JP2023529417A - アデノ関連ウイルス抗体及びそのフラグメント - Google Patents

Abstract

本開示は、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質のエピトープに特異的に結合することが可能な単離された抗ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）抗体又はその抗原結合フラグメント、及びそれらの使用に関する。本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質のエピトープに結合するマウス、ヒト化又はキメラ抗体に関する。より具体的には、本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質のエピトープに特異的に結合することが可能な、単離された抗ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、エピトープは、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）又はその一部を含む。

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２０年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０３８，９５７号の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での優先権を主張するものであり、その内容は、本明細書により、参照により本願中に組み入れられる。
電子的に提出された配列表への参照。

本願とともに出願された、ＡＳＣＩＩテキストファイルの電子的に提出された配列表（名称：８１７６ＷＯ００＿ＳＬ；サイズ：５４キロバイト；及び作成日：２０２１年５月２５日）の内容は、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。

アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、非エンベロープ一本鎖ＤＮＡパルボウイルスの一種（約２５ｎｍ）である。ＡＡＶは、特徴、例えば異なる組織の異なる型の分裂細胞及び非分裂細胞に形質導入するそれらの能力ならびに安定した長期導入遺伝子発現を確立するそれらの能力などのため、遺伝子導入のための魅力的な媒体となっている。さらに、ＡＡＶは、ヒトにおいて天然には病原性を示さない。同定されている１００を上回るヒト及び非ヒト霊長類ＡＡＶがあり、カプシドアミノ酸配列において５１％～９９％の間の同一性を有する１２の血清型を含む。

ＡＡＶカプシドタンパク質は組織指向性を決定し、このように、標的組織とＡＡＶベクターの間での一次界面である。しかし、遺伝子治療において使用される一部のＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質の構造及びアミノ酸配列における類似性に起因して、一つのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質を認識する抗体は、他のＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質と交差反応する。特に、ＡＡＶｒｈ７４を他の血清型のＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９から区別又は特異的に同定することができる抗体についてのニーズがある。また、ＡＡＶｒｈ７４での遺伝子治療を受けている患者の血清中のＡＡＶｒｈ７４特異的抗体のレベルを測定又は定量化する信頼できる方法についての必要性がある。

本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質のエピトープに結合するマウス、ヒト化又はキメラ抗体に関する。より具体的には、本開示は、ＡＡＶカプシドタンパク質のエピトープに特異的に結合することが可能な、単離された抗ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、エピトープは、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）又はその一部を含む。別の態様では、本発明は、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質のエピトープに結合するマウス、ヒト化又はキメラ抗体に関し、ここで、エピトープは、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）又はその一部を含む。一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体である。別の実施形態では、カプシドタンパク質はＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質である。一実施形態では、抗体は抗ＡＡＶ抗体である。

本開示はさらに、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質内のエピトープに特異的に結合する、単離された抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、抗体は、エピトープへの結合について参照抗体と競合し、ここで、（ａ）参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ならびに（ｂ）参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本開示はまた、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、（ａ）ＶＨ ＣＤＲ１ドメインは、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４６、配列番号５２、及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；（ｂ）ＶＨ ＣＤＲ２ドメインは、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４７、配列番号５３、及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；（ｃ）ＶＨ ＣＤＲ３ドメインは、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４８、配列番号５４、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；（ｄ）ＶＬ ＣＤＲ１ドメインは、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５５、及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；（ｅ）ＶＬ ＣＤＲ２ドメインは、配列番号３７、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５６、及び配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；又は（ｆ）ＶＬ ＣＤＲ３ドメインは、配列番号３８、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５７、及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

本開示はさらに、（ａ）配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに（ｂ）配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶｒｈ７４の等価のタンパク質又はカプシドタンパク質と比較して、より少ない親和性でＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９のカプシドタンパク質に結合する。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、ＧＶＡＨＹＳＤＳＲＦＡＦＤＹ（配列番号３５）、ＧＮＡＨＰＧＧＳＡＦＶＹ（配列番号４１）、ＲＧＳＹＹＹＤＳＳＰＡＷＦＡＹ（配列番号４８）、ＲＧＶＤＳＳＧＹＧＡＦＡＹ（配列番号５４）、及びＴＲＧＴＳＴＭＩＳＴＦＡＦＶＹ（配列番号６０）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、ＮＹＧＭＮ（配列番号３３）、ＤＹＧＭＮ（配列番号３９）、ＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号４６）、ＹＴＦＴＫＹＧＭＮ（配列番号５２）、及びＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号５８）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１をさらに含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号３４）、ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＴＹＧＤＤＦＫＧ（配列番号４０）、ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号４７）、ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号５３）、及びＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号５９）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ２をさらに含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、ＳＶＳＳＶＳＳＹＭＨ（配列番号３６）、ＳＡＳＳＧＶＴＹＭＨ（配列番号４２）、ＳＳＶＳＳＹＭＨ（配列番号４９）、ＳＳＶＳＳＹＭＨ（配列番号５５）、及びＳＳＶＲＹＭＨ（配列番号６１）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、ＹＴＳＮＬＡＳ（配列番号３７）、ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号４３）、ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５０）、ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５６）、及びＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号６２）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ２をさらに含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、ＱＱＲＳＳＳＹＰＦＴ（配列番号３８）、ＱＱＲＳＳＳＹＰＦＴ（配列番号４４）、ＱＱＲＳＴＹＰＦ（配列番号５１）、ＱＱＲＳＳＦＹＰＦ（配列番号５７）、及びＱＱＲＲＴＹＹＰＦ（配列番号６３）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ３をさらに含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下：
ａ．配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
ｂ．配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
ｃ．配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
ｄ．配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；ならびに
ｅ．配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、からなる群から選択される、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を含む：
ａ．配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｂ．配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｃ．配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｄ．配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；あるいは
ｅ．配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％ 、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択される。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択される。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ならびに、軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性基、酵素基、又は蛍光基で標識される。

一部の態様では、単離抗体は、全長抗体、又はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディ、及び同じ又は異なる抗体に遺伝子的に融合されたｓｘＦｖからなる群から選択される抗体フラグメントである。

一部の態様では、単離抗体は、マウス抗体、キメラマウス／ヒト抗体、ヒト抗体、操作抗体、又はヒト化抗体である。

一部の態様では、単離抗体は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。

一部の態様では、単離抗体は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。

一部の態様では、単離抗体は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。

一部の態様では、単離抗体は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは二重特異性抗体である。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは多特異性抗体である。

本開示はまた、本明細書中に記載する抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。

一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３３、配列番号３９、配列番号４６、配列番号５２、及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１ドメイン；（ｂ）配列番号３４、配列番号４０、配列番号４７、配列番号５３、及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２ドメイン；（ｃ）配列番号３５、配列番号４１、配列番号４８、配列番号５４、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３ドメイン；（ｄ）配列番号３６、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５５、及び配列番号６１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１ドメイン；（ｅ）配列番号３７、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５６、及び配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２ドメイン；ならびに（ｆ）配列番号３８、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５７、及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３ドメインをコードする、核酸配列を含む。

本開示の一部の態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号３、配列番号７、配列番号１５、配列番号１１、及び配列番号１９からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含み；ならびに、抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域をコードする核酸配列は、配列番号４、配列番号８、配列番号１６、配列番号１２、及び配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

本開示はまた、本明細書中に記載するポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。

本開示はまた、本明細書中に記載するベクターを含む宿主細胞を提供する。

本開示はまた、本明細書中に記載する、単離抗体又はその抗原結合フラグメントを含むインビトロ検出キットを提供する。

一部の態様では、キットは、放射性基、酵素基、及び／又は蛍光基で標識された第二の抗体又はその抗原結合フラグメントをさらに含む。

本開示はさらに、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出するための方法を提供し、サンプルを、本明細書中に記載する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物に接触させることを含む。

一部の態様では、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在は、抗体又はその抗原結合フラグメントの存在を検出することにより示される。

一部の態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントの存在は、イムノアッセイにより検出される。

一部の態様では、イムノアッセイは、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び免疫沈降アッセイの一つ又は複数を含む。

一部の態様では、本方法は、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質と比較して、サンプル中のＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質を検出するための感度が低い。一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合するが、しかし、サンプル中のＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質には結合しない。

本開示はまた、（ａ）アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含むポリペプチドの免疫原性量を非ヒト脊椎動物に投与すること；（ｂ）動物から脾臓細胞を回収すること；（ｃ）回収された脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成すること；（ｄ）ＡＡＶカプシドタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマについてハイブリドーマをスクリーニングすること；及び（ｅ）当該抗体を回収することを含む、抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法を提供する。別の実施形態では、カプシドタンパク質はＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質である。一実施形態では、抗体は抗ＡＡＶ抗体である。

一部の態様では、非ヒト脊椎動物はトランスジェニック動物であり、ここで、トランスジェニック動物はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する。

一部の態様では、本方法は、非ヒト脊椎動物に、一つ又は複数の免疫アジュバントを投与することをさらに含む。

一部の態様では、非ヒト脊椎動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ブタ、ヤギ、ウシ、及びウマから選択される。

一部の態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に、他の血清型ｏ ＡＡＶカプシド、例えば、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質と比較して、より多くの親和性で特異的に結合する。

本開示はまた、（ａ）アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含む抗原を固体支持体上に固定化すること；（ｂ）固定化抗原にファージ抗体ライブラリーを適用すること；（ｃ）抗原に結合するファージについてライブラリーをスクリーニングすること；及び（ｄ）抗原結合ファージを回収することを含む、抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法を提供する。別の実施形態では、カプシドタンパク質はＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質である。一実施形態では、抗体は抗ＡＡＶ抗体である。

一部の態様では、固体支持体は、マイクロタイタープレートウェル、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜、カラムマトリックス、イムノチューブ、及び磁気ビーズからなる群から選択される。

一部の態様では、ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含むポリペプチドの免疫原性量を含む組成物で以前に免疫化された非ヒト脊椎動物から由来する。

一部の態様では、非ヒト脊椎動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ブタ、ヤギ、ウシ、及びウマから選択される。

一部の態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合するが、しかし、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質には結合しない。

本開示はまた、（ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープに特異的に結合するＣＤＲをインシリコで設計すること；（ｂ）ＣＤＲを単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）上に移植すること；（ｃ）抗体ファージディスプレイを使用して、標的ポリペプチドへの結合についてｓｃＦｖをスクリーニングすること；及び（ｄ）標的ポリペプチドに結合するｓｃＦｖを選択することを含む、抗ＡＡＶｒｈ７４抗体又はその抗原結合フラグメントを作製するインシリコ方法を提供し、ここで、ＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープ及び標的ポリペプチドは各々が、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含む。別の実施形態では、カプシドタンパク質はＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質である。一実施形態では、抗体は抗ＡＡＶ抗体である。

一部の態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質と比較して、より多くの親和性でＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合する。

図１は、ＡＡＶｒｈ７４に結合する抗体をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡデータを示す。

図２は、ＡＡＶｒｈ７４を結合するが、しかし、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９への結合がより少ない、限定されている、又はない抗体をスクリーニングするためのＥＬＩＳＡデータを示す。

図３Ａ～３Ｃは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するキメラＩｇＧ１ １０Ｄ２ ＡＡＶｒｈ７４抗体及びキメラＩｇＧ ２８Ｄ８ ＡＡＶｒｈ７４抗体の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。図３Ａは、キメラＩｇＧ１ １０Ｄ２の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図Ｂは、キメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図３Ｃは、キメラＩｇＧ １０Ｄ２及びキメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８の滴定曲線についてのオーバーレイのグラフを示す。

図４Ａ～４Ｄは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するが、しかし、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９への結合がほとんどない又はないキメラＩｇＧ１ １０Ｄ２ ＡＡＶｒｈ７４抗体の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。図４Ａは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するキメラＩｇＧ１ １０Ｄ２の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図４Ｂは、ＡＡＶ８に結合するキメラＩｇＧ１ １０Ｄ２の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図４Ｃは、ＡＡＶ９に結合するキメラＩｇＧ１ １０Ｄ２の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図４Ｄは、陽性対照及び陰性対照のＥＬＩＳＡデータを示す。

図５Ａ～５Ｄは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するが、しかし、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９への結合がほとんどない又はないキメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８ ＡＡＶｒｈ７４抗体の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。図５Ａは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するキメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図５Ｂは、ＡＡＶ８に結合するキメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図５Ｃは、ＡＡＶ９に結合するキメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図５Ｄは、陽性対照及び陰性対照のＥＬＩＳＡデータを示す。

図６Ａ～６Ｃは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するキメラＩｇＡ １０Ｄ２ ＡＡＶｒｈ７４抗体及びキメラＩｇＡ ２８Ｄ８ ＡＡＶｒｈ７４抗体の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。図６Ａは、キメラＩｇＡ １０Ｄ２の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図６Ｂは、キメラＩｇＡ ２８Ｄ８の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図６Ｃは、キメラＩｇＡ １０Ｄ２及びキメラＩｇＡ ２８Ｄ８についての滴定曲線のオーバーレイのグラフを示す。

図７Ａ～７Ｄは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するが、しかし、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９への結合がほとんどない又はないキメラＩｇＡ １０Ｄ２ ＡＡＶｒｈ７４抗体の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。図７Ａは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するキメラＩｇＡ １０Ｄ２の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図７Ｂは、ＡＡＶ８に結合するキメラＩｇＡ １０Ｄ２の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図７Ｃは、ＡＡＶ９に結合するキメラＩｇＡ １０Ｄ２の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図７Ｄは、陽性対照及び陰性対照についてのＥＬＩＳＡデータを示す。

図８Ａ～８Ｄは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するが、しかし、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９への結合がほとんどない又はないキメラＩｇＡ ２８Ｄ８ ＡＡＶｒｈ７４抗体の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。図８Ａは、ＡＡＶｒｈ７４に結合するキメラＩｇＡ ２８Ｄ８の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図８Ｂは、ＡＡＶ８に結合するキメラＩｇＡ ２８Ｄ８の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図８Ｃは、ＡＡＶ９に結合するキメラＩｇＡ ２８Ｄ８の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。 図８Ｄは、陽性対照及び陰性対照についてのＥＬＩＳＡデータを示す。

図９Ａ～９Ｅは、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９と比較して、ずっと高い親和性でＡＡＶｒｈ７４に結合するモノクローナル抗体７Ｄ４Ｂ９、１Ｃ４Ｆ４、及び６Ｅ１０Ｂ５の滴定曲線についてのＥＬＩＳＡデータを示す。図９Ａは、７Ｄ４Ｂ９についての滴定曲線及び交差反応性を示す。 図９Ｂは、１Ｃ４Ｆ４についての滴定曲線及び交差反応性を示す。 図９Ｃは、６Ｅ１０Ｂ５についての滴定曲線及び交差反応性を示す。 図９Ｄは、アッセイにおいて使用される陽性対照及び陰性対照についてのデータを示す。 図９Ｅは、７Ｄ４Ｂ９、１Ｃ４Ｆ４、及び６Ｅ１０Ｂ５についての滴定曲線のオーバーレイを示す。全ての三つの抗体が、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９との比較的低い交差反応性を伴うＡＡＶｒｈ７４への血清型特異的結合を示す。

他に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示の属する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合では、定義を含む本願が支配する。文脈により他に要求されない限り、単数形は複数形を含むものとし、複数形は単数形を含むものとする。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許、及び他の参考文献が、各々の個々の刊行物又は特許出願が具体的かつ個々に参照により組み入れられるように示されているかのように、参照によりそれらの全体において、全ての目的のために組み入れられる。

本開示全体を通して、用語「ａ」又は「ａｎ」実体は、その実体の一つ又は複数を指し；例えば、ポリヌクレオチドは、一つ又は複数のポリヌクレオチドを表すと理解される。そのようなものとして、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「一つ又は複数」、及び「少なくとも一つ」は、本明細書中で互換的に使用することができる。

さらに、「及び／又は」は、本明細書中で使用される場合、他を伴う又は伴わない、二つの特定された特色又は成分の各々の特定の開示として理解される。このように、語句において使用される用語「及び／又は」、例えば本明細書中の「Ａ及び／又はＢ」などは、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、語句において使用される用語「及び／又は」、例えば「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などは、以下の態様の各々を包含することが意図される：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）。

用語「約」は、およそ、大まかに、前後、又はその領域内を意味するために本明細書中で使用される。用語「約」が数値範囲と併せて使用される場合、それによって、示される数値の上下の境界を拡張させることによりその範囲が変更される。一般的に、用語「約」を本明細書中で使用して、１０パーセントの分散の上又は下（より高い又はより低い）により、記載値を上回って及び下回って数値を変更する。

本明細書中で使用するように、「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン、その抗原結合フラグメント、又は抗原結合分子を意味する。本開示の抗体は、任意のアイソタイプ又はクラス（例、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡ）、又は任意のサブクラス（例、ＩｇＧ１－４、ＩｇＡ１－２）、又は任意の型のサブクラス（例、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）であることができ、カッパ（κ）又はラムダ（λ）のいずれかの軽鎖を有することができる。抗体の抗原結合フラグメントは、例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、及びＦｄフラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体（ｓｃＡｂ）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体、二特異性抗体、多特異性抗体、ならびに抗体及び非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含む。本開示の抗体は、例えば、放射性基、酵素基、又は蛍光基で標識することができる。本開示の抗体はまた、他の部分、例えば特異的結合対のメンバーなど、例えば、ビオチン（ビオチン－アビジン特異的結合対のメンバー）などにコンジュゲートさせることができる。本開示の抗体はまた、固体支持体、例えばポリスチレンプレート又はビーズなどに結合させることができる。

本明細書中で使用するように、「モノクローナル抗体」は、同一の細胞の群により産生された抗体であり、その全てが、反復的な細胞複製により単一の細胞から産生された。すなわち、細胞のクローンは、単一の抗体種を産生するのみである。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ産生技術を使用して、又は例えば、抗体ファージディスプレイライブラリーを含む、当技術分野における当業者に公知の他の産生方法を使用して産生することができる。

本明細書中で使用するように、用語「重鎖」は、可変領域及び定常領域からなる抗体重鎖を指す。本明細書中で使用するように、用語「軽鎖」は、可変領域及び定常領域からなる抗体軽鎖を指す。

用語「全長抗体」は、二つの全長抗体重鎖及び二つの全長抗体軽鎖を含む抗体を表す。例えば、全長ＩｇＧ抗体重鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向において抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）、抗体ヒンジ領域（ＨＲ）、抗体重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、及び抗体重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）からなり、ＶＨ－ＣＨ－ＨＲ－ＣＨ２－ＣＨ３として略されるポリペプチドである。全長抗体軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端方向において抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）からなり、ＶＬ－ＣＬとして略されるポリペプチドである。抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、κ（カッパ）又はλ（ラムダ）であることができる。二つの全長抗体ドメインは、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインの間の及び全長抗体重鎖のヒンジ領域間のポリペプチド間ジスルフィド結合を介して一緒に連結される。全長抗体は、任意のアイソタイプもしくはクラス（例、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、及びＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例、ＩｇＧ１－４、ＩｇＡ１－２）又は任意の型のサブクラス（例、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ）であることができる。

本明細書中で使用するように、上で言及するように、用語「カプシド」又は「カプシドタンパク質」は、ウイルス粒子のタンパク質性シェル又はコートを指す。カプシドは、ウイルスゲノムをカプシド形成し、保護し、輸送し、及び宿主細胞中に放出するように機能する。カプシドは一般的に、タンパク質のオリゴマー構造サブユニット（「カプシドタンパク質」）、例えば、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成される。本明細書中で使用するように、用語「カプシド形成された」は、ウイルスカプシド内に封入されたことを意味する。例えば、ＡＡＶｒｈ７４カプシド配列は、米国特許第９，４３４，９２８号に開示されており、その内容は、参照によりその全体において組み入れられる。

本明細書中で使用するように、及び上で言及するように、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続抗原結合部位（抗原結合領域としても公知である）を記載する。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６６０９－６６１６（１９７７）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（１９９１）（本明細書中ではＫａｂａｔ １９９１としても言及される）により；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）（本明細書中ではＣｏｔｈｉａ １９８７としても言及される）；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５（１９９６）により記載されており、ここで、その定義は、互いに対して比較された場合に、アミノ酸残基の重複又はサブセットを含む。しかしながら、抗体又はその移植された抗体もしくはバリアントのＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書中で定義される及び使用される用語の範囲内であることが意図される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列及びサイズに依存して変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、いずれの残基が特定のＣＤＲを含むかをルーチン的に決定することができる。本明細書中で使用するように、用語「ＣＤＲＬ１」、「ＣＤＲＬ２」、及び「ＣＤＲＬ３」は、軽鎖可変領域中のそれぞれ第一、第二、及び第三のＣＤＲを指す。本明細書中で使用するように、用語「ＣＤＲＨ１」、「ＣＤＲＨ２」、及び「ＣＤＲＨ３」は、重鎖可変領域のそれぞれ第一、第二、及び第三のＣＤＲを指す。

「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定ならびに分離及び／又は回収された抗体である。一部の態様では、用語「単離された」は、用語「組換え型」と互換的に使用される。本明細書中で使用するように、用語「単離された」及び「組み換え型」は、実験室の方法、例えば分子クローニングなどにより形成されるポリペプチド又はヌクレオチドを指す。一部の態様では、抗体は、（ａ）Ｌｏｗｒｙ法により決定される抗体の～９０重量％超、９５％超、又は９８％超、 例えば、９９重量％超まで、（ｂ）スピニングカップシークエンサーの使用による、Ｎ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに十分な程度まで、 又は（ｃ）クーマシーブルー又は銀染色を使用した還元又は非還元条件下でのドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による均一性まで精製される。単離抗体は、組換え細胞内でインサイツで抗体を含む。なぜなら、抗体の天然環境の少なくとも一つの成分が存在しないためである。一部の態様では、単離抗体は、少なくとも一つの精製工程により調製される。

本明細書中で使用するように、用語「パーセント（％）同一性」は、配列を整列させ、必要な場合にギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後の、参照配列のヌクレオチド残基又はアミノ酸残基と同一である配列中のヌクレオチド残基又はアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。例えば、抗体のパーセント（％）アミノ酸配列同一性は、配列を整列させ、必要な場合にギャップを導入して最大パーセントの配列同一性を達成した後の、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しない、参照抗体配列中のアミノ酸残基と同一である抗体配列を指す。同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア、又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどを使用して、当技術分野の技能内にある様々な方法で達成することができる。一実施形態では、配列比較は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実施される。ＢＬＡＳＴＮを使用して核酸配列を比較する一方で、ＢＬＡＳＴＰを使用してアミノ酸配列を比較する。他の適切なプログラムは、例えば、Ｎｅｅｄｌｅ、Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ、Ｗａｔｅｒ、又はＭａｔｃｈｅｒ、バイオインフォマティクスプログラムのＥＭＢＯＳＳスイートの一部であり、また、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａの欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＢＩ）から利用可能である。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適したパラメータを決定することができる。

当業者は、配列同一性パーセントの算出のための配列アライメントの生成が、もっぱら一次配列データにより駆動されるバイナリ配列－配列比較に限定されないことを理解するであろう。配列アライメントは、複数の配列アライメントから導き出すことができる。複数の配列アライメントを生成するために適切な一つのプログラムは、ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇから利用可能なＣｌｕｓｔａｌＷ２である。別の適切なプログラムはｄｒｉｖｅ５．ｃｏｍ／ｍｕｓｃｌｅ／からのＭＵＳＣＬＥである。ＣｌｕｓｔａｌＷ２及びＭＵＳＣＬＥは、例えば、ＥＢＩから代替的に利用可能である。

本明細書中で使用するように、本開示中で使用する用語「８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一性」は、全てのそのような配列が、少なくとも約８０％同一性、少なくとも約８１％同一性、少なくとも約８２％同一性、少なくとも約８３％同一性、少なくとも約８４％同一性、少なくとも約８５％同一性、約８６％同一性、少なくとも約８７％同一性、少なくとも約８８％同一性、少なくとも約８９％同一性、少なくとも約９０％同一性、少なくとも約９１％同一性、少なくとも約９２％同一性、少なくとも約９３％同一性、少なくとも約９４％同一性、少なくとも約９５％同一性、少なくとも約９６％同一性、少なくとも約９７％同一性、少なくとも約９８％同一性、少なくとも約９９％同一性、又は１００％同一性（完全に同一）のいずれかであることを意味する。

用語「エピトープ」は、抗体により結合される抗原の領域を指す。エピトープは、構造的又は機能的として定義され得る。機能的エピトープは、一般的に、構造的エピトープのサブセットであり、相互作用の親和性に直接的に寄与する残基を有する。エピトープはまた、立体構造的であってもよく、すなわち、非線状アミノ酸で構成され得る。特定の実施形態では、エピトープは、分子の化学的に活性な表面基である決定基、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、又はスルホニル基などを含んでもよく、特定の実施形態では、特定の三次元構造特性、及び／又は特定の荷電特性を有し得る。

用語「結合」は、例えば、相互作用、例えば塩架橋及び水架橋などを含む、共有結合性、静電性、疎水性、ならびにイオン性及び／又は水素結合の相互作用に起因する、二つの分子間の直接的な会合を指す。対象の抗ＡＡＶ抗体は、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質内のエピトープに特異的に結合する。

本明細書中で使用する用語「マウス抗体」は、可変領域配列及び定常領域配列がマウスから由来する抗体を含む。

本明細書中で使用する用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が一つの種から由来し、定常領域配列が別の種から由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体から由来し、定常領域配列がヒト抗体から由来する抗体を含む。

本明細書中で使用する用語「ヒト化抗体」は、別の哺乳動物種、例えばマウスなどの生殖細胞系列から由来するＣＤＲ配列が、ヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体を含む。追加のフレームワーク領域修飾は、ヒトフレームワーク配列内ならびに別の哺乳動物種の生殖細胞系列から由来するＣＤＲ配列内で作製されてもよい。

本明細書中で使用する用語「ヒト抗体」は、ヒトにより産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味し、及び／又は当技術分野において公知の、もしくは本明細書中に開示するヒト抗体を作製するための技術のいずれかを使用して作製されている。ヒト抗体のこの定義は、少なくとも一つのヒト重鎖ポリペプチド又は少なくとも一つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。

本明細書中で使用するように、用語「対象」は、任意のヒト又は非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物など、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、虫類などを含む。好ましくは、対象はヒトである。
抗ＡＡＶｒｈ７４抗体

本開示は、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質又は組換えＡＡＶベクターのエピトープをＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質で特異的に結合することが可能な、単離された抗ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定の態様では、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質内のエピトープは、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）又はその一部と少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の態様では、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質内のエピトープのアミノ酸配列は、ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）である。

一部の態様では、本開示は、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質内のエピトープに特異的に結合する、単離された抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供し、この抗体は、エピトープへの結合について標準抗体と競合する。競合抗体又はその抗原結合フラグメントは、例えば、抗体競合アッセイを使用して同定することができる。そのような競合アッセイを行うための手順の詳細は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ ５６７－５６９において見出すことができる。本開示の目的のために、参照抗体と競合する抗ＡＡＶｒｈ７４抗体又はそのフラグメントは、標的ポリペプチドへの参照抗体の結合を少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％だけ減少させるものである。

一部の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ならびに参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

本開示はさらに、参照抗体としてＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質内の同じエピトープに結合する、単離された抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを提供する。特定のタンパク質内の同じエピトープに結合する抗体を同定するためのアッセイは、当業者に公知である。例えば、そのようなアッセイは、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｔｅｒ １４において詳述されている。

一部の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ならびに参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む。別の態様では、参照抗体の重鎖可変領域は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含み、参照抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む。

本開示の単離された抗ＡＡＶｒｈ７４抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質内のエピトープに特異的に結合する。一実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３に結合する。一部の実施形態では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９カプシドと比較して、ＡＡＶｒｈ７４カプシドに結合する際に高い親和性を有する。一部の実施形態では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶ８のカプシドタンパク質に結合しない。一部の実施形態では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶ９のカプシドタンパク質に結合しない。一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９に結合しない。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、ＧＶＡＨＹＳＤＳＲＦＡＦＤＹ（配列番号３５）、ＧＮＡＨＰＧＧＳＡＦＶＹ（配列番号４１）、ＲＧＳＹＹＹＤＳＳＰＡＷＦＡＹ（配列番号４８）、ＲＧＶＤＳＳＧＹＧＡＦＡＹ（配列番号５４）、及びＴＲＧＴＳＴＭＩＳＴＦＡＦＶＹ（配列番号６０）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、ＮＹＧＭＮ（配列番号３３）、ＤＹＧＭＮ（配列番号３９）、ＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号４６）、ＹＴＦＴＫＹＧＭＮ（配列番号５２）、及びＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号５８）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号３４）、ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＴＹＧＤＤＦＫＧ（配列番号４０）、ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号４７）、ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号５３）、及びＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号５９）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ２を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、アミノ酸配列ＧＶＡＨＹＳＤＳＲＦＡＦＤＹ（配列番号３５）を有するＶＨ ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＮＹＧＭＮ（配列番号３３）を有するＶＨ ＣＤＲ１、及びアミノ酸配列ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号３４）を有するＶＨ ＣＤＲ２を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、アミノ酸配列ＧＮＡＨＰＧＧＳＡＦＶＹ（配列番号４１）を有するＶＨ ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＤＹＧＭＮ（配列番号３９）を有するＶＨ ＣＤＲ１、及びアミノ酸配列ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＴＹＧＤＤＦＫＧ（配列番号４０）を有するＶＨ ＣＤＲ２を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、アミノ酸配列ＲＧＳＹＹＹＤＳＳＰＡＷＦＡＹ（配列番号４８）を有するＶＨ ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号４６）を有するＶＨ ＣＤＲ１、及びアミノ酸配列ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴ＿（配列番号４７）を有するＶＨ ＣＤＲ２を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、アミノ酸配列ＲＧＶＤＳＳＧＹＧＡＦＡＹ（配列番号５４）を有するＶＨ ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＹＴＦＴＫＹＧＭＮ（配列番号５２）を有するＶＨ ＣＤＲ１、及びアミノ酸配列ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号５３）を有するＶＨ ＣＤＲ２を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、アミノ酸配列ＴＲＧＴＳＴＭＩＳＴＦＡＦＶＹ（配列番号６０）を有するＶＨ ＣＤＲ３、アミノ酸配列ＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号５８）を有するＶＨ ＣＤＲ１、及びアミノ酸配列ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号５９）を有するＶＨ ＣＤＲ２を含む。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、ＳＶＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号３６）、ＳＡＳＳＧＶＴＹＭＨ（配列番号４２）、ＳＳＶＳＳＹＭＨ（配列番号４９）、ＳＳＶＳＳＹＭＨ（配列番号５５）、及びＳＳＶＲＹＭＨ（配列番号６１）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、ＹＴＳＮＬＡＳ（配列番号３７）、ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号４３）、ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５０）、ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５６）、及びＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号６２）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ２を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、ＱＱＲＳＳＳＹＰＦＴ（配列番号３８）、ＱＱＲＳＳＳＹＰＦＴ（配列番号４４）、ＱＱＲＳＴＹＰＦ（配列番号５１）、ＱＱＲＳＳＦＹＰＦ（配列番号５７）、及びＱＱＲＲＴＹＹＰＦ（配列番号６３）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ３を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＳＶＳＳＶＳＳＹＭＨ（配列番号３６）を有するＶＬ ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＴＳＮＬＡＳ（配列番号３７）を有するＶＬ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＲＳＳＳＹＰＦＴ（配列番号３８）を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＳＡＳＳＧＶＴＹＭＨ（配列番号４２）を有するＶＬ ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号４３）を有するＶＬ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＲＳＳＳＹＰＦＴ（配列番号４４）を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＳＳＶＳＳＹＭＨ（配列番号４９）を有するＶＬ ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５０）を有するＶＬ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＲＳＴＹＰＦ（配列番号５１）を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＳＳＶＳＳＹＭＨ（配列番号５５）を有するＶＬ ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５６）を有するＶＬ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＲＳＦＹＰＦ（配列番号５７）を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、アミノ酸配列ＳＳＶＲＹＭＨ（配列番号６１）を有するＶＬ ＣＤＲ１、アミノ酸配列ＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号６２）を有するＶＬ ＣＤＲ２、及びアミノ酸配列ＱＱＲＴＹＹＰＦ（配列番号６３）を有するＶＬ ＣＤＲ３を含む。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下：
ａ．配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
ｂ．配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
ｃ．配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
ｄ．配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；ならびに
ｅ．配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、からなる群から選択される、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、以下を含む：
ａ．配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｂ．配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｃ．配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
ｄ．配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；あるいは
ｅ．配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を有し；ならびに、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列からのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３をさらに含む。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択される。

本開示の一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であり；ならびに、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列からのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３をさらに含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択される。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントの重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ならびに、軽鎖可変領域は、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

一部の態様では、本開示の単離抗体は、以下の表１中に提示される抗体である。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、表２中に提示される配列から選択される、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む。

ＡＡＶｒｈ７４又はＡＡＶｒｈ７４抗体に対する抗体の結合能力を評価するための標準的なアッセイは、当技術分野において公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）、ウェスタンブロット、ＲＩＡ、及びフローサイトメトリー分析を含む。抗体の結合動態（例、ＫＤのような結合親和性）も、当技術分野において公知の標準アッセイにより、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ又はＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）システム分析などにより評価することができる。相対的結合親和性Ｋ_ｉは、当技術分野において公知の標準競合アッセイにより評価することができる。

一部の態様では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、放射性基、酵素基、又は蛍光基で標識される。抗体を標識する目的のための基の例は、様々な酵素、結合対、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、及び放射性材料を含む。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含むが、これらに限定しない；適切な結合対の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含むが、これらに限定しない；適切な蛍光基の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダニルクロリド、又はフィコエリスリンを含むが、これらに限定しない；発光材料の例は、ルミノールを含むが、これに限定しない；生物発光材料の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含むが、これらに限定しない；ならびに、適切な放射性材料の例は、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^３５Ｓ、又は^３Ｈを含むが、これらに限定しない。

一部の実施形態では、単離抗体は、全長抗体、又はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディ、及び同じ又は異なる抗体に遺伝子的に融合されたｓｘＦｖからなる群から選択される抗体フラグメントである。

一部の実施形態では、単離抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、操作抗体、又はヒト化抗体である。一部の態様では、キメラ抗体はキメラマウス／ヒト抗体である。

一部の態様では、単離抗体は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含むキメラ抗体である。一部の態様では、単離抗体は、配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。一部の態様では、単離抗体は、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。

一部の態様では、単離抗体は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含むキメラ抗体である。一部の態様では、単離抗体は、配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。一部の態様では、単離抗体は、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。

他の態様では、単離抗体は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含むキメラ抗体である。一部の態様では、単離抗体は、配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。一部の態様では、単離抗体は、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。

他の態様では、単離抗体は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含むキメラ抗体である。一部の態様では、単離抗体は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。一部の態様では、単離抗体は、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含むキメラ抗体である。

一部の態様では、単離抗体は、表３中に提示されるキメラ抗体である：

一部の実施形態では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、二重特異性抗体である。一部の実施形態では、単離抗体又はその抗原結合フラグメントは、多重特異性抗体である。

核酸、ベクター、及び宿主細胞
本開示はまた、ＡＡＶｒｈ７４、ベクター、及びポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞に結合する抗体及びそのフラグメントをコードする核酸を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。核酸は、全細胞中で、細胞ライセート中で、又は部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態中に存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野において周知の他の標準的な技術により、他の細胞成分又は他の汚染物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質から離れて精製された場合に「単離される」又は「実質的に純粋になる」。例えば、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと。本発明の核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡであることができ、イントロン配列を含み得る、又は含まないであろう。好ましい実施形態では、核酸はｃＤＮＡ分子である。

本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術、例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードする、あるいはＶＨ及び／又はＶＬセグメントをコードするｃＤＮＡを、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術により得ることができる。イムノグロブリン遺伝子ライブラリーから得られた抗体（例、ファージディスプレイ技術を使用）については、抗体をコードする一つ又は複数の核酸をライブラリーから回収することができる。外因性核酸を宿主細胞中に導入する方法は、当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞により変動する。技術は、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、塩化カルシウム処理、ポリエチレンイミン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス又はファージ感染、リポソーム中でのポリヌクレオチドのカプセル封入、及び核中へのＤＮＡの直接マイクロインジェクションを含むが、これらに限定しない。哺乳動物細胞の場合では、トランスフェクションは一過性又は安定のいずれかであり得る。

一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４６、配列番号５２、及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１ドメインをコードする核酸配列を含む。

一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４７、配列番号５３、及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２ドメインをコードする核酸配列を含む。

一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４８、配列番号５４、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３ドメインをコードする核酸配列を含む。

一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５５、及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１ドメインをコードする核酸配列を含む。

一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３７、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５６、及び配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２ドメインをコードする核酸配列を含む。

一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号３８、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５７、及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３ドメインをコードする核酸配列を含む。

一部の態様では、本開示のポリヌクレオチドは、（ａ）配列番号３３、配列番号３９、配列番号４６、配列番号５２、及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１ドメインをコードする核酸配列を含み；（ｂ）配列番号３４、配列番号４０、配列番号４７、配列番号５３、及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２ドメイン；（ｃ）配列番号３５、配列番号４１、配列番号４８、配列番号５４、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３ドメイン；（ｄ）配列番号３６、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５５、及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１ドメイン；（ｅ）配列番号３７、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５６、及び配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２ドメイン；ならびに（ｆ）配列番号３８、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５７、及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３ドメインをコードする核酸配列を含む。

本開示の一部の態様では、そのフラグメントの抗体の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号３、配列番号７、配列番号１５、配列番号１１、及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

本開示の一部の態様では、軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号４、配列番号８、配列番号１６、配列番号１２、及び配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

本開示の一部の態様では、そのフラグメントの抗体の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号３、配列番号７、配列番号１５、配列番号１１、及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；ならびに軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号４、配列番号８、配列番号１６、配列番号１２、及び配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

一部の態様では、そのフラグメントの抗体の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号３のヌクレオチド配列を含み、軽鎖可変領域をコードする核酸は配列番号４のヌクレオチド配列を含む。

一部の態様では、そのフラグメントの抗体の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号７のヌクレオチド配列を含み、軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号８のヌクレオチド配列を含む。

一部の態様では、そのフラグメントの抗体の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１１のヌクレオチド配列を含み、軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１２のヌクレオチド配列を含む。

一部の態様では、そのフラグメントの抗体の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１５のヌクレオチド配列を含み、軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１６のヌクレオチド配列を含む。

一部の態様では、そのフラグメントの抗体の重鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号１９のヌクレオチド配列を含み、軽鎖可変領域をコードする核酸は、配列番号２０のヌクレオチド配列を含む。

一部の態様では、本開示の核酸は、表４中に示される配列である。

一度、ＶＨ及び／又はＶＬセグメントをコードするＤＮＡフラグメントが得られたら、これらのＤＮＡフラグメントを、標準的な組み換えＤＮＡ技術によりさらに操作することができ、例えば、重鎖可変領域ＤＮＡ配列を、重鎖全長可変領域配列及び定常領域配列に、又は本明細書中に記載するフラグメント、例えばＦａｂもしくはｓｃＦｖなどに対応するフラグメントをコードする配列に変換する。これらの操作では、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡフラグメントを、別のタンパク質、例えば抗体定常領域又は可動性リンカーなどをコードする別のＤＮＡフラグメントに操作的に連結される。用語「操作的に連結された」は、この文脈において使用するように、二つのＤＮＡフラグメントが結合されて、二つのＤＮＡフラグメントによりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであることを意味することが意図される。ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に操作的に連結することにより、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．、上記を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントは、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１（ＩＧＨＧ１）、ＩｇＧ２（ＩＧＨＧ２）、ＩｇＧ３（ＩＧＨＧ３）、ＩｇＧ４（ＩＧＨＧ４）、ＩｇＡ１（ＩＧＨＡ１）、ＩｇＡ２（ＩＧＨＡ２）、ＩｇＭ（ＩＧＨＭ）、ＩｇＤ（ＩＧＨＤ）、又はＩｇＥ（ＩＧＨＥ）定常領域であることができる。

Ｆａｂフラグメント重鎖をコードする核酸について、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に操作的に連結することができる。ＶＬ領域をコードする、単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に操作的に連結することにより、全長軽鎖（ならびにＦａｂ軽鎖）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当技術分野において公知であり（例、Ｋａｂａｔ ＥＡ ｅｔ ａｌ．、上記を参照のこと）、これらの領域を包含するＤＮＡフラグメントを、標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。一部の実施形態では、軽鎖定常領域は、カッパ定常領域又はラムダ定常領域、好ましくはカッパ定常領域であることができる。

ｓｃＦｖをコードする核酸については、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡフラグメントを、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸リンカー配列をコードする別のフラグメントに操作的に連結させて、ＶＨ配列及びＶＬ配列を、連続的な単鎖タンパク質として発現させることができるようにし、ＶＬ領域及びＶＨ領域は可動性リンカーにより結合されている（例、Ｂｉｒｄ ＲＥ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３－４２６；Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２－５５４を参照のこと）。様々な技術が、抗体の抗体フラグメントの産生のために開発されてきた。従来、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して由来した（例、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７－１１７及びＢｒｅｎｎａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１－３を参照のこと）。しかし、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞により直接的に産生させることができる。例えば、抗体フラグメントは、抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’－ＳＨフラグメントを大腸菌から直接的に回収して、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントを形成するように化学的に共役させることができる（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３－１６７）。別のアプローチによれば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、組換え宿主細胞培養から直接的に単離することができる。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に明らかであろう。一部の実施形態では、選択された抗体は、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。

本開示の抗体をコードする核酸は、タンパク質を発現させるために、ベクター、好ましくは発現ベクターに組み入れてもよい。様々な発現ベクターをタンパク質発現のために利用してもよい。発現ベクターは、自己複製染色体外ベクター又は宿主ゲノム中に組込まれるベクターを含んでもよい。発現ベクターは、宿主細胞型と適合するように構築される。このように、ベクター、好ましくは発現ベクターは、本発明における使用が見出され、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母における、及びインビトロシステムにおけるタンパク質発現を可能にするベクターを含むが、これらに限定しない。当技術分野において公知であるように、様々な発現ベクターが、商業的に又は他の方法で利用可能であり、それは、抗体を発現させるための本開示において使用を見出すことができる。適切な発現ベクターの例は、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）である。

発現ベクターは、典型的には、制御配列又は調節配列、選択可能なマーカー、任意の融合パートナー、及び／又は追加エレメントと操作的に連結されたタンパク質を含む。本明細書中の「操作的に連結される」により、核酸が、別の核酸配列と機能的関係中に置かれることを意味する。用語「調節配列」は、抗体鎖遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメント（例、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０））において記載されている。一般的に、これらの発現ベクターは、抗体をコードする核酸に操作的に連結された転写調節核酸及び翻訳調節核酸を含み、典型的には、タンパク質を発現するために使用される宿主細胞に適している。一般的に、転写調節配列及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始配列及び転写停止配列、翻訳開始配列及び翻訳停止配列、ならびにエンハンサー配列又はアクチベーター配列を含んでもよい。当技術分野においても公知であるように、発現ベクターは、典型的には、発現ベクターを含む形質転換宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子又はマーカーを含む。選択遺伝子は当技術分野において周知であり、使用される宿主細胞によって変動する。例えば、典型的には、選択可能なマーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞に、薬物、例えばＧ４１８、ハイグロマイシン、又はメトトレキサートなどに対する耐性を付与する。好ましい選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞における使用）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）を含む。

一部の態様では、本開示のベクターは、配列番号２９に示される核酸配列を含む。一部の態様では、ベクターは、配列番号３０に示される核酸配列を含む。一部の態様では、ベクターは、配列番号３１に示される核酸配列を含む。一部の態様では、ベクターは、配列番号３２に示される核酸配列を含む。

本明細書中のベクターにおけるＤＮＡをクローニング又は発現させるための適切な宿主細胞は、原核生物細胞、酵母細胞、又はより高い真核生物細胞である。この目的のための適切な原核生物は、真正細菌、グラム陰性菌又はグラム陽性菌、例えば、腸内細菌、例えばエシェリヒアなど、例えば、大腸菌、エンテロバクター、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えば、サルモネラ・チフィリウム、セラチア、例えば、セラチア・マルセスカンス、及び赤痢菌、ならびにバチルス、例えば枯草菌及びＢリケニフォルミス、シュードモナス、例えば緑膿菌など、及びストレプトマイセスなどを含む。適切な大腸菌クローニング宿主は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ ３１，４４６）、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ ３１，５３７）、及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７，３２５）を含む。

原核生物に加えて、真核微生物、例えば線状真菌又は酵母などが、適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ、又は一般的なパン酵母は、より低い真核生物宿主微生物の間で最も一般的に使用される。しかし多数の他の属、種、及び株が一般的に利用可能で、有用であり、例えばシゾサッカロリス・ポンベ；クルイベロミセス宿主（Ｋラクティス、Ｋフラジリス（ＡＴＣＣ １２，４２４）、Ｋブルガリクス（ＡＴＣＣ １６，０４５）、Ｋウィッケラミ（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、Ｋ．ＷａＩｔＨ（ＡＪＣＣ ５６，５００）、Ｋドロソプマルム（ＡＴＣＣ ３６，９０６）、Ｋサーモトレランス、又はＫマルシアヌシャロウィア（ＥＰ４０２２２６）を含む）；ピキア・パストリス（ＥＰ１８３０７０）；カンジダ；トリコデルマ・レシア（ＥＰ２４４２３４）；ニューロスポラ・クラッサ；シュワニオマイセス、例えばシュワンニオマイセス・オクシデンタリスなど；及び糸状菌（ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム、又はアスペルギルス宿主、例えばＡニドゥランス又はＡニジェールなどを含む）などである。

本発明の抗体の発現のための適切な宿主細胞は、多細胞生物体から由来する。無脊椎細胞の例は、プラリル及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株及びバリアントならびに宿主からの対応する許容昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（カテリャル）、ネッタイシマカ（モスキト）、ヒトスジシマカ（モスキト）、キイロショウジョウバエ（ショウジョウバエ）、及びカイコなどが同定されている。トランスフェクション用の多様なウイルス株が公的に利用可能であり、例えば、オートグラフ・カリフォーニカＮＰＶのＬ－１バリアント及びカイコＮＰＶのＢｍ－５株、ならびにそのようなウイルスが、特にスポドプテラ・フルジペルダ細胞のトランスフェクションのために使用され得る。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用することができる。

本発明の組み換え抗体を発現するための宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞も含み、それらは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、及びＳＰ２細胞を含むが、これらに限定しない。組み換え抗体遺伝子が哺乳動物宿主細胞中に導入される場合、抗体は、宿主細胞中での抗体の発現、又はより好ましくは、宿主細胞が成長する培養培地中への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間にわたり宿主細胞を培養することにより産生される。ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に結合する抗体を産生するために有用な宿主細胞は、様々な培地中で培養させてもよい。商業的に利用可能な培地、例えばＨａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、スイス、ブフス）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、スイス、バーゼル）、及びＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ（（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ）が、宿主細胞を培養するために適切である。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。

抗体は、発現タンパク質、精製、スクリーニング、ディスプレイなどの標的化を可能にするために、融合パートナーに操作的に連結されてもよい。融合パートナーは、リンカー配列を介して抗体配列に連結されてもよい。リンカー配列は、一般的に、少数のアミノ酸、典型的には１０未満を含むが、より長いリンカーも使用されてもよい。典型的には、リンカー配列は可動性であり、分解に耐性であるように選択される。当業者により理解されるように、幅広い配列のいずれかをリンカーとして使用してもよい。例えば、共通リンカー配列はアミノ酸配列Ｇ_４Ｓを含む。融合パートナーは、抗体及び任意の関連する融合パートナーを所望の細胞位置又は細胞外培地に向ける標的化配列又はシグナル配列であり得る。当技術分野で公知のように、特定のシグナル伝達配列は、細胞の内膜と外膜の間に位置する、成長培地中に、又はペリプラズム空間中のいずれかに分泌されるタンパク質を標的化し得る。融合パートナーはまた、精製及び／又はスクリーニングを可能にするペプチド又はタンパク質をコードする配列であり得る。そのような融合パートナーは、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－タグ）（例えば、Ｈ６及びＨ１０、又は固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）システム（例、Ｎｉ^＋２親和性カラム）での使用のための他のタグ）、ＧＳＴ融合、ＭＢＰ融合、Ｓｔｒｅｐ－タグ、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、及び抗体により標的化されるエピトープタグ（例えば、ｃ－ｍｙｃタグ、フラグタグなど）を含むが、これらに限定しない。当業者により理解されるように、そのようなタグは、精製のために、スクリーニングのために、又はその両方に有用であり得る。

抗体の構築及び産生
本開示はさらに、抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法を提供する。一部の態様では、本開示の方法は、ハイブリドーマ技術を使用して抗体を作製することを含む。ハイブリドーマ細胞を作製するための技術は、当業者に周知である。一部の態様では、本開示は、（ａ）非ヒト脊椎動物に、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含むポリペプチドの免疫原性量を投与すること；（ｂ）動物から脾臓細胞を回収すること；（ｃ）回収された脾臓細胞をミエローマ細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成すること；（ｄ）ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマについてハイブリドーマをスクリーニングすること；及び（ｅ）当該抗体を回収することを含む、抗体を作製する方法を提供する。動物へのポリペプチドの投与は、周知のルーチン的なプロトコルを使用して行うことができる。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｅｉｒ ＤＭ（ｅｄ．），Ｖｏｌ ４，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８６）を参照のこと。

一部の実施形態では、非ヒト脊椎動物はトランスジェニック動物であり、トランスジェニック動物はヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する。そのような態様では、トランスジェニック動物は、ＡＡＶｒｈ７４に向けられたヒト抗体を産生する。

一部の実施形態では、本開示の方法は、非ヒト脊椎動物に、一つ又は複数の免疫アジュバントを投与することをさらに含む。

一部の実施形態では、非ヒト脊椎動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ブタ、ヤギ、ウシ、及びウマから選択される。特定の態様では、非ヒト脊椎動物はマウスである。別の特定の態様では、非ヒト脊椎動物はラットである。

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合するが、しかし、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質には結合しない。

一部の態様では、本開示の抗体を発現するハイブリドーマはマウスハイブリドーマである。一部の態様では、ハイブリドーマは、１０Ｄ２－１、２８Ｄ８－１、１Ｃ４Ｆ４、６Ｅ１０Ｂ５、及び７Ｄ４Ｂ９からなる群から選択されるハイブリドーマである。

本開示はさらに、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを使用して、抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法を提供する。ファージディスプレイ抗体ライブラリーを使用して抗体を作製する技術は、当業者に周知である。本開示の一部の態様では、本方法は、（ａ）アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含む抗原を固体支持体上に固定化すること；（ｂ）ファージディスプレイ抗体ライブラリーを固定化抗原に適用すること；（ｃ）抗原に結合するファージについてライブラリーをスクリーニングすること；及び（ｄ）抗原結合ファージを回収することを含む。

適切な支持体は、当技術分野において周知であり、とりわけ、商業的に利用可能なカラム材料、ポリスチレンビーズ、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、コロイド金属粒子、ガラス及び／又はシリコンチップならびに表面、ニトロセルロースストリップ、ナイロン膜、シート、デュラサイト、反応トレイのウェル（例、マルチウェルプレート）、プラスチックチューブなどを含む。固体支持体は、例えば、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、及びマグネタイトを含む、様々な物質のいずれかを含み得る。固体支持体上に対象抗体を固定化するための適切な方法は周知であり、イオン性、疎水性、共有結合性の相互作用などを含むが、これらに限定しない。固体支持体は、例えば、水溶液中で、可溶性又は不溶性であり得る。一部の態様では、適切な固体支持体は、一般的に、水溶液中で不溶性である。一部の実施形態では、固体支持体は、マイクロタイタープレートウェル、ポリビニリデンフッ素（ＰＶＤＦ）膜、カラムマトリックス、イムノチューブ、及び磁気ビーズからなる群から選択される。

一部の実施形態では、ファージディスプレイ抗体ライブラリーは、免疫原を含む組成物で以前に免疫化された非ヒト脊椎動物から由来する。一部の態様では、免疫原は、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含むポリペプチドの免疫原性量を含む。

一部の実施形態では、非ヒト脊椎動物は、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ブタ、ヤギ、ウシ、及びウマから選択される。

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合するが、しかし、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質には結合しない。

本開示はさらに、抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製するインシリコ方法を提供する。抗体を設計するためのインシリコ技術は、当業者に公知である。一部の態様では、本方法は、（ａ）ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質上のエピトープに特異的に結合するＣＤＲをインシリコで設計すること；（ｂ）一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）上にＣＤＲを移植すること；（ｃ）抗体ファージディスプレイを使用して標的ポリペプチドへの結合についてｓｃＦｖをスクリーニングすること；及び（ｄ）標的ポリペプチドに結合するｓｃＦｖを選択することを含み、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質上のエピトープ及び標的ポリペプチドの各々が、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含む。

一部の実施形態では、抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合するが、しかし、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質には結合しない。

本開示のヒト化抗体は、非ヒト動物（例、マウス）からのＶＨ領域及び／又はＶＬ領域からの一つ又は複数のＣＤＲあるいはその一部分を、ヒトＶＨ領域及び／又はＶＬ領域からの一つ又は複数のフレームワーク領域へ移すことにより構築され得る。場合により、ＶＨ領域及び／又はＶＬ領域中にこのように存在するヒトフレームワーク残基は、抗体の免疫原性を減少させるため、及び／又は結合親和性を維持するために必要とされる又は望ましい場合に、対応する非ヒト（例、マウス）残基により置換され得る。場合により、ＣＤＲ中に存在する非ヒトアミノ酸残基を、ヒト残基で置換してもよい。本発明のキメラ抗体又はヒト化抗体は、上に記載するように調製された非ヒトモノクローナル抗体の配列に基づいて調製することができる。重鎖及び軽鎖イムノグロブリンをコードするＤＮＡは、目的の非ヒトハイブリドーマから得られ、標準的な分子生物学技術を使用して非マウス（例、ヒト）イムノグロブリン配列を含むように操作することができる。例えば、キメラ抗体を作製するために、マウス可変領域を、当技術分野において公知の方法を使用して、ヒト定常領域に連結することができる（例、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．の米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）。ヒト化抗体を作製するために、マウスＣＤＲ領域を、当技術分野において公知の方法を使用して、ヒトフレームワーク中に挿入することができる（例えば、Ｗｉｎｔｅｒの米国特許第５，２２５，５３９号、ならびにＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌの米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号；及び第６，１８０，３７０号を参照のこと）。

本発明は、ＡＡＶｒｈ７４に結合する抗体又はそのフラグメントを産生する方法を提供し、ＡＡＶｒｈ７４に結合する抗体又はそのフラグメントをコードする単離核酸、あるいは、核酸が発現され、抗体が産生されるように、ＡＡＶｒｈ７４に結合する抗体又はそのフラグメントをコードする単離核酸を含むベクターを含む宿主細胞を培養することを含む。好ましくは、抗体は単離される。宿主細胞、核酸、及びベクターについては、上に記載するものを使用することができる。核酸の発現は、例えば、当技術分野において周知である組換えＤＮＡ技術及び遺伝子トランスフェクション方法の組み合わせ（例、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２）により、及び上でさらに概説されるように得ることができる。例えば、抗体又はその抗体フラグメントを発現させるために、部分又は全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学技術（例、目的の抗体を発現するハイブリドーマを使用したＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング）により得ることができ、ＤＮＡをベクター、例えば発現ベクター中などに挿入することができる。発現ベクター及び発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別々のベクター中に挿入することができる、又はより典型的には、両方の遺伝子を同じ発現ベクター中に挿入する。抗体遺伝子は、標準的な方法（例、抗体遺伝子フラグメント及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、又は制限部位が存在しない場合での平滑末端ライゲーション）により発現ベクター中に挿入される。本明細書中に記載する抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨ１セグメントに操作的に連結され、ＶＫセグメントがベクター内のＣＫセグメントに操作的に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域を既にコードする発現ベクター中にそれらを挿入することにより、任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製するために使用することができる。

抗ＡＡＶｒｈ７４抗体の精製
抗体についてのスクリーニングは、当業者に公知の抗体結合アッセイを使用して実施することができる。抗体スクリーニングアッセイを実施するための詳細な方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて見出すことができる。そのようなアッセイを使用して、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質への抗体結合を測定することができる。結合アッセイの例は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。一部の態様では、ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質とヒトＦｃの融合タンパク質を含み、それを固体支持体上に固定化させて、コンジュゲートされた二次抗体を用いて、融合タンパク質に結合された抗ＡＡＶｒｈ７４抗体を検出する。本発明の抗体は、サンプル（例、血液）中の抗ＡＡＶｒｈ７４抗体の測定のための陽性対照として使用され得る。一実施形態では、ＥＬＩＳＡは、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、又は競合ＥＬＩＳＡである。一実施形態では、本開示のＡＡＶｒｈ７４抗体は、ＡＡＶｒｈ７４に対する既存の抗体を、マウス、非ヒト霊長類、及びヒトを含む、対象からの血清又は血漿中で検出するためのアッセイにおいて使用することができる。一態様では、既存の抗体の検出に向けられた任意の実施形態について、既存の抗体は、ＡＡＶベースの遺伝子治療で処置された、そのような対象の血清又は血漿中に含まれる。一実施形態では、遺伝子治療はＡＡｖｒｈ７４ベースの遺伝子治療である。既存の抗体の検出を対象とする任意の実施形態の別の態様では、対象は、そのような遺伝子治療で処置されていない。アッセイは、ＥＬＩＳＡ又は電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）であることができる。そのようなアッセイでは、ＡＡＶｒｈ７４抗体は陽性対照又はキャプチャーとしての役割を果たす。ＥＬＩＳＡアプローチは、場合により、ＡＡＶｒｈ７４に対する抗体をオプションの陽性対照として有することが公知である血清又は血漿のいずれかを利用する。アッセイは、テスト血清又は血漿中に見出される抗体を抗原（ＡＡＶｒｈ７４カプシド）に結合させ、それに続く、吸光度の読み取りを通して抗体を定量化するための、基質を使用した抗体の検出を含む。抗原を受けるウェルの平均光学密度（ＯＤ）を、非コーティングウェルのＯＤに対して算出して、抗体エンドポイント力価を決定する。ＥＣＬＩＡアッセイは、間接ＥＬＩＳＡと同じ概念に従い、抗ｒｈ７４抗体を伴う又は伴わないサンプルを同定し、競合的結合を通じて陽性サンプルの特異性を決定し、滴定方法を通じて抗体のレベルを決定することができる。

加えて、抗ＡＡＶｒｈ７４抗体を使用して、サンドイッチＥＬＩＳＡを通じて遺伝子治療産物中のカプシドを定量化することができ、ここでＡＡＶｒｈ７４抗体は捕捉抗体に結合し、検出器抗体、酵素、及び基質の添加が続き、吸光度の読み取りを通じて定量化される。

一態様では、本開示は、対象からのサンプル中のＡＡＶカプシドに対する既存の抗体を検出する方法を提供し、サンプルをアッセイに供することを含み、請求項１～３０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントが、陽性対照キャプチャーとして使用される。一実施形態では、アッセイはイムノアッセイである。別の実施形態では、アッセイは、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は免疫沈降アッセイである。別の実施形態では、アッセイは電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）である。別の実施形態では、方法は、吸光度の読み取りを通じて既存の抗体を定量化することをさらに含む。

本発明の抗体は、当業者に公知の様々な方法で単離又は精製され得る。標準的な精製方法は、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズ排除又はゲル濾過、及び逆相を含む、クロマトグラフィー技術を含み、大気圧で又は高圧でシステム、例えばＦＰＬＣ及びＨＰＬＣなどを使用して行われる。精製方法はまた、電気泳動技術、免疫学的技術、沈殿技術、透析技術、及びクロマトフォーカシング技術を含む。限外濾過技術及び透析濾過技術がまた、タンパク質濃縮との併用において有用である。ＡＡＶｒｈ７４抗体を精製するために、選択された宿主細胞を、例えば、モノクローナル抗体精製のためのスピナーフラスコ中で成長させることができる。上清は、タンパク質Ａ－セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いた親和性クロマトグラフィーの前に濾過及び濃縮することができる。溶出した抗体をゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーによりチェックし、純度を保証することができる。本発明の好ましい抗体は、このように、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に結合する単離及び／又は精製された抗体である。

免疫学的アッセイ
本開示はまた、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出するための方法を提供し、本明細書中に記載する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物にサンプルを接触させることを含む。一部の態様では、サンプルは環境サンプルである。一部の態様では、サンプルは、生物学的サンプルであり、血液、例えば、全血液、尿、唾液、血漿、肺洗浄液、又はリンパ液を含むが、これらに限定しない。一部の実施形態では、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在は、抗体又はその抗原結合フラグメントの存在を検出することにより示される。

本開示の一部の態様では、抗体又はその抗原結合フラグメントの存在は、イムノアッセイにより検出される。抗体又は抗原結合フラグメントの存在を検出するための適切なイムノアッセイは、当業者に公知である。適切なイムノアッセイの例は、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び免疫沈降アッセイを含むが、これらに限定しない。本開示の例示的な、適切なイムノアッセイを実施するための方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにおいて見出される。

免疫蛍光アッセイによって、目的のタンパク質の発現及び／又は細胞位置が検出される。直接免疫蛍光アッセイでは、一次検出抗体はフルオロフォアと共役される。目的のタンパク質に結合された標識抗体を、蛍光顕微鏡を使用して検出する。間接免疫蛍光アッセイでは、二次抗体をフルオロフォアに共役させて、一次抗体に特異的に結合する。二次抗体を次に、蛍光顕微鏡を使用して検出する。

一部の態様では、本明細書中に開示する抗ＡＡＶｒｈ７４抗体は、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出するために、免疫蛍光アッセイにおいて一次抗体を含む。

免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイによって、目的のタンパク質の発現及び／又は細胞位置が検出される。直接免疫組織化学アッセイでは、酵素と共役された一次検出抗体は、目的のタンパク質に結合する。検出は、測定可能な産物、例えば色などを産生するための基質とのインキュベーションを介してコンジュゲート酵素の存在を評価することにより達成される。間接ＩＨＣアッセイでは、二次抗体は酵素に共役されて、一次抗体に特異的に結合する。二次抗体の検出は、測定可能な産物、例えば色などを産生するための基質とのインキュベーションを介してコンジュゲート酵素の存在を評価することにより達成される。

一部の態様では、本明細書中に開示する抗ＡＡＶｒｈ７４抗体は、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出するために、免疫組織化学アッセイにおいて一次抗体を含む。

ウェスタンブロットは、サンプル中の特定のタンパク質又はタンパク質を検出するために使用される。ウェスタンブロットでは、タンパク質サンプルを洗剤で処理してタンパク質をアンフォールドさせる。線状タンパク質をゲル電気泳動（例、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はＰＡＧＥ）を介してサイズにより分離して、次にブロッティング膜（例、ポリビニリデンジフルオリド－ＰＶＤＦ）に移す。膜を次に、目的のタンパク質に結合する一次抗体とインキュベートする。一次抗体は次に、標識された二次抗体により結合される。標識された二次抗体は、レポーター酵素に連結される。検出は、測定可能な産物、例えば色又は光などを産生するための基質とのインキュベーションを介して二次抗体上のコンジュゲート酵素の存在を評価することにより達成される。

一部の態様では、本明細書中に開示する抗ＡＡＶｒｈ７４抗体は、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出するために、ウェスタンブロットの一次抗体を含む。

ＡＡＶカプシド及び／又はＡＡＶ血清型に対する既存の中和抗体価ならびにそれらの交差反応性、あるいは投与により誘発されるそれらのものが、ＡＡＶベクターにより媒介される遺伝子治療及び遺伝子ワクチンの臨床適用についての懸念及び課題として出現している。ウイルスカプシドを認識する既存のＮａｂは、宿主細胞へのＡＡＶ侵入及び導入遺伝子送達を阻害し、それにより、ヒトにおける長期治療を阻害し得る。対象における中和抗体の存在及び交差反応性を決定することは、ＡＡＶベクターの臨床適用のために不可欠である。

従って、別の態様では、本開示は、サンプル中のＡＡＶ抗体の存在を検出する方法に関し、イムノアッセイによりＡＡＶ抗体を検出することを含み、イムノアッセイでは、本開示における単離抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物が使用される。一実施形態では、ＡＡＶ抗体はＡＡＶｒｈ７４抗体である。一実施形態では、サンプルは対象からの生物学的サンプルである。一実施形態では、サンプルは、対象からの血液、血清、血漿、体液、尿、又は組織である。一実施形態では、対象は、遺伝的障害を保有する哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウス、ネコ、又はイヌである。別の実施形態では、対象は患者である。別の実施形態では、患者は、心臓疾患、筋ジストロフィー、自己免疫疾患、代謝障害、糖尿病、眼疾患、及び／又は腎疾患に罹患する。別の実施形態では、患者はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又は肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）に罹患する。ＬＧＭＤは、それらの関連付けられる遺伝的欠損により分類されたＬＧＭＤ型のグループを指す。ＬＧＭＤの非限定的な例は、ＬＧＭＤ１Ａ ＬＧＭＤ１Ｂ ＬＧＭＤ１Ｃ ＬＧＭＤ１Ｄ、ＬＧＭＤ１Ｅ、ＬＧＭＤ１Ｆ、ＬＧＭＤ１Ｇ、ＬＧＭＤ２Ａ ＬＧＭＤ２Ｂ、ＬＧＭＤ２Ｃ、ＬＧＭＤ２Ｄ、ＬＧＭＤ２Ｅ、ＬＧＭＤ２Ｆ、ＬＧＭＤ２Ｈ、ＬＧＭＤ２Ｉ、ＬＧＭＤ２Ｊ、ＬＧＭＤ２Ｋ、及びＬＧＭＤ２Ｌを含む。

別の実施形態では、イムノアッセイは、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＭＡ）、中和アッセイ、蛍光材料を使用するフルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）、化学発光材料をｓ化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、及び粒子計数技術を用いるカウンティングイムノアッセイ（ＣＩＡ）、他の改変アッセイ、例えばウェスタンブロット、免疫組織化学（ＩＨＣ）、及び凝集などの一つ又は複数を含む。最も一般的な酵素イムノアッセイの一つは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。一実施形態では、イムノアッセイは、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、ＥＣＬＩＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は免疫沈降アッセイの一つ又は複数を含む。

用語「中和アッセイ」及び「血清ウイルス中和アッセイ」は、ウイルスの感染性を防止し得る全身抗体の存在を検出するための血清学的テストを指す。そのようなアッセイはまた、標的を中和するための抗体の結合能力（例、大きさ）又は効率を定性的又は定量的に識別し得る。用語「患者」は、予防的処置又は治療的処置のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。中和アッセイは、ウイルスの中和抗体の力価を定量化するために適合された特定のイムノアッセイである。一般的に、サンプル、例えば、血清サンプル及び抗体の溶液を希釈して、ウイルス懸濁液と混合させる。混合物を、インキュベーションした後に、宿主細胞のコンフルエントな単層に加えて、中和抗体がウイルスと反応することを可能にする。宿主細胞に対するウイルスの感染性を定量化する。最も一般的なアッセイは、プラーク減少中和テスト（ＰＲＮＴ）と呼ばれる。このアッセイでは、プラーク形成単位の濃度を、インキュベーションの期間（典型的には数日）後に培養物中に形成されるプラーク（感染細胞の領域）の数により推定する。ウイルスに依存して、プラーク形成単位は、顕微鏡観察、蛍光抗体、又は感染細胞と反応する特異的染料により測定される。プラークの数を、血清中の遊離ウイルスと比較して５０％だけ低下させる血清の濃度によって、抗体の存在量又はそれらの有効性の測定値が与えられる。ウイルス中和アッセイはまた、ＡＡＶに対する中和抗体を検出及び測定するためにも広く使用されている。いくつかのアッセイが、異なるＡＡＶ血清型に対する中和抗体を検出するために、当技術分野において提案されている。これらの方法の一部によって、ＡＡＶカプシドに対する全結合抗体が検出され、他によって、インビトロ又はインビボでＡＡＶベクターの形質導入を中和する抗体が検出される。ＡＡＶベクターに対する全抗体反応を評価するための初期方法は、ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット（Ｂｌａｃｋｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，１９６８，４０（２）：３１９；Ｍａｙｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ，１９７６，１２６（１）：１００；及びＰａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，１９７０；２（６）：７１６）を含んだ。ＥＬＩＳＡによって、非中和抗体及び中和抗体を含む、ＡＡＶ血清型に結合する血清中の抗体の総量を検出することができる（Ｃｈｉｒｍｕｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９９，６：１５７４－１５８３）；Ｅｒｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９９，５９：４０６－４１１；及びＢｏｕｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２０１０，２１：７０４－７１２）。ＥＬＩＳＡベースのアッセイは準備が簡単で、ＡＡＶに結合する全抗体の比較的高感度の測定をもたらすが、結果は必ずしもそれらの中和活性を反映していない。

別の実施形態では、ＡＡＶｒｈ７４抗体は中和抗体である。既存の抗体の検出を対象とする任意の実施形態の別の態様では、対象は、そのような遺伝子治療で処置されていない。アッセイは、ＥＬＩＳＡ又は電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）であることができる。そのようなアッセイでは、ＡＡＶｒｈ７４抗体は陽性対照又はキャプチャーとしての役割を果たす。ＥＬＩＳＡアプローチは、場合により、ＡＡＶｒｈ７４に対する抗体をオプションの陽性対照として有することが公知である血清又は血漿のいずれかを利用する。アッセイは、テスト血清又は血漿中に見出される抗体を抗原（ＡＡＶｒｈ７４カプシド）に結合させ、それに続く、吸光度の読み取りを通して抗体を定量化するための、基質を使用した抗体の検出を含む。抗原を受けるウェルの平均光学密度（ＯＤ）を、非コーティングウェルのＯＤに対して算出して、抗体エンドポイント力価を決定する。ＥＣＬＩＡアッセイは、間接ＥＬＩＳＡと同じ概念に従い、抗ｒｈ７４抗体を伴う又は伴わないサンプルを同定し、競合的結合を通じて陽性サンプルの特異性を決定し、滴定方法を通じて抗体のレベルを決定することができる。

ＥＬＩＳＡは、物質、例えばペプチド、タンパク質、及び抗体などを検出及び定量化するために設計されたアッセイである。ＥＬＩＳＡでは、抗原は固体表面上に固定化され、次に酵素に連結された抗体と複合体化される。検出は、測定可能な産物、例えば色などを産生するための基質とのインキュベーションを介してコンジュゲート酵素の存在を評価することにより達成される。検出酵素は、一次抗体に直接連結させることができる（直接ＥＬＩＳＡ）、又は一次抗体を認識する二次抗体を介して導入することができる（間接ＥＬＩＳＡ）。

一部の態様では、本明細書中に開示する抗ＡＡＶ抗体は、サンプル中のＡＡＶカプシドタンパク質の存在を検出するための直接又は間接ＥＬＩＳＡにおいて一次抗体を含む。一実施形態では、抗ＡＡＶ抗体は抗ＡＡＶｒｈ７４抗体である。ＡＡＶカプシドタンパク質はＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質である。

サンドイッチＥＬＩＳＡは、捕捉抗体を最初に固体支持体上に固定化し、その後に目的のタンパク質及び二次抗体の添加が続くＥＬＩＳＡである。サンドイッチＥＬＩＳＡでは、目的のタンパク質は、固体表面上に固定化された捕捉抗体と、目的のタンパク質に結合する検出抗体の間に結合する。

一部の態様では、本明細書中に開示する抗ＡＡＶｒｈ７４抗体は、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出するために、サンドイッチＥＬＩＳＡ中に捕捉抗体又は検出抗体を含む。

競合ＥＬＩＳＡは、また、阻害ＥＬＩＳＡ又は競合イムノアッセイとして公知であり、シグナル干渉の検出により抗原の濃度を測定する。サンプル抗原は参照抗原と競合し、特定量の標識抗体に結合する。参照抗原は、マルチウェルプレート上に予めコーティングされている。サンプルを標識抗体で予めインキュベートし、ウェルに加える。サンプル中の抗原の量に依存して、より多い又は少ない遊離抗体が、参照抗原を結合するために利用可能であり得る。従って、より多くの抗原がサンプル中に存在するほど、より少ない参照抗原が検出され、シグナルが弱くなる。

一部の態様では、本明細書中に開示する抗ＡＡＶｒｈ７４抗体は、競合ＥＬＩＳＡにおいて、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出するための標識抗体を含む。

化学発光アッセイは、発光性化学物質を、色素原の代わりに基質として利用する。検出抗体にコンジュゲートされる一般的な酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含むが、これらに限定しない。ルミノールは、ＨＲＰの検出のために使用される一般的な化学発光基質である。

一部の態様では、本明細書中に開示する抗ＡＡＶｒｈ７４抗体は、化学発光反応を触媒して、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出する酵素にコンジュゲートされる。

ラジオイムノアッセイでは、既知量の抗原を放射性標識して、その抗原についての既知量の抗体と混合させる。未知量の非標識抗原を含むサンプルを次に加える。非標識抗原及び放射性標識抗原は、抗体結合部位について競合する。非標識抗原の濃度が増加するにつれて、より多くの放射性標識抗原が置換され、抗体結合された放射性標識抗原と遊離の放射性標識抗原との比率が低下する。結合された放射性標識抗原を次に分離し、上清中に残っている遊離（非結合）の放射性標識抗原の放射活性を、ガンマカウンターを使用して測定する。

一部の態様では、本明細書中に開示する抗ＡＡＶｒｈ７４抗体は、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出するために、ラジオイムノアッセイにおいて使用される。

免疫沈降アッセイでは、目的のタンパク質について特異的な抗体を使用し、多くの異なるタンパク質、例えば植物もしくは動物の細胞又は組織の粗ライセート、あるいは体液などを含む溶液からそのタンパク質を単離する。直接免疫沈降アッセイでは、目的のタンパク質について特異的な抗体は、固相基質、例えば超常磁性マイクロビーズ又は顕微鏡アガロースビーズなどの上に固定化される。結合抗体を伴うビーズを次に溶液に加え、目的のタンパク質が抗体に結合して、ビーズにより捕捉される。目的のタンパク質を次に、ビーズから溶出させる。

間接免疫沈降アッセイでは、目的のタンパク質について特異的な抗体を溶液に直接加える。抗体は固相支持体にまだ付着していない。タンパク質Ａ／Ｇ中にコーティングされたビーズを混合物に加えて、抗体は、ここで目的のタンパク質に結合し、ビーズに結合する。目的のタンパク質を次に、ビーズから溶出させる。

一部の態様では、本明細書中に開示する抗ＡＡＶｒｈ７４抗体を使用して、サンプルからＡＡＶｒｈ７４を単離することができる。

上に記載するイムノアッセイ及び方法は、例示的及び非限定的であることが意図される。

本開示の方法は、サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を特異的に検出する。本開示の一部の態様では、本方法によって、ＡＡＶ８カプシドタンパク質は検出されない。一部の態様では、本方法によって、ＡＡＶ９カプシドタンパク質は検出されない。一部の態様では、本方法によって、サンプル中のＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質は検出されない。

キット
本開示の実施形態は、活性薬剤として本明細書中に記載する抗体又はその抗原結合フラグメントを含むインビトロ検出キット、及び使用のための指示を対象とする。本開示のキットは、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、及び免疫沈降アッセイにおける使用のためのキットを含み得るが、これらに限定しない。一部の態様では、キットは、放射性基、酵素基、又は蛍光基で標識された二次抗体又はその抗原結合フラグメントをさらに含むことができる。一部の態様では、キットは、追加の試薬、例えば緩衝剤、酵素、及び／又は基質など、ならびにキットのためのユーザーマニュアルを含む。

一実施形態では、本開示は、イムノアッセイによりＡＡＶ抗体を検出することを含む、サンプル中のＡＡＶ抗体の存在を検出するための方法を提供し、イムノアッセイでは、本開示の単離抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物を使用する。別の実施形態では、イムノアッセイは、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＭＡ）、フルオロイムノアッセイ（ＦＩＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）及び計数イムノアッセイ（ＣＩＡ）、中和アッセイ、又は免疫組織化学（ＩＨＣ）を含む。別の実施形態では、イムノアッセイは、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、ＥＣＬＩＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は免疫沈降アッセイの一つ又は複数を含む。別の実施形態では、イムノアッセイは中和アッセイである。別の実施形態では、ＡＡＶ抗体はＡＡＶｒｈ７４抗体である。別の実施形態では、ＡＡＶ抗体は中和抗体である。別の実施形態では、サンプルは、対象からの生物学的サンプルである。一実施形態では、対象は、遺伝的障害を保有する哺乳動物である。一実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、サル、ラット、マウス、ネコ、又はイヌである。一実施形態では、対象はヒト患者である。一実施形態では、患者は、心臓疾患、筋ジストロフィー、自己免疫疾患、代謝障害、糖尿病、眼疾患、及び／又は腎疾患に罹患する。一実施形態では、患者はデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又は肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）に罹患する。一実施形態では、本開示の単離抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物は、陽性対照又はキャプチャーとしての役割を果たす。

以下の実施例を、本発明をどのように作製及び使用するかの完全な開示及び記載を当業者に提供するように示しており、本発明者らが自分達の発明とみなすものの範囲を限定することを意図しておらず、また、本発明者らは、以下の実験が、実施される全て又は唯一の実験であることを表すことを意図していない。使用した数（例、量、温度など）に関して正確さを保証するために努力がなされているが、しかし、一部の実験誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。

実施例１
ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質への抗ＡＡＶｒｈ７４抗体の結合。
本開示の方法に従って作製された抗体を、ＡＡＶｒｈ７４へのそれらの特異的結合についてテストした。

酵素結合免疫吸着アッセイを、ＡＡＶｒｈ．７４カプシドへの抗体の結合を測定するために実施した。簡単には、Ｉｍｍｕｌｏｎ－４ ＨＢＸ ９６ウェルプレートを、１ウェル当たり１００μｌの、炭酸緩衝液（ｐＨ ９．４）中の２Ｘ１０^１０ ｖｇ／ｍｌ ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９ウイルスストックでコーティングした。プレートを密封し、４℃で一晩保存した。プレートを、１ウェル当たり１００μｌの、ＰＢＳ中の５％非脂肪乾燥乳及び１％正常ヤギ血清で、３７℃で１時間にわたりブロッキングした。抗体ストック又はサンプルをブロッキング溶液中で連続希釈（２倍）し、１００μｌを、炭酸緩衝液中のＡＡＶ粒子でコーティングされたウェル及び炭酸緩衝液のみでコーティングされたウェルの両方に二通りで加えた。１：５０希釈の非ヒト霊長類血清を、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９についての陽性対照として使用した一方で、マウス抗ＡＡＶｒｈ７４血清をマウス一次抗体についての陽性対照として使用した。プレートを、インキュベーション前及び後に１時間にわたり室温でインキュベートし、ウェルを、２００μｌのＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標））で５回洗浄した。ブロッキング溶液を再び使用し、二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを１：２０，０００希釈で希釈した。ウェルは１００μｌの二次抗体を受けて、５回洗浄し、乾燥してブロットする前に、室温で３０分間にわたりインキュベートした。テトラメチベンジジン基質（１００μｌ／ウェル）を加えて、１００μｌの１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止する前に、室温で２～３分間にわたり暗所でインキュベートした。４５０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して測定した。抗ＡＡＶｒｈ７４抗体の吸光度データを図１及び図２中に示す。

図１は、ＡＡＶｒｈ７４への結合についての抗体のスクリーニングを示す。図２は、 ＡＡＶ８又はＡＡＶ９のいずれかに比較してずっと高い親和性でＡＡＶｒｈ７４に特異的に結合する抗体についての抗体のテストを示す。結果は、ＡＡＶｒｈ７４への血清型特異的結合を示し、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９と交差反応性をほとんど又は全く伴わない。

実施例２
ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質へのキメラ抗ＡＡＶｒｈ７４抗体の結合。
酵素結合免疫吸着アッセイを、異なる抗体濃度でのＡＡＶｒｈ７４カプシドへのキメラ抗体の結合を測定するために上のように実施した。

図３Ａ～３Ｃは、キメラＩｇＧ１ １０Ｄ２及びキメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８の滴定曲線を示す。ＡＡＶｒｈ７４へのキメラ抗体の結合を、様々な抗体濃度でバックグラウンドシグナルと比較した。図３Ａは、キメラＩｇＧ１ １０Ｄ２抗体についての滴定曲線を示し、エンドポイント力価１：１６３８４００を伴った。図３Ｂは、キメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８抗体の滴定曲線を示し、エンドポイント力価１：６３８４００を伴う。図３Ｃは、キメラＩｇＧ１ １０Ｄ２及びキメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８についての曲線のオーバーレイを示す。

キメラＩｇＧ１ １０Ｄ２についての交差反応（図４Ａ～４Ｄ）及びキメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８（図 ５Ａ～５Ｄ）を異なる抗体濃度でテストした。図４Ａ～４Ｃは、キメラＩｇＧ１ １０Ｄ２が、ＡＡＶ８（図４Ｂ）又はＡＡＶ９（図４Ｃ）のいずれかと比較してずっと高い親和性でＡＡＶｒｈ７４に特異的に結合することを示す（図４Ａ）。陽性対照及び陰性対照を図４Ｄ中に示す。結果は、ＡＡＶｒｈ７４への血清型特異的結合を示し、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９と交差反応性をほとんど又は全く伴わない。図５Ａ～５Ｄは、キメラＩｇＧ１ ２８Ｄ８が、ＡＡＶ８（図５Ｂ）又はＡＡＶ９（図５Ｃ）のいずれかと比較してずっと高い親和性でＡＡＶｒｈ７４に特異的に結合することを示す（図５Ａ）。陽性対照及び陰性対照を図５Ｄ中に示す。結果は、ＡＡＶｒｈ７４への血清型特異的結合を示し、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９と交差反応性をほとんど又は全く伴わない。

図６Ａ～６Ｃは、キメラＩｇＡ １０Ｄ２及びキメラＩｇＡ ２８Ｄ８の滴定曲線を示す。ＡＡＶｒｈ７４へのキメラ抗体の結合を、様々な抗体濃度でバックグラウンドシグナルと比較した。図６Ａは、キメラＩｇＡ １０Ｄ２についての滴定曲線を示し、エンドポイント力価１：４０９６００を伴う。図６Ｂは、キメラＩｇＡ ２８Ｄ８についての滴定曲線を示し、エンドポイント力価１：８１９２００を伴う。図６Ｃは、キメラＩｇＡ １０Ｄ２及びキメラＩｇＡ ２８Ｄ８についての滴定曲線のオーバーレイを示す。

キメラＩｇＡ １０Ｄ２（図７Ａ～７Ｄ）及びキメラＩｇＡ ２８Ｄ８（図８Ａ～８Ｄ）についての交差反応を異なる抗体濃度でテストした。図７Ａ～７Ｃは、キメラＩｇＡ １０Ｄ２が、ＡＡＶ８（図７Ｂ）又はＡＡＶ９（図７Ｃ）のいずれかと比較してずっと高い親和性でＡＡＶｒｈ７４に特異的に結合することを示す（図７Ａ）。陽性対照及び陰性対照を図７Ｄ中に示す。結果は、ＡＡＶｒｈ７４への血清型特異的結合を示し、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９と交差反応性をほとんど又は全く伴わない。図８Ａ～８Ｃは、キメラＩｇＡ ２８Ｄ８が、ＡＡＶ８（図８Ｂ）又はＡＡＶ９（図８Ｃ）のいずれかと比較してずっと高い親和性でＡＡＶｒｈ７４に特異的に結合することを示す（図８Ａ）。陽性対照及び陰性対照を図８Ｄ中に示す。結果は、ＡＡＶｒｈ７４への血清型特異的結合を示し、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９と交差反応性をほとんど又は全く伴わない。

モノクローナル抗体７Ｄ４Ｂ９（図９Ａ）、１Ｃ４Ｆ４（図９Ｂ）、及び６Ｅ１０Ｂ５（図９Ｃ）についての交差反応を異なる抗体濃度でテストした。酵素結合免疫吸着アッセイを、ＡＡＶｒｈ．７４カプシドへの抗体の結合を測定するために実施した。簡単には、Ｉｍｍｕｌｏｎ－４ ＨＢＸ ９６ウェルプレートを、１ウェル当たり１００μｌの、炭酸緩衝液（ｐＨ ９．４）中の２Ｘ１０^１０ ｖｇ／ｍｌ ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９ウイルスストックでコーティングした。プレートを密封し、４℃で一晩保存した。プレートを、１ウェル当たり１００μｌの、ＰＢＳ中の５％非脂肪乾燥乳及び１％正常ヤギ血清で、３７℃で１時間にわたりブロッキングした。抗体ストック又はサンプルをブロッキング溶液中で連続希釈（１０倍）し、１００μｌを、炭酸緩衝液中のＡＡＶ粒子でコーティングされたウェル及び炭酸緩衝液のみでコーティングされたウェルの両方に二通りで加えた。１：５０希釈の非ヒト霊長類血清を、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９についての陽性対照として使用した一方で、マウス抗ＡＡＶｒｈ７４血清をマウス一次抗体についての陽性対照として使用した。プレートを、インキュベーション前及び後に１時間にわたり室温でインキュベートし、ウェルを、２００μｌのＰＢＳ－Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標））で５回洗浄した。ブロッキング溶液を再び使用し、二次抗体、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰを１：１０，０００希釈で希釈した。ウェルは１００μｌの二次抗体を受けて、５回洗浄し、乾燥してブロットする前に、室温で３０分間にわたりインキュベートした。テトラメチベンジジン基質（１００μｌ／ウェル）を加えて、１００μｌの１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４を加えて反応を停止する前に、室温で２～３分間にわたり暗所でインキュベートした。４５０ｎｍでの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して測定した。

図９Ａ～９Ｃは、全ての三つのモノクローナル抗体（７Ｄ４Ｂ９、１Ｃ４Ｆ４、６Ｅ１０Ｂ５）が、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９のいずれかと比較してより高い親和性でＡＡＶｒｈ７４に特異的に結合したことを示す。陽性対照及び陰性対照を図９Ｄ中に示す。図９Ｅは、７Ｄ４Ｂ９、１Ｃ４Ｆ４、及び６Ｅ１０Ｂ５についての滴定曲線のオーバーレイを示す。全ての三つの抗体が、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９との比較的低い交差反応性を伴った、ＡＡＶｒｈ７４への血清型特異的結合を示す。

実施例３
サンドイッチＥＬＩＳＡ：血清中の抗体の決定
材料
捕捉抗体＝本発明の抗ＡＡＶｒｈ７４ ｍＡｂ

テストサンプル＝血清又は血漿は検出において役立つ。

抗原＝ＡＡＶｒｈ７４カプシド

ブロッキング溶液＝５％乾燥乳、１％ヤギ血清、１００ｍＬ ＰＢＳ

洗浄緩衝液＝０．０５％ ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）

陽性対照＝抗ＡＡＶｒｈ７４抗体を有することが公知である血清

二次抗体＝抗ヒト－ＨＲＰコンジュゲート抗体

基質＝ＴＭＢ

停止溶液＝硫酸

方法
９６ウェルプレートの全てのウェルを、炭酸緩衝液中で希釈された捕捉抗体で、４℃で一晩コーティングする。内容物を廃棄し、プレートを３７℃で１時間にわたりブロッキング溶液でブロッキングする。ブロッキング溶液を廃棄し、ＡＡＶｒｈ７４カプシドを、捕捉抗体でコーティングされたウェルに二通りに加える。加えて、炭酸緩衝液を二通りのウェルに加えて、バックグラウンド値を決定する。非結合カプシドを廃棄して、テスト血清を、ブロッキング溶液中での１：２５の開始希釈で加えて、連続希釈する。陽性対照をブロッキング溶液中で１：４００希釈で希釈する。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、その後にブロッキング溶液中の１：１０，０００の希釈での二次インキュベーションが続く。プレートを洗浄し、緩衝液を廃棄し、基質を加えて、その後に硫酸でのアッセイの終了が続く。プレート吸光度を４５０ｎｍで読み取る。
分析及び結果

吸光度比率を、抗原コーティングウェルの平均光学密度（ＯＤ）から非抗原コーティングウェルの平均ＯＤを減算し、非抗原コーティングウェルの平均（ＯＤ）により割ることにより決定する。≧２．００の比率は、陽性の抗体応答と考えられる。エンドポイント力価は、≧２．００の比率をもたらす最後の血清希釈を特定することにより決定される。抗体カットオフは、＞１：４００の血清希釈で定義される。
実施例４
サンドイッチＥＬＩＳＡ：サンプルＯＲベクターの一覧表中に存在するベクターの決定。
材料

捕捉Ａｂ：ＡＤＫ８クローン

テストサンプル又は抗原：抗ＡＡＶｒｈ７４含有サンプル

ブロッキング溶液：５％乾燥乳、１％ヤギ血清又はＢＳＡ、１００ｍＬ ＰＢＳ

洗浄緩衝液＝０．０５％ ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）

検出抗体：本発明の抗ＡＡＶｒｈ７４ ｍＡｂ（ビオチンコンジュゲート）

二次抗体：ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン

基質：ＴＭＢ

停止溶液：硫酸

方法
９６ウェルプレートのウェルを、４℃で、炭酸緩衝液中での所望の量の希釈捕捉抗体でコーティングする。ＡＡＶｒｈ７４カプシド標準サンプル及びテストサンプルを、アッセイ緩衝液中で連続的に希釈し、捕捉抗体でコーティングされた対応するウェル中に二通りに加える。プレートを、３７℃で１時間にわたりインキュベートする。プレートを、希釈された２８Ｄ８ビオチン抗体（本発明のｍＡｂ）を全ての指定ウェルに加える前に洗浄し、１時間にわたりインキュベートする。プレートを洗浄し、その後に１時間にわたる希釈されたＳｔｒｅｐ－ＨＲＰ（１：５０００～１：１０，０００）の二次インキュベーションが続く。プレートを洗浄した後、各ウェル中に既製のＴＭＢを加え、室温で１０～１５分間にわたりインキュベートした。反応を、各ウェル中に硫酸を加えることにより停止させて、色強度を波長４５０ｎｍの光度計で測定する。
分析及び結果

任意の所与のサンプル中に存在するカプシドの量を、４５０でのＯＤ及び標準曲線から得られた４パラメータロジスティック曲線（４ＰＬ）等式を使用して外挿する。

実施例５ 電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）ＥＬＩＳＡ：血清中の抗体の決定
材料
捕捉試薬＝ＡＡＶｒｈ７４カプシド又はウイルス様粒子

検出抗体＝スルホ－ＴＡＧ標識抗ヒトＩｇＧ抗体

テストサンプル＝血清又は血漿

陽性対照＝本発明のＡＡＶｒｈ７４ ｍＡｂ

ブロッキング溶液＝５％乾燥乳、１％ヤギ血清又はＢＳＡ、１００ｍＬ ＰＢＳ

洗浄緩衝液＝０．０５％ ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ（登録商標）

読み取り緩衝液＝ＭＳＤ緩衝液又は同等物

シグナル反応器＝トリプロピルアミン又は同等物

方法／原理：
ＥＣＬ ＥＬＩＳＡでは、検出抗体にコンジュゲートされた電気化学発光標識を使用する。標識はＳＵＬＦＯ－ＴＡＧと呼ばれ、超高感度検出を可能にする。電気が、特殊な機器によりプレート電極に適用されて、ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ標識による光放射に導く。光強度を次に測定し、サンプル中の分析物を定量化する。

ウェルを、４℃で一晩、捕捉試薬（ＡＡＶｒｈ７４カプシド）でコーティングする。プレートへの非特異的結合を、ブロッキング緩衝液を１時間にわたり加えることによりブロッキングする。ブロッキングを破棄し、その後に、指定されたウェルへの、希釈されたテスト血清、陰性、及び対照サンプルの添加が続く。希釈された抗ＡＡＶｒｈ７４の本発明のｍＡｂを陽性対照として使用する。ウェルを洗浄して、検出抗体（希釈された抗ヒトＩｇＧスルホ－ＴＡＧ）を加える。プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、その後に各ウェルへの読み取り緩衝液の添加が続く。読み取り緩衝液を加えた後、プレートを直ちに読み取る又はスキャンする。

分析及び結果
電流を、シグナル反応器の存在を決定するために使用する。シグナルは、血清内の抗体の量に対する。

表面プラズモン共鳴
序論／原理：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、標識フリーの検出方法であり、生体分子相互作用についての臨床分析における信頼できるプラットフォームである。この技術によって、高い感度を伴い、標識の必要性を伴わず、リアルタイムで相互作用を測定することが可能になる。表面プラズモン共鳴は、入射光の光子が金属表面（金表面）に当たった際に起こる。特定の入射角で、光エネルギーの一部分は、金属コーティングを通して金属表面層中の電子と共役して、それは次に、励起に起因して移動する。電子移動は現在、プラズモンと呼ばれ、それらは金属表面に平行に伝搬する。プラズモン振動は次に、金属表面とサンプル溶液の間での境界から電場を生成する。定義されたＳＰＲ角は、そこで、共鳴が、一定の光源波長及び金属薄表面の条件で生じ、金属表面近くの材料の屈折率に依存的である。結果的に、感知媒体の反射率において（例、生体分子付着を通じて）小さな変化がある場合、プラズモンは形成されない。検出は、このように、検出器上で得られた反射光における変化を測定することにより達成される。また、表面濃度の量は、反射光強度をモニターすること又は共鳴角度シフトを追跡することにより定量化することができる。典型的には、ＳＰＲバイオセンサーは、１０ｐｇ／ｍＬの順序の検出限界を有する。

基本的な方法：
表面プラズモン共鳴は、ＨＥＰＥＳ緩衝液を使用し、機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００などを使用して行われる。本発明のｍＡｂを、所望の濃度のＡＡＶｒｈ７４と混合して、アミドカップリングによりセンサーチップ上に固定化させる。テスト分析物（血清サンプル）をチップ及び異なる希釈を通して流す。固定化ＡＡＶへの、血清サンプル中に存在するＡＡＶｒｈ７４特異的抗体の結合に起因する屈折率における変化を記録する。データ及びグラフは、ＢＩＡｃｏｒｅソフトウェアを使用して生成される。標準曲線を生成することができ、血清中に存在する抗体の量を、グラフ等式を使用して外挿することができる。

特定の実施形態の前述の記載は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにしており、それは、他者は、当技術分野の技能内の知識を適用することにより、本開示の一般的な概念から逸脱することなく、過度の実験を行うことなく、様々な適用のために、そのような特定の実施形態を容易に変更及び／又は適応することができる。従って、そのような適応及び変更は、本明細書中に提示する教示及びガイダンスに基づいて、開示する実施形態の同等物の意味及び範囲内であることが意図される。本明細書中の語句又は用語は、本明細書の用語又は語句が、教示及びガイダンスに照らして当業者により解釈されるように、限定ではなく、説明の目的のためであることを理解すべきである。

Claims (60)

1. ＡＡＶカプシドタンパク質のエピトープに特異的に結合することが可能な単離された抗ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記エピトープが、アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）又はその一部を含む、単離された抗ＡＡＶ（アデノ関連ウイルス）抗体又はその抗原結合フラグメント。
2. ＡＡＶカプシドタンパク質内のエピトープに特異的に結合する、単離された抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントであって、前記抗体が、前記エピトープへの結合について参照抗体と競合し、
   ａ．前記参照抗体の重鎖可変領域が 配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ならびに
   ｂ．前記参照抗体の軽鎖可変領域が 配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離された抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む単離抗体又はその抗原結合フラグメントであって、
   ａ．前記ＶＨ ＣＤＲ１ドメインが、配列番号３３、配列番号３９、配列番号４６、配列番号５２、及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
   ｂ．前記ＶＨ ＣＤＲ２ドメインが、配列番号３４、配列番号４０、配列番号４７、配列番号５３、及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
   ｃ．前記ＶＨ ＣＤＲ３ドメインが、配列番号３５、配列番号４１、配列番号４８、配列番号５４、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
   ｄ．前記ＶＬ ＣＤＲ１ドメインが、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５５、及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；
   ｅ．前記ＶＬ ＣＤＲ２ドメインが、配列番号３７、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５６、及び配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；あるいは
   ｆ．前記ＶＬ ＣＤＲ３ドメインが、配列番号３８、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５７、及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. ａ．配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに
   ｂ．配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. 前記抗体が、ＡＡＶｒｈ７４のカプシドタンパク質と比較してより少ない親和性で、ＡＡＶ８及び／又はＡＡＶ９のカプシドタンパク質に結合する、請求項１～４のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
6. 前記重鎖可変領域が、ＧＶＡＨＹＳＤＳＲＦＡＦＤＹ（配列番号３５）、ＧＮＡＨＰＧＧＳＡＦＶＹ（配列番号４１）、ＲＧＳＹＹＹＤＳＳＰＡＷＦＡＹ（配列番号４８）、ＲＧＶＤＳＳＧＹＧＡＦＡＹ（配列番号５４）、及びＴＲＧＴＳＴＭＩＳＴＦＡＦＶＹ（配列番号６０）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ３を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
7. 前記重鎖可変領域が、ＮＹＧＭＮ（配列番号３３）、ＤＹＧＭＮ（配列番号３９）、ＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号４６）、ＹＴＦＴＫＹＧＭＮ（配列番号５２）、及びＹＴＦＴＮＹＧＭＮ（配列番号５８）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ１をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
8. 前記重鎖可変領域が、ＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＤＤＦＫＧ（配列番号３４）、ＷＩＮＴＮＴＧＥＰＴＹＧＤＤＦＫＧ（配列番号４０）、ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号４７）、ＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号５３）、及びＷＭＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹ（配列番号５９）からなる群から選択されるＶＨ ＣＤＲ２をさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
9. 前記軽鎖可変領域が、ＳＶＳＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号３６）、ＳＡＳＳＧＶＴＹＭＨ（配列番号４２）、ＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号４９）、ＳＳＶＳＹＭＨ（配列番号５５）、及びＳＳＶＲＹＭＨ（配列番号６１）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ１を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
10. 前記軽鎖可変領域が、ＹＴＳＮＬＡＳ（配列番号３７）、ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号４３）、ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５０）、ＬＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号５６）、及びＶＷＩＹＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号６２）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ２をさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
11. 前記軽鎖可変領域が、ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号３８）、ＱＱＲＳＳＹＰＦＴ（配列番号４４）、ＱＱＲＳＴＹＰＦ（配列番号５１）、ＱＱＲＳＦＹＰＦ（配列番号５７）、及びＱＱＲＴＹＹＰＦ（配列番号６３）からなる群から選択されるＶＬ ＣＤＲ３をさらに含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
12. 前記抗体が、
    ａ．配列番号３３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号３４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号３５に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号３６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号３８に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    ｂ．配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４１に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号４３に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号４４に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    ｃ．配列番号４６に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号４７に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号５１に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；
    ｄ．配列番号５２に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５３に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号５４に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号５５に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号５６に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号５７に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３；ならびに
    ｅ．配列番号５８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、配列番号５９に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ２、配列番号６０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ３、配列番号６１に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、配列番号６２に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ２、及び配列番号６３に示されるアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ３、からなる群から選択される、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３ドメインを含む重鎖可変領域ならびにＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３ドメインを含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
13. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、
    ａ．配列番号１に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号２に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    ｂ．配列番号５に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び配列番号６に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    ｃ．配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号１４に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；
    ｄ．配列番号９に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；あるいは
    ｅ．配列番号１７に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；及び、配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％ 、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１２に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
14. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントの前記重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
15. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントの前記軽鎖可変領域が、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
16. ａ．前記重鎖可変領域が、配列番号１、配列番号５、配列番号１３、配列番号９、及び配列番号１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ならびに
    ｂ．前記軽鎖可変領域が、配列番号２、配列番号６、配列番号１４、配列番号１０、及び配列番号１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
17. 配列番号１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
18. 配列番号５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
19. 配列番号１３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
20. 配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
21. 配列番号１７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
22. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、放射性基、酵素基、又は蛍光基で標識されている、請求項１～２１のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
23. 前記抗体が、同じ、もしくは異なる抗体に遺伝子的に融合されたＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、ダイアボディ、トリアボディ、及びｓｘＦｖからなる群から選択される全長抗体又は抗体フラグメントである、請求項１～２２のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
24. 前記抗体が、マウス抗体、キメラマウス／ヒト抗体、ヒト抗体、操作抗体、又はヒト化抗体である、請求項１～５のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
25. 前記抗体が、配列番号２１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２４に記載の単離抗体。
26. 前記抗体が、配列番号２３に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２４に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２４に記載の単離抗体。
27. 前記抗体が、配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２４に記載の単離抗体。
28. 前記抗体が、配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項２４に記載の単離抗体。
29. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが二重特異性抗体である、請求項１～２８のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
30. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが多重特異性抗体である、請求項１～２９のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
31. 請求項１～３０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む単離ポリヌクレオチド。
32. 前記核酸配列が、
    ａ．配列番号３３、配列番号３９、配列番号４６、配列番号５２、及び配列番号５８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ１ドメイン；
    ｂ．配列番号３４、配列番号４０、配列番号４７、配列番号５３、及び配列番号５９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ２ドメイン；
    ｃ．配列番号３５、配列番号４１、配列番号４８、配列番号５４、及び配列番号６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＨ ＣＤＲ３ドメイン；
    ｄ．配列番号３６、配列番号４２、配列番号４９、配列番号５５、及び配列番号６１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ１ドメイン；
    ｅ．配列番号３７、配列番号４３、配列番号５０、配列番号５６、及び配列番号６２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ２ドメイン；あるいは
    ｆ．配列番号３８、配列番号４４、配列番号５１、配列番号５７、及び配列番号６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＶＬ ＣＤＲ３ドメインをコードする、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
33. ａ．前記重鎖可変領域をコードする核酸が、配列番号３、配列番号７、配列番号１５、配列番号１１、及び配列番号１９からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含み；ならびに
    ｂ．前記軽鎖可変領域をコードする核酸が、配列番号４、配列番号８、配列番号１６、配列番号１２、及び配列番号２０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項３１又は３２に記載のポリヌクレオチド。
34. 請求項３１～３３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
35. 請求項３４に記載のベクターを含む宿主細胞。
36. 請求項１～３０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントを含む、インビトロ検出キット。
37. 放射性基、酵素基、及び／又は蛍光基で標識された第二抗体又はその抗原結合フラグメントをさらに含む、請求項３６に記載のキット。
38. サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在を検出するための方法であって、前記サンプルを、請求項１～３０のいずれか一項に記載の単離抗体又はその抗原結合フラグメントを含む組成物と接触させることを含む、方法。
39. 前記サンプル中のＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質の存在が、前記抗体又はその抗原結合フラグメントの存在を検出することにより示される、請求項３８に記載の方法。
40. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントの存在が、イムノアッセイにより検出される、請求項３９に記載の方法。
41. 前記イムノアッセイが、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は免疫沈降アッセイのうちの一つ又は複数を含む、請求項４０に記載の方法。
42. 前記方法が、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質と比較して、前記サンプル中のＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質の検出に対する感度が低い、請求項３８～４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 前記単離抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合するが、しかし、前記サンプル中のＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質には結合しない、請求項４２に記載の方法。
44. （ａ）前記アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含むポリペプチドの免疫原性量を非ヒト脊椎動物に投与すること；（ｂ）前記動物から脾臓細胞を回収すること；（ｃ）前記回収された脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマを生成すること；（ｄ）ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマについてスクリーニングすること；及び（ｅ）前記抗体を回収することを含む、抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法。
45. 前記非ヒト脊椎動物がトランスジェニック動物であり、前記トランスジェニック動物がヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する、請求項４４に記載の方法。
46. 前記非ヒト脊椎動物に一つ又は複数の免疫アジュバントを投与することをさらに含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
47. 前記非ヒト脊椎動物が、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ブタ、ヤギ、ウシ、及びウマから選択される、請求項４４～４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合するが、しかし、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質には結合しない、請求項４４～４７のいずれか一項に記載の方法。
49. （ａ）前記アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含む抗原を固体支持体上に固定化すること；（ｂ）ファージディスプレイ抗体ライブラリーを前記固定化抗原に適用すること；（ｃ）前記抗原に結合するファージについて前記ライブラリーをスクリーニングすること；及び（ｄ）抗原結合ファージを回収することを含む、抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製する方法。
50. 前記固体支持体が、マイクロタイタープレートウェル、ポリビニリデンフッ素（ＰＶＤＦ）膜、カラムマトリックス、イムノチューブ、及び磁気ビーズからなる群から選択される、請求項４９に記載の方法。
51. 前記ファージディスプレイ抗体ライブラリーが、前記アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含むポリペプチドの免疫原性量を含む組成物で以前に免疫化された非ヒト脊椎動物から由来する、請求項４９又は５０に記載の方法。
52. 前記非ヒト脊椎動物が、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリ、非ヒト霊長類、ブタ、ヤギ、ウシ、及びウマから選択される、請求項５１に記載の方法。
53. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合するが、しかし、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質には結合しない、請求項４９～５２のいずれか一項に記載の方法。
54. （ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質上のエピトープに特異的に結合するＣＤＲをインシリコで設計すること；（ｂ）前記ＣＤＲを単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）上に移植すること；（ｃ）抗体ファージディスプレイを使用して、標的ポリペプチドへの結合について前記ｓｃＦｖをスクリーニングすること；及び（ｄ）前記標的ポリペプチドに結合するｓｃＦｖを選択することを含み、ＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質上の前記エピトープ及び前記標的ポリペプチドの各々が、前記アミノ酸配列ＱＧＡＧＫＤＮＶＤＹＳＳ（配列番号４５）を含む、抗ＡＡＶ抗体又はその抗原結合フラグメントを作製するインシリコ方法。
55. 前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、ＡＡＶ８カプシドタンパク質及び／又はＡＡＶ９カプシドタンパク質と比較してより高い親和性でＡＡＶｒｈ７４カプシドタンパク質に特異的に結合する、請求項５４に記載の方法。
56. 対象からのサンプル中のＡＡＶカプシドに対する既存の抗体を検出する方法であって、前記サンプルをアッセイに供することを含み、請求項１～３０のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントが陽性対照として使用される、方法。
57. 前記アッセイがイムノアッセイである、請求項５６に記載の方法。
58. 前記アッセイが、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ウェスタンブロット、直接酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、化学発光アッセイ、ラジオイムノアッセイ、又は免疫沈降アッセイである、請求項５６に記載の方法。
59. 前記アッセイが電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）である、請求項５６に記載の方法。
60. 吸光度読み取りを通じて前記既存の抗体を定量化することをさらに含む、請求項５６に記載の方法。

Images