CN104936980B - 用于治疗和预防多瘤病毒相关的疾病的重组人抗体 - Google Patents

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Abstract

提供了新的人源化抗体以及与其相关的方法，该抗体特异性识别多瘤病毒多肽，优选能够结合至JC病毒(JCV)和/或BK病毒(BKV)类型的多瘤病毒。另外，公开了与抗体相关的测定和试剂盒，该抗体对于优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1和或多瘤病毒VP1病毒样颗粒(VLP)是特异性的。人源化抗体以及其结合片段、衍生物和变体以被用于多瘤病毒靶向的免疫治疗和诊断的药物和诊断组合物中。

Description

用于治疗和预防多瘤病毒相关的疾病的重组人抗体
技术领域
本发明通常涉及特异性地结合至人多瘤病毒和/或其抗原的新型分子，特别是人抗体及其片段、衍生物和变体，其识别JC病毒(JCV)或BK病毒(BKV)，JCV VP1蛋白和/或BKVVP1蛋白或其片段。
另外，本发明涉及包含这样的结合分子、抗体和其模拟物的药物和诊断组合物，它们均有价值作为诊断工具以识别多瘤病毒和/或多瘤病毒VP1蛋白，优选JC病毒(JCV)和/或BK病毒(BKV)，JCV VP1蛋白和/或BKV VP1蛋白或其片段，并且也均有价值作为被动疫苗接种策略，用于治疗与多瘤病毒感染相关的疾病，如进行性多灶性白质脑病(PML)，颗粒神经元的感染，深染核，颗粒细胞神经元病，脑自萎缩，脑病，脑膜炎，多瘤诱导的肿瘤，免疫重建炎性综合征(IRIS)，出血性膀胱炎，肺炎，视网膜炎，结肠炎，脉管炎，间质性肾病，呼吸道的感染。
背景技术
多瘤病毒是显示受限的物种和细胞类型特异性的小的非包膜的双链DNA病毒。在人类中已经发现具有致癌潜力并且可以引起慢性感染的可达十种不同的多瘤病毒。JC病毒、或约翰坎宁安病毒(JCV)，是多瘤病毒科家族的成员以及多灶性脑白质病(PML)的病原体，一种大脑的威胁生命的病毒感染。BK病毒(BKV)也是人特异性多瘤病毒，其负责BK肾病和在肾移植患者中移植物的损失。JCV和BKV都是条件致病菌，其在儿童早期感染人类群体，而感染主要是渐近式的。成人中的发病流行率(血清流行率，seroprevalescence)为约70-80％(Knowls,ADV.Exp.Med.Biol.577(2006),19-45)。该病毒大多潜伏在宿主的肾细胞中，直至在免疫抑制的个体中发生重新激活。
病毒衣壳的直径为约40nm且由72个五聚体的VP1蛋白形成。每个五聚体与VP2或VP3(2个次要衣壳蛋白)的一个分子相关联。仅VP1暴露在病毒的表面上，因此，它是负责受体结合的蛋白。该病毒基因组被分为早期编码区(小和大T抗原)和晚期编码区(VP1，VP2，VP3和agno蛋白(agnoprotein))。
可达90％的全球人口已暴露于JCV而没有发展出任何临床综合征。该病毒可以在患者中在长的时间周期保留在休眠状态，并且保持在免疫系统的控制之下。然而，JCV可以被重新激活，并且可以导致中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘疾病，即进行性多灶性脑白质病(PML)。PML是发生在免疫功能低下的状态中的机会性的且常常是致命的感染，诸如人免疫缺陷病毒(HIV)感染，癌症，器官移植，血液系统恶性肿瘤或很少时在自身免疫性疾病期间。在获得性免疫缺陷综合症(AIDS)患者中，PML是最严重的并发症之一，虽然在引进抗逆转录病毒治疗后其发病率下降。
此外，靶向免疫细胞的免疫调节治疗或用于如下病症的治疗：如多发硬化(MS)以及具有肝或肾损伤的患者，和具有银屑病，系统性红斑狼疮，慢性淋巴细胞白血病(CLL)，霍奇金淋巴瘤，和克罗恩病的患者，具有发生PML的增加的风险。JCV感染小脑颗粒(granual)细胞，少突胶质细胞，肥大细胞和锥体细胞。到目前为止，其原发感染仅限于肾脏，上皮细胞，扁桃体基质细胞，骨髓，少突胶质细胞，和星形胶质细胞(Frenchy等人,Clin.Microbiol.Rev.425(2012),471-506)。
PML的发病机理的特征是在不存在显著的免疫反应的情况下髓鞘形成少突胶质细胞的裂解性感染和星形胶质细胞的顿挫感染。然而，其他中枢神经系统(CNS)细胞，如小脑颗粒神经元，也可以通过JCV感染。PML的最常见症状包括认知损伤，运动功能障碍，视觉缺陷，癫痫发作，受损的语音和头痛。
针对JCV没有特效的抗病毒药来治疗PML，所以免疫系统的重建或恢复是最好的解决方案。另一方面，增加的免疫系统活性可导致重要的淋巴细胞流涌入脑和免疫重建炎性综合征(IRIS)。
中断RNA和DNA合成的许多广谱核苷酸类似物化学治疗剂，包含例如阿糖胞苷、阿昔洛韦、和西多福韦，已被用来抑制在PML患者中的JC病毒(JCV)复制，但不是很成功(Frenchy等人，Clin.Microbiol.Rev.25(2012),471-506)。
此外，进一步的治疗策略包括通过例如5HT2a拮抗剂抑制病毒进入宿主细胞，通过例如IL-2增加T细胞量，在产生PML的患者中进行血浆交换作为例如那他珠单抗的结果。
确定用于预防PML的发作或治疗PML的疗法解决了在医药的多个领域中迫切未满足的医疗需要，包括获得性和遗传性免疫缺陷，肿瘤，移植医学和自身免疫性疾病。这种常常是致命的病毒疾病代表了与免疫缺陷相关的严重的机会性感染，如HIV感染、同种异体移植和癌症化疗。在过去的几十年中，与AIDS的流行有关，PML的发病率显著增加，而且最近与免疫抑制药物的不断增长的使用有关。接受那他珠单抗(Tysabri；Biogen/Elan)用于多发性硬化(MS)，依法利珠单抗(Raptiva；Genentech/Merck Serono)用于牛皮癣，利妥昔单抗(Rituxan；Genentech/Biogen)用于系统性红斑狼疮，以及英夫利昔单抗(Remicade；Centocor)用于类风湿关节炎和克罗恩病的患者的PML相关的死亡报告彰显了对于未来使用这些不那么安全且有效拯救生命的治疗的PML的巨大负面影响。在具有致命结果的数个PML病例后，依法利珠不得不退出市场。类似地，最近的估计认为PML的发病率以1:500使用他珠单抗治疗的MS患者在超过2年的治疗情况下具有强劲增长从而危及进一步使用这个目前最有效的针对MS的治疗。对于一些处于后期开发阶段的针对MS的新的药物候选物如利妥昔单抗/奥瑞珠单抗(抗CD20；Roche)和阿仑单抗(抗CD52；Sanofi-Aventis/Genzyme)PML的风险增加也很明显。
BK病毒(BKV)也在全球人口中广泛散布且感染可保持无症状。然而，免疫受损的患者不再抑制病毒的复制且BKV活化可导致多种疾病。BKV成为例如在接受了肾移植且因此必须服用免疫抑制药物的患者中严重的免疫抑制的情况下的主要问题。在这些患者中，病毒可在移植细胞内繁殖且造成称为BK肾病的疾病，其最终可能会导致移植失败。对于接受了骨髓移植且可以产生出血性膀胱炎的患者，BK病毒也是一个问题。(Bogdanovic等人,Anticancer Res.26(2006),1311-1318；Hirsch,Am.J.Transplant.2(2002),25-30)。然而，在移植接受者中，BKV再活化是常见的，并且导致在不同患者组中独特的病理条目(VanAlderen等人,Neth.J.Med.70(2012),172-183)。此外，BKV在HIV感染的患者中可以被重新激活，从而导致例如脑膜炎。
没有可用的治疗以清除BKV感染。一些小分子已经被报道用于限制病毒传播，但它们的作用机制尚未完全清楚。控制病毒复制的最有效的方式是恢复免疫系统或减小免疫抑制药物的剂量。然而，这也可能导致移植物排斥。
因此，需要如下的治疗装置，它能够防止多瘤病毒在人体内的感染或扩散以及与多瘤病毒感染相关的疾病的发作和进展，包括那些其中常见的医学治疗激活了多瘤病毒复制，如使用免疫抑制药物。
这种技术问题已经通过权利要求中表征的和下面如在实施例和附图中进一步描述的实施方式来解决。
发明内容
利用单克隆抗体的靶向治疗提供了一种新的治疗方法来阻止JCV和/或BKV的传播，其中通过被动免疫解决与JCV和BKV相关疾病有关的较大未满足的医疗需求。根据本发明的第一类(first in class)重组人抗体代表用于这些适应症的极有希望的新的药物候选物，所述第一类重组类抗体基于包含从PML和PML-IRIS恢复的供体的选定的人类供体群的B细胞分析产生。
本发明利用健康人类受试者的人类多瘤病毒特异性免疫应答用于产生重组抗人多瘤病毒特异性人单克隆抗体。按照本发明进行的实验成功地分别从健康人类受试者的池和从已成功地从PML和PML-IRIS恢复的患者池以及与多瘤病毒相关疾病的其他患者群体产生靶向人多瘤病毒，即JC病毒(JCV)和BK病毒(BKV)的重组单克隆人抗体；还参见在本发明上文的背景中的描述。
特别是，从健康供体的集群获得的免疫全集(HLA-DRB1*04:01+或未知单倍型)或从PML和PML-IRIS恢复的患者针对VP1进行筛选用于记忆B细胞。阳性命中被反筛选，以排除与无关的靶交叉反应的克隆并且选择性的VP1反应性B细胞受到IgG重链和轻链的cDNA克隆以及通过使用用于人类可变重链和轻链家族的免疫球蛋白框架特异性引物与人类JH区段特异性引物的组合在表达构建物中亚克隆。在表II中提供了所得到的抗体的氨基酸和DNA序列。对于这些抗体对它们在JCV VP1，JCV VP1 VLP，BKV VP1和BKV VP1 VLP上的结合特异性和结合效率进行了测试。为了测试抗体命中结合病毒样颗粒(VLP)，VP1蛋白的重折叠被设置(参见实施例2)。人类VP1特异性抗体对其靶显示出高亲和力，在皮摩尔范围内。它们是JCV特异性的(参见实施例4)，或者还对来自BKV的VP1蛋白交叉反应(参见实施例5)。一些抗体是来自两种病毒但偏爱BKV的结合VP1蛋白(参见实施例6)。接着通过跨越全长VP1序列的线性重叠肽的结合分析来评估VP1抗体的结合表位(参见实施例8)。
为了测试抗体命中阻断病毒感染和传播的效力，可以进行病毒中和测定(参见实施例9)。
由于基于抗体的治疗的安全性高度依赖于靶特异性，因此VP1抗体对不相关蛋白组的交叉反应性通过直接ELISA进行评价。VP1抗体展示对无关靶的最小的交叉反应性(图6)。将从健康供体和从PML-IRIS后患者得到的抗体命中进行比较，其响应于多发性硬化的免疫疗法而产生。可以鉴定由这种患者的记忆B细胞产生的VP1特异性高亲和抗体的升高的数量，其有可能保护和负责恢复。有趣的是，这些抗体中的大多数仅识别JCV VP1 VLP(参见实施例10)。
为了测试的示例性抗体体内识别并阻止JCV的效力，对示例性的抗体在溶液中结合至VP1 VLP和JCV的能力进行评价(参见实例11)。
在感染和PML/PML-IRIS疾病过程期间，与WT病毒相比，来自JC病毒的VP1蛋白能获得突变以逃避免疫系统或获得优势。因此，示例性的抗体的结合至最常见的PML相关的VP1突变体的能力已经被测试(参见实施例12)。
虽然控制JCV感染的机制尚未完全了解，但是JCV感染的潜伏期可能通过在健康个体中的有效的体液和/或细胞免疫应答来控制。因此，JCV特异性CD8+细胞毒性T细胞的存在已被证实与来自PML的恢复有关，而在具有致命结果的PML病例中不存在这些细胞。此外，PML优先发生在下降的CD4+T细胞数量或损害的CD4+T细胞功能的情况中，如AIDS和特发性CD4+淋巴细胞减少症。与CD8+JCV特异性T细胞的作用可比，PML的消退伴随CD4+数量和功能的恢复，这表明CD4+和CD8+病毒特异性T细胞对宿主保护至关重要。最后，存在这样的证据，鞘内抗体应答在PML中且在PML-IRIS期间消除来自大脑的JCV中起重要的作用，其中记忆B细胞和浆细胞浸润大脑和明显高的鞘内JCV VP1特异性抗体以IgG1和IgG3子类的占主导地位的应答被发现。它可能是在适应性免疫应答的所有主要参与者(即JCV特异性CD4+T细胞，JCV特异性CD8+T细胞和抗体)之间的相互作用，这确保了JCV感染在健康个体中被控制并且PML不发展。
因此，本发明涉及人和人源化抗体，抗原结合片段，以及类似的抗原结合分子，其能够特异性地识别多瘤病毒，和/或多瘤病毒VP1蛋白或其片段。如果没有另外说明，“特异性识别多瘤病毒和/或多瘤病毒VP1蛋白”，“针对/对于多瘤病毒特异性的抗体”，以及“抗多瘤病毒抗体”具体地、一般地、和统一地是指针对天然形式的多瘤病毒的抗体和/或特异性结合至任一形式的多瘤病毒的抗体和/或结合至多瘤病毒特异性VP1蛋白的抗体。本文中提供的是对于多瘤病毒，多瘤病毒VP1蛋白，和/或多瘤病毒VP1病毒样颗粒(VLP)特异性的人类抗体。
在本发明的一个优选实施方式中，人类抗体或其抗原结合片段表明其特征在于可变区VH和/或VL的抗体的免疫结合特性，如图8中所示。
此外，本发明涉及包含根据本发明的抗体或其活性片段的组合物，以及免疫治疗和免疫诊断方法，其中在预防、诊断或治疗与多瘤病毒相关的疾病，如PML中使用这样的组合物，其中将有效量的该组合物给予需要其的患者。
自然地，本发明分别延伸到人类B记忆淋巴细胞和B细胞，其产生所述抗体或其抗原结合片段，其具有如下所定义的不同的和独特的特征。
本发明还涉及至少编码本发明的抗体的免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。优选地，所述可变区包含可变区的至少一个互补决定区(CDR)，如图8所示。
因此，本发明还包括载体，其包含所述多核苷酸与其转化的宿主细胞以及它们在用于生产抗体和等效结合分子中的用途，它们对于多瘤病毒和/或多瘤病毒VP1蛋白是特异性的。用于抗体和其模拟物的重组生产的装置和方法以及用于竞争结合分子的筛选的方法在本领域中是已知的，所述竞争结合分子可以是或可以不是抗体。然而，如本文中所述，特别是关于在人类中的治疗应用，本发明的抗体是在如下意义上的人类抗体，即，所述抗体的应用基本上没有针对嵌合的和人源化的抗体以其他方式观察到这样的抗体的免疫应答。
此外，本文中所公开的是可以被用于识别样品中和/或体内的多瘤病毒和/或多瘤病毒VP1蛋白的组合物和方法。抗多瘤病毒和/或抗多瘤病毒VP1蛋白的抗体和/或其结合片段可用于针对多瘤病毒的存在来筛选人类样本，优选在样品中的JCV和/或BKV，例如通过使用基于适于表面测定的ELISA。
在本发明的一个实施方式中，包含本发明的抗体的至少一个CDR的多瘤病毒结合分子和/或其结合片段用于在体内检测或将治疗和/或诊断剂靶向人的多瘤病毒。本文公开的方法和组合物还可以给予与多瘤病毒相关的疾病并可用于监测疾病进展和提供给受试者的治疗的治疗功效，例如在体内成像相关的诊断方法中。因此，在一个实施方式中，提供本发明的多瘤病毒结合分子，其中，所述体内成像包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、近红外(NIR)、光学成像或磁共振成像(MRI)。
因此，本发明的一个特定目的是提供用于治疗、诊断和/或预防与多瘤病毒相关的疾病如PML的方法。该方法包括将有效量的人类抗体或抗体衍生物给予受试者，其中所述抗体靶向多瘤病毒和/或其片段。
在另一方面，本发明提供了一种具有多瘤病毒的表位、多瘤病毒VP1蛋白和/或其抗原结合片段的肽，优选JCV和/或BKV的抗原结合片段，所述肽特异性识别本发明的抗体。所述肽包含如下氨基酸序列或其修饰序列，或者由如下氨基酸序列或其修饰序列组成，下面在具体实施方式和实施例中指出所述氨基酸序列，在所述修饰序列中，一个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加。
另外，本发明提供了一种用于诊断与多瘤病毒相关的病症的方法，包括以下步骤：确定在所述受试者的生物样品中结合至所述肽的抗体的存在。
详细地，本发明涉及
(1)一种人类单克隆抗体或其抗原结合片段，其能够结合至多瘤病毒和/或其抗原。
(2)根据(1)所述的抗体或抗原结合片段，其中，该多瘤病毒是JC病毒(JCV)或BK病毒(BKV)。
(3)根据(1)或(2)所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够结合VP1蛋白或其片段，优选地，其中所述抗体或其抗原结合片段能够结合在实施例12和图11中所描述的VP1突变体中的至少一个、两个、三个等、或者更多个。
(4)根据(1)至(3)中任一个所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够识别暴露在病毒的表面上的表位。
(5)根据(1)至(4)中任一个所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段基本上不识别血清白蛋白，优选牛血清白蛋白(BSA)。
(6)根据(1)至(5)中任一个所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够相对于BKV优先地结合至JCV或相对于JCV优先地结合至BKV。
(7)根据(1)至(6)中任一个所述的抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够特异性地结合至少一个VP1表位，其包含或基本上由氨基酸序列LPGDPDM(SEQ IDNO:85)，GQATHDN(SEQ ID NO:86)，MRYVDKYGQLQT(SEQ ID NO:87)或RVFEGTEELPG(SEQ IDNO:88)组成。在一个实施方式中，抗体或其片段识别所提到的表位中的两个。
(8)根据权利要求(1)至(7)中任一个所述的抗体或其抗原结合片段，在所述抗体或其抗原结合片段的可变区中包括：
(a)图8所示的VH和/或VL可变区氨基酸序列的至少一个互补决定区(CDR)
(i)VH序列(SEQ ID NOs:1,5,9,13,17,21,25,29,33,37,41,45,49,53,57,61,65,69,73,77,81,89,93,97,101,105,109,113,117,121,125,129,133,137,141,145,149,153,157,161,165)；和
(ii)VL或VK序列(SEQ ID NOs:3,7,11,15,19,23,27,31,35,39,43,47,51,55,59,63,67,71,75,79,83,91,95,99,103,107,111,115,119,123,127,131,135,139,143,147,151,155,159,163,167)；
(b)如在图8中所示的VH和/或VL区的氨基酸序列；
(c)由从(a)的氨基酸序列中任一个的局部改变获得的氨基酸序列构成的至少一个CDR；和/或
(d)包含从(b)的氨基酸序列中任一个的局部改变获得的氨基酸序列的重链和/或轻链可变区；
所述抗体或其抗原结合片段可选地还包含多肽序列，其异源于VH和/或VL区或至少一个CDR，优选地，其中多肽序列包含人类恒定结构域，优选IgG型的人类恒定结构域，最优选，IgG1类或同种型的人类恒定结构域。
(9)一种多核苷酸，其至少编码根据(1)至(8)中任一个所述的抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白链的可变区的结合结构域。
(10)一种载体，其包含(9)中所述的多核苷酸，可选地与编码所述抗体或其抗原结合片段的其他免疫球蛋白链的可变区的(9)中所述的多核苷酸结合。
(11)一种宿主细胞，其包含(9)所述的多核苷酸或(10)所述的载体。
(12)一种用于制备抗体，或其一个或多个免疫球蛋白链的方法，所述抗体结合至多瘤病毒和/或其抗原结合片段/结构域，所述方法包括：
(a)培养(11)所述的细胞；以及
(b)从培养物中分离所述抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
(13)一种由(9)所述的多核苷酸编码的或通过(12)所述的方法获得的抗体。
(14)(1)至(8)或(13)中任一个所述的抗体，其被可检测性地标记。
(15)(14)所述的抗体，其中，所述可检测标记选自由酶、放射性同位素、荧光团、肽和重金属组成的组。
(16)(1)至(8)或(13)至(15)中任一个所述的抗体，其附着至药物。
(17)一种组合物，包含(1)至(8)或(13)至(16)中任一个所述的抗体，(10)所述的多核苷酸，(11)所述的载体或(12)所述的细胞，优选地，其中所述组合物
(a)是药物组合物并且还包含药学上可接受的载体，或
(b)诊断组合物，并且还包含常规用于基于免疫或基于核酸的诊断方法中的试剂。
(18)(17)所述的组合物，其是疫苗。
(19)(17)或(18)所述的组合物，还包含免疫调节剂。
(20)(1)至(8)或(13)至(16)中任一个所述的抗体、或实质上具有其任一个的相同结合特异性的多瘤病毒VP1结合分子、(9)所述的多核苷酸、(10)所述的载体或(11)所述的细胞，用于制备用于预防性和治疗性治疗的药物或诊断组合物，所述预防和治疗性治疗监测如下疾病的进展或对如下疾病的治疗的反应：进行性多灶性白质脑病(PML)，颗粒神经元的感染，深染核，颗粒细胞神经元病，脑自萎缩，脑病，脑膜炎，多瘤诱导的肿瘤，免疫重建炎性综合征(IRIS)，出血性膀胱炎，肺炎，视网膜炎，结肠炎，脉管炎，间质性肾病，呼吸道的感染，JCV肾病，BKV肾病，脑膜炎，Merkel细胞癌，毛发发育不良毛壅病(trichodysplasiaspinulosa)或恶性胸膜间皮瘤。
(21)一种多瘤病毒结合分子，其包含(1)至(8)或(13)至(16)中任一个所述的抗体的至少一个CDR，用于体内检测人类或动物体内的多瘤病毒或将治疗和/或诊断剂靶向人类或动物体内的多瘤病毒。
(22)根据(21)所述的多瘤病毒结合分子，其中，所述体内成像包括正电子发射断层扫描(PET)，单光子发射断层扫描(SPECT)，近红外(NIR)，光学成像或磁共振成像(MRI)。
(23)一种具有由权利要求(1)至(8)或(13)至(16)中任一个所述的抗体特异性识别的多瘤病毒的表位的肽。
(24)根据(23)所述的肽，其中，所述肽包含如在(7)中定义的氨基酸序列或其修饰序列，在所述修饰序列中，一个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加，其中，所述肽由(7)或(8)中所述的抗体识别。
(25)一种用于诊断受试者中JC病毒(JCV)或BK病毒(BKV)感染和与多瘤病毒相关的病症如进行性多灶性白质脑病(PML)或BK(肾病)的方法，包含以下步骤：确定在所述受试者的生物样品中结合至(23)或(24)所述的肽的抗体的存在。
(26)一种试剂盒，能够用于诊断或监测进行性多灶性白质脑病(PML)和/或伴随临床骨髓、肾和其他实体器官移植的移植排斥反应的进展，所述试剂盒包含根据(1)至(8)或(13)至(16)中任一个所述的至少一种抗体或实质上具有其任一个的相同结合特异性的多瘤病毒结合分子、根据(9)所述的多核苷酸、根据(10)所述的载体或根据(11)所述的细胞和/或根据(23)或(24)所述的肽，可选地连同试剂和/或使用说明。
(27)根据(1)至(8)或(13)至(16)中任一个所述的至少一种抗体，与免疫调节剂组合、同时或依次使用来治疗与多瘤病毒的(重)激活相关的疾病。
(28)根据(19)所述的组合物或根据(27)所述的抗体，其中，所述疾病是进行性多灶性白质脑病(PML)，颗粒神经元的感染，深染核，颗粒细胞神经元病，脑自萎缩，脑病，脑膜炎，多瘤诱导的肿瘤，免疫重建炎性综合征(IRIS)，出血性膀胱炎，肺炎，视网膜炎，结肠炎，脉管炎，间质性肾病，呼吸道的感染，JCV肾病，BKV肾病，脑膜炎，Merkel细胞癌，毛发发育不良毛壅病或恶性胸膜间皮瘤，和/或所述试剂(药剂)是那他珠单抗，依法珠单抗，利妥昔单抗，英夫利昔单抗，奥瑞珠单抗，阿仑单抗，贝伦妥单抗或维度汀。
本发明的进一步的实施方式将由随后的描述和实施例而显而易见。
附图说明
图1：通过透射电子显微镜来表征VP1制剂。
用于ELISA板的VP1蛋白的电子显微镜图像，其在碳酸盐包被缓冲液(A)或在重新关联(reassociation)缓冲液(B)中稀释到200微克/毫升包被。VP1蛋白用抗VP1抗体(Ab34756)染色，然后用山羊抗小鼠IgG、10纳米的金染色。比例尺表示200nm。
图2：通过直接ELISA和EC50确定评估的重组人源性抗体特异性结合至JCV VP1。
(A)利用指定浓度的重组人源化抗体孵育板。示例性的抗体NI-307.19F8以高亲和力与JCV VP1(■,5μg/ml)和JCV VP1 VLP(●,5μg/ml)结合，但既不与BKV VP1(□,5μg/ml)也不与BKV VP1 VLP(○,5μg/ml)还不与牛血清清蛋白(◆,5μg/ml)结合。抗体Ab34756结合至来自JC病毒(JCV)的VP1且弱地结合至来自BK病毒(BKV)的VP1，但它也结合至BSA。该数据被表示为在450nm处的OD值。
(B)对于抗体NI-307.13G4，NI-307.18E12，NI-307.18F4A，NI-307.19F8，NI-307.20F5，NI-307.61D11和Ab34756的EC50值使用GraphPad Prism软件通过非线性回归估算。N/A：不适用
图3：通过直接ELISA和EC50确定来评估重组人源化抗体特异性结合至JCV VP1和BKV VP1。
(A)利用指定浓度的重组人源化抗体孵育板。示例性的抗体NI-307.11G6和NI-307.25G10以高亲和力与JCV VP1(■,5μg/ml)、JCV VP1 VLP(●,5μg/ml)、BKV VP1(□,5μg/ml)和BKV VP1 VLP(○,5μg/ml)结合。抗体NI-307.11G6和NI-307.25G10不与牛血清白蛋白(◆,5μg/ml)结合。该数据被表示为在450nm处的OD值。
(B)对于抗体NI-307.3G4，NI-307.6A2，NI-307.11G6，NI-307.19F10，NI-307.24F3，NI-307.25G10，NI-307.43A11，NI-307.44F6B，NI-307.57D5和NI-307.78C3的EC50值使用GraphPad Prism软件通过非线性回归来估算。
图4：通过直接ELISA和EC50确定来评估重组人源化抗体特异性结合至BKV VP1。
(A)利用指定浓度的重组人源化抗体孵育板。示例性的抗体NI-307.26E10和NI-307.5H3以高亲和力与BKV VP1(□,5μg/ml)和BKV VP1 VLP(○,5μg/ml)结合，并且较弱地与JCV VP1(■,5μg/ml)和JCV VP1 VLP(●,5μg/ml)结合。抗体NI-307.26E10和NI-307.5H3不与牛血清白蛋白(◆,5μg/ml)结合。该数据被表示为在450nm处的OD值。
(B)对于抗体NI-307.1E1，NI-307.5H3，NI-307.24C6和NI-307.26E10的EC50值使用GraphPad Prism软件通过非线性回归来估算。
图5：通过肽扫描(pepscan)分析来评估人源化重组抗体的VP1结合表位。
(A)重组NI-307.11G6人源化抗体(1微克/毫升)的肽扫描图像。在肽82、83和84(线E，第2，第3和第4点)处发生NI-307.11G6结合，其中包括氨基酸333-339(肽82：325-RVFEGTEELPGDPDM-339，肽83：329-GTEELPGDPDMMRYV-343，肽84：333-LPGDPDMMRYVDKYV-343，共有结合序列：LPGDPDM)。仅HRP-结合的驴抗人二抗IgG Fcγ(1:20000；仅二抗)被用作对照。
(B)在VP1蛋白序列的指示氨基酸中鉴定不同人源化VP1特异性抗体的结合表位。
加下划线的氨基酸在JCV VP1和BKV VP1蛋白之间是不同的。
图6：通过直接ELISA进行VP1抗体针对单体的或聚集的蛋白的交叉反应性测试。
(A)将ELISA板用不同浓度的指示的抗原包被，然后利用重组NI-307.11G6，NI-307.25G10，NI-307.19F8和NI-307.26E10抗体孵育。该抗体示出特异性结合至VP1制剂而且不结合至不相关的蛋白。该数据被表示为在450nm处的OD值。
(B)将ELISA板用浓度为1μg/mL的指示的抗原包被，然后利用重组NI-307.11G6，NI-307.25G10，NI-307.19F8和NI-307.26E10抗体孵育。该抗体示出特异性结合至不同VP1制剂，而不结合至JCV VP2和VP3蛋白(Bioclone Inc)和其他不相关的蛋白。该数据被表示为在450nm处的OD值。
图7：从PML-IRIS后患者分离VP1特异性抗体。
(A)利用不同浓度的指示抗原包被ELISA板，然后利用从PML和PML-IRIS成功恢复的患者克隆的重组NI-307.58C7和NI-307.105C7抗体孵育。所述抗体显示出特异性结合至JCV VP1 VLP而不结合至扰乱颗粒(JCV VP1)、BKV VP1制剂或者无关的单体的或聚集的蛋白。该数据被表示为在450nm处的OD值。
(B)对于抗体NI-307.7J3，NI-307.26A3，NI-307.27C2，NI-307.27C11，NI-307.29B1，NI-307.43E8，NI-307.45E10，NI-307.47B11，NI-307.50H4，NI-307.53B11，NI-307.56A8，NI-307.57D4，NI-307.58C7，NI-307.59A7，NI-307.72F7，NI-307.72F10，NI-307.98D3，NI-307.98H1，NI-307.105A6和NI-307.105C7的EC50值使用GraphPad Prism软件通过非线性回归来估算。N/A：不适用。
图8：可变区的氨基酸和核苷酸序列，即人类JCV和/或BKV抗体的重链和κ/λ轻链。
(A)NI-307.13G4,(B)NI-307.19F10,(C)NI-307.19F8,(D)NI-307.11G6,(E)NI-307.17F12,(F)NI-307.6A2,(G)NI-307.5H3,(H)NI-307.25G10,(I)NI-307.26E10,(J)NI-307.1E1,(K)NI-307.24C6,(L)NI-307.78C3,(M)NI-307.57D5,(N)NI-307.43A11,(O)NI-307.3G4,(P)NI-307.61D11,(Q)NI-307.24F3,(R)NI-307.18E12,(S)NI-307.20F5,(T)NI-307.58C7,(U)NI-307.105C7,(V)NI-307.98D3,(W)NI-307.72F7,(X)NI-307.45E10,(Y)NI-307.72F10,(Z)NI-307.56A8,(A2)NI-307.27C11,(B2)NI-307.47B11,(C2)NI-307.26A3,(D2)NI-307.27C2,(E2)NI-307.57D4,(F2)NI-307.50H4,(G2)NI-307.53B11,(H2)NI-307.7J3,(I2)NI-307.59A7,(J2)NI-307.105A6,(K2)NI-307.29B1,(L2)NI-307.44F6B,(M2)NI-307.98H1,(N2)NI-307.43E8和(O2)NI-307.18F4A。框架(FR)和互补决定区(CDR)利用被加下划线的CDR表示。由于克隆策略，在重链和轻链的N-末端上的氨基酸序列可以潜在地包含在F1中的引物诱导的改变，然而其基本上不影响抗体的生物活性。为了提供共有的人类抗体，根据在数据库中的有关人类种系可变区序列，原始克隆的核苷酸和氨基酸序列被对齐并调整；参见，例如，蛋白质工程的MRC中心主办的V base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)(英国剑桥)。
图9：通过流式细胞仪来评估在溶液中重组人源化抗体结合至VP1 VLP和JCV。
(A)组装的VP1 VLP利用乳胶珠孵育以允许它们附着。将珠随后洗涤，利用NI-307.98D3，NI-307.44F6B和NI-307.11G6染色，然后通过流式细胞仪分析，以评估示例性抗体与VP1 VLP的结合。
(B)通过感染的SVG-A细胞产生的JCV利用乳胶珠孵育以允许它们附着。将珠随后洗涤，利用NI-307.98D3，NI-307.44F6B和NI-307.11G6染色，然后通过流式细胞仪分析，以评估示例性抗体与JCV的结合。
图10：通过重组人源化抗体来中和SVG-A细胞的JCV感染。
(A)利用示例性的抗体或同型对照来孵育JCV。随后将病毒加入到SVG-A细胞中，然后将其感染后固定3天，渗透并且用DAPI(蓝色)和抗-VP1抗体(绿色，亮)染色。然后将染色的细胞用荧光显微镜可视化。
(B)利用不同浓度的示例性NI-307.98D3抗体或不同浓度的同型对照来孵育JCV。随后将病毒加入到SVG-A细胞中，然后将其感染后固定3天，渗透并且用DAPI和抗-VP1抗体染色。然后将染色的细胞用荧光显微镜可视化并对每种情况下被感染细胞的数量进行定量，对于每种情况进行一式三份。受感染细胞的最大数量通过对当病毒在不含抗体的介质中预孵育时感染的细胞进行计数来确定。IC50对应于中和可能被感染细胞的50％的感染所需的抗体浓度，并且使用GraphPad Prism软件通过非线性回归来估算。
图11：通过流式细胞仪来评估重组人源化抗体结合至PML-相关的VP1突变体。
293TT细胞被瞬时转染以表达VP1 L55F S269F，VP1 L55F S267F，VP1 L55FN265D，VP1 GCN突变体和野生型VP1或模拟转染。然后，它们被固定、渗透以及用示例性的NI-307.11G6，NI-307.98D3，NI-307.27C11和NI-307.53B11抗体和同型对照染色。然后通过流式细胞仪测量结合至VP1突变体的抗体。
具体实施方式
本发明涉及人类和重组人源化单克隆抗体和其抗原结合片段，其已经基于从选定的人类供体群获得的序列信息生成，并且其能够结合至多瘤病毒和/或其抗原，特别是结合至JCV或BKV和/或其VP1蛋白。本发明的抗体有利的特征在于特异性结合至该病毒和/或分离的病毒蛋白，这使得其适合于靶向病毒以及诊断被释放到体液如血液中的病毒蛋白。此外，本发明的抗体通常不显示出与不相关的蛋白的任何交叉活动，不相关的蛋白如血清白蛋白，尤其是牛血清白蛋白，即通常在药品或实验室使用的配制(制剂)中使用的蛋白。因此，本发明的抗体，也由于其人类起源和亲和力成熟，可以合理预期安全地作为治疗剂并特定地作为实验室试剂以用于多瘤病毒的检测而不给出假阳性。
另外，由于其中和多瘤病毒的活性，本发明的抗体以及其衍生物可以被用于患者的组合疗法，所述患者患有待用例如免疫抑制药治疗的疾病并承受机会性多瘤病毒感染和激活多瘤病毒复制的危险(如本文之前在背景技术部分中描述的那些)。因此，作为一个特别有利的实施方式，本发明涉及本文中描述的人类单克隆抗体和其任何衍生物，用于免疫受损的患者的治疗，例如接受器官移植或者单独或者在接受免疫抑制药物的患者的治疗中，如在背景部分中描述的那些，其中本发明的抗体和任何其衍生物被设计为与免疫抑制药物同时或依次在给予它们之前或之后给予。在本发明的一个实施方式中，提供了药物组合物，其包含本发明的人类单克隆抗体或其任何衍生物和一种或多种免疫抑制药物。
I.定义
除非另有说明，否则如本文中所用的术语给出了如在牛津生物化学与分子生物学词典，牛津大学出版社，1997，2000年修订和2003年重印，ISBN 0198506732中所提供的定义。
但应该指出的是，术语“一个”或“一种”实体是指该实体中的一个/种或多个/种；例如，“一种抗体”，应理解为代表一种或多种抗体。这样，术语“一个”(或“一种”)，“一个或多个(一种或多种)”和“至少一个(至少一种)”可以互换使用。
如果没有特别指出其他的，术语“多瘤病毒”，“JCV”和“BKV”可互换使用，具体是指多瘤病毒肽、JCV肽和BKV肽的天然的单体、二聚体和寡聚形式。该术语也通常用于识别肽的其他形式，例如低聚物和/或聚集体，VP1，VP2，VP3蛋白，并且也用于统指所有类型和形式。
本申请公开的人类抗多瘤病毒，优选抗JCV和抗BKV抗体特异性结合多瘤病毒，优选JCV和/或BKV，多瘤病毒VP1蛋白，优选JCV VP1和/或BKV VP1和其表位并且结合至多瘤病毒，优选JCV和/或BKV和其表位的各种变体，参见Ferenczy等人,Clinical MicrobiologyReviews 25(3)(2012),471-506和Gorelik等人,The Journal of Infectious Diseases204(2011),103-114。如本文中所使用的，提及的“特异性结合”，“选择性地结合”或“优选地结合”多瘤病毒，JCV和/或BKV，多瘤病毒VP1蛋白，优选JCV VP1和/或BKV VP1的抗体是指不结合其他不相关的蛋白的抗体。在一个实施方式中，本文中公开的多瘤病毒，JCV和/或BKV抗体可结合多瘤病毒，优选JCV和/或BKV，多瘤病毒VP1蛋白，优选JCV VP1和/或BKV VP1蛋白，以及多瘤病毒VP1病毒样颗粒(VLP)，优选JCV VP1 VLP和/或BKV VP1 VLP或其表位，并且显示出不结合至BSA和其它蛋白。由于本发明的人类多瘤病毒，JCV和/或BKV抗体已经从健康的人类受试者的池或从表现出多瘤病毒，优选JCV和/或BKV特异性免疫反应的PML-IRIS患者池产生，本发明的多瘤病毒，优选JCV和/或BKV抗体也可以被称作“人源化抗体”，以便强调这些抗体确实来自于由受试者表达的抗体并没有被从例如人类免疫球蛋白表达的噬菌体分离，其表示试图提供人类样抗体的常用方法。
肽：
如本文所用的术语“肽”被理解为包括其含义内的术语“多肽”和“蛋白质”(有时，其在本文中可互换使用)。同样地，蛋白和多肽的片段也被考虑，并且可以在本文中称为“肽”。尽管如此，术语“肽”优选表示，包括至少5个连续氨基酸，优选至少10个连续氨基酸，更优选至少15个连续氨基酸，还更优选至少20个连续氨基酸，并且特别优选至少25个连续氨基酸的氨基酸聚合物。此外，根据本发明的肽通常具有不超过100个连续氨基酸，优选少于80个连续氨基酸，更优选少于50个连续氨基酸。
多肽：
如本文所使用的，术语“多肽”旨在包括单个“多肽”以及复数个“多肽”，并且是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”是指两种或更多种氨基酸链的任一个链或多个链，并且不指代产物的特定长度。因此，“肽”、“二肽”、“三肽”、“寡肽”、“蛋白质”、“氨基酸链”或任何其他术语用来指两种或更多种氨基酸的一个链或多个链，都包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以由这些术语中任何一个代替或可互换使用。
术语“多肽”还旨在表示多肽的表达后修饰的产物，包括但不限于通过已知的保护/阻断基团、蛋白水解裂解、或由非天然存在的氨基酸的改性进行的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化和衍生化。多肽可以衍生自天然生物来源或通过重组技术来生产，但不一定是从指定的核酸序列转录。它可以以任何方式产生，包括通过化学合成。
本发明的多肽的大小可以是约3个或更多，5个或更多，10个或更多，20个或更多，25个或更多，50个或更多，75或更多，100个或更多，200个或更多，500个或更多，1000个或更多，或者2000个或更多个氨基酸。多肽可以具有限定的三维结构，虽然它们不是必须具有这样的结构。具有限定的三维结构的多肽被称为折叠的，并且不具有限定的三维结构的多肽而是可以采用大量不同的构造，且被称为未折叠的。如本文所使用的，术语糖蛋白是指偶联到至少一个碳水化合物部分的蛋白质，所述碳水化合物部分通过氨基酸残基(例如，丝氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧或含氮侧链附着至蛋白质。
“分离的”多肽或其片段、变体或衍生物是指不在其天然环境的多肽。不需要特别的纯化水平。例如，分离的多肽可以从其天然的或自然的环境中除去。在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白质对于本发明的目的被认为是分离的，因为它们是通过任何合适的技术已经分离的、分馏、或者部分或基本上纯化的天然或重组的多肽。
“重组肽、多肽或蛋白质”指的是通过重组DNA技术产生的肽、多肽或蛋白质，即从细胞、微生物或哺乳动物产生，通过对包括所需肽的融合蛋白编码的外源重组DNA表达构建体技术转化。在大多数细菌培养基中表达的蛋白质或肽通常不含聚糖。酵母中表达的蛋白或多肽可以具有与哺乳动物细胞中所表达的不同的糖基化模式。
作为本发明的多肽包括的是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体以及其任何组合。术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括肽和具有的氨基酸序列充分相似于天然肽的氨基酸序列的多肽。术语“充分相似”是指含有足够或最小数量的相对于第二氨基酸序列相同或等同的氨基酸残基的第一氨基酸序列，使得第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性。例如，包含至少约45％，至少约50％，至少约55％，至少约60％，至少约65％，至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约91％，至少约92％，至少约93％，至少约94％，至少约95％，至少约96％，至少约97％，至少约98％，至少约99％，或至少约100％相同的共同结构域的氨基酸序列在本文中被定义为充分相似。优选地，变体将充分相似于本发明的优选肽的氨基酸序列，特别是多瘤病毒，优选JCV和/或BKV，多瘤病毒的VP1蛋白，优选JCV VP1和/或BKV VP1蛋白，多瘤病毒的VP1病毒样颗粒(VLP)，优选JCV VP1 VLP和/或BKV VP1 VLP或它们中的任一种的片段、变体、衍生物或类似物。这样的变体通常保持本发明的肽的功能活性。变体包括氨基酸序列分别与天然和野生型(wt)肽不同的肽，其中通过一个或多个氨基酸缺失、添加和/或取代。这些可以是天然存在的变体以及人工设计的变体。
此外，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”在指本发明的抗体或抗体多肽时，包括保留相应的天然结合分子、抗体或多肽的至少一些抗原结合特性的任何多肽。除了本文所讨论的特定抗体片段外，本发明的多肽的片段还包括蛋白水解片段以及缺失片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括如上所述的片段，以及由于氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然存在或者非天然存在。非天然存在的变体可以使用本领域已知的诱变技术来产生。变体多肽可包含保守或非保守的氨基酸取代、缺失或添加。多瘤病毒的衍生物，优选JCV和/或BKV特异性结合分子，例如本发明的抗体和抗体多肽，是已被改变的多肽，从而显示出在天然多肽上未发现的附加特征。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文中也可称为“多肽类似物”。如本文所使用的，结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”是指具有一个或多个残基的通过官能侧基团的反应而被化学衍生的主题多肽。还包括的“衍生物”是那些含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的肽。例如，4-羟基脯氨酸可以取代(代替)脯氨酸；5-羟基赖氨酸可以取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可以取代组氨酸；高丝氨酸可以取代丝氨酸；并且鸟氨酸可以取代赖氨酸。
分子的相似性和/或同一性的确定：
两个肽之间的“相似性”通过比较一种肽的氨基酸序列与第二种肽的序列来确定。一种肽的氨基酸类似于第二种肽的相应氨基酸，如果它是相同的或保守的氨基酸取代。保守取代包括在Dayhoff,M.O.,ed.，The Atlas of Protein Sequence and Structure 5,National Biomedical Research Foundation(国家生物医学研究基金会)，Washington,D.C.(1978)和在Argos,EMBO J.8(1989),779-785中所描述的那些。例如，属于下列组之一的氨基酸代表保守改变或取代：-Ala,Pro,Gly,Gln,Asn,Ser,Thr；-Cys,Ser,Tyr,Thr；-Val,Ile,Leu,Met,Ala,Phe；-Lys,Arg,His；-Phe,Tyr,Trp,His；和-Asp,Glu。
两个多核苷酸之间的“相似性”通过比较一个多核苷酸的核酸序列与一个多核苷酸的序列来确定。一个多核苷酸的核酸类似于第二多核苷酸的相应核酸，如果它是相同的，或者如果该核酸是编码序列的一部分，相应的三元组包含用于相同氨基酸或用于保守氨基酸取代的核酸编码。
两个序列之间的百分比同一性或相似性的确定优选使用Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877的数学算法来实现。这样的算法结合在NCBI可获得的Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410的BLASTn和BLASTp程序中(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cge)。
百分比同一性或相似性的确定用BLASTn和BLASTp程序的标准参数来执行，如就特定长度和组成的序列在NCBI网页上和“BLAST程序选择指南”中所推荐的。
利用BLASTn程序进行BLAST核苷酸搜索。
对于一般的参数，可将“最大靶序列”框设置为100，可以勾选“短查询”框，可将“期待阈值”框设置为1000，并可将“字大小”框设置为7，如在NCBI网页上对于短序列(少于20个碱基)所建议的。对于较长序列，可将“期待阈值”框设置为10，并可将“字大小”框设置为11。对于评分参数，可将“匹配/不匹配分数”设置为1，-2，并可将“差距成本”框设置为线性的。对于过滤器和屏蔽参数，可以不勾选“低复杂性区域”框，可以不勾选“物种特异性重复”框，可以勾选“仅对于查找表屏蔽”框，可以勾选“DUST过滤器设定”，并且可以不勾选“屏蔽小写字母”框。通常，在这方面可以使用“搜索接近精确匹配”，其提供了大部分的上面所指出的设置。在这方面的进一步信息可以在NCBI网页上发表的“BLAST程序选择指南”中找到。
利用BLASTp程序进行BLAST蛋白质搜索。对于一般的参数，可将“最大靶序列”框设置为100，可以勾选“短查询”框，可将“期待阈值”框设置为10，并可将“字大小”框设置为“3”。对于评分参数，可将“矩阵”框设置为“BLOSUM62”，可将“差距成本”框设置为“存在：11延伸：1”，可将“组成调整”框设置为“有条件的组成得分矩阵调整”。对于过滤器和屏蔽参数，可以不勾选“低复杂性区域”框，可以不勾选“仅对于查找表屏蔽”框，并且可以不勾选“屏蔽小写字母”框。
这两个程序的修改，例如，就搜索序列的长度而言，是根据NCBI网页上以HTML和PDF版本发表的“BLAST程序选择指南”中的建议进行的。
多核苷酸：
术语“多核苷酸”旨在涵盖单数个核酸以及复数个核酸，并且是指分离的核酸分子或构造，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可以包括常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，酰胺键，如在肽核酸(PNA)中发现的)。术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸片段，例如，DNA或RNA片段。“分离的”核酸或多核苷酸是指已经从其天然环境中取出的核酸分子、DNA或RNA。例如，对包含在载体中的编码抗体的重组多核苷酸被认为是分离的，以用于本发明的目的。分离的多核苷酸的其它实例包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化的(部分地或基本上)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录。根据本发明，分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的这些分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，例如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
如本文所使用的，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子构成的核酸的一部分。虽然“终止密码子”(TAG，TGA或TAA)不被翻译成氨基酸，但它可以被认为是编码区的一部分，但任何侧翼序列(例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等)都不是编码区的一部分。本发明的两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中，例如，在单独的载体上，或者在分离的多核苷酸构建体中，例如，在分离的(不同)载体上。此外，任何载体可以含有单个编码区，或者可以包括两个或更多个编码区，例如，单个载体可分别对免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区进行编码。此外，本发明的载体、多核苷酸或核酸可以对异源编码区进行编码，其融合或者未融合至编码结合分子、抗体、或其片段、变体或衍生物的核酸。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序，例如分泌信号肽或异源功能性结构域。
在某些实施方式中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况下，包含编码多肽的核酸的多核苷酸通常可以包括可操作地与一个或多个编码区相关联的启动子和/或其它转录或翻译控制元件。当用于基因产物(例如，多肽)的编码区与一个或多个调节序列以在一个或多个调节序列的影响或控制下设置基因产物的表达的方式相关联时，为可操作的关联。如果启动子功能的感应导致编码所需基因产物的mRNA转录，并且如果两个DNA片段之间的连接性质不干扰表达调节序列指导该基因产物的表达的能力或者不干扰DNA模板待被转录的能力，则两个DNA片段(例如多肽编码区和与其相关联的启动子)是“可操作的关联的”或“可操作的连接的”。因此，启动子区将与编码多肽的核酸可操作的关联，如果启动子能够影响该核酸的转录的话。启动子可以是细胞特异性启动子，其用来指导仅在预定细胞中的DNA的大量转录。除了启动子外，其它转录控制元件，例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号，可与多核苷酸可操作的关联，以指导细胞特异性转录。本文公开了合适的启动子和其它转录控制区。
多种转录控制区对本领域普通技术人员来说是已知的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，如但不限于，来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A结合)、猿猴病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如Rous肉瘤病毒)的启动子和增强子片段。其它转录控制区包括源自脊椎动物基因的那些，如肌动蛋白、热休克蛋白、牛生长激素和兔β-内球蛋白，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。其他合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导的启动子(例如，可由干扰素或白细胞介素诱导的启动子)。
同样地，各种翻译控制元件对本领域普通技术人员来说是公知的。这些包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子、以及从细小核糖核酸病毒衍生的元件(特别是内部核糖体进入位点，或IRES，也被称为CITE序列)。
在其他实施方式中，本发明的多核苷酸为RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与编码分泌或信号肽的附加编码区相关联，所述分泌或信号肽引导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有一旦越过粗糙型内质网的生长蛋白链的出口已启动，就从成熟蛋白质裂解的信号肽或分泌前导序列。本领域普通技术人员都知道，由脊椎动物细胞分泌的多肽通常具有融合至多肽的N-末端的信号肽，该信号肽从完整的或“全长”的多肽裂解，以产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用天然的信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或该序列的功能性衍生物，其保持引导与之可操作关联的多肽的分泌的能力。可替代地，可以使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，野生型前导序列可被人组织纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)或小鼠β-葡萄糖醛酸酶的前导序列替代。
如在本发明的上下文中所使用的“结合分子”主要涉及抗体及其片段，但也可指结合到优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1蛋白以及多瘤病毒VP1病毒样颗粒(VLP)的非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合体(MHC)分子、分子伴侣(如热休克蛋白(HSP))、以及细胞-细胞粘附分子，如钙粘蛋白、整合素、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。因此，仅为了清楚起见，且在不限制本发明的范围的情况下，相对于抗体和代表用于治疗剂和诊断剂的开发的优选结合分子的抗体样分子讨论大部分的以下实施例。
抗体：
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。如本文所使用的抗体或免疫球蛋白是多瘤病毒-，多瘤病毒VP1蛋白-，和/或多瘤病毒VP1 VLP-结合分子，优选是至少包括重链的可变结构域(且通常至少包括重链和轻链的可变结构域)的JCV和/或BKV类型的。脊椎动物系统中的基本的免疫球蛋白结构相对容易理解；例如，参见Harlow等人的Antibodies：实验室手册，(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)，第2版，1988)。
如将在下面更详细地讨论的，术语“免疫球蛋白”包括可以在生物化学方面加以区别的各种广泛类别的多肽。本领域技术人员将理解到，重链被分类为γ、μ、α、δ或ε(γ、μ、α、δ、ε)以及它们中的一些亚类(例如，γ1-γ4)。正是这种链的性质决定了抗体的“类别”，分别为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等，被充分表征并且是已知的，以赋予功能特异化。这些类别和同种型中的每个的修改版本对本领域技术人员而言鉴于本公开是易于确定的，因此，在本发明的范围内。所有免疫球蛋白类别显然在本发明的范围内，下面的讨论将通常针对免疫球蛋白分子的IgG类别。对于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含分子量大约为23,000道尔顿的两条相同的轻链多肽以及分子量为53,000-70,000的两条相同的重链多肽。四条链通常通过二硫键而结合成“Y”结构，其中，轻链为重链的托架，重链开始于“Y”的嘴部并继续通过可变区。
轻链被分类为κ或λ(κ，λ)。每条重链类别可以与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链彼此共价结合，并且当通过杂交瘤、B细胞或遗传改造的宿主细胞产生免疫球蛋白时，两个重链的“尾”部通过共价二硫键或非共价键彼此结合。在重链中，氨基酸序列从Y形结构的叉形端部的N-末端延伸到每条链底部的C-末端。
轻链和重链都被分成结构和功能同源性的区域。术语“恒定”和“可变”在功能方面使用。在这方面，应该理解的是，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定了抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1，CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物特性，例如分泌、经胎盘的移动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得距离抗原结合位点或抗体的氨基端更远而增大。N-末端部分是可变区，而C-末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
如上所述，可变区允许抗体选择性地识别并特异性地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域，或者互补决定区(CDR)的子集，结合以形成定义三维抗原结合位点的可变区。这种四元抗体结构形成存在于Y的每个臂的端部的抗原结合位点。更具体地，抗原结合位点由在各VH和VL链上的三个CDR定义。任何抗体或包含足够的结构以特异性结合优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1蛋白和/或多瘤病毒VP1病毒样颗粒(VLP)的免疫球蛋白片段，在本文中可互换地表示为“结合片段”或“免疫特异性片段”。
抗体包含存在于每个抗原结合结构域中的六个高变区，有时称为“互补决定区”或“CDR”，它们是被专门定位以形成抗原结合结构域的短的非连续的氨基酸序列，这是由于抗体在水性环境中呈现出它的三维结构。“CDR”的侧翼是四个相对保守的“框架”区或“FR”，所述“框架”区或“FR”显示出较少的分子间变异性。框架区主要采取β-折叠构造，且CDR形成环，所述环连接并且在某些情况下形成β-折叠结构的一部分。因此，框架区的作用是形成支架，该支架提供了通过链间的非共价相互作用以正确方向定位CDR。由定位的CDR形成的抗原结合结构域限定与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补的表面促进了抗体与其同源表位的非共价结合。包含CDR和框架区的氨基酸分别可以由本领域普通技术人员容易地识别用于任何给定的重链或轻链可变区，因为它们已被精确地定义；参见Kabat等人的美国Department of Health and Human Services(健康和人类服务部)，“Sequences ofProteins of Immunological Interest(感兴趣的免疫学蛋白质序列)”，(1983)；以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.，196(1987)，901-917，将这两篇文献的全部内容通过引用并入本文。
在本领域内使用和/或接受的术语存在两个或更多个定义的情况下，如本文所使用的术语的定义意在包括所有这样的含义，除非明确说明与此相反。一个具体的实例是术语“互补决定区”(“CDR”)的使用，以描述在两个重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这个特定区域已经描述于Kabat等人的美国Dept.of Health and HumanServices(卫生和人类服务部)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest(感兴趣的免疫学蛋白质序列)”，(1983)以及Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.，196(1987)，901-917中，将这两篇文献的全部内容通过引用并入本文，其中，当相互比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子集。然而，涉及抗体的CDR或其变体的任一定义的应用旨在处于如本文所定义和所使用的术语的范围内。下面在表I中列出了包括如由每个上述引用的参考文献所定义的CDR的合适的氨基酸残基，作为比较。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员可以常规地确定哪些残基包含由抗体的可变区氨基酸序列给出的抗体的人IgG子型的特定超变区或CDR。
表I：CDR定义1
Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VH CDR1 24-34 26-32
VH CDR2 50-56 50-52
VH CDR3 89-97 91-96
1表I中所有CDR定义的编号是根据Kabat等人阐述的编号约定。(参见下文)。
Kabat等人还定义了用于适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可以将“Kabat编号”的这个系统明确地分配给任何可变结构域序列，而不依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文所使用的，“Kabat编号”是指由Kabat等人在美国Dept.of Health and Human Services(健康和人类服务部)，“Sequences of Proteinsof Immunological Interest(感兴趣的免疫学蛋白质序列)”，(1983)中阐述的编号系统。除非特别说明，否则本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中的特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统引用的，然而这是理论上的，并且不能等同地适用于本发明的每个抗体。例如，根据第一CDR的位置，可以在任一方向改变后续的CDR。
本发明的抗体或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体、或衍生物包括但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人类、人源化、灵长类化、鼠源化(murinized)或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2,Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、由Fab表达文库产生的片段、以及抗独特型(抗Id)抗体(包括，例如，抗-Id抗体至本文中公开的抗体)。scFv分子是本领域中已知的且例如在美国专利5,892,019中描述。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA 1和IgA2)或免疫球蛋白分子的子类。
在一个实施方式中，本文中所描述的本发明的人抗多瘤病毒抗体和抗原结合分子的特征在于，包括恒定结构域或其部分，该部分对可变区是异源的，例如，如图8所示，或其至少一个CDR。例如，虽然最初由人类B细胞产生的天然抗体可以是IgA类型的，如抗体NI-307.13G4(参见表IV)，但受试者的人抗体优选是IgG类型的。因此，抗体NI-307.13G4的可变区融合至人免疫球蛋白γ1的恒定结构域。同样，如果最初由人类B细胞产生的天然抗体属于IgG3类别的，如抗体NI-307.45E10(见表IV)，则受试者的人抗体优选是IgG1类别的。这里，IgG3恒定结构域或其部分优选被IgG1恒定结构域或其部分替代。可替换地，如果天然抗体已经是IgG1类型和子类的，则可变区优选被克隆成通用骨干，例如天然IgG1被重新克隆成通用的IgG1骨干。在一个优选的实施方式中，本发明的抗体被克隆并表达为用于生物化学表征的人类IgG1和/或用于动物模型中的体内实验的鼠类IgG2，例如参见实施例1。
在一个实施方式中，本发明的抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别地，在本发明的具体应用中，特别是治疗用途，IgM比IgG和其他二价抗体或相应结合分子是更少有用的，因为IgM由于其五价结构和缺乏亲和力成熟而经常表现出非特异性交叉反应性和非常低的亲和力。
在一个特别优选的实施方式中，本发明的抗体不是多克隆抗体，即，其基本上由一个特定抗体种类组成，而不是从血浆免疫球蛋白样品得到的混合物。
抗体片段(包括单链抗体)可以包括单独的或与以下中的全部或一部分结合的一个或多个可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。还包括在本发明内的是识别以下的抗体和抗体样结合分子：优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1蛋白-、和/或多瘤病毒VP1病毒样颗粒(VLP)，其包括一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合。本发明的抗体或其免疫特异性片段可以来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、小鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡抗体。在另一个实施方式中，可变区可以是海洋生物(condricthoid)起源的(例如，来自鲨鱼)。
在一个方面，本发明的抗体是从人分离的人单克隆抗体。可选地，人抗体的框架区按照数据库中的相关人种系可变区序列对齐并更改；例如，参见MRC蛋白质工程中心(英国剑桥)主办的Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)。例如，被认为潜在地与真正的种系序列偏离的氨基酸可能是由于在克隆过程中掺入的PCR引物序列。与人工生成的人样抗体(如来自噬菌体展示抗体库或异种小鼠的单链抗体片段(scFvs)相比，本发明的人单克隆抗体的特征在于(i)利用人免疫反应而不是动物替代品获得，即抗体响应于优选在人体中的相关构象中JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP而生成；(ii)对于优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP的存在至少是显著的；以及(iii)由于抗体是人来源的，所以针对自身抗原的交叉反应性的风险被最小化。因此，按照本发明，术语“人单克隆抗体”、“人单克隆自身抗体”、“人抗体”等用来表示优选人来源的(即，与人细胞分离)的JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP-结合分子，如B细胞或其杂交瘤或从人细胞(例如人的记忆B细胞)的mRNA直接克隆的cDNA。人抗体仍然是“人的”，即使氨基酸取代是在抗体中进行的，例如，以改善结合特征。
衍生自人免疫球蛋白库或衍生自用于一种或多种人免疫球蛋白的转基因动物且不表达内源免疫球蛋白的抗体，如下文中例如在Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598中所描述的，被表示人样抗体，以便将它们与本发明的真正的人抗体区分开。
例如，人样抗体(诸如通常分离自噬菌体展示的合成的和半合成的抗体)的重链和轻链的配对不一定反映原始配对，因为它发生在原始的人B细胞中。因此，从如现有技术中通常使用的重组表达库中获得的Fab和scFv片段可以被认为是人工的，其中对免疫原性和稳定性具有所有可能的相关影响。
与此相反，本发明提供了从所选的人受试者分离的亲和力成熟的抗体，其特征在于它们在人类中的治疗效用和耐药性。
如本文所使用的，术语“啮齿化(rodentized)抗体”或“啮齿化免疫球蛋白”是指一种包含来自本发明的人抗体的一个或多个CDR的抗体；以及包含基于啮齿动物抗体序列的氨基酸取代和/或缺失和/或插入的人框架区。当提到啮齿动物时，优选使用源自小鼠和大鼠的序列，其中，包含这样的序列的抗体分别被称为“小鼠化的(murinized)”或“大鼠化的(ratinized)”。提供CDR的人免疫球蛋白被称为“亲本”或“受体”，且提供框架变化的啮齿动物抗体被称为“供体”。恒定区无需存在，但如果存在，它们通常基本上与啮齿动物抗体恒定区相同，即至少约85-90％，优选约95％或更多相同。因此，在一些实施方式中，全长小鼠化的人重链或轻链免疫球蛋白包含小鼠恒定区、人CDR和，具有若干“小鼠化”氨基酸取代的大体上的人框架。通常情况下，“小鼠化的抗体”是一种包含小鼠化的可变轻链和/或小鼠化的可变重链的抗体。例如，小鼠化的抗体将不包括典型的嵌合抗体，例如，因为嵌合抗体的整个可变区是非小鼠的。通过“鼠源化(murinization)”的过程已被“小鼠化的”的修饰抗体结合于与提供CDR的亲本抗体相同的抗原，并且与亲本抗体相比，在小鼠中通常免疫原性更低。关于该“小鼠化”抗体的上述说明类似地适用于“啮齿动物化”抗体，如“大鼠化抗体”，其中，代替小鼠，使用了大鼠序列。
如本文所使用的，术语“重链部分”包括来源于免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括以下中的至少一个：CH1结构域、铰链(例如，上、中、和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或其变体或片段。例如，用于本发明中的结合多肽可以包括包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域、以及CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域以及CH3结构域的多肽链，或者包含CH1结构域、至少一部分铰链结构域、CH2结构域、以及CH3结构域的多肽链。在另一个实施方式中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。此外，用于本发明中的结合多肽可缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或一部分)。如上所述，本领域普通技术人员将理解的是，这些结构域(例如，重链部分)可被修改，使得它们随天然存在的免疫球蛋白分子而改变氨基酸序列。
在本文所公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体，或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与该多聚体的第二条多肽链上的那些相同。可替换地，本发明的含有重链部分的单体是不相同的。例如，每个单体可包含不同的靶结合位点，其形成例如双特异性抗体或双抗体。
在另一个实施方式中，本文所公开的某些抗体或其抗原结合片段、变体，或衍生物由单个多肽链组成(如scFvs)构成，且以细胞内方式表达(细胞内抗体)，用于潜在的体内治疗和诊断应用。
用于本文公开的诊断和治疗方法中的结合多肽的重链部分可以来源于不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包括衍生自IgG1分子的CH1结构域以及衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包括部分地衍生自IgG1分子和部分地衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可以包含部分地衍生自IgG1分子和部分地衍生自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所使用的，术语“轻链部分”包括来源于免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链部分包括VL或CL结构域中的至少一个。
用于抗体的肽或多肽表位的最小尺寸被认为是大约四到五个氨基酸。肽或多肽表位优选地包含至少7个氨基酸，更优选地至少9个，最优选地至少约15至约30个之间。由于CDR可以识别其三级形式的抗原性肽或多肽，因此包含表位的氨基酸不需要是连续的，并且在某些情况下，甚至可能不在同一个肽链上。在本发明中，通过本发明的抗体识别的肽或多肽表位包含优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP的至少4个，至少5个，至少6个，至少7，更优选至少8个，至少9个，至少10个，至少15个，至少20个，至少25个，或约15至约30个连续或非连续氨基酸的序列。
“特异性结合”或“特异性识别”在本文中可互换使用，通常是指结合分子(例如，抗体)通过其抗原结合结构域结合至表位，并且该结合引起抗原结合结构域和表位之间的一些互补。根据该定义，抗体在其结合于表位时被说成通过其抗原结合结构域比其结合于随机的不相关的表位更容易地“特异性结合”于该表位。术语“特异性”在本文中用于定量某一抗体结合至某一表位的相对亲和力。例如，抗体“A”可被认为对于给定的表位比抗体“B”具有更高的特异性，或抗体“A”可以被说成比其对于相关的表位“D”以更高的特异性结合于表位“C”。
当存在时，术语“免疫结合特征”，或抗体与抗原的其它结合特征，对于其所有语法形式，是指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性以及其它结合特征。
“优先结合”是指与其结合于相关的、相似的、同源的或类似的表位相比，结合分子(例如，抗体)更容易地特异性地结合于表位。因此，“优先结合”于给定表位的抗体比结合于相关表位更可能结合于该表位，即使这样的抗体可能与相关的表位交叉反应。
通过非限制性实例的方式，如果结合分子(例如，抗体)以小于该抗体的对于第二表位的解离常数(KD)的KD结合于所述第一表位，则该抗体可被认为优先结合于第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以小于该抗体的对于第二表位的KD至少一个数量级的亲和力结合于第一表位，则该抗体可被认为优先结合于第一抗原。在另一非限制性实例中，如果抗体以小于该抗体的对于第二表位的KD至少两个数量级的亲和力结合于第一表位，则该抗体可被认为优先结合于第一表位。
在另一非限制性实例中，如果结合分子(例如，抗体)以小于该抗体的对于第二表位的解离速率(k(off))的k(off)结合于第一表位，则该抗体可被认为优先结合于第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以小于该抗体的对于第二表位的k(off)至少一个数量级的亲和力结合于第一表位，则该抗体可被认为优先结合于第一表位。在另一非限制性实例中，如果抗体以小于该抗体的对于第二表位的k(off)至少两个数量级的亲和力结合于第一表位，则该抗体可被认为优先结合于第一表位。
结合分子(例如，本文所公开的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物)可以被说成以小于或等于5x 10-2秒-1，10-2秒-1，5x 10-3秒-1或10-3秒-1的解离速率(k(off))结合于优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1蛋白、和/或多瘤病毒VP1 VLP，或其片段或变体。更优选地，本发明的抗体可被说成以小于或等于5x 10-4秒-1，10-4秒-1，5x 10-5秒-1或10-5秒-1，5x 10-6秒-1，10-6秒-1，5x 10-7秒-1或10-7秒-1的解离速率(k(off))结合于优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1蛋白、和/或多瘤病毒VP1 VLP，或其片段或变体。
结合分子(例如，本文所公开的抗体或抗原结合片段、变体或衍生物)可以被说成以大于或等于103M-1秒-1，5x 103M-1秒-1，104M-1秒-1或5x 104M-1秒-1的吸收速率(吸附速率，onrate)结合于优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1蛋白、和/或多瘤病毒VP1VLP，或其片段或变体。更优选地，本发明的抗体可被说成以大于或等于105M-1秒-1，5x 105M-1秒-1，106M-1秒-1或5x106M-1秒-1或107M-1秒-1的吸收速率(k(on))结合于优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1蛋白、和/或多瘤病毒VP1 VLP，或其片段或变体。
如果结合分子(例如，抗体)在一定程度上阻止参考抗体结合于表位而优先结合于该表位，则其被说成竞争性抑制参考抗体结合于给定表位。竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法(例如，竞争性ELISA测定)来确定。抗体可以被说成至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，或至少50％地竞争性抑制参考抗体与给定表位的结合。
如本文所使用的，术语“亲和力”是指单独的表位与结合分子(例如，免疫球蛋白分子)的CDR的结合强度的度量，例如参见Harlow等人的Antibodies(抗体):A LaboratoryManual(实验室手册),Cold Spring Harbor Laboratory Press,2nd ed.(1988)，第27-28页。如本文所用的，术语“亲合力(avidity)”是指免疫球蛋白的群体和抗原之间的复合物的整体稳定性，也就是说，免疫球蛋白混合物与抗原的功能性结合强度；参见，例如，Harlow，第29-34页。亲合力与具有特定表位的群体中的单独的免疫球蛋白分子的亲和力，以及免疫球蛋白和抗原的价数相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复的表位结构如聚合物的抗原之间的相互作用将是高亲合力之一。抗体对于抗原的亲和力或亲合力可以通过实验使用任何合适的方法；参见，例如，Berzofsky等人，"Antibody-Antigen Interactions"InFundamental Immunology,Paul、W.E.，Ed.,Raven Press New York,N Y(1984)Kuby,JanisImmunology,W.H.Freeman和Company New York,N Y(1992)，以及本文所述的方法来确定。用于测量抗体对于抗原的亲和力的一般技术包括ELISA、RIA、和表面等离子体共振。如果在不同的条件，例如，盐浓度，pH下测量，则特定抗体-抗原相互作用的测量的亲和力可以变化。因此，亲和力和其他抗原结合参数例如KD、IC50的测量，优选利用抗体和抗原、以及标准化的缓冲液的标准化溶液来进行。。
本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物也可在其交叉反应性方面来描述或规定。如本文所使用的，术语“交叉反应性”是指对于一种抗原特异性的抗体与第二抗原反应的能力；两种不同的抗原物质之间的相关性度量。因此，如果抗体结合于诱导其形成的表位之外的表位，则抗体是交叉反应性的。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，并且在一些情况下，实际上可能比原来更适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如，具有至少95％，至少90％，至少85％，至少80％，至少75％，至少70％，至少65％，至少60％，至少55％，和至少50％同一性(如使用本领域已知的和本文所描述的方法计算的)的表位结合于参考表位。如果抗体没有将具有小于95％，小于90％，小于85％，小于80％，小于75％，小于70％，小于65％，小于60％，小于55％和小于50％同一性(如使用本领域中已知的和本文所描述的方法计算的)的表位结合于参考表位，则抗体可以被说成具有很少或没有交叉反应性。如果抗体不结合表位的任何其它类似物、直系同源物或同系物，则抗体可以被认为对于该表位是“高度特异性的”。
本发明的结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)也可以在其对于优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1VLP的结合亲和力方面描述或规定。优选的结合亲和力包括小于5x 10-2M，10-2M,5x 10-3M，10-3M,5x 10-4M，10- 4M，5x 10-5M，10-5M，5x 10-6M，10-6M，5x 10-7M，10-7M，5x 10-8M，10-8M，5x 10-9M，10-9M，5x 10-10M，10-10M，5x 10-11M，10-11M，5x 10-12M，10-12M，5x 10-13M，10-13M，5x 10-14M，10-14M，5x 10- 15M，或10-15M的解离常数或Kd的那些。
如前面所指出的，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维结构(构象)是公知的。如本文所使用的，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(大部分氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻且是对于免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所使用的，术语“CH2结构域”包括重链分子的部分，其例如利用常规的编号方案从抗体的大约残基244延伸到残基360(残基244至360，Kabat编号系统；以及残基231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等人，同前)。CH2结构域的独特之处在于它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。还有据可查的是，CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C末端，并且包含约108个残基。
如本文所使用的，术语“铰链区”包括重链分子的将CH1结构域加入到CH2结构域的部分。该铰链区包含约25个残基并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区独立地移动。铰链区可以被细分成三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域；参见Roux等人的J.Immunol(免疫学杂志)161(1998),4083-4090。
如本文所使用的，术语“二硫键”包括在两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键连接，并且两条重链通过两个二硫键在对应于利用Kabat编号系统的239和242的位置(位置226或229，EU编号系统)连接。
如本文所使用的，术语“连接”、“融合的”或“融合”可互换使用。这些术语指的是两个以上的元件或部件以任何方式连接在一起，包括化学结合或重组手段。“框内融合”是指两个或更多个多核苷酸开放阅读框(ORF)以保持原始ORF的正确翻译阅读框的方式的接合，以形成连续的更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有与由原始ORF(所述片段通常不那么自然地接合)编码的多肽对应的两个或更多个片段的单个蛋白。虽然阅读框在整个融合片段被如此制成连续的，但这些片段可以在物理上或空间上由例如框内连接序列分隔开。例如，编码免疫球蛋白可变区的CDR的多核苷酸可以在框内融合，但是由编码至少一个免疫球蛋白框架区或附加CDR区的多核苷酸分隔开，只要“融合的”CDR被共翻译为连续多肽的一部分。
如本文所用的术语“表达”是指这样的过程，通过该过程，基因产生一种生物化学物质，例如RNA或多肽。该过程包括细胞内的基因的功能性存在的任何表现，包括但不限于，基因敲除以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于基因转录成信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发卡RNA(shRNA)、小干涉RNA(siRNA)或任何其它RNA产物，以及mRNA翻译成一个或多个多肽。如果最终希望的产物是一种生物化学物质，则表达包括该生物化学物质和任何前体的创建。基因的表达产生“基因产物”。如本文所使用的，基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使RNA，或由转录物翻译的多肽。本文所描述的基因产物进一步包括具有转录后修饰(例如，多聚腺苷酸化)的核酸，或具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、添加脂质、与其它蛋白亚基关联、蛋白水解裂解等)的多肽。
如本文所使用的，术语“样品”是指从受试者或患者获得的任何生物材料。在一个方面，样品可以包括血液、腹膜液、CSF、唾液或尿液。在其它方面，样品可以包括全血、血浆、血清、由血液样本富集的B细胞和培养细胞(例如，来自受试者的B细胞)。样品还可以包括活组织检查或组织样本，包括神经组织。在其它方面，样品可以包括全细胞和/或该细胞的裂解液(溶胞产物)。血液样品可以通过本领域已知的方法来收集。在一个方面，颗粒(pellet)可以通过在4℃下在200μl缓冲液(20mM的Tris，pH值7.5，0.5％的Nonidet，1mM的EDTA，1mM的PMSF，0.1M的NaCl，IX西格玛蛋白酶抑制剂，以及IX西格玛磷酸酶抑制剂1和2)中涡旋而重悬浮。可将悬浮液以间歇涡旋在冰上保持20分钟。在约4℃下以15,000x g纺丝5分钟后，可在约-70℃存储上清液的等分试样。
疾病：
除非另有说明，否则术语“病症”和“疾病”在本文可互换使用，并且包括受试者、动物、分离的器官、组织或细胞/细胞培养物中的任何不期望的生理变化。
多瘤病毒感染导致在免疫低下患者体内的多瘤病毒激活后多种疾病的发展。传播方式是广泛的，并且大多通过直接的人与人之间的污染而发生。尽管如此，污水对于多瘤病毒而言也是最重要的贮液器之一。具有JCV和/或BKV类型的多瘤病毒的主要感染大多发生在幼儿期，而多瘤病毒保留一延迟阶段，直到它在特定的病理和/或生理状态(例如，免疫抑制状态发展)期间被激活。与像JCV或BK的多瘤病毒相关的疾病是广泛的。JCV的最常见疾病是人脑的诱发脱髓鞘疾病、进行性多灶性白质脑病(PML)，导致免疫功能缺陷。PML作为免疫调节疗法的副作用的发展日益关注患者中致命性PML病例的报告，治疗多发性硬化症(MS)和克罗恩病、何杰金氏淋巴瘤、类风湿关节炎、自身免疫性血液障碍、重症肌无力、系统性红斑狼疮、B细胞淋巴瘤、斑块牛皮癣、强直性脊柱炎、牛皮癣性关节炎、溃疡性结肠炎、以及器官移植排斥的抑制(Frenchy等人的Clin.Micro Biol.Rev.25(2012),471-506)。此外，JCV也与其它神经病症和人类癌症有关。除JCV外，BKV还针对导致上呼吸道感染和肺炎的呼吸树以及膀胱感染或肾脏、中枢神经系统(CNS)、眼、消化道感染导致的出血性膀胱炎，以及导致像与多瘤病毒有关的间质性肾疾病、输尿管狭窄的内皮、移植物的丧失、脑膜炎、脑炎、视网膜炎、结肠炎和脉管炎的疾病。本发明提供了来自健康供体或PML-IRIS患者的池的几种人源化抗体，用于治疗或预防接种克隆和重组产生的多瘤病毒感染，如下文更详细地描述。
在本发明的一个实施方式中，本发明的抗体、具有其任一种大致相同的结合特异性的结合分子、多核苷酸、载体或本发明的细胞被用于药物或诊断组合物的制备，以用于预防性和/或治疗性治疗，监测来自PML、颗粒神经元、深染核、颗粒细胞神经细胞病、脑萎缩、脑病、多瘤病毒诱导的肿瘤、免疫重建炎性综合征(IRIS)、出血性膀胱炎、肺炎、视网膜炎、结肠炎、脉管炎、间质性肾病、呼吸道的感染的疾病的进展或对所述疾病的治疗和/或诊断的反应。
此外，本发明的抗体、具有与其任一种大致相同的结合特异性的结合分子、多核苷酸、载体或本发明的细胞用于组合物的制备，该组合物用于多瘤病毒感染(例如JCV和/或BKV感染)的检测。
经常观察到诸如PML的病症作为免疫抑制患者中的JCV感染的症状，其导致中枢神经系统(CNS)的脱髓鞘疾病(脱髓鞘作用，demyelinisation)，并且在严重的情况下可能导致死亡。
已知许多疾病与多瘤病毒感染有关。因此，在一个实施方式中，本发明的抗体、具有与其任一种大致相同的结合特异性的结合分子、多核苷酸、载体或本发明的细胞用于药物或诊断组合物的制备，该药物或诊断组合物用于预防性和/或治疗性处理、改善、监测治疗的进展或对治疗的反应和/或用于诊断伴随多瘤病毒感染的病症的组。
治疗：
如本文所使用的，术语“治疗”或“处理”指治疗性治疗以及预防性或防范性措施两者，其中目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或病症。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状的减轻、疾病程度的消失、疾病的稳定(即不恶化)状态、延迟或延缓疾病进展、改善或缓和疾病状态、以及缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。“治疗”也可以指与如果不接受治疗的预期存活相比延长的存活。需要治疗的那些包括已经患有所述病症或障碍的那些以及易患所述病症或障碍的那些或者其中所述病症或障碍的表现形式被防止的那些。
如果没有另外说明，则术语“药物(drug)”，“药品(药剂，medicine)”或“药剂(medicament)”在本文中可互换使用，并且应当包括但不限于所有的：(A)用于内部或外部使用的制品、药品和制剂，以及旨在用于诊断，治愈，缓解，治疗或预防人或其他动物的疾病的任何物质或物质的混合物；和(B)旨在影响人或其他动物的身体的结构或任何功能的制品、药品和制剂(除了食物)；以及(C)旨在用作在条目(A)和(B)中规定的任何制品的组分的制品。术语“药物”、“药品”或“药剂”应当包括旨在用于人或其他动物中的制剂的完整配方，其包含一种或多种“试剂(药剂，agent)”，“化合物”，“物质”或“(化学)组合物”，作为并且在一些其他情况下还包括其他药学上无活性的赋形剂作为填充剂，崩解剂，润滑剂，助流剂，粘合剂或者在人或其他动物的身体内的预定目标位置(例如，在皮肤上，在胃或肠中)确保“药物”，“药品”或“药剂”的容易运输，崩解，解聚，溶出和生物可用性。术语“试剂”，“化合物”，或“物质”在本文可互换使用，并且在更具体的上下文中，应当包括，但不限于所有的药理学活性剂，即诱导期望的生物学或药理学效果或研究或测试用于通过本发明的方法诱导这样的可能的药理作用的能力的试剂。
“受试者”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”是指任何受试者，特别是哺乳动物受试者，例如人类患者，对他们来说，诊断、预后、预防或治疗是期望的。
药物载体：
药物上可接受的载体和给药途径可以获自本领域技术人员所熟知的相应文献。本发明的药物组合物可根据本领域熟知的方法配制；例如参见Remington:University ofSciences in Philadelphia(费城的科学大学)的Robinson等人的The Science andPractice of Pharmacy(药学科学与实践)(2000),ISBN 0-683-306472,VaccineProtocols,第二版,Humana Press,Totowa,New Jersey,USA,2003；Taylor和Francis的Banga,Therapeutic Peptides and Proteins:Formulation,Processing,and DeliverySystems(治疗性多肽和蛋白质：配方，加工和递送系统)第二版(2006),ISBN:0-8493-1630-8。合适的药物载体的实例是本领域所熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂，例如油/水乳液，各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括这样的载体的组合物可以通过公知的传统方法来配制。这些药物组合物可以以合适的剂量给予受试者。合适组合物的给药可通过不同的方式来实现。实例包括通过口服、鼻内、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、真皮下、经皮、鞘内和颅内方法给予包含药学可接受的载体的组合物。气溶胶制剂(例如鼻喷雾制剂)包括具有防腐剂和等渗剂的活性剂的纯化水溶液或其他溶液。这样的制剂优选被调节至与鼻粘膜兼容的pH和等渗状态。用于口服给药的药物组合物(例如单结构域抗体分子(例如，“nanobodiesTM”)等)也被设想在本发明中。这种的口服制剂可以是片剂、胶囊、粉末、液体或半固体形式。片剂可以包含固体载体，如明胶或佐剂。用于直肠或阴道给药的制剂可呈现为具有合适载体的栓剂；还参见O'Hagan等人的Nature Reviews(自然综述),DrugDiscovery(药物发现)2(9)(2003),727-735。有关适合于各种类型给药的配方的进一步指导可以在Remington的Pharmaceutical Sciences(药物科学),Mace Publishing Company,Philadelphia,PA,17th ed.(1985)和相应的更新中找到。对于用于药物递送的方法的简要评述，参见Langer,Science 249(1990),1527-1533。
II.本发明的抗体
本发明一般涉及人类抗多瘤病毒抗体、抗多瘤病毒VP1抗体和抗多瘤病毒VP1 VLP抗体及其抗原结合片段，其优选地说明了如在实施例中所示的抗体所概述的免疫结合特性和/或生物学性质。根据本发明，对优选JCV和/或BKV类型的多瘤病毒特异的人类单克隆抗体从具有未知HLA分型和抗JCV效价的健康老年人受试者、呈现出强大的JCV特异性抗体产生的HLA-DRB1*04:01+健康供体、以及接受单克隆抗体疗法以治疗多发性硬化症(MS)和发展PML和PML-IRIS症状的患者的池中克隆。
在根据本发明进行的实验的过程中，人记忆B细胞库(repertoire)的抗体通过用于多瘤病毒VP蛋白特异性结合的高通量分析进行筛选。只有对于多瘤病毒VP1蛋白而不是对于BSA阳性的B细胞培养物经受抗体克隆。
由于该措施，几种抗体可以被分离。所选择的抗体被进一步分析，以用于类别和轻链子类确定。从记忆B细胞培养物中选择的相关抗体信息然后可通过RT-PCR进行转录，克隆且组合成用于重组生产的表达载体。在HEK 293或CHO细胞中的人抗体的重组表达，以及它们针对多瘤病毒VP1蛋白的结合特异性的后续表征，优选人JCV VP1和/或BKV VP1蛋白(图2至4和图7；实施例2至4和10)，证实了首次人抗体被克隆，其对于JCV和/或BKV以及JCV VP1和/或BKV VP1蛋白是高度特异性的。
此外，这些抗体被测试其对不同的多瘤病毒VP1蛋白和结合于病毒样颗粒(VLP)的结合特异性和结合效率。
因此，本发明总体上涉及一种人源化的单克隆抗多瘤病毒、抗多瘤病毒VP1蛋白、和/或抗多瘤病毒VP1 VLP抗体和其结合片段、衍生物和变体，优选JCV和/或BKV类型的。
在本发明的一个实施方式中，抗体能够结合人多瘤病毒和/或其抗原，优选JCV和/或BKV。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体能够结合至突变的人多瘤病毒和/或其抗原、多瘤病毒VP1蛋白、和/或多瘤病毒VP1 VLP，优选JCV和/或BKV类型的。换句话说，优选地，本发明的人源化抗多瘤病毒抗体的结合亲和力基本上不受病毒蛋白突变的影响；参见实施例12和图11。这对于那些识别不连续或构象表位的抗体可能尤其如此，其可能不受病毒抗原的氨基酸序列中的单个氨基酸置换的影响，特别是当存在于病毒颗粒或VLP中时。
在一个实施方式中，本发明涉及一种多瘤病毒抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中该抗体特异性地结合于与选自由以下组成的组中的参考抗体相同的多瘤病毒的表位：(A)NI-307.13G4,(B)NI-307.18E12,(C)NI-307.19F8,(D)NI-307.20F5,(E)NI-307.61D11,(F)NI-307.3G4(G)NI-307.6A2,(H)NI-307.11G6,(I)NI-307.19F10,(J)NI-307.24F3,(K)NI-307.25G10,(L)NI-307.43A11,(M)NI-307.57D5,(N)NI-307.78C3,(O)NI-307.1E1,(P)NI-307.5H3,(Q)NI-307.24C6,(R)NI-307.26E10,(S)NI-307.11G6,(T)NI-307.13G4,(U)NI-307.61D11,(V)NI-307.98D3,(W)NI-307.72F7,(X)NI-307.45E10,(Y)NI-307.72F10,(Z)NI-307.56A8,(A2)NI-307.27C11,(B2)NI-307.47B11,(C2)NI-307.26A3,(D2)NI-307.27C2,(E2)NI-307.57D4,(F2)NI-307.50H4,(G2)NI-307.53B11,(H2)NI-307.7J3,(I2)NI-307.59A7,(J2)NI-307.105A6,(K2)NI-307.29B1,(L2)NI-307.44F6B,(M2)NI-307.98H1,(N2)NI-307.43E8,(O2)NI-307.18F4A。表位映射识别包括aa 333-LPGDPDM-339的人多瘤病毒内的序列作为由本发明的抗体NI-307.11G6识别的独特线性表位，并识别包括aa 124-SQATHDN-130的人多瘤病毒JC内的序列作为由本发明的抗体NI-307.13G4识别的独特线性表位(参见图8和实施例7)。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体，其中该抗体特异性地结合包含或由氨基酸序列LPGDPDM(SEQ ID NO:85),GQATHDN(SEQ ID NO:86),MRYVDKYGQLQT(SEQ ID NO:87)或RVFEGTEELPG(SEQ ID NO:88)组成的多瘤病毒表位。在一个优选的实施方式中，本发明的抗体结合包含GQATHDN(SEQ IDNO:86),MRYVDKYGQLQT(SEQ ID NO:87)的表位。
此外，在没有打算受到如在实施例4至7和10中所说明的以及图2至4和7中所示的初始实验观察的约束的情况下，本发明的人单克隆(A)NI-307.13G4,(B)NI-307.19F10,(C)NI-307.19F8,(D)NI-307.11G6,(E)NI-307.17F12,(F)NI-307.6A2,(G)NI-307.5H3,(H)NI-307.25G10,(I)NI-307.26E10,(J)NI-307.1E1,(K)NI-307.24C6,(L)NI-307.78C3,(M)NI-307.57D5,(N)NI-307.43A11,(O)NI-307.3G4,(P)NI-307.61D11,(Q)NI-307.24F3,(R)NI-307.18E12,(S)NI-307.20F5,(T)NI-307.58C7(U)NI-307.105C7,(V)NI-307.98D3,(W)NI-307.72F7,(X)NI-307.45E10,(Y)NI-307.72F10,(Z)NI-307.56A8,(A2)NI-307.27C11,(B2)NI-307.47B11,(C2)NI-307.26A3,(D2)NI-307.27C2,(E2)NI-307.57D4,(F2)NI-307.50H4,(G2)NI-307.53B11,(H2)NI-307.7J3,(I2)NI-307.59A7,(J2)NI-307.105A6,(K2)NI-307.29B1,(L2)NI-307.44F6B,(M2)NI-307.98H1,(N2)NI-307.43E8和(O2)NI-307.18F4A抗体优选地特征在于，特异性地结合至多瘤病毒VP1蛋白和VP1 VLP蛋白且基本上不识别BSA；参见实施例4至6和10。因此，本发明提供了一组具有结合特异性的人抗多瘤病毒、抗JCV和/或抗BKV抗体，其对于诊断和治疗目的是特别有用的。
在一个实施方式中，本发明的抗体显示出特异性结合于JCV VP1而不结合或弱结合于BKV VP1的示例性重组人NI-307.13G4，NI-307.18E12，NI-307.19F8，NI-307.20F5和NI-307.61D11抗体的结合性质，如在实施例2中所描述的。在本文中，结合特异性可以如在图2中对于示例性的NI-307.13G4，NI-307.18E12，NI-307.18F4A，NI-307.19F8，NI-307.20F5和NI-307.61D11抗体所示的范围内，即，对于JCV VP1，具有约1pM至100nM的半数最大有效浓度(EC50)，优选地约10pM至50nM的EC50，最优选地约100pM至5nM的EC50，如对于NI-307.13G4，NI-307.18E12，NI-307.18F4A，NI-307.19F8，NI-307.20F5，和NI-307.61D11所示出的。
另外，或可替代地，本发明的抗多瘤病毒抗体特异性地结合于JCV VP1和BKV VP1。在本文中，结合特异性可以是如在实施例5和图3中的针对示例性NI-307.3G4，NI-307.6A2，NI-307.11G6，NI-307.19F10，NI-307.24F3，NI-307.25G10，NI-307.43A11，NI-307.44F6B，NI-307.57D5和NI-307.78C3所示的范围，对于CV VP1具有约1pM至500nM的半数最大有效浓度(EC50)，优选地约10pM至100nM的EC50，最优选地约500pM至80nM的EC50，并且对于VP1VLP，约1pM至500nM的EC50，优选地约5pM至100nM的EC50，最优选地约10pM至30nM的EC50。分别地，与BKV VP1具有高亲和力的重组人源化抗体NI-307.3G4，NI-307.6A2，NI-307.11G6，NI-307.19F10，NI-307.24F3，NI-307.25G10，NI-307.43A11，NI-307.44F6B，NI-307.57D5和NI-307.78C3对于BKV VP1具有约1pM至500nM的EC50，优选地约5pM至100nM的EC50，最优选地对于BKV VP1具有约10pM至50nM的EC50，并且对于BKV VP1 VLP具有约1pM至500nM的EC50，优选地约10pM至200nM的EC50，最优选地约30pM至120nM的EC50。另外，或可替代地，本发明的抗多瘤病毒抗体特异性地结合于BKV VP1，如实施例6和图4中所描述的。在一个实施方式中，本发明的抗体表现出示例性重组人NI-307.1E1，NI-307.5H3，NI-307.24C6，和NI-307.26E10的结合性质，其强烈地结合至来自BKV的VP1且弱地结合于JCV VP1。在本文中，结合特异性可以在实施例6和相应的图4中如针对示例性的NI-307.1E1，NI-307.5H3，NI-307.24C6和NI-307.26E10所示的范围内，即，对于BKV VP1具有约1pM至500nM的半数最大有效浓度(EC50)，优选地约10pM至100nM的EC50，最优选地约800pM至5nM的EC50，并且对于BKVVP1 VLP，具有约1pM至500nM的EC50，优选地约10pM至100nM的EC50，最优选地约200pM至20nM的EC50，对于JCV VP1，具有约1pM至500nM的EC50，优选地约10pM至300nM的EC50，最优选地约1pM至200nM的EC50，且对于JCV VP1 VLP，具有约1pM至500nM的EC50，优选地约100pM至300nM的EC50，最优选地约1pM至300nM的EC50。
在一个优选的实施方式中，本发明的抗体显示出强结合于JCV VP1 VLP的示例性重组人NI-307.7J3,NI-307.26A3,NI-307.27C2,NI-307.27C11,NI-307.29B1,NI-307.43E8,NI-307.45E10,NI-307.47B11,NI-307.50H4,NI-307.53B11,NI-307.56A8,NI-307.57D4,NI-307.58C7,NI-307.59A7,NI-307.72F7,NI-307.72F10,NI-307.98D3,NI-307.98H1,NI-307.105A6和NI-307.105C7抗体的结合性质，如在实施例10中所描述的。在本文中，结合特异性可以是在图7中的如针对示例性的NI-307.7J3,NI-307.26A3,NI-307.27C2,NI-307.27C11,NI-307.29B1,NI-307.43E8,NI-307.45E10,NI-307.47B11,NI-307.50H4,NI-307.53B11,NI-307.56A8,NI-307.57D4,NI-307.58C7,NI-307.59A7,NI-307.72F7,NI-307.72F10,NI-307.98D3,NI-307.98H1,NI-307.105A6和NI-307.105C7抗体所示的范围内，即，对于JCV VP1VLP，具有约0.1pM至1nM的半数最大有效浓度(EC50)，优选地小于1nM的EC50，如针对NI-307.7J3,NI-307.26A3,NI-307.27C2,NI-307.27C11,NI-307.29B1,NI-307.43E8,NI-307.45E10,NI-307.47B11,NI-307.50H4,NI-307.53B11,NI-307.56A8,NI-307.57D4,NI-307.58C7,NI-307.59A7,NI-307.72F7,NI-307.72F10,NI-307.98D3,NI-307.98H1,NI-307.105A6和NI-307.105C7所示出的。
在一个实施方式中，本发明的抗多瘤病毒抗体优选显示出示例性的抗体NI-307.13G4、NI-307.18E12、NI-307.18F4A、NI-307.19F8、NI-307.20F5和NI-307.61D11的结合性质，相比于BKV VP1而优先结合JCV VP1。
此外或可替换地，本发明的抗体优选显示出示例性的抗体NI-307.3G4、NI-307.6A2、NI-307.11G6、NI-307.19F10、NI-307.24F3、NI-307.25G10、NI-307.43A11、NI-307.44F6B、NI-307.57D5和NI-307.78C3的结合特性，其结合JCV和BKV VP1蛋白两者。
在另一个实施方式中，另外地或可替代地，本发明的抗体显示出示例性的抗体NI-307.1E1、NI-307.5H3、NI-307.24C6和NI-307.26E10的结合性质，相比于BKV VP1而优先地结合JCV VP1。
在又一个实施方式中，本发明的抗体优选显示出示例性的抗体NI-307.7J3、NI-307.26A3、NI-307.27C2、NI-307.27C11、NI-307.29B1、NI-307.43E8、NI-307.45E10、NI-307.47B11、NI-307.50H4、NI-307.53B11、NI-307.56A8、NI-307.57D4、NI-307.58C7、NI-307.59A7、NI-307.72F7、NI-307.72F10、NI-307.98D3、NI-307.98H1、NI-307.105A6和NI-307.105C7的结合性质，以高亲和力地结合至JCV VP1 VLP。
本发明还提出了一种抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中，该抗体包括抗原结合结构域，其与选自由如下组成的组中的抗体是相同的：(A)NI-307.13G4、(B)NI-307.18E12、(C)NI-307.19F8、(D)NI-307.20F5、(E)NI-307.61D11、(F)NI-307.3G4(G)NI-307.6A2、(H)NI-307.11G6、(Ⅰ)NI-307.19F10、(J)NI-307.24F3、(K)NI-307.25G10、(L)NI-307.43A11、(M)NI-307.57D5、(N)NI-307.78C3、(O)NI-307.1E1、(P)NI-307.5H3、(Q)NI-307.24C6、(R)NI-307.26E10、(S)NI-307.11G6、(T)NI-307.13G4、(U)NI-307.61D11、(Ⅴ)NI-307.98D3、(W)NI-307.72F7、(Ⅹ)NI-307.45E10、(Y)NI-307.72F10、(Z)NI-307.56A8、(A2)、NI-307.27C11、(B2)NI-307.47B11、(C)NI-307.26A3、(D 2)NI-307.27C2、(E2)NI-307.57D4、(F2)、NI-307.50H4、(G2)NI-307.53B11、(H 2)NI-307.7J3、(I2)NI-307.59A7、(J2)NI-307.105A6、(K2)NI-307.29B1、(L2)NI-307.44F6B、(M2)NI-307.98H1、(N2)NI-307.43E8和(O2)NI-307.18F4A。
本发明进一步举例说明了几个这样的结合分子，例如，抗体及其结合片段，其特征在于，在它们的可变区(例如，结合结构域)中包括VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)，其包括图8中所描绘的氨基酸序列中的任何一个。编码上述确定可变区的相应核苷酸序列分别列于下面的表II和表III中。以上VH和/或VL区的氨基酸序列的CDR的示例性组被描绘在图8中。然而，如下面所讨论的，本领域技术人员非常了解的是，另外地或可替换地，可以使用CDR，其氨基酸序列不同于图8所示的那些，在CDR2和CDR3的情况下，有一个、两个、三个或甚至更多个氨基酸是不同的。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或其多瘤病毒和/或多瘤病毒VP1结合片段，在它的可变区中包括至少一个CDR(如图8所示)和/或包含一个或多个氨基酸取代的其一个或多个CDR。
在一个实施方式中，本发明的抗体是包含如图8所示的VH和/或VL区或包含一个或多个氨基酸取代的其VH和/或VL区的氨基酸序列的抗体的任一种。优选地，本发明的抗体的特征在于重链和轻链的同源配对的保存，如存在于人B细胞中。
可替换地，本发明的抗体是这样的抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与具有如图8所示的VH和/或VL区的抗体中的至少一种竞争结合于多瘤病毒和/或多瘤病毒的VP1蛋白。
如前面已经指出的，本发明的一些抗体已被证明能够结合多瘤病毒JCV和BKV两者。
因此，可替代地或除上述之外，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体或其多瘤病毒的VP1、JCV VP1和/或BKV VP1结合片段，其在其可变区中包括如图8所示的至少一个CDR和/或包含一个或多个氨基酸取代的其一个或多个CDR。
可替代地，本发明的抗体是这样的抗体或其抗原结合片段、衍生物或变体，其与如图8所示的具有VH和/或VL区的抗体中的至少一个竞争结合至多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP，优选结合至JCV VP1、JCV VP1 VLP和/或BKV VP1、BKV VP1 VLP。
本发明的抗体可以是人，特别是用于治疗应用。
可替代地，本发明的抗体是啮齿动物、啮齿动物化的(rodentized)或嵌合啮齿类人的抗体，优选小鼠、小鼠化的或嵌合小鼠-人抗体或大鼠，大鼠化的或嵌合大鼠-人抗体，其特别是可用于诊断方法以及动物研究。在一个实施方式中，本发明的抗体是嵌合啮齿动物-人或啮齿动物化的抗体。
如上所述，由于其在人免疫反应之后产生，因此本发明的人单克隆抗体将识别这样的表位，其具有特定的病理相关性且其不可能是可访问的或免疫原性较低的，分别在例如小鼠单克隆的产生和噬菌体展示文库的体外筛选的免疫过程的情况下。因此，为谨慎起见，规定了本发明的人类抗多瘤病毒、抗多瘤病毒的VP1和/或多瘤病毒的VP1 VLP抗体的抗原表位是独特的，并且不存在能够结合至由本发明的人单克隆抗体所识别的表位的其他抗体。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多肽，其包含、基本上由或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中，重链可变区的至少一个VH-CDR或重链可变区的至少两个VH-CDR与来自本文所公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。可替代地，VH的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3区域与来自本文所公开的抗体的参考重链VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。这样，根据本实施方式，本发明的重链可变区具有与图8中所示的基团(组)相关的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。而图8示出了由Kabat系统限定的VH-CDR，其他的CDR定义(例如，由Chothia系统限定的VH-CDR)也包括在本发明中，并且可以通过使用图8呈现的数据由普通技术人员很容易地识别。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含、基本上由或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中，VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有多肽序列，它们与图8所示的VH-CDR1，VH-CDR2和VH-CDR3基团(组)相同。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含、基本上由或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成，其中，VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有多肽序列，它们与图8所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团(组)相同，除了在任何一个VH-CDR中的一、二、三、四、五、或六个氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸取代是保守的。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含、基本上由或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成，其中，轻链可变区的至少一个VL-CDR或轻链可变区的至少两个VL-CDR与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。可替代地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文所公开抗体的参考轻链VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％相同。因此，根据本实施方式，本发明的轻链可变区具有与图8中所示的多肽相关的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。而图8示出了由Kabat系统定义的VL-CDR，其他CDR定义，例如由Chothia系统定义的VL-CDR，也包括在本发明中。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、基本上由其组成或由其组成，其中，VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3区具有多肽序列，其与图8所示的VL-CDR1，VL-CDR2和VL-CDR3基团(组)相同。
在进一步的实施方式中，本发明提供了一种分离的多肽，其包含免疫球蛋白重链可变区(VL)、基本上由其组成或由其组成，其中，VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区具有多肽序列，其与图8所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3基团相同，除了在任何一个VL-CDR中的一、二、三、四、五、或六个氨基酸取代。在某些实施方式中，氨基酸取代是保守的。
免疫球蛋白或其编码cDNA可被进一步修饰。因此，在进一步的实施方式中，本发明的方法包括如下步骤中的任何一个：生产嵌合抗体、小鼠化的抗体、单链抗体、Fab片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或这些中的任一个的类似物。相应的方法对于本领域技术人员来说是已知的并且描述在例如Harlow和Lane的“Antibodies(抗体)，实验室手册”，CSH出版社，冷泉港(Cold Spring Harbor)(1988)。当所述抗体的衍生物通过噬菌体展示技术获得时，如BIAcore系统中使用的表面等离子体共振可用于增加噬菌体抗体的效率，该噬菌体抗体结合至与在此描述的抗体中的任一个的表位相同的表位(Schier，HumanAntibodies Hybridomas(人抗体杂交瘤)7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)183(1995)，7-13)。嵌合抗体的产生描述于例如国际申请WO 89/09622中。用于生产人源化抗体的方法描述在例如欧洲申请EP-A10239400和国际申请WO90/07861中。按照本发明待利用的抗体的进一步来源是所谓的异种抗体。用于生产异种抗体(例如人样小鼠抗体)的一般原理描述在例如国际申请WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096和WO 96/33735中。如上所讨论的，在完整抗体形式之外，本发明的抗体还可以以各种形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab)2以及单链；例如参见国际申请WO 88/09344。因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体，其选自由单链Fv片段(scFv)，F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab')2片段组成的组。
本发明的抗体或其一个或多个相应的免疫球蛋白链可以使用本领域中已知的常规技术进一步修饰，例如，通过使用一个或多个氨基酸缺失、一个或多个插入、一个或多个取代、一个或多个添加，和/或一种或多种重组和/或本领域已知的一种或多种任何其它修饰，以单独或组合的方式。用于在免疫球蛋白链的氨基酸序列下的DNA序列中引入这种修饰的方法对于本领域技术人员来说是公知的，参见例如，Sambrook，Molecular Cloning ALaboratory Manual(分子克隆实验手册)，冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)(1989)纽约和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学的目前协议)，格林出版协会(Green Publishing Associates)和威利(Wiley)Interscience，纽约(1994)。本发明的抗体的修饰包括在一个或多个构成(组成)氨基酸上的化学和/或酶促衍生化，包括侧链改性，主链改性，以及包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化的N-和C-末端改性，和碳水化合物或脂质部分、辅因子的连接，等等。同样地，本发明包括嵌合蛋白质的生产，其包含在融合至异源分子的氨基末端的所描述的抗体或其某些片段，如在羧基末端的免疫刺激配体；对于相应的技术细节，参见例如国际申请WO00/30680。
另外，本发明包括这样的肽，其包括含有如上所述的结合分子的那些，例如含有所提及的抗体中的任何一种的可变区的CDR3区域，尤其是重链的CDR3，因为经常观察到，重链CDR3(HCDR3)是具有更大程度的可变性和在抗原-抗体相互作用中占优势的参与的区域。这样的肽可以容易地合成或通过重组方法来生产，以产生根据本发明有用的结合剂。这样的方法对于本领域普通技术人员来说是公知的。肽可以例如使用可市场购买到的自动肽合成仪来合成。通过将表达该肽的DNA并入到表达载体中并且转化具有该表达载体的细胞以产生所述肽，使得肽还可以通过重组技术而产生。
因此，本发明涉及任何结合分子，例如抗体或其结合片段，其朝向本发明的人抗多瘤病毒、抗多瘤病毒的VP1和/或抗多瘤病毒的VP1 VLP抗体而定向，并显示出所提及的特性，即，其特异性地识别多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP。如本文描述的，通过ELISA和免疫组织化学，可以测试这样的抗体和结合分子的结合特异性和亲和力，参见例如，实施例2至4和10。抗体和结合分子的这些特性也可通过蛋白质印迹法来测试。
作为直接从B细胞或B记忆细胞的培养物获得免疫球蛋白的一种替代方案，细胞可以被用作重排重链和轻链基因座的来源，用于随后的表达和/或遗传操作。重排的抗体基因可以从适当的mRNA进行逆转录，以产生cDNA。如果需要的话，重链恒定区可以变换成不同的同种型或一起被消除。可变区可被连接，以编码单链Fv区。多个Fv区可被连接，以将结合能力赋予给多于一个的靶，或者可以采用嵌合重链和轻链的组合。一旦遗传物质可获得，则如上所述的类似物的设计是简单的，其同时保留其结合所期望的靶的能力。用于抗体可变区的克隆和产生重组抗体的方法对本领域技术人员来说是已知的，并且描述在例如Gilliland等人的Tissue Antigens(组织抗原)47(1996)，1-20；Doenecke等人，Leukemia(白血病)11(1997)，1787-1792中。
一旦合适的遗传物质被获得并且如果需要被改性以编码类似物，则编码序列(包括最低限度编码重链和轻链的可变区的那些)可插入到在载体上包含的表达系统中，该载体可被转染入标准的重组宿主细胞中。可以使用各种这样的宿主细胞；然而，为了有效处理，哺乳动物细胞是优选的。可用于此目的的典型的哺乳动物细胞系包括但不限于：CHO细胞、HEK293细胞或NSO细胞。该抗体或类似物的生产然后通过在适于宿主细胞的生长和编码序列的表达的培养条件下培养改性的重组宿主而进行。所述抗体然后通过从培养物中分离它们而被回收。表达系统优选地被设计成包括信号肽，以使所得的抗体被分泌到培养基中；然而，细胞内的生产也是可能的。
按照以上所述，在该抗体(优选地，至少上述抗体的免疫球蛋白链的可变区)的情况下，本发明还涉及编码本发明的抗体或等效结合分子的多核苷酸。典型地，由所述多核苷酸编码的可变区包含所述抗体的可变区的VH和/或VL的至少一个互补决定区(CDR)。
本领域技术人员将容易理解，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可以被用于构建其它多肽或所需特异性和生物功能的抗体。因此，本发明还包括多肽和抗体，其包括上述可变结构域的至少一个CDR，并且其有利地具有与在所附的实施例中描述的抗体基本相同或相似的结合特性。本领域技术人员知道，结合亲和性可以通过在CDR内或高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)196(1987)，901-917)中进行氨基酸取代而被提高，其部分地与如由Kabat所定义的CDR重叠；参见例如Riechmann等人，Nature 332(1988)，323-327。因此，本发明还涉及这样的抗体，其中，所提到的CDR中的一个或多个包括一个或多个(优选不超过两个)氨基酸取代。优选地，本发明的抗体在其免疫球蛋白链中的一个或两个中包含可变区的两个或所有三个CDR，如图8所示的。
如由本领域普通技术人员已知的，本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或其衍生物可以包括介导一种或多种效应子功能的恒定区。例如，补体的C1成分与抗体恒定区的结合可以激活补体系统。补体的活化在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体的活化还刺激炎症反应，并且也可以参与自身免疫超敏性。此外，抗体经由Fc区而结合至各种细胞上的受体，其中抗体Fc区上的Fc受体结合位点结合至细胞上的Fc受体(FcR)。存在许多Fc受体，其对于不同类的抗体是特异性的，包括IgG(γ-受体)、IgE(ε受体)，IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合引发了许多重要和多样的生物反应，包括抗体包覆的颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、抗体包覆的靶细胞被杀伤细胞的裂解(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或ADCC)、炎症介质的释放、胎盘转移和免疫球蛋白生产的控制。
因此，本发明的某些实施方式包括抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中，恒定区结构域中的一个或多个的至少一部分已被缺失或以其他方式被改变以提供所需的生化特性。例如，用于本文所述的诊断和治疗方法中的某些抗体是包括类似于免疫球蛋白重链的多肽链但缺少一个或多个重链结构域的至少一部分的域缺失抗体。例如，在某些抗体中，改性的抗体的恒定区的一个完整结构域将被缺失，例如，CH2结构域的全部或部分将被缺失。在其他实施方式中，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些抗体具有恒定区，例如，IgG重链恒定区，其被改变以消除糖基化，在本文其它地方被称为无糖基化的或“阿格利河(agly)”抗体。这样的“阿格利河(agly)”抗体可酶促地以及通过改造(工程化，engineering)恒定区中的一个或多个共有糖基化位点而制备。虽然不受理论的束缚，但据信，“阿格利河(agly)”抗体可以具有改进的安全性和体内的稳定性分布。制备具有所需的效应子功能的无糖基化抗体的方法例如在国际申请WO 2005/018572中找到，其通过引用整体并入于此。
在这里描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可以使用本领域中已知的技术来突变，以降低效应子功能。在其他情况下，可以是，与本发明一致的恒定区改性缓和了补体结合，并因此降低了血清半衰期和共轭细胞毒素的非特异性关联。还可以使用恒定区的其它改性来改性二硫键或寡糖部分，其由于增加的抗原特异性或抗体柔性而实现了增强的定位。所得的生理分布、生物利用度和改性的其它生化效果(生物分布和血清半衰期)可以使用公知的免疫学技术无需过度实验容易地被测定和定量。
在本文中所描述的某些抗体或其抗原结合片段，变体或衍生物中，所述Fc部分可以突变或变换成可替代的蛋白质序列，以增加抗体的细胞摄取，示例的方式是，通过经由FCγ受体、LRP或Thy1受体或由'SuperAntibody技术增强抗体的受体介导的内吞，这是说，使抗体可以穿梭进入活细胞而不伤害它们(Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241)。例如，抗体结合区的融合蛋白和细胞表面受体或双或多特异性抗体的同源蛋白质配体(其特定序列结合到多瘤病毒、多瘤病毒的VP1和/或多瘤病毒的VP1 VLP)以及细胞表面受体的产生可以使用本领域中已知的技术被改造(engineering，工程化)。
在本文中所描述的某些抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物中，所述Fc部分可以突变或变换为可替换的蛋白质序列，或抗体可以被化学改性以增加其血脑屏障渗透。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的改性(修饰)形式可以使用本领域中已知的技术由整个前体或亲本抗体来制备。示例性的技术在本文中更详细地讨论。本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物能够使用本领域已知的技术制备或者制造。在某些实施方式中，抗体分子或其片段被“重组产生”，即，使用重组DNA技术而产生。用于制成抗体分子或其片段的示例性技术在本文其它地方更详细地讨论。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括被改性的衍生物，例如，通过任何类型分子与抗体的共价附着被改性，使得共价连接不阻止抗体特异地结合至其同源表位。例如，但不是通过限制性方式，所述抗体衍生物包括已经改性的抗体，例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其它蛋白质的联接等。任何多种化学改性可以通过公知的技术进行，包括但不限于：特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，该衍生物可以含有一种或多种非经典的氨基酸。
在另一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物将不会在待治疗的动物(例如，在人体中)中引发有害的免疫应答。在某些实施方式中，本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段从患者(例如人类患者)衍生，并且随后在衍生它们的相同物种中使用，例如人，从而缓解或最小化有害免疫应答的发生。
脱免疫也可用于降低抗体的免疫原性。如本文所用的，术语“去免疫”包括改变抗体，以改性T细胞表位，例如参见国际申请WO 98/52976和WO 00/34317。例如，来自起始抗体的VH和VL序列被分析，并且来自每个V区的人T细胞表位绘图(map)示出了表位相对于所述序列中的CDR和其他关键残基的位置。来自T细胞表位绘图的单独的T细胞表位被分析，以便以改变最终抗体的活性的低风险来识别可替代的氨基酸取代。可替代的VH和VL序列的范围被设计成包括氨基酸取代的组合，并且这些序列随后被并入到一系列的结合多肽，例如，多瘤病毒、多瘤病毒的VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP-特异性抗体或其免疫特异性片段，其用于在本文所公开的诊断和治疗方法中，其然后针对功能而被测试。典型地，产生并测试12至24个变体抗体。包含经改性的V和人C区的完整重链和轻链基因然后被克隆到表达载体以及导入到用于生产完整抗体的细胞系的随后质粒中。所述抗体然后在适当的生物化学和生物学测定中被比较，并且识别最佳变体。
单克隆抗体可使用本领域中已知的多种技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术，或它们的组合。例如，单克隆抗体可以使用杂交瘤技术来生产，包括本领域已知和教导的那些，例如，在Harlow等人的Antibodies：实验室手册(A LaboratoryManual)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版。(1988)；Hammerling等人的Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)Elsevier，NY，563-681(1981)，所述参考文献通过引入方式整体结合于本文中。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术生产的抗体。术语“单克隆抗体”是指从单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)而不是通过产生其的方法衍生的抗体。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。在某些实施方式中，本发明的抗体从人B细胞衍生，该人B细胞已用爱泼斯坦-巴尔氏(Epstein-Barr)病毒通过转化而被永生化。
在公知的杂交瘤方法(Kohler等人的Nature 256(1975)，495)中，来自哺乳动物的相对短寿命或致命的淋巴细胞(例如，从如本文所述的人受试者衍生的B细胞)与永生肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，由此，产生杂交细胞或“杂交瘤”，其是永生的并且能够产生B细胞的遗传编码的抗体。通过选择、稀释和再生长，所得的杂种被分成单个基因的菌株，其中每个菌株包含用于形成单个抗体的特定基因。它们产生抗体，该抗体针对所需的抗原是均匀的，并且根据它们的纯的遗传血统而被称为“单克隆的”。
由此制备的杂交瘤细胞被接种并在优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞的生长或存活的一种或多种物质的合适培养基中生长。本领域技术人员将理解，用于杂交瘤的形成、选择和生长的试剂、细胞系和培养基可商购自许多来源，并且标准化协议被很好地建立。通常，所述杂交瘤细胞正在其中生长的培养基被测定，用于产生针对所期望抗原的单克隆抗体。由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过体外测定来确定，诸如如本文所描述的免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)。在杂交瘤细胞被鉴定为产生具有期望的特异性、亲和力和/或亲合力的抗体后，该克隆可以通过限制稀释流程被亚克隆并且通过标准方法而生长，参见例如，Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,Academic Press,第59-103页(1986)。还应该理解的是，由亚克隆分泌的单克隆抗体可以通过常规的纯化方法(诸如例如，蛋白-A、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)从培养基、腹水或血清中分离。
在另一个实施方式中，淋巴细胞可以通过显微操作和分离出来的可变基因来选择。例如，外周血单核细胞可以从免疫的或天然免疫的哺乳动物(例如人)分离并且在体外培养约7天。培养物可针对符合筛选标准的特定的IgG而被筛选。来自阳性孔中的细胞可以被分离。单独的产生Ig的B细胞可以通过FACS或通过在补体介导的溶血斑测定法中识别它们而被分离。产生Ig的B细胞可以显微操作到管中，并且所述VH和VL基因例如可以使用RT-PCR法来扩增。VH和VL基因可被克隆到抗体表达载体中并转染到细胞(例如，真核或原核细胞)中，以便进行表达。
可替代地，产生抗体的细胞系可以使用本领域技术人员公知的技术进行选择和培养。这样的技术描述在各种实验室手册和主要出版物中。在这方面，适于在如下所述的本发明中使用的技术被描述在Current Protocols in Immunology,Coligan等人,Eds.,GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience,John Wiley and Sons,New York(1991)中，其通过引用方式整体(包括附录)合并于此。
可以通过已知技术来产生识别特定表位的抗体片段。例如，Fab和F(ab')2片段可以被重组地或通过免疫球蛋白分子的蛋白水解切割而产生，其使用了酶，例如木瓜蛋白酶(以产生Fab片段)或胃蛋白酶(以产生F(ab')2片段)。F(ab')2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。这样的片段足以例如用于涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分与检测试剂例如放射性同位素偶联的免疫诊断程序中。
如本文中所描述的人抗体特别期望用于人患者中的治疗应用中。本发明的人抗体例如分离自健康的老年人受试者(其具有未知的HLA分型和抗JCV效价)、提供稳固的JCV特异性抗体产生的HLA-DRB1*04：01+健康供体，和接受单克隆抗体疗法以治疗MS且发展PML和PML-IRIS的症状的患者。
在一个实施方式中，本发明的抗体包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方式中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。本文描述了包含至少一个CDR的示例性的抗体分子，其可包含在受试者抗体中。
本发明的抗体可以通过本领域中已知的任何用于合成抗体的方法而生产，尤其是通过化学合成，或者优选通过如本文所述的重组表达技术。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括合成恒定区，其中，一个或多个结构域被部分地或完全地缺失(“结构域缺失的抗体”)。在某些实施方式中，兼容的改性抗体将包含结构域缺失的构建体或变体，其中，整个CH2结构域已被去除(△CH2构建体)。对于其它实施方式，短的连接肽可取代缺失的结构域，从而为可变区提供灵活性和移动自由度。本领域技术人员将理解，这样的构建体是特别优选的，这是由于CH2结构域对抗体的分解代谢速率的调节特性。结构域缺失的构建体可以使用编码IgG1人恒定结构域的载体来衍生，例如参见国际申请WO 02/060955和WO 02/096948A2。这个载体被工程化，以缺失CH2结构域并提供表达结构域缺失的IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物是微型抗体。微型抗体可以使用本领域中描述的方法来制备，参见例如，美国专利5837821或国际申请WO94/09817。
在一个实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物包括免疫球蛋白重链，其具有几个甚至单个氨基酸的缺失或取代，只要它允许单体亚基之间的关联性即可。例如，CH2结构域的所选区域中的单个氨基酸的突变可足以基本上减少Fc结合。类似地，可期望简单地缺失控制效应子功能(例如补体结合)的一个或多个恒定区结构域的部分，以被调制。恒定区的这种部分缺失可改善抗体的所选择的特性(血清半衰期)，同时留下与受试体恒定区结构域的完整性相关联的其他所需的功能。此外，如上面提到的，所公开抗体的恒定区可以是通过一个或多个氨基酸的突变或取代而合成的，其增强了所得的构建体的轮廓(分布)。在这方面，有可能的是，破坏由保守结合位点(例如，Fc结合)提供的活性，同时基本上维持改性的抗体的结构和免疫原性轮廓(分布)。其它实施方式包括将一种或多种氨基酸添加至恒定区，以增强所需的特性，诸如，效应子功能，或提供更多的细胞毒素或碳水化合物的连接(附着)。在这样的实施方式中，可能期望插入或复制从选定的恒定区结构域衍生的特定序列。
本发明还提供了这样的抗体，其包含、基本上由或由本文中所描述的抗体分子的(例如，VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)组成，该抗体或其片段免疫特异性地结合至多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒的VP1 VLP。本领域人员已知的标准技术可以用于将突变引入到编码抗体的核苷酸序列中，包括但不限于：位点定向诱变和PCR介导的诱变，其导致氨基酸取代。优选地，该变体(包括衍生物)编码少于50个氨基酸取代、少于40个氨基酸取代、少于30个氨基酸取代、少于25个氨基酸取代、少于20个氨基酸取代、少于15个氨基酸取代、少于10个氨基酸的取代、少于5个氨基酸的取代、少于4个氨基酸的取代、少于3个氨基酸的取代、或少于2个氨基酸取代，其是相对于所述参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3。“保守氨基酸取代”是这样的取代，其中，氨基酸残基被替换为具有侧链(具有相似电荷)的氨基酸残基。具有侧链(具有相似电荷)的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。可替代地，突变可以随机地沿着编码序列的全部或部分而被引入，诸如，通过饱和诱变，并且可将所得的突变体针对生物活性进行筛选，以识别保留活性的突变体。
例如，可以仅在框架区或仅在抗体分子的CDR区中引入突变。引入的突变可以是沉默或中性的错义突变，例如，在抗体的结合抗原的能力方面没有效果或具有很少效果，确实，一些这样的突变不改变氨基酸序列任何内容。这些类型的突变可以用于优化密码子使用，或改善杂交瘤的抗体产生。编码本发明抗体的密码子优化的编码区在本文其他地方被公开。可替代地，非中性错义突变可以改变抗体结合抗原的能力。大多数沉默和中性的错义突变的位置容易在构架区中，而大多数非中性的错义突变的位置容易在CDR中，但这不是绝对要求。本领域技术人员将能够利用所需的性质设计和测试突变分子，诸如，在抗原结合活性中没有改变或在结合活性中有改变(例如，抗原结合活性的改善或抗体特异性的改变)。在诱变之后，所编码的蛋白质可以常规地被表达，并且所编码蛋白质的功能和/或生物活性可以使用本文所描述的技术或通过本领域已知的常规改性技术来确定。
III.编码抗体的多核苷酸
编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由以下组成：单链DNA和双链DNA、作为单链区和双链区的混合物的DNA、单链RNA和双链RNA、和作为单链区和双链区的混合物的RNA，包含DNA和RNA的杂交分子，其可以是单链的，或更典型地是双链的或单链区和双链区的混合物。此外，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以由包括RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区组成。编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸也可含有一个或更多个修饰的碱基或因为稳定性或其他原因而被修饰的DNA或RNA骨架。“修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化碱基和稀有碱基，诸如，肌苷。可对DNA和RNA进行各种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学地，酶地，或代谢地进行修饰的形式。
可以通过向免疫球蛋白的核苷酸序列中引入一个或更多个核苷酸取代、添加或缺失，来创建编码衍生自免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离的多核苷酸，使得一个或多个氨基酸取代、添加或缺失被引入到所编码的蛋白质中。可以通过标准技术，诸如定点诱变和PCR介导的诱变，来引入突变。优选地，保守氨基酸取代是在一个或多个非必需的氨基酸残基上进行的。
如众所周知的，RNA可以通过标准技术与原始B细胞、杂交瘤细胞或与其它转化细胞分离，诸如，异硫氰酸胍提取和沉淀，接着是离心或层析分离。当期望时，mRNA可以通过标准技术与全部RNA分离，诸如，色谱法对寡dT纤维素。在本领域中，合适的技术是熟悉的。在一个实施方式中，使用根据公知方法的逆转录酶和DNA聚合酶，编码该抗体的轻链和重链的cDNA可同时或分别形成。可以通过共有的恒定区引物或通过更特异性的引物基于公布的重链和轻链DNA和氨基酸序列来启动PCR。如上所讨论的，PCR也可以用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况下，可以通过共有引物或更大的同源探针(诸如人恒定区探针)来筛选这些文库。
可以使用本领域中已知的技术，使DNA(通常为质粒DNA)与细胞分离，根据例如在有关重组DNA技术的前述引用中更详细阐述的标准的公知技术进行限制映射和测序。当然，根据本发明，在分离过程或随后分析中的任意点，DNA可以是合成的。
在这种背景下，本发明还涉及编码本发明的抗体的免疫球蛋白链的至少结合结构域或可变区的多核苷酸。在一个实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包括、基本上由或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成，其中，所述重链可变区的至少一个CDR或者所述重链可变区的至少两个VH-CDR是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3氨基酸序列。可替代地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3区是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文所公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3氨基酸序列。因此，根据本实施方式，本发明的重链可变区具有与图8中所示的多肽序列相关的VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列，具有与图8中所示的多肽序列相关的VH-CDR1，VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包括、基本上由或由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成，其中，所述轻链可变区的至少一个VL-CDR或所述轻链可变区的至少两个VL-CDR是至少80％，85％，90％或95％相同于来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3氨基酸序列。可替代地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3区是至少80％、85％、90％或95％相同于来自本文所公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3氨基酸序列。因此，根据本实施方式，本发明的轻链可变区具有与图8中所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列，或者分别具有与图8所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。
在另一个实施方式中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包括、基本上由或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成，其中，所述VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有多肽序列，其与图8中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团相同，分别与如图8中所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3基团相同。
如本领域已知的，通过将一个多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二多肽或多核苷酸的序列相比较来确定两个多肽或两个多核苷酸之间“序列同一性”。当在本文中讨论时，可以使用本领域已知的方法和计算机程序/软件，来确定任何特定的多肽是否为至少约40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或95％相同于另一种多肽，所述计算机程序/软件为诸如但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin序列分析软件包，Version 8，用于Unix，Genetics Computer Group,University Research Park,575Science Drive,Madison,WI 53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman的局部同源性算法，Advances in Applied Mathematics 2(1981),482-489，以发现两个序列之间的同源性最好的部分(区段)。当使用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定特定序列是否例如是与根据本发明的参考序列95％相同时，当然，设定所述参数，使得在参考多肽序列的全长范围内计算同一性的百分比，并且允许参照序列中的氨基酸的总数的可达5％的同源性间隙(缺口)。
在本发明的一个优选实施方式中，多核苷酸包含以下核酸、基本上由以下核酸组成或由以下核酸组成：具有如表II中所示的抗多瘤病毒、抗多瘤病毒VP1，和/或抗多瘤病毒的VP1 VLP抗体的VH或VL区的多核苷酸序列的核酸。在这方面，本领域技术人员将容易理解的是，编码至少轻链和/或重链的可变结构域的多核苷酸可以编码两个免疫球蛋白链或其仅一个的可变结构域。因此，在一个实施方式中，所述多核苷酸包含以下核酸、基本上由以下核酸组成或由以下核酸组成：具有如表II或表III中所示的抗多瘤病毒、抗多瘤病毒VP1，和/或抗多瘤病毒的VP1VLP，优选抗JCV VP1或VLP或抗BKV VP1或VLP抗体的VH和VL区的多核苷酸序列的核酸。
表II：示例性的多瘤病毒、多瘤病毒VP1、和多瘤病毒的VP1 VLP抗体的VH和VL区的核苷酸序列
表III.示例性的的多瘤病毒、多瘤病毒VP1和多瘤病毒VP1 VLP抗体的VH和VL区的氨基酸序列，其中CDR被加下划线。
本发明还包括本发明的多核苷酸的片段，如其他地方描述的。另外，本发明还设想了如本文所述的编码融合多核苷酸、Fab片段和其他衍生物的多核苷酸。
可以通过本领域中已知的任何方法来生产或制造多核苷酸。例如，如果抗体的核苷酸序列是已知的，则编码抗体的多核苷酸可以从化学合成的寡核苷酸而组装，例如，如在Kutmeier等人的BioTechniques(生物技术)，17(1994)，242中描述的，其主要涉及含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成、这些寡核苷酸的退火和结扎以及之后的通过PCR的连接的寡核苷酸的扩增。
可替换地，编码抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可以从来自合适来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆无法获得，但抗体分子的序列是已知的，则编码抗体的核酸可被化学合成或从合适的来源获得(例如，抗体cDNA文库或从任何组织或细胞所产生的cDNA文库或从任何组织或细胞所分离的核酸，优选聚A+RNA，该细胞表达多瘤病毒、多瘤病毒的VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP特异性抗体，诸如选择为表达抗体的杂交瘤细胞)，通过PCR扩增，使用可杂交至序列的3’和5’端的合成引物，或通过使用对于特定基因序列特异性的寡核苷酸探针进行克隆以识别，例如，来自编码抗体的cDNA库的cDNA克隆。使用本领域公知的任何方法，通过PCR产生的扩增核酸可以进而被克隆到可复制的克隆载体中。
一旦该抗体的核苷酸序列和相应的氨基酸序列，或其抗原结合片段、变体，或衍生物被确定，可以使用本领域公知的用于操纵核苷酸序列的方法来操纵其核苷酸序列，例如，重组DNA技术、定点突变、PCR等(参见，例如，在Sambrook等人的Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)和Ausubel等人的,eds.,Current Protocols in Molecular Biology,JohnWiley&Sons,NY(1998)中描述的技术，其全部内容均通过引用方式结合于此)，以便产生具有不同的氨基酸序列的抗体，例如，以产生氨基酸取代、缺失和/或插入。
IV.抗体多肽的表达
在操纵分离的遗传物质以提供本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物之后，编码抗体的多核苷酸通常被插入到表达载体中，以便导入宿主细胞中，该宿主细胞可用于产生所需量的抗体。本文中描述了抗体或其片段、衍生物或类似物的重组表达，例如，结合于目标分子的抗体的重链或轻链。一旦已经获得本发明的编码抗体分子或抗体的重链或轻链或其一部分的多核苷酸(优选地，含有重链或轻链可变结构域)，则可使用本领域众所周知的技术，通过重组DNA技术来产生用于产生抗体分子的该载体。因此，这里描述了通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸来制备蛋白质的方法。本领域技术人员公知的方法可以用来构建含有编码抗体的序列和合适的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括，例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此，本发明提供了包括编码本发明的抗体分子或其重链或轻链或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列的可复制载体，其可操作性地连接至启动子。这样的载体可以包括编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见，例如，国际申请WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且抗体的可变结构域可以被克隆到用于整个重链或轻链表达的这样的载体中。
术语“载体(媒介，vector)”或“表达载体”在本文中用于表示根据本发明使用的载体，作为用于导入并表达宿主细胞中的所需基因的媒介物(vehicle)。如本领域技术人员所公知的，这样的载体可以容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒组成的组。通常，可与本发明兼容的载体将包括选择标记、适当的限制位点，以促进所期望的基因的克隆和进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力。对于本发明的目的，可以使用许多表达载体系统。例如，一类载体利用DNA元件，其从动物病毒衍生，诸如，牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、牛痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒。其他的涉及使用多顺反子系统，其具有内部核糖体结合位点。此外，可以通过引入一个或多个标记，来选择将DNA整合到其染色体中的细胞，所述标记允许选择转染的宿主细胞。该标记可以(针对原养型)向营养缺陷型宿主提供杀生物剂抗性(例如，抗生素)或耐重金属(诸如铜)性。可选择的标记基因可以被直接连接至待被表达的DNA序列，或者通过共转化而导入相同的细胞中。对于mRNA的最佳合成，还可能需要另外的元件。这些元件可以包括信号序列、剪接信号以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方式中，克隆的可变区基因与重链和轻链恒定区基因(优选是人)一起被插入到表达载体中，如上面所讨论的。在一个实施方式中，这是使用Biogen IDEC公司(称为NEOSPLA)的专有的表达载体来完成的，并且公开在美国专利号6,159,730中。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素聚腺苷酸化序列、新霉素磷酸转移外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。已发现，在可变区和恒定区基因的结合、CHO细胞中的转染、接着在含有培养基和甲氨蝶呤扩增的G418中的选择之后，该载体导致抗体的非常高水平的表达。当然，在本发明中也可以使用能够引发在真核细胞中表达的任何表达载体。合适的载体的实例包括，但不限于，质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His，pVAX1和pZeoSV2(可从加拿大圣地亚哥的Invitrogen获得)和质粒pCI(可从麦迪逊，威斯康星州Promega公司(Promega,Madison,WI)获得)。通常，针对那些而筛选大量的转化细胞，其表达适当高的水平，如果免疫球蛋白重链和轻链是可以进行的常规实验，例如，通过机器人系统。在美国专利号5,736,137和5,658,570中也教导了载体系统，其每一个的全部内容通过引用并入到本文中。该系统提供了高的表达水平，例如>30pg/细胞/天。其它示例性的载体系统被公开在例如美国专利号6,413,777中。
在其它优选的实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可使用多顺反子构建体来表达，如在美国专利申请公开号2003-0157641A1中披露的那些，并且将其全部内容并入本文中。在这些表达系统中，多个感兴趣的基因产物(例如抗体的重链和轻链)可以由单一的多顺反子构建体产生。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)以提供相对高水平的抗体。在美国专利号6,193,980中披露了兼容的IRES序列，其也并入本文中。本领域技术人员将理解，这样的表达系统可以用于有效地产生在本申请中公开的完整范围的抗体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了包含多核苷酸的载体，所述多核苷酸至少编码抗体的免疫球蛋白链的结合域或可变区，可选地，与编码所述结合分子的其它免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸结合。
更一般地，一旦编码抗体的单体亚基的载体或DNA序列已经制备，则表达载体可以被引入到适当的宿主细胞中。将质粒导入宿主细胞中可以通过本领域技术人员公知的各种技术来完成。这些包括但不限于：转染，其包括脂质转染(lipotransfection)，使用例如或脂质体(lipofectamine)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、具有包膜DNA的细胞融合、显微注射及利用完整病毒的感染。通常，进入宿主的质粒导入是通过标准磷酸钙共沉淀法实现的。隐藏表达构建体的宿主细胞在适于生产轻链和重链的条件下生长，并且被测定用于重链和/或轻链蛋白合成。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)或荧光激活的细胞分选仪分析(FACS)、免疫组化等。
将表达载体通过常规技术转移至宿主细胞，然后通过常规技术培养转染的细胞，以产生抗体，以便用于本文描述的方法。因此，本发明包括含有多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸编码本发明的抗体或其重链或轻链或至少其免疫球蛋白的结合域或可变区，其优选可操作地连接至异源启动子。此外或可替换地，本发明还包括包含载体的宿主细胞，如上文所定义的，其包含编码抗体的免疫球蛋白链的至少所述结合域或可变区的多核苷酸，可选地，与编码所述结合分子的其它免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸结合。在用于双链抗体的表达的优选实施方式中，编码重链和轻链的单个载体或多个载体可以在宿主细胞中被共表达，用于表达整个免疫球蛋白分子，如下文详述。
可以利用本发明的两种表达载体来共转染所述宿主细胞，第一载体编码重链衍生的多肽，并且第二载体编码轻链衍生的多肽。所述两种载体可以含有相同的可选标记，其实现了重链和轻链多肽的同等表达。可替代地，可以使用单一的载体，其编码重链和轻链多肽。在这种情况下，轻链被有利地置于重链之前，以避免过量的有毒游离重链，参见Proudfoot，Nature(自然)322(1986)，52；Kohler，PROC.Natl.Acad,Sci.USA 77(1980)，2197。对于重链和轻链的编码序列可以包含cDNA或基因组DNA。
如本文所使用的，“宿主细胞”是指这样的细胞，其包含载体，所述载体使用重组DNA技术构建且编码至少一种异源基因。在用于从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用，以表示抗体的来源，除非它被明确地另有规定。换句话说，从“细胞”恢复多肽可意味着从旋降完整细胞恢复或从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物恢复。
各种宿主表达载体系统可以用于表达用于本文所述方法中的抗体分子。这种宿主表达系统代表媒介物，感兴趣的编码序列可以通过该媒介物而产生并且随后被纯化，而且还表示这样的细胞，其可以在利用合适的核苷酸编码序列被转化或转染时，原位表达本发明的抗体分子。这些包括但不限于，诸如细菌(例如，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌)的微生物，其利用含抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化；酵母(如酵母属，毕赤酵母属)，其用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化；昆虫细胞系统，其用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染；植物细胞系统，其用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化；或哺乳动物细胞系统(例如COS、CHO、NSO、BLK、293、3T3细胞)，其隐藏含有从哺乳动物细胞的基因组衍生的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或从哺乳动物病毒衍生的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)的重组表达构建体。优选地，细菌细胞(诸如大肠杆菌)，更优选真核细胞，尤其是对于整个重组抗体分子的表达，可用于重组抗体分子的表达。例如，哺乳动物细胞(诸如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)与载体结合，是用于抗体的有效表达系统，所述载体例如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件，参见，例如，Foecking等人，Gene 45(1986)，101；Cockett等人，Bio/Technology(生物/技术)8(1990),2。
用于蛋白表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；本领域技术人员具有优先确定特定宿主细胞系的能力，该特定宿主细胞系最适合于在期望的基因产物在其中表达。示例性的宿主细胞系包括但不限于：CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系、DHFR负)、HELA(人宫颈癌)、CVI(猴肾细胞系)、COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾细胞系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人类淋巴细胞)和293(人肾)。CHO和293细胞是特别优选的。宿主细胞系通常可从商业服务(美国组织培养物保藏中心(American Tissue Culture Collection))或者从公开的文献中获得。
此外，可以选择宿主细胞菌株，其调节插入序列的表达，或以所需的特定方式修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这种修饰(如糖基化)和加工(例如，切割)可能对于所述蛋白质的功能来说是重要的。不同的宿主细胞具有特性和特定机制，以用于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰。可以选择适当的细胞系或宿主系统，以确保所表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为此目的，可以使用真核宿主细胞，其具有细胞机器，以用于基因产物的初级转录、糖基化和磷酸化的适当处理。
对于重组蛋白的长期高产率的生产，稳定的表达是优选的。例如，稳定表达抗体分子的细胞系可以被工程化。不使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用DNA而被转化，DNA由适当的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)和可选的标记来控制。在导入外源DNA后，工程化的细胞可以被允许在富含培养基中生长1-2天，然后被切换至选择性培养基。在重组质粒中的可选标记赋予对于选择的抗力并且允许细胞将质粒稳定地整合到其染色体中并生长以形成病灶，其又可以被克隆并扩展到细胞系中。这种方法可以有利地用于工程化细胞系，所述细胞系稳定地表达抗体分子。
可以使用多个选择系统，包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell 11(1977)，223)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48(1992),202)，并且，腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，Cell22(1980),817)基因可以被分别用在tk-，hgprt-或aprt-细胞中。此外，抗代谢物抗性可以被用作选择下列基因的基础：dbfr，其赋予对氨甲喋呤的抗性(Wigler等人,Natl.Acad.Sci.USA 77(1980),357；O'Hare等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78(1981),2072)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Goldspiel等人,Clinical Pharmacy 12(1993),488-505；Wu和Wu,Biotherapy 3(1991),87-95；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32(1993),573-596；Mulligan,Science 260(1993),926-932；以及Morgan和Anderson,Ann.Rev.Biochem.62(1993),191-217；TIB TECH 11(1993),155-215)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人,Gene 30(1984),147)。可以使用的重组DNA技术领域中常用的方法被描述在Ausubel等人的(eds.),Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer andExpression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；并且在第12和13章中,Dracopoli等人.(eds),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994)；Colberre-Garapin等人.,J.Mol.Biol.150:1(1981)中，将其全部内容通过引用并入本文中。
抗体分子的表达水平可以通过载体扩增而增加，对于综述，参见Bebbington和Hentschel,The use of vectors based on gene amplification for the expressionof cloned genes in mammalian cells in DNA cloning,Academic Press,New York,Vol.3.(1987)。当表达抗体的载体系统中的标记是可扩增的时，存在于宿主细胞的培养物中的抑制剂的水平的增加将增加标记基因的拷贝数。因为扩增的区域与抗体基因相关，所以抗体的产生也将增加，参见Crouse等人,Mol.Cell.Biol.3(1983),257。
体外生产允许按比例放大，以产生大量的所需多肽。用于在组织培养条件下的哺乳动物细胞培养的技术在本领域中是已知的，并且包括均质悬浮培养，例如，在气升式反应器或在连续搅拌反应器中，或固定化或包埋的细胞培养，例如，在空心纤维、微胶囊中、在琼脂糖微珠或陶瓷盒上。如果有必要和/或期望的话，多肽的溶液可以通过惯用的层析方法来纯化，例如，凝胶过滤、离子交换层析、DEAE纤维素上的层析或(免疫-)亲和层析，例如，在合成铰链区多肽的优先生物合成后或在这里所描述的HIC层析步骤之前或之后。
本发明的编码抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的基因也可以表达在非哺乳动物细胞中，诸如，细菌或昆虫或酵母或植物细胞。容易拾取核酸的细菌包括肠杆菌科的成员，诸如，大肠杆菌或沙门氏菌的菌株；芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌。将进一步理解的是，当在细菌中表达时，所述异源多肽典型地成为包涵体的一部分。所述异源多肽必须被分离、纯化，然后被组装成功能性分子。当期望抗体的四价形式时，该亚基将然后被自组装成四价抗体，参见，例如，国际申请WO02/096948。
在细菌系统中，取决于针对被表达的抗体分子的使用，可有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量的这种蛋白时，对于抗体分子的药物组合物的生产，可以期望这样的载体，该载体指导容易被纯化的高水平融合蛋白产物的表达。这样的载体包括但不限于：大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人，EMBO J.2(1983)，1791)，其中，编码抗体的序列可以单独被连接到载体中，在具有lacZ编码区的框架中，使得融合蛋白被产生；pIN载体(Inouye&Inouye,Nucleic Acids Res.13(1985),3101-3109；Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24(1989),5503-5509)；和类似物。pGEX载体也可以用于表达外源多肽，作为融合蛋白，其具有谷胱甘肽S-转移酶(GST)。通常，这样的融合蛋白是可溶的，并且通过吸附和结合至谷胱甘肽-琼脂糖珠的基质可以很容易地从裂解的细胞被纯化，随后在游离谷胱甘肽存在的情况下进行洗脱。pGEX载体被设计成包括凝血酶或Xa因子蛋白酶切割位点，使得克隆的靶基因产物可以从GST部分释放。
除了原核生物，也可以使用真核微生物。酿酒酵母或普通面包酵母最常使用在真核微生物中，但是许多其它菌株是通常可获得的，例如，巴斯德毕赤酵母。为了在酵母属中表达，通常使用质粒YRp7，例如，(Stinchcomb等人,Nature 282(1979),39；Kingsman等人,Gene 7(1979),141；Tschemper等人.,Gene 10(1980),157)。该质粒已包含TRP1基因，其提供了用于酵母突变株的选择标记，该酵母突变株缺乏在色氨酸中生长的能力，例如ATCCNo.44076或PEP4-1(Jones,Genetics85(1977),12)。trp1病变的存在(作为酵母宿主细胞基因组的特征)于是提供了有效的环境，用于通过在缺乏色氨酸中的生长来检测转化。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcNPV)通常被用作载体，以表达外源基因。该病毒生长在草地贪夜蛾细胞中。编码抗体的序列可被单独地克隆到病毒的非必需区(例如，多角体蛋白基因)中并置于AcNPV启动子(例如，多角体启动子)的控制下。
一旦本发明的抗体分子已经被重组地表达，则本发明的全部抗体、其二聚体、单独的轻链和重链或其他免疫球蛋白形式，可以根据本领域的标准程序来纯化，包括例如，通过色谱(例如，离子交换、亲和，特别是通过对蛋白A后的特异性抗原的亲和力，以及分级柱色谱)、离心、差异溶解度，例如，硫酸铵沉淀，或通过用于纯化蛋白质的任何其它标准技术；参见，例如，Scopes,"Protein Purification",Springer Verlag,N.Y.(1982)。可替代地，用于提高本发明的抗体的亲和力的优选方法披露在美国专利公开2002-0123057A1中。因此，在一个实施方式中，本发明还提供了一种用于制备抗多瘤病毒、抗多瘤病毒的VP1或抗多瘤病毒的VP1 VLP抗体或其一个或多个免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养如上文所定义的宿主细胞，所述细胞包含如上文所定义的多核苷酸或载体；和
(b)从培养物中分离所述抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
此外，在一个实施方式中，本发明还涉及抗体或其一个或多个免疫球蛋白链，其由如上文所定义的多核苷酸编码或可以通过用于制备抗多瘤病毒、抗多瘤病毒的VP1或抗多瘤病毒的VP1 VLP抗体或其一个或多个免疫球蛋白链的所述方法获得。
V.融合蛋白和结合物
在某些实施方式中，所述抗体多肽包括氨基酸序列或者通常不与抗体相关的一个或多个部分(moiety)。下面更详细地描述示例性改变(修饰)。例如，本发明的单链Fv抗体片段可以包括柔性连接序列(linker sequence)，或可以被修改以添加功能性部分(例如，PEG、药物、毒素、或标记，诸如荧光团、放射性、酶、核磁、重金属等)
本发明的抗体多肽可以包括融合蛋白、基本上由其组成或者由其组成。融合蛋白是嵌合分子，其包括例如免疫球蛋白多瘤病毒，多瘤病毒VP1和/或具有至少一个靶结合位点和至少一个异源部分(即，性质上不是自然连接的部分)的多瘤病毒VP1 VLP结合域。氨基酸序列通常可以存在于汇集在融合多肽中的单独的蛋白质中，或者它们通常可以存在于相同的蛋白质中但是以新的排列被放置在融合多肽中。融合蛋白可以例如通过化学合成或通过创建和转化多核苷酸来创建，肽区域以所需的关系编码在多核苷酸中。
如应用于多核苷酸或多肽的术语“异源”是指多核苷酸或多肽从该实体的其余部分的独特实体衍生，该其余部分与独特实体相比较。例如，如本文所使用的，待被融合至抗体或其抗原结合片段、变体或类似物的“异源多肽”从相同物种的非免疫球蛋白多肽、或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽衍生。
如在本文中的其它地方更详细讨论的，本发明的抗体或抗原结合片段、变体或其衍生物可进一步重组地融合至N-或C-末端的异源多肽或化学结合(包括共价和非共价结合)至多肽或其他组合物。例如，抗体可重组地融合或结合至可用作检测测定和效应分子的标记的分子，如异源多肽、药物、放射性核素或毒素；参见，例如，国际申请WO 92/08495；WO91/14438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号；以及欧洲专利申请EP 0 396 387。
本发明的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可以由通过肽键或修饰的肽键(即肽等排体)彼此结合的氨基酸组成，并且可以包含除了20个基因-编码的氨基酸之外的氨基酸。抗体可以通过天然工艺，如后转化加工，或通过本领域已知的化学修饰技术来修饰。这样的修饰在基础教科书和更详细的专著以及大量的研究文献中更好地描述。修饰可以在包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端的抗体的任何地方出现，或在如碳水化合物的部分上。应当理解的是，相同类型的修饰可以在几个位点处以相同或不同程度出现于给定的抗体中。此外，给定的抗体可以包括许多类型的修饰。抗体可以是支链的，例如作为泛素化的结果，并且它们可以是环状的，具有或没有分支。环状的、支链的和支化环状的抗体可以从后转化的天然过程产生或者可以通过合成方法来制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附着、血红素部分的共价附着、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附着、脂质或脂质衍生物的共价附着、磷脂酰肌醇的共价附着、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、氨基酸转移RNA媒介添加到蛋白质，如精氨酰化和泛素化；参见，例如，Proteins-Structure And Molecular Properties(蛋白质-结构和分子特性),T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York 2nd Ed.,(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins(蛋白质的后转化的共价修饰),B.C.Johnson,Ed.,Academic Press,New York,pgs.1-12(1983)；Seifter等人,Meth.Enzymol.182(1990),626-646；Rattan等人,Ann.NY Acad.Sci.663(1992),48-62)。
本发明还提供了融合蛋白，其包括抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，以及异源多肽。在一个实施方式中，本发明的融合蛋白包括具有本发明的抗体的VH区中的任何一个或多个的氨基酸序列或本发明的抗体或其片段或变体，以及异源多肽序列的VL区中的一个或多个的氨基酸序列的多肽，基本上由上述多肽组成，或由上述多肽组成。在另一个实施方式中，用于本文所公开的诊断和治疗方法中的融合蛋白包括具有抗体或其片段、变体、或衍生物的VH-CDR的任何一个、两个、三个的氨基酸序列或抗体或其片段、变体、或衍生物以及异源多肽序列的VL-CDR中的任何一个、两个、三个的氨基酸序列的多肽，基本上由上述多肽组成，或由上述多肽组成。在一个实施方式中，融合蛋白包括具有本发明的抗体或其片段、衍生物或变体以及异源多肽序列的VH-CDR3的氨基酸序列的多肽，所述融合蛋白特异性地结合至多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP。在另一个实施方式中，融合蛋白包括具有本发明的抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明的抗体或其片段、衍生物或变体以及异源多肽序列的至少一个VL区的氨基酸序列的多肽。优选地，该融合蛋白的VH和VL区对应于单源抗体(或scFv或Fab片段)，其特异性地结合多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP。在又一实施方式中，用于本文所公开的诊断和治疗方法中的融合蛋白包括具有抗体的VHCDR中的任一个、两个、三个或更多的氨基酸序列以及抗体、或其片段或变体和异源性多肽序列的VLCDR中的任一个、两个、三个的氨基酸序列的多肽。优选地，VH-CDR或VL-CDR中的两个、三个、四个、五个、六个或更多个对应于本发明的单源抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包括在本发明内。
文献中报道的示例性融合蛋白包括T细胞受体的融合物(Gascoigne等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),2936-2940；CD4(Capon等人,Nature 337(1989),525-531；Traunecker等人,Nature 339(1989),68-70；Zettmeissl等人,DNA Cell Biol.USA 9(1990),347-353；以及Byrn等人,Nature 344(1990),667-670)；L-选择素(归巢受体)(Watson等人,J.Cell.Biol.110(1990),2221-2229；和Watson等人,Nature 349(1991),164-167)；CD44(Aruffo等人,Cell 61(1990),1303-1313)；CD28和B7(Linsley等人,J.Exp.Med.173(1991),721-730)；CTLA-4(Lisley等人,J.Exp.Med.174(1991),561-569)；CD22(Stamenkovic等人,Cell 66(1991),1133-1144)；TNF受体(Ashkenazi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991),10535-10539；Lesslauer等人,Eur.J.Immunol.27(1991),2883-2886；以及Peppel等人,J.Exp.Med.174(1991),1483-1489(1991)；以及IgE受体(Ridgway和Gorman,J.Cell.Biol.115(1991),Abstract No.1448)。
如本文其他地方讨论的，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物可被融合至异源多肽，以增加多肽的体内半衰期或用于使用本领域已知的方法的免疫测定中。例如，在一个实施方式中，PEG可以结合至本发明的抗体以增加其体内半衰期；参见，例如，Leong等人,Cytokine16(2001),106-119；Adv.in Drug Deliv.Rev.54(2002),531；或者Weir等人,Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
而且，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可以被融合至标记序列，例如肽，以方便其纯化或检测。在优选的实施方式中，标记氨基酸序列是六组氨酸肽(HIS)，如pQE载体中提供的标记(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,9131)，尤其是，这些中的许多是市售的。如在Gentz等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989),821-824中所描述的，例如，六组氨酸提供了融合蛋白的便利纯化。可用于纯化的其他肽标记包括但不限于，“HA”标签，其对应于从流感血细胞凝集素蛋白衍生的表位(Wilson等人,Cell37(1984),767)、GST、c-myc和“标志”标签；参见，例如Bill Brizzard,BioTechniques 44(2008)693-695，用于表位标记技术的综述，和第694页的表1，在其中列出了本发明中可使用的最常见的表位标签，将其主题通过引用明确地结合于此。
融合蛋白可以用本领域中公知的方法来制备；参见例如美国专利第5,116,964号和第5,225,538号。制备该融合物的精确位点可以凭经验选择以优化融合蛋白的分泌或结合特征。编码融合蛋白的DNA然后被转染到宿主细胞中用于表达，其如前文所述地执行。
本发明的抗体可以非轭合形式使用或可以被轭合至各种分子中的至少一种，例如，以提高该分子的治疗特性，以促进目标检测，或用于病人的成像或治疗。当进行纯化时，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物可以在纯化之前或纯化后被标记或轭合。具体地说，本发明的抗体或其抗原结合片段、变体、或衍生物可轭合至治疗剂、前药、肽、蛋白、酶、病毒、脂质、生物反应调节剂、药剂、或PEG。
作为包括常规抗体的免疫毒素的轭合物已经在本领域中广泛地描述。毒素可以通过常规的偶联技术耦合到所述抗体，或者包含蛋白质毒素部分的免疫毒素可以被制备为融合蛋白。本发明的抗体可以以相应的方式用于获得这样的免疫毒素。这种免疫毒素的说明是通过Byers,Seminars Cell.Biol.2(1991),59-70和Fanger,Immunol.Today 12(1991),51-54描述的那些。
本领域技术人员将理解的是，轭合物还可以根据待轭合的所选择的制剂使用各种技术来组装。例如，例如通过使多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合多肽与如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯的生物素的活化酯反应来制备具有生物素的轭合物。类似地，具有荧光标记物的轭合物可在存在偶联剂的情况下制备，如下本文所列出的那些，或通过与异硫氰酸酯、优选异硫氰酸荧光素的反应。本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的轭合物以类似的方式制备。
本发明还包括本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，它们轭合至诊断剂或治疗剂。该抗体可诊断地用于例如，描述多瘤病毒的存在，以监测与多瘤病毒相关的疾病的发展或进展，即表示存在多瘤病毒蛋白、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP的疾病作为临床试验过程的一部分，例如以确定给定治疗和/或预防方案的功效。因此，在一个实施方式中，本发明涉及可检测性地标记的抗体。此外，在一个实施方式中，本发明涉及附着至药物的抗体。可以通过将抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物偶联至可检测物质来促进检测。可检测的物质或标记通常可以是酶；重金属，优选是金；染料，优选是荧光或发光染料；或放射性标记。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子发射层析成像的正电子发射金属、以及非放射性顺磁性金属离子；参见，例如，美国专利第4741900号，对于可以轭合至用作根据本发明的诊断的抗体的金属离子。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；并且合适的放射性物质的实例包括125I、131I、111In或99Tc。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种可检测地标记的抗体，其中，所述可检测标记选自由酶、放射性同位素、荧光团、蛋白质以及重金属组成的组。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可通过将其耦合至化学发光化合物可检测地标记。然后，通过检测在化学反应的过程中出现的发光的存在来确定化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺，氨基(theromatic)吖啶鎓、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
可检测地标记抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的方法之一是通过将其连接至酶，并在酶免疫测定(EIA)中使用联产物(Voller,A.,"The Enzyme LinkedImmunosorbent Assay(ELISA)(酶联免疫吸附测定)"Microbiological AssociatesQuarterly Publication,Walkersville,Md.,Diagnostic Horizons 2(1978),1-7)；Voller等人,J.Clin.Pathol.31(1978),507-520；Butler,Meth.Enzymol.73(1981),482-523；Maggio,E.(ed.),Enzyme Immunoassay(酶免疫测定),CRC Press,Boca Raton,Fla.,(1980)；Ishikawa,E.等人,(eds.),Enzyme Immunoassay(酶免疫测定),Kgaku Shoin,Tokyo(1981)。与抗体结合的酶将以这样的方式与适当的底物(优选为显色底物)反应：产生例如可以通过分光光度法、荧光或通过视觉装置检测的化学部分。可用于可检测地标记抗体的酶包括，但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-磷酸甘油脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶以及乙酰胆碱酯酶。此外，该检测可以通过使用显色底物用于酶的比色方法来完成。检测也可通过相较于相似制备的标准的底物的酶反应程度的视觉比较来完成。
检测也可以使用任何各种其它免疫测定来完成。例如，通过放射性标记抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，可以通过使用放射免疫测定(RIA)来检测抗体(参见，例如，Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays(放射免疫测定原理),SeventhTraining Course on Radioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,(March,1986)，其通过引用并入本文中)。放射性同位素可以通过包括但不限于γ计数器、闪烁计数器或放射自显影的装置来检测。
抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物还可以使用如152Eu或其它镧系的发射荧光的金属可检测地标记。这些金属可以使用如二乙三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的这样的金属螯合基团连接至抗体。
用于将各种成分轭合至抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等人,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of DrugsIn Cancer Therapy(用于癌症治疗中的药物的免疫靶向的单克隆抗体)",in MonoclonalAntibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等人(eds.),pp.243-56(Alan R.Liss,Inc.(1985)；Hellstrom等人,"Antibodies For Drug Delivery(用于药物递送的抗体)",inControlled Drug Delivery(2nd Ed.),Robinson等人(eds.),Marcel Dekker,Inc.,pp.623-53(1987)；Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy:A Review(在癌症治疗中细胞毒性药物的抗体载体：回顾与展望)",inMonoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等人(eds.),pp.475-506(1985)；"Analysis,Results,And Future Prospective Of TheTherapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy(在癌症治疗中放射性标记抗体的治疗用途的分析、结果和未来的前瞻性)",in Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy,Baldwin等人(eds.),Academic Press pp.303-16(1985),和Thorpe等人,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒性特性)",Immunol.Rev.62(1982),119-158。
如所提到的，在某些实施方式中，可以轭合增强例如结合多肽的结合分子的稳定性或功效的部分，如抗体或其免疫特异性片段。例如，在一个实施方式中，PEG可以轭合至本发明的结合分子以增加其体内半衰期。Leong等人的Cytokine16(2001),106；Adv.in DrugDeliv.Rev.54(2002),531；或Weir等人的Biochem.Soc.Transactions 30(2002),512。
VI.组合物和使用方法
本发明涉及包括上述多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子的组合物，例如，本发明的抗体或其抗原结合片段或衍生物或变体，或如前所定义的本发明的多核苷酸、载体或细胞。在一个实施方式中，本发明的组合物是药物组合物并且还包括药学上可接受的载体。此外，根据药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物可以包括例如白介素或干扰素的另外的药剂。为了用于显示多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP的出现的与多瘤病毒有关的疾病的治疗，附加的药剂可以选自由有机小分子、抗多瘤病毒、抗多瘤病毒VP1和/或抗多瘤病毒VP1 VLP抗体及其组合组成的组。因此，在一个特别优选的实施方式中，本发明涉及多瘤病毒蛋白质、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子(例如本发明的抗体或其抗原结合片段)，或者具有其任何一个的基本相同的结合特异性的结合分子、本发明的多核苷酸、载体或细胞在制备用于预防性和/或治疗性治疗代谢疾病的药物或诊断组合物，在受试者中监测代谢疾病的进展或对于受验者中代谢疾病治疗的响应或用于确定受试者用于发展代谢性疾病的危险中的应用。
在一个实施方式中，本发明涉及治疗与多瘤病毒相关的病症(障碍)的方法，优选JCV和/或BKV类型，该方法包括给予需要其的受试者治疗有效量的上述多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子、抗体、多核苷酸、本发明的载体或细胞中的任何一种。
本发明的治疗方法的一个特别的优点在于，本发明的抗体衍生自来自健康老年人受试者的B细胞或记忆B细胞，接受治疗多发性硬化症(MS)的单克隆抗体疗法的患者和形成PML和PML-IRIS的症状和以一定的概率从PML和PML-IRIS恢复的患者，能够防止与多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP有关的临床表现的疾病，或减少出现临床表现的疾病的风险，或延迟临床表现疾病的发作或进展。通常，本发明的抗体也已经成功地通过体细胞成熟，即，通过抗体的可变区的体细胞变异相对于高亲和力结合到目标多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP分子的选择性和效力的优化。
体内(例如人体)的这种细胞没有通过在自免疫或过敏性反应的意义上相关或其他生理蛋白质或细胞结构激活的知识也具有很大的医疗重要性，因为这意味着成功经历临床测试阶段的显著增加的机会。可以这么说，效率、可接受性和耐受性已经在至少一个人类受试者中的预防或治疗抗体中的临床前和临床开发之前被证实。因此，可以预期的是，本发明的人抗多瘤病毒，抗多瘤病毒VP1和/或抗多瘤病毒VP1 VLP抗体，作为治疗剂的其靶结构特异性效率和其副作用的降低的可能性显著增加了其成功的临床可能性。
本发明还提供了药物和诊断各自的包装或试剂盒，包括填充有上述成分中的一种或多种的一个或多个容器，如抗多瘤病毒、抗多瘤病毒VP1和/或抗多瘤病毒VP1 VLP抗体、其结合片段、衍生物或变体、多核苷酸、本发明的载体或细胞。与这样的一个或多个容器相关的可以是由政府机构规范生产、使用或出售药品或生物制品形式的通知，该通知反映了制造、使用或出售用于人给药的机构的批准。另外或可替代地，试剂盒包含在适当的诊断测定法中使用的试剂和/或说明。组合物，例如，本发明的试剂盒当然特别适合于风险评估、诊断、预防，监测和治疗病症，其伴随有多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP的存在，尤其适用于通常特征是多瘤病毒感染的病症的治疗。
可以根据本领域熟知的方法来配制本发明的药物组合物；例如参见，The Scienceand Practice of Pharmacy(2000)by the University of Sciences in Philadelphia,ISBN0-683-306472。合适的药物载体的实例是本领域所熟知的，并且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂，例如油/水乳液，各种类型的润湿剂，无菌溶液等。包括这样的载体的组合物可以通过公知的常规方法来配制。这些药物组合物可以以合适的剂量给予受试者。合适的组合物的给药可以通过不同的方式来实现，例如，通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、鼻内、局部或皮内给药或脊髓或脑递送。例如鼻喷雾制剂的气溶胶剂制剂包括与防腐剂和等渗剂的活性药剂的纯化的水溶液或其他溶液。这样的制剂优选调节至与鼻粘膜兼容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道给药的制剂可以呈现为具有合适的载体的栓剂。
剂量方案将由主治医生和临床因素确定。如医学领域所熟知的，用于任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的大小、体表面积、年龄、待给予的特定化合物、性别、给药时间和途径、一般健康状况以及同时给予的其它药物。典型的剂量可以是，例如，在0.001-1000μg的范围(或用于表达或用于在该范围内表达抑制的核酸)；然而，可以设想低于或高于该示例性范围的剂量，特别是考虑到前述因素。通常，剂量范围可以，例如，从约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等等)的宿主体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选为至少1mg/kg。在上述范围中间的剂量也意在本发明的范围之内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其他时间表来给予这样的剂量。示例性的治疗需要在延长的时间以多剂量给予，例如，至少6个月。另外的示例性治疗方案需要每两周一次或每月一次或每3至6个月给予一次。示例性的剂量方案包括连续数天的1-10mg/kg或15mg/kg，隔天的30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，两个或更多个具有不同结合特异性的单克隆抗体同时给予，在这种情况下，给予的每种抗体的剂量落入所示范围内。可以通过定期评估来监测该过程。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液以及乳液。非水性溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇，如橄榄油的植物油，以及如油酸乙酯的可注射有机酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳剂或混悬剂，包括盐水和缓冲介质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖以及氯化钠，乳酸林格氏或不挥发性油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏右旋糖的那些)等。防腐剂和其它添加剂也可以存在，如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂以及惰性气体等。此外，本发明的药物组合物可以包含如多巴胺或心理药理学药物的另外的药剂，这取决于药物组合物的目的用途。
此外，在本发明的一个优选实施方式中，药物组合物可被配制成疫苗，例如，如果本发明的药物组合物包括抗多瘤病毒、抗多瘤病毒VP1和/或抗多瘤病毒VP1VLP抗体或其结合片段、衍生物或变体，用于被动免疫。
在一个实施方式中，可能有益的是，使用本发明的抗体的重组双特异性或多特异性构建物。对于参考，参见Fischer和Léger,Pathobiology 74(2007),3-14。这种双特异性分子可能被设计为靶向由多瘤病毒的感染引起的不同多瘤病毒或疾病。双特异性分子也可以被设计成与在与多瘤病毒相关的发病中已知的第二结合臂的其他实体结合。
在一个实施方式中，可能有益的是，使用本发明的抗体的重组Fab(rFab)和单链片段(scFv)，这可能会更容易地渗透细胞膜。使用缺乏效应子功能的小的Fab和scFv设计抗体格式的感知优点包括穿过血-脑屏障的更有效通道和最小化触发炎性副反应的风险。此外，除了scFv和单域抗体保留全长抗体的结合特异性，它们可以被表达为单基因并且在哺乳动物细胞内被细胞内作为胞内抗体，具有变更它们的目标的折叠、相互作用、修饰、或亚细胞定位的潜力；对于综述，参见，例如，Miller和Messer,Molecular Therapy(分子治疗)12(2005),394–401。在不同的方法中，Muller等人,Expert Opin.Biol.Ther.(2005),237-241，描述了一个技术平台，所谓的“超抗体技术”，其据说能使抗体穿梭进入活细胞而不伤害它们。这种细胞穿透抗体打开新的诊断和治疗窗口。术语“TransMabs”已经为这些抗体而克隆。
在一个实施方式中，本发明的抗体、药物组合物或疫苗与免疫调节剂组合、同时或依次用于治疗与多瘤病毒的(重新)激活有关的疾病，优选用于治疗进行性多灶性白质脑病(PML)，颗粒神经元、细胞核深染、颗粒细胞中枢神经途径、脑自萎缩、脑病、脑膜炎、多瘤诱导的肿瘤、免疫重建炎性综合征(IRIS)、出血性膀胱炎、肺炎、视网膜、结肠炎、血管炎、间质性肾脏疾病的感染，呼吸道、JCV肾病、BKV肾病、脑膜炎、Merkel细胞癌、毛发发育不良毛壅病或恶性胸膜间皮瘤和/或与试剂珠单抗，依法珠单抗，利妥昔单抗，英夫利昔单抗，奥瑞珠单抗(ocrelizumab)，阿仑单抗，贝妥昔单抗(bentuximab)或维度汀(维多汀)共同给予的感染。
治疗有效剂量或量是指足以改善症状或病症的活性成分的量。这样的化合物的治疗功效和毒性可以在细胞培养物或实验动物中通过标准药学方法来确定，例如，ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)和LD50(致死50％的群体的剂量)。治疗和毒性效果之间的剂量比率是治疗指数，并且它可以被表示为比率，LD50/ED50。优选地，在组合物中的治疗剂以足以例如防止移植排斥反应，PML以及由多瘤病毒感染引起的其他疾病的量存在。
根据上述内容，很明显的是，本发明涵盖多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或包括上述抗体的至少一个CDR的多瘤病毒VP1 VLP结合分子特别是在用于诊断和/或治疗与多瘤病毒感染相关的疾病中的任何用途。优选地，所述结合分子是本发明的抗体或其免疫球蛋白链。另外，本发明涉及上文所述的提及到的抗体中的任何一种的抗独特型抗体。这些是抗体或其它结合分子，其结合到位于所述抗原结合位点附近的抗体的可变区的独特抗原性肽序列并且可用于例如在从受试者获得的样品中检测抗多瘤病毒、抗多瘤病毒VP1和/或抗多瘤病毒VP1 VLP抗体。因此，在一个实施方式中，本发明提供了如上文定义和下面的抗体或多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或具有其任何一种的实质上相同的结合特异性的多瘤病毒VP1 VLP结合分子、多核苷酸、载体或如本文定义的细胞或者包括其任何一种的药物或诊断组合物，用于预防性治疗、治疗性治疗和/或监测与多瘤病毒感染相关的病症的治疗的进展或对所述治疗的应答，优选地，其中所述病症选自包括PML、颗粒神经元、细胞核深染、颗粒细胞中枢神经途径、脑自萎缩、脑病、脑膜炎、多瘤诱导的肿瘤、免疫重建炎性综合征(IRIS)、出血性膀胱炎、肺炎、视网膜、结肠炎、血管炎、间质性肾脏疾病、呼吸道的感染的组。上述组的病症将被称为与多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP有关的病症的组。
在另一个实施方式中，本发明涉及一种诊断组合物，包括本发明的上述多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞以及用于检测如在基于免疫或基于核酸的诊断方法中常规使用的试剂的可选的合适装置中的任何一种。本发明的抗体例如适合用于免疫测定，其中它们可以被用于液相中或结合于固相载体。可以使用本发明的抗体免疫测定的实例是以直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。这种免疫试验的实例是放射性免疫测定(RIA)、夹心(免疫分析测定)、流式细胞术和蛋白质印迹测定。本发明的抗原和抗体可以与许多不同的载体结合并用来分离特异性结合至其的细胞。已知载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。对于本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不溶的。存在许多本领域普通技术人员所熟知的不同的标记和标记的方法。可在本发明中使用的标签的类型的实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也参见上文讨论的实施方式。
通过进一步的实施方式，多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子，尤其是本发明的特定抗体，也可以通过从测试个体获得体液样品并且在使得能够形成抗体-抗原复合物的条件下使体液样品与本发的抗体接触而用于在个体中的病症的诊断的方法中，所述体液样品可以是血液样品、血浆样品、血清样品、淋巴样品或任何其它体液样品，如唾液或尿液样品。这种复合物的水平于是通过本领域中已知的方法来确定，显著高于表示在测试个体中的疾病的在对照样品中形成的水平。以相同的方式，也可以使用通过本发明的抗体结合的特异性抗原。因此，本发明涉及一种体外免疫测定，其包括结合分子，例如，本发明的抗体或其抗原结合片段。
在此背景下，本发明还涉及专门为此目的而设计的装置。例如，可以使用基于抗体的阵列，其例如装载有本发明的抗体或等效的抗原结合分子，其特定地识别多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP。微阵列免疫测定的设计总结在Kusnezow等人,Mol.CellProteomics 5(2006),1681-1696中。因此，本发明还涉及在根据本发明鉴定的装载有多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子的微阵列。
在一个实施方式中，本发明涉及诊断涉及在受试者中诊断与多瘤病毒感染相关的疾病的方法，该方法包括使用本发明的至少一种抗体来确定在待诊断的受试者的样品中多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP、具有其任何一种的实质上相同结合特异性的其结合片段或结合分子的存在。
多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP的水平可以通过本领域中已知的任何合适的方法来评价，包括例如通过选自以下中的一种或多种技术来分析多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP：蛋白质印迹、免疫沉淀、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、荧光激活细胞分选(FACS)、二维凝胶电泳、质谱法(MS)、飞行-MS的基质辅助激光解吸/电离时间(MALDI-TOF)、表面增强激光解吸飞行时间(SELDI-TOF)、高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白液相色谱法(FPLC)、伴随串联质谱(MS/MS)的多维液相色谱(LC)，以及激光光密度。优选地，VP1的所述体内成像包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、近红外(NIR)光成像或磁共振成像(MRI)。
因此，在一个实施方式中，提供了本发明的抗体、或多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或具有其任何一种的实质上相同的结合特异性的多瘤病毒VP1 VLP结合分子、多核苷酸、载体或如上文定义的细胞，或者包括其任何一种的药物或诊断组合物，用于预防性治疗、治疗性治疗和/或监测与多瘤病毒感染相关的病症的进展或对其进行治疗的反应。因此，通常，本发明还涉及诊断或监测与多瘤病毒感染有关的病症的进展的方法。
正如上面所指出的，本发明的抗体，其片段以及与其抗体和片段具有相同结合特异性的的分子不仅可以在体外而且也可以在体内使用，其中除了诊断之外，也可以追求治疗的应用。因此，在一个实施方式中，本发明还涉及多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子(其包括本发明的抗体的至少一个CDR)用于制备用于体内检测或将治疗和/或诊断剂靶向到在人体或动物体内的多瘤病毒的组合物。潜在的治疗和/或诊断剂可以选自可用于治疗与多瘤病毒有关的疾病的治疗剂的非穷尽详表。就该体内成像而言，在一个优选的实施方式中，本发明提供了所述多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子(其包含本发明的抗体的至少一个CDR)，其中所述体内成像包括正电子发射断层扫描(PET)，单光子发射断层扫描(SPECT)，近红外(NIR)光成像或磁共振成像(MRI)。在进一步的实施方式中，本发明还提供了所述多瘤病毒、多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子(其包含本发明的抗体的至少一个CDR)或所述分子用于制备用于上述体内成像方法中指定的组合物，用于在受试者中诊断或监测与多瘤病毒感染相关的病症的进展，如上文所定义的。
VII.具有多瘤病毒特异性表位的肽
在进一步的方面，本发明涉及具有由本发明的任何抗体特异性识别的多瘤病毒VP1的表位的肽。优选地，这样的肽包括或由在SEQ ID NOs：85至88中指示的氨基酸序列构成，其作为由抗体或其修饰的序列识别的独特线性表位，其中一个或多个氨基酸被取代、缺失和/或添加，其中所述肽是由本发明的任何抗体所识别，优选通过抗体(A)NI-307.13G4,(B)NI-307.19F10,(C)NI-307.19F8,(D)NI-307.11G6,(E)NI-307.17F12,(F)NI-307.6A2,(G)NI-307.5H3,(H)NI-307.25G10,(I)NI-307.26E10,(J)NI-307.1E1,(K)NI-307.24C6,(L)NI-307.78C3,(M)NI-307.57D5,(N)NI-307.43A11,(O)NI-307.3G4,(P)NI-307.61D11,(Q)NI-307.24F3,(R)NI-307.18E12,(S)NI-307.20F5,(T)NI-307.58C7,(U)NI-307.105C7,(V)NI-307.98D3,(W)NI-307.72F7,(X)NI-307.45E10,(Y)NI-307.72F10,(Z)NI-307.56A8,(A2)NI-307.27C11,(B2)NI-307.47B11,(C2)NI-307.26A3,(D2)NI-307.27C2,(E2)NI-307.57D4,(F2)NI-307.50H4,(G2)NI-307.53B11,(H2)NI-307.7J3,(I2)NI-307.59A7,(J2)NI-307.105A6,(K2)NI-307.29B1,(L2)NI-307.44F6B,(M2)NI-307.98H1,(N2)NI-307.43E8和/或(O2)NI-307.18F4A。
在本发明的一个实施方式中，这样的肽可被用于在受试者中诊断和/或监测与多瘤病毒感染有关的疾病，包括以下步骤：确定在所述受试者的生物样品中的与肽结合的抗体的存在，并且通过测量识别本发明的上述肽的抗体的水平并且比较测量值与在可比的年龄和性别的健康受试者中发现的水平而被用于在所述受试者中诊断这样的疾病。因此，在一个实施方式中，本发明涉及用于诊断PML的方法。本发明的肽可以被分别配制成阵列、试剂盒和组合物，如前所述。在此背景下，本发明还涉及可用于诊断或监测多瘤病毒感染的进展的试剂盒，所述试剂盒包含本发明的至少一种抗体，或多瘤病毒，多瘤病毒VP1和/或多瘤病毒VP1 VLP结合分子(其具有其任何一种的基本相同的结合特异性)，分别如前面定义的多核苷酸，载体或细胞和/或肽，可选地连同试剂和/或使用说明。
公开了这些和其它实施例并通过本发明的说明书和实施例涵盖。关于待用于根据本发明的材料、方法、用途和化合物中的任何一种的进一步的文献可以使用例如电子设备从公共图书馆和数据库中检索到。例如，可以使用公共数据库“Medline”，其是由国家生物技术信息中心和/或国家医学图书馆国立卫生研究院主办。进一步的数据库和网址，例如欧洲生物信息研究所(EBI)的那些，其是欧洲分子生物学实验室(EMBL)的一部分，是本领域技术人员公知的，并且也可以使用互联网搜索引擎获得。生物技术中的专利信息和可用于追溯检索和当前意识的专利信息的相关来源的调查的概述在伯克斯，TIBTECH 12(1994)，352-364中给出。
上述公开内容总体描述了本发明。除非另有说明，否则如本文所用的术语给出了如在牛津生物化学和分子生物学词典，牛津大学出版社，1997年，2000年修订和2003年重印，ISBN 0198506732提供的定义。几个文件在整个本说明书中引用。所有引用的参考文献(包括文献参考，授权的专利，如在整个本申请中引用的公开的专利申请和制造商的说明书，指南等)的内容明确地通过引入并入本文；然而，没有承认引用的任何文件确实是作为本发明的现有技术。
更完整的理解可以通过参考下列具体实施例而获得，其在此提供目的仅用于说明而不旨在限制本发明的范围。
实施例
实施例1：供体的选择
招募临床感兴趣的供体，在适当的知情同意下取出外周血并制备PBMCs并将其储存于液氮中。
供体可分成3个类别，包括具有未知HLA分型和抗JCV滴度的健康老年患者，提供强大的JCV特异性抗体生产的HLA-DRB1*04:01+健康捐赠者，和接受单克隆抗体疗法以治疗多发性硬化症和出现PML和PML-IRIS的症状并成功痊愈的患者。从后一类中选择的捐赠者配有具有高抗JCV抗体滴度的有效免疫应答。
通过对从临床上选择的捐赠者衍生的人记忆性B细胞受体库的补体的高通量分析来识别靶向VP1的人源性抗体。为了VP1抗体筛选，利用VP1溶液或在碳酸盐缓冲液(15mMNa2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.42)或复性缓冲液中的稀释成浓度为1μg/ml的BSA(Sigma-Aldrich，布克斯，瑞士)对96孔微板(Costar，康宁，美国)在4℃下包被过夜。在pH值为7.6的PBS-T中洗涤板，然后用含有2％的BSA(Sigma-Aldrich，布克斯，瑞士)的PBS/含0.1％的吐温-20在室温下封闭非特异性结合位点1小时。B细胞条件培养基从记忆B细胞培养板转移至ELISA板，并在室温孵育1小时。在PBS-T中洗涤ELISA板并且使用辣根过氧化物酶(HRP)结合的抗人免疫球蛋白多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch，纽马克特，英国)测定结合，接着在标准比色测定中测量HRP活性。仅示出了在培养基中包含的抗体与VP1而不是与BSA的结合的B细胞培养物经受抗体克隆。还进行了高通量分析来表征天然抗体的亚类；见表4。衍生自VP1反应性记忆B细胞的抗体cDNA表达为用于确定结合蛋白，并且VP1反应性IgG克隆在CHO细胞中重组产生以用于体外表征。通过亲和层析纯化抗体去除内毒素，例如参见，Sheehan和O’Sullivan,Methods Mol.Biol.244(2004)，253-258。
用于重组全长JCV VP1和BKV VP1的VP1抗原从Abcam(英国剑桥)购买。可替换地，JCV VP1基因融合至6xHis标签，其在大肠杆菌中表达并使用镍柱纯化。此外，该抗原在复性缓冲液(在TBS中的1mM CaCl2)在24℃下在振荡的情况下孵育48小时以形成病毒样颗粒(VLP)。
所使用的JCV VP1来自Mad-1菌株(UniProtKB/SWISS-PROT，NCBI登录号P03089)，而BKV VP1来自AS菌株(UniProtKB/SWISS-PROT，NCBI登录号P03088)。
表IV：本发明的抗体的亚类的表征
抗体代码 抗体名称 抗体亚类
A NI-307.13G4 IgA
B NI-307.19F10 IgG
C NI-307.19F8 IgG
D NI-307.11G6 IgG1
E NI-307.17F12 IgG
F NI-307.6A2 IgG
G NI-307.5H3 IgA
H NI-307.25G10 IgG2
I NI-307.26E10 IgG
J NI-307.1E1 IgG
K NI-307.24C6 IgG
L NI-307.78C3 IgG2
M NI-307.57D5 IgG
N NI-307.43A11 IgG
O NI-307.3G4 IgG
P NI-307.61D11 IgA
Q NI-307.24F3 IgA
R NI-307.18E12 IgG
S NI-307.20F5 IgA
T NI-307.58C7 IgG1
U NI-307.105C7 IgG2
V NI-307.98D3 IgG1
W NI-307.72F7 IgG1
X NI-307.45E10 IgG3
Y NI-307.72F10 IgG1
Z NI-307.56A8 IgG1
A2 NI-307.27C11 IgG3
B2 NI-307.47B11 IgA1
C2 NI-307.26A3 IgG3
D2 NI-307.27C2 IgG1
E2 NI-307.57D4 IgA1
F2 NI-307.50H4 IgG
G2 NI-307.53B11 IgG1
H2 NI-307.7J3 IgA1
I2 NI-307.59A7 IgG1
J2 NI-307.105A6 IgG1
K2 NI-307.29B1 IgG3
L2 NI-307.44F6B IgA1
M2 NI-307.98H1 IgG1
N2 NI-307.43E8 IgG2
O2 NI-307.18F4A IgG
实施例2：VP1蛋白设置重折叠成病毒样颗粒
为了筛选和测试抗体采样数与暴露在病毒表面上的VP1抗原表位的结合，必须建立VP1单体重折叠成病毒样颗粒(VLP)。VP1蛋白(Abcam)在碳酸盐ELISA包被缓冲液中稀释或者在复性缓冲液(含有1mM CaCl2的TBS)中在24℃下孵育48小时。然后，将制备物用抗-VP1抗体染色并通过透射电子显微镜进行研究。如图1A中所示，稀释在碳酸盐包被缓冲液中的VP1蛋白质不形成任何结构。相反，在复性缓冲液中孵育的VP1蛋白被重新组装成模拟病毒结构的VLP(见图1B)。此过程被进一步用于重折叠颗粒以包被在ELISA板上(称为VP1VLP)。
实施例3：VP1抗体的分子克隆
收获选定记忆B细胞培养物的活B细胞并制备mRNA。然后使用巢式PCR方法来获得免疫球蛋白重链和轻链序列。
代表人免疫球蛋白种系谱的所有序列家族的引物组合被用于前导肽、V-片段和J-片段的扩增。使用前导肽-特异性引物在5'-端和恒定区-特异性的引物在3'-端进行第一轮扩增(Smith等人,Nat Protoc.4(2009)，372-384)。对于重链和κ轻链，使用V-片段-特异性引物在5'-端和J-片段-特异性引物在3'-端进行第二轮扩增。对于λ轻链，使用V-片段-特异性引物在5'-端和C区特异性引物在3'-端进行第二轮扩增(Marks等人,Mol.Biol.222(1991),581-597；de Haard等人,J.Biol.Chem.26(1999)，18218-18230)。
在完全抗体的重组表达之后，通过在ELISA上的重新筛选进行具有所需特异性的抗体克隆的识别。完全人IgG1抗体的重组表达是在将“在正确的阅读框中”的可变重链和轻链序列插入到表达载体中之后实现的，该表达载体用在5'-端编码前导肽的序列和在3'-端具有编码适当的一个或多个恒定域的序列补充可变区序列。为此目的，包含限制性位点的引物被设计成便于可变重链和轻链序列克隆到抗体表达载体中。通过将在框架中的免疫球蛋白重链RT-PCR产物插入到带有信号肽的重链表达载体和人免疫球蛋白γ1的恒定域内来表达重链免疫球蛋白。通过将在框架中的κ轻链RT-PCR-产物插入到提供信号肽的轻链表达载体和人κ轻链免疫球蛋白的恒定域内来表达κ轻链免疫球蛋白。通过将在框架中的λ轻链RT-PCR-产物插入到提供信号肽的λ轻链表达载体和人或小鼠的λ轻链免疫球蛋白的恒定域内来表达λ轻链免疫球蛋白。
在共转染到Ig重链表达载体和κ或λ的Ig轻链表达载体的HEK 293或CHO细胞(或人或小鼠源的任何其他适当的受体细胞系)时获得功能性重组单克隆抗体。随后使用标准蛋白A柱纯化由条件培养基来纯化重组人单克隆抗体。使用瞬时或稳定转染细胞以未限制的量产生重组人单克隆抗体。通过直接使用Ig-表达载体或通过将Ig-可变区再克隆成不同的表达载体可以建立产生重组人单克隆抗体的细胞系。也可以从这些Ig-可变区产生衍生物，如F(ab),F(ab)2和scFv。
根据制造商的协议使用在实验中使用的抗体，小鼠单克隆抗-VP1抗体2E4(SC-65930，Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州，美国)和小鼠单克隆抗-VP1抗体(ab34756，Abcam，剑桥，英国)。重组人VP1抗体(A)NI-307.13G4，(B)NI-307.19F10，(C)NI-307.19F8，(D)NI-307.11G6，(E)NI-307.17F12，(F)NI-307.6A2，(G)NI-307.5H3，(H)NI-307.25G10，(I)NI-307.26E10，(J)NI-307.1E1，(K)NI-307.24C6，(L)NI-307.78C3，(M)NI-307.57D5，(N)NI-307.43A11，(O)NI-307.3G4，(P)NI-307.61D11，(Q)NI-307.24F3，(R)NI-307.18E12(S)NI-307.20F5，(T)NI-307.58C7，(U)NI-307.105C7，(V)NI-307.98D3，(W)NI-307.72F7，(X)NI-307.45E10，(Y)NI-307.72F10，(Z)NI-307.56A8，(A2)NI-307.27C11，(B2)NI-307.47B11，(C2)NI-307.26A3，(D2)NI-307.27C2，(E2)NI-307.57D4，(F2)NI-307.50H4，(G2)NI-307.53B11，(H2)NI-307.7J3，(I2)NI-307.59A7，(J2)NI-307.105A6，(K2)NI-307.29B1，(L2)NI-307.44F6B，(M2)NI-307.98H1，(N 2)NI-307.43E8和/或(O2)NI-307.18F4A是本发明的抗体。它们在HEK 293或CHO细胞中表达，从条件培养基纯化并直接在随后的应用中使用，除非另有说明。
实施例4：JCV VP1抗体的结合特异性
用不同的抗体浓度进行直接ELISA测定，以证实抗体与JCV VP1的结合，并能够确定它们的半数最大有效浓度(EC50)。简言之，在96孔微孔板(Costar，康宁，美国)中进行直接ELISA，在4℃下用VP1溶液或在碳酸盐包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.42)或复性缓冲液中稀释成1μg/ml浓度的BSA(Sigma-Aldrich，布克斯，瑞士)过夜包被所述96孔微孔板。包被有在碳酸盐缓冲液中稀释的VP1抗原的板被称为“VP1”，而包被有在复性缓冲液中预孵育的VP1以及然后进一步在复性缓冲液中稀释的板被称为“VP1 VLP”。用含2％的BSA(Sigma-Aldrich，布克斯，瑞士)和0.5％吐温20的PBST在室温下封闭非特异性结合位点2小时。使用结合有HRP(Jackson ImmunoResearch，纽马克特，英国)的驴抗人IgG抗体来确定本发明的人抗体的结合，接着在标准比色测定中测量HRP活性。通过使用GraphPad Prism软件(圣地亚哥，美国)的非线性回归来估计EC50值。
对于本发明的示例性重组人NI-307.13G4、NI-307.18E12、NI-307.18F4A、NI-307.19F8、NI-307.20F5和NI-307.61D11抗体和商业抗体Ab34756，用VP1溶液或用在碳酸盐ELISA包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.4)或复性缓冲液中被稀释成浓度为5μg/ml的BSA(Sigma-Aldrich，布克斯，瑞士)包被96孔微孔板(Costar，康宁，美国)。然后，测试抗体的结合效率。示例性的抗体特异性地结合至来自JCV的VP1而不结合或较弱地结合至来自BKV的VP1。商业抗体Ab34756结合至来自JC病毒的VP1并较弱地结合至来自BK的VP1，但它也结合至BSA，因此，如通过ELISA判断的没有特异性。NI-307.13G4和NI-307.20F5抗体在JCV VP1(用碳酸盐缓冲液包被)上的结合比在JCV VP1 VLP(用复性缓冲液包被)上的结合更有效，而与JCV VP1 VLP相比，NI-307.18E12、NI-307.19F8和NI-307.61D11抗体的结合在JCV VP1上略强。但是，对于示例性抗体观察到不与BSA结合；参见图2A。
通过使用GraphPad Prism(圣地亚哥，美国)软件的非线性回归来估计EC50值。重组人源抗体NI-307.13G4、NI-307.18E12、NI-307.18F4A、NI-307.19F8、NI-307.20F5和NI-307.61D11以高亲和力分别以2.67nM、4.52nM、125nM、2.08nM、284pM和3.80nM的EC50结合至JCV VP1。重组人源抗体NI-307.13G4、NI-307.18E12、NI-307.19F8和NI-307.61D11以高亲和力分别以95.4nM、19.9nM、55nM、6.68nM和17.7nM的EC50结合至JCV VP1 VLP；参见图2B。
在SDS-PAGE凝胶上分离重组VP1蛋白和来自感染有或不感染有JCV的SVG-A细胞的上清液，然后转移到硝酸纤维素膜上。为了制备病毒上清液，使SVG-A(人星形胶质细胞系)生长直至60-80％克隆率，用PBS洗涤，然后在37℃下用JCV感染1小时。之后加入新鲜培养基并在6至9天的生产后收集病毒上清液。通过以2500rpm离心10分钟将细胞碎片从上清液中清除。然后将病毒上清液储存在-80℃。如果有必要的话，通过在20％蔗糖垫上覆盖上清液来浓缩这些病毒，然后在4℃下以100,000g超速离心2小时。
然后用示例性抗体探测上述膜。
实施例5：JCV/BKV VP1抗体的结合特异性
用不同的抗体浓度进行直接ELISA测定，以证实抗体与JCV/BKV VP1的结合，并能够以确定它们的半数最大有效浓度(EC50)。对于示例性的重组人NI-307.3G4、NI-307.6A2、NI-307.11G6、NI-307.19F10、NI-307.24F3、NI-307.25G10、NI-307.43A11、NI-307.44F6B、NI-307.57D5和NI-307.78C3抗体，用VP1溶液或用在碳酸盐ELISA包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.4)或复性缓冲液中的稀释成浓度为5μg/ml的BSA(Sigma-Aldrich，布克斯，瑞士)包被96孔微孔板(Costar，康宁，美国)。然后测试抗体的结合效率。示例性的NI-307.3G4、NI-307.6A2、NI-307.11G6、NI-307.19F10、NI-307.24F3、NI-307.25G10、NI-307.43A11、NI-307.44F6B、NI-307.57D5和NI-307.78C3抗体特异性地结合至来自JCV和来自BKV的VP1。抗体NI-307.3G4、NI-307.6A2、NI-307.11G6、NI-307.19F10、NI-307.25G10、NI-307.43A11、NI-307.44F6B、NI-307.57D5和NI-307.78C3以相同的效率与VP1(用碳酸盐缓冲液包被)和VP1 VLP(用复性缓冲液包被)结合，而不依赖这些病毒。抗体NI-307.24F3与VP1结合比与VP1 VLP的结合更加强烈，并与BKV相比，更好地结合于来自JCV的抗原。观察到不与BSA结合；见图3A。
通过使用GraphPad Prism(圣地亚哥，美国)软件的非线性回归来估计EC50值。重组人源抗体NI-307.3G4、NI-307.6A2、NI-307.11G6、NI-307.19F10、NI-307.24F3、NI-307.25G10、NI-307.43A11、NI-307.44F6B、NI-307.57D5和NI-307.78C3以高亲和力分别以71.0nM、1.59nM、11.6pM、10.1nM、281pM、605pM、8.07nM、101pM、38.6nm和859pM的EC50结合于JCV VP1。重组人源抗体NI-307.3G4、NI-307.6A2、NI-307.11G6、NI-307.19F10、NI-307.24F3、NI-307.25G10、NI-307.43A11、NI-307.44F6B、NI-307.57D5和NI-307.78C3以高亲和力分别以28.2nM、1.39nM、11.8pM、3.41nM、6.95nM、509pM、6.15nM、83pM、57nM和932pM的EC50结合于JCV VP1 VLP。重组人源抗体NI-307.3G4、NI-307.6A2、NI-307.11G6、NI-307.19F10、NI-307.24F3、NI-307.25G10、NI-307.43A11、NI-307.44F6B、NI-307.57D5和NI-307.78C3以高亲和力分别以27.4nM、1.79nM、18.8pM、2.41nM、1.04nM、514pM、9.7nM、600pM、37.5nM和1.96nM的EC50结合于BKV VP1。重组人源抗体NI-307.3G4、NI-307.6A2、NI-307.11G6、NI-307.19F10、NI-307.24F3、NI-307.25G10、NI-307.43A11、NI-307.44F6B、NI-307.57D5和NI-307.78C3以高亲和力分别以16.4nM、1.17nM、38.7pM、1.1nM、28.8nM、172pM、10nM、200pM、104nM和939pM的EC50结合于BKV VP1 VLP；见图3B。
实施例6：BKV VP1抗体的结合特异性
用不同的抗体浓度进行直接ELISA测定，以证实本发明的示例性抗体与BKV VP1的结合，并能够确定它们的半数最大有效浓度(EC50)。对于示例性重组人NI-307.1E1、NI-307.5H3、NI-307.24C6和NI-307.26E10抗体，用VP1溶液或用在碳酸盐ELISA包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.4)或复性缓冲液中被稀释成浓度为5μg/ml的BSA(Sigma-Aldrich，布克斯，瑞士)包被96孔微孔板(Costar，康宁，美国)。然后测试抗体的结合效率。示例性NI-307.1E1、NI-307.5H3、NI-307.24C6和NI-307.26E10抗体特异性地并强烈地与来自BKV的VP1结合且较弱地与来自JCV的VP1结合。抗体NI-307.1E1与VP1(用碳酸盐缓冲液包被)结合比与VP1 VLP(用复性缓冲液包被)结合更有效，与上述多个抗体同时。抗体NI-307.24C6和NI-307.26E10在VP1 VLP上的结合比在VP1上的结合更有效。如果VP1蛋白是单体的或被重新组装成VLP，则抗体NI-307.5H3以同样的方式结合。观察到不与BSA结合；见图4A。
通过使用GraphPad Prism(圣地亚哥，美国)软件的非线性回归来估计EC50值。重组人源抗体NI-307.1E1、NI-307.5H3、NI-307.24C6和NI-307.26E10以高亲和力分别以6.05nM、362pM、816pM和1.35nM的EC50结合于BKV VP1。重组人源抗体NI-307.1E1、NI-307.5H3、NI-307.24C6和NI-307.26E10以高亲和力分别以11nM、288pM、396pM和740pM的EC50结合于BKV VP1 VLP。重组人源抗体NI-307.1E1、NI-307.5H3、NI-307.24C6和NI-307.26E10以较弱的亲和力分别以8.04nM、1.54nM、178nM和22.9nM的EC50结合于JCV VP1。重组人源抗体NI-307.1E1、NI-307.5H3、NI-307.24C6和NI-307.26E10以较弱的亲和力分别以281nM、1.16nM、2.84nM和14.9nM的EC50结合于JCV VP1 VLP；参见图4B。
实施例7：VP1特异性抗体的结合表位的评估
为了确定示例性NI-307.11G6抗体的结合表位，利用定位JCV VP1的整个序列的重叠肽进行结合分析。在这些点样到硝酸纤维素膜(JPT Peptide Technologies，柏林，德国)上的肽上并使用HRP结合的驴抗-人IgG二抗(Jackson immunoResearch，纽马克特，英国)测试抗体的结合能力，接着测量HRP活性(图5A)。简言之，使用重叠肽的扫描进行表位定位。合成JCV VP1和BKV VP1的整个序列作为整个的在单个肽之间具有7个氨基酸重叠的分别为86和88线性的10-mer肽。那些肽被点样到硝酸纤维素膜上(JPT Peptide Technologies，柏林，德国)。该膜在甲醇中被激活5分钟并在室温下在TBS中洗涤10分钟。在室温下用(Carl Roth GmbH+Co.KG，卡尔斯鲁厄，德国)封闭非特异性结合位点2小时。在室温下在中孵育人抗体(1μg/ml)3小时。使用HRP结合的驴抗人IgG二抗来确定一抗的结合。形成印迹并使用ECL和ImageQuant350检测(GE Healthcare，Otelfingen，瑞士)进行估计。
抗体NI-307.11G6识别斑点82、83和84(线E，第2，第3和第4斑点)，其对应于在JCVVP1上的序列333-LPGDPDM-339。在BKV VP1的序列中这些氨基酸是100％被保守的，这解释了本抗体类似地结合于来自JCV和BKV的VP1。抗体NI-307.13G4识别JCV VP1蛋白质的两个区：序列124-GQATHDN-130和340-MRYVDKYGQLQT-351。在BKV VP1蛋白质中有下划线的氨基酸是不同的，这将解释该抗体NI-307.13G4特异性地并只结合于来自JC病毒(JCV)的VP1的事实。小鼠抗体Ab34756识别序列340-MRYVDKYGQLQT-351(图5A和5B)。其他抗体(1和10μg/ml)的表位可能不被识别。这可以通过以下事实进行解释：那些抗体识别不能用此方法识别的不连续的或构象的表位。
实施例8：通过电子显微镜评估结合于病毒的VP1特异性抗体的特异性识别
为了确定VP1特异性抗体对病毒的特异性识别，进行蛋白质印迹和电子显微术。使用VP1制剂进行电子显微术，所述VP1制剂通过加入等体积的在PBS中的多聚甲醛(4％)被固定并在室温下孵育20分钟。7μl固定样品的液滴放在封口膜上并且网格(Formvar/碳包覆的，镍300目)被放置在液滴的顶部20分钟。然后，用PBS洗涤网格3次持续3分钟，并在封闭缓冲液(含10％BSA的PBS)中孵育1小时。然后，用在封闭缓冲液中稀释的抗体Ab34756孵育网格30分钟。未结合的抗体通过用PBS洗涤该网格6次持续3分钟而除去。然后用二抗(山羊抗小鼠IgG，10nm金)孵育网格30分钟。然后用1％的戊二醛将样品固定5分钟，然后在水中洗涤4次2分钟。用滤纸干燥网格并用2％磷钨酸孵育2分钟。在用滤纸最终干燥后，在PhillipsEM400上在x 25000的倍数分析该网格。
实施例9：NI-307抗体的中和能力的评估
识别病毒蛋白的抗体可以预防感染，例如通过阻断病毒与细胞的附着，干扰病毒内化或为吞噬作用靶向病毒或补体介导的溶解。为了检测本发明的抗体阻断由JCV感染的能力，以及为了选择具有治疗潜力的抗体候选物，可以如下面概括地进行病毒中和测定。
简言之，识别病毒蛋白的抗体可以以多种方式通过中和病毒来防止感染，例如通过阻断其附着于细胞或干扰该病毒到细胞中的摄取，以用于脱壳和复制。为了检测抗-VP1抗体阻断由JCV感染的能力，检测它们对某些细胞系，SVG-A(人星形胶质细胞系)或M03.13(人少突胶质细胞系)的JCV感染的效果。20,000个细胞接种在置于24孔组织培养板的孔的盖玻片上。在37℃下孵育15-24小时以使细胞粘附于表面之后，最小浓度的需要达到最大百分比感染的Mad-4病毒株被加入到孔中。允许该病毒附着于细胞1小时，然后在37℃下通过标准方法在新鲜培养基中培养细胞以允许保持感染。72小时感染后确定感染的细胞的百分比，当细胞被固定时，用识别病毒蛋白(例如Ab34756)的抗体以及一般的DNA染色标记，并且通过荧光显微术分析以将细胞的总数与含病毒的细胞的数目进行比较。在病毒附着期间或者在感染后孵育期间，将抗-VP1特异性抗体加入到细胞中。测定在存在和不存在如上所述的抗-VP1抗体的情况下被感染的细胞的百分比。
在该实施例中，在37℃下用含有以下中任一种或者没有抗体的缓冲液孵育病毒1小时：NI-307.98D3、NI-307.44F6B、NI-307.11G6、同种型对照(不与JCV VP1结合的人IgG1抗体)。然后将病毒加入到SVG-A细胞1个小时，其中SVG-A细胞被允许附着在盖玻片的表面上。然后用PBS洗涤细胞并加入新鲜培养基。如上所述，在72小时后测定细胞的感染。示例性的NI-307.98D3和NI-307.44F6B抗体能够完全阻断SVG-A细胞被JCV的感染，而NI-307.11G6和同型对照抗体则不能；参见图10A。
在上述条件下，示例性的NI-307.7J3、NI-307.26A3、NI-307.27C2、NI-307.27C11、NI-307.29B1、NI-307.44F6B、NI-307.45E10、NI-307.47B11、NI-307.50H4、NI-307.53B11、NI-307.56A8、NI-307.57D4、NI-307.58C7、NI-307.59A7、NI-307.72F10、NI-307.98D3、，NI-307.98H1、NI-307.105A6和NI-307.105C7抗体能够全部地阻断SVG-A细胞被JCV的感染。
为了确定示例性的NI-307.98D3抗体中和JCV感染的效力，在如上所述将病毒添加到SVG-A细胞之前，用降低量的抗体孵育病毒。IC50被确定为抗体浓度，对于其感染性被50％抑制(在没有抗体的情况下测定被感染细胞的最大数目)。示例性的NI-307.98D3抗体甚至在低浓度能有效地以0.8ng/mL的IC50抑制SVG-A细胞的感染，而同型对照抗体没有阻断感染；参见图10B。
当在这些测定中抗体不能有效阻断JCV附着到神经胶质细胞或在这些细胞中的病毒复制时，则还测试了其阻断病毒在细胞间传播的能力。在该测定中，评估抗体减少病毒从SVG-A细胞传播到M03.13细胞的能力。SVG-A细胞感染Mad-4，如在基本感染方案中，但是细胞在感染后生长，其中相等数目的M03.13细胞尚未暴露于JCV。这种感染后的培养包括用于中和试验的抗体或者不包括用于对照反应的抗体。通过上述免疫荧光程序来测定在培养一个或两个星期后感染的和未感染的细胞的百分比，具有以下差异：少突胶质细胞特异性抗体(实例)加入到免疫染色中，以便将SVG-A星形胶质细胞系的细胞与M03.13少突胶质细胞系的细胞进行区分。在细胞测定法中被识别的JCV-中和抗体可以在原发性胶质细胞中被进一步证实。
为了调查JCV的补体介导的中和作用，在补体因子存在或不存在的情况下分析具有Mad-4病毒株的JCV易感细胞系SVG-A和MO3.13的感染率。对于这些实验，游离的JCV病毒体用不同浓度的抗-VP1抗体和热灭活或感染前未经处理的人血清预孵育30分钟。人血清的热灭活(56℃持续30分钟)导致补体因子的破坏并且用作对照。在预孵育之后，用预处理的病毒上清液培养上述的细胞系。感染后(p.i.)72小时通过用抗-VP1抗体染色来测定JCV的感染率并随后通过荧光显微术分析，如前所述。
通过使用JCV的Mad-4菌株来解决JCV的抗体介导的吞噬作用，所述菌株用抗-VP1抗体预孵育并用抗原呈递细胞共培养。详细地，UV-灭活(规程)JCV上清液用不同浓度的抗-VP1抗体预孵育并用单核细胞衍生的巨噬细胞(通过加入M-CSF而生成)或将B细胞从PML患者转化的EBV共培养。UV-灭活阻断了病毒的复制和传播。通过用内溶酶体降解抑制剂(如氯喹)处理抗原呈递细胞来分析吞噬的病毒并随后用抗-VP1抗体染色以及用荧光显微术分析。作为用于吞噬作用的额外的读数(readout)，我们共同培养具有抗-VP1-包被的JCV病毒体的抗原呈递细胞和来自与抗原呈递细胞相同的PML患者的自体JCV-特异性T细胞。这些JCV-特异性T细胞从PML-IRIS和JCV-颗粒细胞神经元病变患者的脑活检获得。作为JCV病毒粒子通过抗原呈递细胞的吞噬作用导致JCV-特异性肽在HLA分子学上呈现的增强，这些T细胞能够由于在自体设置中的HLA匹配而进行反应。通过增殖(CFSE的掺入)或细胞因子的产生来测量T细胞的反应性。为了排除如果补体的加入增强了抗体介导的吞噬作用，还在人血清存在的情况下进行测定。
通过使用用不同浓度的抗-VP1抗体孵育的J CV感染的细胞系以及用于ADCC的分析的自然杀伤细胞或用于CDC的分析的人血清来测试JCV感染的细胞的抗体介导的裂解(ADCC或CDC)。通过使用铕、铬或基于荧光的细胞毒性测定法来监测JCV感染的细胞的裂解。
实施例10：来自后PML-IRIS患者的VP1特异性抗体的分离
为了分析在患有PML-IRIS后康复的患者是否设立了针对JCV的保护性体液免疫反应，血液样本收集自健康捐赠者和已成功地从PML和PML-IRIS康复的患者。当来自这两组捐赠者的记忆B细胞产生类似量的免疫球蛋白时，在一个从PML和PML-IRIS康复的捐赠者中发现产生强烈并特异性结合至VP1的抗体的显著更高数目的记忆B细胞，而第二个这样的捐赠者并没有表现出增加数目的VP1反应性B细胞。有趣的是，当被适当地组装成VLP时，来自高频捐赠者的大部分VP1-特异性B细胞特异性地识别出来自JC病毒的VP1蛋白。一些抗体与来自JCV和BKV的VP1蛋白结合，可能是由于这两种病毒的主要衣壳蛋白之间的高同源性。
如先前所描述的，克隆并表达那些抗体。可以确认能够获得特异性结合至来自JCV而非BKV的VP1蛋白的抗体。当VLP被组装(JCV VP1 VLP)时，而不是当颗粒被破坏(JCV VP1)时，示例性的抗体NI-307.58C7和NI-307.105C7只识别JCV VP1；参见图7A。这些抗体仅识别VLP的事实表明它们的结合表位是构象的或不连续的。这种表位仅被显示且在正确组装的VLP中是可识别的，并且是用于中和抗体的优选表位。
克隆并重组表达从高命中率捐赠者获得的示例性抗体。用不同的抗体浓度进行直接ELISA测定法，以证实抗体与形成VLP的JCV/BKV VP1的结合或不结合，并且能够确定它们的半数最大有效浓度(EC50)。对于示例性重组人NI-307.7J3、NI-307.26A3、NI-307.27C2、NI-307.27C11、NI-307.29B1、NI-307.43E8、NI-307.45E10、NI-307.47B11、NI-307.50H4、NI-307.53B11、NI-307.56A8、NI-307.57D4、NI-307.58C7、NI-307.59A7、NI-307.72F7、NI-307.72F10、NI-307.98D3、NI-307.98H1、NI-307.105A6和NI-307.105C7抗体，用VP1溶液或用在碳酸盐ELISA包被缓冲液(15mM Na2CO3,35mM NaHCO3,pH 9.4)或复性缓冲液中的被稀释成浓度为5μg/ml的BSA(Sigma-Aldrich，布克斯，瑞士)包被96孔微孔板(Costar，康宁，美国)。然后测试抗体的结合效率。示例性的NI-307.29B1、NI-307.43E8和NI-307.72F7抗体特异性地结合至来自JCV和BKV的VP1。抗体NI-307.7J3、NI-307.26A3、NI-307.27C2、NI-307.27C11、NI-307.45E10、NI-307.47B11、NI-307.50H4、NI-307.53B11、NI-307.56A8、NI-307.57D4、NI-307.58C7、NI-307.59A7、NI-307.72F10、NI-307.98D3、NI-307.98H1、NI-307.105A6和NI-307.105C7特异性地并只结合于来自JCV的VP1，而不结合至来自BKV的VP1。当组装VLP时，示例性的NI-307.7J3、NI-307.26A3、NI-307.27C2、NI-307.27C11、NI-307.29B1、NI-307.43E8、NI-307.47B11、NI-307.50H4、NI-307.53B11、NI-307.56A8、NI-307.57D4、NI-307.58C7、NI-307.59A7、NI-307.72F10、NI-307.98D3、NI-307.98H1、NI-307.105A6和NI-307.105C7抗体优先结合于JCV VP1；参见图7B。
实施例11：在溶液中结合于VLP和JCV的评估
为了确定示例性的NI-307.98D3、NI-307.44F6B和NI-307.11G6抗体在溶液中结合至VP1 VLP和JC病毒的能力，进行了流式细胞术测定。简言之，用VP1 VLP(在复性缓冲液中组装成VLP的重组VP1蛋白)或者用JCV(从感染的SVG-A细胞的上清液中纯化)在室温下孵育乳胶珠30分钟，以允许它们附着。然后洗涤珠并用示例性的抗体，接着用二抗孵育珠。通过流式细胞术来评估示例性的抗体与VP1 VLP或JCV的结合。
在溶液中示例性的NI-307.98D3、NI-307.44F6B和NI-307.11G6抗体能够结合于附着于乳胶珠的VP1 VLP，而同种型对照(不识别VP1的人IgG1)没有显示出任何信号；参见图9A。
在溶液中示例性的NI-307.98D3、NI-307.44F6B和NI-307.11G6抗体也能够结合于附着于乳胶珠的JCV，而同种型对照不显示出任何信号；参见图9B。
实施例12：示例性的抗体与PML相关的VP1突变体的结合
为了确定示例性的NI-307.11G6、NI-307.98D3、NI-307.27C11和NI-307.53B11抗体中和最常见的JCV变体的能力，测试抗体与VP1突变体的结合。
从具有PML的患者的CSF分离出的JC病毒通常在VP1序列内含有保守突变。因此，研究示例性抗体结合那些VP1突变体的能力是重要的。简言之，用快速变化的突变试剂盒在VP1序列内引入点突变。选择突变体以覆盖在PML患者的CSF中发现的最常见的JCV变体。构建的VP1突变体是VP1 L55F S269F、VP1 L55F S267F、VP1 L55F N265D和VP1GCN(N74S R75KT128A L158V K345R Q350缺失T351缺失，在具有颗粒细胞神经元病变的患者中发现的一种突变体)。用那些VP1突变体构建体来转染293TT，固定和转染后透化3天，并用示例性的NI-307.11G6、NI-307.98D3、NI-307.27C11和NI-307.53B11抗体进行染色。然后通过流式细胞仪来分析细胞，以确定示例性的抗体与VP1突变体的结合。
示例性的NI-307.11G6抗体结合于VP1 L55F S269F、VP1 L55F S267、VP1L55FN265D和VP1 GCN突变体，并且WT VP1.NI-307.11G6已知结合至JCV VP1上的区域333-LPGDPDM-339，其未在那些突变体中改变。
示例性的NI-307.98D3抗体结合至VP1 GCN突变体和WT VP1，但并没有显示出结合至VP1 L55F S269F、，VP1 L55F S267F和VP1 L55F N265D突变体。NI-307.98D3的结合表位是未知的，并且可以存在于引入其他突变的这个区域中。与被打乱的VLP相比，当VLP被正确地组装时，NI-307.98D3也显示出强烈地和优先地结合至VP1。这表明，其结合表位是构象的或不连续的，并且这样的表位将主要被呈现并可在正确组装的VLP中识别。这样引入的突变可能使VLP结构不稳定或改变VLP结构，因此阻断NI-307.98D3与这些突变体的结合或隐藏或修改表位。
示例性的NI-307.27C11抗体强烈地结合至VP1 GCN突变体和WT VP1并较少强烈地结合至VP1 L55F S269F、VP1 L55F S267F和VP1 L55F N265D突变体。示例性的NI-307.53B11抗体强烈地结合至VP1 L55F S269F、VP1 GCN突变体和WT VP1并较少强烈地结合至VP1 L55F S267F和VP1 L55F N265D突变体。示例性的NI-307.27C11和NI-307.53B11抗体的结合表位是未知的，并且可以存在于引起其他突变的这个区域中。当与被打乱的VLPs相比VLP被正确地组装时，NI-307.27C11和NI-307.53B11也显示出强烈地和优先地结合至VP1。这表明，其结合表位是构象的或不连续的，并且这样的表位将主要被呈现并且可在正确组装的VLP中识别。这样引起的突变可能使VLP结构不稳定或改变VLP结构，因此减少NI-307.27C11和NI-307.53B11与这些突变体的结合或隐藏或修改表位；参见图11。
示例性的NI-307.72F7和NI-307.72F10抗体强烈地结合至VP1 L55F S269F、VP1GCN突变体和WT VP1，并较少强烈地结合至VP1 L55F S267F和VP1 L55F N265D突变体。示例性的NI-307.29B1抗体强烈地结合至VP1 L55F S269F突变体和WT VP1并较少强烈地结合至VP1 L55F S267F、VP1 L55F N265D和VP1 GCN突变体。示例性的NI-307.56A8和NI-307.27C2抗体强烈地结合至VP1 L55F S269F、VP1 GCN突变体和WT VP1，并较少强烈地结合至VP1L55F N265D突变体。示例性的NI-307.44F6B抗体强烈地结合至VP1 L55F S269F、VP1 GCN突变体和WT VP1，并较少强烈地结合至VP1 L55F S267F突变体。示例性的NI-307.58C7和NI-307.98H1抗体强烈地结合于VP1 L55F S269F、VP1 GCN突变体和WT VP1。示例性的NI-307.50H4和NI-307.105A6抗体强烈地结合至VP1 GCN突变体和WT VP1并较少强烈地结合至VP1 L55F S269F、VP1 L55F S267F和VP1 L55F N265D突变体。示例性的NI-307.45E10、NI-307.105C7、NI-307.26A3、NI-307.7J3和NI-307.59A7抗体强烈地结合至VP1 GCN突变体和WT VP1。示例性的NI-307.47B11抗体强烈地结合至WT VP1并较少强烈地结合至VP1 L55FS267F、VP1 L55F S269F和VP1 GCN突变体。

Claims (33)

1.一种人单克隆抗体或其抗原结合片段，所述人单克隆抗体或其抗原结合片段能够结合至多瘤病毒和/或其抗原，所述人单克隆抗体为来自从人分离的抗体，所述多瘤病毒是JC病毒(JCV)或BK病毒(BKV)，并且在所述抗体或其抗原结合片段的可变区中包括：
(a)选自如下的VH和VL可变区的六个互补决定区(CDR)：
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(b)选自如下的VH和VL区的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:78和SEQ ID NO:80
(ii)SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:84
(iii)SEQ ID NO:90和SEQ ID NO:92
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(vi)SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:108
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(xviii)SEQ ID NO:154和SEQ ID NO:156
(xix)SEQ ID NO:158和SEQ ID NO:160。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够结合VP1蛋白或其片段。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够识别暴露在所述病毒的表面上的表位。
4.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段基本上不识别血清白蛋白。
5.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述血清白蛋白是牛血清白蛋白(BSA)。
6.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够相对于BKV优先结合至JCV或相对于JCV优先结合至BKV。
7.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段能够特异性地结合VP1表位，所述VP1表位包含氨基酸序列LPGDPDM(SEQ ID NO：85)、GQATHDN(SEQ ID NO：86)、MRYVDKYGQLQT(SEQ ID NO：87)或RVFEGTEELPG(SEQ ID NO：88)或由上述氨基酸序列组成。
8.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段识别进行性多灶性白质脑病(PML)相关的VP1突变体。
9.一种至少编码根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的免疫球蛋白链的可变区的结合域的多核苷酸。
10.一种载体，包含根据权利要求9所述的多核苷酸，与编码所述抗体或其抗原结合片段的其他免疫球蛋白链的可变区的根据权利要求9所述的多核苷酸结合。
11.一种包含根据权利要求9所述的多核苷酸或根据权利要求10所述的载体的宿主细胞。
12.一种用于制备结合至多瘤病毒和/或其抗原的抗体，或其一个或多个免疫球蛋白链的方法，所述方法包括：
(a)培养根据权利要求11所述的细胞；以及
(b)从培养物中分离所述抗体或其一个或多个免疫球蛋白链。
13.一种由根据权利要求9所述的多核苷酸编码的或通过根据权利要求12所述的方法获得的抗体。
14.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体被可检测性地标记。
15.根据权利要求14所述的抗体，其中，可检测标记选自由酶、放射性同位素、荧光团、肽和重金属组成的组。
16.根据权利要求1或2所述的抗体，所述抗体附着至药物。
17.一种包含根据权利要求1至8或13至16中任一项所述的抗体、根据权利要求9所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的载体或根据权利要求11所述的细胞的组合物，其中所述组合物
(a)是药物组合物并且还包含药学上可接受的载体，或
(b)诊断组合物，并且还包含常规用于基于免疫或基于核酸的诊断方法中的试剂。
18.根据权利要求17所述的组合物，所述组合物是疫苗。
19.根据权利要求17或18所述的组合物，还包含免疫调节剂。
20.根据权利要求1或2所述的抗体，用于制备用于预防性和治疗性治疗的药物或诊断组合物，所述预防性和治疗性治疗监测颗粒神经元的感染、深染核、颗粒细胞神经元病、脑病、多瘤诱导的肿瘤、免疫重建炎性综合征(IRIS)、出血性膀胱炎、肺炎、视网膜炎、结肠炎、脉管炎、间质性肾病、呼吸道的感染、JCV肾病、BKV肾病、Merkel细胞癌、毛发发育不良毛壅病或恶性胸膜间皮瘤的进展或对其治疗的反应。
21.根据权利要求1或2所述的抗体，用于制备用于预防性和治疗性治疗的药物或诊断组合物，所述预防性和治疗性治疗监测进行性多灶性白质脑病(PML)的进展或对其治疗的反应。
22.根据权利要求1或2所述的抗体，用于制备用于预防性和治疗性治疗的药物或诊断组合物，所述预防性和治疗性治疗监测脑自萎缩或脑膜炎的进展或对其治疗的反应。
23.根据权利要求10所述的载体，用于制备用于预防性和治疗性治疗的药物或诊断组合物，所述预防性和治疗性治疗监测颗粒神经元的感染、深染核、颗粒细胞神经元病、脑病、多瘤诱导的肿瘤、免疫重建炎性综合征(IRIS)、出血性膀胱炎、肺炎、视网膜炎、结肠炎、脉管炎、间质性肾病、呼吸道的感染、JCV肾病、BKV肾病、Merkel细胞癌、毛发发育不良毛壅病或恶性胸膜间皮瘤的进展或对其治疗的反应。
24.根据权利要求10所述的载体，用于制备用于预防性和治疗性治疗的药物或诊断组合物，所述预防性和治疗性治疗监测进行性多灶性白质脑病(PML)的进展或对其治疗的反应。
25.根据权利要求10所述的载体，用于制备用于预防性和治疗性治疗的药物或诊断组合物，所述预防性和治疗性治疗监测脑自萎缩或脑膜炎的进展或对其治疗的反应。
26.一种根据权利要求1或2所述的抗体，用于体内检测或将治疗剂和/或诊断剂靶向人体或动物体内的多瘤病毒。
27.根据权利要求26所述的抗体，其中，所述体内检测包括正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射断层扫描(SPECT)、近红外(NIR)、光学成像或磁共振成像(MRI)。
28.一种用于诊断或监测进行性多灶性白质脑病(PML)和/或伴随临床骨髓、肾和其他实体器官移植的移植排斥反应的进展的试剂盒，所述试剂盒包括根据权利要求1至8或13至16中任一项所述的至少一种抗体、根据权利要求9所述的多核苷酸、根据权利要求10所述的载体和/或根据权利要求11所述的细胞，连同试剂和/或使用说明书。
29.根据权利要求1所述的至少一种抗体，用于与免疫调节剂组合、同时或依次使用来治疗与多瘤病毒的激活相关的疾病。
30.根据权利要求1所述的至少一种抗体，用于与免疫调节剂组合、同时或依次使用来治疗与多瘤病毒的重激活相关的疾病。
31.根据权利要求19所述的组合物或根据权利要求29或30所述的抗体，其中，所述疾病是颗粒神经元的感染、深染核、颗粒细胞神经元病、脑病、多瘤诱导的肿瘤、免疫重建炎性综合征(IRIS)、出血性膀胱炎、肺炎、视网膜炎、结肠炎、脉管炎、间质性肾病、呼吸道的感染、JCV肾病、BKV肾病、Merkel细胞癌、毛发发育不良毛壅病或恶性胸膜间皮瘤，和/或所述免疫调节剂是那他珠单抗、依法珠单抗、利妥昔单抗、英夫利昔单抗、奥瑞珠单抗、阿仑单抗、贝伦妥单抗或维度汀。
32.根据权利要求19所述的组合物或根据权利要求29或30所述的抗体，其中，所述疾病是进行性多灶性白质脑病(PML)，和/或所述免疫调节剂是那他珠单抗、依法珠单抗、利妥昔单抗、英夫利昔单抗、奥瑞珠单抗、阿仑单抗、贝伦妥单抗或维度汀。
33.根据权利要求19所述的组合物或根据权利要求29或30所述的抗体，其中，所述疾病是脑自萎缩或脑膜炎，和/或所述免疫调节剂是那他珠单抗、依法珠单抗、利妥昔单抗、英夫利昔单抗、奥瑞珠单抗、阿仑单抗、贝伦妥单抗或维度汀。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10096038B2 (en) 2007-05-10 2018-10-09 Allstate Insurance Company Road segment safety rating system
US8606512B1 (en) 2007-05-10 2013-12-10 Allstate Insurance Company Route risk mitigation
US9932033B2 (en) 2007-05-10 2018-04-03 Allstate Insurance Company Route risk mitigation
ITTO20120570A1 (it) * 2012-06-27 2013-12-28 Pomona Ricerca Srl Anticorpo monoclonale diretto contro il virus jc
EP3517545A1 (en) 2012-12-31 2019-07-31 Neurimmune Holding AG Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases
US9355423B1 (en) 2014-01-24 2016-05-31 Allstate Insurance Company Reward system related to a vehicle-to-vehicle communication system
US10096067B1 (en) 2014-01-24 2018-10-09 Allstate Insurance Company Reward system related to a vehicle-to-vehicle communication system
US9390451B1 (en) 2014-01-24 2016-07-12 Allstate Insurance Company Insurance system related to a vehicle-to-vehicle communication system
US10796369B1 (en) 2014-02-19 2020-10-06 Allstate Insurance Company Determining a property of an insurance policy based on the level of autonomy of a vehicle
US9940676B1 (en) 2014-02-19 2018-04-10 Allstate Insurance Company Insurance system for analysis of autonomous driving
US10783587B1 (en) 2014-02-19 2020-09-22 Allstate Insurance Company Determining a driver score based on the driver's response to autonomous features of a vehicle
US9862760B2 (en) 2015-09-16 2018-01-09 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
US10269075B2 (en) 2016-02-02 2019-04-23 Allstate Insurance Company Subjective route risk mapping and mitigation
AU2017252574A1 (en) * 2016-04-22 2018-10-04 Acceleron Pharma Inc. ALK7 binding proteins and uses thereof
WO2019106578A2 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 Novartis Ag Polyomavirus neutralizing antibodies
WO2020257633A2 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Monoclonal antibodies against jc virus
PT4126932T (pt) 2020-06-09 2024-01-18 Univ Zuerich Moléculas de anticorpo anti-vírus b
CN114702580B (zh) * 2021-11-07 2023-06-27 吉林大学重庆研究院 特异性结合人血清白蛋白单克隆抗体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104520318A (zh) * 2012-06-27 2015-04-15 泼莫纳搜索有限公司 针对jc病毒的vp1蛋白的人单克隆抗体

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4741900A (en) 1982-11-16 1988-05-03 Cytogen Corporation Antibody-metal ion complexes
JP2532858B2 (ja) 1985-04-01 1996-09-11 セルテツク リミテツド 形質転換したミエロ―マ細胞系
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
EP0318554B2 (en) 1987-05-21 2005-01-12 Micromet AG Targeted multifunctional proteins
US5892019A (en) 1987-07-15 1999-04-06 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of a single-gene-encoded immunoglobulin
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
EP0362371A4 (en) 1988-04-15 1990-10-24 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
DE68921982T4 (de) 1988-06-14 1996-04-25 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
ZA902949B (en) 1989-05-05 1992-02-26 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
ES2087997T3 (es) 1990-01-12 1996-08-01 Cell Genesys Inc Generacion de anticuerpos xenogenicos.
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
EP0521985B1 (en) 1990-03-20 1997-09-24 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
ES2178635T3 (es) 1990-11-09 2003-01-01 Stephen D Gillies Inmunoconjugados de citoquinas.
MX9204374A (es) 1991-07-25 1993-03-01 Idec Pharma Corp Anticuerpo recombinante y metodo para su produccion.
NZ255101A (en) 1992-07-24 1997-08-22 Cell Genesys Inc A yeast artificial chromosome (yac) vector containing an hprt minigene expressible in murine stem cells and genetically modified rodent therefor
WO1994009817A1 (en) 1992-11-04 1994-05-11 City Of Hope Novel antibody construct
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
ES2088838T3 (es) 1992-11-13 2004-01-01 Idec Pharmaceuticals Corporation Secuencias kozak de consenso totalmente alteradas destinadas a la expresion en los mamiferos.
ATE390933T1 (de) 1995-04-27 2008-04-15 Amgen Fremont Inc Aus immunisierten xenomäusen stammende menschliche antikörper gegen il-8
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
GB9524973D0 (en) 1995-12-06 1996-02-07 Lynxvale Ltd Viral vectors
WO1998041645A1 (en) 1997-03-14 1998-09-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
EP1724282B1 (en) 1997-05-21 2013-05-15 Merck Patent GmbH Method for the production of non-immunogenic proteins
WO2000030680A1 (en) 1998-11-23 2000-06-02 Idec Pharmaceuticals Corporation Tumor antigen-specific antibody-gp39 chimeric protein constructs
JP2002534959A (ja) 1998-12-08 2002-10-22 バイオベーション リミテッド 免疫原性タンパク質の改変方法
CN1306272C (zh) 2000-11-17 2007-03-21 罗切斯特大学 筛选编码抗原特异性免疫球蛋白分子或其抗原特异性片段的方法
JP2005503109A (ja) 2001-01-29 2005-02-03 アイデック ファーマスーティカルズ コーポレイション 修飾抗体と使用方法
AU2002327164A1 (en) 2001-01-29 2002-12-09 Idec Pharmaceuticals Corporation Engineered tetravalent antibodies and methods of use
US20030157641A1 (en) 2001-11-16 2003-08-21 Idec Pharmaceuticals Corporation Polycistronic expression of antibodies
AU2004266159A1 (en) 2003-08-22 2005-03-03 Biogen Idec Ma Inc. Improved antibodies having altered effector function and methods for making the same
US20090062237A1 (en) * 2007-06-15 2009-03-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Evaluating immune competence
WO2009079481A2 (en) 2007-12-14 2009-06-25 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Methods to diagnose and immunize against the virus causing human merkel cell carcinoma
WO2010059543A1 (en) * 2008-11-20 2010-05-27 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation and characterization of anti-notch antibodies for therapeutic and diagnostic use
CN104316696A (zh) * 2009-02-05 2015-01-28 生物基因Idecma公司 用于检测jc多瘤病毒的方法
IT1399334B1 (it) * 2009-09-09 2013-04-16 Tognon Test elisa indiretto per l'identificazione nel siero e in altri fluidi umani di anticorpi contro il virus sv40 mediante l'uso di peptidi sintetici specifici della sua regione precoce, codificante per l'oncoproteina antigene t grande
HUE060312T2 (hu) * 2010-01-11 2023-02-28 Biogen Ma Inc A JC vírus antitestek vizsgálata
US20150065367A1 (en) * 2011-12-12 2015-03-05 Janssen Diagnostics Bvba Polyomavirus peptide sequences
ES2706173T3 (es) * 2012-03-20 2019-03-27 Biogen Ma Inc Anticuerpos de neutralización de JCV
EP3517545A1 (en) 2012-12-31 2019-07-31 Neurimmune Holding AG Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104520318A (zh) * 2012-06-27 2015-04-15 泼莫纳搜索有限公司 针对jc病毒的vp1蛋白的人单克隆抗体

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Anti-JCV Neutralizing Antibodies as a Potential Therapy for the Treatment of PML;Lyla Youssef，et al.;《 JOURNAL OF NEUROVIROLOGY》;20120531;第18卷(第S1期);第125页右栏
Characterization of the VP1 loop mutations widespread among JC polyomavirus isolates associated with progressive multifocal leukoencephalopathy;Zheng Huai Ying et al.;《Biochemical and biophysical research communications》;20050805;第333卷(第3期);996-1002

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