KR20230124433A - SARS-CoV-2 핵단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도 - Google Patents

SARS-CoV-2 핵단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 핵단백질(nucleoprotein, NP)에 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

SARS-CoV-2 핵단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도{An antibody specific to nucleoprotein of SARS-CoV-2 and uses thereof}
본 발명은 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 핵단백질(nucleoprotein, NP)에 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
코로나바이러스감염증-19(coronavirus disease 2019, COVID-19)는 2019년 12월에 처음 보고된 사람 코로나바이러스(human coronavirus)인 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)에 감염되어 발생하는 중증급성호흡기 질환이다. 코로나바이러스는 1920년 후반에 닭에서 처음 발견된 뒤 개, 돼지, 조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에서도 발견되었다. 사람 코로나바이러스는 감염자의 비말이 호흡기나 눈, 코, 입의 점막으로 침투될 때 전염되는 것으로 알려져 있으며, 계절에 따라 호흡기 감염증의 15-35%를 차지하며 대부분 감기와 같은 경미한 증상을 일으킨다. 하지만 치명적인 호흡기 질환을 일으킨 2009년에 발생한 사스(SARS)와 2012년 발생한 중동 호흡기 증후군(메르스, middle east respiratory syndrome, MERS) 역시 사람 코로나바이러스에 의한 감염성 질환으로 알려졌다. 특히, SARS-CoV-2 감염에 의한 COVID-19은 높은 치사율과 빠른 전파력에 의해 전세계로 확산되어 2020년 3월 세계보건기구(world health organization, WHO)에서 팬더믹(pandemic)으로 선언되었고, 일부 국가는 확진자가 다수 발생한 국가로부터의 입국을 통제하는 등 확산 방지에 총력을 기울이고 있다. 또한 SARS-CoV-2 변이 바이러스가 세계적으로 여러 지역에서 출몰하면서 COVID-19을 진단하고 통제하는 것이 더욱 어려운 상황이다.
감염병 통제를 위한 가장 필수적인 방법은 바이러스 감염 진단으로, 진단 시 가장 중요한 요소는 정확성과 신속성이다. 이에 따라, 분석 대상 개체의 코로나바이러스 감염 여부를 신속 정확히 진단할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 SARS-CoV-2가 발현하는 항원 중 핵단백질(nucleoprotein, NP)에 특이적으로 결합하는 항체를 개발하여 SARS-CoV-2 감염의 진단에 사용할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
KR 10-2245849 B1 KR 10-2021-0076854 A
본 발명의 목적은 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 핵단백질(nucleoprotein, NP)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편을 포함하는 SARS-CoV-2 감염 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편을 이용하여, 생물학적 시료에 존재하는 SARS-CoV-2를 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 하나의 양태는 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 핵단백질(nucleoprotein, NP)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명의 용어, "SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2)"는 호흡기 질환인 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 야기하는 바이러스이다.
SARS-CoV-2는 분류학적으로 SARS-CoV의 계통(strain)으로, 동물원성 감염증의 기원(zoonotic origins)을 가지며, 박쥐 코로나바이러스와 근접한 유전적 유사성을 갖는 것으로 간주된다. 상기 SARS-CoV-2는 주로 사람들 간의 긴밀한 접촉을 통해 또는 기침이나 재채기시 발생하는 비말을 통해 전파되며, 주로 인간세포 표면에 존재하는 수용체 안지오텐신 전환 효소 2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)에 결합하여 인간세포에 진입하는 것으로 알려져 있다.
SARS-CoV-2는 RNA 의존적 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA polymerase), 스파이크(S), 핵단백질(뉴클레오캡시드, NP), 멤브레인(M) 단백질, 엔벨로프(E) 및 단백질 및/또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. SARS-CoV-2 구조 단백질 중 핵단백질(NP)은 유전물질인 ssRNA와 그 주위를 감싸며 RNA 복제에 관여한다. 스파이크(S) 단백질은 바이러스 입자 표면에 존재하여 숙주세포 침입에 관여하고, S1과 S2로 나누어진다. S1 단백질은 숙주세포의 수용체와 상호작용하는데, S1 단백질 내 존재하는 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain, RBD)는 숙주세포 표면에 존재하는 ACE2 수용체와 결합하는 핵심 부위로 알려져 있다. S2 단백질은 숙주세포 세포막과의 융합에 관여한다. 상기 구조에 대한 내용은 Cascella, M., Rajnik, M., Cuomo, A., Dulebohn, S. C., & Di Napoli, R. (2020). Features, Evaluation and Treatment Coronavirus (COVID-19). In StatPearls. Treasure Island (FL)에 상세히 기재되어 있다.
일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 SARS-CoV-2의 핵단백질(NP) ("N 단백질" 로도 지칭)에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기 SARS-CoV-2의 핵단백질(NP)에 결합하는 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 리간드 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn(neonatal Fc receptor)에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변 영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain, LC) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain, HC)를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체는 IgG 항체일 수 있다.
상기 용어 "단편", "폴리펩타이드의 결합 단편" 및 "항체 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항체 단편은 단일 쇄 항체, Fd, Fab, Fab', F(ab')2, dsFv 또는 scFv를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역(variable region)과 경쇄의 불변 영역(framework region, FR) 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 그 예로 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체는 단일클론 항체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론 항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론 항체는 특정 항원결정부위(에피토프, epitope)에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, CDR)이라 표기하는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조영역을 포함한다.
상기 CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 표기하고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다. 상기 상보성 결정 영역은 비교적 보존적인, 불변 영역(FR)로 불리는 영역 사이에 배치되어 있다. 각각의 중쇄가변영역(VH) 및 경쇄가변영역(VL)은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 이루어지며, 아미노-말단에서 카복시-말단까지 다음의 순서로 배열된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 중쇄가변영역의 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3으로, 경쇄가변영역의 CDR은 LCDR1, LCDR2, LCDR3으로, 중쇄가변영역의 FR은 HFR1, HFR2, HFR3, HFR4로, 경쇄가변영역의 FR은 LFR1, LFR2, LFR3, LFR4로 지칭될 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 SARS-CoV-2 핵단백질(NP)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
i) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함; 또는
ii) 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함;하는 것일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 테일(tail) 도메인을 더 포함하는 것일 수 있다.
전술한 구현예 중 어느 하나의 구현예로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄 테일(tail) 도메인을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 가변 영역의 CDR은 Kabat 등에 의해 고안된 시스템에 따라 통상적인 방법으로 결정되었으며(문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest(5th), National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)] 참조) 본 발명에 사용된 CDR 넘버링은 Kabat 방법을 사용했지만, 이외에 IMGT 방법, Chothia 방법, AbM 방법 등 다른 방법에 따라 결정된 CDR을 포함하는 항체 역시 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는, 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 통상적인 절차를 사용하여 쉽게 단리되고 서열분석될 수 있다.
그 예로, 파지 주형 DNA로부터 당해 중쇄 및 경쇄 코딩 영역을 특이적으로 증폭시키도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드가 단리되면, 이를 발현 벡터 내로 넣을 수 있고, 그 후 상기 발현 벡터를 적당한 숙주세포에 도입하여, 형질전환된 숙주세포(즉, 형질전환체)로부터 원하는 단일클론 항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다.
상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동 가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별 마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현 벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현 벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현 벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 보우스 멜라노마(bowes melanoma) 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간배아신장세포, human embryonic kidney cells), PER.C6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 봄바드먼트(bombardment) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질주입, 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, SARS-CoV-2 감염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, SARS-CoV-2 감염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 이를 포함하는 감염 진단용 조성물; 또는 상기 조성물을 포함하는 키트를 이용하여, SARS-CoV-2 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 존재하는 SARS-CoV-2를 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염 진단 방법 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다.
본 발명의 목적상, 상기 진단은 SARS-CoV-2 감염 질환의 발병 여부를 확인하는 것일 수 있다. 상기 "SARS-CoV-2 감염 질환"은 SARS-CoV-2가 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하는 감염에 의해 발병되는 질환을 의미한다. 그 예로 상기 SARS-CoV-2 감염 질환은 COVID-19 일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 SARS-CoV-2 감염 진단용 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 이외의 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또한, 이 밖에 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항원의 결합 반응에 필요한 물질, 예를 들어 시약이 더 포함될 수 있다. 또한, 이 결합을 검출하는데 필요한 물질, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 안정화를 위한 물질 등이 더 포함될 수 있다.
일 예로, 본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출을 위해 표지 된 것일 수 있다. 분자 표식에 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들 역시 잘 알려져 있다.
본 발명의 키트는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항원의 결합을 검출하는데 필요한 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있다.
일 예로, 본 발명의 키트 용기에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명의 항체는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.
일 예로, 상기 키트는 고체 담체; 분석하고자 하는 검체를 수용하고 버퍼 투입부 및 검체 투입부를 구비하는 검체 패드; 상기 검체 패드에서 유입된 검체에 함유되어 있는 SARS-CoV-2와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 컨쥬게이트 패드; 상기 검체에 SARS-CoV-2가 존재하는지 여부를 검출하는 신호검출부와 분석 물질의 존재 유무와 관계없이 검체가 흡수 패드로 이동하였는지 여부를 확인하는 대조부를 포함하는 신호 검출 패드; 및 신호 검출 반응이 종료된 검체를 흡수하는 흡수 패드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 발명의 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 형태일 수 있다. 본 발명의 용어 "ELISA"는 효소면역측정방법이라고도 하며, 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지 된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지 된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지 된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지 된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 생물학적 시료와 접촉시켜, 반응을 확인하여 생물학적 시료 내 SARS-CoV-2 존재 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 생물학적 시료는 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 준비가 가능하다.
일 예로, 본 발명의 SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 정보제공방법은 (a) 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 접촉으로 형성된, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 SARS-CoV-2 NP 단백질의 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있으며, 구체적으로 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으며, 측면 유동 어세이(Lateral Flow Assay, LFA), 항원 블롯 어세이(antigen blotting assay), 웨스턴 블롯(western blotting), ELISA, 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포 분석법(fluorescence-activated cell sorting, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 사용할 수 있고, 특히 LFA 등의 래피트키트를 이용한 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항체는 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 핵단백질(nucleoprotein, NP) 항원에 대해 높은 결합력을 나타내어, 다양한 검출 및 진단 시스템에 적용할 수 있으며, 특히 측면 유동 어세이(Lateral Flow Assay, LFA) 등의 래피드키트에 활용할 수 있다.
도 1은 SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 핵단백질(nucleoprotein, NP)을 항원으로 한 panning의 input, output titration을 나타낸 도이다.
도 2는 Poly Fab ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), Mono Fab ELISA 스크리닝, 전체 항체(Whole antibody)를 이용한 SDS-PAGE를 통해 SARS-CoV-2 NP 항원에 선택적으로 결합하는 항체를 선별한 결과이다.
도 3은 선별된 항체를 이용하여 전체 항체 Kd ELISA를 수행한 결과이다.
도 4는 선별된 항체를 이용하여 SARS-CoV-2 NP 항원 및 SARS-CoV-2를 비롯한 다양한 바이러스(인간 코로나바이러스, pH1N1, 인플루엔자 B, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus, RSV))에 대해 도트 블롯 어세이를 수행한 결과이다.
도 5는 선별된 항체를 이용하여 측면 유동 어세이(Lateral Flow Assay, LFA)를 수행한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: Bio-panning
SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 핵단백질(nucleoprotein, NP) (Cat# 40588-V08B, Sino Biological)을 항원으로 Bio-panning을 수행하였다.
인간 항체 라이브러리를 포함하고 있는 대장균(Escherichia coli)를 OD600=0.6-0.7까지 배양한 후, 헬퍼 파지(helper phage)를 첨가하여 30분간 방치하고(standing) 30분간 진탕(shaking)한 후, 카나마이신(kanamycin)을 첨가하고 밤새 배양하였다. 그 후 증폭된 라이브러리 파지를 배양액으로부터 회수하였다.
SARS-CoV-2 NP 100 μg을 튜브 내에 코팅하고(immunotube), 상기 튜브에 준비한 라이브러리 파지를 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 둔 후 0.5% PBST로 10회 세척하였다. 세척 후 남아있는 파지를 0.1 M 글리신-HCl(pH 2.5)로 희석한 후, E.coli TG1 변이주에 감염시켜 증폭하였다. 이때 패닝 방법은 동일하게 하고, 패닝 횟수가 증가할 때마다 0.5% PBST로 세척하는 횟수를 10회씩 증가시켰다.
그 결과, 도 1과 같이 panning의 input, output titration이 도출되었다.
실시예 2: SARS-CoV-2 NP 항원에 선택적으로 결합하는 항체 선별
상기 실시예 1에서 도출된 1 내지 4차 panning에 대해 Poly Fab ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), Mono Fab ELISA 스크리닝, 전체 항체(Whole antibody)를 이용한 SDS-PAGE, 전체 항체 Kd ELISA 및 도트 블롯(dot blot) 어세이를 순차적으로 수행하여 최종적으로 SARS-CoV-2 NP 항원에 선택적으로 결합하는 NP 항체를 선별하였다.
2-1. Poly Fab ELISA
상기 실시예 1에서 도출된 1 내지 4차 panning에 대해 Poly Fab ELISA를 수행하였다.
panning 횟수가 증가됨에 따라 항원결합능이 높은 항체들이 증폭되고 있는지 확인하기 위하여, 라이브러리와 1차, 2차, 3차, 4차 panning 후에 선택된 콜로니들을 모아 OD600 값이 0.6이 되도록 37℃에서 배양한 후 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 최종농도 1mM로 가하여 37℃에서 밤새 발현시킨 다음 상층액에 존재하는 항체들의 항원결합능을 간접 ELISA 방법으로 측정하였다.
간접 ELISA를 수행하기 위해, 항원 단백질을 96 웰 플레이트(MaxiSorp, Nunc)에 코팅한 후 상기 배양 상층액 100㎕를 각 웰에 넣고 실온에서 60분 동안 반응시켰다. 이어서 PBST로 3번 세척한 다음, 1차 항체(Goat F(ab')2 Anti-Human IgG (Fab')2 (HRP), abcam으로부터 구입(cat.ab98535))를 PBS에 1:3000으로 희석한 후 37℃에서 1시간 동안 부착시킨 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다음 다시 PBST로 3번 세척한 후, TMB(BD) 와 과산화수소수를 1:1의 비율로 섞어 100㎕ 씩 웰에 넣고 5분간 반응시킨 다음 2M H2SO4를 50㎕ 가하여 반응을 정지시켰다. 흡광 분석기(VERSA max 사의 microplate reader)를 이용하여 450nm 파장에서의 흡광도를 읽어 항체의 발현을 측정하였다.
그 결과, 바이오 panning의 차수가 지남에 따라 타겟에 대한 반응도가 점점 상승하였다(도 2).
2-2. Mono Fab ELISA 스크리닝
상기 실시예 2-1의 결과로부터 선별된 panning에 대해 Mono Fab ELISA 스크리닝을 수행하였다.
3차 및 4차 panning에서 증폭된 96종의 클론들을 무작위로 선택하여 E.coli TG1 변이주에 감염시킨 세포를 약 1000개의 단일 콜로니가 되도록 플레이팅하여 각각의 단일 콜로니를 OD600=0.6-0.7까지 배양한 후 IPTG로 28℃ 유도한 상층액(sup)을 SARS-CoV-2 NP가 100ng/well로 코팅되어있는 96 웰 플레이트에 넣고 37℃에서 1시간 둔 뒤, 0.05% PBST로 3번 세척하였다.
그 다음, ELISA를 수행하기 위해, 상기 증폭된 클론을 NP가 코팅된 튜브에 첨가하고, 상기 튜브에 1차 항체(Goat F(ab')2 Anti-Human IgG (Fab')2 (HRP), abcam으로부터 구입(cat.ab98535))를 0.05% PBST에 1:3000으로 희석한 후 37℃에서 1시간 동안 결합시키고, 세척한 다음 TMB가 결합된 2차 항체와 반응시킨 후 세척하고, TMB 기질 용액을 첨가하여 SARS-CoV-2 NP에 결합한 클론을 검출하였다. 음성 대조군으로는 BSA를 사용하였다. 음성 대조군(negative control)에는 결합하지 않고 SARS-CoV-2 NP에만 선택적으로 결합하는 클론을 수득하였다.
그 결과, A1, B2, C6 및 H1 항체 중 B2 항체가, E1 및 E6 항체 중 E1 항체가 선별되었다(도 2).
2-3. 전체 항체를 이용한 SDS-PAGE (항체 클론의 전항체화)
상기 선별된 클론들을 보다 정밀하게 분석하기 위해 하기 방법에 따라 전항체(whole Ig) 형태로 전환하였다.
선택된 NP-B2, NP-E1을 보다 정밀하게 분석하기 위해, 먼저 이를 whole form으로 전환하여 293T 세포에서 형질감염(transfection) 발현시킨 뒤, protein A column을 이용하여 정제하였다.
Fab 형태의 NP-B2, NP-E1을 whole form 형태로 전환하기 위하여 Fab NP-B2, NP-E1로부터 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역을 PCR에 의하여 증폭시켰고 1.5% 아가로즈 겔 (Cambrex) 을 통하여 분리한 정제하였다. 이 때 사용한 프라이머는 경쇄 가변영역의 경우 프라이머 1(5'-TTGTCTGGTGTTGAAGGAGACATCCAGATGACCCAG-3', 서열번호 9)과 프라이머 2(5'-GCAGCCGCCGTACGTTTGATCTCCACTTTGGTCCCTTGGCC-3', 서열번호 10)였고, 중쇄 가변영역의 경우 프라이머 3(5'-ACTACAGGTGTCCACTCCGAAGTGCAGCTGGTGGAG-3', 서열번호 11)과 프라이머 4(5'-CACCGGTTCGGGGAAGT-3', 서열번호 12)였다.
다음으로, 항체를 동물세포에서 발현 생산할 수 있도록 pdCMV-dhfrC(대한민국 특허 등록번호 제10-0476363호)로부터 중쇄와 경쇄의 리더 시퀀스를 PCR에 의하여 합성하고 분리하고 정제하였다. 이 때 사용한 프라이머는 경쇄 리더 시퀀스의 경우 프라이머 5(5'-TGCAAAGCTTCGGCACGAGCA-3', 서열번호 13)와 프라이머 6(5'-TCCTTCAACACCAGACAAC-3', 서열번호 14)이었고, 중쇄 리더 시퀀스의 경우 프라이머 7(5'-GACGAATTCACTCTAACCATGGAA-3', 서열번호 15)과 프라이머 8(5'-GGAGTGGACACCTGTAG-3', 서열번호 16)이었다. 다음 중쇄 리더 시퀀스와 중쇄 가변영역을, 경쇄 리더 시퀀스와 경쇄 가변영역을 각각 재조합(recombination) PCR을 이용하여 연결시켰고, 1.5% 아가로즈 겔(Cambrex)을 통하여 분리 정제하였다. 중쇄 가변영역과 중쇄의 리더 펩타이드를 연결시키는데 사용한 프라이머는 프라이머 4과 프라이머 7이었고, 경쇄 가변영역과 경쇄의 리더 시퀀스를 연결시키는데 사용한 프라이머는 프라이머 5와 프라이머 2였다.
이를 중쇄는 제한효소 EcoRI(Roche, 스위스)과 ApaI(Roche, 스위스)으로, 경쇄는 HindⅢ(Roche, 스위스)와 BsiWI(Roche, 스위스)로 잘라 동일한 제한효소로 절단하고 정제한 pdCMV-dhfrC 벡터의 중쇄와 경쇄 불변영역 위쪽에 각각 클로닝하고 하였다. 상기 DNA를 HEK293T 세포에 PEI을 사용하여 형질전환하였다. 4-6시간 동안 37℃의 5% CO2 항온 배양기에서 배양한 후 혈청을 함유하고 있지 않은 배지 CD293(Gibco, 미국)로 바꾸어 3일간 동일한 항온 배양기에서 배양하여 NP-B2, NP-E1 항체가 생산된 상청액을 모았다. 상기에서 얻어진 상청액으로부터 protein A 아가로즈 컬럼(Upstate, 미국)을 통하여 NP-B2, NP-E1 항체를 정제하였다.
그 결과, 이 항체를 환원시켰을 때에 항체의 중쇄 및 경쇄의 분자량으로 알려진 55 KDa, 25 KDa의 분자량을 갖는 단백질 밴드를 관찰하였다
또한, 상기 실시예 2-2의 결과로부터 선별된 B2 및 E1 항체에 대해서도 SDS-PAGE를 수행한 결과, 항체의 전항체화가 잘 이루어졌음을 확인하였다(도 2).
2-4. 전체 항체 Kd ELISA
상기 실시예 2-3의 결과로부터 선별된 B2 및 E1 항체를 이용하여 전체 항체 Kd ELISA를 수행하였다.
그 결과, B2 항체는 6.239 X 10-11의 Kd 값, E1 항체는 1.037 X 10-10의 Kd 값을 나타냄을 확인하고, 선별된 항체가 SARS-CoV-2 NP 항원에 높은 결합능을 나타내는 것을 확인하였다(도 3).
2-5. 도트 블롯 어세이
상기 실시예 2-3의 결과로부터 선별된 B2 및 E1 항체를 이용하여 SARS-CoV-2 NP 항원에 대해 도트 블롯 어세이를 수행하였다.
그 결과, B2 항체는 0.03125ug 농도의 SARS-CoV-2 NP 항원을 검출하고, E1 항체는 0.0625ug 농도의 SARS-CoV-2 NP 항원을 검출하여, 선별된 항체가 미량의 SARS-CoV-2 NP 항원에 대해서도 검출능이 우수함을 확인하였다(도 4).
다음으로, B2 및 E1 항체를 이용하여 SARS-CoV-2를 비롯한 다양한 바이러스(인간 코로나바이러스, pH1N1, 인플루엔자 B, 호흡기 세포융합 바이러스(Respiratory Syncytial Virus, RSV))에 대해 도트 블롯 어세이를 수행하였다.
그 결과, B2 및 E1 항체는 SARS-CoV-2 이외 바이러스에 대해서는 현저히 낮은 검출능을 나타내어, SARS-CoV-2 특이적 검출능을 가짐을 확인하였다(도 5).
실시예 3: 항체를 이용한 측면 유동 어세이(Lateral Flow Assay, LFA)
상기 실시예 2에서 선별된 B2 및 E1 항체를 이용하여 LFA를 수행하였다.
그 결과, B2 및 E1 항체를 이용하여 미량으로 존재하는 SARS-CoV-2를 특이적으로 검출할 수 있어(도 5), 이를 SARS-CoV-2 감염 진단에 적용할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> An antibody specific to nucleoprotein of SARS-CoV-2 and uses thereof <130> KPA211976-KR <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2-HC <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Asp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Thr Pro Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gln Arg Ser Gly Glu Trp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2-LC <400> 2 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Gly Ile Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 3 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E1-HC <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Leu Pro Lys Arg Met Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 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acagcctgcg tgccgaggac acggctgtct attactgtgc gcgtgagcag 300 aggagcggcg agtgggttat ggattattgg ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctcg 360 gccagc 366 <210> 6 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2-LC <400> 6 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtcggaga ccgcgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagtatctct acttacctgg cctggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctacggg gcttccaaca gggaaagtgg ggtcccatca 180 cgcttcagtg gcagtggatc tgggacggat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag tcttacggta ttcctcggac gttcggccaa 300 ggtaccaagg tggagatcaa a 321 <210> 7 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E1-HC <400> 7 gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggttcagc ctggagggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctctggatt caccttcaac ggttacgata tgagctgggt tcgccaggct 120 ccagggaagg ggctggagtg ggtttctgaa atttatggtt ctggcggtac tactaactac 180 gcagactctg tgaagggccg tttcaccatc tcccgggaca actctaagaa cactctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac acggctgtct 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Sequence <220> <223> primer 4 <400> 12 caccggttcg gggaagt 17 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 13 tgcaaagctt cggcacgagc a 21 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 14 tccttcaaca ccagacaac 19 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 15 gacgaattca ctctaaccat ggaa 24 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 16 ggagtggaca cctgtag 17

Claims (6)

  1. SARS-CoV-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2) 핵단백질(nucleoprotein)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    i) 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역; 또는
    ii) 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역;을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  4. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, SARS-CoV-2 감염 진단용 조성물.
  5. 제4항의 조성물을 포함하는, SARS-CoV-2 감염 진단용 키트.
  6. 제1항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 이를 포함하는 감염 진단용 조성물; 또는 상기 조성물을 포함하는 키트를 이용하여, SARS-CoV-2 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 존재하는 SARS-CoV-2를 검출하는 단계를 포함하는, SARS-CoV-2 감염 진단을 위한 정보제공방법.
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KR1020220021781A KR20230124433A (ko) 2022-02-18 2022-02-18 SARS-CoV-2 핵단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102245849B1 (ko) 2020-09-04 2021-04-28 주식회사 에이아이더뉴트리진 코로나바이러스 검출용 조성물 및 이의 검출용 키트
KR20210076854A (ko) 2019-12-13 2021-06-24 오토노머스 메디컬 디바이시스 인코포레이티드 Covid-19, 바이러스, 항체 및 마커의 현장 진료, 신속, 현장 배포 가능 진단 검사를 위한 장치 및 방법 - 오토랩 20

Patent Citations (2)

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