CN104520318A - 针对jc病毒的vp1蛋白的人单克隆抗体 - Google Patents
针对jc病毒的vp1蛋白的人单克隆抗体 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104520318A CN104520318A CN201380034401.2A CN201380034401A CN104520318A CN 104520318 A CN104520318 A CN 104520318A CN 201380034401 A CN201380034401 A CN 201380034401A CN 104520318 A CN104520318 A CN 104520318A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- jcv
- monoclonal antibody
- antibody
- disease
- albumen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 10
- 241000701460 JC polyomavirus Species 0.000 claims abstract description 59
- 206010036807 progressive multifocal leukoencephalopathy Diseases 0.000 claims abstract description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 32
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 21
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 16
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims description 14
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 8
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 claims description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 claims description 5
- 108010003723 Single-Domain Antibodies Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 5
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 abstract 1
- 101100069417 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) GRE1 gene Proteins 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 20
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 20
- 230000008859 change Effects 0.000 description 20
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 20
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 101100533701 Rattus norvegicus Smad1 gene Proteins 0.000 description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 9
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 241000829111 Human polyomavirus 1 Species 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 6
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 102100033195 DNA ligase 4 Human genes 0.000 description 5
- 101000927810 Homo sapiens DNA ligase 4 Proteins 0.000 description 5
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 2
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 206010025482 malaise Diseases 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005027 natalizumab Drugs 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 2
- -1 phenolic ester Chemical class 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 2
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 101100338052 Arabidopsis thaliana GTE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 102220616674 CCAAT/enhancer-binding protein alpha_I62A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241001269238 Data Species 0.000 description 1
- 208000016192 Demyelinating disease Diseases 0.000 description 1
- 206010012305 Demyelination Diseases 0.000 description 1
- XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N FLAG peptide Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XZWYTXMRWQJBGX-VXBMVYAYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 206010023163 JC virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241001631648 Polyomaviridae Species 0.000 description 1
- 101100221606 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) COS7 gene Proteins 0.000 description 1
- RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N Sulphur dioxide Chemical group O=S=O RAHZWNYVWXNFOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000798 anti-retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000011225 antiretroviral therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012490 blank solution Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 238000011262 co‐therapy Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 229960000284 efalizumab Drugs 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000005210 lymphoid organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 description 1
- 102200089550 rs869025616 Human genes 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
本发明涉及抗JC病毒的VP1蛋白的人中和单克隆抗体，该病毒是进行性多灶性白质脑病(PML)的原因，也涉及该单克隆抗体在JCV感染或与JCV感染相关联的疾病的治疗性或预防性处置中的应用，疾病如进行性多灶性白质脑病(PML)，并且涉及该单克隆抗体在JCV感染或与JCV感染相关联的疾病的诊断中的应用。
Description
技术领域
本发明在免疫学领域范围内，特别是抗(针对，direct against)病毒病原体的抗原的中和抗体领域。
更具体地，本发明涉及抗JC病毒(JCV)的VP1蛋白的单克隆抗体。
背景技术
JC病毒(JCV)是多瘤病毒科(Polyomaviridae)家族的人多瘤病毒，并且该病毒是引起极其严重的、通常致死的脱髓鞘疾病的原因，该疾病被指定为进行性多灶性白质脑病(progressive multifocal leukoencephalopathy，PML)。JC病毒具有无包膜的二十面体衣壳，该衣壳包封环状双链DNA基因组。衣壳主要成分是病毒蛋白VP1。在病毒粒子上完成的结构研究显示多瘤病毒衣壳由72个由VP1单体经C末端相连所形成的五聚体组成。VP1结合至靶细胞上的受体从而开始感染。
JC病毒感染超过85％的成年人。初次感染之后，JC病毒在肾和淋巴器官中保持静止。在健康的个体中，该病毒能够在肾小管细胞中复制并在尿中被排泻出，不引起任何疾病。然而，在严重免疫低下的情况下、在接受过器官移植的受试者中、在肿瘤患者中、在用基于新的单克隆抗体的免疫调节治疗的患者中或在患有AIDS的人群中，JC病毒可以蔓延到中枢神经系统并引起进行性多灶性白质脑病(PML)。在前cART(抗逆转录病毒联合疗法)时代，PML在HIV患者中的发病率范围为0.3％到8％，但是抗逆转录病毒治疗的广泛使用决定该病发病率的明显下降。HIV感染是免疫缺陷的原因，仍然非常频繁的与PML相关联，占病例的约80％，随后是血液性肿瘤(约8％)、实体瘤(约3％)、器官移植以及用免疫调节治疗的自身免疫疾病。
然而，在过去十年中，报道了越来越多的非HIV/AIDS相关联的PML病例。这些新病例中的许多都发生在经历过用最近可获得的药物的免疫疗法的个体当中。到2012年2月29日，记录了212个与那他珠单抗治疗有关的PML的病例，至于全世界，99571患有多发性硬化的患者用了该药品治疗。PML也与其他免疫调节疗法相关，包括依法利珠单抗、霉考酚酯和利妥昔单抗。
对于PML的治疗，尝试了数个治疗策略，这些治疗策略是导向针对不同的病毒复制周期阶段，如，例如，进入靶细胞以及基因组的复制。然而，它们中没有一个给出了显著的有益效果。基于PML与严重免疫低下病况之间的联系，也尝试了免疫学方法。例如，患有PML并具有更有利预后的患者显示出特征在于更强的JCV特异性细胞介导应答和体液应答。通过用JCV VP1蛋白免疫的动物(兔)血清的强的中和活性确认特异性抗JCV应答(特别是针对VP1)的潜在重要性(Goldmann C et al.Journal ofVirology，May 1999，pages 4465-4469)。
基于抗JCV抗体的替代疗法因此可以应用于患PML的患者的治疗。特别地，考虑到VP1蛋白在JCV感染的早期中的关键作用，最佳候选可以是针对JCV VP1蛋白的抗体。
现在，由本发明人满足了这样的需求，本发明人首次成功获得导向针对JCV VP1蛋白的完整人单克隆抗体，并且成功具有针对所述病毒的中和活性，这使得它们适合于在PML的治疗性处置(处理，治疗，treatment)中使用。
根据现有技术状态认为这些结果是新的和令人惊奇的，因为目前还没有描述过人抗JCV VP1单克隆抗体，更不用说(least of all)人抗JCV VP1中和单克隆抗体。
在先(supra)的Goldmann C et al.描述了超免疫血清，该超免疫血清具有由病毒样颗粒诱发的(evoke)、具有针对JCV的中和特性的兔抗VP1抗体。
日本专利申请JP9067397A提及用于获得中和抗JCV抗体的方法，该方法包括：用对应于VP1蛋白的一部分的合成肽免疫大鼠、从大鼠中收集免疫血清以及分离一部分γ球蛋白。在这个专利中，未提及单克隆抗体的选择，更不用说衍生自人的单克隆抗体。
指定为ab34756、由艾碧康()英国销售的抗JCV VP1单克隆抗体是用于通过ELISA和免疫印迹法(Western Blot)检测病毒的鼠科动物抗体，很明显不适合于治疗性应用，更不用说在人类中。
因此，现有技术的抗JCV抗体中没有一种潜在地适合于在人类患者中在JCV感染或与其相关的疾病的治疗性或预防性应用中使用。
同样应当指出的是，在本发明人完成测试前，本领域的技术人员不能预期获得能够中和JC病毒的完整人抗JCV单克隆抗体，因为没有可利用的科学出版物，其中在人体液应答中精确评估了中和抗JCV抗体的存在。举例来说，提及G.Bloomgren et al.N Engl J Med 2012；366:1870-80的论文，其中，作者提出在患有多发性硬化症患者中对PML的风险分层法。对于该风险分层法，作者提出三个风险因素，即：抗JCV抗体的存在或不存在、免疫抑制剂的在先使用以及用那他珠单抗治疗的时长，但是他们没有以任何方式提出或提及中和抗体在人体液应答中的存在的评估。另一方面，现有技术指出与在人类中检测体液抗JCV应答有关的技术问题，例如，在Raphael P.Viscidi and Barbara Clayman、Advances in experimentalmedicine and biology 2006；577():73-84和在Wendy A.Knowles、Advancesin experimental medicine and biology 2006；577():19-45中。
发明内容
因此，本发明的第一目的是针对JC病毒的VP1蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体的特征在于它是人抗体并且能够中和JC病毒的事实。
在本说明书的范围内，术语“单克隆抗体”旨在表示任何能够结合抗原的肽结构，在本案中，抗原是JCV VP1蛋白。因此该术语同时包括全长免疫球蛋白和功能性免疫球蛋白片段，其通常包含重链可变区和轻链可变区，但是可能也包含单可变区。具体的，但非限制的，功能性免疫球蛋白片段的实例是Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、单链抗体(scFv)以及单域抗体。单链抗体例如是根据Ladner et al.的专利US 4,946,778中描述的方法而构建。单链抗体包含通过柔性结合部分(接头(linker))所连接的轻链可变区和重链可变区。指定为单域抗体的抗体片段甚至比单链抗体还小，因为它包含单独的单VH域。用于获得具有与全长抗体至少部分相同的结合能力的单域抗体的技术，现有技术中已有描述并且在本领域普通技术人员的技术范围内。Ward et al.在"Binding Activities of a Repertoire ofSingle Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli、Nature 341:544-6中描述了一种用于获得对靶标表位具有足够强的亲和力从而以分离的形式结合于其上的抗体的重链可变区(VH单域抗体)的筛选方法。
如在本文描述中使用的，术语“免疫球蛋白”，包括以单体和聚合体形式的IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgM、IgD和IgE。
术语“中和JC病毒”或“能够中和JC病毒”表示本发明的目的单克隆抗体可以在复制周期的一个阶段中阻断JC病毒的复制周期，从而影响它的生物学活性以及与之相关联的至少一种疾病。
在优选的实施方式中，本发明的抗JCV单克隆抗体能够结合到JCVVP1蛋白的构象表位，该构象表位包含JCV VP1蛋白的一级序列(primarysequence)的至少一个氨基酸残基，该残基选自由以下组成的组：I62、S65、A127、D130、N131、A133和A175或它们的任何组合。在更具体的实施方式中，该构象表位包含JCV VP1蛋白的一级序列的氨基酸残基I62、S65、A127、D130、N131、A133和A175。
氨基酸残基的编号基于来自Mad1株(SEQ ID NO:7)的VP1蛋白的氨基酸序列的编号。SEQ ID NO:7可获自UniProtKB/Swiss-Prot数据文库(Swiss ID:P03089特征标识符：PRO_0000115021)。
术语“构象表位”旨在表示所有的氨基酸残基，即使在蛋白的一级序列中不连续，但其直接涉及与抗体的结合；或，即使突变免于改变蛋白的总体构象，但仍然影响抗体本身的结合亲和力。
进一步优选的实施方式中，本发明的单克隆抗体包含至少重链可变区和轻链可变区，其中重链可变区具有序列SEQ ID NO:1(或由序列SEQ IDNO:3编码)并且轻链可变区有序列SEQ ID NO:2(或由序列SEQ ID NO:4编码)。这样的特定的单克隆抗体也称为GRE1。
本发明的另一个方面是，如先前所定义的抗JC病毒的VP1蛋白的人单克隆抗体，用于在JCV感染或与JCV感染相关联的疾病、优选进行性多灶性白质脑病(PML)的治疗性或预防性处置中使用。
确定(identify)有效剂量并将本发明的单克隆抗体配制为适合于在本发明的范围内的使用的药物组合物在本领域普通技术人员的技能范围之内，无需过度的创造性努力。
因为其特征在于高敏感性和高特异性，本发明的单克隆抗体也适合于在诊断学领域中使用。该单克隆抗体表现出对来自Mad1株的重组VP1的高亲和力(约1nM)，并且以与商业鼠科动物抗体()相同浓度时，通过ELISA显示出高度提高的信号。甚至当通过在JCV感染的(Mad4株)COS-7细胞上的进行免疫荧光实验评估时，该抗体显示出比商业抗体更高的敏感性和特异性。此外，重点指出的是，通过ELISA，本发明的单克隆抗体显示出对重组BKV VP1(如JCV一样属于多瘤病毒科家族的病毒；JCV和BKV VP1显示出约75％的核苷酸序列同源性)无反应性，从而表明它对JCV VP1高度唯一地特异性。
因此，JCV感染的体外诊断方法以及用于诊断的相关试剂盒在本发明的范围之内，其中本发明的单克隆抗体用作JCV特异的诊断测试剂。
体外免疫诊断方法包括在本发明的单克隆抗体与JCV VP1抗原(如果在样品中存在)结合的适宜条件下用本发明的单克隆抗体接触来自疑似感染有JCV的患者的生物学样品的步骤，以及定性或定量检测本发明的单克隆抗体与JCV VP1抗原的结合的步骤。
例如，作为ELISA免疫酶试验或作为免疫荧光试验进行本发明的免疫诊断方法。进行试验的样品例如是血液、血浆、血清、尿液、脑脊液(cephalo-rachidic liquid)、活体组织切片或认为合适的任何其他生物学样品。
用于进行该方法的免疫诊断试剂盒包括：本发明的单克隆抗体作为特异性试剂、和进行该试验的说明以及最终将取决于试验类型而变化的其他成分，并且这些成分本身是本领域技术人员已知的。能够可选地包含在该试剂盒中的另外的成分的实例是用于定性的和/或定量的检测抗体与抗原之间的成功结合的方式、一种或多种固体支撑物(例如微量滴定板)、空白溶液、一种或多种包含已知量的感兴趣抗原的标准溶液、对照溶液，待测样品的稀释溶液、结合有可检测标志物(例如荧光分子)的检测抗体或结合有能够与底物反应形成可检测的产物的酶的检测抗体、缓冲洗涤液、包含该酶底物的溶液、停止溶液等。
本发明的方法和试剂盒可以有效地用于在具有不同倾向(predisposing)情况的患者中发展PML的风险分层(stratifying)。
具体实施方式
随后的实施例例证说明在本发明范围内的人中和单克隆抗体的识别和表征，以及由所述抗体识别的表位的表征。提供这些实施例仅以例证的方式说明随附权利要求中限定的本发明的范围，而没有限制目的。
实施例1
通过与先前描述的那些相似的方法(Plaisant,P.,et al.,Humanmonoclonal recombinant Fabs specific for HCV antigens obtained byrepertoire cloning in phage display combinatorial vectors.Res Virol，1997.148(2):p.165-9)在pPD噬粒载体中构建IgG1/k同种型的并且具有2x107个要素的预估规模的人抗体片段(单价Fab)的组合噬菌体展示文库。文库产生自一名68岁的男性老人的骨髓，该老人的血清通过ELISA检测出对于抗VP1/JCV抗体的存在呈阳性。通过在磷酸缓冲盐水(PBS)中用100ng/孔的重组JCV VP1蛋白(Mad1，)涂覆96孔板进行ELISA。数个血清稀释液一式两份的添加至VP1涂覆的板。将该板在37℃孵育1小时然后用0.1％的PBS/TWEEN 20洗涤。用结合(conjugate)有过氧化物酶(HRP)的抗人IgG1抗体()来检测结合的抗体。
如先前所描述的进行(Williamson、R.A.、et al.、Human monoclonalantibodies against a plethora of viral pathogens from single combinatoriallibraries.Proc Natl Acad Sci U S A，1993.90(9):p.4141-5)用于选择抗VP1抗体的噬菌体表达组合的抗体文库的生物淘选。简单地，在生物淘选周期的每一个中使用每毫升1012个噬菌体的浓度的噬菌体配制品(制剂，preparation)用于在涂覆有来自Mad1株的VP1的高结合ELISA板()上选择抗体。进行总共5个生物淘选周期并将从最后三个周期获得的噬菌体转入表达可溶Fab的噬粒系统。
将来自XL-1-blue株(Agilent)的、转化有Fab表达载体的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞用于生产选择的Fab分子用于进一步表征。简单地，通过由培养物的冻融程序获得Fab配制品。用转化的细菌接种5毫升的包含氨苄青霉素(50μg/ml；)的SB(超级肉汤)并在旋转搅拌器中37℃生长7小时。将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG、1mmol/l；)加入至生长的细菌，其进一步在30℃.孵育过夜。然后，将细胞离心、重悬于1毫升PBS/1％牛血清白蛋白(BSA)中，然后经历冻融程序(3轮)。通过在室温、在微型离心机(microfuge)中以13000g离心，细胞碎片被缩减(reduce)为沉淀，并且上层清液用于ELISA无需进一步处理。如先前所描述的进行ELISA。
通过ELISA针对JCV VP1产生OD450>0.8的克隆被认为是阳性的，并进一步表征。
分析了105个克隆，11个克隆检测呈阳性(10.5％)。证明了针对BSA的无反应性。
为了确认ELISA阳性克隆的特异性，通过在感染有Mad4JCV株的COS-7细胞(转化的非洲绿猴肾成纤维细胞)上的免疫荧光试验检测这些克隆。将结合有异硫氰酸荧光素酯(fluorescein isothiocyanate)()的山羊抗人Fab抗血清用作二级抗体。确认所有ELISA检测的阳性克隆能够结合感染的细胞，而用未感染细胞检测到无反应性。ELISA检测的阴性克隆不能与感染的细胞结合。
用旋转小量制备试剂盒(Spin Miniprep kit)()获得来自ELISA检测的阳性克隆的核酸并在373A测序仪()上测序。为了测序重链，使用引物SEQGz(5’-GTCGTTGACCAGGCAGCCCAG-3’)(SEQID NO:5)，其结合至(+)链。对于轻链，使用引物SEQKb(5’-ATAGAAGTTGTTCAGCAGGCA-3’)(SEQ ID NO:6)，其结合至(+)链。用BLAST和IMGT工具进行序列分析，并显示，所有的克隆，对于重链，均获自VH基因的相同亚家族(subfamily)，对于轻链，均获自Vk基因的相同亚家族，且共有相同的序列。此外，抗体的DNA序列是新的。应当重点指出的是文献中目前没有人类抗体被描述是导向针对JCV VP1蛋白。因此，这是首个描述的人抗JCV VP1单克隆抗体。由名称GRE1来识别该抗体。
为了测试该人抗VP1GRE1抗体的中和活性，将5x104/孔的COS-7细胞接种在24孔板()中的完全DMEM培养基中。COS-7是允许JCV感染的细胞。
第二天，将约100个病灶形成单位的JCV(Mad4株)加入100μl的GRE1的渐进(progressive)稀释液(二倍(two-fold)稀释，从约20μg/ml到约0.3μg/ml)。将混合物在37℃孵育1小时并加入至COS-7细胞。然后，将它们在37℃孵育2小时。用PBS洗涤一次后，将500μl新鲜的培养基加入每一个孔中并将这些细胞在37℃孵育6天。
中和活性的评估
通过免疫荧光法评估抗体的中和活性。简单地，感染后6天进行免疫荧光法。通过在室温下用甲醇/丙酮混合物(1:1比例)固定细胞15分钟并遵循厂商提供的指南通过使用商业鼠科动物抗VP1抗体(1μg/ml)作为一级抗体和FITC结合的鼠科动物抗Fab()作为二级抗体准备载玻片。
通过比较其中将病毒加入至GRE1的孔中的阳性细胞与在无抗体的情况下感染的细胞(100％感染)的数量完成评估。
也通过自动化荧光读取系统(IN Cell Analizer Sistem 1000,GEHealthcare)确认了荧光显微镜下观察到的数据，该自动化荧光读取系统能够自动地将阳性细胞与背景区分开，其表明作为Fab片段的抗体能够以1ng/μl的浓度抑制多于50％的JCV感染。
类似的实验同样在实验地证明了不是所有来自针对JCV VP1有反应的患者的血清都能够中和该病毒。
为了这个目的，用以1:400稀释(在PBS/1％BSA中稀释)的ELISA检测了100份血清来验证抗JCV抗体的存在。简言之，用25μL/孔的含有100ng的重组VP1()的溶液涂覆ELISA板()并在4℃孵育过夜。第二天，用水洗涤该板并用PBS-1％BSA(w/v)在37℃封闭一小时。然后，加入40μL的单一稀释(1:400在PBS/1％BSA中)的待检测的血清并且然后将板在37℃孵育一小时。完成用PBS-0.1％Tween 20()5次洗涤之后，通过用于ELISA微孔板的自动洗涤器(ETI-System Kasher，DiaSorin)，遵从厂商的指南，加入40μL/孔的商业辣根过氧化物酶结合的抗人IgG抗体()。然后将该板在37℃孵育45分钟。完成几次洗涤后，如先前所描述的，将40μL的底物(H2O2和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的1:1溶液，TMB底物试剂盒，ThermoScientific)加入每个孔，用于发生酶促反应。15分钟后，通过加入40μL/孔的1N的H2SO4(Carlo Erba)来封闭酶的活性并以450nm的波长用分光光度计(680型酶标仪，Bio-Rad)测量比色反应。
将BSA抗原或其他合适的抗原引入每个实验作为阴性对照，其O.D.450将用于检测可能的非特异反应性。
用中和试验分析了显示出针对JCV VP1反应性>1O.D.450的一些血清。简单的，感染的前一天，将5x104/孔COS-7细胞(允许JCV感染)接种在24孔板()中的完全DMEM培养基中。第二天，将200μL的包含JCV(Mad1)的培养基加入200μL的1:200稀释的待测血清中(血清的最终稀释则为1:400，与用于ELISA试验的相同)。在37℃孵育该混合物1小时，随后添加至COS7细胞。随后，它们在37℃孵育2小时。一次PBS洗涤之后，将500μl的新鲜培养基加入每个孔并将这些细胞在37℃孵育6天。
通过间接免疫荧光法评估检测的样品的中和活性。通过在室温下用甲醇/丙酮混合物(1:1比例)固定细胞15分钟并遵循厂商提供的指南通过使用商业鼠科动物抗VP1抗体(1μg/ml)作为一级抗体和FITC结合的鼠科动物抗Fab()作为二级抗体准备载玻片。
通过比较其中将病毒加入到检测的样品的孔中阳性细胞与在无样品的情况下感染的细胞(100％感染)的数量完成评估。
这个分析证明，尽管通过ELISA对VP1有反应性，不可忽略数量的血清显示出没有中和抗JCV活性。在图1的图表中图示说明该获得的结果。在图1的图表中，报道了一部分已检测的血清的中和活性的百分比。所有报道的血清均由ELISA证明针对VP1的反应性>1O.D.450。
活体组织切片样品上的免疫荧光法和免疫组织化学法
通过在免疫荧光和免疫组织化学试验中使用本发明的抗JCV VP1GRE1抗体，可以在活体组织切片样品中确定JCV的存在。这个抗体事实上显示出对JCV VP1蛋白的高敏感性和特异性，而相反表现出对BKV VP1无反应性。
活体组织切片样品可以是新鲜的或固定的或蜡化(paraffinized)样品。在固定的和蜡化样品的情况下，如果必要，按照标准流程将该样品去蜡化并恢复抗原性(antigenicity)。然后将该样品用GRE1(在PBS中10μg/ml)在37℃孵育30分钟。孵育期后，在PBS中洗涤该样品5次，然后遵照厂商的指南，用FITC结合的或辣根过氧化物酶结合的抗人Fab()在37℃孵育30分钟。在使用结合有辣根过氧化物酶的抗体的情况下，有必要加入底物(二氨基联苯胺、DAB底物试剂盒、Thermo Scientific)，在过氧化物酶存在时其产生棕色沉淀，该棕色沉淀使得能够可视化可能的抗体结合。
通过以下进行试验的评价：如果使用了FITC结合的抗体，则在荧光显微镜下或用自动荧光探测系统观察样品；或，如果使用辣根过氧化物酶结合的抗体，则通过光学显微镜或用自动成像系统观察样品。
用于检测生物学样品中的JCV的捕获ELISA
对于用人抗JCV VP1GRE1抗体进行ELISA，用25μL/孔的包含40ng的PBS中的绵羊抗人Fd抗体的溶液(1.6μg/ml的最终浓度)涂覆ELISA板()并在4℃孵育过夜。第二天，用水洗涤该板并用PBS-1％BSA(w/v)在37℃封闭1小时。然后，将40μL的GRE1(PBS/1％BSA中最终浓度约为4ng/μl)加入每个孔然后将该板在37℃孵育1小时。完成用PBS-0.1％Tween 20()5次洗涤之后，通过用于ELISA微孔板的自动洗涤器(ETI-System Kasher，DiaSorin)，将40μL的待测生物学样品的数个稀释液(连续10倍稀释，从未稀释开始最高达1:1000稀释)加入每个孔中。然后将该板在37℃孵育1小时。完成几次洗涤后，如先前所描述的，将40μL的1:1000稀释的商业鼠科动物抗VP1抗体(在PBS/BSA中稀释的)加入每个孔。将该板在37℃留置1小时。进一步洗涤后，加入40μL/孔的山羊抗体的多克隆配制品，其结合鼠科动物IgG的Fc部分并且结合有辣根过氧化物酶(在山羊中生产的抗小鼠IgG(Fc特异的)-辣根过氧化物酶抗体，)。将该板在37℃孵育45分钟。如先前所描述的，进行用PBS-Tween20的5次洗涤之后，将40μL的底物(H2O2和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的1:1溶液，TMB底物试剂盒，Thermo Scientific)加入每个孔，用于使酶促反应发生。约15分钟后，通过加入40μL/孔的1N的H2SO4(Carlo Erba)来封闭酶的活性并且以450nm的波长用分光光度计(680型酶标仪，Bio-Rad)测量比色反应。
将BSA抗原或其他适当的抗原引入每个实验作为阴性对照，其O.D.450用于检测可能的非特异反应性。
实施例2
定义由GRE1单克隆抗体识别的表位的(线性的或构象的)性质
为了定义由GRE1单克隆抗体识别的表位的(线性的或构象的)性质，用变性蛋白和野生型蛋白二者进行免疫印迹试验(Western Blot)和斑点印迹试验(Dot Blot)。
图2示出了在变性情况下免疫印迹的结果。用β-硫基乙醇(β-mer)或用十二烷基硫酸钠(SDS)使蛋白变性。商业鼠科动物抗体被指定为Abcam，而GRE1抗JCV VP1单克隆抗体被指定为GRE。
图3示出用变性的VP1和野生型构象的VP1二者进行的斑点印迹试验的结果。商业鼠科动物抗体被指定为Abcam，而GRE1抗JCV VP1单克隆抗体被指定为IgG GRE。
结果显示GRE1不能结合至变性形式的蛋白，而其仅能够识别未变性的蛋白。为证实这个事实，抗VP1线性表位的商业鼠科动物抗体(ab34756)反而能够识别两种蛋白形式。因此，这些结果产生如下结论：由GRE1单克隆抗体识别的表位是构象的表位。
定义GRE1单克隆抗体的特异性
在文献当中已广泛描述了BK病毒基因组(BKV)与JCV基因组(它们是能够感染人的主要的多瘤病毒)之间的高度核苷酸序列同源性(约70％)。
为了确定GRE1是否能够排他地识别JCV，通过针对重组JCV VP1蛋白(ab74569)以及针对重组BKV VP1蛋白的ELISA试验检测了其反应性。证明GRE1仅能够结合至JCV VP1蛋白，指示其绝对特异性。
由丙氨酸扫描定点诱变表征由GRE1单克隆抗体识别的表位
由ClustalX程序对齐JCV VP1和BKV VP1蛋白的氨基酸序列，从而识别带有这样的残基的部分：该残基显示出两个蛋白之间的深的(完全的，profound)差异(如电荷和极性)，以及，该残基可能是本发明的抗体具有对两个蛋白的结合差异的原因。通过这个分析识别了JCV和BKV VP1之间33个完全不同的(如电荷和极性)氨基酸残基。
为了定义涉及与GRE1单克隆抗体结合的决定性的VP1残基，将先前识别出的残基单独地突变成丙氨酸(或在原始残基为丙氨酸的情况下突变成甘氨酸)。简单的，在pcDNATM 3.1表达载体/V5-HisTA表达试剂盒(Life TechnologiesTM)上进行定点诱变，其中，已经预先克隆了编码来自Mad1株JCV的VP1蛋白的核苷酸序列。将用于诱变的引物设计成长度约30个核苷酸，并在5’端显示出15至20个核苷酸重叠区，通过这样的方法来获得有效的诱变产物。扩增反应后，用酶DpnI在37℃消化PCR产物4小时，以清除用作模板的甲基化的DNA。消化后，将1μL的扩增子用于转化电转感受态细胞。将一些转化的菌落分离并通过测序检查，以分析是否插入了期望的突变。然后将突变的VP1克隆到另一个表达载体(pCAGEN，Addgene#11160)中。
用pCAG-VP1mut载体转染HEK 293T(人类肾上皮)细胞，并通过FACS(荧光激活细胞分选仪)评估抗VP1抗体与这些突变的VP1的结合。简言之，用其中已经克隆了突变的VP1的4μg的载体转染HEK 293T细胞。离心并用4％的多聚甲醛固定后，在室温下用GRE1或针对羧基端线性序列的商业抗体孵育转染的细胞30分钟，抗体稀释在1μg/ml浓度的渗透溶液中。随后洗涤细胞，并遵循指南的指示()在室温下用抗人或抗鼠FITC结合的单克隆抗体孵育30分钟，其后由FACS分析。用未突变的VP1蛋白观察的反应性认为是100％结合，相反，将未转染的细胞用作阴性对照。
软件GraphPad Prism用于分析由FACS获得的数据并用于编辑图像。
通过FACS分析，可以观察到如果以下残基突变将会破坏结合：I62A、S65A、A127G、D130A、N131A、A133G、A175G(氨基酸残基编号基于Mad1株VP1的残基，其中，编号起始于位置1处的甲硫氨酸)(图4)。相反，这个分析中没有考虑在体外能够改变蛋白构象或严重减少蛋白表达的突变的残基。
先前已在文献中描述的以及提交在免费进入的RCSB-PDB数据文库(www.rcsb.org)中的、具有登录码3NXG晶体图像模型(crystallographicmodel)(www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do？structureId＝3NXG)被用于结构表征由GRE1识别的表位。这个模型的使用使得能够注意到，在单个单体上相远离、相反在五聚体形式中的两个邻近的单体上非常接近的、并且和涉及与唾液酸结合的蛋白质的部分绝对(完全，absolutely)邻近的残基。这些结构数据解释了GRE1的可观的中和活性。
获得的实验数据显示GRE1识别构象的、而不是线性的表位，表位包括至少以下残基：I62、S65、A127、D130、N131、A133、A175(氨基酸残基编号基于Mad1株VP1的残基，其中，编号起始于位置1处的甲硫氨酸)。
特别地，发现了如果突变就会破坏GRE1结合的这些残基非常接近于对于VP1蛋白和它的受体之间的结合重要的区域，并且这解释了GRE1的中和活性。
用于体外测定中和抗体在生物学样品中的存在的ELISA试验
为了确定中和抗体在生物学样品(特别地，但不排他地，在脑脊液、血清或血浆中)中的存在，在ELISA试验中使用了由GRE1(中和抗体)识别的表位。用两个策略完成快速有效的检测系统的建立：在其中的一个中，用样品和GRE1进行竞争性ELISA试验；在另一个中，将仍能够被中和抗体识别的VP1的最少的部分(包含原始蛋白的位置50到140之间的残基)来用作抗原。同样建立了后者试验的变体，其中，使待测的生物学样品在液相中与只突变了由GRE1识别的残基的VP1竞争，以更加有效的从反应中减去能够识别VP1部分，其与由GRE1识别的那些不同。
通过与GRE1单克隆抗体竞争VP1蛋白来体外测定中和抗体存在的
ELISA试验
为了将GRE1于待测生物学样品中的其他人类抗体区别开，通过与氨基酸序列DYKDDDDK的基因表达融合的方法标记GRE1，以由结合有辣根过氧化物酶()的商业单克隆抗体M2排他地识别。
用25μL/孔的含有300ng的重组的VP1(ab74569)的溶液涂覆ELISA板()并在4℃孵育过夜。第二天，用水洗涤该板并用PBS-1％BSA(w/v)在37℃封闭1小时。然后，加入40μL的待测样品的数个稀释(连续10倍稀释，从未稀释开始最高达1:1000的稀释)并随后将该板在37℃孵育1小时。其后，将40μL的GRE1抗JCV VP1抗体(在PBS/1％BSA中最终浓度约为1ng/μL)连同各样品稀释物加入每个孔，并将该板在37℃孵育1小时。完成用PBS-0.1％Tween 20()5次洗涤之后，通过用于ELISA微孔板的自动洗涤器(ETI-System Kasher，DiaSorin)，加入40μL/孔的商业辣根过氧化物酶结合的M2抗体()。然后将该板在37℃孵育45分钟。完成几次洗涤后，如先前表明的，将40μL的底物(H2O2和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的1:1溶液、TMB底物试剂盒、Thermo Scientific)加入每个孔，用于使酶促反应发生。15分钟后，通过加入40μL/孔的1N的H2SO4(Carlo Erba)来封闭酶的活性并以450nm的波长用分光光度计(680型酶标仪，Bio-Rad)来测量比色反应。
将BSA抗原或其他适当的抗原引入每个实验作为阴性对照，其O.D.450用于检测可能的非特异反应性。
观察其中加入单克隆抗体连同待测生物学样品的不同稀释物的孔以及其中仅加入单克隆抗体的孔中检测的吸光度的差别来估计GRE1结合的抑制。
特别地，如果其中加入单克隆抗体连同待测生物学样品的不同稀释物的孔中的吸光度低于用单独的单克隆抗体观察到的吸光度，则GRE1与样品中抗体之间存在对VP1上的表位结合的竞争，从而表明样品中JCV-GRE1样抗体的存在，以及因此中和以及保护性抗体的存在。
用于体外测定生物学样品中能够识别由GRE1单克隆抗体结合的相同
表位的抗体的存在的ELISA试验
为了确定包含由GTE1单克隆抗体识别的表位的VP1的最小部分，并且该部分仍保留构象的特征，用DNA酶消化编码来自Mad1株JCV的VP1的核苷酸序列以获得随机切割的VP1序列。将各种VP1部分克隆在噬粒中以通过针对GRE1的生物淘选来选择仍然能够由该单克隆抗体识别的VP1部分。一旦确定仍由GRE1识别的部分，则由特定的软件经由电脑模拟(in silico)分析该片段以确定构象和可能地将其与全长VP1蛋白的构象相比较。
考虑到该预测的结果，在细菌表达载体pET15b中，与6xHis-标签以及凝血酶切割位点(pETminiVP1)在框内(in frame)克隆所选择的编码由GRE1识别的最小部分的、并且包含原始蛋白的位置50到140之间残基的核苷酸序列。将限制性位点XhoI和BamHI(存在于载体的克隆区域中，但不存在于VP1中)用于克隆。为了这个目的，通过在5’端和3’端分别插入XhoI和BamHI限制性位点，通过PCR扩增感兴趣的VP1区域。在氨苄青霉素抗性的基础上并且通过序列分析完成包含pETminiVP1的菌落的选择。
对于该片段的纯化，将一个含有pETminiVP1的菌落接种在10ml的具有50μg/mL氨苄青霉素的LB中，并在37℃生长过夜。第二天，将5ml的培养物进一步接种在500ml的具有50μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中。用分光光度计以规律间隔分析该培养物来检测细菌生长。当该培养物到达0.6-1的OD600时，将0.4mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)加入该培养基然后将其留在室温下搅拌过夜。
第二天，将细菌培养物以3900rcf离心15分钟，然后将细菌沉淀重悬在20ml的缓冲液A(50mM Tris(三异丙基乙磺酰)pH 7.5、5％丙三醇、250mM NaCl、3mM咪唑)中。然后通过使用超声波仪裂解细胞。将该悬浮液以12,000rcf离心45分钟并用0.4μm的过滤器过滤来清除细菌碎片。
然后通过在镍柱上亲和色谱纯化片段。在将样品应用于柱之前，用3体积的缓冲液A、3体积的缓冲液B(20mM Tris pH 7.5、5％丙三醇、250mMNaCl、500mM咪唑)洗涤树脂，并用8体积的缓冲液A再平衡。这时，将样品在柱上运行。用50ml的缓冲液A洗涤该柱去除未结合的样品，并用0％-100％梯度的缓冲液B洗脱样品。洗脱后，使用缓冲液A再平衡该柱。一旦浓缩，用凝血酶消化片段以便清除可以影响该待测生物学样品的组氨酸尾巴。为了清除可以影响纯化的片段的可能应用的洗脱缓冲液的痕迹，将缓冲液对PBS透析。由12％的SDS凝胶分析该片段的质量和浓度，该片段从现在起将称为miniVP1。
对于ELISA，用25μL/孔的含有300ng的miniVP1片段(如先前描述产生的)的溶液涂覆96孔板()，并在4℃孵育过夜。第二天，用水洗该板并用PBS-1％BSA(w/v)在37℃封闭1小时。
当完成板的孵育时，加入40μL的待测样品的数个稀释(连续10倍稀释，从未稀释开始最高达1:1000的稀释)，并将该板在37℃孵育1小时。完成用PBS-0.1％Tween 20()5次洗涤之后，通过用于ELISA微孔板的自动洗涤器(ETI-System Kasher，DiaSorin)，加入40μL/孔的结合人IgG的Fc部分的辣根过氧化物酶结合的山羊抗体的多克隆配制品。将该板在37℃孵育45分钟。如先前所描述的，进行用PBS-0.1％Tween 20的5次洗涤之后，将40μL底物(H2O2和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的1:1溶液，TMB底物试剂盒，Thermo Scientific)加入每个孔，用于使酶促反应发生。15分钟后，通过加入40μL/孔的1N的H2SO4(Carlo Erba)封闭酶的活性，并以450nm的波长用分光光度计(680型酶标仪，Bio-Rad)来测量比色反应。
将BSA抗原或其他适当的抗原引入每个实验作为阴性对照，其O.D.450用于检测可能的非特异的反应性。将1ng/μL的最终浓度的GRE1单克隆抗体用作阳性对照。
与BSA相比，对miniVP1显示出更高反应性的样品被认为是阳性的，并因此包含具有中和活性进而保护性活性的JCV-GRE1样抗体。
用于体外测定生物学样品中能够识别由GRE1单克隆抗体结合的相
同表位的抗体(具有由突变的VP1竞争的变体)的存在的ELISA试验
为了增强先前试验的严谨性，通过增加用在对于GRE1与蛋白的结合重要的残基上突变了的VP1预孵育待测样品的步骤建立了另一个版本的实验。
为了获得在GRE1结合位点上修饰了的VP1蛋白，并且其之后将在生物学样品中通过去选择抗体而起作用，通过进行以下一些改变来使用定点诱变策略：既然有些残基非常接近于诱变处理，一些残基被同时突变。首先，通过使用以下引物突变残基I62和S65：Fw：5’-gttttagtaagcaGCa 62I/A tctataGca 65S/A gatac-3’(SEQ ID NO:8)以及作为反向的5’-tgacttactaaaacccctaagatgctcatctgg-3’(SEQ ID NO:9)。其中已预先克隆有来自Mad1株JCV的VP1的载体pcDNATM 3.1/V5-His表达试剂盒(Life Technologies)用作模板。通过PCR获得同样包含突变的蛋白的扩增产物。为了除去用于反应的DNA模板(该模板当然不会包含期望的突变)，在37℃用DpnI消化该反应产物4小时。其后，用2μL的预先处理过的扩增产物转化电转感受态细胞。在氨苄青霉素耐受性的基础上选择包含该质粒的细胞，然后通过序列分析核对。将在第一次扩增反应中显示出突变插入的载体用作第二次扩增反应的模板，其中位置127A、130D、131N和133A被突变。为了插入这些突变，将5’-cactctaatgggcaagGa 127A/G actcatgCc 130D/A GCt 131N/A ggtgGa 133A/G ggg-3’(SEQID NO:10)用作Fw引物，以及5’-cttgcccattagagtgcacattcatcaaac-3’(SEQ IDNO:11)作为反向引物。用DpnI在37℃消化PCR产物4小时。其后，用2μL的预先处理过的扩增产物转化电转感受态细胞。在氨苄青霉素耐受性的基础上选择包含该质粒的细胞，然后通过序列分析核对。在细菌表达载体pET15b中，将通过序列分析示出所有插入突变的VP1与6xHis-标签以及凝血酶切割位点在框内克隆(pET-VP1mut)。然后用与用于纯化miniVP1相同的方案来纯化突变的VP1(VP1mut)。
对于ELISA，用25μL/孔的含有300ng的miniVP1(如先前所描述的产生的)的溶液涂覆96孔板()，并在4℃孵育过夜。第二天，用水洗该板并用PBS-1％BSA(w/v)在37℃封闭1小时。同时，用待测生物学样品的数个稀释(连续10倍稀释，从未稀释开始最高达1:1000稀释)预孵育50μg/mL的突变的VP1，然后在37℃孵育30分钟。当完成板的孵育时，加入40μL的各种血清稀释物(或其他生物学样品)与突变的VP1的混合物，并将该板在37℃孵育1小时。完成用PBS-0.1％Tween20()5次洗涤之后，通过用于ELISA微孔板的自动洗涤器(ETI-System Kasher，DiaSorin)，加入40μL/孔的结合人IgG的Fc部分()的辣根过氧化物酶结合的山羊抗体的多克隆配制品。将该板在37℃孵育45分钟。如先前所描述的，进行用PBS-0.1％Tween 20的5次洗涤之后，将40μL的底物(H2O2和3,3',5,5'-四甲基联苯胺的1:1溶液，TMB底物试剂盒，Thermo Scientific)加入每个孔，用于使酶促反应发生。15分钟后，通过加入40μL/孔的1N的H2SO4(Carlo Erba)来封闭酶的活性，并以450nm的波长用分光光度计(680型酶标仪，Bio-Rad)来测量比色反应。
将BSA抗原或其他适当的抗原引入每个实验作为阴性对照，其O.D.450用于检测可能的非特异的反应性。将1ng/μL的最终浓度的GRE1单克隆抗体用作阳性对照。
与BSA相比，认为对miniVP1显示出更高反应性的样品是阳性的，进而包含具有中和活性、进而保护性活性的JCV-GRE1样抗体。
Claims (17)
1.一种抗JC病毒的VP1蛋白的单克隆抗体，其特征在于以下事实，所述单克隆抗体是人抗体并且能够中和所述JC病毒。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体能够结合至JCVVP1蛋白的构象表位，所述构象表位包含选自由以下组成的组的至少一个JCV VP1蛋白的一级序列的氨基酸残基：I62、S65、A127、D130、N131、A133、A175和它们的任何组合。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其中，所述JCV VP1蛋白的所述构象表位包含所述JCV VP1蛋白的所述一级序列的氨基酸残基I62、S65、A127、D130、N131、A133和A175。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体是选自由以下组成的组的全长免疫球蛋白或功能性免疫球蛋白片段：Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、单链抗体(svFv)和单域抗体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体包含至少重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区具有序列SEQ ID NO:1并且所述轻链可变区具有序列SEQ ID NO:2；或所述重链可变区由序列SEQ ID NO:3编码并且所述轻链可变区由序列SEQ ID NO:4编码。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体，用于在JCV感染或与JCV感染相关联的疾病的治疗性或预防性处置中使用。
7.用于根据权利要求6使用的单克隆抗体，其中，与JCV感染相关联的所述疾病是进行性多灶性白质脑病(PML)。
8.一种药物组合物，包含根据权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，用于在JCV感染或与JCV感染相关联的疾病的治疗性或预防性处置中使用。
10.用于根据权利要求9使用的药物组合物，其中，与JCV感染相关联的所述疾病是进行性多灶性白质脑病(PML)。
11.一种诊断JCV感染或与JCV感染相关联的疾病的体外方法，所述方法包括在单克隆抗体与如果存在于样品中的JCV VP1抗原结合的适宜条件下用根据权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体接触来自疑似感染有JCV的患者的生物学样品的步骤，以及定性或定量检测所述单克隆抗体与所述JCV VP1抗原的结合的步骤，这样的结合表明JCV感染或与JCV感染相关联的疾病。
12.根据权利要求11所述的方法，其中与JCV感染相关联的所述疾病是进行性多灶性白质脑病(PML)。
13.根据权利要求11或12所述的方法，所述方法是免疫ELISA试验或免疫荧光试验或免疫组织化学试验。
14.一种用于诊断JCV感染或与JCV感染相关联的疾病的免疫诊断试剂盒，所述试剂盒包括：根据权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体以及用于进行体外免疫诊断方法的说明。
15.根据权利要求14所述的免疫诊断试剂盒，其中，所述体外免疫诊断方法是根据权利要求11至13中任一项所述的方法。
16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其中，所述与JCV感染相关联的疾病是进行性多灶性白质脑病(PML)。
17.一种对于患有JCV感染的人类患者中的JCV病毒的中和方法，所述方法包括给予所述人类患者有效量的根据权利要求1至5中任一项所述的单克隆抗体。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITTO2012A000570 | 2012-06-27 | ||
| IT000570A ITTO20120570A1 (it) | 2012-06-27 | 2012-06-27 | Anticorpo monoclonale diretto contro il virus jc |
| PCT/IB2013/055257 WO2014002035A2 (en) | 2012-06-27 | 2013-06-26 | A human monoclonal antibody against the vp1 protein of jc virus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104520318A true CN104520318A (zh) | 2015-04-15 |
| CN104520318B CN104520318B (zh) | 2017-12-15 |
Family
ID=46690644
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380034401.2A Active CN104520318B (zh) | 2012-06-27 | 2013-06-26 | 针对jc病毒的vp1蛋白的人单克隆抗体 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US10011648B2 (zh) |
| EP (1) | EP2867257B1 (zh) |
| JP (1) | JP6320375B2 (zh) |
| KR (1) | KR102085305B1 (zh) |
| CN (1) | CN104520318B (zh) |
| BR (1) | BR112014032682B1 (zh) |
| CA (1) | CA2877598C (zh) |
| EA (1) | EA029346B1 (zh) |
| ES (1) | ES2673230T3 (zh) |
| IT (1) | ITTO20120570A1 (zh) |
| MX (1) | MX356745B (zh) |
| WO (1) | WO2014002035A2 (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104936980A (zh) * | 2012-12-31 | 2015-09-23 | 生物控股有限公司 | 用于治疗和预防多瘤病毒相关的疾病的重组人抗体 |
| CN108026166A (zh) * | 2015-09-16 | 2018-05-11 | 诺华股份有限公司 | 多瘤病毒中和抗体 |
| CN111417651A (zh) * | 2017-12-01 | 2020-07-14 | 诺华股份有限公司 | 多瘤病毒中和抗体 |
| CN111732654A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-10-02 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1E10 |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ITTO20120570A1 (it) * | 2012-06-27 | 2013-12-28 | Pomona Ricerca Srl | Anticorpo monoclonale diretto contro il virus jc |
| JP2018203632A (ja) * | 2017-05-30 | 2018-12-27 | 公益財団法人ヒューマンサイエンス振興財団 | モノクローナル抗体及び測定キット |
| CA3142000A1 (en) * | 2019-06-19 | 2020-12-24 | Icahn School Of Medicine At Mount Sinai | Monoclonal antibodies against jc virus |
| CN118047865A (zh) * | 2024-04-15 | 2024-05-17 | 北京市农林科学院 | 一种牛早幼粒细胞白血病蛋白单克隆抗体及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6238859B1 (en) * | 1995-11-22 | 2001-05-29 | Deutsches Primatenzentrum | Virus protein antigens of the JC virus |
| US20040259767A1 (en) * | 2001-11-22 | 2004-12-23 | Kazuo Nagashima | Treatment of pml targeting jc virus agno |
| JP3767755B2 (ja) * | 1995-06-23 | 2006-04-19 | エーザイ株式会社 | 抗ｊｃウイルス抗体 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| PL2828284T3 (pl) * | 2012-03-20 | 2019-11-29 | Biogen Ma Inc | Przeciwciała neutralizujące wirus jc |
| DK2828292T3 (da) * | 2012-03-20 | 2019-01-02 | Biogen Ma Inc | Jcv-neutraliserende antistoffer |
| ITTO20120570A1 (it) * | 2012-06-27 | 2013-12-28 | Pomona Ricerca Srl | Anticorpo monoclonale diretto contro il virus jc |
| JP6407165B2 (ja) * | 2012-12-31 | 2018-10-17 | ニューリミューン ホールディング エイジー | ポリオーマウイルス関連疾患の治療および防止のための組換えヒト抗体 |
-
2012
- 2012-06-27 IT IT000570A patent/ITTO20120570A1/it unknown
-
2013
- 2013-06-26 MX MX2014015850A patent/MX356745B/es active IP Right Grant
- 2013-06-26 ES ES13785909.6T patent/ES2673230T3/es active Active
- 2013-06-26 EA EA201590111A patent/EA029346B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2013-06-26 CA CA2877598A patent/CA2877598C/en active Active
- 2013-06-26 WO PCT/IB2013/055257 patent/WO2014002035A2/en active Application Filing
- 2013-06-26 CN CN201380034401.2A patent/CN104520318B/zh active Active
- 2013-06-26 US US14/410,896 patent/US10011648B2/en active Active
- 2013-06-26 BR BR112014032682-7A patent/BR112014032682B1/pt not_active IP Right Cessation
- 2013-06-26 EP EP13785909.6A patent/EP2867257B1/en active Active
- 2013-06-26 KR KR1020157002126A patent/KR102085305B1/ko active IP Right Grant
- 2013-06-26 JP JP2015519447A patent/JP6320375B2/ja active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3767755B2 (ja) * | 1995-06-23 | 2006-04-19 | エーザイ株式会社 | 抗ｊｃウイルス抗体 |
| US6238859B1 (en) * | 1995-11-22 | 2001-05-29 | Deutsches Primatenzentrum | Virus protein antigens of the JC virus |
| US20040259767A1 (en) * | 2001-11-22 | 2004-12-23 | Kazuo Nagashima | Treatment of pml targeting jc virus agno |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LYLA YOUSSEF，ET AL.: "Anti-JCV Neutralizing Antibodies as a Potential Therapy for the Treatment of PML", 《JOURNAL OF NEUROVIROLOGY》 * |
| P. PLAISANT,ET AL.: "Human monoclonal recombinant Fabs specific", 《RES. VIRAL.》 * |
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104936980A (zh) * | 2012-12-31 | 2015-09-23 | 生物控股有限公司 | 用于治疗和预防多瘤病毒相关的疾病的重组人抗体 |
| CN104936980B (zh) * | 2012-12-31 | 2019-06-07 | 生物控股有限公司 | 用于治疗和预防多瘤病毒相关的疾病的重组人抗体 |
| US10450365B2 (en) | 2012-12-31 | 2019-10-22 | Neurimmune Holding Ag | Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases |
| US11608372B2 (en) | 2012-12-31 | 2023-03-21 | Neurimmune Holding Ag | Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases |
| CN108026166A (zh) * | 2015-09-16 | 2018-05-11 | 诺华股份有限公司 | 多瘤病毒中和抗体 |
| CN108026166B (zh) * | 2015-09-16 | 2021-10-08 | 诺华股份有限公司 | 多瘤病毒中和抗体 |
| CN113929771A (zh) * | 2015-09-16 | 2022-01-14 | 诺华股份有限公司 | 多瘤病毒中和抗体 |
| US11639378B2 (en) | 2015-09-16 | 2023-05-02 | Novartis Ag | Polyomavirus neutralizing antibodies |
| CN111417651A (zh) * | 2017-12-01 | 2020-07-14 | 诺华股份有限公司 | 多瘤病毒中和抗体 |
| CN111417651B (zh) * | 2017-12-01 | 2023-09-29 | 诺华股份有限公司 | 多瘤病毒中和抗体 |
| CN111732654A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-10-02 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | 一种抗SARS-CoV-2的单克隆抗体1E10 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20150191530A1 (en) | 2015-07-09 |
| JP6320375B2 (ja) | 2018-05-09 |
| EA029346B1 (ru) | 2018-03-30 |
| EP2867257A2 (en) | 2015-05-06 |
| EA201590111A1 (ru) | 2015-04-30 |
| MX2014015850A (es) | 2015-08-20 |
| KR102085305B1 (ko) | 2020-03-05 |
| CA2877598C (en) | 2021-10-19 |
| EP2867257B1 (en) | 2018-03-14 |
| CA2877598A1 (en) | 2014-01-03 |
| BR112014032682A2 (pt) | 2017-08-01 |
| CN104520318B (zh) | 2017-12-15 |
| MX356745B (es) | 2018-06-12 |
| ES2673230T3 (es) | 2018-06-20 |
| KR20150023893A (ko) | 2015-03-05 |
| WO2014002035A3 (en) | 2014-02-27 |
| US10011648B2 (en) | 2018-07-03 |
| WO2014002035A2 (en) | 2014-01-03 |
| ITTO20120570A1 (it) | 2013-12-28 |
| BR112014032682B1 (pt) | 2020-10-27 |
| JP2015524389A (ja) | 2015-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104520318A (zh) | 针对jc病毒的vp1蛋白的人单克隆抗体 | |
| CN111748033B (zh) | 一种与新型冠状病毒np蛋白结合的分离抗体、包含其的检测试剂盒 | |
| KR102671155B1 (ko) | Ns1 단백질의 결합 단백질 | |
| JP2023529417A (ja) | アデノ関連ウイルス抗体及びそのフラグメント | |
| Chen et al. | Synthetic antibodies and peptides recognizing progressive multifocal leukoencephalopathy-specific point mutations in polyomavirus JC capsid viral protein 1 | |
| AU2021277373A1 (en) | Potent neutralizing antibodies against SARS-CoV-2, generation and uses thereof | |
| CN109593130B (zh) | 乙型肝炎病毒前s1抗原特异性单链抗体及其应用 | |
| KR102029394B1 (ko) | 치쿤구니아 바이러스 감염 진단용 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 이를 이용한 치쿤구니아 바이러스 감염 진단 방법 | |
| US20210395394A1 (en) | Antibody against pan-species-specific plasmodium lactate dehydrogenase | |
| KR20210068067A (ko) | 인간 심장 트로포닌 i에 대한 재조합 항체 | |
| CN113004397B (zh) | 特异性结合新型冠状病毒np蛋白的抗体 | |
| CN111434686B (zh) | 一种抗人pbx1单克隆抗体，其制备方法及其在复发性流产临床诊断中的用途 | |
| EP4194054A1 (en) | Camelid antibodies for use in therapy and diagnosis | |
| CN112646029B (zh) | 成熟脑源性神经营养因子的抗体及其应用和诊断试剂盒 | |
| WO2019156223A1 (ja) | チクングニアウイルスに対する抗体またはその抗原結合断片、およびその用途 | |
| WO2023285620A2 (en) | Compositions and methods for targeting viral proteins | |
| WO2023104933A1 (en) | Camelid antibodies for use in therapy and diagnosis | |
| EP4178979A1 (en) | Anti-human immunodeficiency virus-1 antibodies and methods for uses thereof | |
| JP6440968B2 (ja) | ＩｇＳＦ４／ＴＳＬＣ１／ＣＡＤＭ１を特異的に認識できる抗体 | |
| CN114437205A (zh) | 抗冠状病毒抗体及其应用 | |
| WO2008087254A2 (en) | Method for detection of human immunodeficiency virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |