-Ser-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa (SEQ ID NO:258)의 경량 사슬 CDR3 시퀀스를 나타내는 LC3-1과 LC3-2로 표시하였다. 비오틴이 결합된 역전사 프라이머(reverse primer)인 20C2LC3F(SEQ ID NO:259)과 20C2LC3-2(SEQ ID NO:260)는 LC3-1과 LC3-2 라이브러리를 생성하기 위해서 프라이머(SEQ ID NO:261)와 결합하여 사용되었다. 프라이머들은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 정제되었고, 벡터 DNA는 겔 전기영동법과 전기용출법에 의해 정제되었다. 상기 두 개의 경량 사슬 라이브러리들은 무작위적으로 변화되도록 형성되었다. 세 개의 10G5H6 LC3 라이브러리들의 최종 다양성은 각각 4.76×108과 7.45×108이다(표 8). 상기 라이브러리들로부터의 대략 100 클론에 대한 시퀀스 분석한 결과, 형성된 아미노산 배치 상에 있어서 돌연변이 클론의 100% 다양성을 나타내고 있다.
Figure 112007038039374-PCT00006
* 높은 수준의 역가(titer)는 농도 또는 파지 구조(phage rescue)에 의해 이루어졌다.
고분자 bADDL에 대하여 상기 두 개의 20C2 경량 사슬 라이브러리의 가용성 패닝(soluble panning)을 실행하였다. 간단히 말하자면, 4회의 패닝이 비오틴이 결합된 고분자 ADDL(bADDL)을 사용하여 실행되었다. 최초 3회는 대략 1.5 μM의 항체 농도(입력= 1×1010 내지 1×1011)로 실행되었다. 상기 3회를 실행한 후에, 상기 두 개의 라이브러리들의 산출물은 결합되어 패닝기법의 정확도를 높이기 위해 10 nM, 100 nM 및 약 1.5 μM 항체로 분석할 수 있도록 세 개의 그룹으로 나뉘었다. 이와 같이, 총 58개의 출력 플레이트이 파지 ELISA 측정법(phage ELISA assay)에 의해 테스트되었다. 즉, 1회차에서의 라이브러리마다 두 개의 플레이트(총 네 개의 플레이트), 2회차에서의 라이브러리마다 여섯 개의 플레이트(총 열두 개의 플레이트), 3회차에서의 LC3-1에 대한 여덟 개의 플레이트와 LC3-2에 대한 열 개의 플레이트(총 18개의 플레이트) 및 4회차에서의 각각의 항체 농도에 대한 여덟 개의 플레이트(총 24개의 플레이트).
패닝은 1000번 이루어졌고, 436개의 시퀀스가 발생되었다.
Figure 112007038039374-PCT00007
a20C2 LC3-1 대 고분자 10% bADDL.
b20C2 LC3-2 대 고분자 10% bADDL.
c20C2 LC3-1 + 20C2 LC3-2 대 고분자 10% bADDL.
* 콜로니(colony)의 총개수 마다의 횟수(hit)
고농축 클론의 시퀀스와 횟수가 표 10에 기재되어 있다.
Figure 112007038039374-PCT00008
농축 횟수에 기초하여 상위 10개의 클론으로부터 fab 절편을 형성하고, 총 15개의 클론들을 IgG1 인간화 A 버전으로 변화시키고, 두 개의 클론, 20C2-6과 20C2-8은 IgG1 인간화 B 버전으로 변환되었다. 이러한 클론들에 대한 KD 수치는 항체로서 비오틴-Aβ1-20(biotin-Aβ1-20)(표 11)과 bADDL(표 12)를 사용하여 BIACORETM에 의해 측정되었다. 쥐 20C2(mouse 20C2) 항체뿐만 아니라 모체 인간화 20C2A와 20C2B와 비교한 결과, 친화력에 있어서 매우 향상된 것으로 관찰되었다. 특히, 시퀀스 Xaa1-Gln-Xaa2-Thr-Arg-Val-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:318)의 경량 사슬 CDR3은 나노몰(nanomolar) 내지 서브-피코몰(sub-picomolar) 사이의 KD 수치를 갖고, 상기 Xaa1는 Phe 또는 Leu이고 Xaa1는 Ala 또는 Thr이다. 또한, 비오틴-Aβ1-20과 bADDL를 사용하는 BIACORETM으로 측정한 KD 수치들을 비교한 결과, 20C2와 같은 anti-ADDL 항체들은 단량체 Aβ 펩티드보다 다-차원 형상의 ADDL과 결합하는 것이 바람직하다는 것을 보여준다.
Figure 112007038039374-PCT00009
Figure 112007038039374-PCT00010
SEQUENCE LISTING <110> Merck & Co., Inc. Acumen Pharmaceuticals, Inc. Northwestern University Acton, Paul An, Zhiqiang Bett, Andrew J. Breese, Robert Chen Dodson, Elizabeth Kinney, Gene Klein, William R. Krafft, Grant A. Lambert, Mary P. Liang, Xiaoping Pray, Todd R. Shughrue, Paul Strohl, William R. Wang, Fubao <120> ANTI-ADDL ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> MRK0002US <150> US 60/621,776 <151> 2004-10-25 <150> US 60/652,538 <151> 2005-02-14 <150> US 60/695,528 <151> 2005-06-30 <150> US 60/695,526 <151> 2005-06-30 <160> 322 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 459 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1 tgggcagact taccattctc attcctgctg ctgattgtcc ctgcatatgt cttgtcccaa 60 gttactctaa aagagtctgg ccctgggata ttgaagccct cacagaccct cagtctgact 120 tgttctctct ctgggttttc actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gtttcgtcag 180 ccttcaggga agggtctgga gtggctggca cacatttggt gggatgatga taagtcctat 240 aatccatccc tgaagagccg gctcacaatc tccaagtata cctctagaaa ccaggttttc 300 ctcacgatca ccagtgtgga cactgcagat actgccactt actattgtgc tcgaagacaa 360 ctcggactaa gatcaattga tgctatggac tactggggtc aaggaacctc agtcaccgtc 420 tcctcagcca aaacgacacc cccatctgtc tatccactg 459 <210> 2 <211> 435 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 2 agattgcctg ttaggctgtt ggtgctgatg ttctggattc ctgcttccac cagtgatgtt 60 ttgatgaccc aaactcctct ctccctgcct gtcagtcttg gagatcaagc ctccatctct 120 tgcagatcta gtcagagcat tctacatagt aatggaaaca cctatttaga gtggtacctg 180 cagaaaccag gccagtctcc aaagctcctg atctacaaag tttccaaccg attttctggg 240 gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca gggacagatt tcacactcaa gatcagcaga 300 gtggaggctg aggatctggg agtttattac tgttttcaag gttcacttgt tccgctcacg 360 ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420 ttcccaccat ccagt 435 <210> 3 <211> 453 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 3 tgggcagact taccattctc attcctgctg ctgattgtcc ctgcatatgt cctttcccag 60 gttactctga aagagtctgg ccctgggata ttgcagccct cccagaccct cagtctgact 120 tgttctttct ctgggttttc actgagcact tctggtatgg gtgtgagctg gattcgtcag 180 ccttcaggaa agggtctgga gtggctggca cacatttact gggatgatga caagcgctat 240 aacccatccc tgaagagccg gctcacattc tccaaggatt cctccagaaa ccaggtattc 300 ctcaagatca ccagtgtgga cactgcagat actgccacat actactgtgc tcgctatgat 360 ggttacccct actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 gccaaaacaa cacccccatc ggtctatcca ctg 453 <210> 4 <211> 435 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 agattgcctg ttaggctgtt ggtgctgatg ttctggattc ctgtttccag cagtgttgtt 60 ctgatgaccc aaactccact ctccctgcct gtcagtcttg gagatcaagc ctccatctct 120 tgcagatcta gtcagagcct tgtacacagt aatggaaaca cctatttaca ttggtacctg 180 cagaagccag gccagtctcc aaagctcctg atctacaaag tttccaaccg attttctggg 240 gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca gggacagatt tcacactcaa gatcagcaga 300 gtggaggctg aggatctggg agtttatttc tgttttcaaa gtacacatgt tccgctcacg 360 ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420 ttcccaccat ccagt 435 <210> 5 <211> 462 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 5 tgggcagact taccattctc attcctgctg ctgattgtcc ctgcatatgt cttgtcccaa 60 gttactctaa aagagtctgg ccctgggata ttgaagccct cacagaccct cagtctgact 120 tgttctttct ctgggttttc actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag 180 ccttcaggga agggtctgga gtggctggca cacatttggt gggatgatga taagtactat 240 aacccatccc tgaagagcca gctcacaatc tccaaggata cctccagaaa ccaggtattc 300 ctcaagatca ccagtgtgga cactgcagat actgccactt actactgtgc tcgaagatcc 360 attagtacgg taatacctga ggactacttt gactactggg gccaaggcac cattctcaca 420 gtctcctcag ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tg 462 <210> 6 <211> 435 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 agattgcctg ttaggctgtt ggtgctgatg ttctggattc ctgcttccac cagtgatgtt 60 ttgatgaccc aaactccact ctccctgacc gtcagtcttg gagatcaagc ctccatctct 120 tgcagatcta gtcagagcat tgtgcatagt aatggaaaca cctatttaga atggtacctg 180 cagaaaccag gccagtctcc aaagctcctg atctacaaag tttccaaccg attttctggg 240 gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca gggacagatt tcacactcaa gatcagcaga 300 gtggaggctg aggatctggg agtttattac tgctttcaag gttcacatgt tccgctcacg 360 ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420 ttcccaccat ccagt 435 <210> 7 <211> 453 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 7 tgggcagact taccattctc attcctgctg ctgattgtcc ctgcatatgt cctttcccag 60 gttactctga aagagtctgg ccctgggata ttgcagccct cccagaccct cagtctgact 120 tgttctttct ctgggttttc actgagcact tctggtatgg gtgtgagctg gattcgtcag 180 ccttcaggaa agggtctgga gtggctggca cacatttact gggatgatga caagcgctat 240 aacccatccc tgaagagccg gctcacaatc tccaaggata cctccagaaa ccaggtattc 300 ctcaagatca ccagtgtgga cactgcagat actgccacat actactgtgc tcgctatgat 360 ggttacccct actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 420 gccaaaacaa cacccccatc agctcatcca ctg 453 <210> 8 <211> 435 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 8 agattgcctg ttaggctgtt ggtgctgatg ttctggattc ctgcttccag cagtgatgtt 60 gtgatgaccc aaactccact ctccctgcct gtcagtcttg gagatcaagc ctccatctct 120 tgcagatcta gtcagagcct tgtacacagt aatggaaaca cctatttaca ttggtacctg 180 cagaagccag gccagtctcc aaagctcctg atctacaaag tttccaaccg attttttggg 240 gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca gggacagatt tcacactcaa gatcagcaga 300 gtggaggctg aggatctggg agtttacttc tgctctcaaa ctacatatgt tccgctcacg 360 ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420 ttcccaccat ccagt 435 <210> 9 <211> 462 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 9 tgggcagact taccattctc attcctgctg ctgattgtcc ctgcatatgt cttgtcccaa 60 gttactctaa aagagtctgg ccctgggata ttgaagccct cacagaccct cagtctgact 120 tgttctttct ctgggttttc actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag 180 ccttcaggga agggtctgga gtggctggca cacatttggt gggatgatga taagtactat 240 aacccatccc tgaagagcca gctcacaatc tccaaggata cctccagaaa ccaggtattc 300 ctcaagatca ccagtgtgga cactgcagat actgccactt actactgtgc tcgaagatcc 360 attaattcgg tagtacctga ggactacttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca 420 gtctccttag ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tg 462 <210> 10 <211> 435 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 agattgcctg ttaggctgtt ggtgctgatg ttctggattc ctgcttccag cagtgatgtt 60 ttgatgaccc aaactccact ctccctgcct gtcagtcttg gagatcaagc ctccatctct 120 tgcagatcta gtcagagcat tgtgcatagt aatggaaaca cctatttaga atggtacctg 180 cagaaaccag gccagtctcc aaagctcctg atctacaaag tttccaaccg attttctggg 240 gtcccagaca ggttcagtgg cagtggatca gggacagatt tcacactcaa gatcagcaga 300 gtggaggctg aggatctggg agtttattat tgttttcaag gttcacatgt tccgctcacg 360 ttcggtgctg ggaccaagct ggagctgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420 ttcccaccat ccagt 435 <210> 11 <211> 455 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 11 tgggactcca ggcttcaatt tagttttcct tgtccttatt ttaaaaggtg tccagtgtga 60 tgtgcagctg gtggagtctg ggggaggctt agtgcagcct ggagggtccc ggaaactctc 120 ctgtgcagcc tctggattca ctttcagtag ctttggaatg cactgggttc gtcaggctcc 180 agagaagggg ctggagtggg tcgcatacat tcgtagtggc agtagtacca tctactatgc 240 agacacagtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaat cccaagaaca ccctgttcct 300 gcaaatgacc agtctaaggt ctgaggacac ggccatgtat tactgtacaa gaggcgggaa 360 ttactacggt agtagccggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc 420 agccaaaaca acagccccca tcggtctatc cactg 455 <210> 12 <211> 425 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 12 tgagggcccc tgctcagttt tttggattct tgttgctctg gtttccaggt atcaaatgtg 60 acatcaagat gacccagtct ccatcttcca tgtatgcatc tctaggagag agagtcacta 120 tcacttgcaa ggcgagtcag gacattaata gctatttaag ctggttccag cagaaaccag 180 ggaaatctcc taagaccctg atctatcgtg caaacagatt cgtagatggg gtcccatcaa 240 ggttcagtgg cagtggatct gggcaagatt attctctcac catcagcagc ctggagtatg 300 aagatatggg aatttatttt tgtctacagt atgatgagtt tccgctcacg ttcggtgctg 360 ggaccaagct ggtactgaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc ttcccaccat 420 ccagt 425 <210> 13 <211> 462 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 13 tgggcagact taccattctc attcctgctg ctgattgtcc ctgcatatgt cttgtcccaa 60 gttactctaa aagagtctgg ccctgggata ttgaagccct cacagaccct cagtctgact 120 tgttctttct ctgggttttc actgagcact tctggtatgg gtgtaggctg gattcgtcag 180 ccttcaggga agggtctgga gtggctggca cacatttggt gggatgatga taagtactat 240 aacccatccc tgaagagcca gctcacaatc tccaaggata cctccagaaa ccaggttttc 300 ctcaagatca ccagtgtgga cactgcagat actgccactt actactgtgc tcgaagatcc 360 attagtacgt tggtacctga ggactacttt gactactggg gccaaggcac cactctcaca 420 gtctcctcag ccaaaacgac acccccatct gtctatccac tg 462 <210> 14 <211> 438 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 14 tgaagattgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 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agtagtacca tctactatgc 240 agacacagtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaat cccaagaata ctctgttcct 300 gcaaatgacc agtctaaggt ctgaggacac ggccatgtat tactgtgcaa gatcgggcta 360 cggtagtagt tacgggtatg gtatggacta ctggggtcaa ggaaccttag tcaccgtctc 420 ctcagccaaa acgacacccc catctgtcta tccactg 457 <210> 20 <211> 438 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 tgaagattgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttttgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag cattgtacat agtaatggaa acacctattt agaatggtac 180 ctgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tactgctttc aaggttcaca tgttccgctc 360 acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac catccagt 438 <210> 21 <211> 454 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 tgggactcca ggcttcaatt tagttttcct tgtccttatt ttaaaaggtg tccagtgtga 60 tgtgcagctg gtggagtctg ggggaggctt agtgcagcct ggagggtccc ggaaactctc 120 ctgtgcagcc tctggattca ctttcagtag ctttggaatg cactgggttc gtcaggctcc 180 agagaagggg ctggagtggg tcgcatacat tagtagtggc agttatacca tctactatgc 240 agacacagtg aagggccgat tcaccatctc cagagacaat cccaagaaca ccctgttcct 300 gcaaatgacc agtctaaggt ctgaggacac ggccatgtat tactgtgcaa gatacggtaa 360 ttacggctat tactatggta tggactactg gggtcaagga acctcagtca ccgtctcctc 420 agccaaaacg acacccccat ctgtctatcc actg 454 <210> 22 <211> 438 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 tgaagattgc ctgttaggct gttggtgctg atgttctgga ttcctgcttc cagcagtgat 60 gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120 tcttgcagat ctagtcagag ccttgtacac agtaatggaa acacctattt acattggtac 180 ctgcagaagc caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240 ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag atttcacact caagatcagc 300 agagtggagg ctgaggatct gggagtttat ttctgctctc aaagtacaca tgttcctccg 360 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420 atcttcccac 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aliphatic side chain group <400> 65 Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Val Pro Xaa Thr 1 5 <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR3 <400> 66 Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 67 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 67 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Leu Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Val Gly Trp Phe Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Ser Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Tyr Thr Ser Arg Asn Gln Val 65 70 75 80 Phe Leu Thr Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Arg Gln Leu Gly Leu Arg Ser Ile Asp Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 68 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser 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<220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 243 gatctctaga tggmttgggt gtggamcttg cttattcctg 40 <210> 244 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 244 gatctctaga tgggcagact taccattctc attcctg 37 <210> 245 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 245 gatctctaga tggattttgg gctgattttt tttattg 37 <210> 246 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 246 gatctctaga tgatggtgtt aagtcttctg tacctg 36 <210> 247 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 247 gcatcgagct ccagtggata gacagatggg gg 32 <210> 248 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 248 gcatcgagct ccagtggata gaccgatggg gg 32 <210> 249 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 249 gcatcgagct ccagtggatg agctgatggg gg 32 <210> 250 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 250 gcatcgagct ccaagggata gacagatggg gc 32 <210> 251 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 251 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Ala Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln 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Sequence <220> <223> Synthetic immunoglobulin constant region <400> 254 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Thr Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr 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(63)..(64) <223> n denotes any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (66)..(67) <223> n denotes any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (69)..(70) <223> n denotes any nucleotide <400> 259 cagccaccgt acgcttgatc tccagcttgg tgccctggcc aaaggtcagg ggcacmnnmn 60 nmnnmnnmnn gcagtagtag ac 82 <210> 260 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <220> <221> misc_feature <222> (45)..(46) <223> n denotes any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (48)..(49) <223> n denotes any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (51)..(52) <223> n denotes any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (54)..(55) <223> n denotes any nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (57)..(58) <223> n denotes any nucleotide <400> 260 cagccaccgt acgcttgatc tccagcttgg tgccctggcc aaamnnmnnm nnmnnmnngc 60 tgccctggaa gcagtagtag ac 82 <210> 261 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 261 ctatggcttc tagagatgtg gtgatg 26 <210> 262 <211> 9 <212> 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Claims (10)

  1. 하나 또는 그 이상의 Aβ-유도된 확산성 리간드의 다차원적 구조를 특이하게 인식할 수 있는 분리된 항체 또는 그 절편.
  2. 약제학적으로 수용 가능한 운반체와 혼합된 하나 또는 그 이상의 Aβ-유도된 확산성 리간드의 다차원적 구조를 특이하게 인식할 수 있는 분리된 항체 또는 그 절편을 포함하는 약제학적 조성물.
  3. 제1항의 항체에 뉴런을 접촉시키는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 뉴런에 Aβ-유도된 확산성 리간드의 결합을 차단하기 위한 방법.
  4. 제1항의 항체에 아밀로이드 β 1-42 펩티드를 포함하는 샘플을 접촉시켜 Aβ-유도된 확산성 리간드의 어셈블리를 차단하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 Aβ-유도된 확산성 리간드의 어셈블리를 차단하기 위한 방법.
  5. 제1항의 항체에 타우 단백질을 포함하는 샘플을 접촉시켜 Ser202/Thr205에서의 타우 단백질의 인산화 반응을 차단하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 Ser202/Thr205에서의 타우 단백질의 인산화 반응을 차단하기 위한 방법.
  6. 제2항의 약제학적 조성물을 효과적인 양으로 투여하는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 Aβ-유도된 확산성 리간드와 연관된 병을 예방적으로 또는 치료적으로 처리하기 위한 방법.
  7. 약제 존재하에 Aβ-유도된 확산성 리간드와 뉴런을 접촉시키고, 그리고 제1항의 항체를 사용하여 약제 존재하에서 뉴런에 Aβ-유도된 확산성 리간드의 결합을 결정하는 것을 특징으로 하는 뉴런에 Aβ-유도된 확산성 리간드의 결합을 차단하는 치료 약제를 식별하기 위한 방법.
  8. 제1항의 항체와 샘플을 접촉시켜 Aβ-유도된 확산성 리간드를 검출되는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 샘플 내에서 Aβ-유도된 확산성 리간드를 검출하기 위한 방법.
  9. 제1항의 항체와 샘플을 접촉시켜 Aβ-유도된 확산성 리간드와 연관된 병을 진단되는 단계로 이루어지는 것을 특징으로 하는 Aβ-유도된 확산성 리간드와 연관된 병을 진단하기 위한 방법.
  10. 제1항의 분리된 항체 또는 그 절편으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 Aβ-유도된 확산성 리간드를 검출하기 위한 키트.
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